BR112021003916A2

BR112021003916A2 - molécula de anticorpo, sequência de nucleotídeos isolada, plasmídeo, vírus, célula, uso de uma molécula de anticorpo, composição farmacêutica, e, método para tratar câncer em um sujeito

Info

Publication number: BR112021003916A2
Application number: BR112021003916-3A
Authority: BR
Inventors: Björn Frendéus; Ingrid Teige; Monika SEMMRICH; Linda Mårtensson; Petra Holmkvist; Jean-Baptiste Marchand; Nathalie Silvestre
Original assignee: Transgene Sa; Bioinvent International Ab
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2021-05-25
Also published as: IL281198A; MX2021002500A; JP2022512544A; KR20210055722A; CA3111153A1; CN112912398A; WO2020049001A1; EP3847193A1; AU2019333862A1; EP3617230A1; US20220041723A1

Abstract

MOLÉCULA DE ANTICORPO, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ISOLADA, PLASMÍDEO, VÍRUS, CÉLULA, USO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER EM UM SUJEITO. Trata-se de moléculas de anticorpo anti-CTLA-4 inovadoras e sequências de nucleotídeos e vetores de expressão, tais como vírus, que codificam tais moléculas de anticorpo. As moléculas de anticorpo inovadoras são moléculas de anticorpo de depleção de Treg e têm um efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas, tais como Tregs, em comparação com ipilimumabe. Descreve-se também o uso de tais moléculas de anticorpos ou sequências de nucleotídeos ou vírus na medicina, tal como no tratamento de câncer, tais como de tumores sólidos.

Description

1 / 115 MOLÉCULA DE ANTICORPO, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ISOLADA, PLASMÍDEO, VÍRUS, CÉLULA, USO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA

TRATAR CÂNCER EM UM SUJEITO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo anti- CTLA-4, sequências de nucleotídeos e vetores de expressão (por exemplo, vírus oncolítico) que codificam tais moléculas de anticorpo para uso em terapia de câncer. Os anticorpos inovadores melhoraram a depleção de Treg em comparação com o ipilimumabe.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O antígeno associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4 ou CTLA4), também conhecido como CD152, é um membro da família B7/CD28 que bloqueia a ativação de células T. O CTLA-4 é expresso em células T ativadas e transmite um sinal inibitório para as células T. É homóloga à proteína coestimuladora de células T CD28 e tanto CTLA-4 quanto CD28 se ligam a CD80 (também denominado B7-1) e CD86 (também denominado B7-2). O CTLA4 também é encontrado nas células T reguladoras (Tregs) e contribui para sua função inibitória. A proteína de CTLA-4 contém um domínio V extracelular, um domínio transmembranar e uma cauda citoplasmática.

[003] Anticorpos que bloqueiam a interação de CTLA-4 com seus ligantes B7.1 e B7.2 podem aumentar as respostas imunes e demonstraram ser capazes de estimular a imunidade antitumoral potente (Korman et al 2006, Checkpoint blockade in cancer immunotherapy, Adv Immunol. 90:297 a 339).

[004] Resultados clínicos promissores com anticorpos monoclonais imunomoduladores (mAbs) reavivaram a crença de que o sistema imunológico é a chave para controlar o câncer. A classificação desses mAb em bloqueadores de ponto de verificação (antagonistas) ou ativadores de

2 / 115 moléculas coestimulatórias (agonistas) foi recentemente questionada com a constatação de que exemplos de ambos os tipos podem combater tumores por meio da depleção de células T reguladoras supressoras (Treg).

[005] Os mAbs imunomoduladores, tal como ipilimumabe e outros anticorpos anti-CTLA4, mostraram resultados positivos quando testados em doenças malignas de difícil tratamento, embora em uma minoria de pacientes (Hodi, F. S., et al. 2010, N Engl J Med 363(8): 711 a 723; Beatty, G. L., et al. 2011, Science 331(6024): 1.612 a 1.616; Brahmer, J. R., et al. 2012, N Engl J Med 366(26): 2.455 a 2.465; Topalian, S. L., et al. 2012 N Engl J Med 366(26): 2.443 a 2.454). Esses resultados promissores ajudaram a revigorar a crença de que o sistema imunológico pode ser a chave para controlar o câncer. Esses mAbs foram gerados para terem como alvo os reguladores moleculares- chave em células T ou células que apresentam antígeno (APCs) e para aumentar a imunidade anticâncer através do bloqueio de sinais inibitórios (bloqueadores de ponto de verificação) ou entrega de sinais coestimulatórios (agonistas). Recentemente, essa classificação binária foi questionada quando se constatou que a atividade terapêutica de anticorpos anti-CTLA4, anticorpos antiGITR e anticorpos antiOX40, que são todos células T-alvo, envolve a deleção de células T reguladoras CD4+ supressoras dependentes de coengajamento de FcγRs ativadores (Bulliard, Jolicoeur et al. 2013, Marabelle, A., et al. 2013, J Clin Invest 123(6): 2.447 a 2.463; Simpson, T.R., et al. J Exp Med 210(9): 1.695 a 1.710).

[006] Um anticorpo monoclonal CTLA-4, ipilimumabe (YERVOY®; anteriormente denominado 10D1, BMS-734016, MDX 101, MDX-010, MDX-CTLA-4 e MDX-CTLA4), foi aprovado em vários países para o tratamento de melanoma e está passando por ensaios clínicos para outras indicações (Weber 2008, Overcoming immunologic tolerance to melanoma: targeting CTLA-4 with ipilimumab (MDX-010) Oncologist, 13 (Suppl 4):16 a 25). Ipilimumabe é um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4

3 / 115 totalmente humano (IgG1κ) produzido em células de ovário de hamster chinês por tecnologia de DNA recombinante. O mesmo tem 477202-00-9 e 6T8C155666. O ipilimumabe é, ainda, definido no documento US 9.789.182, que também estabelece as sequências das cadeias pesadas e leves de ipilimumabe (tal como SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente), as sequências das regiões VH e/ou VL (tais como SEQ ID NOs: 19 e SEQ ID NO: 20, respectivamente) e as sequências de CDR (CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 24, 25 e 26).

[007] Um segundo anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 totalmente humano que foi testado em vários ensaios clínicos é o tremelimumabe (anteriormente ticilimumabe, CP-675.206) (Ribas 2008, Overcoming immunologic tolerance to melanoma: targeting CTLA-4 with tremelimumab (CP-675.206) Oncologist, 13 (Suppl 4):10 a 5; Callahan et al 2010, Anti- CTLA-4 Antibody Therapy: Immune Monitoring During Clinical Development of a Novel Immunotherapy. Semin Oncol. 37(5): 473 a 484; Blank et al 2015, Therapeutic use of anti-CTLA-4 antibodies. International Immunology, 27(1): 3 a 10).

[008] Os anticorpos anti-CTLA-4 foram descritos em vários pedidos de patente e patentes, incluindo o seguinte.

[009] O documento WO 93/00431 se refere a uma proteína receptora de CTLA4, a uma proteína de fusão de CTLA4Ig e a um método para a regulação de interações celulares com o uso de tal proteína de fusão ou de um anticorpo monoclonal.

[0010] O documento WO 97/20574 se refere ao bloqueio da regulação negativa de linfócitos T associada à sinalização de CTLA-4 e a um agente de bloqueio de CTLA-4 diferente de um anticorpo para o domínio extracelular de CTLA-4 que aumenta a resposta de células T de mamíferos ao estímulo do antígeno ou diminui o crescimento de células tumorais em um hospedeiro

4 / 115 mamífero.

[0011] O documento WO 00/37504 se refere a anticorpos anti-CTLA- 4 humanos e uso de tais anticorpos no tratamento de câncer. O documento WO 00/37504 se refere, ainda, ao anticorpo monoclonal humano tremelimumabe, acima mencionado, que é denotado como 11.2.1 no pedido de patente.

[0012] O documento WO 01/14424 também se refere a anticorpos humanos que se ligam especificamente a CTLA-4 humano e ao seu uso no tratamento de doenças e infecções humanas, tal como câncer. O documento WO 01/14424 se refere, ainda, ao anticorpo monoclonal humano ipilimumabe, acima mencionado e discutido mais adiante, que é referido como 10D1 nesse pedido de patente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção se refere a moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a CTLA-4 e que têm efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas em comparação com ipilimumabe.

[0014] Além disso, a presente invenção se refere a moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a CTLA-4, cujas moléculas de anticorpo compreendem as 6 CDRs que têm SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19 ou as 6 CDRs que têm SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26.

[0015] Além disso, a presente invenção se refere a sequências de nucleotídeos isoladas que codificam as moléculas de anticorpo acima.

[0016] Além disso, a presente invenção se refere a plasmídeos que compreendem as sequências de nucleotídeos acima.

[0017] Além disso, a presente invenção se refere a vírus, tais como vírus oncolíticos, que compreendem as sequências de nucleotídeos acima ou os plasmídeos acima.

[0018] Além disso, a presente invenção se refere a células, tais como células T CAR, que compreendem as sequências de nucleotídeos acima ou os

5 / 115 plasmídeos acima.

[0019] Além disso, a presente invenção se refere a moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos e/ou células acima para uso em medicina.

[0020] Além disso, a presente invenção se refere a moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima para uso no tratamento de câncer.

[0021] Além disso, a presente invenção se refere ao uso das moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima para a fabricação de uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer.

[0022] Além disso, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas que compreendem pelo menos uma das moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima e, opcionalmente, um diluente, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0023] Além disso, a presente invenção se refere a métodos para o tratamento de câncer em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma das moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas acima.

[0024] Além disso, a presente invenção se refere a uma molécula de anticorpo, uma molécula de anticorpo para uso, uma sequência de nucleotídeos isolada, uma sequência de nucleotídeos isolada para uso, um plasmídeo, um plasmídeo para uso, um vírus, um vírus para uso, uma célula, uma célula para uso, um uso, uma composição farmacêutica ou um método de tratamento, conforme descrito no presente documento com referência à descrição detalhada, exemplos e/ou Figuras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

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[0025] As células CTLA-4 positivas incluem células T reguladoras, células Treg, Tregs ou Tregs, (anteriormente conhecidas como células T supressoras, às vezes também denominadas células T reguladoras supressoras), que é uma subpopulação de células T reguladoras com capacidade de suprimir outras células imunes em configurações imunológicas normais e patológicas. Tregs são células CD4 positivas (células CD4+). Há outras células T CD4+ que não são Tregs; no entanto, as Tregs podem ser separadas das células CD4+ não Treg pelo fato de que as Tregs também são FOXP3 positivas (FOXP3+), enquanto as células CD4+ não Treg são FOXP3 negativas (FOXP3-).

[0026] Como o ipilimumabe, as moléculas de anticorpo anti-CTLA-4 descritas no presente documento atuam, pelo menos em parte, realizando-se a depleção de células CTLA-4 positivas, tais como Tregs. Além disso, como o ipilimumabe, as moléculas de anticorpo anti-CTLA-4 descritas no presente documento bloqueiam as interações de CTLA-4 com B7.1 e B7.2. Assim, esses anticorpos podem, consequentemente, ajudar a superar os efeitos supressivos induzidos por CTLA-4 na proliferação de células T efetoras.

[0027] Por depleção de Tregs, ou depleção de Treg, o presente documento refere-se à depleção, deleção ou eliminação de Tregs por meio da depuração física de células. Em particular, nos referimos à depleção de Tregs intratumorais. A depleção de Tregs pode ser alcançada através de ADCC, isto é, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos, e/ou ADCP, isto é, fagocitose celular dependente de anticorpos. Isso significa que quando uma molécula de anticorpo, conforme descrito no presente documento, é administrada a um sujeito, como um ser humano, a mesma se liga especificamente a CTLA-4 expressa na superfície de Tregs, e essa ligação resulta na depleção de Tregs. Em algumas modalidades, o CTLA-4 é expresso, preferencialmente, em linfócitos infiltrantes de tumor no

7 / 115 microambiente tumoral ou em células tumorais.

[0028] ADCC é um mecanismo imunológico através do qual células efetoras portadoras de receptor Fc podem reconhecer e exterminar células- alvo revestidas de anticorpos que expressam antígenos derivados de tumor, isto é, no presente caso, CTLA-4, em sua superfície. O ADCP é um mecanismo similar, embora resulte na morte das células-alvo por meio de fagocitose em vez de citotoxicidade.

[0029] Os anticorpos são bem conhecidos por pessoas versadas nas técnicas de imunologia e biologia molecular. Tipicamente, um anticorpo compreende duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L). No presente documento, às vezes nos referimos a essa molécula de anticorpo completa como um anticorpo em tamanho completo ou em comprimento completo. A cadeia pesada do anticorpo compreende um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), e a cadeia leve da molécula do anticorpo compreende um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). Os domínios variáveis (por vezes coletivamente referidos como a região Fv) se ligam ao alvo do anticorpo, ou antígeno. Cada domínio variável compreende três ciclos fechados, referidos como regiões determinantes complementares (CDRs), responsáveis pela ligação ao alvo. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de cadeias pesadas dos mesmos, anticorpos ou imunoglobulinas podem ser atribuídos a diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e em seres humanos várias das mesmas são divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. Outra parte de um anticorpo é o domínio Fc (também conhecido como domínio cristalizável do fragmento), que compreende dois dos domínios constantes de cada uma das cadeias pesadas do anticorpo. O domínio Fc é responsável pelas interações

8 / 115 entre o anticorpo e o receptor de Fc.

[0030] Os receptores de Fc são proteínas de membrana frequentemente encontradas na superfície celular das células do sistema imunológico (isto é, os receptores de Fc são encontrados na membrana de célula-alvo - também conhecida como membrana plasmática ou membrana citoplasmática). O papel de receptores de Fc é ligar os anticorpos por meio do domínio Fc e internalizar o anticorpo na célula. No sistema imunológico, isso pode resultar em fagocitose mediada por anticorpos e citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos.

[0031] O termo molécula de anticorpo, conforme usado no presente documento, abrange anticorpos de tamanho completo ou comprimento completo, bem como fragmentos funcionais de anticorpos de comprimento completo e derivados de tais moléculas de anticorpo.

[0032] Fragmentos funcionais de um anticorpo de tamanho completo têm as mesmas características de ligação ao antígeno que o anticorpo em tamanho completo correspondente e incluem os mesmos domínios variáveis (isto é, as sequências de VH e VL) e/ou as mesmas sequências de CDR que o anticorpo de tamanho completo correspondente. O fato de o fragmento funcional ter as mesmas características de ligação ao antígeno que o anticorpo de tamanho completo correspondente significa que o mesmo se liga ao mesmo epítopo no alvo que o anticorpo de tamanho completo. Tal fragmento funcional pode corresponder à parte Fv de um anticorpo de tamanho completo. Alternativamente, esse fragmento pode ser um Fab, também denominado F(ab), que é um fragmento de ligação ao antígeno monovalente que não contém uma parte Fc, ou um F(ab')2, que é um fragmento de ligação ao antígeno divalente que contém duas partes Fab de ligação ao antígeno conectadas entre si por ligações de dissulfeto, ou um F(ab'), isto é, uma variante monovalente de um F(ab')2. Esse fragmento também pode ser um fragmento variável de cadeia única (scFv).

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[0033] Um fragmento funcional nem sempre contém todas as seis CDRs de um anticorpo de tamanho completo correspondente. Observa-se que moléculas que contêm três regiões CDR ou menos (em alguns casos, mesmo apenas uma única CDR ou uma parte da mesma) têm a capacidade de reter a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo da qual as CDR (ou CDRs) são derivadas. Por exemplo, em Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32.389 a

32.393, é descrito que uma cadeia VL completa (incluindo todas as três CDRs) tem uma alta afinidade pelo seu substrato.

[0034] Moléculas que contêm duas regiões CDR são descritas, por exemplo, por Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417 a 430. Na página 418 (coluna da direita - 3 Our Strategy for Design), é descrito um minicorpo que inclui apenas as regiões hipervariáveis CDR H1 e H2 intercaladas nas regiões de framework. O minicorpo é descrito como sendo capaz de se ligar a um alvo. Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367 a 369 e Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649 a 659 são referenciados por Vaughan & Sollazzo e descrevem o minicorpo H1 e H2 e suas propriedades em mais detalhes. Em Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25:921 a 929 é demonstrado que uma molécula que consiste em duas CDRs conectadas tem a capacidade de se ligar ao antígeno. Quiocho 1993, Nature, 362: 293 a 294 fornece um resumo da tecnologia de “minicorpo". Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25: 875 a 877 comenta que as moléculas que contêm duas CDRs têm a capacidade de reter a atividade de ligação ao antígeno.

[0035] Moléculas de anticorpo que contêm uma única região CDR são descritas, por exemplo, em Laune et al., 1997, JBC, 272: 30.937 a 30.944, em que é demonstrado que uma variedade de hexapeptídeos derivados de uma CDR exibe atividade de ligação ao antígeno e observa-se que peptídeos sintéticos de uma CDR completa e única exibem forte atividade de ligação. Em Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3.789 a 3.796, mostra-se que uma

10 / 115 variedade de peptídeos de 12 monômeros e regiões de framework associadas têm atividade de ligação ao antígeno e comenta-se que um peptídeo do tipo CDR3, isoladamente, tem capacidade de se ligar a um antígeno. Em Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1.791 a 1.800, relata-se que um “microanticorpo” (uma molécula que contém uma única CDR) tem a capacidade de se ligar ao antígeno e mostra-se que um peptídeo cíclico de um anticorpo antiHIV tem atividade e função de ligação ao antígeno. Em Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13:1.882 a 1.891, mostra-se que uma única CDR pode conferir atividade de ligação ao antígeno e afinidade pelo seu antígeno de lisozima.

[0036] Assim, moléculas de anticorpo que têm cinco, quatro, três ou menos CDRs têm a capacidade de reter as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos de comprimento completo a partir dos quais são derivados.

[0037] A molécula de anticorpo também pode ser um derivado de um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de tal anticorpo. O derivado tem as mesmas características de ligação ao antígeno que o anticorpo de tamanho completo correspondente, no sentido de que se liga ao mesmo epítopo no alvo que o anticorpo de tamanho completo.

[0038] Assim, pelo termo “molécula de anticorpo”, conforme usado no presente documento, inclui-se todos os tipos de moléculas de anticorpo e fragmentos funcionais dos mesmos e derivados dos mesmos, incluindo: anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos variáveis (Fvs), fragmentos variáveis de cadeia única (fragmentos scFv), incluindo fragmentos variáveis divalentes de cadeia única (di-scFvs) e fragmentos variáveis conectados a dissulfeto, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', cadeias pesadas de anticorpo, cadeias leves de anticorpo,

11 / 115 homodímeros de cadeias pesadas de anticorpo, homodímeros de cadeias leves de anticorpo, heterodímeros de cadeias pesadas de anticorpo, heterodímeros de cadeias leves de anticorpo, fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais homo e heterodímeros.

[0039] Além disso, o termo “molécula de anticorpo”, conforme usado no presente documento, inclui todas as classes de moléculas de anticorpo e fragmentos funcionais, incluindo: IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD e IgE.

[0040] Em algumas modalidades, o anticorpo é um IgG1 humano. A pessoa versada na técnica está ciente de que o IgG2a de camundongo e o IgG1 humano se envolvem produtivamente com os receptores Fc gama ativadores e compartilham a capacidade de ativar a deleção de células-alvo através da ativação de células imunes portadoras do receptor Fc gama ativador (por exemplo, macrófagos e células NK) através de, por exemplo, ADCP e ADCC. Sendo assim, à medida que o IgG2a de camundongo é o isótipo preferencial para deleção no camundongo, o IgG1 humano é um isótipo preferencial para a deleção em ser humano. Por outro lado, sabe-se que a coestimulação ideal dos receptores agonistas da superfamília TNFR, por exemplo, 4-1BB, OX40, TNFRII, CD40 depende do envolvimento de anticorpo de FcγRII inibitório. No camundongo, o isótipo IgG1, que se liga, preferencialmente, ao receptor Fc gama inibitório (FcγRIIB) e, apenas fracamente, aos receptores Fc gama ativadores, é conhecido por ser ideal para a atividade coestimuladora do mAb que tem como alvo a superfamília de TNFR. Embora nenhum equivalente direto do isótipo IgG1 de camundongo tenha sido descrito no homem, os anticorpos podem ser geneticamente modificados para mostrar uma ligação aumentada de forma similar a receptores Fc gama humanos ativadores sobre os inibitórios. Esses anticorpos que têm como alvo a superfamília de TNFR geneticamente modificados também têm atividade coestimulatória melhorada in vivo em camundongos

12 / 115 transgênicos geneticamente modificados para expressar receptores Fc gama ativadores e inibitórios humanos (Dahan et al, 2016, Therapeutic Activity of Agonistic, Human antiCD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcγR Engagement. Cancer Cell. 29(6):820 a 831).

[0041] Conforme descrito acima, diferentes tipos e formas de moléculas de anticorpo são incluídos na invenção e seriam conhecidos pela pessoa versada em imunologia. Sabe-se que os anticorpos usados para fins terapêuticos são, frequentemente, modificados com componentes adicionais que modificam as propriedades da molécula de anticorpo.

[0042] Consequentemente, inclui-se que uma molécula de anticorpo da invenção ou uma molécula de anticorpo usada de acordo com a invenção (por exemplo, uma molécula de anticorpo monoclonal, e/ou molécula de anticorpo policlonal, e/ou molécula de anticorpo biespecífico) compreende uma porção química detectável e/ou uma porção química citotóxica.

[0043] Por “porção química detectável”, inclui-se um ou mais do grupo que compreende: uma enzima; um átomo radioativo; uma porção química fluorescente; uma porção química quimioluminescente; uma porção química bioluminescente. A porção química detectável permite que a molécula de anticorpo seja visualizada in vitro, e/ou in vivo, e/ou ex vivo.

[0044] Por “porção química citotóxica”, inclui-se uma porção química radioativa e/ou enzima, por exemplo, em que a enzima é uma caspase e/ou toxina, por exemplo, em que a toxina é uma toxina bacteriana ou um veneno; em que a porção química citotóxica é capaz de induzir a lise celular.

[0045] Inclui-se, ainda, que a molécula de anticorpo pode estar sob uma forma isolada e/ou sob a forma purificada e/ou pode ser PEGuilada.

[0046] Conforme discutido acima, as CDRs de um anticorpo se ligam ao alvo do anticorpo. A atribuição de aminoácidos a cada CDR descrita neste documento está em conformidade com as definições de acordo com Kabat EA et al. 1991, em “Sequences of Proteins of Immunological Interest” Quinta

13 / 115 Edição, Publicação NIH no 91-3242, páginas xv a xvii.

[0047] Como a pessoa versada na técnica saberia, também há outros métodos para atribuir aminoácidos a cada CDR. Por exemplo, o sistema internacional de informações ImMunoGeneTics (IMGT(R)) (http://www.imgt.org/ e Lefranc e Lefranc “The Immunoglobulin FactsBook” publicado por Academic Press, 2001).

[0048] Em uma outra modalidade, a molécula de anticorpo da presente invenção ou usada de acordo com a invenção é uma molécula de anticorpo que tem capacidade para competir com os anticorpos específicos descritos no presente documento, tais como as moléculas de anticorpo que compreendem SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19 ou SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26.

[0049] Por “com capacidade de competir com", entende-se que o anticorpo concorrente tem a capacidade de inibir ou interferir de outra forma, pelo menos em parte, a ligação de uma molécula de anticorpo, conforme definido no presente documento, ao alvo específico.

[0050] Por exemplo, tal molécula de anticorpo concorrente pode ser capaz de inibir a ligação de uma molécula de anticorpo descrita no presente documento em pelo menos cerca de 10%; por exemplo, pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100% e/ou inibir a capacidade do anticorpo descrita no presente documento de prevenir ou reduzir a ligação ao alvo específico em pelo menos cerca de 10%; por exemplo, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100%.

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[0051] A ligação competitiva pode ser determinada por métodos bem conhecidos por pessoas versadas na técnicas, tal como o ensaio imunossorvente conectado à enzima (ELISA).

[0052] Os ensaios ELISA podem ser usados para avaliar anticorpos modificadores ou bloqueadores de epítopos. Métodos adicionais adequados para identificar anticorpos concorrentes são divulgados em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, que é incorporado ao presente documento a título de referência (por exemplo, consultar as páginas 567 a 569, 574 a 576, 583 e 590 a 612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2).

[0053] É bem conhecido que um anticorpo se liga especificamente a uma molécula ou antígeno-alvo definido e que isso significa que o anticorpo se liga preferencial e seletivamente ao seu alvo e não a uma molécula que não seja um alvo.

[0054] O CTLA-4-alvo dos anticorpos, de acordo com a presente invenção ou dos anticorpos usados de acordo com a invenção, são expressos na superfície das células, isto é, os mesmos são antígenos de superfície celular, que incluem um epítopo (de outra forma conhecido neste contexto como um epítopo de superfície celular) para o anticorpo. Antígeno e epítopo de superfície celular são termos que seriam facilmente entendidos por uma pessoa versada em imunologia ou biologia celular.

[0055] Por “antígeno de superfície celular”, inclui-se o antígeno de superfície celular ou pelo menos o epítopo do mesmo a partir da qual a molécula de anticorpo descrita no presente documento é exposta no lado extracelular da membrana celular.

[0056] Os métodos para avaliar a ligação de proteína são conhecidos pela pessoa versada em bioquímica e imunologia. Será observado pela pessoa versada na técnica que esses métodos podem ser usados para avaliar a ligação de um anticorpo a um alvo e/ou a ligação do domínio Fc de um anticorpo a um receptor Fc; bem como a força relativa, ou a especificidade, ou a inibição,

15 / 115 ou a prevenção ou a redução nessas interações. Exemplos de métodos que podem ser utilizados para avaliar a ligação às proteínas são, por exemplo, imunoensaios, BIAcore, western blots, radioimunoensaio (RIA) e ensaios imunossorventes conectados à enzima (ELISA) (consultar Fundamental Immunology, Segunda Edição, Raven Press, Nova Iorque, nas páginas 332 a 336 (1989) para uma discussão sobre a especificidade de anticorpo).

[0057] Consequentemente no presente documento, tanto uma “molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4” quanto uma “molécula de anticorpo anti-CTLA-4” se referem a uma molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4-alvo, mas que não se liga a um não alvo ou que se liga a um não alvo mais fraco (tal como com uma afinidade menor) do que o alvo.

[0058] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4 (ou a molécula de anticorpo anti-CTLA-4) se refere a uma molécula de anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular de CTLA-4.

[0059] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4 (ou a molécula de anticorpo anti-CTLA-4) não apresenta reação cruzada com CD28. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4 (ou a molécula de anticorpo anti-CTLA-4) bloqueia a ligação de CTLA-4 a CD80 e/ou CD86, inibindo, assim, a sinalização de CLTA-4.

[0060] Ademais, inclui-se o significado de que o anticorpo se liga especificamente a CTLA-4-alvo pelo menos duas vezes mais fortemente, ou pelo menos cinco vezes mais fortemente, ou pelo menos 10 vezes mais fortemente, ou pelo menos 20 vezes mais fortemente, ou pelo menos 50 vezes mais fortemente, ou pelo menos 100 vezes mais fortemente, ou pelo menos 200 vezes mais fortemente, ou pelo menos 500 vezes mais fortemente, ou pelo menos cerca de 1.000 vezes mais fortemente do que um não alvo.

