BR112020025591A2 - ativadores da resposta da proteína não dobrada - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um conjunto de moléculas pequenas biomoduladoras de ERa que matam células de câncer de mama, de ovário e endométrio positivas para ERa resistentes à terapia. Essas moléculas pequenas têm potencial terapêutico aumentado, devido a uma habilidade aumentada de matar células de câncer de mama resistentes a terapia em comparação com BHPI e outras terapias convencionais (terapias endócrinas, tamoxifen e fulvestrant/ICI). Os novos compostos não apenas inibem a proliferação das células de câncer, mas realmente causa sua morte, o que previne a reativação dos tumores anos mais tarde.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ATIVA- DORES DA RESPOSTA DA PROTEÍNA NÃO DOBRADA".

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 ET.SC $119 (e) para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/693.641, depositado em 3 de julho de 2018, que está aqui incorporado por referência

APOIO GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob a con- cessão No. RO1DK071909 concedida pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Aproximadamente 70% dos cânceres de mama são ERa po- sitivos. As terapias endócrinas (hormonais) para esses tumores incluem os inibidores da aromatase que bloqueiam a produção de estrogênio, o tamoxifeno que compete com os estrogênios pela ligação a ERa e ful- vestrant/Faslodex/ICI 182.780, que competem com os estrogênios e promovem a degradação de ERa. Embora eficaz inicialmente, a resis- tência às vezes se desenvolve em tumores primários e é quase univer- sal no cenário metastático. Embora os mecanismos de resistência se- jam diversos, estudos recentes mostram que aproximadamente 30% desses tumores metastáticos abrigam mutações de ERa, mais comu- mente ERaD538G e ERaY537S. Há evidências abundantes de que es- ses tumores exibem proliferação independente do estrogênio e, por- tanto, são resistentes aos inibidores da aromatase que bloqueiam a pro- dução de estrogênio. Eles também são amplamente resistentes ao ta- moxifeno e parcialmente resistentes ao fulvestrant. Notavelmente, os pacientes cujos tumores metastáticos contêm a mutação ERaD538G têm um tempo de sobrevida 6 meses mais curto e aqueles com a muta- ção ERaY537S têm um tempo de sobrevida 12 meses mais curto, do que os pacientes cujos tumores metastáticos contêm ERa do tipo sel- vagem não mutado. Portanto, os esforços para desenvolver agentes quimioterápicos direcionados às células de câncer de mama que con- têm essas mutações são extensos e generalizados.

[004] A patologia do câncer de mama ERa positivo é incomum. Embora as taxas de sobrevida em 5 anos sejam impressionantes, os tumores geralmente reaparecem 10-20 anos após o diagnóstico inicial. Isso é considerado ser devido à reativação da proliferação de células dormentes de câncer de mama. Portanto, é especialmente importante matar as células tumorais e não permitir que permaneçam dormentes e suscetíveis à reativação. As terapias endócrinas atuais são citostáticas, não citotóxicas e, portanto, não matam as células residuais de câncer de mama. Isso permite que as células fiquem dormentes e sejam reati- vadas posteriormente. As opções terapêuticas para esses tumores re- correntes são deficientes e a maioria das mortes por câncer de mama ocorre em pacientes com tumores ERa positivos.

[005] O câncer de ovário geralmente se apresenta em um estágio avançado. Os tumores geralmente reaparecem após a cirurgia. Embora 30-70% dos tumores ovarianos sejam ERa positivos e a expressão de ERa esteja associada a um resultado ruim, a terapia endócrina é inefi- caz e os tumores recorrentes são geralmente tratados com quimiotera- pia à base de platina e paclitaxel. Embora inicialmente responsivos, após vários ciclos de tratamento, os tumores reaparecem como câncer de ovário resistente, com poucas opções terapêuticas. Mais da metade das pacientes com câncer de ovário morrem dentro de 5 anos. No câncer de ovário, um mecanismo muito comum para a resistência ao paclitaxel e outros os agentes quimioterápicos é a resistência a múltiplos fármacos; efluxo do fármaco dependente de energia causado pela superexpressão de bombas de efluxo dependentes de ATP, especialmente a Proteína 1 de Resistência a Múltiplos Fármacos (MDR1)/ glicoproteína P/ABCB1.

Apesar dos esforços intensivos, os inibidores de MDR1 não tóxicos efi- cazes permaneceram indefinidos.

[006] Embora muitos cânceres do endométrio uterino sejam ERa positivos, a terapia endócrina funciona mal.

[007] Consequentemente, um objetivo terapêutico importante é, portanto, identificar novas moléculas pequenas que sejam citotóxicas, não apenas citostáticas, e desenvolver métodos terapêuticos corres- pondentes.

SUMÁRIO

[008] Esta descrição fornece os benefícios de moléculas pequenas com uma capacidade melhorada de realmente matar células de câncer de mama resistentes à terapia que possuem um potencial terapêutico muito aumentado. Especificamente, para prevenir a recorrência, é fun- damental destruir toda a população de células de câncer de mama re- sistentes à terapia em crescimento e dormentes. Comparado com BHPI e com as terapias endócrinas com tamoxifeno e fulvestrant/ICI, o enan- tiômero ativo (-)C-105 tem uma capacidade muito maior de matar célu- las do câncer de mama. O composto (-)C-105, portanto, mostra um po- tencial terapêutico dramaticamente aumentado (Figura 4A-4C).

[009] Esta descrição fornece um composto de Fórmula |: Ss! 2 EV (O A no 2 Rê nº (DD= R2 x R O), ou seu sal ou solvato; em que R', R R$ e Rº são cada um independentemente H, halo, -OR?, -SRº, -N(Rº)>, alquila, cicloalquila, heterociclila, arila ou he- teroarila

A, A?, A? e Aº são cada um independentemente H, halo ou alquila; G' é halo, -ORE, -SR8, -S(=O)2Rº ou alquila; G? é halo, -ORC, -SRº, -S(=O)2Rº ou alquila; Xe Z são cada um independentemente O, S, ou -NRº; e Rô, RB, Rº e R? são cada um independentemente H ou al- quila, em que quando presentes, -OR8 e -ORº não são ambos -OH; em que cada alquila, cicloalquila, heterociclila, arila ou hete- roarila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes.

[0010] O composto acima pode se ligar ao receptor de estrogênio alfa (ERa) e matar ou inibir o crescimento de células cancerosas pela hiperativação da resposta de proteína não dobrada (UPR) no retículo endoplasmático.

[0011] Além disso, esta descrição fornece um método de tratamento de um câncer que compreende a administração a um indivíduo com câncer ERa positivo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto acima, tratando assim o câncer no indivíduo.

[0012] A invenção fornece novos compostos de Fórmulas |-IV, in- termediários para a síntese de compostos de Fórmulas |-IV, assim como métodos de preparação de compostos de Fórmulas |-IV. A invenção também fornece compostos de Fórmulas |-IV que são úteis como inter- mediários para a síntese de outros compostos úteis. A invenção fornece o uso de compostos de Fórmulas |-IV para a fabricação de medicamen- tos úteis para o tratamento de câncer em um mamífero, tal como um humano.

[0013] A invenção fornece o uso das composições aqui descritas para uso na terapia médica. A terapia médica pode ser o tratamento do câncer, por exemplo, câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical, câncer endometrial, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de próstata ou câncer de cólon. A invenção também fornece o uso de uma composição como aqui descrita para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença em um mamífero, por exemplo, câncer em um humano. O medicamento pode incluir um dilu- ente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] As figuras a seguir fazem parte do pedido e estão incluídas para demonstrar ainda certas modalidades ou vários aspectos da inven- ção. Em alguns casos, as modalidades da invenção podem ser melhor compreendidas com referência às figuras em anexo em combinação com a descrição detalhada apresentada aqui. A descrição e as figuras em anexo podem destacar um certo exemplo específico ou um certo aspecto da invenção. No entanto, aquele versado na técnica entenderá que porções do exemplo ou aspectos podem ser usados em combina- ção com outros exemplos ou aspectos da invenção.

[0015] Figura 1. Estudo de resposta à dose do efeito de (+)-105 so- bre células de câncer humanas positivas para ERa e negativas para ERa. Ensaio de morte em 24 horas com Alamar blue para determinar a IC5o do composto 105.

[0016] Figura 2. Estudo de resposta à dose comparando a capaci- dade de BHPI e (+)-105 de matar células T47D positivas para ERa. O composto (+)-105 induz potentemente a morte de células de câncer de mama.

[0017] Figura 3. Comparação da capacidade de (+)-105 para matar ERa positivo e sua incapacidade de matar células negativas para ERa.

[0018] Figura 4. (-) 105 Mata Potentemente e Quantitativamente as Células de Câncer. Células MCF7 (ER +), incubação por 24 horas, lei- tura através da Fluorescência de Alamar Blue, Controle de Morte: Rap- tinal, n= 3 (A, B). (-)-105 é eficaz quando administrado por via oral (C). Xenoenxerto Ortóptico de cânceres de mama em camundongos de cé- lulas TYS, visualização por imagem bioluminescente. Tratamento: 40 mg/kg por dia de (-)-105 por 3 dias por gavagem oral ou por injeção intraperitoneal.

[0019] Figura 5. Separação quiral de (+)-105 mostrando a resolu- ção de enantiômeros individuais.

[0020] Figura 6. Traçado de HPLC quiral de (+)-105 mostrando pi- cos resolvidos.

[0021] Figura 7. Traçado de HPLC quiral do enantiômero isolado de (+)-105.

[0022] Figura 8. Traçado de HPLC quiral de outro enantiômero iso- lado de (+)-105.

[0023] Figura 9. O enantiômero (-) de 105 é ativo e o enantiômero (+) é inativo na linhagem de células T47D.

[0024] Figura 10. (-)-105 induz a morte dependente da dose de cé- lulas MCF-7; (+)-105 é inativo.

[0025] Figura 11. O estudo de resposta à dose mostra que (-)-105 é superior a BHPI para matar células T47D.

[0026] Figura 12. O estudo de resposta à dose mostra que (-)-105 é superior a BHPI na morte de células MCF-7 e TYS.

[0027] Figura 13. O estudo de resposta à dose mostra que (-)-105 é superior a BHPI e às terapias endócrinas atuais na morte de células TDG-Luc.

[0028] Figura 14. Estudos de resposta à dose para determinar a IC5o para matar células cancerosas por (-)-105.

[0029] Figura 15. Em experimentos de longo prazo, (-)-105, mas não BHPI, mata 100% das células TYS-Luc.

[0030] Figura 16. Em experimentos de longo prazo que simulam terapia, (-)-105, mas não BHPI, erradica as células letais do câncer de mama resistentes à terapia.

[0031] Figura 17. Imagem bioluminescente (BLI) usando luciferase mostra a quase erradicação de tumores de mama TYS-luc resistentes à terapia em camundongos.

[0032] Figura 18. (-)-105 mata as células do câncer de mama resis- tentes à morte por BHPI.

[0033] Figura 19. (-)-105 ativa potentemente UPR, como mostrado pela indução de MRNA XBP-1 ligado.

[0034] Figura 20. (-)-105 é superior ao BHPI na inibição da síntese de proteínas em células de câncer de ovário Caov-3 positivas para ERa resistentes à terapia.

[0035] Figura 21. Bloqueio do efluxo de cálcio do retículo endoplas- mático com 2 - APB inibe (-)-105 de morte celular induzida por câncer.

[0036] Figura 22.-105 reduz os níveis de ATP intracelular; esta re- dução nos níveis de ATP é bloqueada pela inativação da bomba SERCA do retículo endoplasmático com tapsigargina.

[0037] Figura 23. Bloqueio do declínio nos níveis de ATP com tap- sigargina inibe a morte celular induzida por -105.

[0038] Figura 24. Comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células TDG.

[0039] Figura 25. Comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células TYS.

[0040] Figura 26. Comparação da capacidade dos compostos de teste 4, 6, 105 e BHPI para matar células TYS.

[0041] Figura 27. Comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células T47D.

[0042] Figura 28. Nem os compostos de teste nem BHPI matam células de mama MCF-10A não tumorigênicas negativas para ERa.

[0043] Figura 29. Avaliação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células T47D.

[0044] Figura 30. Estudos de dose-resposta comparando a capaci- dade de BHPI e compostos de teste para inibir a proliferação de células T47D, TYS e TDG.

[0045] Figura 31. (-)105 é altamente seletivo para células cancero- sas ER+, incluindo contra os mutantes ER+ mortais.

[0046] Figura 32. (-)105 tem o mesmo mecanismo de ação (MOA) como o BHPI.

[0047] Figura 33. 105, mas não o BHPI, mata as células de câncer de ovário CaOV-3 resistentes à terapia. (+)-105; Ensaio de morte celu- lar: exclusão automatizada com Trypan Blue. (24 horas após (+)-105).

[0048] Figura 34. (-)105 quase erradica os tumores resistentes a fármacos ER+. Modelo ortotópico de câncer de mama, células TYS-Luc, 40 mg/kg (-)-105 ip, diariamente. Imagem 7d depois da injeção é uma exposição muito mais longa com ganho maior do que a imagem antes da injeção.

[0049] Figura 35. Lâmina PPT extra (-)-105 é superior ao BHPI| em Experimentos em Longo Prazo que Simulam a Terapia do Câncer. Cé- lulas: T47D-luciferase.

[0050] Figura 36. Descoberta de SERK-F6 (também conhecido como, C(-)-105, (-)-105, (R)-105, (-)-1 ou (R) -I), um composto que mata células cancerosas positivas para Era. a, Estruturas químicas de BHPI e composto racêmico 1 (isto é (+)-1) e sua atividade citotóxica em célu- las de câncer de mama T47D após incubações de 24 horas com con- centrações conforme indicado em nM. As células foram coradas com anexina V-FITC e corantes PI antes da análise através de citometria de fluxo. As barras de erro representam S.E.M de 3 replicatas independen- tes. b, SERK-F6 é citotóxico para a linhagem celular positiva para Era, MCF-7, mas tem efeitos mínimos contra a linhagem celular negativa para ERa, MDA-MB-231. As células foram incubadas com SERK-F6 ou controle positivo, Raptinal, por 24 horas e então coradas com anexina V-FITC e corantes PI e analisadas por citometria de fluxo. Barras de erro representam S.E.M de 3 repetições independentes. c, Valores IC5o de SERK-F6 após incubação de 24 horas contra um painel de linhagens de células de câncer agrupadas por seu status ERa relatado. A viabili- dade celular foi medida por fluorescência com Alamar blue e definida em relação a um controle com veículo e um controle morto quantitativo tratado com Raptinal. As barras de erro representam S.E.M de 3 expe- rimentos independentes. d, coloração com cristal violeta de células T47D após incubações de 24 horas com compostos e concentrações como indicado. A imagem é representativa de 2 experimentos indepen- dentes. e, f, Experiência de cultura de células em longo prazo com cé- lulas T47D, TDG e TYS. As células foram incubadas por 2 semanas com compostos (1 mM), seguido por lavagem do composto, e as células fo- ram cultivadas por 2 meses. O número de células foi determinado por MTS.

[0051] Figura 37. SERK-F6 é a espécie ativa que leva à erradica- ção de células positivas para Era. a, ensaio de exclusão com Trypan blue após 24 horas de incubação do composto em um painel de linha- gens celulares positivas para Era. b, experimento de cultura de células de longo prazo com células MCF-7, MDG e MYS incubadas com 1 mM de BHPI ou SERK-F6.

[0052] Figura 38. SERK-F6 ativa UPR antecipatória. a, Indução de MRNA de sp-XBP1 em células T47D como resultado do tratamento com composto após os tempos indicados. BHPI| e SERK-F6 foram adminis- trados a 1 UM. Os níveis de mMRNA foram quantificados por RT-PCR. Barras de erro representam S.E.M de 6 replicatas biológicas b, depleção de ATP intracelular (detalhes necessários aqui), também precisam de dados de T47D aqui. c, o tratamento com SERK-F6 (1 uM) leva à rápida inibição da síntese de proteínas em células T47D.

[0053] Figura 39. SERK-F6 erradica tumores com ERa de tipo sel- vagem através da hiperativação de aUPR. a, tumores ortotópicos de MCF-7 foram estabelecidos em camundongos ooforectomizados Nu/J suplementados com um pélete E2 em 60 dias (0,36 mg) e cultivados até

400 mm (28 dias para o estabelecimento), randomizados, depois tra- tados com veículo diariamente (n = 3), veículo semanalmente (n = 3), fulv. semanalmente (5 mg/camundongo, sc, n = 6), SERK-F6 diaria- mente (10 ou 40 mg/kg po). Os braços com veículo foram calculados pela média. p: *: p <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001, ****; p <0,0001. As imagens do tumor foram obtidas no final do estudo (dia 21) e são repre- sentativas de todos os tumores (n = 6). b-e, as células MCF-7 foram enxertadas ortotopticamente bilateralmente e os tumores foram cultiva- dos até que a carga total do tumor fosse — 400 mm? antes do tratamento diário com veículo ou SERK-F6 (40 mg/kg p.o.). Os camundongos (n = por braço) foram sacrificados após 3 dias (b, c) e 7 dias (d e) e os tumores coletados. A carga tumoral é exibida como uma soma de am- bos os tumores (b,d). c, e, análise por western blot de marcadores de aUPR, P-PERK e P-ElF2a, assim como ERa. Vinculina (Vin) foi usada como um controle de carregamento. Os Western blots exibidos são re- presentativos de 4 réplicas técnicas. Péletes de E2 estavam presentes durante a progressão de todos os experimentos exibidos. Barras de erro representam S.E.M.

[0054] Figura 40. SERK-F6 é tolerado, atinge concentrações biolo- gicamente relevantes e atravessa a barreira hematoencefálica in vivo. a, Concentrações séricas de SERK-F6 após as doses indicadas, via de administração e tempo. A concentração foi determinada por meio de análise LC/MS/MS. A ICs5o média de 24 horas de SERK-F6 é de 42 nM. b, Parâmetros farmacocinéticos calculados para SERK-F6. AUC: Área Sob a Curva, Cmax: concentração máxima, t12: meia-vida. c, d, Camun- dongos (CD-1) foram tratados com as doses e tempos indicados, então sacrificados e seu soro e cérebros coletados. As concentrações foram determinadas por meio de análise LC/MS/MS. O volume médio de san- gue por camundongo foi aproximado para 58,5 mL/Kkg. f-j, tratamento com SERK-F6 de camundongos portadores de tumor ortotópico MCF-

7. f, Percentual de alteração do tumor com comparação das medições do tumor no Dia O e Dia 21. Braços de tratamento: veículo diariamente (n = 3), veículo semanalmente (n = 3), fulv. semanalmente (5 mg/ca- mundongo, sc, n = 6), SERK-F6 diariamente (10 ou 40 mg/kg p.o.). Os braços do veículo foram combinados. g, Massa de tumores coletadas de camundongos. |, peso observado do murino durante este estudo com MCF-7 (n = 6). i, |, Medidas de tumor para o modelo ortotópico bilateral de MCF-7 (n = 4-5).

