KR20210075068A - 엔젤만 증후군 및 자폐증 치료를 위한 igf-2 수용체 작용제 리간드의 용도 - Google Patents
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Abstract
엔젤만 증후군(Angelman Syndrome) 및 자폐증(autism)과 같은 신경 발달 장애(neurodevelopmental disorder)의 치료 방법으로서, 상기 방법은 개체에 IGF-2 수용체의 작용제 리간드(agonist ligand)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법이 제공된다. IGF-2 수용체의 작용제 리간드는 IGF-2, 또는 만노오스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate) 또는 이의 유도체일 수 있다. 또한, 만노오스-6-포스페이트 유도체를 포함하는 조성물이 개시된다.
Description
(연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술)
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 연구 장려금 번호(grant number) 제MH065635호 및 제MH074736호 하에 정부 지원으로 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 2018년 8월 10일자 미국 가출원 번호 제62/717,372호의 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
엔젤만 증후군(Angelman Syndrome, AS)은 약 20,000 생존 출생 중 한명에게 발생하는 신경 발달 장애(neurodevelopmental disorder)이다. 엔젤만 증후군(AS)의 특징 또는 증상은 발달 지연, 언어 부족, 보행 및 균형 장애, 및 발작(seizure)을 포함한다. 간질 발작(Epileptic seizure)은 여러 유형이 있을 수 있으며, 종종 처방된 다수의 약물에 반응하지 않는다. 또한, 엔젤만 증후군(AS)은 인지 장애(cognitive impairment)와 관련이 있다. 엔젤만 증후군의 특징 중 일부는 자폐 스펙트럼 장애와 겹치지만, 두 가지 상태는 이들 자체의 고유한 특징을 갖는다. 현재, 엔젤만 증후군(AS) 또는 자폐증에 대한 알려진 치료법이나 이러한 징후와 관련된 다양한 증상을 개선하기 위한 실행 가능한 치료적 접근법이 없다.
본 개시 내용은 엔젤만 증후군(AS) 및 자폐증(autism)과 같은 신경 발달 장애(neurodevelopmental disorder)를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 치료를 필요로 하는 대상체에 IGF-2 수용체에 특이적인 인슐린 유사 성장 인자 2(insulin-like growth factor 2)(IGF-2 또는 IGF-II) 수용체 작용제 리간드(receptor agonist ligand)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 상기 조성물은 IGF-2 및/또는 만노오스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate, M6P) 또는 이의 유도체의 치료학적 유효량을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어질 수 있다. IGF-2 수용체에 특이적으로 결합하는 IGF-2 또는 만노오스-6-포스페이트(M6P)의 임의의 유도체가 사용될 수 있다. 만노오스-6-포스페이트(M6P)의 유도체는 탄소 1이 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시 등) 또는 알킨으로 작용화되거나, 탄소 6이 포스포네이트(phosphonate), 에틸 에스테르(ethyl ester), 메틸 말로네이트(methyl malonate), 포스폰산(phosphonic acid), 카르복실레이트(carboxylate), 또는 말로네이트(malonate)로 작용화된 유도체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
도 1은 IGF-2가 엔젤만 증후군(AS)의 마우스 모델에서 관측된 대부분의 행동 결함을 역전시키는 것을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 모든 실험에서, 훈련 또는 시험 20분 전에 운반체 또는 IGF-2 (↑)를 마우스에 피하 주사했다. 모든 데이터는 평균 ± s.e.m으로 나타냈다. N은 그룹 당 8-12마리이다. 이원 배치 분산 분석(Two-way analysis of variance, ANOVA) 후 본페로니 사후 검정(Bonferroni post-hoc test). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. (A) 대조군 역할을 하는 정상 마우스(야생형, WT) 및 운반체나 IGF-2가 주사된 Ube3a-/+마우스 (엔젤만 증후군(AS)의 마우스 모델, 마우스라고도 함)의 훈련(시험) 후 24시간(시)에 시험 시 및 전후 관계상 두려움 조절(contextual fear conditioning) 훈련 중 충격 전달 전(Pre-US) 또는 후(Post-US)에 부동(freezing)에 소요된 시간의 퍼센트. (B) 훈련 20분 전, 훈련 후 4시간 및 24시간에 시험된, 운반체나 IGF-2가 주사된 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT)의 새로운 물체 인식 중에 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트. (C) 시험(테스트) 전에 운반체나 IGF-2가 주사된 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT)의 Y-미로(Y-maze)에서 정확한 교체율 퍼센트(정확도%). (D) 시험 20분 전에 운반체나 IGF-2가 주사되고, 3일 및 7일 후에 다시 시험된 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT)에 의한 회전 막대(rotating rod)로부터의 낙하 지연 시간(Latency to fall off). (E) 시험 20분 전에 운반체나 IGF-2가 주사된 Ube3a-/+ 마우스 및 야생형(WT)에 의해 대리석이 매립되는데 소요되는 시간. (F) 시험 20분 전에 운반체나 IGF-2가 주사된 Ube3a-/+ 마우스 및 야생형(WT)에 의한 오픈 필드의 중앙에서 소모된 시간. 왼쪽에서 오른쪽으로 각 세트에 대한 바는, WT 운반체, WT IGF-2, Ube3a-/+ 운반체, 및 Ube3a-/+ IGF-2이다.
도 2는 야생형 한배새끼(littermate)와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 등에 있는 해마(dorsal hippocampus, dHC)의 생화학적 마커 특성화를 도시한다. 비훈련된(나이브(naive)라고 함) 8주령 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT) 한배새끼로부터 전체 해마의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 수집했다. 동일한 블롯(로딩 대조군으로 사용되는)에 대해 검출된 β-액틴에 대해 각각의 상대적인 값을 노멀라이징했다. 모든 데이터를 평균 ± s.e.m.으로 나타내고, 야생형(WT) 나이브 마우스의 평균 값으로 노멀라이징했다. N은 그룹당 4마리였다. 독립 t-시험. *P<0.05, **P<0.01.
도 3은 야생형(WT) 한배새끼와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 내측 전전두피질(medial prefrontal cortex, mPFC)의 생화학적 마커 특성화를 도시한다. 나이브(비훈련된 대조군) 8주령 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT) 한배새끼의 내측 전전두피질(mPFC)로부터 전체 해마 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 수집했다. 로딩 대조군으로 사용되는 동일한 블롯에 대해 검출된 β-액틴에 대해 각각의 상대적인 값을 노멀라이징했다. 모든 데이터를 평균 ± s.e.m.으로 나타내고, 야생형(WT) 나이브 마우스의 평균 값으로 노멀라이징했다. N은 그룹당 4마리였다. 독립 t-시험. *P<0.05, **P<0.01.
도 4는 정상(야생형, WT) 마우스에서 nOR에 대한 IGF2R.L1 (L1) (M6P)의 효과의 용량-반응 곡선을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. N은 그룹당 4마리였다. 일원배치 분산분석(One-way analysis of variance, ANOVA) 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01. nOR에 대해 훈련하기 20분 전에 다양한 용량의 IGF2R.L1 (L1)을 야생형 마우스에 피하 주사했다. 그래프는 훈련 4시간 후 및 24시간 후에 수행된 시험에서 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트를 나타낸다.
도 5는 M6P가 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 인지 및 운동 결핍을 역전시키는 것을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 모든 실험에서, 훈련 또는 시험 20분 전에 운반체 또는 850 ㎍/Kg의 M6P (IGF-2R.L1 또는 L1)(↑)을 마우스에 피하 주사했다. (A) 훈련 20분 전에 운반체 또는 IGF-2R.L1로 주사하고, 훈련 후 4시간 및 24시간에 시험한 Ube3a-/+ (AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 nOR 패러다임 중에 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트. N은 그룹 당 4마리이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. 이원 배치 분산 분석 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01. (B) 시험(테스트) 전에 운반체 또는 M6P가 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 Y-미로에서 정확한 교체 퍼센트(정확도%). 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. (C) 시험 20분 전에 운반체 또는 IGF-2R.L1이 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 뒷다리 움켜쥠 점수(Hindlimb clasping score). 뒷다리 움켜쥠 점수는 다음과 같이 측정 및 표현된다: 뒷다리가 복부에서 멀리 바깥쪽으로 지속적으로 벌어지면, 0점이 부여된다. 1개의 뒷다리가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 복부쪽으로 후퇴하면, 1점을 받는다. 2개의 뒷다리 모두가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 부분적으로 복부쪽으로 후퇴하면, 2점을 받는다. 뒷다리가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 복부쪽으로 완전히 후퇴하고 접촉하면, 3점을 받는다. 데이터는 점수로 나타낸다. B 및 C는 N이 그룹당 8-14마리이다. 이원 배치 분산 분석(ANOVA) 후 터키 사후 검정(Tukey post-hoc test). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 6은 PnM6P는 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 기억 및 운동 결핍을 역전시키는 것을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 모든 실험에서, 훈련 또는 시험 20분 전에 운반체 또는 850 ㎍/Kg의 IGF-2R.L2 (또는 L2)(↑)라고 하는 포스포네이트-M6P (PnM6P)을 마우스에 피하 주사했다. (A) 훈련 전에 운반체 또는 L2를 주사하고, 훈련 후 4시간, 24시간, 5일에 시험한 Ube3a-/+ (AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 nOR 패러다임 중에 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트. N은 그룹 당 4마리이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. (B) 시험 20분 전에 운반체 또는 L2를 주사하고(시험 1), 다시 2일 후에 시험한(시험 2) 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 회전 막대로부터의 낙하 지연 시간. 데이터는 초(s)로 나타낸다. (C) 시험 전에 운반체 또는 L2가 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 뒷다리 움켜쥠 점수. B 및 C는 N이 그룹당 3-4마리이다. 데이터는 뒷다리 점수로 나타낸다. 이원 배치 분산 분석(ANOVA) 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 2는 야생형 한배새끼(littermate)와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 등에 있는 해마(dorsal hippocampus, dHC)의 생화학적 마커 특성화를 도시한다. 비훈련된(나이브(naive)라고 함) 8주령 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT) 한배새끼로부터 전체 해마의 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 수집했다. 동일한 블롯(로딩 대조군으로 사용되는)에 대해 검출된 β-액틴에 대해 각각의 상대적인 값을 노멀라이징했다. 모든 데이터를 평균 ± s.e.m.으로 나타내고, 야생형(WT) 나이브 마우스의 평균 값으로 노멀라이징했다. N은 그룹당 4마리였다. 독립 t-시험. *P<0.05, **P<0.01.
