BR112020026693A2

BR112020026693A2 - Método para preparar composições enriquecidas com alfa-lactalbumina, produtos relacionados e usos, por exemplo, em fórmulas infantis

Info

Publication number: BR112020026693A2
Application number: BR112020026693-0A
Authority: BR
Inventors: Kasper Bøgelund Lauridsen; Hans Bertelsen; Behnaz Razi Parjikolaei; Søren Bang Nielsen; Tanja Christine Jæger; Kåre Søndergaard; Guilherme De Moura Maciel
Original assignee: Arla Foods Amba
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-03-30
Also published as: AU2019295060A1; US20210267231A1; WO2020002422A1; JP7431181B2; KR20210033992A; CN112770637A; JP2021529769A; CA3105203A1; EP3813536A1

Abstract

método para preparar composições enriquecidas com alfa-lactalbumina, produtos relacionados e usos, por exemplo, em fórmulas infantis. a presente invenção se refere a um novo método para produzir composições de proteína comestíveis enriquecidas com alfa-lactalbumina com base na remoção de beta-lactoglobulina (blg) de um alimento contendo proteína de soro de queijo por meio de cristalização seletiva de blg não agregada. a invenção se refere adicionalmente a novas composições de proteína comestíveis enriquecidas com alfa-lactalbumina, usos dessas composições e produtos alimentícios que compreendem essas composições.

Description

1 / 115

MÉTODO PARA PREPARAR COMPOSIÇÕES ENRIQUECIDAS COM ALFA-LACTALBUMINA, PRODUTOS RELACIONADOS E USOS, POR EXEMPLO, EM FÓRMULAS INFANTIS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um novo método para produzir composições de proteína comestíveis enriquecidas com alfa-lactalbumina com base na remoção de beta-lactoglobulina (BLG) de um alimento contendo proteína de soro de queijo (whey) por meio de cristalização seletiva de BLG não agregada. A invenção se refere adicionalmente a composições de proteína comestíveis enriquecidas com alfa-lactalbumina, usos dessas composição e produtos alimentícios que compreendem essas composições.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O conceito de fracionamento da proteína do leite é bem conhecido na técnica e desenvolveu-se durante as últimas décadas em uma variedade de tecnologias para preparar composições enriquecidas com várias espécies de proteína do leite, cada uma tendo propriedades e características específicas.

[003] O isolamento de alfa-lactalbumina (ALA) do soro do leite ou soro de queijo é tema de diversas publicações e tipicamente envolve múltiplas etapas de separação e muitas vezes filtração e/ou técnicas de cromatografia para chegar a uma ALA purificada.

[004] O documento U.S. 5.008.376 descreve uma técnica de separação de ALA que usa ultrafiltração. Os métodos de precipitação pelo calor envolvem a aplicação de calor ao soro de queijo em uma determinada faixa de pH por um período suficiente para promover a floculação da ALA. Tais métodos de precipitação pelo calor são descritos no documento U.S.

5.455.331. Os métodos de troca iônica envolvem colocar o soro de queijo em contato com um trocador de ânion ou cátion de modo a reter seletivamente uma fração de proteína. Um processo como esse é descrito na patente norte-

2 / 115 americana n° 5.077.067.

[005] Muller et al (Lait 83, páginas 439-451, 2003) descrevem métodos para enriquecer ALA a partir de soro de queijo ácido por meio de tratamentos de ultrafiltração específicos e, opcionalmente, por meio de precipitação reversível de ALA. O precipitado de ALA é separado das outras proteínas de soro de queijo por centrifugação, por exemplo, e redissolvido.

[006] Um bom rendimento de precipitação foi obtido a 55 graus C mantidos por 5-10 minutos e a um pH de 3,9.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Acidentalmente, os presentes inventores fizeram a surpreendente constatação de que a ALA pode ser enriquecida a partir de soluções de proteína de soro de queijo brutas por meio de cristalização seletiva de BLG e remoção dos cristais de BLG. Isso pode ser feito sem o uso de solventes orgânicos tais como tolueno. A constatação é contrária ao conhecimento geral na técnica que ensina que proteínas precisam ser altamente purificadas antes de se ter esperanças de cristalizá-las e de que nem todas as proteínas podem ser cristalizadas.

[008] Essa constatação tem o potencial de mudar a forma como a proteína de soro de queijo é manipulada e fracionada na indústria de laticínios e abre espaço para uma produção eficiente e delicada de composições de proteína enriquecidas com ALA que sejam seguras de usar como um ingrediente alimentício, por exemplo, para a produção de produtos de fórmula infantil.

[009] Assim, um aspecto da invenção se refere a um método para preparar uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com alfa-lactalbumina, o método compreendendo as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreende beta-lactoglobulina (BLG) não agregada, alfa-lactalbumina (ALA) e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução

3 / 115 de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) secar: - a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, ou - a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma.

[0010] Outro aspecto da invenção se refere a uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA, a dita composição, por exemplo, obtenível por meio de um ou mais métodos como definidos no presente documento.

[0011] Ainda um aspecto da invenção se refere a um método para produzir um produto alimentício, o método compreendendo as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreende beta-lactoglobulina (BLG) não agregada, alfa-lactalbumina (ALA) e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e

4 / 115 c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) opcionalmente, secar a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma ou secar a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma, g) combinar: g1) a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, g2) a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma e/ou g3) a composição seca obtida na etapa f) com um ou mais ingredientes e converter a combinação em um produto alimentício.

[0012] Um aspecto adicional da invenção se refere a um produto alimentício que compreende a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA, o dito produto alimentício, por exemplo, obtenível pelo método para produzir um produto alimentício definido no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A Figura 1 mostra dois cromatogramas sobrepostos de uma solução de proteína de soro de queijo bruta (linha contínua) com base em soro de queijo doce e o licor-mãe resultante após a cristalização (linha tracejada). A diferença entre as linhas contínuas e as tracejadas é devida aos cristais de BLG removidos.

5 / 115

[0014] A Figura 2 é uma foto microscópica dos cristais de BLG recuperados do Exemplo 2.

[0015] A Figura 3 é um cromatograma do cristal de BLG recuperado do Exemplo 2.

[0016] A Figura 4 mostra cromatogramas do alimento do Exemplo 3 (linha contínua) e do licor-mãe (linha tracejada) obtido após a cristalização e a remoção dos cristais de BLG.

[0017] A Figura 5 mostra uma imagem do alimento 3 do Exemplo 5 antes (imagem esquerda) e depois (imagem direita) da cristalização.

[0018] A Figura 6 é uma ilustração esquemática da variante do processo de cristalização do Exemplo 6 que usa DCF para a separação de cristais de BLG a partir do licor-mãe.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0019] No contexto da presente invenção, os termos “beta- lactoglobulina” ou “BLG” referem-se à beta-lactoglobulina de espécies mamíferas, por exemplo, em formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. Os termos incluem ainda BLG agregada, BLG precipitada e BLG cristalina. Ao se referir à quantidade de BLG, é feita referência à quantidade total de BLG incluindo BLG agregada. A quantidade total de BLG é determinada de acordo com o Exemplo 1.21. A expressão “BLG agregada” se refere à BLG que esteja pelo menos parcialmente desdobrada e que, adicionalmente, tenha se agregado com outras moléculas de BLG desnaturadas e/ou outras proteínas de soro de queijo desnaturadas, tipicamente por meio de interações hidrofóbicas e/ou ligações covalentes.

[0020] A BLG é a proteína mais predominante no soro de queijo e soro de leite bovinos e existe em várias variantes genéticas, as principais no leite de vaca sendo identificadas como A e B. A BLG é uma proteína

6 / 115 lipocalina e pode ligar muitas moléculas hidrofóbicas, sugerindo um papel no seu transporte. A BLG também se mostrou capaz de ligar ferro através de sideróforos e pode ter um papel no combate de patógenos. Falta um homólogo de BLG no leite humano.

[0021] A BLG bovina é uma proteína relativamente pequena de aproximadamente 162 resíduos de aminoácido com peso molecular de aproximadamente 18,3-18,4 kDa. Sob condições fisiológicas, ela é predominantemente dimérica, mas se dissocia a um monômero abaixo de cerca de pH 3, preservando seu estado nativo como determinado usando Espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear. Por outro lado, a BLG também ocorre em forma tetramérica, octamérica e outras formas de agregação multimérica sob uma variedade de condições naturais.

[0022] No contexto da presente invenção, os termos “beta- lactoglobulina não agregada” ou “BLG não agregada” referem-se também à beta-lactoglobulina de espécies mamíferas, por exemplo, em formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. No entanto, os termos não incluem BLG agregada, BLG precipitada ou BLG cristalizada. A quantidade ou concentração de BLG não agregada é determinada de acordo com o Exemplo 1.2.

[0023] A porcentagem de BLG não agregada em relação à BLG total é determinada pelo cálculo (mBLG total - mBLG não agregada)/mBLG total *100%. mBLG total é a concentração ou quantidade de BLG determinada de acordo com o Exemplo 1.21 e mBLG não agregada é a concentração ou quantidade de BLG não agregada determinada de acordo com o Exemplo 1.2.

[0024] No contexto da presente invenção, o termo “cristal” se refere a um material sólido cujos constituintes (tais como átomos, moléculas ou íons) são dispostos em uma estrutura microscópica altamente ordenada, formando uma retícula de cristal que se estende em todas as direções.

[0025] No contexto da presente invenção, a expressão “cristal de

7 / 115 BLG” se refere a cristais de proteína que primariamente contêm BLG não agregada e preferivelmente nativa disposta em uma estrutura microscópica altamente ordenada, formando uma retícula de cristal que se estende em todas as direções. Os cristais de BLG podem, por exemplo, ser monolíticos ou policristalinos e podem, por exemplo, ser cristais intactos, fragmentos de cristais, ou uma combinação dos mesmos. Fragmentos de cristal são, por exemplo, formados quando cristais intactos são submetidos a cisalhamento mecânico durante o processamento. Fragmentos de cristais também têm a estrutura microscópica altamente ordenada do cristal, mas podem não ter a superfície uniforme e/ou bordas ou cantos uniformes de um cristal intacto. Consultar, por exemplo, a Figura 18 do pedido PCT nº PCT/EP2017/084553 para um exemplo de muitos cristais de BLG intactos e a Figura 13 do pedido PCT nº PCT/EP2017/084553 para um exemplo de fragmentos de cristais de BLG. Em ambos os casos, o cristal de BLG ou os fragmentos de cristal podem ser identificados visualmente como estruturas bem definidas, compactas e coerentes usando microscopia de luz. Cristais de proteína são, ainda, conhecidos por serem birrefringentes e essa propriedade óptica pode ser usada para identificar partículas desconhecidas que tenham uma estrutura de cristal. Agregados de BLG não cristalinos, por outro lado, aparecem muitas vezes como pouco definidos, não transparentes, e como massas abertas ou porosas de tamanho irregular.

[0026] No contexto da presente invenção, o termo “cristalizar” se refere à formação de cristais de proteína. A cristalização pode, por exemplo, ocorrer espontaneamente ou ser iniciada pela adição de sementes de cristalização.

[0027] “Licor-mãe”

[0028] No contexto da presente invenção, o termo “licor-mãe” se refere à solução de proteína de soro de queijo que resta após a BLG ter sido cristalizada e os cristais de BLG terem sido pelo menos parcialmente

8 / 115 removidos. O licor-mãe pode ainda conter alguns cristais de BLG, mas normalmente apenas cristais de BLG que escaparam da separação.

[0029] No contexto da presente invenção, a expressão “composição comestível” se refere a uma composição que é segura para o consumo humano e uso como um ingrediente alimentício e que não contenha quantidades problemáticas de componentes tóxicos, tais como tolueno ou outros solventes orgânicos indesejados.

[0030] No contexto da presente invenção, os termos “ALA” ou “alfa- lactalbumina” referem-se à alfa-lactalbumina de espécies mamíferas, por exemplo, nas formas nativas e/ou glicosiladas, e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. Os termos incluem, ainda, ALA agregada e BLG precipitada. Ao se referir à quantidade de ALA, é feita referência à quantidade total de ALA incluindo, por exemplo, ALA agregada. A quantidade total de ALA é determinada de acordo com o Exemplo 1.21. A expressão “ALA agregada” se refere à ALA que tipicamente esteja pelo menos parcialmente desdobrada e que, adicionalmente, tenha se agregado com outras moléculas de ALA desnaturadas e/ou outras proteínas de soro de queijo desnaturadas, tipicamente por meio de interações hidrofóbicas e/ou ligações covalentes.

[0031] A alfa-lactalbumina (ALA) é uma proteína presente no leite de quase todas as espécies mamíferas. A ALA forma a subunidade regulatória do heterodímero de lactose sintase (LS) e a β-1,4-galactosiltransferase (beta4Gal- T1) forma o componente catalítico. Juntas, essas proteínas possibilitam que a LS produza lactose transferindo porções de galactose para glicose. Uma das principais diferenças estruturais com relação à beta-lactoglobulina é que a ALA não tem nenhum grupo tiol livre que possa servir como o ponto de partida para uma reação de agregação covalente.

[0032] No contexto da presente invenção, a expressão “ALA não agregada” também se refere à ALA de espécies mamíferas, por exemplo, em

9 / 115 formas nativas, desdobradas e/ou glicosiladas e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural. No entanto, o termo não inclui ALA agregada ou ALA precipitada. A quantidade ou concentração de BLG não agregada é determinada de acordo com o Exemplo 1.2.

[0033] A porcentagem de ALA não agregada em relação à ALA total é determinada pelo cálculo (mALA total - mALA não agregada)/mALA total *100%. mALA total é a concentração ou quantidade de ALA determinada de acordo com o Exemplo 1.21 e mALA não agregada é a concentração ou quantidade de ALA não agregada determinada de acordo com o Exemplo 1.2.

[0034] No contexto da presente invenção, uma composição que é “enriquecida com ALA” ou “enriquecida no que se refere à ALA” tem uma porcentagem em peso mais alta de ALA em relação à proteína total do que o alimento do qual foi derivada.

[0035] No contexto da presente invenção, os termos “caseinomacropeptídeo” ou “CMP” referem-se ao peptídeo hidrofílico, resíduo 106-169, originado da hidrólise de “k-CN” ou “kappa-caseína” de espécies mamíferas, por exemplo, nas formas nativas e/ou glicosiladas, e incluem as variantes genéticas de ocorrência natural, por uma proteinase aspártica, por exemplo, quimosina.

[0036] A expressão “soro de queijo” se refere à fase líquida que fica após a caseína do leite ter sido precipitada e removida. A precipitação de caseína pode, por exemplo, ser realizada pela acidificação do leite e/ou pelo uso da enzima rennet. Existem vários tipos de soro de queijo, tais como “soro de queijo doce”, que é o produto de soro de queijo produzido pela precipitação à base de rennet da caseína, e “soro de queijo ácido” ou “soro de queijo azedo”, que é o produto de soro de queijo produzido pela precipitação à base de ácido da caseína. A precipitação à base de ácido da caseína pode, por exemplo, ser realizada pela adição de ácidos alimentícios ou por meio de culturas bacterianas.

10 / 115

[0037] A expressão “soro de leite” se refere ao líquido que resta quando a caseína e os glóbulos de gordura do leite foram removidos do leite, por exemplo, por microfiltração ou ultrafiltração de poros grandes. O soro de leite também pode ser chamado de “soro de queijo ideal”.

[0038] Os termos “proteína do soro do leite” ou “proteína de soro” referem-se à proteína que está presente no soro de leite.

[0039] No contexto da presente invenção, a expressão “proteína de soro de queijo” se refere à proteína que é encontrada no soro de queijo ou no soro de leite. A proteína de soro de queijo pode ser um subconjunto da espécie de proteína encontrada no soro de queijo ou soro de leite e até mesmo uma única espécie de proteína de soro de queijo, ou pode ser o conjunto completo da espécie de proteína encontrada no soro de queijo e/ou soro de leite.

[0040] O termo caseína se refere à proteína de caseína encontrada no leite e abrange tanto a caseína micelar nativa tal como encontrada no leite cru, quanto a espécie de caseína individual, e caseinatos.

[0041] No contexto da presente invenção, um líquido que é “supersaturado” ou “supersaturado no que se refere à BLG” contém uma concentração de BLG dissolvida não agregada que está acima do ponto de saturação da BLG não agregada nesse líquido nas determinadas condições físicas e químicas. O termo “supersaturado” é bem conhecido no campo da cristalização (consultar, por exemplo, Gérard Coquerela, “Crystallization of molecular systems from solution: phase diagrams, supersaturation and other basic concepts” [Cristalização de sistemas moleculares a partir de uma solução: diagramas de fase, supersaturação e outros conceitos básicos], Chemical Society Reviews, págs. 2.286-2.300, edição 7, 2014) e a supersaturação pode ser determinada por inúmeras técnicas de medição diferentes (por exemplo, por espectroscopia ou análise de tamanho de partícula). No contexto da presente invenção, a supersaturação no que se

11 / 115 refere à BLG é determinada mediante o seguinte procedimento.

Procedimento para testar se um líquido em um conjunto de condições específico está supersaturado no que se refere à BLG: a) transferir uma amostra de 50 ml do líquido a ser testado a um tubo de centrifugação (VWR catálogo nº 525-0402) com uma altura de 115 mm, um diâmetro interno de 25 mm e uma capacidade de 50 mL.

Deve- se tomar cuidado para manter a amostra e as frações subsequentes da mesma nas condições físicas e químicas originais do líquido durante as etapas a) - h). b) A amostra é imediatamente centrifugada a 3.000 g por 3,0 minutos com uma aceleração de no máximo 30 segundos e uma desaceleração de no máximo 30 segundos. c) Imediatamente após a centrifugação, transferir o máximo possível do sobrenadante (sem perturbar a pelota se uma pelota tiver sido formada) a um segundo tubo de centrifugação (mesmo tipo da etapa a). d) Colher uma subamostra de 0,05 mL do sobrenadante (subamostra A). e) Adicionar 10 mg de cristais de BLG (pelo menos 98% de BLG pura e não agregada em relação ao total de sólidos) com um tamanho de partícula de no máximo 200 mícron a um segundo tubo de centrifugação e agitar a mistura. f) Deixar o segundo tubo de centrifugação ficar por 60 minutos na temperatura original. g) Imediatamente após a etapa f), centrifugar o segundo tubo de centrifugação a 500 g por 10 minutos e então colher outra subamostra de 0,05 mL do sobrenadante (subamostra B). h) Recuperar a pelota de centrifugação da etapa g) caso haja alguma, ressuspendê-la em água Milli-Q e imediatamente inspecionar a suspensão para ver se há presença de cristais que sejam visíveis por microscopia.

12 / 115 i) Determinar a concentração de BLG não agregada nas subamostras A e B usando o método delineado no Exemplo 1.2 - os resultados são expressados como % de p/p de BLG em relação ao peso total das subamostras. A concentração de BLG não agregada da subamostra A é chamada de CBLG, A, e a concentração de BLG não agregada da subamostra B é chamada de CBLG, B. j) O líquido do qual a amostra da etapa a) foi colhida foi supersaturado (nas condições específicas) se CBLG, B for mais baixa do que a CBLG, A e se os cristais forem observados na etapa i).

[0042] No contexto da presente invenção, os termos “líquido” e “solução” abrangem tanto composições que são livres de matéria particulada quanto composições que contêm uma combinação de partículas líquidas e sólidas e/ou semissólidas, tais como, por exemplo, cristais de proteína ou outras partículas proteicas. Um “líquido” ou uma “solução” podem, portanto, ser uma suspensão ou até mesmo uma pasta fluida. No entanto, um “líquido” e uma “solução” são preferivelmente bombeáveis.

[0043] No contexto da presente invenção, os termos “concentrado de proteína de soro de queijo” (WPC) e “concentrado de proteína de soro” (SPC) referem-se a composições secas ou aquosas que contêm uma quantidade total de proteína de 20-89% de p/p em relação ao total de sólidos.

[0044] Um WPC ou um SPC preferivelmente contêm: 20-89% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-70% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 8-50% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% de p/p de CMP em relação à proteína.

[0045] Alternativamente, mas também de forma preferida, um WPC ou um SPC podem conter: 20-89% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos,

13 / 115 15-90% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 4-50% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% de p/p de CMP em relação à proteína.

[0046] Preferivelmente, um WPC ou um SPC contêm: 20-89% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-80% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 4-50% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% de p/p de CMP em relação à proteína.

[0047] Mais preferivelmente, um WPC ou um SPC contêm: 70-89% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 30-90% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 4-35% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% de p/p de CMP em relação à proteína.

[0048] O SPC tipicamente não contém CMP ou apenas traços de CMP.

[0049] Os termos “isolado de proteína de soro de queijo” (WPI) e “isolado de proteína de soro” (SPI) referem-se a composições secas ou aquosas que contêm uma quantidade total de proteína de 90-100% de p/p em relação ao total de sólidos.

[0050] Um WPI ou um SPI preferivelmente contêm: 90-100% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 15-70% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 8-50% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-40% de p/p de CMP em relação ao total de proteína.

[0051] Alternativamente, mas também de forma preferida, um WPI

14 / 115 ou um SPI podem conter: 90-100% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 30-95% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 4-35% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% de p/p de CMP em relação ao total de proteína.

[0052] Mais preferivelmente, um WPI ou um SPI podem conter: 90-100% de p/p de proteína em relação ao total de sólidos, 30-90% de p/p de BLG não agregada em relação ao total de proteína, 4-35% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e 0-25% de p/p de CMP em relação ao total de proteína.

[0053] O SPI tipicamente não contém CMP ou apenas traços de CMP.

[0054] Os termos “consiste essencialmente em” e “consistindo essencialmente em” significam que a reivindicação ou o atributo em questão abrangem os materiais ou etapas especificados e os que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada.