[0055] Figura 41. SERK-F6 erradica o câncer de mama primário e metastático de ERa mutante. a-c, TYS-luc. Os tumores ortotópicos fo- ram estabelecidos em camundongos NSG ooforectomizados (sem pé- lete E2, 60 dias até o estabelecimento) e dosados diariamente conforme indicado (n = 5-6). b, exemplos representativos de imagens de biolumi- nescência de camundongos tratados com SERK-F6 (7 dias). d, e, TDG- luc. Os tumores ortotópicos foram estabelecidos em camundongos NSG ooforectomizados (sem pélete E2, 120 dias até o estabelecimento) e dosados diariamente conforme indicado (n = 4-5). e, Imagem de biolu- minescência de camundongos tratados com SERK-F6 com TDG-luc. carga tumoral após 7 dias. f, MYS-luc. tumores ortotópicos em camun- dongos NSG ooforectomizados (sem pélete E2, 45 dias até o estabele- cimento) e tratados diariamente conforme indicado (n = 4-5). g, MDG- luc. tumores ortotópicos em camundongos NSG ooforectomizados (sem pélete E2, 45 dias até o estabelecimento) e dosados diariamente con- forme indicado (n = 4-5). h, modelo metastático com MDG-luc. As célu- las são injetadas na veia da cauda de camundongos NSG ooforectomi- zados (sem pélete E2, 1,5 meses até o estabelecimento) e os camun- dongos foram dosados diariamente conforme indicado (n = 4-5).

[0056] Figura 42. Os resultados mostram que a erradicação de ERa mutante mediada por SERK-F6 é dependente da morte celular quanti- tativa. a. O tratamento foi interrompido após 21 doses diárias de SERK-

F6 (40 mg/kg i.p) e a carga tumoral em camundongos foi rastreada por bioluminescência. b, c peso de camundongos portadores de tumor TYS durante o tratamento com SERK-F6. d, Em camundongos com tumores TYS tratados com uma dose mais baixa de SERK-F6 (10 mg/ kg po), os tumores voltam a crescer, no entanto, a repetição do tratamento com SERK-F6 com uma dose mais alta (40 mg/kg po) leva à regressão com- pleta. e, os pesos dos camundongos observados durante o modelo TDG. f, camundongos portadores de TDG foram tratados por 14 dias contínuos e o tratamento foi interrompido, permitindo a observação do recrescimento do tumor por meio de imagem bioluminescente. g, TDG- luc., tumores ortotópicos foram estabelecidos em camundongos NSG ooforectomizados (sem pélete E2, -120 dias até o estabelecimento) e tratados diariamente conforme indicado (n = 5-6). h, camundongos com TDG-luc. Os tumores tratados com uma dose mais baixa de SERK-F6 (10 mg/kg po) voltam a crescer após 2 meses sem tratamento, no en- tanto, o retratamento com SERK-F6 com uma dose mais alta (40 mg/kg po) leva à regressão completa. As barras de erro exibidas são S.E.M.

[0057] Figura 43. A erradicação de tumores MYS/MDG mediada por SERK-F6 é dependente da morte celular quantitativa. a-b, MYS-luc. Tumores ortotópicos foram estabelecidos em camundongos NSG oofo- rectomizados (sem pélete E2, —45 dias até o estabelecimento) e trata- dos diariamente conforme indicado (n = 5-6). b, Tratamento de MYS- luc. Os tumores foram interrompidos após 21 doses diárias de SERK- F6 e a carga tumoral em camundongos foi rastreada por bioluminescên- cia. No dia 60, os tumores que cresceram novamente foram tratados com SERK-F6 (40 mg/kg diário ip). c, imagens representativas de bio- luminescência. c-d, MDG-luc. tumores ortotópicos foram estabelecidos em camundongos NSG ooforectomizados (sem pélete E2, — 45 dias até o estabelecimento) e tratados diariamente conforme indicado (n = 5-6). O volume do tumor foi rastreado através do fluxo total de fótons. d,

MDG-luc. os tumores tratados com 40 mg/kg de SERK-F6 p.o. diaria- mente voltaram a crescer após a interrupção do tratamento. Os tumores com crescimento foram novamente tratados com SERK-F6 i.p. 40 mg/kg e a regressão do tumor foi observada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0058] As células de câncer podem permanecer quiescentes por longos períodos de tempo e depois reativar. Portanto, é desejável matar as células tumorais, não apenas impedir que elas proliferem. Esta des- crição também fornece a descrição de vários ensaios para testar com- postos quanto à capacidade de matar células de câncer, tais como cé- lulas de câncer de mama.

[0059] Esta descrição também identifica novos compostos que são mais eficazes do que BHPI em matar células de câncer de mama que expressam tanto o receptor a de estrogênio de tipo selvagem (ERa) quanto mutações de ERa que são comuns no câncer de mama metas- tático. Essas mutações estão associadas à resistência às terapias atu- ais. Além disso, esta descrição identifica compostos ativos contra célu- las de câncer de ovário, células de câncer uterino e outras células de câncer que contêm ERa. Ho, > O OH

N me * (BHPI)

[0060] A descoberta do composto C(-)-105 está estruturalmente re- lacionada a BHPI. A configuração absoluta do enantiômero levorotatório do composto 105 descoberto foi determinada ter a configuração (R) (isto é, (R)-105). Foi identificado como citotóxico para as células de câncer, mas não por meramente inibir o crescimento das células de câncer. O fenótipo de (R)-105 mata as células de câncer e, por sua vez, os tumo- res. Esta descoberta é surpreendente tendo em vista os compostos

BHPI, fulvestrant, tamoxifeno e 01-15, porque eles não matam as célu- las de câncer. Esses compostos apenas retardam o crescimento das células de câncer, isto é, eles são citostáticos. Assim, (R)-105 foi iden- tificado por seu perfil de citotoxicidade distinto e capacidade de matar quantitativamente células de câncer in-vitro. Os dados coletados de es- tudos in-vivo adicionais provaram a eficácia do composto na regressão de tumores. Definições

[0061] As seguintes definições são incluídas para fornecer uma compreensão clara e consistente do pedido e reivindicações. Como usa- das aqui, as expressões citadas têm os seguintes significados. Todas as outras expressões e frases usadas nesta especificação têm seus sig- nificados comuns como compreendidas por aqueles versados na téc- nica. Esses significados comuns podem ser obtidos com referência a dicionários técnicos, tais como Hawley's Condensed Chemical Dictio- nary 14thEdition, de RJ Lewis, John Wiley & Sons, New York, NY, 2001.

[0062] As referências no pedido a "uma modalidade", "a modali- dade", etc., indicam que a modalidade descrita pode incluir um aspecto, recurso, estrutura, porção ou característica particulares, mas nem toda modalidade inclui necessariamente esse aspecto, recurso, estrutura, porção ou característica. Além disso, tais frases podem, mas não ne- cessariamente, se referir à mesma modalidade referida em outras par- tes do pedido. Além disso, quando um aspecto, recurso, estrutura, por- ção ou característica particular é descrito em conexão com uma moda- lidade, é do conhecimento daquele versado na técnica afetar ou conec- tar tal aspecto, recurso, estrutura, porção ou característica com outras modalidades, descritas explicitamente ou não.

[0063] As formas no singular "um", "uma" e "o" incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "um composto" inclui uma pluralidade de tais compostos, de modo que um composto X inclui uma pluralidade de compostos X. É observada ainda que as reivindicações podem ser redi- gidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declara- ção se destina a servir como base antecedente para o uso de termino- logia exclusiva, tal como "somente", "apenas" e semelhantes, em cone- xão com qualquer elemento aqui descrito e/ou a citação de elementos de reivindicação ou uso de limitações "negativas".

[0064] A expressão "e/ou" significa qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais esta expressão está associado. As frases "um ou mais" e "pelo menos um" são facilmente compreendidas por aquele versado na técnica, particularmente quando lidas no contexto de seu uso. Por exemplo, a frase pode significar um, dois, três, quatro, cinco, seis, dez, 100 ou qualquer limite superior apro- ximadamente 10, 100 ou 1000 vezes maior do que um limite inferior re- citado. Por exemplo, um ou mais substituintes em um anel fenila se re- ferem a um a cinco substituintes no anel.

[0065] Como será entendido por aquele versado na técnica, todos os números, incluindo aqueles que expressam quantidades de ingredi- entes, propriedades tais como peso molecular, condições de reação e assim por diante, são aproximações e são entendidos como sendo op- cionalmente modificados em todos os casos pela expressão "cerca de". Estes valores podem variar dependendo das propriedades desejadas que devem ser obtidas por aqueles versados na técnica utilizando os ensinamentos das descrições desse. Também é entendido que tais va- lores contêm inerentemente, uma variabilidade que resulta necessaria- mente dos desvios-padrão encontrados em suas respectivas medições de teste. Quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular sem o modificador "cerca de" também forma um aspecto adicional.

[0066] As expressões "cerca de" e "aproximadamente" são usadas alternativamente. Ambas as expressões podem se referir a uma varia- ção de + 5%, + 10%, + 20% ou + 25% do valor especificado. Por exem- plo, "cerca de 50" por cento pode, em algumas modalidades, apresentar uma variação de 45 a 55 por cento, ou como definido de outra forma por uma reivindicação particular. Para intervalos de números inteiros, a ex- pressão "cerca de" pode incluir um ou dois números inteiros maiores e/ou menores do que um número inteiro citado em cada extremidade do intervalo. A menos que indicado de outra forma aqui, as expressões "cerca de" e "aproximadamente" são pretendidas incluir valores, por exemplo, percentuais em peso, próximos à faixa citada que são equiva- lentes em termos da funcionalidade do ingrediente, composição ou mo- dalidade individuais. As expressões "cerca de" e "aproximadamente" também podem modificar os pontos finais de uma faixa citada como dis- cutido acima nesse parágrafo.

[0067] Como será entendido por um versado na técnica, para todos e quaisquer propósitos, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas aqui citadas também abrangem qual- quer e todas as sub-faixas e combinações de sub-faixas possíveis, as- sim como os valores individuais que constituem o intervalo, especial- mente os valores inteiros. Portanto, é entendido que cada unidade entre duas unidades particulares também é descrita. Por exemplo, se 10 a 15 são descritos, então 11, 12, 13 e 14 também são descritos, individual- mente e como parte de um intervalo. Um intervalo citado (por exemplo, percentuais em peso ou grupos de carbono) inclui cada valor específico, inteiro, decimal ou identidade dentro do intervalo. Qualquer intervalo lis- tado pode ser facilmente reconhecido como descrevendo suficiente- mente e permitindo que o mesmo intervalo seja dividido em pelo menos metades iguais, terços, quartos, quintos, ou décimos. Como um exem- plo não limitante, cada faixa discutida neste documento pode ser facil- mente dividida em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc.

Como será compreendido por aquele versado na técnica, toda as ex- pressões, tais como "até", "pelo menos", "maior do que", "menos do que", "mais do que" "ou mais" e semelhantes, incluem o número citado etais expressões se referem a faixas que podem ser subsequentemente divididos em sub-faixas como descrito acima. Consequentemente, valo- res específicos citados para radicais, substituintes e faixas são apenas ilustrativos; eles não excluem outros valores definidos ou outros valores dentro de faixas definidas para radicais e substituintes. Será entendido ainda que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos em relação a outro ponto final e independentemente do outro ponto final.

[0068] A pessoa versada na técnica também reconhecerá pronta- mente que, onde os membros são agrupados de uma maneira comum, tal como em um grupo de Markush, a invenção abrange não apenas todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo indivi- dualmente e todos os possíveis subgrupos do grupo principal. Além disso, para todos os efeitos, a invenção abrange não apenas o grupo principal, mas também o grupo principal na ausência de um ou mais dos membros do grupo. A invenção, portanto, prevê a exclusão explícita de qualquer um ou mais dos membros de um grupo citado. Por conse- guinte, as ressalvas podem ser aplicadas a qualquer uma das catego- rias ou modalidades descritas, em que qualquer um ou mais dos ele- mentos, espécies ou modalidades citadas podem ser excluídos de tais categorias ou modalidades, por exemplo, para uso em uma limitação negativa explícita.

[0069] A expressão "contatar" se refere ao ato de tocar, fazer con- tato ou trazer uma proximidade imediata ou próxima, incluindo à nível celular ou molecular, por exemplo, para provocar uma reação fisiológica, uma reação química ou uma mudança física, por exemplo, em uma so- lução, em uma mistura de reação, in vitro ou in vivo.

[0070] Uma "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade eficaz para tratar uma doença, distúrbio e/ou condição ou para provocar um efeito citado. Por exemplo, uma quantidade eficaz pode ser uma quan- tidade eficaz para reduzir a progressão ou gravidade da condição ou sintomas a serem tratados. A determinação de uma quantidade tera- peuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica. A expressão "quantidade eficaz" pretende incluir uma quan- tidade de um composto aqui descrito, ou uma quantidade de uma com- binação de compostos aqui descritos, por exemplo, que seja eficaz para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio, ou para tratar os sintomas da doença ou distúrbio, em um hospedeiro. Assim, uma "quantidade efi- caz" geralmente significa uma quantidade que fornece o efeito dese- jado.

[0071] Alternativamente, as expressões "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizadas, se refe- rem a uma quantidade suficiente de um agente ou uma composição ou combinação de composições a serem administradas que irão aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença ou condição a ser tra- tada. O resultado pode ser a redução e/ou o alívio dos sinais, sintomas Ou causas de uma doença ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" para usos te- rapêuticos é a quantidade da composição que compreende um com- posto conforme aqui descrito, necessário para fornecer uma diminuição clinicamente significativa nos sintomas da doença. Uma quantidade "efi- caz" apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada usando técnicas, tais como um estudo de escalonamento de dose. À dose pode ser administrada em uma ou mais administrações. No en- tanto, a determinação precisa do que será considerado uma dose eficaz pode ser baseada em fatores individuais para cada paciente, incluindo, mas não se limitando a, idade do paciente, tamanho, tipo ou extensão da doença, estágio da doença, via de administração das composições,

o tipo ou extensão da terapia suplementar usada, o processo da doença em andamento e o tipo de tratamento desejado (por exemplo, trata- mento agressivo vs. convencional).

[0072] As expressões "tratando", "tratar" e "tratamento" incluem (i) prevenir a ocorrência de uma doença, condição patológica ou médica (por exemplo, profilaxia); (ii) inibir a doença, condição patológica ou mé- dica ou interromper seu desenvolvimento; (iii) aliviar a doença, condição patológica ou médica; e/ou (iv) diminuir os sintomas associados à do- ença, condição patológica ou médica. Assim, as expressões "tratar", "tratamento" e "tratando" podem se estender à profilaxia e podem incluir prevenir, prevenção, diminuir, interromper ou reverter a progressão ou gravidade da condição ou sintomas a serem tratados. Como tal, A ex- pressão "tratamento" pode incluir administração médica, terapêutica e/ou profilática, conforme apropriado.

[0073] Como usado aqui, "indivíduo" ou "paciente" significa um in- divíduo com sintomas de, ou em risco de uma doença ou outra maligni- dade. Um paciente pode ser humano ou não humano e pode incluir, por exemplo, linhagens de animais ou espécies usadas como "sistemas de modelo" para fins de pesquisa, como um modelo de camundongo como aqui descrito. Da mesma forma, o paciente pode incluir adultos ou jo- vens (por exemplo, crianças). Além disso, paciente pode significar qual- quer organismo vivo, de preferência um mamífero (por exemplo, hu- mano ou não humano) que pode se beneficiar da administração das composições aqui contempladas. Exemplos de mamíferos incluem, mas não estão limitados a qualquer membro da classe dos mamíferos: hu- manos, primatas não humanos, tais como chimpanzés e outras espé- cies de macacos e micos; animais de fazenda, como gado, cavalos, ovelhas, cabras, porcos; animais domésticos, tais como coelhos, cães e gatos; animais de laboratório, incluindo roedores, tais como ratos, ca- mundongos e porquinhos da guiné e semelhantes. Exemplos de não mamíferos incluem, mas não estão limitados a pássaros, peixes e se- melhantes. Em uma modalidade dos métodos fornecidos aqui, o mamí- fero é um humano.

[0074] Como usadas aqui, as expressões "fornecendo", "adminis- trando", "introduzindo" são usadas indistintamente aqui e se referem à colocação das composições da descrição em um indivíduo por um mé- todo ou via que resulta em pelo menos na localização parcial do com- posição em um local desejado. As composições podem ser administra- das por qualquer via apropriada que resulte na liberação em um local desejado no indivíduo.

[0075] As composições aqui descritas podem ser administradas com composições adicionais para prolongar a estabilidade e a atividade das composições ou em combinação com outros fármacos terapêuticos.

[0076] As expressões "inibir", "inibindo" e "inibição" se referem ao retardo, interrupção ou reversão do crescimento ou progressão de uma doença, infecção, condição ou grupo de células. A inibição pode ser maior do que cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 90%, 95% ou 99%, por exemplo, em comparação com o crescimento ou progressão que ocorre na ausência do tratamento ou contato.

[0077] A expressão "substancialmente", como usada aqui, é uma expressão ampla e é usada em seu sentido comum, que inclui sem limi- tação, ser amplamente, mas não necessariamente totalmente, aquilo que é especificado. Por exemplo, A expressão pode se referir a um valor numérico que pode não ser 100% do valor numérico completo. O valor numérico completo pode ser menos em cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 15% ou cerca de 20%.

[0078] Esta descrição fornece métodos de preparação dos compos- tos e composições da invenção. Os compostos e composições podem ser preparados por qualquer uma das técnicas aplicáveis aqui descritas, opcionalmente em combinação com técnicas padronizada de síntese orgânica. Muitas técnicas, tais como eterificação e esterificação, são bem conhecidas. No entanto, muitas dessas técnicas são elaboradas em Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, lan T. Harrison e Shuyen Harrison, 1971; Vol. 2, lan T. Harrison e Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus e Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; e vol. 6; assim como textos de referência or- gânica padronizados, tais como Advanced Organic Chemistry: Reac- tions, Mechanisms and Structure, 5th Ed., de MB Smith e J. March (John Wiley & Sons, New York, 2001); Comprehensive Organic Synthesis. Se- letividade, Estratégia e Eficiência em Química Orgânica Moderna. Em 9 Volumes, Barry M. Trost, Editor-Chefe (Pergamon Press, New York, im- pressão de 1993); Advanced Organic Chemistry, Parte B: Reactions and Synthesis, Segunda Edição, Cary e Sundberg (1983);

[0079] As fórmulas e compostos descritos neste documento podem ser modificados usando grupos de proteção. Os grupos de proteção de amino e carboxi adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Protecting Groups in Organic Synthesis, Se- gunda Edição, Greene, TW e Wutz, PGM, John Wiley & Sons, New York, e referências aí citadas; Philip J. Kocienski; Protecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1994) e referências aí cita- das); e Comprehensive Organic Transformations, Larock, RC, Segunda Edição, John Wiley & Sons, New York (1999) e referências aí citadas.

