JP2021529769A - アルファ−ラクトアルブミン強化組成物を調製するための新規方法、関連製品及び乳児用調製粉乳等での使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)非凝集ベータ−ラクトグロブリン(BLG)、アルファ−ラクトアルブミン(ALA)及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、BLGに関して過飽和であり、pHが5〜6の範囲であるものとする工程、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液から誘導された第1の組成物を供給する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整することもある工程、
f)
−工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
−工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む。
a)非凝集ベータ−ラクトグロブリン(BLG)、アルファ−ラクトアルブミン(ALA)及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、BLGに関して過飽和であり、pHが5〜6の範囲であるものとする工程、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液から誘導された第1の組成物を供給する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整することもある工程、
f)任意に、工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥することもある工程、
g)
g1)工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
g2)工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び/又は
g3)工程f)で得られた乾燥組成物
を1つ又は2つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む。
本発明の文脈において、「ベータ−ラクトグロブリン」又は「BLG」という用語は、例えば天然の、折りたたまれていない、及び/又はグリコシル化された形態での、哺乳動物種からのベータ−ラクトグロブリンに関するものであり、天然に存在する遺伝的バリアントを含む。この用語はさらに、凝集BLG、沈殿BLG及び結晶性BLGを含む。BLGの量に言及する場合、凝集BLGを含むBLGの総量を指すものとする。BLGの総量は、例1.21に従って決定される。「凝集BLG」という用語は、少なくとも部分的に折りたたまれておらず、さらに、典型的には疎水性相互作用及び/又は共有結合によって、他の変性BLG分子及び/又は他の変性乳清タンパク質と凝集しているBLGを指す。
本発明の文脈において、「母液」という用語は、BLGが結晶化され、BLG結晶が少なくとも部分的に除去された後に残る乳清タンパク質溶液に関する。母液にはまだいくつかのBLG結晶が含まれ得るが、通常は分離を免れた小さなBLG結晶のみが含まれ得る。
a)試験する液体の50ml試料を、高さ115mm、内径25mm及び容量50mLの遠心分離管(VWRカタログ番号525−0402)に移す。工程a)〜工程h)の間、試料とその後続の画分を液体の元の物理的及び化学的条件に保つように注意するべきである。
b)試料を直ちに3000gで3.0分間、最大30秒の加速と最大30秒の減速で遠心分離する。
c)遠心分離の直後に、(ペレットが形成された場合にはペレットを乱すことなく)可能な限り多くの上清を第2の遠心分離管(工程aと同じタイプ)に移す。
d)上清の0.05mL二次試料を採取する(二次試料A)
e)粒子サイズが最大200ミクロンのBLG結晶10mg(全固形分に対して少なくとも98%純粋の、非凝集BLG)を第2の遠心分離管に加え、混合物を攪拌する。
f)第2の遠心分離管を元の温度で60分間放置する。
g)工程f)の直後に、第2の遠心分離管を500gで10分間遠心分離し、次いで上清の別の0.05mL二次試料(二次試料B)を採取する。
h)工程g)の遠心分離ペレットを、存在する場合は回収し、milliQ水に再懸濁し、顕微鏡で見ることができる結晶の存在について懸濁液を直ちに検査する。
i)例1.2に概説されている方法を使用して、二次試料A及びBの非凝集BLGの濃度を測定し、結果を、二次試料の総重量に対するBLGの重量%として表す。二次試料Aの非凝集BLGの濃度をCBLG、Aと称し、二次試料Bの非凝集BLGの濃度をCBLG、Bと称す。
j)工程a)の試料を採取した液体は、cBLG、BがcBLG、Aよりも低く、工程i)で結晶が観察される場合、(特定の条件で)過飽和であった。
総固形分に対して20〜89重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して15〜70重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して8〜50重量%のALA、及び
タンパク質に対して0〜40重量%のCMP
を含む。
総固形分に対して20〜89重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して15〜90重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して4〜50重量%のALA、及び
タンパク質に対して0〜40重量%のCMP
を含み得る。
総固形分に対して20〜89重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して15〜80重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して4〜50重量%のALA、及び
タンパク質に対して0〜40重量%のCMP
を含む。
総固形分に対して70〜89重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して30〜90重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して4〜35重量%のALA、及び
タンパク質に対して0〜25重量%のCMP
を含む。
総固形分に対して90〜100重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して15〜70重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して8〜50重量%のALA、及び
総タンパク質に対して0〜40重量%のCMP
を含む。
総固形分に対して90〜100重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して30〜95重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して4〜35重量%のALA、及び
総タンパク質に対して0〜25重量%のCMP
を含み得る。
総固形分に対して90〜100重量%のタンパク質、
総タンパク質に対して30〜90重量%の非凝集BLG、
総タンパク質に対して4〜35重量%のALA、及び
総タンパク質に対して0〜25重量%のCMP
を含み得る。
a)非凝集BLG、ALA及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を供給する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、BLGに関して過飽和であり、pHが5〜6の範囲であるものとする工程、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液及び任意に使用された洗浄液から誘導された第1の組成物を供給する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整することもある工程、
f)
−工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
−工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む。
乳清タンパク質溶液及び乳清タンパク質フィード中の非凝集BLG及び他のタンパク質の量と濃度はすべて、溶解したタンパク質を指しており、沈殿又は結晶化したタンパク質は含まれない。
−pHを調整すること、
−導電率を低減すること、
−温度を下げること、
−タンパク質濃度を増加させること、
−水活性を低下させる薬剤を添加すること、
−イオン組成を改変すること
のうちの1つ又は2つ以上にかけることによって調製される。
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、乳清タンパク質溶液の調製は、乳清タンパク質フィードの導電率を低下させることを含む。
−例えば、10℃を超える温度での、限外ろ過、ナノろ過又は逆浸透の使用による濃縮、及び
−それに続く、10℃未満の温度への冷却
を実施することを含む。
−6.0を超えるpHでの濃縮、及び
−それに続く、酸(GDL又はH+型のカチオン交換物質など)の添加によるpHの低減
を行うことを含む。
−例えば少なくとも非凝集BLGを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによる、導電率の低減
を行うことを含む。
−5〜6へのpHの調整、
−少なくとも非凝集BLGを保持する膜を使用したダイアフィルトレーションによる導電率の低減、
−例えば10℃を超える温度での、限外ろ過、ナノろ過又は逆浸透を使用した、タンパク質の濃縮、及び
−最終的な、10℃未満の温度への冷却
の組合せを実施することを含む。
−結晶化が起こるのを待つこと、
−結晶化シードの添加、
−非凝集BLGの過飽和度をさらに高めること、及び/又は
−機械的刺激
のうちの1つ又は2つ以上が含まれ得る。
−乳清タンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−乳清タンパク質溶液をさらに冷却すること、
−乳清タンパク質溶液をBLG結晶化に最適なpHに近づけること、
−導電率をさらに低減すること
のうちの1つ又は2つ以上により高められ得る。
−結晶化している乳清タンパク質溶液のタンパク質濃度をさらに上げること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液をさらに低温まで冷却すること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液をBLG結晶化に最適なpHに近づけること、
−結晶化している乳清タンパク質溶液の導電率をさらに低減すること
のうちの1つ又は2つ以上が含まれ得る。
−遠心分離、
−デカンテーション、
−ろ過、
−沈降、
−上記の組合せ
のうちの1つ又は複数を含む。
本方法はさらに、
−分離したBLG結晶を再結晶液に溶解すること、
−BLGに関して過飽和になるように再結晶液を調整すること、
−過飽和で調整された再結晶液中で非凝集BLGを結晶化すること、及び
−残りの調整された再結晶液からBLG結晶を分離すること
を含む再結晶化工程を含む工程を含み得る。
−1つ又は2つ以上の洗浄工程と、それに続く
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程
に供され得る。
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程と、それに続く
−1つ又は2つ以上の洗浄工程
に供され得る。
−1つ又は2つ以上の洗浄工程、
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程、
−1つ又は2つ以上の洗浄工程、及び
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程
という手順で、
又は、例えば、
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程、
−1つ又は2つ以上の洗浄工程、
−1つ又は2つ以上の再結晶化工程、
−1つ又は2つ以上の洗浄工程
という手順で、
洗浄と再結晶化の複数の工程を組み合わせることも可能である。
−脱塩、
−ミネラルの追加
−希釈、
−濃縮、
−物理的微生物低減、及び
−pH調整
の群から選択される1つ又は2つ以上の工程にかけることを含み得る。
−第1の組成物のpHを、2.5〜4.9、好ましくは2.8〜4.5、より好ましくは2.8〜3.2の範囲のpHに調整するか、又は
−第1の組成物のpHを、6.1〜8.5、好ましくは6.3〜8.0、さらにより好ましくは6.5〜7.5の範囲のpHに調整する。
−工程d)から得られた第1の組成物又はそのタンパク質濃縮物、又は
−工程e)から得られたpH調整された第1の組成物又はそのタンパク質濃縮物
を乾燥することを含む。
−工程d)から得られた第1の組成物、
−工程d)から得られた第1の組成物のタンパク質濃縮物、
−工程e)から得られたpH調整された第1の組成物、又は
−工程e)から得られたpH調整された第1の組成物のタンパク質濃縮物
のうちの1つを指す。
−
−熱処理、好ましくは少なくとも低温殺菌、
−紫外線照射処理、
−パルス光処理、
−パルス電界処理、
−精密ろ過、
−高圧処理、及び
−超音波処理
のうちの1つ又は2つ以上を含む。
−総タンパク質に対して24〜80重量%、好ましくは24〜70重量%の範囲の量のALA、
−総タンパク質に対して3〜14重量%の範囲の量の免疫グロブリン、及び
−任意に、総タンパク質に対して1〜6重量%の範囲、好ましくは総タンパク質に対して2〜5重量%の範囲の量のリン脂質
を含む。
−総タンパク質に対して40〜70重量%の範囲のALA、
−総タンパク質に対して最大15重量%のカゼイン種、及び
−総タンパク質に対して少なくとも3重量%の免疫グロブリン
を含み得る。
a)非凝集BLG、ALA及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程であって、前記乳清タンパク質溶液が、BLGに関して過飽和であり、pHが5〜6の範囲であるものとする工程、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液及び任意に使用済み洗浄液から誘導された第1の組成物を供給する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整することもある工程、
f)任意に、工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥する工程、
g)
g1)工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
g2)工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び/又は
g3)工程f)で得られた乾燥組成物
を1つ又は2つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む。
−タンパク質の総量に対して少なくとも40重量%、好ましくは少なくとも45重量%のALA、及び
−タンパク質の総量に対して少なくとも5重量%の免疫グロブリン
を含む。
−総タンパク質に対して40〜70重量%の範囲のALA、
−総タンパク質に対して最大で15重量%のカゼイン種
−及び少なくとも5重量%の免疫グロブリン
を含む。
−総タンパク質に対して24〜80重量%、好ましくは総タンパク質に対して40〜70重量%、及びさらに好ましくは総タンパク質に対して45〜65重量%の範囲の量のALA、
−総タンパク質に対して5〜14重量%の範囲の量の免疫グロブリン、及び
−任意に、総タンパク質に対して1〜6重量%の範囲、好ましくは総タンパク質に対して2〜5重量%の範囲の量のリン脂質
を含む。
−総タンパク質に対して24〜50重量%の範囲のALA、
−総タンパク質に対して20〜40重量%のカゼイン種、及び
−総タンパク質に対して少なくとも3〜15重量%の免疫グロブリン
を含む。
例1−分析方法
例1.1:総タンパク質の測定
試料の総タンパク質含有量(真のタンパク質)を、以下の要領で測定する:
1)ISO 8968−1/2|IDF 020−1/2−乳−窒素含有量の測定−パート1/2:ケルダール法を使用した窒素含有量の測定に準拠して試料の総窒素を測定する。
2)ISO 8968−4|IDF 020−4−乳−窒素含有量の測定−パート4:非タンパク質窒素含有量の測定に準拠して試料の非タンパク質窒素を測定する。
3)タンパク質の総量を(m総窒素−m非タンパク質窒素)*6.38として計算する。