[0055] No contexto da presente invenção, a frase “Y e/ou X” significa “Y” ou “X” ou “Y e X”. Na mesma linha de pensamento, a frase “n1, n2, ..., ni- 1, e/ou ni” significa “ n1” ou “ n2” ou ... ou “ni-1” ou “ni” ou qualquer combinação dos componentes: n1, n2,...ni-1, e ni.

[0056] No contexto da presente invenção, os termos “seco” ou “secado” significam que a composição ou o produto em questão compreendem no máximo 10% de p/p de água, preferivelmente no máximo 6% de p/p e, mais preferivelmente, menos ainda.

[0057] No contexto da presente invenção, a expressão “redução microbiana física” se refere à interação física com uma composição que resulta na redução da quantidade total de micro-organismos viáveis da

15 / 115 composição. O termo não abrange a adição de produtos químicos que resultam na morte de micro-organismos. O termo também não abrange a exposição ao calor ao qual as gotículas atomizadas de líquido são expostas durante a secagem por pulverização, mas inclui um possível pré-aquecimento antes da secagem por pulverização.

[0058] No contexto da presente invenção, o pH de um pó se refere ao pH de 10 g do pó misturados em 90 g de água desmineralizada e é medido de acordo com o Exemplo 1.8.

[0059] No contexto da presente invenção, a porcentagem em peso (% de p/p) de um componente de uma certa composição, produto, ou material, significa a porcentagem de peso desse componente em relação ao peso da composição, produto, ou material específicos, a não ser que outra referência (por exemplo, total de sólidos ou total de proteína) seja especificamente mencionada.

[0060] No contexto da presente invenção, a expressão “razão de peso” entre o componente X e o componente Y significa o valor obtido pelo cálculo mx/mY, em que mx é a quantidade (peso) de componentes X e mY é a quantidade (peso) de componentes Y.

[0061] No contexto da presente invenção, a expressão “pelo menos pasteurização” se refere a um tratamento térmico que tem um efeito de morte microbiana igual a ou maior que um tratamento térmico de 70 graus C por 10 segundos. A referência para determinar o efeito de morte de bactérias é E. coli O157:H7.

[0062] No contexto da presente invenção, a expressão “solução de proteína de soro de queijo” é usada para descrever a composição de proteína de soro de queijo aquosa especial que é supersaturada no que se refere à BLG no modo salting-in e útil para preparar cristais de BLG.

[0063] No contexto da presente invenção, a expressão “alimento de proteína de soro de queijo” se refere à proteína de soro de queijo da qual uma

16 / 115 solução é derivada. O alimento de proteína de soro de queijo é tipicamente um WPC, um WPI, um SPC ou um SPI.

[0064] No contexto da presente invenção, o termo “estéril” significa que a composição ou o produto estéril em questão não contêm qualquer micro-organismo viável e, portanto, não possui crescimento microbiano durante o armazenamento à temperatura ambiente. Uma composição que foi esterilizada é estéril.

[0065] Quando um líquido, tal como uma preparação de bebida, é esterilizado e embalado assepticamente em um recipiente estéril, ele tipicamente tem uma vida útil de pelo menos seis meses à temperatura ambiente. O tratamento de esterilização mata esporos e micro-organismos que podem causar o deterioramento do líquido.

[0066] No contexto da presente invenção, a expressão “fração de proteína” se refere a proteínas da composição em questão, por exemplo, as proteínas de um pó ou uma preparação de bebida.

[0067] No contexto da presente invenção, o termo “minerais” como usado no presente documento, a não ser que especificado em contrário, se refere a qualquer um dentre macrominerais, microminerais ou minerais menores, outros minerais, e combinações dos mesmos. Macrominerais incluem cálcio, fósforo, potássio, enxofre, sódio, cloro, magnésio. Microminerais ou minerais menores incluem ferro, cobalto, cobre, zinco, molibdênio, iodo, selênio, manganês, e outros minerais incluem cromo, flúor, boro, lítio e estrôncio.

[0068] No contexto da presente invenção, os termos “lipídeo”, “gordura” e “óleo” como usados no presente documento, a não ser que especificado em contrário, são usados de forma intercambiável para se referir a materiais lipídicos derivados ou processados de plantas ou animais. Esses termos incluem também materiais lipídicos sintéticos desde que tais materiais sintéticos sejam adequados ao consumo humano.

17 / 115

[0069] No contexto da presente invenção, o termo “transparente” abrange uma preparação de bebida com uma aparência visivelmente límpida e que permita que a luz passe e através da qual apareçam imagens distintas. Uma bebida transparente tem uma turbidez de no máximo 200 NTU.

[0070] No contexto da presente invenção, o termo “opaco” abrange uma preparação de bebida com uma aparência visivelmente embaçada e que tem uma turbidez de mais que 200 NTU.

[0071] No contexto da presente invenção, um “concentrado de proteína de” uma primeira solução ou um “concentrado de proteína da mesma” referem-se a uma segunda solução que tem i) uma porcentagem em peso mais alta do total de proteína em uma base de total de sólidos e/ou ii) uma porcentagem em peso do total de proteína em uma base de peso total mais alta do que a primeira solução. Um concentrado de proteína pode, por exemplo, ser obtido removendo-se somente água da primeira solução e/ou removendo-se sólidos não proteicos tais como, por exemplo, carboidratos e sais. O concentrado de proteína preferivelmente tem substancialmente o mesmo pH que a primeira solução, isto é, preferivelmente no máximo 0,3 de valor de pH acima ou abaixo do pH da primeira solução e, mais preferivelmente, no máximo 0,2 de valor de pH acima ou abaixo do pH da primeira solução e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1 de valor de pH acima ou abaixo do pH da primeira solução.

[0072] No contexto da presente invenção, a expressão “proteína adicional” significa uma proteína que não é BLG ou ALA. A proteína adicional que está presente na solução de proteína de soro de queijo tipicamente compreende uma ou mais dentre as proteínas não BLG/ALA que são encontradas no soro de leite ou de queijo. Exemplos não limitantes de tais proteínas são albumina sérica bovina, imunoglobulinas, caseinomacropeptídeo (CMP), osteopontina, lactoferrina e proteínas da membrana do glóbulo de gordura.

18 / 115

[0073] A solução de proteína de soro de queijo pode, portanto, preferivelmente conter pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional selecionada do grupo que consiste em albumina sérica bovina, imunoglobulinas, caseinomacropeptídeo (CMP), osteopontina, lactoferrina, proteínas da membrana do glóbulo de gordura, e combinações dos mesmos.

[0074] No contexto da presente invenção, o termo “licor-mãe” se refere à solução de proteína de soro de queijo que resta após a BLG não agregada ter sido cristalizada e os cristais de BLG terem sido pelo menos parcialmente removidos. O licor-mãe pode ainda conter alguns cristais de BLG, mas normalmente apenas cristais de BLG que escaparam da separação.

[0075] Como dito, um aspecto da invenção se refere a um método para preparar uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com alfa-lactalbumina, o método compreendendo as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreende BLG não agregada, ALA e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado e, opcionalmente, também o líquido de lavagem usado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) secar: - a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, ou

19 / 115 - a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma.

[0076] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o método compreende adicionalmente redução microbiana física, preferivelmente realizada após o ajuste de pH da etapa e) e antes da secagem da etapa f).

[0077] Como dito, a etapa a) da presente invenção envolve prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreende BLG não agregada, ALA, e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional.

[0078] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende no máximo 10% de p/p de caseína em relação à quantidade total de proteína, preferivelmente no máximo 5% de p/p, mais preferivelmente no máximo 1% de p/p e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% de caseína em relação à quantidade total de proteína. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo não contém qualquer quantidade detectável de caseína.

[0079] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 5% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 10% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 15% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

[0080] Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 20% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 30% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

20 / 115

[0081] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 1% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 2% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 3% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 4% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

[0082] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 35% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 40% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender pelo menos 45% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 50% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

[0083] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 5-90% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 10-80% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de

21 / 115 soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender na faixa de 20- 70% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 30-70% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

[0084] Como dito, os presentes inventores constataram que é possível cristalizar BLG não agregada sem o uso de solventes orgânicos. Essa abordagem de purificação pode também ser usada para refinar preparações contendo proteína de soro de queijo, preparações essas que já foram submetidas a alguma purificação de BLG, e provê métodos simples para aumentar a pureza de BLG não agregada ainda mais. Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 1-20% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 2-15% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender na faixa de 3-10% de p/p de proteína de soro de queijo adicional em relação à quantidade total de proteína.

[0085] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 5% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 10% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 15% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 20% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína.

22 / 115

[0086] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 25% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 30% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende preferivelmente pelo menos 35% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 40% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína.

[0087] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 5-95% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 5- 70% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 10-60% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende preferivelmente na faixa de 12-50% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferível, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 20-45% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína.

[0088] É muitas vezes preferível que pelo menos alguma parte da ALA das composições e produtos mencionados no presente documento contenha pelo menos alguma ALA não agregada. Preferivelmente, pelo menos 25% da ALA é ALA não agregada. Mais preferivelmente, pelo menos 50% da ALA é ALA não agregada. Ainda mais preferivelmente, pelo menos 70% da ALA é ALA não agregada. O mais preferivelmente, pelo menos 90% da ALA é ALA não agregada. Ainda mais preferível, aproximadamente 100%

23 / 115 da ALA pode ser ALA não agregada.

[0089] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA de pelo menos 0,01. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA de pelo menos 0,5. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA de pelo menos 1, tal como, por exemplo, pelo menos 2. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode ter uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA de pelo menos 3.

[0090] As quantidades e concentrações de BLG não agregada e outras proteínas na solução de proteína de soro de queijo e no alimento de proteína de soro de queijo referem-se todas a proteína dissolvida e não incluem proteína precipitada ou cristalizada.

[0091] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA na faixa de 0,01-20. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA na faixa de 0,2-10. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA na faixa de 0,5-4. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode ter uma razão de peso entre BLG não agregada e ALA na faixa de 1-3.

[0092] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 1% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 2% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de

24 / 115 proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 5% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 10% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.

[0093] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 12% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Por exemplo, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 15% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. A solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender pelo menos 20% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender pelo menos 30% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.

[0094] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende no máximo 95% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender no máximo 90% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender no máximo 85% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode, por exemplo, compreender no máximo 80% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender no máximo 78% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a)

25 / 115 pode compreender no máximo 75% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.

[0095] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 1-95% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 5-90% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 10-85% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 10-80% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 20-70% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.

[0096] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 10-95% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 12-90% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 15-85% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 15-80% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) pode compreender na faixa de 30-70% de p/p de BLG não agregada em relação à quantidade total de proteína.

[0097] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução

26 / 115 de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende pelo menos 0,4% de p/p de BLG não agregada em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 1,0% de p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 2,0% de p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda pelo menos 4% de p/p de BLG não agregada.

[0098] Concentrações mais altas de BLG não agregada são ainda mais preferidas e, preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 6% de p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende pelo menos 10% de p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda pelo menos 15% de p/p de BLG não agregada.

[0099] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende na faixa de 0,4-40% de p/p de BLG não agregada em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende na faixa de 1-35% de p/p de BLG não agregada. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo compreende na faixa de 4-30% de p/p de BLG não agregada. É ainda mais preferível que a solução de proteína de soro de queijo compreenda na faixa de 10-25% de p/p de BLG não agregada.

[00100] Qualquer fonte de proteína de soro de queijo adequada pode ser usada para preparar a solução de proteína de soro de queijo. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende, ou até mesmo consiste em, um concentrado de proteína de soro de leite, concentrado de proteína de soro de queijo, isolado de proteína de soro de leite, isolado de proteína de soro de queijo, ou uma

27 / 115 combinação dos mesmos.

[00101] É preferível que a solução de proteína de soro de queijo seja uma solução de proteína de soro de queijo desmineralizada.

[00102] Neste contexto, o termo desmineralizado significa que a condutividade da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 15 mS/cm e, preferivelmente, no máximo 10 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 8 mS/cm. A condutividade de permeado de UF de uma solução de proteína de soro de queijo desmineralizada é preferivelmente no máximo 7 mS/cm, mais preferivelmente no máximo 4 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1 mS/cm.

[00103] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro de queijo seja um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado, um isolado de proteína de soro de leite desmineralizado, um concentrado de proteína de soro de queijo desmineralizado, ou um isolado de proteína de soro de queijo desmineralizado.

[00104] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo compreende, ou até mesmo consiste em, um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado e com pH ajustado, concentrado de proteína de soro de queijo, isolado de proteína de soro de leite, isolado de proteína de soro de queijo, ou uma combinação dos mesmos.

[00105] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir em, um concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo consistir em, um concentrado de proteína de soro de queijo desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo consistir em, um isolado de proteína de soro de leite desmineralizado. Alternativamente, a solução de proteína de soro de queijo pode compreender, ou até mesmo

28 / 115 consistir em, um isolado de proteína de soro de queijo desmineralizado.

[00106] A proteína da solução de proteína de soro de queijo é preferivelmente derivada de leite mamífero e, preferivelmente, do leite de um ruminante, tal como, por exemplo, uma vaca, ovelha, cabra, búfalo, camelo, lhama, égua e/ou veado. Proteína derivada de leite bovino (de vaca) é particularmente preferível. A BLG e a proteína de soro de queijo adicional são, portanto, preferivelmente BLG bovina e proteína de soro de queijo bovina.

[00107] A proteína da solução de proteína de soro de queijo é preferivelmente o mais próximo possível de seu estado nativo e, preferivelmente, somente foi submetida a tratamentos térmicos delicados, se foi submetida a algum.

[00108] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo tem um grau de lactosilação de no máximo 1. Preferivelmente, a BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo tem um grau de lactosilação de no máximo 0,6. Mais preferivelmente, a BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo tem um grau de lactosilação de no máximo 0,4. Ainda mais preferivelmente, a BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo tem um grau de lactosilação de no máximo 0,2. O mais preferivelmente, a BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo tem um grau de lactosilação de no máximo 0,1, tal como, por exemplo, preferivelmente no máximo 0,01.

[00109] O grau de lactosilação de BLG é determinado de acordo com Czerwenka et al (J. Agric. Food Chem., Vol. 54, nº 23, 2006, páginas 8874- 8882).

[00110] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 80 mg/100 g de proteína. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de

29 / 115 queijo tem um valor de furosina de no máximo 40 mg/100 g de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 20 mg/100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 10 mg/100 g de proteína. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um valor de furosina de no máximo 5 mg/100 g de proteína, tal como, por exemplo, preferivelmente um valor de furosina de 0 mg/ 100 g de proteína.

[00111] A solução de proteína de soro de queijo tipicamente contém outros componentes além de proteína. A solução de proteína de soro de queijo pode conter outros componentes que são normalmente encontrados no soro de queijo ou no soro de leite, tais como, por exemplo, minerais, carboidrato, e/ou lipídeo. Alternativa ou adicionalmente, a solução de proteína de soro de queijo pode conter componentes que não sejam nativos ao soro de queijo ou ao soro de leite. No entanto, tais componentes não nativos devem preferivelmente ser seguros para uso na produção de alimentos e, preferivelmente, também para o consumo humano.

[00112] O presente método é particularmente vantajoso para separar BLG não agregada de soluções de proteína de soro de queijo brutas que contenham outros sólidos que não a BLG não agregada.

[00113] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, conter carboidratos, tais como, por exemplo, lactose, oligossacarídeos e/ou produtos de hidrólise da lactose (isto é, glicose e galactose). A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, conter carboidrato na faixa de 0-40% de p/p, tal como na faixa de 1-30% de p/p, ou na faixa de 2-20% de p/p.

[00114] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo contém no máximo 20% de p/p de carboidrato, preferivelmente no máximo 10% de p/p de carboidrato, mais preferivelmente

30 / 115 no máximo 5% de p/p de carboidrato e, ainda mais preferivelmente, no máximo 2% de p/p de carboidrato.

[00115] A solução de proteína de soro de queijo pode também compreender lipídeo, por exemplo, na forma de triglicerídeo e/ou outros tipos de lipídeo, tais como fosfolipídeos.

[00116] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende uma quantidade total de lipídeo de no máximo 15% de p/p em relação ao total de sólidos. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende uma quantidade total de lipídeo de no máximo 10% de p/p em relação ao total de sólidos. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende uma quantidade total de lipídeo de no máximo 6% de p/p em relação ao total de sólidos. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende uma quantidade total de lipídeo de no máximo 1,0% de p/p em relação ao total de sólidos. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende uma quantidade total de lipídeo de no máximo 0,5% de p/p em relação ao total de sólidos.

[00117] A quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é tipicamente pelo menos 1% de p/p em relação ao peso da solução de proteína de soro de queijo. Preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 5% de p/p. Mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 10% de p/p. Ainda mais preferivelmente, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é pelo menos 15% de p/p.

[00118] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 1-50% de p/p. Preferivelmente, a quantidade total de proteína da

31 / 115 solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5-40% de p/p. Mais preferível, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 10-30% de p/p. Ainda mais preferível, a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 15-25% de p/p.

[00119] A quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é determinada de acordo com o Exemplo 1.1.

[00120] A solução de proteína de soro de queijo é tipicamente preparada submetendo-se um alimento de proteína de soro de queijo a um ou mais ajustes que formam a solução de proteína de soro de queijo que é supersaturada no que se refere à BLG.

[00121] O alimento é preferivelmente um WPC, um WPI, um SPC, um SPI, ou uma combinação dos mesmos.

[00122] No contexto da presente invenção, a expressão “alimento de proteína de soro de queijo” se refere à composição que é transformada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada no que se refere à BLG. O alimento de proteína de soro de queijo é tipicamente um líquido aquoso que compreende BLG não agregada, ALA, e pelo menos uma proteína de soro de queijo adicional, mas normalmente não é supersaturado no que se refere à BLG.

[00123] As modalidades referentes à composição química da solução de proteína de soro de queijo aplicam-se igualmente ao alimento de proteína de soro de queijo. No entanto, tipicamente pelo menos um parâmetro do alimento de proteína de soro de queijo é definido para evitar supersaturação ou pelo menos cristalização espontânea.

[00124] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo supersaturada é preparada submetendo-se o alimento de proteína de soro de queijo a um ou mais dos seguintes ajustes: ajuste do pH,

32 / 115 redução da condutividade redução da temperatura aumento da concentração proteica adição de um agente que reduza a atividade da água modificação da composição iônica.

[00125] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve ajustar o pH do alimento de proteína de soro de queijo a um pH na faixa de 5-6.

[00126] Todos os valores de pH são medidos com o uso de um eletrodo de vidro de pH e são normalizados a 25 graus C.

[00127] A solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ter um pH na faixa de 4,9-6,1. O pH da solução de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser na faixa de 5,0-6,1. Alternativamente, o pH da solução de proteína de soro de queijo pode ser na faixa de 5.1-6.1. Preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-6,0.

[00128] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,0-6,0. Preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-6,0. Mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,1-5,9. Ainda mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo pode ser na faixa de 5,2-5,9. O mais preferivelmente, o pH da solução de proteína de soro de queijo é na faixa de 5,2-5,8.

[00129] O pH é preferivelmente ajustado com o uso de ácidos e/ou bases aceitáveis para uso em alimentos. Ácidos aceitáveis para uso em alimentos são particularmente preferíveis, tais como, por exemplo, ácidos carboxílicos. Exemplos úteis de tais ácidos são, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido lático, ácido cítrico, ou ácido glucônico, e/ou misturas dos mesmos.

[00130] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pH é

33 / 115 ajustado com o uso de uma lactona, tal como, por exemplo, D-glucono-delta- lactona, que lentamente hidrolisa e ao mesmo tempo reduz o pH do líquido aquoso que a contém. O pH-alvo após a hidrólise da lactona ter terminado pode ser calculado de maneira precisa.

[00131] Exemplos úteis de bases aceitáveis para uso em alimentos são, por exemplo, fontes de hidróxido tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, sais de ácidos alimentares tais como, por exemplo, citrato trissódico, e/ou combinações dos mesmos.

[00132] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o pH é ajustado pela adição de material de troca de cátions em sua forma H+. Material de troca de cátions do tipo conta/partícula grande é facilmente removido da solução de proteína de soro de queijo antes da cristalização ou até mesmo após a cristalização. O ajuste do pH pela adição de material de troca de cátions na sua forma H+ é particularmente vantajoso na presente invenção visto que reduziu o pH sem adicionar contraíons negativos que afetam significativamente a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo.

[00133] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve reduzir a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo.

[00134] Os valores de condutividade mencionados no presente documento foram normalizados a 25 graus C a não ser que seja especificado em contrário.

[00135] Os inventores constataram que reduzir a condutividade da solução de proteína de soro de queijo leva a um rendimento mais alto de cristais de BLG. A mínima condutividade obtenível da solução de proteína de soro de queijo depende da composição da fração proteica e da fração de lipídeo (se houver). Algumas espécies de proteína, tais como, por exemplo, caseinomacropeptídeo (CMP), contribuem mais para a condutividade do que

34 / 115 outras espécies de proteína. É, portanto, preferível que a condutividade do alimento de proteína de soro de queijo seja aproximada do nível em que a proteína e os contraíons da proteína são os principais contribuidores à condutividade. A redução de condutividade muitas vezes envolve a remoção de pelo menos uma parte dos íons pequenos e livres que estão presentes na fase líquida e não ligados firmemente às proteínas.

[00136] É muitas vezes preferível que a solução de proteína de soro de queijo tenha uma condutividade de no máximo 10 mS/cm. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 5 mS/cm. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 4 mS/cm.