[0080] Como usada aqui, a expressão "substituído" ou "substituinte" pretende indicar que um ou mais (por exemplo, 1 a 20 em várias moda- lidades, 1 a 10 em outras modalidades, 1, 2, 3, 4 ou 5; em algumas modalidades 1, 2 ou 3; e em outras modalidades 1 ou 2) hidrogênios no grupo indicado na expressão usando "substituído" (ou "substituinte")

são substituídos por uma seleção do(s) grupo(s) indicado(s), ou com um grupo adequado conhecido por aqueles versados na técnica, desde que a valência normal do átomo indicado não seja excedida e que a substi- tuição resulte em um composto estável.

Os grupos indicados apropria- dos incluem, por exemplo, alquila, alquenila, alquinila, alcoxila, halo, ha- loalquila, hidroxila, hidroxialquila, arila, heteroarila, heterociclo, cicloal- quila, alcanoila, alcoxicarbonila, amina, alquilamina, dialquilamina, triflu- ormetiltio, difluormetila, acilamina, nitro, trifluormetila, trifluormetoxila, carboxila, carboxialquila, ceto, tioxo, alquiltio, alquilsulfinila, alquilsulfo- nila e ciano.

Além disso, exemplos não limitativos de substituintes que podem ser ligados a um átomo de carbono substituído (ou outro) in- cluem F, CI, Br, |, OR', OC(O)N(R')2, CN, CF3, OCF3, R', O, S, C(O), S(O), metilenodioxila, etilenodioxila, N(R'), SR, SOR, SO>2R', SO2N(R'), SO3R', C(O)JR', C(O)JC(OJ)R', C(O)JCH2C(OJ)R', C(S) R', C(O)JOR', OC(OJR', C(O)N(R')e, OC(O)N(R'),, C(S)N(R')» (CH2)o- 2aNHC(O)R', N(RIN(RY)C(OJR', N(RIN(R)C(O)JOR', N(R')N(R)CON (R')a, N(R')SO2R', N(R')SO2N(R')a, N(R')C(O)OR', N(R')C(O)R', N(R)C (S)R', N(R)C(O)N(R')2a, N(R')C(S)N(R')., N(COR')COR', N(OR'JR', C (=NH)N(R')2, C(O)N(OR')R', ou C(=NOR')R' em que R' pode ser hidro- gênio ou uma porção à base de carbono, e em que a porção à base de carbono pode ser ela própria ainda substituída.

Quando um substituinte é monovalente, como, por exemplo, F ou CI, ele está ligado ao átomo que está substituindo por uma ligação simples.

Quando um substituinte é mais do que monovalente, como O, que é divalente, ele pode ser |li- gado ao átomo que está substituindo por mais de uma ligação, isto é, um substituinte divalente é ligado por uma ligação dupla; por exemplo, um C substituído com O forma um grupo carbonila, C=O, em que C e O são duplamente ligados.

Alternativamente, um substituinte divalente, tal como O, S, C(O), S(O) ou S(O)2 pode ser conectado por duas ligações simples a dois átomos de carbono diferentes. Por exemplo, O, um subs- tituinte divalente, pode ser ligado a cada um dos dois átomos de carbono adjacentes para fornecer um grupo epóxido, ou O pode formar um grupo de ligação éter entre átomos de carbono adjacentes ou não adjacentes, por exemplo, ligando os carbonos 1,4 de um grupo ciclohexila para for- mar um sistema [2.2.1]-oxabiciclo. Além disso, qualquer substituinte pode ser ligado a um carbono ou outro átomo por um ligante, tal como (CH2)n ou (CR'2)) em que n é 1, 2, 3 ou mais, e cada R é selecionado independentemente.

[0081] A expressão "halo" ou "haleto" se refere a flúor, cloro, bromo ou iodo. Da mesma forma, a expressão "halogênio" se refere a flúor, cloro, bromo e iodo.

[0082] A expressão "alquila" se refere a um hidrocarboneto ramifi- cado ou não ramificado que possui, por exemplo, entre 1 a 20 átomos de carbono, e frequentemente 1 a 12, 1a 10,1a8,1a60ou1adátomos de carbono. Como usada aqui, a expressão "alquila" também abrange uma "cicloalquila", definida abaixo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a metila, etila, 1-propila, 2-propila (iso-propila), 1-butila, 2-me- til-1-propila (isobutila), 2-butila (sec-butila) , 2-metil-2-propila (t-butila), 1-pentila, 2-pentila, 3-pentila, 2-metil-2-butila, 3-metil-2-butila, 3 -metil- 1-butila, 2-metil-1-butila, 1-hexila, 2-hexila, 3-hexila, 2-metil-2-pentila, 3- metil-2-pentila, 4-metil-2-pentila, 3-metil- 3-pentila, 2-metil-3-pentila, 2,3-dimetil-2-butila, 3,3-dimetil-2-butila, hexila, octila, decila, dodecila e semelhantes. A alquila pode ser não substituída ou substituída, por exemplo, com um substituinte descrito abaixo. Como tal, a citação de um grupo alquila pode incluir grupos alquenila e alquinila. A alquila pode ser um radical de hidrocarboneto monovalente, como descrito e exem- plificado acima ou pode ser um radical de hidrocarboneto divalente (isto é, um alquileno).

[0083] A expressão "cicloalquila" se refere a grupos alquila cíclicos de, por exemplo, 3 a 10 átomos de carbono que possuem um único anel cíclico ou múltiplos anéis condensados. Os grupos cicloalquila incluem, por exemplo, estruturas de anel único, tais como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclooctila e semelhantes ou estruturas de anéis múltiplos, tais como adamantila e semelhantes. A cicloalquila pode ser não subs- tituída ou substituída. O grupo cicloalquila pode ser monovalente ou di- valente e pode ser opcionalmente substituído conforme descrito para grupos alquila. O grupo cicloalquila pode incluir opcionalmente um ou mais sítios de insaturação, por exemplo, o grupo cicloalquila pode incluir uma ou mais ligações duplas de carbono-carbono, tais como, por exem- plo, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, ciclohe- xil, I-ciclohex-1-enila, 1-ciclohex-2-enila, 1-ciclohex-3-enila e semelhan- tes.

[0084] A expressão "heterocicloalquila" ou "heterociclila" se refere a um anel monocíclico, bicíclico ou policíclico saturado ou parcialmente saturado que contém pelo menos um heteroátomo selecionado entre nitrogênio, enxofre, oxigênio, preferivelmente entre 1 a 3 heteroátomos em pelo menos um anel. Cada anel tem preferivelmente de 3 a 10 mem- bros, mais preferivelmente de 4 a 7 membros. Exemplos de substituintes heterocicloalquila “adequados incluem pirrolidila,y tetraidrofurila, tetraidrotiofuranila, piperidila, piperazila, tetraidropiranila, morfolino, 1,3- diazapano, 1,4-diazapano, 1,4-0xazepano e 1,4-oxatiapano. O grupo pode ser um grupo terminal ou um grupo de ligação.

[0085] A expressão "aromático" se refere a um grupo arila ou hete- roarila ou substituinte aqui descrito. Além disso, uma porção aromática pode ser uma fração bis-aromática, uma porção tris-aromática e assim por diante. Uma porção bis-aromática tem uma ligação simples entre duas porções aromáticas, tais como, mas não limitadas a bifenila ou bipiridina. Similarmente, uma fração tris-aromática tem uma única liga- ção entre cada porção aromática.

[0086] A expressão "arila" se refere a um grupo de hidrocarboneto aromático derivado da remoção de pelo menos um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático paren- tal. O local de acoplamento do radical pode estar em um átomo de car- bono saturado ou insaturado do sistema de anel parental. O grupo arila pode ter entre 6 a 30 átomos de carbono, por exemplo, cerca de 6 a 10 átomos de carbono. Em outras modalidades, o grupo arila pode ter 6 a 60 átomos de carbono, 6 a 120 átomos de carbono ou 6 a 240 átomos de carbono. O grupo arila pode ter um único anel (por exemplo, fenila) ou múltiplos anéis condensados (fundidos), em que pelo menos um anel é aromático (por exemplo, naftila, dihidrofenantrenila, fluorenila ou an- tranila). Grupos arila típicos incluem, mas não estão limitados a radicais derivados de benzeno, naftaleno, antraceno, bifenila e semelhantes. À arila pode ser não substituída ou opcionalmente substituída.

[0087] A expressão "heteroarila" se refere a um sistema de anel mo- nocíclico, bicíclico ou tricíclico que contém um, dois ou três anéis aro- máticos e que contém pelo menos um átomo de nitrogênio, oxigênio ou enxofre em um anel aromático. A heteroarila pode ser não substituída ou substituída, por exemplo, com um ou mais, e em particular um a três, substituintes, conforme descrito na definição de "substituído". Os grupos heteroarila típicos contêm 2 a 20 átomos de carbono no arcabouço do anel, além de um ou mais heteroátomos. Exemplos de grupos hetero- arila incluem, mas não estão limitados a 2H-pirrolila, 3H-indolila, 4H-qui- nolizinila, acridinila, benzo[b]tienila, benzotiazolila, B-carbolinila, carba- zolila, cromenila, cinolinila, dibenzo[b,dlfuranila, furazanila, furila, imi- dazolila, imidizolila, indazolila, indolisinila, indolila, isobenzofuranila, isoindolila, isoquinolila, isotiazolila, isoxazolila, naftiridinila, oxazolila, pi- rimidinila, fenantridinila, fenantrolinila, fenarsazinila, fenazinila, fenotia- zinila, fenoxatiinila, fenoxazinila, ftalazinila, pteridinila, purinila, piranila,

pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridila, pirimidinila, pirrolila, quinazoli- nila, quinolila, quinoxalinila, tiadiazolila, tiantrenila, tiazolila, tienila, triazolila, tetrazolila e xantenila. Em uma modalidade, a expressão "he- teroarila" denota um anel aromático monocíclico que contém cinco ou seis átomos no anel que contém carbono e 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de oxigênio não peróxido, en- xofre e N(Z) em que Z está ausente ou é H, O , alquila, arila ou (C1-C6) alquilarila. Em algumas modalidades, heteroarila denota um heterociclo bicíclico orto-fundido com cerca de oito a dez átomos no anel derivados do mesmo, particularmente um derivado benz ou um derivado pela fu- são de um di-radical de propileno, trimetileno ou tetrametileno.

[0088] A expressão "enantiomericamente enriquecido" ("ee"), tal como aqui utilizada, se refere a misturas que possuem um enantiômero presente em maior extensão do que outro. As reações que fornecem um enantiômero presente em uma extensão maior do que outro seriam, por- tanto, "enantioseletivas" (ou demonstrariam "enantioseletividade"). Em uma modalidade da invenção, a expressão enantiomericamente enri- quecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 2% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomerica- mente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 5% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 20% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 50% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 80% de ee; em outra mo- dalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 90% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 95% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiome- ricamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 98% de ee; em outra modalidade da invenção, a expressão "enantiomericamente enriquecida" se refere a uma mistura que possui pelo menos cerca de 99% de ee. A expressão "enantiomericamente enriquecida" inclui misturas enantiomericamente puras que são mistu- ras substancialmente livres das espécies da atividade óptica oposta ou um enantiômero está presente em quantidades muito pequenas, por exemplo, 0,01%, 0,001% ou 0,0001%.

[0089] A expressão "ICso" é geralmente definida como a concentra- ção necessária para matar 50% das células em 24 horas.

[0090] Ao longo desta descrição, a expressão "(-)-105", que se re- fere ao enantiômero levorotatório do composto 105, pode ser usado al- ternativamente com as expressões C(-)-105, (-)-1, (R)-105, (R)-1 ou SERK-F6. Similarmente, (+)-105 é o enantiômero dextrorotatório, tam- bém conhecido como (S)-105, (S)-1 ou (+)-1. Além disso, a expressão "(+)-105", que se refere ao racemato do composto 105, pode ser usado indistintamente com a expressão (+)-1. Modalidades da Invenção

[0091] Esta descrição fornece várias modalidades de um composto de Fórmula |: GG! Al O Pê eo Rê a (ID R2 x R O), ou seu sal ou solvato; em que Ri, R?, R? and Rº são cada um independentemente H,

halo, -ORA, -SRA, -N(Rô)>, alquila, cicloalquila, heterociclila, arila, ou he- teroarila; A, A?, A? e Aº são cada um independentemente H, halo, ou alquila; G' é halo, -OR8, -SR8, -S(=O)2R, ou alquila; G? é halo, -ORº, -SRº, -S(=O)2Rº, ou alquila; X and Z são cada um independentemente O, S ou -NRº?; e RA, RB, Rº e RP são cada um independentemente H ou al- quila, em que, quando presentes, -ORº e -ORº não são ambos -OH; em que cada alquila, cicloalquila, heterociclila, arila, e hete- roarila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes.

[0092] Em várias modalidades das Fórmulas |-IV aqui descritas, Rº é um substituinte na posição orto para A'. Em várias modalidades, Rô é um substituinte na posição orto para A?. Em várias modalidades, R' é um substituinte na posição orto para Aº. Em várias modalidades, Rº é um substituinte na posição orto para A*. Em várias modalidades, Rº, R$, R? e R$ são cada um, independentemente, H, halo, -OR8, -SR8, -N(Rô)>, alquila, cicloalquila, heterociclila, arila ou heteroarila.

[0093] Em algumas modalidades, o composto é o enantiômero (S). Em outras modalidades, o composto é o enantiômero (R). Em modali- dades adicionais, R4, RB, Rº e RP são cada um independentemente H ou -(C1-Ce)alquila, e R', R2, Rº e Rº são cada um independentemente H, halo, ou -(C1-Ce)alquila. Em algumas outras modalidades, A', A?, A? e Aº* são cada um independentemente H ou halo, e G' é -ORÊê. Em modalidades adicionais, Xé -NR?P e Zé O. Em modalidades adicionais, Rô, RE, Rº, R?, R!, R2?, Rº e Rº são cada um independentemente -(C>- Cs)alquila, -(C3-Ce)alquila, ou -(C3-Cse)cicloalquila.

[0094] Em várias modalidades adicionais, R' é CH3, CH2CH3, CF3, CHF2, CH20F3, CF2CH3 ou CF2C0F3. Em outras modalidades adicionais ainda, G' é -ORê e R$ é H, CH3, CH2CH3, CF3, CHF2, CH2C0F3, CF2CH3 ou CF2CF3.

[0095] Em modalidades adicionais, o composto é um composto de Fórmula (11) ou Fórmula (Ill):

G GG Or “Orr 2 (O O Rê A Aa CX CX. R2 N R2? N RR (11) ou RURA (1).

[0096] Em algumas outras modalidades, o composto é um com- posto de Fórmula |V:

G

SS xx R2 x ROOR (1), em que G' é -ORº e Rº e R' são cada um independentemente alquila ou cicloalquila, em que a alquila e a cicloalquila são opcionalmente substituídos por um ou mais grupos halo.

[0097] Em várias modalidades, um ou mais átomos de hidrogênio é deutério ou trítio, um ou mais átomos de carbono é um isótopo de car- bono ou uma combinação desses.

[0098] Em outras modalidades, o composto é qualquer um dos com- postos (S)- ou (R)-2, 4, 6, 8 ou 105: HCO HCO F;CO F;CO F;CO Oy" Oy" OS” OS” O"

E CH; CF3 CH; CF3 CH; (S)-2, (S)-4, (S)-6, (S)-105, (S)-8,

Do ba bo ba Dor

E CH CF CH CF; CH (R)-2, (R)-A, (R)-6, (R)-105, ou (R)-8.

[0099] Em modalidades adicionais, o composto é qualquer um dos compostos mostrados: Ho Ho Ho Ho Oy” O er” ÕO e Oy”

N N N N CHs 9 CF; 9 CH; 9 CHs 9 Ho HO H;CO O O O O" O ES

N N N CH; 9 CH; 9 CH; 9 ou um enantiômero desses.

[00100] Em algumas modalidades adicionais, o composto é levorota- tório. Em outras modalidades, o composto é dextrorotatório. Em outras modalidades, o composto é (R)-105 ou (S)-105. Em ainda outras moda- lidades , o composto é (R)-105.

[00101] Em outras modalidades adicionais, o composto (um enantiô- mero ou racemato) tem uma afinidade de ligação pelo receptor alfa de estrogênio (ERa) e a IC5o da afinidade de ligação é inferior a cerca de 500 nM. Em outras modalidades, a ICso para ERa é de cerca de 1 pM a cerca de 1000 nM, cerca de 0,1nM a cerca de 750 nM, cerca de 1 nM a cerca de 250 nM, cerca de 5nM a cerca de 500 nM, ou cerca de 10 nM a cerca de 5000 nM. Em várias outras modalidades, o composto mata ou inibe o crescimento de células de câncer pela hiperativação da res- posta de proteína não dobrada (UPR) no retículo endoplasmático. Em outras modalidades, as células de câncer são células de câncer positi- vas para ERa. Em algumas outras modalidades, as células de câncer são células de câncer de mama, células de câncer de ovário ou células de câncer endometrial.

[00102] Esta descrição também fornece uma composição que com- preende o composto aqui descrito e um segundo fármaco. A descrição fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende o com- posto em combinação com um diluente, veículo, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades da composi- ção farmacêutica, o composto é uma mistura racêmica de (R)-105 e (S)-

105. Em várias modalidades, uma mistura racêmica de um composto é uma mistura de enantiômeros em que a mistura de enantiômeros tem uma proporção entre cerca de 50:50, cerca de 45:55, cerca de 40:60, cerca de 30:70, cerca de 20:80, cerca de 10:90 ou cerca de 5:95.

[00103] A descrição fornece adicionalmente um método de trata- mento de um câncer, compreendendo a administração a um indivíduo necessitado com câncer positivo para ERa de uma quantidade terapeu- ticamente eficaz do composto, tratando dessa maneira o câncer no in- divíduo. Em outras modalidades, o composto mata ou inibe o cresci- mento de câncer positivo para ERa pela hiperativação da resposta da proteína não dobrada (UPR) no retículo endoplasmático. Em outras mo- dalidades, o composto é uma mistura racêmica de (R)-105 e (S)-105. Em outras modalidades, o câncer positivo para ERa é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical ou câncer endometrial.

[00104] A descrição fornece adicionalmente o uso do composto para o tratamento de uma doença positiva para ERa em um indivíduo neces- sitado, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto é administrada ao indivíduo, tratando assim o câncer no indivíduo. Em vá- rias modalidades, a doença positiva para ERa é um câncer positivo para

ERa. Em outras modalidades, o câncer positivo para ERa é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical ou cân- cer endometrial. Em modalidades adicionais, o composto é adminis- trado por via oral, por injeção, por via subcutânea, sublingual, retal, por infusão, por via intravenosa, por absorção dérmica ou através de uma cavidade ou orifício corporal.