非凝集アルファ−ラクトアルブミン(ALA)、ベータ−ラクトグロブリン(BLG)及びカゼイノマクロペプチド(CMP)の含有量を、それぞれ0.4mL/分でHPLC分析により分析した。25マイクロリットルのろ過試料を、210nmのUV検出器を用い、溶離液(465gのMilli−Q水、417.3gのアセトニトリル及び1mLのトリフルオロ酢酸からなる)で平衡化して取り付けたプレカラムPWxl(6mm×4cm、Tosohass、日本)と直列に接続した2つのTSKgel3000PWxl(7.8mm×30cm、Tosohass、日本)カラムに注入する。
濁度は、空気中の煙と同様に、一般に肉眼では見えない多数の粒子によって引き起こされる流体の曇り又はかすみである。
飲料調製物の粘度は、レオメータ(Anton Paar、Physica MCR301)を使用して測定した。
食品の灰分含有量は、NMKL 173:2005「食品中の灰分重量測定」に従って測定される。
水溶液の「導電率」(「比導電率」と呼ばれることもある)は、溶液が電気を伝導する能力の尺度である。導電率は、例えば、2つの電極間の溶液のAC抵抗を測定することによって決定され得、結果は、典型的にはミリジーメンス/cm(mS/cm)の単位で示される。導電率は、例えば、EPA(米国環境保護庁)の方法番号120.1に従って測定され得る。
溶液の総固形分は、NMKL 110第2版、2005(総固形分(水)−乳及び乳製品の重量分析)に従って測定され得る。NMKLは、「北欧食品分析委員会(Nordisk Metodikkomite Naeringsmidler)」の略語である。
すべてのpH値は、pHガラス電極を使用して測定され、25℃に正規化されている。
pHガラス電極(温度補償付き)を、前もって注意深くすすぎ、使用前に較正する。試料が液体形態の場合、25℃の液状溶液中で直接pHを測定する。試料が粉末の場合、10グラムの粉末を90mlの脱塩水に室温で激しく攪拌しながら溶かす。次に、溶液のpHを25℃で測定する。
食品の含水量は、ISO 5537:2004(粉乳−水分含有量の測定(参照方法))に従って測定される。
カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンの総量は、試料を、最初にマイクロ波分解を使用して分解し、次に複数の場合もあるミネラルの総量を、ICP装置を使用して測定するという手順を使用して決定される。
マイクロ波装置はAntonPaar製で、ICPはPerkin Elmer Inc製のOptima2000DVである。
1MのHNO3
2%HNO3中のイットリウム
5%HNO3中のカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、及びリンについての適切な標準物質
一定量の粉末を量り取り、その粉末をマイクロ波分解チューブに移す。5mLの1M HNO3を添加する。マイクロ波装置の使用説明書に従って、マイクロ波装置中で試料を分解する。分解にかけたチューブを、ドラフトチャンバに入れ、蓋を外して揮発性のヒュームを蒸発させる。
既知量のMilli−Q水を使用して、前処理した試料をDigiTUBEに移す。2%HNO3中のイットリウムの溶液を、分解チューブに添加し(50mLの希釈試料あたり約0.25mL)、Milli−Q水を使用して既知の体積に希釈する。製造元が説明する手順を使用して、ICPで試料を分析する。
フロシン値は、「乳児用穀物加工中のフロシン測定によるメイラード反応評価」(Maillard Reaction Evaluation by Furosine Determination During Infant Cereal Processing)、Guerra−Hernandezら、穀物科学誌(Journal of Cereal Science)、29(1999)171−176に記載されているように測定され、タンパク質の総量は例1.1に従って決定される。フロシン値は、タンパク質100gあたりのmg単位のフロシンで記録される。
次の方法を使用して、pHが5〜6の範囲の液体中のBLGの結晶化度を測定する。
a)問題の液体の10mL試料を、細孔径0.45ミクロンのCA膜を備えたMaxi−Spinフィルタに移す。
b)遠心分離機を2℃に保ちながら、直ちにフィルタを1500gで5分間回転させる。
c)スピンフィルタの保持側に2mLの冷Milli−Q水(2℃)を加え、すぐに、遠心分離機を2℃に冷却したまま、フィルタを1500gで5分間回転させ、透過液(透過液A)を集め、体積を測定し、例1.2に概説されている方法を使用して、HPLCにより非凝集BLG濃度を測定する。
d)フィルタの保持側に4mLの2M NaClを加え、すばやく攪拌し、混合物を25℃で15分間放置する。
e)直ちにフィルタを1500gで5分間回転させ、透過液(透過液B)を集める。
f)例1.2に概説されている方法を使用して、透過液A及び透過液B中の非凝集BLGの総重量を測定し、その結果を重量パーセントではなく非凝集BLGの総重量に変換する。透過液A中の非凝集BLGの重量をm透過液Aと称し、透過液B中の非凝集BLGの重量をm透過液Bと称す。
g)BLGに関する液体の結晶化度は、次のように決定される:
結晶化度=m透過液B/(m透過液A+m透過液B)*100%
この方法を使用して、乾燥粉末中のBLGの結晶化度を測定する。
a)5.0グラムの粉末試料を20.0グラムの冷Milli−Q水(2℃)と混合し、2℃で5分間放置する。
b)問題の液体の試料を、0.45ミクロンのCA膜を備えたMaxi−Spinフィルタに移す。
c)遠心分離機を2℃に保ちながら、直ちにフィルタを1500gで5分間回転させる。
d)スピンフィルタの保持側に2mLの冷Milli−Q水(2℃)を加え、直ちに、フィルタを1500gで5分間回転させ、透過液(透過液A)を集め、体積を測定し、例1.2に概説されている方法を使用して、HPLCにより非凝集BLG濃度を測定し、その結果を重量パーセントではなく非凝集BLGの総重量に変換する。透過液A中の非凝集BLGの重量を、m透過液Aと称す。
f)次に、粉末中のBLGの結晶化度は、次の式を使用して計算される:
式中、mBLG総量は、工程a)の粉末試料中の非凝集BLGの総量である。
15mLの試料を3kDaカットオフ(3000NMWL)のAmicon Ultra−15遠心フィルタユニットに移し、4000gで20〜30分間、又は導電率を測定するのに十分な体積のUF透過液がフィルタユニットの下部に蓄積するまで遠心分離する。遠心分離直後に導電率を測定する。試料の取り扱いと遠心分離は、試料の供給源の温度で実行される。
粉末中の乾燥BLG結晶の存在は、次の方法で識別され得る:
ラクトースの総量は、ISO 5765−2:2002(IDF 79−2:2002)「粉乳、ドライアイス−ミックス及び方法チーズ−ラクトース含有量の測定−パート2:ラクトースのガラクトース部分を利用した酵素法」に従って測定される。
炭水化物の量は、Sigma Aldrich総炭水化物アッセイキット(Cat MAK104−1KT)を使用して決定され、このキットでは、炭水化物が加水分解され、フルフラールとヒドロキシフルフラールに変換され、490nmで分光光度的にモニターされるクロマゲン(chromagen)に変換される。
脂質の量は、ISO 1211:2010(脂肪含有量の測定−Rose−Gottlieb重量分析法)に従って測定される。
ブリックス測定は、研磨水(逆浸透によってろ過された水で最大0.05mS/cmの導電率が得られる)に対して較正されたPAL−αデジタルハンドヘルド屈折計(Atago)を使用して実施された。
試料1グラムあたりのコロニー形成単位の数の測定は、ISO 4833−1:2013(E):食品及び動物の摂食物の微生物学−微生物の列挙のための水平方法−30℃でのコロニーカウント技術に従って実行される。
この手順は、ALA、BLG及びCMPなどのタンパク質、並びに任意に組成物中の他のタンパク質種をも定量分析するための液体クロマトグラフィー(HPLC)方法である。例1.2の方法とは対照的に、本方法はまた、凝集体中に存在するタンパク質を測定し、したがって、問題の組成物中のタンパク質種の総量の測定値を提供する。
1.手動シール洗浄付きHPLCポンプ515(Waters)
2.HPLCポンプコントローラモジュールII(Waters)
3.オートサンプラ717(Waters)
4.デュアル吸光度検出器2487(Waters)
5.定量記録を作成することができるコンピュータソフトウェア(Empower 3、Waters)
6.分析カラム:2つのTSK−GEL G3000SWXL(7.8×300mm、P/N:08541)。
ガードカラム:TSK−ガードカラムSWxL(6.0x40mm、P/N:08543)。
7.超音波浴(Branson 5200)
0.2μmの酢酸セルロース膜を備えた8.25mmシリンジフィルタ(514−0060、VWR)
移動相:
A.ストック緩衝液。
1.1000mLビーカに56.6gのNa2HPO4、3.5gのNaH2PO4、及び2.9gのEDTAを量り入れる。
800mLの水に溶かす。
2.pHを測定し、任意にHCl(pHを下げる)又はNaOH(pHを上げる)で7.5±0.1に調整する。
3.1000mLメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。
1.2000mLビーカに1146gのグアニジンHClを量り取り、200mLのストック緩衝液(A)を加える。
2.マグネチックスターラ(50℃)で混合しながら、この溶液を水で約1600mLに希釈する。
3.NaOHでpHを7.5±0.1に調整する。
4.2000mLメスフラスコに移し、水で希釈して容量を調整する。
5.0.22μmの膜フィルタを備えた溶媒ろ過装置を使用してろ過する。
定量する各タンパク質の較正標準を、次の方法で調製する:
1.約25mgのタンパク質参照標準を、10mLのメスフラスコに正確に(0.01mgまで)秤量して入れ、10mLの水に溶かす。
これが、前記タンパク質のタンパク質ストック標準溶液(S1)である。
2.200μlのS1を20mlメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、低希釈標準溶液WS1である。
3.500μLのS1を10mLのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液WS2である。
4.500μLのS1を5mLのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液WS3である。
5.750μLのS1を5mLのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、標準溶液WS4である。
6.1.0mLのS1を5mLのメスフラスコにピペットで入れ、移動相で希釈して容量を調整する。
これが、高希釈標準溶液WS5である。
7.目盛り付き使い捨てピペットを使用して、1.5mLのWS1〜5を別々のバイアルに移す。
各バイアルに10μLの2−メルカプトエタノールを添加し、キャップをする。溶液を10秒間ボルテックスする。
標準液を周囲温度で約1時間放置する。
8.0.22μmの酢酸セルロースシリンジフィルタを使用して標準液をろ過する。
タンパク質(mg)=「タンパク質標準重量」(mg)xP1xP2
P1=P%(ケルダール)
P2=タンパク質面積%(HPLC)
1.元の試料のタンパク質25mgに相当する量を秤量し、25mLのメスフラスコに入れる。
2.約20mLの移動相を加え、試料を約30分間溶解させる。
3.移動相を容量に加え、167μLの2−メルカプトエタノールを25mlの試料溶液に加える。
4.約30分間超音波処理し、その後、試料を周囲温度で約1時間半放置する。
5.溶液を混合し、0.22μlの酢酸セルロースシリンジフィルタを使用してろ過する。
カラムの平衡化
1.GPCガードカラムと2つのGPC分析カラムを直列に接続する。
新しいカラムは通常、リン酸塩緩衝液中で出荷される。
2.新しいカラムに水を30〜60分で0.1mL/分から0.5mL/分へと徐々に流す。
約1時間フラッシングを続ける。
3.流量を0.5mL/分から0.1mL/分へと徐々に下げ、貯蔵器中で移動相と交換する。
4.圧力ショックを回避するために、ポンプの流量を30〜60分で0.1mL/分から0.5mL/分に徐々に増やし、0.5mL/分のままにする。
5.10個の試料を注入してカラムを飽和させ、ピークが溶出するのを待つ。
これは、カラムの調整に役立つ。
この工程は、次の注入の前に各注入が完了するのを待つ必要なしに実行される。
6.移動相と少なくとも1時間平衡を保つ。
定量化されるタンパク質、例えば、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリン、及びカゼイノマクロペプチドの含有量の定量的測定は、対応する標準タンパク質で得られたピーク面積を試料のピーク面積と比較することによって実行される。結果については、元の試料100gあたりの特定タンパク質のg数、又は元の試料の重量に対する特定タンパク質の重量パーセンテージとして記録する。
プロトコル:
標準的なチーズ製造方法からの甘性乳清に由来するラクトース枯渇UF保持液を、1.2ミクロンの膜を使用する精密ろ過にかけ、その後BLG結晶化方法のためのフィードとして使用した。甘性乳清フィードについては、46ミルスペーサを備えたKoch HFK−328タイプの膜を使用した限外ろ過セットアップを使用し、1.5〜3.0barのフィード圧力、21%TS(総固形分)±5のフィード濃度、及びダイアフィルトレーション媒質としての研磨水(逆浸透によってろ過された水)を使用して調整した。次に、HClを加えることによってpHを調整して、約5.40のpHを得た。保持液の導電率の低下が20分間で0.03mS/cmを下回るまで、ダイアフィルトレーションを続けた。次に、保持液を約30%TS(濃縮保持液の総重量に対して約23.1%の総タンパク質)に濃縮した。濃縮保持液の調製は、10〜12℃の温度で実施した。濃縮保持液の試料を3000gで5分間遠心分離したが、目に見えるペレットは形成されなかった。上清をHPLC分析にかけた。フィードの組成を表1に示す。
タンパク質の定量には、標準物質でのTSK−HPLCを使用し、6.38の係数でケルダール法を使用して、タンパク質濃度を測定した。
すべての試料に対し、研磨水を加えることによって同じ程度の希釈を行い、試料を0.22μmフィルタでろ過した。各試料について、Phenomenex Jupiter(登録商標)5μmC4 300オングストローム、LCカラム250x4.6mm、Eaを備えたHPLCシステムに同じ容量をロードした。そして214nmで検出した。
試料については、次の条件を使用して処理した。
緩衝液B:HPLCグレードのアセトニトリル、0.085重量%TFA
カラム温度:40℃
流量:1ml/分
勾配:0〜30分82〜55%A及び18〜45%B;30〜32分55〜10%A及び45〜90%B;32.5〜37.5分10%A及び90%B;38〜48分10〜82%A及び90〜18%B。
すべての試料を同じ方法で処理したため、BLGピークの面積を直接比較して、相対収量を得ることができる。結晶にはBLGのみが含まれており、試料はすべて同じ方法で処理されたため、アルファ−ラクトアルブミン(ALA)の濃度、それゆえALAの面積は、すべての試料で当然同じであり、したがって、結晶化の前後のALAの面積を、相対収率の計算時の補正係数(cf)として使用する。
フィード中のタンパク質組成を測定し、質量保存の法則とBLGの相対的除去に関する知識に基づいて、BLG以外のタンパク質が除去されなかったと仮定して、母液中のタンパク質組成を計算した。したがって:
mタンパク質ML=mタンパク質フィード−m結晶中のBLG
mALAフィード=mALA ML
図1は、甘性乳清からのBLGの結晶化の前後のクロマトグラムを重ね合わせたものである。「結晶化前」の試料は黒い実線で表され、「結晶化後」の試料は点線で表されている。BLGの濃度が大幅に低下していることは明らかであり、前述の収率計算を使用すると、BLGの64.5%が除去されていることが判明した。ALAML%は29.2%と決定され、50%のALA強化がもたらされた。BLG結晶と共に除去されたALAはほとんどなかったため、ALAの収率はほぼ100%であった。図2はBLG結晶の写真を示し、図3は溶解した結晶のクロマトグラフを示しており、BLG結晶と共に除去された非BLGタンパク質はほとんどなかったことが分かる。
この例は、驚くべきことに、総タンパク質に対して48%を超える非BLGタンパク質を含む粗乳清タンパク質濃縮物中でBLGを選択的に結晶化し、続いてBLG結晶を除去することにより、ALA強化乳清タンパク質組成物を調製できることを示した。ALAの収率はほぼ100%であった。この発見は、工業的乳タンパク質分離の新しいアプローチへの道を開くもので、そのアプローチによると、BLGがALA及び他のタンパク質成分から、好ましくも高温や問題のある化学物質への長時間の曝露を回避する穏やかな方法で除去される。
プロトコル:
標準的なチーズ製造方法からの甘性乳清に由来するラクトース枯渇UF保持液を、1.2ミクロンのフィルタでろ過し、それに続いてSynder FR膜を使用して脂肪低減を行った。次に、播種を加えないことを除いて、例2に記載の要領で透過液を結晶化のために調製した。フィードの組成を表3に示す。次に、データを例2に記載の要領で処理した。
結果:
プロトコル:
酸性乳清を原料として使用し、例2に記載の要領で処理した。フィードを例2に記載の要領で結晶化させ、結果を例2に記載の要領で特徴検定し、分析した。フィードの選択された成分の濃度は、表5に示されている。
脱脂乳を原料として、SynderFR膜によりカゼインを除去した。次に、透過液を例2に記載の要領で結晶化のために調製し、データも例2に記載の要領で処理した。
表7参照。
本発明の方法を使用して試験したすべてのフィードからタンパク質のALA部分を顕著に強化することが可能であり、それにより、ALA成分自体として使用され得るか又はさらなる強化にかけることができるALA強化乳清タンパク質製品を提供することが可能であった。
脱脂乳の精密ろ過(精密ろ過にSynder FR膜を使用)によって調製された乳血清を、例2に記載の方法のためのフィードとして使用したが、ただし、ダイアフィルトレーション中のpHは5.40ではなく5.92であり、最終的な総固形分は20重量%であるものとする。
BLGの結晶化が行われるマトリックスから過剰なミネラルと水を継続的に除去することにより、ALAの強化を大幅に改善し、この方法を低温で行うことができる。
本発明者らは、母液の直接濃縮及び噴霧乾燥がファウリングの問題及び膜の閉塞を引き起こし、微生物負荷を許容可能なレベルにするためにかなりの熱処理を必要とするという兆候を以前に目にしている。得られた乾燥粉末は、必要とされる比較的過酷な熱処理のためにタンパク質の溶解度が低くなる。
例3に概説したものと同様の結晶化から730kgの母液を回収し、5℃で一晩保存した。回収された母液には約4.6重量%のタンパク質が含まれ、化学組成は表11に示されている。母液については、希釈したリン酸をゆっくりと加えることにより、pHを3.2に調整した。この工程は、残ったBLG結晶を溶解するために実行された。初期pH及びpH調整後における母液の細菌分析を例1.20に従って実施し、結果を表12に示す。
細菌を取り除くために、pHが約3.2の母液を、0.8マイクロメートルのセラミック膜(Pall Membralox GP)に通した。精密ろ過工程を、約10℃の操作温度で実行し、膜貫通圧力は3.2barであり、透過流を60L/時/膜に固定した。透過液を、さらなる処理のために収集した。MF工程の終わりに、約15.2NTUの濁度を有するMF透過液が収集された。透過液を例1.20に従って分析した。
精密ろ過工程から収集された透過液を、48ミルスペーサを備えた渦巻き型GR82PE UF膜(分子量カットオフ5kDa)を使用してろ過した。限外ろ過工程中に、母液は約16のブリックスに濃縮された(おおよそ12重量%の量のタンパク質)。ろ過工程中のpH変化を回避するために、追加のリン酸を加えた。
pH調整された濃縮母液の一部を、入口温度が185℃、出口温度が約85℃の噴霧乾燥機を使用して乾燥した。得られた粉末(約15kg)の含水量は約4.0重量%であった。微生物の含有量を、例1.20に従って分析した。
表12から分かるように、酸を添加して母液のpHを約5.5から3.2に調整すると、総生菌数が約10分の1に減少した。さらに、透過液の総生菌数が1000CFU/g未満に低減されたように、精密ろ過工程で細菌を有効に除去することができた。噴霧乾燥後、pH3.2の最終母液粉末の総生菌数は10CFU/gであった。
pH3.2の母液粉末を生成するための酸性化により、細菌の負荷が大幅に減少した。さらに、母液の濁度が約87NTUから24NTUに減少し、これは、母液におけるBLG結晶の溶解及び/又は微生物負荷の減少の結果であると考えられている。
pH約5.5の母液400mLを、希釈したKOHと混合して、約7のpHを得た。pH調整された母液を、ブリックス6の固形分含有量に達するまで膜貫通圧力4bar及び約10℃の温度でのSynder HFK328膜を使用するろ過工程に供した。
限外ろ過工程の後、母液は総固形分に対して89%のタンパク質を含んでいた。pH調整により、ファウリングの問題や膜の目詰まりの問題は発生しなかった。pH調整された濃縮母液は、より高い総固形分に濃縮された場合、乾燥に適しているように思われ、あるいは、例えば小児用栄養又はインスタント飲料用の成分としてさらなる改変を伴わずに直接使用することができた。
この例では、母液のALAのさらなる強化について説明した。
2つの乳児用調製粉乳製品A及びBは、
−例4(乳児用調製粉乳Aの場合)又は例9(乳児用調製粉乳Bの場合)からの6.8kgのALA強化乳清タンパク質粉末、
−20.5kgの食品グレードのラクトース、
−152.7kgの水
−70kgのUF濃縮脱脂乳(9.0重量%タンパク質、4.2重量%ラクトース、0.05重量%脂肪、0.7重量%灰、14.7重量%総固形分)、
−脱脂乳の374kgの脱塩UF透過液、
−33.2kgの植物性脂肪ミックス、
−71%総固形分を含む15.1kgのGOSシロップ、並びに
−ビタミン、ヌクレオチド、及び多価不飽和脂肪酸PUFAなどの必要な微量栄養素
を混合することにより、例4又は例9のALA強化乳清タンパク質粉末から製造される。
Claims (17)
- 以下の工程を含む食用のアルファ−ラクトアルブミン強化乳清タンパク質組成物を調製する方法
a)非凝集ベータ−ラクトグロブリン(BLG)、アルファ−ラクトアルブミン(ALA)及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、BLGに関して過飽和であり、pHは5〜6の範囲である、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液から誘導された第1の組成物を提供する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整する工程、
f)
工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、又は
工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物
を乾燥する工程
を含む方法。 - 好ましくはe)のpH調整後かつ工程f)の乾燥前に実施される、物理的微生物低減をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程a)の乳清タンパク質溶液が、タンパク質の総量に対して最大で90重量%BLGを含む、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- 乳清タンパク質溶液が、乳血清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質濃縮物、乳血清タンパク質分離物、及び/又は乳清タンパク質分離物を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 乳清タンパク質溶液の導電率とタンパク質の総量との間の比が最大で0.3である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 乳清タンパク質溶液のUF透過液導電率が最大で7mS/cmである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 過飽和乳清タンパク質溶液が、乳清タンパク質フィードに対し、以下の調整:
pHを調整すること、
導電率を低減すること、
温度を下げること、
タンパク質濃度を増加させること、及び
水活性を低下させる薬剤を添加すること、
のうちの1つ又は2つ以上を行うことによって調製される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 工程c)が、BLG結晶を、少なくとも30重量%、好ましくは少なくとも40重量%、さらにより好ましくは少なくとも50重量%の固形分に分離することを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 第1の組成物が、回収された母液を含むか、又はそれからなる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 第1の組成物が、回収された母液のタンパク質濃縮物を含むか、又はそれからなる、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 第1の組成物の供給が、好ましくは総タンパク質に対するALAの重量パーセンテージが回収された母液の場合より少なくとも5%高くなっている第1の組成物を包含する、さらなるALA強化を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 第1の組成物のpHが、2.5〜4.9、好ましくは2.8〜4.5、より好ましくは2.8〜3.2の範囲のpHに調整される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 第1の組成物のpHが、6.1〜8.5、好ましくは6.3〜8.0、さらにより好ましくは6.5〜7.5の範囲のpHに調整される、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 物理的微生物低減が、
熱処理、好ましくは少なくとも低温殺菌、
紫外線照射処理、
パルス光処理、
精密ろ過、
高圧処理、及び
超音波処理
のうちの1つ又は2つ以上を含む、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。 - 食用の、ALA強化乳清タンパク質組成物であって、請求項1〜14のいずれかに記載の1つ又は2つ以上の方法によって得ることができる組成物。
- 食品を製造する方法であって、
a)非凝集ベータ−ラクトグロブリン(BLG)、アルファ−ラクトアルブミン(ALA)及び任意の追加の乳清タンパク質を含む乳清タンパク質溶液を提供する工程、前記乳清タンパク質溶液は、BLGに関して過飽和であり、pHは5〜6の範囲である、
b)過飽和乳清タンパク質溶液中で、好ましくは塩溶モードで、非凝集BLGを結晶化する工程、及び
c)残りの母液からBLG結晶を分離し、母液の少なくとも一部を回収する工程、
d)回収された母液から誘導される第1の組成物を供給する工程、
e)任意に、第1の組成物のpHを、
i)2.5〜4.9の範囲のpH、又は
ii)6.1〜8.5の範囲のpH
に調整する工程、
f)任意に、工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥するか、又は工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物を乾燥する工程、
g)
g1)工程d)から得られた第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、
g2)工程e)から得られたpH調整された第1の組成物もしくはそのタンパク質濃縮物、及び/又は
g3)工程f)で得られた乾燥組成物
を1つ又は2つ以上の成分と組み合わせ、そして組合せを食品に変換する工程
を含む方法。 - 例えば請求項16に記載の方法により得ることができる、ALA強化乳清タンパク質組成物を含む食品。
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