16 / 115

[0061] Além disso, inclui-se o significado de que o anticorpo se liga especificamente ao CTLA-4-alvo se ele se ligar ao alvo com um Kd de pelo menos cerca de 10-1 Kd, ou pelo menos cerca de 10-2 Kd, ou pelo menos cerca de 10-3 Kd, ou pelo menos cerca de 10-4 Kd, ou pelo menos cerca de 10-5 Kd, ou pelo menos cerca de 10-6 Kd, ou pelo menos cerca de 10-7 Kd, ou pelo menos cerca de 10-8 Kd, ou pelo menos cerca de 10-9 Kd, ou pelo menos cerca de 10-10 Kd, ou pelo menos cerca de 10-11 Kd, ou pelo menos cerca de 10-12 Kd, ou pelo menos cerca de 10-13 Kd, ou pelo menos cerca de 10-14 Kd, ou pelo menos cerca de 10-15 Kd.

[0062] Conforme acima mencionado, as moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a CTLA-4 (ou as moléculas de anticorpo anti- CTLA-4) descritas no presente documento têm um efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas em comparação com ipilimumabe.

[0063] O fato de que as moléculas de anticorpo têm um efeito de depleção nas células CTLA-4 positivas significa que após a administração a um sujeito, como um ser humano, tal anticorpo se liga especificamente a CTLA-4 expressa na superfície de células CTLA-4 positivas, e esta ligação resulta na depleção de tais células.

[0064] Em algumas modalidades, as células CTLA-4 positivas são células CD4 positivas (CD4+), isto é, células que expressam CD4.

[0065] Em algumas modalidades, as células CTLA-4 positivas são positivas tanto para CD4 quanto positivas para FOXP3, isto é, expressam tanto CD4 quanto FOXP3. Essas células são Tregs. As células T CD8 positivas também expressam CTLA-4, mas as Tregs expressam níveis significativamente mais elevados de CTLA-4 do que as células T CD8 positivas. Isso torna as Tregs mais suscetíveis à depleção em comparação com células CD8+ com menor expressão.

[0066] Em algumas situações, a CTLA-4 é expressa, preferencialmente, em células imunes no microambiente tumoral (células

17 / 115 infiltrantes de tumor, TILS).

[0067] Assim, em um microambiente tumoral, as Tregs serão as células que têm a maior expressão de CTLA-4, resultando nas moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a CTLA-4 (ou as moléculas de anticorpo anti-CTLA-4) com um efeito de depleção de Treg. Isso é discutido em mais detalhes abaixo, por exemplo, no Exemplo 4 e em conexão com a Figura 13.

[0068] Em algumas modalidades, as células CTLA-4 positivas serão Tregs em um tumor sólido. Tais Tregs terão uma expressão muito elevada de CTLA-4 e, portanto, a administração de moléculas de anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, resultará, preferencialmente, na depleção de tais Tregs.

[0069] Como acima mencionado, as moléculas de anticorpo anti- CTLA-4 descritas no presente documento são moléculas de anticorpo de depleção de Treg, o que significa que após a administração a um sujeito, tal como um ser humano, tal molécula de anticorpo se liga especificamente a CTLA-4 expressa na superfície de Tregs, e essa ligação resulta na depleção de Tregs.

[0070] Para decidir se uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo que tem efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas em comparação com ipilimumabe como referido no presente documento, é possível usar um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo in vitro (ADCC) ou um teste in vivo em um modelo PBMC-NOG/SCID.

[0071] O teste de ADCC in vitro é realizado com o uso de uma linhagem celular NK-92 estavelmente transfectada para expressar o alelo CD16-158V juntamente com GFP, em que o teste de ADCC compreende as seguintes sete etapas consecutivas: 1) Células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas ou Tregs como células-alvo são isoladas do sangue periférico de dadores saudáveis.

18 / 115 Esse isolamento pode ser feito com o uso de um kit de isolamento de células T CD4+, tal como um kit comercial da Miltenyi Biotec.

[0072] 2) As células-alvo são, então, estimuladas, por exemplo, por 48 horas, com CD3/CD28, por exemplo, usando-se Dynabeads® CD3/CD28 e rhIL-2, tal como 50 ng/ml de rhIL-2. A estimulação pode ser feita a 37 °C.

[0073] 3) As células-alvo são, então, pré-incubadas com a molécula de anticorpo a ser testada, por exemplo, a 10 µg/ml por 30 min a 4 °C, e são, então, misturadas com células NK.

[0074] 4) As células-alvo são, então, incubadas por um tempo apropriado, tal como 4 horas, em meio de RPMI 1640 + GlutaMAX que contém tampão HEPES, piruvato de sódio e IgG com baixo teor de FBS. O meio de RPMI 1640 + GlutaMAX pode conter tampão HEPES a 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e IgG com baixo teor de FBS a 10%, e a razão de efetor:célula-alvo pode ser de 2:1.

[0075] 5) A lise é determinada por citometria de fluxo.

[0076] 6) As etapas 1 a 5 são repetidas, ou realizadas em paralelo, com ipilimumabe usado em vez da molécula de anticorpo testada na etapa 3.

[0077] 7) Os resultados da lise da molécula de anticorpo testada são comparados aos resultados da lise para ipilimumabe. Uma lise melhorada para a molécula de anticorpo testada em comparação com ipilimumabe demonstra que a molécula de anticorpo testada tem efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas ou Tregs, respectivamente, dependendo de quais células-alvo foram usadas.

[0078] Em algumas modalidades, o efeito de depleção melhorado na etapa 7) acima é um efeito de depleção significativamente melhorado.

[0079] Esse ensaio é demonstrado em mais detalhes abaixo no Exemplo 4, em combinação com a Figura 12.

[0080] O teste in vivo é baseado no uso combinado de camundongos PBMC e camundongos NOG/SCID, que é aqui denominado modelo PBMC-

19 / 115 NOG/SCID. Tanto os camundongos PBMC quanto os camundongos NOG/SCID são modelos bem conhecidos. O teste in vivo no modelo PBMC- NOG/SCID compreende as seguintes nove etapas consecutivas: 1) PBMCs humanas (células mononucleares de sangue periférico) são isoladas, lavadas e ressuspensas em PBS estéril. Em algumas modalidades, as PBMCs são ressuspensas em PBS a 75 x 106 células/ml.

[0081] 2) Camundongos NOG são injetados i.v. (por via intravenosa) com uma quantidade apropriada, tal como 200 µl, da suspensão de células da etapa 1). Se 200 µl forem injetados, isso corresponde a 15 x 106 células/camundongo.

[0082] 3) Em um tempo adequado, tal como 2 semanas, após a injeção, os baços dos camundongos NOG são isolados e transformados em uma suspensão de célula única. Opcionalmente, uma pequena amostra da suspensão de célula única é retirada para determinar a expressão de CTLA-4 em células T humanas por FACS, a fim de confirmar a expressão de CTLA-4.

[0083] 4) A suspensão de células da etapa 3) é ressuspensa em PBS estéril. Em algumas modalidades, a suspensão de células é ressuspensa em PBS estéril a 50x106 células/ml. Se a determinação da expressão de CTLA-4 opcional for incluída na etapa 3, o restante da suspensão de células é, então, ressuspensa na etapa 4.

[0084] 5) Camundongos SCID são injetados i.p. (intraperitonealmente) com uma quantidade apropriada, tal como 200 µl, da suspensão da etapa 4. Se 200 µl forem injetados, isso corresponde a 10x106 células/camundongo.

[0085] 6) Em um tempo adequado, tal como 1 hora, após a injeção na etapa 5), os camundongos SCID são tratados com uma quantidade apropriada, tal como 10 mg/kg, da molécula de anticorpo a ser testada, ipilimumabe ou um anticorpo monoclonal de controle de isótipo.

[0086] 7) O fluido intraperitoneal dos camundongos SCID tratados é

20 / 115 coletado em um momento adequado, tal como 24 horas, após o tratamento na etapa 6).

[0087] 8) Subconjuntos de células T humanas são identificados e quantificados por FACS usando-se os seguintes marcadores: CD45, CD4, CD8, CD25 e/ou CD127.

[0088] 9) Os resultados da identificação e da quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com a molécula de anticorpo testada são comparados aos resultados da identificação e quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com ipilimumabe e aos resultados da identificação e da quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com anticorpo monoclonal de controle de isótipo. Um menor número de células CTLA-4 positivas no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com a molécula de anticorpo a ser testada em comparação com o número de células CTLA-4 positivas no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com ipilimumabe demonstra que a molécula de anticorpo melhorou o efeito de depleção em células CTLA-4 positivas em comparação com ipilimumabe. Um número menor de células CD4 positivas no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com a molécula de anticorpo a ser testada em comparação com o número de células CD4 positivas no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com ipilimumabe demonstra que a molécula de anticorpo tem efeito de depleção melhorado em células CD4 positivas em comparação com ipilimumabe. Um menor número de Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com a molécula de anticorpo a ser testada em comparação com o número de Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com ipilimumabe demonstra que a molécula de anticorpo tem efeito de depleção melhorado em Tregs em comparação com ipilimumabe.

[0089] Neste teste in vivo, é, em algumas modalidades, de máximo

21 / 115 interesse observar a depleção de Treg na etapa 7.

[0090] Esse ensaio é demonstrado em mais detalhes abaixo no Exemplo 4, em combinação com a Figura 14.

[0091] A depleção de Treg também pode ser avaliada em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), como conhecido pela pessoa versada na técnica.

[0092] Em algumas modalidades, as moléculas de anticorpo têm efeito de bloqueio similar nas interações de CTLA-4 com ligantes B7.1 e B7.2 em comparação com Yervoy. Isso pode ser avaliado por ELISA (conforme mostrado na Figura 10) ou em um ensaio mais funcional em que os anticorpos anti-CTLA-4 aumentam a produção de IL-2 por células T em resposta à estimulação de PBMCs com SEB.

[0093] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo humano.

[0094] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo humanizado.

[0095] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo de origem humana, o que significa que se origina de uma molécula de anticorpo humano que foi modificada.

[0096] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é um anticorpo IgG1 humano.

[0097] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo na forma de um anticorpo IgG1 humano que mostra ligação melhorada a um ou vários receptores de Fc ativadores e/ou que é geneticamente modificado para a ligação melhorada a um ou vários receptores de Fc ativadores; consequentemente, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo IgG1 humano geneticamente modificado por Fc.

[0098] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo IgG2a murino ou humanizado murino.

22 / 115

[0099] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo murino que apresenta reação cruzada com CTLA-4 humana.

[00100] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo monoclonal.

[00101] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo policlonal.

[00102] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo que compreende uma das três sequências alternativas de VH-CDR1, uma das três sequências alternativas de VH-CDR2, uma das duas sequências alternativas de VH-CDR3, uma das duas sequências de VL-CDR1, uma das duas sequências de VL-CDR2 e/ou uma das duas sequências alternativas de VL-CDR3 apresentadas na Tabela 1 abaixo.

[00103] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 1 a 6 dentre as CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 3, 6, 8, 10, 12 e 14.

[00104] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-CTLA-4 é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem as CDRs que têm SEQ ID NOs: 3, 6, 8, 10, 12 e 14.

[00105] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 1 a 6 dentre as CDRs, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 e VL-CDR3, em que VH-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 22, 29 e 35; em que VH-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 23, 30 e 36;

23 / 115 em que VH-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 17, 24, 31 e 37; em que VL-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10 e 38. em que VL-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 18, 25, 32 e 39; em que VL-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19, 26 e 40.

[00106] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 6 CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19; SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26; SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 10, 32 e 26; e SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40.

[00107] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19.

[00108] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26.

[00109] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem uma VH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 20, 27, 33 e 41.

[00110] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem uma VL selecionada a

24 / 115 partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21, 28, 34 e 42.

[00111] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem uma VH e uma VL selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 20 a 21, 27 a 28, 33 a 34 e 41 a 42.

[00112] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 compreende uma VH que tem a sequência SEQ ID No: 20 e uma VL que tem a sequência SEQ ID No: 21.

[00113] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 compreende uma VH que tem a sequência SEQ ID No: 27 e uma VL que tem a sequência SEQ ID No: 28. TABELA 1: SEQUÊNCIAS DE CDR GERAIS DE ANTICORPOS

DIVULGADOS NO PRESENTE DOCUMENTO Parte relevante Sequência Explicação de resíduos de SEQ. ID. do anticorpo aminoácidos não identificados NO VH-CDR1 FX1X2YX3MX4WX5R QAPG X1 = S ou K; X2 = D, S ou A; X3 = alternativa 1 Y, S ou A; X4 = S ou N; e X5 = V 1 ou I VH-CDR1 FSX1YX2MX3WVRQ APG X1= D ou S; X2 = Y, S ou A; e X3 2 alternativa 2 = S ou N VH-CDR1 FSX1YX2MX3WVRQ APG X1 = D ou S; X2 = Y ou S; e X3 = 3 alternativa 3 S ou N VH-CDR2, SX1ISX2X3X4X5X6X7 X8X9ADSVKGR X1 = G ou A; X2 = W, G ou N; X3 alternativa 1 = S ou T; X4 = S ou G; X5 = R ou 4 G; X6 = D, S ou Y; X7 = K, T ou I; X8 = G, Y, H ou D; X9 = Y ou F VH-CDR2, SX1ISX2X3X4X5X6X7 X8YADSVKGR X1 = G ou A; X2 = W, G ou N; X3 alternativa 2 = S ou T; X4 = S ou G; X5 = R ou 5 G; X6 = D, S ou Y; X7 = K, T ou I; X8 = G, Y, H ou D VH-CDR2, SX1ISX2SX3X4X5X6X7 YADSVKGR X1 = G ou A; X2 = W ou G; X3 = alternativa 3 S ou G; X4 = R ou G; X5 = D ou 6 S; X6 = K ou T; X7 = G ou Y, H ou D VH-CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 X11X12X13X14X15 X1 = T ou A; X2 = T ou R; X3 = alternativa 1 D, Y ou L; X4 = L, R, S ou G; X5 = A, V, S ou Y; X6 = R, E, G ou S; X7 = Y, M, L ou G; X8 = N, H, Y ou nenhum; X9 = Q, D ou nenhum; X10 = W, A, D ou 7 nenhum; X11 = L, F, R ou nenhum; X12 = A, D, G ou nenhum; X13 = D, I, M ou nenhum; X14 = D ou nenhum; e X15 = V ou nenhum

25 / 115 Parte relevante Sequência Explicação de resíduos de SEQ. ID. do anticorpo aminoácidos não identificados NO VH-CDR3 X1X2DX3X4X5X6X7X8X9X10 X11X12X13 X1 = T ou A; X2 = T ou R; X3 = L alternativa 2 ou R; X4 = A ou V; X5 = R ou E; X6 = Y ou M; X7 = N ou nenhum; X8 = Q ou nenhum; X9 = W ou 8 nenhum; X10 = L ou nenhum; X11 = A ou nenhum; X12 = D ou nenhum VL-CDR1 CX1GSSSNIGX2 X3YX4X5X6 X1 = T ou S; X2 = A ou S; X3 = G alternativa 1 ou N; X4 = D ou V; X5 = V ou Y; 9 X6 = H ou nenhum VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 10 alternativa 2 VL-CDR2 X1NX2X3RPS X1 = G, R ou D; X2 = D, N ou S; e 11 alternativa 1 X3 = N, Q ou K VL-CDR2 X1NX2X3RPS X1 = G ou R; X2 = D ou N; e X3 = 12 alternativa 2 N ou Q VL-CDR3 CX1X2X3DX4SLX5G X6VX7 X1 = A ou Q; X2 = V, A ou S; X3 alternativa 1 = W ou Y; X4 = D ou S; X5 = N 13 ou S; X6 = V, W ou P; e X7 = V ou nenhum VL-CDR3 CAX1WDDSLNG X2V X1 = V ou A; e X2 = V ou W 14 alternativa 2 TABELA 2: MOLÉCULAS DE ANTICORPO ANTI-CTLA-4 ESPECÍFICAS; AS SEQUÊNCIAS DE CDR ESTÃO MARCADAS EM

NEGRITO NAS SEQUÊNCIAS VH E VL COMPLETAS Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: 4-E03 VH-CDR1 FSDYYMSWVR QAPG 15 VH-CDR2 SGISWSSRDK GYADSVKGR 16 VH-CDR3 TTDLARY 17 VL-CDR1 CTGSSSNIGA GYDVH 10 VL-CDR2 GNDNRPS 18 VL-CDR3 CAVWDDSLNG VV 19

VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS

DYYMSWVRQA PGKGLEWVSG ISWSSRDKGY 20

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTTDL ARYWGQGTLV TVSS VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG

AGYDVHWYQQ LPGTAPKLLI YGNDNRPSGV 21

PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC

AVWDDSLNGV VFGGGTKLTV LG imunoglobulina MGWSCIILFLVATATGVHS humana G1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ (IgG1) QLPGTAPKLLIYGNDNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS cadeia leve GLRSEDEADYYCAVWDDSLNGVVFGGGTKLTVLGQPK 53 (LC) AAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK

ADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKS HRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

26 / 115 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: IgG1 humana MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSL cadeia pesada RLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGISWSS (HC) RDKGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA

VYYCTTDLARYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSK STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD 54

TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK 5-B07 VH-CDR1 FSSYSMNWVRQ APG 22 VH-CDR2 SAISGSGGST YYADSVKGR 23 VH-CDR3 ARDRVEMNQW LAD 24 VL-CDR1 CTGSSSNIGA GYDVH 10 VL-CDR2 RNNQRPS 25 VL-CDR3 CAAWDDSLNG WV 26

VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS

SYSMNWVRQA PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY 27

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR VEMNQWLADW GQGTLVTVSS VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG

AGYDVHWYQQ LPGTAPKLLI YRNNQRPSGV 28

PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC

AAWDDSLNGW VFGGGTKLTV LG cadeia leve (LC) MGWSCIILFLVATATGVHSQSVLTQPPSASGTPGQRVTI de SCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPS imunoglobulina GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDS murina (IgG2a) LNGWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKA 62

TLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQS NNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKS

LSRADCS cadeia pesada MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLR (HC) de LSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS imunoglobulina TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY murina (IgG2a) YCARDRVEMNQWLADWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYP

LAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSS

GVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHP ASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPP 63

KIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEV HTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTK KQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPV LDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHN

HHTTKSFSRTPGK 2-C06 VH-CDR1 FSSYAMSWVRQ APG 29 VH-CDR2 SGISGSGGYI HYADSVKGR 30 VH-CDR3 ATYSSGLHDA FDI 31 VL-CDR1 CTGSSSNIGA GYDVH 10 VL-CDR2 DNNKRPS 32 VL-CDR3 CAAWDDSLNG WV 26

VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS

SYAMSWVRQA PGKGLEWVSG ISGSGGYIHY 33

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATYS SGLHDAFDIW GQGTLVTVSS

27 / 115 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO:

VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG

AGYDVHWYQQ LPGTAPKLLI YDNNKRPSGV 34

PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC

AAWDDSLNGW VFGGGTKLTV LG 2-F09 VH-CDR1 FKAYSMSWIR QAPG 35 VH-CDR2 SGISNTGGST DFADSVKGR 36 VH-CDR3 ARLGYSGYDD RGMDV 37 VL-CDR1 CSGSSSNIGS NYVY 38 VL-CDR2 GNSNRPS 39 VL-CDR3 CQSYDSSLSG PVV 40

VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFK

AYSMSWIRQA PGKGLEWVSG ISNTGGSTDF 41

ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARLG YSGYDDRGMD VWGQGTLVTV SS VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG

SNYVYWYQQL PGTAPKLLIY GNSNRPSGVP 42

DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCQ SYDSSLSGPV VFGGGTKLTV LG

[00114] Em algumas modalidades, as moléculas de anticorpo anti- CTLA-4 descritas no presente documento também podem compreender uma ou ambas as regiões constantes apresentadas na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE REGIÕES CONSTANTES DE

ANTICORPOS DIVULGADOS NO PRESENTE DOCUMENTO SEQ. ID. Região Sequência NO:

CH ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV 43

SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

CL QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAG VETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPT 44

ECS

[00115] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- CTLA-4 é uma molécula codificada por uma dentre as sequências de nucleotídeos apresentadas na Tabela 4 abaixo.

28 / 115 TABELA 4: SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS ESPECÍFICAS QUE CODIFICAM MOLÉCULAS DE ANTICORPO ANTI-CTLA-4 Clone Codificação Sequência SEQ. ID. NO: Cadeia VH de 4-E03 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAC pesada de 4- AGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT E03 γ1 GGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGGTCCG

CCAGGCTCCCGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGC ATTAGTTGGAGTAGTCGTGACAAAGGCTATGCGGACTC TGTGAAGGGCCGTTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCA AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTACCACAGATCTCG CTAGGTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC TCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCC

AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCC 45

AGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT

CTCCGGGTAAATGA Cadeia leve VL de 4-E03 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGAC de 4-E03 λ CCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCA

GCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTAT CAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTA TGGTAATGATAACCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGAT TCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCC ATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTA CTGTGCAGTATGGGATGACAGCCTGAATGGTGTGGTAT

TCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTCAGCC 46

CAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTC TGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTC TCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCC TGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGG AGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTA CGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGT GGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCA TGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGA

29 / 115 Clone Codificação Sequência SEQ. ID. NO: Cadeia VH de 5-B07 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAC pesada de 5- AGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT B07 γ1 GGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCG

CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCT ATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCA AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGG TAGAGATGAACCAGTGGCTGGCCGACTGGGGCCAGGG TACACTGGTCACCGTGAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCA GGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG TGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTAC ATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGG

TGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC 47

TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAG CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT

ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Cadeia leve VL de 5-B07 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGAC de 5-B07 λ CCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCA

GCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTAT CAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTA TAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGAT TCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCC ATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTA CTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGT

TCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTCAGCC 48

30 / 115 Clone Codificação Sequência SEQ. ID. NO: Cadeia VH de 2-C06 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAC pesada de 2- AGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT C06 γ1 GGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCG

CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGT ATTAGTGGCAGCGGTGGGTACATACACTATGCAGACTC CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCA AGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGACCTATAGCA GTGGCCTGCATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGT ACACTGGTCACCGTGAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGT

GGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT 49

CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGG GGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCC CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC

ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Cadeia leve VL de 2-C06 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGAC de 2-C06 λ CCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCA

GCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTAT CAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTA TGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGGTCCCTGACCGAT TCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCC ATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTA CTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGT

TCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTCAGCC 50

31 / 115 Clone Codificação Sequência SEQ. ID. NO: Cadeia VH de 2-F09 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAC pesada de 2- AGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT F09 γ1 GGATTCACCTTCAAAGCCTATAGCATGAGCTGGATCCG

CCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGT ATCAGTAACACGGGAGGTAGCACAGACTTCGCAGACT CCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAG CCGAGGACACTGCCATGTATTACTGTGCGAGATTGGGA TATAGTGGCTACGACGACCGTGGTATGGACGTCTGGGG CCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGCCTCCACCA AGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGT CAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCG GCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC

AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACA AAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC 51

CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACA ACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA

ATGA Cadeia leve VL de 2-F09 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGAC de 2-F09 λ CCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCA

GCTCCAACATCGGAAGTAATTATGTGTACTGGTATCAG CAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGG TAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCT CTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATC AGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTG CCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTCCTGTGGTAT

TCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGTCAGCC 52

[00116] Em algumas modalidades, é vantajoso que a molécula de anticorpo se ligue tanto a CTLA-4 humano (hCTLA-4) quanto a CTLA-4 de

32 / 115 macaco cinomolgo (cmCTLA-4 ou cino CTLA-4). A reatividade cruzada com CTLA-4 expressa em células de macaco cinomolgo, também denominado macaco caranguejeiro ou Macaca fascicularis, pode ser vantajosa, uma vez que permite a testagem da molécula de anticorpo em macaco sem ter que usar um anticorpo substituto, que se concentra particularmente em tolerabilidade.

[00117] Em algumas modalidades, é vantajoso que a molécula de anticorpo se ligue tanto a CTLA-4 humano (hCTLA-4) quanto a CTLA-4 murino (mCTLA-4). Isso pode ser vantajoso, visto que o mesmo permite a testagem da molécula de anticorpo em camundongos, com foco particular no efeito e na farmacodinâmica, sem ter que usar um anticorpo substituto.

[00118] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo se liga a todos os três, hCTLA-4, cmCTLA-4 e mCTLA-4.

[00119] Em algumas modalidades, é necessário usar um anticorpo substituto para testar a atividade funcional de uma molécula de anticorpo em modelos in vivo relevantes em camundongos. Para garantir a comparabilidade entre o efeito da molécula de anticorpo em seres humanos e os resultados in vivo para o anticorpo substituto em camundongos, é essencial selecionar um anticorpo substituto funcionalmente equivalente com as mesmas características in vitro da molécula de anticorpo humano.

[00120] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo não se liga à CD28 humana.

[00121] É conhecido pela pessoa versada em medicina que os medicamentos podem ser modificados com diferentes aditivos, por exemplo, para alterar a taxa em que o medicamento é absorvido pelo organismo; e pode ser modificado de diferentes formas, por exemplo, para permitir uma via de administração específica para o corpo.

[00122] Consequentemente, inclui-se que as moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células descritos no presente documento podem ser combinados com um excipiente, carreador,

33 / 115 diluente, veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável em uma composição farmacêutica. Nesse contexto, o termo "composição farmacêutica" pode ser usado indistintamente com os termos preparação farmacêutica, formulação farmacêutica, composição terapêutica, preparação terapêutica, formulação terapêutica e entidade terapêutica.

[00123] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem compreender, ou em algumas modalidades consistem em, moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus ou células.

[00124] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem, em algumas modalidades, consistir em, ou compreender, plasmídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as moléculas de anticorpo descritas acima ou que compreendem as sequências de nucleotídeos descritas acima.

[00125] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam partes de, ou uma, molécula de anticorpo completa descrita no presente documento integrada em uma célula ou genoma viral ou em um virioma. A composição farmacêutica pode, então, compreender uma célula ou um vírus como um veículo de entrega para um anticorpo da invenção (ou um veículo de entrega para uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo da invenção). Por exemplo, em uma modalidade, o vírus pode estar sob a forma de um vírus oncolítico terapêutico que compreende sequências de nucleotídeos que codificam pelo menos uma dentre as moléculas de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo IgG humano comprimento completo. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam uma molécula de anticorpo de scFv, Fab ou F(ab’)2.

34 / 115

[00126] Conforme descrito nas reivindicações anexas, em uma modalidade, a invenção se refere a um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção ou um plasmídeo de acordo com a invenção. De preferência, o vírus é um vírus oncolítico, tal como um vírus oncolítico terapêutico. Conforme usado no presente documento, o termo “oncolítico” se refere à capacidade de um vírus de se replicar seletivamente em células em divisão (por exemplo, uma célula proliferativa, tal como uma célula cancerígena) com o objetivo de retardar o crescimento e/ou lisar a dita célula em divisão, in vitro ou in vivo, enquanto mostra nenhuma ou mínima replicação em células sem divisão (por exemplo, normais ou saudáveis). “Replicação” (ou qualquer forma de replicação, tais como “replicar” e “que replica”, etc.) significa a duplicação de um vírus que pode ocorrer no nível do ácido nucleico ou, preferencialmente, no nível da partícula viral infecciosa. Esse vírus oncolítico pode ser obtido a partir de qualquer membro do vírus identificado no momento. Pode ser um vírus nativo que é naturalmente oncolítico ou pode ser geneticamente modificado por meio da modificação de um ou mais genes virais de modo a aumentar a seletividade do tumor e/ou a replicação preferencial em células em divisão, tais como aquelas envolvidas na replicação do DNA, metabolismo do ácido nucleico, tropismo de hospedeiro, adesão à superfície, virulência, lise e disseminação (consultar, por exemplo, Wong et al., 2010, Viruses 2: 78 a 106). Pode-se, também, considerar a colocação de um ou mais genes virais sob o controle de eventos ou elementos reguladores específicos para tecido (por exemplo, promotor). Vírus oncolíticos exemplificativos incluem, sem limitação, reovírus, vírus Seneca Valley (SVV), vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus herpes simplex (HSV), morbilivírus, adenovírus, poxvírus, retrovírus, vírus do sarampo, vírus espumoso, vírus alfa, lentivírus, vírus influenza, vírus Sinbis, vírus mixoma, rabdovírus, picornavírus, vírus de coxsackie, parvovírus ou similares. Os vírus são conhecidos pelas pessoas

35 / 115 versadas na técnica de medicina e virologia.