[00105] Esta descrição fornece faixas, limites e desvios para variá- veis como volume, massa, percentuais, proporções, etc. É entendido por uma pessoa versada na técnica que uma faixa, tal como "número1" a "número2", implica um intervalo contínuo de números que inclui nú- meros inteiros e números fracionários. Por exemplo, 1 a 10 significa 1, 2,3,4,5,... 9, 10. Também significa 1,0, 1,1, 1,2. 1,3, ..., 9,8, 9,9, 10,0 e também significa 1,01, 1,02, 1,03 e assim por diante. Se a variável divulgada é um número menor que "número10", isso implica em um in- tervalo contínuo que inclui números inteiros e números fracionários me- nores que número 10, como discutido acima. Da mesma forma, se a variável divulgada é um número maior que "número10", isso implica em um intervalo contínuo que inclui números inteiros e números fracionários maiores que número 10. Essas faixas podem ser modificadas pela ex- pressão "cerca de", cujo significado foi descrito acima.

Resultados e Discussão

[00106] O sistema de edição do gene CRISPR/Cas9 foi usado para substituir ERa do tipo selvagem em células T47D de câncer de mama humano com as duas mutações mais comuns de ERa vistas no câncer de mama metastático, EraY537S e EraD538G. As linhagens celulares resultantes TYS-4 (também chamadas de TYS) e TDG-1 (também cha- mada de TDG) T47DERaY537S clone 4 e T47DERaD538G clone 1) exibiram resistência significativa ao tamoxifen (a forma ativa o tamoxifen é z-4-hidroxitamoxifen; z-OHT) e ao fulvestrant/ICI. (Mao et al., 2016).

[00107] Para permitir a visualização de tumores que abrigam essas mutações em animais vivos, foram isoladas linhagens clonais de células TYS e TDG que expressam estavelmente a luciferase do vagalume. Tu- mores ortotópicos de camundongos contendo essas células TYS-Luc e TYDG-Luc são visualizados em animais vivos por imagem biolumines- cente (BLI). Como o In Vivo Imaging System (IVIS) tem um intervalo de detecção de mais de 10.000 vezes e pode ser usado para visualizar a progressão de tumores primários e metastáticos, BLI| usando IVIS é con- siderado a forma mais avançada de avaliar a eficácia de novos fármacos anticâncer em modelos em animais. Nenhuma outra equipe de pesquisa em uma universidade, empresa farmacêutica ou de biotecnologia de- senvolveu linhagens celulares que combinam a expressão das muta- ções ERa do câncer de mama e a luciferase para BLI.

[00108] O rastreamento imparcial de alto rendimento foi usado para moléculas pequenas que bloqueiam a ação de ERa para identificar no- vos biomoduladores de ERa. BHPI foi a primeira geração de molécula pequena líder a emergir dessa pesquisa. BHPI é um potente biomodu- lador de molécula pequena não competitivo potente de ERa que mata células de câncer endometrial e de mama positivas para ERa resisten- tes à terapia e bloqueia o crescimento de células de câncer de ovário. BHPI se liga a um sítio sobre ERa diferente do tamoxifeno e fulvestrant e tem um mecanismo de ação diferente. Foi demonstrado que o BHPI atua através de ERa para induzir a hiperativação letal persistente da via antecipatória de ativação da resposta proteica não dobrada (UPR). Em modelos de cultura de células, BHPI bloqueia seletivamente o cresci- mento e, muitas vezes, mata as células de câncer da mama, do ovário e do endométrio resistentes à terapia. Notavelmente, BHPI bloqueou a proliferação das células TYS e TDG que expressam as mutações de ERa identificadas no câncer de mama metastático.

[00109] Em um modelo de xenoenxerto de câncer de mama positivo para ERa em camundongo, em doses razoáveis, BHPI interrompeu o crescimento do tumor e induziu uma regressão tumoral rápida e subs- tancial.

[00110] Em estudos de xenoenxerto usando células TYS-Luc e TDG- Luc após 4 semanas, os tumores de mama de controle com veículo quase quadruplicaram em células. Em contraste, os tumores em camun- dongos tratados com BHPI exibiram regressão de 97% -99,5%.

[00111] Emum modelo de xenoenxerto ortotópico de câncer de ová- rio usando células OVCAR-3, que são altamente resistentes a diversos medicamentos anticâncer, o taxano paclitaxel foi ineficaz. BHPI sozinho reduziu acentuadamente o crescimento do tumor. Notavelmente, os tu- mores eram indetectáveis em camundongos tratados com BHPI mais paclitaxel e os níveis do biomarcador de câncer circulante CA125 pro- gressivamente diminuíram para indetectáveis. Em ambos os estudos, o BHPI foi bem tolerado pelos camundongos. Novos Compostos com Capacidade Superior para Matar Células de Câncer de Mama Resistentes à Terapia

[00112] Por meio de síntese e avaliação, foram identificados novos compostos que são superiores ao BHPI em sua capacidade de matar células de câncer de mama resistentes à terapia. Comparado com o

BHPI, o composto principal neste grupo, o C-105 exibe potência e efi- cácia superiores.

[00113] Os ensaios foram desenvolvidos para compostos com uma capacidade melhorada de matar células de câncer. Um dos ensaios é baseado no critério clássico de morte celular, perda de integridade da membrana medida pela absorção do corante Trypan Blue. Este é um ensaio baseado em instrumento que determina o percentual de células em uma população que absorveu o Trypan Blue. Todas as células que absorveram Trypan Blue estão mortas. Este novo ensaio é exclusivo para o fluxo de trabalho de rastreamento descrito. Embora a captação de Trypan Blue seja universalmente aceita como medida de morte celu- lar, ela não foi usada por outros para testar fármacos anticâncer em po- tencial. Ensaios adicionais usados para avaliar a morte celular incluem classificação de células ativada por fluorescência (FACS) e ensaios ba- seados na inibição da proliferação e determinação do número de célu- las, às vezes em conjunto com raptinal, um composto conhecido por induzir 100% de morte celular.

[00114] Através da síntese, foram obtidas moléculas pequenas que contêm uma nova característica estrutural que oferece resultados sur- preendentes. Em comparação com o BHPI, a molécula pequena princi- pal, C-105, exibe potência e eficácia muito superiores. Notavelmente, ao contrário de BHPI, o enantiômero (-) ativo de C-105 matou 100% das células TYS-Luc em um experimento de cultura de células de longo prazo.

[00115] Além disso, os medicamentos atuais da terapia endócrina, tamoxifeno e fulvestrant, são citostáticos e não mostraram nenhuma ca- pacidade de matar células TYS e TDG de câncer de mama. Demons- trando especificidade pelo alvo, mesmo em concentrações mais de 10 vezes maiores do que aquelas que efetivamente matam células de cân- cer de mama positivas para Positivas para ERa, C-105 não teve efeito em várias linhagens celulares negativas para ERa.

[00116] Notavelmente, em um xenoenxerto em camundongo, depois da administração de (-)C-105 ativo por apenas 3 dias, os tumores foram destruídos. Usando BLI para visualizar os tumores, 4 dos 5 tumores en- colheram (regrediram) em mais do que 99,9% e todos os cinco encolhe- ram mais do que 99%. Usando paquímetros, dentro de sete dias, todos os 5 tumores encolheram até um tamanho indetectável. Depois de três semanas, o tumor em um camundongo desapareceu completamente (regressão completa — 100%) e os tumores em 3 dos 4 camundongos restantes encolheram em mais do que 99,9%. Em um teste de longa duração para determinar se os sinais restantes são devidos a células tumorais mortas ou dormentes, ou se as células tumorais irão crescer novamente, após a interrupção do tratamento e a espera de 4 semanas, o único tumor que desapareceu completamente (regressão completa - 100%) permaneceu em -100% e NÃO HOUVE RECRESCIMENTO DE "MICROTUMOR!" nos outros camundongos. Esta é uma resposta sem precedentes.

[00117] Mecanismo de ação de -105: As ações de -105 incluem, mas não estão limitadas a indução da hiperativação letal do sensor de es- tresse do retículo endoplasmático, a resposta de proteína não dobrada (UPR). O sensor de estresse do retículo endoplasmático (EnR), a res- posta de proteína não dobrada (UPR) equilibra a síntese de novas pro- teínas com a disponibilidade de chaperonas e outras proteínas que aju- dam a dobrar e transportar proteínas dentro das células. A via UPR an- tecipatória é ativada na ausência de proteínas não dobradas e antecipa as necessidades futuras de nova capacidade de dobramento de proteí- nas (Figura 32).

[00118] Parainduzira hiperativação letal da resposta da proteína não dobrada, -105 se liga à ERa nas células de câncer. Isso leva à ativação da fosfolipase C y (PLCy), PLCy ativada enzimaticamente produz trifos- fato de inositol (IP3). O IP3 se liga e abre os canais de cálcio do receptor de IP3 do retículo endoplasmático no EnR. A abertura dos canais de cálcio por IP3R resulta em um efluxo muito rápido de cálcio armazenado na luz (interior) do retículo endoplasmático no corpo celular. Isso hipe- rativa UPR. Quando ativada, um braço da UPR, o braço de PERK, inibe a síntese de proteínas. A ativação de outro braço de UPR, IRE1a, induz a formação do spliced ativo do MRNA que codifica o fator de transcrição XBP-1 (spXBP-1). Para restaurar a homeostase do cálcio, as poderosas bombas SERCA na membrana do retículo endoplasmático realizam o bombeamento dependente de ATP de cálcio do corpo celular para o interior do EnR. Como os canais de cálcio IP;?R permanecem abertos, o cálcio bombeado para a luz do EnR volta a vazar. Isso cria um ciclo fútil que esgota o ATP intracelular.

[00119] Marcadores e Inibidores de UPR: A formação de mRNA de SpXBP-1 é usada como um marcador para a ativação de UPR. A molé- cula pequena amplamente utilizada 2-APB bloqueia IP3Rs e evita o efluxo de cálcio e a hiperativação de UPR. A molécula pequena de tap- sigargina (THG) inibe potentemente as bombas SERCA e impede que a célula gaste seus estoques de ATP.

[00120] Em um tratamento e estudo de tumor em camundongo con- trolado por veículo, as células de câncer de mama humano foram mani- puladas para conter a mutação letal ERaY537S encontrada no câncer de mama metastático e o gene para a luciferase do vagalume - quando o produto químico apropriado é adicionado, a luciferase do vagalume decompõe o química e a luz é produzida. Usando um detector sensível chamado sistema de imagem, isso nos permite visualizar os tumores dentro de camundongos vivos. Isso é chamado de imagem biolumines- cente ou BLI. Tumores grandes foram deixados se formar. Em seguida, (-)-105 foi injetado diariamente sob a pele durante três semanas.

Usando o sistema de imagem, o efeito de (-)-105 nos tumores foi moni- torado. Ao mesmo tempo, o efeito do veículo no qual (-)-105 foi dissol- vido em tumores também foi monitorado. Esses tumores foram tratados de forma idêntica, exceto pelo fato de não terem recebido o medica- mento de teste (-)-105.

[00121] Aimagem na Figura 17 mostra um dos tumores de controle injetado com veículo no final do estudo em uma comparação lado a lado com 4 dos 5 camundongos tratados com (-)-105 (o gerador de imagem só pode fotografar 5 camundongos de uma vez). A Tabela 1 mostra a luz emitida pelos tumores. Em um xenoenxerto de camundongo, (-) 105 induz uma regressão rápida e profunda de grandes tumores de mama resistentes à terapia. Mesmo que os tumores na Figura 17 não possam ser visualizados, aumentando muito o tempo de exposição e a sensibi- lidade, os pequenos números de células emissoras de luz nos camun- dongos tratados podem ser visualizados (Figura 34).

[00122] Foi realizado um estudo para determinar o que acontece após interromper o tratamento com (-)-105 (Tabela 2). O estudo foi de- senhado para mostrar se os micro-tumores permaneceriam dormentes ou se eles voltariam a crescer. No final das três semanas de tratamento, há material residual que emite uma pequena quantidade de luz, que são denominados "micro-tumores". Com base na sensibilidade do sistema de imagem, é considerado que esses micro-tumores contenham de 0 a — 1.000 células de câncer; os micro-tumores não serão visíveis a olho nu. Vê-los requer um poderoso sistema de imagem ou um microscópio. Para testar se essas células estão mortas ou não se dividem mais e estão dormentes, as células duas e 4 semanas após terem parado de receber qualquer tratamento foram fotografadas. Este estudo testou se as células de câncer em crescimento tinham sido erradicadas; este es- tudo continua.

[00123] Aimagem bioluminescente (BLI) usando luciferase mostra a quase erradicação de tumores de mama resistentes à terapia em ca- mundongos na imagem lado a lado de um camundongo de controle inje- tado com veículo e 4 de 5 camundongos tratados com (-)-105 (Figura 17). Em um estudo de 3 semanas, grandes tumores de mama estavam pre- sentes no início do tratamento e regrediram conforme mostrado na ima- gem da Figura 17. O estudo foi realizado usando Orthotopic TYS-Luc (cé- lulas injetadas: células de câncer de mama humano T47DERaY537- Luc), por exemplo, a mutação de ERa mais letal em humanos em câncer de mama metastático.

Os tumores foram cultivados em camundongos NSG.

Mais detalhes são fornecidos nos Exemplos.

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[00124] Osistemade imagem usado é mais sensível e capaz de cap- tar números pequenos de células tumorais do que os sistemas de me- dida padronizados, tais como os paquímetros que medem o tamanho do tumor ou a pesagem dos tumores depois da dissecção deles dos camundongos. Tabela 2. Sem recrescimento de micro-tumores 4 semanas depois da paralisação do tratamento com (-)-105 Grupo | Camundongo | Fluxo de Recupe- | Início sem Fár- Semana 2 ração Inicial (mi- maco: % Alteração | Fluxo no Tumor Sem lhões de fó- no Fluxo do Tumor | Fármaco (milhões de tons/seg) fótons/seg) Do 0.051 007 Dos 99,04 105 29,81 6105 Fase o 105 0,046 99,997 po Tabela 2 —continuação- Grupo | Camundongo | Semana 2 Semana 4 Semana 4 % Alteração no | Fluxo no Tumor Sem % Alteração no Fluxo do Tumor | Fármaco (milhões de Fluxo do Tumor Sem Fármaco fótons/seg) Sem Fármaco ()-105 -99,991 0,038 -99,998 ()-105 -99,95 0,038 -99,98 0105 29,88 Eos [151 o o o 0105 0008 29,097

[00125] — Achados importantes nos estudos mostraram o seguinte: (a) (-)-105 destruiu rápida e dramaticamente os tumores. De- pois de apenas três dias, os tumores em todos os 5 ratos encolheram ou regrediram, em mais do que 99%. Quatro dos cinco tumores enco- lheram em mais do que 99,9%.

(b) No final do estudo de três semanas, não havia tumor detec- tável em um camundongo (o tumor foi erradicado; -100%), os tumores nos outros quatro camundongos foram quase erradicados, com dois deles muito próximos do limite que o sistema de imagem pode detectar.

(c) Duas semanas após o tratamento ser interrompido, os micro-tumores não começaram a crescer novamente. Dois dos cinco ra- tos não tinham tumores detectáveis (o tumor foi erradicado; -100%), dois diminuíram muito pouco e um aumentou muito pouco (d) No geral, os tumores tratados com veículo de controle continuaram a crescer. A dramática regressão do tumor foi observada, portanto, devido à administração do medicamento de teste (-)-105.

(e) Usando paquímetros para medir o tamanho do tumor, os tumores em todos os 5 camundongos encolheram, (regrediram) para indetectáveis após apenas 3 dias de tratamento com (-)-105.

(f) No geral, a saúde dos camundongos tratados com (-)-105 era boa. Sem toxicidade.

Métodos Sintéticos Gerais

[00126] A invenção também se refere a métodos de preparação dos compostos e composições da invenção. Os compostos e composições podem ser preparados por qualquer uma das técnicas aplicáveis de sín- tese orgânica, por exemplo, as técnicas aqui descritas. Muitas dessas técnicas são bem conhecidas. Entretanto, muitas das técnicas conhe- cidas são elaboradas em Compendium of Organic Synthetic Methods (John Wiley & Sons, New York), Vol. 1, lan T. Harrison e Shuyen Harri- son, 1971; Vol. 2, lan T. Harrison e Shuyen Harrison, 1974; Vol. 3, Louis S. Hegedus e Leroy Wade, 1977; Vol. 4, Leroy G. Wade, Jr., 1980; Vol. 5, Leroy G. Wade, Jr., 1984; e vol. 6, Michael B. Smith; asim como textos de referência padronizados, tais como Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 5th Ed por M.B. Smith e J. March (John Wiley & Sons, New York, 2001), Comprehensive Organic Synthe- sis; Selectivity, Strategy & Efficiency in Modern Organic Chemistry, em 9 Volumes, Barry M. Trost, Ed.-in-Chief (Pergamon Press, New York, impressão de 1993)); Advanced Organic Chemistry, Parte B: Reactions and Synthesis, Second Edition, Cary e Sundberg (1983); Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Greene, TW e Wutz,

PGM, John Wiley & Sons, Nova York; e Comprehensive Organic Trans- formations, Larock, RC, Second Edition, John Wiley & Sons, New York (1999). Cary e Sundberg (1983); Protecting Groups in Organic Synthe- sis, Second Edition, Greene, TW e Wutz, PGM, John Wiley & Sons, Nova York; e Comprehensive Organic Transformations, Larock, RC, Se- gunda Edição, John Wiley & Sons, New York (1999).

[00127] Vários métodos exemplificadores para a preparação dos compostos da invenção são fornecidos abaixo. Esses métodos têm como objetivo ilustrar a natureza de tais preparações e não pretendem limitar o escopo dos métodos aplicáveis.

[00128] Geralmente, as condições de reação, tais como temperatura, tempo de reação, solventes, procedimentos de processamento e seme- lhantes, serão aquelas comuns na técnica para a reação particular a ser realizada. O material de referência citado, juntamente com o material aí citado, contém descrições detalhadas de tais condições. Tipicamente, as temperaturas serão de -100ºC a 200ºC, os solventes serão apróticos ou próticos dependendo das condições necessárias e os tempos de re- ação serão de 1 minuto a 10 dias. O processamento consiste tipica- mente em extinguir quaisquer reagentes não reagidos, seguido pelo fra- cionamento entre um sistema de água/camada orgânica (extração) e separação da camada que contém o produto.

[00129] —Asreações de oxidação e redução são tipicamente realizadas em temperaturas próximas da temperatura ambiente (cerca de 20ºC), em- bora para reduções de hidreto de metal frequentemente a temperatura seja reduzida para 0ºC a -100ºC. O aquecimento também pode ser usado quando apropriado. Os solventes são tipicamente apróticos para reduções e podem ser próticos ou apróticos para oxidações. Os tempos de reação são ajustados para alcançar as conversões desejadas.