도 3은 야생형(WT) 한배새끼와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 내측 전전두피질(medial prefrontal cortex, mPFC)의 생화학적 마커 특성화를 도시한다. 나이브(비훈련된 대조군) 8주령 Ube3a-/+마우스 및 야생형(WT) 한배새끼의 내측 전전두피질(mPFC)로부터 전체 해마 단백질 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 수집했다. 로딩 대조군으로 사용되는 동일한 블롯에 대해 검출된 β-액틴에 대해 각각의 상대적인 값을 노멀라이징했다. 모든 데이터를 평균 ± s.e.m.으로 나타내고, 야생형(WT) 나이브 마우스의 평균 값으로 노멀라이징했다. N은 그룹당 4마리였다. 독립 t-시험. *P<0.05, **P<0.01.
도 4는 정상(야생형, WT) 마우스에서 nOR에 대한 IGF2R.L1 (L1) (M6P)의 효과의 용량-반응 곡선을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. N은 그룹당 4마리였다. 일원배치 분산분석(One-way analysis of variance, ANOVA) 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01. nOR에 대해 훈련하기 20분 전에 다양한 용량의 IGF2R.L1 (L1)을 야생형 마우스에 피하 주사했다. 그래프는 훈련 4시간 후 및 24시간 후에 수행된 시험에서 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트를 나타낸다.
도 5는 M6P가 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 인지 및 운동 결핍을 역전시키는 것을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 모든 실험에서, 훈련 또는 시험 20분 전에 운반체 또는 850 ㎍/Kg의 M6P (IGF-2R.L1 또는 L1)(↑)을 마우스에 피하 주사했다. (A) 훈련 20분 전에 운반체 또는 IGF-2R.L1로 주사하고, 훈련 후 4시간 및 24시간에 시험한 Ube3a-/+ (AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 nOR 패러다임 중에 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트. N은 그룹 당 4마리이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. 이원 배치 분산 분석 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01. (B) 시험(테스트) 전에 운반체 또는 M6P가 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 Y-미로에서 정확한 교체 퍼센트(정확도%). 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. (C) 시험 20분 전에 운반체 또는 IGF-2R.L1이 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 뒷다리 움켜쥠 점수(Hindlimb clasping score). 뒷다리 움켜쥠 점수는 다음과 같이 측정 및 표현된다: 뒷다리가 복부에서 멀리 바깥쪽으로 지속적으로 벌어지면, 0점이 부여된다. 1개의 뒷다리가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 복부쪽으로 후퇴하면, 1점을 받는다. 2개의 뒷다리 모두가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 부분적으로 복부쪽으로 후퇴하면, 2점을 받는다. 뒷다리가 일시 중단된 시간의 50% 이상 동안 복부쪽으로 완전히 후퇴하고 접촉하면, 3점을 받는다. 데이터는 점수로 나타낸다. B 및 C는 N이 그룹당 8-14마리이다. 이원 배치 분산 분석(ANOVA) 후 터키 사후 검정(Tukey post-hoc test). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 6은 PnM6P는 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 기억 및 운동 결핍을 역전시키는 것을 도시한다. 실험 타임 라인은 그래프 위에 표시된다. 모든 실험에서, 훈련 또는 시험 20분 전에 운반체 또는 850 ㎍/Kg의 IGF-2R.L2 (또는 L2)(↑)라고 하는 포스포네이트-M6P (PnM6P)을 마우스에 피하 주사했다. (A) 훈련 전에 운반체 또는 L2를 주사하고, 훈련 후 4시간, 24시간, 5일에 시험한 Ube3a-/+ (AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 nOR 패러다임 중에 친숙한 물체와 비교하여 새로운 물체에 대한 탐색 선호도 퍼센트. N은 그룹 당 4마리이다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로 나타낸다. (B) 시험 20분 전에 운반체 또는 L2를 주사하고(시험 1), 다시 2일 후에 시험한(시험 2) 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT) (대조군)의 회전 막대로부터의 낙하 지연 시간. 데이터는 초(s)로 나타낸다. (C) 시험 전에 운반체 또는 L2가 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT)의 뒷다리 움켜쥠 점수. B 및 C는 N이 그룹당 3-4마리이다. 데이터는 뒷다리 점수로 나타낸다. 이원 배치 분산 분석(ANOVA) 후 본페로니 사후 검정. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
본 개시 내용은 엔젤만 증후군(Angelman Syndrome, AS) 및 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)와 같은 신경 발달 장애를 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 조성물 및 방법은 IGF-2 수용체 리간드와 관련된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료(treatment)"는 치료할 특정 상태, 예를 들면 엔젤만 증후군의 존재와 관련된 하나 이상의 증상 또는 특징의 감소 또는 지연을 말한다. 치료가 완전한 치유를 의미하지는 않는다. 예를 들면, 본 개시 내용에서 엔젤만 증후군(AS)의 치료는 엔젤만 증후군(AS)과 관련된 하나 이상의 증상을 감소 또는 억제하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 단일 또는 복수의 투여량으로 치료의 의도된 목적을 달성하기 위해 충분한 양이다. 예를 들면, 엔젤만 증후군(AS)을 치료하기 위한 유효량은 엔젤만 증후군(AS)의 하나 이상의 증상을 완화시키는데 충분한 양이다. 치료로 완화되는 증상은 발달 이정표(developmental milestones), 언어 능력(speech), 지능 능력(intellectual ability), 운동(movement)(보행 및 균형), 사회적 행동(social behavior) 및 간질(epilepsy) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 목적하거나 필요한 정확한 양은 투여 방식, 환자 특성 등에 따라 달라질 것이다. 적절한 유효량은 본 개시 내용의 이점과 함께 당업자 (예를 들면, 임상의)에 의해 결정될 수 있다.
본 개시 내용에서 값의 범위가 제공되는 경우, 달리 명확하게 나타내지 않으면 그 범위의 상한과 하한 사이의 하한의 단위의 10분의 1까지의 각각의 개재 값 및 그 언급된 범위의 임의의 다른 개재 값이 본 발명 내에 포함되는 것을 이해해야 한다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 본 개시 내용 내에 포함되는 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있다.
본 개시 내용에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 나타내지 않으면 복수 형태를 포함하고, 그 반대도 마찬가지이다.
본 개시 내용은 엔젤만 증후군(AS)과 같은 신경 발달 장애에 대한 IGF-2 수용체의 작용제 리간드의 효과를 기재한다. 일 측면에서, 본 개시 내용은 치료를 필요로 하는 대상체에 IGF-2 수용체의 하나 이상의 작용제 리간드를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 엔젤만 증후군 및 자폐증과 같은 신경 발달 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용에서, 용어 "개체(individual)" 및 "대상체(subject)"는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 대상체는 인간, 실험실 동물, 또는 임의의 다른 동물과 같은 임의의 동물 대상체일 수 있다. 일 양태에서, IGF-2 수용체의 작용제 리간드는 IGF-2 수용체에 특이적이고, IGF-2-관련 다른 수용체(예를 들면, IGF-1 또는 인슐린 수용체)에 대한 리간드가 아니다. 예를 들면, 작용제 리간드(본원에서 제제(agent)라고도 함)는 변형된 만노오스(예를 들면, M6P), 변형된 M6P(예를 들면, M6P의 유도체), IGF-2, 또는 변형된 IGF-2 또는 IGF-2 수용체에 결합하는 임의의 화학적 또는 펩티드일 수 있고, 세포의 반응을 활성화한다. M6P의 포스포네이트 또는 설포네이트 유도체는 당 업계에 공지되어 있다(퍼거슨의 미국 특허 번호 제6,140,307호, 변형에 대한 설명은 본원에 참조로 포함된다). 또한, 인간 Leu 27 (Armitaj et al., Neuroscience, 2010 Oct 27;170(3):722-30)과 같은 아미노산 치환을 갖는 IGF-2가 사용될 수도 있다.
