BR112021003134A2

BR112021003134A2 - processo de produção de calulases usando um fungo filamentoso

Info

Publication number: BR112021003134A2
Application number: BR112021003134-0A
Authority: BR
Inventors: Mohamed Fadhel Ben Chaabane; Celine Cohen; Bernard Chaussepied; Frederic Augier
Original assignee: IFP Energies Nouvelles
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-05-11
Also published as: FR3085961B1; CA3110386A1; EP3850091A1; FR3085961A1; CN112912498A; US20210284982A1; WO2020052952A1

Abstract

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CALULASES USANDO UM FUNGO FILAMENTOSO. A presente invenção refere-se a um processo de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, o qual compreende três etapas: (a) uma primeira etapa de crescimento de fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um biorreator agitado (1) e aerado em fase batch, (b) uma segunda etapa de diluição do meio de cultura obtido na primeira etapa (a), (c) uma terceira etapa de produção de enzimas a partir do meio de cultura diluído, obtido na etapa (b), na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor, em fase fed-batch.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CALULASES USANDO UM FUNGO FILAMENTOSO”.

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a um processo de produção de enzimas por um fungo filamentoso, notadamente enzimas do tipo celulases (celulolíticas e/ou hemicelulolíticas), as quais são necessárias para a hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica.

[002] Esta hidrólise enzimática é realizada, por exemplo, nos processos de produção chamados de segunda geração (2G) de biocombustíveis como bioetanol, ou para produzir sucos açucarados que podem ser utilizados para produzir outros produtos por via química ou via bioquímica/fermentar (por exemplo, álcoois como etanol, butanol, propanol, isopropanol ou outras moléculas, por exemplo, solventes tais como acetona e outras moléculas bioaçucaradas), ou em outros processos das indústrias química, de papel ou têxtil.

ESTADO DA TÉCNICA

[003] Trichoderma reesei é o microorganismo mais utilizado para a produção de celulases em escala industrial. As cepas selvagens têm a faculdade de excretar, na presença de um substrato indutor, a celulose, por exemplo, um complexo enzimático considerado como bem adaptado à hidrólise de biomassa lignocelulósica. As enzimas do complexo enzimático contêm três grandes tipos segundo sua atividade: as endoglucanases, as exoglucanases e as celobiases. Outras proteínas que têm propriedades indispensáveis à hidrólise dos materiais lignocelulósicos são igualmente produzidas por Trichoderma reesei, as xilanases, por exemplo.

[004] A presença de um substrato indutor é indispensável para a expressão das enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas. A natureza do substrato carbonado tem uma forte influência sobre a composição do complexo enzimático. É o caso da xilose, que, associada a um substrato carbonado indutor, como a celulose ou a lactose, permite melhorar significativamente a atividade da dita xilanase. A regulação dos genes de celulases sobre diferentes fontes de carbono tem sido estudada detalhadamente. Eles são induzidos na presença de celulose, de seus produtos de hidrólise (por exemplo: celobiose) ou de certos oligossacarídeos como a lactose e a soforose (Ilmen et al., 1997; Appl.Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).

[005] As técnicas de genética clássica por mutação permitiram a seleção de cepas de Trichoderma reesei hiperprodutoras de celulases, tais como as cepas MCG77 (Gallo – Patente US 4.275.167), MCT 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol-Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM “Génétique des microorganismes industriels”. Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50).

[006] O processo de produção de celulases por Trichoderma reesei foi objeto de trabalhos de desenvolvimento importantes para passar à escala industrial. Para obter boas produtividades em enzimas, é necessário prover uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei, e um substrato indutor que permita a expressão das celulases e da secreção no meio de cultura. A celulose pode desempenhar dois papéis. Entretanto, ela é de difícil utilização em escala industrial, pois ela aumenta a viscosidade do meio e pode perturbar a transferência de oxigênio indispensável ao crescimento do microorganismo, que é estritamente aeróbico. Ela pode ser substituída por fontes de carbono solúveis, tais como glicose, xilose e lactose, a lactose desempenhando igualmente o papel de substrato indutor. Outros açúcares solúveis, como a celobiose e a soforose, foram descritos como indutores, mas podem ser considerados demasiadamente onerosos para serem utilizados em escala industrial.

[007] Constatou-se que as produções de celulases por Trichoderma reesei com substratos solúveis são muito inferiores àquelas obtidas em celulose em “batch”. Isso se deve ao efeito repressor dos açúcares facilmente assimiláveis em alta concentração. A alimentação contínua no modo “fed-batch” dos substratos carbonados solúveis permitiu elevar a repressão catabólica eliminando a concentração residual nas culturas e otimizando a quantidade de açúcar, permitindo obter um melhor rendimento e uma melhor produtividade enzimática, como descrito na patente FR-B-2555603. Esse protocolo permite chegar a uma concentraçãode proteínas da ordem de 35 a 40 g/L com uma produtividade da ordem de 0,2 g/L/h.

[008] Para obter essas performances, os processos industriais de produção de celulases, tais como descritos na patente mentionada acima, são realizados em duas etapas no mesmo reator:

[009] - uma etapa de crescimento no modo “batch”, em que é necessário prover uma fonte de carbono rapidamente assimilável para o crescimento de Trichoderma reesei. Esta fase se caracteriza pelo aumento da viscosidade do meio, bem como por uma forte demanda de oxigênio;

[0010] - uma etapa de produção no modo “fed-batch” utilizando um substrato indutor (por exemplo, lactose), que permite a expressão das celulases e a secreção no meio de cultura. O fluxo ótimo aplicado está compreendido entre 35 e 45 mg (de açúcar).g (de peso seco celular)- 1 .h-1, Esta fase se caracteriza por uma queda da viscosidade do meio e uma demanda de oxigênio mais fraca.

[0011] As etapas de produção propostas no estado da técnica são realizadas em cubas agitadas, as etapas de crescimento e de produção sendo realizadas no mesmo biorreator. É uma solução interessante, pois compacta em termos de instalação industrial, mas não a solução forçosamente melhor, pois as duas etapas, crescimento e produção, não requerem as mesmas necessidades, por exemplo, em termos de meios de agitação ou em termos de transferência de oxigênio: o biorreator deve apresentar o volume e todos os meios de equipamento e de funcionamento que lhe permitam assegurar o conjunto dessas duas etapas, desenrolando-se, entretanto, em condições bem diferentes.

[0012] O objetivo da invenção é, portanto, propor um processo melhorado de produção de enzimas de tipo celulases a partir de cepas de fungo filamentoso, notadamente um processo que permite obter produtividades de enzimas aumentadas, e, acessoriamente, que possa ser realizado em escala industrial em instalações que permitam mais flexibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A presente invenção refere-se a um processo de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, o dito processo compreendendo três etapas:

[0014] uma primeira etapa de crescimento de fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um biorreator agitado e aerado em fase Batch,

[0015] Uma segunda etapa de diluição (volúmica) do meio de cultura obtido na primeira etapa (a),

[0016] Uma terceira etapa de produção de enzimas a partir do meio de cultura diluído obtido na segunda etapa (b), na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor, em fase Fed-batch.

[0017] A invenção inclui um processo em que a etapa (b) pode começar (um pouco) antes do fim da etapa (a) ou terminar (um pouco) depois do começo da etapa (c). A invenção inclui, portanto, tal processo, com uma realização em que as etapas (a) e (b), por um lado, e as etapas (b) e (c), por outro lado, podem sobrepor-se parcialmente. De fato, como detalhado mais adiante, a etapa de diluição (b) pode durar várias horas e, portanto, pode ser interessante iniciá-la entre 0 e 4 horas antes do fim da etapa (a), e/ou terminá-la entre 0 e 4 horas após a passagem na etapa (c).

[0018] Portanto, a invenção criou uma nova conduta de fermentação, com uma etapa de diluição intermediária entre a etapa de crescimento e a etapa de produção. De maneira totalmente surpreendente, verificou-se que as produtividades específicas obtidas após ter diluído o meio de cultura no fim da fase de crescimento são significativamente mais elevadas do que aquelas obtidas com o meio de cultura sem diluição (o aumento podendo chegar a 30% e mais), e isso para um mesmo fluxo específico de substrato carbonado (calculado em relação à massa de biomassa nos reatores).

[0019] De preferência, a terceira etapa de produção (c) é realizada em uma coluna de bolhas: em um a forma de realização preferida, a invenção explora também, judicialmente, a ideia de que as etapas de crescimento e de produção não têm as mesmas necessidades, não o mesmo modo de operação, notadamente em termos de agitação e transferência de oxigênio e, portanto, é mais pertinente realizar essas etapas em dois fermentadores diferentes: a produção de biomassa pode ser operada em boas condições em cuba agitada, visando preferivelmente uma concentração e biomassa elevada (por exemplo, superior ou igual a 20 g/L. A produção é operada em coluna de bolhas, que é, de fato, um reator particularmente adequado para operar a produção, uma vez que é um reator adaptado aos meios diluídos, pouco viscosos, que apresenta ainda novas vantagens, como uma grande facilidade de limpeza, uma eficácia energética superior aos biorreatores agitados, a possibilidade de oferecer grandes volumes reacionais (no presente contexto, “bioreator agitado” tem u mesmo significado que “cuba agitada”).

[0020] Vantajosamente, a segunda etapa (b) de diluição é realizada no biorreator no fim da etapa (a) de crescimento dos fungos e/ou na coluna de bolhas antes ou no começo da terceira etapa (c) de produção de enzimas.

[0021] A etapa de diluição, que leva à queda da viscosidade do meio de cultura, pode ser realizada em um ou outro dos reatores, ou mesmo em linha durante o transvasamento do primeiro reator para o segundo reator. Pode-se preferir operar a diluição na cuba agitada, de maneira a facilitar a transferência do meio, já diluído, da cuba agitada até a coluna de bolhas.

[0022] Vantajosamente o fator de diluição do meio de cultua na etapa (b) de diluição é de pelo menos 1,1 ou 1,2, notadamente de pelo menos 1,5, preferivelmente cerca de 2, e notadamente de pelo menos

6. A diluição é deve ser ajustada para que o meio de cultura tenha uma concentração de biomassa que permita limitar a viscosidade do meio, isto é, compreendida entre 5 e 20 g/L. na presente invenção, o termo biomassa corresponde aos fungos.

[0023] O fator de diluição é entendido como um fator de diluição volúmica, e corresponde à razão entre o volume após diluição e antes de diluição. Preferivelmente, o meio de cultura sendo um meio aquoso, o líquido de diluição é água ou um meio aquoso, como um meio de cultura igualmente.

[0024] De acordo com uma forma de realização preferida, são previstos meios de conexão fluida entre o biorreator e a coluna de bolhas, para assegurar a transferência do meio de cultura obtido na etapa de crescimento no biorreator para a coluna de bolhas, meios notadamente sob fora de condutos equipados com comportas manuais ou pilotadas e notadamente com bomba (s). Nesse caso de figura, pode- se realizar a etapa (b) de diluição, total ou parcialmente, nos meios de conexão fluida quando da transferência do meio de cultura por esses meios de conexão fluida do biorreator para a coluna de bolhas.

[0025] De preferência, a concentração de substrato carbonado de crescimento no biorreator é superior a 20 g/L, estando compreendida notadamente entre 30 e 100 g/L, e preferivelmente entre 50 e 80 g/L.

[0026] Preferivelmente, o substrato carbonado indutor alimenta a coluna de bolhas a uma velocidade específica compreendida entre 30 e 140 mg por grama de biomassa celular e por hora, preferivelmente entre 35 e 45 mg por grama de biomassa celular e por hora.

[0027] Vantajosamente, persegue-se a etapa de crescimento da biomassa até uma concentração de biomassa (fungos) de pelo menos 20 g/L. Obtém-se assim um meio de cultura concentrado, que será diluído em seguida para proceder à produção.

[0028] De acordo com uma forma de realização, pode-se realizar o processo da invenção com um número n de biorreatores agitados e aerados e um número m de colunas de bolhas, com n inferior ou igual a m, uma coluna de bolhas podendo estar conectada fluidamente a vários biorreatores e inversamente. É possível ter colunas de bolhas de capacidade bem maior do que biorreatores agitados, o que permite a vários biorreatores agitados alimentarem uma única coluna de bolhas, por exemplo, e levar em consideração o fato de que a etapa de crescimento é mais rápida do que a etapa de produção.

[0029] De preferência, o substrato carbonado de crescimento é escolhido dentre pelo menos um dos seguintes compostos: lactose, glicose, xilose, os resíduos obtidos após fermentação etanólica dos açúcares monômeros de hidrolisados enzimáticos de biomassa celulósica, um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis proveniente do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.

[0030] Preferivelmente, o substrato carbonado indutor é escolhido dentre pelo menos um dos seguintes compostos: lactose, celobiose, soforose, os resíduos obtidos após fermentação etanólica dos açúcares monômeros dos hidrolizados enzimáticos de biomassa celulócica, um extrato bruto de pentoses hidrossolúveis proveniente do pré-tratamento de uma biomassa celulósica.

[0031] Os substratos de crescimento e indutores citados acima podem ser utilizados isoladamente ou em mistura.

[0032] De acordo com sua natureza, o substrato carbonado de crescimento escolhido para obtenção da biomassa é introduzido no biorreator antes de esterilização, ou é esterilizado separadamente e introduzido no biorreator após esterilização.

[0033] O substrato carbonado indutor introduzido durante a etapa de produção em “fed-batch” é esterilizado preferivelmente de maneira independente, antes de ser introduzido na coluna de bolhas. Se o substrato carbonado indutor é a biomassa pré-tratada ou hidrolizados hemicelulósicos, é possível utilizá-lo sem esterilizá-lo.

[0034] De maneira preferida, quando a fonte de carbono indutora é lactose, a solução aquosa é preparada na concentração de 200-250 g.L-

1. E o substrato carbonado indutor é a biomassa pré-tratada, visa-se preferivelmente uma relação média de açúcar compreendida entre 35 e 140 mg por grama de célula e por hora.

[0035] Preferivelmente, as capas utilizadas pertencem à espécie Trichoderma reesei, eventualmente modificadas para melhorar as enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas pelas propriedades de mutação-seleção; as cepas melhoradas pelas técnicas de recombinação genética podem ser utilizadas igualmente. Essas cepas são cultivadas em condições compatíveis com seu crescimento e a produção das encimas. Outras cepas de microorganismos que produzem enzimas de acordo com processos similares aos utilizados por Trichoderma podem ser utilizadas.*

[0036] De preferência, as enzimas são enzimas celuloliticas ou hemicelulolíticas.

[0037] Preferivelmente, a cepa de fungo filamentoso utilizada é,

portanto, uma cepa de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modificada por mutação, seleção ou recombinação genética. De maneira muito preferida, a Cepa é uma cepa CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80.

[0038] A invenção tem igualmente como objeto a instalação de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, de modo que a dita instalação compreendendo: - um biorreator agitado e aerado funcionando em fase “batch” para operar uma etapa de crescimento dos fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento; - uma coluna de bolhas funcionando em fase “fed-batch” para operar uma etapa de produção de enzima a partir do meio de cultua procedente do biorreator; - meios de conexão fluida ligando o biorreator à coluna de bolhas para operar a transferência do meio de cultura do biorreator para a coluna de bolhas; - meios de injeção de líquido de diluição no biorreator e/ou na coluna de bolhas e/ou nos meios de conexão de fluido. Preferivelmente, o biorreator e/ou a coluna de bolhas contêm um meio de cultura com uma cepa pertencente a um fungo filamentoso.

[0039] Esta instalação pode realizar, vantajosamente, o processo descrito anteriormente, com as mesmas vantagens que decorrem do mesmo: melhor produtividade específica do que uma fermentação sem diluição intermediária, em uma cuba agitada, operabilidade e manutenção da instalação mais fáceis, adaptação a produções de quantidades variáveis...

[0040] Vantajosamente, a coluna de bolhas tem um volume interior pelo menos duas vezes superior ao volume interior do biorreator agitado, o que permite à coluna de bolhas “absorver” o volume aumentado do meio de cultura diluído e/ou ser alimentada por vários biorreatores agitados.

[0041] A instalação descrita acima pode compreender então n biorreatores agitados e aerados e m colunas de bolhas, com n inferior ou igual a m (e com n superior ou igual a 1).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0042] A figura 1 é uma representação muito esquemática da instalação que realiza o processo da invenção.

[0043] As figuras 2a, 2b e 2c são gráficos mostrando a evolução da concentração da massa de proteínas produzidas e da massa da biomassa celular de acordo com três exemplos diferentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0044] Em uma forma de realização preferida, a presente invenção refere-se a um processo de produção de celulases por uma cepa pertencente à espécie Trichoderma reesei, em biorreator agitado e aerado compreendendo três etapas:

[0045] - a primeira etapa de crescimento na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento em fase “batch” com uma concentração de substrato carbonado de crescimento compreendida entre 30 e 100 g/L, preferivelmente de 50 a 80 g/L. Esta etapa se realiza em uma cuba agitada,

[0046] - uma segunda etapa de diluição do mosto de fermentação de um fator superior a 1,1 e preferivelmente 2. Esta etapa de diluição pode ser realizada na cuba de crescimento. Outa solução consiste em realizar uma diluição em linha durante o transvasamento da cuba agitada para a coluna de bolhas,

[0047] - uma terceira etapa de produção em coluna de bolhas, na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor em fase “fed- batch”, esse substrato sendo alimentado a uma velocidade específica compreendida entre 35 e 140 mg por grama de células e por hora, e preferivelmente entre 35 e 45 mg por grama de células e por hora.

[0048] A etapa de produção é realizada em condição de limitação do substrato carbonado indutor com um fluxo inferior à capacidade máxima de consumo da cepa.

[0049] Diferentes substratos carbonados de crescimento e indutores já foram listados acima. De maneira preferida, quando a fonte de carbono indutora é lactose, a solução aquosa é preparada na concentração de 200-250 g.L-1. Quando o substrato carbonado indutor é da biomassa pré-tratada, visa-se uma relação média de açúcar compreendida entre 35 e 140 mg por grama de célula e por hora.

[0050] O processo de acordo com a presente invenção permite obter uma produtividade superior em celulases utilizando melhor biorreatores agitados: dedicados ao crescimento de biomassa, eles podem ser dispostos, adaptados melhor a esta etapa somente. A biomassa é transvasada em seguida para colunas de bolhas, que são fermentadores de grandes volumes e que serão dedicados à produção de enzimas. O processo em seu conjunto é mais econômico em utilidades (consumo energético...) e mais flexível.

[0051] A forma de condução é adaptada em relação aos processos convencionais, por um lado, diluindo a concentração de fungo em fim de crescimento e, por outro lado, realizando a produção em coluna de bolha.

[0052] Um exemplo de realização do processo de acordo com a invenção compreende a figura 1, representando um exemplo de uma instalação que o realiza.

[0053] As referências têm o significado seguinte:

[0054] 1 – cuba agitada

[0055] 2 – alimentação da cuba agitada

[0056] 3 - motor

[0057] 4 – dispositivo de agitação

[0058] 5 – dispositivo de formação de bolhas

[0059] 6 - alimentação de ar

[0060] 7 – coluna de bolhas

[0061] 8 – alimentação de substrato

[0062] 9 – alimentação da coluna de bolhas

[0063] 10 – ponto de esvaziamento

[0064] 11 – dispositivo de formação de bolhas

[0065] 12 – alimentação de ar

[0066] 13 – linha de transvasamento

[0067] 14 – ponto de injeção

[0068] 15 – bomba

[0069] A instalação comporta, assim, inicialmente, uma cuba agitada 1, na qual se vai realizar a etapa de crescimento. Esta cuba 1 apresenta um volume compreendido entre 20 e 500 m3, preferivelmente entre 40 e 400 m3.

[0070] A cuba agitada 1 compreende entre um e cinco dispositivos de agitação 4, com uma potência de agitação compreendida entre 0,1 e 7 kW/m3, preferivelmente com uma potência máxima compreendida entre 1 e 4 kW/m3 pelo motor 3. A cuba 1 apresenta uma relação altura/diâmetro compreendida entre 1 e 5, preferivelmente entre 1,5 e 3. A cuba 1 está provida igualmente de um dispositivo de formação de bolhas 5 na parte inferior, conectada fluidamente a uma entrada externa de ar 6, e de uma (ou várias) entrada (s) 2 em fonte carbonada de crescimento e de fungos.

[0071] A cuba 1 funciona entre 1 e 5 bars abs. Ela é alimentada com ar (5,6) a um débito compreendido entre 0,1 e 2 volume de ar (em condições normais) por volume de líquido e por hora, preferivelmente entre 0,2 e 1 volume de ar por volume de líquido e por hora.

[0072] A instalação compreende assim uma coluna de bolhas 7, para realizar a etapa de produção. Para lembrete, uma coluna de bolhas é um espaço fechado reacional composto de uma coluna cilíndrica, de relação altura sobre diâmetro classicamente compreendida entre 1 e 10, preferivelmente entre 2,5 e 6. A coluna está equipada com um dispositivo de injeção de ar, eventualmente enriquecido com oxigênio. Esse dispositivo de injeção está posicionado na base da coluna, para que o ar injetado alimente o conjunto do volume de bolhas e, portanto, de oxigênio. O dispositivo de injeção pode ser uma bandeja perfurada, um sistema de tubos perfurados ou qualquer outro sistema conhecido de um técnico no assunto. A obra “Bubble Column Reactors” de W.D.Deckwer (J.Wiley & Sons, 1992) apresenta um conjunto de descrição de colunas de bolhas, que podem ter múltiplas variantes dependendo de se são vazias ou equipadas com insertos do tipo bandejas perfuradas, conduto de recirculação ou outro.

[0073] A representação simplificada da coluna de bolhas 7 de acordo com a figura 1 representa a alimentação 8 de coluna de bolhas de substrato carbonado indutor, um dispositivo de formação de bolhas 11 na parte interna em conexão fluida com uma entrada de ar externa

12.

[0074] A coluna de bolhas tem um volume compreendido entre 40 e 1000 m3, define geralmente um volume interno pelo menos 2 vezes maior do que o da cuba agitada 1, para permitir a diluição do meio de cultura procedente do crescimento em cuba 1. A coluna de bolhas 7 tem uma relação altura/diâmetro compreendida entre 2 e 10, preferivelmente entre 2,5 e 7.

[0075] Como mencionado anteriormente, a coluna de bolhas pode ser vazia ou equipada com um cilindro interno para favorecer a recirculação do líquido. Um técnico no assunto fala então de reator “airlift”, que é uma variante bem conhecida da coluna de bolhas simples e que pode muito bem ser utilizada no âmbito da presente invenção.

[0076] Como a cuba 1, a coluna de bolhas 7 funciona entre 1 e 5 bars abs. Ela é alimentada com ar 11, 12 a um débito compreendido entre 0,1 e 2 Volume de ar (em condições normais) por volume de líquido e por hora, preferivelmente entre 0,2 e 1 volume de ar por volume de líquido e por hora.

[0077] O transvasamento do meio de cultura da cuba agitada 1 para a coluna de bolhas 7 se efetua por uma conexão fluida 13 entre os dois reatores realizada por uma ou várias linhas que ligam os dois reatores. Aqui, essas linhas são dispostas em partes baixas dos dois reatores, ambos essencialmente orientados de acordo com um eixo vertical. Essas linhas estão providas de uma bomba 15, e de eclusas manuais ou pilotadas, que permitem comandar a transferência do meio da cuba 1 para a coluna de bolhas 7.

[0078] A etapa de diluição do meio de cultura entre a etapa de crescimento na cuba 1 e a etapa de produção na coluna de bolhas pode ser realizada de três maneiras diferentes: - na cuba 1, no fim do crescimento, em relação ao líquido aquoso no ponto de injeção 2, antes de transferência para a coluna 7; - no nível da conexão fluida, em relação ao líquido aquoso no meio de cultura que está sendo transferido (ponto de injeção 14); - na entrada da coluna 7 em relação ao líquido aquoso ao nível da coluna 7 no ponto de injeção 9. Pode-se escolher também misturar essas três formas de diluição, isto é, acrescentar uma parte da água necessária na cuba e outra quando da transferência e/ou na coluna de bolhas, por exemplo. Tudo para atingir o nível de diluição requerido, por exemplo, cerca de 2, dependendo dos volumes específicos dos dois reatores, da viscosidade do meio de cultura no fim da etapa de crescimento, etc.

[0079] A etapa de diluição anterior de acordo com a invenção permite, portanto, notadamente, acrescentar a concentração de biomassa final em uma concentração alvo compreendida entre 5 e 20 g/L.

[0080] Como os diferentes tempos de crescimento e de produção (um fator 3 a 8 pode existir entre os tempos de duas etapas, o crescimento sendo sempre a etapa mais curta), o processo industrial de produção de enzimas de acordo com a invenção pode utilizar um número de cubas agitadas mais baixo do que o número de colunas de bolhas, o que permite maximizar a utilização dos dois tipos de fermentadores.

[0081] Por exemplo, a etapa (a) dura 50 horas e a etapa (c) dura 200 horas, o conteúdo da cuba agitada pode ser transvasado após diluição (b) para uma primeira coluna de bolhas, depois a cuba pode ser reutilizada para realizar uma novamente a etapa (a). Seu novo conteúdo será diluído então e transvasado para outra coluna de bolhas. o número de colunas de bolhas e de reatores agitados deve ser ajustado em função d duração de cada etapa.

EXEMPLOS

[0082] O exemplo 1 é um exemplo de comparação de duas produções realizadas em concentrações de, respectivamente, 12,5 g/L e 25 g/L de biomassa estabilizada na etapa fed-batch de produção. O exemplo 2 de acordo com a invenção demonstra a exequibilidade e as performances de produção obtidas com uma condução realizada em cuba agitada na etapa de crescimento e em coluna de bolhas na etapa de produção de enzimas. O exemplo 3 comparativo demonstra a dificuldade de realizar a etapa de crescimento em coluna de bolhas sem respeitar as condições da invenção. Exemplo 1 (comparação – preliminar à invenção)

[0083] A produção de celulases é efetuada em fermentador agitado mecanicamente (não representada na figura 1). O meio mineral tem a seguinte composição: KOH, 1,66 g./l, H3PO4 85% 2 mL/L (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/L, CaCl2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H20 2,8 mg/L, CoCl2 10 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/L, Com Steep 1,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L.

[0084] O fermentador contendo o meio mineral é esterilizado a 120ºC durante 20 minutos, a fonte carbonada glicose é esterilizada à parte a 120ºC durante 20 minutos, depois acrescentada esterilmente à cuba 1 de maneira a ter uma concentração final de 25 g/L. O fermantador é semeado a 10% (v/v) com uma pré-cultura líquida da cepa de Trichoderma reesai CL847. O meio mineral da pré-cultura é idêntico ao do fermentador, à parte a adição de ftalato de potássio a 5 g.L-1 para tamponar o pH do meio O crescimento do fungo em pré- cultura é feito utilizando glicose como substrato carbonado, na concentração de 30 g.L-1. O crescimento do inóculo dura 2 a 3 dias, e é efetuado a 28º C em um incubador agitado. A transferência para o fermentador é realizada quando a concentração residual de glicose é inferior a 15 g/L.

[0085] A etapa de crescimento é efetuada durante 50 horas no biorreator agitado 1 com uma concentração inicial de 50 g/L de glicose a uma temperatura de 27ºC e um pH de 4,8 (regulado por amoníaco 5,5 M). A aeração é de 0,5 vvm (volume/volume/minuto), e a pressão parcial em oxigênio dissolvido no maio é de 40% de P O2sst. Los 50 g/L de glicose permitem chegar, após esgotamento do substrato, a uma concentração de biomassa de cerca de 25 g/L. Uma parte do meio é extraído e diluído de um fator dois em outro biorreator estéril idêntico ao precedente, de modo a ter, no começo da fase fed-batch de produção, um biorreator de 25 g/l de biomassa e outro de 12,5 g/L de biomassa.

[0086] Uma solução de lactose a 250 g/L é injetada continuamente a um débito de 3353 a 45 mg por g de células e por hora até 164 horas nos dois reatores (cerca de 2 mL/h para a experiência a 12,5 g/L de biomassa e 4 mL/h para a experiência a 25 g/L de biomassa). A temperatura é baixada a 25º C, e o pH é mantido a 4 até o fim da cultura. O pH é regulado por adição de uma solução de amoníaco a 5,5 N que traz o oxigênio necessário para a síntese das proteínas excretadas. O teor de oxigênio dissolvido é mantido em 40% de P O2sat.

[0087] A produção de enzimas é seguida pela dosagem das proteínas extracelulares pelo método Lowry e padrão BSA, após separação do micélio por filtração ou centrifugação.

[0088] A figura 2a apresenta a evolução da massa de biomassa celular e de proteínas para a experiência a 25 g/L de biomassa e a figura 2b, as mesmas curvas, mas a uma biomassa estabilizada a 12,5 g/L. Vê-se, da comparação dos dois gráficos, que 47 g de proteínas são obtidas com a experiência a 25 g/L de biomassa, e somente 35 g de proteínas com a experiência a 12,5 g/L de biomassa. Por outro lado, a velocidade específica de produção de proteínas notada qp é nitidamente superior com a experiência a 12,5 g/L de biomassa (cerca de 65% superior). De fato, ela é de 12±2 mg/g/h a 25 g/L de biomassa e de 20 ±1 mg/g/h com a experiência a 12,5 g/L de biomassa.

[0089] Esta comparação permite demonstrar que, de maneira surpreendente, obtém-se uma velocidade específica pelo menos 50% superior com uma concentração de biomassa de 12,5g/L em relação a uma concentração de 25 g/L. isso demonstra o interesse de fazer uma diluição tendo a etapa de produção e isso determinou a maneira de produção apresentada no exemplo 2 seguinte de acordo com a invenção. Exemplo 2 (de acordo com a invenção):

[0090] A experiência é realizada nas mesmas condições do exemplo 1, salvo que após a etapa de diluição (para passar de uma concentração de 25 a 12,5 g/L de biomassa celular) na cuba agitada 1, a etapa de produção é realizada na coluna de bolhas 7 após transvasamento de um reator para o outro pelo sistema de linhas 13, a agitação realizando-se, portanto, em produção unicamente por injeção de ar a uma vvm de 1 na coluna de bolhas.

[0091] As evoluções das massas da biomassa celulares e da massa das proteínas estão representadas na figura 2c. vê-se, por esse gráfico, que a massa final de proteínas obtida é de 42 g (após 168 h de produção em fed-batch). A velocidade específica de produção de proteínas calculada é de 22 ± 1 mg/g/h. Exemplo 3 (comparativo):

[0092] O exemplo 3 é realizado nas mesmas condições que o exemplo 1, mas simulando uma etapa de crescimento em coluna de bolhas, como na produção: neste exemplo, o crescimento é realizado em uma cuba agitada, mas sem agitação, para simular o funcionamento em coluna de bolhas.

[0093] Em conclusão, a invenção integra uma etapa intermediária de diluição de efeitos muito interessantes e inesperados sobre as performances do processo. Mostrou-se ainda muito interessante utilizar dois tipos de reatores diferentes para operar as etapas de crescimento e de produção, para que essas etapas se desenrolam em condições ótimas industrialmente: a invenção permite uma passagem de produção de proteínas em escala industrial que é robusta, competitiva, que permanece simples e que é muito flexível em sua realização.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende três etapas: (a) uma primeira etapa de crescimento de fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento, em um biorreator agitado (1) e aerado em fase “batch”, (b) uma segunda etapa de diluição do meio de cultura obtido na primeira etapa (a), (c) uma terceira etapa de produção de enzimas a partir do meio de cultura diluído, obtido na etapa (b), na presença de pelo menos um substrato carbonado indutor, em fase “fed-batch”.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a terceira etapa de produção de enzimas (c) é realizada em uma coluna de bolhas (7).

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o fator de diluição volúmica do meio de cultura na etapa (b) de diluição é de pelo menos 1,1 ou 1,2, notadamente de pelo menos 1,5, preferivelmente de cerca de 2, e notadamente de no máximo 6, notadamente a fim de atingir uma concentração em fungos compreendida entre 5 e 20 g/L.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que se realiza a segunda etapa (b) e diluição no biorreator (1) no fim da etapa (a) de crescimento e/ou na coluna de bolhas (7) antes ou no começo da terceira etapa (c) de produção de enzimas.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que são previstos meios de conexão fluida (13) entre o biorreator (1) e a coluna de bolhas (7) para assegurar a transferência do meio de cultura obtido na etapa de crescimento no biorreator para a coluna de bolhas, meios notadamente em forma de condutos equipados de eclusas manuais ou pilotadas e notadamente bomba (s) (15).

6. Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que se realiza a segunda etapa (b) de diluição, total ou parcialmente, nos meios de conexão fluida (13) quando da transferência do meio de cultura para os ditos meios de conexão fluida do biorreator (a) para a coluna de bolhas (7).

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a concentração de substrato carbonado de crescimento no biorreator está compreendida entre 30 e 100 g/L, e preferivelmente entre 50 e 80 g/L.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o substrato carbonado indutor alimenta a coluna de bolhas a uma velocidade específica compreendida entre 30 e 140 mg por grama de biomassa celular e por hora, preferivelmente entre 35 e 45 mg por grama de biomassa celular e por hora.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que se persegue a etapa de crescimento até uma concentração de fungos de pelo menos 20 g/L.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ele é operado com um número n de biorreatores agitados e aerados (1) e um número m de colunas de bolhas (7), com n inferior ou igual a m, uma coluna de bolhas podendo estar conectada fluidamente a vários biorreatores ou inversamente.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a cepa utilizada é uma cepa de Trichoderma reesei ou de Trichoderma resei modificada por mutação, seleção ou recombinação genética.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as enzimas são enzimas celulolíticas ou hemicelulolíticas.

13. Instalação de produção de enzimas por uma cepa pertencente a um fungo filamentoso, caracterizada pelo fato de que a dita instalação compreende: - um biorreator agitado e aerado(1) funcionando em fase “batch” para operar uma etapa de crescimento dos fungos, na presença de pelo menos um substrato carbonado de crescimento; - uma coluna de bolhas (7) funcionando em fase “fed-batch” para operar uma etapa de produção de enzimas a partir do meio de cultua procedente do biorreator; - meios de conexão fluida (13) ligando o biorreator à coluna de bolhas para operar a transferência do meio de cultura do biorreator para a coluna de bolhas; - meios de injeção de líquido de diluição (2; 9; 14) no biorreator (1) e/ou na coluna de bolhas (7) e/ou nos meios de conexão de fluido (13).

14. Instalação de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de eu a coluna de bolhas (7) tem um volume interno pelo menos duas fezes superior ao volume interno do biorreator agitado (1).

15. Instalação de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que ela compreende n bioreatores agitados e aerados (1) e m colunas de bolhas (7), com n inferior ou igual a m.