BR112021002456A2 - método de tratamento de um distúrbio do neurodesenvolvimento, composto, e, composição - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO LIGANTE AGONISTA ESPECÍFICO PARA RECEPTOR DE IGF-2, COMPOSTO OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO, E, COMPOSIÇÃO. São providos métodos para o tratamento de distúrbios do neurodesenvolvimento, tais como síndrome de Angelman e autismo, compreendendo administrar a um indivíduo uma composição compreendendo um ligando de agonista de receptor de IGF-2. O ligando de agonista de receptor de IGF-2 pode ser IGF-2, ou manose-6-fosfato, ou um derivado da mesma. Composições compreendendo derivados de manose-6-fosfato também são descritas.

Description

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USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO LIGANTE AGONISTA ESPECÍFICO PARA RECEPTOR DE IGF-2, COMPOSTO OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO, E,

COMPOSIÇÃO DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO COM FINANCIAMENTO FEDERAL

[001] Esta invenção foi realizada com apoio governamental sob os números de subvenção MH065635 e MH074736 concedido pelo National Institutes of Health. O Governo possui determinados direitos sobre a invenção.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório US No 62/717.372, depositado em 10 de agosto de 2018, cuja descrição é incorporada aqui por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A síndrome de Angelman (AS) é um distúrbio neurológico que ocorre em um dentre cerca de 20.000 nascidos vivos. Características ou sintomas de AS incluem atraso de desenvolvimento, ausência de fala, distúrbios no andar de equilíbrio e convulsões. Convulsões epilépticas podem ser de muitos tipos e frequentemente são não responsivas a muitas medicações prescritas. AS é também associada com deficiências cognitivas. Algumas das características da síndrome de Angelman se sobrepõem com distúrbios do espectro do autismo, embora as duas condições tenham suas características singulares. Correntemente, não há nenhuma cura conhecida para AS ou autismo ou nenhuma abordagem terapêutica viável para melhorar os vários sintomas associados com estas indicações.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[004] A presente descrição provê métodos para tratamento de distúrbios de neurodesenvolvimento, tais como síndrome de Angelman (AS) e

2 / 33 autismo. O método compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento, uma composição compreendendo um agonista ligante de receptor de fator de crescimento tipo insulina 2 (IGF-2 ou IGF-II), que é específico para o receptor de IGF-2. Por exemplo, as composições podem compreender, ou consistir essencialmente em, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IGF-2 e/ou manose-6-fosfato (M6P), ou derivados da mesma. Qualquer derivado de M6P ou IGF-2 que se liga especificamente ao receptor de IGF-2 pode ser usado. Derivados de M6P incluem, mas não são limitados a derivados onde carbono 1 é funcionalizado com um grupo alcóxi (por exemplo, metóxi, etóxi e similares) ou uma alquina e carbono 6 é funcionalizado com um fosfonato, um éster etílico, um malonato de metila, um ácido fosfônico, um carboxilato, ou um malonato.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[005] Figura 1. IGF-2 reverte a maior parte dos déficits comportamentais observados em um modelo de camundongo de AS. Linhas de tempo experimentais são mostradas acima dos gráficos. Em todos os experimentos, camundongos receberam uma injeção s.c. de ou veículo ou IGF-2 (↑) 20 min antes de qualquer treinamento ou testagem. Todos os dados são expressos como a média ± s.e.m. N=8-12 por grupo. Análise de variância bidirecional (ANOVA) seguida por testes post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (A) Porcentagem de tempo gasto congelando antes (Pré-US) ou depois (Pós-US) da administração de choque durante treinamento do condicionamento de medo contextual e testando em 24 horas (h) após o treinamento (Teste) de camundongos normais (tipo selvagem, WT), que serviram de controles e camundongos Ube3a-/+ (modelo de camundongo de AS, também referido como camundongos) injetados com veículo ou IGF-2. (B) Preferência percentual de exploração para um novo objeto comparado com um objeto familiar durante um reconhecimento de novos objetos por camundongos WT e Ube3a-/+ injetados com veículo ou IGF-2, 20 min antes

3 / 33 de treinamento, testados a 4 h e 24 h após o treinamento. (C) Porcentagem de alternações corretas (% Corretas) em um labirinto em Y de camundongos WT e Ube3a-/+ injetados com veículo ou IGF-2 antes de testar (Teste). (D) Latência para cair fora de uma haste rotativa por camundongos WT e Ube3a- /+ injetados com veículo ou IGF-2, 20 min antes do teste e testados novamente 3 e 7 dias mais tarde. (E) Tempo gasto enterrando bolinhas de gude por camundongos WT e Ube3a-/+ injetados com veículo ou IGF-2, 20 min antes do teste. (F) Tempo gasto no centro de um campo aberto por camundongos WT e Ube3a-/+ em seguida a uma injeção de veículo ou IGF-2 dada 20 min antes do teste. As barras para cada conjunto da esquerda para a direita são: Veículo WT, WT IGF-2, Ube3a-/+ Veiculo e Ube3a-/+ IGF-2.

[006] Figura 2. Caracterização de marcador bioquímico de hipocampo dorsal (dHC) em camundongos AS comparados com ninhadas WT. Análises de Western Blot de extratos de proteína hipocampal completos coletados de camundongos Ube3a-/+ de 8 semanas de idade não treinados (referidos como ingênuos) e ninhadas WT. Cada valor relativo foi normalizado contra β-actina detectada no mesmo blot (usado como controle de carregamento). Todos os dados são expressos como a média ± s.e.m. e normalizados para o valor médio de camundongos WT ingênuos. N=4 por grupo. Testes t independentes. *P<0,05, **P<0,01.

[007] Figura 3. Caracterização de marcador bioquímico de córtex prefrontal mediano (mPFC) em camundongos AS comparados com ninhadas WT. Análises de Western Blot de extratos de proteínas hipocampais completos coletados a partir do mPFC de camundongos Ube3a- /+ ingênuos de 8 semanas de idade (controles não treinados) e ninhadas WT. Cada valor relativo foi normalizado contra β-actina detectada no mesmo blot, que foi usado como controle de carregamento. Todos os dados são expressos como a média ± s.e.m. e normalizados no valor médio de camundongos ingênuos WT. N=4 por grupo. Testes t independentes. *P<0,05, **P<0,01.

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[008] Figura 4. Curva de resposta a dose do efeito de IGF2R.L1 (L1) (M6P) sobre nOR em camundongos normais (tipo selvagem, WT). A linha do tempo experimental é mostrada acima dos gráficos. Dados são expressos como a média ± s.e.m. N=4 por grupo. Análise de variância unilateral (ANOVA) seguida por testes post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01. Camundongos WT foram injetados s.c. com doses diferentes de IGF2R.L1 (L1) 20 min antes do treinamento em nOR. Gráficos mostram a Preferência percentual de exploração para o novo objeto em comparação com o objeto familiar no teste realizado em 4 h e 24 h após o treinamento.

[009] Figura 5. M6P reverte déficits cognitivos e motores em camundongos AS. Linhas de tempo experimentais são mostradas acima dos gráficos. Em todos os experimentos, camundongos receberam uma injeção s.c. de ou veículo ou 850 µg/kg de M6P (IGF-2R.L1 ou L1) (↑) 20 min antes de treinamento ou da testagem. (A) Preferência percentual de exploração para um novo objeto comparado com um objeto familiar durante o paradigma de nOR de WT (Controle) e camundongos Ube3a-/+ (AS) injetados com veículo ou IGF-2R.L1 20 min antes de treinamento e testados a 4 h e 24 h após o treinamento. N=4 /grupo. Dados são expressos como a média ± s.e.m. Análise de variância bidirecional (ANOVA) seguida por testes post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (B) Porcentagem de alternações corretas (% Corretas) em um labirinto Y de camundongos WT e AS injetados com veículo ou M6P antes de testagem (Teste). Dados são expressos como a média (± s.e.m.). (C) Pontuações de aperto de membros posteriores de camundongos WT e AS injetados com veículo ou IGF-2R.L1, 20 min antes do teste. Pontuações de aperto de membros posteriores são medidas e expressas como se segue: Se os membros posteriores são consistentemente espalhados para fora, afastando-se do abdome, é atribuída uma pontuação de