[00130] —Asreações de condensação são normalmente realizadas em temperaturas próximas da ambiente temperatura, embora para conden- sações cineticamente controladas não equilibradas, temperaturas redu- zidas (0ºC a -100ºC) também sejam comuns. Os solventes podem ser pró- ticos (comuns em reações de equilíbrio) ou apróticos (comuns em reações cineticamente controladas). Técnicas sintéticas padronizadas, tais como a remoção azeotrópica de subprodutos da reação e o uso de condições de reação anidras (por exemplo, ambientes em gás inerte) são comuns na técnica e serão aplicadas quando aplicável.

[00131] Grupos Protetores. A expressão "grupo de proteção" se re- fere a qualquer grupo que, quando ligado a uma hidroxila ou outro he- teroátomo, evita que reações indesejadas ocorram neste grupo e que pode ser removido por etapas químicas ou enzimáticas convencionais para restabelecer o grupo hidroxila. O grupo de proteção removível par- ticular empregado nem sempre é crítico e os grupos de bloqueio de hi- droxila removíveis preferidos incluem substituintes convencionais, tais como, por exemplo, alila, benzila, acetila, cloroacetila, tiobenzila, benzi- lideno, fenacila, metilmetoxila, éteres de silila (por exemplo, trimetilsilila ( TMS), t-butil-difenilsilila (TBDPS) ou t-butildimetilsilila (TBS)) e qual- quer outro grupo que possa ser introduzido quimicamente em uma fun- cionalidade hidroxila e mais tarde seletivamente removido por métodos químicos ou enzimáticos em condições moderadas compatíveis com a natureza do produto.

[00132] Os grupos de proteção de hidroxila adequados são conheci- dos por aqueles versados na técnica e descritos com mais detalhes em TW Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis; Wiley: New York, 1981 ("Greene") e as referências aí citadas, e Kocienski, Philip J.; Pro- tecting Groups (Georg Thieme Verlag Stuttgart, Nova York, 1994), am- bos aqui incorporados por referência.

[00133] Os grupos de proteção estão disponíveis, comumente co- nhecidos e usados e são opcionalmente usados para prevenir reações colaterais com o grupo protegido durante os procedimentos de síntese, isto é, vias ou métodos para preparar os compostos pelos métodos da invenção. Na maior parte, a decisão sobre quais grupos proteger, quando fazê-lo e a natureza do grupo de proteção química "PG" depen- derá da química da reação a ser protegida contra (por exemplo, ácido, básico, oxidativo, condições redutivas ou outras) e a direção pretendida da síntese. Esquema 1. Síntese de (+) 105 e (-) 105. ocr, O oH FCO oct, om e x LIT O Qo neu TOM Gt (O O — (O o N THE. N CcH.Chz. ta, n CF, SR tn Cr, 50% em duas etapas (2)-105 Fo Fo FcO QE” Q" Q" SS ssa O O Cr = Qro + (LD K N ns CF, e, cr, (2)-105 ()105 (+)-105 fa) =-134 laj=nd. Esquema 2. Via sintética geral para a síntese dos compostos 1 a 6. oras » O Que Meo nã oH o Te o SOS O CR O 7661 1a om Fr ú THE K o E x tal6n x x x xe crnámeiia x rendimento mena CG 17 OH a 2 CH 6% Ttrifluormetilisatina CF, 3 CFs 35% 4 CF, 6% Sentimento divs claças oc,

O OH ECO oc, or

XY ROO QO neu Tou Coro = IS E (CI N THF. N CH.Ck. ta. N 78'Cto ta, H 1h Li x 1h x x x x — rendimento x rendimento Tm OA TF Mem 6 OM sm Esquema 3. Síntese dos compostos 7 e 8.

oH or, ou ro co ocr Ô oh io Mari, 1 O e O QO refiux, tn o o TIOM “ a, soro |O Y ÇA O o EI ao Cu em VE dlanos .

[00134] Os Esquemas 1a;3 mostram a síntese geral dos compostos aqui descritos, tais como os compostos do Esquema 4. As condições experimentais detalhadas são fornecidas nos Exemplos.

[00135] Esquema 4. Estruturas dos compostos sintetizados pelos Esquemas 1 a3. Racêmico HCO H.CO F.CO F,CO Fac QT" QE" QT" QE" QT” CH CF, CH. CF, Me 2 4 6 (2)-105 8 Enantiômeros rs neo Fea Rca, Fa Ox Ox O x Ox OQ

E CH CFa es E me (S)-2 (S)-4 (S)-6 (8)-105 (S)8 na o o o no O O 00H. O O 0H, O O 00, O O cr, O O cr,

E e cn en cr É me (R)-2 (R-4 (R)-6 (R)-105 (R)-8 Base dos Ensaios de Morte de Células de Câncer

[00136] TRYPAN BLUE: Durante décadas, as células viáveis foram medidas por sua capacidade de excluir o corante Trypan Blue. As célu- las com membranas intactas não absorvem o Trypan Blue. As células mortas, que perderam a integridade da membrana, absorvem o corante e ficam azuis. Assim, o percentual de células mortas é o percentual de células que são positivas para o Trypan Blue na população total de cé- lulas. A avaliação quantitativa da captação de Trypan Blue usa um con-

tador de células da Fisher. Uma vez que o ensaio é baseado em instru- mentos, não há tendência do observador na determinação do percen- tual de células positivas para Trypan Blue.

[00137] ENSAIO COM ALAMAR BLUE/RAPTINAL: As células vivas mantêm um ambiente redutor. O ingrediente permeável a célula não flu- orescente de Alamar Blue& (resazurina) é absorvido pelas células. Em células vivas, é reduzido ao composto fluorescente resorufina. Usando uma curva padronizada de número de células versus fluorescência, o número de células vivas em uma amostra de teste pode ser determi- nado. Em altas concentrações, o raptinal mata 100% das células. O ve- íÍculo em que o composto de teste é dissolvido não é tóxico. Assim, após subtrair o branco para o meio sozinho, a leitura de fluorescência para o veículo corresponde a 100% de células viáveis e o sinal para raptinal corresponde a 0% de células viáveis. Embora este ensaio forneça uma medição menos direta da morte celular do que o ensaio de trypan blue, ele é mais facilmente escalonado para um grande número de amostras.

[00138] CITOMETRIA DE FLUXO (FITC): As células que morrem exibem alterações específicas que podem ser monitoradas usando um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). Uma dessas mudanças é a perda da polaridade da membrana plasmática. Isso é mo- nitorado usando Anexina V. As células mortas também absorvem o co- rante iodeto de propídio. O iodeto de propídio (PI) apresenta fluorescên- cia quando é intercalado em DNA. Esses ensaios monitoram células em estágios específicos de morte celular. Por exemplo, as células que estão mortas e cujo DNA foi destruído e está em pedaços tão pequenos que não absorve mais PI estão mortas, mas não são mais vistas como PI positivas. Execução e condições de ensaio

[00139] ENSAIOS COM TRYPAN BLUE: Os ensaios são realizados em células em placas de 6 poços: 300.000 células são colocadas em cada poço de uma placa de 6 poços em 3 ml de meio. Após 24 horas, o veículo DMSO ou o composto indicado é adicionado (em 1000º do vol.). As células são incubadas por mais 24 horas e então coletadas em 0,25 ml de tripsina, seguido após a coleta por 0,75 ml de meio. As células são giradas para baixo e ressuspensas em 100-200 ul de meio restante que fica sobre o pélete celular (ressuspender as células pipetando para cima e para baixo algumas vezes). Adicione 10 ul a 10 ul de Trypan blue. Em seguida, 10 ul são inseridos na lâmina de contagem. Depois de inserir a lâmina no Fisher TC20, a contagem é automática (essas muitas células são necessárias porque uma proporção precisa de célu- las positivas para Trypan blue com células negativas para Trypan blue requer cerca de 200 células no campo para a contagem do instrumento).

[00140] ENSAIOS COM ALAMAR BLUE/RAPTINAL: As células fo- ram plaqueadas a 4.000-10.000 células/poço (placa de 96 poços), ge- ralmente em 50 ul de meio. Após cerca de 18 horas, um adicional de 50 ul de meio contendo 2X a concentração final desejada do composto de teste (C-105) foram adicionados a cada poço. Após 24 horas, o reagente Alamar Blue foi adicionado e a fluorescência nos poços foi lida (BMG PhERaStar ou Molecular Devices Spectra Max M3 Microplate Reader). O % de morte relativa foi determinado pela definição da leitura para cé- lulas tratadas com raptinal para 100% de células mortas e a leitura para células tratadas com veículo para 0% de células mortas.

[00141] ENSAIOS DE CITOMETRIA DE FLUXO (FITC): As células foram semeadas em placas de 12 poços, 75.000 células/poço e deixa- das aderir durante a noite. No dia seguinte, as concentrações indicadas de raptinal (controle positivo), (-)-105, (+)-105 e (+)-105 foram adiciona- das e incubadas a 37ºC por 24 horas (Volume final: 1 ml, 0,1% DMSO). Após a incubação, as células foram coletadas e ressuspensas em 350 ul de tampão de ligação de Anexina frio (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM, pH 7,4) pré-misturado com Anexina V-FITC e corantes

PI. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo BD Biosci- ences LSRII e a análise de dados foi realizada usando FSC Express Versão 5-6. A morte celular foi avaliada em relação a um controle tra- tado com DMSO. Linhagens celulares usadas como alvo terapêutico: células de câncer de mama positivas para ERa

[00142] TDGeTDG-LUC (T47DERaD538G clone 1): Ambas as có- pias do gene de ERa de tipo selvagem substituídas pela mutação ERaD538G observada no câncer de mama metastático. Essas células crescem sem estrogênio, com um aumento modesto na taxa de cresci- mento com a adição de estrogênio. Resistência substancial a z-OHT (a forma ativa de tamoxifeno) e fulvestrant//Faslodex/ICI 182.780. Discre- tamente menos resistente a z=-OHT e fulvestrant/ICI do que as células ERaY537S. ERAD538G é a mutação mais comum no câncer de mama metastático. Portanto, essas células são essenciais para o teste. Célu- las (TDG-LUC) TDG transfectadas de forma estável para expressar lu- ciferase de pirilampo. A transcrição do gene da luciferase é conduzida por um promotor de CMV constitutivamente ativo.

[00143] TYSeTYS-LUC (T47DERaY537S CLONE 4): Ambas as có- pias do gene de ERa de tipo selvagem substituídas pela mutação ERaY537S observada no câncer de mama metastático. Crescimento rá- pido sem estrogênio. Sem estimulação de crescimento adicional por es- trogênio. Resistência substancial a z=-OHT e fulvestrant/ICI. Discreta- mente mais resistente aos medicamentos atuais do que as células ERaD538G. Esta é a mutação mais letal no câncer de mama metastá- tico. Células (TYS-Luc) TYS estavelmente transfectadas para expressar a luciferase do pirilampo. A transcrição do gene da luciferase é condu- zida por um promotor de CMV constitutivamente ativo.

[00144] T47D: Positiva para ERa, requer estrogênio para crescer,

sensível az-OHT e fulvestrant/ICI; linhagem celular parental, ampla- mente utilizada, mas menos comum do que as células MCF-7. Os níveis mais baixos de ERa em células T47D, em comparação com as células MCF-7, estão mais alinhados com os níveis de ERa em cânceres de mama reais. As células T47D foram testadas em parte porque as células T47D requerem concentrações mais altas de BHPI para inibir a prolife- ração e matar do que as duas linhagens celulares que expressam ERa mutante.

[00145] MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) Positiva para ERa, a linhagem de célula de câncer de mama positiva para ERa mais am- plamente usada. Estrogenio estimula acentuadamente seu crescimento; sensível a z-OHT e fulvestrant/ICI.

[00146] ECC-1: células de câncer de útero positivas para ERa.

[00147] Caov3: Células de câncer de ovário positivas para ERa re- sistentes a medicamentos. BHPI bloqueia o crescimento das células Caov-3, mas não as mata. Estas células são completamente resistentes ao tamoxifeno e fulvestrant e parcialmente resistentes à cisplatina e pa- clitaxel. Células negativas para ERa usadas para testar a toxicidade e efeitos fora do alvo.

[00148] HeLa: Estas são células negativas para ERa de origem cer- vical. A linhagem de células humanas mais amplamente utilizada.

[00149] Células MDA-MB-231: Estas são células negativas para ERa e são o modelo mais comum para câncer de mama triplo negativo. Al- tamente metastático. Essas células são usadas porque, neste trabalho, elas são mais sensíveis à inibição não específica do crescimento do que a maioria das outras linhagens celulares. Elas são, portanto, um teste rigoroso de toxicidade não específica.

[00150] MCF-10A (Michigan Cancer Foundation-10 A): Linhagem ce- lular de mama negativa para ERa imortal, mas não tumorigênica.

Estatísticas

[00151] Salvo indicação em contrário, existem pelo menos 3 replica- tas biológicas de cada amostra (n = 3). Os dados são apresentados como a média das repetições + S.E.M. Para significância estatística, as comparações são para as células tratadas com o veículo em compara- ção com as células tratadas com a mesma concentração de 105, BHPI ou outros compostos, em que P<0,05; ** P<0,01; *** P< 0,001 todos usando o teste T de Student. Formulações Farmacêuticas

[00152] Os compostos aqui descritos podem ser usados para prepa- rar composições farmacêuticas terapêuticas, por exemplo, pela combi- nação dos compostos com um diluente, excipiente ou veículo farmaceu- ticamente aceitáveis. Os compostos podem ser adicionados a um veí- culo na forma de um sal ou solvato. Por exemplo, nos casos em que os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais áci- dos ou básicos não tóxicos estáveis, a administração dos compostos como sais pode ser apropriada. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são sais de adição de ácido orgânico formados com ácidos que formam um àânion fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzo- ato, ascorbato, a-cetoglutarato e B-glicerofosfato. Sais inorgânicos ade- quados também podem ser formados, incluindo sais de cloridrato, ha- leto, sulfato, nitrato, bicarbonato e carbonato.

[00153] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos usando procedimentos padronizados bem conhecidos na técnica, por exemplo, fazendo reagir um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com um ácido adequado para fornecer um composto iônico fisiologicamente aceitável. Os sais de metais alcalinos (por exemplo, só- dio, potássio ou lítio) ou metais alcalino-terrosos (por exemplo, cálcio)

de ácidos carboxílicos também podem ser preparados por métodos aná- logos.

[00154] Os compostos das fórmulas aqui descritas podem ser formu- lados como composições farmacêuticas e administrados a um hospe- deiro mamífero, tal como um paciente humano, em uma variedade de formas. As formas podem ser especificamente adaptadas a uma via de administração escolhida, por exemplo, administração oral ou parenteral, por via intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea.

[00155] Os compostos aqui descritos podem ser administrados sis- temicamente em combinação com um veículo farmaceuticamente acei- tável, tal como um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. Para administração oral, os compostos podem ser encerrados em cáp- sulas de gelatina dura ou mole, prensados em comprimidos ou incorpo- rados diretamente no alimento da dieta de um paciente. Os compostos também podem ser combinados com um ou mais excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e semelhantes. Essas composições e preparações contêm tipicamente pelo menos 0,1% do composto ativo. O percentual das composições e preparações pode va- riar e pode estar convenientemente entre cerca de 0,5% a cerca de 60%, cerca de 1% a cerca de 25%, ou cerca de 2% a cerca de 10%, do peso de uma dada forma de dosagem unitária. A quantidade de com- posto ativo em tais composições terapeuticamente úteis pode ser tal que um nível de dosagem eficaz pode ser obtido.

[00156] Os comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter um ou mais dos seguintes: aglutinantes, tais como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; um agente desintegrante, como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; e um lubrificante como o estearato de magnésio. Um agente edulcorante tal como sacarose,

frutose, lactose ou aspartame; ou um agente flavorizante, tal como hor- telã-pimenta, óleo de gaultéria ou aroma de cereja, pode ser adicionado. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo vege- tal ou um polietilenoglicol. Vários outros materiais podem estar presen- tes tais como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou as cápsulas podem ser revestidas com gelatina, cera, goma- laca ou açúcar e semelhantes. Um xarope ou elixir pode conter o com- posto ativo, sacarose ou frutose como agente edulcorante, metil e propil parabenos como conservantes, um corante e aromatizante, como cereja ou laranja. Qualquer material usado na preparação de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e substanci- almente não tóxico nas quantidades empregadas. Além disso, o com- posto ativo pode ser incorporado em preparações e dispositivos de libe- ração sustentada.

[00157] O composto ativo pode ser administrado por via intravenosa ou intraperitoneal por infusão ou injeção. Soluções do composto ativo Ou seus sais podem ser preparadas em água, opcionalmente mistura- das com um tensoativo não tóxico. As dispersões podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, triacetina ou suas misturas, ou em um óleo farmaceuticamente aceitável. Em condições normais de armazenamento e uso, as preparações po- dem conter um conservante para prevenir o crescimento de microrga- nismos.

[00158] As formas de dosagem farmacêutica adequadas para inje- ção ou infusão podem incluir soluções aquosas estéreis, dispersões ou pós estéreis que compreendem o ingrediente ativo adaptado para a pre- paração extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis ou infusí- veis estéreis, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. A forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável nas condições de fabri- cação e armazenamento. O transportador ou veículo líquido pode ser um solvente ou meio de dispersão líquido que compreende, por exem- plo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polie- tileno glicóis líquidos e semelhantes), óleos vegetais, ésteres glicerílicos não tóxicos e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, ou pela uti- lização de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e/ou antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e se- melhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção pro- longada das composições injetáveis pode ser provocada por agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e/ou gelatina.

[00159] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo- rando o composto ativo na quantidade necessária no solvente apropri- ado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme ne- cessário, opcionalmente seguido por esterilização por filtração. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação podem incluir técnicas de secagem a vácuo e de liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado presente na solução.

[00160] Para administração tópica, os compostos podem ser aplica- dos na forma pura, por exemplo, quando são líquidos. No entanto, será geralmente desejável administrar o agente ativo à pele como uma com- posição ou formulação, por exemplo, em combinação com um veículo dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido, um líquido, um gel ou semelhantes.

[00161] Os veículos sólidos úteis incluem sólidos finamente dividi- dos, tais como talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina e semelhantes. Os veículos líquidos úteis incluem água, dimetilsulfóxido (DMSO), álcoois, glicóis ou misturas de água-álcool/glicol, em que um composto pode ser dissolvido ou disperso em níveis eficazes, opcional- mente com o auxílio de tensoativos não tóxicos. Adjuvantes tais como fragrâncias e agentes antimicrobianos adicionais podem ser adiciona- dos para otimizar as propriedades para um determinado uso. As com- posições líquidas resultantes podem ser aplicadas a partir de almofadas absorventes, usadas para impregnar ataduras e outros curativos, ou pul- verizadas sobre a área afetada usando um tipo de bomba ou pulveriza- dor de aerossol.

[00162] Espessantes, tais como polímeros sintéticos, ácidos graxos, sais de ácidos graxos e ésteres, álcoois graxos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados também podem ser empregados com veículos líquidos para formar pastas para espalhar, géis, pomadas, sa- bões e semelhantes, para aplicação direta na pele do usuário.

