WO2020052952A1 - Procédé de production de cellulases par un champignon filamenteux - Google Patents

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WO2020052952A1
WO2020052952A1 PCT/EP2019/072722 EP2019072722W WO2020052952A1 WO 2020052952 A1 WO2020052952 A1 WO 2020052952A1 EP 2019072722 W EP2019072722 W EP 2019072722W WO 2020052952 A1 WO2020052952 A1 WO 2020052952A1
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WO
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bioreactor
bubble column
stage
growth
production
Prior art date
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PCT/EP2019/072722
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Fadhel Ben Chaabane
Celine Cohen
Bernard Chaussepied
Frederic Augier
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IFP Energies Nouvelles
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of enzymes by a filamentous fungus, in particular enzymes of the cellulase type (cellulolytics and / or hemicellulolytics), which are necessary for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass.
  • enzymes of the cellulase type cellulolytics and / or hemicellulolytics
  • This enzymatic hydrolysis is implemented for example in the so-called second generation (2G) production processes of biofuels such as bioethanol, or to produce sweet juices which can be used to produce other products chemically or biochemically.
  • fermentation for example, alcohols such as ethanol, butanol, propanol, isopropanol or other molecules, for example solvents such as acetone and other bio-based molecules
  • solvents such as acetone and other bio-based molecules
  • Trichoderma reesei is the most widely used microorganism for the production of cellulases on an industrial scale. Wild strains have the ability to excrete, in the presence of an inducing substrate, cellulose for example, an enzyme complex considered to be well suited to the hydrolysis of lignocellulosic biomass.
  • the enzymes in the enzyme complex contain three main types depending on their activity: endoglucanases, exoglucanases and cellobiases.
  • Other proteins having properties essential for the hydrolysis of lignocellulosic materials are also produced by Trichoderma reesei, xylanases for example.
  • an inducing substrate is essential for the expression of cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes.
  • the nature of the carbon substrate has a strong influence on the composition of the enzyme complex. This is the case with xylose, which, associated with a carbon-inducing substrate such as cellulose or lactose, makes it possible to significantly improve the so-called xylanase activity.
  • xylose which, associated with a carbon-inducing substrate such as cellulose or lactose, makes it possible to significantly improve the so-called xylanase activity.
  • the regulation of cellulase genes on different carbon sources has been studied in detail. They are induced in the presence of cellulose, its hydrolysis products (example: cellobiose) or certain oligosaccharides such as lactose or sophorose (llmen et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).
  • soluble carbon sources such as glucose, xylose or lactose
  • lactose also playing the role of an inducing substrate.
  • Other soluble sugars such as cellobiose and sophorose have been described as inducers, but they may be considered too expensive to be used on an industrial scale.
  • a growth stage in "batch" mode where it is necessary to provide a source of carbon that can be quickly assimilated for the growth of Trichoderma reesei.
  • This phase is characterized by an increase in the viscosity of the medium, as well as by a high demand for oxygen.
  • a production step in "fed-batch” mode using an inducing substrate for example lactose which allows the expression of cellulases and secretion in the culture centre.
  • the optimal flow applied is between 35 and 45 mg (of sugar) .g (of dry cell weight) 1 .h 1 .
  • This phase is characterized by a drop in the viscosity of the medium and a lower oxygen demand.
  • Protein productivity is equal to the product between the concentration of living biomass and the specific rate of protein production. This productivity can be increased by increasing the production performance of the strain (increase in specific speed) and / or by increasing the concentration of cellular biomass. But the methods to improve the performance of the strains, by genetically modifying them as mentioned above, may end up reaching their limits, and increasing the biomass concentration results in a sharp increase in viscosity, which limits oxygen transfer, especially at the end of the growth stage.
  • the production stages proposed in the prior art are carried out in agitated tanks, the growth and production stages being carried out in the same bioreactor. It is an interesting solution because compact in terms of industrial installation, but not necessarily the best solution, because the two stages, growth and production, do not require the same needs, for example in terms of means of agitation or in terms of oxygen transfer: the bioreactor must therefore have the volume and all the equipment and operating means enabling it to carry out all of these two stages, however taking place under very different conditions.
  • the object of the invention is therefore to propose an improved process for the production of enzymes of the cellulase type from filamentous fungus strains, in particular a process which makes it possible to obtain increased productivity of enzymes, and, incidentally, which can be implemented on an industrial scale in installations allowing more flexibility.
  • the present invention relates to a process for the production of enzymes by a strain belonging to a filamentous fungus, said process comprising three stages:
  • step (c) a third step of producing enzymes from the diluted culture medium obtained in the second step (b), in the presence of at least one inducing carbon substrate, in the fed-batch phase.
  • the invention includes such a method, where step (b) can start (a little) before the end of step (a) or end (a little) after the start of step (c).
  • the invention therefore includes such a method, with an implementation in which steps (a) and (b) on the one hand, and steps (b) and (c) on the other hand can partially overlap.
  • the dilution stage (b) can last several hours, and it may therefore be advantageous to start it between 0 and 4 hours before the end of stage (a), and / or to finish it between 0 and 4 hours after going to step (c).
  • the invention has thus developed a new fermentation line, with an intermediate dilution stage between the growth stage and the production stage. Surprisingly, it turned out that the specific productivities obtained after diluting the culture medium at the end of the growth phase are significantly higher than those obtained with the culture medium without dilution (l 'increase of up to 30% and more), and this for the same specific flux of carbonaceous substrate (calculated relative to the mass of biomass in the reactors).
  • the third production stage (c) is carried out in a bubble column:
  • the invention also judiciously exploits the idea that the growth and production stages do not have the same needs , do not have the same operating mode, in particular in terms of agitation and oxygen transfer, and that it is therefore more relevant to carry out these stages in two different fermenters:
  • the production of biomass can take place in good conditions in a stirred tank, preferably targeting a high biomass concentration (for example greater than or equal to 20 g / L).
  • agitated bioreactor has the same meaning as “agitated tank”.
  • the second stage (b) of dilution is carried out in the bioreactor at the end of the stage (a) of mushroom growth and / or in the bubble column before or at the start of the third stage (c) of production. enzymes.
  • the dilution step which therefore leads to lowering the viscosity of the culture medium, can thus be carried out in one or the other of the reactors, or even online during the transfer. from the first reactor to the second reactor. It may be preferable to carry out the dilution in the agitated tank, so as to facilitate the transfer of the medium, already diluted, from the agitated tank to the bubble column.
  • the dilution factor of the culture medium in stage (b) of dilution is at least 1, 1 or 1, 2, in particular at least 1, 5, preferably about 2, and in particular at most 6.
  • the dilution must be adjusted so that the culture medium has a biomass concentration making it possible to limit the viscosity of the medium, that is to say between 5 and 20 g / L.
  • biomass corresponds to fungi.
  • the dilution factor is understood as a volume dilution factor, and corresponds to the ratio between the volume after dilution and before dilution.
  • the culture medium being an aqueous medium
  • the dilution liquid is water or an aqueous medium, such as a culture medium also.