0. Se um membro posterior é retraído na direção do abdome por mais de 50% do tempo suspenso, recebe uma pontuação de 1. Se ambos os membros

5 / 33 posteriores parcialmente retraídos para o abdome por mais de 50% do tempo suspenso, recebem uma pontuação de 2. Se seus membros posteriores são inteiramente retraídos e tocam o abdome por mais de 50% do tempo suspenso, recebem uma pontuação 3. Dados são expressos em pontuação. B e C: N=8-l4 por grupo. Análise de variância de duas vias (ANOVA) seguida por testes post-hoc de Tukey. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

[0010] Figura 6. PnM6P reverte déficits de memória e motores em camundongos AS. Linhas de tempo experimentais são mostradas acima dos gráficos. Em todos os experimentos camundongos receberam uma injeção s.c. de ou veículo ou 850 µg/kg de fosfonato-M6P (PnM6P) chamado IGF-2R.L2 (ou L2) (↑) 20 min antes de ou em treinamento ou testagem. (A) Preferência percentual de exploração para um novo objeto comparado com um objeto familiar durante o paradigma de nOR de camundongos WT (Controle) e Ube3a-/+ (AS) injetados com veículo ou L2 antes de treinamento e testados a 4 h, 24 h e 5 dias (5d) após o treinamento. N=4 /grupo. Dados são expressos como a % média ± s.e.m. (B). Latência para cair fora de uma haste rotativa por camundongos WT (Controle) e AS injetados com veículo ou L2, 20 min antes do teste (Teste l) e testados novamente dois dias mais tarde (Teste 2). Dados são expressos em segundos (s). (C) Pontuações de aperto de membros posteriores de camundongos WT e AS injetados com veículo ou L2 antes do teste. B e C: N=3-4 por grupo. Dados são expressos em pontuações de membros posteriores. Análise de variância bidirecional (ANOVA) seguida por testes post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0011] Esta descrição provê composições e métodos para tratamento de distúrbios neurodegenerativos, tais como síndrome de Angelman (AS) e distúrbios do espectro do autismo (ASD). As composições e métodos se referem ao ligantes de receptor de IGF-2.

[0012] O termo “tratamento” como usado aqui se refere à redução ou

6 / 33 atraso de um ou mais sintomas ou aspectos associados com a presença da condição particular sendo tratada, por exemplo, síndrome de Angelman. Tratamento não significa cura completa. Por exemplo, tratamento de AS na presente descrição significa reduzir ou inibir um ou mais sintomas associados com AS.

[0013] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como usado aqui é a quantidade suficiente par obter, em uma dose única ou em múltiplas doses, a finalidade pretendida de tratamento. Por exemplo, uma quantidade efetiva para tratar AS é uma quantidade suficiente para aliviar um ou mais sintomas de AS. Os sintomas que são aliviados com o tratamento podem incluir um ou mais de marcos de desenvolvimento, fala, habilidades intelectuais, movimento (caminhar e se equilibrar), comportamento social e epilepsia. A quantidade exata desejada ou requerida variará dependendo do modo de administração, especificidades do paciente e similares. Quantidades efetivas apropriadas podem ser determinadas por um versado comum na técnica (como um médico clínico) com o benefício da presente descrição.

[0014] Quando uma faixa de valores é dada nesta descrição, deve ser entendido que cada valor interveniente, até o decimo da unidade do limite inferior entre o limite superior e inferior dessa faixa, e qualquer outro valor interveniente nessa faixa declarada, é englobado pela invenção, salvo se claramente indicado o contrário. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores englobadas pela descrição.

[0015] Como usado nesta descrição, as formas no singular incluem as formas no plural e vice-versa, salvo se o contexto claramente indicar de outro modo.

[0016] Esta descrição descreve os efeitos de ligantes agonistas de receptor de IGF-2 sobre distúrbios de neurodesenvolvimento como síndrome de Angelman (AS). Em um aspecto, esta descrição provê um método de

7 / 33 tratamento de um distúrbio de neurodesenvolvimento tal como síndrome de Angelman ou autismo por administração a um indivíduo em necessidade de tratamento, uma composição compreendendo um ou mais ligantes agonistas de receptor de IGF-2. Nesta descrição, os termos “individual” e “indivíduo” podem ser usados de modo interpermutável. O indivíduo pode ser qualquer indivíduo animal, tal como um humano, um animal de laboratório, ou qualquer outro animal. Em uma modalidade, o agonista ligante do receptor de IGF-2 é especifico para o receptor de IGF-2 e não é um ligante para outros receptores relacionados a IGF-2 (como IGF-l ou receptores de insulina). Por exemplo, o agonista ligante (também referido aqui como agente) pode ser uma manose modificada (tal como, por exemplo, M6P), uma M6P modificada (por exemplo, um derivado de M6P), IGF-2, ou um IGF-2 modificado ou qualquer substância química ou peptídeo que se liga ao receptor de IGF-2 e ativa sua resposta celular. Derivados de fosfonato e sulfonato de M6P são conhecidos na técnica (patente dos EUA 6.140.307 para Ferguson, a descrição de tais modificações é incorporada aqui por referência). Além disso, IGF-2 com substituições de aminoácidos, como Leu 27 humana (Armitaj et al, Neuroscience, 27 de outubro de 2010; l70(3):722-30) também pode ser usado.

[0017] Modificações para M6P (também referidas aqui como derivados de M6P) incluem modificações para carbono 1 e/ou carbono 6 de manose. Exemplos de derivados incluem exemplos onde carbono 1 é funcionalizado com um grupo alcóxi (por exemplo, metóxi, etóxi e similares) ou uma alquina e carbono 6 é funcionalizado com um fosfonato, um éster etílico, um malonato de metila, um ácido fosfônico, um carboxilato, ou um malonato. Em vários exemplos, carbono 1 é funcionalizado com um alcóxi (por exemplo, um metóxi) e carbono 6 é funcionalizado com um fosfonato (referido aqui como L2), um éster etílico (referido aqui como L3), um malonato de metila (referido aqui como L4), um ácido fosfônico (referido aqui como L5), um carboxilato (por exemplo, o sal de sódio de um

8 / 33 carboxilato) (referido aqui como L6), ou um malonato (referido aqui como L7) e carbono 1 é funcionalizado com alquina e carbono 6 é funcionalizado com um ácido fosfônico (referido como L8) ou um fosfonato (referido como L9). As estruturas para M6P e seus derivados listados acima são mostradas abaixo:

,

,

,

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,

9 / 33 , , ,e .

[0018] O agonista ligante pode se ligar ao receptor de IGF-2 com uma afinidade similar àquela de IGF-2 ou M6P. Sabe-se que IGF-2 se liga a seu receptor com um Kd de cerca de 40-60 nM (Williams et al., Science, 30 de novembro de 2012, 338(6111): 1209-1213) e M6P se liga ao receptor de IGF- 2 com uma afinidade que pode ser cerca de 1 nM ou cerca de 1 mM (dependendo de a qual dos dois sítios conhecidos ele se liga) (Olson et al., J.

10 / 33 Biol., Chem. 06 de agosto de 2004; 279(32):34000-9. Epub 28 de maio de 2004).

[0019] Geralmente, uma dose terapêutica de ligante de receptor de IGF-2 para a presente descrição está na faixa de cerca de 1 a 10000 micrograma/kg de peso corporal. IGF-2 pode ser usado a partir de cerca 1 a 500 µg/kg de peso corporal e todos valores e faixas entre eles. Por exemplo, IGF-2 pode ser usado a 1 a 500 µg/kg, 1 a 100 µg/kg, 1 a 50 µg/kg, 10 a 500 µg/kg, 10 a 100 µg/kg, 10 a 50 µg/kg de peso corporal. Em uma modalidade, IGF-2 pode ser usado a 10 a 45 µg/kg administrados subcutaneamente. Em modalidades específicas, IGF-2 pode ser usado a 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 e 500 µg/kg de peso corporal.

[0020] M6P e derivados de M6P podem ser usados de cerca de 1 a

2.000 µg/kg de peso corporal e todos valores e faixas entre os mesmos. Por exemplo, M6P pode ser usada de 1 a 2000 µg/kg, 1 a 1500 µg/kg, 1 a 1000 µg/kg, 1 a 500 µg/kg, 1 a 100 µg/kg, 10 a 2000 µg/kg, 10 a 1500 µg/kg, 10 a 1000 µg/kg, 10 a 500 µg/kg e 10 a 100 µg/kg, 50 a 2000 µg/kg, 50 a 1500 µg/kg, 50 a 1000 µg/kg, 50 a 500 µg/kg e 50 a 100 µg/kg peso corporal e todos valores entre as faixas acima mencionadas. Em uma modalidade, M6P ou derivados podem ser usados a 850 µg/kg administrados subcutaneamente. Em uma modalidade, M6P ou derivados podem ser usados a 100 a 1,000 µg/kg. Em modalidades específicas, M6P pode ser usada a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750 e 2000 µg/kg peso corporal. Além disso, com base nos dados aqui sobre animais, um versado na técnica pode obter dosagem humana relevante para M6P e IGF-2. Um guia para tais conversões é conhecido na técnica (Ver, por exemplo, Nair et al., J. Basic Clin. Pharma., v 7(2), Março 2016-Maio 2016; 27-31, incorporado aqui por referência).

[0021] M6P pode estar presente na forma do ácido fosfórico livre ou

11 / 33 um mono- ou di-sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como, por exemplo sal de sódio, cálcio, magnésio ou bário. Ele pode também ser fornecido como um composto contendo M6P a partir do qual ele pode ser liberado in vivo, ou pode ser fornecido como um precursor a partir do qual ele pode ser produzido in vivo. Derivados de M6P podem também estar presentes (onde aplicável (por exemplo, L3, L7 e L8)) como ácidos livres ou como sais dos mesmos (por exemplo, sais de monossódio ou dissódio dos mesmos).

[0022] Em um aspecto, esta descrição provê um método para tratamento de distúrbios de neurodesenvolvimento distinguidos por atrasos de desenvolvimento na fala e em movimento, deficiência intelectual, convulsões em crianças muito pequenas e comportamentos incomuns e/ou comportamentos repetitivos, como agitar as mãos. Exemplos de tais distúrbios de neurodesenvolvimento incluem síndrome de Angelman e distúrbios do espectro do autismo.

[0023] Síndrome de Angelman é um distúrbio neurogenético distinguido por atraso intelectual e de desenvolvimento. AS é causada por mutação da E3 ubiquitina ligase ETbe3A. Os sintomas da síndrome de Angelman podem incluir: atrasos de desenvolvimento, como uma falta de engatinhar ou balbuciar aos 6 a 12 meses, desenvolvimento mental atenuado, nenhuma ou mínima fala, ataxia (incapacidade de se mover, andar ou se equilibrar apropriadamente), movimentos rígidos ou espasmódicos (por exemplo, agitação das mãos), hiperatividade, tremor nos braços e pernas, sorrisos e risos frequentes, acessos de risos inapropriados, dentes muito espaçados, uma personalidade feliz e excitável, epilepsia, uma anormalidade eletroencefalográfica com ondas e picos lentos e com entalhes, convulsões que geralmente começam aos 2 a 3 anos de idade e podem ser acompanhadas por mioclonia e ausência atípica, convulsões parciais com desvio do olho e vômitos, uma cabeça pequena que é visivelmente achatada no dorso (microbraquioefalia), olhos cruzados (estrabismo), estocadas da língua e

12 / 33 distúrbios de sucção/deglutição, língua protuberante, comportamentos excessivos de mastigação/boca, reflexos tendinosos profundos hiperativos das extremidades inferiores, marcha ampla com tornozelos pronados ou posicionados em valgo, sensibilidade aumentada ao calor, caminhada com os braços no ar, fascinação por água ou itens enrugados, como alguns papéis ou plásticos, obesidade em crianças mais velhas, constipação, mandíbula saliente, pigmentação clara do cabelo, pele e olhos (hipopigmentação), salivação frequente, prognacia, problemas de alimentação e/ou hipotonia troncular durante a infância e/ou escoliose. Os sintomas geralmente não são evidentes no nascimento e são frequentemente primeiro notados como atrasos de desenvolvimento, tais como como uma falha de engatinhar ou balbuciar entre as idades de 6 a 12 meses, assim como crescimento lento da cabeça antes da idade de 12 meses. Indivíduos com síndrome de Angelman também podem sofrer de distúrbios do sono incluindo dificuldade de iniciar e manter latência de sono prolongada, vigília prolongada após o início do sono, alto número de despertares noturnos e redução do tempo total de sono, enurese, bruxismo, terrores noturnos, sonambulismo, hipercinesia noturna e ronco, alto número de despertares noturnos e redução do tempo total de sono, enurese, bruxismo, terrores noturnos, sonambulismo, hipercinesia noturna e roncos.

[0024] A severidade de sintomas para AS pode ser medida clinicamente (Williams et al, American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8, incorporado aqui por referência) e a quantificação da severidade de diferentes sintomas pode também ser realizada (Lossie et al, Journal of Medical Genetics 2001, 38; 834-845, incorporado aqui por referência; Ohtsuka et al, Brain and Development 2005, 27; 95-100, incorporado aqui por referência). Isto pode incluir a extensão de capacidade de linguagem, grau de mobilidade independente, frequência e severidade de convulsões, capacidade de compreender linguagem, aquisição de habilidades motoras, parâmetros de crescimento. Um procedimento de triagem para pacientes suspeitos de terem

13 / 33 síndrome de Angelman que quantifica a severidade de 22 critérios distintos (Lossie et al., Journal of Medical Genetics 2001, 38) pode ser usado. Outras medições de severidade de AS incluem métodos psicométricos para distinguir o grau de atraso no desenvolvimento com relação à obtenção de desenvolvimento psicomotor, habilidades visuais, interações sociais baseadas em eventos não verbais, capacidades de linguagem expressivas, capacidades de linguagem receptivas e deficiência na fala. O grau de distúrbios de marcha e movimento assim como a capacidade de atenção e a extensão de anormalidades EEG podem ser medidos (Williams et al., American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8). Todos os testes de capacidade intelectual na idade apropriada também podem ser usados, como o Teste 2 de Inteligência Breve de Kaufman (KBIT-2; Kaufman & Kaufman, Circle Pines, MN: American Guidance Services; 2004, incorporado aqui por referência). Uma ou mais das características acima podem ser usadas para avaliar a efetividade de tratamento com as presentes composições.

[0025] Em uma modalidade, protocolos de avaliação para avaliar o efeito do tratamento incluem exame neurológico e neurovisual e a avalição de aspectos motores (por exemplo Escala de Medida de Função Motora Grosseira), cognitivos (por exemplo Escala de Desenvolvimento Mental de Griffiths e Escala Uzgiris-Hunt e testes de memória de trabalho espacial); adaptativos (por exemplo Escala Comportamental Adaptativa de Vineland); de comunicação (por exemplo Inventário de Desenvolvimento Comunicativo de MacArthur-Bates e expressão verbal de criança em vídeo-gravação), aspectos comportamentais (por exemplo Escala IPDDAG) e aspectos neurovisuais, como descrito em Micheletti et al., (Ital J Pediatr. 2016; 42(1): 91), incorporado aqui por referência.

[0026] Distúrbios do espectro do autismo (ASD) são distinguidos por incapacidade de desenvolvimento complexa que interfere com o desenvolvimento normal do cérebro, impactando particularmente a interação

14 / 33 social e as habilidades de comunicação. Eles aparecem tipicamente durante os primeiros três anos de vida. Indivíduos autistas têm dificuldades na comunicação verbal e não verbal, interações sociais e atividades de lazer ou lúdicas. A deficiência na interação social varia desde a dificuldade de iniciar e manter interação, capacidade prejudicada de reconhecer e experimentar emoções e dificuldade de processar e apreciar os sentimentos dos outros. Os déficits de comunicação variam entre indivíduos autistas, com alguns indivíduos autistas tendo forma de comunicação severamente limitada com indivíduos tendo habilidades de linguagem significativas. Comportamentos repetitivos e estereotipados incluem rituais complexos, dificuldade em se adaptar a mudanças e movimentos não comuns, como agitar as mãos. Alguns comportamentos característicos que podem ser úteis para diagnosticar autismo incluem falta de ou atraso na linguagem falada, uso repetitivo de linguagem ou maneirismos motores (agitar as mãos ou girar objetos), pouco ou nenhum contato com o olho, fixação persistente sobre certos objetos e falta de interesse em socializar.

[0027] A administração de IGF-2, modificações de IGF-2 (por exemplo, análogos de IGF-2), M6P ou derivados da mesma pode ser iniciada assim que o diagnóstico é feito. A frequência e a duração do tratamento podem ser determinadas monitorando um ou mais sintomas de AS ou ASD. O tratamento pode ser continuado tanto quanto necessário, incluindo dias, meses ou anos. O tratamento pode ser continuado mesmo depois dos sintomas terem diminuído ou não serem mais mensuráveis.

[0028] Os agentes da presente descrição podem ser providos em composições farmacêuticas para administração por combinação dos mesmos com quaisquer carreadores, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis apropriados. Exemplos de carreadores, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis apropriados podem ser encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005)

15 / 33 21ª. ed., Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. Por exemplo, M6P pode ser usada como uma suspensão ou solução. Carreadores apropriados incluem excipientes ou estabilizantes que são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como acetato, Tris, fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes, como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m- cresol; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como como EDTA; tonificadores como trealose e cloreto de sódio; açucares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensoativos, como polissorbato; contra-íons formadores de sal, como sódio; e/ou tensoativos aniônicos, como Tween ou polietileno glicol (PEG). As composições farmacêuticas podem conter de 0,01 a 99% em peso por volume ou peso por peso do material ativo (por exemplo, M6P ou derivado da mesma ou IGF-2 ou modificação do mesmo (por exemplo, análogos de IGF-2)).

[0029] Administração das presentes composições, pode ser realizada usando qualquer via apropriada de administração conhecida na técnica. Por exemplo, as composições podem ser administradas através de vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, oral, tópica ou por inalação. As composições podem ser administradas parenteralmente ou entericamente. Em uma modalidade, as composições da presente descrição podem ser administradas oralmente, tal como, por exemplo, na forma de um comprimido, cápsula, pílula, pó, pasta, grânulos, elixir, solução, suspensão, dispersão, gel, xarope ou qualquer outra forma ingerível. M6P e/ou derivados da mesma e/ou IGF-2

16 / 33 e/ou modificações dos mesmos (por exemplo, análogos de IGF-2) podem ser entregues via lipossomas, micropartículas, microcápsulas. As composições podem ser introduzidas como uma única administração ou como múltiplas administrações ou podem ser introduzidas em um modo contínuo durante um período de tempo. Por exemplo, a(s) administração(ões) pode(m) ser em um número pré-especificado de administrações ou administrações diárias, semanais ou mensais, que podem ser contínuas ou intermitentes, conforme podem ser clinicamente necessárias e/ou terapeuticamente indicadas.

[0030] Em uma modalidade, o ligante de receptor de IGF-2 é o único componente ativo. Por componente ativo entende-se que ele é o único componente na composição que especificamente se liga ao receptor de IGF-2. O ligante de receptor de IGF-2 pode ser IGF-2, modificações do mesmo (por exemplo, análogos de IGF-2), ou M6P ou outros derivados de M6P. Em uma modalidade, a M6P ou derivado da mesma é o único componente ativo. Em uma modalidade, M6P ou derivado da mesma não é ligada (por exemplo, não é covalentemente ligada diretamente ou via ligante) a qualquer outra porção e não atua como um carreador para qualquer outra porção ou agente. Em uma modalidade, o derivado de M6P pode ser L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 ou L9.

[0031] Em um aspecto, esta descrição provê derivados de M6P e composições compreendendo derivados de manose. Derivados de M6P podem ser obtidos realizando química em carbono 1 e/ou carbono 6 de M6P. Vários métodos de realizar química em carbono 1 e/ou carbono 6 de hexoses são conhecidos na técnica. Exemplos de derivados de M6P incluem, mas não são limitados a, fosfonato (L2), éster etílico (L3), malonato de metila (L4), ácido fosfônico (L5), carboxilato (L6), malonato (L7), alquina (L8) e profármaco de alquina (L9). Em uma modalidade, esta descrição provê um composto selecionado dentre o grupo consistindo em L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 e L9. Em uma modalidade, esta descrição provê uma composição compreendendo um ou mais de L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 e L9.

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[0032] Os exemplos seguintes são dados como exemplos ilustrativos e não se destinam de forma alguma a serem limitativos. EXEMPLO 1

[0033] Modelo de camundongo usado: Os camundongos foram obtidos pela criação de camundongos machos mutantes (B6. l29S7- Ube3atmlAlb/J) carregando uma mutação de nocaute de Ube3A (ubiquitina proteína ligase E3A) paternalmente impressa (requisitada de Jackson labs www.jax.org; stock # 016590), com camundongos fêmeas normais C57BL/6J. Camundongos heterozigotos fêmeas foram criados com camundongos machos C57BL/6J; a progênie deste cruzamento sendo machos heterozigotos (transmissão maternal), fêmeas heterozigotas (transmissão maternal), machos tipo selvagem e fêmeas tipo selvagem. Estas progênies foram usadas para estudos comportamentais e bioquímicos. Estes camundongos são referidos aqui como camundongos e suas ninhadas normais como camundongos tipo selvagem (WT) ou camundongos de controle.

[0034] Tratamento: injeção subcutânea (s.c.) de IGF-2, ou solução de veículo de controle, 20 minutos antes de iniciar os procedimentos comportamentais. Resultados:

[0035] IGF-2 reverte respostas de memória e motoras enfraquecidas, assim como comportamentos repetitivos em um camundongo AS.

[0036] Como medidas de respostas de aprendizagem/cognitivas, que são conhecidas como sendo alteradas na síndrome de Angelman (AS), as requerentes testaram diferentes tipos de memórias aversivas e não aversivas. As requerentes verificaram que camundongos AS exibem um déficit robusto em formas tanto aversivas (condicionamento de medo contextual; CFC), quanto não aversivas (reconhecimento de objetos novos; nOR) de memória a longo prazo. Especificamente, no paradigma CFC, camundongos foram

18 / 33 treinados para associar uma câmara (contexto) com um choque aversivo no pé. IGF-2 ou solução de veículo eram injetados 20 minutos antes de treinamento. As requerentes testaram retenção de memória um dia mais tarde (um tempo que é usado para medir memória a longo prazo) colocando camundongos de volta na mesma câmara e medindo seu comportamento relacionado ao medo (paralisação). As requerentes verificaram que enquanto camundongos da ninhada WT (controles) injetados com solução de controle (veículo) tinham uma memória forte, evidenciada por uma robusta resposta de paralisação, os camundongos AS injetados com veículo mostraram comportamento de paralisação significativamente menor, indicando um déficit de retenção de memória a curto prazo (Figura 1A). Em contraste, camundongos AS tratados com IGF-2 mostraram paralisação similar e, portanto, retenção de memória similar como camundongos de controle, indicando que IGF-2 reverteu completamente o enfraquecimento da memória de camundongos AS.

[0037] As requerentes verificaram resultados similares com a memória não aversiva, teste de nOR. Esta tarefa é um teste validado para memória de reconhecimento e é baseada na tendência espontânea de roedores a gastar mais tempo explorando um novo objeto do que um familiar. Camundongos foram expostos a dois objetos idênticos em uma nova arena e o tempo gasto explorando cada objeto foi medido. Subsequentemente, 4 h e 24 h depois da primeira experiência, camundongos retornaram à mesma arena, mas desta vez um dos objetos foi substituído por um novo objeto e o tempo gasto explorando ambos objetos foi medido. Quando testados 4 h após o treinamento, como esperado, camundongos de controle gastaram uma porcentagem de tempo significativamente maior explorando o novo objeto, indicativo de memória para o primeiro objeto. Em contraste, camundongos AS não exibiram tal preferência e gastaram um tempo igual explorando ambos os objetos, revelando enfraquecimento da memória (Figura 1B). A

19 / 33 injeção de IGF-2 reverteu completamente os déficits de memória de camundongos AS, como mostrado pela sua preferência significante para o novo objeto. Além disso, embora ambos os camundongos tanto de controle quanto AS mostraram um declínio significativo de retenção de memória quando testados 24 h após treinamento, ambos os grupos de camundongos tratados com IGF-2 tinham uma preferência significativa para um novo objeto, indicando que a capacidade de IGF-2 de reverter o déficit de memória a longo prazo observada em AS é persistente.

[0038] Para avaliar estratégias exploratórias e memória de trabalho, as requerentes empregaram um paradigma de alternação espontâneo usando um labirinto Y com três braços. As requerentes verificaram que camundongos de controle (WT) injetados com veículo alternavam sua exploração entre os três braços enquanto que camundongos AS injetados com veículo alternaram mais entre os braços recentemente visitados antes de explorar um braço não visitado, de um modo repetitivo (Figura 1C). Em contraste, camundongos AS tratados com IGF-2, 20 min antes da exposição ao labirinto Y, tinham uma estratégia exploratória similar como os camundongos de controle, indicando que IGF-2 reverte o comportamento repetitivo e inflexível visto nestes camundongos.

[0039] AS é também associada com deficiências motoras robustas, que novamente são reproduzidos nos camundongos AS. A capacidade e a coordenação motoras são avaliadas de modo confiável em camundongos colocando os mesmos sobre uma haste rotativa acelerada (teste RotaRod). Neste teste, as requerentes observaram um déficit robusto na capacidade motora em camundongos tratados com veículo AS, em comparação com camundongos de controle WT (Figura 1D). No entanto, AS tratados com IGF- 2 mostraram uma significante melhora na capacidade motora no RotaRod e, de fato, suas latências cadentes retornaram aos níveis similares àqueles de camundongos de controle normais.

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[0040] As requerentes também observaram uma diferença significativa no comportamento exibido por camundongos AS em comparação com ninhadas de controle WT no teste de enterrar bolinhas de gude. Quando colocados em uma gaiola doméstica vazia com forro e bolinhas de gude, os camundongos normais tipicamente se engajam em uma quantidade modesta de comportamento de enterrar. Em comparação com estes camundongos de controle, camundongos AS mostraram níveis extremamente baixos de enterrar, exibindo uma redução significante tanto no tempo gasto enterrando (Figura 1E) quanto na quantidade de bolinhas de gude enterradas. No entanto, o tratamento com IGF-2 resgatou os déficits dos camundongos AS, que então mostraram níveis similares de enterrar como os camundongos normais.

[0041] Para medir o efeito de IGF-2 sobre comportamento similar a ansiedade, as requerentes empregaram campo aberto e mediram a entrada no centro (que mede comportamento de ansiedade): Nenhum efeito de tratamento com IGF-2 foi encontrado em camundongos AS, que permaneceram alterados em comparação com o comportamento de camundongos normais (Figura 1F).

[0042] Caracterização bioquímica de hipocampo e córtex prefrontal mediano em condições basais mostra anormalidades do trajeto de IGF-2, marcadores de plasticidade e metabolismo. As requerentes realizaram análise Western Blot para comparar os níveis de proteína em duas regiões do cérebro importantes para aprendizagem e memória e funções executivas, o hipocampo dorsal (dHC) e o córtex prefrontal mediano (mPFC) de camundongos AS adultos e ninhadas WT sob condições basais (permanecido na gaiola doméstica). As requerentes encontraram evidência de alterações significantes nas classes de marcadores críticos para metabolismo de glicose, plasticidade, função neuronal inibitória e vias de IGF-2 no hipocampo dorsal (dHC) e córtex prefrontal mediano (mPFC).

21 / 33 Especificamente, as requerentes avaliaram proteína completa e extratos sinaptoneurossomais (fração sináptica) em AS e ninhadas WT para comparar os níveis de expressão de: i) IGF-2 e IGF-2R, ii) mTOR e fosfo-mTOR, ULK-l e fosfo-ULK-l; iii) plasticidade neuronal excitatória (Arc/Arg3. l, GluAl, GluA2), iv) marcadores neuronais inibitórios (GAD67) e v) metabolismo de glicose/energia (LDHB, MCT1, MCT4, MCT2, GLUT1, GLUT3, pAMPK).

[0043] As análises realizadas assim indicam de longe que, em comparação com ninhadas WT, camundongos AS têm alterações em IGF- 2/IGF-2R, plasticidade e mecanismos de metabolismo de glicose em ambas as regiões do cérebro. Especificamente, como mostrado nas Figuras 2 (dHC) e 3 (mPFC), camundongos AS têm um decréscimo significante em GAD67 no dHC, sugerindo alterações em neurônios inibitórios. AS dHC também tem um decréscimo significante na enzima metabólica lactato desidrogenase B (LDHB) e um aumento significante em GLUT3, assim como uma forte tendência de GLUT1 total, endotelial e astrocítica aumentada, sugerindo que o metabolismo da glicose em camundongos AS é significativamente alterado. A subunidade de receptor AMPA, GluA2 mostrou uma robusta tendência de redução, mas ela não atingiu níveis significantes. Aumentar o número de amostras provavelmente revelará um déficit significante. Os níveis de IGF-2, receptor de IGF-2, subunidade de receptor AMPA GluAl, plasticidade relacionada a gene Arc/Arg3.l, proteína PSD95 sinapticamente enriquecida, pULK e os transportadores de monocarboxilato MCT1, MCT4 e MCT2 ficaram inalterados sob condições basais no dHC de camundongos AS.

[0044] No mPFC (Figura 3) há mais alterações significantes na via de IGF-2, com um aumento significante da forma madura de IGF-2 e um decréscimo significante de pro-IGF-2 no extrato de proteína total, enquanto que frações sinaptoneurossomais mostram um decréscimo drástico de uma forma madura de IGF-2 e uma forte tendência para redução de pro-IGF-2

22 / 33 (forma imatura) nos camundongos AS em comparação com camundongos normais. Os níveis de receptor de IGF-2 não são afetados no mPFC de camundongos AS. As frações sinaptoneurossomais também revelavam um decréscimo significante do gene relacionado a plasticidade imediata prematura, Arc/Arg 3.1 e há são também significantes decréscimos em GluA2, mas não em GluAl. Similarmente ao dHC, um nível diminuído significante de LDHB e uma forte tendência para um decréscimo em GLUT3 foram encontrados no mPFC de camundongos AS. Os níveis do marcador neuronal inibitório GAD67 foram parcialmente reduzidos no mPFC, mas ainda não estavam atingindo valores estatisticamente significantes. Ademais, com transportadores de monocarboxilato pAMPK, PSD95, pULK, os níveis de MCT1, MCT4 e MCT2 permaneceram inalterados no mPFC de camundongos AS. EXEMPLO 2

[0045] Este exemplo demonstra que administração sistêmica de manose-6-fosfato (M6P) reverte déficit de memória no modelo de camundongo de síndrome de Angelman. As requerentes primeiramente testaram diferentes concentrações de M6P para efeito sobre melhora da memória em camundongos normais. Resultados são mostrados na Figura 4. IGF2R.L1 é M6P.

[0046] Adicionalmente, as requerentes verificaram que M6P administrada sistemicamente em camundongos modelando a síndrome de Angelman (camundongos Ube3a-/+, camundongos AS) reverte seus enfraquecimentos de memória (Figura 5).

[0047] Especificamente, as requerentes usaram o novo paradigma de reconhecimento de objetos (nOR) em camundongos para avaliar memória episódica não aversiva. Nesta tarefa, a preferência inata pela novidade do roedor é usada. Durante treinamento, o camundongo é deixado explorar 2 objetos idênticos. No dia do teste, um dos objetos de treinamento é substituído

23 / 33 por um novo objeto. Como camundongos têm uma preferência inata pela novidade, se o camundongo reconhece o objeto familiar, ele passará mais tempo com o novo objeto.

[0048] Uma injeção s.c. de M6P reverteu enfraquecimento da memória de camundongos AS. Como mostrado na Figura 5A, o teste em 4 h depois do treinamento de nOR revelou que, enquanto camundongos de controle (ninhadas tipo selvagem WT) injetados com solução de controle (veículo) tinham uma memória forte, os camundongos AS injetados com veículo mostraram significante enfraquecimentos da memória, confirmando seus déficits de memória estabelecidos. Injeção de M6P antes do treinamento reverteu déficits de memória em camundongos AS, que, de fato, tinham níveis de retenção de memória similares aos de camundongos WT de controle. Quando testados em 24 horas após treinamento, os camundongos tanto WT quanto AS mostraram significante retenção de memória, enquanto camundongos WT e AS injetados com veículo esqueceram (Figura 5 A).

[0049] Como indicado acima, camundongos AS mostram déficits em estratégias exploratórias/memória de trabalho, medidas com um paradigma de alternação espontânea em um labirinto Y com três braços. A injeção de IGF- 2R.L1 (M6P), em comparação com injeção de veículo, reverteu completamente o déficit (Figura 5B).

[0050] AS é também associada com deficiências motoras, que são reproduzidas nos camundongos AS. Um teste usado para avaliar problemas motores é aperto do membro posterior, que é observado em modelos de camundongos em que os sistemas motores são deficientes incluindo em doenças neurodegenerativas do sistema motor. Este teste descreve o aperto da pata e uma postura tipo morcego em camundongos com déficits motores quando suspensos pela cauda em vez de uma resposta de flexão. Como mostrado na Figura 5C, camundongos AS injetados com veículo mostraram uma significante resposta de aperto de membro posterior em comparação com

24 / 33 camundongos WT de controle. A injeção de IGF-2R.L1 em camundongos AS reduziu significativamente o aperto do membro posterior e, assim, reverteu seu déficit. EXEMPLO 3

[0051] As requerentes testaram uma M6P modificada: uma fosfonato- M6P (PnM6P) chamada IGF-2R.L2 (ou L2). Como mostrado na Figura 6, L2, injetado a 850 µg/kg, significativamente reverteu o déficit de camundongos AS em nOR e melhorou significativamente a retenção de memória no nOR em camundongos WT em 4 horas após o treinamento (Figura 6A). Em 24 horas após o treinamento, camundongos tanto WT quanto AS injetados com L2 mostraram significante memória em comparação com grupos injetados com veículo. Quando re-testados em 5 horas após o treinamento (teste 5d) nenhum dos grupos (injetados com veículo ou L2) mostraram memória significante, embora os controles WT exibissem uma forte tendência para melhora da memória, que pode se tornar significante quando um número maior de indivíduos por grupo será incluído.

[0052] L2 também reverteu déficits motores de camundongos AS como revelado por teste RotaRod (descrito em 0034). Embora camundongos AS injetados com veículo mostrassem um significante déficit na capacidade motora em comparação com camundongos WT de controle (Figura 6B), camundongos AS injetados com L2 melhoraram significativamente sua capacidade motora no RotaRod e, de fato, suas latências cadentes retornaram a níveis similares àqueles de camundongos de controle WT (Figura 6B).

[0053] Injeção de L2 reverteu déficits motores como medidos por aperto dos membros posteriores. Embora camundongos AS injetados com veículo mostrassem uma pontuação significativamente alta de comportamento de aperto dos membros posteriores, em comparação com camundongos de controle injetados com veículo, camundongos AS injetados com L2 retornaram seu comportamento de aperto dos membros posteriores aos níveis

25 / 33 de controle (Figura 6C). EXEMPLO 4

[0054] Este exemplo descreve a síntese e a caracterização de derivados de M6P. Procedimentos Sintéticos Gerais

[0055] Todas as reações foram realizadas em artigos de vidro secos por chama ou secos em estufa sob uma pressão positiva de nitrogênio ou argônio com agitação magnética, salvo se descrito de outro modo. Diclorometano anidro (CH2Cl2), éter dietílico (Et2O), 1,4-dioxano, tetra- hidrofurano (THF), tolueno (PhMe) e N,N-dimetillformamida (DMF) foram obtidos passando o solvente através de colunas de alumina ativada em artigos de vidro secos por chama. Outros solventes e reagentes foram usados como obtidos a partir de vendedores comerciais (Acros Organics, AK Scientific, Alfa Aesar, Chem-Impex International, Combi-Blocks, Sigma-Aldrich, Strem Chemicals, Synthonix, Tokyo Chemical Industry Co.) salvo se descrito de outro modo. Cromatografia de camada fina (TLC) foi realizada para monitoramento de reação usando placas de vidro de sílica gel 60 pré- revestidas com indicador fluorescente F254 (Millipore Sigma) e visualizadas por bloqueio de luz ultravioleta (λ=254 nm) ou por manchamento com solução aquosa de permanganato de potássio (KMnO4), solução aquosa de molibdato de amônio cérico ácido (IV) (CAM), solução de p-anisaldeido etanólico ácido ou solução de ninidrina butanólica, seguido por aquecimento suave com uma pistola térmica. Cromatografia de coluna de vaporização instantânea foi realizada a temperatura ambiente sob pressão de nitrogênio com sílica gel (60 Å, 40-63 μm, Silicycle ou Merck) usando colunas de vidro ou um Teledyne Isco MPLC CombiFlash® Rf+. Espectros de ressonância magnética nuclear protônica (1HRMN) foram registrados sobre um espectrômetro Bruker Avance III HD 400 MHz equipado com CryoProbe™ a 25°C, foram reportados em partes por milhão (ppm, espectrômetro δ) campo

26 / 33 abaixo a partir de tetrametilsilano (TMS, δ = 0 ppm), e são referenciados internamente com outras ressonâncias de prótio residual do solvente de RMN (CDCl3: 7,26 CHCl3], CD3OD: 4,87 MeOH], D2O:3,31 H2O], C6D6:7,16 C6H6], (CD3)2SO:2,50 (CH3)2SO]). Espectros de ressonância magnética nuclear de carbono13 desacoplados em próton (13C{1H} RMN) foram registrados sobre um espectrômetro Bruker Avance III HD 400 MHz equipado com CryoProbe™ a 25°C, são reportados em partes por milhão (ppm, escala δ) campo abaixo a partir de tetrametilsilano (TMS, δ = 0 ppm), e são referenciados internamente à linha central de ressonâncias de carbono 13 do solvente de RMN (CDCl3: 77,36 CHCl3], CD3OD: 49,00 MeOH], (CD3)2SO: 39,52 (CH3)2SO]). Espectros de ressonância magnética nuclear de fósforo-31 desacoplados em prótons (31P{1H} RMN) foram registrados sobre um espectrômetro Bruker Avance III HD 400 MHz equipado com CryoProbe™ a 25°C, são reportados em partes por milhão (ppm, escala δ) campo abaixo a partir de ácido fosfórico (H3PO4, δ = 0), e são referenciados externamente a uma solução padrão de fosfato de trifenila (0,0485 M em CDCl3, δ = -17,7 ppm). Os dados reportados são representados como: deslocamento químico em partes por milhão (ppm, escala δ) (integração, multiplicidade, constantes de acoplamento J em Hz, atribuição de átomo). Multiplicidades são abreviadas como: s, singleto; d, dupleto; t, tripleto; q, quarteto; quinto, quinteto; sexto, sexteto; sete, hepteto; br, amplo; m, multipleto; ou combinações dos mesmos.

Espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) foi conduzida usando um espectrômetro de massa de cromatografia líquida de tempo de voo (TOF) de massa precisa Agilent 6224 (LC/MS) em combinação com métodos de ou ionização química a pressão atmosférica (APCI) ou ionização de eletropulverização (ESI). Espectros de infravermelho de transformada de Fourier (FT-IR) foram registrados sobre um espectrômetro Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR referenciado a um padrão de poliestireno.

Os sinais são reportados como frequência de absorção

27 / 33 em números de onda (cm-1) com descritores abreviados como: w, fraco; m, médio; s, forte, br, amplo. Purificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi realizada sobre um Agilent 1260 Infinity II LC com uma coluna semipreparativa de fase reversa (RP) Phenomenex (00D-4439-E0 Gemini, C18 fase, 3 μm de tamanho de partícula, 110 Å de tamanho de poro) com uma vazão de 8 mL/min e misturas solventes de 0,1% de ácido fórmico (FA) em (A) acetonitrila (grau HPLC) e (B) água (grau HPLC). Medições de rotação óptica foram registradas sobre um polarímetro Jasco P-2000 com um modulador celular Flint Glass Faraday, fonte luminosa de lâmpada de sódio, e detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Rotações específicas foram calculadas com base na equação α] = (100∙α)/(l∙c) onde a concentração c é em g/100 mL e o comprimento do trajeto l é em decímetros. Rotações específicas calculadas são reportadas em valores sem unidades e são representadas como: α]DT rotação específica (c concentração, solvente), onde a temperatura T é em °C e D representa o comprimento de onda do monitor de linha D de sódio (589 nm). Síntese e Caracterização do Composto Síntese de L2 6-O-Trifenilmetil-α-D-manopiranosideo de metila (2)

[0056] Éter de tritila 2 foi preparado seguindo procedimentos modificados publicados (Traboni et al., ChemistrySelect 2017, 2, 4906-4911; Tennant-Eyles et al., J. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 231-243). A uma mistura de metil-α-D-manopiranosideo (5,02 g, 25,8 mmol, 1,0 equiv) e cloreto de tritila (7,91 g, 28,4 mmol, 1,1 equiv) foi adicionada piridina (5,2 mL, 64,6 mmol, 2,5 equiv). A mistura de reação foi aquecida a 100°C e agitada por 30 min. Depois de 30 min, a pasta viscosa resultante foi dissolvida em CH2Cl2 por ultrassonicação a 40°C. A solução foi lavada com cloreto de

28 / 33 amônio saturado aquoso (2×), secada sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna de vaporização instantânea (50% a 100% acetato de etila/hexanos) para dar 2 (11,0 g, 25,2 mmol, 98%) como uma espuma branca. Espectros RMN correspondem aos reportados na literatura (Traboni et al., ChemistrySelect 2017, 2, 4906-4911; Tennant-Eyles et al., J. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 231-243), 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,48 – 7,28 (15H, m), 4,72 (1H, d, J = 1,6 Hz), 3,92 (1H, m), 3,82 - 3,63 (3H, m), 3,50 - 13 3,39 (2H, m), 3,38 (3H, s), 2,73 (1H, m), 2,54 (1H, m), 2,27 (1H, m), C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 143,9, 128,9, 128,3, 127,5, 100,9, 87,7, 72,0, 70,64, 70,59, 70,1, 65,2, 55,3. 2,3,4-Tri-O-benzil-α-D-manopiranosideo de metila (4) ´

[0057] Éter benzílico 3 foi preparado de acordo com um procedimento modificado publicado (Hofmann et al., Carbohydr. Res. 2015, 412, 34-42). Éter de tritila 2 (2,01 g, 4,61 mmol) foi dissolvido em DMF anidra (115 mL) e a esta solução foi adicionada porção a porção uma suspensão de NaH (60% em óleo mineral, 14,8 g, 371 mmol, 7,2 equiv) a 0°C. A mistura de reação foi agitada por 10 min a 0°C e a esta mistura foi lentamente adicionado cloreto de benzila (39,1 g, 309 mmol, 6,0 equiv) e a suspensão foi agitada por 5 min a 0°C, então aquecida a temperatura ambiente e agitada por 16 h. A mistura de reação foi resfriada bruscamente com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão reduzida para dar 3 como um óleo viscoso amarelo, que foi usado diretamente no procedimento seguinte.

[0058] Álcool 4 foi preparado de acordo com um procedimento modificado publicado (Jaramillo et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 3135-3141). Éter benzílico 3 foi dissolvido em MeOH-CH2Cl2 (2:1, 6 mL) e p-TsOH foi

29 / 33 adicionado até pH < 4. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 20 h, então neutralizada com Et3N e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em CH2Cl2 e lavado com água destilada e salmoura. A camada orgânica foi secada sobre sulfato de sódio anidro e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna de vaporização instantânea (30% a 60% acetato de etila/hexanos) para dar álcool 4 (0,90 g, 1,94 mmol, 42%) como um xarope amarelo claro. Espectros de RMN correspondem aos reportados na literatura (Norberg et al., Carbohydr. Res. 2017, 452, 35-42). 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) δ 7,41 - 7,30 (15H, m), 4,97 (1H, d, J = 10,9 Hz), 4,81 (1H, d, J = 12,3 Hz), 4,75 - 4,65 (5H, m), 3,99 (1H, app, t, J = 9,4 Hz), 3,92 (1H, dd, J = 9,4, 2,9 Hz), 3,90 - 3,84 (1H, m), 3,83 - 3,76 (2H, m), 3,68 - 3,62 (1H, m), 3,33 (3H, s), 2,00 (1H, app, t, J = 6,4 Hz), 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 138,8, 138,7, 138,6, 128,70, 128,68, 128,67, 128,3, 128,1, 128,0, 127,9, 99,6, 80,5, 75,5, 75,2, 75,0, 73,2, 72,5, 72,4, 62,7, 55,1, HRMS (APCI/LC-TOF) m/z: M + NH4]+ Calculado para C28H32O6 482,2537; Encontrado 482,2533. 2,3,4-Tri-O-benzil-6-deoxi-6-dietoxifosfinilmetileno-α-D-manopiranosideo de metila (7)

[0059] Aldeído 5 foi preparado de acordo com um procedimento geral para oxidação de álcoois primários (Tojo et al., Oxidation of alcohols to aldehydes and ketones: a guide to current common practice. Springer Science & Business Media: 2006). Uma solução de 4 (0,334 g, 0,72 mmol, 0,4 M) foi preparada em DMSO anidra (1,8 mL) sob nitrogênio. A esta solução foi adicionado Et3N (1,0 mL, 7,2 mmol, 10 equiv) e a mistura de reação foi resfriada a 0°C em um banho de água com gelo e agitada. A esta solução foi adicionada gota a gota a solução de complexo de trióxido de enxofre-piridina

30 / 33 (0,347 g, 2,2 mmol, 3,0 equiv) em DMSO (1 mL) a 0°C. A mistura de reação foi aquecida em temperatura ambiente e agitada por 20 h. A solução foi diluída com CH2Cl2 e lavada com água destilada, secada sobre sulfato de sódio anidro, e concentrada sob pressão reduzida para dar 5 como um óleo amarelo. O óleo foi filtrado sobre um tampão de sílica e usado diretamente no procedimento seguinte.

[0060] Fosfonato 7 foi preparado de acordo com um procedimento modificado publicado (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450). A uma suspensão de NaH (60% em óleo mineral, 37,8 mg, 0,945 mmol, 2,2 equiv) em tolueno anidro (2 mL) foi adicionado gota a gota metilenodifosfonato de tetraetila (0,27 mL, 1,08 mmol, 2,5 equiv) e agitado 30 min em temperatura ambiente. Uma solução de 5 em tolueno anidro (5 mL) foi adicionada gota a gota a esta mistura sob nitrogênio e agitada à temperatura ambiente por 2 h. A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 e resfriada bruscamente com água destilada. A camada orgânica foi extraída com CH2Cl2 (3×), secada sobre sulfato de sódio anidro, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna de vaporização instantânea (40% a 100% acetato de etila/hexanos) para dar 7 como um xarope incolor (162 mg, 0,272 mmol, 62%). Espectros de RMN correspondem aos reportados na literatura (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450), α]D20 = +40,4 (c = 1,01, CHCl3), 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) δ 7,39 - 7,27 (15H, m), 6,96 (1H, ddd, J = 22,1, 17,2, 4,3 Hz), 6,12 (1H, ddd, J = 21,2, 17,5, 1,8 Hz), 4,88 e 4,59 (2H, AMq, J = 10,6 Hz), 4,77 e 4,70 (2H, ABq, J = 12,4 Hz), 4,73 (1H, s), 4,63 (2H, s), 4,14 - 4,03 (5H, m), 3,90 (1H, dd, J = 9,3, 3,0 Hz), 3,81 - 3,77 (1H, m), 3,72 (1H, t, J = 9,5 Hz), 3,29 (3H, s), 1,31 (6H, t, J = 7,1 Hz), 13 C RMN (CDCl3, 101 MHz) δ 148,4 (d, J = 5,8 Hz), 138,7, 138,5, 138,3, 128,7, 128,4, 128,14, 128,05, 127,9, 118,3 (d, J = 188,2 Hz), 99,6, 80,4, 78,5 (d, J = 1,9 Hz), 75,7, 75,0, 73,2, 72,7, 71,5 (d, J = 21,5 Hz), 62,1 (dd, J = 5,8, 1,3 Hz), 55,3, 16,7, 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 18,3, FT-IR (puro, cm-1):

31 / 33 ν(C-H) = 2982 (m), ν(P=O) = 1253 (s), ν(P-O-C) = 1024 (s), ν(P-O-C) = 969 (m). 2,3,4-Tri-O-benzil-6-deoxi-6-diisopropiloxicarboniloxi-metil- fosfinilmetileno-α-D-manopiranosideo de metila (10)

[0061] Ácido fosfônico 8 foi preparado de acordo com um procedimento publicado (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450). A uma solução de 7 (0,146 g, 0,245 mmol, 1 equiv) em CH3CN anidro (5,6 mL) sob nitrogênio foi adicionada piridina (31 μL, 0,392 mmol, 1,6 equiv) e brometo de trimetilsilila (0,32 mL, 2,45 mmol, 10 equiv) com agitação em temperatura ambiente. Depois de 2 h, a mistura de reação foi resfriada a 0°C e foi adicionada piridina (51 μL, 0,634 mmol, 2,6 equiv) e H2O (185 μL, 10,3 mmol, 42 equiv) então aquecida a temperatura ambiente e agitada. Depois de 2 h, a mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 e 2 M HCl (4 mL) e H2O (4 mL). A camada orgânica foi extraída com CH2Cl2, secada sobre sulfato de sódio anidro, e concentrada sob pressão reduzida para dar 8 como um óleo marrom. O resíduo bruto foi usado diretamente no procedimento seguinte.

[0062] Fosfonato 10 foi preparado seguindo um procedimento modificado (Graham et al., (2017). Publicação de Pedido de Patente Internacional WO2017/87256). Uma mistura de 8 em CH3CN anidro sob nitrogênio foi tratada com DIPEA (0,480 mL, 2,76 mmol, 9,9 equiv), TBAB (93,1 mg, 0,289 mmol, 1,0 equiv), e carbonato de clorometil isopropila (0,30 mL, 2,24 mmol, 8,1 equiv) então foi aquecida a 60°C. Depois de agitação por 16 h, a mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia de coluna de vaporização instantânea (30% a 100% acetato de etila/hexanos) para dar 10 como um óleo incolor (116 mg, 0,150 mmol, 54%), TLC (EtOH/EtOAc/hexanos 1,5:1,5:7): Rf =

32 / 33 0,49, 1H RMN (CDCl3, 400 MHz) δ 7,40 – 7,29 (15H, m), 7,10 (1H, ddd, J = 24,5, 17,2, 3,8 Hz), 6,40 – 6,17 (1H, m), 5,80 – 5,65 (6H, m), 4,81 – 4,59 (7H, m), 4,22 – 4,14 (1H, m), 3,91 (1H, dd, J = 9,3, 3,1 Hz), 3,83 – 3,78 (1H, 13 m), 3,74 (1H, t, J = 9,5 Hz), 3,30 (3H, s), 1,32 – 1,29 (12H, m), C RMN (CDCl3, 101 MHz) δ 153,5, 138,7, 138,5, 138,3, 128,8, 128,7, 128,6, 128,2, 128,1, 127,9, 99,7, 84,5 (d, J = 5,7 Hz), 84,4 (d, J = 6,8 Hz), 80,5, 78,3 (d, J = 2,1 Hz), 75,8, 75,0, 73,5 (d, J = 3,5 Hz), 73,3, 72,7, 71,3 (d, J = 22,3 Hz), 55,3, 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 26,3.

6-Deoxi-6-diisopropiloxicarboniloxi-metil-fosfinilmetil-α-D- manopiranosideo de metila (L2)

[0063] A etapa final na síntese de L2 foi realizada de acordo com um procedimento de hidrogenação publicado (Jeanjean et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 6240-6243). Em um frasco secado em estufa, 10 (36,0 mg, 0,047, 1 equiv) foi secado e desgaseificado sob alto vácuo. A este foi adicionado Pd/C a 10% (36,6 mg, 0,344 mmol, 7,4 equiv) e enxaguado com CH2Cl2 (2 mL) e EtOH (2 mL). A mistura de reação foi pulverizada subsuperficialmente com N2 por 1 min. A mistura de reação foi então desgaseificada sob pressão reduzida e a atmosfera foi substituída por H2 (5×). A mistura de reação foi agitada vigorosamente sob H2 por 4 h, depois desse

33 / 33 tempo a mistura de reação foi desgaseificada sob pressão reduzida e recarregada com N2 (5×). A mistura de reação foi diluída com CH2Cl2 (2 mL) e filtrada sobre um tampão de celite úmida. A camada orgânica filtrada foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo bruto foi purificado por HPLC (40% a 85% H2O + 0,1% FA]:CH3CN + 0,1% FA], tR(L2) = 7,00 min) para dar L2 (10,1 mg, 0,020 mmol, 43%) como um sólido branco. Todas as 13 constantes de acoplamento C-31P estão dentro da faixa padrão de valores (Buchanan et al., Can. J. Chem. 1976, 54, 231-237), 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,68 (2H, dd, J = 20,5 Hz, J = 5,3 Hz, H8), 5,65 (2H, dd, J = 18,3 Hz, J = 5,4 Hz, H8’), 4,93 (2H, hept, J = 6,3 Hz, H10) , 4,68 (1H, s, H1), 3,95 - 3,86 (1H, br, H5), 3,74 (1H, m, H2), 3,58 (2H, m, H3, H4), 3,35 (3H, s, OCH3), 3,22 - 3,07 (1H, m, OH), 2,95 (2H, m, 2 × OH), 2,27 - 2,07 (2H, m), 2,06 - 1,86 (2H, m, H6, H6’, H7, H7’), 1,32 (12H, d, J = 6,2 Hz, H11), 13C RMN (101 MHz, CDCl3) δ 153,6 (d, J = 3,7 Hz, C9), 101,2 (s, C1), 84,5 (d, J = 6,3 Hz, C8), 84,3 (d, J = 6,3 Hz, C8’), 73,7 (d, J = 3,2 Hz, C10), 72,0 (s, C2), 70,9 (d, J = 16,1 Hz, C5), 70,6 (s), 70,5 (s, C3, C4), 55,3 (s, OCH3), 23,8 (d, J = 4,5 Hz, C6), 22,4 (s, C11), 21,7 (d, J = 142,3 Hz, C7), 31P RMN (162 MHz, CDCl3) δ 34,4, FT-IR (puro, cm-1): ν(O-H) = 3409 (br), ν(C-H) = 2923 (m), ν(C=O) = 1760 (s), ν(P=O) = 1269 (s), LR-MS (ESI-) calculado para M + HCOO]-: 549,2; encontrado: 549,2.

[0064] Embora a presente invenção tenha sido descrita através de modalidades ilustrativas, modificação de rotina será evidente para os versados na técnica e tais modificações são destinadas a estar dentro do escopo desta descrição.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ligante agonista específico para receptor de IGF-2, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para tratamento de um distúrbio do neurodesenvolvimento (ND) selecionado do grupo consistindo em síndrome de Angelman (AS) e transtorno do espectro do autismo (ASD) em um indivíduo que foi diagnosticado com um ND.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende aliviar uma ou mais etapas do desenvolvimento, fala, habilidades intelectuais, movimento, comportamento social e epilepsia.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante agonista é IGF-2 ou uma modificação do mesmo.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante agonista é manose-6-fosfato (M6P) ou um derivado da mesma, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o derivado de M6P é selecionado do grupo consistindo em , ,

,

,

,

,

,e

, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a M6P ou um derivado da mesma é administrado em uma quantidade na faixa de 1 a 2.000 µg/kg peso corporal.

7. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a M6P ou um derivado da mesma não é conjugada a outra porção.

8. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a M6P ou um derivado da mesma é o único agente na composição que se liga especificamente ao receptor de IGF -2.

9. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o IGF-2 é administrado em uma quantidade na faixa de 1 a 500 µg/kg peso corporal.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o IGF-2 é o único agente na composição que se liga especificamente a um receptor de IGF-2.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição consiste essencialmente em i) um ligante selecionado do grupo consistindo em M6P e um derivado de M6P e um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos; e ii) IGF-2.

12. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado do grupo consistindo em L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, e L9.

13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido na reivindicação 12 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

14. Composto de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o composto tem a estrutura: .

15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o composto tem a estrutura: .

16. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de M6P é .

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que L2 é administrado em uma quantidade na faixa de 1 a 2.000 µg/kg de peso corporal.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que L2 é administrado em uma quantidade na faixa de 1 a 500 µg/kg de peso corporal.

19. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que L2 não é conjugado a outra porção.

20. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que L2 é o único agente na composição que especificamente liga ao receptor IGF-2.