[00137] Condutividades inferiores são ainda mais preferíveis e ocasionam rendimentos mais alto de cristais de BLG. Assim, a solução de proteína de soro de queijo preferivelmente tem uma condutividade de no máximo 3 mS/cm. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 1 mS/cm. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem uma condutividade de no máximo 0,5 mS/cm.

[00138] A condutividade do alimento de proteína de soro de queijo é preferivelmente reduzida por diálise ou diafiltração. Diafiltração por ultrafiltração é particularmente preferível visto que permite a lavagem de sais e pequenas moléculas carregadas enquanto as proteínas são retidas. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a mesma unidade de UF é usada para UF/diafiltração e subsequente concentração do alimento de proteína de soro de queijo.

[00139] Os presentes inventores viram indicações de que a razão entre a condutividade (expressa em mS/cm) e a quantidade total de proteína na solução de proteína de soro de queijo (expressa em % em peso do total de

35 / 115 proteína em relação ao peso total da solução de proteína de soro de queijo) pode ser vantajosamente mantida em ou abaixo de um certo limiar para facilitar a cristalização de BLG não agregada.

[00140] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,3. Preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,25. Preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,20. Mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,18. Ainda mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,12. O mais preferivelmente, a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,10.

[00141] É, por exemplo, preferível que a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo seja aproximadamente 0,07, ou até mesmo inferior.

[00142] Os presentes inventores constataram adicionalmente que o alimento de proteína de soro de queijo pode ser vantajosamente condicionado para prover uma solução de proteína de soro de queijo com uma condutividade de permeado de UF de no máximo 10 mS/cm. A condutividade de permeado de UF é uma medida da condutividade da fração de molécula pequena de um líquido. Quando o termo “condutividade” é usado no presente documento por si só, ele se refere à condutividade do líquido em questão. Quando a expressão “condutividade de permeado de UF” é usada, ela se refere à condutividade da fração de molécula pequena de um líquido e é medida de acordo com o Exemplo 1.14.

36 / 115

[00143] Preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 7 mS/cm. Mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 5 mS/cm. Ainda mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 3 mS/cm.

[00144] Condutividades de permeado de UF ainda mais baixas podem ser usadas e são particularmente preferíveis se um alto rendimento de BLG não agregada dever ser obtido. Assim, preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 1,0 mS/cm. Mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,4 mS/cm. Ainda mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,1 mS/cm. O mais preferivelmente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,04 mS/cm.

[00145] Condutividades de permeado de UF ainda mais baixas podem ser alcançadas, por exemplo, se for usada água Milli-Q como um diluente durante a diafiltração (a água Milli-Q tem uma condutividade de aproximadamente 0,06 µS/cm). Assim, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,01 mS/cm. Alternativamente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,001 mS/cm. Alternativamente, a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo pode ser no máximo 0,0001 mS/cm.

[00146] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo.

[00147] Por exemplo, a preparação da solução de proteína de soro de

37 / 115 queijo pode envolver reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos 5 graus C, preferivelmente pelo menos 10 graus C e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 15 graus C. Por exemplo, a preparação da solução de proteína de soro de queijo pode envolver reduzir a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos 20 graus C.

[00148] A temperatura do alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser reduzida a no máximo 30 graus C, preferivelmente no máximo 20 graus C e, ainda mais preferivelmente, a no máximo 10 graus C. Os inventores constataram que temperaturas ainda mais baixas proveem um maior grau de supersaturação e, assim, a temperatura do alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser reduzida a no máximo 5 graus C, preferivelmente no máximo 2 graus C e, ainda mais preferivelmente, a no máximo 0 graus C. A temperatura pode até mesmo ser inferior a 0 graus C. No entanto, preferivelmente a solução de proteína de soro de queijo deve permanecer bombeável, por exemplo, na forma de uma pasta fluida gelada.

[00149] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo é uma pasta fluida gelada antes da inicialização da cristalização de BLG. Alternativa ou adicionalmente, a cristalização da solução de proteína de soro de queijo pode ser convertida em ou mantida como uma pasta fluida gelada durante a cristalização de BLG da etapa b).

[00150] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve aumentar a concentração total de proteína do alimento de proteína de soro de queijo. O alimento de proteína de soro de queijo pode, por exemplo, ser submetido a uma ou mais etapas de concentração de proteína tais como ultrafiltração, nanofiltração, osmose reversa, e/ou evaporação e, desse modo, concentrado para obter-se a solução de proteína de soro de queijo.

[00151] Ultrafiltração é particularmente preferível visto que permite

38 / 115 concentração seletiva de proteína enquanto as concentrações de sais e carboidratos praticamente não são afetadas. Como mencionado acima, a ultrafiltração é preferivelmente usada tanto para diafiltração quanto para concentração do alimento de proteína de soro de queijo.

[00152] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a concentração de BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo é abaixo do nível em que a cristalização espontânea de BLG não agregada ocorre. É, portanto, muitas vezes preferível interromper as modificações do alimento de proteína de soro de queijo quando a solução de proteína de soro de queijo está na região metaestável, isto é, na região supersaturada em que os cristais de BLG podem crescer quando é usada semeadura, mas em que a cristalização não se inicia espontaneamente.

[00153] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve adição de um ou mais agente(s) redutor(es) de atividade de água ao alimento de proteína de soro de queijo.

[00154] Exemplos úteis, mas não limitantes, de tais agentes redutores de atividade de água são polissacarídeos e/ou polietilenoglicol (PEG).

[00155] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve modificar a composição iônica do alimento de proteína de soro de queijo, por exemplo, por troca iônica, pela adição de novas espécies iônicas, por diálise ou por diafiltração.

[00156] Tipicamente, a solução de proteína de soro de queijo é preparada combinando-se duas ou mais das etapas de processo acima para criar supersaturação.

[00157] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos:

39 / 115 - concentração, por exemplo, com o uso de ultrafiltração, nanofiltração ou osmose reversa, a uma temperatura acima de 10 graus C, e - subsequente resfriamento a uma temperatura abaixo de 10 graus C.

[00158] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos - concentração a um pH acima de 6,0, e - subsequente redução do pH pela adição de um ácido (por exemplo, GDL ou material de troca de cátions na forma H+)

[00159] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a pelo menos: - redução da condutividade, por exemplo, por diafiltração com o uso de uma membrana que retenha pelo menos BLG não agregada.

[00160] Em modalidades preferenciais adicionais da invenção, a preparação da solução de proteína de soro de queijo envolve submeter o alimento de proteína de soro de queijo a uma combinação de pelo menos: - ajuste do pH a 5-6, - redução da condutividade por diafiltração com o uso de uma membrana que retenha pelo menos BLG não agregada, - concentração de proteína, por exemplo, com o uso de ultrafiltração, nanofiltração ou osmose reversa, a uma temperatura acima de 10 graus C e - finalmente, resfriamento a uma temperatura abaixo de 10 graus C.

[00161] Os presentes inventores constataram adicionalmente que o rendimento de BLG não agregada do presente método pode ser melhorado controlando-se a razão molar entre a soma de sódio+potássio vs. a soma de

40 / 115 cálcio+magnésio. Uma quantidade relativa mais alta de cálcio e magnésio surpreendentemente parece aumentar o rendimento de BLG não agregada e, portanto, aumenta a eficiência da recuperação de BLG não agregada do presente método.

[00162] Em algumas modalidades preferenciais da presente invenção, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 4. Mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 2. Ainda mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 1,5 e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1,0. O mais preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) tem uma razão molar entre Na + K e Ca + Mg de no máximo 0,5, tal como, por exemplo, no máximo 0,2.

[00163] A razão molar entre Na + K e Ca + Mg é calculada como (mNa+mK)/(mCa+mMg) em que mNa é o teor de Na elementar em mol, mK é o teor de K elementar em mol, mCa é o teor de Ca elementar em mol, e mMg é o teor de Mg elementar em mol.

[00164] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro de queijo tenha sido supersaturada no que se refere à BLG por meio de salting-in e que a BLG não agregada, portanto, possa ser cristalizada da solução de proteína de soro de queijo no modo salting-in.

[00165] Em algumas modalidades da invenção, a solução de proteína de soro de queijo tem um teor baixo de proteína desnaturada. Isso é particularmente preferível para evitar que a BLG agregada acabe na composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA. Preferivelmente, a solução de proteína de soro de queijo tem um grau de desnaturação de proteína de no máximo 2%, preferivelmente no máximo 1,5%, mais preferivelmente no máximo 1,0% e, o mais preferivelmente, no

41 / 115 máximo 0,8%.

[00166] A etapa b) do método envolve cristalizar pelo menos uma parte da BLG não agregada da solução de proteína de soro de queijo supersaturada.

[00167] É particularmente preferível que a cristalização da etapa b) aconteça no modo salting-in, isto é, em um líquido que tenha uma baixa força iônica e condutividade. Isso é contrário ao modo salting-out, em que quantidades significativas de sais são adicionadas a uma solução a fim de provocar cristalização.

[00168] A cristalização de BLG não agregada da etapa b) pode, por exemplo, envolver um ou mais dos seguintes itens: espera para que a cristalização aconteça, adição de sementes de cristalização, aumento dos graus de supersaturação de BLG não agregada ainda mais e/ou estimulação mecânica.

[00169] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa b) envolve adicionar sementes de cristalização à solução de proteína de soro de queijo. Os inventores constataram que a adição de sementes de cristalização possibilita controlar quando e onde a cristalização de BLG acontece para evitar o súbito entupimento do equipamento de processo e interrupções não intencionais durante a produção. É, por exemplo, muitas vezes desejável evitar cristalização inicial enquanto se concentra o alimento de proteína de soro de queijo.

[00170] É particularmente preferível que a solução de proteína de soro de queijo não entre em contato com uma membrana de UF ou membrana de MF em operação durante a etapa b) a não ser que membranas cerâmicas ou sistemas de alto cisalhamento, tais como DCF, sejam empregados.

[00171] Em princípio, pode ser usado qualquer material de semente

42 / 115 que inicie a cristalização de BLG não agregada. No entanto, é preferível que cristais de BLG hidratados ou cristais de BLG secados sejam usados para semeadura para evitar adicionar impurezas adicionais à solução de proteína de soro de queijo.

[00172] As sementes de cristalização podem ser na forma seca ou podem formar parte de uma suspensão quando adicionadas à solução de proteína de soro de queijo. Adicionar uma suspensão contendo as sementes de cristalização, por exemplo, cristais de BLG, é presentemente preferível visto que parece prover um início mais rápido de cristalização. É preferível que uma tal suspensão contenha sementes de cristalização com um pH na faixa de 5-6 e uma condutividade de no máximo 10 mS/cm.

[00173] É particularmente preferível que as sementes de cristalização sejam adicionadas por meio de uma suspensão de cristais de BLG que não tenham sido secados após a cristalização de BLG. Uma tal suspensão poderia, por exemplo, ser uma porção de cristais de BLG e licor-mãe obtidos na etapa 2) de um lote anterior ou uma porção de cristais de BLG úmidos obtidos na etapa 3), 4) ou 5) de um lote anterior.

[00174] Os presentes inventores observaram que o uso de cristais de BLG úmidos para sementes de cristalização provê cristais de BLG muito maiores durante a etapa 2) do que se forem usados cristais de BLG secos ou mal hidratados, o que de novo torna a separação de BLG do licor-mãe mais eficiente. Em um experimento em que o alimento de proteína de soro de queijo, as condições de cristalização, o tamanho de massa e partícula do material de semeadura, o perfil de resfriamento, e o método de separação foram os mesmos, os inventores constataram que a semeadura com cristais de BLG não secados proveu um aumento de 100% no tamanho de partícula dos cristais obtidos (tamanho de partícula obtido: 100-130 mícrons) em relação aos cristais de BLG obtidos por semeadura com cristais de BLG secados e reidratados (tamanho de partícula obtido: 40-60 mícrons).

43 / 115

[00175] Alternativamente, se as sementes de cristalização são baseadas em cristais de BLG secados, é preferível ressuspender os cristais em um líquido aquoso, por exemplo, água, e permitir que os cristais de BLG secados reidratem por pelo menos 30 minutos, preferivelmente pelo menos 1,0 hora e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 1,5 hora antes de a suspensão de cristal de BLG resultante ser usada para iniciar a cristalização.

[00176] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos algumas das sementes de cristalização se localizam em uma fase sólida que é colocada em contato com a solução de proteína de soro de queijo.

[00177] As sementes de cristalização preferivelmente têm um tamanho de partícula menor do que o tamanho desejado dos cristais de BLG. O tamanho das sementes de cristalização pode ser modificado removendo-se as sementes maiores por crivagem ou outros processos de fracionamento de tamanho. A redução de tamanho de partícula, por exemplo, por meio de moagem, pode também ser empregada antes do fracionamento de tamanho de partícula.

[00178] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos 90% de p/p das sementes de cristalização têm um tamanho de partícula (medido por análise por crivagem) na faixa de 0,1-600 mícrons. Por exemplo, pelo menos 90% de p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 1-400 mícrons. Preferivelmente, pelo menos 90% de p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 5-200 mícrons. Mais preferivelmente, pelo menos 90% de p/p das sementes de cristalização pode ter um tamanho de partícula na faixa de 5-100 mícrons.

[00179] O tamanho de partícula e a dosagem das sementes de cristalização podem adaptados para prover a cristalização de BLG não agregada ideal.

[00180] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, as sementes de cristalização são adicionadas ao alimento de proteína de soro de

44 / 115 queijo antes de se obter a supersaturação no que se refere à BLG, mas preferivelmente de modo que pelo menos algumas das sementes de cristalização ainda estejam presentes quando a supersaturação for alcançada. Isso pode, por exemplo, ser conseguido adicionando-se sementes de cristalização quando o alimento de proteína de soro de queijo está perto da supersaturação, por exemplo, durante o resfriamento, a concentração e/ou o ajuste de pH, e para alcançar a supersaturação antes de as sementes de cristalização serem completamente dissolvidas.

[00181] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa b) envolve aumentar o grau de supersaturação de BLG não agregada ainda mais, preferivelmente a um grau em que a cristalização de BLG inicie imediatamente, isto é, em no máximo 20 minutos e, preferivelmente, em no máximo 5 minutos. Isso é também chamado de a zona de nucleação, em que cristalitos se formam espontaneamente e começam o processo de cristalização.

[00182] O grau de supersaturação pode, por exemplo, ser aumentado por um ou mais dos seguintes itens: aumentar mais a concentração de proteína da solução de proteína de soro de queijo resfriar mais a solução de proteína de soro de queijo aproximar a solução de proteína de soro de queijo do pH ideal para cristalização de BLG reduzir a condutividade ainda mais.

[00183] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa b) envolve esperar que os cristais de BLG se formem. Isso pode levar várias horas e é tipicamente para uma solução de proteína de soro de queijo que é apenas ligeiramente supersaturada no que se refere à BLG e à qual nenhuma semente de cristalização foi adicionada.

[00184] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a

45 / 115 provisão da solução de proteína de soro de queijo (etapa a) e a cristalização de BLG não agregada (etapa b) ocorrem como duas etapas separadas.

[00185] No entanto, em outras modalidades preferenciais da invenção, a etapa b) envolve ajuste adicional da solução de proteína de soro de queijo em cristalização para elevar o grau de supersaturação de BLG não agregada, ou pelo menos manter a supersaturação. O ajuste adicional resulta em um aumento no rendimento de cristais de BLG.

[00186] Tal ajuste adicional pode envolver um ou mais de: aumentar ainda mais a concentração de proteína da solução de proteína de soro de queijo em cristalização resfriar a solução de proteína de soro de queijo em cristalização a uma temperatura ainda mais baixa aproximar a solução de proteína de soro de queijo em cristalização ainda mais do pH ideal para a cristalização de BLG reduzir ainda mais a condutividade da solução de proteína de soro de queijo em cristalização.

[00187] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a solução de proteína de soro de queijo em cristalização é mantida na zona metaestável durante a etapa b) para evitar a formação espontânea de novos cristalitos.

[00188] Os inventores determinaram a estrutura de retícula de cristal dos cristais de BLG isolados por cristalografia de raio X e não encontraram um cristal similar na técnica anterior.

[00189] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos durante a etapa b) têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21.

[00190] Preferivelmente, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±5%) Å, b = 68,68 (±5%) Å, e c = 156,65 (±5%) Å; e ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.

46 / 115

[00191] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±2%) Å, b = 68,68 (±2%) Å, e c = 156,65 (±2%) Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.

[00192] Ainda mais preferível, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos podem ter um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 (±1%) Å, b = 68,68 (±1%) Å, e c = 156,65 (±1%) Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.

[00193] O mais preferivelmente, pelo menos alguns dos cristais de BLG obtidos têm um grupo de espaço ortorrômbico P 21 21 21 e as dimensões de célula de unidade a=68,68 Å, b = 68,68 Å, e c = 156,65 Å; e os ângulos integrais de célula de unidade α=90°, β=90°, e γ=90°.

[00194] Em algumas modalidades particularmente preferenciais da invenção, o método contém uma etapa c) de separar pelo menos alguns dos cristais de BLG da solução de proteína de soro de queijo restante. Isso é especialmente preferível quando a purificação de BLG não agregada é desejada.

[00195] A etapa c) pode, por exemplo, compreender separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 30% de p/p. Preferivelmente, a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 40% de p/p. Ainda mais preferivelmente, a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 50% de p/p.

[00196] Os inventores constataram que o alto teor de sólidos é vantajoso para a purificação de BLG não agregada, visto que a porção aquosa que adere aos cristais de BLG separados tipicamente contém as impurezas que devem ser evitadas. Adicionalmente, o alto teor de sólidos reduz o consumo de energia para a conversão dos cristais de BLG separados a um produto seco, tal como, por exemplo, um pó, e aumenta o rendimento de BLG

47 / 115 não agregada obtido de uma unidade de secagem com uma determinada capacidade.

[00197] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 60%. Preferivelmente, a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 70%. Ainda mais preferivelmente, a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 80%.

[00198] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a separação da etapa c) envolve uma ou mais das seguintes operações: centrifugação, decantação, filtração, sedimentação, combinações dos itens acima.

[00199] Essas operações unitárias são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica e são facilmente implementadas. A separação por filtração pode, por exemplo, envolver o uso de filtração a vácuo, filtração de fluxo cruzado dinâmico (DCF), uma prensa de filtrado ou uma centrífuga de filtro.

[00200] Podem ser empregados diferentes tamanhos de poro para filtração com base no resultado desejado. Preferivelmente, o filtro permite que a proteína de soro de queijo nativa e pequenos agregados passem, mas retenham os cristais de BLG. O filtro preferivelmente tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 0,1 mícron. O filtro pode, por exemplo, ter um tamanho de poro nominal de pelo menos 0,5 mícron. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro nominal de pelo menos 2 mícrons.

[00201] Filtros com tamanhos de poro maiores podem também ser usados e são, na verdade, preferíveis se principalmente os cristais grandes

48 / 115 devam ser separados de um líquido contendo cristais de BLG. Em algumas modalidades da invenção, o filtro tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 5 mícrons. Preferivelmente, o filtro tem um tamanho de poro nominal de pelo menos 20 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro de pelo menos 40 mícrons.

[00202] O filtro pode, por exemplo, ter um tamanho de poro na faixa de 0,03-5.000 mícrons, tal como, por exemplo, 0,1-5.000 mícrons. Preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 0,5-1.000 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 5-800 mícrons, tal como, por exemplo, na faixa de 10-500 mícrons ou na faixa de 50-500 mícrons.

[00203] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o filtro tem um tamanho de poro na faixa de 0,03-100 mícrons. Preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 0,1-50 mícrons. Mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 4-40 mícrons. Ainda mais preferivelmente, o filtro pode ter um tamanho de poro na faixa de 5-30 mícrons, tal como na faixa de 10-20 mícrons.

[00204] Uma vantagem de usar filtros com um tamanho de poro maior do que 1 mícron é que bactérias e outros micro-organismos também são pelo menos parcialmente removidos durante a separação e opcionalmente também durante a lavagem e/ou recristalização.

[00205] Outra vantagem de usar filtros com um tamanho de poro maior do que 1 mícron é que a remoção de água e a subsequente secagem ficam mais fáceis e consomem menos energia.

[00206] A solução de proteína de soro de queijo restante que é separada dos cristais de BLG pode ser reciclada ao alimento de proteína de soro de queijo durante a preparação da solução de proteína de soro de queijo.

[00207] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa c) emprega uma centrífuga de filtro. Em outras modalidades preferenciais da

49 / 115 invenção, a etapa c) emprega uma centrífuga decantadora. Os resultados iniciais mostraram que o uso de uma centrífuga de filtro e/ou uma centrífuga decantadora para separar cristais de BLG do licor-mãe provê uma operação mais robusta do método do que, por exemplo, filtração a vácuo.

[00208] Muitas vezes é preferível secar uma torta de filtro formada com um gás de secagem para reduzir o teor de umidade da torta de filtro e, preferivelmente, possibilitar destacar a torta de filtro do filtro. O uso de um gás de secagem pode formar parte da etapa de separação ou, alternativamente, da etapa de secagem final, se a torta de filtro for convertida diretamente a uma composição de BLG comestível seca.

[00209] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa c) emprega uma unidade de DCF.

[00210] Os testes iniciais (consultar o exemplo 6) mostraram que o uso de uma unidade de DCF com um tamanho de poro de membrana na faixa de 0,03-5 mícrons e, preferivelmente, na faixa de 0,3-1,0 mícron, oferece uma separação eficiente de cristais de BLG, e os inventores observaram que a unidade de DCF pode ser colocada em funcionamento por uma duração suficiente para separar os cristais de até mesmo lotes grandes de solução de proteína de soro de queijo contendo cristais de BLG.

[00211] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a etapa c) é realizada com o uso de uma unidade de DCF equipada com uma membrana capaz de reter cristais de BLG, o permeado de DCF é reciclado para formar parte da solução de proteína de soro de queijo ou do alimento de proteína de soro de queijo, e o retentado de DCF pode ser recuperado ou devolvido ao tanque de cristalização. Preferivelmente, o permeado de DCF é tratado, por exemplo, por ultrafiltração/diafiltração para torná-lo supersaturado no que se refere à BLG antes de misturar com a solução de proteína de soro de queijo ou o alimento de proteína de soro de queijo.

[00212] Vantajosamente, essas modalidades não requerem que a

50 / 115 temperatura das correntes líquidas seja elevada acima de 15 graus C e são, portanto, menos propensas a contaminação microbiana do que as variantes do método que requerem temperaturas mais altas. Outra vantagem industrial dessas modalidades é que o nível de supersaturação é facilmente controlado e pode ser mantido em um nível em que cristalização espontânea indesejada não ocorra. A temperatura das correntes líquidas durante essas modalidades do método é, portanto, preferivelmente no máximo 15 graus C, mais preferivelmente no máximo 12 graus C e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 graus C e, o mais preferivelmente, no máximo 5 graus C.

[00213] Essas modalidades são exemplificadas no Exemplo 6 e ilustradas na figura 6. Essas modalidades podem ser implementadas como um método em lotes ou um método contínuo.

[00214] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o método compreende uma etapa de lavagem cristais de BLG, por exemplo, os cristais de BLG separados da c). A lavagem pode consistir em uma única lavagem ou em múltiplas etapas de lavagem.

[00215] A lavagem preferivelmente envolve colocar os cristais de BLG em contato com um líquido de lavagem, sem completamente dissolver os cristais de BLG e, subsequentemente, separar os cristais de BLG restantes do líquido de lavagem.

[00216] O líquido de lavagem é preferivelmente selecionado para evitar a completa dissolução dos cristais de BLG e pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir essencialmente em, água desmineralizada, água de torneira, ou permeado de osmose reversa.

[00217] O líquido de lavagem pode, por exemplo, compreender, ou até mesmo consistir essencialmente em, água desmineralizada fria, água de torneira fria, ou permeado de osmose reversa frio.

[00218] O líquido de lavagem pode ter um pH na faixa de 5-6, preferivelmente na faixa de 5,0-6,0 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de

51 / 115 5,1-6,0, tal como por exemplo na faixa de 5,1-5,9.

[00219] Alternativamente, o líquido de lavagem pode ter um pH na faixa de 6,1-8, preferivelmente na faixa de 6,4-7,6 e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 6,6-7,4, tal como por exemplo na faixa de 6,8- 7,2. Esse é tipicamente o pH do líquido de lavagem quando água desmineralizada, água de torneira, ou permeado de osmose reversa. É no geral preferível que o líquido de lavagem tenha um nível baixo de minerais e uma baixa capacidade de tamponamento.

[00220] O líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 0,1 mS/cm, preferivelmente no máximo 0,02 mS/cm e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,005 mS/cm.

[00221] Podem ser usados líquidos de lavagem com condutividades ainda mais baixas. Por exemplo, o líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 1 microS/cm. Alternativamente, o líquido de lavagem pode ter uma condutividade de no máximo 0,1 microS/cm, tal como, por exemplo, aproximadamente 0,05 microS/cm.

[00222] Uma etapa de lavagem é preferivelmente realizada em baixa temperatura para limitar a dissolução de BLG cristalizada. A temperatura do líquido de lavagem é preferivelmente no máximo 30 graus C, mais preferivelmente no máximo 20 graus C e, ainda mais preferivelmente, no máximo 10 graus C.

[00223] Uma etapa de lavagem pode, por exemplo, ser realizada a no máximo 5 graus C, mais preferivelmente a no máximo 2 graus C, tal como, por exemplo, aproximadamente 0 grau C. Temperaturas mais baixas do que 0 grau C podem ser usadas desde que o líquido de lavagem não congele nessa temperatura, por exemplo, devido à presença de um ou mais redutor(es) de ponto de congelamento.

[00224] Em algumas modalidades da invenção, o líquido de lavagem contém BLG não agregada, por exemplo, em uma quantidade de pelo menos

52 / 115 1% de p/p e, preferivelmente, em uma quantidade de pelo menos 3% de p/p, tal como, por exemplo, em uma quantidade de 4% de p/p.

[00225] A lavagem da etapa d) tipicamente dissolve no máximo 80% de p/p da quantidade inicial de cristais de BLG, preferivelmente no máximo 50% de p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 20% de p/p da quantidade inicial de cristais de BLG. Preferivelmente, a lavagem da etapa d) dissolve no máximo 15% de p/p da quantidade inicial de cristais de BLG, mais preferivelmente no máximo 10% de p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 5% de p/p da quantidade inicial de cristais de BLG.

[00226] A razão de peso entre a quantidade total de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados é muitas vezes pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 2 e, mais preferivelmente, pelo menos 5. Por exemplo, a razão de peso entre a quantidade de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados pode ser pelo menos 10. Alternativamente, a razão de peso entre a quantidade total de líquido de lavagem e a quantidade inicial de cristais de BLG separados pode ser pelo menos 20, tal como, por exemplo, pelo menos 50 ou pelo menos 100.

[00227] A expressão “quantidade total de líquido de lavagem” se refere à quantidade total de líquido de lavagem usada durante todo o processo.

[00228] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, as uma ou mais sequências de lavagem ocorrem no mesmo conjunto de filtro ou em um conjunto de filtro similar que o da separação de cristal de BLG. A uma torta de filtro contendo principalmente cristais de BLG adiciona-se uma ou mais sequências de líquido de lavagem, que é removido através do filtro enquanto a parte restante dos cristais de BLG fica na torta de filtro.

[00229] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, a separação da etapa c) é realizada com o uso de um filtro que retém cristais de BLG. Subsequentemente, a torta de filtro é colocada em contato com uma ou mais quantidades de líquido de lavagem que se move pela torta de filtro e pelo

53 / 115 filtro. É muitas vezes preferível que cada quantidade de líquido de lavagem seja no máximo 10 vezes o volume da torta de filtro, preferivelmente no máximo 5 vezes o volume da torta de filtro, mais preferivelmente no máximo 1 vez o volume da torta de filtro, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 vez o volume da torta de filtro, tal como, por exemplo, no máximo 0,2 vez o volume da torta de filtro. O volume da torta de filtro inclui tanto sólidos quanto fluidos (líquidos e gases) da torta de filtro. A torta de filtro é preferivelmente lavada desse modo pelo menos 2 vezes, preferivelmente pelo menos 4 vezes e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 6 vezes.

[00230] O líquido de lavagem usado da etapa de lavagem pode, por exemplo, ser reciclado ao alimento de proteína de soro de queijo ou à solução de proteína de soro de queijo em que a BLG não agregada lavada pode ser isolada de novo.

[00231] O método pode compreender adicionalmente uma etapa que envolve uma etapa de recristalização que compreende: - dissolver os cristais de BLG separados em um líquido de recristalização, - ajustar o líquido de recristalização para obter supersaturação no que se refere à BLG, - cristalizar BLG não agregada no líquido de recristalização supersaturado e ajustado e - separar cristais de BLG do líquido de recristalização ajustado restante.

[00232] A recristalização pode compreender ou uma única sequência de recristalização ou múltiplas sequências de recristalização.

[00233] Em algumas modalidades da invenção, os cristais de BLG da etapa ou c) ou subsequentemente cristais de BLG lavados são recristalizados pelo menos 2 vezes. Por exemplo, os cristais de BLG podem ser recristalizados pelo menos 3 vezes, tal como, por exemplo, pelo menos 4

54 / 115 vezes.

[00234] As etapas de lavagem e recristalização podem ser combinadas em qualquer sequência e podem ser realizadas múltiplas vezes se necessário.

[00235] Os cristais de BLG separados da etapa c) podem, por exemplo, ser submetidos à sequência de processo: uma ou mais etapas de lavagem, seguidas de uma ou mais etapas de recristalização.

[00236] Alternativamente, os cristais de BLG separados da etapa c) podem ser submetidos à sequência de processo: uma ou mais etapas de recristalização, seguidas de uma ou mais etapas de lavagem.

[00237] É também possível combinar múltiplas etapas de lavagem e recristalização, por exemplo, na sequência: uma ou mais etapas de lavagem, uma ou mais etapas de recristalização, uma ou mais etapas de lavagem e uma ou mais etapas de recristalização.

[00238] Ou, por exemplo, na sequência: uma ou mais etapas de recristalização, uma ou mais etapas de lavagem, uma ou mais etapas de recristalização. uma ou mais etapas de lavagem

[00239] A etapa d) provê uma primeira composição derivada do licor- mãe recuperado.

[00240] No contexto da presente invenção, os termos “primeira composição derivada do licor-mãe recuperado” e “primeira composição” referem-se a uma composição líquida aquosa que compreende pelo menos uma quantidade significativa da ALA do licor-mãe recuperado e, preferivelmente, substancialmente toda a ALA do licor-mãe recuperado.

55 / 115

[00241] Em algumas modalidades da invenção, a primeira composição compreende pelo menos 20% da ALA do licor-mãe recuperado, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 60%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% e, o mais preferivelmente, pelo menos 90% da ALA do licor-mãe recuperado. Preferivelmente, a primeira composição compreende substancialmente toda a ALA do licor-mãe recuperado.

[00242] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende ou até mesmo consiste no licor-mãe recuperado. Assim, pode ser preferível que a primeira composição seja o licor-mãe recuperado em si.

[00243] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição é um concentrado de proteína do licor-mãe recuperado.

[00244] Em algumas modalidades da invenção, é adicionalmente possível que a primeira composição compreenda uma ou mais fontes de proteína de soro de queijo adicionais, e é muitas vezes preferível que a porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína da primeira composição seja pelo menos igual à do licor-mãe recuperado.

[00245] Se o licor-mãe recuperado já não tiver as características necessárias, a provisão da primeira composição pode, por exemplo, envolver submeter o licor-mãe recuperado a uma ou mais etapas selecionadas do grupo de: - desmineralização, - adição de minerais - diluição, - concentração, - redução microbiana física e - ajuste de pH.

[00246] Exemplos não limitantes de desmineralização incluem, por

56 / 115 exemplo, diálise, filtração em gel, UF/diafiltração, NF/diafiltração, e cromatografia por troca iônica.

[00247] Exemplos não limitantes de adição de minerais incluem adição de sais solúveis aceitáveis para uso em alimentos, tais como, por exemplo, sais de Na, K, Ca, e/ou Mg. Tal sal pode, por exemplo, ser sais de fosfato, sais de cloreto ou sais de ácidos alimentares, tais como, por exemplo, sais de citrato, lactobionato ou lactato. Os minerais podem ser adicionados em forma sólida, suspensa, ou dissolvida.

[00248] Exemplos não limitantes de diluição incluem, por exemplo, adição de diluentes líquidos tais como água, água desmineralizada, ou soluções aquosas de minerais, ácidos ou bases.

[00249] Exemplos não limitantes de concentração incluem, por exemplo, evaporação, osmose reversa, nanofiltração, ultrafiltração e combinações dos mesmos.

[00250] Se a concentração precisar aumentar a concentração de proteína em relação ao total de sólidos, é preferível usar etapas de concentração tais como ultrafiltração ou, alternativamente, diálise. Se a concentração não precisar aumentar a concentração de proteína em relação ao total de sólidos, métodos tais como, por exemplo, evaporação, nanofiltração e/ou osmose reversa podem ser úteis.

[00251] Exemplos não limitantes de redução microbiana física incluem, por exemplo, tratamento térmico, filtração de germe, radiação UV, tratamento de alta pressão, tratamento por luz pulsada, tratamento por campo elétrico pulsado, e ultrassom. Esses métodos são bem conhecidas pela pessoa versada na técnica.

[00252] A filtração de germe tipicamente envolve microfiltração ou ultrafiltração de poro grande e requer um tamanho de poro que seja capaz de reter micro-organismos, mas permitir que as proteínas e outros componentes de interesse passem. Tamanhos de poro úteis são tipicamente no máximo 1,5

57 / 115 mícron, preferivelmente no máximo 1,0 mícron, mais preferivelmente no máximo 0,8 mícron, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mícron e, o mais preferivelmente, no máximo 0,2 mícron. O tamanho de poro para filtração de germe é normalmente pelo menos 0,1 mícron.

[00253] A filtração de germe pode, por exemplo, envolver uma membrana com um tamanho de poro de 0,02-1 mícron, preferivelmente 0,03- 0,8 mícron, mais preferivelmente 0,04-0,6 mícron, ainda mais preferivelmente 0,05-0,4 mícron e, o mais preferivelmente, 0,1-0,2 mícron.

[00254] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o líquido a ser tratado, preferivelmente o licor-mãe, é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando uma temperatura de no máximo 80 graus C e, preferivelmente, no máximo 75 graus C. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico foi preferivelmente escolhida para prover um líquido estéril.

[00255] Em outras modalidades preferenciais da invenção, o líquido a ser tratado, preferivelmente o licor-mãe, é submetido a uma filtração de germe e subsequentemente ao tratamento térmico usando uma temperatura de pelo menos 150 graus C por uma duração de no máximo 0,2 segundo e, preferivelmente, no máximo 0,1 segundo. A combinação de temperatura e duração desse tratamento térmico foi preferivelmente escolhida para prover um líquido estéril.

[00256] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a redução microbiana física envolve ou até mesmo consiste em tratamento térmico.

[00257] Preferivelmente, o tratamento térmico envolve pelo menos pasteurização.

[00258] Em modalidades particularmente preferenciais, o tratamento térmico envolve aquecimento a uma temperatura na faixa de 70-80 graus C.

[00259] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a temperatura do tratamento térmico é na faixa de 70-80 graus C,

58 / 115 preferivelmente na faixa de 70-79 graus C, mais preferivelmente na faixa de 71-78 graus C, ainda mais preferivelmente na faixa de 72-77 graus C e, o mais preferivelmente, na faixa de 73-76 graus C, tal como aproximadamente 75 graus C.

[00260] Preferivelmente, a duração do tratamento térmico, quando realizado na faixa de temperatura de 70-80, é de 1 segundo a 30 minutos. Os tempos de exposição mais altos são mais adequados para as temperaturas mais baixas da faixa de temperatura e vice-versa.

[00261] Em modalidades particularmente preferenciais da invenção, o tratamento térmico provê 70-78 graus C por 1 segundo a 30 minutos, mais preferivelmente 71-77 graus C por 1 minuto a 25 minutos e, ainda mais preferível, 72-76 graus C por 2 minutos a 20 minutos.

[00262] Temperaturas mais altas podem também ser preferíveis em algumas modalidades, especialmente se desdobramento e, opcionalmente, também agregação de BLG não agregada forem necessários antes da secagem. Por exemplo, a temperatura do tratamento térmico pode ser pelo menos 81 graus C, preferivelmente pelo menos 91 graus C, mais preferivelmente pelo menos 100 graus C, ainda mais preferivelmente pelo menos 120 graus C e, o mais preferivelmente, pelo menos 140 graus C.

[00263] O tratamento térmico pode, por exemplo, envolver uma temperatura na faixa de 90-130 graus C e uma duração na faixa de 4 segundos - 30 minutos. O tratamento térmico pode, por exemplo, envolver aquecimento a uma temperatura na faixa de 90-95 graus C por uma duração de 1-10 minutos, por exemplo, aproximadamente 120 graus C por 20 aproximadamente segundos. Alternativamente, o tratamento térmico pode envolver aquecimento a uma temperatura na faixa de 115-125 graus C por uma duração de 5-30 segundos, por exemplo, aproximadamente 120 graus C por 20 aproximadamente segundos.

[00264] Alternativamente, o tratamento térmico pode, por exemplo, ser

59 / 115 um tratamento do tipo UHT que tipicamente envolva uma temperatura na faixa de 135-144 graus C e uma duração na faixa de 2-10 segundos.

[00265] Alternativamente, mas também preferível, o tratamento térmico pode envolver uma temperatura na faixa de 145-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-2 segundos e, mais preferivelmente, uma temperatura na faixa de 150-180 graus C e uma duração na faixa de 0,01-0,3 segundo.

[00266] A implementação do tratamento térmico pode envolver o uso de equipamento convencional tal como um trocador de calor de placa ou tubular, um trocador de calor de superfície raspada ou um sistema de retorta. Alternativamente, e particularmente preferível para tratamentos térmicos acima de 95 graus C, pode ser empregado aquecimento direto à base de vapor, por exemplo, com o uso de injeção direta de vapor, infusão direta de vapor, ou cozimento por pulverização. Adicionalmente, tal aquecimento direto à base de vapor é preferivelmente usado em combinação com resfriamento instantâneo. Exemplos adequados de implementação de cozimento por pulverização são encontrados no documento WO2009113858A1, que é incorporado ao presente documento para todos os fins. Exemplos adequados de implementação de injeção direta de vapor e infusão direta de vapor são encontrados nos documentos WO2009113858A1 e WO 2010/085957 A3, que são incorporados ao presente documento para todos os fins. Os aspectos gerais de tratamento de alta temperatura são, por exemplo, encontrados em “Thermaltechnologies in food processing” (Termotecnologias no processamento de alimentos) ISBN 185573558 X, que é incorporado ao presente documento a título de referência para todos os fins.

[00267]

[00268] Exemplos não limitantes de ajuste de pH incluem, por exemplo, adição de bases e/ou ácidos e, preferivelmente, bases e/ou ácidos aceitáveis para uso em alimentos. É particularmente preferível empregar

60 / 115 ácidos e/ou bases que sejam capazes de quelar cátions de metal divalentes. Exemplos de tais ácidos bases são EDTA, ácido cítrico, sais de citrato, ácido lactobiônico, sal de lactobionato, ácido glucônico, sais de gluconato, ácidos láticos, sal de lactato, ácido fosfórico, sal de fosfato e combinações dos mesmos.

[00269] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o pH da primeira composição é substancialmente o mesmo pH que o licor-mãe, preferivelmente, assim, na faixa de pH 5-6. Alternativamente, a primeira composição pode ter um pH fora da faixa de pH 5-6.

[00270] Experimentos iniciais realizados pelos inventores revelaram que o licor-mãe recuperado muitas vezes é capaz de cristalização de BLG continuada se, por exemplo, for mais concentrado ou resfriado a uma temperatura mais baixa. Os presentes inventores acreditam que o licor-mãe recuperado ainda contém pequenos fragmentos de cristal que escaparam da separação da etapa c) e, portanto, já está semeado para cristalização. Os líquidos são tipicamente concentrados antes da secagem a fim de reduzir a quantidade de energia necessária para a secagem, mas essa concentração pode provocar a formação de cristais indesejados de BLG se o licor-mãe recuperado for usado por si só. Os inventores constataram que é vantajoso colocar o nível de BLG não agregada do licor-mãe recuperado abaixo do nível de supersaturação antes de secar o produto ou antes de concentrá-lo para evitar cristalização e incrustação indesejadas na produção.

[00271] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição ou o concentrado de proteína da primeira composição não são supersaturados no que se refere à BLG. Alternativamente, a primeira composição ou o concentrado de proteína da primeira composição podem ser supersaturados no que se refere à BLG desde que não contenham cristais de BLG.

[00272] O ajuste de pH da etapa e) garante que a primeira composição

61 / 115 ou o concentrado de proteína da primeira composição não sejam supersaturados. Se o pH da primeira composição ou de um concentrado de proteína da mesma for um pH na faixa de 5,0-6,0, é preferível que a concentração de BLG não agregada, a condutividade, e/ou a temperatura sejam selecionadas para evitar supersaturação.

[00273] Em ainda outras modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição é um isolado de ALA do licor-mãe recuperado. Se esse for o caso, a provisão da primeira composição compreende enriquecimento com ALA adicional do licor-mãe recuperado.

[00274] No contexto da presente invenção, a expressão “enriquecimento com ALA adicional” significa que a provisão da primeira composição envolveu uma ou mais etapas de processo, isto é, o enriquecimento com ALA adicional, que proveram uma primeira composição com uma porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína que é pelo menos 5% mais alta do que a do licor-mãe recuperado.

[00275] Assim, a primeira composição pode, por exemplo, ter uma porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína que é pelo menos 5% mais alta do que a do licor-mãe recuperado. Preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína que é pelo menos 10% mais alta do que a do licor-mãe recuperado, mais preferivelmente pelo menos 20% mais alta, ainda mais preferível pelo menos 30% mais alta e, o mais preferível, pelo menos 50% mais alta.

[00276] Níveis ainda mais altos de enriquecimento com ALA podem ser desejados e, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína que é pelo menos 75% mais alta do que a do licor-mãe recuperado. Preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA em relação ao total de proteína que é pelo menos 100% mais

62 / 115 alta do que a do licor-mãe recuperado, mais preferivelmente pelo menos 150% mais alta, ainda mais preferível pelo menos 200% mais alta e, o mais preferível, pelo menos 400% mais alta.

[00277] A porcentagem em peso de ALA da primeira composição depende de como o licor-mãe foi processado para obter a primeira composição, mas é tipicamente pelo menos 20% de p/p em relação ao total de proteína. Preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 25% de p/p em relação ao total de proteína. Mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 30% de p/p em relação ao total de proteína. Ainda mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 40% de p/p em relação ao total de proteína. O mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 50% de p/p em relação ao total de proteína.

[00278] Os presentes inventores estimaram que uma porcentagem em peso de ALA de mais que 60% em relação ao total de proteína pode ser obtida se o alimento de proteína de soro de queijo for uma fonte de proteína de soro de queijo livre de CMP, tal como isolado de proteína de soro de queijo do soro de queijo ácido ou isolado de proteína de soro de leite e se DCF for usada como delineado no Exemplo 5.

[00279] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 60% de p/p em relação ao total de proteína. Mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 70% de p/p. Ainda mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 80% de p/p em relação ao total de proteína. O mais preferivelmente, a primeira composição tem uma porcentagem em peso de ALA de pelo menos 90% de p/p em relação ao total de proteína.

63 / 115

[00280] O enriquecimento adicional de ALA pode ser conseguido por qualquer método adequado.

[00281] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o enriquecimento adicional de ALA envolve enriquecimento tipo A, que envolve ajuste do pH a 3,5-5,5 e aquecimento a 50-70 graus C a fim de formar agregação reversível de ALA e subsequentemente recuperar a ALA agregada. A ALA recuperada por esse processo formará, então, parte da primeira composição. Exemplos úteis de tais processos para enriquecimento adicional de ALA são descritos na patente U.S. 5.455.331 (de Pearce et al), na patente U.S. 6.613.377 e em Muller et al (Lait 83, páginas 439–451, 2003), que são todos incorporados ao presente documento a título de referência para todos os fins.

[00282] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o enriquecimento adicional de ALA envolve enriquecimento tipo B, que envolve submeter o licor-mãe recuperado a cromatografia por troca iônica. Exemplos úteis de tais processos para enriquecimento adicional de ALA são descritos em de Jonghet al (Mild Isolation Procedure Discloses New Protein Structural Properties of β-Lactoglobulin [Procedimento de isolamento leve revela novas propriedades proteicas estruturais da β-lactoglobulina], J Dairy Sci., vol. 84(3), 2001, páginas 562-571) e Vyas et al (Scale-Up of Native β- Lactoglobulin Affinity Separation Process [Escalamento do processo de separação de afinidades de β-lactoglobulina nativa], J. Dairy Sci. 85:1639– 1645, 2002), que são incorporados ao presente documento a título de referência para todos os fins.

[00283] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o enriquecimento adicional de ALA envolve enriquecimento tipo C com o uso de separação por membrana para separar ALA das outras proteínas de soro de queijo. Um exemplo útil de um processo como esse para enriquecimento adicional de ALA é descrito em US 5.008.376, que é incorporado ao presente

64 / 115 documento a título de referência para todos os fins.

[00284] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o enriquecimento adicional de ALA envolve enriquecimento tipo D com o uso de ultrafiltração a um pH de no máximo pH 4 para remover CMP da ALA e de outras proteínas de soro de queijo. Modalidades e exemplos úteis das etapas de ultrafiltração acídica são descritos em WO2014076252A1, WO9929183 A1, e US5278288, os quais são todos incorporados ao presente documento a título de referência para todos os fins.

[00285] O enriquecimento adicional de ALA pode, por exemplo, envolver uma combinação de dois ou mais processos de enriquecimento selecionados do grupo que consiste em tipo A, tipo B, tipo C, e tipo D.

[00286] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende ALA em uma quantidade de pelo menos 92% de p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente pelo menos 95% de p/p, mais preferivelmente pelo menos 97% de p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% e, o mais preferivelmente, BLG não agregada em uma quantidade de pelo menos 99.5% de p/p em relação ao total de proteína.

[00287] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende total de proteína em uma quantidade de pelo menos 5% de p/p, preferivelmente pelo menos 10% de p/p, mais preferivelmente pelo menos 15% de p/p, ainda mais preferivelmente pelo menos 20% e, o mais preferivelmente, total de proteína em uma quantidade de pelo menos 30% de p/p.

[00288] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende total de proteína em uma quantidade na faixa de 5-40% de p/p, preferivelmente na faixa de 10-35% de p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-30% de p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-25% de p/p.

65 / 115

[00289] Os presentes inventores observaram que uma concentração de proteína crescente na primeira composição ocasiona pós secados por pulverização com uma densidade aparente mais alta, e é, portanto, preferível ter uma concentração de proteína relativamente alta na primeira composição.

[00290] Assim, em outras modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende total de proteína em uma quantidade na faixa de 10-40% de p/p, preferivelmente na faixa de 20-38% de p/p, mais preferivelmente na faixa de 24-36% de p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 28-34% de p/p.

[00291] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende um teor total de sólidos em uma quantidade na faixa de 5-50% de p/p, preferivelmente na faixa de 10-40% de p/p, mais preferivelmente na faixa de 15-35% de p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 20-30% de p/p.

[00292] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende um teor de água em uma quantidade na faixa de 50-95% de p/p, preferivelmente na faixa de 60-90% de p/p, mais preferivelmente na faixa de 65-85% de p/p, ainda mais preferivelmente na faixa de 70-80% de p/p.

[00293] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a primeira composição compreende carboidrato em uma quantidade de no máximo 60% de p/p, preferivelmente no máximo 50% de p/p, mais preferivelmente no máximo 20% de p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 10% de p/p, ainda mais preferivelmente no máximo 1% de p/p e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1%. A primeira composição pode, por exemplo, conter carboidratos, tais como, por exemplo, lactose, oligossacarídeos e/ou hidrólise produtos de lactose (isto é glucose e galactose), sucrose, e/ou maltodextrina.

[00294] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a

66 / 115 primeira composição compreende lipídeo em uma quantidade de no máximo 10% de p/p, preferivelmente no máximo 5% de p/p, mais preferivelmente no máximo 2% de p/p e, ainda mais preferivelmente, no máximo 0,1% de p/p.

[00295] Os presentes inventores constataram que pode ser vantajoso controlar o teor de mineral para alcançar algumas das propriedades desejadas da primeira composição.

[00296] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca da primeira composição é no máximo 10 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca da primeira composição é no máximo 6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 2 mmol/g de proteína.

[00297] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca da primeira composição é no máximo 1,0 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Na, K, Mg, e Ca da primeira composição é no máximo 0,6 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 0,4 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,2 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1 mmol/g de proteína.

[00298] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca da primeira composição é no máximo 5 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca da primeira composição é no máximo 3 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no máximo 1,0 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mmol/g de proteína.

[00299] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a soma das quantidades de Mg e Ca da primeira composição é no máximo 0,3 mmol/g de proteína. Preferivelmente, a soma das quantidades de Mg e Ca da primeira composição é no máximo 0,2 mmol/g de proteína, mais preferivelmente no

67 / 115 máximo 0,1 mmol/g de proteína, ainda mais preferivelmente no máximo 0,03 mmol/g de proteína e, o mais preferivelmente, no máximo 0,01 mmol/g de proteína.

[00300] Para algumas aplicações, é necessário modificar o pH da primeira composição para obter um produto que tenha as características apropriadas. Em tais modalidades, o método da invenção compreende a etapa e).

[00301] Assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, o método compreende a etapa e) em que: - o pH da primeira composição é ajustado a um pH na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,8-4,5 e, mais preferivelmente, 2,8-3,2, ou - o pH da primeira composição é ajustado a um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, 6,5-7,5.

[00302] Por exemplo, o pH da primeira composição pode ser ajustado a um pH na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,8-4,5 e, mais preferivelmente, 2,8-3,2.

[00303] Alternativamente, o pH da primeira composição pode ser ajustado a um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, 6,5-7,5.

[00304] O ajuste de pH é preferivelmente realizado com um ou mais dos ácidos e bases de grau alimentício mencionados no presente documento e, preferivelmente, com ácidos diluídos ou bases diluídas se ácidos ou bases fortes forem usados.

[00305] A etapa f) envolve secar: - a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, ou - a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma.

[00306] A secagem da etapa f) tipicamente envolve secagem por

68 / 115 pulverização ou secagem por congelamento.

[00307] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a corrente líquida submetida a secagem é um concentrado de proteína da primeira composição com pH ajustado.

[00308] A expressão “corrente líquida submetida a secagem” se refere a um dos seguintes líquidos: - a primeira composição obtida na etapa d) - um concentrado de proteína da primeira composição obtida na etapa d), - a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e), ou - um concentrado de proteína da primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e).

[00309] Em outras modalidades preferenciais da invenção, a corrente líquida submetida a secagem é um concentrado de proteína da primeira composição.

[00310] A secagem por pulverização é o método de secagem presentemente preferido.

[00311] Em algumas modalidades da invenção, a corrente líquida submetida a secagem tem uma temperatura de no máximo 70 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização (por exemplo, um bocal ou um atomizador), preferivelmente no máximo 60 graus C, mais preferivelmente no máximo 50 graus C. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a corrente líquida submetida a secagem tem uma temperatura de no máximo 40 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização, preferivelmente no máximo 30 graus C, mais preferivelmente no máximo 20 graus C, ainda mais preferivelmente no máximo 10 graus C e, o mais preferivelmente, no máximo 5 graus C.

[00312] O dispositivo de pulverização do secador por pulverização é o

69 / 115 dispositivo, por exemplo, o bocal ou o atomizador, que converte a solução ou suspensão a ser secada em gotículas que entram na câmara de secagem do secador por pulverização.

[00313] É particularmente preferível que a corrente líquida submetida a secagem tenha uma temperatura na faixa de 0-50 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização, preferivelmente na faixa de 2-40 graus C, mais preferivelmente na faixa de 4-35 graus C e, o mais preferivelmente, na faixa de 5-10 graus C quando alcança a saída do dispositivo de pulverização.

[00314] A temperatura de entrada de gás do secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 140-220 graus C, mais preferivelmente na faixa de 160-200 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 170-190 graus C, tal como, por exemplo, preferivelmente cerca de 180 graus C. A temperatura de saída do gás do secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 50-95 graus C, mais preferivelmente na faixa de 70-90 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 80-88 graus C, tal como, por exemplo, preferivelmente cerca de 85 graus C. Via de regra, diz-se que os sólidos que são submetidos a secagem por pulverização são aquecidos a uma temperatura que é 10-15 graus C menos do que a temperatura de saída do gás.

[00315] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o secador por pulverização é preferivelmente na faixa de 50-85 graus C, mais preferivelmente na faixa de 60-80 graus C e, ainda mais preferivelmente, na faixa de 65-75 graus C, tal como por exemplo preferivelmente cerca de 70 graus C.

[00316] A etapa de secagem pode envolver adicionalmente secagem de leito fluidizado, por exemplo, integrada no dispositivo de secagem por pulverização ou como uma operação unitária separada realizada após a secagem por pulverização.

[00317] A combinação de secagem por pulverização e secagem de leito

70 / 115 fluidizado possibilita reduzir a quantidade de água que é removida enquanto a gotícula de líquido a ser secado move a câmara de secagem por pulverização e, em vez disso, remove água residual do pó úmido por secagem de leito fluidizado. Essa solução requer menos energia para secagem do que somente secagem por pulverização e, além disso, possibilita modificar o pó, por exemplo, por instantização e/ou aglomeração. A instantização é preferivelmente realizada aplicando-se lecitina ou outro agente umectante útil à superfície do pó. Quando instantização é aplicada, o agente de instantização, por exemplo, lecitina dissolvida em um óleo comestível, é tipicamente adicionado em uma quantidade na faixa de 0,5-2% de p/p em relação ao peso de pó final total e, preferivelmente, na faixa de 1,0-1,5% de p/p em relação ao peso de pó final total.

[00318] Os presentes inventores notaram que o processo de cristalização incluindo a preparação da solução de proteína de soro de queijo é propenso a crescimento microbiano e constataram ser vantajoso modificar o processo para cuidar desse problema.

[00319] É particularmente preferível que a quantidade total de tempo que uma molécula de ALA fique a uma temperatura acima 12 graus C desde a provisão de alimento de proteína de soro de queijo até a secagem da etapa f) ou o subsequente uso de ALA para produção de alimentos seja no máximo 24 horas, preferivelmente 20 horas, mais preferível no máximo 12, ainda mais preferivelmente no máximo 6 horas e, o mais preferivelmente, no máximo 3 horas.

[00320] É possível e muitas vezes preferível reduzir a duração ainda mais e, assim, em algumas modalidades preferenciais da invenção, a quantidade total de tempo que uma molécula de ALA fica a uma temperatura acima 12 graus C desde a provisão de alimento de proteína de soro de queijo até a secagem da etapa f) ou o subsequente uso da primeira composição para produção de alimentos é no máximo 2 horas, preferivelmente 1 hora, mais

71 / 115 preferivelmente no máximo 0,5, ainda mais preferivelmente no máximo 0,3 hora e, o mais preferivelmente, no máximo 0,1 hora.

[00321] É adicionalmente preferível que o método inclua pelo menos uma redução microbiana física, preferivelmente aplicada ao licor-mãe após a remoção de cristais de BLG e/ou aplicada a uma corrente líquida contendo ALA após a etapa c).

[00322] A redução microbiana física preferivelmente envolve um ou mais de: - tratamento térmico, preferivelmente pelo menos pasteurização, - tratamento por radiação UV, - tratamentos por luz pulsada, - tratamento por campo elétrico pulsado, - microfiltração, - tratamento de alta pressão e - tratamento por ultrassom.

[00323] Esses processos são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica e detalhes adicionais com relação ao tratamento térmico foram providos no presente documento.

[00324] A redução microbiana física que envolve microfiltração requer um tamanho de poro que seja capaz de reter micro-organismos, mas permita que as proteínas e outros componentes de interesse passem. Tamanhos de poro úteis são tipicamente no máximo 1,5 mícron, preferivelmente no máximo 1,0 mícron, mais preferivelmente no máximo 0,8 mícron, ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 mícron e, o mais preferivelmente, no máximo 0,2 mícron. O tamanho de poro para filtração de germe é normalmente pelo menos 0,1 mícron.

[00325] A corrente líquida submetida a secagem preferivelmente tem um baixo teor de micro-organismos.

72 / 115

[00326] Em algumas modalidades da invenção, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 500.000 CFU/g, preferivelmente no máximo 100.000 CFU/g, mais preferivelmente no máximo 50.000 CFU/g, ainda mais preferivelmente no máximo 10.000 CFU/g.

[00327] Preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem pode conter no máximo 1.000 unidades formadoras de colônia (CFU)/g. Ainda mais preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 600 CFU/g. Mais preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 300 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 100 CFU/g. Ainda mais preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 50 CFU/g. O mais preferivelmente, a corrente líquida submetida a secagem contém no máximo 20 CFU/gm, tal como, por exemplo, no máximo 10 CFU/g. Em uma modalidade particularmente preferencial, a corrente líquida submetida a secagem é estéril. Uma corrente líquida submetida a secagem pode, por exemplo, ser preparada combinando-se vários processos de redução microbiana física durante a corrente líquida submetida a secagem.

[00328] O método muitas vezes compreende uma etapa de embalar a composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA. A composição de proteína de soro de queijo comestível é tipicamente embalada em recipientes adequados que são subsequentemente fechados e/ou vedados. O acondicionamento pode, por exemplo, ser realizado sob condições assépticas ou estéreis e pode, por exemplo, envolver preencher e vedar a composição de proteína de soro de queijo comestível em recipientes estéreis.

[00329] Outro aspecto da invenção se refere a uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA, por exemplo, obtenível pelo método definido no presente documento.

[00330] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA

73 / 115 compreende: - ALA em uma quantidade na faixa de 24-80% de p/p, preferivelmente 24-70% de p/p em relação ao total de proteína, - imunoglobulina em uma quantidade na faixa de 3-14% de p/p em relação ao total de proteína e - opcionalmente, fosfolipídeo em uma quantidade na faixa de 1-6% de p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente na faixa de 2-5% de p/p em relação ao total de proteína.

[00331] A quantidade de fosfolipídeo é medida de acordo com Vaghela et al (Vaghela et al, Quantitative analysis of phospholipids from whey protein concentrates by high-performance liquid chromatography with a narrow-bore column and an evaporative light-scattering detector, Journal of the American Oil Chemists’ Society, junho de 1995, volume 72, edição 6, págs. 729–733).

[00332] Uma tal composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA é, por exemplo, obtenível quando o alimento de proteína de soro de queijo é um concentrado de proteína de soro que não foi submetido a tratamento térmico de desnaturação de proteína.

[00333] Os inventores constataram particularmente vantajoso ser capaz de prover uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA que contenha imunoglobulina além de ALA e, opcionalmente, também fosfolipídeo, visto que esses componentes são úteis para nutrição pediátrica.

[00334] Em algumas modalidades da invenção, a composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA compreende no máximo 15% de p/p espécies de caseína em relação ao total de proteína.

[00335] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA pode compreender: - na faixa de 40-70% de p/p ALA em relação ao total de

74 / 115 proteína, - no máximo 15% de p/p espécies de caseína em relação ao total de proteína e - pelo menos 3% de p/p de imunoglobulina em relação ao total de proteína.

[00336] Uma vantagem da presente invenção é que a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA obtida foi tipicamente tratada de maneira bem delicada e não foi submetida a estresse térmico excessivo. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA tem um valor de furosina de no máximo 50 mg/ 100 g de proteína. Preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA tem um valor de furosina de no máximo 30 mg/100 g de proteína. Mais preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA tem um valor de furosina de no máximo 20 mg/100 g de proteína. Ainda mais preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA tem um valor de furosina de no máximo 10 mg/100 g de proteína. O mais preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA tem um valor de furosina de no máximo 2 mg/100 g de proteína e, preferivelmente, nenhum valor de furosina detectável.

[00337] O teor de BLG na composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA é muitas vezes relativamente baixo. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 40% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 30% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Mais preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 20% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Ainda mais

75 / 115 preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 10% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. O mais preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 2% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Por exemplo, é preferível que a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreenda no máximo 0,5% de p/p de BLG em relação ao total de proteína.

[00338] Outro aspecto da invenção se refere a um método para produzir um produto alimentício, o método compreendendo as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda BLG e ALA não agregadas e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado e, opcionalmente, também o líquido de lavagem usado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) opcionalmente, secar a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma ou secar a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma, g) combinar: g1) uma primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, g2) uma primeira composição com pH ajustado obtida na etapa

76 / 115 e) ou um concentrado de proteína da mesma e/ou g3) a composição seca obtida na etapa f) com um ou mais ingredientes e converter a combinação em um produto alimentício.

[00339] O produto alimentício é uma fórmula infantil, uma bebida, um pó de bebida instantânea, uma barra de proteína, mingau, ou uma vitamina.

[00340] Os um ou mais ingredientes para preparar o produto alimentício muitas vezes contêm um ou mais carboidratos não lácteos, lipídeos não lácteos, e/ou proteína não láctea. Pela expressão “carboidrato não lácteo” quer-se dizer um carboidrato que não esteja presente no leite bovino. Pela expressão “lipídeo não lácteo” quer-se dizer um lipídeo que não esteja presente no leite bovino. Pela expressão “carboidrato não lácteo” quer-se dizer uma proteína que não esteja presente no leite bovino.

[00341] O perfil de aminoácido da composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA é particularmente adequado para fórmulas infantis e outros produtos alimentícios pediátricos.

[00342] Ainda um aspecto da invenção se refere a um produto alimentício, preferivelmente um produto nutricional, que compreende a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA, por exemplo, obtenível pelo método supracitado.

[00343] Um aspecto adicional da invenção se refere a um produto nutricional que compreende a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA como definida no presente documento.

[00344] No contexto da presente invenção, a expressão “produto nutricional” se refere a um produto comestível, isto é, seguro para o consumo humano, que compreende pelo menos proteína e um ou mais dos seguintes itens: lipídeo, carboidrato, mineral e vitamina. O produto nutricional preferivelmente compreende proteína, carboidrato e lipídeo, e, ainda mais preferível, compreende proteína, carboidrato, lipídeo, mineral e vitamina.

[00345] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o produto

77 / 115 nutricional é um produto nutricional adequado para nutrição clínica, um produto nutricional adequado para nutrição esportiva ou um produto nutricional adequado para nutrição pediátrica.

[00346] É particularmente preferível que o produto nutricional seja um produto nutricional pediátrico. Preferivelmente, o produto nutricional é uma fórmula infantil nutricionalmente completa ou uma base de fórmula infantil que contém pelo menos a proteína necessária para uma fórmula infantil. Alternativamente, mas também preferível, o produto nutricional pediátrico pode ser uma fórmula de seguimento ou um leite de crescimento.

[00347] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o produto nutricional, por exemplo, na forma de uma fórmula infantil, compreende: - pelo menos 40% de p/p de ALA em relação à quantidade total de proteína, preferivelmente pelo menos 45% de p/p, e - pelo menos 5% de p/p de imunoglobulina em relação à quantidade total de proteína.

[00348] Em outras modalidades da invenção, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreende: - na faixa de 40-70% de p/p ALA em relação ao total de proteína - no máximo 15% p/p de espécies de caseína em relação ao total de proteína - e pelo menos 5% de p/p de imunoglobulina.

[00349] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o produto nutricional, por exemplo, na forma de uma fórmula infantil, compreende: - ALA em uma quantidade na faixa de 24-80% p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente 40-70% de p/p em relação ao total de proteína e, mais preferivelmente, 45-65% de p/p em relação ao total de proteína, -imunoglobulina em uma quantidade na faixa de 5-14% de p/p

78 / 115 em relação ao total de proteína e - opcionalmente, fosfolipídeo em uma quantidade na faixa de 1-6% de p/p em relação ao total de proteína, preferivelmente na faixa de 2-5% de p/p em relação ao total de proteína.

[00350] Em algumas modalidades da invenção, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreende no máximo 50% de p/p de espécies de caseína em relação ao total de proteína, preferivelmente no máximo 40% de p/p de espécies de caseína em relação ao total de proteína e, o mais, 30% de p/p de espécies de caseína em relação ao total de proteína.

[00351] Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o produto nutricional, por exemplo, na forma de uma fórmula infantil, compreende: -na faixa de 24-50% de p/p ALA em relação ao total de proteína - na faixa de 20-40% de p/p de espécies de caseína em relação ao total de proteína e - pelo menos 3-15% de p/p de imunoglobulina em relação ao total de proteína.

[00352] O teor de BLG do produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, é muitas vezes relativamente baixo. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreende no máximo 40% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Preferivelmente, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA compreende no máximo 30% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Mais preferivelmente, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreende no máximo 20% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Ainda mais preferivelmente, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreende no máximo 10% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. O mais preferivelmente, o produto nutricional, por exemplo na

79 / 115 forma de uma fórmula infantil, compreende no máximo 2% de p/p de BLG em relação ao total de proteína. Por exemplo, é preferível que o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, compreenda no máximo 0,5% de p/p de BLG em relação ao total de proteína.

[00353] Os um ou mais ingredientes adicionais que podem ser incluídos no produto nutricional podem vantajosamente ser selecionados dentre os ingredientes que tipicamente são usados em produtos pediátricos.

[00354] Por exemplo, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, pode incluir pelo menos um dentre os oligossacarídeos de leite humano (HMOs), tais como, por exemplo, 2'-FL e LNnT. Pesquisas mostraram múltiplos papéis para os HMOs no melhoramento da função do sistema nervoso central (CNS). Além de incluir pelo menos um dentre o 2'-FL e o LNnT descritos acima, em certos aspectos, o produto nutricional inclui adicional oligossacarídeos de leite humano (HMOs) sialilados ou fucosilados.

[00355] Qualquer um ou todos os HMOs usados no produto nutricional podem ser isolados ou enriquecidos de leite(s) secretado(s) por mamíferos, incluindo, mas não limitados a: espécie humana, bovina, ovina, suína ou caprina. Os HMOs podem também ser produzidos através de fermentação microbiana, processos enzimáticos, síntese química ou combinações dos mesmos.

[00356] HMOs sialilados adequados para inclusão na fórmula infantil podem, por exemplo, incluir pelo menos um resíduo de ácido siálico na cadeia principal do oligossacarídeo. Em certos aspectos, o HMO sialilado inclui dois ou mais resíduos de ácido siálico.

[00357] Alternativa ou adicionalmente, o produto nutricional pode também conter outros tipos de oligossacarídeos tais como, por exemplo, trans- galacto-oligossacarídeos (GOS), fructose-oligossacarídeos (FOS), e/ou polidextrose.

[00358] O produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula

80 / 115 infantil, pode incluir adicionalmente um ou mais ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs), tais como, por exemplo, ácido docosaexaenoico (DHA), ácido araquidônico (AA), ácido eicosapentanoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido linoleico, ácido linolênico (ácido alfa- linolênico) e ácido gama-ácido alfa-linolênico.

[00359] Pesquisas mostraram múltiplos papéis para PUFAs no auxílio do desenvolvimento do cérebro e da visão em bebês. Os requerentes acreditam que a inclusão de DHA e AA na fórmula infantil pode melhorar as funções neurológicas, tais como cognição, aprendizado e memória associados com o CNS.

[00360] Em certos aspectos, os PUFAs são providos como ácidos graxos livres, na forma de triglicerídeo, na forma de diglicerídeo, na forma de monoglicerídeo, na forma de fosfolipídeo ou como uma mistura de um ou mais dos itens acima, preferivelmente na forma de triglicerídeo. Os PUFAs podem ser derivados de fontes de óleo, tais como óleos de planta, plâncton marinho, óleos fúngicos e óleos de peixe. Em certos aspectos, os PUFAs são derivados de óleos de peixe, tais como óleo de savelha, salmão, anchova, bacalhau, halibute, atum ou arenque.

[00361] O produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, pode incluir adicionalmente um ou mais nucleotídeos, incluindo, por exemplo, o nucleotídeo inosina monofosfato, citidina 5 '-monofosfato, uridina 5 '-monofosfato, adenosina 5'-monofosfato, guanosina 5'-1 -monofosfato, mais preferivelmente citidina 5'- monofosfato, uridina 5'-monofosfato, adenosina 5'-monofosfato e guanosina 5'- monofosfato.

[00362] A concentração de carboidrato do produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, pode, por exemplo, variar de cerca de 5% a cerca de 40% de p/p, incluindo de cerca de 7% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 10% a cerca de 25%, por peso do produto nutricional. Quando presentes, concentrações de gordura tipicamente variam de cerca de

81 / 115 1% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 2% a cerca de 15%, e também incluindo de cerca de 3% a cerca de 10%, por peso da fórmula infantil. Quando presentes, concentrações de proteína tipicamente variam de cerca de 0,5% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 1% a cerca de 15%, e também incluindo de cerca de 2% a cerca de 10%, por peso do produto nutricional.

[00363] Em algumas modalidades da invenção, o produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, inclui uma fonte ou fontes de gordura além dos PUFAs, descritos acima. Fontes de gordura adequadas para uso no presente documento incluem qualquer gordura ou fonte de gordura que seja adequada para uso em uma fórmula infantil oral e que seja compatível com os elementos e atributos essenciais de uma fórmula como essa.

[00364] Exemplos não limitantes adicionais de gorduras adequadas ou fontes das mesmas para uso no produto nutricional descrito no presente documento incluem óleo de coco, óleo de coco fracionado, óleo de soja, óleo de milho, azeite de oliva, óleo de cártamo, óleo de cártamo altamente oleico, ácidos oleicos (ÁCIDO OLEICO EMERSOL 6313, CognisOleochemicals, Malásia), óleo MCT (triglicerídeos de cadeia média), óleo de girassol, óleo de girassol altamente oleico, óleos de dendê e de palmiste, oleína de dendê, óleo de canola, óleos marinhos, óleos de peixe, óleos fúngicos, óleos de algas, óleos de algodão e combinações dos mesmos.

[00365] O produto nutricional pode, além de proteína de soro de leite e caseína, também conter outros tipos de proteína. Exemplos não limitantes de proteínas adequadas ou fontes das mesmas para uso no produto nutricional, por exemplo na forma de uma fórmula infantil, incluem proteínas ou fontes de proteína hidrolisadas, parcialmente hidrolisadas ou não hidrolisadas, que podem ser derivadas de qualquer fonte conhecida ou de outro modo adequada, tal como animal (por exemplo, carne, peixe), cereal (por exemplo, arroz, milho), vegetal (por exemplo, soja) ou combinações das mesmas. Exemplos não limitantes de tais proteínas incluem caseína extensivamente hidrolisada,

82 / 115 isolados de proteína de soja, e concentrados de proteína de soja.

[00366] O produto nutricional pode, por exemplo, conter uma proteína hidrolisada, isto é, um hidrolisado de proteína. Nesse contexto, as expressões “proteína hidrolisada” ou “hidrolisados proteína” são usadas de maneira intercambiável e incluem proteínas extensivamente hidrolisadas, em que o grau de hidrólise é muitas vezes pelo menos cerca de 20%, incluindo de cerca de 20% a cerca de 80%, e também incluindo de cerca de 30%) a cerca de 80%), ainda mais preferivelmente de cerca de 40%> a cerca de 60%>. O grau de hidrólise é a medida na qual as ligações de peptídeo são quebradas por um método de hidrólise. O grau de proteína hidrólise a título de caracterizar o componente de proteína extensivamente hidrolisada dessas modalidades é facilmente determinado por uma pessoa versada nas técnicas de formulação quantificando-se a razão de nitrogênio amino para total de nitrogênio (AN/TN) do componente de proteína da formulação líquida selecionada. O componente de nitrogênio amino é quantificado por métodos de titulação USP para determinar o teor de nitrogênio amino, enquanto o componente de total de nitrogênio é determinado pelo método de Kjeldahl de Tecator, todos os quais são métodos bem conhecidos a uma pessoa versada na técnica de química analítica.

[00367] Proteínas hidrolisadas adequadas incluem hidrolisado de proteína de soja, hidrolisado de proteína de caseína, hidrolisado de proteína de soro de queijo, hidrolisado de proteína de arroz, hidrolisado de proteína de batata, hidrolisado de proteína de peixe, hidrolisado de albúmen de ovo, hidrolisado de proteína de gelatina, combinações de hidrolisados de proteína animal e vegetal, e combinações dos mesmos. Hidrolisados de proteína particularmente preferíveis incluem hidrolisado de proteína de soro de queijo e caseinato de sódio hidrolisado.

[00368] O produto nutricional pode, além do sacarídeo de leite, conter carboidrato adicional. Exemplos não limitantes de carboidratos adequados ou

83 / 115 fontes dos mesmos incluem maltodextrina, amido ou amido de milho hidrolisado ou modificado, polímeros de glicose, xarope de milho, sólidos de xarope de milho, carboidratos derivados de arroz, carboidratos derivados de ervilha, carboidratos derivados de batata, tapioca, sucrose, fructose, lactose, xarope de milho com alta fructose, mel, poliálcoois (por exemplo, maltitol, eritritol, sorbitol), adoçantes artificiais (por exemplo, sucralose, acessulfame de potássio, estévia) e combinações dos mesmos. Um carboidrato particularmente desejável é uma maltodextrina equivalente de dextrose (DE).

[00369] A fonte de caseína é tipicamente adicionada à composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA em uma quantidade suficiente para obter a razão de peso desejada entre caseína e proteína de soro de leite no produto nutricional. Em algumas modalidades preferenciais da invenção, a composição de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA e a fonte de caseína são misturadas para obter uma razão de peso entre a proteína de soro de leite e a caseína na faixa de 1-9, preferivelmente 1-3 e, ainda mais preferivelmente, 1,2-1,9, tal como aproximadamente 1,5.

[00370] No contexto da presente invenção, a razão de peso entre dois componentes A e B é determinada como o peso do componente A dividido pelo peso do componente B. Assim, se uma composição contém 9% de p/p de A e 6% de p/p de B, a razão de peso seria 9%/6%=1,5.

[00371] Uma vantagem do presente método é que é bem mais rápido do que métodos comparáveis para cristalização de BLG não agregada da técnica anterior. A duração desde o ajuste inicial do alimento de proteína de soro de queijo até a conclusão da separação da etapa c pode ser no máximo 10 horas, preferivelmente no máximo 4 horas, mais preferivelmente no máximo 2 horas e, ainda mais preferivelmente, no máximo 1 hora.

EXEMPLOS Exemplo 1– Métodos de análise Exemplo 1.1: Determinação do total de proteína

84 / 115

[00372] O teor total de proteína (proteína verdadeira) de uma amostra é determinado: 1) Determinando-se o total de nitrogênio da amostra seguindo o ISO 8968-1/2|IDF 020-1/2- Determination of nitrogen content - Part 1/2: Determination of nitrogen content using the Kjeldahl method (Leite - Determinação de teor de nitrogênio - Parte 1/2: Determinação de teor de nitrogênio com o uso do método de Kjeldahl. 2) Determinando-se o nitrogênio não proteína da amostra seguindo o ISO 8968-4|IDF 020-4- Milk - Determination of nitrogen content - Part 4: Determination of non-protein-nitrogen content (Leite - Determinação de teor de nitrogênio - Parte 4: Determinação de teor de nitrogênio não proteína. 3) Calculando-se a quantidade total de proteína como (mtotal de nitrogênio – nitrogênio não proteína)*6,38. Exemplo 1.2: Determinação de BLG, ALA e CMP não agregados

[00373] O teor de alfa-lactalbumina (ALA), beta-lactoglobulina (BLG) e caseinomacropeptídeo (CMP) não agregados, respectivamente, foi analisado por análise HPLC a 0,4mL/min. Uma amostra filtrada de 25 microL é injetada em 2 colunas TSKgel3000PWxl (7,8 mm 30 cm, Tosohass, Japão) conectadas em série com pré-coluna PWxl afixada (6 mm x 4 cm, Tosohass, Japão) equilibradas no eluente (consistindo em 465g de água Milli-Q, 417,3 g de acetonitrila e 1mL de ácido trifluoroacético) e com o uso de um detector por UV a 210nm.

[00374] A determinação quantitativa dos teores de alfa-lactalbumina (Calfa), beta-lactoglobulina (Cbeta) e caseinomacropeptídeo (CCMP) nativos foi realizada comparando-se as áreas pico obtidas para as proteínas padrão correspondentes com as das amostras.

[00375] A quantidade total de adicional proteína (proteína não BLG) foi determinada subtraindo-se a quantidade de BLG da quantidade de total de

85 / 115 proteína (determinada de acordo com o Exemplo 1.1) Exemplo 1.3: Determinação de turbidez

[00376] A turbidez é a nebulosidade ou a turvação de um fluido causadas por um grande número de partículas que são no geral invisíveis ao olho humano, similar a fumaça no ar.

[00377] A turbidez é medida em unidades nefelométricas de turbidez (NTU).

[00378] Bebidas/amostras de 20mL foram adicionadas a um vidro de NTU e colocadas no turbidímetro Turbiquant® 3000 IR. O valor de NTU foi medido após a estabilização e repetido duas vezes. Exemplo 1.4: Determinação da viscosidade

[00379] A viscosidade das preparações de bebida foi medida com o uso de um reômetro (Anton Paar, Physica MCR301).

[00380] Uma amostra de 3,8 mL foi adicionada a um copo DG26.7. As amostras foram equilibradas a 22 °C, então pré-cisalhadas por 30 segundos a 50 s-1, seguido de um tempo de equilíbrio de 30 segundos e varreduras de taxa de cisalhamento entre 1 s-1 e 200 s-1 e 1 s-1 foram realizadas.

[00381] A viscosidade é apresentada na unidade centipoise (cP) a uma taxa de cisalhamento de 100 s-1a não ser que afirmado em contrário. Quanto mais altos os valores de cP medidos, mais alta a viscosidade.

[00382] Alternativamente, a viscosidade foi estimada com o uso de um Viscoman da Gilson e relatada a uma taxa de cisalhamento de cerca de 300s-1 Exemplo 1.5: Determinação de teor de cinzas

[00383] O teor de cinzas de um produto alimentício é determinado de acordo com NMKL 173:2005 “Ash, gravimetric determination in foods”. Exemplo 1.6: Determinação da condutividade

[00384] A “condutividade” (às vezes chamada de a “condutância específica”) de uma solução aquosa é uma medida da capacidade da solução de conduzir eletricidade. A condutividade pode, por exemplo, ser determinada

86 / 115 medindo-se a resistência de CA da solução entre dois eletrodos e o resultado é tipicamente determinado na unidade milliSiemens por cm (mS/cm). A condutividade pode, por exemplo, ser medida de acordo com o método nº

120.1 da EPA (a Agência de Proteção Ambiental dos EUA).

[00385] Os valores de condutividade mencionados no presente documento foram normalizados a 25 graus C a não ser que seja especificado em contrário.

[00386] A condutividade é medida em um condutivímetro (cond. WTW 3210 com um eletrodo tetracon 325).

[00387] O sistema é calibrado como descrito no manual antes do uso. O eletrodo é totalmente enxaguado no mesmo tipo de meio em que a medição é conduzida, a fim de evitar diluições locais. O eletrodo é abaixado ao meio de modo que a área em que a medição ocorre seja completamente submergida. O eletrodo é então agitado de modo que qualquer ar preso no eletrodo seja removido. O eletrodo é então mantido imóvel até que um valor estável possa ser obtido e registrado a partir do visor. Exemplo 1.7: Determinação do total de sólidos de uma solução

[00388] O total de sólidos de uma solução pode ser determinado de acordo com o NMKL 110 2ª edição, 2005 (total de sólidos (água) - determinação gravimétrica no leite e em produtos lácteos). NMKL é uma abreviação para “Nordisk Metodikkomité for Næringsmidler”.

[00389] O teor de água da solução pode ser calculado como 100% menos a quantidade relativa do total de sólidos (% de p/p). Exemplo 1.8: Determinação do pH

[00390] Todos os valores de pH são medidos com o uso de um eletrodo de vidro de pH e são normalizados a 25 graus C.

[00391] O eletrodo de vidro de pH (com compensação de temperatura) é cuidadosamente enxaguado antes e calibrado antes do uso. Quando a amostra está na forma líquida, o pH é medido diretamente na solução líquida

87 / 115 a 25 graus C. Quando a amostra é um pó, 10 gramas de um pó são dissolvidos em 90 ml de água desmineralizada à temperatura ambiente enquanto é agitada vigorosamente. O pH da solução é então medido a 25 graus C. Exemplo 1.9: Determinação do teor de água de um pó

[00392] O teor de água de um produto alimentício é determinado de acordo com o ISO 5537:2004 (Dried milk - Determination of moisture content [Leite secado - determinação de teor de umidade] (método de referência)). Exemplo 1.10: Determinação das quantidades de cálcio, magnésio, sódio, potássio, fósforo (método ICP-MS)

[00393] As quantidades totais de cálcio, magnésio, sódio, potássio e fósforo são determinadas com o uso de um procedimento em que as amostras são primeiro decompostas com o uso de digestão por micro-ondas e, então, a quantidade total de mineral(is) é determinada com o uso de um aparelho ICP.

[00394] Aparelho: O micro-ondas é da Anton Paar e o ICP é um Optima 2000DV da PerkinElmer Inc.

[00395] Materiais: 1 M HNO3 ítrio em 2% de HNO3 Padrões adequados para cálcio, magnésio, sódio, potássio e fósforo em 5% de HNO3 Pré-tratamento:

[00396] Pesar uma certa quantidade de pó e transferir o pó a um tubo de digestão por micro-ondas. Adicionar 5 mL de 1M HNO3. Digerir as amostras no micro-ondas de acordo com as instruções do micro-ondas. Colocar os tubos de digestão em uma capela de exaustão, remover a tampa e deixar os gases voláteis evaporarem. Procedimento de medição:

88 / 115

[00397] Transferir amostra pré-tratada ao DigiTUBE usando uma quantidade conhecida de água Milli-Q. Adicionar uma solução de ítrio em 2% de HNO3 ao tubo de digestão (cerca de 0,25 mL por 50 mL de amostra diluída) e diluir ao volume conhecido usando água Milli-Q. Analisar as amostras no ICP usando o procedimento descrito pelo fabricante.

[00398] Uma amostra cega é preparada diluindo-se uma mistura de 10 mL de 1M HNO3 e 0,5 mL de solução de ítrio em 2% de HNO3 a um volume final de 100 mL com o uso de água Milli-Q.

[00399] Pelo menos 3 amostras padrão são preparadas com concentrações que estão dentro das concentrações esperadas de amostra. Exemplo 1.11: Determinação do valor de furosina:

[00400] O valor de furosina é determinado como descrito em “Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination During Infant Cereal Processing”, Guerra-Hernandez et al, Journal of Cereal Science 29 (1999) 171–176, e a quantidade total de proteína é determinada de acordo com o Exemplo 1.1. O valor de furosina é relatado na unidade mg furosina por 100 g de proteína. Exemplo 1.12: Determinação da cristalinidade de BLG em um líquido

[00401] O método a seguir é usado para determinar a cristalinidade de BLG em um líquido com um pH na faixa de 5-6. a) Transferir uma amostra de 10 mL do líquido em questão a um filtro Maxi-Spin com uma membrana CA com um tamanho de poro de 0,45 mícron. b) Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos mantendo a centrífuga a 2 graus C c) Adicionar 2 mL de água Milli-Q fria (2 graus C) ao lado de retentado do filtro giratório e, imediatamente, girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos enquanto mantém a centrífuga resfriada a 2 graus C, recolher o permeado (permeado A), medir o volume e determinar a concentração de

89 / 115 BLG não agregada através de HPLC usando o método delineado no Exemplo

1.2. d) Adicionar 4 mL de 2M NaCl ao lado de retentado do filtro, agitar rapidamente e deixar a mistura ficar por 15 minutos a 25 graus C. e) Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos e recolher o permeado (permeado B) f) Determinar o peso total de BLG não agregada no permeado A e no permeado B usando o método delineado no Exemplo 1.2 e converter os resultados ao peso total de BLG não agregada em vez do percentual de peso. O peso de BLG não agregada no permeado A é chamado de m PermeadoA e o peso de BLG não agregada no permeado B é chamado de mPermeade B. g) A cristalinidade do líquido no que se refere à BLG é determinada como: cristalinidade = mPermeado B/(mPermeado A+mPermeado B)*100% Exemplo 1.13: Determinação da cristalinidade da BLG em um pó seco

[00402] Esse método é usado para determinar a cristalinidade da BLG em um pó seco.

[00403] a) 5,0 gramas da amostra de pó são misturadas com 20,0 gramas de água Milli-Q fria (2 graus C) e deixadas ficar por 5 minutos a 2 graus C.

[00404] b) Transferir a amostra do líquido em questão a um filtro Maxi-Spin com uma membrana CA de 0,45 mícron.

[00405] c) Imediatamente girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos mantendo a centrífuga a 2 graus C

[00406] d) Adicionar 2 mL de água Milli-Q fria (2 graus C) ao lado de retentado do filtro giratório e, imediatamente, girar o filtro a 1.500 g por 5 minutos, recolher o permeado (permeado A), medir o volume e determinar a concentração de BLG não agregada através de HPLC usando o método delineado no Exemplo 1.2 e converter os resultados ao peso total da BLG não

90 / 115 agregada em vez do percentual de peso. O peso da BLG não agregada no permeado A é chamado de mpermeadoA

[00407] f) A cristalinidade da BLG no pó é, então, calculada com o uso da seguinte fórmula: em que mBLG total é a quantidade total de BLG não agregada na amostra de pó da etapa a).

[00408] Se a quantidade total de BLG não agregada da amostra de pó não for conhecida, ela pode ser determinada suspendendo-se outros 5 g de amostra de pó (da mesma fonte de pó) em 20,0 gramas de água Milli-Q, ajustando-se o pH a 7,0 pela adição de NaOH aquoso, permitindo-se que a mistura fique por 1 hora a 25 graus C sob agitação e, finalmente, determinando-se a quantidade total de BLG não agregada da amostra de pó com o uso do Exemplo 1.2. Exemplo 1.14: Determinação da condutividade do permeado de UF

[00409] Uma amostra de 15 mL é transferida a unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com um ponto de corte (cut off) de 3 kDa (3.000 NMWL) e centrifugada a 4.000 g por 20-30 minutos ou até um volume suficiente de permeado de UF para medir a condutividade seja acumulado na parte inferior das unidades de filtro. A condutividade é medida imediatamente após a centrifugação. O manuseio e a centrifugação da amostra são realizados à temperatura da fonte da amostra. Exemplo 1.15: Detecção de cristais de BLG secados em um pó

[00410] A presença de cristais de BLG secados em um pó pode ser identificada da seguinte maneira:

[00411] a amostra do pó a ser analisada é ressuspensa e delicadamente misturada em água desmineralizada com uma temperatura de 4 graus C em uma razão de peso de 2 partes de água para 1 parte de pó e deixada

91 / 115 reidratando por 1 hora a 4 graus C.

[00412] A amostra reidratada é inspecionada por microscopia para identificar a presença de cristais, preferivelmente com o uso de luz polarizada plana para detectar birrefringência.

[00413] Matéria semelhante a cristal é separada e submetida a cristalografia de raio X a fim de verificar a existência de estrutura de cristal e, preferivelmente, também verificar que a retícula de cristal (grupo de espaço e dimensões de célula de unidade) corresponde à de um cristal de BLG.

[00414] A composição química da matéria semelhante a cristal separada é analisada para verificar que seus sólidos consistem principalmente em BLG não agregada. Exemplo 1.16: Determinação da quantidade total de lactose

[00415] A quantidade total de lactose é determinada de acordo com o ISO 5765-2:2002 (IDF 79-2: 2002) “Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese – Determination of lactose content – Part 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose” (Leite secado, misturas de gelo secadas e queijo processado – determinação de teor de lactose – parte 2: método enzimático que utiliza a porção de galactose da lactose). Exemplo 1.17: Determinação da quantidade total de carboidrato:

[00416] A quantidade de carboidrato é determinada pelo uso do kit para ensaio de total de carboidratos Sigma Aldrich (Cat MAK104-1KT) em que os carboidratos são hidrolisados e convertidos a furfurais e hidroxifurfurais que são convertidos a um cromogênio que é monitorado espectrofotometricamente a 490nm. Exemplo 1.18: Determinação da quantidade total de lipídeos

[00417] A quantidade de lipídeo é determinada de acordo com o ISO 1211:2010 (Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method [Determinação do teor de gordura - método gravimétrico Röse- Gottlieb]).

92 / 115 Exemplo 1.19: Determinação de brix

[00418] Medições de brix foram conduzidas com o uso de um refractômetro PAL-α digital portátil (Atago) calibrado contra água polida (água filtrada por osmose reversa para obter uma condutividade de no máximo 0,05 mS/cm).

[00419] Aproximadamente 500µl de amostra foram transferidos à superfície de prisma do instrumento e a medição foi iniciada. O valor medido foi lido e registrado.

[00420] O Brix de uma solução de proteína de soro de queijo é proporcional ao teor de total de sólidos (TS) e o TS (% de p/p) é aproximadamente Brix * 0,85.

[00421] Exemplo 1.20: Determinação do número de unidades formadoras de colônia

[00422] A determinação do número de unidades formadoras de colônia por grama de amostra é realizada de acordo com o ISO 4833-1:2013(E): Microbiology of food and animal feeding stuffs - horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony-count technique at 30°C (Microbiologia do alimento e substâncias de alimentação animal - método horizontal para a enumeração de micro-organismos - técnica de contagem de colônia a 30°C). Exemplo 1.21: Determinação da quantidade total de BLG, ALA, e CMP

[00423] Esse procedimento é um método de cromatografia líquida (HPLC) para a análise quantitativa de proteínas tais como ALA, BLG e CMP e, opcionalmente, também outras espécies de proteína em uma composição. Contrariamente ao método do Exemplo 1.2, o presente método também mede proteínas que estão presentes em agregados e, portanto, provê uma medida da quantidade total das espécies de proteína na composição em questão.

[00424] O modo de separação é cromatografia de exclusão de tamanho

93 / 115 (SEC) e o método usa tampão de HCI de guanidina de 6M tanto como solvente da amostra e fase móvel de HPLC. Mercaptoetanol é usado como um agente redutor para reduzir o dissulfeto (S-S) nas proteínas ou nos agregados de proteína para criar estruturas monoméricas desdobradas.

[00425] A preparação de amostra é facilmente alcançada dissolvendo- se 10 mg de equivalente de proteína na fase móvel.

[00426] Duas colunas TSK-GEL G3000SWXL (7,7 mm x 30,0 cm) (colunas GPC) e uma pré-coluna são colocadas em série para alcançar separação adequada das proteínas maiores em matérias-primas.

[00427] Os analitos eluídos são detectados e quantificados por detecção por UV (280 nm).

[00428] Equipamentos /Materiais :

[00429] 1. Bomba de HPLC 515 com lavagem de vedação manual ( Waters )

[00430] 2. Módulo de controle II de bomba de HPLC (Waters)

[00431] 3. Autoamostrador 717 (Waters)

[00432] 4. Detector duplo de absorbância 2487 (Waters)

[00433] 5. Programa de computador capaz de gerar relatórios quantitativos ( Empower 3, Waters )

[00434] 6. Coluna analítica: Duas TSK-GEL G3000SWXL (7,8 x 300 mm, P/N: 08541).

[00435] Pré-coluna: Pré-coluna TSK SWxL (6,0 x 40 mm, P/N: 08543).

[00436] 7. Banho ultrassônico ( Branson 5200 )

[00437] 8. Filtro para seringa de 25 mm com membrana de acetato de celulose de 0,2 µm. ( 514-0060, VWR )

[00438] Procedimento:

[00439] Fase móvel:

[00440] A. Solução tampão estoque.

94 / 115

[00441] 1. Pesar 56,6 g de Na2HPO4, 3,5 g de NaH2PO4, e 2,9g de EDTA em um béquer de 1.000 mL.

[00442] Dissolver em 800 mL de água.

[00443] 2. Medir o pH e ajustar a 7,5 ± 0,1, se necessário, com HCl (diminuir o pH) ou NaOH (aumentar o pH).

[00444] 3. Transferir a um balão volumétrico de 1.000 mL e diluir ao volume com água.

[00445] B. Fase móvel de HCl de guanidina de 6M.

[00446] 1. Pesar 1.146 g de HCl de guanidina em um béquer de 2.000 mL e adicionar 200 mL da solução tampão estoque (A)

[00447] 2. Diluir essa solução a cerca de 1.600 mL com água enquanto se mistura com uma barra de agitação magnética (50°C)

[00448] 3. Ajustar o pH a 7,5 ± 0,1 com NaOH.

4. Transferir a um balão volumétrico de 2.000 mL e diluir ao volume com água.

[00449] 5. Filtrar usando o aparelho de filtração solvente com o filtro de membrana de 0,22μm. Padrões de calibração.

[00450] Os padrões de calibração de cada proteína a ser quantificada são preparados da seguinte maneira:

1. Pesar com exatidão (em 0,01 mg) cerca de 25mg do padrão de referência de proteína em um balão volumétrico de 10mL e dissolver em 10 mL de água. Essa é a solução padrão estoque de proteína (S1) da proteína

2. Pipetar 200 µl de S1 em um balão volumétrico de 20 ml e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão de trabalho baixa WS1.

3. Pipetar 500 µl de S1 em um balão volumétrico de 10 ml e diluir ao volume com fase móvel.

95 / 115 Essa é a solução padrão WS2.

4. Pipetar 500 µl de S1 em um balão volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão WS3.

5. Pipetar 750 µl de S1 em um balão volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão WS4.

6. Pipetar 1,0 mL de S1 em um balão volumétrico de 5 mL e diluir ao volume com fase móvel. Essa é a solução padrão de trabalho alta WS5.

7. Usando pipetas descartáveis graduadas, transferir 1,5 mL de WS1-5 em frascos separados. Adicionar 10 μL de 2-mercaptoetanol a cada frasco e tampar. Turbilhonar as soluções por 10 segundos. Deixar as soluções padrão ficarem à temperatura ambiente por cerca de 1 hora.

8. Filtrar as soluções padrão com o uso de filtros para seringa de acetato de celulose de 0,22 µm. A pureza da proteína é medida com o uso de Kjeldahl (N x 6,38 ) e a % de área da solução padrão WS5 com o uso da HPLC. proteína (mg) = “peso padrão da proteína” (mg) x P1 x P2 P1 = % de P (Kjeldahl) P2 = % de área de proteína (HPLC)

[00451] Preparação de amostra

[00452] 1. Pesar o equivalente de 25 mg de proteína da amostra original em um balão volumétrico de 25 mL.

[00453] 2. Adicionar aproximadamente 20 mL de fase móvel e deixar a amostra dissolver por cerca de 30 min.

[00454] 3. Adicionar fase móvel ao volume e adicionar 167 μL de 2-

96 / 115 mercaptoetanol à solução de amostra de 25 ml.

[00455] 4. Sonicar por cerca de 30 min. e depois deixar a amostra ficar à temperatura ambiente por cerca de 1½ hora.

[00456] 5. Misturar a solução e filtrar usando filtros para seringa de acetato de celulose de 0,22 µl. Sistema/colunas de HPLC

[00457] Equilibração de coluna

[00458] 1. Conectar a pré-coluna GPC e as duas colunas analíticas GPC em série.

[00459] Novas colunas são no geral enviadas em um tampão de sal de fosfato.

[00460] 2. Escorrer água por uma nova coluna gradualmente de 0,1 a 0,5 mL/min em 30 a 60 minutos.

[00461] Continuar lavando por cerca de 1 hora.

[00462] 3. Gradualmente diminuir a vazão de 0,5 mL/min a 0,1 mL/min e substituir com fase móvel

[00463] no reservatório.

[00464] 4. Aumentar a vazão da bomba gradualmente de 0,1 a 0,5 mL/min em 30 a 60 minutos para evitar choque de pressão e deixar em 0,5 mL/min.

[00465] 5. Injetar dez amostras para permitir que a coluna seja saturada e esperar os picos eluírem.

[00466] Isso auxiliará no condicionamento da coluna.

[00467] Essa etapa é feita sem a necessidade de esperar que cada injeção esteja completa antes de injetar a próxima.

[00468] 6. Equilibrar com a fase móvel pelo menos 1 hora. Cálculo dos resultados

[00469] A determinação quantitativa dos teores das proteínas a ser quantificados, por exemplo alfa-lactalbumina, beta-lactoglobulina, e

97 / 115 caseinomacropeptídeo, é realizada comparando-se as áreas de pico obtidas para as proteínas padrão correspondentes com as das amostras. Os resultados são relatados como g de proteína específica/100 g da amostra original ou porcentagem em peso da proteína específica em relação ao peso da amostra original. Exemplo 2: Enriquecimento de alfa-lactalbumina em soro de queijo por remoção de beta-lactoglobulina por cristalização

[00470] Protocolo: O retentado de UF esgotado de lactose derivado de soro de queijo doce proveniente de um processo padrão de produção de queijo foi submetido a microfiltração usando uma membrana de 1,2 mícron e foi subsequentemente usado como alimento para o processo de cristalização de BLG. O alimento de soro de queijo doce foi condicionado com o uso de uma aparelhagem de ultrafiltração com uma membrana do tipo Koch HFK-328 com um espaçador de 46 mill, com o uso de uma pressão de alimento de 1,5- 3,0 bars, uma concentração de alimento de 21% de TS (total de sólidos) ±5, e água polida (água filtrada por osmose reversa) como meio de diafiltração. O pH foi, então, ajustado adicionando-se HCl para obter-se um pH de aproximadamente 5,40. A diafiltração continuou até que a queda na condutividade do retentado foi abaixo de 0,03 mS/cm por um período de 20 minutos. O retentado foi, então, concentrado a aproximadamente 30% de TS (aproximadamente 23,1% de total de proteína em relação ao peso total do retentado concentrado). A preparação do retentado concentrado foi realizada a uma temperatura de 10-12 graus C. Uma amostra do retentado concentrado foi centrifugada a 3.000 g por 5 minutos, mas nenhuma pelota visível se formou. O sobrenadante foi submetido a análise por HPLC. A composição do alimento pode ser vista na Tabela 1.

[00471] Deve ser notado que todas as concentrações de proteínas específicas tais como BLG e ALA nesse exemplo referem-se às concentrações

98 / 115 das proteínas não agregadas e são medidas de acordo com o Exemplo 1.2.

[00472] O retentado concentrado foi semeado com 0,5 g/L de cristal puro de material de cristal de BLG obtido de uma cristalização de BLG espontânea (como descrito no pedido PCT nº PCT/EP2017/084553, Exemplo 3). O material de semeadura foi preparado lavando-se uma pasta fluida de cristal de BLG 5 vezes em água Milli-Q e recolhendo-se os cristais de BLG após cada lavagem. Após a lavagem, os cristais de BLG foram secados por congelamento, moídos com o uso de pilão e almofariz, e então passados por uma peneira de 200 mícron. As sementes de cristalização tinham, portanto, um tamanho de partícula de menos do que 200 mícrons

[00473] O retentado concentrado foi transferido a um tanque de cristalização de 300 L em que ele foi resfriado a cerca de 2 graus C e mantido nessa temperatura durante a noite com leve agitação. Na manhã seguinte, uma amostra do retentado concentrado resfriado foi transferida a um tubo de ensaio e inspecionada tanto visualmente quanto por microscopia. Cristais de rápida sedimentação haviam claramente se formado durante a noite. Uma amostra de laboratório da mistura compreendendo tanto cristais quanto licor- mãe foi adicionalmente resfriada a 0 graus C em um banho gelado. O licor- mãe e os cristais foram separados por centrifugação a 3.000 g por 5 minutos, e amostras do sobrenadante e da pelota foram colhidas para análise por HPLC. Os cristais foram lavados uma vez em água polida fria e, então, centrifugados de novo antes da secagem por congelamento. Tabela 1 Concentração de componentes selecionados do alimento padronizado a 95% de p/p do total de sólidos.

99 / 115 Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 17,7 BLG 51,6 Outras proteínas incl. CMP 30,7 Outros componentes (% de p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,357 K 0,200 Mg 0,058 Na 0,045 P 0,280 gordura 5,6 proteína 79

[00474] Análises de proteína: HPLC TSK com padrões foi usada para a quantificação das proteínas, e a concentração total de proteína foi medida com o uso do método de Kjeldahl com um fator de 6,38.

[00475] Quantificação de rendimento relativo de BLG por HPLC: Todas as amostras foram submetidas ao mesmo grau de diluição adicionando-se água polida, as amostras foram filtradas através de um filtro de 0,22 µm. Para cada amostra, o mesmo volume foi carregado em um sistema de HPLC com um PhenomenexJupiter® 5 µm C4 300 Å, coluna de LC 250 x 4,6 mm, Ea. e detectado a 214 nm.

[00476] As amostras foram rodadas usando-se as seguintes condições: Tampão A: Água Milli-Q, 0,1% de p/p de TFA Tampão B: Acetonitrila de grau HPLC, 0,085% de p/p de TFA Temperatura da coluna: 40 graus C Fluxo: 1ml/min Gradiente: 0-30 minutos 82-55% A e 18-45% B; 30-32 minutos 55-10% A e 45-90% B; 32,5-37,5 minutos 10% A e 90% B; 38-48

100 / 115 minutos 10-82% A e 90-18% B.

[00477] Tratamento dos dados: Visto que todas as amostras foram tratadas da mesma maneira, podem-se comparar diretamente a área dos picos de BLG para ganhar um rendimento relativo. Visto que os cristais somente contêm BLG e todas as amostras foram tratadas da mesma maneira, a concentração de alfa- lactalbumina (ALA) e, logo, a área de ALA devem ser as mesmas em todas as amostras, portanto a área de ALA antes e após a cristalização é usada como um fator de correção (cf) ao se calcular o rendimento relativo.

[00478] O rendimento relativo é calculado pela seguinte equação:

[00479] Enriquecimento de outras proteínas no licor-mãe: a composição de proteína no alimento foi medida e a composição de proteína no licor-mãe foi calculada, com base na conservação de massa e no conhecimento da remoção relativa de BLG, com a presunção de que nenhuma outra proteína além da BLG foi removida. De modo que:

101 / 115

[00480] Resultados: A Figura 1 mostra os cromatogramas sobrepostos de antes e após a cristalização de BLG de um soro de queijo doce. A amostra de “antes de cristalização” é representada pela linha contínua preta e a amostra “após cristalização” pela linha pontilhada. É evidente que uma grande diminuição na concentração de BLG ocorreu e, usando-se o cálculo de rendimento como descrito anteriormente, constatou-se que 64,5% de BLG foram removidos. A % de ALAML foi determinada a 29,2% fornecendo um enriquecimento de ALA de 50%. O rendimento de ALA foi quase 100% visto que praticamente nenhum ALA foi removido com os cristais de BLG. A Figura 2 mostra uma fotografia dos cristais de BLG e a Figura 3 mostra um cromatógrafo doa cristais dissolvidos, ilustrando que praticamente nenhuma proteína não BLG foi removida com os cristais de BLG.

[00481] A composição de proteína calculada do licor-mãe é mostrada na Tabela 2. Tabela 2 Composição de proteína calculada do licor-mãe Licor-mãe padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 29,2 BLG 27,5 Outras proteínas incl. CMP 43,3 Conclusão:

102 / 115

[00482] Esse exemplo demonstrou que, surpreendentemente, foi possível preparar composições de proteína de soro de queijo enriquecidas com ALA cristalizando-se BLG seletivamente em um concentrado de proteína de soro de queijo bruto que continha mais que 48% de proteína não BLG em relação ao total de proteína e subsequentemente removendo-se os cristais de BLG. O rendimento de ALA foi quase 100%. Essa constatação abre espaço para uma nova abordagem da separação industrial de proteína de leite, em que a BLG é removida da ALA e dos outros componentes proteicos de maneira delicada que preferivelmente evita exposição estendida a altas temperaturas e produtos químicos problemáticos. Exemplo 3: Enriquecimento de ALA e outras espécies de proteína de soro de queijo de concentrado de proteína de soro de queijo do soro de queijo doce por remoção de BLG por cristalização

[00483] Protocolo: O retentado de UF esgotado de lactose derivado do soro de queijo doce de um processo padrão de produção de queijo foi filtrado por um filtro de 1,2 mícron e subsequentemente submetido a redução de gordura com o uso de uma membrana Synder FR. O permeado foi então preparado para cristalização como descrito no Exemplo 2 com a exceção de que nenhuma semeadura foi adicionada. A composição do alimento é mostrada na Tabela 3. Os dados foram então tratados como descrito no Exemplo 2. Tabela 3 Concentração de componentes selecionados do alimento padronizado a 95% de p/p do total de sólidos.

Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 12,2 BLG 70,0 Outras proteínas incl. CMP 17,8

103 / 115 Outros componentes (% de p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,387 K 0,204 Mg 0,066 Na 0,051 P 0,174 Gordura BDL concentração de proteína 89

[00484] Deve ser notado que todas as concentrações de proteínas específicas tais como BLG e ALA nesse exemplo referem-se às concentrações de proteínas não agregadas e são medidas de acordo com o Exemplo 1.2.

[00485] Resultados: Na Figura 4, a composição de proteína do alimento e o licor- mãe podem ser vistos. É evidente que uma grande porção de BLG foi removida, calcular o rendimento como descrito no Exemplo 2 fornece um rendimento de 82% de BLG. A % de ALAML foi determinada a 29,6%, fornecendo um enriquecimento de 143%. A composição de proteína do licor- mãe é mostrada na Tabela 4Tabela . Tabela 4 Composição de proteína calculada do licor-mãe Licor-mãe padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 29,6 BLG 28,6 Outras proteínas incl. CMP 41,8 Exemplo 4: Enriquecimento de ALA e outras espécies de proteína de soro de queijo de concentrado de proteína de soro de queijo do soro de queijo ácido por remoção de BLG por cristalização

[00486] Protocolo:

104 / 115 um soro de queijo ácido foi usado como matéria-prima e foi tratado como descrito no Exemplo 2. O alimento foi submetido a cristalização como descrito no Exemplo 2 e os resultados foram caracterizados e analisados como descrito no Exemplo 2. A concentração de componentes selecionados do alimento pode ser vista na Tabela 5. Tabela 5 Concentração de componentes selecionados do alimento padronizado a 95% de p/p do total de sólidos.

Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 24,0 BLG 63,6 Outras proteínas incl. CMP 12,4 Outros componentes (% de p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,289 K 0,131 Mg 0,020 Na 0,394 P 0,327 gordura 5,1 concentração de proteína 79

[00487] Na figura 5, a composição de proteína do alimento e o licor- mãe podem ser vistos. É evidente que uma grande porção de BLG foi removida. O rendimento de BLG por separação de cristal foi determinado a 70,3%. Se a concentração de total de proteína houvesse sido mais alta antes da cristalização, o rendimento teria sido ainda mais alto. A partir desse exemplo, a ALA foi enriquecida 81%, resultando em um percentual de ALA de 43,4. A composição de proteína da solução de proteína de soro de queijo restante (o licor-mãe) é mostrada na Tabela 6.

105 / 115 Tabela 6 Composição de proteína calculada do licor-mãe Licor-mãe padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 43,4 BLG 34,2 Outras proteínas incl . CMP 22,4

[00488] Deve ser notado que todas as concentrações de proteínas específicas tais como BLG e ALA nesse exemplo referem-se às concentrações das proteínas não agregadas.

[00489] Além de um nível aumentado de ALA, o licor-mãe recuperado adicionalmente contém a gordura de soro de queijo rica em fosfolipídeo e as imunoglobulinas do alimento de proteína de soro de queijo original. Esses são percebidos como componentes nutricionalmente valiosos na nutrição infantil, por exemplo, no que se refere ao desenvolvimento de funções cognitivas e ao sistema imunológico de um bebê. As composições de proteína de soro de queijo preparadas a partir do licor-mãe recuperado são, portanto, particularmente adequadas como um ingrediente em produtos de nutrição infantil humanizada. Exemplo 5: Enriquecimento de ALA e outras espécies de proteína de soro de queijo de concentrado de proteína de soro de queijo da proteína de soro por remoção de BLG por cristalização

[00490] Usando leite desnatado como matéria-prima, a caseína foi removida através de uma membrana Synder FR. O permeado foi então preparado para cristalização como descrito no Exemplo 2, os dados foram também tratados como descrito no Exemplo 2.

[00491] Consultar a Tabela 7. Tabela 7 Concentração de componentes selecionados do alimento padronizado a 95% de p/p do total de sólidos.

106 / 115 Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 23,5 BLG 66,7 outras proteínas 9,8 Outros componentes (% de p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,292

K BDL Mg 0,042 Na BDL P 0,149 Gordura BDL concentração de proteína 91

[00492] Deve ser notado que todas as concentrações de proteínas específicas tais como BLG e ALA nesse exemplo referem-se às concentrações das proteínas não agregadas.

[00493] Novamente foi observado que uma grande porção de BLG havia sido removida. O rendimento de BLG foi determinado a 70,0%. Se o total de sólidos do retentado concentrado houvesse sido mais alto antes da e/ou durante a cristalização, o rendimento teria sido ainda mais alto. No presente exemplo, a ALA foi enriquecida em 88%, resultando em um teor de ALA no licor-mãe de 44,1% de p/p em relação ao total de proteína. A composição de proteína calculada do licor-mãe é mostrada na Tabela 2. Tabela 8 Composição de proteína calculada do licor-mãe Licor-mãe padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 44,1 BLG 37,5 Outras proteínas 18,4

[00494] Conclusão: Foi possível enriquecer significativamente a porção de ALA da proteína de todos os alimentos testados usando o método da invenção e,

107 / 115 desse modo, prover um produto de proteína de soro de queijo enriquecido com ALA que pode ser usado como um ingrediente de ALA por si só ou pode ser submetido a enriquecimento adicional. Exemplo 6 - Cristalização auxiliada por UF-DCF

[00495] O soro de leite preparado por microfiltração de leite desnatado (com o uso de uma membrana Synder FR para microfiltração) foi usado como alimento para o processo descrito no Exemplo 2 com a exceção de que o pH durante a diafiltração é 5,92, não 5,40, e que o total de sólidos final é 20% de p/p.

[00496] Após o alimento ser condicionado (a composição de alimento pode ser vista na Tabela 9Tabela ), ele é transferido a um tanque de cristalização de 300 L e o pH é inicialmente ajustado a pH 5,80 e a temperatura é mantida em por volta de 10-12 graus C. Após o ajuste do pH, é adicionado material de semeadura produzido da mesma forma como descrito no Exemplo 2, mas originado de uma produção de cristalização não espontânea. O alimento é semeado com uma concentração de 0,5 g de material de semeadura por litro de alimento. Após a semeadura, a temperatura na capa de resfriamento é definida em 5 graus C e o pH é lentamente ajustado a 5,50 e deixado para cristalizar por aproximadamente uma hora, após a qual a DCF (filtração de fluxo cruzado dinâmico) é conectada ao tanque de cristalização como mostrado na figura 6. O retentado da DCF é devolvido ao tanque de cristalização enquanto o permeado é usado como alimento para uma unidade de UF equipada com uma membrana do tipo Koch HFK-328 com um espaçador de 46 mill. A unidade de DCF é abastecida com membranas cerâmicas Kerafol com um tamanho de poro de 500 nm. A pressão transmembrana (TMP) é definida em 0,4 bar e a velocidade de rotação da membrana é 32 Hz.

[00497] O retentado da DCF é devolvido ao tanque de cristalização, enquanto o permeado é usado como alimento em uma unidade de UF

108 / 115 (ultrafiltração) equipada com uma membrana do tipo Koch HFK-328 com um espaçador de 46 mil. Na unidade de UF, permite-se que as temperaturas subam até, mas não acima de, 12 graus C. A quantidade de água de diafiltração adicionada é ajustada de modo que o retentado saindo da unidade de UF e reentrando no tanque de cristalização seja cerca de 21% de TS enquanto os minerais são removidos do licor-mãe. A diafiltração do licor-mãe continua até que a diferença na condutividade entre o permeado e a água de diafiltração seja abaixo de 50 microS/cm. A essa altura, a quantidade de água de diafiltração é ajustada de modo que o retentado seja por volta de 30% de TS. A quantidade de total de sólidos do licor-mãe diminui conforme a BLG é removida como cristais, essa remoção contínua de excesso de água e minerais possibilita aumentar o rendimento de BLG visto que a concentração de proteínas não BLG durante a cristalização de BLG parece ter um efeito limitado sobre a solubilidade da BLG. A composição estimada do licor-mãe da DCF (o permeado de DCF) pode ser vista na Tabela 10. Os 300 L iniciais de alimento são reduzidos a por volta de 100 L de licor-mãe. Com base na conservação de massa, o rendimento relativo de BLG é estimado em 94% e estima-se que a concentração de ALA em relação ao total de proteína aumente 267 por cento em relação à concentração de ALA do alimento. Tabela 9 Concentração de componentes selecionados do alimento padronizado a 95% de p/p do total de sólidos.

Alimento padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 23,5 BLG 66,7 Outra proteína 9,8 Outros componentes (% de p/p em relação ao peso total do alimento padronizado) Ca 0,292

K BDL Mg 0,042 Na BDL

109 / 115 P 0,149 Gordura BDL proteína 91

[00498] Deve ser notado que todas as concentrações de proteínas específicas tais como BLG e ALA nesse exemplo referem-se às concentrações das proteínas não agregadas e são medidas de acordo com o Exemplo 1.2. Tabela 10 Composição de proteína estimada do licor-mãe.

Licor-mãe padronizado a 95% de TS Composição de proteína (% de p/p em relação ao total de proteína) ALA 63,2 BLG 10,5 Outra proteína 26,3

[00499] Conclusão: Removendo-se continuamente o excesso de minerais e água da matriz onde a cristalização de BLG ocorre, o enriquecimento de ALA pode ser significativamente melhorado e o processo pode ser feito em baixas temperaturas. Exemplo 7: Solucionar os problemas de processamento do licor-mãe por acidificação

[00500] Os inventores haviam visto anteriormente indicações de que a concentração e secagem por pulverização diretas de licor-mãe ocasionavam problemas de incrustação e bloqueio de membrana e requeriam um tratamento térmico significativo para trazer a carga microbiana a um nível aceitável. O pó secado resultante sofreria com uma solubilidade de proteína deficiente devido ao tratamento térmico relativamente severo necessário.

[00501] Ajuste de pH do licor-mãe de 5,5 a 3,2

[00502] 730 kg de licor-mãe foram recuperados de uma cristalização similar à delineada no Exemplo 3 e armazenados a 5 graus C durante a noite. O licor-mãe recuperado continha aproximadamente 4,6% de p/p de proteína e

110 / 115 tinha a composição química mostrada na Tabela 11Tabela 11Erro! Fonte de referência não encontrada.. O licor-mãe teve seu pH ajustado a pH 3,2 por adição lenta de ácido fosfórico diluído. Essa etapa foi realizada para dissolver os cristais de BLG restantes. A análise bacteriana do licor-mãe no pH inicial e após o ajuste de pH foi realizada de acordo com o Exemplo 1.20 e os resultados são mostrados na Tabela 12. Tabela 11 Composição química de componentes selecionados do licor-mãe (padronizado a 95% de total sólido) Componente % de p/p Proteína 85 Ca 0,59 Cl 0,75 Gordura 0,75 K 0,41 Mg 0,11 Na 0,10 P 0,30

[00503] Curiosamente, foi observado que a turbidez mudou de 86,8 NTU (no licor-mãe) para 23,7 NTU (no licor-mãe com pH ajustado). Remoção bacteriana de licor-mãe durante a etapa de microfiltração

[00504] A fim de remover as bactérias, o licor-mãe no pH de aproximadamente 3,2 foi passado por membranas cerâmicas de 0,8 micrômetro (Pall Membralox GP). A etapa de microfiltração foi realizada à temperatura de operação de aproximadamente 10 graus C, em que a pressão transmembrana foi 3,2 bars e o fluxo de permeado foi fixado para ser 60 L/h/membrana. O permeado foi recolhido para processamento adicional. No final da etapa de MF, foi recolhido permeado de MF com a turbidez de por volta de 15,2 NTU. O permeado foi analisado de acordo com o Exemplo 1.20. Processo de licor-mãe durante a etapa de ultrafiltração

[00505] O permeado recolhido da etapa de microfiltração foi filtrado

111 / 115 com o uso de uma membrana de UF GR82PE enrolada em espiral (ponto de corte de peso molecular de 5 kDa) com espaçador de 48 mill. Durante a etapa de ultrafiltração, o licor-mãe foi concentrado a um Brix de por volta de 16 (aproximadamente proteína em uma quantidade de 12% de p/p). A fim de contornar as mudanças de pH durante a etapa de filtração, foi adicionado ácido fosfórico adicional.

[00506] Nessa etapa, um fator de concentração de 3 foi alcançado (visto que por volta de 185 kg de permeado de MF concentrado foram recolhidos). Um fator de concentração ainda mais alto poderia ser obtido se a filtração fosse continuada. Nesse exemplo, o alimento com o brix e o pH aproximados de 16,5 e 3,3, respectivamente, foi recolhido para ser enviado ao secador por pulverização. O licor-mãe em pH ácido após a etapa de ultrafiltração foi analisado de acordo com o Exemplo 1.20. Secagem de licor-mãe concentrado com pH ajustado

[00507] Uma porção de licor-mãe concentrado com pH ajustado foi secada com o uso de um secador por pulverização com uma temperatura de entrada de 185 graus C e uma temperatura de saída de aproximadamente 85 graus C. O pó resultante (aproximadamente 15 Kg) tinha um teor de água de aproximadamente 4,0% de p/p. O teor de micro-organismos foi analisado de acordo com o Exemplo 1.20.

[00508] Resultados: Com pode ser visto na Tabela 12Tabela 12, a adição de ácido para ajustar o pH do licor-mãe de aproximadamente 5,5 para 3,2 resultou na diminuição da contagem em placa total por volta de dez vezes. Além disso, a etapa de microfiltração poderia remover com sucesso as bactérias visto que a contagem em placa total do permeado foi reduzida para <1.000 CFU/g. Após a secagem por pulverização, o pó de licor-mãe final em pH 3,2 tinha uma contagem em placa total de 10 CFU/g. Tabela 12 Teor de micro-organismos (CFU/g) após cada etapa de processo

112 / 115 Antes da Após a adição Após a etapa Após a etapa Após o secador adição de de ácido de MF de UF por pulverização ácido (como um pó) Contagem em placa total 3.700.000 460.000 40 590 10 (CFU/g)

[00509] Além disso, o licor-mãe após o ajuste de pH para 3,2 foi mantido por três dias em armazenamento a 5 graus C. A contagem em placa total foi reduzida de 460.000 CFU/g para 350.000 CFU/g. A redução da contagem em placa total da amostra antes e depois do armazenamento mostrou que manter o licor-mãe em pH ácido de 3,2 também leva à inibição do crescimento das bactérias.

[00510] Conclusão: A acidificação a fim de produzir o pó de licor-mãe em pH 3,2 ocasionou uma redução significativa de carga bacteriana. Além disso, a turbidez do licor-mãe foi reduzida de cerca de 87 para 24 NTU, o que se acredita ser o resultado de dissolver os cristais de BLG e/ou da redução de carga microbiana no licor-mãe.

[00511] Ademais, a microfiltração de licor-mãe levou a uma remoção bacteriana bem-sucedida. Além disso, usar o pó final em pH de aproximadamente 3,2 tem uma aparência transparente e uma turbidez abaixo de 50 NTU. Consequentemente, o pó ácido derivado do licor-mãe condicionado pode ser usado em aplicações de bebida e bebida instantânea, por exemplo, para nutrição pediátrica. Exemplo 8: Solucionar os problemas de processamento do licor-mãe aumentando o pH

[00512] 400 mL de licor-mãe em um pH de aproximadamente 5,5 foram misturados com KOH diluído para obter um pH de aproximadamente 7. O licor-mãe com pH ajustado foi submetido à etapa de filtração com o uso de uma membrana Synder HFK328 a uma pressão transmembrana de 4 bars, e

113 / 115 uma temperatura de aproximadamente 10 graus C até um teor de sólidos de um brix 6 foi alcançada.

[00513] Resultados: Após a etapa de ultrafiltração, o licor-mãe continha 89% de proteína em relação ao total de sólidos. Devido ao ajuste de pH, nenhum problema de incrustação ou de entupimento de membrana foi encontrado. O licor-mãe concentrado com pH ajustado pareceu adequado para secagem se concentrado a um teor de total de sólidos mais alto ou poderia alternativamente ser usado diretamente sem modificações adicionais como um ingrediente para, por exemplo, nutrição pediátrica ou bebidas instantâneas. Exemplo 9: Enriquecimento adicional de ALA do licor-mãe

[00514] Esse exemplo descreveu enriquecimento adicional de ALA do licor-mãe.

[00515] 100 L do licor-mãe obtido de acordo com o Exemplo 5 com um teor de proteína de aproximadamente 13,7% de p/p são misturados com ácido clorídrico (8% de p/v) e rapidamente misturados para alcançar um pH final de 4,3. O licor-mãe com pH ajustado é, então, concentrado por ultrafiltração em uma planta de ultrafiltração de estágios em série de quatro estágios com o uso de uma membrana de UF de 5 kDa a um teor de proteína de aproximadamente 22% de p/p. O licor-mãe concentrado com pH ajustado é, então, passado por um trocador de calor tubular em que a temperatura foi lentamente aumentada a 64 graus C ±1 grau C e então por um tubo mantido na mesma temperatura de equivalente de comprimento a um tempo de permanência de 6 minutos. A solução é, então, resfriada a 50 graus C em um segundo trocador de calor tubular e recolhida em uma cuba isolada abastecida com pás de agitação rotadas a 20 r.p.m. Após um tempo médio de permanência na cuba de 10 minutos, a solução é bombeada a 200 L/hr por um clarificador de autopurga contínua. A fração proteica sedimentada é descarregada periodicamente após lavar a bacia do clarificador com água. A

114 / 115 fração proteica sedimentada é suspensa em água polida e dissolvida ajustando o pH a 6,7 por adição de NaOH aquoso (10% de p/v).

[00516] A fração proteica dissolvida é concentrada por ultrafiltração com o uso de uma membrana de 5 kDa a aproximadamente 25% de p/p do teor total de sólidos e secada por pulverização. Espera-se que o pó enriquecido com ALA contenha mais do que 60% de p/p de ALA em relação ao total de proteína e tenha um teor total de proteína de pelo menos 85% em relação ao total de sólidos do pó. O teor de água é no máximo 5% de p/p. Exemplo 10: Fórmulas infantis contendo composições de proteína de soro de queijo enriquecidas com ALA

[00517] Dois produtos de fórmula infantil, A e B, são produzidos a partir dos pós de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA dos Exemplos 4 ou 9 misturando-se: - 6,8 kg de pó de proteína de soro de queijo enriquecida com ALA do Exemplo 4 (para a fórmula infantil A) ou do Exemplo 9 (para a fórmula infantil B), - 20,5 kg de lactose de grau alimentício, - 152,7 kg de água - 70 kg de leite desnatado concentrado por UF (9,0% de p/p de proteína, 4,2% de p/p de lactose, 0,05% de p/p de gordura, 0,7% de p/p de cinzas, 14,7% de p/p de total de sólidos), - 374 kg de permeado de UF desmineralizado de leite desnatado, - 33,2 kg de mistura de gordura vegetal, - 15,1 kg de xarope de GOS contendo 71% de total de sólidos e - micronutrientes necessários incluindo vitaminas, nucleotídeos, e ácidos graxos poli-insaturados PUFA.

[00518] As mesclas são homogeneizadas, pasteurizadas, evaporadas e

115 / 115 secadas por pulverização para produzir 118 kg de pó de fórmula infantil final com uma proporção de proteína de soro de leite/caseína de aproximadamente 62/38 e um teor de energia de aproximadamente 2.000 kJ por 100 g de pó.

[00519] Ambas as fórmulas infantis imitam o leite humano melhor do que uma fórmula infantil comum à base de proteína de soro de queijo padrão. Ambas as fórmulas infantis contêm uma quantidade de ALA mais alta do que uma fórmula infantil comum à base de proteína de soro de queijo padrão (especialmente a fórmula infantil B). A fórmula infantil A adicionalmente contém a gordura de soro de queijo rica em fosfolipídeo e as imunoglobulinas do alimento de proteína de soro de queijo original, que são percebidas como sendo componentes nutricionalmente valiosos na nutrição infantil, por exemplo no que se refere ao desenvolvimento de funções cognitivas e ao sistema imunológico de um bebê.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar uma composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com alfa-lactalbumina tendo maior porcentagem em peso de alfa-lactalbumina (ALA) em relação à proteína total do que a solução de proteína de soro de queijo da qual é derivada, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda beta-lactoglobulina (BLG) e ALA não agregadas e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) secar: - a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, ou - a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente redução microbiana física, preferivelmente realizada após o ajuste de pH da e) e antes da secagem da etapa f).

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a solução de proteína de soro de queijo da etapa a) compreende no máximo 90% de p/p de BLG em relação à quantidade total de proteína.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução de proteína de soro de queijo compreende um concentrado de proteína do soro do leite, um concentrado de proteína de soro de queijo, isolado de proteína do soro do leite e/ou isolado de proteína de soro de queijo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a razão entre a condutividade e a quantidade total de proteína da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 0,3.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a condutividade de permeado de UF da solução de proteína de soro de queijo é no máximo 7 mS/cm.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a solução de proteína de soro de queijo supersaturada é preparada submetendo-se um alimento de proteína de soro de queijo a um ou mais dos seguintes ajustes: - ajuste do pH, - redução da condutividade - redução da temperatura - aumento da concentração proteica e - adição de um agente que reduza a atividade da água.

8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende separar os cristais de BLG a um teor de sólidos de pelo menos 30% de p/p, preferivelmente pelo menos 40% de p/p e ainda mais preferivelmente pelo menos 50% de p/p.

9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8,

caracterizado pelo fato de que a primeira composição compreende o, ou até mesmo consiste no, licor-mãe recuperado.

10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a primeira composição compreende um, ou até mesmo consiste em um, concentrado de proteína do licor-mãe recuperado.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a provisão da primeira composição envolve enriquecimento adicional com ALA, preferivelmente a uma primeira composição que tenha uma porcentagem em peso de ALA em relação à proteína total que seja pelo menos 5% mais alta do que a do licor-mãe recuperado.

12. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o pH da primeira composição é ajustado a um pH na faixa de 2,5-4,9, preferivelmente 2,8-4,5 e mais preferivelmente 2,8- 3,2.

13. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o pH da primeira composição é ajustado a um pH na faixa de 6,1-8,5, preferivelmente 6,3-8,0 e, ainda mais preferivelmente, 6,5-7,5.

14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a redução microbiana física envolve um ou mais de: - tratamento térmico, preferivelmente pelo menos pasteurização, - tratamento por radiação UV, - tratamentos por luz pulsada, - microfiltração, - tratamento de alta pressão e - tratamento por ultrassom.

15. Composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com alfa-lactalbumina, caracterizada pelo fato de ser obtenível por um ou mais métodos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, a composição compreendendo: - ALA em uma quantidade na faixa de 24-80% p/p, preferivelmente 24-70% p/p em relação à proteína total, - imunoglobulina em uma quantidade na faixa de 3-14% p/p em relação à proteína total, e - opcionalmente, fosfolipídio em uma quantidade na faixa de 1-6% p/p em relação à proteína total, preferivelmente na faixa de 2-5% p/p em relação à proteína total.

16. Composição de proteína de soro de queijo comestível enriquecida com ALA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ser com um valor de furosina de no máximo 50 mg/100 g de proteína.

17. Método para produzir um produto alimentício, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) prover uma solução de proteína de soro de queijo que compreenda beta-lactoglobulina (BLG) e alfa-lactalbumina (ALA) não agregadas e, opcionalmente, proteína de soro de queijo adicional, a dita solução de proteína de soro de queijo sendo supersaturada no que se refere à BLG e tendo um pH na faixa de 5-6, b) cristalizar BLG não agregada na solução de proteína de soro de queijo supersaturada, preferivelmente no modo salting-in e c) separar os cristais de BLG do licor-mãe restante e recuperar pelo menos alguma parte do licor-mãe, d) prover uma primeira composição derivada do licor-mãe recuperado, e) opcionalmente, ajustar o pH da primeira composição a i) um pH na faixa de 2,5-4,9 ou ii) um pH na faixa de 6,1-8,5, f) opcionalmente, secar a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma ou secar a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma, g) combinar: g1) a primeira composição obtida na etapa d) ou um concentrado de proteína da mesma, g2) a primeira composição com pH ajustado obtida na etapa e) ou um concentrado de proteína da mesma e/ou g3) a composição seca obtida na etapa f) com um ou mais ingredientes e converter a combinação em um produto alimentício.