[00127] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico é obtido a partir de um vírus do herpes. Os Herpesviridae são uma grande família de vírus de DNA que compartilham uma estrutura comum e são compostos de genomas de DNA linear de filamento duplo relativamente grandes que codificam de 100 a 200 genes encapsidados dentro de um capsídeo icosaédrico que é envolvido por uma membrana de bicamada lipídica. Embora o vírus do herpes oncolítico possa ser derivado de diferentes tipos de HSV, HSV1 e HSV2 são particularmente preferenciais. O vírus do herpes pode ser geneticamente modificado de modo a restringir a replicação viral em tumores ou reduzir sua citotoxicidade em células sem divisão. Por exemplo, qualquer gene viral envolvido no metabolismo do ácido nucleico pode ser inativado, tal como timidina quinase (Martuza et al., 1991, Science 252: 854 a 856), ribonucleotídeo redutase (RR) (Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54:

3.363 a 3.666) ou uracil-N-glicosilase (Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4.963 a

4.972). Outro aspecto envolve mutantes virais com defeitos na função de genes que codificam fatores de virulência, tal como o gene ICP34.5 (Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1.411 a 1415). Exemplos representativos de vírus do herpes oncolítico incluem NV1020 (por exemplo, Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1.119 a 1.128) e T-VEC (Harrington et al., 2015, Expert Rev. Anticancer Ther. 15(12): 1.389 a

1.403).

[00128] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico é obtido a partir de um adenovírus. Métodos estão disponíveis na técnica para projetar adenovírus oncolíticos. Uma estratégia vantajosa inclui a substituição de promotores virais por promotores seletivos de tumor ou modificações do produto (ou produtos) do gene adenoviral E1 para inativar sua função de ligação com p53 ou proteína de retinoblastoma (Rb) que são alterados em células tumorais. No contexto natural, o gene E1B55kDa do adenovírus

36 / 115 coopera com outro produto adenoviral para inativar p53 (p53 é, frequentemente, desregulado nas células cancerígenas), evitando, assim, a apoptose. Exemplos representativos de adenovírus oncolíticos incluem ONYX-015 (por exemplo, Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879 a 885) e H101 também denominado Oncorine (Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12):

1.666 a 1670).

[00129] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico é um poxvírus. Conforme usado no presente documento, o termo “poxvírus” se refere a um vírus pertencente à família Poxviridae, com uma preferência específica por um poxvírus pertencente à subfamília de Chordopoxviridae e, mais preferencialmente, ao gênero Ortopoxvírus. Vírus vaccinia, vírus da varíola bovina, vírus da varíola dos canários, vírus ectromelia, vírus mixoma são, particularmente, apropriados no contexto da invenção. As sequências genômicas de tais poxvírus estão disponíveis na técnica e em bancos de dados especializados (por exemplo, Genbank sob o número de acesso NC_006998, NC_003663 ou AF482758.2, NC_005309, NC_004105, NC_001132, respectivamente).

[00130] Em modalidades específicas e preferenciais, esse poxvírus oncolítico é um vírus vaccinia oncolítico. Os vírus vaccinia são membros da família dos poxvírus caracterizados por um genoma de DNA de filamento duplo de 200 kb que codifica várias enzimas virais e fatores que permitem que o vírus se replique independentemente da maquinaria da célula hospedeira. A maioria das partículas do vírus vaccinia é intracelular (IMV para vírion maduro intracelular) com um único envoltório lipídico e permanece no citosol das células infectadas até a lise. A outra forma infecciosa é uma partícula com envoltório duplo (EEV para vírion com envoltório extracelular) que brota a partir da célula infectada sem lisá-la. Embora possa derivar de qualquer cepa de vírus vaccinia, as cepas Elstree, Wyeth, Copenhagen, Lister e Western Reserve são particularmente

37 / 115 preferenciais. A nomenclatura do gene usada no presente documento é da cepa de vaccinia Copenhagen, a menos que seja indicado de outra forma. No entanto, a correspondência entre Copenhagen e outras cepas de vaccinia está geralmente disponível na literatura.

[00131] De preferência, esse vírus vaccinia oncolítico é modificado alterando-se um ou mais genes virais. A dita modificação (ou modificações) conduz, preferencialmente, à ausência de síntese ou à síntese de uma proteína viral defeituosa, incapaz de assegurar a atividade da proteína produzida em condições normais pelo gene não modificado. Modificações exemplificativas são divulgadas na literatura com o objetivo de alterar genes virais envolvidos no metabolismo do DNA, virulência do hospedeiro, via de IFN (por exemplo, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5): 595 a 608) e similares. As modificações para alterar um lócus viral englobam a deleção, a mutação e/ou a substituição de um ou mais nucleotídeos (contíguos ou não) dentro do gene viral ou de seus elementos reguladores. A modificação (ou modificações) pode ser feita por meio de uma série de maneiras conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, usando-se técnicas recombinantes convencionais.

[00132] Mais preferencialmente, um tal vírus vaccinia oncolítico é modificado pela alteração do gene que codifica a timidina quinase (lócus J2R). A enzima timidina quinase (TK) está envolvida na síntese de desoxirribonucleotídeos. A TK é necessária para a replicação viral em células normais, visto que essas células geralmente têm baixa concentração de nucleotídeos, ao passo que é dispensável em células em divisão que contêm alta concentração de nucleotídeos.

[00133] Alternativamente ou em combinação, esse vírus vaccinia oncolítico é modificado alterando-se pelo menos um gene ou ambos os genes que codificam a ribonucleotídeo redutase (RR). No contexto natural, essa enzima catalisa a redução de ribonucleotídeos a desoxirribonucleotídeos, que representam uma etapa crucial na biossíntese de DNA. A enzima viral é

38 / 115 similar em estrutura de subunidade à enzima de mamífero, sendo composta por duas subunidades heterólogas, designadas por R1 e R2 codificadas respectivamente pelos lócus I4L e F4L. No contexto da invenção, o gene I4L (que codifica a subunidade grande R1) ou o gene F4L (que codifica a subunidade pequena R2) ou ambos podem ser inativados (por exemplo, conforme descrito no documento WO2009/065546 e Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1.361 a 1.371). Sequências para os genes J2R, I4L e F4L e suas localizações no genoma de vários poxvírus estão disponíveis em bancos de dados públicos.

[00134] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 2 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 2 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 2 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 2 acima.

[00135] Em algumas modalidades, tal vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NO:

21. Em algumas modalidades, tal vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 27 e SEQ. ID. NO: 28. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 33 e SEQ. ID. NO: 34. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 41 e SEQ. ID. NO: 42.

[00136] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende

39 / 115 sequências de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 4 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 4 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 4 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 4 acima.

[00137] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende SEQ. ID. NOs: 45 e 46. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende SEQ. ID. NOs: 47 e 48. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende SEQ. ID. NOs: 49 e 50. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende SEQ. ID. NOs: 51 e 52.

[00138] Alguns vírus oncolíticos têm capacidade para hospedar inserções de DNA grandes o suficiente para acomodar a integração de sequências de anticorpos humanos de comprimento completo. Os vírus vaccinia atenuados e os vírus Herpes Simplex são exemplos de vírus oncolíticos terapêuticos cujo genoma é suficientemente grande para permitir a integração de sequências de anticorpos IgG de comprimento completo (Chan, W. M. et al 2014 Annu Rev Virol 1(1): 119 a 141; Bommareddy, P. K., et al. 2018 Nat Rev Immunol 18(8): 498 a 513). Os anticorpos IgG de comprimento completo foram integrados com sucesso ao vírus vaccinia oncolítico, resultando na expressão e na liberação extracelular (produção) de anticorpos IgG de comprimento completo após a infecção de células hospedeiras suscetíveis a vírus, por exemplo, células cancerígenas (Kleinpeter, P., et al. 2016, Oncoimmunology 5(10): e1220467). Os adenovírus também podem ser geneticamente modificados para codificar anticorpos IgG de comprimento completo que sejam funcionalmente produzidos e secretados após a infecção

40 / 115 celular (Marino, N., et al. 2017 J Clin Invest 123 (6): 2.447 a 2.463).

[00139] Em uma modalidade preferencial, tal vírus oncolítico é um poxvírus (por exemplo, um vírus vaccinia) defeituoso para a atividade TK (resultante da alteração do lócus J2R) ou defeituoso para ambas as atividades TK e RR (resultante da alteração de ambos os lócus J2R e de pelo menos um dos lócus de codificação RR I4L e/ou F4L) e que compreende (a) sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NO: 21 ou (b) sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 27 e SEQ. ID. NO: 28 ou (c) sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 33 e SEQ. ID. NO: 34 ou (d) sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 41 e SEQ. ID. NO: 42.

[00140] Quando apropriado, pode ser vantajoso que a sequência de nucleotídeos (ou sequências de nucleotídeos) inserida no vírus oncolítico descrito no presente documento inclua elementos reguladores adicionais para facilitar a expressão, o fluxo e a atividade biológica. Por exemplo, um peptídeo-sinal pode ser incluído para facilitar a secreção fora da célula produtora (por exemplo, célula infectada). O peptídeo-sinal é, tipicamente, inserido no terminal N do polipeptídeo codificado imediatamente após o iniciador Met. A escolha de peptídeos-sinal é ampla e está acessível às pessoas versadas na técnica. Por exemplo, os peptídeos-sinal originários de outra imunoglobina (por exemplo, uma IgG de cadeia pesada) podem ser usados no contexto da invenção para permitir a secreção do anticorpo anti- CTLA4 descrito no presente documento fora da célula produtora. Para fins ilustrativos, pode-se referir à SEQ ID NO: 53 e à SEQ ID NO: 54 que compreendem a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo 4-E03 descrito no presente documento equipado com sinais de peptídeos originários de IgG.

[00141] Um vírus oncolítico particularmente preferencial é um vírus vaccinia (por exemplo, cepa Copenhagen) defeituoso para ambas as atividades TK e RR (resultante da alteração de ambos os lócus J2R e I4L) e

41 / 115 que compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 20 e SEQ ID. NO: 21 ou SEQ. ID. NO: 53 e SEQ ID. NO: 54.

[00142] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico pode compreender, ainda, sequência (ou sequências) de nucleotídeos de interesse terapêutico, tal como sequência (ou sequências) de nucleotídeos que codificam polipeptídeo (ou polipeptídeos) imunomodulador (isto é, um polipeptídeo envolvido na estimulação de uma resposta imunológica direta ou indiretamente). Exemplos representativos de polipeptídeos imunomoduladores adequados incluem, sem qualquer limitação, citocinas e quimiocinas com uma preferência específica por fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos (GM-CSF) e particularmente ser humano, primata não humano ou GM-CSF murino. A sequência de nucleotídeos adicional pode ser facilmente obtida por meio de técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR, clonagem de cDNA, síntese química) com o uso de dados de sequência acessíveis na técnica e as informações fornecidas no presente documento. Um vírus oncolítico particularmente preferencial é um vírus vaccinia (por exemplo, cepa Copenhagen) defeituoso para ambas as atividades TK e RR (resultante da alteração de ambos os lócus J2R e I4L) e que compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ. ID. NO: 20 e SEQ. ID. NO: 21 ou SEQ. ID. NO: 53 e SEQ ID. NO: 54 e uma sequência de nucleotídeos que codifica um GM-CSF, com uma preferência específica para um GM-CSF humano (por exemplo, que tem SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56) ou um GM-CSF murino (por exemplo, que tem SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 58).

[00143] Além disso, as sequências de nucleotídeos a serem inseridas em tal vírus oncolítico podem ser otimizadas para fornecer um alto nível de expressão em uma célula hospedeira particular ou sujeito, modificando-se um ou mais códons. Além da otimização do uso de códons, várias modificações também podem ser consideradas de modo a evitar o agrupamento de códons

42 / 115 raros e não ideais presentes em áreas concentradas e/ou para suprimir ou modificar elementos de sequência “negativa” que se espera que influenciem negativamente níveis de expressão. Esses elementos de sequência negativa incluem, sem limitação, as regiões com teor de GC muito alto (>80%) ou muito baixo (<30%); trechos de sequência ricos em AT ou ricos em GC; sequências de repetição direta ou invertida instáveis; estruturas secundárias de RA; e/ou elementos reguladores criptográficos internos, tais como caixas de TATA internas, chi-sítios, sítios de entrada de ribossomo e/ou sítios doadores/aceitadores de splicing.

[00144] Em algumas modalidades, a sequência (ou sequências) de nucleotídeos são colocadas sob o controle de elementos reguladores adequados para a sua expressão adequada em uma célula hospedeira ou sujeito. Conforme usado no presente documento, o termo “elementos reguladores” se refere a qualquer elemento que permite, contribui ou modula a expressão da sequência (ou sequências) de nucleotídeos de codificação em uma determinada célula hospedeira ou sujeito, incluindo sua replicação, duplicação, transcrição, splicing, tradução, estabilidade e/ou transporte dentro ou fora da célula de expressão. Será observado por pessoas versadas na técnicas que a escolha dos elementos reguladores pode depender de fatores, tal como a própria sequência de nucleotídeos, o vírus no qual é inserida, a célula hospedeira ou sujeito, o nível de expressão desejado, etc. O promotor é de especial importância. No contexto da invenção, pode ser a expressão de direção constitutiva da sequência de nucleotídeos que controla em muitos tipos de células hospedeiras ou específicas para certas células hospedeiras ou reguladas em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (por exemplo, por temperatura, aditivo nutriente, hormônio, etc.) ou de acordo com a fase de um ciclo viral (por exemplo, tardio ou precoce). Os promotores adaptados à expressão mediada por vírus são conhecidos na técnica. Exemplos representativos para expressão por um poxvírus oncolítico incluem,

43 / 115 sem limitação, os promotores de vaccinia p7.5K, pH5.R, p11K7.5, TK, p28, p11, pB2R, pA35R, K1L e pSE/L (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1):18 a 28; Orubu et al. 2012, PloS One 7: e40167), promotores quiméricos precoces/tardios e promotores sintéticos (Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23: 1.094 a 1097; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135 a 138; e Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151 a158). Em modalidades preferenciais, as sequências de nucleotídeos das cadeias leve e pesada do anticorpo descrito no presente documento são, respectivamente, colocadas sob o controle de promotores com a mesma força de transcrição e, preferencialmente, sob o controle do mesmo promotor (por exemplo, p7.5K, tal como aquele descrito na SEQ ID NO: 59 ou pH5.R, tal como aquele descrito na SEQ ID NO: 60) para obter um nível similar de expressão para ambas as cadeias e, portanto, uma montagem ideal do anticorpo como uma proteína heterotetramérica (isto é, para evitar o excesso de cadeia não associada). A sequência de nucleotídeos adicional (por exemplo, codificação de GM-CSF) pode ser colocada sob um promotor diferente (por exemplo, pSE/L, tal como aquele descrito na SEQ ID NO: 61).

[00145] A inserção da sequência (ou sequências) de nucleotídeos (possivelmente equipada com elementos reguladores apropriados) no genoma de um tal vírus oncolítico é feita por meios convencionais, utilizando enzimas de restrição apropriadas ou, preferencialmente, por meio de recombinação homóloga. A sequência (ou sequências) de nucleotídeos pode ser inserida independentemente em qualquer localização do genoma viral. Vários sítios de inserção podem ser considerados, por exemplo, em um gene viral não essencial, em uma região intergênica ou em uma porção não codificadora do genoma de tal vírus oncolítico. O lócus J2R e/ou o lócus I4L são particularmente apropriados para um vírus oncolítico que é um poxvírus (por exemplo, um vírus vaccinia oncolítico). Após a inserção da sequência (ou sequências) de nucleotídeos no genoma viral, o lócus viral no sítio de inserção

44 / 115 pode ser deletado pelo menos parcialmente. Em uma modalidade, esta deleção ou deleção parcial pode resultar na expressão suprimida do produto do gene viral codificado pelo lócus total ou parcialmente deletado, resultando em um vírus defeituoso para a dita função do vírus. Um vírus oncolítico particularmente preferencial é um vírus vaccinia defeituoso TK e/ou RR que compreende o cassete que codifica a cadeia pesada inserida no lócus J2R e o cassete que codifica a cadeia leve inserido no lócus I4L. O cassete que codifica a sequência de nucleotídeos que codifica GM-CSF adicional pode ser inserido em outro local do genoma viral ou no lócus J2R ou I4L, com preferência pela inserção no lócus I4L.

[00146] A presente invenção também fornece um método para gerar tal vírus oncolítico descrito no presente documento, e particularmente um poxvírus oncolítico, em uma célula hospedeira adequada (célula produtora). Em algumas modalidades, tal método compreende uma ou mais etapas de recombinação homóloga entre um genoma de vírus e um plasmídeo de transferência que compreende a sequência (ou sequências) de nucleotídeos a ser inserida (possivelmente com elementos reguladores) flanqueados em 5’ e 3’ com as sequências virais que se apresentam, respectivamente, a montante e a jusante do sítio de inserção. O dito plasmídeo de transferência pode ser gerado e introduzido na célula hospedeira por meio de técnicas de rotina (por exemplo: por meio de transfecção). O genoma do vírus pode ser introduzido na célula hospedeira por meio de infecção. O tamanho de cada sequência viral flanqueadora pode variar de pelo menos 100 pb e no máximo 1.500 pb em cada lado da sequência de nucleotídeos (preferencialmente, de 200 a 550 pb e, mais preferencialmente, de 250 a 500 pb). A recombinação homóloga que permite gerar um tal vírus oncolítico é, preferencialmente, realizada em linhagens celulares em cultura (por exemplo, HeLa, Vero) ou em células de fibroblastos embrionários de galinha (CEF) obtidas de ovos embrionados.

[00147] Em algumas modalidades, a identificação do vírus oncolítico

45 / 115 que incorporou as sequências de nucleotídeos que codificam anti-CTLA4 e possivelmente a sequência de nucleotídeos adicional (por exemplo, GM-CSF) pode ser facilitada pelo uso de uma seleção e/ou de um gene detectável. Em modalidades preferenciais, o plasmídeo de transferência compreende, ainda, um marcador de seleção com uma preferência específica para o gene GPT (que codifica uma guanina fosforibosil transferase) permitindo o crescimento em um meio seletivo (por exemplo, na presença de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina) ou um gene detectável que codifica um produto gênico detectável, tal como GFP, e-GFP ou mCherry. Além disso, o uso de uma endonuclease capaz de fornecer uma quebra de filamento duplo na dita seleção ou gene detectável também pode ser considerado. A dita endonuclease pode estar sob a forma de uma proteína ou expressa por um vetor de expressão.

[00148] Uma vez gerado, esse vírus oncolítico pode ser amplificado em uma célula hospedeira adequada com o uso de técnicas convencionais, incluindo a cultura da célula hospedeira transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção e a recuperação de partículas infecciosas.

[00149] A presente invenção também se refere a um método para produzir o vírus oncolítico descrito no presente documento. De preferência, o dito método compreende as etapas de a) preparar uma linhagem celular produtora, b) transfectar ou infectar a linhagem celular produtora preparada com o vírus oncolítico, c) cultivar a linhagem celular produtora transfectada ou infectada sob condições adequadas de modo a permitir a produção do vírus, d) recuperar o vírus produzido a partir da cultura da dita linhagem celular produtora e, opcionalmente, e) purificar o dito vírus recuperado.

[00150] Em algumas modalidades, a célula produtora é selecionada a partir do grupo que consiste em células de mamíferos (por exemplo, humanas ou não humanas), tais como células HeLa (por exemplo, ATCC-CRM-CCL-

46 / 115 2TM ou ATCC-CCL-2.2TM), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1.909 a 1.917), linhagens celulares de hamster, tal como BHK- 21 (ATCC CCL-10), etc. e células aviárias, tais como as descritas nos documentos WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075, bem como um fibroblasto de embrião de galinha primário (CEF) preparado a partir de embriões de galinha obtidos de ovos fertilizados. As células produtoras são, preferencialmente, cultivadas em um meio apropriado que pode, se necessário, ser suplementado com soro e/ou fator (ou fatores) de crescimento adequado ou não (por exemplo, um meio quimicamente definido, preferencialmente, livre de produtos derivados de animais ou seres humanos). Um meio apropriado pode ser facilmente selecionado por pessoas versadas na técnicas dependendo das células produtoras. Esses meios estão comercialmente disponíveis. As células produtoras são, preferencialmente, cultivadas a uma temperatura compreendida entre +30 °C e +38 °C (mais preferencialmente a aproximadamente + 37 °C) por entre 1 e 8 dias antes da infecção. Se necessário, várias passagens de 1 a 8 dias podem ser feitas para aumentar o número total de células.

[00151] Na etapa b), as células produtoras são infectadas pelo vírus oncolítico sob condições apropriadas com o uso de uma multiplicidade de infecção (MOI) apropriada para permitir a infecção produtiva das células produtoras. Para fins ilustrativos, uma MOI apropriada está na faixa de 10-3 a 20, com preferência específica para uma MOI que compreenda de 0,01 a 5 e, mais preferencialmente, de 0,03 a 1. A etapa de infecção é realizada em um meio que pode ser igual ou diferente do meio usado para a cultura de células produtoras.

[00152] Na etapa c), as células produtoras infectadas são, então, cultivadas em condições apropriadas bem-conhecidas pelas pessoas versadas na técnica até que sejam produzidas partículas de vírus descendentes. A

47 / 115 cultura de células produtoras infectadas também é realizada, preferencialmente, em um meio que pode ser igual ou diferente do meio/meios usados para a cultura de células produtoras e/ou para a etapa de infecção, a uma temperatura entre + 32 °C e + 37 °C, por 1 a 5 dias.

[00153] Na etapa d), as partículas de vírus produzidas na etapa c) são coletadas do sobrenadante da cultura e/ou das células produtoras. A recuperação das células produtoras pode exigir uma etapa que permita o rompimento da membrana celular produtora para permitir a liberação do vírus. A ruptura da membrana celular produtora pode ser induzida por várias técnicas bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, incluindo, mas sem limitação, o congelamento/descongelamento, a lise hipotônica, a sonicação, a microfluidização, a homogeneização de alto cisalhamento (também denominada de alta velocidade) ou a homogeneização de alta pressão.

[00154] O vírus oncolítico recuperado pode ser, pelo menos parcialmente, purificado antes de ser distribuído em doses e usado, conforme descrito no presente documento. Um grande número de etapas e métodos de purificação está disponível na técnica, incluindo, por exemplo, a clarificação, o tratamento enzimático (por exemplo, endonuclease, protease, etc.), as etapas cromatográficas e filtrantes. Métodos apropriados são descritos na técnica (consultar, por exemplo, os documentos WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).

[00155] Em uma modalidade, a presente invenção também fornece uma célula infectada com o vírus oncolítico descrito no presente documento.

[00156] A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem um vírus, tal como um vírus oncolítico, conforme discutido acima, e um diluente, veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00157] A composição farmacêutica pode, em algumas modalidades, estar sob a forma de uma célula CAR-T, transportando partes ou as

48 / 115 sequências de anticorpo completas descritas no presente documento como parte da codificação de sequências para seu receptor de células T de antígeno quimérico.

[00158] A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem uma célula CAR-T, conforme discutido acima, e um diluente, veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00159] A invenção também compreende outras modalidades terapêuticas, ou “formatos” de fármacos, tais como conjugados de fármacos de anticorpos, proteínas de fusão, etc., e a composição farmacêutica que compreende tais modalidades terapêuticas.

[00160] As moléculas de anticorpo, as sequências de nucleotídeos, os plasmídeos, os vírus, as células e/ou as composições farmacêuticas descritos no presente documento podem ser adequados para a administração parenteral, incluindo soluções de injeção estéreis aquosas e/ou não aquosas que podem conter antioxidantes, e/ou tampões, e/ou bacteriostáticos, e/ou solutos que rendem a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido; e/ou suspensões estéreis aquosas e/ou não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e/ou agentes espessantes. As moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenados em uma condição desidratada por congelamento (ou seja, liofilizada) que exige apenas a adição do carreador líquido estéril, por exemplo, água para preparações injetáveis, imediatamente antes do uso.

[00161] Soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, e/ou grânulos e/ou comprimidos estéreis do tipo anteriormente descrito.

[00162] Para administração parenteral a pacientes humanos, o nível de dosagem diária da molécula de anticorpo anti-CTLA-4 será, geralmente,

49 / 115 de 1 mg/kg de peso corporal do paciente a 20 mg/kg ou, em alguns casos, até 100 mg/kg administrado em doses únicas ou divididas. Doses mais baixas podem ser usadas em circunstâncias especiais, por exemplo, em combinação com a administração prolongada. Em qualquer caso, o médico determinará a dosagem real que será mais adequada para qualquer paciente individual e variará com a idade, peso e resposta do paciente em particular. As dosagens acima são exemplificativas do caso médio. Pode, evidentemente, haver casos individuais em que sejam necessárias faixas de dosagem mais altas ou mais baixas, e tais faixas são abrangidas pelo escopo desta invenção.

[00163] Normalmente, uma composição farmacêutica (ou medicamento) descrita no presente documento que compreende uma molécula de anticorpo conterá a molécula de anticorpo anti-CTLA-4 a uma concentração entre aproximadamente 2 mg/ml e 150 mg/ml ou entre aproximadamente 2 mg/ml e 200 mg/ml. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas conterão a molécula de anticorpo anti-CTLA-4 a uma concentração de 10 mg/ml.

[00164] Normalmente, uma composição farmacêutica (ou medicamento) conterá o vírus oncolítico descrito no presente documento em uma concentração entre aproximadamente 103 a 1012 vp (partículas virais), iu (unidade infecciosa) ou pfu (unidades formadoras de placas), dependendo do vírus e da técnica quantitativa. A quantidade de pfu presente em uma amostra pode ser determinada contando-se o número de placas após a infecção de células permissivas (por exemplo, células CEF ou Vero) para obter um título de unidades formadoras de placa (pfu), a quantidade de vp medindo-se a absorvância de A260, e a quantidade de iu por imunofluorescência quantitativa, por exemplo, usando-se anticorpos antivirais. Como orientação geral, doses individuais que são adequadas para uma composição farmacêutica que compreende uma faixa de poxvírus oncolítico de aproximadamente 103 a aproximadamente 1010 pfu, vantajosamente de

50 / 115 aproximadamente 103 pfu a aproximadamente 109 pfu, preferencialmente de aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 108 pfu; e mais preferencialmente, de aproximadamente 104 pfu a aproximadamente 107 pfu.

[00165] Geralmente, em seres humanos, a administração oral ou parenteral das moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento é a via preferencial, sendo a mais conveniente. Para uso veterinário, as moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou as composições farmacêuticas descritos no presente documento são administradas como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal e o cirurgião veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração que será mais apropriada para um animal particular. Assim, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende uma quantidade de uma molécula de anticorpo, plasmídeo de sequências de nucleotídeos, vírus e/ou célula da invenção eficazes para tratar várias condições (conforme descrito acima e mais abaixo). De preferência, as moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento são adaptados para a entrega por uma via selecionada a partir do grupo que compreende: intravenosa; intratumoral; intramuscular; subcutânea. A administração pode ser sob a forma de uma única injeção ou várias injeções repetidas (por exemplo, com as mesmas ou diferentes doses, com as mesmas ou diferentes vias, no mesmo ou em diferentes sítios de administração). Para fins ilustrativos, doses individuais que compreendem aproximadamente 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 109, 5x109 ou 1010 pfu de um poxvírus oncolítico (por exemplo, o vírus vaccinia defeituoso TK e RR descrito no presente documento) são particularmente adequadas para a administração intratumoral.

[00166] A presente invenção também inclui moléculas de anticorpos,

51 / 115 sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento que compreendem sais de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitáveis das porções químicas de ligação de polipeptídeo da presente invenção.

Os ácidos que são usados para preparar os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de base supramencionados úteis nesta invenção são aqueles que formam sais de adição de ácido não tóxicos, isto é, sais que contêm ânions farmacologicamente aceitáveis, tais como sais de cloridrato, bromidrato, iodidrato, nitrato, sulfato, bissulfato, fosfato, ácido fosfático, acetato, lactato, citrato, ácido de citrato, tartarato, bitartarato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e sais de pamoato [isto é, 1,1’- metileno-bis-(2-hidróxi-3 naftoato)], entre outros.

Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para produzir formas de sal farmaceuticamente aceitáveis dos agentes de acordo com a presente invenção.

As bases químicas que podem ser usadas como reagentes para preparar sais de base farmaceuticamente aceitáveis dos presentes agentes que são de natureza ácida são aquelas que formam sais de base não tóxicos com tais compostos.

Tais sais básicos não tóxicos incluem, porém sem limitação, aqueles derivados de cátions farmacologicamente aceitáveis, tais como cátions de metais alcalinos (por exemplo, potássio e sódio) e cátions de metais alcalino-terrosos (por exemplo, cálcio e magnésio), sais de adição de amônio ou amina solúveis em água, tal como N-metilglucamina-(meglumina) e o alcanolamônio inferior e outros sais básicos de aminas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis, entre outros.

As moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células descritas no presente documento podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um carreador adequado antes do uso.

Qualquer método de liofilização adequado (por exemplo, secagem por aspersão, secagem de

52 / 115 massa) e/ou técnicas de reconstituição podem ser empregados. Será observado por pessoas versadas na técnicas que a liofilização e a reconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade de anticorpos (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a ter maior perda de atividade que os anticorpos IgG) e que os níveis de uso podem ter que ser ajustados para cima para compensar. Em uma modalidade, a porção química de ligação ao polipeptídeo liofilizado (desidratada por congelamento) perde não mais do que 20%, ou não mais do que 25%, ou não mais do que 30%, ou não mais do que 35%, ou não mais do que 40%, ou não mais do que 45%, ou não mais do que 50% da sua atividade (antes da liofilização) quando reidratados.

[00167] Em algumas modalidades, a composição viral é adequadamente tamponada a um pH fisiológico ou ligeiramente básico (por exemplo, de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9 com uma preferência específica para um pH compreendido entre 7 e 8,5 e, mais particularmente, próximo a 8). Pode ser benéfico incluir também na composição viral um sal monovalente de modo a assegurar uma pressão osmótica apropriada. O dito sal monovalente pode ser selecionado de forma notável a partir de NaCl e KCl, preferencialmente, o dito sal monovalente é NaCl, preferencialmente, em uma concentração de 10 a 500 mM (por exemplo, 50 mM). Uma composição viral adequada compreende sacarose 50 g/l, NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM e glutamato de sódio 10 mM, pH8. A composição também pode ser formulada de modo a incluir um crioprotetor para proteger o vírus oncolítico à baixa temperatura de armazenamento. Crioprotetores adequados incluem, sem limitação, sucrose (ou sacarose), trealose, maltose, lactose, manitol, sorbitol e glicerol, preferencialmente, em uma concentração de 0,5 a 20% (peso em g/volume em l, referido como p/v) também como polímeros de alto peso molecular, tal como dextrano ou polivinilpirrolidona (PVP).

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[00168] As moléculas de anticorpo anti-CTLA-4, sequências de nucleotídeos e composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser usadas no tratamento de câncer em um sujeito.

[00169] Inclui-se que o paciente pode ser mamífero ou não mamífero. De preferência, o sujeito mamífero é um ser humano ou um não mamífero, tal como um cavalo, ou uma vaca, ou uma ovelha, ou um porco, ou um camelo, ou um cão ou um gato. Com máxima preferência, o sujeito mamífero é um ser humano.

[00170] Por “exibir", inclui-se que o sujeito exiba um sintoma de câncer, e/ou um marcador de diagnóstico de câncer, e/ou o sintoma de câncer, e/ou um marcador de diagnóstico de câncer que podem ser medidos, e/ou avaliados, e/ou quantificados.

[00171] Seria prontamente evidente para a pessoa versada em medicina quais seriam os sintomas e os marcadores de diagnóstico de câncer e como medir, e/ou avaliar, e/ou quantificar se há uma redução ou aumento na gravidade dos sintomas de câncer ou uma redução ou aumento dos marcadores de diagnóstico de câncer; além de como esses sintomas e/ou marcadores de diagnóstico de câncer podem ser usados para formar um prognóstico para o câncer.

[00172] Os tratamentos contra o câncer são, frequentemente, administrados como um curso de tratamento, ou seja, o agente terapêutico é administrado por um período de tempo. A duração do tratamento dependerá de uma série de fatores, que podem incluir o tipo de agente terapêutico que é administrado, o tipo de câncer que é tratado, a gravidade do câncer que é tratado e a idade e saúde do sujeito, entre outras razões.

[00173] Por “durante o tratamento”, incluímos que o sujeito está atualmente recebendo um curso de tratamento, e/ou recebendo um agente terapêutico e/ou recebendo um curso de um agente terapêutico.

[00174] Em algumas modalidades, o câncer a ser tratado, de acordo

54 / 115 com a presente invenção, é um tumor sólido.

[00175] Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em tumor sólido avançado, melanoma e outras neoplasias malignas da pele, sarcoma sinovial, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de pulmão de células pequenas (SCLC), câncer de bexiga, câncer de próstata, mesotelioma, câncer de ovário, câncer de mama, câncer de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer de cabeça e pescoço e câncer colorretal.

[00176] Cada um dos cânceres descritos acima é bem conhecido, e os sintomas e marcadores de diagnóstico de câncer são bem descritos, assim como o são os agentes terapêuticos usados para tratar esses cânceres. Por conseguinte, os sintomas, marcadores de diagnóstico de câncer e agentes terapêuticos usados para tratar os tipos de câncer acima mencionados seriam conhecidos pelos versados em medicina.

[00177] As definições clínicas do diagnóstico, prognóstico e progressão de um grande número de cânceres dependem de determinadas classificações conhecidas como estadiamento. Esses sistemas de estadiamento atuam para agrupar vários marcadores de diagnóstico de câncer e sintomas de câncer para fornecer um resumo do diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão do câncer. É conhecido pela pessoa versada em oncologia como avaliar o diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão do câncer usando um sistema de estadiamento e quais marcadores de diagnóstico e sintomas de câncer devem ser usados para fazer isso.

[00178] Por “estadiamento do câncer”, inclui-se o estadiamento Rai, que inclui o estágio 0, estágio I, estágio II, estágio III e estágio IV, e/ou o estadiamento Binet, que inclui o estágio A, estágio B e estágio C, e/ou o estadiamento de Ann Arbor, que inclui os estágios I, II, III e IV.

[00179] Sabe-se que o câncer pode causar anormalidades na morfologia das células. Essas anormalidades geralmente ocorrem de maneira

55 / 115 reproduzível em certos tipos de câncer, o que significa que o exame dessas alterações na morfologia (também conhecido como exame histológico) pode ser usado no diagnóstico ou prognóstico do câncer. Técnicas para visualizar amostras para examinar a morfologia das células e preparar amostras para visualização são bem-conhecidas na técnica; por exemplo, microscopia de luz ou microscopia confocal.

[00180] Por “exame histológico”, inclui-se a presença de pequenos linfócitos maduros e/ou a presença de pequenos linfócitos maduros com uma borda estreita do citoplasma, a presença de pequenos linfócitos maduros com um núcleo denso sem núcleos discerníveis, e/ou a presença de pequenos linfócitos maduros com uma borda estreita do citoplasma, e com um núcleo denso sem nucléolos discerníveis, e/ou a presença de células atípicas, e/ou células clivadas, e/ou prolinfócitos.

[00181] Sabe-se que o câncer é resultado de mutações no DNA da célula, que podem levar a célula a evitar a morte celular ou a proliferar incontrolavelmente. Portanto, o exame dessas mutações (também conhecido como exame citogenético) pode ser uma ferramenta útil para avaliar o diagnóstico e/ou prognóstico de um câncer. Um exemplo disso é a exclusão da localização cromossômica 13q14.1, que é característica da leucemia linfocítica crônica. As técnicas para examinar mutações nas células são bem- conhecidas na técnica; por exemplo, hibridização fluorescente in situ (FISH).

[00182] Por “exame citogenético”, inclui-se o exame do DNA em uma célula e, em particular, os cromossomos. O exame citogenético pode ser usado para identificar alterações no DNA que podem estar associadas à presença de câncer refratário e/ou câncer recidivado. Tais podem incluir: deleções no braço longo do cromossomo 13, e/ou a deleção do local cromossômico 13q14.1, e/ou trissomia do cromossomo 12, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 12, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 11, e/ou a deleção de 11q, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 6,

56 / 115 e/ou a deleção de 6q, e/ou deleções no braço curto do cromossomo 17, e/ou a deleção de 17p, e/ou a translocação t(11:14), e/ou a translocação (q13:q32), e/ou rearranjos de receptores de genes de antígenos e/ou rearranjos de BCL2, e/ou rearranjos de BCL6, e/ou translocações t(14:18), e/ou translocações t(11:14), e/ou translocações (q13:q32), e/ou translocações (3:v), e/ou translocações (8:14), e/ou translocações (8:v), e/ou translocações t(11:14) e (q13:q32).

[00183] Sabe-se que os sujeitos com câncer apresentam certos sintomas físicos, que muitas vezes são resultado da carga do câncer sobre o corpo. Esses sintomas geralmente reaparecem no mesmo câncer e, portanto, podem ser característicos do diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão da doença. Uma pessoa versada em medicina entende quais sintomas físicos estão associados a quais tipos de câncer e como a avaliação desses sistemas físicos pode se correlacionar com o diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão da doença. Por “sintomas físicos”, inclui-se hepatomegalia e/ou esplenomegalia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00184] Nos exemplos abaixo, é feita referência às seguintes Figuras: FIGURA 1: ANTICORPOS DA INVENÇÃO QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE A CTLA-4

[00185] Os anticorpos demonstraram se ligar por ELISA ao CTLA-4 humano e de cinomolgo, mas não à proteína CD28 humana. A ligação a 2- C06 (Figura 1A), 4-E-03 (Figura 1B), 5-B07 (Figura 1C) foi comparada com Yervoy (Figura 1D). FIGURA 2: LIGAÇÃO DEPENDENTE DA DOSE DE MAB ANTI-CTLA-4 A CÉLULAS TRANSFECTADAS COM HCTLA-4

[00186] O mAb anti-CTLA-4 (Figuras 2A a 2D) mostra forte ligação às células 293T que expressam CTLA-4 similares a Yervoy (Figura 2E). FIGURA 3: O MAB ANTI-CTLA-4 SE LIGA A CÉLULAS T CD4+

57 / 115

HUMANAS ATIVADAS IN VITRO

[00187] As células T CD4+ obtidas a partir de sangue humano periférico foram estimuladas in vitro. A ligação do mAb anti-CTLA-4 (linhas contínuas, fileira superior) foi analisada por FACS e comparada com Yervoy (linha pontilhada, fileira superior) e um anticorpo FACS comercial (fileira inferior). FIGURA 4: BLOCO DE LIGAÇÃO EM CÉLULAS T CD4+ ATIVADAS

IN VITRO

[00188] Células T CD4+ ativadas in vitro humanas foram coradas com mAb anti-CTLA-4 marcado com Alexa 647 (linha preta). A ligação do anticorpo foi bloqueada pela proteína rhCTLA-4-Fc (linha cinza). FIGURA 5: LIGAÇÃO A CÉLULAS T CD4+ CINOMÓLOGAS

ATIVADAS IN VITRO

[00189] As células T CD4+ obtidas a partir de sangue cinomólogo periférico foram estimuladas in vitro com esferas magnéticas de CD3/CD28. A ligação do mAb anti-CTLA-4 (linhas contínuas, fileira superior) foi analisada por FACS e comparada com Yervoy (linha pontilhada, fileira superior) e um anticorpo FACS comercial (fileira inferior). FIGURA 6: BLOCO DE LIGAÇÃO CELULAR PELA PROTEÍNA CTLA-4

HUMANA E CINOMÓLOGA

[00190] As células 293T-CTLA-4 foram coradas com mAb anti- CTLA-4 marcado com Alexa 647 (linha preta). A ligação do anticorpo foi bloqueada pela proteína rhCTLA-4-Fc (linha cinza claro) e proteína rcmCTLA-4-Fc (linha cinza escuro). FIGURA 7: LIGAÇÃO A CÉLULAS 293T QUE EXPRESSAM CTLA-4

CINOMÓLOGO

[00191] As células 293T foram transitoriamente transfectadas com CTLA-4 cinomólogo e a ligação do mAb anti-CTLA-4 em diferentes concentrações foi analisada por FACS.

58 / 115 FIGURA 8: FALTA DE LIGAÇÃO ESPERADA PARA PBMCS HUMANAS/CINOMÓLOGAS EM REPOUSO

[00192] 4-E03 - bem como 2-C06, 5-B07 e 2-F09 (dados não mostrados) - não mostram qualquer ligação inespecífica a diferentes subconjuntos de células em PBMCs humanas (fileira superior) e cinomólogas (fileira inferior) conforme analisado por FACS. FIGURA 9: FALTA ESPERADA DE ATIVIDADE AGONÍSTICA DIRETA

[00193] Células T CD4+ marcadas com CFSE de doadores saudáveis foram estimuladas com antiCD3 revestido mais mAb anti-CTLA-4 solúvel ou antiCD28. % de células em divisão (células CD25+ CFSElow) foram determinadas após 3 dias por FACS. (A) gráficos de FACS de um experimento representativo (B) que resume o gráfico de 6 doadores. FIGURA 10: ATIVIDADE DE BLOQUEIO DE CD80/CD86

[00194] O mAb anti-CTLA-4 bloqueia a ligação de CD80 (Figura 8A) e CD86 (Figura 8b) ao seu ligante CTLA-4, conforme mostrado por ELISA. FIGURA 11: BLOQUEIO DE LIGANTE FUNCIONAL IN VITRO

[00195] PBMCs foram estimuladas com SEB mais doses de titulação de anticorpos anti-CTLA-4. A quantidade de IL-2 secretada no sobrenadante foi determinada por MSD. Nesta Figura, 1 doador representativo de 6 é mostrado. FIGURA 12: ENSAIO ADCC EM CÉLULAS T CD4+ ATIVADAS IN

VITRO

[00196] Células T CD4+ ativadas in vitro de doadores saudáveis pré- opsonizados com mAbs anti-CTLA-4 a 10 µg/ml foram cocultivadas com células NK (linhagem celular NK-92) na razão de 2:1. A atividade de ADCC foi avaliada por FACS, conforme descrito abaixo. A Figura mostra a média + SD de 4 a 8 doadores. FIGURA 13: CTLA-4 É A MAIS EXPRESSA EM CÉLULAS TREG RESIDENTES EM TUMOR.

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[00197] Amostras de tumores ovarianos recentemente excisados e de sangue foram obtidas de pacientes na cirurgia. A ascite foi coletada de pacientes com diferentes indicações de câncer. A expressão de CTLA neste material de paciente foi comparada com PBMCs saudáveis. As amostras de tumor foram picadas e assimiladas. As células mononucleares de sangue periférico foram separadas por centrifugação. A expressão de CTLA-4 foi avaliada em células Treg CD4+ CD25+CD127-, células não Treg CD4+ e células T efetoras CD8+ por citometria de fluxo. Os dados representam pacientes/dadores individuais com n=12 para PBMCs saudáveis, n=20 para ascite, n=9 para tumor e n=5 para sangue do paciente.

[00198] A expressão de CTLA-4 também foi analisada em células T humanas que foram ativadas em camundongos NOG in vivo e, então, isoladas do baço desses camundongos (consultar a Figura 14). FIGURA 14: O MAB ANTI-CTLA-4 MEDEIA A DEPLEÇÃO DE TREG IN VIVO.

[00199] PBMCs humanas foram injetadas i.v. em camundongos NOG. Após aproximadamente 2 semanas, foram retirados baços e a expressão de CTLA-4 em células Treg humanas e em células T CD8+ foi analisada por FACS. As células esplênicas isoladas de camundongos NOG foram transferidas i.p. para camundongos SCID. 1 h depois, os camundongos foram tratados i.p. com CTLA-4 hIgG1 ou mAb de controle. O fluido intraperitoneal foi coletado após 24 h e a frequência de subconjuntos de células T humanas (14A: células Tregs e 14B: células T CD8+) foi determinada por citometria de fluxo. FIGURA 15: TABELA QUE RESUME AS CARACTERÍSTICAS PARA ANTICORPOS ANTI-CTLA-4 FIGURA 16: CARACTERIZAÇÃO DO MAB ANTI-CTLA-4

SUBSTITUTO DE CAMUNDONGO

[00200] FIGURAS 16A A 16B: ELISAS DE BLOQUEIO FORAM

60 / 115 REALIZADOS COM M5-B07 PARA AVALIAR AS CARACTERÍSTICAS DE BLOQUEIO DE LIGANTE. O anticorpo bloqueia a ligação da Figura 16A) CD80 e da Figura 16B) CD86 ao seu ligante CTLA-4 de uma maneira dependente da dose.

[00201] Figuras 16C e 16D: 5-B07 em deleção de Treg mediada pelo formato de IgG2a de camundongo no modelo de tumor de CT26. Camundongos Balb/c foram injetados, por via subcutânea, com 1x106 células CT26 e o tratamento foi iniciado com tumor de tamanho de cerca de 7x7 mm. Após 3 injeções de 10 mg/kg de anticorpo, as suspensões de células tumorais individuais foram analisadas quanto ao teor de células imunes por FACS. Figura 16C: o anticorpo substituto 5-B07 que bloqueia o ligante causa depleção de Treg. Isso causa uma mudança na razão de células T CD8+/Treg, conforme representado na Figura 16D. FIGURA 17: GERAÇÃO DE COPTG19384 E COPTG19385

[00202] Representação esquemática de COPTG19384 e COPTG19385 usados neste estudo. COPTG19385 contém uma deleção do gene J2R no lócus TK substituído pela cadeia pesada de anti-CTLA-4 conduzida por p7.5K e uma deleção do gene I4L no lócus RR substituído pela cadeia leve de anti-CTLA-4 conduzida por p7.5K. COPTG19384 contém uma deleção do gene J2R no lócus TK substituído pela cadeia pesada do anti-CTLA-4 conduzido por p7.5K, e uma deleção do gene I4L no lócus RR substituído pela cadeia leve do anti-CTLA-4 conduzido por p7.5K e por GM-CSF conduzido por pSE/L. FIGURA 18: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL 4-E03 EM SOBRENADANTE DE CÉLULAS CEF INFECTADAS COM COPTG19384 A) por Western Blot: células CEF foram infectadas em MOI a 0,05 com COPTG19384 em triplicado. Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 48 h e foram analisados por WB após uma eletroforese em

61 / 115 condição não redutora e usando-se um anticorpo conjugado com HRP anti-Ig (blot à esquerda) ou anticadeia leve (blot à direita). B) por ELISA: células CEF foram infectadas em MOI 0,05 com COPTG19384 em triplicado ou VVTG17137. Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 48 h e foram analisados por ELISA para detecção de qualquer anticorpo monoclonal 4-E03. FIGURA 19: ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GM-CSF EM

SOBRENADANTE DE CÉLULAS CEF INFECTADAS COM COPTG19384 POR ELISA

[00203] As células CEF foram infectadas em MOI a 0,05 com estoque de pesquisa primário COPTG19384 em triplicado ou VVTG17137. Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 48 h e foram analisados por ELISA para detecção de GM-CSF. FIGURA 20: ESTUDOS DE REPLICAÇÃO DE COP WT, COPTG19384 (DOIS LOTES) E VVTG17137 (DOIS LOTES) EM HEPATÓCITOS

NORMAIS E TUMORAIS A) Taxa de replicação em hepatócitos humanos normais. B) Taxa de replicação em HepG2 maligno. C) Índices terapêuticos calculados a partir das taxas de replicação medidas em HepG2 e hepatócitos. FIGURA 21: REPLICAÇÃO DE COPTG19384 E VVTG17137 EM PELE

HUMANA RECONSTRUÍDA

[00204] A replicação de COPTG19384 e VVTG17137 foram avaliadas após 7 dias e com inóculos que variam de 10 a 105 pfu. Os resultados são as médias e SEM de três medições. FIGURA 22: ATIVIDADES ONCOLÍTICAS DE COPTG19384 E VVTG17137 EM TRÊS LINHAGENS CELULARES TUMORAIS HUMANAS: MIA PACA-2 (A), LOVO (B) E HEPG2 (C) FIGURA 23: NÍVEL DE EXPRESSÃO TANTO DE ANTICORPO

62 / 115 MONOCLONAL 4-E03 QUANTO DE GM-CSF EM (A) SOBRENADANTES DE HEPG2 E LOVO INFECTADOS E (B) SOBRENADANTES DE 5 DIFERENTES LINHAGENS CELULARES

TUMORAIS HUMANAS INFECTADAS A) Os níveis de expressão de 4-E03 e GM-CSF foram avaliados após 5 dias de incubação, em MOI de 10-5 a 10-2 para COPTG19384 e em MOI de 10-2 para VVTG17137 usado como controle negativo. B) Os níveis de expressão de 4-E03 e GM-CSF foram avaliados 48 horas após a infecção por COPTG19384 em MOI a 0,05. FIGURA 24: LIGAÇÃO DE DIFERENTES LOTES DE 4-E03 À PROTEÍNA CTLA-4

[00205] A ligação de 4-E03 produzida de forma recombinante por células CHO (lote de pesquisa 4-E03) ou HEK (lote de 4-E03 tox) a proteína recombinante (A) humana e (B) de cinomolgo foi comparada à ligação de 4- E03 purificado a partir de sobrenadante de células tumorais MIA PaCa-2 infectadas (4-E03 TG) por ELISA. FIGURA 25: LIGAÇÃO DE DIFERENTES LOTES DE 4-E03 A CÉLULAS QUE EXPRESSAM CTLA-4

[00206] A ligação de 4-E03 produzido de forma recombinante por células CHO (lote de pesquisa 4-E03) ou HEK (lote 4-E03 tox) a células que expressam CTLA-4 (A) humanas e (B) de cinomolgo foi comparada com a ligação de 4-E03 purificado a partir do sobrenadante de células tumorais MIA PaCa-2 infectadas (4-E03 TG) por citometria de fluxo. FIGURA 26: CINÉTICA DE ACUMULAÇÃO DE VÍRUS EM TUMOR XENOENXERTADO COM LoVo

[00207] A cinética do acúmulo de vírus foi avaliada em tumor xenoenxertado com LoVo após uma única injeção i.t. de COPTG19384 ou VVTG17137 em duas doses diferentes (104 ou 105 pfu). As linhas contínuas ou tracejadas representam a média dos três valores determinados em cada

63 / 115 ponto de tempo. FIGURA 27: CINÉTICA DE MAB 4-E03 E ACUMULAÇÃO DE GM-CSF EM TUMOR XENOENXERTADO COM LoVo A) A cinética de acumulação de mAb 4-E03 em tumor xenoenxertado com LoVo foi avaliada após uma injeção única i.t. de qualquer um dentre COPTG19384 ou VVTG17137 em duas doses diferentes (104 ou 105 pfu) ou depois de uma única injeção i.p. de 3 mg/kg de anticorpo monoclonal 4-E03. As linhas contínuas ou tracejadas representam a média dos três valores. B) A cinética da acumulação de GM-CSF em tumor xenoenxertado com LoVo foi avaliada após uma única injeção i.t. de COPTG19384 em duas doses diferentes (104 ou 105 pfu) ou VVTG17137 (105 pfu). As linhas contínuas representam a média dos três valores determinados em cada ponto de tempo. FIGURA 28: CINÉTICA DE CONCENTRAÇÕES DE MAB 4-E03 E DE GM-CSF EM SOROS DE CAMUNDONGOS XENOENXERTADOS COM

LOVO C) A cinética das concentrações de mAb 4-E03 nos soros foi avaliada após uma única injeção i.t. em tumor xenoenxertado com LoVo de qualquer um dentre COPTG19384 ou VVTG17137 em duas doses diferentes (104 ou 105 pfu) ou depois de uma única injeção i.p. de 3 mg/kg de anticorpo monoclonal 4-E03. As linhas contínuas representam a média dos três valores. D) A cinética das concentrações de GM-CSF nos soros após uma única injeção i.t. em tumor xenoenxertado com LoVo de qualquer um dentre COPTG19384 em duas doses diferentes (104 ou 105 pfu) ou VVTG17137 (105 pfu). As linhas tracejadas representam a média dos três valores determinados em cada ponto de tempo. FIGURA 29: CINÉTICA DE ACUMULAÇÃO DE VÍRUS EM TUMORES CT26

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[00208] Cinética de acumulação de vírus em tumores CT26 após três injeções i.t. (em D0, D2 e D4) de qualquer um dentre VVTG18058, COPTG19421 ou COPTG19407 em 107 pfu/injeção. FIGURA 30: CINÉTICA DE MAB M5-B07 E ACUMULAÇÃO DE MGM- CSF EM TUMOR CT26 A) Cinética das concentrações de m5-B07 mAb no tumor CT26 durante e após três injeções i.t. de VVTG18058, COPTG19421 ou COPTG19407 (107 pfu/injeção) ou após uma única injeção i.p. de 3 mg/kg de anticorpo monoclonal m5-B07. As linhas contínuas representam a média dos três valores. B) Cinética das concentrações de mGM-CSF no tumor CT26 durante e após três injeções i.t. de VVTG18058, COPTG19421 ou COPTG19407 (10 7 pfu/injeção) ou após uma única injeção i.p. de 3 mg/kg de anticorpo monoclonal m5-B07. As linhas contínuas representam a média dos três valores determinados em cada ponto de tempo. FIGURA 31: CINÉTICA DAS CONCENTRAÇÕES DE M5-B07 MAB NOS SOROS DO MODELO CT26

[00209] Cinética das concentrações de mAb m5-B07 nos soros após três injeções i.t. no tumor CT26 de VVTG18058, COPTG19421 ou COPTG19407 (107 pfu/injeção) ou após uma única injeção i.p. de 3 mg/kg de anticorpo monoclonal m5-B07. As linhas contínuas representam a média dos três valores determinados em cada ponto de tempo. FIGURA 32: ATIVIDADE ANTITUMORAL NO MODELO CT26: EFEITO DE COPTG19347 +/- ANTIPD1 NO CRESCIMENTO DO TUMOR CT26 (A) E SOBREVIVÊNCIA DE CAMUNDONGOS (B)

[00210] As células CT26 foram injetadas SC em camundongos BalB/c em D-7. COPTG19347 (107 pfu), VVTG18058 (107 pfu), VVTG18058 ou tampão foram injetados IT, em D0, D2 e D4, possivelmente seguido pela injeção i.p. de 250 µg/camundongo de antiPD1 RMPI-14 em D7, D10, D14,

65 / 115 D17 e D21. FIGURA 33: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA DOSE NO MODELO CT26 (COMPILAÇÃO DOS DADOS DE SOBREVIVÊNCIA OBSERVADOS APÓS O TRATAMENTO DE COPTG19407, COPTG19421 E VVTG18058) FIGURA 34: ATIVIDADE ANTITUMORAL DE COPTG19407 EM COMPARAÇÃO COM VVTG18058 MAIS M5-B07 NO MODELO DE TUMOR CT26

[00211] Células CT26 foram injetadas s.c. em camundongos Balb/C. O tratamento dos camundongos foi iniciado quando os tumores alcançaram aprox. 100 mm3. Os camundongos foram injetados em D0, D2 e D5 com COPTG19407 (8,5x106 pfu i.t.), VVTG18058 (8,5 x 106 pfu i.t.), m5-B07 (10 mg/kg i.p.) ou a combinação de VVTG18058 (8,5 x 106 pfu i.t.) mais m5-B07 (10 mg/kg i.p.). AS FIGURAS 30A A 30D: CRESCIMENTO DE TUMOR E A FIGURA 16E: SOBREVIVÊNCIA FORAM ACOMPANHADOS AO LONGO DO TEMPO. FIGURA 35: CURVAS DE VOLUME TUMORAL INDIVIDUAL DE CAMUNDONGOS BALB/C PORTADORES DE TUMORES A20 SUBCUTÂNEOS.