  • means are provided for fluid connection between the bioreactor and the bubble column to ensure the transfer of the culture medium obtained in the growth step in the bioreactor to the bubble column, means in particular in the form pipes fitted with manual or piloted valves and in particular pump (s).
  • the second stage (b) of dilution in whole or in part, can be carried out in the fluid connection means during the transfer of the culture medium by these fluid connection means from the bioreactor to the bubble column.
  • the concentration of carbonaceous growth substrate in the bioreactor is greater than 20 g / L, it is in particular between 30 and 100 g / L, and preferably between 50 and 80 g / L.
  • the inducing carbon substrate feeds the bubble column at a specific speed of between 30 and 140 mg per gram of cellular biomass per hour, preferably between 35 and 45 mg per gram of cellular biomass per hour.
  • the biomass growth step is continued until a biomass (mushroom) concentration of at least 20 g / L.
  • a concentrated culture medium is thus obtained, which will then be diluted to proceed with production.
  • the method of the invention can be implemented with a number n of agitated and aerated bioreactors and a number m of bubble columns, with n less than or equal to m, a bubble column being able to be connected fluidly to many bioreactors or vice versa. It is possible to have bubble columns of much larger capacity than agitated bioreactors, which allows several agitated bioreactors to feed a single bubble column for example, and to take into account that the step of growth is faster than the production stage.
  • the carbonaceous growth substrate is chosen from at least one of the following compounds: lactose, glucose, xylose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, a crude extract of water-soluble pentoses from pretreatment of cellulosic biomass.
  • the inducing carbon substrate is chosen from at least one of the following compounds: lactose, cellobiose, sophorose, the residues obtained after ethanolic fermentation of the monomeric sugars of the enzymatic hydrolysates of cellulosic biomass, a crude extract of water-soluble pentoses from pretreatment of cellulosic biomass.
  • the growth substrates and inducers mentioned above can be used alone or as a mixture.
  • the carbonaceous growth substrate chosen for obtaining the biomass is introduced into the bioreactor before sterilization, or is sterilized separately and introduced into the bioreactor after sterilization.
  • the inducing carbon substrate introduced during the fed-batch production step is preferably sterilized independently, before being introduced into the bubble column. If the inducing carbon substrate is pretreated biomass or hemicellulosic hydrolysates, it can be used without sterilizing it.
  • the aqueous solution is prepared at the concentration of 200-250 gL 1 .
  • the inducing carbon substrate is the pretreated biomass, it is preferably aimed at an average sugar intake of between 35 and 140 mg per gram of cell and per hour.
  • the strains used belong to the species Trichoderma reesei, possibly modified to improve the cellulolytic enzymes and / or hemicellulolytics by mutation-selection processes; strains improved by genetic recombination techniques can also be used. These strains are cultivated under conditions compatible with their growth and the production of enzymes. Other strains of microorganisms producing enzymes according to processes similar to those used for Trichoderma can be used. *
  • the enzymes are cellulolytic or hemicellulolytic enzymes.
  • the filamentous fungus strain used is therefore a Trichoderma reesei or Trichoderma reesei strain modified by genetic mutation, selection or recombination.
  • the strain is a CL847, RutC30, MCG77, or MCG80 strain.
  • the invention also relates to an installation for the production of enzymes by a strain belonging to a filamentous fungus, such that said installation comprises: - a stirred and aerated bioreactor operating in batch phase to operate a stage of growth of the fungi, in the presence at least one carbonaceous growth substrate; - a bubble column operating in fed-batch phase to operate a step of producing enzymes from the culture medium originating from the bioreactor; - Fluid connection means connecting the bioreactor to the bubble column to effect the transfer of the culture medium from the bioreactor to the bubble column; - means for injecting dilution liquid into the bioreactor and / or into the bubble column and / or into the fluid connection means.
  • the bioreactor and / or the bubble column contain a culture medium with a strain belonging to a filamentous fungus.
  • This installation can advantageously implement the process described above, with the same advantages which result therefrom: better specific productivity than fermentation without intermediate dilution, in a single agitated tank, easier operability and maintenance of the installation, adaptation to productions of variable quantities ...
  • the bubble column has an interior volume at least twice greater than the interior volume of the stirred bioreactor, which allows the bubble column to "absorb" the increased volume of the diluted culture medium and / or to be supplied by several agitated bioreactors.
  • the installation described above can thus include n agitated and aerated bioreactors and m bubble columns, with n less than or equal to m (and with n greater than or equal to 1). DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 is a very schematic representation of the installation implementing the method of the invention.
  • Figures 2a, 2b and 2c are graphs showing the evolution of the concentration of the mass of the proteins produced and of the mass of the cellular biomass according to three different examples.
  • the present invention relates to a process for the production of cellulases by a strain belonging to the species Trichoderma reesei, in a stirred and aerated bioreactor comprising three stages:
  • the first growth step in the presence of at least one carbonaceous growth substrate in the batch phase with a concentration of carbonaceous growth substrate of between 30 and 100 g / L, preferably from 50 to 80 g / L. This step is done in a stirred tank
  • a second stage of dilution of the fermentation must by a factor greater than 1, 1 and preferably by 2.
  • This stage of dilution can be carried out in the growth tank.
  • Another solution is to carry out an online dilution during the transfer from the agitated tank to the bubble column.
  • a third stage of production in a bubble column in the presence of at least one inducing carbon substrate in the fed-batch phase, this substrate being fed at a specific speed of between 35 and 140 mg per gram of cells and per hour, and preferably between 35 and 45 mg per gram of cells per hour.
  • the production step is carried out under conditions of limitation of the inducing carbon substrate with a flow lower than the maximum consumption capacity of the strain.
  • the inducing carbon source is lactose
  • the aqueous solution is prepared at the concentration of 200-250 gL 1 .
  • the inducing carbon substrate is pretreated biomass, we aim for an average sugar intake of between 35 and 140 mg per gram of cell and per hour.
  • the process according to the present invention makes it possible to obtain a higher productivity in cellulases by better using agitated bioreactors: dedicated to the growth of biomass, they can be arranged, best suited to this stage only.
  • the biomass is then transferred to bubble columns, which are large volume fermenters and which will be dedicated to the production of enzymes.
  • the whole process is more economical in utilities (energy consumption %) and more flexible.
  • control mode was thus adapted compared to conventional methods, on the one hand by diluting the concentration of mushrooms at the end of growth, and on the other hand by carrying out the production in bubble column.
  • FIG. 1 An exemplary embodiment of the method according to the invention is understood from FIG. 1, representing an example of an installation implementing it.
  • the installation thus comprises, first of all, a stirred tank 1, in which the growth stage will be carried out.
  • This tank 1 has a volume of between 20 and 500 m 3 , preferably between 40 and 400 m 3 .
  • the agitated tank 1 comprises between one and five agitation mobiles 4, with an agitation power of between 0.1 and 7 kW / m 3 , preferably with a maximum power of between 1 and 4 kW / m 3 by the motor 3.
  • the tank 1 has a height / diameter ratio of between 1 and 5, preferably between 1, 5 and 3.
  • the tank 1 is also provided with a bubbling device 5 in the lower part, fluidly connected to an external air inlet 6, and with one (or more) inlet (s) 2 in carbonaceous growth source and in mushrooms.
  • the tank 1 operates between 1 and 5 bar abs. It is supplied with air (5.6) at a flow rate between 0.1 and 2 Volume of air (under normal conditions) per volume of liquid and per hour, preferably between 0.2 and 1 Volume of air per volume of liquid per hour.
  • a bubble column is a reaction chamber composed of a cylindrical column, with a height to diameter ratio conventionally between 1 and 10, preferably between 2.5 and 6.
  • the column is equipped with an injection device for air, possibly enriched with oxygen.
  • This injection device is positioned at the bottom of the column so that the injected air supplies the entire volume with bubbles and therefore with oxygen.
  • the injection device can be a perforated tray, a system of perforated tubes or any other system known to those skilled in the art.
  • the book “Bubble Column Reactors” by WDDeckwer (J. Wiley & Sons, 1992) provides a set of description of bubble columns, which can be declined in multiple variants according to whether they are empty or equipped with internal type perforated trays, recirculation line or other.
  • the simplified representation of the bubble column 7 according to FIG. 1 represents the supply 8 of the bubble column with an inducing carbon substrate, a bubbling device 1 1 at the bottom in fluid connection with an external air inlet 12.
  • the bubble column at a volume between 40 and 1000 m 3 , it generally defines an interior volume at least 2 times greater than that of the agitated tank 1, to allow the dilution of the culture medium resulting from the growth in tank 1 .
  • the bubble column 7 has a height / diameter ratio of between 2 and 10, preferably between 2.5 and 7.
  • the bubble column can be empty, or equipped with an internal cylinder to promote the recirculation of the liquid.
  • a person skilled in the art then speaks of an “airlift” reactor, which is a well-known variant of the simple bubble column and which can just as easily be used in the context of the present invention.
  • the bubble column 7 operates between 1 and 5 bar abs. It is supplied with air 1 1, 12 at a flow rate of between 0.1 and 2 Volume of air (under normal conditions) per volume of liquid and per hour, preferably between 0.2 and 1 Volume of air per volume of liquid and per hour.
  • Transfer of the culture medium from the agitated tank 1 to the ball column 7 is effected by a fluid connection 13 between the two reactors produced by one or more pipes connecting the two reactors.
  • these pipes are arranged in the lower parts of the two reactors, both essentially oriented along a vertical axis.
  • These lines are provided with a pump 15, and with manual or pilot-operated valves making it possible to control the transfer of the medium from the tank 1 to the bubble column 7.
  • the stage of dilution of the culture medium between the stage of growth in tank 1 and the stage of production in the bubble column can be carried out in three different ways: - either in tank 1, at the end of growth, by supplying aqueous liquid to injection point 2, before transfer to column 7 - either at the fluid connection, by supplying aqueous liquid to the culture medium being transferred (injection point 14), - either at the inlet of column 7 by adding aqueous liquid to column 7 at the injection point 9. It is also possible to choose to mix these three dilution modes, that is to say to add a portion of the water required in the tank and another during the transfer and / or in the bubble column for example. The main thing is to reach the required dilution level, for example around 2, depending on the respective volumes of the two reactors, the viscosity of the culture medium at the end of the growth stage, etc.
  • the prior dilution step according to the invention therefore makes it possible, in particular, to adjust the final biomass concentration to a target concentration of between 5 and 20 g / L.
  • the industrial process for the production of enzymes according to the invention can use a lower number of stirred tanks than the number of bubble columns, which maximizes the use of both types of fermenters.
  • step (a) lasts 50 hours and step (c) lasts 200 hours
  • the contents of the agitated tank can be transferred after dilution (b) into a first bubble column, then the tank can be reused to perform step (a) again. His new content will then be diluted and transferred to another bubble column.
  • the number of bubble columns and agitated reactors is to be adjusted according to the duration of each stage.
  • Example 1 is an example of comparison of two productions carried out at concentrations of 12.5 g / L and 25 g / L respectively of biomass stabilized during the fed-batch production step.
  • Example 2 according to the invention demonstrates the feasibility and the production performances obtained with a pipe carried out in a stirred tank during the growth step and in a bubble column during the enzyme production step.
  • Comparative example 3 demonstrates the difficulty in carrying out the growth step in a bubble column without respecting the conditions of the invention.
  • the production of cellulases is carried out in a mechanically stirred fermenter (not shown in Figure 1).
  • the mineral medium has the following composition: KOH 1, 66 g./L, H3PO4 85% 2 mL / L, (NH 4 ) 2S0 4 2.8 g / L, MgS04, 7 H 2 0 0.6 g / L , CaCI 2 0.6 g / L, MnS0 4 3.2 mg / L, ZnS0 4 , 7 H2 o 2.8 mg / L, CoCI 2 10 4.0 mg / L, FeS0 4 , 7 H 2 0 10 mg / L, Corn Steep 1, 2 g / L, anti-foam 0.5 ml / L.
  • the fermenter containing the mineral medium is sterilized at 120 ° C for 20 minutes, the carbonaceous glucose source is sterilized separately at 120 ° C for 20 minutes and then added sterile to tank 1 so as to have a final concentration of 25 g / L .
  • the fermenter is seeded at 10% (v / v) with a liquid preculture of the Trichoderma reesei CL847 strain.
  • the mineral medium of the preculture is identical to that of the fermenter, except for the addition of potassium phthalate at 5 gL 1 to buffer the pH of the medium.
  • the growth of the mushroom in preculture is done using glucose as carbonaceous substrate, at the concentration of 30 gL 1 .
  • the growth of the inoculum lasts 2 to 3 days, and is carried out at 28 ° C in a shaken incubator.
  • the transfer to the fermenter is carried out when the residual concentration of glucose is less than 15 g / L.
  • the growth stage is carried out for 50 hours in the agitated bioreactor 1 with an initial concentration of 50 g / L of glucose at a temperature of 27 ° C and a pH of 4.8 (regulated by ammonia 5.5 M).
  • the aeration is 0.5 vvm (volume / volume / minute), and the partial pressure of dissolved oxygen in the medium is 40% of P 0 2 sat.
  • the 50 g / L of glucose makes it possible, after exhaustion of the substrate, to a biomass concentration of approximately 25 g / L.
  • Part of the medium is drawn off and diluted by a factor of two in another sterile bioreactor identical to the previous one, so as to have, at the start of the fed-batch phase of production, a bioreactor at 25 g / L of biomass and another at 12.5 g / L of biomass.
  • a lactose solution at 250 g / L is injected continuously at a rate of 35 to 45 mg per g of cells and per hour up to 164 hours in the two reactors (approximately 2 ml_ / h for the experiment at 12, 5 g / L of biomass and 4 mL / h for the experiment at 25 g / L of biomass).
  • the temperature is lowered to 25 ° C, and the pH is maintained at 4 until the end of the culture.
  • the pH is regulated by adding a 5.5 N ammonia solution which provides the nitrogen necessary for the synthesis of the excreted proteins.
  • the dissolved oxygen content is maintained at 40% P 0 2 sat.
  • Figure 2a shows the evolution of the mass of cellular biomass and proteins for the experiment at 25 g / L of biomass and Figure 2b, the same curves but at a biomass stabilized at 12.5 g / L.
  • Figure 2b shows the same curves but at a biomass stabilized at 12.5 g / L.
  • 47 g of proteins are obtained with the experiment at 25 g / L of biomass, and only 36 g of proteins with the experiment at 12.5 g / L of biomass.
  • the specific speed of protein production noted qp is significantly higher with experience at 12.5 g / L of biomass (about 65% higher). Indeed, it is 12 ⁇ 2 mg / g / h at 25 g / L of biomass and 20 ⁇ 1 mg / g / h with the experiment at 12.5 g / L of biomass.
  • Example 2 The experiment is carried out under the same conditions as Example 1, except that after the dilution step (to go from a concentration of from 25 to 12.5 g / L of cellular biomass) in the agitated tank 1 , the production step is carried out in the bubble column 7 after transfer from one reactor to another by the system of pipes 13, the stirring being carried out therefore in production only by injecting air at a vvm of 1 in the bubble column.
  • Example 3 is carried out under the same conditions as Example 1, but simulating a growth step in a bubble column, as in production: In this example, the growth is carried out in a tank stirred but without stirring, to mimic operation in a bubble column.
  • the invention incorporates an intermediate dilution step with very interesting and unexpected effects on the performance of the process. It has also proved to be very advantageous to use two different types of reactors to operate the growth and production stages, so that these stages take place under industrially optimal conditions: the invention allows a transition from production of proteins to the industrial scale which is robust, efficient, which remains simple and which is very flexible in its implementation.

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Abstract

La présente invention porte sur un procédé de production d'enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, qui comprend trois étapes : (a) une première étape de croissance de biomasse, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité (1) et aéré en phase batch, (b) une deuxième étape de dilution du milieu de culture obtenu à la première étape (a), (c) une troisième étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture dilué obtenu à la deuxième étape (b), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, en phase fed-batch.

Description

PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE CELLULASES PAR UN CHAMPIGNON FILAMENTEUX
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention est relative à un procédé de production d’enzymes par un champignon filamenteux, notamment des enzymes de type cellulases (cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques), qui sont nécessaires pour l'hydrolyse enzymatique de biomasse lignocellulosique.
Cette hydrolyse enzymatique est mise en oeuvre par exemple dans les procédés de production dits de seconde génération (2G) de biocarburants comme le bioéthanol, ou pour produire des jus sucrés qui peuvent être utilisés pour produire d’autres produits par voie chimique ou voie biochimique/fermentaire (par exemple, des alcools comme l'éthanol, le butanol, le propanol, l’isopropanol ou d’autres molécules, par exemple des solvants tels que l’acétone et d’autres molécules biosourcées), ou dans d'autres procédés des industries chimiques, papetières ou textiles.
ART ANTÉRIEUR
Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases à l’échelle industrielle. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, un complexe enzymatique considéré comme bien adapté à l'hydrolyse de biomasse lignocellulosique. Les enzymes du complexe enzymatique contiennent trois grands types selon leur activité: les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple.
La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques. La nature du substrat carboné a une forte influence sur la composition du complexe enzymatique. C'est le cas du xylose, qui, associé à un substrat carboné inducteur comme la cellulose ou le lactose, permet d'améliorer significativement l'activité dite xylanase. La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été étudiée dans le détail. Ils sont induits en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse (exemple: cellobiose) ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (llmén et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).
Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US-4,275,167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451 -459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B. S. et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50).
Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet de travaux de développement importants pour passer à l'échelle industrielle. Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei, et un substrat inducteur qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. La cellulose peut jouer ces deux rôles. Cependant, elle est difficile d'utilisation à l’échelle industrielle, car elle augmente la viscosité du milieu et peut gêner le transfert d’oxygène indispensable à la croissance du microorganisme, qui est aérobie strict. Elle peut être remplacée par des sources de carbone solubles, telles que le glucose, le xylose ou le lactose, le lactose jouant également le rôle de substrat inducteur. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme inducteurs, mais ils peuvent être considérés trop onéreux pour être utilisés à l’échelle industrielle.
On a constaté que les productions de cellulases par Trichoderma reesei avec des substrats solubles sont très inférieures à celles obtenues sur cellulose en "batch". Ceci est dû à l'effet répresseur des sucres facilement assimilables à forte concentration. L'alimentation en continu en mode fed-batch des substrats carbonés solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle dans les cultures et en optimisant la quantité de sucre, permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité enzymatique, comme décrit dans le brevet FR-B-2 555 603. Ce protocole permet d'aboutir à une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0.2 g/L/h.
Pour obtenir ces performances, les procédés industriels de production de cellulases, tels que décrits dans le brevet ci-dessus mentionné, se font donc en deux étapes dans le même réacteur :
- Une étape de croissance en mode "batch", où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei. Cette phase se caractérise par une augmentation de la viscosité du milieu, ainsi que par une forte demande en oxygène.
Une étape de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur (par exemple le lactose) qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. Le flux optimal appliqué est compris entre 35 et 45 mg (de sucre).g (de poids sec cellulaire) 1.h 1. Cette phase se caractérise par une baisse de la viscosité du milieu et une demande en oxygène plus faible.
La productivité en protéines est égale au produit entre la concentration en biomasse vivante et la vitesse spécifique de production de protéines. Cette productivité peut être augmentée en augmentant les performances de production de la souche (augmentation de la vitesse spécifique) et/ou en augmentant la concentration en biomasse cellulaire. Mais les méthodes pour améliorer les performances des souches, en les modifiant génétiquement comme évoqué plus haut, peuvent finir par atteindre leurs limites, et augmenter la concentration en biomasse aboutit à une forte augmentation de la viscosité, ce qui limite le transfert d’oxygène, notamment en fin d’étape de croissance.
Les étapes de production proposés dans l’art antérieur se font en cuves agitées, les étapes de croissance et de production se faisant dans le même bioréacteur. C’est une solution intéressante car compacte en termes d’installation industrielle, mais pas la solution forcément la meilleure, car les deux étapes, croissance et production, ne requièrent pas les mêmes besoins, par exemple en termes de moyens d’agitation ou en termes de transfert d’oxygène : le bioréacteur doit donc présenter le volume et tous les moyens d’équipement et de fonctionnement lui permettant d’assurer l’ensemble de ces deux étapes, se déroulant pourtant dans des conditions bien différentes.
Le but de l’invention est alors de proposer un procédé amélioré de production d’enzymes de type cellulases à partir de souches de champignon filamenteux, notamment un procédé qui permette d’obtenir des productivités en enzymes augmentées, et, accessoirement, qui puisse être mis en œuvre à l’échelle industrielle dans des installations permettant plus de flexibilité.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, ledit procédé comprenant trois étapes :
(a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité et aéré en phase batch,
(b) une deuxième étape de dilution (volumique) du milieu de culture obtenu à la première étape (a),
(c) une troisième étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture dilué obtenu à la deuxième étape (b), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, en phase fed-batch. L’invention inclut un tel procédé, où l’étape (b) peut commencer (un peu) avant la fin de l’étape (a) ou se terminer (un peu) après le début de l’étape (c). L’invention inclut donc un tel procédé, avec une mise en oeuvre dans laquelle les étapes (a) et (b) d’une part, et les étapes (b) et (c) d’autre part peuvent partiellement se recouvrir. En effet, comme détaillé plus loin, l’étape de dilution (b) peut durer plusieurs heures, et il peut donc s’avérer intéressant de la démarrer entre 0 et 4 heures avant la fin de l’étape (a), et/ou de la finir entre 0 et 4 heures après le passage en étape (c).
L’invention a ainsi mis au point une nouvelle conduite de fermentation, avec une étape de dilution intermédiaire entre l’étape de croissance et l’étape de production. De manière tout-à- fait surprenante, il s’est avéré que les productivités spécifiques obtenues après avoir dilué le milieu de culture à la fin de la phase de croissance sont significativement plus élevées que celles obtenues avec le milieu de culture sans dilution (l’augmentation pouvant aller jusqu’à 30% et plus), et cela pour un même flux spécifique de substrat carboné (calculé par rapport à la masse de biomasse dans les réacteurs).
De préférence, la troisième étape de production (c) est réalisée dans une colonne à bulles : Dans ce mode de réalisation préféré, l’invention exploite également judicieusement l’idée que les étapes de croissance et de production n’ont pas les mêmes besoins, n’ont pas le même mode opératoire, notamment en termes d’agitation et de transfert d’oxygène, et qu’il est donc plus pertinent de réaliser ces étapes dans deux fermenteurs différents : La production de biomasse peut s’opérer dans de bonnes conditions en cuve agitée, en visant de préférence une concentration de biomasse élevée (par exemple supérieure ou égale à 20 g/L). La production s’opère en colonne à bulles, qui est en effet un réacteur particulièrement approprié pour opérer la production, car c’est un réacteur adaptés aux milieux dilués, peu visqueux, qui présente par ailleurs de nombreux avantages, comme une grande facilité de nettoyage, une efficacité énergétique supérieure aux bioréacteurs agités, la possibilité d’offrir de grands volumes réactionnels (Dans le présent texte, « bioréacteur agité » a la même signification que « cuve agitée »).
Avantageusement, on réalise la deuxième étape (b) de dilution dans le bioréacteur à la fin de l’étape (a) de croissance des champignons et/ou dans la colonne à bulles avant ou au début de la troisième étape (c) de production d’enzymes.
L’étape de dilution, qui conduit donc à baisser la viscosité du milieu de culture, peut ainsi, être réalisée dans l’un ou l’autre des réacteurs, ou même en ligne pendant le transvasement du premier réacteur vers le deuxième réacteur. On peut préférer opérer la dilution dans la cuve agitée, de façon à faciliter le transfert du milieu, déjà dilué, depuis la cuve agitée jusqu’à la colonne à bulles.
Avantageusement, le facteur de dilution du milieu de culture à l’étape (b) de dilution est d’au moins 1 ,1 ou 1 ,2, notamment d’au moins 1 ,5, de préférence d’environ 2, et notamment d’au plus 6. La dilution est à ajuster pour que le milieu de culture ait une concentration en biomasse permettant de limiter la viscosité du milieu, c’est-à-dire comprise entre 5 et 20 g/L. Dans la présente invention, le terme biomasse correspond aux champignons.
Le facteur de dilution se comprend comme un facteur de dilution volumique, et correspond au ratio entre le volume après dilution et avant dilution. De préférence, le milieu de culture étant un milieu aqueux, le liquide de dilution est de l’eau ou un milieu aqueux , comme un milieu de culture également.
Selon un mode de réalisation préféré, on prévoit des moyens de connexion fluidique entre le bioréacteur et la colonne à bulles pour assurer le transfert du milieu de culture obtenu à l’étape de croissance dans le bioréacteur vers la colonne à bulles, moyens notamment sous forme de conduites équipées de vannes manuelles ou pilotées et notamment de pompe(s). Dans ce cas de figure, on peut réaliser la deuxième étape (b) de dilution, en tout ou partie, dans les moyens de connexion fluidique lors du transfert du milieu de culture par ces moyens de connexion fluidique depuis le bioréacteur à la colonne à bulles.
De préférence, la concentration en substrat carboné de croissance dans le bioréacteur est supérieure à 20 g/L, elle est notamment comprise entre 30 et 100 g/L, et de préférence entre 50 et 80 g/L.
De préférence, le substrat carboné inducteur alimente la colonne à bulles à une vitesse spécifique comprise entre 30 et 140 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure, de préférence entre 35 et 45 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure.
Avantageusement, on poursuit l’étape de croissance de la biomasse jusqu’à une concentration en biomasse (champignons) d’au moins 20 g/L. On obtient ainsi un milieu de culture concentré, qui sera ensuite dilué pour procéder à la production.
Selon un mode de réalisation, on peut mettre en œuvre le procédé de l’invention avec un nombre n de bioréacteurs agités et aérés et un nombre m de colonnes à bulles, avec n inférieur ou égal à m, une colonne à bulles pouvant être connectée fluidiquement à plusieurs bioréacteurs ou inversement. Il est en possible d’avoir des colonnes à bulles de capacité bien plus grande que des bioréacteurs agités, ce qui permet à plusieurs bioréacteurs agités d’alimenter une seule colonne à bulles par exemple, et de tenir compte du fait que l’étape de croissance est plus rapide que l’étape de production.
De préférence, le substrat carboné de croissance est choisi parmi au moins un des composés suivants : le lactose, le glucose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.
De préférence, le substrat carboné inducteur est choisi parmi au moins un des composés suivants : le lactose, le cellobiose, le sophorose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de biomasse cellulosique, un extrait brut de pentoses hydrosolubles provenant du prétraitement d'une biomasse cellulosique.
Les substrats de croissance et inducteurs cités ci-dessus peuvent être utilisés seuls ou en mélange.
Selon sa nature, le substrat carboné de croissance choisi pour l'obtention de la biomasse est introduit dans le bioréacteur avant stérilisation, ou est stérilisé séparément et introduit dans le bioréacteur après stérilisation.
Le substrat carboné inducteur introduit pendant l’étape de production en fed-batch est de préférence stérilisé de façon indépendante, avant d'être introduite dans la colonne à bulles. Si le substrat carboné inducteur est la biomasse prétraitée ou des hydrolysats hémicellulosiques, il est possible de l’utiliser sans le stériliser.
De façon préférée, quand la source de carbone inductrice est le lactose, la solution aqueuse est préparée à la concentration de 200-250 g.L 1. Si le substrat carboné inducteur est la biomasse prétraitée, on vise de préférence un apport moyen de sucre compris entre 35 et 140 mg par gramme de cellule et par heure.
De préférence, les souches utilisées appartiennent à l'espèce Trichoderma reesei, éventuellement modifiées pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques par les procédés de mutation-sélection; les souches améliorées par les techniques de recombinaison génétique peuvent être également utilisées. Ces souches sont cultivées dans des conditions compatibles avec leur croissance et la production des enzymes. D'autres souches de microorganismes produisant des enzymes selon des processus similaires à ceux utilisés pour Trichoderma peuvent être utilisées.*
De préférence, les enzymes sont des enzymes cellulolytiques ou hémicellulolytiques.
De préférence, la souche de champignon filamenteux utilisée est donc une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation, sélection ou recombinaison génétique. De façon très préférée, la souche est une souche CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80.
L’invention a également pour objet une Installation de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, telle que ladite installation comprend : - un bioréacteur agité et aéré fonctionnant en phase batch pour opérer une étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance ; - une colonne à bulles fonctionnant en phase fed-batch pour opérer une étape de production d’enzymes à partir du milieu de culture provenant du bioréacteur ; - des moyens de connexion fluidique reliant le bioréacteur à la colonne à bulles pour opérer le transfert du milieu de culture du bioréacteur vers la colonne à bulles ; - des moyens d’injection de liquide de dilution dans le bioréacteur et/ou dans la colonne à bulles et/ou dans les moyens de connexion de fluidique. De préférence, le bioréacteur et/ou la colonne à bulles contiennent un milieu de culture avec une souche appartenant à un champignon filamenteux.
Cette installation peut avantageusement mettre en œuvre le procédé précédemment décrit, avec les mêmes avantages qui en découlent : meilleure productivité spécifique qu’une fermentation sans dilution intermédiaire, en une seule cuve agitée, opérabilité et maintenance de l’installation plus aisées, adaptation à des productions de quantités variables...
Avantageusement, la colonne à bulles a un volume intérieur au moins deux fois supérieur au volume intérieur du bioréacteur agité, ce qui permet à la colonne à bulles « d’absorber » le volume accru du milieu de culture dilué et/ou d’être alimentée par plusieurs bioréacteurs agités.
L’installation décrite plus haut peut ainsi comprendre n bioréacteurs agités et aérés et m colonnes à bulles, avec n inférieur ou égal à m (et avec n supérieur ou égal à 1 ). DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est une représentation très schématique de l’installation mettant en oeuvre le procédé de l’invention.
Les Figures 2a, 2b et 2c sont des graphes montrant l’évolution de la concentration de la masse des protéines produites et de la masse de la biomasse cellulaire selon trois exemples différents.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention porte sur un procédé de production de cellulases par une souche appartenant à l'espèce Trichoderma reesei, en bioréacteur agité et aéré comprenant trois étapes :
- la première étape de croissance en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en phase batch avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 30 et 100 g/L, de préférence de 50 à 80 g/L. Cette étape se fait dans une cuve agitée
- une deuxième étape de dilution du moût de fermentation d’un facteur supérieur à 1 ,1 et de préférence de 2. Cette étape de dilution peut être réalisée dans la cuve de croissance. Une autre solution consiste à réaliser une dilution en ligne durant le transvasement de la cuve agitée vers la colonne à bulles.
- une troisième étape de production en colonne à bulles, en présence d'au moins un substrat carboné inducteur en phase fed-batch, ce substrat étant alimenté à une vitesse spécifique comprise entre 35 et 140 mg par gramme de cellules et par heure, et de préférence entre 35 et 45 mg par gramme de cellules et par heure.
L’étape de production est réalisée en condition de limitation du substrat carboné inducteur avec un flux inférieur à la capacité maximale de consommation de la souche.
Différents substrats carbonés de croissance et inducteurs ont déjà été listés plus haut. De façon préférée, quand la source de carbone inductrice est le lactose, la solution aqueuse est préparée à la concentration de 200-250 g.L 1. Quand le substrat carboné inducteur est de la biomasse prétraitée, on vise un apport moyen de sucre compris entre 35 et 140 mg par gramme de cellule et par heure.
Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir une productivité supérieure en cellulases en utilisant mieux des bioréacteurs agités : dédiés à la croissance de biomasse, ils peuvent être agencés, adaptés au mieux à cette étape seulement. La biomasse est ensuite transvasée dans des colonnes à bulles, qui sont des fermenteurs de grands volumes et qui, eux, seront dédiés à la production d’enzymes. Le procédé dans son ensemble est plus économe en utilités (consommation énergétique...) et plus flexible.
Le mode de conduite a été ainsi adapté par rapport aux procédés conventionnels, d'une part en diluant la concentration en champignons en fin de croissance, et d’autre part en réalisant la production en colonne à bulles.
Un exemple de réalisation du procédé selon l’invention se comprend de la figure 1 , représentant un exemple d’une installation le mettant en œuvre.
Les références ont la signification suivante :
1 : cuve agitée
2 : alimentation de la cuve agitée
3 : moteur
4 : dispositif d’agitation
5 : dispositif de bullage
6 : alimentation en air
7 : colonne à bulles
8 : alimentation en substrat
9 : alimentation de la colonne à bulles
10 : point de vidange
1 1 : dispositif de bullage
12 : alimentation en air
13 : ligne de transvasement
14 : point d’injection
15 : pompe
L’installation comporte ainsi, tout d’abord, une cuve agitée 1 , dans laquelle on va réaliser l’étape de croissance. Cette cuve 1 présente a un volume compris entre 20 et 500 m3, préférentiellement entre 40 et 400 m3.
La cuve agitée 1 comporte entre un et cinq mobiles d’agitation 4, avec une puissance d’agitation comprise entre 0,1 et 7 kW/m3, avec préférentiellement une puissance maximale comprise entre 1 et 4 kW/m3 par le moteur 3. La cuve 1 présente un rapport hauteur/diamètre compris entre 1 et 5, préférentiellement compris entre 1 ,5 et 3. La cuve 1 est également munie d’un dispositif de bullage 5 en partie inférieure, connectée fluidiquement à une arrivée externe 6 d’air, et d’une (ou plusieurs) arrivée(s) 2 en source carbonée de croissance et en champignons.
La cuve 1 fonctionne entre 1 et 5 bars abs. Elle est sont alimentée en air (5,6) à un débit compris entre 0,1 et 2 Volume d’air (en conditions normales) par volume de liquide et par heure, préférentiellement entre 0,2 et 1 Volume d’air par volume de liquide et par heure.
L’installation comporte aussi une colonne à bulles 7, pour réaliser l’étape de production. Pour rappel, une colonne à bulles est une enceinte réactionnelle composée d’une colonne cylindrique, de rapport hauteur sur diamètre classiquement compris entre 1 et 10, préférentiellement entre 2,5 et 6. La colonne est équipée d’un dispositif d’injection d’air, éventuellement enrichi en oxygène. Ce dispositif d’injection est positionné en bas de colonne pour que l’air injecté alimente l’ensemble du volume en bulles et donc en oxygène. Le dispositif d’injection peut être un plateau perforé, un système de tubes perforés ou tout autre système connu de l’homme du métier. L’ouvrage « Bubble Column Reactors » de W.D.Deckwer (J.Wiley & Sons, 1992) fournit un ensemble de description de colonnes à bulles, qui peuvent se décliner sous de multiples variantes selon qu’elles sont vides ou équipées d’internes type plateaux perforés, conduite de recirculation ou autre.
La représentation simplifiée de la colonne à bulles 7 selon la figure 1 représente l’alimentation 8 de la colonne à bulles en substrat carboné inducteur, un dispositif de bullage 1 1 en partie inférieure en connexion fluidique avec une arrivée d’air externe 12.
La colonne à bulles à un volume compris entre 40 et 1000 m3, elle définit généralement un volume intérieur au moins 2 fois plus grand que celui de la cuve agitée 1 , pour permettre la dilution du milieu de culture issu de la croissance en cuve 1 . La colonne à bulles 7 a un rapport hauteur/diamètre compris entre 2 et 10, préférentiellement entre 2,5 et 7.
Comme évoqué plus haut, la colonne à bulles peut être vide, ou équipée d’un cylindre interne pour favoriser la recirculation du liquide. L’homme du métier parle alors de réacteur « airlift », qui est une variante bien connue de la colonne à bulle simple et qui peut tout aussi bien être utilisée dans le cadre de la présente invention. Comme la cuve 1 , la colonne à bulles 7 fonctionne entre 1 et 5 bars abs. Elle est alimentée en air 1 1 ,12 à un débit compris entre 0,1 et 2 Volume d’air (en conditions normales) par volume de liquide et par heure, préférentiellement entre 0,2 et 1 Volume d’air par volume de liquide et par heure.
Le transvasement du milieu de culture depuis la cuve agitée 1 vers la colonne à billes 7 s’effectue par une connexion fluidique 13 entre les deux réacteurs réalisée par une ou des conduites reliant les deux réacteurs. Ici, ces conduites sont disposées en parties basses des deux réacteurs, tous deux essentiellement orientés selon un axe vertical. Ces conduites sont munies d’une pompe 15, et de vannes manuelles ou pilotées permettant de commander le transfert du milieu de la cuve 1 à la colonne à bulles 7.
L’étape de dilution du milieu de culture entre l’étape de croissance dans la cuve 1 et l’étape de production dans la colonne à bulles peut être réalisée de trois façons différentes : - soit dans la cuve 1 , en fin de croissance, par apport de liquide aqueux au point d’injection 2, avant transfert vers la colonne 7 - soit au niveau de la connexion fluidique, par apport de liquide aqueux dans le milieu de culture en cours de transferts (point d’injection 14), - soit en entrée de la colonne 7 par apport de liquide aqueux au niveau de la colonne 7 au point d’injection 9. On peut aussi choisir de mixer ces trois modes de dilution, c’est-à-dire d’ajouter une partie de l’eau nécessaire dans la cuve et une autre lors du transfert et/ou dans la colonne à bulles par exemple. Le tout est d’atteindre le niveau de dilution requis, par exemple d’environ 2, dépendant des volumes respectifs des deux réacteurs, de la viscosité du milieu de culture en fin d’étape de croissance etc...
L’étape de dilution préalable selon l’invention permet donc, notamment, d’ajuster la concentration en biomasse finale à une concentration cible comprise entre 5 et 20 g/L.
Etant donné les temps différents de croissance et de production (un facteur 3 à 8 peut exister entre les temps des deux étapes, la croissance étant toujours l’étape la plus courte), le procédé industriel de production d’enzymes selon l’invention peut utiliser un nombre de cuves agitées plus faible que le nombre de colonnes à bulles, ce qui permet de maximiser l’utilisation des deux types de fermenteurs.
Par exemple, si l’étape (a) dure 50 heures et l’étape (c) dure 200 heures, le contenu de la cuve agitée peut être transvasé après dilution (b) dans une première colonne à bulles, puis la cuve peut être réutilisée pour réaliser une nouvelle fois l’étape (a). Son nouveau contenu sera alors dilué et transvasé dans une autre colonne à bulles. Le nombre de colonnes à bulles et de réacteurs agité est à ajuster en fonction de la durée de chaque étape.
EXEMPLES
L’exemple 1 est un exemple de comparaison de deux productions réalisées à des concentrations de respectivement 12,5 g/L et 25 g/L de biomasse stabilisée lors de l’étape fed-batch de production. L’exemple 2 selon l’invention démontre la faisabilité et les performances de production obtenues avec une conduite réalisée en cuve agitée lors de l’étape de croissance et en colonne à bulle lors de l’étape de production d’enzymes.
L’exemple 3 comparatif démontre la difficulté à réaliser l’étape de croissance en colonne à bulles sans respecter les conditions de l’invention.
Exemple 1 (comparaison - préliminaire à l’invention)
La production de cellulases est effectuée en fermenteur agité mécaniquement (non représenté à la figure 1 ). Le milieu minéral a la composition suivante : KOH 1 ,66 g./L, H3P04 85 % 2 mL/L, (NH4)2S04 2,8 g/L, MgS04, 7 H20 0,6 g/L, CaCI2 0,6 g/L, MnS04 3,2 mg/L, ZnS04, 7 H2o 2,8 mg/L, CoCI2 10 4,0 mg/L, FeS04, 7 H20 10 mg/L, Corn Steep 1 ,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L.
Le fermenteur contenant le milieu minéral est stérilisé à 120 °C pendant 20 minutes, la source carbonée glucose est stérilisée à part à 120°C pendant 20 minutes puis ajoutée stérilement dans la cuve 1 de façon à avoir une concentration finale de 25 g/L. Le fermenteur est ensemencé à 10% (v/v) avec une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847. Le milieu minéral de la préculture est identique à celui du fermenteur, mis à part l'addition de phtalate de potassium à 5 g.L 1 pour tamponner le pH du milieu. La croissance du champignon en préculture est faite en utilisant le glucose comme substrat carboné, à la concentration de 30 g.L 1. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours, et est effectuée à 28 °C dans un incubateur agité. Le transfert vers le fermenteur est réalisé quand la concentration résiduelle en glucose est inférieure à 15 g/L.
L’étape de croissance est effectuée pendant 50 heures dans le bioréacteur agité 1 avec une concentration initiale de 50 g/L de glucose à une température de 27 °C et un pH de 4,8 (régulé par de l'ammoniaque 5,5 M). L'aération est de 0,5 vvm (volume/volume/minute), et la pression partielle en oxygène dissous dans le milieu est de 40 % de P 02sat. Les 50 g/L de glucose permettent d’aboutir, après épuisement du substrat, à une concentration en biomasse d’environ 25 g/L. Une partie du milieu est soutirée et diluée d’un facteur deux dans un autre bioréacteur stérile identique au précédent, de façon à avoir, en début de phase fed- batch de production, un bioréacteur à 25 g/L de biomasse et un autre à 12,5 g/L de biomasse.
Une solution de lactose à 250 g/L est injectée en continu à un débit de 35 à 45 mg par g de cellules et par heure jusqu'à 164 heures dans les deux réacteurs (environ 2 ml_/h pour l’expérience à 12,5 g/L de biomasse et 4 mL/h pour l’expérience à 25 g/L de biomasse). La température est baissée à 25 °C, et le pH est maintenu à 4 jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé par addition d'une solution d'ammoniaque à 5,5 N qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des protéines excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue à 40 % de P 02sat.
La production d'enzymes est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Lowry et standard BSA, après séparation du mycélium par filtration ou centrifugation.
La figure 2a présente l’évolution de la masse en biomasse cellulaire et en protéines pour l’expérience à 25 g/L de biomasse et la figure 2b, les mêmes courbes mais à une biomasse stabilisée à 12.5 g/L. On voit, de la comparaison des deux graphes, que 47 g de protéines sont obtenues avec l’expérience à 25 g/L de biomasse, et seulement 36 g de protéines avec l’expérience à 12,5 g/L de biomasse. Par contre, la vitesse spécifique de production de protéines notée qp est nettement supérieure avec l’expérience à 12,5 g/L de biomasse (environ 65 % supérieure). En effet, elle est de 12 ± 2 mg/g/h à 25 g/L de biomasse et de 20 ± 1 mg/g/h avec l’expérience à 12,5 g/L de biomasse.
Cette comparaison permet de démontrer que, de façon surprenante, on obtient une vitesse spécifique au moins 50% supérieure avec une concentration en biomasse de 12,5g/L par rapport à une concentration de 25 g/L. Cela démontre l’intérêt de faire une dilution avant l’étape de production et cela a déterminé le mode de production présenté dans l’exemple 2 suivant selon l’invention.
Exemple 2 (selon l’invention):
L’expérience est réalisée dans les même conditions que l’exemple 1 , sauf qu’après l’étape de dilution (pour passer d’une concentration de de 25 à 12,5 g/L de biomasse cellulaire) dans la cuve agitée 1 , l’étape de production est réalisée dans la colonne à bulles 7 après transvasement d’un réacteur à l’autre par le système de conduites 13, l’agitation se faisant donc en production uniquement par injection de l’air à une vvm de 1 dans la colonne à bulles.
Les évolutions des masses de la biomasse cellulaires et de la masse des protéines sont représentées en figure 2c : On voit de ce graphe que la masse finale de protéines obtenue est de 42 g (après 168 h de production en fed-batch). La vitesse spécifique de production de protéines calculée est de 22 ± 1 mg/g/h.
Exemple 3 (comparatif) :
L’exemple 3 est réalisé dans les mêmes conditions que l’exemple 1 , mais en simulant une étape de croissance en colonne à bulles, comme en production : Dans cet exemple, la croissance est réalisée dans une cuve agitée mais sans agitation, pour mimer le fonctionnement en colonne à bulles.
Celle-ci a abouti à un échec de la culture. La concentration en biomasse n’a pas pu être mesurée et a formé une grosse boule autour de l’arbre d’agitation, qui n’avait pas été activé.
En conclusion, l’invention intègre une étape intermédiaire de dilution aux effets très intéressants et inattendus sur les performances du procédé. Il s’est avéré en outre très intéressant d’utiliser deux types de réacteurs différents pour opérer les étapes de croissance et de production, pour que ces étapes se déroulent dans des conditions optimales industriellement : l’invention permet un passage de production de protéines à l’échelle industrielle qui est robuste, performant, qui reste simple et qui est très souple dans sa mise en œuvre.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, caractérisé en ce que ledit procédé comprend trois étapes :
(a) une première étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance, dans un bioréacteur agité (1 ) et aéré en phase batch,
(b) une deuxième étape de dilution du milieu de culture obtenu à la première étape (a),
(c) une troisième étape de production d'enzymes à partir du milieu de culture dilué obtenu à la deuxième étape (b), en présence d'au moins un substrat carboné inducteur, en phase fed-batch.
2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la troisième étape de production d’enzymes (c ) est réalisé dans une colonne à bulles (7).
3. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de dilution volumique du milieu de culture à l’étape (b) de dilution est d’au moins 1 ,1 ou 1 ,2, notamment d’au moins 1 ,5, de préférence d’environ 2, et notamment d’au plus 6, notamment afin d’atteindre une concentration en champignons comprise entre 5 et 20 g/L .
4. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on réalise la deuxième étape (b) de dilution dans le bioréacteur (1 ) à la fin de l’étape (a) de croissance et/ou dans la colonne à bulles (7) avant ou au début de la troisième étape (c) de production d’enzymes.
5. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on prévoit des moyens de connexion fluidique (13) entre le bioréacteur (1 ) et la colonne à bulles (7) pour assurer le transfert du milieu de culture obtenu à l’étape de croissance dans le bioréacteur vers la colonne à bulles, moyens notamment sous forme de conduites équipées de vannes manuelles ou pilotées et notamment de pompe(s) (15).
6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’on réalise la deuxième étape (b) de dilution, en tout ou partie, dans les moyens de connexion fluidique (13) lors du transfert du milieu de culture par lesdits moyens de connexion fluidique depuis le bioréacteur (1 ) à la colonne à bulles (7).
7. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en substrat carboné de croissance dans le bioréacteur est comprise entre 30 et 100 g/L, et de préférence entre 50 et 80 g/L.
8. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat carboné inducteur alimente la colonne à bulles à une vitesse spécifique comprise entre 30 et 140 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure, de préférence entre 35 et 45 mg par gramme de biomasse cellulaire et par heure.
9. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’on poursuit l’étape de croissance jusqu’à une concentration en champignons d’au moins 20 g/L.
10. Procédé selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il est opéré avec un nombre n de bioréacteurs agités et aérés (1 ) et un nombre m de colonnes à bulles (7), avec n inférieur ou égal à m, une colonne à bulles pouvant être connectée fluidiquement à plusieurs bioréacteurs ou inversement.
1 1. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la souche utilisée est une souche de Trichoderma reesei ou de Trichoderma reesei modifiée par mutation sélection ou recombinaison génétique.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les enzymes sont des enzymes cellulolytiques ou hémicellulolytiques.
13. Installation de production d’enzymes par une souche appartenant à un champignon filamenteux, caractérisée en ce que ladite installation comprend : - un bioréacteur agité et aéré (1 ) fonctionnant en phase batch pour opérer une étape de croissance des champignons, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance ; - une colonne à bulles (7) fonctionnant en phase fed-batch pour opérer une étape de production d’enzymes à partir du milieu de culture provenant du bioréacteur ; - des moyens de connexion fluidique (13) reliant le bioréacteur à la colonne à bulles pour opérer le transfert du milieu de culture du bioréacteur vers la colonne à bulles ; - des moyens d’injection de liquide de dilution (2 ;9 ;14) dans le bioréacteur (1 ) et/ou dans la colonne à bulles (7) et/ou dans les moyens de connexion de fluidique (13).
14. Installation selon la revendication précédente, caractérisée en ce que la colonne à bulles (7) a un volume intérieur au moins deux fois supérieur au volume intérieur du bioréacteur agité (1 ).
15. Installation selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu’elle comprend n bioréacteurs agités et aérés (1 ) et m colonnes à bulles (7), avec n inférieur ou égal à m.
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