BR112021001339A2

BR112021001339A2 - composições e métodos para tratar os olhos

Info

Publication number: BR112021001339A2
Application number: BR112021001339-3A
Authority: BR
Inventors: Wen-Hwa Ting Li; Khalid Mahmood; Ramine Parsa; Manpreet Randhawa; Mingqi Bai; Kenneth T. Holeva
Original assignee: Johnson & Johnson Surgical Vision, Inc.
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-04-20
Also published as: CA3106947A1; WO2020021479A1; US20220047657A1; JP2024107298A; AU2019308822B2; AU2019308822A1; CN112930189A; US11878041B2; US20200030394A1; EP3829609A1; ZA202101361B; JP2021533100A; KR20210038599A; US11166997B2

Abstract

A presente invenção refere-se a composições que compreendem um ou mais compostos e/ou extratos, os quais induzem, promovem e/ou melhoram a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, e a métodos para uso das composições para tratar os olhos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR OS OLHOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a composições que compreendem um ou mais compostos e/ou extratos, os quais induzem, promovem e/ou melhoram a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, e a métodos para uso das composições para tratar os olhos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] "A xeroftalmia é uma doença multifatorial da superfície ocular, caracterizada por uma perda da homeostase do filme lacrimal e acompanhada por sintomas oculares, na qual a instabilidade e a hiperosmolaridade do filme lacrimal, a inflamação e os danos na superfície ocular, e as anomalias neurossensoriais desempenham papéis etiológicos." Craig, J.P. et al. TFOS DEWS II definition and classification report. Ocul Surf. 2017; 15: 276-283. A xeroftalmia pode resultar da formação anormal ou inadequada de lágrimas, e da deficiência na secreção de mucina (isto é, ceratoconjuntivite seca). Os sintomas da xeroftalmia podem se manifestar como resultado de vários distúrbios subjacentes, como distúrbios autoimunes que danificam as glândulas lacrimais (isto é, que produzem lágrimas), como artrite reumatoide, síndrome de Sjögren, lúpus eritematoso sistêmico, e esclerose sistêmica e sarcoidose. A xeroftalmia pode também ser induzida após cirurgia ocular, como cirurgia Lasik®. Estima-se que o olho seco afete mais de 13 milhões de indivíduos nos Estados Unidos.

[0003] Independentemente da patologia subjacente, a xeroftalmia comumente envolve a rápida decomposição do filme lacrimal pré-ocular, resultando na desidratação da superfície externa exposta. A formação normal de lágrimas é necessária para manter úmidas a córnea e a conjuntiva, e isto por sua vez ajuda a evitar a ulceração de ambas, bem como a manter a transparência da córnea. Além disso, as lágrimas facilitam o movimento da pálpebra sobre a superfície ocular (por exemplo, ao piscar) e a remoção de substâncias estranhas do olho. As lágrimas normalmente contêm também lisozima, que é útil na prevenção de infecções nos olhos. A xeroftalmia pode estar associada a desde um desconforto suave até dor intensa no olho. Quando ocorre durante períodos de tempo prolongados, pode causar visão turva, sensação de aspereza e/ou queimação, e prurido. Se a condição for deixada persistir sem tratamento, pode adicionalmente levar à formação de úlceras corneais e/ou cicatrizes.

[0004] Os sintomas de xeroftalmia incluem dor ou cansaço nos olhos, aumento das piscadas e olhos avermelhados. Adicionalmente, bactérias podem entrar através de um arranhão e causar infecção e, se o arranhão for suficientemente fundo, pode até mesmo afetar a visão da pessoa. Além da fadiga ocular, as causas da xeroftalmia incluem síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, queimaduras e lesões aos olhos, e efeitos colaterais de fármacos hipotensivos, tranquilizantes, colírios para tratamento de glaucoma e outros fármacos similares.

[0005] Colírios são uma forma eficaz de tratar a xeroftalmia. Tais colírios tipicamente incluem ativos para tratamento da xeroftalmia - um ativo comum nesses colírios é o ácido hialurônico. O ácido hialurônico é uma substância macromolecular biologicamente derivada, tem retenção de água extremamente alta e propriedades características como alta viscoelasticidade, boa propriedade de espessamento, e boa capacidade de formação de fios, e tem sido usado como um umectante em agentes de uso tópico para tratar vários tipos de problemas de pele e assim por diante. No caso de xeroftalmia causada por síndrome de Sjogren, na qual o ressecamento é visto no corpo todo, a aplicação de colírios contendo ácido hialurônico é eficaz. Entretanto, quando instilado sob a forma de um colírio, o ácido hialurônico tem um tempo de residência relativamente curto sobre a córnea, de modo que o efeito de colírios com ácido hialurônico dura apenas cerca de 2 ou 3 horas, o que significa que o paciente precisa aplicar as gotas mais frequentemente (como 5 a 10 vezes ao dia).

[0006] O ácido hialurônico (HA) é produzido por células epiteliais corneais no olho. Notavelmente, têm sido encontradas concentrações significativamente mais altas de ácido hialurônico nas córneas da população humana mais jovem do que nas da população mais velha. (Consulte Pacella, E., Pascella, F., De Paolis, G., et al. Glycosaminoglycans in the human cornea: age-related changes. Ophthalmol. Eye Dis. 7: 1–5, 2015).

[0007] O ácido hialurônico também é útil na cura de ferimentos em geral, e é essencial para a manutenção geral da saúde ocular.

[0008] Existe, portanto, uma necessidade por uma composição farmacêutica oftálmica que promova e/ou melhore a produção e/ou liberação de ácido hialurônico da e/ou na córnea.

[0009] Os presentes inventores descobriram extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia que, em níveis suficientes no fluido corneal, podem induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea.

[0010] Por conseguinte, um aspecto da presente invenção se refere a métodos para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, compreendendo a etapa de administrar composições oftálmicas que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia.

[0011] Outro aspecto da presente invenção se refere a métodos para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, compreendendo a etapa de administrar composições oftálmicas que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, composições essas que podem ser administradas a pacientes tendo, em suas lágrimas, uma concentração de ácido hialurônico menor que 10 (ou cerca de 10) nanogramas, opcionalmente menor que 15 (ou cerca de 15) nanogramas, opcionalmente menor que 20 (ou cerca de 20) nanogramas ou, opcionalmente, menor que 25 (ou cerca de 25) nanogramas por miligrama de proteínas, de modo que a concentração de ácido hialurônico em suas lágrimas seja elevada até (ou seja tornada) igual a ou maior que 10 (ou cerca de 10), opcionalmente igual a ou maior que 15 (ou cerca de 15), opcionalmente igual a ou maior que 20 (ou cerca de 20), opcionalmente igual a ou maior que 25 (ou cerca de 25) nanogramas, opcionalmente igual a ou maior que 30 (ou cerca de 30), opcionalmente igual a ou maior que 35 (ou cerca de 35), opcionalmente igual a ou maior que 40 (ou cerca de 40), ou opcionalmente igual a ou maior que 45 (ou cerca de 45) nanogramas por miligrama de proteínas até 100 (ou cerca de 100), opcionalmente 90 (ou cerca de 90), opcionalmente 80 (ou cerca de 80), opcionalmente 70 (ou cerca de 70), ou opcionalmente 60 (ou cerca de 60) nanogramas por miligrama de proteínas.

[0012] Em certas modalidades, a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas dos pacientes, descrita acima, resultante dos compostos e/ou extratos da presente invenção, é mantida durante um período de até ao menos cerca de 2 horas, opcionalmente cerca de 4 horas, opcionalmente cerca de 6 horas, opcionalmente cerca de 8 horas, opcionalmente cerca de 10 horas, opcionalmente cerca de 12 horas ou, opcionalmente, de cerca de 12 a cerca de 24 horas.

[0013] As concentrações de ácido hialurônico, detalhadas acima, são determinadas com o uso do método Dreyfuss (descrito abaixo nas definições).

[0014] Outro aspecto da presente invenção se refere a métodos para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, para tratar (por exemplo, reduzir) e/ou evitar xeroftalmia, ou os sintomas associados com xeroftalmia, compreendendo a etapa de administrar composições oftálmicas que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia.

[0015] Outro aspecto da presente invenção se refere a métodos para prevenir e/ou tratar os sintomas resultantes da produção/liberação/fornecimento/excreção reduzida ou de baixo nível de ácido hialurônico da e/ou na córnea, mediante a administração de composições que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, de modo que a concentração de ácido hialurônico da e/ou na superfície da córnea.

[0016] Outro aspecto da presente invenção se refere a métodos para promover a cura ou aumentar a taxa de cura de ferimentos em e/ou no olho (por exemplo, não associados a xeroftalmia, trauma ocular, ferimentos cirúrgicos pós-operatórios ou não específicos) de um paciente por meio da administração de composições que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia para aumentar a produção/fornecimento/liberação/excreção do ácido hialurônico a partir de e/ou na córnea. Em certas modalidades, os métodos acima mencionados aumentam a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico de e/ou na córnea além do nível de concentração de ácido hialurônico normalmente produzido por tal paciente sem a administração das composições que compreendem uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] A presente invenção se refere aos métodos para o tratamento de um paciente que tem nível diminuído ou baixo de produção/liberação/fornecimento/excreção do ácido hialurônico de e/ou na córnea, compreendendo a etapa de administrar topicamente ao olho do paciente (opcionalmente, em um paciente que necessita aumentar essa produção/liberação/fornecimento/excreção do ácido hialurônico) uma composição que compreende: i) uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, para obter uma concentração de ao menos cerca de 0,3 mg/ml de extrato do gênero Pichia no fluido corneal dos tecidos corneais do olho; ii) opcionalmente, uma quantidade segura e eficaz de um intensificador de permeação; e iii) opcionalmente, um veículo oftalmologicamente aceitável.

[0018] A presente invenção se refere a métodos para promover a cicatrização ou aumentar a velocidade de cicatrização de feridas em e/ou no olho (opcionalmente, de um paciente que necessita de tal promoção de cicatrização de ferida ocular ou maior taxa de cicatrização), compreendendo a etapa de administrar topicamente a tal paciente uma composição (isto é, que aumenta a produção/libe- ração/fornecimento/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, em certas modalidades, além do nível de concentração do ácido hialurônico produzido por tal paciente sem a (ou na ausência da) administração das composições compreendendo uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia) que compreende:

i) uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, para obter uma concentração de ao menos cerca de 0,3 mg/ml de extrato do gênero Pichia no fluido corneal dos tecidos corneais do olho; ii) opcionalmente, uma quantidade segura e eficaz de um intensificador de permeação; e iii) opcionalmente, um veículo oftalmologicamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] A Figura 1 representa gráficos de barras mostrando uma produção aumentada de HA nas células epiteliais corneais, após aplicações tópicas de extrato de Pichia anomala a 24 e a 48 horas.

[0020] A Figura 2 representa gráficos de barras mostrando um aumento estatisticamente significativo na produção de HA em células epiteliais corneais 48 horas após a colocação de células epiteliais corneais em meio de crescimento contendo extrato de Pichia anomala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] Acredita-se que o versado na técnica possa, com base na descrição aqui contida, usar a presente invenção em sua mais completa extensão. As modalidades específicas a seguir podem ser interpretadas como meramente ilustrativas, e não como limitadoras, de qualquer maneira, do restante da descrição.