M6P에 대한 변형물(본원에서 M6P 유도체라고도 함)은 만노오스의 탄소 1 및/또는 탄소 6에 대한 변형을 포함한다. 유도체의 예는 탄소 1이 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시 등) 또는 알킨으로 작용화되거나, 탄소 6이 포스포네이트(phosphonate), 에틸 에스테르(ethyl ester), 메틸 말로네이트(methyl malonate), 포스폰산(phosphonic acid), 카르복실레이트(carboxylate), 또는 말로네이트(malonate)로 작용화된 예들을 포함한다. 다양한 예에서, 탄소 1은 알콕시(예를 들면, 메톡시)로 작용화되고, 탄소 6은 포스포네이트(본원에서 L2라고 함), 에틸 에스테르(본원에서 L3이라고 함), 메틸 말로네이트(본원에서 L4라고 함), 포스폰산(본원에서 L5라고 함), 카르복실레이트(예를 들면, 카르복실레이트의 소듐염)(본원에서 L6이라고 함), 또는 말로네이트(본원에서 L7이라고 함)로 작용화되고, 탄소 1은 알킨으로 작용화되고, 탄소 6은 포스폰산(L8이라고 함) 또는 포스포네이트(L9라고 함)로 작용화된다. 앞서 나열된 M6P 및 이의 유도체의 구조는 하기에 나타냈다:
작용제 리간드는 IGF-2 또는 M6P의 친화도와 유사한 친화도를 갖는 IGF-2 수용체에 결합할 수 있다. IGF-2는 약 40-60 nM의 Kd를 갖는 이의 수용체에 결합하고(Williams et al., Science, 2012 Nov 30, 338(6111):1209-1213), M6P는 약 1 nM 또는 약 1 μM일 수 있는(결합하는 2개의 알려진 부위에 따라 달라짐) 친화도를 갖는 IGF-2 수용체에 결합하는 것이 알려져 있다(Olson et al., J. Biol., Chem. 2004 Aug 6;279(32):34000-9. Epub 2004 May 28).
일반적으로, 본 개시 내용의 IGF-2 수용체 리간드의 치료적 용량은 약 1 내지 10,000 마이크로그램/kg 체중의 범위 내이다. IGF-2는 약 1 내지 500 μg/kg 체중 및 그 사이의 모든 값들 및 범위들에서 사용될 수 있다. 예를 들면, IGF-2는 1 내지 500 μg/kg, 1 내지 100 μg/kg, 1 내지 50 μg/kg, 10 내지 500 μg/kg, 10 내지 100 μg/kg, 10 내지 50 μg/kg 체중으로 사용될 수 있다. 일 양태에서, IGF-2는 10 내지 45 μg/kg 피하 투여로 사용될 수 있다. 특정 양태에서, IGF-2는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 및 500 μg/kg 체중에서 사용될 수 있다.
M6P 및 M6P 유도체는 약 1 내지 2,000 μg/kg 체중 및 이들 사이의 모든 값 및 범위들에서 사용될 수 있다. 예를 들면, M6P는 1 내지 2,000 μg/kg, 1 내지 1,500 μg/kg, 1 내지 1,000 μg/kg, 1 내지 500 μg/kg, 1 내지 100 μg/kg, 10 내지 2,000 μg/kg, 10 내지 1,500 μg/kg 10 내지 1,000 μg/kg, 10 내지 500 μg/kg, 및 10 내지 100 μg/kg, 50 내지 2,000 μg/kg, 50 내지 1,500 μg/kg, 50 내지 1,000 μg/kg, 50 내지 500 μg/kg, 및 50 내지 100 μg/kg 체중 및 상기 범위들 사이의 모든 값에서 사용될 수 있다. 일 양태에서, M6P 또는 유도체는 850 μg/kg 피하 투여로 사용될 수 있다. 일 양태에서, M6P 또는 유도체는 100 내지 1,000 μg/kg에서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, M6P는 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1,250, 1,500, 1,750 및 2,000 μg/kg 체중으로 사용될 수 있다. 또한, 동물에 대해 본원에 제공된 데이터에 기초하여, 당업자는 M6P 및 IGF-2에 대한 적합한 인간 용량을 얻을 수 있다. 이러한 전환에 대한 지침은 당업계에 알려져 있다(예를 들면, 본원에 참조로 포함되는 Nair et al., J. Basic Clin. Pharma., v 7(2), March 2016-May 2016; 27-31 참조).
M6P는 유리된 인산(free phosphoric acid) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 모노(mono)- 또는 디(di)- 염, 예를 들면 소듐, 칼슘, 마그네슘 또는 바륨 염의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 생체 내에서 분해될 수 있는 화합물을 함유하는 M6P로서 제공될 수 있거나, 생체 내에서 생성될 수 있는 전구체로서 제공될 수 있다. 또한, M6P 유도체는 유리된 산 또는 이의 염(예를 들면, 이의 모노소듐 또는 디소듐염)으로 존재할 수 있다(적용 가능한(예를 들면, L3, L7, 및 L8)).
일 측면에서, 본 개시 내용은 대략 토들러 연령에 의한 언어 능력 및 운동, 지능 능력의 발달 지연, 발작, 손 펄럭임(hand flapping)과 같은 비정상적인 행태 및/또는 반복 행동이 특징인 신경 발달 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 신경 발달 장애의 예는 엔젤만 증후군 및 자폐 스펙트럼 장애를 포함한다.
엔젤만 증후군은 지능 및 발달 지연이 특징인 신경 발달 장애이다. 엔젤만 증후군(AS)은 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase) Ube3A의 돌연변이에 의해 야기된다. 엔젤만 증후군의 증상은 하기를 포함할 수 있다: 발달 지연, 예를 들면 6 내지 12개월에 기기(crawling) 또는 옹알이(babbling) 부족, 정신 발달 약화, 언어 능력이 없거나 최소, 운동 실조(ataxia) (적절하게 움직이고, 걷거나, 균형을 맞출 수 없음), 뻣뻣하거나 경련한(jerky) 움직임 (예를 들면, 손 펄럭임), 과잉 행동, 팔다리 떨림, 잦은 미소와 웃음, 부적절한 웃음 발작, 넓게 벌어진 치아, 행복하고 흥분되는 성격, 간질, 느리고 노치 파(notched wave)와 스파이크가 있는 뇌파 전위 기록 장치 이상(electroencephalographic abnormality), 보통 2 내지 3세 연령에서 시작되고 근간대 경련(myoclonus) 및 비전형적 결여, 눈의 편향 및 구토를 동반할 수 있는 발작, 뒤에서 눈에 띄게 편평한 작은 머리 (소뇌 뇌증(microbrachyoephaly)), 교차된 눈(crossed eye) (사시(strabismus)), 혀 찌르기 및 빨기/삼키기 장애, 튀어 나온 혀, 과도한 씹기/마우싱 행동(mouthing behavior), 과잉 하지 심부건 반사(hyperactive lower extremity deep tendon reflex), 발목이 튀어 나오거나 외반이 있는 넓은 보행(wide-based gait with pronated or valgus-positioned ankle), 열에 대한 민감성 증가, 팔을 공중에 들고 걷기, 종이나 플라스틱과 같은 물이나 주름진 물건에 대한 매료됨, 나이가 많은 어린이의 비만, 변비, 튀어 나온 아래턱, 머리카락, 피부 및 눈의 밝은 색소 침착 (저색소 침착(hypopigmentation)), 잦은 침 흘림(drooling), 악전돌증(prognathia), 수유 문제 및/또는 유아기 중 근 긴장 저하(truncal hypotonia), 및/또는 척추 측만증(scoliosis). 증상은 일반적으로 출생시 분명하지 않으며, 6 내지 12개월의 연령 사이에 기기나 옹알이를 하지 못하거나 12개월의 연령이 되기 전에 머리의 성장을 늦추는 것과 같은 발달 지연으로 종종 처음 나타난다. 또한, 엔젤만 증후군을 앓는 개체는 수면 시작 및 유지의 어려움, 연장된 수면 지연(prolonged sleep latency), 수면 시작 후 연장된 깨어남(prolonged wakefulness after sleep onset), 야간 각성의 높은 횟수 및 총 수면 시간 감소, 야뇨증(enuresis), 이갈이(bruxism), 야경증(sleep terror), 몽유병(somnambulism), 야간 운동 과다증(nocturnal hyperkinesia), 및 코골이를 포함하는 수면 장애로 고통받을 수 있다.
엔젤만 증후군(AS)의 증상의 중증도는 임상적으로 측정될 수 있고(본원에서 참조로 포함되는 Williams et al., American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8), 다양한 증상의 중증도의 정량화 또한 수행될 수 있다(본원에서 참조로 포함되는 Lossie et al., Journal of Medical Genetics 2001, 38; 834-845; 본원에서 참조로 포함되는 Ohtsuka et al., Brain and Development 2005, 27; 95-100). 이는 언어 능력의 범위, 독립적 이동성(independent mobility)의 정도, 발작의 빈도 및 중증도, 언어를 이해하는 능력, 운동 기능(motor skill)의 획득, 성장 파라미터를 포함할 수 있다. 22개의 구별되는 기준(Lossie et al., Journal of Medical Genetics 2001, 38)의 중증도를 정량화하는 의심되는 엔젤만 증후군 환자에 대한 선별 절차가 사용될 수 있다. 엔젤만 증후군(AS) 중증도의 다른 측정은 정신 운동 발달 성취도(psychomotor developmental achievement), 시각 기술, 비언어적 사건에 기반한 사회적 상호 작용, 표현 언어 능력, 수용 언어 능력, 및 언어 장애와 관련하여 발달 지연 정도를 구별하는 심리 측정 방법(psychometric method)을 포함한다. 보행 및 운동 장애의 정도, 및 주의력 및 EEG 이상의 범위가 측정될 수 있다(Williams et al., American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8). 또한, 적절한 연령에, 카우프만 간이 지능 검사-2(KBIT-2; 본원에 참조로 포함되는 Kaufman & Kaufman, Circle Pines, MN: American Guidance Services; 2004)와 같은 지능 능력 시험이 사용될 수 있다. 상기 특징들 중 하나 이상이 본 발명의 조성물을 사용한 치료의 유효성을 평가하는데 사용될 수 있다.
일 양태에서, 치료 효과를 평가하는 평가 프로토콜은 신경의 및 신경 시각 검사 및 운동 평가(예를 들면, 총 운동 기능 측정 척도(Gross Motor Function Measure Scale)), 인지(예를 들면, 그리피스 정신 발달 척도(Griffiths Mental Development Scale) 및 우즈그리스-헌트 척도(Uzgiris-Hunt Scale) 및 공간 작업 기억 검사(spatial working memory test)); 적응성(예를 들면, 비엔랜드 적응 행동 척도(Vineland Adaptive Behavioral Scale)); 의사 소통(예를 들면, 맥아더-베이츠 의사 소통 발달 평가(MacArthur-Bates Communicative Development Inventory) 및 비디오-기록 어린이의 언어 표현), 행동 측면(예를 들면, IPDDAG 척도) 및 본원에 참조로 포함되는 Micheletti et al., (Ital J Pediatr. 2016; 42(1): 91)에 기재된 바와 같은 신경 시각 측면을 포함한다.
자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 뇌의 정상적인 발달을 방해하는 복잡한 발달 장애, 특히 사회적 상호 작용 및 의사 소통 기술에 영향을 미치는 것이 특징이다. 자폐 스펙트럼 장애는 일반적으로 생후 3년 동안 나타난다. 자폐를 앓는 개체는 언어 및 비언어적 의사 소통, 사회적 상호 작용, 및 여가 또는 놀이 활동에 어려움을 겪는다. 사회적 상호 작용의 장애는 상호 작용을 시작하고 유지하는 어려움, 감정을 인식하고 경험하는 능력 장애, 및 다른 사람의 감정을 처리하고 인식하는 어려움의 범위이다. 의사 소통 결핍은 자폐를 앓는 개체에 따라 다르며, 일부 자폐를 앓는 개체는 상당한 언어 능력을 가진 개체와의 의사 소통 형태가 심각하게 제한된다. 반복적이고 고정 관념적인 행동은 복잡한 의식, 변화에 대한 적응의 어려움, 손 펄럭임과 같은 비정상적인 행동을 포함한다. 자폐증을 진단하는데 유용할 수 있는 일부 특징적 행태는 구어(spoken language)의 부족 또는 지연, 언어의 반복적 사용 또는 운동 매너리즘 (손 펄럭임 또는 물체를 빙글 빙글 돌림), 눈 마주침이 거의 또는 전혀 없음, 특정 물체에 대한 지속적인 고정, 사교에 대한 관심 부족 등을 포함한다.
IGF-2, IGF-2 변형물 (예를 들면, IGF-2 유사체), M6P 또는 이의 유도체의 투여는 진단이 이루어지고 바로 개시될 수 있다. 치료 주기 및 기간은 엔젤만 증후군(AS) 또는 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 중 하나 이상의 증상을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 치료는 일, 월, 년을 포함하여 필요한만큼 계속될 수 있다. 치료는 증상이 진정되거나 더 이상 측정 불가능한 이후 조차도 계속될 수 있다.
본 개시 내용의 제제는 이들을 임의의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제와 혼합함으로써 투여용 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 안정화제의 예는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins에서 확인될 수 있다. 예를 들면, M6P는 서스펜션 또는 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 담체는 적용되는 용량 및 농도에서 수령인에게 비독성인 부형제, 또는 안정화제를 포함하고, 또한 아세테이트, 트리스(Tris), 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌(methionine)을 포함하는 산화방지제; 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)와 같은 보존제; 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤즈에토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜탄올(3-pentanol); 및 m-크레졸(m-cresol); 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제(chelating agent); 트레할로오스 및 소듐 클로라이드와 같은 강장제(tonicify); 슈크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 폴리소르베이트(polysorbate)와 같은 계면활성제; 소듐과 같은 염-형성 카운터 이온(salt-forming counter-ion); 및/또는 Tween 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 약제학적 조성물은 활성 물질(예를 들면, M6P 또는 이의 유도체 또는 IGF-2 또는 이의 변형물(예를 들면, IGF-2 유사체))의 부피 당 0.01 내지 99% 중량 또는 중량 당 중량을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 정맥 내(intravenous), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 뇌 척수 내(intracerebrospinal), 피하(subcutaneous), 관절 내(intra-articular), 윤활액 내(intrasynovial), 경구, 국소, 또는 흡입(inhalation) 경로를 통해 투여될 수 있다. 조성물은 비경구적으로(parenterally) 또는 장용성으로(enterically) 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 조성물은, 예를 들면 정제, 캡슐, 알약(pill), 분말, 페이스트, 과립, 엘릭시르(elixir), 용액, 서스펜션, 분산액, 겔, 시럽 또는 임의의 다른 삼킴 가능한(ingestible) 형태의 형태로 경구 투여될 수 있다. M6P 및/또는 이의 유도체 및/또는 IGF-2 및/또는 이의 변형물(예를 들면, IGF-2 유사체)은 리포솜(liposome), 미세 입자(microparticle), 미세 캡슐(microcapsule)을 통해 전달될 수 있다. 조성물은 단일 투여로서 또는 복수 투여로서 도입될 수 있거나, 기간에 걸쳐 연속적인 방식으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 투여(들)은 미리 정해진 수의 투여 또는 매일, 매주 또는 매달 투여일 수 있으며, 이는 임상적으로 필요하고 및/또는 치료적으로 지시될 수 있는 바와 같이 연속적이거나 간헐적일 수 있다.
일 양태에서, IGF-2 수용체 리간드는 유일한 유효 성분(active component)이다. 유효 성분은, 조성물에서 IGF-2 수용체에 특이적으로 결합하는 유일한 성분인 것을 의미한다. IGF-2 수용체 리간드는 IGF-2, 이의 변형물(예를 들면, IGF-2 유사체), 또는 M6P 또는 다른 M6P 유도체일 수 있다. 일 양태에서, M6P 또는 이의 유도체는 유일한 유효 성분이다. 일 양태에서, M6P 또는 이의 유도체는 임의의 다른 모이어티에 결합되지 않고(예를 들면, 직접적으로 또는 링커를 통해 공유 결합되지 않고), 임의의 다른 모이어티 또는 제제에 담체로서 작용하지 않는다. 일 양태에서, M6P 유도체는 L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 또는 L9일 수 있다.
일 측면에서, 본 개시 내용은 M6P 유도체 및 만노오스 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. M6P의 유도체는 M6P의 탄소 1 및/또는 탄소 6에서 화학 반응(chemistry)을 수행함으로써 제조될 수 있다. 헥소오스(hexose)의 탄소 1 및/또는 탄소 6에서의 화학 반응을 수행하는 다양한 방법은 당 업계에 공지되어 있다. M6P 유도체의 예는, 포스페이트 (L2), 에틸 에스테르 (L3), 메틸 말로네이트 (L4), 포스폰산 (L5), 카르복실레이트 (L6), 말로네이트 (L7), 알킨 (L8), 및 알킨 프로드럭(alkyne prodrug) (L9)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 및 L9로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 및 L9 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.
하기 실시예는 예시적인 실시예로서 제공되며, 어떤 방식으로든 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
사용되는 마우스 모델: 마우스는 부계 각인된 Ube3A (유비퀴틴 단백질 리가아제 E3A) 녹아웃 돌연변이 (Jackson labs www.jax.org에서 주문, 재고 번호 016590)를 보유한 돌연변이 수컷 마우스 (B6.129S7-Ube3atm1Alb/J)를 C57BL/6J 암컷 정상 마우스를 사육하여 얻었다. 암컷 이형 접합(heterozygous) 마우스는 수컷 C57BL/6J 마우스와 사육했고; 이 교배(cross)의 자손은 이형 접합 수컷 (모성 전파(maternal transmission)), 이형 접합 암컷 (모성 전파), 야생형 수컷 및 야생형 암컷이다. 이 자손은 행동 및 생화학 연구에 사용했다. 이들 마우스는 본원에서 마우스라 하고, 이들의 정상적인 한배새끼는 야생형 (WT) 마우스 또는 대조군 마우스라고 한다.
치료: 행동 절차 시작 20분 전에 IGF-2, 또는 운반체 대조군 용액의 피하 (s.c.) 주사.
결과:
IGF-2는 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 반복 행동 및 손상된 기억 및 운동 반응을 역전시켰다.
엔젤만 증후군(AS)에서 변경되는 것으로 알려진 학습/인지 반응의 척도로서, 다양한 유형의 회피(aversive) 및 비-회피 기억(non-aversive memory)을 시험했다. 엔젤만 증후군(AS) 마우스가 회피(전후 관계상 두려움 조절; CFC), 비-회피(새로운 물체 인식; nOR) 형태의 장기간 기억 모두에서 강력한 결핍을 나타내는 것을 발견했다. 구체적으로, CFC 패러다임에서, 마우스는 회피 발 충격과 챔버 (정황)를 연관시키도록 훈련되었다. IGF-2 또는 운반체 용액을 훈련 20분 전에 주사했다. 하루 후 (장기 기억을 측정하는데 사용되는 시간) 마우스를 동일한 챔버에 다시 배치하고 공포 관련 (부동성) 행동을 측정하여 기억 유지를 시험했다. 대조군 용액(운반체)이 주사된 야생형(WT) 한배새끼 마우스(대조군)가 강력한 부동 반응에 의해 입증된 강력한 기억력을 가지고 있는 반면, 운반체-주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스가 상당히 적은 부동 행태를 보여, 장기간 기억 유지에 결핍을 나타내는 것을 확인했다(도 1의 A). 대조적으로, IGF-2로 치료한 엔젤만 증후군 마우스는 유사한 부동성을 보였으며, 따라서 대조군 마우스와 유사한 기억 유지를 보였고, 이는 IGF-2가 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 기억 손상을 완전히 역전시켰음을 나타낸다.
비-회피 기억, nOR 시험에서 유사한 결과를 발견했다. 이 작업은 인식 기억에 대한 검증된 시험이며, 설치류가 익숙한 물체보다 새로운 물체를 탐색하는데 더 많은 시간을 보내는 자발적인 경향을 기반으로 한다. 마우스를 새로운 경기장에서 2개의 동일한 물체에 노출시키고, 각 물체를 탐색하는데 소요된 시간을 측정했다. 그 후, 첫 경험 4시간 및 24시간 후에, 마우스를 동일한 경기장으로 돌려보냈지만, 이번에는 물체 중 하나를 새로운 물체로 교체하고, 2개의 물체를 탐색하는데 소요된 시간을 측정했다. 예상대로, 훈련 4시간 후 시험했을 때, 대조군 마우스는 첫번째 물체에 대한 기억을 나타내는 새로운 물체를 탐색하는데 훨씬 더 많은 시간을 소모했다. 대조적으로, 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 그러한 선호도를 나타내지 않았고, 2개 물체를 모두 탐색하는데 동일한 시간을 소모하여, 기억 손상을 나타냈다 (도 1의 B). IGF-2 주사는 새로운 물체에 대한 마우스의 상당한 선호도에 의해 나타낸 바와 같이 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 기억 결핍을 완전히 역전시켰다. 또한, 대조군 및 엔젤만 증후군(AS) 마우스 모두 훈련 24시간 후에 시험했을 때 기억 유지에 상당한 감소를 보였지만, IGF-2로 치료된 두 그룹의 마우스 모두 새로운 물체에 대해 상당한 선호를 보였으며, 이는 엔젤만 증후군(AS)에서 관측되는 장기간 기억 결핍을 역전시키는 IGF-2의 능력이 지속적인 것을 나타낸다.
탐색적 전략과 작업 기억을 평가하기 위해, 3개의 팔의 Y-미로를 사용하는 자발적 교체 패러다임(spontaneous alternation paradigm)을 적용했다. 운반체 주사된 대조군 마우스(WT)가 3개의 팔 사이의 탐색을 번갈아 했으며, 운반체 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 반복적인 방식으로 방문하지 않은 팔을 탐색하기 전에 최근에 방문한 팔 사이에서 더 많이 번갈아 가며 있음을 발견했다 (도 1의 C). 대조적으로, Y-미로에 노출되기 20분 전에 IGF-2로 치료된 AS 마우스는 대조군 마우스와 유사한 탐색 전략을 가졌으며, 이는 IGF-2가 이들 마우스에서 보이는 반복적이고 경직된 행동을 역전시키는 것을 나타낸다.
또한, 엔젤만 증후군(AS)은 강력한 운동 장애와 관련이 있으며, 이는 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 다시 재현된다. 가속 회전 막대 (로타로드 시험(RotaRod test))에 마우스를 배치하여 마우스에서 운동 조정 및 능력을 신뢰할 수 있게 평가한다. 이 시험에서, 야생형(WT) 대조군 마우스와 비교하여 운반체 치료된 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 운동 능력의 강력한 결핍을 관찰했다 (도 1의 D). 그러나, IGF-2로 치료한 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 로타로드에서 운동 능력이 크게 향상됨을 보였으며, 실제로는 이들의 낙하 지연 시간(falling latency)이 일반 대조군 마우스와 유사한 수준으로 돌아왔다.
또한, 대리석 매립 시험(marble-burying test)에서 대조군 야생형(WT) 한배새끼와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스에 의해 나타내는 행태의 유의미한 차이를 관측했다. 침구와 대리석이 있는 빈 집 케이지에 넣으면, 일반 마우스는 일반적으로 보통의 매립 행태와 관련된다. 이 대조군 마우스와 비교하여, 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 매립 수준이 극히 낮음을 보였고, 매립에 소모되는 시간 (도 1의 E)과 매립된 마블의 양 모두에서 상당한 감소를 나타냈다. 그러나, IGF-2 치료는 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 결핍을 구제하여, 정상 마우스와 유사한 수준의 매립을 보였다.
불안 유사한 행동에 대한 IGF-2의 효과를 측정하기 위해, 오픈 필드(open field)를 적용하고, 중앙 진입(center entry)을 측정했다(불안 행태를 측정함): 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 IGF-2 치료 효과가 발견되지 않았으며, 정상 마우스의 행동에 비해 변경된 상태로 남아 있었다 (도 1의 F).
기초 조건에서 해마와 내측 전전두피질의 생화학적 특성화는 IGF-2 경로, 가소성(plasticity) 및 대사 마커(metabolism marker)의 이상을 보였다. 기초 조건 하에서(집 케이지에 남아 있는) 성체 엔젤만 증후군(AS) 마우스 및 야생형(WT) 한배새끼의 등에 있는, 학습 및 기억 및 실행 기능에 중요한 2개의 뇌 영역인 해마(dHC) 및 내측 전전두피질(mPFC)의 단백질 수준을 비교하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 글루코오스 대사, 가소성, 억제 뉴런 기능 및 등에 있는 해마(dHC) 및 내측 전전두피질(mPFC)에서 IGF-2 경로에 중요한 마커 부류에서 중요한 변화의 증거를 발견했다. 구체적으로, 하기 요소들의 발현 수준을 비교하기 위해 엔젤만 증후군(AS) 및 야생형(WT) 한배새끼의 전체 단백질 및 시냅토뉴로소말(synaptoneurosomal) (시냅스 부분) 추출물을 평가했다: i) IGF-2 및 IGF-2R, ii) mTOR 및 포스포-mTOR, ULK-1 및 포스포-ULK-1; iii) 흥분성 뉴런 가소성(excitatory neuron plasticity) (Arc/Arg3.1, GluA1, GluA2), iv) 억제 뉴런 마커(inhibitory neurons marker) (GAD67), 및 v) 글루코오스/에너지 대사 (LDHB, MCT1, MCT4, MCT2, GLUT1, GLUT3, pAMPK).
이제까지 수행된 분석은 야생형(WT) 한배새끼와 비교하여 엔젤만 증후군(AS) 마우스가 2개의 뇌 영역에서 IGF-2/IGF-2R, 가소성 및 글루코오스 대사 메커니즘에 변화가 있음을 나타냈다. 구체적으로, 도 2(dHC) 및 도 3(mPFC)에 도시된 바와 같이, 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 dHC에서 GAD67이 현저하게 감소했고, 이는 억제 뉴런의 변화를 시사한다. 또한, 엔젤만 증후군(AS)의 dHC는 대사 효소 락테이트 탈수소효소 B (LDHB)의 현저한 감소와, GLUT3의 현저한 증가, 증가된 총, 내피 및 성상 세포 GLUT1의 강한 추세가 있고, 이는 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 글루코오스 대사가 현저히 변경됨을 시사한다. AMPA 수용체 서브 유닛인 GluA2는 강력한 감소 추세를 보였지만, 상당한 수준에 도달하지 못했다. 샘플의 수의 증가는 상당한 결핍을 나타낼 수 있다. IGF-2, IGF-2 수용체, AMPA 수용체 서브 유닛 GluA1, 가소성 관련 유전자 Arc/Arg3.1, 시냅스 농축 단백질 PSD95, pULK 및 모노카르복실레이트 수송체 MCT1, MCT4 및 MCT2의 수준은 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 dHC의 기본 조건 하에서 변경되지 않았다.
mPFC에서(도 3), 전체 단백질 추출물에서 성숙한 형태의 IGF-2의 현저한 증가와 pro-IGF-2의 현저한 감소와 함께, IGF-2 경로에 더욱 현저한 변화가 있었지만, 시냅토뉴로소말 부분(synaptoneurosomal fraction)은 정상 마우스에 비해 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 성숙한 형태의 IGF-2의 급격한 감소 및 pro-IGF-2(미성숙한 형태)의 감소에 대한 강한 추세를 보였다. IGF-2 수용체의 수준은 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 mPFC에서 영향을 받지 않았다. 또한, 시냅토뉴로소말 부분은 즉각적인 초기 가소성 관련 유전자인 Arc/Arg 3.1의 현저한 감소를 나타냈으며, GluA2에서도 상당한 감소가 있지만, GluA1에서는 그렇지 않았다. dHC와 마찬가지로, LDHB의 현저한 감소 수준과 GLUT3의 감소에 대한 강한 추세가 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 mPFC에서 발견되었다. 뉴런 억제 마커 GAD67의 수준은 mPFC에서 부분적으로 감소했지만, 아직 통계적으로 유의미한 값에 도달하지 않았다. 또한, pAMPK, PSD95, pULK 모노카르복실레이트 수송체 MCT1, MCT4 및 MCT2, 수준은 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 mPFC에서 변경되지 않았다.
실시예 2
이 실시예는, 만노오스-6-포스페이트(M6P)의 전신 투여가 엔젤만 증후군 마우스 모델에서 기억 결핍을 역전시키는 것을 입증한다. 우선, 정상 마우스의 기억 향상 효과에 대한 다양한 농도의 M6P를 시험했다. 결과를 도 4에 도시했다. IGF2R.L1이 M6P이다.
또한, 엔젤만 증후군 마우스 모델 (Ube3a-/+ 마우스, 엔젤만 증후군(AS) 마우스)에서 M6P의 전신 투여가 마우스의 기억 손상을 역전시키는 것을 발견했다 (도 5).
구체적으로, 비-회피적 에피소드 기억(non-aversive episodic memory)에 접근하기 위해 마우스의 새로운 물체 인식(nOR) 패러다임을 사용했다. 이 작업에서, 설치류의 새로움에 대한 타고난 선호도를 사용했다. 훈련 중에, 마우스는 2개의 동일한 물체를 탐색할 수 있다. 시험 당일, 훈련 물체들 중 중 하나를 새로운 물체로 대체한다. 마우스는 선천적으로 새로움을 선호하기 때문에, 마우스가 익숙한 물체를 인식하면, 새로운 물체에 더 많은 시간을 소모하게 될 것이다.
M6P의 피하 주사는 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 기억 손상을 연전시켰다. 도 5의 A에 도시된 바와 같이, nOR 훈련 4시간 후에 시험은, 대조군 용액(운반체)이 주사된 대조군(야생형 한배새끼, WT) 마우스는 강한 기억을 가지고 있었지만, 운반체 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 현저한 기억 손상을 보여, 이들의 확립된 기억 결핍을 확인했음을 밝혀냈다. 훈련 전에 M6P 주사는 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 기억 결핍을 역전시켰는데, 이는 실제로 대조군 야생형(WT) 마우스와 유사한 기억 유지 수준을 가졌다. 훈련 24 시간 후에 시험했을 때, 야생형(WT) 및 엔젤만 증후군(AS) 마우스 모두 상당한 기억 유지를 보인 반면, 야생형(WT) 및 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 잊었다 (도 5의 A).
앞서 나타낸 바와 같이, 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 3개의 팔의 Y-미로에서 자발적 교체 패러다임으로 측정된 탐색 전략/작업 기억에 결핍을 보였다. 운반체 주사와 비교하여 IGF-2R.L1 (M6P) 주사는 완전히 결핍을 역전시켰다 (도 5의 B).
또한, 엔젤만 증후군(AS)은 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 재현되는 운동 장애와 관련이 있다. 운동 문제를 평가하는데 사용되는 하나의 시험은 뒷다리 움켜쥠(hind limb clasping)이고, 이는 운동 신경의 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disease)을 포함하여 운동 신경이 손상된 마우스 모델에서 관측된다. 이 시험은 굴곡 반응(flexion response) 대신 꼬리에 의해 매달렸을 때 운동 장애가 있는 마우스에서 발을 움켜 쥐고 박쥐와 같은 자세를 취하는 것을 보여준다. 도 5의 C에 도시된 바와 같이, 운반체 주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 야생형(WT) 대조군 마우스에 비해 현저한 뒷다리 움켜쥠 반응을 보였다. 엔젤만 증후군(AS) 마우스에서 IGF-2R.L1 주사는 뒷다리 움켜쥠을 현저히 감소시켰고, 따라서 이들의 결핍을 되돌렸다.
실시예 3
변형된 M6P: IGF-2R.L2 (또는 L2)라고 하는 포스포네이트-M6P (PnM6P)를 시험했다. 도 6에 도시된 바와 같이, 850 μg/kg로 주사된 L2는 nOR에서 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 결핍을 현저히 역전시켰으며, 훈련 4시간 후에 야생형(WT) 마우스에서 nOR 기억 유지를 현저히 향상시켰다(도 6의 A). 훈련 24시간 후에, L2가 주사된 야생형(WT) 및 엔젤만 증후군(AS) 마우스 모두는 운반체-주사된 그룹에 비해 현저한 기억을 보였다. 훈련 5시간 후에 재시험(5일 시험) 시에, 어떤 그룹 (운반체 또는 L2 주사)도 현저한 기억을 보이지 않았지만, 야생형(WT) 대조군이 기억력 향상에 대한 강한 추세를 보였는데, 이는 그룹당 더 많은 수의 대상체가 포함될 수 있을 때 현저해질 수 있다.
또한, L2는 로타로드 시험(0034에 기재된)에 의해 나타낸 바와 같이 엔젤만 증후군(AS) 마우스의 운동 결핍을 역전시켰다. 운반체-주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 야생형(WT) 대조군 마우스에 비해 운동 능력의 현저한 결핍을 보였지만(도 6의 B), L2-주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 로타로드에서 이들의 운동 능력을 현저히 향상시켰으며, 실제로 낙하 지연 시간은 야생형(WT) 대조군 마우스와 유사한 수준으로 되돌렸다(도 6의 B).
L2 주사는 뒷다리 움켜쥠에 의해 측정되는 운동 결핍을 역전시켰다. 운반체-주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 운반체-주사된 대조군 마우스에 비해 뒷다리 움켜쥠 행태의 현저히 높은 점수를 보였지만, L2-주사된 엔젤만 증후군(AS) 마우스는 대조군 수준으로 이들의 뒷다리 움켜쥠 행태를 되돌렸다(도 6의 C).
실시예 4
이 실시예는 M6P 유도체의 합성 및 특성화를 기재한다.
일반적인 합성 절차
모든 반응들은 달리 언급되지 않으면 자석 교반기와 함께 질소 또는 아르곤의 정압(positive pressure) 하에서 화염-건조되거나 오븐-건조된 유리 제품에서 수행된다. 용매를 활성화 알루미나 컬럼을 통해 화염-건조된 유리 제품으로 통과시킴으로써 무수 디클로로메탄 (CH2Cl2), 디에틸 에테르 (Et2O), 1,4-디옥산, 테트라하이드로푸란 (THF), 톨루엔 (PhMe), 및 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)를 수득했다. 달리 기재되지 않으면 다른 용매 및 시약은 제조업체(Acros Organics, AK Scientific, Alfa Aesar, Chem-Impex International, Combi-Blocks, Sigma-Aldrich, Strem Chemicals, Synthonix, Tokyo Chemical Industry Co.)로부터 입수한 것을 사용했다. F254 형광 지시약(fluorescent indicator) (Millipore Sigma)으로 미리 코팅된 실리카겔 60 유리판을 사용하여 반응 모니터링을 위해 박막 크로마토그래피 (TLC)를 수행하고, 자외선 (λ= 254 nm) 차단 또는 수성 포타슘 퍼망가네이트 (KMnO4) 용액, 수성 산성 세릭암모늄 몰리브데이트 (IV) (CAM) 용액, 산성 에탄올성 p-아니스알데히드 용액(acidic ethanolic p-anisaldehyde solution), 또는 부탄올 닌하이드린 용액(butanolic ninhydrin solution)으로 염색 후 히트 건(heat gun)으로 부드럽게 가열함으로써 시각화했다. 플래시-컬럼 크로마토그래피를 유리 컬럼 또는 Teledyne Isco MPLC CombiFlash ® Rf+를 사용하여 실리카 겔(60 Å, 40-63 μm, Silicycle or Merck)을 사용하여 질소 압력 하에서 실온에서 수행했다. 양성자 핵자기 공명법 (1H NMR) 스펙트럼을 25 ℃에서 CryoProbe™가 구비된 Bruker Avance III HD 400 MHz 분광기 상에 기록하고, 테트라메틸실란(TMS, δ = 0 ppm)으로부터 다운 필드로의 ppm(parts per million, δ 스케일)으로 보고하고, NMR 용매의 잔여 프로튬 공명에 내부적으로 참조했다 (CDCl3: 7.26 [CHCl3], CD3OD: 4.87 [MeOH], D2O: 3.31 [H2O], C6D6: 7.16 [C6H6], (CD3)2SO: 2.50 [(CH3)2SO]). 양성자-탈결합된 탄소-13 핵 자기 공명 (13C{1H} NMR) 스펙트럼을 Bruker Avance III HD 400 MHz 분광기 상에 기록하고, 테트라메틸실란(TMS, δ = 0 ppm)으로부터 다운 필드로의 ppm(parts per million, δ 스케일)으로 보고하고, NMR 용매의 탄소-13 공명의 중앙선에 내부적으로 참조했다 (CDCl3: 77.36 [CHCl3], CD3OD: 49.00 [MeOH], (CD3)2SO: 39.52 [(CH3)2SO]). 양성자-탈결합된 인-31 핵 자기 공명 (31P{1H} NMR) 스펙트럼을 25 ℃에서 CryoProbe™이 구비된 Bruker Avance III HD 400 MHz 분광기 상에 기록하고, 인산(H3PO4, δ = 0)으로부터 다운 필드로의 ppm(parts per million, δ 스케일)으로 보고하고, 트리페닐 포스페이트 표준 용액에 내부적으로 참조했다(CDCl3 중 0.0485 M, δ = -17.7 ppm). 보고된 데이터를 ppm(δ 스케일)(적분(integration), 다중도(multiplicity), 결합 상수 J (Hz), 원자 할당(atom assignment))으로 화학적 이동으로 나타냈다. 다중도는, s, 싱글렛(singlet); d, 더블렛(doublet); t, 트리플렛(triplet); q, 쿼텟(quartet); 퀸트(quint), 퀸텟(quintet); 섹스트(sext), 섹스텟(sextet); 헵트(hept), 헵텟(heptet); br, 브로드(broad); m, 멀티플렛(multiplet); 또는 이들의 조합으로 축약된다. 대기압 화학 이온화(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 또는 전기 분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 방법과 조합하여 Agilent 6224 정확한-질량(Accurate-Mass) 비행 시간(time-of-flight, TOF) 액체-크로마토그래피 질량 분석기 (LC/MS)를 사용하여 고-분해능 질량 분석법(High-resolution mass spectrometry, HRMS)을 수행했다. 푸리에-변환 적외선 (FT-IR) 스펙트럼은 폴리스티렌 표준을 참조하는 Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR 분광계에서 기록했다. 신호는 w, 약함; m, 중간; s, 강함, br, 브로드함으로 축약되는 기술어와 함께 파수 (cm-1)의 흡수 주파수로 보고했다. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 정제는 8 mL/min의 유속 및 (A) 아세토니트릴 (HPLC 등급) 및 (B) 물 (HPLC 등급) 중 0.1% 포름산 (FA)의 용매 혼합물과 함께, 역상 (RP) Phenomenex Semipreparative 컬럼 (00D-4439-E0 Gemini, C18 상, 3 μm 입자 크기, 110 Å 기공 크기)이 있는 Agilent 1260 Infinity II LC 상에서 수행했다. 광학 회전 측정은 Flint Glass Faraday 셀 변조기, 나트륨 램프 광원 및 PMT (photomultiplier tube) 검출기가 구비된 Jasco P-2000 편광계에 기록했다. 비선광도(specific rotation)는 방정식 [α] = (100·α)/(l·c)를 기반으로 계산했고, 여기서 농도 c는 g/100 mL이고, 경로 길이 l은 데시미터이다. 계산된 비선광도는 단위가 없는 값으로 보고되며, 다음과 같이 표시된다: [α]D T 비선광도 (c 농도, 용매), 여기서 온도 T는 ℃이고, D는 나트륨 D-라인 모니터 파장 (589 nm)을 나타낸다.
화합물 합성 및 특성화
L2의 합성
메틸 6-
O
-트리페닐메틸-α-D-만노피라노사이드 (2)
트리틸 에테르(2)를 변형된 공개된 절차를 따라 제조했다 (Traboni et al., ChemistrySelect 2017, 2, 4906-4911; Tennant-Eyles et al., J. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 231-243). 메틸-α-D-만노피라노사이드 (5.02 g, 25.8 mmol, 1.0 당량) 및 트리틸 클로라이드 (7.91 g, 28.4 mmol, 1.1 당량)의 혼합물에 피리딘(5.2 mL, 64.6 mmol, 2.5 당량)을 첨가했다. 반응 혼합물을 100 ℃로 가열하고, 30분 동안 교반했다. 30분 후, 생성된 점성이 있는 페이스트를 40 ℃에서 초음파 처리에 의해 CH2Cl2에 용해시켰다. 용액을 포화 수성 암모늄 클로라이드로 세정하고 (2Х), 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 크루드한 잔여물(crude residue)을 플래시 컬럼 크로마토그래피(50% 내지 100% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제하여 백색 폼(foam)으로서 (2)를 수득했다(11.0 g, 25.2 mmol, 98%). NMR 스펙트럼을 문헌에 보고된 것과 매칭시켰다(Traboni et al., ChemistrySelect 2017, 2, 4906-4911; Tennant-Eyles et al., J. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 231-243). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.28 (15H, m), 4.72 (1H, d, J = 1.6 Hz), 3.92 (1H, m), 3.82 - 3.63 (3H, m), 3.50 - 3.39 (2H, m), 3.38 (3H, s), 2.73 (1H, m), 2.54 (1H, m), 2.27 (1H, m). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 143.9, 128.9, 128.3, 127.5, 100.9, 87.7, 72.0, 70.64, 70.59, 70.1, 65.2, 55.3.
메틸 2,3,4-트리-
O
-벤질-α-D-만노피라노사이드 (4)
벤질 에테르(3)을 변형된 공개된 절차에 따라 제조했다 (Hofmann et al., Carbohydr. Res. 2015, 412, 34-42). 트리틸 에테르(2)(2.01 g, 4.61 mmol)를 무수 DMF (115 mL)에 용해시키고, 0 ℃에서 이 용액에 NaH (미네랄 오일 중 60%, 14.8 g, 371 mmol, 7.2 당량)의 서스펜션을 부분적으로 첨가했다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 10분 동안 교반하고, 이 혼합물에 벤질 클로라이드(39.1 g, 309 mmol, 6.0 당량)를 천천히 첨가하고, 서스펜션을 0 ℃에서 5분 동안 교반한 후 실온으로 승온시키고, 16시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 물로 급냉하고, 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 유기층을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 점성이 있는 황색 오일로서 (3)을 수득했고, 이것을 다음 절차에서 바로 사용했다.
알콜(4)을 변형된 공개된 절차에 따라 제조했다 (Jaramillo et al., J. Org. Chem. 1994, 59, 3135-3141). 벤질 에테르(3)를 MeOH-CH2Cl2 (2:1, 6 mL)에 용해시키고, pH가 4 미만이 될 때까지 p-TsOH를 첨가했다. 반응 혼합물을 20시간 동안 실온에서 교반한 후, Et3N으로 중성화하여 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 CH2Cl2 용해시키고, 증류수 및 브라인으로 세정했다. 유기층을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 크루드한 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(30% 내지 60% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 밝은 황색 시럽으로서 알콜(4)을 수득했다(0.90 g, 1.94 mmol, 42%). NMR 스펙트럼을 문헌에 보고된 것과 매칭시켰다 (Norberg et al., Carbohydr. Res. 2017, 452, 35-42). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.41 - 7.30 (15H, m), 4.97 (1H, d, J = 10.9 Hz), 4.81 (1H, d, J = 12.3 Hz), 4.75 - 4.65 (5H, m), 3.99 (1H, app. t, J = 9.4 Hz), 3.92 (1H, dd, J = 9.4, 2.9 Hz), 3.90 - 3.84 (1H, m), 3.83 - 3.76 (2H, m), 3.68 - 3.62 (1H, m), 3.33 (3H, s), 2.00 (1H, app. t, J = 6.4 Hz). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 138.8, 138.7, 138.6, 128.70, 128.68, 128.67, 128.3, 128.1, 128.0, 127.9, 99.6, 80.5, 75.5, 75.2, 75.0, 73.2, 72.5, 72.4, 62.7, 55.1. HRMS (APCI/LC-TOF) m/z: C28H32O6 에 대한 [M + NH4]+ Calcd 482.2537; 측정값 482.2533.
메틸 2,3,4-트리-
O
-벤질-6-데옥시-6-디에톡시포스피닐메틸렌-α-D-만노피라노사이드(7)
알데히드(5)를 1차 알콜의 산화에 대한 일반적인 절차에 따라 제조했다 (Tojo et al., Oxidation of alcohols to aldehydes and ketones: a guide to current common practice. Springer Science & Business Media: 2006). (4)(0.334 g, 0.72 mmol, 0.4 M)의 용액을 질소 하에서 무수 DMSO (1.8 mL)에서 제조했다. 이 용액에 Et3N (1.0 mL, 7.2 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 반응 혼합물을 얼음물 욕에서 0 ℃로 냉각시키고, 교반했다. 이 용액에 0 ℃에서 DMSO (1 mL) 중에서 황 트리옥사이드-피리딘 착체 (0.347 g, 2.2 mmol, 3.0 당량)의 용액을 적하 첨가했다. 반응 혼합물을 실온으로 승온시키고, 20시간 동안 교반했다. 용액을 CH2Cl2로 희석하고, 증류수로 세정하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 황색 오일로서 (5)를 수득했다. 이 오일을 실리카의 플러그 상에서 여과하고, 다음 절차에서 바로 사용했다.
포스포네이트(7)를 변형된 공개된 절차에 따라 제조했다 (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450). 무수 톨루엔(2 mL) 중에서 NaH (미네랄 오일 중 60%, 37.8 mg, 0.945 mmol, 2.2 당량)의 서스펜션에, 테트라에틸 메틸렌디포스포네이트 (0.27 mL, 1.08 mmol, 2.5 당량)를 적하 첨가하고, 실온에서 30분 교반했다. 무수 톨루엔(5 mL) 중 (5)의 용액을 질소 하에서 이 혼합물에 적하 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 교반했다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고, 증류수로 급냉시켰다. 유기층을 CH2Cl2 (3Х)로 추출하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 크루드한 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(40% 내지 100% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 무색 시럽으로서 (7)을 수득했다(162 mg, 0.272 mmol, 62%). NMR 스펙트럼을 문헌에 보고된 것과 매칭시켰다 (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450). [α]D 20 = +40.4 (c = 1.01, CHCl3). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.39 - 7.27 (15H, m), 6.96 (1H, ddd, J = 22.1, 17.2, 4.3 Hz), 6.12 (1H, ddd, J = 21.2, 17.5, 1.8 Hz), 4.88 및 4.59 (2H, AMq, J = 10.6 Hz), 4.77 및 4.70 (2H, ABq, J = 12.4 Hz), 4.73 (1H, s), 4.63 (2H, s), 4.14 - 4.03 (5H, m), 3.90 (1H, dd, J = 9.3, 3.0 Hz), 3.81 - 3.77 (1H, m), 3.72 (1H, t, J = 9.5 Hz), 3.29 (3H, s), 1.31 (6H, t, J = 7.1 Hz). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 148.4 (d, J = 5.8 Hz), 138.7, 138.5, 138.3, 128.7, 128.4, 128.14, 128.05, 127.9, 118.3 (d, J = 188.2 Hz), 99.6, 80.4, 78.5 (d, J = 1.9 Hz), 75.7, 75.0, 73.2, 72.7, 71.5 (d, J = 21.5 Hz), 62.1 (dd, J = 5.8, 1.3 Hz), 55.3, 16.7. 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 18.3. FT-IR (neat, cm-1): υ(C-H) = 2982 (m), υ(P=O) = 1253 (s), υ(P-O-C) = 1024 (s), υ(P-O-C) = 969 (m).
메틸 2,3,4-트리-
O
-벤질-6-데옥시-6-디이소프로필옥시카르보닐옥시-메틸-포스피닐메틸렌-α-D-만노피라노사이드 (10)
포스폰산(8)을 공개된 절차에 따라 제조했다 (Vidil et al., Eur. J. Org. Chem. 1999, 447-450). 질소 하에서 무수 CH3CN (5.6 mL) 중 (7) (0.146 g, 0.245 mmol, 1 당량)의 용액에 실온에서 교반하면서 피리딘 (31 μL, 0.392 mmol, 1.6 당량) 및 트리메틸실릴 브로마이드 (0.32 mL, 2.45 mmol, 10 당량)를 첨가했다. 2시간 후, 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 피리딘 (51 μL, 0.634 mmol, 2.6 당량) 및 H2O (185 μL, 10.3 mmol, 42 당량)을 첨가한 후 실온으로 승온시키고 교반했다. 2시간 후, 반응 혼합물을 CH2Cl2 및 2 M HCl (4 mL) 및 H2O (4 mL)로 희석했다. 유기층을 CH2Cl2로 추출하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 갈색 오일로서 (8)을 수득했다. 크루드한 잔여물을 다음 절차에 바로 사용했다.
포스포네이트(10)를 변형된 절차에 따라 제조했다 (Graham et al., (2017). 국제 특허 출원 공개 번호 WO2017/87256). 질소 하에서 무수 CH3CN 중에서 (8)의 혼합물을 DIPEA (0.480 mL, 2.76 mmol, 9.9 당량), TBAB (93.1 mg, 0.289 mmol, 1.0 당량), 및 클로로메틸 이소프로필 카보네이트 (0.30 mL, 2.24 mmol, 8.1 당량)로 처리한 후, 60 ℃로 가열시켰다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 크루드한 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(30% 내지 100% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여, 무색 오일로서 (10)을 수득했다(116 mg, 0.150 mmol, 54%). TLC (EtOH/EtOAc/헥산 1.5:1.5:7): R f = 0.49. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.40 - 7.29 (15H, m), 7.10 (1H, ddd, J = 24.5, 17.2, 3.8 Hz), 6.40 - 6.17 (1H, m), 5.80 - 5.65 (6H, m), 4.81 - 4.59 (7H, m), 4.22 - 4.14 (1H, m), 3.91 (1H, dd, J = 9.3, 3.1 Hz), 3.83 - 3.78 (1H, m), 3.74 (1H, t, J = 9.5 Hz), 3.30 (3H, s), 1.32 - 1.29 (12H, m). 13C NMR (CDCl3, 101 MHz) δ 153.5, 138.7, 138.5, 138.3, 128.8, 128.7, 128.6, 128.2, 128.1, 127.9, 99.7, 84.5 (d, J = 5.7 Hz), 84.4 (d, J = 6.8 Hz), 80.5, 78.3 (d, J = 2.1 Hz), 75.8, 75.0, 73.5 (d, J = 3.5 Hz), 73.3, 72.7, 71.3 (d, J = 22.3 Hz), 55.3. 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 26.3.
메틸 3-데옥시-6-디이소프로필옥시카르보닐옥시-메틸-포스피닐메틸-α-D-만노피라노사이드 (L2)
(L2)의 합성의 마지막 단계를 공개된 수소화 절차에 따라 수행했다 (Jeanjean et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 6240-6243). 오븐-건조된 바이알에서, (10) (36.0 mg, 0.047, 1 당량)을 건조시키고 고진공 하에서 탈기시켰다. 여기에 10% Pd/C (36.6 mg, 0.344 mmol, 7.4 당량)를 첨가하고 CH2Cl2 (2 mL) 및 EtOH (2 mL)로 헹구었다. 반응 혼합물을 1분 동안 N2로 표면 아래에 살포했다. 그 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 탈기하고, 분위기를 H2 (5Х)로 교체했다. 반응 혼합물을 4시간 동안 H2 하에서 격렬하게 교반하고, 그 후 반응 혼합물을 감압 하에서 탈기하고, N2 (5Х)로 재충전시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (2 mL)로 희석하고, 젖은 셀라이트의 플러그 상에서 여과시켰다. 여과된 유기층을 감압 하에서 농축시키고, 크루드한 잔여물을 HPLC (40% 내지 85% [H2O + 0.1% FA]:[CH3CN + 0.1% FA], t R(L2) = 7.00분)로 정제하여 백색 고형물로서 (L2) (10.1 mg, 0.020 mmol, 43%)를 수득했다. 모든 13C-31P 결합 상수는 값들의 표준 범위 내였다 (Buchanan et al., Can. J. Chem. 1976, 54, 231-237). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.68 (2H, dd, J = 20.5 Hz, J = 5.3 Hz, H8), 5.65 (2H, dd, J = 18.3 Hz, J = 5.4 Hz, H8'), 4.93 (2H, hept, J = 6.3 Hz, H10) , 4.68 (1H, s, H1), 3.95 - 3.86 (1H, br, H5), 3.74 (1H, m, H2), 3.58 (2H, m, H3, H4), 3.35 (3H, s, OCH 3 ), 3.22 - 3.07 (1H, m, OH), 2.95 (2H, m, 2 Х OH), 2.27 - 2.07 (2H, m), 2.06 - 1.86 (2H, m, H6, H6', H7, H7'), 1.32 (12H, d, J = 6.2 Hz, H11). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 153.6 (d, J = 3.7 Hz, C9), 101.2 (s, C1), 84.5 (d, J = 6.3 Hz, C8), 84.3 (d, J = 6.3 Hz, C8'), 73.7 (d, J = 3.2 Hz, C10), 72.0 (s, C2), 70.9 (d, J = 16.1 Hz, C5), 70.6 (s), 70.5 (s, C3, C4), 55.3 (s, OCH3), 23.8 (d, J = 4.5 Hz, C6), 22.4 (s, C11), 21.7 (d, J = 142.3 Hz, C7). 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ 34.4. FT-IR (neat, cm-1): υ(O-H) = 3409 (br), υ(C-H) = 2923 (m), υ(C=O) = 1760 (s), υ(P=O) = 1269 (s). [M + HCOO]-에 대한 LR-MS (ESI-) calcd: 549.2; 측정값: 549.2.
본 발명은 예시적인 양태를 통해 기재되었으나, 통상적인 변형은 당업자에게 명백할 것이고, 이러한 변형은 본 개시 내용의 범위 내인 것으로 의도된다.
Claims (13)
- 엔젤만 증후군(Angelman Syndrome, AS) 및 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder, ASD)로 이루어진 군에서 선택되는 신경 발달 장애(neurodevelopmental disorder, ND)의 치료 방법으로서,
상기 방법은, 신경 발달 장애(ND)로 진단된 대상체에 IGF-2 수용체에 대한 특정한 작용제 리간드(agonist ligand)의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 치료는 발달 이정표(developmental milestones), 언어 능력(speech), 지능 능력(intellectual ability), 운동(movement), 사회적 행동(social behavior) 및 간질(epilepsy) 중 하나 이상을 완화시키는 것을 포함하는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 작용제 리간드는 IGF-2 또는 이의 변형물(modification)인 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 작용제 리간드는 만노오스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate, M6P) 또는 이의 유도체인 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 만노오스-6-포스페이트(M6P)의 유도체는 하기 화학식으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법:
,
및
.
- 제4항에 있어서,
상기 만노오스-6-포스페이트(M6P) 또는 이의 유도체는 1 내지 2,000 μg/kg 체중의 범위 내의 양으로 투여되는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 만노오스-6-포스페이트(M6P) 또는 이의 유도체는 다른 모이어티와 컨쥬게이트되지 않는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 만노오스-6-포스페이트(M6P) 또는 이의 유도체는 IGF-2 수용체에 특이적으로 결합하는 조성물 내 유일한 제제인 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 IGF-2는 1 내지 500 μg/kg 체중의 범위 내의 양으로 투여되는 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 IGF-2는 IGF-2 수용체에 특이적으로 결합하는 조성물 내 유일한 제제인 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은, i) 만노오스-6-포스페이트(M6P) 또는 만노오스-6-포스페이트(M6P) 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 리간드, 및 ii) IGF-2로 필수적으로 이루어진 것인, 신경 발달 장애의 치료 방법.
- L3, L4, L5, L6, L7, L8, 및 L9로 이루어진 군에서 선택되는 화합물.
- 제12항의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
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