[00163] “Exemplos de composições dermatológicas para distribuição de agentes ativos na pele são conhecidos na técnica; por exemplo, ver as Patentes US Nos. 4.992.478 (Geria), 4.820.508 (Wortzman),

4.608.392 (Jacquet et al) e 4.559.157 (Smith et al). Essas composições dermatológicas podem ser usadas em combinações com os compostos aqui descritos, onde um ingrediente de tais composições pode ser opci- onalmente substituído por um composto aqui descrito, ou um composto aqui descrito pode ser adicionado à composição.

[00164] As dosagens úteis dos compostos aqui descritos podem ser determinadas pela comparação da sua atividade in vitro e a atividade in vivo em modelos com animais. Os métodos para a extrapolação de do- sagens eficazes em camundongos e outros animais para humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, ver Patente US No. 4.938.949

(Borch et al). A quantidade de um composto, ou um sal ativo ou derivado do mesmo, necessária para uso no tratamento irá variar não apenas com o composto ou sal específico selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada e a idade e con- dição do paciente e, em última análise, ficará a critério de um médico ou clínico assistente.

[00165] Em geral, no entanto, uma dose adequada estará na faixa entre cerca de 0,5 a cerca de 100 mg/kg, por exemplo, entre cerca de a cerca de 75 mg kg de peso corporal por dia, tal como 3 a cerca de 50 mg por quilograma peso corporal do receptor por dia, preferivelmente na faixa de 6 a 90 mg/kg/dia, mais preferivelmente na faixa de 15 a 60 mg/kg/dia.

[00166] O composto é convenientemente formulado na forma de do- sagem unitária; por exemplo, contendo 5 a 1000 mg, convenientemente 10 a 750 mg, mais convenientemente, 50 a 500 mg do ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. Em uma modalidade, a invenção for- nece uma composição que compreende um composto da invenção for- mulado em tal forma de dosagem unitária.

[00167] O composto pode ser convenientemente administrado em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, contendo 5 a 1000 mg/m?, convenientemente 10 a 750 mg/m?, mais convenientemente, 50 a 500 mg/m? de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. A própria sub-dose pode ser ainda dividida, por exemplo, em várias administra- ções distintas com espaçamento livre.

[00168] A dose desejada pode ser convenientemente apresentada em uma dose única ou como doses divididas administradas em interva-

los apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub-do- ses por dia. A própria sub-dose pode ser ainda dividida, por exemplo, em várias administrações distintas com espaçamento livre; tal como ina- lações múltiplas de um insuflador ou pela aplicação de uma pluralidade de gotas no olho.

[00169] Os compostos aqui descritos podem ser agentes antitumo- rais eficazes e têm maior potência e/ou toxicidade reduzida em compa- ração com BHPI. Preferivelmente, os compostos da invenção são mais potentes e menos tóxicos do que o BHPI e/ou evitam um local potencial de metabolismo catabólico encontrado com o BHPI, isto é, têm um perfil metabólico diferente do BHPI.

[00170] A invenção fornece métodos terapêuticos de tratamento de câncer em um mamífero, que envolvem a administração a um mamífero com câncer de uma quantidade eficaz de um composto ou composição aqui descritos. Um mamífero inclui um primata, humano, roedor, canino, felino, bovino, ovino, equino, suíno, caprino, bovino e semelhantes. Câncer se refere a qualquer tipo de neoplasma maligno, por exemplo, câncer de cólon, câncer de mama, melanoma e leucemia e, em geral, é caracterizado por uma proliferação celular indesejável, por exemplo, crescimento desre- gulado, falta de diferenciação, invasão de tecido local e metástase.

[00171] —Acapacidade de um composto da invenção para tratar o cân- cer pode ser determinada usando ensaios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o projeto de protocolos de tratamento, avaliação de toxicidade, análise de dados, quantificação de mortes de células tumorais e o signifi- cado biológico do uso de rastreamentos de tumor transplantáveis são co- nhecidos. Além disso, a capacidade de um composto para tratar o câncer pode ser determinada usando os testes conforme descrito abaixo.

[00172] Os exemplos a seguir se destinam a ilustrar a invenção acima e não devem ser interpretados como estreitando o seu âmbito. Um especialista na técnica reconhecerá prontamente que os Exemplos sugerem muitas outras maneiras pelas quais a invenção pode ser prati- cada. Deve ser entendido que numerosas variações e modificações po- dem ser feitas enquanto permanecem dentro do escopo da invenção. Formatar subtítulos abaixo conforme original da pag 38 Exemplo 1. Procedimentos sintéticos

[00173] Informação Geral: Salvo indicação em contrário, todos os reagentes foram adquiridos de fontes comerciais e usados sem seca- gem ou purificação adicional. Os solventes usados aqui foram secos após serem passados através de colunas de alumina ativada. Todas as reações foram realizadas em vidro seco por chama sob uma pressão positiva de gás nitrogênio. Os experimentos de *H RMN e 1ºC RMN fo- ram conduzidos em uma criossonda Bruker a 500 MHz e 188 MHz, res- pectivamente. Os espectros obtidos em CD3OD foram referenciados para 3,31 ppm e 49,00 ppm para espectros de *'H e *?ºC RMN, respecti- vamente. As multiplicidades de RMN são relatadas como: s = singleto, d = dubleto, t = tripleto, q = quarteto, m = multipleto. As multiplicidades de *ºC são todas singletos, a menos que indicado de outra forma.

ov 2 o Átia E x tanén x x x x T.otiuomenisatna. CF à: <4) é

[00174] Procedimento A: Um frasco de fundo redondo foi carregado com o brometo de fenila desejado (3,08 mmol) e dissolvido em THF (3,0 mL). A mistura de reação foi resfriada para -78ºC e uma solução de n- BuLi (2,77 mmol, 1,7 mL) foi adicionada por gotejamento ao longo de 10 minutos. A reação foi agitada durante 1 hora. Em outro frasco, a isatina desejada (1,54 mmol) foi adicionada e dissolvida em THF (9,4 mL). Esta solução de isatina foi adicionada ao frasco de reação por gotejamento durante 10 minutos. A mistura resultante foi agitada a -78ºC durante 1 hora, aquecida até a temperatura ambiente e depois agitada durante 1 hora. A reação foi extinta com água (10 mL). A solução foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. O óleo resul- tante foi corrido através de um tampão de sílica (gradiente de solvente de eluição: 10% de EtOAc/hexanos com subida para 100% de EtOAc). A espécie eluída foi então carregada em um frasco de fundo redondo, purgada com ar, colocada sob atmosfera de nitrogênio e dissolvida em THF (15,4 mL). Uma solução de fluoreto de tetra-n-butilamônio (5,4 mL) foi adicionada ao frasco de reação. Após 16 horas de agitação, a reação foi extinta com uma solução 1:1 de cloreto de amônio saturado aq:água (30 mL). A solução foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. OCF; o O E Co nBuLi O õ x 8 700% ta, L 8 pue—— —— 7-metilisatina = CH3 5

[00175] Procedimento B: Um frasco de fundo redondo foi carregado com o brometo de fenila desejado (3,35 mmol) e dissolvido em THF (2,8 mL). A mistura de reação foi resfriada para -78ºC e uma solução de n- BuLi (2,79 mmol, 1,8 mL) foi adicionada por gotejamento ao longo de 10 minutos. A reação foi agitada durante 1 hora. Em outro frasco, a isatina desejada (1,86 mmol) foi adicionada e dissolvida em THF (5,6 mL). Esta solução de isatina foi adicionada ao frasco de reação por gotejamento durante 10 minutos. A mistura resultante foi agitada a -78ºC durante 1 hora, aquecida até a temperatura ambiente e depois agitada durante 1 hora. A reação foi extinta com água (10 mL). A solução foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. O óleo resul- tante foi corrido através de um tampão de sílica (gradiente de solvente de eluição: 10% de EtOAc/ hexanos com subida para 100% de EtOAc).

OR RO or Ô O ao

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[00176] Procedimento C: Um frasco de fundo redondo foi carregado com o álcool terciário desejado (0,93 mmol) e o fenol desejado (4,2 mmol) e dissolvido em diclorometano (4,7 mL). A mistura de reação foi então colocada em um banho de gelo e ácido tríflico (TIOH, 0,42 mL) foi então adicionado por gotejamento. O frasco de reação foi removido do banho de gelo e agitado em temperatura ambiente durante 1 hora. À mistura de reação foi então vertida sobre bicarbonato de sódio cheio de gelo e a solução aquosa foi extraída com acetato de etila (3x). As cama- das orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. O óleo resultante foi então purificado por cro- matografia de coluna. oH 1 Cro x es,

[00177] 3-hidróxi-3-(4-hidroxifenil)-7-metilindolin-2-ona (1): Utili- zando o Procedimento Geral A, 1 foi isolado com rendimento de 45% durante as duas etapas. *H RMN (CD3OD, 500 MHz): 5 7,19 (d, J = 8,86

Hz 2H), 7,10 (d, J =7,59 Hz 1H), 7,02 (d, J = 7,46 Hz 1H), 6,96 (dd, J= 7,54 Hz, 7,49 Hz 1 H), 6,71 (d, J = 8,72 Hz 2H), 2,29 (s, 3H). 13C RMN (CD3OD, 188MHz): 5 182,20, 158,40, 141,39, 134,47, 132,71, 131,78, 128,23, 123,86, 123,48, 121,00, 115,93, 79,17, 16,58. H;CO > OH

O (xe

N CH;z 2

[00178] 3-(4-hidroxifenil)-3-(4-metoxifenil)-7-metilindolin-2-ona (2): Utilizando o Procedimento Geral C, 2 foi isolado com 83% de rendi- mento.*H RMN (CD3OD, 500 MHz) à: 7,12 (d, J = 8,93 Hz, 2H), 7,02 (m, 3H), 6,94 (m, 2H), 6,82 (d, J = 6,82 Hz, 2H), 6,69 (d, J = 8,74 Hz), 3,74 (s, 3H), 2,30 (s, 3H). 3C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 182,87, 160,24, 157,71, 140,70, 135,73, 135,65, 134,26, 130,58, 130,54, 130,38, 124,48, 123,51, 121,02, 116,02, 114,64, 63,36, 55,67, 16,81. HRMS (ESI): m/z calc, para Co2H2oNO;3 [M+H]* 346,1443, encontrado: 346,1442.

OH ro SO

N CF; S

[00179] 3-hidróxi-3-(4-hidroxifenil)-7-(trifluormetil)indolin-2-ona (3): Utilizando o Procedimento Geral A, 3 foi isolado com 35% de rendi- mento durante duas etapas. 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5: 7,54 (m, 1H), 7,43 (d, J = 7,49Hz 1H), 7,19 (m, 3H), 6,74 (d, J = 8,74 Hz, 2H). 13C RMN (CD3OD, 188MHz) 5: 181,60, 158,73, 140,54 (q, J = 2,25 Hz), 136,85, 131,80, 129,89, 128,89, 126,90 (q, J = 4,6 Hz), 125,16 (q, J =

270,76 Hz), 123,74, 116,16, 113,56 (q, J = 33,17 Hz), 77,66. H;CO

E (o

N CF;3 4

[00180] 3-(4-hidroxifenil)-3-(4-metoxifenil)-7-(trifluormetil)indolino-2- ona (4): Utilizando o Procedimento Geral C, 4 foi isolado com 82% de rendimento. 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) à: 7,50 (dd, J = 8,09 Hz, 0,62 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 7,76 Hz, 0,64 Hz, 1H), 7,18 (ddd, J = 8,08 Hz, 7,46 Hz, 0,87 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8,87 Hz, 2H), 7,01 (d, J = 8,76 Hz, 2H), 6,86 (d, J = 8,87 Hz, 2H), 6,72 (d, J = 8,75 Hz 2H), 3,77 (s, 3H). 13C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 182,24, 160,55, 158,10, 139,74 (m), 137,85, 134,73, 133,30, 130,98, 130,50, 130,49, 125,72 (q, J = 4,6 Hz, 125,23 (q, J = 270,71 Hz), 123,32, 116,27, 114,89, 113,55 (q, J = 33,50Hz), 62,12, 55,72. HRMS (ESI): m/z calc, for Co2H17NO3F3 [M+H]* 400,1161, encontrado: 400,1154. OCF; Ne

N CH; Ni

[00181] 3-hidróxi-7-metil-3-(4-(trifluormetóxi)fenil)indolin-2-ona (5): Utilizando o Procedimento Geral B, 5 foi isolado com 68% de rendi- mento durante duas etapas. 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5: 7,46 (d, J = 8,83 Hz 2H), 7,22 (dd, J = 1,02 Hz, 8,98 Hz, 2H), 7,13 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 2,31 (s, 3H). 13C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 181,41, 150,1 (q, J = 1,6Hz), 141,55, 141,46, 134,03, 132,19, 128,67, 124,13, 123,4, 121,90 (q, J = 255,61

Hz), 121,32, 79,04, 16,61. F3;CO QT” Cro

N

H CH; 6

[00182] 3-(4-hidroxifenil)-7-metil-3-(4-(trifluormetóxi)fenil)indolin-2- ona (6): Utilizando o Procedimento Geral C, 6 foi isolado com 59% de rendimento. 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5: 7,30 (d, J = 8,86Hz 2H), 7,20 (m, 2 H), 7,08 (m, 1H), 7,03 (d, J = 8,74 Hz, 2H), 6,99 (m, 2H), 6,72 (d, J = 8,73 Hz, 2H), 2,31 (s, 3H). 13C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 182,00, 158,02, 149,56 (q, J = 1,47 Hz), 143,12, 140,82, 134,85, 133,55, 131,22, 130,77, 130,56, 124,51, 123,73, 121,89 (q, J = 255,61 Hz), 121,78, 121,32, 116,23, 63,49, 16,82. HRMS (ES): m/z calc. para Co2H17NO3F3 [M+H]* 400,1161, encontrado: 400,1163. OCF; O OH F.CO OCF; oH 2 Y ROO Qo o nBuLi O o TIOH O o y THF. N CH,Cb, ta. N CF, TOR CF; A m CF 50% durante duas etapas (2)-105

[00183] Síntese de 3-(4-hidroxifenil)-3-(4-(trifluormetóxi)fenil)-7-(tri- fluormetil)indolin-2-ona (((+)-105):

[00184] Um frasco de fundo redondo foi carregado com 1-bromo- 4- (triluormetoxi benzeno (3,08 mmol) e dissolvido em THF (3,0 mL). À mistura de reação foi resfriada para -78ºC e uma solução de n-BuLi (2,77 mmol, 1,7 mL) adicionada por gotejamento ao longo de 10 minu- tos. A reação foi agitada durante 1 hora. Em outro frasco, a isatina de- sejada (1,54 mmol) foi adicionada e dissolvida em THF (9,4 mL). Esta solução de isatina foi adicionada ao frasco de reação por gotejamento durante 10 minutos. A mistura resultante foi agitada a -78ºC durante 1 hora, aquecida até a temperatura ambiente e depois agitada durante 1 hora. A reação foi extinta com água (10 mL). A solução foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. Um novo frasco de fundo redondo foi carregado com álcool terciário bruto e fenol (6,95 mmol) e dissolvido em diclorometano (7,7 mL). A mistura de reação foi então colocada em um banho de gelo e ácido tríflico (TIOH, 0,7 mL) foi então adicionado por gotejamento. O frasco de reação foi removido do banho de gelo e agitado em temperatura ambiente durante 1 hora. À mistura de reação foi então vertida em bicarbonato de sódio cheio de gelo e a solução aquosa foi extraída com acetato de etila (3x). As cama- das orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. O óleo resultante foi então purificado por cro- matografia em coluna. (+)-105 foi isolado com 50% de rendimento ao longo de duas etapas sintéticas. 1H RMN (CD3OD, 500 MHz) d: 7,54 (d, J = 7,95 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 7,48 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8,91 Hz 2 H), 7,22 (m, 3H), 7,03 (d, J = 8,85 Hz, 2H), 6,75 (d, J = 8,80 Hz, 2H). 13C RMN (CD3OD, 188 MHz) d: 181,35, 158,37, 149,81 (q, J = 1,78 Hz), 142,17, 139,84 (q, J = 2,29 Hz), 136,92, 132,65, 131,22, 131,06, 130,48, 126,12 (q, J = 4,58 Hz), 125,15 (q, J = 270,89 Hz), 123,55,121,88 (q, J = 255,84 Hz), 122,01, 116,48, 113,77 (q, J = 33,32 Hz), 62,22. HRMS (ESI): m/z calc. para C22H14NO3F6 [M+H]* 454,0878, encon- trado: 454,0878.

[00185] Separação quiral de (+)-105: (+)-105 foi separado em seus respectivos enantiômeros usando separação por HPLC quiral prepara- tiva (Lux& 5 uM Celulose-1, Coluna LC, 250 x 21,2 mm, AXIATY Packed, isocrática: 7% i-ProOH/hexanos). As frações coletadas forneceram (-)-

105 (pico A) e (+)-105 (pico B): Figura 5. Este método de separação quiral produz (-)-105 como um sólido branco (pureza enantiomérica => 99%, SºTaJcHeis = -14.6º (+ 0.1º)) e (+)-105 como um sólido branco (pu- reza enantiomérica = -98-99%, **alcxcia = -13.8º (+ 0.1º)) (veja o Exemplo 4). A determinação da pureza enantiomérica foi conduzida por coluna analítica de HPLC quiral: CHIRALPAKO |IB-3 (tamanho de partí- cula 3 uM, dimensões: 4,6 mm x 100 mm, método de separação, iso- crático 7,5% i-PrOH/hexanos) (Figura 6-8). OH OCF; CEE DA] o RO CO o o Í Me 2) H,SO, (conc.), & Me RN n-BulLi Cc N Cc refluxo, 30 min 708% me Me o 7 durante três etapas

[00186] 6-cloro-3-hidróxi-7-metil-3-(4-(trifluormetóxi)fenil)indo- lin-2-ona (7): Um frasco de reação foi carregado com anilina substituída (2,82 mmol), HCI 1M (2,82 mL) , água (18,8 mL), sulfato de sódio anidro (16,92 mmol) e cloridrato de hidroxilamina (9,17 mmol). A mistura foi aquecida até a ebulição e, em seguida, hidrato de cloral foi adicionado como uma porção. A reação foi mantida em refluxo durante 40 minutos, depois esfriada até refluir e a solução aquosa foi extraída com acetato de etila (3x). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sul- fato de sódio, filtradas e concentradas a vácuo. Ácido sulfúrico concen- trado (3 mL) foi então adicionado ao resíduo resultante. Esta solução foi aquecida a 80ºC durante 20 minutos e depois vertida sobre gelo. A mistura aquosa resultante foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas or- gânicas combinadas secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentra- das a vácuo. O sólido marrom-avermelhado obtido depois concentração mostrou-se pouco solúvel na maioria dos solventes orgânicos.