[0022] As composições da presente invenção podem compreender os, consistir nos, ou consistir essencialmente nos elementos, etapas e limitações da invenção aqui descritos, bem como de quaisquer dentre os ingredientes, componentes ou limitações adicionais ou opcionais aqui descritos.

[0023] Como usado aqui, o termo "compreendendo" (e suas variações gramaticais) é usado no sentido inclusivo de "tendo" ou "incluindo" e não no sentido exclusivo de "consistindo apenas em". Como usados aqui, os termos "um", "uma", "o" e "a" são compreendidos como abrangendo tanto o plural como o singular.

[0024] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido pelo versado na técnica à qual pertence a invenção. Além disso, todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas estão incorporadas a título de referência em sua totalidade, até o ponto em que não sejam inconsistentes com o presente relatório descritivo. Como usado aqui, todas as porcentagens são em peso do total da composição, exceto onde especificado em contrário.

[0025] Como usados aqui, os termos "córnea" ou "corneal" são, incluem e/ou se referem a, a parte frontal transparente do olho, que cobre a íris, a pupila e a câmara anterior, cujas camadas da parte frontal transparente incluem a camada de epitélio corneal (compre- endendo células epiteliais corneais), camada de Bowman (também conhecida como membrana limitante anterior), estroma corneal (também conhecido como substantia propria), membrana de Descemet (também conhecida como membrana limitante posterior), e endotélio corneal (monocamada simples de células ricas em mitocôndrias, escamosas ou cuboidais baixas, com aproximadamente 5 µm de espessura).

[0026] As funções das várias camadas são as seguintes: O epitélio fornece: ● fornece uma barreira contra produtos químicos e água; ● fornece uma barreira contra micróbios; ● fornece uma superfície óptica lisa como uma parte interna da interface entre filme lacrimal e córnea, contribuindo com o poder refrativo do olho; e ● abriga células de Langerhans, as quais desempenham importantes funções imunológicas. Camada de Bowman:

● auxilia a manter o formato da córnea. Estroma corneal: ● fornece resistência mecânica à córnea; ● fornece transparência à córnea; e ● atua como lente de refração. Membrana de Descemet: ● atua como camada de suporte para células endoteliais. Endotélio corneal: ● mantém a clareza da córnea mediante a remoção de água do estroma corneal.

[0027] A camada de epitélio corneal é composta, de modo razoavelmente uniforme, por 5 a 7 camadas de células. O epitélio corneal tem cerca de 50 µ de espessura. O epitélio é uniforme a fim de fornecer uma superfície lisa regular, e é composto por epitélio escamoso estratificado não queratinizado. Sem se ater à teoria acredita-se que a camada de epitélio corneal contenha adicionalmente estruturas de junção intercelular (isto é, aquelas estruturas, [por exemplo, barreiras de membrana ou de filme] tipicamente inibem a permeação química para dentro dos tecidos) as quais podem obstruir, ou atuar como uma barreira, à difusão dos um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, reduzindo a difusão dos um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia através do epitélio corneal e para dentro dos tecidos corneais, reduzindo assim os níveis de concentração do extrato que pode se acumular dentro dos tecidos corneais e entrar em contato com as porções celulares desses tecidos responsáveis pela produção de ácido hialurônico.

[0028] Como usado aqui, a frase "baixo nível de produção/liberação/administração/excreção, ou diminuição, do ácido hialurônico de e/ou na córnea" significa uma concentração de ácido hialurônico que é menor que a concentração do ácido hialurônico nas lágrimas de uma pessoa normal (ou seja, não doente) ou, em certas modalidades, menor que 25 (ou cerca de 25) nanogramas por miligrama de proteínas, conforme determinado usando o método descrito em Dreyfuss JL, Regatieri CV, Coelho B, et al.

Altered hyaluronic acid content in tear fluid of patients with adenoviral conjunctivitis.

An Acad Bras Cienc. 2015;87(1):455–462. Esse método (o método Dreyfuss) é reproduzido abaixo: ● Coleta da amostra Para coletar as lágrimas, tiras de Schirmer foram colocadas no lado temporal de cada olho, sob a pálpebra, durante 5 minutos, sem qualquer uso de anestésicos tópicos.

As tiras foram secas à temperatura ambiente e armazenadas a -20°C até a análise. ● Preparação da amostra de lágrima Os compostos de lágrima foram eluídos das tiras de Schirmer mediante o uso de 100 µL de água destilada, e foram executadas análises de teor de ácido hialurônico e de proteína. ● Medição de ácido hialurônico O teor de ácido hialurônico nos fluidos lacrimais foi testado por um fluoroensaio não isotópico (consulte Martins Jr, Passerotti CC, Maciel RM, Sampaio Lo, Dietrich CP e Nader HB. 2003.) Practical determination of hyaluronan by a new noncompetitive fluorescence- based assay on serum of normal and cirrhotic patients.

Anal Biochem 319: 65-72.) Fluidos lacrimais eluídos e concentrações padrão de ácido hialurônico (Sigma, St.

Louis, MO, EUA) foram adicionados a placas de 96 multipoços (FluoroNUNC Maxisorp-microtiterplates, Roskilde, Dinamarca) previamente revestidas com proteína de ligação a ácido hialurônico.

As placas foram, então, sequencialmente incubadas com proteína de ligação a ácido hialurônico biotinilado e estreptavidina marcada com európio (Amershan, Piscataway, NJ, EUA). Posteriormente, o európio restante na fase sólida foi liberado por meio de uma solução de intensificação, e a fluorescência foi medida com o uso de um fluorômetro com resolução de tempo (Perkin-Elmer Life Sciences- Wallac Oy, Turku, Finlândia). Os dados (contagens/s) foram automaticamente processados com o uso do programa de software MultiCalc (Perkin-Elmer Life Sciences-Wallac Oy), e os valores são expressos como ng/mg de proteína. ● Análise de proteínas A concentração total de proteína nas lágrimas foi determinada com o uso de um kit de ensaio colorimétrico, de acordo com as instruções do fabricante (Protein Assay Kit, disponível junto à Bio-Rad, de Hercules, CA, EUA). O perfil de proteína foi analisado através de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS- PAGE), conforme foi anteriormente descrito (consulte Laemmli UK. 1970.) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.). Em resumo, 10 µg de proteína provenientes das amostras de lágrima foram aplicados a um gradiente linear de 3 a 20% em gel de poliacrilamida sob condições redutoras. Após a eletroforese, os géis foram corados com azul de coomassie (Bio Rad, Hercules, CA, EUA). Cada banda de proteína foi quantificada por meio de densitometria, com o uso do software ImageJ versão 10.2 para Mac (U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA). Os resultados são expressos em unidades densitométricas arbitrárias (UDA).

[0029] Como usado aqui, uma composição que é "essencialmente isenta" de um ingrediente significa a composição que possui cerca de 2%, em peso, ou menos daquele ingrediente, com base no peso total da composição. De preferência, uma composição que é essencialmente isenta de um ingrediente tem cerca de 1% ou menos, com mais preferência cerca de 0,5% ou menos, com mais preferência cerca de 0,1% ou menos, com mais preferência cerca de 0,05 ou menos, com mais preferência cerca de 0,01% ou menos em peso com base no peso total da composição do ingrediente. Em certas modalidades mais preferidas, uma composição que é essencialmente isenta de um ingrediente é isenta do ingrediente, isto é, não contém nada daquele ingrediente na composição.

[0030] Como usado aqui, "oftalmologicamente aceitável" significa que os ingredientes que o termo descreve são adequados ao uso em contato com os tecidos (por exemplo, os tecidos moles dos olhos ou os tecidos cutâneos periorbitais) sem toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação ou resposta alérgica indevidas, e similares. Como será reconhecido pelo versado na técnica, sais cosmeticamente/dermatologicamente aceitáveis são sais ácidos/aniônicos ou básicos/catiônicos.

[0031] Como usado aqui, o termo "quantidade segura e eficaz" significa uma quantidade do extrato, composto ou composição descrito que é suficiente para induzir, promover e/ou melhorar a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico de e/ou em uma ou mais camadas da córnea, porém baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais graves. A quantidade segura e eficaz do composto, extrato ou composição variará de acordo com, por exemplo, a idade, a saúde e a exposição ambiental do usuário final, a duração e a natureza do tratamento, o extrato, ingrediente ou composição empregado específico, o veículo oftalmologicamente aceitável específico usado, e fatores similares.

[0032] Em certas modalidades, a presente invenção, conforme aqui descrita, pode ser praticada na ausência de qualquer composto ou elemento (ou grupo de compostos ou elementos) que não esteja especificamente descrito neste documento.

[0033] De modo geral, as regras de nomenclatura da IUPAC são utilizadas na presente invenção e de acordo com as seguintes definições de termos.

[0034] O termo "alquila C1-8", usado sozinho ou como parte de um grupo substituinte, se refere a um radical de hidrocarboneto monovalente saturado alifático de cadeia linear ou ramificada tendo de 1 a 8 átomos de carbono. Por exemplo, "C1-8alquila" inclui especificamente os radicais metila, etila, 1-propila, 2-propila, 1-butila, 2-butila, terc-butila, 1-butila, 1- pentila, 2-pentila, 3-pentila, 1-hexila, 2-hexila, 3- hexila, 1-heptila, 2-heptila, 3-heptila, 1-octila, 2-octila, 3-octila e similares. O dito termo também pode se referir ao radical alquildiila correspondente. Os radicais alquila e alquildiila podem ser fixados a uma molécula central por meio de um átomo de carbono terminal ou por meio de um átomo de carbono dentro da cadeia. De modo similar, qualquer número de substituintes variáveis pode ser fixado a um radical alquila ou alquildiila quando permitido pelas valências disponíveis.

[0035] O termo "C1-4alquila", usado sozinho ou como parte de um grupo substituinte, se refere a um radical de hidrocarboneto monovalente saturado alifático de cadeia linear ou ramificada ou grupo de ligação alquildiila tendo um número especificado de átomos de carbono, em que o radical é derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de carbono e o grupo de ligação alquildiila é derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de cada um dos dois átomos de carbono na cadeia. O termo "C1-4alquila" se refere a um radical tendo de 1 a 4 átomos de carbono em uma disposição linear ou ramificada. Por exemplo, "C1-4alquila" inclui especificamente os radicais metila, etila, 1-propila, 2-propila, 1-butila, 2-butila, terc-butila, 1-butila e similares. Os radicais alquila e alquildiila podem ser fixados a uma molécula central por meio de um átomo de carbono terminal ou por meio de um átomo de carbono dentro da cadeia. De modo similar, qualquer número de substituintes variáveis pode ser fixado a um radical alquila ou alquildiila quando permitido pelas valências disponíveis.

[0036] O termo "C2-4alquenila" se refere a um radical alquenila tendo de 2 a 4 átomos de carbono. Por exemplo, ele inclui especificamente os radicais etenila, propenila, alila (2-propenila), butenila e similares. Como descrito acima, um radical alquenila pode ser fixado de modo similar a uma molécula central e adicionalmente substituído onde indicado.

[0037] O termo "halo", dessa forma ou em combinação com outros termos significa átomo de halogênio, como flúor, cloro, bromo ou iodo.

[0038] O termo "substituído(a)(s)" se refere a uma molécula central na qual um ou mais átomos de hidrogênio foram substituídos com aquela quantidade de substituintes permitida pelas valências disponíveis. A substituição não está limitada à molécula central, mas também pode ocorrer em um radical substituinte, por meio do qual o radical se torna um grupo de ligação.

[0039] O termo "independentemente selecionado(a)(s)" se refere a dois ou mais substituintes que podem ser selecionados a partir de um grupo substituinte variável, em que os substituintes selecionados podem ser iguais ou diferentes.

[0040] O termo "dependentemente selecionado(a)(s)" se refere a um ou mais substituintes variáveis que são especificados em uma combinação indicada para substituição em uma molécula central (por exemplo, variáveis que se referem a grupos de substituintes que aparecem em uma lista de compostos na forma de tabela).

[0041] Os sais aceitáveis de bases inorgânicas incluem, por exemplo, sais de sódio ou potássio, e similares. Os sais aceitáveis de bases orgânicas incluem, por exemplo, sais formados com aminas primárias, secundárias ou terciárias, e similares. Compostos e/ou extratos que induzem, promovem e/ou melhoram a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico na córnea.

[0042] A presente invenção compreende um ou mais compostos e/ou extratos que induzem, promovem e/ou melhoram a produção/liberação/fornecimento/excreção de ácido hialurônico de e/ou na córnea.

[0043] Em certas modalidades, os compostos e/ou extratos que induzem, promovem e/ou melhoram a produção/liberação/forneci- mento/excreção de ácido hialurônico de e/ou na córnea são, ou compreendem, extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia.

[0044] Pichia é um gênero de leveduras da família Saccharomycetaceae. Mais de 100 espécies de gênero são conhecidas. Espécies adequadas para uso nas composições da presente invenção incluem (selecionadas a partir do grupo que consiste em) Pichia anomala, Pichia guilliermondii, Pichia norvegensis e Pichia ohmeri. A Pichia anomala (anteriormente nomeada como Hansenula anomala) pode ser encontrada em leite cru e queijo. Os extratos de leveduras do gênero Pichia são ricos em mananos, polissacarídeos compostos de monômeros de manose. Extratos ou fontes de extratos do gênero Pichia podem ser isolados do fruto ou de outras partes aéreas de uma planta. Pode ser usado qualquer extrato oftalmologicamente aceitável do gênero Pichia. Misturas de extratos, ou fontes de extrato, das espécies acima do gênero Pichia também podem ser usadas.

[0045] Em certas modalidades, os extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia usados na presente invenção são extratos de Pichia anomala. Em certas modalidades, um extrato adequado de Pichia anomala é produzido a partir de uma cepa de Pichia anomala presente em frutas ou folhas de uma planta de kiwi. Em outra modalidade, o extrato de Pichia anomala está comercialmente disponível junto à Silab- France como PRO-LIPISKIN ou UNFLAMAGYL®, onde o extrato é produzido a partir de uma cepa de Pichia anomala presente em cana de açúcar.

[0046] Em uma modalidade, o extrato de Pichia anomala é obtido de acordo com o seguinte processo conforme descrito nos documentos

FR2897266 e FR2938768, ambos incorporados ao presente documento a título de referência.

[0047] Em certas modalidades, o processo de extração descrito abaixo elimina grande parte da proteína a partir de um extrato de Pichia e concentra o ativo em termos de manano. O processo compreende pelo menos uma etapa de hidrólise enzimática das proteínas, para obter peptídeos e pequenas proteínas e, em certas modalidades, uma etapa adicional para remover esses pequenos peptídeos e proteínas por filtração com base na seleção do tamanho de tais moléculas.

[0048] Em certas modalidades, os extratos do gênero Pichia, incluindo o extrato de Pichia anomala, são obtidos por meio de um processo de extração que envolve uma ou mais enzima(s) de hidrólise para hidrolisar proteínas no gênero Pichia, sucessiva ou simultaneamente.

[0049] Em certas modalidades, a hidrólise enzimática é usada para decompor proteínas no extrato do gênero Pichia em frações de proteína que têm pesos moleculares médios ponderados menores que

5.000 Da. As enzimas de hidrólise adequadas incluem, mas não se limitam a, pelo menos uma peptidase, em certas modalidades, selecionadas dentre papaína, tripsina, quimotripsina, subtilisina, pepsina, termolisina, pronase, flavastacina, enteroquinase, protease de fator Xa, Turin, bromelaína, proteinase K, genenase I, termitase, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B, colagenase ou misturas das mesmas.

[0050] Em certas modalidades, as enzimas usadas para obter o extrato do gênero Pichia são inativadas antes da separação das fases solúveis e insolúveis resultantes.

[0051] Em uma modalidade, o extrato de Pichia anomala é caracterizado como tendo: - um teor de sólidos entre 5 e 300 g/l,

- um pH entre 4 e 9, - um teor de proteína entre 2 e 170 g/l, e - um teor de açúcares na faixa entre 1 e 100 g/l

[0052] Em certas modalidades, o extrato do gênero Pichia compreende um teor de manano maior que ou igual a 30% do peso total do extrato do gênero Pichia seco, ou opcionalmente um teor de manano de pelo menos 50% em peso do peso total do extrato do gênero Pichia seco.

[0053] Em certas modalidades, a fase de extrato do gênero Pichia é secado (e o teor de sólidos é medido) passando-se a fase contendo extrato do gênero Pichia por um calor de forno de 105 °C (ou cerca de 105 °C) na presença de areia até um peso constante ser obtido/observado.

[0054] Em certas modalidades, o teor de sólidos do extrato seco do gênero Pichia situa-se entre 10 e 200 g/l, ou opcionalmente entre 26 e 40 g/l.

[0055] Em certas modalidades, o pH medido pelo método potenciométrico à temperatura ambiente (25 °C) leva a valores entre 4,5 e 8,5, opcionalmente entre 6,0 e 7,0.

[0056] Determinação do teor de açúcar total, o método DUBOIS pode ser usado. Na presença de ácido sulfúrico concentrado e fenol, açúcares redutores geram um composto amarelo alaranjado. A partir de uma faixa padrão, o teor de açúcar total de uma amostra pode ser determinado. Em certas modalidades, o teor de açúcar total no extrato seco do gênero Pichia situase entre 7 e 145 g/l, ou opcionalmente 18 e 29 ou g/l. Em certas modalidades, o extrato seco do gênero Pichia contém pelo menos do total 30% de total de açúcares em peso de extrato seco do gênero Pichia em comparação com o total de sólidos em peso de extrato seco do gênero Pichia, opcionalmente, pelo menos 50% em peso de extrato seco do gênero Pichia.

[0057] Em certas modalidades, a fração de carboidrato do extrato seco do gênero Pichia é composta de manose e glicose sob a forma de (ou essencialmente sob a forma de) oligossacarídeos e polissacarídeos que têm um peso molecular médio ponderado de cerca de 180 cerca de

800.000 Da, opcionalmente, de cerca de 5.000 a cerca de 515.000 Da, opcionalmente de cerca de 6.000 a cerca de 270.000 Da. Em certas modalidades, pelo menos 70% (ou cerca de 70%), opcionalmente pelo menos 75% (ou cerca de 75%), pelo menos 80% (ou cerca de 80%), opcionalmente pelo menos 85% (ou cerca de 85%), pelo menos 90% (ou cerca de 90%), opcionalmente pelo menos 95% (ou cerca de 95%), ou 100% (ou cerca de 100%) dos oligossacarídeos e polissacarídeos no extrato seco do gênero Pichia estão dentro das faixas de peso molecular ponderado supracitadas.

[0058] A determinação do teor de proteína é obtida pelo método Kjedhal. Em certas modalidades, o extrato seco do gênero Pichia tem um teor de proteína entre 4 e 90 g/l, ou opcionalmente entre 12 e 18 g/l. O extrato seco do gênero Pichia contém menos que 45% de proteínas, ou opcionalmente menos que 30%, dos sólidos totais no extrato seco do gênero Pichia.

[0059] Em certas modalidades, o extrato seco do gênero Pichia compreende mananos, manoses polimerizadas sob a forma de oligossacarídeos e polissacarídeos, cujo peso molecular médio ponderado é de cerca de 180 a cerca de 800.000 Da, opcionalmente, de cerca de 5.000 a cerca de 515.000 Da, opcionalmente de cerca de

6.000 a cerca de 270.000 Da de extrato seco do gênero Pichia. Em certas modalidades, pelo menos 70% (ou cerca de 70%), opcionalmente pelo menos 75% (ou cerca de 75%), pelo menos 80% (ou cerca de 80%), opcionalmente pelo menos 85% (ou cerca de 85%), pelo menos 90% (ou cerca de 90%), opcionalmente pelo menos 95% (ou cerca de 95%), ou 100% (ou cerca de 100%) dos oligossacarídeos e polissacarídeos no extrato seco do gênero Pichia estão dentro das faixas de peso molecular ponderado supracitadas.

[0060] Em certas modalidades, o processo de extração inclui uma etapa, após a etapa de hidrólise enzimática de proteínas, de remover (por exemplo, através de filtração) proteínas que tenham um peso molecular médio ponderado menor que 5.000 Da. Consequentemente, os extratos do gênero Pichia são livres de ou substancialmente livres de proteínas e/ou peptídeos que têm um peso molecular médio ponderado menor que 5.000 Da.

[0061] Em certas modalidades, o processo de extração descrito acima pode incluir uma etapa de desodorização, alvejamento e/ou estabilização do extrato do gênero Pichia antes das filtrações. As filtrações podem ser as seguintes: - Filtração por prensa, e - filtração de esterilização.

[0062] Em certas modalidades, os extratos usados pertencem à variedade Pichia anomala. Um exemplo não limitador específico de um processo de produção é descrito abaixo. - Extratos (ou leveduras) de Pichia anomala são cultivados em um meio de cultura adaptado a seu desenvolvimento e, então, centrifugados para recuperar a biomassa, - A biomassa é, então, moída em um moinho de bolas. Então, o material triturado é ressuspenso em água a uma concentração de 50 gramas por litro, antes da hidrólise enzimática em meio básico a 30 °C durante 6 horas, - Após a hidrólise, o produto é centrifugado e filtrado antes da esterilização, - Por meio de sucessivas filtrações em filtros de tamanhos diferentes, é obtido um hidrolisado contendo ao menos 30% de mananos em relação ao peso total dos sólidos e/ou são obtidas proteínas com peso molecular médio ponderado específico. (O hidrolisado assim obtido está sob a forma de uma solução aquosa líquida límpida de cor amarela clara.)

[0063] Em certas modalidades, o extrato de Pichia anomala é obtido de acordo com os seguintes exemplos de fabricação:

1. Extrato A de Pichia anomala: I. Extração do extrato A de Pichia anomala: A preparação do extrato A de Pichia anomala inclui as seguintes etapas: - cultura de levedura de Pichia anomala em um ambiente adaptado ao seu desenvolvimento, - centrifugação para recuperar a biomassa, - solubilização de biomassa, - hidrólise enzimática em pH básico, - separação das fases solúveis e insolúveis, - tratamento térmico, - filtração, e - filtração estéril. II. Caracterização do extrato A de Pichia anomala: O extrato A de Pichia anomala obtido acima é caracterizado por: - - um teor de sólidos entre 48 e 84 g/l, - - um pH entre 4 e 9, - - um teor de proteína entre 19 e 48 g/l, e - - um teor total de açúcar entre 10 e 42 g/l.

2. Extrato B de Pichia anomala I. Extração do extrato B de Pichia anomala: A preparação do extrato B de Pichia anomala inclui as seguintes etapas: - cultura de levedura de Pichia anomala em um ambiente adaptado ao seu desenvolvimento,

- centrifugação para recuperar a biomassa, - solubilização de biomassa, - hidrólise enzimática em pH ácido, - separação das fases solúveis e insolúveis, - tratamento térmico, - filtração, e - filtração estéril. II. Caracterização do extrato B de Pichia anomala: O extrato B de Pichia anomala obtido acima é caracterizado por: - - um teor de sólidos entre 58 e 95 g/l, - - um pH entre 4 e 9, - - um teor de proteína entre 23 e 54 g/l, e - - um teor de açúcar total entre 12 e 32 g/l.

3. Extrato C de Pichia anomala I. Extração do extrato C de Pichia anomala: A preparação do extrato C de Pichia anomala inclui as seguintes etapas: - cultura de levedura de Pichia anomala em um ambiente adaptado ao seu desenvolvimento, - centrifugação para recuperar a biomassa, - solubilização de biomassa, - hidrólises enzimáticas sucessivas em meio básico, - separação das fases solúveis e insolúveis, - tratamento térmico, - filtração, e - filtração estéril. II. Caracterização do extrato C de Pichia anomala: O extrato C de Pichia anomala obtido acima é caracterizado por:

- - um teor de sólidos entre 91 e 195 g/l, - - um pH entre 4 e 9, - - um teor de proteína entre 36 e 111 g/l, e - - um teor total de açúcar entre 18 e 65 g/l.

4. Extrato D de Pichia anomala I. Extração do extrato D de Pichia anomala: A preparação do extrato D de Pichia anomala inclui as seguintes etapas: - cultura de levedura de Pichia anomala em um ambiente adaptado ao seu desenvolvimento, - centrifugação para recuperar a biomassa, - solubilização de biomassa, - hidrolisado simultaneamente com pelo menos duas enzimas em pH ácido, - separação das fases solúveis e insolúveis, - tratamento térmico, - filtração, e - filtração estéril. II. Caracterização do extrato D de Pichia anomala: O extrato D de Pichia anomala obtido acima é caracterizado por: - - um teor de sólidos entre 5 e 53 g/l, - - um pH entre 4 e 9, - - um teor de proteína entre 2 e 30 g/l, e - - um teor total de açúcar entre 1 e 18 g/l.

5. Extrato E de Pichia anomala I. Extração do extrato E de Pichia anomala: A preparação do extrato E de Pichia anomala inclui as seguintes etapas: - cultura de levedura de Pichia anomala em um ambiente adaptado ao seu desenvolvimento, - centrifugação para recuperar a biomassa, - solubilização da biomassa em um ambiente hidroglicólico, - hidrolisado simultaneamente com pelo menos duas enzimas em pH ácido, - separação das fases solúveis e insolúveis, - tratamento térmico, - filtração, e - filtração estéril. II. Caracterização do extrato E de Pichia anomala: O extrato E de Pichia anomala obtido acima é caracterizado por: - - um teor de sólidos entre 172 e 300 g/l, - - um pH entre 4 e 9, - - um teor de proteína entre 69 e 170 g/l, e - - um teor total de açúcar entre 34 e 100 g/l.

[0064] Em certas modalidades, o extrato, ou fonte de extratos, do gênero Pichia compreende oligossacarídeos e polissacarídeos que têm um grau médio de polimerização de DP 1 a DP 4.444, opcionalmente de DP 30 a DP 2.860, opcionalmente de DP 35 a DP 1.500. Em certas modalidades, pelo menos 70% (ou cerca de 70%), opcionalmente pelo menos 75% (ou cerca de 75%), pelo menos 80% (ou cerca de 80%), opcionalmente pelo menos 85% (ou cerca de 85%), pelo menos 90% (ou cerca de 90%), opcionalmente pelo menos 95% (ou cerca de 95%), ou 100% (ou cerca de 100%) dos oligossacarídeos e polissacarídeos no extrato seco do gênero Pichia estão dentro do grau médio supracitado de faixas de polimerização.

[0065] Em certas modalidades, o extrato, ou a fonte de extratos, do gênero Pichia está presente nas composições da presente invenção, de modo a fornecer uma concentração de extrato de Pichia nas, ou em contato com as, células de tecido corneal do usuário (isto é, níveis de fluido corneal interno), após aplicação tópica de ao menos 0,3 mg/ml (ou cerca de 0,3 mg/ml), opcionalmente ao menos 0,5 mg/ml (ou cerca de 0,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 1 mg/ml (ou cerca de 1 mg/ml), opcionalmente ao menos 1,5 mg/ml (ou cerca de 1,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 2 mg/ml (ou cerca de 2 mg/ml), opcionalmente ao menos 2,5 mg/ml (ou cerca de 2,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 3 mg/ml (ou cerca de 3 mg/ml), opcionalmente ao menos 3,5 mg/ml (ou cerca de 3,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 4 mg/ml (ou cerca de 4 mg/ml), opcionalmente ao menos 4,5 mg/ml (ou cerca de 4,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 5 mg/ml (ou cerca de 5 mg/ml), ou ao menos 5,5 mg/ml (ou cerca de 5,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 6 mg/ml (ou cerca de 6 mg/ml), ou opcionalmente ao menos 6,5 mg/ml (ou cerca de 6,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 7 mg/ml (ou cerca de 7 mg/ml), opcionalmente ao menos 7,5 mg/ml (ou cerca de 7,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 8 mg/ml (ou cerca de 8 mg/ml), opcionalmente ao menos 8,5 mg/ml (ou cerca de 8,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 9 mg/ml (ou cerca de 9 mg/ml), opcionalmente ao menos 8,5 mg/ml (ou cerca de 8,5 mg/ml), opcionalmente ao menos 9 mg/ml (ou cerca de 9 mg/ml), opcionalmente ao menos 9,5 mg/ml (ou cerca de 9,5 mg/ml), ou opcionalmente ao menos 10 mg/ml (ou cerca de 10 mg/ml) até 100 mg/ml (ou cerca de 100 mg/ml), opcionalmente até 95 mg/ml (ou cerca de 95 mg/ml), opcionalmente até 90 mg/ml (ou cerca de 90 mg/ml), opcionalmente até 85 mg/ml (ou cerca de 85 mg/ml), opcionalmente até 80 mg/ml (ou cerca de 80 mg/ml), opcionalmente até 75 mg/ml (ou cerca de 75 mg/ml), opcionalmente até 70 mg/ml (ou cerca de 70 mg/ml), opcionalmente até 65 mg/ml (ou cerca de 65 mg/ml), opcionalmente até 60 mg/ml (ou cerca de 60 mg/ml), opcionalmente até 55 mg/ml (ou cerca de 55 mg/ml), opcionalmente até 50 mg/ml (ou cerca de 50 mg/ml),

opcionalmente até 45 mg/ml (ou cerca de 45 mg/ml), opcionalmente até 40 mg/ml (ou cerca de 40 mg/ml), opcionalmente até 35 mg/ml (ou cerca de 35 mg/ml), opcionalmente até 30 mg/ml (ou cerca de 30 mg/ml), opcionalmente até 25 mg/ml (ou cerca de 25 mg/ml), opcionalmente até 20 mg/ml (ou cerca de 20 mg/ml), ou opcionalmente até 15 mg/ml (ou cerca de 15 mg/ml).

[0066] Em certas modalidades, o extrato, ou fonte de extratos, do gênero Pichia está presente nas composições da presente invenção a uma concentração de 0,01% (ou cerca de 0,01%), opcionalmente, de 0,05% (ou cerca de 0,05%), opcionalmente, de 0,1% (ou cerca de 0,1%), opcionalmente, de 0,5% (ou cerca de 0,5%), opcionalmente, de 1% (ou cerca de 1%), opcionalmente, de 1,5% (ou cerca de 1,5%), opcionalmente, de 2% (ou cerca de 2%), opcionalmente, de 2,5% (ou cerca de 2,5%), opcionalmente, de 3% (ou cerca de 3%), opcionalmente, de 3,5%, (ou cerca de 3,5%), opcionalmente, de 4% (ou cerca de 4%), opcionalmente, de 4,5% (ou cerca de 4,5%), opcionalmente, de 5% (ou cerca de 5%), opcionalmente, de 5,5% (ou cerca de 5,5%), opcionalmente, de 6% (ou cerca de 6%), opcionalmente, de 6,5% (ou cerca de 6,5%), opcionalmente, de 7% (ou cerca de 7%), opcionalmente, de 7,5% (ou cerca de 7,5%), opcionalmente, de 8% (ou cerca de 8%), opcionalmente, de 8,5% (ou cerca de 8,5%), opcionalmente, de 9% (ou cerca de 9%), opcionalmente, de 9,5% (ou cerca de 9,5%), opcionalmente, de 10% (ou cerca de 10%), opcionalmente, de 10,5% (ou cerca de 10,5%), opcionalmente, de 11% (ou cerca de 11%), opcionalmente, de 11,5% (ou cerca de 11,5%), opcionalmente, de 12% (ou cerca de 12%), opcionalmente, de 12,5% (ou cerca de 12,5%), opcionalmente, de 13% (ou cerca de 13%), opcionalmente, de 13,5% (ou cerca de 13,5%), opcionalmente, de 14% (ou cerca de 14%), opcionalmente, de 14,5% (ou cerca de 14,5%), opcionalmente, de 15% (ou cerca de 15%),

opcionalmente, de 15,5% (ou cerca de 15,5%), opcionalmente, de 16% (ou cerca de 16%), opcionalmente, de 16,5% (ou cerca de 16,5%), opcionalmente, de 17% (ou cerca de 17%), opcionalmente, de 17,5% (ou cerca de 17,5%), opcionalmente, de 18% (ou cerca de 18%), opcionalmente, de 18,5% (ou cerca de 18,5%), opcionalmente, de 19% (ou cerca de 19%), opcionalmente, de 19,5% (ou cerca de 19,5%), opcionalmente, de 20% (ou cerca de 20%), opcionalmente, de 20,5% (ou cerca de 20,5%) a 30% (ou cerca de 30%), opcionalmente, a 35% (ou cerca de 35%), opcionalmente, a 40% (ou cerca de 40%), opcionalmente, a 45% (ou cerca de 45%), opcionalmente, a 50% (ou cerca de 50%), opcionalmente, a 55% (ou cerca de 55%), opcionalmente, a 60% (ou cerca de 60%), opcionalmente, a 65% (ou cerca de 65%), opcionalmente, a 70% (ou cerca de 70%), opcionalmente, a 75% (ou cerca de 75%), opcionalmente, a 80% (ou cerca de 80%), opcionalmente, a 85% (ou cerca de 85%), opcionalmente, a 90% (ou cerca de 90%), opcionalmente, a 95% (ou cerca de 95%), ou opcionalmente, a 100% (ou cerca de 100%), em peso, da composição total. Intensificador de permeação

[0067] Em certas modalidades, as composições da presente invenção compreendem opcionalmente um intensificador de permeação.

[0068] Intensificadores de permeação adequados incluem (selecionados de ou selecionados a partir do grupo que consiste em), isoladamente ou em combinação, tensoativos, como saponinas, polioxietileno, éteres de polioxietileno de ácidos graxos, como éter 4-, 9-, 10- e 23-laurílico de polioxietileno, éter 10- e 20-cetílico de polioxietileno, éter 10-e 20-estearílico de polioxietileno, mono-oleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monolaurato de polioxietileno, polioxietileno sorbitanos, como monolaurato de polioxietileno sorbitano, decametônio, brometo de decametônio e brometo de dodeciltrimetilamônio; quelantes como poliácidos naturais (por exemplo, ácido cítrico), sais de fosfato (por exemplo, pirofosfato dissódico), fosfonatos, bisfosfonatos (por exemplo, ácido etridrônico), ácidos aminocarboxílicos (por exemplo, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e EDTA dissódico) e etilenodiamina- ácido N, N’-dissuccínico (EDDS)); sais biliares e ácidos, como ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido glicocólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, colato de sódio, glicocolato de sódio, glicocolato, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicodesoxicolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, ácido quenodesoxicólico e ácido ursodesoxicólico; derivados de ácido fusídico, ácido glicirrízico e glicirrizida de amônio, com EDTA de saponina, ácido fusídico, éter 9-laurílico de polioxietileno, éter 20-estearílico de polioxietileno, glicocolato ou misturas do qualquer um dos supracitados.

[0069] A concentração de intensificador de permeação administrada precisa ser a quantidade mínima necessária para aumentar suficientemente a absorção do composto e/ou extrato através da membrana mucosa ou de outras membranas de barreira do olho. De modo geral, concentrações na faixa de 0,01% (ou cerca de 0,01%), opcionalmente de 0,05% (ou cerca de 0,05%), opcionalmente de 0,1% (ou cerca de 0,1%), opcionalmente de 0,15% (ou cerca de 0,15%), opcionalmente de 0,2% (ou cerca de 0,2%), opcionalmente de 0,25% (ou cerca de 0,25%) a 2% (ou cerca de 2%), opcionalmente até 2,5% (ou cerca de 2,5%), opcionalmente, a 3% (ou cerca de 3%), opcionalmente até 3,5%, (ou cerca de 3,5%), opcionalmente até 4% (ou cerca de 4%), opcionalmente até 4,5% (ou cerca de 4,5%), opcionalmente até 5% (ou cerca de 5%), opcionalmente até 5,5% (ou cerca de 5,5%), opcionalmente até 6% (ou cerca de 6%), opcionalmente até 6,5% (ou cerca de 6,5%), opcionalmente até 7% (ou cerca de 7%), opcionalmente até 7,5% (ou cerca de 7,5%), opcionalmente até 8% (ou cerca de 8%), opcionalmente até 8,5% (ou cerca de 8,5%), opcionalmente até 9% (ou cerca de 9%),

opcionalmente até 9,5% (ou cerca de 9,5%), opcionalmente até 10% (ou cerca de 10%), opcionalmente até 10,5% (ou cerca de 10,5%), opcionalmente até 11% (ou cerca de 11%), opcionalmente até 11,5% (ou cerca de 11,5%), opcionalmente até 12% (ou cerca de 12%), opcionalmente até 12,5% (ou cerca de 12,5%), opcionalmente até 13% (ou cerca de 13%), opcionalmente até 13,5% (ou cerca de 13,5%), opcionalmente até 14% (ou cerca de 14%), opcionalmente até 14,5% (ou cerca de 14,5%), opcionalmente até 15% (ou cerca de 15%), opcionalmente até 15,5% (ou cerca de 15,5%), opcionalmente até 16% (ou cerca de 16%), opcionalmente até 16,5% (ou cerca de 16,5%), opcionalmente até 17% (ou cerca de 17%), opcionalmente até 17,5% (ou cerca de 17,5%), opcionalmente até 18% (ou cerca de 18%), opcionalmente até 18,5% (ou cerca de 18,5%), opcionalmente até 19% (ou cerca de 19%), opcionalmente até 19,5% (ou cerca de 19,5%), opcionalmente até 20% (ou cerca de 20%) do total da composição (p/v), são úteis nas composições da presente invenção. Veículo oftalmologicamente aceitável

[0070] As composições da presente invenção compreendem, também, um veículo aquoso de emulsão óleo em água, ou de água em óleo. O veículo é oftalmologicamente aceitável. Veículos de óleo em água e de água em óleo úteis podem ser encontrados na publicação de patente US 20030165545A1 e nas patentes US n° 9480645, US n° 8828412 e US n° 8496976, estando cada um dos documentos de patente aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

[0071] O veículo oftalmologicamente aceitável (ou as composições da presente invenção) podem opcionalmente compreender um ou mais excipientes adicionais e/ou um ou mais ingredientes ativos adicionais. Exemplos desses componentes opcionais são descritos abaixo.

[0072] Os excipientes comumente usados em composições oftálmicas incluem, mas não se limitam a, demulcentes, agentes de tonicidade, conservantes, agentes quelantes, agentes tamponantes (diferentes e além dos ácidos orgânicos da presente invenção) e tensoativos. Outros excipientes compreendem agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes acentuadores de conforto, polímeros, emolientes, agentes de ajuste de pH (diferentes e além dos ácidos orgânicos da presente invenção), e/ou lubrificantes. Qualquer um dentre uma variedade de excipientes pode ser usado nas composições da presente invenção incluindo água, misturas de água e solventes miscíveis em água, como óleos vegetais ou óleos minerais compreendendo de 0,5% a 5% de polímeros solúveis em água não tóxicos, produtos naturais, como ágar e acácia, derivados de amido, como acetato de amido e hidroxipropilamido, e também outros produtos sintéticos, como poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, poli(éter metilvinílico), poli(óxido de etileno) e, de preferência, poli(ácido acrílico) reticulado e misturas dos mesmos.

[0073] Os demulcentes ou agentes suavizantes usados com modalidades da presente invenção incluem, mas não se limitam a, derivados de celulose (como hidroxietilcelulose, metilcelulose, hipromelose ou misturas dos mesmos), ácido hialurônico, extrato de semente de tamarindo, glicerina, polivinilpirrolidona, poli(óxido de etileno), poli(glicol etilênico), glicol propilênico e poli(ácido acrílico), e misturas dos mesmos. Em certas modalidades, um ou mais dentre ácido hialurônico, propilenoglicol, extrato de semente de tamarindo, glicerina e/ou poli(glicol etilênico) 400 são os demulcentes ou agentes suavizantes. Em certas modalidades, o demulcente ou agente suavizante é selecionado dentre ácido hialurônico, extrato de semente de tamarindo ou misturas dos mesmos.

[0074] As composições da presente invenção são oftalmicamente adequadas para aplicação aos olhos de um indivíduo. O termo "aquoso" tipicamente denota uma formulação aquosa em que o excipiente é > que cerca de 50%, com mais preferência > que cerca de 75% e particularmente > que cerca de 90% em peso de água. Em certas modalidades, as composições da presente invenção são essencialmente isentas de compostos que irritam os olhos. Em certas modalidades, as composições da presente invenção são essencialmente isentas de ácidos graxos livres e alcoóis C1 a C4. Em certas modalidades, as composições da presente invenção compreendem menos que 40% (ou cerca de 40%), opcionalmente menos que 35% (ou cerca de 35%), opcionalmente menos que 30% (ou cerca de 30%), opcionalmente menos que 25% (ou cerca de 25%), opcionalmente menos que 20% (ou cerca de 20%), opcionalmente menos que 15% (ou cerca de 15%), opcionalmente menos que 10% (ou cerca de 10%) ou, opcionalmente, menos que 5% (ou cerca de 5%), em peso, do total da composição, de um excipiente ou solvente orgânico não alcoólico. Estas gotas podem ser fornecidas a partir de uma ampola de dose única que pode ser, de preferência, estéril, tornando, desse modo, os componentes bacteriostáticos da formulação desnecessários. Alternativamente, as gotas podem ser distribuídas a partir de um frasco de múltiplas doses que pode, de preferência, compreender um dispositivo que extrai qualquer conservante da composição conforme ela é liberada, sendo tais dispositivos conhecidos na técnica.

[0075] Em certas modalidades, as composições da presente invenção são isotônicas, ou ligeiramente hipotônicas para combater qualquer hipertonicidade das lágrimas causada por evaporação e/ou doença. Isso pode exigir um agente de tonicidade para trazer a osmolalidade da formulação para um nível de ou próximo a 210 a 320 miliosmols por quilograma (mOsm/kg). As composições da presente invenção têm, em geral, uma osmolalidade na faixa de 220 a 320 mOsm/kg ou, opcionalmente, têm uma osmolalidade na faixa de 235 a 300 mOsm/kg. As composições oftálmicas serão, em geral, formuladas como soluções aquosas estéreis.

[0076] A osmolalidade das composições da presente invenção pode ser ajustada com agentes de tonicidade até um valor que seja compatível com o uso pretendido das composições. Por exemplo, a osmolalidade da composição pode ser ajustada para se aproximar da pressão osmótica do fluido lacrimal normal, a qual é equivalente a cerca de 0,9% p/v de cloreto de sódio em água. Exemplos de agentes de ajuste de tonicidade adequados incluem, mas não se limitam a, cloreto de sódio, potássio, cálcio e magnésio; dextrose; glicerina; propilenoglicol; manitol; sorbitol e similares, e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, uma combinação de cloreto de sódio e cloreto de potássio é usada para ajustar a tonicidade da composição.

[0077] As composições da presente invenção podem também ser usadas para administrar compostos farmaceuticamente ativos. Tais compostos incluem, mas não se limitam a, produtos terapêuticos para glaucoma, analgésicos, medicações anti-inflamatórias e anti-alérgicas, e antimicrobianos. Exemplos mais específicos de compostos farmaceuticamente ativos incluem betaxolol, timolol, pilocarpina, inibidores da anidrase carbônica e prostaglandinas; antagonistas dopaminérgicos; agentes anti-hipertensivos pós-operatórios, como para-amino clonidina (apraclonidina); anti-infectivos como ciprofloxacina, moxifloxacina, tobramicina; anti-inflamatórios não esteroidais e esteroidais, como naproxeno, diclofenaco, nepafenaco, suprofeno, cetorolaco, tetra- hidrocortisol e dexametasona; produtos terapêuticos para olhos secos como inibidores de PDE4; e medicações antialérgicas como inibidores H1/H4, inibidores H4, olopatadina e misturas dos mesmos.

[0078] É também contemplado que as concentrações dos ingredientes compreendendo as formulações da presente invenção podem variar. O versado na técnica na técnica entenderia que as concentrações podem variar dependendo da adição, substituição e/ou subtração de componentes em uma dada formulação.

[0079] Em certas modalidades, as composições da presente invenção podem ter um pH que é compatível com o uso pretendido, e está frequentemente na faixa de 4 (ou cerca de 4) até 10 (ou cerca de 10), opcionalmente entre 6 (ou cerca de 6) e 8 (ou cerca de 8), opcionalmente entre 6,5 (ou cerca de 6,5) e 7,5 (ou cerca de 7,5), ou opcionalmente entre 6,8 (ou cerca de 6,8) até 7,2 (ou cerca de 7,2).

[0080] Em certas modalidades, pode-se empregar vários tampões convencionais, como fosfato, borato, citrato, acetato, histidina, tris, bis tris e similares, bem como misturas dos mesmos. Os tampões de borato incluem ácido bórico e seus sais, como borato de sódio ou potássio. Também podem ser empregados o tetraborato de potássio ou o metaborato de potássio, que produzem ácido bórico ou um sal de ácido bórico em solução. Os sais hidratados, como borato de sódio deca- hidratado, também podem ser usados. Os tampões de fosfato incluem ácido fosfórico e seus sais; por exemplo, M 2HPO4 e MH2PO4, sendo que M é um metal alcalino como sódio e potássio. Também podem ser usados sais hidratados. Em uma modalidade da presente invenção, Na2HPO4.7H 2O e NaH2PO2.H2O são usados como tampões. O termo fosfato inclui também compostos que produzem ácido fosfórico ou um sal de ácido fosfórico em solução. Adicionalmente, podem também ser empregados contraíons orgânicos para os tampões acima. A concentração de tampão geralmente varia de cerca de 0,01 a 2,5% p/v e, com mais preferência, varia de cerca de 0,05 a cerca de 0,5% p/v.

[0081] Em certas modalidades, a viscosidade das composições da presente invenção situa-se na faixa de cerca de 1 cerca de 500 cps, opcionalmente de cerca de 10 cerca de 200 cps ou, opcionalmente, de cerca de 10 cerca de 100 cps, quando medida com o uso de um reômetro AR 2000 da TA Instrument. O reômetro AR 2000 da TA Instrument deve ser usado com o método de teste de fluxo AR2000 do software TA Rheological Advantage, com uma geometria de placa de aço de 40 mm;

as faixas de viscosidade devem ser obtidas mediante a medição de fluxo em estado estacionário, controlando a taxa de cisalhamento de 0 s-1 a 200 s-1.

[0082] Em certas modalidades, as composições da presente invenção são úteis como, e sob a forma de, solução de colírio, solução para lavagem dos olhos, solução lubrificante e/ou umidificadora para lentes de contato, aspersão, névoa ou qualquer outra maneira de administrar uma composição aos olhos.

[0083] As composições da presente invenção podem também ser úteis como, e sob a forma de, soluções de embalagem para lentes de contato. Em certas modalidades, como soluções de embalagem, as composições da presente invenção podem ser vedadas em uma embalagem blister e, também, adequada para ser submetida a esterilização.

[0084] Exemplos de embalagens tipo blister e técnicas de esterilização são descritos nas seguintes referências que estão aqui incorporadas a título de referência em suas totalidades, Patentes US n°s D435.966; 4.691.820; 5.467.868; 5.704.468; 5.823.327; 6.050.398,

5.696.686. 6.018.931; 5.577.367; e 5.488.815. Esta porção do processo de fabricação apresenta um outro método para tratar dispositivos oftálmicos com agente antialérgico, a saber, adicionar agentes antialérgicos a uma solução antes de vedar a embalagem e, subsequentemente, esterilizar a embalagem. Esse é o método preferencial de tratamento para dispositivos oftálmicos com agentes anti-alérgicos.

[0085] A esterilização pode ocorrer em diferentes temperaturas e períodos de tempo. As condições de esterilização preferenciais ficam na faixa de cerca de 100°C durante cerca de 8 horas até cerca de 150°C durante cerca de 0,5 minuto. As condições de esterilização mais preferenciais ficam na faixa de cerca de 115°C a durante cerca de 2,5 horas até cerca de 130°C durante cerca de 5,0 minutos. As condições de esterilização de máxima preferência são de cerca de 124°C durante cerca de 18 minutos.

[0086] Quando usadas como soluções de embalagem, as composições da presente invenção podem ser soluções à base de água. As típicas soluções de embalagem incluem, mas não se limitam a, soluções salinas, outras soluções tamponadas e água desionizada. Em certas modalidades, a solução de embalagem é uma solução aquosa de água desionizada ou solução salina, contendo sais que incluem, sem limitação, cloreto de sódio, borato de sódio, fosfato de sódio, hidrogenofosfato de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio ou os correspondentes sais de potássio dos mesmos. Esses ingredientes são geralmente combinados para formar soluções tamponadas que incluem um ácido e sua base conjugada, de modo que a adição de ácidos e bases cause apenas uma alteração relativamente pequena no pH. Em certas modalidades, o pH da solução de embalagem é conforme descrito acima. As soluções tamponadas podem incluir, adicionalmente, ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico (MES), hidróxido de sódio, 2,2-bis(hidroximetil)- 2,2’,2”-nitrilotrietanol, ácido n-tris(hidroximetil)metil-2- aminoetanossulfônico, ácido cítrico, citrato de sódio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, ácido acético, acetato de sódio, ácido etilenodiamino tetra-acético e similares, bem como combinações dos mesmos. De preferência, a solução é uma solução salina tamponada com borato ou com fosfato, ou água desionizada. A solução particularmente preferencial contém de cerca de 500 ppm a cerca de 18.500 ppm de borato de sódio, sendo mais particularmente preferencial cerca de 1.000 ppm de borato de sódio.

[0087] Se quaisquer ingredientes incorporados às soluções de embalagem estiverem sujeitos à degradação oxidativa, podem ser adicionados agentes que estabilizam as soluções de embalagem contendo tais ingredientes.

Esses "agentes de estabilização oxidativa" incluem, mas não se limitam a, quelantes como EDTA, Dequest, Desferal, sílica, derivados de quitina como quitosano, celulose e seus derivados, e N,N,N’,N’,N”, N”-hexa(2-piridil)-1,3,5- tris(aminometil)benzeno, e certos ligandos macrocíclicos como éteres de coroa, ligandos contendo nós e catenandos.

Consulte David A.

Leigh et al Angew.

Chem Int.

Ed., 2001, 40, No. 8, páginas 1538-1542 e Jean-Claude Chambron et al.

Pure & Appl.

Chem., 1990, Vol. 62, No. 6, páginas 1027-1034. Os agentes de estabilização oxidativa podem incluir outros compostos que inibem oxidações, como aqueles selecionados do grupo que consiste em 2,2',2",6,6',6"-hexa-(1,1- dimetiletil)4,4',4"-[(2,4,6-trimetil-1,3,5-benzenotriil)-trismetileno]- trifenol (Irganox 1330), 1,3,5tris[3,5-di(1,1-dimetiletil)4-hidroxibenzil]- 1H,3H,5H-1,3,5-triazino-2,4,6-triona, pentaeritritil tetraquis[3-[3,5- di(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]-propionato], octadecil-3-[3,5-di(1,1- dimetiletil)-4-hidroxifenil]-propionato, tris[2,4-di(1,1-dimetiletil)-fenil]- fosfito, 2,2'-di(octadeciloxi)-5,5'-espirobi(1,3,2-dioxafosforinano), dissulfeto de dioctadecila, didodecil-3,3'-tiodipropionato, dioctadecil- 3,3'-tiodipropionato, butil-hidroxitolueno, etileno bis[3,3-di[3-(1,1- dimetiletil)-4-hidroxifenil]butirato] e misturas dos mesmos.

Os agentes de estabilização oxidativa preferenciais são ácido dietilenotriaminapentaacético ("DTPA"), ou sais de DTPA, como CaNa3DTPA, ZnNa3DTPA e Ca2DTPA.

Consulte o pedido US de Patente n° 60/783.557, depositado em 17 de março de 2006, intitulado "Methods for Stabilizing Oxidatively Unstable Pharmaceutical Compositions" e seu depósito não provisório correspondente, que estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.

Em certas modalidades, a concentração de agentes de estabilização oxidativa na solução é de cerca de 2,5 µmoles/litro a cerca de 5.000 µmoles/litro, opcionalmente de cerca de 20 µmoles/litro a cerca de

1.000 µmoles/litro, opcionalmente de cerca de 100 µmoles/litro a cerca de 1.000 µmoles/litro ou, opcionalmente, de cerca de 100 µmoles/litro a cerca de 500 µmoles/litro.

[0088] Em modalidades específicas, as composições da presente invenção são formuladas para administração em qualquer frequência de administração, inclusive uma vez por semana, uma vez a cada cinco dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada dois dias, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, seis vezes ao dia, oito vezes ao dia, a cada hora, ou com uma frequência maior. Tal frequência de dosagem é também mantida por um período de tempo que varia dependendo das necessidades terapêuticas do usuário. A duração de um regime terapêutico específico pode variar desde uma única dosagem até um regime que se estende durante meses ou anos. O versado na técnica estaria familiarizado com a determinação de um regime terapêutico para uma indicação específica.

[0089] A composição e os produtos contendo tais composições da presente invenção podem ser preparados com o uso de metodologia que é bem conhecida pelo versado na técnica. Exemplos

[0090] Quaisquer composições da presente invenção, conforme descrito nos exemplos a seguir, ilustram modalidades específicas de composições da presente invenção, mas não se destinam a limitar a mesma. Outras modificações podem ser feitas pelo versado na técnica, sem que se afaste do espírito e do escopo desta invenção.

[0091] Os seguintes métodos de teste foram utilizados nos Exemplos: Exemplo 1

[0092] Os extratos de fermento de Pichia anomala (Hyalurodine) induziram a secreção de ácido hialurônico em tecidos humanos

EpiCorneal 3D, quando aplicados topicamente às células de tecido corneal. Sem se ater à teoria, acredita-se que tal aplicação tópica exija a difusão dos extratos de fermento de Pichia anomala através de estruturas de junção intercelular do tecido epicorneal humano (isto é, aquelas estruturas [por exemplo, barreiras de membrana ou de filme] tipicamente inibindo a permeação química para dentro de tecidos) a fim de atingir o interior do tecido epicorneal.

[0093] Tecidos humanos EpiCorneal 3D foram adquiridos junto à MatTek Company (Ashland, MA, EUA). Uma vez recebidos os tecidos humanos EpiCorneal 3D, estes foram incubados de um dia para o outro em meio de ensaio MatTek, seguindo as instruções do fabricante. Os tecidos humanos EpiCorneal 3D foram divididos em cinco grupos de tratamento com três tecidos por grupo. Quatro concentrações de extratos de fermento de Pichia anomala (Hyalurodine), de 1,95 mg/ml, 7,8 mg/ml, 19,5 mg/ml e 39 mg/ml em veículo de solução aquosa tamponada com fosfato (STF) foram topicamente aplicadas, respectivamente, à superfície de epitélio corneal de quatro dos grupos de tratamento (de modo que os extratos de fermento de Pichia anomala fossem liberados através das supracitadas estruturas de junção intercelular). Os tecidos epicorneais em todos os cinco grupos de tratamento foram deixados incubar durante dois dias. O extrato de fermento de Pichia anomala foi fornecido por Silab, de St. Viance, França. Após os dois dias, os meios de cultura foram coletados para medir-se a secreção do ácido hialurônico (HA) com o uso de um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para HA (K-1200, Echelon, de Salt Lake City, UT, EUA) seguindo-se o protocolo do fabricante. Para avaliar a atividade, a alteração colorimétrica foi medida com o uso de um leitor de microplacas (SpectraMax M2E, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Esse ensaio emprega a técnica competitiva de ensaio imunossorvente ligado a enzima, então há uma correlação inversa entre a concentração de HA na amostra e a alteração colorimétrica. Foi gerada uma curva padrão, com a concentração de HA no eixo geométrico x e a absorbância no eixo geométrico y, a fim de indicar a concentração de HA correspondente. Os resultados foram mostrados na Figura 1.

[0094] Embora os resultados sugiram que a aplicação tópica na concentração testada indica direcionalmente a indução da produção de HA nas células corneais, fatores como as estruturas de junção intercelular (ou outras barreiras de superfície de camada de membrana ou filme) podem reduzir a concentração de Pichia anomala que chega aos tecidos internos da córnea. Em tais situações, as modalidades da presente invenção incorporando intensificadores de penetração podem ser úteis. Exemplo 2

[0095] Para reduzir a obstrução potencialmente causada pelas supracitadas estruturas de junção intercelular (ou barreiras de membrana ou filme), a indução da secreção de ácido hialurônico em tecidos humanos EpiCorneal 3D foi observada colocando-se os tecidos corneais em contato com o meio de crescimento contendo extratos de fermento de Pichia anomala (Hyalurodine) (isto é meio "tratado"), de modo que as camadas celulares de fundo dos tecidos corneais (isto é, as camadas celulares que não têm estruturas de junção intercelular inibindo a permeação química nos tecidos) foram imersas no meio de crescimento. Ao se colocar a camada celular de fundo dos tecidos corneais em contato com o meio de crescimento contendo os extratos de fermento de Pichia anomala, o extrato pode entrar diretamente em contato e se mover para cima, para dentro dos tecidos corneais internos, sem precisar primeiro passar através de quaisquer estruturas de junção intercelular ou outra barreira de superfície, proporcionando biodisponibilidade melhorada de Pichia anomala no interior das células de tecido corneal.

[0096] Tecidos humanos EpiCorneal 3D foram adquiridos junto à MatTek Company (Ashland, MA, EUA). Uma vez recebidos os tecidos humanos EpiCorneal 3D, estes foram incubados de um dia para o outro em meio de ensaio MatTek, seguindo as instruções do fabricante. Os tecidos humanos EpiCorneal 3D foram divididos em cinco grupos de tratamento com três tecidos por grupo. Os extratos de fermento de Pichia anomala (Hyalurodine) foram adicionados no meio de cultura de quatro dentre os grupos de tratamento para produzir, no meio, concentrações de 0,39 mg/ml, 0,78 mg/ml, 1,56 mg/ml e 1,95 mg/ml, respectivamente, para entrar em contato com a camada celular de fundo dos tecidos epicorneais humanos. Os tecidos epicorneais em todos os cinco dentre os grupos de tratamento foram deixados incubar durante dois dias. O extrato de fermento de Pichia anomala foi fornecido por Silab, de St. Viance, França. Após os dois dias, os meios de cultura foram coletados para medir-se a secreção do ácido hialurônico (HA) com o uso de um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para HA (K-1200, Echelon, de Salt Lake City, UT, EUA) seguindo-se o protocolo do fabricante. Para avaliar a atividade, a alteração colorimétrica foi medida com o uso de um leitor de microplacas (SpectraMax M2E, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Esse ensaio emprega a técnica competitiva de ensaio imunossorvente ligado a enzima, então há uma correlação inversa entre a concentração de HA na amostra e a alteração colorimétrica. Foi gerada uma curva padrão, com a concentração de HA no eixo geométrico x e a absorbância no eixo geométrico y, a fim de indicar a concentração de HA correspondente. Os resultados foram mostrados na Figura 2.

[0097] Os resultados mostram que um aumento estatisticamente significativo na produção de HA nas células do tecido corneal foi observado nessas concentrações ambientais de ao menos 0,3 mg/ml de Pichia anomala no tecido (isto é, concentrações de extrato de Pichia anomala em contato com tais células de tecido corneal interno [por exemplo, concentrações no nível de fluido corneal]).

[0098] As soluções podem ser preparadas contendo um ou mais dos compostos e/ou extrato da presente invenção, conforme mostrado nos Exemplos 3 e 4. Exemplo 3

[0099] A Tabela 1 ilustra os componentes de tais formulações (conforme ilustrado nas formulações 3A e 3B), componentes esses que podem ser incorporados conforme descrito abaixo, com o uso de tecnologia de misturação convencional. Tabela 1 3A 3B Útil para aliviar a irritação causada por Útil para aliviar a irritação causada por olhos secos olhos secos pelo uso de lente de contato INGREDIENTE % em peso quantidade por % em peso quantidade por batelada (g) batelada (g) Hialuronato de sódio 0,20 2,0 0,15 1,5 Extrato de Pichia anomala 2,0 20,0 5,0 50,0 Polissorbato-80 1,0 10,0 2,0 20,0 Polissorbato 20 5,0 50,0 10,0 100,0 Poli(glicol etilênico) 400 0,25 2,5 0 0 Ácido bórico 0,60 6,0 0,60 6,0 Borato de sódio 0,05 0,50 0,05 0,50 Cloreto de sódio* Cloreto de potássio 0,10 1,0 0,10 1,0 Cloreto de cálcio di-hidratado 0,006 0,06 0,006 0,06 Cloreto de magnésio 0,006 0,06 0,006 0,06 Citrato de sódio di-hidratado 0,014 0,14 0,014 0,14 Poliquatérnio 42 (33% aquoso) 0,0015 0,015 0,0015 0,015 Citrato de sódio di-hidratado 0,014 0,14 0,014 0,14 Solução de hidróxido de sódio 1N** Solução de ácido clorídrico 1N** Água purificada*** total 100,00% 1000,0 g 100,00% 1000,00 g * ajustar para a tonicidade de 280 a 290 mOsm/kg ** ajustar para pH 7,2 *** q.s. até 100% p/p

[0100] Para os Exemplos 3A e 3B: O hialuronato de sódio pode ser fornecido pela CONTIPRO A.S. (DOLNI, DOBROUC, REPÚBLICA CHECA)

[0101] Para os Exemplos 3A e 3B: O extrato de Pichia anomala pode ser fornecido por SILAB (SAINT VIANCE, FRANCE).

[0102] Para os Exemplos 3A e 3B: O polissorbato 20 pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0103] Para os Exemplos 3A e 3B: O polissorbato 80 pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0104] Para o Exemplo 3A: O poli(glicol etilênico) 400 pode ser fornecido por Clariant Produkte (BURGKIRCHEN, ALEMANHA).

[0105] Para os Exemplos 3A e 3B: O ácido bórico pode ser fornecido por MERCK (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0106] Para os Exemplos 3A e 3B: O borato de sódio pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0107] Para os Exemplos 3A e 3B: O cloreto de sódio pode ser fornecido por Caldic (DUSSELDORF, ALEMANHA).

[0108] Para os Exemplos 3A e 3B: O cloreto de potássio pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0109] Para os Exemplos 3A e 3B: O cloreto de cálcio di-hidratado pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0110] Para os Exemplos 3A e 3B: O cloreto de magnésio pode ser fornecido por KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0111] Para os Exemplos 3A e 3B: O poliquatérnio-42 (33% aquoso) pode ser fornecido por DSM BIOMEDICAL (BERKELEY, CA, EUA).

[0112] Para os Exemplos 3A e 3B: O clorito de sódio di-hidratado pode ser fornecido por Oxychem (WICHITA, KS, EUA)

[0113] Para os Exemplos 3A e 3B: O hidróxido de sódio 1N pode ser fornecido por VWR (RADNER, PA, EUA).

[0114] Para os Exemplos 3A e 3B: O ácido clorídrico 1N pode ser fornecido por VWR (RADNER, PA, EUA). A solução 3A pode ser preparada da seguinte forma:

1. Em um béquer de 1.500 ml adiciona-se 800 gramas de água purificada USP.

2. Ao supracitado adiciona-se 10 g de polissorbato 80 e 50 g de polissorbato 20. A solução é misturada até que ambos estejam completamente misturados e dissolvidos.

3. Ao supracitado adiciona-se 20,0 g de extrato de Pichia anomala. A solução é misturada até que o extrato de Pichia anomala esteja dissolvido.

4. A solução é filtrada através de um filtro de 0,45 micron e retornada a um béquer de 1.500 ml.

5. À solução da Etapa 4 adiciona-se 2,0 gramas de hialuronato de sódio. A solução é misturada até dissolver completamente o hialuronato de sódio.

6. Os seguintes ingredientes são, então, sequencialmente adicionados, permitindo-se que cada qual se dissolva antes de adicionar-se o próximo: 2,5 gramas de poli(glicol etilênico) 400, 6,0 gramas de ácido bórico, 0,05 grama de borato de sódio, 1,0 grama de cloreto de potássio, 0,06 grama de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,06 grama de cloreto de magnésio e 0,0015 grama de poliquatérnio-42 (aquoso).

7. Continuando a misturar, adiciona-se 0,14 grama de clorito de sódio di-hidratado e mistura-se até dissolver.

8. A tonicidade da fórmula é determinada e ajustada para 280 mOsm/kg com cloreto de sódio.

9. O pH da Fórmula é ajustado para pH 7,2 com o uso de hidróxido de sódio 1N e/ou ácido clorídrico 1N.

10. A solução é levada a um peso de 1.000,0 gramas com o uso de água purificada USP, e misturada durante 10 minutos até ficar completamente uniforme.

11. A solução é filtrada com o uso de um filtro de 0,22 mícron. A solução 3B pode ser preparada da seguinte forma:

1. Em um béquer de 1.500 ml adiciona-se 800 gramas de água purificada USP.

2. Ao supracitado adiciona-se 20 g de polissorbato 10 e 100 g de polissorbato 20. A solução é misturada até que ambos estejam completamente misturados e dissolvidos.

3. Ao supracitado adiciona-se 50 g de extrato de Pichia anomala. A solução é misturada até que o extrato de Pichia anomala esteja dissolvido.

5. À solução da Etapa 4 adiciona-se 1,5 grama de hialuronato de sódio. A solução é misturada até dissolver completamente o hialuronato de sódio.

6. Os seguintes ingredientes são, então, sequencialmente adicionados, permitindo-se que cada qual se dissolva antes de adicionar-se o próximo: 6,0 gramas de ácido bórico, 0,05 grama de borato de sódio, 1,0 grama de cloreto de potássio, 0,06 grama de cloreto de cálcio di-hidratado, 0,06 grama de cloreto de magnésio e 0,0015 grama de poliquatérnio-42 (aquoso).

11. A solução é filtrada com o uso de um filtro de 0,22 mícron. Exemplo 4

[0115] A Tabela 2 ilustra os componentes das formulações da presente invenção (conforme ilustrado nas formulações 4A e 4B), em que os componentes podem ser incorporados conforme descrito abaixo com o uso de tecnologia de mistura convencional. Tabela 2 4A 4B Útil para aliviar a irritação causada por Útil para aliviar a irritação causada por olhos secos olhos secos pelo uso de lente de contato INGREDIENTE % em peso quantidade por % em peso quantidade por batelada (g) batelada (g) Extrato de Pichia anomala 1,0 10,0 2,0 20,0 Polissorbato-80 1,0 10,0 1,0 10,0 Polissorbato 20 3,0 30,0 5,0 50,0 Glicerina 0,25 2,5 0,25 2,5 Hipromelose E3 2910 0,198 1,98 0,198 1,98 Ácido bórico 0,40 4,0 0,40 4,0 Borato de sódio 0,022 0,22 0,022 0,22 Fosfato dissódico 0,027 0,27 0,027 0,27 Citrato de sódio di-hidratado 0,40 4,0 0,40 4,0 Cloreto de sódio* Cloreto de potássio 0,10 1,0 0,10 1,0 Solução aquosa a 50% de 0,057 0,57 0,057 0,57 lactato de sódio Cloreto de magnésio 0,013 0,13 0,013 0,13 Glicose 0,0036 0,036 0,0036 0,036 Glicina 0,00002 0,0002 0,00002 0,0002 Ácido ascórbico 0,00001 0,0001 0,00001 0,0001 Edetato dissódico 0,01 0,1 0,05 0,5 Poliquatérnio 42 (33% aquoso) 0,0030 0,030 0,0015 0,015 Citrato de sódio di-hidratado 0,014 0,14 0,014 0,14 Solução de hidróxido de sódio 1N** Solução de ácido clorídrico 1N** Água purificada*** total 100,00% 1000,00 g 100,00% 1000,00 g * ajustar para a tonicidade de 280 a 290 mOsm/kg ** ajustar para pH 7,2 *** q.s. até 100,00% do volume

[0116] Para os Exemplos 4A e 4B: O extrato de Pichia anomala pode ser fornecido por SILAB (SAINT VIANCE, FRANCE).

[0117] Para os Exemplos 4A e 4B: O polissorbato 20 pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0118] Para os Exemplos 4A e 4B: O polissorbato 80 pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0119] Para os Exemplos 4A e 4B, o ácido bórico pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0120] Para os Exemplos 4A e 4B: O borato de sódio pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0121] Para os Exemplos 4A e 4B: O cloreto de sódio pode ser fornecido por Caldic (DUSSELDORF, ALEMANHA).

[0122] Para os Exemplos 4A e 4B: O cloreto de potássio pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0123] Para os Exemplos 4A e 4B: A hipromelose E3 2910 pode ser fornecida por DOW CHEMICAL (PLAQUEMINE, LOUISIANA, EUA).

[0124] Para os Exemplos 4A e 4B: A glicerina pode ser fornecida por Emery Oleochemicals GmbH (DUSSELDORF, ALEMANHA).

[0125] Para os Exemplos 4A e 4B: O fosfato dissódico pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0126] Para os Exemplos 4A e 4B: O citrato de sódio pode ser fornecido por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0127] Para os Exemplos 4A e 4B: O lactato de sódio pode ser fornecido como lactato de sódio (50% aquoso) por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0128] Para os Exemplos 4A e 4B: A glicose pode ser fornecida por Roquette Freres (LASTREM, FRANÇA).

[0129] Para os Exemplos 4A e 4B: A glicina pode ser fornecida por Merck KGaA (DARMSTADT, ALEMANHA).

[0130] Para os Exemplos 4A e 4B: O ácido ascórbico pode ser fornecido por DSM NUTRITIONAL Products (DRAKEMYRE, ESCÓCIA, REINO UNIDO).

[0131] Para os Exemplos 4A e 4B: O poliquatérnio 42 pode ser fornecido como poliquatérnio 42 (33% aquoso) por DSM BIOMEDICAL (BERKELEY, CA).

[0132] Para os Exemplos 4A e 4B: O edetato dissódico pode ser fornecido por Merck NV/SA (OVERIJSE, BÉLGICA).

[0133] Para os Exemplos 4A e 4B: O hidróxido de sódio 1N pode ser fornecido por VWR (RADNER, PA, EUA).

[0134] Para os Exemplos 4A e 4B: O ácido clorídrico 1N pode ser fornecido por VWR (RADNER, PA, EUA). Para os Exemplos 4A e 4B: O clorito de sódio di-hidratado pode ser fornecido por Oxychem (WICHITA, KS, EUA) A solução 4A pode ser preparada da seguinte forma:

1. Em um béquer de 1.500 ml adiciona-se 800 gramas de água purificada USP.

2. Ao supracitado adiciona-se 10 g de polissorbato 80 e 30 g de polissorbato 20. A solução é misturada até que ambos estejam completamente misturados e dissolvidos.

3. Ao supracitado adiciona-se 10,0 g de extrato de Pichia anomala. A solução é misturada até que o extrato de Pichia anomala esteja dissolvido.

5. Ao supracitado adiciona-se 1,98 g de Hipromelose E3 Premium. A solução é misturada até que a Hipromelose E3 Premium esteja dissolvida.

6. Os seguintes ingredientes são, então, sequencialmente adicionados, permitindo-se que cada qual se dissolva antes de adicionar- se o próximo: 2,50 gramas de glicerina, 4,0 gramas de ácido bórico, 0,22 grama de borato de sódio, 0,27 grama de fosfato dissódico, 4,00 gramas de citrato de sódio di-hidratado, 1 grama de cloreto de potássio, 0,57 grama de lactato de sódio (50% aquoso), 0,13 grama de cloreto de magnésio, 0,036 grama de glicose, 0,0002 grama de glicina, 0,0001 grama de ácido ascórbico, 0,10 grama de edetato dissódico, 0,030 grama de poliquatérnio-42 (33% aquoso) e 0,14 grama de clorito de sódio.

7. A tonicidade da solução é determinada e ajustada para 280 mOsm com cloreto de sódio.

8. O pH da solução é medido e ajustado para 7,2 com hidróxido de sódio 1N e/ou ácido clorídrico 1N.

9. A solução é levada a um volume de 1.000,00 gramas com o uso de água purificada, e misturada durante 10 minutos.

10. A solução é filtrada com o uso de um filtro de 0,22 mícron. A solução 4B pode ser preparada da seguinte forma:

1. Em um béquer de 1.500 ml adiciona-se 800 gramas de água purificada USP.

6. Os seguintes ingredientes são, então, sequencialmente adicionados, permitindo-se que cada qual se dissolva antes de adicionar- se o próximo: 2,50 gramas de glicerina, 4,0 gramas de ácido bórico, 0,22 grama de borato de sódio, 0,27 grama de fosfato dissódico, 4,00 gramas de citrato de sódio di-hidratado, 1 grama de cloreto de potássio, 0,57 grama de lactato de sódio (50% aquoso), 0,13 grama de cloreto de magnésio, 0,036 grama de glicose, 0,0002 grama de glicina, 0,0001 grama de ácido ascórbico, 0,05 grama de edetato dissódico, 0,015 grama de poliquatérnio-42 (33% aquoso) e 0,14 grama de clorito de sódio.

10. A solução é filtrada com o uso de um filtro de 0,22 mícron. Modalidades da presente invenção

1. Um método para tratar um paciente que tenha uma diminuição ou um baixo nível de produção/liberação/fornecimen- to/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, compreendendo a etapa de administrar topicamente, ao olho do paciente, uma composição que compreende: i) uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, para obter uma concentração de ao menos cerca de 0,3 mg/ml de extrato do gênero Pichia no fluido corneal dos tecidos corneais do olho; ii) opcionalmente, uma quantidade segura e eficaz de um intensificador de permeação; e iii) opcionalmente, um veículo oftalmologicamente aceitável.

2. O método da modalidade 1 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que o extrato do gênero Pichia na composição compreende oligossacarídeos e polissacarídeos tendo um peso molecular ponderal médio de cerca de 180 a cerca de 800.000 Da.

3. O método da modalidade 1 e/ou 2 (ou de qualquer uma das modalidades seguintes), sendo que o extrato do gênero Pichia na composição compreende oligossacarídeos e polissacarídeos tendo um grau médio de polimerização de DP 1 a DP 4.444.

4. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 3 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição compreende um intensificador de permeação.

5. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 4 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que o intensificador de permeação está presente a uma concentração de cerca de 0,01% a cerca de 20% (em p/v) do total da composição.

6. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 5 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que o intensificador de permeação está presente a uma concentração de cerca de 0,1% a 10% (em p/v) do total da composição.

7. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 6 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que o intensificador de permeação está presente a uma concentração de cerca de 0,25% a 5% (em p/v) do total da composição.

8. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 7 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que o intensificador de permeação é selecionado dentre polioxietileno, éteres polioxietilênicos de ácidos graxos, monoleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monolaurato de polioxietileno, monolaurato de polioxietileno sorbitano, ácido fusídico e derivados dos mesmos, EDTA, EDTA dissódico, ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido glicocólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, colato de sódio, glicocolato de sódio, glicocolato, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicodesoxicolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, saponinas, ácido glicirrízico, glicirrizida de amônio, decametônio, brometo de decametônio e brometo de dodeciltrimetilamônio, ou misturas de quaisquer dos mencionados acima.

9. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 8 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 10 nanogramas por miligrama de proteínas.

10. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 9 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 15 nanogramas por miligrama de proteínas.

11. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 10 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 20 nanogramas por miligrama de proteínas.

12. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 11 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 25 nanogramas por miligrama de proteínas.

13. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 12 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 10 nanogramas por miligrama de proteínas.

14. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 13 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 15 nanogramas por miligrama de proteínas.

15. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 14 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 20 nanogramas por miligrama de proteínas.

16. O método de qualquer uma dentre as, ou de uma combinação das, modalidades 1 a 15 (ou de qualquer das modalidades seguintes), sendo que a composição é administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 25 nanogramas por miligrama de proteínas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar um paciente que tenha uma diminuição ou um baixo nível de produção/liberação/fornecimen- to/excreção de ácido hialurônico da e/ou na córnea, caracterizado por compreender a etapa de administrar topicamente, ao olho do paciente, uma composição que compreende: iv) uma quantidade segura e eficaz de um ou mais extratos, ou fontes de extratos, do gênero Pichia, para obter uma concentração de ao menos cerca de 0,3 mg/ml de extrato do gênero Pichia no fluido corneal dos tecidos corneais do olho; v) opcionalmente, uma quantidade segura e eficaz de um intensificador de permeação; e vi) opcionalmente, um veículo oftalmologicamente aceitável.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extrato de gênero Pichia na composição compreender oligossacarídeos e polissacarídeos que têm um peso molecular médio ponderal de cerca de 180 a cerca de 800.000 Da.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extrato de gênero Pichia na composição compreender oligossacarídeos e polissacarídeos que têm um grau médio de polimerização de DP 1 a DP 4.444.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição compreender um intensificador de permeação.

5. Método, de acordo com as reivindicações 1 e/ou 2, caracterizado por o intensificador de permeação estar presente a uma concentração de cerca de 0,01% a cerca de 20% (em p/v) da composição total.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o intensificador de permeação estar presente a uma concentração de cerca de 0,1% a 10% (em p/v) da composição total.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o intensificador de permeação estar presente a uma concentração de cerca de 0,25% a 5% (em p/v) da composição total.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o intensificador de permeação ser selecionado dentre polioxietileno, éteres polioxietilênicos de ácidos graxos, monoleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, monolaurato de polioxietileno, monolaurato de polioxietileno sorbitano, ácido fusídico e derivados dos mesmos, EDTA, EDTA dissódico, ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido glicocólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, colato de sódio, glicocolato de sódio, glicocolato, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicodesoxicolato de sódio, taurodesoxicolato de sódio, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, saponinas, ácido glicirrízico, glicirrizida de amônio, decametônio, brometo de decametônio e brometo de dodeciltrimetilamônio ou misturas de quaisquer dos mencionados acima.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 10 nanogramas por miligrama de proteínas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 15 nanogramas por miligrama de proteínas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 20 nanogramas por miligrama de proteínas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada quando a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente é menor que cerca de 25 nanogramas por miligrama de proteínas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 10 nanogramas por miligrama de proteínas.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 15 nanogramas por miligrama de proteínas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 20 nanogramas por miligrama de proteínas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição ser administrada ao olho do paciente para elevar a concentração de ácido hialurônico nas lágrimas do paciente, a fim de que seja igual a ou maior que cerca de 25 nanogramas por miligrama de proteínas.