[00212] Células A20 foram injetadas s.c. em camundongos Balb/C. O tratamento dos camundongos foi iniciado quando os tumores alcançaram 80 a 100 mm3. Os camundongos foram injetados em D0, D2 e D4 com veículo (i.t.), COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.), VVTG18058 (4,75x106 pfu i.t.), RMP1-14 (antimPD-1) (250 µg/camundongo i.p.) ou a combinação de COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.) mais RMP1-14 (250 µg/camundongo i.p.). Animais do Grupo 1 tratados com veículo Animais do Grupo 2 tratados com VVTG18058 Animais do Grupo 3 tratados com COPTG19407 Animais do Grupo 4 tratados com antiPD1 murino Animais do Grupo 5 tratados com COPTG19407 e antiPD1

66 / 115 murino FIGURA 36: CURVAS DE VOLUME TUMORAL MÉDIO DE CAMUNDONGOS BALB/CN PORTADORES DE TUMORES A20 SUBCUTÂNEOS.

[00213] Cada ponto representa a média do volume do tumor registrado por grupo. Os volumes do tumor de todos os animais foram monitorados durante 64 dias. Os camundongos foram tratados com veículo (grupo 1), VVTG18058 (grupo 2), COPTG19407 (grupo 3), o anticorpo antiPD1 murino RMP1-14 (BioXCell) (grupo 4) e COPTG19407 e RMP1-14 (grupo 5). Os animais foram randomizados em D7 e tratados durante o período D7 a D31. Os últimos camundongos foram sacrificados em D61. FIGURA 37: ATIVIDADE ANTITUMORAL NO MODELO A20: EFEITO DE COPTG19407 +/- ANTIPD1 NO CRESCIMENTO DO TUMOR A20 (A) E SOBREVIVÊNCIA DE CAMUNDONGOS (B)

[00214] As células A20 foram injetadas s.c. em camundongos Balb/C. O tratamento dos camundongos foi iniciado quando os tumores alcançaram 80 a 100 mm3. Os camundongos foram tratados com veículo (i.t.) (grupo 1), antiPD-1 (grupo 2), isótipo (grupo 3), VVTG18058 (105 pfu i.t.) (grupo 4), VVTG18058 (105 pfu i.t.) + isótipo (grupo 5), VVTG18058 (105 pfu i.t.) + antiPD-1 (grupo 6), VVTG19407 (105 pfu i.t.) (grupo 7), VVTG19407 (105 pfu i.t.) + isótipo (grupo 8) e VVTG19407 (105 pfu i.t.) + antiDP-1 (grupo 9). FIGURA 38: CURVAS DE VOLUME TUMORAL INDIVIDUAL DE CAMUNDONGOS C57BL/6 PORTADORES DE TUMORES C38 SUBCUTÂNEOS.

[00215] As células C38 foram injetadas s.c. em camundongos C57bl/6. O tratamento dos camundongos foi iniciado quando os tumores alcançaram 80 a 100 mm3. Os camundongos foram injetados em D0, D2 e D4 com veículo (i.t.), COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.), VVTG18058 (4,75x106 pfu i.t.), RMP1-14 (antimPD-1) (250 µg/camundongo i.p.) ou a combinação de

67 / 115 COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.) mais RMP1-14 (250 µg/camundongo i.p.). Animais do Grupo 1 tratados com veículo Animais do Grupo 2 tratados com VVTG18058 Animais do Grupo 3 tratados com COPTG19407 Animais do Grupo 4 tratados com antiPD1 murino Animais do Grupo 5 tratados com COPTG19407 e antiPD1 murino FIGURA 39: CURVAS DE VOLUME TUMORAL MÉDIO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 PORTADORES DE TUMORES C38 SUBCUTÂNEOS.

[00216] Cada ponto representa a média do volume do tumor registrado por grupo. Os volumes do tumor de todos os animais foram monitorados ao longo de 61 dias. Os camundongos foram tratados com veículo (grupo 1), VVTG18058 (grupo 2), COPTG19407 (grupo 3), o anticorpo murino antiPD1 RMP1-14 (BioXCell) (grupo 4) e COPTG19407 e RMP1-14 (grupo 5). Os animais foram randomizados em D7 e tratados durante o período D7 a D31. Os últimos camundongos foram sacrificados em D61. FIGURA 40: CURVAS DE VOLUME TUMORAL INDIVIDUAL DE CAMUNDONGOS BALB/C PORTADORES DE TUMORES EMT6 SUBCUTÂNEOS.

[00217] As células EMT6 foram injetadas s.c. em camundongos Balb/C. O tratamento dos camundongos foi iniciado quando os tumores alcançaram 80 a 100 mm3. Os camundongos foram injetados em D0, D2 e D4 com veículo (i.t.), COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.), VVTG18058 (4,75x106 pfu i.t.), RMP1-14 (antimPD-1) (250 µg/camundongo i.p.) ou a combinação de COPTG19407 (4,75x106 pfu i.t.) mais RMP1-14 (250 µg/camundongo i.p.). Animais do Grupo 1 tratados com veículo Animais do Grupo 2 tratados com VVTG18058

68 / 115 Animais do Grupo 3 tratados com COPTG19407 Animais do Grupo 4 tratados com antiPD1 murino Animais do Grupo 5 tratados com COPTG19407 e antiPD1 murino FIGURA 41: CURVAS DE VOLUME TUMORAL MÉDIO DE CAMUNDONGOS BALB/C PORTADORES DE TUMORES EMT6 SUBCUTÂNEOS.

[00218] Cada ponto representa a média do volume do tumor registrado por grupo. Os volumes do tumor de todos os animais foram monitorados ao longo de 61 dias. Os camundongos foram tratados com veículo (grupo 1), VVTG18058 (grupo 2), COPTG19407 (grupo 3), o anticorpo murino antiPD1 RMP1-14 (BioXCell) (grupo 4) e COPTG19407 e RMP1-14 (grupo 5). Os animais foram randomizados em D7 e tratados durante o período D7 a D31. Os últimos camundongos foram sacrificados em D56. As curvas foram interrompidas após a morte de mais de 20% dos camundongos.

EXEMPLOS

[00219] Exemplos específicos, sem limitação, que incorporam determinados aspectos da invenção serão descritos agora. Nos exemplos, a proteína rh denota uma proteína recombinante humana (por exemplo, rhIL-2 denota proteína IL-2 recombinante humana) e a proteína rcm denota uma proteína recombinante de cinomolgo (por exemplo, rcmCTLA4 denota proteína CTLA-4 recombinante de cinomolgo).

[00220] Além das sequências acima mencionadas, algumas sequências adicionais são usadas nos exemplos e são definidas na Tabela 5 abaixo. TABELA 5: SEQUÊNCIAS ADICIONAIS USADAS NOS EXEMPLOS SEQ. ID. Sequência

NO GM-CSF APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQ humano sem EPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQT 55 peptídeo-sinal ITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE GM-CSF MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTA humano com AEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMAS 56 peptídeo-sinal HYKQHCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

69 / 115 SEQ. ID. Sequência

NO GM-CSF APTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTC murino sem VQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYA 57 peptídeo-sinal DFIDSLKTFLTDIPFECKKPVQK GM-CSF MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTL murino com NEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQT 58 peptídeo-sinal YCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPVQK Promotor CCACCCACTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAAT p7.5K AATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGT 59

AAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGT Promotor TTTATTCTATACTTAAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGG pH5.R TTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCG 60

CGATATCCGTTAAGTTTG Promotor AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA 61 pSE/L EXEMPLO 1 - GERAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CTLA-4

ISOLAMENTO DE FRAGMENTOS DE ANTICORPO SCFV

[00221] A biblioteca de scFv n-CoDeR® (BioInvent; Söderlind E, et al Nat Biotechnol. 2000; 18(8):852 a 856) foi usada para isolar os fragmentos de anticorpo scFv que reconhecem CTLA-4 humana.

[00222] A biblioteca de fagos foi usada em três drageamentos consecutivos em oposição à proteína humana recombinante. Após a incubação de fago, as células foram lavadas para remover os fagos não ligados. Os fagos de ligação foram eluídos com tripsina e amplificados em E. coli. O estoque de fago resultante foi convertido para o formato scFv. E.coli foram transformadas com plasmídeos portadores de scFv e clones individuais de scFv foram expressos. IDENTIFICAÇÃO DE scFv DE LIGAÇÃO A CTLA-4 ÚNICO

[00223] O scFv convertido do terceiro drageamento foi testado usando- se uma análise FMAT homogênea (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) para ligação a células 293 FT transfectadas que expressam CTLA-4 humana ou uma proteína não alvo.

[00224] Em suma, as células transfectadas foram adicionadas a placas de fundo transparente, juntamente com o sobrenadante que contém scFv das placas de expressão (diluído 1:7), anticorpo anti-His Tag de camundongo (0,4

70 / 115 g/ml; R&D Systems) e um anticorpo anticamundongo de cabra conjugado com APC (0,2 µg/ml; nº cat. 115-136-146, Jackson Immunoresearch). As placas FMAT foram incubadas à temperatura ambiente (aproximadamente a 20 a 25 °C) durante 9 h antes da leitura. Os clones bacterianos específicos do alvo foram classificados como ativos e colhidos cuidadosamente em uma placa de 96 poços. LIGAÇÃO DE IGG A CTLA-4 EM ELISA

[00225] Placas de 96 poços (placa Lumitrac 600 LIA, Greiner) foram revestidas durante a noite a 4 °C com proteína de CTLA-4-Fc humana recombinante (R&D Systems) a 1 pmol/poço, proteína CTLA-4-Fc de cinomolgo recombinante (cm) (R&D Systems) a 1 pmol/poço, proteína CTLA-4-Fc recombinante de camundongo (R&D Systems) a 0,3 pmol/poço, proteína CD28-Fc humana recombinante (R&D Systems) a 1 pmol/poço ou proteína CD28-Fc de camundongo recombinante (R&D Systems) a 0,3 pmol/poço. Após a lavagem, doses tituladas de mAbs anti-CTLA-4 de 0 µg/ml a 0,06 ng/ml (66 nM a 0,3 pM) foram deixadas para que se ligassem durante 1 hora. As placas foram, então, lavadas novamente e os anticorpos ligados foram detectados com um anticorpo secundário anti-F(ab)-HRP humano (Jackson ImmunoResearch) diluído em 50 ng/ml. Super Signal ELISA Pico (Thermo Scientific) foi usado como substrato e as placas foram analisadas em leitor de microplacas Tecan Ultra.

[00226] Todos os anticorpos mostraram se ligar à proteína CTLA-4 humana e de cinomolgo, mas não à proteína CD28 humana, conforme testado por ELISA. Além disso, 5-B07 mostrou se ligar a CTLA-4 de camundongo, mas não a CD28 de camundongo (consultar Figura 1). LIGAÇÃO DE IgG A CÉLULAS 293T QUE EXPRESSAM CTLA-4 EM

CITOMETRIA DE FLUXO

[00227] Os clones de IgG convertidos foram analisados quanto à ligação a células 293T que expressam CTLA-4 (adquiridas junto à

71 / 115 Crownbio). As células foram incubadas com diferentes concentrações (conforme indicado na Figura 2) de mAb anti-CTLA-4 a 4 °C por 20 min antes da lavagem e coloração com um anticorpo secundário anti-humano de cabra marcado com APC (nº cat. 109-136-088, Jackson ImmunoResearch). As células mortas foram excluídas das análises usando-se o Fixable Viability Dye eFluor780 (eBiosciences). A aquisição de dados foi realizada em um FACSVerse (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e analisados com software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

[00228] Os mAbs anti-CTLA-4 mostraram se ligar a células 293T que expressam CTLA-4 humana de uma maneira dependente da dose com um valor de EC50 semelhante ao de Yervoy (Figura 2).

[00229] Células 293T estavelmente transfectadas com CTLA-4 humana, células 293T transitoriamente transfectadas com CTLA-4 de cinomolgo, PBMCs humanas ou de cinomolgo virgens, células T CD4+ cino ou humanas ativadas in vitro foram incubadas com as concentrações de mAb anti-CTLA-4 indicadas em 4 °C por 20 min antes da lavagem e coloração com um anticorpo secundário anti-humano marcado com APC (Jackson ImmunoResearch). EXEMPLO 2 - mAb ANTI-CTLA-4 QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A SERES HUMANOS E CÉLULAS (PRIMÁRIAS) QUE EXPRESSAM CTLA-4 DE CINOMOLGOS mAb ESPECÍFICO PARA CTLA-4 QUE SE LIGA A CÉLULAS T CD4+ ATIVADAS IN VITRO PRIMÁRIAS HUMANAS E DE CINOMOLGO,

MAS NÃO A PBMCS VIRGENS ISOLADAS DE DOADORES SAUDÁVEIS

[00230] PBMCs foram isoladas de cremes leucocitários. Em suma, o creme leucocitário foi diluído 1:3 em PBS e carregado em almofadas Ficoll- Paque Plus (Amersham). As amostras foram centrifugadas a 800 xg por 20 min a 20 °C. A fase superior que contém plasma foi removida e as células

72 / 115 mononucleares foram isoladas da faixa branca distinta na interfase plasma/Ficoll.

[00231] As células T CD4+ periféricas humanas foram purificadas por seleção negativa com o uso do kit de isolamento de células T CD4 MACS (Miltenyi Biotec). As células T CD4+ foram ativadas in vitro com esferas magnéticas CD3/CD28 (Life Technologies) mais 50 ng/ml de rhIL-2 (R&D Systems) em meio R10 (RPMI que contém glutamina 2 mM, piruvato 1 mM, 100 IU/ml de penicilina e estreptomicina e 10% de FBS (GIBCO da Life Technologies) por 3 dias para regular positivamente a expressão de CTLA-4. Células T CD4+ de cinomolgo foram isoladas com o uso de microesferas CD4 não humanas (Miltenyi Biotec) e incubadas com 50 ng/ml de PMA (Sigma-Aldrich) e 100 ng/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich) por 3 dias.

[00232] PBMCs humanas ou de cinomolgo virgens, células T CD4+ humanas ou cino ativadas in vitro foram incubadas com as concentrações indicadas de mAb anti-CTLA-4 a 4 °C por 20 minutos antes da lavagem e coloração com um anticorpo secundário anti-humano marcado com APC (Jackson ImmunoResearch). A ligação de mAb anti-CTLA-4 foi analisada por FACS usando-se um BD FACS Verse.

[00233] Os anticorpos mostraram se ligar a células T CD4+ humanas ativadas in vitro (Figura 3) e de cinomolgo (Figura 5), mas não a PBMCs em repouso (Figura 8). A ligação a células T que expressam CTLA-4 endogenamente é semelhante à coloração com Yervoy (Figura 3, fileira superior, linha pontilhada) e, como um controle positivo, um anticorpo comercial anti-CTLA-4 FACS da BD Biosciences (clone BNI3; Figura 3, fileira inferior).

[00234] Conforme mostrado na Figura 4, a coloração de células T CD4+ ativadas in vitro humanas (linha preta) pode ser completamente bloqueada por rhCTLA-4-Fc (linha cinza), demonstrando a especificidade dos anticorpos. Neste ensaio de ligação competitiva, 2 µg/ml de mAb anti-CTLA-

73 / 115 4 marcados com Alexa 647 foram misturados com proteína CTLA-4-Fc humana recombinante (50 µg/ml) antes da incubação com células que expressam CTLA-4. A ligação de IgG foi detectada por FACS. AS CÉLULAS 293T TRANSFECTADAS QUE EXPRESSAM CTLA-4

HUMANA E DE CINOMOLGO CONFIRMAM A REATIVIDADE CINOCRUZADA DOS ANTICORPOS TESTADOS

[00235] A reatividade cinocruzada dos anticorpos foi, ainda, confirmada em células 293T que expressam CTLA-4 transfectada.

[00236] Conforme demonstrado na Figura 6, a ligação de anticorpos específicos de CTLA-4 a células transfectadas que expressam CTLA-4 humana pode ser inibida por proteína recombinante humana e de cinomolgo (ambas da R&D Systems). Os anticorpos também demonstraram se ligar a células transfectadas que expressam CTLA-4 de cinomolgo (Figura 7, fileira superior). Essa ligação pode ser bloqueada novamente pela proteína recombinante de cinomolgo (fileira inferior, linha cinza).

[00237] Os experimentos foram realizados de forma semelhante ao ensaio competitivo descrito acima no Exemplo 2 em conexão com a Figura 4.

FALTA ESPERADA DE ATIVIDADE AGONÍSTICA DIRETA

[00238] Os ensaios de proliferação in vitro foram realizados para excluir a atividade agonística direta imprevista (por exemplo, devido à ligação inespecífica).

[00239] As células T CD4+ periféricas humanas foram purificadas a partir de PBMCs saudáveis por seleção negativa usando-se o kit de isolamento de células T CD4 MACS (Miltenyi Biotec) e foram posteriormente marcadas com CFSE (a 2 µM, Molecular Probes). Os anticorpos foram reticulados com F(ab’)2 de cabra de IgG anti-humano, Fcγ fragmento específico ou F(ab’)2 de cabra de IgG anticamundongo, Fcγ fragmento específico em uma razão molar IgG:F(ab’)2 = 1,5:1 por 1 h à temperatura ambiente. 1x105 células T CD4+ humanas purificadas foram

74 / 115 estimuladas com antiCD3 ligado à placa (0,5 µg/ml; clone UCHT1, R&D Systems) e 4 µg/ml de anti-CTLA-4 reticulado e solúvel ou antiCD28 reticulado (clone CD28.2, BioLegend) durante 72 horas a 37 °C. As células foram lavadas e coradas com um anticorpo antiCD25 conjugado com BV421 (clone M-A251, BD Biosciences). A porcentagem de células em divisão CD25+/CFSElow foi analisada por FACS.

[00240] A Figura 9 demonstra que nenhum dos mAb anti-CTLA-4 testados induz a proliferação de células T em contraste com a estimulação antiCD28. EXEMPLO 3 - LIGAÇÃO DO LIGANTE DE BLOQUEIO DE MAB ANTI- CTLA-4 DE CD80/CD86

ELISA DE BLOQUEIO DE LIGANTE

[00241] A atividade de bloqueio de ligante de IgGs anti-CTLA-4 foi avaliada por ELISA. Para este fim, a proteína CTLA-4-Fc humana recombinante (R&D Systems) foi revestida em placas de 96 poços (placa Lumitrac 600 LIA, Greiner) a 1 pmol/poço. Após a lavagem, deixou-se que as doses tituladas de mAbs anti-CTLA-4 se ligassem durante 1 hora. Ligantes marcados com His foram adicionados a 200 nM e 100 nM, respectivamente (rhCD80 e rhCD86; R&D Systems) e as placas foram incubadas adicionalmente por 15 minutos. Após a lavagem, o ligante ligado foi detectado com um anticorpo antiHis marcado com HRP (R&D Systems). Super Signal ELISA Pico (Thermo Scientific) foi usado como substrato e as placas foram analisadas com o uso de leitor de microplacas Tecan Ultra.

[00242] Conforme mostrado na Figura 10, os anticorpos anti-CTLA-4 testados mostram atividade de bloqueio de ligante semelhante à de Yervoy.

BLOQUEIO DE LIGANTE FUNCIONAL IN VITRO

[00243] Para o ensaio SEB PBMC, o total de PBMCs de doadores saudáveis foi semeado em placas de 96 poços (1x105 células/poço) e estimulado com 1 µg/ml de enterotoxina B de Staphylococcus (SEB, Sigma

75 / 115 Aldrich) na presença de doses tituladas de IgGs anti-CTLA-4. A secreção de IL-2 foi medida por MSD (Mesoscale) no dia 3 de acordo com as instruções do fabricante.

[00244] Os anticorpos 4-E03 e 2-C06 demonstraram aumentar a produção de IL-2 e sua potência mostrou ser semelhante à de Yervoy. Na Figura 11, um doador representativo de 6 é mostrado. EXEMPLO 4 - mAb ANTI-CTLA-4 EMPOBRECE CÉLULAS QUE EXPRESSAM CTLA-4 IN VITRO E IN VIVO CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPO (ADCC)

[00245] Os ensaios de ADCC foram realizados usando-se uma linhagem celular NK-92 transfectada de forma estável para expressar o alelo CD16-158V juntamente com GFP (adquirido junto à Conkwest, San Diego, CA; Binyamin, L., et al., 2008, Blocking NK cell inhibitory self-recognition promotes antibody-dependent cellular cytotoxicity in a model of anti- lymphoma therapy. Journal of immunology 180, 6.392 a 6.401). Células T CD4+ alvo foram isoladas de sangue periférico de dadores saudáveis com o uso de kit de isolamento de células T CD4+ (Miltenyi Biotec). As células foram estimuladas por 48 horas com esferas magnéticas CD3/CD28 (Life Technologies, Thermo Fisher) e 50 ng/ml de rhIL-2 (R&D Systems) a 37 °C. As células-alvo foram pré-incubadas com mAb a 10 µg/ml durante 30 min a 4 °C antes de se misturarem com células NK. As células foram incubadas durante 4h em meio RPMI 1640 + GlutaMAX (Invitrogen) que contém tampão HEPES a 10 mM, piruvato de sódio a 1 mM e IgG com baixo teor de FBS a 10% a uma razão de 2:1 célula efetora:alvo. A lise foi determinada por citometria de fluxo. Em suma, no final da incubação, a suspensão de células foi corada com antiCD4 conjugado com BV510 (clone RPA-T4, BD Biosciences) juntamente com coloração de células mortas vermelhas SYTOX a 10 nM (Invitrogen) ou Corante de Viabilidade Fixável eFluor780 (eBioscience) por 20 min no escuro a 4 °C e as células foram, então,

76 / 115 analisadas com o uso de um FACSVerse (BD Biosciences).

[00246] 4-E03 mostrou uma deleção significativamente melhorada de células T CTLA-4+ in vitro em comparação com Yervoy (Figura 12). EXPRESSÃO DE CTLA-4 NO MATERIAL PRIMÁRIO DO PACIENTE

[00247] A fim de validar o potencial de tradução da constatação acima sobre a atividade de depleção de mAb anti-CTLA-4, a expressão de CTLA-4 foi examinada em material primário de paciente.

[00248] A aprovação ética para o uso de amostras clínicas foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Skåne. O consentimento informado foi fornecido de acordo com a Declaração de Helsinque. As amostras foram obtidas através do Departamento de Ginocologia e Departamento de Oncologia do Hospital Universitário Skånes, Lund. O fluido ascítico foi avaliado como suspensões de células únicas que foram isoladas. O material do tumor foi cortado em pequenos pedaços e incubado em R10 com DNase I (Sigma Aldrich) e LiberaseTM (Roche Diagnostics) durante 20 min a 37 °C. O tecido restante foi esmagado mecanicamente e, junto com a suspensão de células, passou por um peneira de células de 70 µm. As células isoladas de líquido ascítico e tumores foram coradas. Para identificar diferentes subconjuntos de células T, os seguintes anticorpos foram usados: CD4-BV510 (RPA-T4), CD25-BV421 (M-A251), anti-CD127-FITC (HIL- 7R-M21), CTLA-4-PE (BNI3), CD8-PeCy7 (RPA-T8), CD3-APC (UCHT1), CD45-PercP-Cy5.5 (HI30), isótipo IgG2a de camundongo,κ controle-PE (G155-178; todos da BD Biosciences). A aquisição de dados foi realizada com o uso de FACSVerse e os dados foram analisados com o uso de FlowJo.

[00249] Conforme mostrado na Figura 13, CTLA-4 é mais expressa em células Treg intratumorais, o que as torna um bom alvo para depleção de anticorpos específicos para CTLA-4. MODELO PBMC-NOG/SCID

[00250] Para confirmar as constatações in vitro sobre a atividade de

77 / 115 depleção dos anticorpos específicos para CTLA-4, analisa-se a capacidade de depleção de mAb anti-CTLA-4 em um modelo PBMC-NOG/SCID in vivo. O modelo é baseado no modelo hu-PBMC-NOG bem estabelecido (Søndergaard H. et al., Clin Exp Immunol. maio de 2013; 172(2):300 a 310. doi:

10.1111/cei.12051; Cox JH et al., PLoS One. 23 de dezembro de 2013; 8(12): e82944. doi: 10.1371/journal.pone.0082944. eCollection 2013) e foi modificado internamente conforme descrito abaixo.

[00251] Os camundongos foram criados e mantidos em instalações locais, de acordo com as diretrizes do home office. C.B. 17 scid fêmea com oito semanas de idade (Bosma GC et al., Nature. 10 de fevereiro de 1983; 301(5900): 527 a 530) e NOG (NOD/scid Shi IL-2Rγnulo; Ito M et al, 2002, NOD/SCID/γnulo mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100 (9):3.175 a 3.182) os camundongos foram disponibilizados pela Taconic (Bomholt, Dinamarca) e mantidos em biotérios locais. Para o modelo PBMC-NOG/SCID (xenoenxerto humano primário), PBMCs humanas foram isoladas com o uso de Ficoll Paque PLUS e, após a lavagem, as células foram ressuspensas em PBS estéril a 75x106 células/ml. Os camundongos NOG foram injetados i.v. com 200 µl de suspensão de células que correspondem a 15x106 células/camundongo. 2 semanas após a injeção, os baços foram isolados e processados em uma suspensão de células individuais. Depois disso, uma pequena amostra foi retirada para determinar a expressão de CTLA-4 em células T humanas por FACS. Conforme indicado na Figura 13, CTLA-4 é mais expressa em células Treg em comparação com outras células T, refletindo a situação em pacientes humanos. A maioria das células foi ressuspensa em PBS estéril em 50x106 células/ml. Os camundongos SCID foram injetados i.p. com 200 µl da suspensão correspondentes a 10x106 células/camundongo. 1h depois, os camundongos foram tratados com 10 mg/kg de hIgG1 anti-CTLA-4, Yervoy ou mAb de controle de isótipo. O fluido intraperitoneal dos camundongos foi coletado

78 / 115 após 24 h. Subconjuntos de células T humanas foram identificados e quantificados por FACS com o uso dos seguintes marcadores: CD45, CD4, CD8, CD25, CD127 (todos da BD Biosciences).

[00252] Todos os anticorpos testados mostraram uma atividade de depleção de Treg similar ou melhor do que Yervoy. Outras populações de células T, tais como células T efetoras CD8+, não foram afetadas (Figura 14). EXEMPLO 5 - O ANTICORPO SUBSTITUTO SELECIONADO M5-B07 MOSTRA AS MESMAS CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS DE 4-E03

[00253] Em alguns dos exemplos, em particular, nos exemplos in vivo, o clone de anticorpo 5-B07 no formato mIgG2a foi usado (também denominado m5-B07). Este é um anticorpo de camundongo, que é um anticorpo substituto para os anticorpos humanos divulgados no presente documento. O mesmo foi selecionado como um anticorpo substituto, uma vez que se liga a CTLA-4 murino e, assim, bloqueia a ligação de ligante (Figuras 16A a 16B). Além disso, o mesmo também mostra a atividade de depleção de Treg (Figuras 16C a 16D).

ELISA DE BLOQUEIO DE LIGANTE

[00254] A atividade de bloqueio de ligante de 5-B07 foi avaliada por ELISA. Para este fim, a proteína CTLA-4-Fc de camundongo recombinante (Sino Biologocal Inc.) foi revestida com placas de 96 poços (placa Lumitrac 600 LIA, Greiner) a 1 pmol/poço. Após a lavagem, deixou-se que as doses tituladas de mAbs anti-CTLA-4 se ligassem durante 1 hora. Ligantes marcados com His foram adicionados a 200 nM e 100 nM, respectivamente (rmCD80 e rmCD86; Sino Biological Inc.) e as placas foram incubadas por mais 15 minutos. Após a lavagem, o ligante ligado foi detectado com um anticorpo antiHis marcado com HRP (R&D Systems). Super Signal ELISA Pico (Thermo Scientific) foi usado como substrato e as placas foram analisadas com o uso de leitor de microplacas Tecan Ultra.

[00255] Conforme mostrado na Figura 16, o anticorpo bloqueia a

79 / 115 ligação de (A) CD80 e (B) CD86 à sua CTLA-4 de ligante.

ATIVIDADE DE DEPLEÇÃO DE TREG IN VIVO

[00256] Os efeitos de anticorpos específicos para CTLA-4 nos subconjuntos de células T no tumor in vivo foram investigados no modelo de tumor de CT26, conforme descrito abaixo.

[00257] Os camundongos foram criados e mantidos em instalações locais, de acordo com as diretrizes do home office. Balb/C fêmeas de seis a oito semanas de idade foram disponibilizadas pela Taconic (Bomholt, Dinamarca) e mantidas em biotérios locais. As células CT26 (ATCC) foram cultivadas em RPMI tamponado com glutamax, suplementado com FCS a 10%. Quando as células estavam semiconfluentes, as mesmas foram separadas com tripsina e ressuspensas em PBS estéril a 10x106 células/ml. Os camundongos foram injetados s.c. com 100 µl de suspensão de células que correspondem a 1x106 células/camundongo. Quando os tumores alcançaram, aproximadamente, 7x7 mm, os camundongos foram tratados duas vezes por semana i.p. com 10 mg/kg dos anticorpos indicados, conforme indicado nas Figuras. Após a terceira administração, os tumores foram dissecados, mecanicamente divididos em pequenos pedaços e assimilados com uma mistura de 100 µg/ml liberase (Roche) e 100 µg/ml Dnase (Sigma) a 37 °C por 2x5 min com Vortex entre os mesmos. A suspensão de células foi, então, lavada (400 g por 10 min) com PBS que contém 10% de FBS. Posteriormente, as células foram ressuspensas em tampão MACS e coradas com um painel de anticorpos com coloração de CD45, CD3, CD8, CD4 e CD25 (todos da BD Biosciences). Antes da coloração, as células foram bloqueadas para ligação inespecífica com o uso de 100 µ/ml de IVIG. As células foram analisadas com o uso de um FACS Verse (BD Biosciences). As células Treg de camundongo foram identificadas como células CD45+CD3+CD4+CD25+.

[00258] Conforme mostrado na Figura 16 C, 5-B07 no formato de

80 / 115 IgG2a de camundongo medeia a deleção de Treg no tumor associado com D) razão CD8/Treg aumentada em comparação com outros anticorpos n-CoDeR específicos para CTLA-4 e o clone 9H10 comercialmente disponível bem descrito. EXEMPLO 6 - GERAÇÃO DE UM VÍRUS QUE EXPRESSA MAB ANTI- CTLA4 (COPTG19385) OU MAB ANTI-CTLA4 E GM-CSF (COPTG19384), EXPRESSÃO DE TRANSGENES E CARACTERIZAÇÃO

DE ESTABILIDADES GENÉTICAS

[00259] COPTG19384 e COPTG19385 são vírus vaccinia (cepa Copenhagen) que codificam o anticorpo monoclonal anti-CTLA4 (4-E03). COPTG19384 codifica, ainda, o GM-CSF humano. Mais particularmente, COPTG19384 e COPTG19385 são ambos defeituosos para as atividades de timidina quinase (TK, lócus J2R) e ribonucleotídeo redutase (RR, lócus I4L). Conforme ilustrado na Figura 17, o cassete de expressão que codifica a cadeia pesada de 4-E03 (HC; SEQ ID NO: 54) sob o controle do promotor p7.5K (SEQ ID NO: 59) foi inserido no lócus J2R, e o cassete de expressão que codifica a cadeia leve (LC, SEQ ID NO: 53) do IgG 4-E03 sob o controle do promotor p7.5K (SEQ ID NO: 59) foi colocado no lócus I4L. Para COPTG19384, o cassete de expressão que codifica o GM-CSF humano (SEQ ID NO: 56) sob o controle do promotor pSE/L (SEQ ID NO: 61) também foi colocado no lócus I4L.

[00260] O mesmo promotor (p7.5K) foi usado para controlar a expressão de HC e LC para obter o mesmo nível de expressão para ambas as cadeias e, portanto, um conjunto ideal do anticorpo como uma proteína heterotetramérica (isto é, para evitar o excesso de cadeia não associada). No entanto, o mesmo promotor para ambas as cadeias do anticorpo impede a inserção no mesmo lócus (sequências de DNA idênticas aumentam o risco de recombinação e, em seguida, a eliminação de transgenes). Portanto, o cassete que codifica o HC de 4-E03 foi inserido no lócus J2R e o cassete que codifica

81 / 115 o LC de 4-E03, no lócus I4L. O cassete que codifica o transgene GM-CSF, mas sob um promotor diferente (pSE/L), também foi inserido no lócus I4L, como a cadeia leve do anticorpo. GERAÇÃO DE COPTG19384

[00261] Os plasmídeos de transferência do vírus vaccinia, pTG19339 e pTG19341, foram projetados para permitir a inserção de sequências de nucleotídeos por recombinação homóloga em loci J2R e em I4L do genoma do vírus vaccinia, respectivamente. Os mesmos se originam a partir do plasmídeo pUC18 no qual foram clonadas as sequências flanqueadoras (BRG e BRD) que envolvem o lócus J2R (pTG19339) ou o lócus I4L (pTG19341). Cada plasmídeo contém também o promotor p7.5K.

[00262] Um fragmento sintético denominado “Fragmento HC” de

1.436 pb que contém o gene de HC do anticorpo 4-E03 foi produzido. Um fragmento “fragmento de LC” que contém o gene de LC do anticorpo 4-E03 e o gene hGM-CSF sob o controle do pSE/L foi gerado de forma sintética e inserido em um vetor plasmídico. As sequências de codificação foram otimizadas para uso de códon humano, uma sequência Kozak (ACC) foi adicionada antes do códon de início ATG e um terminador transcricional (TTTTTNT) foi adicionado após o códon de parada. Além disso, alguns padrões foram excluídos: TTTTTNT, GGGGG, CCCCC que são deletérios para a expressão em poxvírus.

[00263] O fragmento de HC foi inserido em pTG19339 restrito com PvuII por recombinação homóloga, dando origem a pTG19367. O plasmídeo portador de LC foi restringido por SnaB1 e o fragmento “LC- GMCSF” resultante foi inserido por recombinação homóloga em pTG19341 restrito com Pvu II, dando origem a pTG19384. Nesse plasmídeo, os cassetes de expressão foram inseridos da cabeça à cauda entre os braços de recombinação, permitindo a recombinação homóloga no lócus I4L do genoma do vírus vaccinia.

82 / 115

[00264] COPTG19384 foi gerado em fibroblasto de embrião de galinha (CEF) por duas recombinações homólogas sucessivas para inserção sucessiva em loci I4L e J2R e com o uso de COPTG19156 como vírus parental e os dois plasmídeos de transferência pTG19367 e pTG19384. Os CEF foram isolados de ovos SPF embrionados com 12 dias de idade (Charles River). Os embriões foram dilacerados mecanicamente, solubilizados em uma solução de Tripla Seleção (Invitrogen) e cultivados em MBE (Meio Baseado em Águia; Gibco) suplementado com 5% de FCS (Gibco) e L-glutamina 2 mM.

[00265] A recombinação homóloga entre os plasmídeos de transferência e o vírus vaccinia parental permite a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam o GFP e os cassetes de expressão de mCherry e que ganharam o anticorpo e os cassetes de expressão de GM-CSF. COPTG19156 contém o cassete de expressão do gene de mCherry em seu lócus I4L e o cassete de expressão do gene GFP em seu lócus J2R. A recombinação homóloga entre o plasmídeo de transferência pTG19367 e o parental COPTG19156 permite a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam seu cassete de expressão de GFP e que ganharam o cassete de expressão de cadeia pesada de 4-E03 e a seleção foi realizada por meio do isolamento de placas fluorescentes vermelhas. Esse vírus recombinante intermediário (COPTG19367) foi usado como vírus parental para uma segunda rodada de recombinação homóloga com pTG19384 como plasmídeo de transferência para a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam seu cassete de expressão de mCherry e que ganharam a cadeia leve de 4-E03 e cassetes de expressão de GM-CSF. A seleção de COPTG19384 (Figura 17) foi realizada por meio do isolamento de placas brancas não fluorescentes.

[00266] O estoque viral de COPTG19384 foi amplificado em CEFs em dois frascos F175 para gerar estoques apropriados de vírus que podem ser aliquotadas e armazenadas a -80 °C até o uso. O estoque viral foi titulado em células CEF e os títulos infecciosos foram expressos em pfu/ml e calculados

83 / 115 com a seguinte fórmula: número de áreas líticas x fator de diluição x 4. Para fins ilustrativos, o estoque viral produzido titulou 6,8x106 pfu/ml. Este estoque foi analisado por PCR para verificar a integridade dos cassetes de expressão e dos braços de recombinação usando-se pares de iniciadores apropriados. O estoque também foi analisado por sequenciação de ambos os cassetes de expressão. O alinhamento dos resultados do sequenciamento mostrou 100% de homologia com a sequência teórica esperada. Se necessário, as preparações virais foram purificadas com o uso de técnicas convencionais (por exemplo, conforme descrito no documento WO2007/147528). GERAÇÃO DE COPTG19385

[00267] Os plasmídeos de transferência do vírus vaccinia, pTG19339 e pTG19341 foram projetados para permitir a inserção de sequências de nucleotídeos por recombinação homóloga em loci J2R e em I4L do genoma do vírus vaccinia, respectivamente. Eles se originam do plasmídeo pUC18 no qual foram clonadas as sequências flanqueadoras (BRG e BRD) que envolvem o lócus J2R (pTG19339) ou lócus I4L (pTG19341). Cada plasmídeo contém também o promotor p7.5K.

[00268] Um fragmento sintético denominado “Fragmento HC” de 1436 pb que contém o gene HC do anticorpo 4-E03 foi produzido. As sequências de codificação foram otimizadas para uso de códon humano, uma sequência Kozak (ACC) foi adicionada antes do códon de início ATG e um terminador transcricional (TTTTTNT) foi adicionado após o códon de parada. Além disso, alguns padrões foram excluídos: TTTTTNT, GGGGG, CCCCC que são deletérios para expressão em poxvírus.

[00269] O fragmento de HC foi inserido em pTG19339 restrito com PvuII por recombinação homóloga, dando origem a pTG19367.

[00270] O plasmídeo que contém o cassete de expressão que codifica apenas a cadeia leve de 4-E03 foi obtido pela eliminação do cassete que codifica o gene hGM-CSF sob o controle de pSE/L no plasmídeo pTG19384

84 / 115 (descrito acima). O pTG19384 foi restringido com NheI e XbaI (extremidades coesivas compatíveis) e foi religado, dando origem a pTG19385.

[00271] COPTG19385 foi gerado em fibroblasto de embrião de galinha (CEF) por duas recombinações homólogas sucessivas para inserção sucessiva em loci J2R e I4L e usando-se COPTG19156 como vírus parental e os dois plasmídeos de transferência pTG19367 e pTG19385. Os CEF foram isolados de ovos de SPF embrionados com 12 dias de idade (Charles River). Os embriões foram dilacerados mecanicamente, solubilizados em uma solução de Tripla Seleção (Invitrogen) e cultivados em um MBE (Meio Baseado em Águia; Gibco) suplementado com 5% de FCS (Gibco) e L-glutamina 2 mM.

[00272] A recombinação homóloga entre os plasmídeos de transferência e o vírus vaccinia parental permite a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam o GFP e os cassetes de expressão de mCherry e que ganharam os cassetes de expressão de anticorpo. COPTG19156 contém o cassete de expressão do gene mCherry em seu lócus I4L e o cassete de expressão do gene GFP em seu lócus J2R. A recombinação homóloga entre o plasmídeo de transferência pTG19367 e o COPTG19156 parental permite a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam seu cassete de expressão GFP e ganharam o cassete de expressão de cadeia pesada 4-E03 e a seleção foi realizada por isolamento de placas fluorescentes vermelhas. Esse vírus recombinante intermediário (COPTG19367) foi usado como vírus parental para uma segunda rodada de recombinação homóloga com pTG19385 como plasmídeo de transferência para a geração de vírus vaccinia recombinantes que perderam seu cassete de expressão mCherry e ganharam o cassete de expressão de cadeia leve de 4-E03. A seleção de COPTG19385 foi realizada por meio do isolamento de placas brancas não fluorescentes.

[00273] O estoque viral de COPTG19385 foi amplificado em CEFs em dois frascos F175 para gerar estoques apropriados de vírus que podem ser aliquotados e armazenados a -80 °C até o uso. O estoque viral foi titulado em

85 / 115 células CEF e os títulos infecciosos foram expressos em pfu/ml e calculados com a seguinte fórmula: número de áreas líticas x fator de diluição x 4. Para fins ilustrativos, o estoque viral produzido titulou 1,04x107 pfu/ml. Este estoque foi analisado por PCR para verificar a integridade dos cassetes de expressão e dos braços de recombinação usando-se pares de iniciadores apropriados. O estoque também foi analisado por sequenciação de ambos os cassetes de expressão. O alinhamento dos resultados do sequenciamento mostrou 100% de homologia com a sequência teórica esperada. Se necessário, as preparações virais foram purificadas com o uso de técnicas convencionais (por exemplo, conforme descrito no documento WO2007/147528).

EXPRESSÃO DE TRANSGENES

[00274] A expressão mediada por vírus do anticorpo monoclonal 4- E03 foi avaliada em sobrenadantes de células CEF infectadas com COPTG19384 por Western Blot (WB) e em comparação com o anticorpo produzido de forma recombinante (40 ng de 4-E03). WB permite visualizar a presença de moléculas não funcionais que não se ligam à CTLA4 (por exemplo, moléculas com agregados de conjunto de cadeia incompleta). As células CEF foram infectadas em MOI 0,05 com estoque viral de COPTG19384 em triplicado. Os sobrenadantes celulares foram colhidos após 48 h e foram analisados por WB após uma eletroforese em condição não redutora e com o uso de um anticorpo conjugado com HRP anti-Ig (blot à esquerda) ou anticadeia leve (blot à direita). Os resultados ilustrados na Figura 18A indicam que o perfil de WB em condição não redutora do mAb produzido por CEF infectado é próximo ao do 4-E03 purificado com um tamanho aparente semelhante entre 100 a 150 kDa, indicando um correto dobramento de cadeias e montagem.

[00275] A quantificação em sobrenadantes dos anticorpos 4-E03 funcionais secretados e GM-CSF foi realizada com ELISA. ELISA permitiu medir quantitativamente a quantidade de polipeptídeos produzidos em

86 / 115 sobrenadantes celulares. VVTG17137 foi usado como um controle negativo. É um vírus vaccinia (cepa Copenhagen) deletado nos loci J2R e I4L que codificam o gene suicida FCU1 (descrito no documento WO2009/065546).

[00276] Para a estimativa do anticorpo 4-E03, as microplacas foram revestidas por uma incubação durante a noite a 4 °C com 100 µl por poço de CTLA4-Fc a 0,25 µg/ml. Após a incubação, a solução de revestimento foi descartada, a solução de bloqueio foi adicionada e as placas foram incubadas por 1 a 2 horas à temperatura ambiente antes de serem lavadas. Padrões de calibração de 4-E03 (de 0,097 a 100 ng/ml) ou amostras (em triplicado) diluídas em solução de bloqueio foram adicionadas aos poços, e as placas foram incubadas por 2 horas a 37 °C antes de serem lavadas. O anticorpo conjugado com HRP diluído em solução de bloqueio foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas 1 hora a 37 °C antes de serem lavadas. Após a incubação com solução de TMB, por 30 min à temperatura ambiente no escuro, H2SO4 2 M (solução de parada) foi adicionado para interromper a reação enzimática. As absorvâncias foram lidas a 450 nM no leitor de microplaca. As absorvâncias foram traçadas em função da concentração de anticorpos do padrão de calibração. Conforme ilustrado na Figura 18B, mAb 4-E03 foi produzido em células infectadas por COPTG19384, alcançando concentrações próximas a 1 µg/ml.

[00277] A expressão mediada por vírus de GM-CSF também foi avaliada nos mesmos sobrenadantes com o uso de Quantikine® ELISA (R&D Systems Ref SGM00). Em suma, este ensaio está usando dois anticorpos antihGM-CSF. O primeiro anticorpo usado para capturar o hGM-CSF nas amostras foi revestido na superfície do poço de uma placa de 96 poços. O segundo é conjugado e adicionado à placa em solução para detectar o hGM- CSF capturado. A concentração de hGM-CSF na amostra é, então, calculada por interpolação de uma curva de calibração estabelecida com alguns hGM- CSF purificados fornecidos pelo kit. Conforme ilustrado na Figura 19, o

87 / 115 nível de expressão de GM-CSF foi de cerca de 6 µg/ml.

[00278] Em conclusão, concentrações iguais ou superiores a 1 µg/ml foram detectadas para ambos os transgenes, indicando um nível de expressão satisfatório. ESTABILIDADE GENÉTICA:

[00279] Os testes de estabilidade genética foram realizados após cinco passagens do vírus em CEF em meio sem soro a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10-4. A passagem P5 foi diluída e inoculada em células CEF em placas de cultura de 60 mm para obter de 20 a 40 placas virais por chapa. Cem placas virais foram isoladas e subcultivadas. Após um ciclo de amplificação, placas virais isoladas foram inoculadas em células CEF e testadas por PCR e por ELISA. A análise de PCR e a expressão dos transgenes mostraram que mais de 90% dos clones apresentam um perfil correto. Como o critério de aceitação para desenvolvimento clínico de um produto é uma estabilidade genética superior ou igual a 90%, COPTG19384 foi considerado geneticamente estável. EXEMPLO 7 - CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DE COPTG19384 ESTUDOS DE REPLICAÇÃO EM HEPATÓCITOS: SELETIVIDADE TUMORAL DE UM VÍRUS QUE EXPRESSA MAB ANTI-CTLA4 E GM-

CSF

[00280] COPTG19384 carrega duas deleções de genes que codificam enzimas virais (TK e RR) envolvidas no metabolismo de nucleotídeos. Quando funcionais, essas enzimas permitem que o vírus se replique no citoplasma da maioria das células, incluindo aquelas em estado de repouso (isto é, com baixo agrupamento de nucleotídeos disponível). Um estudo de gama de hospedeiros foi realizado em células primárias e malignas para verificar se a inserção dos diferentes transgenes nos loci J2R e I4L não modifica a seletividade de gama de hospedeiros. A replicação de COPTG19384 foi avaliada em células humanas primárias normais

88 / 115 (hepatócitos, preparados por Biopredic) e em células tumorais do mesmo órgão (HepG2 de hepatocarcinoma, ATCC® HB-8065™). As taxas de replicação e os índices terapêuticos foram calculados e comparados com aqueles ambos do tipo selvagem Copenhagen vaccinia (COP WT, vírus sem qualquer deleção) como referências para o vírus vaccinia não seletivo e o vírus VVTG17137 de dupla deleção recombinante (deletado nos genes J2R e I4L com o gene suicida FCU1 inserido no lugar de J2R), respectivamente. Dois lotes foram ensaiados, um lote de pesquisa (lote 1) e um lote produzido por GMP (lote 2). A taxa de replicação foi determinada como a razão de partículas infecciosas totais no final da incubação/partícula infecciosa inicial (inóculo). O índice terapêutico de cada vírus foi determinado como a razão: taxa de replicação em células HepG2/taxa de replicação em hepatócitos. Quanto maior a razão, melhor será a seletividade do vírus em relação às células tumorais.

[00281] Os hepatócitos primários foram cultivados em meio de células basais hepáticas suplementado com aditivos a 1,6% para o meio de cultura de hepatócitos. HepG2 foram semeadas em placa de 12 poços a 4 E+05 células/poço e incubadas por 24 H a 37 °C com 5% de CO2. Antes da infecção, o meio de cultura foi removido e 70 ufp/poço de vírus em PBS para hepatócitos ou PBS suplementado com FCS para HepG2 foram adicionados a cada poço. As células infectadas foram incubadas 30 min a 37 °C com 5% de CO2 e, então, 1,5 ml/poço de meio de cultura foram adicionados. As placas foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 3 dias e, então, armazenadas a - 80 °C. Em seguida, as placas foram descongeladas e os poços sonicados 30 segundos com 40% de amplitude antes da titulação em células Vero. TAXA DE REPLICAÇÃO EM HEPATÓCITOS HUMANOS NORMAIS:

[00282] Hepatócitos normais foram escolhidos para monitorar a capacidade de COPTG19384 em células humanas normais, pois essas células primárias podem ser obtidas regularmente diretamente de doadores. Nessas

89 / 115 células, o COP WT se espalhou bem com uma taxa de replicação de mais de

50.000 (Figura 20A). Em outras palavras, cada partícula viral de infecção inicial produziu cerca de 50.000 novos vírus. No caso dos dois vírus recombinantes com deleção dupla (isto é, VVTG17137 e COPTG19384), essa taxa de replicação foi drasticamente reduzida para 5 a 15 de acordo com o vírus ou lote de vírus (Figura 20A). Este último resultado indica que a replicação atenuada em direção às células normais trazida pelas duas deleções foi conservada entre VVTG17137 e COPTG19384. TAXA DE REPLICAÇÃO EM CÉLULAS TUMORAIS HepG2:

[00283] As células HepG2 foram escolhidas para monitorar a capacidade de COPTG19384 se replicar em células tumorais humanas, visto que essas células são um equivalente maligno de hepatócitos normais. Nessas células, os cinco vírus testados tiveram uma taxa de replicação bastante semelhante, alcançando cerca de 100.000 novos vírus, independentemente do vírus testado inicial (Figura 20B). Portanto, a deleção dupla em VVTG17137 e COPTG19384 e a vetorização dos transgenes não prejudicou sua capacidade de replicação em células malignas. ÍNDICE TERAPÊUTICO:

[00284] Conforme ilustrado na Figura 20C, o índice calculado é apenas dois para COP WT, indicando uma baixa seletividade do COP WT para as células tumorais versus normais. Ao contrário, tanto para VVTG17137 quanto para COPTG19384 (e para ambos os lotes de vírus testados), esse índice varia de 8,2 E+03 a 1,8 E+04. Isso confirma que os dois vírus recombinantes têm a mesma boa seletividade para células tumorais versus células normais.

[00285] Esses resultados demonstraram que COPTG19384 e VVTG17137 têm propriedades replicativas muito semelhantes em células tumorais e saudáveis. Em comparação com COP WT, sua replicação em Hep G2 tumoral é semelhante, embora seja altamente prejudicada em hepatócitos

90 / 115 saudáveis. Portanto, a deleção dos dois genes (J2R e I4L) restringe a replicação do vírus deletado às células que se multiplicam (isto é, com alto agrupamento de nucleotídeos), incluindo as células tumorais. Uma vez que a expressão dos transgenes e a replicação estão intimamente ligadas, COPTG19384 é um vetor eficiente para a entrega seletiva de proteínas terapêuticas no tumor. ENSAIOS DE REPLICAÇÃO EM CEF E LoVo:

[00286] A replicação de COPTG19384 foi avaliada em CEF (células produtoras) isoladas de ovos livres de patógenos específicos embrionados com 11 ou 12 dias de idade (Charles Rivers) e em uma linhagem celular tumoral humana (LoVo; ATCC® CCL-229TM). As células CEF e LoVo foram preparadas em suspensão e infectadas em MOI de 10-3 para CEF e 10-2 para LoVo (três poços por células e por ponto de tempo). Após diferentes tempos de incubação, a titulação viral foi realizada em células Vero (CCL-81TM). A replicação de COPTG19384 foi comparada com à de VVTG17137 como referência. Os resultados mostram que a replicação de COPTG19384 e VVTG17137 foram semelhantes tanto em ambos CEF quanto em LoVo (dados não mostrados). ENSAIOS DE REPLICAÇÃO EM PELE HUMANA RECONSTRUÍDA:

[00287] A replicação de COPTG19384 também foi avaliada em pele humana reconstruída (T-Skin™/Modelo de pele de espessura total humana). Trinta e seis amostras de T-Skin™ obtidas junto à (EPISKIN SA) foram cultivadas em placas de 6 poços e mantidas em meio de cultura fresco. VVTG17137 e COPTG19384 foram distribuídos em cada poço (em triplicado) para obter a concentração final assistida (isto é, 101 a 105 pfu/poço). Um controle negativo correspondente do meio sem vírus também foi testado (Mock). As placas foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 7 dias e amostras de T-Skin™ foram coletadas e cortadas em duas partes. O título infeccioso foi determinado em uma das duas peças com o uso

91 / 115 de células Vero para titulação de vírus. A Figura 21 mostra que COPTG19384 se replica na pele reconstruída na mesma extensão que o VVTG17137 de referência, apoiando o fato de que a vetorização tanto de GM-CSF quanto de mAb 4-E03 não modificou o comportamento de replicação do vírus vaccinia na pele humana reconstruída.

ENSAIO ONCOLÍTICO

[00288] A atividade oncolítica é representativa da atividade lítica das amostras virais testadas em células tumorais. A mesma foi avaliada por quantificação da viabilidade celular após 5 dias de incubação em diferentes linhagens celulares tumorais: a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano LoVo (ATCC® CCL-229™), a linhagem celular de tumor pancreático humano MIA PaCa-2 (ATCC® CCL- 1420) e a linhagem celular de hepatocarcinoma humano HepG2 (ATCC® HB-8065™). As atividades oncolíticas de COPTG19384 foram comparadas às de VVTG17137 como referência. Um controle negativo correspondente às células não infectadas também foi semeado (células infectadas mock).

[00289] As células foram preparadas, distribuídas em tubos Eppendorf (1,2x106 células/tubo) antes de serem infectadas com o vírus em uma MOI de 10-5 a 10-2 e incubadas 30 min a 37 °C. O meio completo apropriado foi adicionado ao tubo Eppendorf e uma alíquota dessa suspensão foi adicionada em cada poço (em triplicado) em uma placa de 6 poços que contém 2 ml de meio completo apropriado. As placas foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 5 dias e a viabilidade celular foi determinada no contador Vi-Cell. Os resultados foram expressos como uma porcentagem da viabilidade celular de células infectadas mock. Os sobrenadantes celulares também foram recuperados para a determinação da concentração de mAb 4-E03 e GM- CSF. A Figura 22 mostra que as atividades oncolíticas de COPTG19384 e VVTG17137 são similares nas três linhagens celulares tumorais avaliadas.

NÍVEL DE EXPRESSÃO DE TRANSGENES

92 / 115

[00290] Os níveis de expressão tanto de anticorpo monoclonal 4-E03 quanto de GM-CSF foram medidos por ELISA (conforme descrito no Exemplo 6) em sobrenadantes de cultura de células HepG2 e LoVo recuperadas após a determinação da atividade de oncólise (5 dias de infecção em MOI variável).

[00291] Os níveis de expressão de 4-E03 e GM-CSF também foram medidos por ELISA (consultar exemplo 6) em sobrenadantes de 5 linhagens celulares cultivadas nas seguintes condições, respectivamente a linhagem celular de carcinoma gástrico humano Hs-746 T (ATCC® HTB-135™), a linhagem celular de tumor de ovário humano SK-OV-3 (ATCC® HTB-77™), a linhagem celular de tumor pancreático humano MIA PaCa-2 (ATCC® CCL-1420), a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano LoVo (ATCC® CCL-229™) e a linhagem celular de carcinoma colorretal humano HCT 116 (ATCC® CCL-247™). Cada linhagem celular foi cultivada (em triplicado) em placas de 6 poços (106 células/poço) e incubada a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h antes de ser infectada em MOI 0,05. Os sobrenadantes celulares foram, então, recuperados 48 h após a infecção para a determinação da concentração de mAb 4-E03 e GM-CSF. Conforme esperado, a MOI, o tempo pós-infecção e a linhagem celular são parâmetros importantes que impactam o nível de expressão de transgenes em sobrenadantes de células infectadas. A Figura 23A mostra que uma linhagem celular tumoral bastante permissiva à replicação (HepG2) e bastante resistente (LoVo), quando infectada por COPTG19384, é capaz de produzir em seus sobrenadantes de cultura aproximadamente a mesma quantidade de mAb 4-E03 e GM-CSF. No entanto, o máximo de expressão para o HepG2 é alcançado em uma MOI 10 vezes menor do que para o LoVo. Além disso, para as 5 linhagens celulares tumorais testadas, a expressão de transgenes foi acima de 0,1 e acima de 1 µg/ml para mAb 4-E03 e GM-CSF, respectivamente (Figura 23B). Deve-se verificar que o ensaio ELISA usado para medir a concentração de mAb 4-E03

93 / 115 usa o antígeno CTLA4 para capturar o anticorpo. Em outras palavras, os anticorpos medidos por este ensaio são pelo menos parcialmente funcionais (isto é, reconhecendo seu antígeno, as outras funções do anticorpo são transportadas pela parte Fc), PURIFICAÇÃO DE MAB 4-E03 E ANÁLISE DE PERFIL DE

GLICOSILAÇÃO

[00292] Para produzir uma quantidade bastante grande de mAb 4-E03 a partir de células infectadas, 15 frascos de F175 que contêm aproximadamente 4,7 107 células Mia-PACA/frasco foram infectados em MOI 0,01 com COPTG19384 e incubados por 72 h. O sobrenadante da cultura de células MIA Paca-2 (cerca de 450 ml que contêm 670 µg de mAb 4-E03, conforme determinado por ELISA) foi colhido, agrupado e clarificado por meio de centrifugação para remover a maioria dos resíduos celulares. Os sobrenadantes limpos foram filtrados em filtros de 0,2 µm e foram adicionados EDTA 2 mM (para inibir as proteases metálicas putativas) e Tris 20 mM a pH 7,5 (para aumentar o pH). O sobrenadante filtrado foi, então, passado através de uma coluna protA Hitrap (GE Healthcare, ref 17-5079-01). A coluna foi transferida e conectada ao Purificador FPLC (GE Healthcare) e o programa de purificação (THM/ ProtA 1 ml de ciclo de injeção frac bleu) foi aplicado. As frações eluídas que contêm o mAb foram carregadas em géis NuPage Bis-Tris a 4 a 12% (Thermo NP0323) após a adição de tampão Laemlli (Biorad) que contém, ou não, betamercaptoetanol para a redução, ou não, das ligações de dissulfeto do mAb. O gel foi corado com InstantBlue (Expedeon, ISB1L). Três frações correspondentes ao pico principal de eluição foram agrupadas e, após a diálise contra o tampão de formulação, a concentração de anticorpo foi determinada por absorvância a 280 nM. A concentração final do mAb purificado foi de 0,29 mg/ml.

[00293] A primeira caracterização foi uma avaliação da montagem de cadeias por eletroforese sob condições redutoras e não redutoras. Sob

94 / 115 condições não redutoras, as 2 cadeias leves e as 2 cadeias pesadas se unem para formar o anticorpo nativo e funcional. Aparentemente, o 4-E03 purificado de MIA PaCa-2 infectado e o 4-E03 produzido de forma recombinante têm perfis de eletroforese indistinguíveis tanto sob condições redutoras quanto sob não redutoras. Em outras palavras, o 4-E03 purificado de MIA PaCa-2 infectado tem a proporção esperada de cadeias leves e pesadas e é, corretamente, unido com heterotetrâmero de 2 cadeias leves e 2 de cadeias pesadas. A presença desse heterotetrâmero também foi confirmada por espectrometria de massa. O mAb purificado foi submetido à espectrometria de massa para análise de glicosilação. Em suma, o mAb foi digerido, ou não, com a IdeS protease que cliva especificamente a IgG na dobradiça (resultando em partes de F(ab’)2 e Fc). As massas de todo o anticorpo ou partes de Fc que contêm a N-glicosilação foram determinadas e cada massa foi ajustada com uma massa teórica calculada a partir da sequência primária de Fc e um padrão de glicosilação. O perfil de glicosilação de mAb 4-E03 purificado a partir de MIA PaCa-2 infectado foi comparado com aquele produzido e purificado de forma recombinante 4-E03 e MabThera como referência para IgG1 humana usada na clínica. Os resultados mostram que os perfis de glicosilação de 4-E03 produzidos a partir de MIA PaCa2 infectado tiveram um perfil de glicosilação diferente das duas referências de anticorpos com uma maioria de G0F (88%) enquanto tanto 4-E03 recombinante quanto MabThera têm um perfil de glicosilação similar com a distribuição típica de G0F, G1F e G2F. Contudo, suspeita-se que MIA PaCa-2 seja a causa das espécies com baixo teor de G1F e G2F no mAb 4-E03 purificado devido a um baixo nível de 1 transcrito de Beta-1,4- Galactosiltransferase, o que pode ser a causa da falta de porção química de galactosila (e, portanto, uma falta de G1f e G2F) do 4-E03 expresso em MIA PaCa-2.

[00294] O mesmo tipo de purificação seguido por análise de massa

95 / 115 também foi realizado a partir do permeado recuperado durante a purificação do COPTG19384 produzido em CEF. Os resultados mostram que os perfis de glicosilação de 4-E03 de CEF infectado eram muito semelhantes aos de MabThera ou 4-E03 recombinante. Este último resultado sugere que o perfil de glicosilação do anticorpo é mais impactado pela linhagem celular usada do que pela própria infecção.

[00295] 4-E03 purificado a partir do sobrenadante de células MIA PaCa-2 infectadas (4-E03 TG) também exibe as mesmas características de ligação que 4-E03 produzido de forma recombinante por células CHO (lote de pesquisa) ou HEK (lote tox) (Figuras 24 e 25) Isto foi demonstrado por ELISA (descrito no Exemplo 1) para testar a ligação à proteína de CTLA-4 humana recombinante (Figura 24A) e (Figura 24B) de cinomolgo. Uma análise de FACS, em que a ligação a células que expressam CTLA-4 humanas (Figura 25A) e de cinomolgo (Figura 25B) foi testada (consultar Exemplos 1 e 2), confirmou a reatividade cruzada e as afinidades de ligação similares para os diferentes lotes de 4-E03. PADRÃO DE GLICOSILAÇÃO DE GM-CSF E LIGAÇÕES DE

DISSULFETO

[00296] Para investigar o padrão de glicosilação e a presença de algumas ligações de dissulfeto, diferentes linhagens celulares tumorais humanas foram infectadas por COPTG19384 e seus sobrenadantes foram analisados pelo mesmo método WB. Células MIA-Paca-2, LoVo, HepG2 e HCT116 foram infectadas a MOI 0,01 e incubadas 72 h em meio de cultura sem soro. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos, clarificados por centrifugação e depois filtrados em filtro de 0,2 µm. Os sobrenadantes foram armazenados a -20 °C até a análise. Os mesmos foram tratados por meio da adição de 8 µl de Tampão F Rapid PNGase 5X seguido por uma incubação a 75 °C durante 5 minutos. Um µl de PNGase F foi, então, adicionado (para remover N-glicanos da glicoproteína) e a mistura foi incubada 30 minutos a

96 / 115 50 °C. Vinte e cinco µl das amostras foram preparadas pela adição de 5 µl de tampão Laemmlix4 com ou sem betamercaptoetanol (condições redutoras e não redutoras) antes de serem submetidas a Western Blotting. Os imunocomplexos foram detectados usando-se Western Blotting Amersham ECL Prime e a quimioluminescência foi registrada com uma Imagiologia Molecular ChemiDOC XRS (Biorad).

[00297] O GM-CSF de HCT116, LoVo e MIA PaCa-2 infectados exibiu o mesmo padrão de glicosilação, enquanto o GM-CSF produzido através de HepG2 infectado migrou como uma molécula não N-glicosilada. Esses resultados indicam que o GM-CSF produzido pelas células tumorais humanas infectadas com COPTG19384 tem as modificações pós-tradução esperadas (isto é, ligações de dissulfeto e N-glicosilação). No entanto, essas modificações, provavelmente, variam dependendo das linhagens celulares tumorais usadas para a infecção e de seu estado metabólico específico. EXEMPLO 8: FARMACOCINÉTICA APÓS INJEÇÕES INTRATUMORAIS DE COPTG19384

CINÉTICA DE EXPRESSÃO EM TUMOR E CORRENTE SANGUÍNEA DE ANTICORPOS ANTI-CTLA4, GM-CSF E VÍRUS APÓS INJEÇÃO INTRATUMORAL (I.T.) DE VÍRUS VACCINIA EM UM MODELO XENOENXERTADO COM LoVo.

PROTOCOLO

[00298] 5x106 células LoVo foram implantadas no flanco direito de camundongos nus Swiss (Charles River, França). Após cerca de duas semanas, quando o volume dos tumores alcançou aproximadamente 120 mm3, os camundongos foram randomizados e divididos em 6 grupos de 15 animais.

[00299] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de COPTG19384 a uma dose de 1x104 pfu/camundongo em D0 (primeiro dia de tratamento).

[00300] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma

97 / 115 administração i.t. de COPTG19384 a uma dose de 1x105 pfu/camundongo em D0.

[00301] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de VVTG17137 a uma dose de 1x104 pfu/camundongo em D0.

[00302] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.t. de VVTG17137 a uma dose de 1x105 pfu/camundongo em D0.

[00303] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração intraperitoneal (i.p.) de 4-E03 a uma dose de 3 mg/kg em D0.

[00304] ● Os camundongos do grupo 6 receberam uma administração i.p. de ipilimumabe (Yervoy) a uma dose de 3 mg/kg em D0.

[00305] O tumor e o sangue de 3 animais foram coletados nos dias 1, 3, 6, 10 e 20. Os tumores foram pesados e homogeneizados para processamento imediato. Um quarto dos tumores homogeneizados foi coletado para titulação de vírus e a suspensão restante foi centrifugada e os sobrenadantes foram armazenados a -20 °C até o uso. O sangue foi dividido em duas partes: uma foi adicionada ao tubo de heparina (25 UI/100 µl de sangue) para o ensaio de titulação e congelada a -80 °C até a análise. Os soros clarificados foram produzidos a partir da outra parte e armazenados a -20 °C até o uso. A titulação de vírus foi determinada em amostras de tumor e sangue por titulação em células Vero. CINÉTICA DE REPLICAÇÃO DE VÍRUS NO MODELO DE LoVo:

[00306] No modelo de LoVo, em que COPTG19384 foi injetado uma vez em duas doses (1x104 ou 1x105 pfu), a replicação do vírus foi monitorada e comparada com a de VVTG17137 injetado sob as mesmas condições. Os resultados exibidos na Figura 26 mostram uma dispersão importante dos três valores de titulações de vírus medidos para cada ponto de tempo. De qualquer forma, os resultados mostram, também, que ambos os vírus e em ambas as

98 / 115 doses se replicam no tumor e mantêm um título bastante alto/g de tumor do dia 3 até 20 dias após a injeção. Não há diferença óbvia de titulação de vírus, para um determinado ponto de tempo, entre as duas doses de vírus ou entre os dois vírus usados. Curiosamente, todas as amostras de sangue foram negativas para detecção de vírus, exceto uma amostra (VVTG17137, dose: 1x107 de pfu no Dia 10) para a qual apenas 13 pfu/ml foram detectados (dados não mostrados).

[00307] Juntos, esses resultados indicam que, após uma injeção i.t. de qualquer um dentre 1x104 ou 1x105 pfu, a replicação do vírus foi mantida em tumores de LoVo por pelo menos 20 dias com uma presença quase imperceptível na corrente sanguínea. Deve-se verificar que o modelo xenoenxertado com LoVo é muito favorável à replicação do vírus, pois o mesmo usa células tumorais humanas permissivas e camundongos nus suíços que têm um sistema imunológico gravemente prejudicado com, portanto, uma atividade antiviral limitada. CINÉTICA DA EXPRESSÃO DE TRANSGENES NO MODELO DE LoVo:

[00308] Conforme esperado, a cinética da expressão de transgenes no tumor seguiu a cinética de replicação de vírus com uma concentração máxima (Cmax) nos dias 6 ou 10 tanto para mAb 4-E03 (Figura 27A) quanto para GM- CSF (Figura 27B). No caso da única injeção de mAb 4-E03 (ou Ipilimumabe), a Cmax no tumor e no sangue foram observadas no primeiro ponto de tempo (dia 1) e as concentrações medidas a seguir de mAb estavam de acordo com a farmacocinética de um IgG1 humana em camundongo (Figuras 28).

[00309] Além disso, as concentrações de 4-E03 no tumor em Cmax e posteriormente (ou seja, de 6 a 10 a 20 dias após a injeção) foram cerca de 10 vezes maiores após o tratamento com COPTG19384 (para ambas as doses) do que após uma única injeção de mAb 4-E03 a uma dose terapêutica de 3 mg/kg (Figura 27A). Em contrapartida, a concentração no sangue do mAb após o

99 / 115 tratamento com COPTG19384 foi sempre inferior às medidas após a injeção i.p. de 3 mg/kg de 4-E03 (Figura 28A). Este resultado indica que a vetorização de mAb permite alcançar alta concentração no tumor sem exceder ou mesmo alcançar a concentração sanguínea obtida na dosagem terapêutica de mAb.

[00310] A cinética de expressão de GM-CSF após o tratamento com COPTG19384 segue a observada com 4-E03 (Figura 27B). Curiosamente, os níveis de GM-CSF medidos no tumor estão abaixo do nível de 4-E03 para as mesmas amostras, embora LoVo in vitro infectada por COPTG19384 expresse cerca de duas vezes mais GM-CSF do que 4-E03. As concentrações sanguíneas de GM-CSF também foram muito baixas em comparação com as de 4-E03 (Figura 28B). Este resultado está de acordo com a meia-vida in vivo de GM-CSF que é muito curta em comparação com a de uma IgG1 humana.

[00311] Estes resultados indicam que os anticorpos vetorizados e GM- CSF são expressos principalmente no tumor após a injeção i.t. de COPTG19384 com uma exposição sistêmica mínima. Estes resultados confirmam que a vetorização é, particularmente, adequada para transgenes com problemas toxicológicos (por exemplo, anti-CTLA4) ou farmacocinéticos (por exemplo, GM-CSF).

CINÉTICA DE EXPRESSÃO EM TUMOR E CORRENTE SANGUÍNEA DE ANTICORPOS ANTI-CTLA4, GM-CSF E VÍRUS APÓS INJEÇÃO

INTRATUMORAL DE VÍRUS VACCINIA EM UM MODELO SINGÊNICO CT26

[00312] A avaliação das atividades virais no modelo murino imunocompetente CT26 requer a geração de vários vírus substitutos que codificam um antimCTLA4 murino com ou sem o GM-CSF murino:

[00313] ● COPTG19407 é um vírus Vaccinia (cepa Copenhagen) que contém um cassete de expressão que codifica a cadeia pesada de IgG2 m5-B07 murina (SEQ ID NO: 63) sob o promotor p7.5 no lócus J2R e um

100 / 115 cassete de expressão que codifica a cadeia leve de m5-B07 (SEQ ID NO: 62) sob o promotor p7.5 e GM-CSF murino (SEQ ID NO: 58) sob o promotor pSE/L no lócus I4L.

[00314] ● COPTG19421 é um vírus Vaccinia (cepa Copenhagen) que contém um cassete de expressão que codifica a cadeia pesada de m5-B07 sob o promotor p7.5 no lócus J2R, e um cassete de expressão que codifica a cadeia leve de m5-B07 sob o promotor p7.5 no lócus I4L.

[00315] ● VVTG18058, usado como referência, é um vírus Vaccinia (cepa Copenhagen) deletado nos genes J2R e I4L, sem qualquer transgene (vírus “vazio”).

[00316] Esses vírus vaccinia foram gerados como para os equivalentes humanos por duas recombinações homólogas sucessivas nos loci J2R (TK) e, em seguida, I4L (RR) seguindo o processo descrito no exemplo 6. O método ELISA para quantificar o anticorpo m5-B07 e mGM-CSF foi similar ao descrito acima (exemplo 6, “expressão de transgene” para 4-E03 e GM-CSF), com exceção de que o antígeno CTLA4-Fc murino foi usado para capturar o anticorpo murino e o kit Quantikine ELISA de GM-CSF de camundongo (R&D Systems) foi usado para quantificar mGM-CSF. A atividade oncolítica desses vírus também foi avaliada em várias linhagens celulares (um sarcoma: MCA205 e dois carcinoma de cólon CT26 e MC38) e considerada similar à de VVTG18058, mostrando que a vetorização do anticorpo murino com ou sem o mGM-CSF não impactou as capacidades oncolíticas do vírus vaccinia (dados não mostrados).

[00317] Protocolo:células CT26 (2x105 células) foram implantadas no flanco direito de camundongos Balb/c (Charles River, França). Após cerca de uma semana, quando o volume de tumores alcançou 25 a 50 mm3, os camundongos foram randomizados e divididos em 3 grupos de 20 animais (grupos 1 a 3) e um grupo de 4 de 10 animais. O tumor e o sangue foram coletados e tratados, conforme descrito para o modelo de LoVo, com exceção

101 / 115 de que os mesmos foram coletados nos dias 1, 4, 8 e 10 para os primeiros 3 grupos e no dia 1 para o grupo 4.

[00318] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 1x107 pfu/camundongo em D0, D2 e D4.

[00319] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 1x107 pfu/camundongo em D0, D2 e D4.

[00320] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de COPTG19421 a uma dose de 1x107 pfu/camundongo em D0, D2 e D4.

[00321] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.p. de m5-B07 a uma dose de 3 mg/kg em D0. CINÉTICA DE REPLICAÇÃO DE VÍRUS NO MODELO DE CT26:

[00322] No modelo de CT26, em que dois vírus substitutos foram injetados três vezes (1x107 pfu/injeção), a replicação do vírus foi monitorada e comparada com a de VVTG18058 injetado sob as mesmas condições. Os resultados apresentados na Figura 29 mostram, como para o modelo de LoVo, uma dispersão importante dos três valores de titulações de vírus medidos para cada ponto de tempo. No entanto, os títulos para os três vírus foram mantidos ao longo do tempo e por até 10 dias, indicando que os dois transgenes não impactaram na eliminação ou na replicação do vírus, pelo menos nesta janela de tempo. Nenhuma partícula infecciosa de vírus foi detectada em qualquer uma das amostras de sangue (dados não mostrados). CINÉTICA DA EXPRESSÃO DE TRANSGENES NO MODELO DE CT26

[00323] Como para o modelo de LoVo, a expressão dos transgenes no tumor refletiu a replicação de vírus. Em outras palavras, o anticorpo m5-B07 (Figura 30A) e o mGM-CSF (Figura 30B) foram detectados no tumor a um nível bastante constante ao longo dos 10 dias de monitorização.

102 / 115

[00324] No caso do anticorpo monoclonal, a Cmax alcançada após as injeções de COPTG19421 ou COPTG19407 foi cerca de 10 vezes menor do que a Cmax observada com uma única injeção i.p. do anticorpo m5-B07 a 3 mg/ml (Figura 30A). No soro, a diferença foi ainda mais pronunciada com uma concentração circulante de m5-B07 aproximadamente 100 vezes menor após tratamentos de vírus versus injeção de m5-B07 a 3 mg/kg (Figura 31).

[00325] Para GM-CSF, apenas o tratamento por COPTG19407 produziu uma concentração mensurável de mGM-CSF em tumores CT26, indicando que a citocina medida tinha uma origem recombinante, em vez de endógena. Como no modelo de LoVo, as concentrações de mGM-CSF medidas no tumor foram menores do que as de m5-B07 (Figura 30B). Além disso, o mGM-CSF produzido pelo tumor não foi detectável em nenhuma amostra de soro, provavelmente devido a uma meia-vida curta da molécula que impede qualquer acumulação sistêmica. EXEMPLO 9: ESTUDOS DE ATIVIDADE ANTITUMORAL

[00326] COPTG19347 é um vírus Vaccinia (cepa de Copenhagen) deletado nos genes J2R e I4L e que codifica um anticorpo murino inteiro (a saber, m5-B07, cadeias pesada e leve), reconhecendo o antígeno CTLA4 murino. COPTG19421 versus COPTG19347 expressa ambos m5-B07, mas sob diferentes promotores: a saber, p7.5K e pH5.R, respectivamente. A quantificação de m5-B07 foi avaliada em sobrenadantes de células infectadas que alcançaram cerca de 1 µg/ml em CT26 infectado em MOI 10-1 a cerca de 4 µg/ml em células MCA205 infectadas em MOI 10-2. A expressão mais elevada em MCA205 versus CT26 foi observada também para mGM-CSF no sobrenadante de cultura de células infectadas por meio de COPTG19407 (dados não mostrados).

ATIVIDADE ANTITUMORAL EM CAMUNDONGOS PORTADORES DE MODELO DE CT26 EM COMBINAÇÃO COM ANTIPD1 PROTOCOLO:

103 / 115

[00327] Células CT26 (2x105 células) foram implantadas no flanco direito de camundongos Balb/c (Charles River, França). Quando os tumores alcançaram um volume de 25 a 50 mm³, os camundongos foram randomizados em cinco grupos de dez animais. Em suma, os camundongos foram tratados por três administrações i.t., 2 dias de intervalo, de vírus seguido de tratamento i.p. de antiPD1 murino (RMP1-14 BioXcell) duas vezes por semana durante três semanas. Mais especificamente,

[00328] ● Os camundongos do grupo 1 receberam veículo;

[00329] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.t. de 1x107 pfu de COPTG19347 em D0, D2 e D4;

[00330] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de 1x107 pfu de COPTG19347 em D0, D2 e D4 e administração intraperitoneal i.p. de 250 µg/camundongo de RMP1-14, em D7, D11, D14, D18 e D22;

[00331] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.p. de 250 µg/camundongo de RMP1-14, em D7, D11, D14, D18 e D22;

[00332] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração i.t. de 1x107 pfu de VVTG18058 em D0, D2 e D4.

[00333] As dimensões do tumor foram medidas duas vezes por semana com compassos e seus volumes foram calculados com o uso da fórmula (ᴨ/6)(comprimento x largura2). Os animais foram submetidos à eutanásia quando o volume tumoral alcançou 2.000 mm3. ATIVIDADES ANTITUMORAIS DE COPTG19347 NO MODELO DE CT26:

[00334] Conforme ilustrado na Figura 32, o tratamento com COPTG19347 levou não apenas à inibição de crescimento de tumor (Figura 32A), mas também à regressão do tumor que, por fim, se traduz em camundongos sem tumor que sobrevivem até 100 dias (Figura 32B). O

104 / 115 tratamento com COPTG19347 levou a 60% de camundongos livres de tumor no dia 100. O cotratamento com anticorpo antiPD-1 não melhorou significativamente a inibição de crescimento de tumor ou a porcentagem de camundongos sobreviventes por muito tempo (cerca de 70% de camundongos livres de tumor no dia 100). Em comparação, o tratamento com RPMI-14 não forneceu nenhum efeito antitumoral (mesmo comportamento dos camundongos não tratados (todos mortos nos primeiros 40 dias), enquanto o VVTG18058 teve uma atividade fraca (cerca de 10% de camundongos sem tumor no dia 100). AVALIAÇÃO DO EFEITO DA DOSE NO MODELO DE CT26:

[00335] Os três vírus substitutos foram comparados (promotor diferente para conduzir m5-B07 e com ou sem m-GM-CSF) e um escalonamento de dose de COPTG19407 versus VVTG18058 foi realizado (7,5x104, 7,5x105 ou 7,5x106 pfu). As condições experimentais foram exatamente como as descritas acima, exceto que o cotratamento com antiPD1 foi omitido.

[00336] Os resultados de duas experiências independentes demonstraram, claramente, que os três vírus testados COPTG19407, COPTG19421 e COPTG19347 tiveram uma forte atividade antitumoral na dose de 7,5x106 pfu. Isso confirma que nem o mGM-CSF codificado em COPTG19407 nem o uso de um promotor mais fraco em COPTG19421 e COPTG19407 prejudicou a atividade antitumoral dos vírus armados. Na dose mais alta testada (isto é, 7,5x106 pfu), o número de camundongos livres de tumor em 80 dias estava entre 5/10 e 7/10 dependendo do vírus e do experimento versus 0/10 para os camundongos tratados com o vírus vazio, conforme resumido na Tabela a seguir. TABELA 6 : EFEITO DOS VÍRUS SUBSTITUTOS COPTG19407, COPTG19421 E COPTG19347 NO CRESCIMENTO DO TUMOR APÓS AS INJEÇÕES I.T.

105 / 115 Nome do vírus Lócus TK Lócus RR Dose (pfu) Número de camundongos livres de tumor em D100 COPTG19407 p7.5K -HC* p7.5K -LC*; 7,5x106 7/10 pSE/L-GM-CSF COPTG19421 p7.5K -HC* p7.5K -LC * 7,5x106 5/10 COPTG19347 pH5.R -HC* pH5.R -LC* 7,5x106 7/10 VVTG18058 - - 7,5x106 0/10 Mock - 0/10 *HC e LC representam cadeia pesada e leve de anticorpo antimCTLA4 murino m5-B07, respectivamente

[00337] Além disso, o escalonamento de dose realizado com o vírus “vazio” (VVTG18058) e o substituto de COPTG19384 (COPTG19407) demonstrou que, mesmo em uma dose relativamente baixa (7,5x104 pfu), o vírus que expressa o anticorpo ainda teve algumas atividades antitumorais claras com 4/10 e 2/10 de camundongos livres de tumor em 80 a 98 dias versus 0/10 para o tratamento com VVTG18058 na mesma dose baixa mostrada na Tabela a seguir. TABELA 7: EFEITO DA DOSE DE COPTG19407 OU VVTG18058 NO CRESCIMENTO DE TUMOR APÓS INJEÇÕES I.T. Nome do vírus Lócus TK Lócus RR Dose (pfu) Número de camundongos livres de tumor em D100 COPTG19407 p7.5K -HC* p7.5K -LC*; pSE/L-GM-CSF 7,5x106 7/10 7,5x105 8/10 7,5x104 4/10 VVTG18058 - - 7,5x106 0/10 7,5x105 0/10 7,5x104 0/10 *HC e LC representam cadeia pesada e leve de anticorpo antimCTLA4 murino m5-B07, respectivamente

[00338] Uma compilação de dados de sobrevivência (gráfico de sobrevivência global compilado de dois estudos independentes) é apresentada na Figura 33. Uma análise estatística, que usa o teste de logrank, foi realizada para descobrir se havia diferenças significativas entre a sobrevivência de cada grupo. ATIVIDADE ANTITUMORAL DE COPTG19407 EM COMPARAÇÃO COM A COMBINAÇÃO DE VVTG18058 MAIS M5-B07

[00339] Camundongos portadores de tumor CT26 foram preparados conforme descrito anteriormente (Exemplo 5). Em suma, células CT26 foram injetadas s.c. em camundongos BALB/c. O tratamento dos camundongos foi

106 / 115 iniciado quando os tumores alcançaram aprox. 100 mm3. Os camundongos foram, então, injetados em D0, D2 e D5 com COPTG19407 (8,5x106 pfu i.t.), VVTG18058 (8,5x106 pfu i.t.), m5-B07 (10 mg/kg i.p.) ou a combinação de VVTG18058 (8,5x106 pfu i.t.) mais m5-B07 (10 mg/kg i.p.). As dimensões de tumor foram medidas duas vezes por semana e os camundongos foram sacrificados quando os tumores alcançaram 2.000 mm3. Conforme mostrado nas Figuras 34A a 34D, o crescimento de tumor foi, significativamente, inibido quando os camundongos foram tratados com o vírus COPTG19407 que expressa anti-CTLA-4 e GM-CSF, enquanto a combinação do vírus desarmado mais m5-B07 anti-CTLA4 não resultou em terapia melhorada comparada ao uso de um único agente. Nos grupos tratados apenas com m5- B07, apenas no vírus VVTG18058 ou na combinação tanto de m5-B07 quanto de VVTG18058, apenas 20% dos camundongos sobreviveram após o dia 70 (Figura 34E). Em contrapartida, 90% dos camundongos sobreviveram mais de 100 dias após a administração de COPTG19407, demonstrando a potência da estratégia de vetorização. ATIVIDADE ANTITUMORAL DE VVTK-RR- QUE CODIFICA ANTI- CTLA-4 E GM-CSF EM CAMUNDONGOS COM LINFOMA DE CÉLULAS B MURINAS SUBCUTÂNEAS A20

[00340] A linhagem celular A20 é uma linhagem de linfoma de células de BALB/c B derivada de uma neoplasia de células de retículo espontânea encontrada em um camundongo BALB/cAnN idoso (ATCC TIB-208TM). PROTOCOLO (1):

[00341] Os tumores foram induzidos por meio de injeção subcutânea de 5x106 células A20 no flanco direito de camundongos Balb/cN fêmea (Charles River, França). Quando os tumores alcançaram um volume médio de 95 mm³, 50 camundongos foram randomizados em 5 grupos de dez animais.

[00342] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de veículo em D0, D2 e D4,

107 / 115

[00343] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4,

[00344] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4,

[00345] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24,

[00346] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4 combinada com uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24. ATIVIDADE ANTITUMORAL:

[00347] Os volumes tumorais de todos os animais foram monitorados ao longo do estudo. A atividade antitumoral dos tratamentos é baseada na avaliação dos critérios de tempo de duplicação de tumor, retardo de crescimento de tumor e inibição de crescimento de tumor (T/C%).

[00348] O tempo de duplicação de tumor foi similar para os Grupos 1, 2 e 4, variando de 5,14 dias (Grupo 1) a 6,37 dias (Grupo 2). Para o Grupo 3, o tempo de duplicação de tumor não pôde ser calculado com precisão, uma vez que os tumores não cresceram exponencialmente, indicando um aumento da eficácia do tratamento, em comparação com os Grupos 1, 2 e 4. De modo similar, o tempo de duplicação de tumor foi calculado usando-se apenas um animal no Grupo 5. 9 de 10 camundongos no Grupo 3 tiveram tumores que regrediram em D15 e que não cresceram substancialmente em volume a partir de D25 até o final do estudo em D64. No D64, os volumes tumorais desses 9 camundongos estavam na faixa de 4 mm³ (limite técnico de detecção de tumor) a 59,77 mm³. De modo similar, no Grupo 5, os tumores regrediram em

108 / 115 9 camundongos após o início do tratamento, para alcançar valores que estavam na faixa de 7,24 a 63,21 mm³ no final do estudo em D64. Como pode ser visto na Figura 35 que apresenta as curvas de volume tumoral individuais de cada grupo de tratamento (Grupos 1 a 5 correspondendo às Figuras 35A a 35E), os tumores não cresceram nos animais dos grupos 3 e 5 que receberam COPTG19407, confirmando a forte atividade antitumoral do vírus que expressa o anticorpo com ou sem antiPD1.

[00349] O retardo no crescimento do tumor foi calculado estimando-se o tempo necessário para que os tumores alcançassem o volume-alvo médio de 300 mm³. Os resultados foram similares aos obtidos com o tempo de duplicação tumoral, pois esse parâmetro somente pôde ser calculado para tumores que alcançaram o volume-alvo de 300 mm³, o que não ocorreu para a maioria dos animais dos Grupos 3 e 5. Os grupos 1, 2 e 4 tiveram retardos médios no crescimento do tumor de 16, 21 e 17 dias, respectivamente, que não foram significativamente diferentes uns dos outros. Além disso, os Grupos 3 (n = 2) tiveram um retardo tumoral médio de 14 dias, o que indicou que os tumores que cresceram neste grupo, cresceram na mesma taxa que os Grupos 1, 2 e 4, no entanto, esses tumores realmente regrediram em ambos os animais. Em comparação, o único tumor do Grupo 5 (n = 1) que cresceu teve um retardo de crescimento de tumor significativamente mais longo (p ≤ 0,0026) do que todos os outros grupos, de 43 dias.

[00350] A inibição do crescimento de tumor (T/C%) foi calculada comparando-se o volume médio do tumor do Grupo 1 tratado com veículo com os outros grupos de tratamento. O Grupo 2 teve um T/C% ideal de 34% em D22, indicando uma atividade antitumoral marginal transitória, mas esse valor aumentou até 71% em D31. A atividade antitumoral moderada (10 a 30% T/C%) foi observada no Grupo 4. Em comparação, os Grupos 3 e 5 mostraram atividade antitumoral marcada (T/C% menor do que 10%) de D27 a D31 (último valor calculável de T/C%).

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[00351] A Figura 36 ilustra as curvas de volume tumoral médio em camundongos BALB/cN com tumores A20 subcutâneos que demonstram o efeito drástico do vírus COPTG19407 que expressa anti-CTLA4 e Gm-CSF com ou sem antiPD1 no crescimento de tumor. PROTOCOLO (2):

[00352] Os tumores foram induzidos por meio de injeção subcutânea de 5x106 de células A20 no flanco direito de camundongos BALB/cN fêmeas. Quando os tumores alcançaram um volume médio de 80 a 100 mm3, 90 animais foram randomizados em 9 grupos de 10 animais.

[00353] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de veículo em D0, D2 e D4.

[00354] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 μg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14 e D17.

[00355] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.p. de isótipo a uma dose de 250 μg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14 e D17.

[00356] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4.

[00357] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4 e uma administração i.p. de isótipo a uma dose de 250 μg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14 e D17.

[00358] ● Os camundongos do grupo 6 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4 e uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 μg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14 e D17.

[00359] ● Os camundongos do grupo 7 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4.

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[00360] ● Os camundongos do grupo 8 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4, combinada com uma administração i.p. de isótipo a uma dose de 250 µg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14, D17 e D24.

[00361] ● Os camundongos do grupo 9 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 1x105 pfu em D0, D2 e D4, combinada com uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg/camundongo/injeção em D0, D4, D7, D10, D14 e D17. ATIVIDADE ANTITUMORAL:

[00362] A dose de COPTG19407 é subideal e demonstrou uma atividade antitumoral leve similar à do tratamento antiPD-1 em termos de volume tumoral e sobrevivência de camundongos.

[00363] Em contrapartida, a combinação de COPTG19407 com antiPD-1 mostrou uma forte atividade antitumoral, resultando em um pequeno volume tumoral em comparação com os outros grupos, conforme mostrado na Figura 37A (aproximadamente 290 mm3 no dia 36 em comparação com aproximadamente 630 mm3 e 750 mm3 no dia 24 para camundongos que receberam antiPD-1 isoladamente ou COPTG19407 isoladamente, respectivamente), e uma sobrevivência muito melhor dos animais, conforme apresentado na Figura 37B (7 animais ainda vivos no dia 57 no grupo 9 versus apenas dois ou um nos grupos 2 ou 7, respectivamente). ESTUDO DE ATIVIDADE ANTITUMORAL DE VVTK- RR- QUE CODIFICA ANTI-CTLA-4 E GM-CSF EM CAMUNDONGOS

PORTADORES DE CÉLULAS TUMORAIS DE CÓLON SUBCUTÂNEO C38

[00364] C38 é um adenocarcinoma de cólon murino originado de American Type Culture Collection (ATCC CRL-2779TM). PROTOCOLO:

[00365] Fragmentos de tumor (30 a 50 mg) foram implantados por via

111 / 115 subcutânea no flanco direito de camundongos C57BL/6J fêmeas (Janvier, França). Quando os tumores alcançaram um volume médio de aproximadamente 60 mm³, 50 animais foram randomizados em cinco grupos de dez animais.

[00366] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de veículo em D0, D2 e D4,

[00367] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.t. de um VVTG18058 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4.

[00368] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4.

[00369] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.p. do anticorpo antiPD-1 murino a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24.

[00370] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4 combinada com uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24. ATIVIDADE ANTITUMORAL:

[00371] Como antes, os volumes do tumor de todos os animais foram monitorados ao longo do estudo. O tempo de duplicação de tumor foi similar para os Grupos 1 e 2 em aproximadamente 6,7 dias. Grupo 4 (n = 5) teve um maior tempo de duplicação de tumor (10,4 dias), mas não houve diferenças significativas entre os grupos. Para os Grupos 3 e 5, o tempo de duplicação de tumor foi calculável, mas com menos animais (n = 2), uma vez que a maioria dos tumores em camundongos nesses grupos não cresceu exponencialmente, indicando um aumento da eficácia de tratamento, em comparação com os Grupos 1, 2 e 4. Como pode ser visto na Figura 38, 8 de 10 camundongos no

112 / 115 Grupo 3 tiveram tumores que regrediram a partir de D15 e que não cresceram substancialmente em volume, com cinco camundongos sem tumores detectáveis no final do estudo em D61. De modo similar, no Grupo 5, os tumores regrediram em 8 camundongos após o início do tratamento, para alcançar valores na faixa de 0 (n = 2) a 47,82 mm³ no final do estudo em D61.

[00372] O retardo no crescimento do tumor foi calculado estimando-se o tempo necessário para que os tumores alcançassem o volume-alvo médio de 300 mm³. Os resultados foram similares aos obtidos com o tempo de duplicação tumoral, pois esse parâmetro somente pôde ser calculado para tumores que alcançaram o volume-alvo de 300 mm³, o que não ocorreu para a maioria dos animais dos Grupos 3 e 5. Não houve diferenças significativas entre os grupos. Os grupos 1, 2 e 4 (n = 5) tiveram retardos médios no crescimento de tumor de 23 a 27 dias, respectivamente. Além disso, os Grupos 3 (n = 2) e 5 (n = 3) tiveram retardos médios de crescimento de 18 e 24 dias, respectivamente. Isso indicou que os tumores que cresceram nesses dois grupos, cresceram em taxas similares às dos Grupos 1, 2 e 4.

[00373] A inibição do crescimento de tumor (T/C%) foi calculada comparando-se o volume médio do tumor do Grupo 1 tratado com veículo com os outros grupos de tratamento. O Grupo 2 não mostrou qualquer inibição do crescimento tumoral, uma vez que T/C% permaneceu acima de 100% durante o estudo. Em comparação, os Grupos 3, 4 e 5 mostraram, todos, atividade antitumoral marcada (T/C% menor do que 10%) de D31 (Grupo 3 apenas) a D42 (último valor calculável de T/C%).

[00374] A Figura 39 ilustra as curvas de volume tumoral médio de camundongos C57BL/6 portadores de tumores C38 subcutâneos que demonstram o efeito drástico do vírus COPTG19407 que expressa anti- CTLA4/GM-CSF com ou sem antiPD1 sobre o crescimento de tumor. ESTUDO DE ATIVIDADE ANTITUMORAL DE VVTK-RR- QUE CODIFICA ANTI-CTLA-4 E GM-CSF EM CAMUNDONGOS

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PORTADORES DE CÉLULAS TUMORAIS DE MAMA SUBCUTÂNEAS EMT6

[00375] EMT6 é um carcinoma de mama murino originado do ATTC (ATCC CRL-2755TM). PROTOCOLO:

[00376] Os tumores foram induzidos por meio de injeção subcutânea de 1x106 células EMT6 em camundongos BALB/cByJ fêmeas (Charles River, França). Quando os tumores alcançaram um volume médio de aproximadamente 51 mm³, cinquenta camundongos foram randomizados por volume tumoral individual em cinco grupos de dez animais.

[00377] ● Os camundongos do grupo 1 receberam uma administração i.t. de veículo em D0, D2 e D4,

[00378] ● Os camundongos do grupo 2 receberam uma administração i.t. de VVTG18058 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4.

[00379] ● Os camundongos do grupo 3 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4.

[00380] ● Os camundongos do grupo 4 receberam uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24,

[00381] ● Os camundongos do grupo 5 receberam uma administração i.t. de COPTG19407 a uma dose de 4,75x106 pfu em D0, D2 e D4 combinada com uma administração i.p. de anticorpo antiPD-1 a uma dose de 250 µg em D7, D10, D14, D17, D21 e D24.

[00382] Os volumes do tumor de todos os animais foram monitorados ao longo do estudo avaliando-se os critérios de tempo de duplicação do tumor, retardo do crescimento de tumor e inibição do crescimento de tumor (T/C%).

114 / 115 ATIVIDADE ANTITUMORAL:

[00383] O tempo de duplicação de tumor foi similar para os Grupos 1, 2 e 4 em aproximadamente 5,4 dias. Para o Grupo 3, o tempo de duplicação de tumor não pôde ser calculado, uma vez que a maioria dos tumores não cresceu exponencialmente, indicando um aumento da eficácia do tratamento, em comparação com os Grupos 1, 2 e 4. Um efeito similar foi observado no Grupo 5, em que apenas um animal foi usado para o cálculo do tempo de duplicação de tumor. Como pode ser visto nos gráficos de volume de tumor individual (Figura 40), 8 de 10 camundongos no Grupo 3 tiveram tumores que regrediram a partir de D15 e não cresceram substancialmente em volume, com sete camundongos sem tumores detectáveis no final do estudo em D61. De modo similar, no Grupo 5, os tumores regrediram em 9 camundongos após o início do tratamento, para alcançar valores na faixa de 0 (n = 8) a 13,24 mm³ no final do estudo em D56.

[00384] O retardo no crescimento do tumor foi calculado estimando-se o tempo necessário para que os tumores alcançassem o volume-alvo médio de 200 mm³. Os resultados foram similares aos obtidos com o tempo de duplicação tumoral, pois esse parâmetro somente pôde ser calculado para tumores que alcançaram o volume-alvo de 200 mm³, o que não ocorreu para a maioria dos animais dos Grupos 3 e 5. Os grupos 1, 2 e 4 tiveram retardos médios no crescimento de tumor de aproximadamente 19 dias. Além disso, os Grupos 3 e 5 (n = 2 para ambos os grupos) tiveram retardos médios de crescimento de 24 e 12 dias, respectivamente. Isso indicou que os tumores que cresceram nesses dois grupos, cresceram em taxas similares às dos Grupos 1, 2 e 4. Não houve diferenças significativas entre os grupos.

[00385] A inibição do crescimento de tumor (T/C%) foi calculada comparando-se o volume médio do tumor do Grupo 1 tratado com veículo com os outros grupos de tratamento. O Grupo 2 mostrou inibição transitória de crescimento de tumor marginal em D28, mas aumentou para 79% em D31.

115 / 115 O Grupo 4 não apresentou atividade antitumoral, com T/C%>60% durante o estudo. Em comparação, os Grupos 3 e 5 mostraram atividade antitumoral marcada (T/C% menor do que 10%) de D24 a D31 (último valor calculável de T/C%).

[00386] A Figura 41 ilustra as curvas de volume tumoral médio em camundongos BALB/cByJ portadores de tumores EMT6 subcutâneos que demostram o efeito drástico do vírus COPTG19407 que expressa anti- CTLA4/GM-CSF com ou sem antiPD1 no crescimento de tumor. REEXPOSIÇÃO A CT26

[00387] Camundongos Balb/c expostos a células tumorais CT26 que sobreviveram após o tratamento com 104, 105 ou 106 pfu de COPTG19421 ou 106 pfu de COPTG19407 foram expostos, novamente, a células tumorais CT26 ou expostos a células Renca (células de adenocarcinoma renal:controle), a fim de estudar se uma resposta imune antitumoral específica foi aumentada. TABELA 8: EFEITO DA REEXPOSIÇÃO A CÉLULAS TUMORAIS CT26

OU EXPOSIÇÃO A CÉLULAS TUMORAIS RENCA SOBRE O NÚMERO

DE CAMUNDONGOS LIVRES DE TUMOR Grupo Livre de tumor/Total de camundongos Controle de CT26 virgem 0/5 Reexposição a VVTG18058 105 + CT26 0/1 Reexposição a COPTG19421 106 + CT26 3/3 Exposição a COPTG19421 106 + RenCa 0/2 Reexposição a COPTG19407 104 + CT26 1/1 Exposição a COPTG19407 104 + RenCa 0/1 Reexposição a COPTG19407 105 + CT26 1/2 Exposição a COPTG19407 105 + RenCa 0/2 Reexposição a COPTG19407 106 + CT26 2/4 Exposição a COPTG19407 106 + RenCa 0/3

[00388] Os resultados apresentados na tabela 8 mostram que 0/8 camundongos que receberam COPTG19421 ou COPTG19407 estavam livres de tumor após exposição a RenCa, enquanto 7/10 camundongos que receberam COPTG19421 ou COPTG19407 estavam livres de tumor após a reexposição a CT26. Isso indica que COPTG19421 e COPTG19407 geraram uma memória imunológica específica contra células CT26.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de anticorpo caracterizada pelo fato de que se liga especificamente a CTLA-4 e tem efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas em comparação com ipilimumabe.

2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem efeito de depleção melhorado em células CD4 positivas em comparação com ipilimumabe.

3. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que tem efeito de depleção melhorado em Tregs em comparação com ipilimumabe.

4. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é considerada por ter efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas e/ou Tregs em comparação com ipilimumabe se a mesma proporcionar uma depleção melhorada em: (i) um teste ADCC in vitro que é realizado com o uso de uma linhagem celular NK-92 transfectada de forma estável para expressar o alelo CD16-158V juntamente com GFP, em que o teste de ADCC compreende as seguintes etapas consecutivas: 1) células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas ou Tregs como células-alvo são isoladas de sangue periférico de dadores saudáveis; 2) as células-alvo são, então, estimuladas com CD3/CD28 e rhIL-2; 3) as células-alvo são, então, pré-incubadas com a molécula de anticorpo e são, então, misturadas com células NK; 4) as células-alvo são, então, incubadas em meio RPMI 1640 + GlutaMAX que contém 1 tampão HEPES, piruvato de sódio e IgG com baixo teor de FBS; 5) a lise é determinada por citometria de fluxo;

6) as etapas 1 a 5 são repetidas, ou realizadas em paralelo, com ipilimumabe usado em vez da molécula de anticorpo na etapa 3; e 7) os resultados da lise para a molécula de anticorpo são comparados com os resultados da lise para ipilimumabe, e uma lise melhorada para a molécula de anticorpo em comparação com ipilimumabe demonstra que a molécula de anticorpo tem efeito de depleção melhorado em células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas e/ou Tregs; e/ou (ii) um teste in vivo em um modelo PBMC-NOG/SCID, em que o teste in vivo compreende as seguintes etapas consecutivas: 1) PBMCs humanas são isoladas, lavadas e ressuspensas em PBS estéril; 2) Os camundongos NOG são injetados i.v. com a suspensão de células da etapa 1); 3) os baços dos camundongos NOG são isolados e transformados em uma única suspensão de células; 4) a suspensão de células da etapa 3) é ressuspensa em PBS estéril; 5) os camundongos SCID são injetados i.p. com a suspensão da etapa 4; 6) os camundongos SCID são, então, tratados com a molécula de anticorpo, ipilimumabe ou um anticorpo monoclonal de controle de isótipo; 7) o fluido intraperitoneal dos camundongos SCID tratados é colhido; 8) subconjuntos de células T humanas são identificados e quantificados por FACS usando-se os seguintes marcadores: CD45, CD4, CD8, CD25, CD127; 9) os resultados da identificação e da quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com a molécula de anticorpo são comparados com os resultados da identificação e da quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com ipilimumabe e com os resultados da identificação e da quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com anticorpo monoclonal de controle de isótipo e um menor número de células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas e/ou Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com a molécula de anticorpo a ser testada em comparação com o número de células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas e/ou Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com ipilimumabe demonstram que a molécula de anticorpo melhorou o efeito de depleção em células CTLA-4 positivas, células CD4 positivas e/ou Tregs em comparação com ipilimumabe.

5. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 1 a 6 dentre as CDRs selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 3, 6, 8, 10, 12 e 14.

6. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 1 a 6 dentre as CDRs VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1 e VL-CDR3, em que VH-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 15, 22, 29 e 35; em que VH-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 16, 23, 30 e 36; em que VH-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 17, 24, 31 e 37; em que VL-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 10 e 38. em que VL-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 18, 25, 32 e 39; em que VL-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 19, 26 e 40.

7. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que compreende as 6 CDRs que têm SEQ ID. NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19 ou as 6 CDRs que têm SEQ ID NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26.

8. Molécula de anticorpo que se liga especificamente a CTLA- 4, sendo que as moléculas de anticorpo são caracterizadas pelo fato de que compreendem as 6 CDRs que têm SEQ ID. NOs: 15, 16, 17, 10, 18 e 19 ou as 6 CDRs que têm SEQ ID. NOs: 22, 23, 24, 10, 25 e 26.

9. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que compreende uma cadeia pesada variável selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 20 e 27 e/ou uma cadeia leve variável selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs: 21 e 28.

10. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que compreende a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 e/ou a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 44.

11. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é uma molécula de anticorpo que tem capacidade para competir pela ligação a CTLA-4 com uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10.

12. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo de tamanho completo, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um Fab, um Fv, um scFv, um Fab' e um (Fab')2.

13. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que se liga a CTLA-4 humano (hCTLA-4) e/ou a CTLA-4 de macaco cinomolgo (cmCTLA-4) e/ou a CTLA-4 murino (mCTLA-4).

14. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que não se liga a CD28 humano.

15. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo IgG humano, um anticorpo IgG humanizado e um anticorpo IgG de origem humana.

16. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo IgG1 humano.

17. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, sendo que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.

18. Sequência de nucleotídeos isolada caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Sequência de nucleotídeos isolada de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID 45 a 52.

20. Plasmídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19.

21. Vírus caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, ou um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20.

22. Vírus de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que é um vírus oncolítico e, preferencialmente, um poxvírus oncolítico.

23. Vírus de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito poxvírus pertence à subfamília Chordopoxviridae, mais preferencialmente ao gênero ortopoxvírus, preferencialmente, selecionado a partir do grupo que consiste em vírus vaccinia, vírus da varíola bovina, vírus da varíola dos canários, vírus ectromelia e vírus mixoma.

24. Vírus de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito vírus oncolítico é um vírus vaccinia defeituoso para ambas as atividades de timidina quinase (TK) e/ou ribonucleotídeo redutase (RR) e que compreende sequências de nucleotídeos que codificam SEQ ID. NO: 20 e SEQ. ID. NO: 21 ou SEQ. ID. NO: 53 e SEQ ID. NO: 54.

25. Vírus de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o dito vírus vaccinia oncolítico compreende, ainda, uma sequência de nucleotídeos que codifica um GM-CSF, com uma preferência específica para um GM-CSF humano (por exemplo, que tem SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 56) ou um GM-CSF murino (por exemplo, que tem SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 58).

26. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que o cassete que codifica a cadeia pesada é inserido no lócus J2R e o cassete que codifica a cadeia leve é inserido no lócus I4L.

27. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, ou um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, ou um vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26.

28. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, ou célula de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que é para uso em medicina.

29. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, ou célula de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

30. Uso de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, de uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, de um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, de um vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, ou de uma célula de acordo com reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer.

31. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que consiste em uma molécula de anticorpo, ou compreende a mesma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, um vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, ou uma célula de acordo com a reivindicação 27, e opcionalmente um diluente, carreador, veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

33. Método para tratar câncer em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 18 ou 19, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, um vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, uma célula de acordo com a reivindicação 27, ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31.

34. Molécula de anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 24, sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a reivindicação 29, plasmídeo para uso de acordo com a reivindicação 29, vírus para uso de acordo com a reivindicação 29, célula para uso de acordo com a reivindicação 29, uso de acordo com para a reivindicação 30, composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 32, ou um método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer sólido.