[00187] Emum novo frasco de reação, o brometo de fenila desejado (3,08 mmol) foi dissolvido em THF (3,0 mL). A mistura de reação foi resfriada para -78ºC e uma solução de n-BuLi (2,77 mmol, 1,73 mL) adicionada por gotejamento ao longo de 10 minutos. A reação foi agi- tada durante 1 hora. Em outro frasco, 6-cloro-7 metilisatina (1,54 mmol) foi adicionada e dissolvida em THF (9,4 mL). Esta solução de isatina foi adicionada ao frasco de reação por gotejamento durante 10 minutos. À mistura resultante foi agitada a -78ºC durante 1 hora, aquecida até a temperatura ambiente e depois agitada durante 1 hora. A reação foi ex- tinta com água (10 mL). A solução foi extraída com acetato de etila (3x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de só- dio, filtradas e concentradas a vácuo. O óleo resultante foi corrido atra- vés de um tampão de sílica (gradiente do solvente de eluição: 10% EtOAc/Hexanos com subida até 100% de EtOAc).

[00188] 7 foiisolado com rendimento de 24% ao longo de três etapas sintéticas. *'H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5: 7,46 (d, J = 8,85 Hz 2H), 7,23 (d, J = 7,98 Hz, 2H), 7,10 (d, J = 7,97 Hz 1H), 6,98 (d, J = 8,02 Hz, 1H), 2,35 (s, 3H). 13C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 181,25, 150,17 (q, J = 1,83 Hz), 143,14, 140,98, 136,68, 132,74, 128,63, 124,53, 124,40, 121,88 (q, J = 255,75 Hz), 121,86, 119,76, 78,91, 14,11. HRMS (ESI): m/z calc, for Ci8sHyNO3F3CINa [M+Na]* 380,0277, encon- trado: 380,0284. OH F;CO “o Õ OCF; Ô >? O OH O N o > O N o ce Á No, CHCh, n&o Cc TN 85%

[00189] 6-cloro-3-(4-hidroxifenil)-7-metil-3-(4-(trifluormetóxi)fe- nil)indolin-2-ona (8): Utilizando o Procedimento Geral C, 8 foi isolado com 85% de rendimento. *H RMN (CD3OD, 500 MHz) 5: 7,30 (d, J = 8,91 Hz 2H), 7,21 (m, 2H), 7,10 (d, J = 8,10 Hz, 1H), 7,02 (m, 4H), 6,73 (d, J = 8,80 Hz, 2H), 2,35 (s, 3H).

13C RMN (CD3OD, 188 MHz) 5: 181,81, 158,16, 149,67 (q, J = 2,02 Hz), 142,6, 142,38, 135,34, 133,50, 133,10, 131,18, 130,47, 125,48, 124,12, 121,89 (q, J = 255,49 Hz), 121,8, 119,66, 116,35, 63,45, 14,30. HRMS (ESI): m/z calc. para CooH1eNO3F3CI [M+H]* 434,0771, encon- trado: 434,0764. “o or OCF;

SD QO x Cr

N N CF; ? CF; ? (S)-105 (R)-105

[00190] Separação de enantiômeros de 105: Misturas racêmicas de 105 foram separadas nos respectivos enantiômeros (Figura 5) usando a separação por HPLC quiral preparativa (Lux&O 5 uM Celulose- 1, Coluna LC, 250 x 21,2 mm, AXIA'Y“ Packed, isocrática: 7% i-PrOH/ hexanos). As frações coletadas renderam (-)-105 (pico A) e (+)-105 (pico B) Este método de separação quiral produz (-)-105 como um sólido branco (pureza enantiomérica => 99%, [a] = - 134) e (+)-105 como um sólido branco (pureza enantiomérica = 98 -> 99%, [a] = não determi- nado). A determinação da pureza enantiomérica foi conduzida por co- luna analítica de HPLC quiral: CHIRALPAKO IB-3 (tamanho de partícula 3 UM, dimensões: 4,6 mm x 100 mm, método de separação, isocrático 7,5% i-PrOH/hexanos). O composto (-)-105 curva a luz na direção ne- gativa (valor [a]). A Figura 6 é um traço de HPLC quiral quantitativa mostrando os picos separados de (+)-105 que estão presentes em con- centrações aproximadamente iguais. A Figura 7 mostra que o pico ativo (-)-105 é altamente puro após a separação. A Figura 8 mostra que o pico (+)-105 inativo também é puro após a separação. Como há um traço de (-)-105 ativo nesta preparação, e por causa da potência excep- cional de (-)105, em concentrações extremamente altas (+)-105 pode exibir alguma atividade.

Exemplo 2. Estudos de Morte de Célula de Câncer com o Composto 105

[00191] Detalhes Experimentais dos Xeno-enxertos: Células TYS- Luc (5.000.000 células em Matrigel) foram injetadas na almofada de gor- dura mamária superior de camundongos fêmeas ooforectomizadas NSG (SCID) (Jackson labs). Após 10 semanas, no dia O, grandes tu- mores (intervalo de tamanho: 100 a 600 mm?) estavam presentes. Os camundongos foram tratados com o veículo usado para dissolver (-)- 105 ou (-)- 105 a 40 mg/kg diariamente por injeção subcutânea. Para imagens bioluminescentes (BLI) dos tumores, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e Lucerfin, o substrato da luciferase, foi injetado nos camundongos. Fluxo, o membro total de fótons de luz que atingem o detector em um segundo foi medido usando um IVIS (In Vitro Imaging System). É mostrado o fluxo (em milhões de unidades por se- gundo) para toda a área que contém cada tumor, ou uma área equiva- lente quando o tumor é minúsculo ou indetectável e o percentual de al- teração no tamanho do tumor em cada vez que uma medição foi feita (dia O, dia 3, semana 1, semana 2, semana 3). Em seguida, o tratamento foi interrompido e outra medição foi feita duas semanas mais tarde. Ob- serve que os tumores também foram medidos com paquímetros. Como alguns tumores não se projetam muito, isso é muito menos preciso do que BLI. Após três dias, todos os tumores (-)-105 diminuíram para inde- tectáveis com o uso de paquímetros.

[00192] A Figura 1 mostra o efeito de resposta à dose de (+)-105 em células de câncer humanas positivas para ERa e negativas para ERa, demonstrando atividade anticâncer. Câncer de mama MCF-7 positivo para ERa, câncer de ovário Caov-3 e células de câncer uterino ECC-1 e células de câncer de mama humano MDA-MB-231 negativas para ERa e HeLa, células de carcinoma cervical humano e células epiteliais mamárias humanas MCF-10A foram plaqueadas em 10.000 células/

poço (placa de 96 poços) em 50 ml de meio. Após cerca de 18 horas, foram adicionados a cada poço 50 mL adicionais de meio contendo 2X a concentração final desejada do composto de teste (C-105) (vol. Final 100 uL/poço). Após 24 horas, o reagente Alamar Blue foi adicionado e a fluorescência nos poços foi lida após 1 hora (BMG PheraStar Micro- plate Reader). % de morte relativa foi determinado pela definição da lei- tura para células tratadas com raptinal 10.000 nM para 100% de células mortas e a leitura de células tratadas com veículo para 0% de células mortas. (Os dados são a média + SEM de 3 experimentos independen- tes com 5 replicatas biológicas para cada amostra em cada experimento independente.)

[00193] A Figura 2 mostra a resposta à dose comparando a capaci- dade de BHPI e (+)-105 para matar células T47D positivas para ERa. TA47D, células de câncer de mama humano foram semeadas a 75.000 células/poço. No dia seguinte, o veículo DMSO, 10 um de raptinal (con- trole para 100% de morte celular) ou 0, 50, 100 500 e 1.000 nM de BHPI ou (+)-105 ou 1.000 nM de ICI/fulvestrant ou 1.000 nM de OHT foram adicionados. Após 24 horas, as células viáveis foram determinadas por FACS usando V-FITC e corantes de iodeto de propídio. (n = 3 experiên- cias independentes + SEM). Os resultados desta experiência de citome- tria de fluxo (que detecta células mortas) mostram que (+)-105 é citotó- xico e não citostático. Enquanto isso os compostos OHT, ICI e BHPI são todos citostáticos com base na baixa atividade observada. A atividade observada de (+)-105 neste ensaio é semelhante ao controle positivo, raptinal, um composto que também mata quantitativamente as células de câncer. (veja também a Figura 36A).

[00194] A Figura 3 compara a capacidade de (+)-105 para matar cé- lulas positivas para ERa e negativas para ERa. A resposta à dose testa a capacidade de (+)-105 para matar rapidamente células positivas para

ERa e negativas para ERa. Linhagens celulares: câncer de mama posi- tivo para ERa: T47D, MCF-1 TYS (Y537S); Endometrial: ECC-1; Linha- gens celulares negativas para ERa: MDA-MB-231 de mama; Melanoma: OMM1, A375; Pulmão: H3122; Cólon: HT-29; fibroblasto: HFF-I. 4.000 a 8.000 células/poço foram plaqueadas. No dia seguinte, (+)-105 em concentrações de 0-10.000 nM foi adicionado. Após 24 horas, o rea- gente Alamar Blue foi adicionado e a fluorescência nos poços foi lida. O % de morte relativa foi determinado pela definição da leitura de células tratadas com raptinal 1000 nM para 100% de células mortas e a leitura de células tratadas com veículo para 0% de células mortas. (n = 3 + SEM). Estes resultados mostram que o composto racêmico 105 é sele- tivo para linhagens de células cancerígenas positivas para ERa; tam- bém demonstrado com (-)-105 enantiomericamente puro na Figura 36F.

[00195] A Figura 4A ilustra como as ICso para morte celular foram determinados. 4B testa a capacidade de BHPI, (-)-105 e 01-15 para ma- tar. 4C mostra que (-)-105 é eficaz quando administrado por via oral. Grandes tumores ortotópicos de mama de células TYD-Luc (células de câncer de mama humano T47DERaD538G-luciferase) foram formados por 4 meses em camundongos NSG imunossuprimidos. Os camundon- gos foram tratados por 3 dias apenas com veículo (Veículo), gavagem oral de 40 mg/kg de (-)-105 (oral) ou injeção diária de 40 mg/kg (-)-105 (injetado). Os tumores foram visualizados por imagem bioluminescente usando luciferase. A linha tracejada representa -100%; regressão do tu- mor até indetectável. Assim, o resultado mostra que (-)- 105 é superior ao BHPI e 01-15.

[00196] A Figura9 mostra que o enantiômero (-) de 105 é ativo e o enantiômero (+) é inativo. 75.000 células de câncer de mama humano TA47D positivas para ERa foram plaqueadas/poço. No dia seguinte, veí- culo DMSO, raptinal 10 um (controle para 100% de morte celular), ou 100, 500 e 1.000 nM de (+)-105 ou (-)- 05. Após 24 horas, as células viáveis foram determinadas por FACS usando V-FITC e corantes de io- deto de propídio. (n = 1).

[00197] A Figura 10 mostra que (-)-105 induz a morte dependente da dose de células MCF-7; (+)-105 é inativo. 75.000 células de câncer de mama humano T47D positivas para ERa foram plaqueadas/ poço. No dia seguinte, veículo DMSO, raptinal 10 um (controle para 100% de morte celular) ou 1 a 500 nM de (-)-105 ou 1.000 nM de (+)-105 ou 1.000 nM (+)-105 foram adicionados. Após 24 horas, as células viáveis foram determinadas por FACS usando V-FITC e corantes de iodeto de propí- dio. (n = 3 experiências independentes + SEM).

[00198] A Figura 11 mostra a resposta à dose para matar células T47D-Luc por BHPI e pelo enantiômero ativo (-)-105 de C-105. O ensaio de morte celular com Trypan Blue foi usado para comparar a capacidade do enantiômero ativo (-) de C-105 e BHPI para matar T47D positivo para o receptor a de estrogênio (ERa), células de câncer de mama humano que expressam luciferase (células T47D-Luc). 300.000 células T47D- Luc/poço em FBS 10% foram plaqueadas em uma placa de 6 poços em triplicata. 24 horas após o plaqueamento, as concentrações indicadas do enantiômero (-) ativo de C-105 [(-)-105] ou BHPI, ou veículo [Veh] foram adicionadas às células. Após 24 horas, as células foram coletadas e o % de células mortas foi determinado por exclusão automatizada de Trypan Blue usando o hemocitômetro automatizado Countess |l. O per- centual de células viáveis foi calculado fazendo 100 - (% de morte celu- lar). (n = 3 + SEM).

[00199] A Figura 12 mostra que a resposta à dose de (-)-105 é su- perior a BHPI na morte de células MCF-7 e TYS-Luc. O ensaio de morte celular com Trypan Blue foi usado para avaliar a capacidade do enanti- ômero ativo de 105 (-) [[-)-105] para matar MCF-7 positiva para ERa e TYS-Luc, células de câncer de mama humano. 300.000 células T47D/ poço em FBS 10% foram plaqueadas em uma placa de 6 poços em triplicata. 24 horas após o plaqueamento, as concentrações indicadas de BHPI ou o enantiômero ativo 105 (-) de C-105 [(-)-105] foram adicio- nadas. Após 24 horas, as células foram coletadas e o % de células mor- tas foi determinado por exclusão automatizada de Trypan Blue usando o hemocitômetro automatizado Countess Il. O percentual de células vi- áveis foi calculado fazendo 100 - (% de morte celular). (n = 3 + SEM).

[00200] A Figura 13 mostra que o estudo de resposta à dose de (-)- 105 é superior ao BHPI e às terapias endócrinas atuais na morte de células TDG-Luc. Na figura superior, a resposta à dose mostra que (-)- 105 é superior ao BHPI na morte de células TDG-Luc. A figura inferior esquerda mostra as terapias endócrinas atuais, ICI/Fulvestrant/Faslo- dex e z-4-hidroxitamoxifeno (a forma ativa do tamoxifeno) não matam as células TDG-Luc. A figura inferior direita mostra que o enantiômero (+)-105 é inativo e não mata as células TDG-luc. O ensaio de morte de células Trypan Blue foi usado para avaliar a capacidade do enantiômero ativo de C-105 [(-)-105] para matar células TDG-Luc positivas para ERa. Para todos os estudos, 300.000 células TDG-Luc/poço em FBS 10% foram semeadas em uma placa de 6 poços em triplicata. 24 horas após o plaqueamento, as concentrações indicadas do enantiômero ativo de (-)-105, ou BHPI (topo) ICI, ou OHT (inferior esquerda) ou (+)-105 (infe- rior direita) foram adicionados. Após 24 horas, as células foram coleta- das e o % de células mortas foi determinado por exclusão automatizada de Trypan Blue usando o hemocitômetro automatizado Countess |l. O percentual de células viáveis foi calculado fazendo 100 - (% de morte celular). (n = 3 + SEM).

[00201] A Figura 14 mostra as ICso para matar as células de câncer por (-)-105. Linhagens celulares: câncer de mama positiva para ERa: TA47D, MCF-7 TYS (T47D Y537S) TDG (T47D D538G), BT-474; Células de câncer de mama MDA-MB-231 negativas para ERa; 6.000 células/

poço foram plaqueadas (placa de 96 poços) em 100 ul de meio. A con- centração de DMSO foi ajustada para 1% em cada poço. (-)-105 em concentrações de 0-100.000 nM foi adicionado. Após 24 horas, foi adi- cionado o reagente Alamar Blue (10 ul de 0,1 mg/ml). Após 2-4 horas, a fluorescência nos poços foi lida ((Xex: 555 NM, X2em: 585 NM, leitor de placas Spectra Max M3). O % relativo de morte foi determinado pela definição da leitura de 10.000 nM de células tratadas com raptinal em 100% de células mortas e a leitura de células tratadas com veículo em 0% de células mortas. (n = 3 + SEM).

[00202] A Figura 15 mostra experimentos em longo prazo em que (- )-105, mas não BHPI, mata 100% das células TYS-Luc. Para simular o efeito de várias semanas de tratamento de um tumor em um xenoen- xerto em camundongo, experimentos de cultura de células em longo prazo foram realizados. Células TYS-Luc (Células T47DERaY537S- Luc; ERaY537S é a mutação de ERa mais letal observada no câncer de mama metastático) foram semeadas em 4.000 células/poço em placas de 96 poços. As células foram mantidas inicialmente por 2 semanas em meio contendo veículo DMSO, enantiômero inativo (+) 1 mM de C-105, BHPI 1 mM ou 1 uM do enantiômero ativo (-) de C-105 (Tratamento). Após 2 semanas (mudança de meio a cada 2 dias), o número de células foi determinado usando MTS e uma curva padronizada de absorbância versus número de células para células TYS-Luc. Notas: (i) Barras deno- tam os braços de BHPI e (-)-105 do experimento. Nenhum fármaco está presente durante o recrescimento (ii) Como os valores de absorbância são extremamente baixos, o ensaio MTS não pode quantificar com pre- cisão menos de 200 células/poço (iii) Após a separação, o enantiômero inativo ainda contém —1-2% de enantiômero ativo; portanto, retém al- guma atividade quando usado na alta concentração de de 1.000 nM), Outro conjunto de poços tratados de forma semelhante não foi testado com MTS e após 4 lavagens com PBS foi colocado em meio livre de estrogênio contendo cd-FBS 10% por 4 semanas (troca de meio a cada 2 dias) (Recrescimento). Isso permite que qualquer célula sobrevivente cresça novamente. Após 4 semanas, as células foram testadas usando MTS. Notavelmente, não houve recrescimento de células tratadas com (-)C-105 ativo e o recrescimento robusto de células tratadas com BHPI. (Nota: A inspeção visual dos poços confirmou que não havia células no poço tratado por 2 semanas com (-)-105.) Para testar se as células que recresceram após o tratamento com BHP!I eram resistentes a BHPI, elas foram tratadas novamente com outro ciclo (Retratamento com BHPI) e mostraram reter a sensibilidade à morte por BHPI. (n = 8 repetições bi- ológicas + SEM).

[00203] A Figura 16 mostra experimentos em longo prazo que simu- lam a terapia, em que (-)-105, mas não BHPI, erradica células letais de câncer de mama resistentes à terapia. Células: MCF-7Y537S (MCF-7 ERaY537S-luciferase (derivada de células MCF-7 de câncer de mama humano. As células MCF-7 são a linhagem mais ampla de células de câncer de mama humano. Esta é a mutação mais letal e a segunda mais comum em câncer de mama metastático.) As condições experimentais são como na legenda da figura 15. O enantiômero (+)-105 era inativo.

[00204] A Figura 18 mostra que (-)-105 mata células de câncer de mama resistentes à morte por BHPI. Células de câncer de mama hu- mano T47D contendo ERa capazes de sobreviver em BHPI 1uM, foram selecionadas pelo crescimento clonal. O efeito de 100 nM e 1 uM de BHPI e (-)-105 no crescimento das células T47D parentais (sensíveis a BHPI) e clones de T47D parcialmente resistentes a BHPI 1,3,8 e 11 foi avaliado. 4.000 células/poço foram plaqueadas. O número de células foi por ensaio MTS a partir de uma curva padronizada de absorbância ver- sus número de células. Conclusões: BHPI bloqueou o crescimento e matou muitas das células T47D e (-)-105 matou todas as células T47D. O BHPI inibiu o crescimento, mas não conseguiu parar o crescimento dos clones resistentes; (-)-105 bloqueou completamente o crescimento dos clones resistentes e reduziu seu número de células abaixo do nú- mero de células original de 4.000 células/poço. Assim, em 4 dias (-)-105 matou algumas, mas não todas, das células resistentes.

[00205] No que diz respeito ao mecanismo de ação de -105 para a resposta antecipatória de proteína não dobrada (UPR), a Figura 19 mostra que (-)-105 induz potentemente a formação de mRNA ligado de XBP-1. T47D-luciferase positiva para ERa, células de câncer de mama humano, foram mantidas pelos tempos indicados em veículo (Ctl, Con- trole), BHPI 100 nm ou 100 nM de (-)-105. Nos tempos indicados, o RNA foi isolado e os níveis de Sspo-mRNA de XBP1 quantificados por gqRT- PCR. (n = 3 + SEM). (-)IO5 ou a ativação por BHPI de UPR ativa o sensor IRE1a de UPR, resultando na clivagem do mMRNA XBP1 inativo em mRNA ligado (sp)-XBP1 ativo.

[00206] O aumento do mMRNA de sp-XBP1 é um marcador ampla- mente utilizado para a ativação da resposta de proteína não dobrada (UPR). Assim, (-)-105 é um hiperativador de UPR e indutor de sp-XBP1 do que BHPI muito potente.

[00207] A Figura 20 mostra que (-)-105, mas não BHPI induz inibição quase quantitativa da síntese de novas proteínas. Células de câncer de ovário humano Caov-3 positivas para ERa, foram tratadas durante os tempos indicados com BHPI 1000 nmM ou 1000 nM de (-)-105. As cé- lulas foram marcadas com *S-metionina. A incorporação de *ºS-metio- nina marcada na proteína foi determinada pela precipitação com ácido tricloroacético e captura da proteína precipitada, mas não dos aminoá- cidos livres, em pequenos filtros sem cinzas endurecidas Whatman. Após solubilização da proteína nos filtros com base e neutralização com ácido, as amostras foram contadas em contador de cintilação líquida. É mostrada o percentual médio de inibição (n2 3) da síntese de proteínas em comparação com a amostra de tempo zero. A inibição quase quan- titativa da síntese proteica por (-)-105 é consistente com a hiperativação letal induzida por (-)-105 do braço PERK de UPR. Mesmo as células que não estão crescendo, estão constantemente degradando proteínas e produzindo novas proteínas. As células nas quais quase toda (> 90%) síntese de proteína é inibida, não podem crescer e acabam morrendo.

[00208] A Figura 21 mostra que o bloqueio do efluxo de cálcio do retículo endoplasmático com 2-APB inibe a morte de células de câncer induzida por (-)-105. MCF-7 e TYS-Luc positivas para ERa foram trata- das com veículo DMSO (Veh), ou BHPI ou (-)-105 mais ou menos 2- APB para os tempos indicados. A morte das células foi determinada usando o ensaio de exclusão com Trypan Blue baseado em instru- mento. Aos 30 minutos, 2-APB bloqueou quase completamente a morte celular induzida por (-)-105 e aos 45 e 60 minutos bloqueou parcial- mente a morte celular. Isso é consistente com (-)-105 induzindo a ativa- ção letal poderosa da via de UPR antecipatória. (n = 3 +SEM).

[00209] A Figura 22 mostra que -105 reduz os níveis de ATP intra- celular; esta redução nos níveis de ATP é bloqueada pela inativação da bomba SERCA com tapsigargina. As células TYS-Luc foram mantidas com veículo DMSO (Veh), 1.000 nM de BHPI, 1.000 nM de -105 com e sem 10.000 nM de tapsigargina (THG) durante os tempos indicados. Os níveis de ATP foram determinados usando um kit e os níveis relativos de ATP foram obtidos a partir de uma curva padronizada. Observe que em 1 hora, THG bloqueou completamente o declínio induzido por -105 nos níveis de ATP intracelular. (n = 3 + SEM).

[00210] A Figura 23 mostra o bloqueio do declínio nos níveis de ATP com a tapsigargina que inibe a morte celular induzida por -105. As célu- las TYS-Luc foram mantidas em veículo DMSO (Veh) ou BHPI, ou (-)- 105 com ou sem tapsigargina (THG) durante os tempos indicados. O bloqueio do declínio nos níveis de ATP (Figura 19) com THG inibiu a morte celular induzida por (-)-105. Observe que quando o THG estava presente, houve uma forte inibição da morte celular induzida por células (-)-105 em 1 hora. (n= 3 + SEM). Exemplo 3. Dados Adicionais para os Compostos Relacionados a 105

[00211] A Figura 24 mostra uma comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células TDG. As células TDG foram incubadas durante 24 horas com 75 nM de BHPI ou 75 nM de cada um dos compostos de teste indicados: 4, 6 e (+)-105 (enantiôme- ros não separados). A morte celular foi determinada usando o ensaio de exclusão de Trypan Blue baseado em instrumento. As estruturas estão na seção de Síntese. Conclusão: Em comparação com BHPI, os com- postos 4 e 105 exibem uma capacidade muito maior de matar as células TDG. (n = 3 + SEM).

[00212] A Figura 25 mostra uma comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células TYS. As células TYS foram incubadas durante 24 horas com 35 nM de BHPI ou 35 nM de cada um dos compostos de teste indicados: 2, 4 e 105. A morte celular foi determinada usando o ensaio de exclusão com Trypan Blue baseado em instrumento. (n = 3 + SEM). Assim, em comparação com BHPI, os compostos 4 e 105 exibem uma capacidade muito aumentada para ma- tar as células TYS.

[00213] A Figura 26 mostra uma comparação da capacidade dos compostos de teste 4, 6, 105 e BHPI para matar células TYS. As células TYS foram incubadas durante 24 horas com 50 nM de BHPI ou 50 nM de cada um dos compostos de teste indicados: 4, 6 e 105. A morte ce- lular foi determinada usando o ensaio de exclusão com Trypan Blue ba- seado em instrumento. (n = 3 + SEM). Assim, em comparação com BHPI, os compostos 4 e 105 exibem maior capacidade de matar as cé- lulas TYS.

[00214] A Figura 27 mostra uma comparação da capacidade dos compostos de teste e BHPI para matar células T47D. As células T47D foram incubadas durante 24 horas com 75 nM de BHPI ou 75 nM de cada um dos compostos de teste indicados: 4 e 6. A morte celular foi determinada usando o ensaio de exclusão com Trypan Blue baseado em instrumento. (n = 3 + SEM). Assim, o composto 4 exibe uma capa- cidade muito aumentada de matar células de câncer de mama contendo receptor de estrogênio de tipo selvagem.

[00215] Na Figura 28,nem os compostos de teste nem BHPI matam Células mamárias MCF-10A não tumorigênicas negativas para ERa. Células MCF-10A negativas para ERa foram mantidas por 24 horas em veículo DMSO ou 75 nM de BHPI ou 75 nM de cada um dos compostos de teste indicados: 4, 6 e 105. A morte celular foi determinada usando o ensaio de exclusão com Trypan Blue baseado em instrumento. (n=3 + SEM). Assim, com 75 nM, nem BHPI nem qualquer um dos compostos de teste induzem morte significativa das células MCF-10A negativas para ERa.

[00216] A Figura 29 mostra a avaliação da capacidade dos compos- tos de teste e BHPI para matar células T47D. As células T47D foram tratadas durante 24 horas com BHPI 100 nM ou com 100 nM de cada um dos compostos de teste: 6, 8 e 105. (n.s. não significativo). A morte celular foi determinada usando o ensaio de exclusão de Trypan Blue baseado em instrumento. (n = 3 + SEM). Assim, em comparação com o BHPI, os compostos 105 exibem capacidade aumentada para matar cé- lulas T47D.

[00217] A Figura 30 compara a capacidade de BHPI e compostos de teste para inibir a proliferação de células T47D, TYS e TDG. As células T47D estavam em meio contendo 10 FBS (que contém estrogênio), as células TYS-4 e TDG-1 estavam em meio contendo cd-FBS 10% (estro- gênio depletado). As células são plaqueadas em 2.000 células/poço em placas de 96 poços. Após 24 horas em meio contendo FBS ou FBS tra- tado com carvão-dextran (depletado de estrogênios endógenos), foi adi- cionada a concentração indicada de cada composto (em DMSO a 1/1000º do volume do meio). Após 2 dias, o meio foi mudado e os com- postos foram adicionados novamente. Após 2 dias adicionais (4 dias no total), os ensaios MTS são usados para avaliar a proliferação celular. (n = 6 + SEM). Assim, BHPI e os novos compostos inibem efetivamente a proliferação das células T47D, TYS-4 e TDG-1. Os dados sugerem que os compostos 2, 4, 6 e 105 são mais eficazes do que BHPI em matar estas células de câncer de mama positivas para ERa.

[00218] Dados adicionais são mostrados nas Figuras 31 e Figuras 33-43. Através de uma campanha de química medicinal, (+)-1 foi des- coberto para mostrar um fenótipo citotóxico inesperado (Figura 36A). Todas as terapias direcionadas conhecidas para o receptor alfa de es- trogênio (ERa) são citostáticas, o que significa que elas apenas previ- nem o crescimento celular e não matam as células de câncer. A croma- tografia em coluna quiral preparativa forneceu acesso a material enan- tiomericamente puro (Exemplo 4) identificado por polarimetria como (- )-105 e (+)-105. A derivatização química e a cristalografia por raios-X caracterizaram ainda o enantiômero ativo com a configuração (R) e o enantiômero inativo que possui a configuração (S) (Esquema 5). Dados biológicos (Figura 36B e Exemplo 4) demonstra que (R)-1 é citotóxico para células positivas para ERa (MCF-7) com efeitos mínimos observa- dos em células negativas para ERa (MDA-MB-231). Portanto, o com- posto foi renomeado como SERK-F6 para Selective Estrogen Receptor Killer, com esta versão possuindo seis flúores. A atividade dependente da dose de SERK-F6 foi determinada contra um painel de linhagens de células de câncer (Figura 36C e Figura 37A) para ERa.

[00219] Um aspecto importante para a terapia citotóxica é a capaci- dade de matar quantitativamente uma população de células. SERK-F6 mata quantitativamente as linhagens de células ERa em um ensaio de cristal violeta de 24 horas rápido (Figura 36D) e em experimentos de cultura de células em longo prazo (Figura 36E-F e Figura 37B). SERK- F6 mata a ativação da via de resposta antecipada de proteína não do- brada (UPR) (Figura 38). Marcadores importantes desse mecanismo são os níveis aumentados de XBP1 ligado (sp-XBP1) (Figura 38A), di- minuição rápida dos níveis de ATP celular (Figura 38B) e inibição rápida da síntese de proteínas (Figura 38C).

[00220] — A farmacocinética de SERK-F6 foi medida em camundongos (Figura 40A-B). Estudos adicionais mostraram que SERK-F6 penetra a barreira hematoencefálica (Figura 40C-D). Além disso, o tratamento em longo prazo de SERK-F6 não remove tecidos ERa conforme medido pelos níveis circulantes de estradiol (Figura 40E). Esses dados de- monstram que SERK-F6 pode atingir concentrações biologicamente re- levantes in vivo e ser bem tolerado.

[00221] Para investigar a eficácia de SERK-F6 para matar tumores positivos para ERa, grandes tumores MCF-7 foram cultivados e, em se- guida a terapia foi interposta. O tratamento com SERK-F6 resulta em regressões tumorais dramáticas (Figura 39A e Figura 40F-G). Como a terapia atual (isto é, fulvestrant, Fulv.) é citostática, não são obtidos efei- tos dramáticos contra esses tumores grandes e estabelecidos. Além disso, o tratamento diário com SERK-F6 não levou a qualquer alteração no peso do murino durante o estudo, demonstrando a tolerância de SERK-F6 in vivo (Figura 40H). Além disso, para demonstrar o meca- nismo de ação in vivo de SERK-F6, tumores MCF-7 foram enxertados em camundongos e então tratados com SERK-F6. Os camundongos fo- ram então sacrificados antes da erradicação completa do tumor. Esses dados mostraram ativação de UPR com aumentos nos níveis de P- PERK e P-eiF2alfa (Figura 39B-E e Figura 401-J).

[00222] “Como as mutações em ERa que levam à ativação constitu- tiva e à resistência à terapia representam um desafio clínico, foi de- monstrado que SERK-F6 também pode tratar esses tumores resisten- tes. Assim, SERK-F6 erradica tumores Y537S (ou seja, linhagem de cé- lula TYS) de uma maneira dependente da dose e em múltiplas adminis- trações da dose (isto é, administração i.p. e oral) e também foi tolerado (Figura 41A-D e Figura 42B-C). Após a interrupção do tratamento, os tumores não voltaram a crescer, indicando a erradicação completa do tumor (Figura 42A). Com uma dose subterapêutica mais baixa de SERK-F6 (ou seja, 10 mg/kg oral), os tumores voltaram a crescer, mas o retratamento desses tumores com doses mais altas de SERK-F6 de- monstrou que esses tumores crescidos ainda são sensíveis a SERK-F6 e não são resistentes (Figura 42D). Este resultado mostra a importância da morte celular completa para a erradicação do câncer. O tratamento com SERK-F6 também leva à destruição de tumores mutantes D538G (linhagem de células TDG) (Figura 41D-E). O tratamento com SERK- F6 foi novamente tolerado (Figura 42E) em doses mais altas e o sufici- ente para erradicar tumores (Figura 42F). Embora as doses mais baixas não erradiquem completamente os tumores, o retratamento desses tu- mores com doses mais altas de SERK-F6 promove a regressão dos tu- mores (Figura 42G-H).

[00223] Para confirmar que as regressões tumorais não são vistas apenas com as linhagens celulares de fundo T47D (TYS e TDG), as células MCF-7 foram tratadas com mutações Y537S ou D538G em suas proteínas ERa (células MYS e MDG, respectivamente) com SERK-F6. Regressões tumorais dramáticas foram observadas (Figura 41F-G e Fi- gura 43A-D). Novamente, doses mais altas são necessárias para res- postas tumorais completas, embora doses menores levem ao cresci- mento do tumor não resistente (Figura 43B-D). O tratamento com SERK-F6 também erradica a carga do tumor metastático (Figura 411).

Exemplo 4. Determinação da Configuração Absoluta e IC50 dos Enan- tiômeros do Composto 1 (105) F;CO Ho Fx;CO > oH ÕO OCF3 ÕO oH O separação quiral e. O o O

E TE E

N N N CF3 cr; SERK-F6 CF3 (2)-1 (R)-1 (S-1 *Aaloneis : -14,6º (+ 0,1º) “alone: +13,8º (+ 0,1º) a (S)-1 > 1000 -

[00224] A separação quiral preparativa em escala de grama de (+)-1 produz (R)-1 e (S)-1 enantiomericamente puros com rotações ópticas opostas (Esquema 5). Os valores IC5o de (+)-1, (R)-1 e (S)-1 contra cé- lulas MCF-7 revelam que (R)-1 é a espécie ativa, referida como SERK- F6. Os valores foram obtidos após incubação de 24 horas utilizando o ensaio de fluorescência com Alamar Blue normalizado para controles vivos e mortos (tratados com veículo e raptinal). ICso de (S)-1 é > 1 UM. Erro mostrado como S.E.M.

[00225] Esquema 5. Sequência sintética para acessar derivados cristalizáveis de (R)-1 e (S)-1: determinação das estruturas de (R)-2 e (S)-2 por raios X oH HO -Buti OCF. OCF. "er, BM vo Õ 2 Ô E Õ , 78ºC to ta, TIOH —h (O O —— O fe emseguida O N CH2Cbk, ta, N H 1h H (1 r o CF; F, N 59% dr H durante duas etapas º lescala em gramas] uma coluna de purificação Ho TIO, OCF; OCF. OCFz QI” QUO neem OQ" > TO, piridina ácido fórmico à Cr ame SO memen E N CH3Ck, 0ºC to ta, N DMF, 110ºC, N Fa 1h Fo 1 FO (RR >99% enantiomeri- > 30% camente puro (R)-1 durante duas etapas F3CO, FaCO, F3CO.

QS QS O q trin-butilamina "e, O A O PA(PPha):Ck À O TO, piridina * ácido fórmico “ Grmo (Do Re (BO N CH2Chb, 0ºC to ta. N DMF, 110ºC, N Fa nv CFa ' ” CF, "s 99% enantiomeri- 25% camente puro (S)-1 durante duas etapas Exemplo 5. Formas de Dosagem Farmacêutica

[00226] As formulações a seguir ilustram formas de dosagem farma- cêuticas que podem ser usadas para administração terapêutica e profi- lática de um composto de uma fórmula aqui descrita, um composto es- pecificamente descrito aqui ou seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis (daqui por diante referido como "Composto X"): (i) Comprimido 1 mg/comprimido "Composto X 100,0 Lactose 77,5 Povidona 15,0 Croscarmelose de sódio 12,0 Celulose microcristalina 92,5 Estearato de magnésio 3,0 300,0

(ii) Comprimido 2 mg/comprimido "Composto X 20,0 Celulose microcristalina 410,0 Amido 50,0 Amido glicolato de sódio 15,0 Estearato de magnésio 5,0

500,0 (iii) Cápsula mg/comprimido "Composto X 10,0 Dióxido de silício coloidal 1,5 Lactose 465,5 Amido pré-gelatinizado 120,0 Estearato de magnésio 3,0

600,0 (iv) Injeção 1 (1 mg/mL) mg/mL "Composto X" (forma de ácido livre — 1,0 Fosfato de sódio dibásico 12,0 Fosfato de sódio monobásico 0,7 Cloreto de sódio 4,5 Solução de hidróxido de sódio 1,0N q.s. (ajuste do pH para 7,0-7,5) Água para injeção q.s até 1 mL (v) Injeção 2 (10 mg/mL) mg/mL "Composto X" (forma de ácido livre) 10,0 Fosfato de sódio monobásico 0,3 Fosfato de sódio dibásico 11 Polietileno glycol 400 200,0

Solução de hidróxido de sódio 1,0N q.s. (ajuste do pH para 7,0-7,5) Água para injeção q.s até 1 mL (vi) Aerossol mg/lata "Composto X" 20 Ácido oleico 10 Tricloromonofluormetano 5000 Diclorodifluormetano 10.0000 Diclorotetrafluoretano 5000 (vii) Gel Tópico 1 % em peso "Composto X" 5% Carbômero 934 1,25% Trietanolamina (ajuste do pH para 5- q.s. 7) Metil parabeno 0,2% Água purificada q.s.até 100 g (viii) Gel Tópico 2 % em peso "Composto X" 5% Metilcelulose 2% Metil parabeno 0,2% Propil parabeno 0,02% Água purificada q.s.até 100 g (ix) Unguento Tópico % em peso "Composto X" 5% Propileno glicol 1% Base anidra para unguento 40%

Polissorbato 80 2% Metil parabeno 0,2% