BR112021002096A2 - uso de anticorpos tim-3 na preparação de medicamentos para o tratamento de tumores - Google Patents

Abstract

“uso de anticorpos tim-3 na preparação de medicamentos para o tratamento de tumores”. a presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo tim-3 na preparação de medicamentos para o tratamento de tumores. especificamente, é fornecido o uso do anticorpo tim-3 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo na preparação de medicamentos para o tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas, o anticorpo tim-3 contendo uma região variável de cadeia pesada mostrada na seq id: 33 e uma região variável de cadeia leve mostrada na seq id no: 36. além disso, é também fornecido o uso do anticorpo tim-3 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo e de um anticorpo pd-1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo na preparação conjunta de medicamentos para o tratamento de tumores.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “USO DE ANTICORPOS TIM-3 NA PREPARAÇÃO DE MEDICAMENTOS PA- RA O TRATAMENTO DE TUMORES”.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo TIM- 3 na preparação de medicamentos para o tratamento de tumores.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A molécula contendo o domínio de mucina e imunoglobuli- na de células T 3 (TIM-3), também referida como o receptor celular 2 do vírus da hepatite A (HAVCR-2), é a proteína de superfície de mem- brana tipo I, um membro da família TIM. A molécula TIM-3 humana é composta por 301 aminoácidos, incluindo peptídeo sinal, região variá- vel Ig (região IgV), região mucina rica em Ser/Thr, região transmem- brana e região citoplasmática; a TIM-3 humana compartilha 63% de homologia com a TIM-3 murina.

[0003] A TIM-3 pode regular a função do sistema imune de muitas maneiras. Ela pode se ligar ao ligante Gal-9 na superfície das células Th1 para regular negativamente a resposta da célula Th1 e induzir a apoptose da célula Th1. Ela desempenha um papel importante nas doenças autoimunes e alogênicas (como o lúpus eritematoso sistêmi- co, asma) e na tolerância imunológica.

[0004] Além disso, a TIM-3 não é apenas expressa em células imunes, mas também sobre-expressa em células tumorais, como o câncer de ovário, meningioma e melanoma, e promove diretamente o crescimento do tumor. A regulação negativa da expressão da TIM-3 pode inibir significativamente a invasão e a metástase das células He- La. A sobre-expressão da TIM-3 está intimamente relacionada com o mau prognóstico do câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de próstata e câncer do colo do útero. Em tumores hematológicos, a TIM- 3 é sobre-expressa nas células-tronco leucêmicas da leucemia mieloi-

de aguda e nas células-tronco hematopoiéticas de pacientes com MDS, e as células-tronco hematopoiéticas TIM-3+ têm características biológicas malignas, como baixa diferenciação, baixa apoptose e ele- vada proliferação. Assim, espera-se que a inibição da atividade da TIM-3 (como o anticorpo TIM-3) para melhorar a função do sistema imune inato se torne um novo método para o tratamento de tumores (consulte, por exemplo, Ngiow et al., Cancer Res., 71 (21): 1-5 (2011); Guo et a1., Journal of Translational Medicine, 11: 215 (2013); e Ngiow et al., Cancer Res., 71(21): 6567-6571 (2011)).

[0005] Atualmente, os anticorpos TIM-3 foram relatados em vários pedidos de patente, como os Documentos WO2011159877, WO2013006490, WO2015117002, WO2016144803, WO2016161270, US20150218274.

[0006] O Documento WO2018153366 (data de depósito 26 de fe- vereiro de 2018) descreve um novo anticorpo TIM-3 com alta ativida- de, excelente afinidade e estabilidade.

[0007] Como representante da imunoterapia tumoral, o efeito do anticorpo PD-1 é óbvio. Os dados clínicos provaram que o anticorpo PD-1 pode aumentar a taxa de sobrevivência de 5 anos de 17% para 34% para pacientes com tumores malignos e de 4% para 16% para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. No entan- to, nem todos os pacientes podem se beneficiar do anticorpo PD-1, ou o anticorpo PD-1 não funciona ou apenas mantém um efeito de curto prazo.

[0008] Foi reportado na Revista Nature Communication (fevereiro de 2016) que uma das razões da resistência aos anticorpos da PD-1 é que os tumores desenvolveram uma nova via de escape imunológico, o TIM-3. No estudo, foram utilizados modelos de camundongos com câncer de pulmão mutante EGFR (T790M/L858) e KRAS (G12D) para a construção de modelos de camundongos resistentes ao anti-PD-1,

respectivamente. Os pesquisadores analisaram em primeiro lugar a alteração do número de células T nos tumores do camundongo antes do tratamento e após a resistência ao tratamento anti-PD-1; e, em se- guida, analisaram especificamente a relação entre a expressão positi- va do TIM-3 e a resistência ao tratamento anti-PD-1; e verificaram que a expressão positiva do TIM-3 é significativamente dependente do tempo da duração do tratamento anti-PD-1, a expressão positiva do TIM-3 é baixa antes do tratamento e durante o período sensível ao tra- tamento, enquanto a expressão positiva do TIM-3 aumenta significati- vamente após o desenvolvimento da resistência aos medicamentos. A expressão positiva do TIM-3 também está significativamente relacio- nada ao grau de ligação do anticorpo PD-1 nas células T. Quanto mai- or o grau de ligação das células T ao anticorpo PD-1, mais forte é a expressão positiva do TIM-3. Em resumo, a falha da terapia anti-PD-1 está relacionada à regulação positiva da expressão do TIM-3. Esta molécula promove a fuga imunológica de forma semelhante ao PD- 1/L1, inibindo a função das células T e promovendo a falha das células T (Nature, volume 545, páginas 60 a 65). Além disso, dois anticorpos TIM-3 combinados com PD-1 para o tratamento de tumores malignos ou tumores sólidos avançados estão na fase de pesquisa clínica (NCT02608268 e NCT02817637). Por este motivo, o desenvolvimento de um novo anticorpo TIM-3 administrado isoladamente ou em combi- nação com o PD-1 para o tratamento de tumores tem atraído interesse suficiente por parte dos pesquisadores farmacêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente descrição proporciona o uso de um anticorpo TIM-3 na preparação de um medicamento para o tratamento de tumo- res.

[0010] Em algumas formas de realização, o anticorpo TIM-3 ou o seu fragmento de ligação a antígeno inclui uma ou mais sequências da região CDR selecionadas do grupo que consiste em: sequências de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos HCDR: conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência; e sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos LCDR: conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência.

[0011] Em algumas formas de realização, as sequências de CDR nas cadeias leve e pesada do anticorpo TIM-3 são mostradas na tabe- la a seguir:

DYYMA RASDNIYSYLA HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 17

NINYDGSSTYYLDSLKS NAKTLAE HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 18

DVGYYGGNYGFAY QQHYGSPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 19

[0012] Em algumas formas de realização, o anticorpo TIM-3 ou o seu fragmento de ligação a antígeno inclui uma ou mais sequências da região CDR selecionadas do grupo que consiste em: sequências de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpos HCDR: conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 8, 43 e 10, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência; e sequências de regiões variáveis de cadeia leve de anti- corpos LCDR: conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência, em que a SEQ ID NO: 43 é mostrada na sequência do DIIPX1X2X3GSKYNQKFKD: em que X1 é selecionado a partir de N, L, V, M ou E, X2 é seleci- onado a partir de N, E, M, H, K, L, A ou V, e X3 é selecionado a partir de G ou A.

[0013] Em outras formas de realização, as sequências de CDR nas cadeias leve e pesada do anticorpo TIM-3 são mostradas na tabe- la a seguir: Cadeia pesada Cadeia leve

DYYMN LASQPIGIWLA HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 11

DIIPNNGGSKYNQKFKD AATSLAD HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 12

WGYGSSYRWFDY QQLYSSPWT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 13

[0014] De preferência, em algumas formas de realização, o anti- corpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo composto por anticorpo murino, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno.

[0015] Em algumas formas de realização, a(s) sequência(s) da re- gião FR da cadeia leve e da cadeia pesada da(s) região(ões) variá- vel(eis) da cadeia leve e da cadeia pesada do anticorpo humanizado é(são) derivada(s), respectivamente, da cadeia pesada e da cadeia leve da linhagem germinativa humana ou da(s) sua(s) sequência(s) mutante(s).

[0016] Além disso, em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado inclui a região variável da cadeia pesada, conforme mos- trado na SEQ ID NO: 31 ou sua variante, e, de preferência, a variante inclui de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada com a região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 31, mais preferivelmente, as alternâncias de aminoácidos são as re- tromutações de aminoácidos Q3K e R87K; e o anticorpo humanizado inclui a região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 32 ou sua variante, e, de preferência, a variante inclui de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada à região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 32, de preferência, a alternância de aminoácidos é selecionada a partir do grupo constituído pelas retromutações de aminoácidos Q3K e I48V, K45Q, A43S e T85S.

[0017] As sequências da região variável das cadeias leve e pesa- da de anticorpos humanizados descritas acima são as seguintes: sequência da região variável da cadeia pesada, SEQ ID NO: 31 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; sequência da região variável da cadeia leve, SEQ ID NO: 32 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK.

[0018] Nota: A disposição é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4, o itálico na sequência representa as sequências FR, e o subli- nhado representa as sequências CDR.

[0019] Em algumas formas de realização, as sequências das regi- ões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo TIM-3 humani- zado são as seguintes: sequência da região variável da cadeia pesada SEQ ID NO: 33 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; sequência da região variável da cadeia leve SEQ ID NO: 36. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK.

[0020] Em algumas formas de realização, o anticorpo humanizado inclui a região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 20 ou sua variante, e, de preferência, a variante inclui de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada com a região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 20, mais prefe- rivelmente, as alternâncias de aminoácidos são as retromutações de aminoácidos D89E, R98T, G49A, M48I, M70L, R38K e V68A; e o anti- corpo humanizado inclui a região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 21 ou sua variante, e, de preferência, a vari- ante inclui de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada à região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 21, mais preferivelmente, a alternância de aminoácidos é a retromuta- ção de aminoácido A43S.

[0021] As sequências das regiões variáveis das cadeias leve e pe- sada do anticorpo humanizado descritas acima são as seguintes: sequência da região variável da cadeia pesada SEQ ID NO: 20 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; sequência da região variável da cadeia leve SEQ ID NO: 21 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.

[0022] Nota: A disposição é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4, o itálico na sequência representa as sequências FR, e o subli- nhado representa as sequências CDR.

[0023] Em algumas formas de realização, as sequências das regi- ões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo TIM-3 humani- zado são as seguintes: sequência da região variável da cadeia pesada SEQ ID NO: 51 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWMGDIIPNLGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; sequência da região variável da cadeia leve SEQ ID NO: 29

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.

[0024] De preferência, o anticorpo TIM-3 é um anticorpo de com- primento total, composto ainda por uma oi mais regiões constantes de anticorpos humanos, de preferência incluindo a sequência da região constante da cadeia pesada humana, conforme mostrado na SEQ ID NO: 41 e, de preferência, a região constante da cadeia leve humana, conforme mostrado na SEQ ID NO: 42.

[0025] A sequência de região constante de cadeia pesada é con- forme se mostra na SEQ ID NO: 41. ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL- GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS- LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR- LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;

[0026] A sequência de região constante de cadeia leve é como se mostra na SEQ ID NO: 42. RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW- KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

[0027] Em algumas formas de realização, o fragmento de ligação a antígeno do anticorpo TIM-3 é selecionado a partir do grupo composto por Fab, Fab’, F(ab’)2, anticorpo de cadeia única (scFv), região V di- merizada (diacorpo), região V estabilizada com ligação dissulfeto (dsFV) e fragmento de ligação a antígeno de peptídeos contendo CDRs.

[0028] Em outro aspecto, o anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno descrito no uso de acordo com a presente descri- ção é administrado em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno.

[0029] O anticorpo anti-PD-1 é conhecido e pode ser selecionado a partir de, mas não se limita a: AMP-224, GLS-010, IBI-308, REGN- 2810, PDR-001, BGB-A317, Pidilizumabe, PF-06801591, Genolimzu- mabe, CA-170, MEDI-0680, JS-001, TSR-042, Camrelizumabe, Pem- brolizumabe, LZM-009, AK-103 e Nivolumabe.

[0030] De preferência, a região variável da cadeia leve do anticor- po PD-1 é composta por LCDR1, LCDR2 e LCDR3, conforme mostra- do na SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78, respetiva- mente; a região variável da cadeia pesada do anticorpo anti-PD-1 é composta por HCDR1, HCDR2 e HCDR3, conforme mostrado na SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 e SEQ ID NO: 75, respectivamente.

[0031] Em outras formas de realização, cada sequência de CDR do anticorpo anti-PD-1 é mostrada na tabela a seguir: Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 SYMMS SEQ ID NO: 73 HCDR2 TISGGGANTYYPDSVKG SEQ ID NO: 74 HCDR3 QLYYFDY SEQ ID NO: 75 LCDR1 LASQTIGTWLT SEQ ID NO: 76 LCDR2 TATSLAD SEQ ID NO: 77 LCDR3 QQVYSIPWT SEQ ID NO: 78

[0032] De preferência, o anticorpo anti-PD-1 é um anticorpo hu- manizado ou fragmento do mesmo.

[0033] Em uma forma de realização alternativa, o fragmento de li- gação a antígeno do anticorpo anti-PD-1 na presente descrição é o fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo constituído pelos fragmentos Fab, Fab’-SH, Fv, scFv e (Fab’) 2.

[0034] A imunoglobulina pode ser derivada de qualquer isotipo comumente conhecido, incluindo, mas não limitado a IgA, IgA secreta-

da, IgG e IgM. As subclasses de IgG também são bem conhecidas pa- ra as pessoas qualificadas na arte, incluindo, mas não se limitando a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. “Isotipo” se refere à classe AB ou subclasse (por exemplo, IgM ou IgG1) codificada pelo gene de região constante de cadeia pesada. Em algumas formas de realização alternativas, o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno na presen- te descrição inclui uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano, e, de preferência, inclui uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada do isotipo IgG1 ou IgG4.

[0035] Em outras formas de realização alternativas, o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno inclui uma ou mais regiões constantes de cadeia leve kappa ou lambda.

[0036] Além disso, de preferência, a sequência da região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado é a sequência mostrada na SEQ ID NO: 82 ou sua variante, e, de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia leve, mais preferencialmente, a alternância de aminoácidos é a A43S; e a sequência da região variável da cadeia pesada do anticorpo humani- zado é como indicada na SEQ ID NO: 81 ou sua variante, e, de prefe- rência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia pesada, mais preferivelmente, a alternância de ami- noácidos é a G44R.

[0037] Em algumas formas de realização, as sequências das regi- ões variáveis das cadeias leve e pesada do anticorpo anti-PD-1 huma- nizado são as seguintes: região variável da cadeia pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVR- QAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNS-

LYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 81; região variável da cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQK- PGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS-

LQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 82.

[0038] De preferência, a sequência de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 humanizado é a sequência mostrada na SEQ ID NO: 80 ou sua variante; de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia leve, mais preferencialmen- te, a alternância de aminoácidos é a A43S; a sequência da cadeia pe- sada do anticorpo humanizado é como mostrada na SEQ ID NO: 79 ou sua variante, de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia pesada, mais preferivelmen- te, a alternância de aminoácidos é a G44R.

[0039] Em outra forma de realização, a sequência de cadeia leve do anticorpo anti-PD-1 humanizado é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 80, e a sequência de cadeia pesada é a sequência como mostrada na SEQ ID NO: 79: cadeia pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVR- QAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKG- PSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNT- KVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 79; cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQK- PGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS- DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE- QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR-

GEC SEQ ID NO: 80

[0040] O anticorpo anti-PD-1 combinado com o anticorpo TIM-3 descrito na presente descrição apresenta um efeito sinérgico farma- cêutico na preparação do medicamento para o tratamento de tumores.

[0041] Dependendo do tipo e da gravidade da doença, a dose de administração em indivíduos humanos do anticorpo TIM-3 ou do seu fragmento de ligação a antígeno aqui descrito (administrada de acordo com o peso do paciente) é de 0,1 a 10,0 mg/kg; podendo ser de 0,1 mg/kg; 0,2 mg/kg; 0,3 mg/kg; 0,4 mg/kg; 0,5 mg/kg; 0,6 mg/kg; 0,7 mg/kg; 0,8 mg/kg; 0,9 mg/kg; 1,0 mg/kg; 1,2 mg/kg; 1,4 mg/kg; 1,6 mg/kg; 1,8 mg/kg; 2,0 mg/kg; 2,2 mg/kg; 2,4 mg/kg; 2,6 mg/kg; 2,8 mg/kg; 3,0 mg/kg; 3,2 mg/kg; 3,4 mg/kg; 3,6 mg/kg; 3,8 mg/kg; 4,0 mg/kg; 4,2 mg/kg; 4,4 mg/kg; 4,6 mg/kg; 4,8 mg/kg; 5,0 mg/kg; 5,2 mg/kg; 5,4 mg/kg; 5,6 mg/kg; 5,8 mg/kg; 6,0 mg/kg; 6,2 mg/kg; 6,4 mg/kg; 6,6 mg/kg; 6,8 mg/kg; 7,0 mg/kg; 7,2 mg/kg; 7,4 mg/kg; 7,6 mg/kg; 7,8 mg/kg; 8,0 mg/kg; 8,2 mg/kg; 8,4 mg/kg; 8,6 mg/kg; 8,8 mg/kg; 9,0 mg/kg; 9,2 mg/kg; 9,4 mg/kg; 9,6 mg/kg; 9,8 mg/kg; 10,0 mg/kg.

[0042] Em uma forma de realização alternativa, a dose administra- da em indivíduos humanos do anticorpo TIM-3 ou do seu fragmento de ligação a antígeno (administrada de acordo com o peso do paciente) é de 1 mg a 1000 mg; podendo ser de 1,0 mg; 1,2 mg; 1,4 mg; 1,6 mg; 1,8 mg; 2,0 mg; 2,2 mg; 2,4 mg; 2,6 mg; 2,8 mg; 3,0 mg; 3,2 mg; 3,4 mg; 3,6 mg; 3,8 mg; 4,0 mg; 4,2 mg; 4,4 mg; 4,6 mg; 4,8 mg; 5,0 mg; 5,2 mg; 5,4 mg; 5,6 mg; 5,8 mg; 6,0 mg; 6,2 mg; 6,4 mg; 6,6 mg; 6,8 mg; 7,0 mg; 7,2 mg; 7,4 mg; 7,6 mg; 7,8 mg; 8,0 mg; 8,2 mg; 8,4 mg; 8,6 mg; 8,8 mg; 9,0 mg; 9,2 mg; 9,4 mg; 9,6 mg; 9,8 mg; 10,0 mg; 15 mg; 20 mg; 25 mg; 30 mg; 35 mg; 40 mg; 45 mg; 50 mg; 55 mg; 60 mg; 65 mg; 70 mg; 75 mg; 80 mg; 85 mg; 90 mg; 95 mg; 100 mg; 105 mg; 110 mg; 115 mg; 120 mg; 125 mg; 130 mg; 135 mg; 140 mg; 145 mg; 150 mg; 155 mg; 160 mg; 165 mg; 170 mg; 175 mg; 180 mg; 185 mg; 190 mg; 195 mg; 200 mg; 205 mg; 210 mg; 215 mg; 220 mg; 225 mg; 230 mg; 235 mg; 240 mg; 245 mg; 250 mg; 255 mg; 260 mg; 265 mg; 270 mg; 275 mg; 280 mg; 285 mg; 290 mg; 295 mg; 300 mg; 305 mg; 310 mg; 315 mg; 320 mg; 325 mg; 330 mg; 335 mg; 340 mg; 345 mg; 350 mg; 355 mg; 360 mg; 365 mg; 370 mg; 375 mg; 380 mg; 385 mg; 390 mg; 395 mg; 400 mg; 405 mg; 410 mg; 415 mg; 420 mg; 425 mg; 430 mg; 435 mg; 440 mg; 445 mg; 450 mg; 455 mg; 460 mg; 465 mg; 470 mg; 475 mg; 480 mg; 485 mg; 490 mg; 495 mg; 500 mg; 505 mg; 510 mg; 515 mg; 520 mg; 525 mg; 530 mg; 535 mg; 540 mg; 545 mg; 550 mg; 555 mg; 560 mg; 565 mg; 570 mg; 575 mg; 580 mg; 585 mg; 590 mg; 595 mg; 600 mg; 605 mg; 610 mg; 615 mg; 620 mg; 625 mg; 630 mg; 635 mg; 640 mg; 645 mg; 650 mg; 655 mg; 660 mg; 665 mg; 670 mg; 675 mg; 680 mg; 685 mg; 690 mg; 695 mg; 700 mg; 705 mg; 710 mg; 715 mg; 720 mg; 725 mg; 730 mg; 735 mg; 740 mg; 745 mg; 750 mg; 755 mg; 760 mg; 765 mg; 770 mg; 775 mg; 780 mg; 785 mg; 790 mg; 795 mg; 800 mg; 805 mg; 810 mg; 815 mg; 820 mg; 825 mg; 830 mg; 835 mg; 840 mg; 845 mg; 850 mg; 855 mg; 860 mg; 865 mg; 870 mg; 875 mg; 880 mg; 885 mg; 890 mg; 895 mg; 900 mg; 905 mg; 910 mg; 915 mg; 920 mg; 925 mg; 930 mg; 935 mg; 940 mg; 945 mg; 950 mg; 955 mg; 960 mg; 965 mg; 970 mg; 975 mg; 980 mg; 985 mg; 990 mg; 995 mg; 1000 mg; preferivelmente de 50 a 600 mg; mais preferivelmente de 200 mg.

[0043] A frequência de administração irá variar de acordo com o tipo e a gravidade da doença. Em algumas formas de realização, a frequência de administração do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno descrito na presente descrição é uma vez por se- mana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada seis semanas ou uma vez a cada oito semanas.

[0044] Em uma forma de realização alternativa, o anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno descrito na presente descrição é administrado em um ser humano a uma dose de 50 a 600 mg/uma vez a cada 2-3 semanas. No entanto, outras doses podem ser úteis, de preferência, 200 mg/uma vez a cada 2-3 semanas.

[0045] A dose de administração em um indivíduo humano do anti- corpo anti-PD-1 ou do seu fragmento de ligação a antígeno aqui des- crito é de 0,1 a 10,0 mg/kg; podendo ser de 0,1 mg/kg; 0,2 mg/kg; 0,3 mg/kg ; 0,4 mg/kg; 0,5 mg/kg; 0,6 mg/kg; 0,7 mg/kg; 0,8 mg/kg; 0,9 mg/kg; 1,0 mg/kg; 1,2 mg/kg; 1,4 mg/kg; 1,6 mg/kg ; 1,8 mg/kg; 2,0 mg/kg; 2,2 mg/kg; 2,4 mg/kg; 2,6 mg/kg; 2,8 mg/kg; 3,0 mg/kg; 3,2 mg/kg; 3,4 mg/kg; 3,6 mg/kg; 3,8 mg/kg; 4,0 mg/kg; 4,2 mg/kg; 4,4 mg/kg; 4,6 mg/kg; 4,8 mg/kg; 5,0 mg/kg; 5,2 mg/kg; 5,4 mg/kg; 5,6 mg/kg; 5,8 mg/kg; 6,0 mg/kg; 6,2 mg/kg; 6,4 mg/kg; 6,6 mg/kg; 6,8 mg/kg; 7,0 mg/kg; 7,2 mg/kg; 7,4 mg/kg; 7,6 mg/kg; 7,8 mg/kg; 8,0 mg/kg; 8,2 mg/kg; 8,4 mg/kg; 8,6 mg/kg; 8,8 mg/kg; 9,0 mg/kg; 9,2 mg/kg; 9,4 mg/kg; 9,6 mg/kg; 9,8 mg/kg; 10,0 mg/kg.

[0046] Em uma forma de realização alternativa, a dose de adminis- tração em um indivíduo humano do anticorpo PD-1 ou do seu fragmen- to de ligação a antígeno é de 1 mg a 1000 mg; podendo ser de 1,0 mg; 1,2 mg; 1,4 mg; 1,6 mg; 1,8 mg; 2,0 mg; 2,2 mg; 2,4 mg; 2,6 mg;

2,8 mg; 3,0 mg; 3,2 mg; 3,4 mg; 3,6 mg; 3,8 mg; 4,0 mg; 4,2 mg; 4,4 mg; 4,6 mg; 4,8 mg; 5,0 mg; 5,2 mg; 5,4 mg; 5,6 mg; 5,8 mg; 6,0 mg; 6,2 mg; 6,4 mg; 6,6 mg; 6,8 mg; 7,0 mg; 7,2 mg; 7,4 mg; 7,6 mg; 7,8 mg; 8,0 mg; 8,2 mg; 8,4 mg; 8,6 mg; 8,8 mg; 9,0 mg; 9,2 mg; 9,4 mg; 9,6 mg; 9,8 mg; 10,0 mg; 15 mg; 20 mg; 25 mg; 30 mg; 35 mg; 40 mg; 45 mg; 50 mg; 55 mg; 60 mg; 65 mg; 70 mg; 75 mg; 80 mg; 85 mg; 90 mg; 95 mg; 100 mg; 105 mg; 110 mg; 115 mg; 120 mg; 125 mg; 130 mg; 135 mg; 140 mg; 145 mg; 150 mg; 155 mg; 160 mg; 165 mg; 170 mg; 175 mg; 180 mg; 185 mg; 190 mg; 195 mg; 200 mg; 205 mg; 210 mg; 215 mg; 220 mg; 225 mg; 230 mg; 235 mg; 240 mg; 245 mg; 250 mg; 255 mg; 260 mg; 265 mg; 270 mg; 275 mg; 280 mg; 285 mg; 290 mg; 295 mg; 300 mg; 305 mg; 310 mg; 315 mg; 320 mg; 325 mg; 330 mg; 335 mg; 340 mg; 345 mg; 350 mg; 355 mg; 360 mg; 365 mg; 370 mg; 375 mg; 380 mg; 385 mg; 390 mg; 395 mg; 400 mg; 405 mg; 410 mg; 415 mg; 420 mg; 425 mg; 430 mg; 435 mg; 440 mg; 445 mg; 450 mg; 455 mg; 460 mg; 465 mg; 470 mg; 475 mg; 480 mg; 485 mg; 490 mg; 495 mg; 500 mg; 505 mg; 510 mg; 515 mg; 520 mg; 525 mg; 530 mg; 535 mg; 540 mg; 545 mg; 550 mg; 555 mg; 560 mg; 565 mg; 570 mg; 575 mg; 580 mg; 585 mg; 590 mg; 595 mg; 600 mg; 605 mg; 610 mg; 615 mg; 620 mg; 625 mg; 630 mg; 635 mg; 640 mg; 645 mg; 650 mg; 655 mg; 660 mg; 665 mg; 670 mg; 675 mg; 680 mg; 685 mg; 690 mg; 695 mg; 700 mg; 705 mg; 710 mg; 715 mg; 720 mg; 725 mg; 730 mg; 735 mg; 740 mg; 745 mg; 750 mg; 755 mg; 760 mg; 765 mg; 770 mg; 775 mg; 780 mg; 785 mg; 790 mg; 795 mg; 800 mg; 805 mg; 810 mg; 815 mg; 820 mg; 825 mg; 830 mg; 835 mg; 840 mg; 845 mg; 850 mg; 855 mg; 860 mg; 865 mg; 870 mg; 875 mg; 880 mg; 885 mg; 890 mg; 895 mg; 900 mg; 905 mg; 910 mg; 915 mg; 920 mg; 925 mg; 930 mg; 935 mg; 940 mg; 945 mg; 950 mg; 955 mg; 960 mg; 965 mg; 970 mg; 975 mg; 980 mg; 985 mg; 990 mg; 995 mg; 1000 mg; preferivel- mente de 50 a 600 mg; mais preferivelmente de 200 mg.

[0047] A frequência de administração irá variar de acordo com o tipo e a gravidade da doença. Em uma forma de realização alternativa, a frequência de administração do anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmen- to de ligação a antígeno descrito na presente descrição é de uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três se- manas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada seis sema- nas ou uma vez a cada oito semanas.

[0048] Em uma forma de realização alternativa, o anticorpo anti- PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno descrito na presente descrição é administrado a uma dose de 50 a 600 mg/uma vez a cada 2-3 semanas. No entanto, outras doses podem ser úteis, de preferên- cia, 200 mg/uma vez a cada 2-3 semanas.

[0049] Em algumas formas de realização, a dose de administração em um indivíduo humano do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de li- gação a antígeno (administrado de acordo com o peso do paciente) é de 0,1 a 10,0 mg/kg, e a dose de administração do anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno é de 0,1 a 10,0 mg/kg.

[0050] Em algumas formas de realização, a dose de administração em um indivíduo humano do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de li- gação a antígeno é de 1 a 1000 mg, e a dose de administração do an- ticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno é de 1 a 1000 mg, uma vez a cada três semanas.

[0051] Em algumas formas de realização, a dose de administração em um indivíduo humano do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de li- gação a antígeno (administrado de acordo com o peso do paciente) é de 1 a 1000 mg, e a dose de administração do anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno é de 50 a 600 mg, uma vez a ca- da três semanas.

[0052] Em algumas formas de realização, a dose de administração em um indivíduo humano do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de li-

gação a antígeno (administrado de acordo com o peso do paciente) é de 1 a 1000 mg, uma vez a cada três semanas; e a dose de adminis- tração em um indivíduo humano do anticorpo anti-PD-1 ou seu frag- mento de ligação a antígeno (administrado de acordo com o peso do paciente) é de 1 a 1000 mg.

[0053] A via de administração na presente descrição pode ser a administração oral, administração parenteral, administração transdér- mica; a administração parenteral compreende, mas não se limita à, injeção intravenosa, injeção subcutânea ou injeção intramuscular.

[0054] Em uma forma de realização preferida da presente descri- ção, o anticorpo PD-1 é administrado por injeção, como injeção subcu- tânea ou intravenosa, e o anticorpo PD-1 deve ser formulado em uma forma injetável antes da injeção. Em particular, de preferência, a forma injetável do anticorpo PD-1 é a solução injetável ou o pó liofilizado, que inclui o anticorpo PD-1, tampão, estabilizante e, opcionalmente, tenso- ativo. O tampão pode ser um ou mais selecionados do grupo constituí- do por acetato, citrato, succinato e fosfato. O estabilizante pode ser selecionado a partir de sacarídeos ou aminoácidos, de preferência, dissacarídeos, como sacarose, lactose, trealose e maltose. O tensoati- vo é selecionado a partir do grupo constituído por óleo de rícino hidro- genado de polioxietileno, glicerídeos de ácidos graxos, ésteres de áci- dos graxos de polioxietileno e sorbitano, de preferência, o éster de ácidos graxos de polioxietileno e sorbitano é o polissorbato 20, 40, 60 ou 80, de preferência, o polissorbato 20. A forma injetável preferida do anticorpo PD-1 é composta pelo anticorpo PD-1, tampão de acetato, trealose e polissorbato 20.

[0055] A presente descrição também fornece um kit farmacêutico ou uma composição farmacêutica, que inclui o anticorpo anti-TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno e o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno.

[0056] A presente descrição também fornece um método de trata- mento de tumores, compreendendo a administração de uma quantida- de terapeuticamente eficaz do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno ou/e o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de li- gação a antígeno a um paciente com tumor.

[0057] Exemplos de tumores descritos no uso da presente descri- ção são selecionados a partir do grupo que consiste em, mas não se limita a: câncer de mama (como o câncer de mama triplo negativo), câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer colorretal (como o câncer retal, câncer colorretal), câncer renal (como o carcinoma das células renais), câncer de fígado (como o câncer hepatocelular), melanoma (como o melanoma metastático), câncer de pulmão de células não pe- quenas, leucemia linfoblástica de células T, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células cabeludas, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia de neu- trófilos crônica, leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia de mastócitos imunoblástica, leucemia de células do manto, leucemia megacarioblástica de mieloma múltiplo, leucemia megacariocítica agu- da, leucemia promielocítica, eritroleucemia, linfoma maligno, mieloma múltiplo, plasmocitoma, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, lin- foma linfoblástico de células T, linfoma de Burkitt, linfoma folicular e síndrome mielodisplásica (SMD).

[0058] Em uma forma de realização alternativa, o tumor no uso da presente descrição é o câncer de pulmão de células não pequenas, o câncer de mama (como o câncer de mama negativo triplo), melanoma (como o melanoma metastático), o câncer renal, o câncer colorretal ou o câncer do fígado, de preferência, o câncer de pulmão de células não pequenas.

[0059] Caso especificamente indicado em contrário, os termos da presente descrição têm a definição a seguir.

[0060] Na presente descrição, o chamado “em combinação com” é uma forma de administração, significando que pelo menos uma dose do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno e pelo me- nos uma dose do anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno são fornecidas dentro de um período de tempo determinado, no qual ambos os medicamentos apresentam efeito farmacológico pa- ra produzir eficácia farmacológica. Este período de tempo pode ser um ciclo de dosagem. Os dois medicamentos podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente.

[0061] O “anticorpo humanizado” usado na presente descrição, também conhecido como anticorpo enxertado com CDR, se refere a um anticorpo gerado pela enxertia de sequências de CDR de camun- dongo nos arcabouços de regiões variáveis de anticorpos humanos (ou seja, anticorpos produzidos dentro de diferentes tipos de sequên- cias de arcabouços de anticorpos da linhagem germinativa humana). Os anticorpos humanizados superam a forte resposta de anticorpos induzida pelo anticorpo quimérico que transporta uma grande quanti- dade de componentes de proteína de camundongo. Essas sequências de arcabouços podem ser obtidas a partir de bases de dados públicas de DNA ou de referências publicadas que incluem sequências de ge- nes de anticorpos da linhagem germinativa. Por exemplo, as sequên- cias de DNA da linhagem germinativa de genes humanos da região variável de cadeia pesada e cadeia leve podem ser encontradas na base de dados de sequências da linhagem germinativa humana “Vba- se” (disponível na Internet www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, etc., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest, quinta edição. Em uma forma de realização preferida da presente descrição, a sequência CDR do anticorpo humanizado PD-1 é selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 73, 74, 75, 76, 77 e 78.

[0062] O “anticorpo murino” usado na presente descrição é um an- ticorpo monoclonal contra o TIM-3 humano, que é preparado de acor- do com os conhecimentos e as competências da técnica. Durante a preparação, um indivíduo de teste recebe por injeção o antígeno TIM-3 e, em seguida, é separado o anticorpo que expressa o hibridoma e que possui as sequências ou características funcionais pretendidas. Em algumas formas de realização preferidas da presente invenção, o anticorpo TIM-3 murino ou seu fragmento de ligação a antígeno inclui ainda mais uma ou mais regiões constantes de cadeia leve da cadeia κ, λ murino ou suas variantes, ou inclui ainda uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 murino ou suas va- riantes.

[0063] O “anticorpo quimérico” usado na presente descrição é um anticorpo que é formado por fusão da região variável de um anticorpo murino com a região constante de um anticorpo humano, o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imunológica induzida pelo anticorpo murino. Para estabelecer um anticorpo quimérico, é primeiro estabele- cido um anticorpo monoclonal murino específico de secreção de hibri- doma, um gene de região variável é clonado a partir de células do hi- bridoma de camundongo, em seguida, um gene de região constante de um anticorpo humano é clonado como desejado, o gene de região variável de camundongo é ligado ao gene de região constante humano para formar um gene quimérico que pode ser, então, inserido em um vetor de expressão, e, finalmente, a molécula de anticorpo quimérico é expressa em um sistema eucariótico ou procariótico. Em uma forma de realização preferida da presente invenção, a cadeia leve de anticorpos do anticorpo quimérico TIM-3 inclui ainda uma ou mais regiões cons- tantes de cadeia leve da cadeia κ, λ humana ou sua variante. A cadeia pesada de anticorpos do anticorpo quimérico TIM-3 inclui ainda uma ou mais regiões constantes de cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3,

IgG4 humano ou sua variante, de preferência inclui uma ou mais regi- ões constantes de cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG4 humano, ou inclui variantes de IgG1, IgG2 ou IgG4 incluindo um ou mais mutações de aminoácidos (como mutação YTE ou retromutação).

[0064] O “fragmento de ligação a antígeno” do anticorpo anti-PD-1 usado na presente descrição se refere ao fragmento Fab, fragmento Fab’, fragmento F(ab’)2 tendo atividade de ligação a antígeno, bem como ao fragmento Fv, fragmento scFv que se liga ao PD-1 humano; o “fragmento de ligação a antígeno” inclui uma ou mais regiões CDR se- lecionadas da SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 6 do anticorpo descrito na presente descrição. O fragmento Fv é um fragmento de anticorpo mí- nimo com todos os sítios de ligação a antígeno, ele inclui a região va- riável de cadeia pesada de anticorpos e a região variável de cadeia leve, mas sem a região constante. Geralmente, o anticorpo Fv inclui ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, e é capaz de formar uma estrutura necessária para ligação a antígeno. Além dis- so, podem ser utilizados ligantes diferentes para ligar as regiões variá- veis de dois anticorpos para formar uma cadeia polipeptídica, nomea- damente, o anticorpo de cadeia única ou o Fv de cadeia única (sFv). O termo “ligação ao PD-1” na presente descrição se refere à capacidade de interagir com o PD-1 humano. O termo “sítio de ligação a antígeno” na presente descrição se refere a sítios tridimensionais discretos no antígeno que é reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente descrição.

[0065] O “fragmento de ligação a antígeno” ou “fragmento funcio- nal” do anticorpo TIM-3 descrito na presente descrição se refere a um ou mais fragmentos do anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, o TIM-3). Demonstrou- se que fragmentos de anticorpos de comprimento total podem ser utili- zados para realizar a função de ligação a antígeno do anticorpo.

Exemplos do fragmento de ligação contido no termo “fragmento de li- gação a antígeno” do anticorpo incluem (i) fragmento Fan, um frag- mento monovalente composto pelos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de charneira, (iii) frag- mento Fd composto por domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv com- posto por domínios VH e VL de um braço de um anticorpo; (v) domínio único ou fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que é composto pelo domínio VH; e (vi) região determinante de com- plementaridade (CDR) isolada ou (vii) combinação de duas ou mais CDRs isoladas, opcionalmente ligadas por ligantes sintéticos. Além disso, embora os dois domínios VL e VH do fragmento Fv sejam codi- ficados por genes separados, os métodos de recombinação podem ser utilizados para liga-los através de um ligante sintético, de modo que possa ser produzida uma única cadeia de proteínas, na qual as regi- ões VL e VH sejam combinadas entre si para formar uma molécula monovalente (referida como Fv de cadeia única (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 85: 5879-5883). Este anticorpo de cadeia única também deve ser incluído no termo “fragmento de ligação a antígeno” do anticorpo. Esses fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas para as pessoas qualifi- cadas na arte, e os fragmentos são triados quanto à sua função da mesma forma que os anticorpos intactos. A porção de ligação a antí- geno pode ser produzida por ou tecnologia de DNA recombinante, ou por fragmentação enzimática ou química da imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, por exemplo, o anticorpo IgG (por exemplo, os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[0066] O Fab é um fragmento de anticorpo que tem um peso mo-

lecular de cerca de 50.000 e tem atividade de ligação a antígeno, que é obtida tratando moléculas de anticorpos IgG com a protease papaína (clivando o resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H), em que cerca de metade da cadeia H em seu lado N-terminal e toda a ca- deia L estão ligadas por ligação dissulfeto.

[0067] O Fab descrito na presente descrição pode ser produzido tratando-se o anticorpo monoclonal da presente invenção (que reco- nhece especificamente o TIM-3 humano e se liga à sequência de ami- noácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional) com a papaína. Além disso, a Fab pode ser produzido inserindo o DNA que codifica o Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou um vetor de expressão eucariótica, e introduzindo o vetor em um or- ganismo procariótico ou eucariótico para expressar o Fab.

[0068] O F(ab’)2 é um fragmento de anticorpo com um peso mole- cular de cerca de 100.000 obtido por digestão da parte a jusante das duas ligações dissulfeto na região de charneira do IgG com a enzima pepsina, a F(ab’)2 tem atividade de ligação a antígeno e inclui duas regiões Fab ligadas na posição de charneira.

[0069] O F(ab’)2 descrito na presente descrição pode ser produzi- do tratando-se o anticorpo monoclonal da presente invenção (que re- conhece especificamente o TIM-3 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional) com a pepsina. Além disso, o F(ab’) 2 pode ser produzido ligando o Fab’ descrito abaixo com uma ligação tioéter ou uma ligação dissulfe- to.

[0070] O Fab’ é um fragmento de anticorpo com um peso molecu- lar de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação a antígeno, que é obtida por clivagem da ligação de dissulfeto na região de charneira do F(ab’)2. O Fab’ presente invenção pode ser produzido tratando-se o F(ab’)2 da presente invenção (que reconhece especificamente o TIM-3 e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional) com a um agente de redução como o ditiotrei- tol.

[0071] Além disso, a Fab’ pode ser produzido inserindo-se o DNA que codifica o fragmento Fab’ do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou um vetor de expressão eucariótica, e introduzindo o vetor em um organismo procariótico ou organismo eucariótico para ex- pressar o Fab’.

[0072] O “anticorpo de cadeia única”, “Fv de cadeia única” ou “scFv” descrito na presente descrição se refere a uma molécula em que o domínio variável de cadeia pesada (ou região; VH) do anticorpo está ligado ao domínio variável de cadeia leve (ou região; VL) do anti- corpo com um ligante. Estas moléculas de scFv têm estrutura geral: NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH. Um ligante adequado na arte anterior consiste em sequências de aminoácidos GGGGS repetidos ou sua variante, por exemplo, de 1 a 4 variantes repetidas podem ser usadas (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448). Outros ligates que podem ser usados na presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

[0073] O scFv descrito na presente descrição pode ser produzido pelas seguintes etapas: produção de cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção (que reconhece especifi- camente o TIM-3 humano e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional), construção de DNA que codifica o scFV, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou um vetor de expressão eucariótica e, em seguida, in- trodução do vetor de expressão em um organismo procariótico ou eu-

cariótico para expressar o scFv.

[0074] A “quantidade eficaz” descrita na presente descrição com- preende uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir os sin- tomas ou condições da condição médica. Uma quantidade eficaz tam- bém se refere a uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. A quantidade eficaz para um determinado paciente ou in- divíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condi- ção a ser tratada, a saúde geral do paciente, o método de administra- ção, a rota e a dosagem e a gravidade dos efeitos colaterais. A quanti- dade eficaz pode ser a dose máxima ou o plano de dosagem que evite efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significativos.

[0075] A “CDR” descrita na presente descrição se refere a uma das seis regiões hipervariáveis dentro do domínio variável de um anti- corpo que contribui principalmente para a ligação ao antígeno. Uma das definições mais comumente usadas das 6 CDRs é fornecida por Kabat E.A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological inte- rest. publicação NIH 91-3242). Conforme usado aqui, a definição de Kabat da CDR se aplica somente à CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, L3), e às CDR2 e CDR3 do domínio variável de cadeia pesada (CDR H2, CDR H3 ou H2, H3).

[0076] O anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno enge- nheirado na presente descrição pode ser preparado e purificado por métodos convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA que codificam as cadeias pesadas e leves podem ser clonadas e recombi- nadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imu- noglobulina recombinante pode ser transfectado de forma estável para células CHO. Como uma técnica anterior mais recomendada, os sis- temas de expressão de mamíferos podem levar à glicosilação de anti- corpos, especialmente nos sítios altamente conservados do terminal N na região Fc. Clones estáveis são obtidos expressando anticorpos que se ligam especificamente ao TIM-3 humano. Clones positivos são ex- pandidos no meio isento de soro do biorreator para produzir anticor- pos. O meio de cultura composto por anticorpos secretados pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, a coluna FF de Sepharose A ou G com tampão ajustado pode ser usada para purifica- ção. Os componentes não especificamente ligados são removidos por lavagem. Em seguida, o anticorpo ligado foi eluído pelo método do gradiente de pH, e o fragmento de anticorpo foi detectado por SDS- PAGE e coletado. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado através de métodos convencionais. Misturas solúveis e polímeros também po- dem ser removidos através de métodos convencionais, como peneiras moleculares e troca iônica. O produto resultante precisa ser congelado imediatamente, como a -70 °C, ou liofilizado.

[0077] O “tratamento” utilizado na presente descrição se refere à administração de um agente terapêutico interno ou externo, tal como uma composição contendo qualquer dos compostos de ligação da pre- sente invenção, a um paciente que tenha um ou mais sintomas da do- ença, e o agente terapêutico é conhecido por ter um efeito terapêutico sobre esses sintomas.

[0078] Os seres humanos e os animais têm uma tolerância bastan- te diferente em relação ao mesmo medicamento. Em termos gerais, os animais são mais tolerantes do que os seres humanos. Geralmente, as seguintes razões são utilizadas para realizar a conversão: a dosagem para seres humanos é definida como 1, de 25 a 50 para camundongos e ratos, de 15 a 20 para coelhos e porquinhos-da-Índia, e de 5 a 10 para cães e gatos. Além disso, podem ser utilizados métodos de cálcu- lo da área superficial humana e animal para realizar a conversão. 1) Os métodos de cálculo da área superficial humana são geralmente considerados, como a fórmula de Xu Wen (Chinese Journal of Physio-

logy, 12, 327, 1937) e a fórmula de Mech-Rubner. O método acima pode ser aplicado para a conversão da dosagem do medicamento en- tre os tipos humanos e diferentes de animais na presente descrição.

[0079] A “homologia” usada na presente descrição se refere à si- milaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeos ou entre dois polipeptídeos. Quando as posições nas duas sequências a serem comparadas são ocupadas pela mesma subunidade monoméri- ca de base ou aminoácidos, por exemplo, cada posição das duas mo- léculas de DNA é ocupada por adenina, então, as moléculas são con- sideradas homólogas nesta posição. A percentagem de homologia en- tre duas sequências é uma função do número de posições correspon- dentes ou homólogas compartilhadas por duas sequências divididas pelo número de posições a comparar × 100. Por exemplo, em um ali- nhamento de sequência ideal, quando existem 6 posições iguais ou homólogas entre 10 posições em duas sequências, então as duas se- quências são consideradas como 60% homólogas; quando existem 95 posições iguais ou homólogas entre 100 posições em duas sequên- cias, então as duas sequências são consideradas como 95% homólo- gas. Em termos gerais, a comparação é realizada quando duas se- quências são alinhadas para obter o percentual máximo de homologia.

[0080] A “composição farmacêutica” usada na presente descrição se refere a uma mistura contendo um ou mais dos compostos aqui descritos ou sais fisiologicamente/farmacêuticos aceitáveis ou seus precursores e outros componentes químicos. Por exemplo, os outros componentes são carreadores e excipientes fisiologicamente/farma- ceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica tem por objetivo promover a administração ao organismo, o que contribui para a absor- ção dos ingredientes ativos e, consequentemente, para a atividade biológica.

[0081] A sobrevida global (OS) se refere à duração do período aleatório até o momento da morte devido a qualquer causa. Para o in- divíduo que ainda está vivo no último acompanhamento, a OS é con- tada como dados censurados no momento do último acompanhamen- to. Para o indivíduo que se perde no acompanhamento, a OS é conta- da como dados censurados no momento da última sobrevida confir- mada antes de ser perdido no acompanhamento. A OS com dados censurados é definida como a duração do agrupamento aleatório até o censuramento.

[0082] A taxa de resposta objetiva (ORR) se refere à taxa de paci- entes cujos tumores diminuíram a um determinado nível e mantiveram- se durante um determinado período de tempo, incluindo casos de CR e PR. Os Critérios de Avaliação da Resposta em Tumores Sólidos (Cri- térios RECIST 1.1) foram utilizados para avaliar a resposta objetiva do tumor. Os indivíduos devem ser acompanhados com lesões tumorais mensuráveis no início da avaliação, e os critérios de avaliação da efi- cácia são divididos em remissão completa (CR), remissão parcial (PR), doença estável (SD) e doença progressiva (PD), de acordo com os critérios RECIST 1.1.

[0083] Taxa de Controle de Doenças (DCR): O período que come- ça a partir do momento da primeira avaliação do tumor como CR/PR/SD até o momento da primeira avaliação como PD ou morte por qualquer causa.

[0084] Taxa de sobrevida de 12 meses/24 meses (Taxa de sobre- vivência global, OSR): A taxa de casos que ainda estão vivos após acompanhamento de 12 meses/24 meses desde a primeira adminis- tração.

[0085] Taxa de Controle de Doenças (DCR): refere-se à taxa de indivíduos com Melhor Resposta Geral (BOR) de remissão completa (CR) ou resposta parcial (PR) ou doença estável (SD ≥ 8 semanas).

[0086] Remissão Completa (CR): Todas as lesões-alvo desapare-

cem e o diâmetro curto de cada um dos nódulos linfáticos patológicos (incluindo os nódulos-alvo e não alvo) deve ser reduzido para < 10 mm.

[0087] Remissão Parcial (PR): A soma dos diâmetros de todas as lesões-alvo é reduzida em pelo menos 30% em relação ao nível basal.

[0088] Doença Progressiva (PD): A soma dos diâmetros de todas as lesões-alvo é aumentada em pelo menos 20% em comparação com a referência, que é o valor mínimo da referida soma medida durante todo o estudo experimental (o valor de medição basal é definido como a referência, se for o valor mínimo). Além disso, o valor absoluto da soma dos diâmetros deve ser aumentado em pelo menos 5 mm (a presença de uma ou mais lesões novas é também considerada doen- ça progressiva).

[0089] Doença Estável (SD): O grau de redução da lesão-alvo não atinge a PR, e o grau de aumento não atinge o nível da PD, que é um valor intermediário. O valor mínimo da soma dos diâmetros pode ser utilizado como referência durante o estudo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0090] Figura 1: o efeito dos anticorpos TIM-3 sobre o tumor xeno- gráfico de camundongos HCC827 com câncer de pulmão de células não pequenas humanas.

[0091] Figura 2: o efeito dos anticorpos sobre o volume tumoral re- lativo em camundongos

DETALHADA DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0092] A seguir, a presente invenção é descrita com referência aos exemplos. No entanto, o âmbito da presente descrição não é assim limitado. EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO E PROTEÍNA TIM-3

USADOS PARA DETECÇÃO

1. Projeto e expressão do antígeno TIM-3

[0093] O receptor celular 2 do vírus da Hepatite A UniProt (HAVCR2 humano, TIM-3 humano, Uniprot nº: Q8TDQ0) foi utilizado como modelo do TIM-3 da presente invenção, a sequência de aminoá- cidos do antígeno e proteína utilizada para detecção na presente in- venção foi concebida, opcionalmente, diferentes etiquetas foram fundi- das à proteína TIM-3, e, em seguida, clonadas no vetor pHr (criado internamente) ou no vetor pTargeT (promega, A1410), respectivamen- te. Os vetores foram expressos transitoriamente em 293 células ou expressos estavelmente em CHO-S e, em seguida, purificados para obter o antígeno codificado e a proteína utilizada para detecção na presente invenção. A menos que indicado especificamente em contrá- rio, os antígenos TIM-3 a seguir se referem ao TIM-3 humano.

[0094] Proteína de fusão da região extracelular do TIM-3 e hIgG1 Fc: TIM-3-Fc (SEQ ID NO: 1), usada para imunização de camundon- gos: MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYL- PCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTS- RYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNL- KLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDIN- LTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIREPKSSDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN- KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG- FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR- WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

[0095] Nota: A parte sublinhada representa o peptídeo sinal, e a parte em itálico representa Fc.

[0096] Região extracelular do TIM-3 com Sinalizadores e etiquetas His: TIM-3-Flag-His (SEQ ID NO: 2), usada para detecção: TIM-3-flag-His

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSEVEYRAEVGQNAYL- PCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTS- RYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNL- KLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDIN- LTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRGSSDYKDDDDKHHHHHH.

[0097] Nota: A parte sublinhada representa o peptídeo sinal, e a parte em itálico representa a etiqueta Sinalizador-His.

[0098] TIM-3 de comprimento total: usado para construir linhagens de células que sobre-expressam TIM-3: TIM-3-comprimento total (SEQ ID NO: 3) MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYL- PCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTS- RYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNL- KLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDIN- LTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALI- FKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEEN- VYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP;

[0099] Nota: Peptídeo sinal + região extracelular + região trans- membrana + região intracelular.

2. Purificação de proteína recombinante relacionada a TIM-3 e purifi- cação de anticorpos hibridomas e anticorpos recombinantes

2.1. Etapas de purificação da proteína recombinante TIM-3- Sinalziador-His:

[0100] A amostra foi centrifugada em alta velocidade para remover impurezas e concentrada em um volume adequado. A coluna de afini- dade NI-NTA (QIAGEN, Cat. nº 30721) foi equilibrada com PBS e la- vada com 2-5 vezes o volume da coluna. Após remoção das impure- zas, a amostra de sobrenadante da expressão celular foi carregada à coluna. A coluna foi lavada com PBS até que a leitura de A280 caiu à linha de base. A coluna foi lavada com PBS para eliminar proteínas de impureza, e a proteína-alvo foi coletada. A proteína-alvo foi eluída com tampão de lavagem (20 mM de imidazol) e tampão de eluição (300 mM de imidazol) sucessivamente, e os picos de eluição foram coleta- dos.

[0101] O eluato coletado foi posteriormente purificado por troca iô- nica (coluna Hiload 16/600 Superdex 200). A coluna foi equilibrada com aproximadamente 2 volumes de coluna de PBS para garantir pH de 7,4. O tampão de eluição foi identificado como contendo a proteína- alvo foi carregado após concentração, e a amostra foi coletada, identi- ficada usando SDS-PAGE e LC-MS, e foi dividida em alíquotas para uso posterior.

2.2. Purificação de hibridomas, anticorpos recombinantes e proteínas de fusão Fc

[0102] A amostra de sobrenadante da expressão celular foi centri- fugada em alta velocidade para remover impurezas, o sobrenadante da expressão de hibridoma foi purificado pela coluna de Proteína G e o anticorpo recombinante e o sobrenadante da expressão da proteína de fusão Fc foram purificados pela coluna de Proteína A. A coluna foi la- vada com PBS até que a leitura de A280 caiu à linha de base. A prote- ína-alvo foi eluída com ácido acético a 100 mM, pH 3,0, e neutralizada com Tris-HCl a 1 M, pH 8,0. A amostra eluída foi adequadamente con- centrada e posteriormente purificada por cromatografia em gel equili- brada com PBS Superdex 200 (GE). Os picos não agregados foram coletados e divididos em alíquotas para uso posterior. EXEMPLO 2. PREPARAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI- HUMANO TIM-3

1. Imunização animal

[0103] O anticorpo monoclonal anti-humano TIM-3 foi produzido através da imunização de camundongos. Camundongos brancos SJL, fêmeas, 6 a 8 semanas de idade (Beijing Charles River Laboratory

Animal Technology Co., Ltd., número da licença de produção animal: SCXK (Pequim) 2012-0001) foram utilizados na experiência. Ambiente de alimentação: Nível SPF. Após a compra dos camundongos, eles foram adaptados ao ambiente laboratorial por 1 semana, ajuste do ci- clo de 12/12 horas claro/escuro, temperatura de 20 a 25 ºC, umidade de 40 a 60%. Os camundongos que foram adaptados ao ambiente fo- ram imunizados de acordo com o seguinte protocolo. O antígeno para imunização foi a região extracelular do TIM-3 humano com a etiqueta Fc (SEQ ID NO: 1).

[0104] Protocolo de imunização: QuickAntibody-Mouse5W (KX0210041) foi usado para imunizar os camundongos. A razão do antígeno para o adjuvante é de 1:1, 10 μg/camundongo/tempo (primei- ra imunização/imunização de reforço). O antígeno e o adjuvante foram rapidamente e completamente misturados e, em seguida, inoculados. O período de inoculação envolveu um intervalo de 21 dias entre a pri- meira e a segunda imunizações, e um intervalo de 14 dias entre as imunizações posteriores. O sangue foi colhido 7 dias após cada imuni- zação, e a titulação do anticorpo no soro dos camundongos foi deter- minada por ELISA. Os camundongos com alta titulação de anticorpos no soro e com sua titulação atingindo a estabilidade foram seleciona- dos para fusão de esplenócitos. A imunização de reforço foi realizada três dias antes da fusão dos esplenócitos, e a solução de antígeno preparada por soro fisiológico foi injetada a 20 μg/camundongo por via intraperitoneal (IP).

2. Fusão de esplenócitos

[0105] Etapas de fusão mediadas por PEG otimizadas foram usa- das para fundir linfócitos esplênicos com células do mieloma Sp2/0 (ATCC® CRL-8287™) para obter células do hibridoma. As células de hibridoma fundidas foram ressuspensas em meio completo (meio DMEM composto por FBS de 20%, 1 × HAT, 1 × OPI) a uma densida-

de de 4 a 5 E5/ml, e foram semeadas em placa de 96 poços a 100 μl/poço e incubadas a 37ºC em 5% de CO2 por 3 a 4 dias, e, em se- guida, meio completo HAT foi adicionado a 100 μl/poço para ainda cul- tivar as células por 3 a 4 dias até que clones pontuais fossem forma- dos. O sobrenadante foi retirado, 200 μl/poço de meio completo HT (meio RPMI-1640 composto por 20% de FBS, 1 × HT e 1 × OPI) foram adicionados e incubados a 37°C em 5% de CO2 por 3 dias e, em se- guida, foi realizada a detecção ELISA.

3. Triagem das células do hibridoma

[0106] De acordo com a densidade de crescimento das células de hibridoma, o sobrenadante da cultura de hibridoma foi detectado pelo método de ligação ELISA (consulte o Exemplo 4, Exemplo de Teste 1). A experiência de ligação de células com sobre-expressão de TIM-3 foi realizada usando o sobrenadante de células em poços positivos que foram identificados no método de ligação ELISA (consulte o Exemplo 4, Exemplo de Teste 2). As células em poços que são positivos tanto para ligação de proteínas como para ligação de células devem ser ex- pandidas a tempo para criopreservação, e subclonadas de duas a três vezes até que um único clone de célula possa ser obtido.

[0107] Foram necessárias as experiências ELISA de ligação a TIM-3 e de ligação à célula para cada subclobagem de células. Os clones de hibridoma foram triados através dos experimentos acima, e os anticorpos secretados mAb-1701 e mAb-1799 foram obtidos. Os anticorpos foram ainda preparados pelo método de cultura de células sem soro. Os anticorpos foram purificados de acordo com o exemplo de purificação, e foram fornecidos para uso nos exemplos de teste.

4. Sequenciação de clones positivos de hibridoma

[0108] O processo de clonagem das sequências do hibridoma po- sitivo foi o seguinte. As células de hibridomas na fase de crescimento logarítmico foram coletadas, o RNA foi extraído por Trizol (Invitrogen,

Cat. nº 15596-018) de acordo com as instruções do kit, e o kit de Transcriptase Reversa PrimeScript™ foi utilizado para transcrição re- versa (Takara, Cat. nº 2680A). O cDNA obtido por transcrição reversa foi amplificado por PCR utilizando o Conjunto Ig-Primer de camundon- go (Novagen, TB326 Rev. B 0503) e entregue à empresa para se- quenciação. Foram obtidas as sequências de aminoácidos correspon- dentes às sequências de DNA para uma ou mais regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de mAb-1701 e mAb-1799: região variável de cadeia pesada mAb-1701 (SEQ ID NO: 4) EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYT- FTDYYMNWVKQSHGKSLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDKATLTVD- KSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQG- TLVSVSA; região variável de cadeia leve mAb-1701 (SEQ ID NO: 5) DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAE- DFVSYYCQQLYSSPWTFGGGTKLEIK; região variável de cadeia pesada mAb-1799 (SEQ ID NO: 6) EVKLVESEGGLVQPGSSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQV- PEKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFIISRDNAKNILYLQMNS- LKSDDTATYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSA; região variável de cadeia leve mAb-1799 (SEQ ID NO: 7) DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRAS- DNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGT- QFSLKINSLQPEDFGSYYCQQHYGSPLTFGAGTKLELK.

[0109] Em que as sequências de CDR nas cadeias leves e pesa- das de cada anticorpo são apresentadas na Tabela 1.

[0110] TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE CDRs DE CADA CADEIA

PESADA E CADEIA LEVE

Ab Cadeia pesada Cadeia leve

DYYMN LASQPIGIWLA HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 11 1701 DIIPNNGGSKYNQKFKD AATSLAD HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 12

WGYGSSYRWFDY QQLYSSPWT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 13

DYYMA RASDNIYSYLA HCDR1 LCDR1 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 17 1799 NINYDGSSTYYLDSLKS NAKTLAE HCDR2 LCDR2 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 18

DVGYYGGNYGFAY QQHYGSPLT HCDR3 LCDR3 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 19 EXEMPLO 3. HUMANIZAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL DO HIBRIDOMA MURINO ANTI-HUMANO TIM-3

1. Humanização do anticorpo anti-TIM-3 mAb-1701

[0111] Por alinhamento com a base de dados de genes da linha- gem germinativa IMGT da região variável de cadeias leve e pesada do anticorpo humano pelo software MOE, os genes da linhagem germina- tiva da região variável da cadeia pesada e cadeia leve com elevada homologia ao anticorpo mAb-1701 foram selecionados como modelos, e as CDRs do anticorpo murino foram respectivamente enxertadas no modelo humano correspondente para formar a região variável na or- dem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4. Os resíduos de ami- noácidos são identificados e anotados pelo sistema de numeração Ka- bat.

1.1. Seleção de arcabouços humanizados para o clone de hibridoma mAb-1701

[0112] Os modelos de cadeia leve para humanização do anticorpo murino mAb-1701 foram IGKV1-33*01 e hjk4.1, e os modelos de ca- deia pesada para humanização foram IGHV1-18*01 e hjh4.1. As se- quências de regiões variáveis humanizadas são as seguintes: enxerto h1701VH-CDR (SEQ ID NO: 20) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL-

RSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; enxerto h1701VL-CDR (SEQ ID NO: 21) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.

[0113] Nota: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, o itálico na sequência representa a sequência FR e a parte sublinhada representa as sequências CDR.

1.2 Seleção de modelos e projeto de retromutação(ões) para h1701

[0114] O projeto de mutação específico é mostrado na Tabela 2 abaixo:

[0115] TABELA 2. SELEÇÃO DE MODELOS E PROJETO DE RETROMUTAÇÃO(ÕES) PARA h1701 h1701_VL h1701_VH h1701_VL.1 Enxertado h1701_VH.1 Enxertado h1701_VL.1A A43S h1701_VH.1A M48I h1701_VH.1B R98T h1701_VH.1C M48I, R98T M48I, R98T, R38K, h1701_VH.1D D89E M48I, R98T, G49A, h1701_VH.1E V68A, M70L M48I, R98T, G49A, h1701_VH.1F V68A, M70L, R38K, D89E

[0116] Nota: Por exemplo, A43S significa que A na posição 43 é mutado de volta para S, de acordo com o sistema de numeração Ka- bat. “Enxertado” representa a sequência de CDRs de anticorpo murino implantada na região FR da linhagem germinativa humana.

[0117] TABELA 3. COMBINAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE REGI-

ÕES VARIÁVEIS DE CADEIA PESADA E REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE DO ANTICORPO HUMANIZADO h1701 h1701_VL.1 h1701_VL.1A h1701_VH.1 h1701-005 h1701-006 h1701_VH.1A h1701-007 h1701-008 h1701_VH.1B h1701-009 h1701-010 h1701_VH.1C h1701-011 h1701-012 h1701_VH.1D h1701-013 h1701-014 h1701_VH.1E h1701-015 h1701-016 h1701_VH.1F h1701-017 h1701-018

[0118] Nota: Esta tabela mostra as sequências resultantes de vá- rias combinações das mutações. Como indicado por h1701-007, o an- ticorpo murino humanizado h1701-007 tem dois mutantes (cadeia leve h1701_VL.1A e cadeia pesada h1701_VH.1A). Outros podem ser indi- cados da mesma forma.

[0119] A sequência particular do 1701 humanizado é a seguinte: > h1701_VH.1 (igual ao enxerto h1701VH-CDR, SEQ ID NO: 22) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; >h1701h1701_VH.1A (SEQ ID NO: 23) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; >h1701_VH.1B (SEQ ID NO: 24) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWMGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; >h1701_VH.1C (SEQ ID NO: 25) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; >h1701_VH.1D (SEQ ID NO: 26) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT-

FTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDIIPNNGGSKYNQKFKDRVTM- TTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQG- TLVTVSS; >h1701_VH.1E (SEQ ID NO: 27) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMEL- RSLRSDDTAVYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; >h1701_VH.1F (SEQ ID NO: 28) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT- FTDYYMNWVKQAPGQGLEWIADIIPNNGGSKYNQKFK- DRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCATWGYGSSYR- WFDYWGQGTLVTVSS; > h1701_VL.1 (igual ao enxerto h1701VL-CDR, SEQ ID NO: 29) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKAPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK; >h1701_VL.1A (SEQ ID NO: 30) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQPIGIWLAWYQQK- PGKSPKLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA- TYYCQQLYSSPWTFGGGTKVEIK.

2. Humanização do anticorpo anti-TIM-3 mAb-1799

[0120] Por alinhamento com a base de dados de genes da linha- gem germinativa IMGT da região variável de cadeias leve e pesada do anticorpo humano pelo software MOE, os genes da linhagem germina- tiva da região variável da cadeia pesada e cadeia leve com elevada homologia ao anticorpo mAb-1799 foram selecionados como modelos, e as CDRs do anticorpo murino foram respectivamente enxertadas no modelo humano correspondente para formar a região variável na or- dem de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4. Os resíduos de ami- noácidos são identificados e anotados pelo sistema de numeração Ka-

bat.

2.1. Seleção de arcabouços humanizados para o clone de hibridoma 1799

[0121] Os modelos de cadeia leve para humanização do anticorpo murino 1799 foram IGKV1-39*01 e hjk2.1, e os modelos de cadeia pe- sada para humanização foram IGHV3-7*01 e hjh4.1. As sequências de regiões variáveis humanizadas são as seguintes: enxerto h1799VH-CDR (SEQ ID NO: 31) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; enxerto h1799VL-CDR (SEQ ID NO: 32) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK.

[0122] Nota: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, o itálico na sequência representa a sequência FR e a parte sublinhada representa as sequências CDR.

2.2. Seleção de modelos e projeto de retromutação(ões) do clone de hibridoma 1799, consulte a Tabela 4 abaixo:

[0123] TABELA 4. SELEÇÃO DE MODELO E PROJETO DE RE- TROMUTAÇÃO(ÕES) DO h1799 h1799_VL h1799_VH h1799_VL.1 Enxertado h1799_VH.1 Enxertado h1799_VL.1A I48V h1799_VH.1A Q3K h1799_VL.1B I48V, K45Q h1799_VH.1B Q3K, R87K h1799_VL.1C I48V, K45Q, A43S h1799_VL.1D I48V, K45Q, A43S, T85S

[0124] Nota: Por exemplo, I48V significa que I na posição 48 é mu- tado de volta para V, de acordo com o sistema de numeração Kabat. “Enxertado” representa a sequência de CDRs de anticorpo murino im- plantada na região FR da linhagem germinativa humana.

[0125] TABELA 5. COMBINAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE REGI-

ÕES VARIÁVEIS DE CADEIA PESADA E REGIÕES VARIÁVEIS DE CADEIA LEVE DO ANTICORPO HUMANIZADO, PARA O ANTICOR- PO MURINO 1799 h1799_VL.1 h1799_VL.1A h1799_VL.1B h1799_VL.1C h1799_VL.1D h1799_VH.1 h1799-005 h1799-006 h1799-007 h1799-008 h1799-009 h1799_VH.1A h1799-010 h1799-011 h1799-012 h1799-013 h1799-014 h1799_VH.1B h1799-015 h1799-016 h1799-017 h1799-018 h1799-019

[0126] Nota: Esta tabela mostra as sequências resultantes de vá- rias combinações das mutações. Como indicado por h1799-005, o an- ticorpo murino humanizado h1799-005 tem dois mutantes (cadeia leve h1799_VL.1A e cadeia pesada h1799_VH. 1). Os outros podem ser indicados da mesma forma.

[0127] A sequência particular do 1799 humanizado é a seguinte: > h1799_VH.1 (igual ao enxerto h1799VH-CDR, SEQ ID NO: 33) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; >h1799_VH.1A (SEQ ID NO: 34) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; >h1799_VH.1B (SEQ ID NO: 35) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVR- QAPGKGLEWVANINYDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLKAEDTAVYYCARDVGYYGGNYGFAYWGQGTLVTVSS; > h1799_VL.1 (igual ao enxerto h1799VL-CDR, SEQ ID NO: 36) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK; >h1799_VL.1A (SEQ ID NO: 37) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK-

PGKAPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK; >h1799_VL.1B (SEQ ID NO: 38) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKAPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK; >h1799_VL.1C (SEQ ID NO: 39) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFATYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK; >h1799_VL.1D (SEQ ID NO: 40) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNIYSYLAWYQQK- PGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS- LQPEDFASYYCQQHYGSPLTFGQGTKLEIK. EXEMPLO 4. PREPARAÇÃO E TESTE DE EFEITO DO ANTICORPO

QUIMÉRICO RECOMBINANTE E ANTICORPO HUMANIZADO

[0128] Para os anticorpos, as regiões constantes de cadeia pesa- da humana IgG4 /cadeia leve kappa foram combinadas com cada uma das regiões variáveis correspondentes, e a mutação S228P foi intro- duzida na seção Fc para aumentar a estabilidade do anticorpo IgG4. Outras mutações conhecidas na arte também podem ser usadas para melhorar seu desempenho.

[0129] A sequência da região constante de cadeia pesada é mos- trada na SEQ ID NO: 41: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL- GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK- CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS-

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR- LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;

[0130] A sequência da região constante de cadeia leve é como se mostra na SEQ ID NO: 42. RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW- KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

1. CLONAGEM MOLECULAR DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS RE-

COMBINANTES

[0131] As moléculas de anticorpos positivas obtidas a partir da tri- agem de hibridoma foram sequenciadas para obter a sequência do gene de codificação da região variável. Os primers forward e reverse foram concebidos com base na sequência obtida por sequenciação, e o gene sequenciado foi oferecido como modelo; vários fragmentos gê- nicos VH/VK de anticorpos foram construídos por PCR e, em seguida, recombinados de forma homóloga com o vetor de expressão pHr (com o fragmento peptídeo sinal e gene da região constante hIgG4/hkappa (CH1-FC/CL)), e plasmídeos de expressão de comprimento total do anticorpo quimérico recombinante VH-CH1-FC-pHr/VL-CL -pHr foram construídos para os dois anticorpos quiméricos Ch1701 e Ch1799.

2. CLONAGEM MOLECULAR DE ANTICORPOS HUMANIZADOS

[0132] As sequências de anticorpos após o projeto de humaniza- ção foram submetidas à optimização de códon para obter a sequência de genes de codificação com preferência para códon humano, os pri- mers foram concebidos para construir vários fragmentos gênicos VH/VK de anticorpos por PCR e, em seguida, os fragmentos foram re- combinados de forma homóloga com o vetor de expressão pHr (com o fragmento peptídeo sinal e gene da região constante hIgG4/hkappa (CH1-FC/CL)) para construir o plasmídeo de expressão de comprimen- to total do anticorpo humanizado VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr.

3. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS

RECOMBINANTES E ANTICORPOS HUMANIZADOS

[0133] Os plasmídeos que expressam separadamente a cadeia le- ve e a cadeia pesada de anticorpos foram transfectados às células HEK293E a uma razão de 1:1,2; o sobrenadante da expressão foi co- letado 6 dias depois e centrifugado em alta velocidade para remover impurezas; e foi purificado com coluna de Proteína A. A coluna foi la- vada com PBS até que a leitura de A280 caiu à linha de base. A prote- ína-alvo foi eluída com solução de eluição ácida, pH 3,0 a pH 3,5, e neutralizada com Tris-HCl a 1M, pH de 8,0 a 9,0. A amostra eluída foi adequadamente concentrada e posteriormente purificada por cromato- grafia em gel equilibrada com PBS Superdex 200 (GE). Os picos agre- gados foram removidos, e os picos de monômeros foram coletados e divididos em alíquotas para uso posterior. EXEMPLO 5. MUTAÇÃO DIRECIONADA A SÍTIO DO ANTICORPO H1701

[0134] A modificação por desamidação é uma modificação química comum em anticorpos que pode afetar a estabilidade posteriormente. Em particular, alguns aminoácidos na(s) região(ões) CDR são alta- mente desamidados, oxidados ou isomerizados. Em geral, essas mu- tações devem ser evitadas ou reduzidas tanto quanto possível. De acordo com experiências de estabilidade acelerada e estrutura de an- ticorpos simulada por computador, bem como previsão por hotspot, o NNG na cadeia pesada CDR2 do anticorpo h1701 é o sítio suscetível à desamidação. O NNG descrito acima está localizado nas posições 54- 56 na região variável de cadeia pesada do anticorpo h1701, respeti- vamente. De acordo com as propriedades dos aminoácidos e a tecno- logia para a estrutura de anticorpos simulada por computador, os ami- noácidos nas posições acima podem ser substituídos por qualquer aminoácido. De preferência, a CDR2 mutante do h1701 é mostrada como: DIIPX1X2X3GSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 43), em que X1, X2 e X3 são resíduos de aminoácidos nas posições 54-56 na região variável de cadeia pesada do anticorpo h1701; X1 é selecionado a partir do grupo composto por Asn, Leu, Val, Met e Glu; X2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Asn, Glu, Met, His, Lys, Leu, Ala e Val; e X3 é selecionado a partir do grupo que consiste em Gly e Ala.

[0135] Além disso, a CDR2 incluindo mutações nas posições 54- 56 acima descritas pode ser combinada com a região FR incluindo di- ferentes retromutações para formar as seguintes regiões variáveis de cadeia pesada: mutante >h1701_VH.1-CDR2 (SEQ ID NO: 44) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWM- GDIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; mutante >h1701_VH.1A-CDR2 (SEQ ID NO: 45) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLE- WIGDIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCARWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; mutante >h1701_VH.1B-CDR2 (SEQ ID NO: 46) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWM- GDIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; mutante >h1701_VH.1C-CDR2 (SEQ ID NO: 47) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLE- WIGDIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTA VYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS;

mutante >h1701_VH.1D-CDR2 (SEQ ID NO: 48) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT- FTDYYMNWVKQAPGQGLE- WIGDIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTA VYYCATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; mutante >h1701_VH.1E-CDR2 (SEQ ID NO: 49) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVR- QAPGQGLEWIA- DIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYY CATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS; mutante >h1701_VH.1F-CDR2 (SEQ ID NO: 50) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT- FTDYYMNWVKQAPGQGLEWIA- DIIPX1X2X3GSKYNQKFKDRATLTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYY CATWGYGSSYRWFDYWGQGTLVTVSS.

[0136] Sequências exemplificativas relacionadas aos mutantes HCDR2 do h1701 e ao mutante h1701_VH.1B-CDR2 de sequência humanizada (SEQ ID NO: 46) compreendendo a mutante CDR2 cor- respondente são apresentadas nos mutantes a seguir e na Tabela 6.

[0137] Como exemplo, o NNG em HCDR2 do h1701-009 foi con- cebido para ser mutado como NLG, NVG, NNA, NMA, NEA, NHA, NMG, NEG, NKG, NAG ou NHG (as sequências dos mutantes de ami- noácidos da região variável de cadeia pesada CDR2 acima são como mostradas em SEQ ID NOs: 51-61 respectivamente). A construção do plasmídeo de expressão e a expressão de 293E foram realizadas pelo método de clonagem molecular, e os anticorpos mutantes foram purifi- cados e, posteriormente, testados quanto à afinidade e estabilidade.

[0138] Os resultados da detecção de afinidade das variantes exemplificativas são apresentados nos Exemplos de Teste 1 e 3, res- petivamente.

[0139] Várias mutações de aminoácidos foram realizadas em h1701-009, as sequências particularmente relacionadas incluem, mas não se limitam às descritas na Tabela 6. Os resultados específicos do teste de estabilidade química são apresentados no Exemplo de Teste

9.

[0140] TABELA 6. SEQUÊNCIAS DE MUTANTES DA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA DO h1701-009 INCLUINDO MODI-

FICAÇÃO ANTIDESAMIDAÇÃO Região variável da cadeia SEQ ID NO. Sequência HCDR2 corres- pesada for VH pondente h1701-009 SEQ ID NO: 24 DIIPNNGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 9) h1701-009NLG SEQ ID NO: 51 DIIPNLGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 62) h1701-009NVG SEQ ID NO: 52 DIIPNVGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 63) h1701-009NNA SEQ ID NO: 53 DIIPNNAGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 64) h1701-009NMA SEQ ID NO: 54 DIIPNMAGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 65) h1701-009NEA SEQ ID NO: 55 DIIPNEAGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 66) h1701-009NHA SEQ ID NO: 56 DIIPNHAGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 67) h1701-009NMG SEQ ID NO: 57 DIIPNMGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 68) h1701-009NEG SEQ ID NO: 58 DIIPNEGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 69) h1701-009NKG SEQ ID NO: 59 DIIPNKGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 70) h1701-009NAG SEQ ID NO: 60 DIIPNAGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 71) h1701-009NHG SEQ ID NO: 61 DIIPNHGGSKYNQKFKD (SEQ ID NO: 72) EXEMPLO DE TESTE 1: AVALIAÇÃO E COMPARAÇÃO DO EFEITO TERAPÊUTICO DOS ANTICORPOS TIM-3 SOBRE O XENOENXER-

TO SUBCUTÂNEO DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS EM CAMUNDONGOS HCC827

ANIMAIS DE LABORATÓRIO E CONDIÇÕES DE REPRODUÇÃO

[0141] Camundongos fêmeas NOG foram adquiridos da Beijing Charles River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., (Pequim China, Certificado número 11400700200456, licença SCXK (Pequim) 2016- 0006), de 4 a 6 semanas de idade no momento da compra, com peso de cerca de 18 g, mantidos a 5 camundongos/gaiola, com ajuste do ciclo claro/escuro de 12/12 horas, temperatura constante de 23 ± 1 ºC, umidade de 50% a 60%, e alimento e água ad libitum.

[0142] Anticorpos a serem testados: C25-hIgG4 (WTRC25, US6114143), a uma concentração de 5,39 mg/ml, e a quantidade administrada foi de 37,73 mg; h1799-005, à concentração de 12,00 mg/ml, e a quantidade ad- ministrada foi de 27 mg; MBG-453 (Novartis AG), a uma concentração de 5,44 mg/ml, e a quantidade administrada foi de 25 mg; h1701-009NLG, a uma concentração de 6,30 mg/ml, e a quanti- dade administrada foi de 24 mg.

[0143] Método de preparação: os anticorpos acima foram diluídos a uma concentração de 2 mg/ml com PBS, utilizando-se a ponta de uma pipeta sem pirogênio sob condições assépticas, divididos em um total de 10 tubos, 1,2 ml/tubo, armazenados a 4 °C; 1 tubo foi retirado para cada injeção. EXTRAÇÃO DE PBMCs

[0144] Os PBMCs utilizados nesta experiência foram extraídos do sangue fresco de dois voluntários. O método de extração foi o seguin- te: a) o sangue venoso foi tratado com heparina para prevenir aglu- tinação e misturado com igual volume de PBS compreendendo SFB a

2%; b) 15 ml da solução de separação 1077 foram transferidos as- septicamente para um tubo de separação de 50 ml (invertendo o tubo com cuidado para misturar completamente a 1077 com antecedência); c) 25 ml de sangue diluído foram cuidadosamente adicionados à 1077 em um tubo de centrifugação (à temperatura ambiente, adiciona- dos lentamente para formar uma camada óbvia entre o sangue e a 1077; sem misturar o sangue diluído com 1077); d) a amostra foi centrifugada a 1200 g por 10 minutos à tempe- ratura ambiente. As células sanguíneas vermelhas e as células san- guíneas brancas multinucleadas foram precipitadas por centrifugação e, nesse intervalo, uma camada de linfócitos mononucleares foi forma- da acima da 1077. O plasma de 4 a 6 cm acima dos linfócitos foi aspi- rado; e) a camada de linfócitos e metade da 1077 abaixo da camada de linfócitos foram aspiradas e transferidas para outro tubo de centrí- fuga. Foi adicionado um volume igual de PBS e centrifugado a 300 g por 8 minutos à temperatura ambiente; f) as células foram lavadas com meio PBS ou RPMI-1640 e res- suspensas com meio RPMI-1640 compreendendo o soro. Etapas experimentais:

[0145] 200 μl de células HCC827 (1×10^7 células/rato) (compre- endendo 50% de matrigel) foram inoculados subcutaneamente nas costelas direitas dos camundongos NOG. 16 dias mais tarde, foram excluídos os animais com tumores muito grandes ou muito pequenos, os camundongos com volume tumoral médio de cerca de 215 mm^3 foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: anticorpo irrelevante C25 IgG4 10mpk, MBG-453 10mpk, h1799-005 10mpk e h1701-009NLG 10mpk, 10 camundongos em cada grupo (Dia 0); durante a experiên- cia, um animal do grupo #60-008L 10mpk apresentou perda de peso persistente após a injeção de PBMCs e morreu no Dia 19 (suspeita de sofrer de GVHD). De fato, foram incluídos 9 animais. PBMCs recém- extraídos de dois voluntários foram misturados a uma razão de 1:1, e a mistura foi injetada intraperitonealmente nos camundongos NOG a 5 × 10^6 células/100 μl, e cada um dos anticorpos também foi injetado in- traperitonealmente, duas vezes por semana por 7 vezes no total (Ta- bela 1); o volume tumoral e o peso do animal foram monitorados duas vezes por semana, os dados foram registrados. Ao final da experiên- cia, os animais foram eutanizados, e o tumor foi retirado e pesado.

PROCESSAMENTO DE DADOS

[0146] A plotagem e a análise estatística de todos os dados foram realizadas utilizando-se os softwares Excel e GraphPad Prism 5.

[0147] O volume tumoral (V) foi calculado de acordo com a fórmu- la: V=1/2×a×b2, em que a e b representam comprimento e largura, respectivamente.

[0148] Taxa de proliferação tumoral relativa T/C (%) = (T-T0)/(C- C0) ×100, em que T e C representam o volume tumoral do grupo de tratamento e do grupo controle ao final da experiência; T 0 e C0 repre- sentam o volume tumoral no início da experiência.

[0149] Taxa de inibição tumoral TGI (%) = 1-T/C (%).

[0150] TABELA 7: O EFEITO TERAPÊUTICO DOS ANTICORPOS TIM-3 SOBRE O XENOENXERTO DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉ- LULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS EM CAMUNDONGOS HCC827 Grupo Nº de Ciclo de admi- Via de admi- D0 D21 animais nistração nistração Média ± SEM Média ± SEM TGI (mm3) (mm3) (%) C25 IgG4 10(10) BIW×7 I.P. 215,6±12,1 577,1±82,9 -- MBG-453 10(10) BIW×7 I.P. 215,0±11,9 294,0±77,1* 78,15 h1799-005 10(10) BIW×7 I.P. 215,1±12,6 139,7±14,3*** 120,86 h1701-009NLG 9(10) BIW×7 I.P. 210,5±15,5 264,7±89,2* 85,01 D0: o tempo para a primeira administração; a: números reais (números de agrupamento) ** p < 0,01, *** p < 0,001 v.s. C25 IgG4-10mpk por ANOVA de duas vias, teste post-hoc de Bonferroni. i.p.: injeção intraperitoneal

[0151] Os resultados experimentais mostram que: três anticorpos

TIM-3 MBG-453 (10mpk, I.P., BIW×7), h1799-005 (10mpk, I.P., BIW×7) e h1701-009NLG (10mpk, I.P., BIW×7) podem inibir significati- vamente o crescimento do xenoenxerto subcutâneo do câncer de pul- mão de células não pequenas humanas nos camundongos HCC827. No Dia 21 (a última medição), o volume médio do tumor em ordem do menor para o maior é h1799-005 (10mpk, I.P., BIW×7), h1701-009NLG (10mpk, I.P., BIW×7) e MBG-453 (10mpk, I.P., BIW×7), respectiva- mente; e as taxas de inibição do tumor foram de 120,86% (p < 0,001); 85,01% (p < 0,05) e 78,15% (p < 0.05), respectivamente (consulte a Tabela 7 e a Figura 1).

[0152] Os pesos tumorais in vitro mostram tendência consistente com o que é observado para os volumes tumorais. Os pesos tumorais dos três grupos de anticorpos TIM-3 foram significativamente menores do que os do anticorpo irrelevante C25 IgG4 (10mpk, I.P., BIW × 7), e h1799-005 (10mpk, I.P., BIW×7), h1701-009NLG (10mpk, I.P., BIW×7) e MBG-453 (10mpk, I.P., BIW×7) exibiram, respectivamente, o menor peso, o peso intermediário e o maior peso. Todos os grupos apresen- taram diferença significativa em relação ao C25 IgG4 (10mpk, I.P., BIW×7), p < 0,001, p < 0,05 e p < 0,05, respectivamente.

[0153] Os camundongos portadores de tumor foram bem toleran- tes a todos os anticorpos TIM-3, e apresentaram apenas uma pequena alteração no peso corporal durante todo o processo de administração, não foram observados sintomas induzidos pelos medicamentos, como a perda de peso evidente, exceto para um animal no grupo h1701- 009NLG (10mpk, I.P., BIW×7), que apresentou perda de peso persis- tente após a injeção de PBMCs e foi encontrado morto no Dia 19 (o abdômen do animal estava preto quando foi encontrado morto, e a pe- le apodreceu quando foi tocada com a pinça, com evidente odor fétido; o intervalo postmortem foi estimado em mais de 8 horas; considerando a persistente perda de peso antes da morte, suspeitou-se de que so-

fria de GVDH por ser intolerante ao xenoenxerto após o transplante de PBMCs humanos). EXEMPLO DE TESTE 2: AVALIAÇÃO E COMPARAÇÃO DO EFEITO DOS ANTICORPOS TIM-3 SOBRE O XENOENXERTO SUBCUTÂ- NEO MC38 DE CÂNCER DO CÓLON DO ÚTERO EM CAMUNDON-

GOS

[0154] Nome do medicamento a ser testado:

[0155] Anticorpo TIM-3, h1799-005.

[0156] Anticorpo PD-1, anticorpo murino PD-1 J43 (J Immunol. 196(1):144-55.).

[0157] Etapas experimentais:

[0158] 1 × 106 células de MC38 de câncer do cólon do útero de camundongo foram injetadas nas axilas do camundongo. Quando o tumor estava se desenvolvendo a um volume médio de 50 a 200 mm 3, os animais foram divididos aleatoriamente em grupos de acordo com o volume tumoral, e administrados. 40 Camundongos foram divididos em 4 grupos: grupo de controle negativo (grupo 1), anticorpo TIM-3, grupo de 30 mg/kg (grupo 2), anticorpo PD-1, grupo de 5 mg/kg (grupo 3) e anticorpo TIM-3 em combinação com o grupo do anticorpo PD-1 (gru- po 4), 10 animais em cada grupo; cada grupo foi administrado com a concentração correspondente da substância de teste via injeção na veia caudal, a um volume de dosagem de 10 ml/kg, e o volume de do- sagem para o grupo de administração combinada foi de 20 mL/kg, du- as vezes por semana, e administrado por um período de 21 dias. Resultados experimentais:

1. quando comparados com o volume tumoral de 581 ± 63 mm3 no grupo de controle negativo, os volumes tumorais para o grupo de 30 mg/kg do anticorpo TIM-3, para o grupo de 5 mg/kg do anticorpo PD-1 e para o grupo de administração combinada foram de 406 ± 31 (P < 0,05), 245 ± 26 (P < 0,01) e 166 ± 19 (P < 0,001) mm3, respecti-

vamente, e significativamente reduzidos;

2. quando comparados com o valor do volume tumoral relativo (RTV) de 5,38 ± 0,56 no grupo de controle negativo, os valores do RTV para o grupo de 30 mg/kg do anticorpo TIM-3, para o grupo de 5 mg/kg do anticorpo PD-1 e para o grupo de administração combinada foram de 3,76 ± 0,32 (P < 0,05); 2,20 ± 0,21 (P < 0,01) e 1,44 ± 0,08 (P < 0,001), respectivamente; os valores T/C foram de 69,91%, 40,92% e 26,66%, respectivamente;

3. quando comparados com o peso tumoral de 0,3502 ± 0,0298g no grupo de controle negativo, os pesos tumorais para o grupo de 30 mg/kg do anticorpo TIM-3, para o grupo de 5 mg/kg do anticorpo PD-1 e para o grupo de administração combinada foram de 0,2550 ± 0,0159 (P < 0,01); 0,1820 ± 0,0178 (P < 0,001) e 0,1102 ± 0,0106 g (P < 0,001), respectivamente; os valores de IR foram de 27,19%, 48,05% e 65,36%, respectivamente;

4. foram analisados o volume tumoral, o valor de RTV e o peso tumoral. Quando comparado com o grupo de 30 mg/kg do anticorpo TIM-3, o grupo de administração combinada aumentou significativa- mente a inibição sobre o crescimento tumoral (P < 0,001); quando comparado com o grupo de 5 mg/kg do anticorpo PD-1, o grupo de administração combinada aumentou significativamente a inibição so- bre o crescimento tumoral (P < 0,05).

[0159] TABELA 8: O EFEITO DOS ANTICORPOS SOBRE O XE- NOENXERTO SUBCUTÂNEO MC38 DE CÂNCER DO CÓLON DO ÚTERO EM CAMUNDONGOS ( x  SE ) Grupo Dose Peso médio (g) Volume tumoral (mm3) RTV T/C (%) mg/kg D1 D22 D1 D22 1 30 30,0±0,5 31,0±0,5 112±9 581±63 5,38±0,56 — 2 30 29,9±0,6 30,8±0,5 112±8 406±31* 3,76±0,32* 69,91 3 5 30,3±0,4 30,8±0,5 113±8 245±26** 2,20±0,21** 40,92 4 30+5 30,9±0,5 32,1±0,6 113±8 166±19***### 1,44±0,08***### 26,66 Em comparação com o Grupo 1, *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Em comparação com o Grupo 2, ###: P < 0,001. Em comparação com o Grupo 3, : P < 0,05.

[0160] TABELA 9: O EFEITO DOS ANTICORPOS SOBRE O PE- SO TUMORAL DO XENOENXERTO SUBCUTÂNEO MC38 DE CÂN- CER DO CÓLON DO ÚTERO EM CAMUNDONGOS ( x  SE ) Grupo Dose Nº de animais Peso tumoral (g) IR (%) mg/kg D1 D22 1 30 10 10 0,3502 ± 0,0298 — 2 30 10 10 0,2550 ± 0,0159** 27,19 3 5 10 10 0,1820 ± 0,0,178*** 48,05 4 30+5 10 10 0,1102 ± 0,0106***### 65,36 Em comparação com o Grupo 1, *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Em comparação com o Grupo 2, ###: P < 0,001. Em comparação com o Grupo 3, : P < 0,05 : P < 0,01 : P < 0,001

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medi- camento para o tratamento de tumores.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma ou mais sequências da região CDR selecionadas do grupo que consiste em: sequências da região variável da cadeia pesada HCDR de anticorpos, conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a mesma; e sequências da região variável da cadeia leve LCDR de an- ticorpos: conforme mostrado na sequência de aminoácidos SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, ou sequências de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a mesma.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir do grupo composto por anticorpo murino, anti- corpo quimérico, anticorpo humanizado ou seu fragmento de ligação a antígeno.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende sequências da região FR de cadeia leve e da região FR de cadeia pesada derivadas das se- quências de cadeia leve e cadeia pesada da linhagem germinativa humana ou suas sequências mutantes, respectivamente.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende a região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 31 ou sua variante, e, de preferência, a variante compreende de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada com a região variável da cadeia pe- sada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 31, mais preferivelmente, as alternâncias de aminoácidos são as retromutações de aminoácidos Q3K e R87K; e o anticorpo humanizado compreende a região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 32 ou sua variante, e, de preferência, a variante compreende de 1 a 10 alternâncias de aminoácidos quando comparada à região variável da cadeia leve, con- forme mostrado na SEQ ID NO: 32, de preferência, a(s) alternância(s) de aminoácidos é(são) é selecionada(s) a partir do grupo constituído pelas retromutações de aminoácidos Q3K e I48V, K45Q, A43S e T85S.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende a região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 33, e uma região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 36.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo TIM-3 é um anticorpo de comprimento total que compreende ainda uma ou mais regiões cons- tantes de anticorpos humanos, de preferência, compreende a região constante da cadeia pesada humana, conforme mostrado na SEQ ID NO: 41, e, de preferência, compreende a região constante da cadeia leve humana, conforme mostrado na SEQ ID NO: 42.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir do grupo composto por Fab, Fab’, F(ab’)2, anti- corpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada com ligação dissulfeto (dsFV) e fragmento de ligação a antígeno de peptídeos contendo CDRs.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o tumor é selecionado a partir do grupo constituído por câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer renal, melanoma e câncer de pulmão de células não pequenas; de preferência, selecio- nado a partir do grupo constituído por câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer colorretal e câncer renal; mais preferivelmente, câncer colorretal ou câncer de pulmão de células não pequenas.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser o uso do anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumores.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracteri- zado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado a partir do grupo constituído pelos fragmentos Fab, Fab’-SH, Fv, scFv e (Fab’)2.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de liga- ção a antígeno compreende a região constante da cadeia pesada do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano, de preferência, a região constante da cadeia pesada do isotipo IgG1 ou IgG4.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende a região constante da cadeia leve kappa ou lambda.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 compreende a região variável da cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 82, ou sua varian- te, e, de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoá- cidos na região variável da cadeia leve, mais preferencialmente, a al- ternância de aminoácidos é a A43S; e o anticorpo anti-PD-1 compre- ende uma região variável da cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 81, ou sua variante, e, de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia pesada, mais preferivelmente, a alternância de aminoácidos é a G44R.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 80, ou sua variante, e, de prefe- rência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia leve, mais preferencialmente, a alternância de ami- noácidos é a A43S; e o anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia pesada, conforme mostrado na SEQ ID NO: 79, ou sua variante, e, de preferência, a variante tem de 0 a 10 alternâncias de aminoácidos na região variável da cadeia pesada, mais preferivelmente, a alternância de aminoácidos é a G44R.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 compreende uma cadeia leve, conforme mostrado na SEQ ID NO: 80, e uma cadeia pesada, confor- me mostrado na SEQ ID NO: 79.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que o anticorpo TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antíge- no é administrado em um indivíduo humano a uma dose que varia de 0,1 mg/kg a 10,0 mg/kg.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo PD-1 ou seu fragmento de ligação a antí- geno é administrado em um indivíduo humano a uma dose que varia de 0,1 mg/kg a 20,0 mg/kg.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo anti-TIM-3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, e um anticorpo anti-PD-1 ou seu fragmento de ligação a antígeno.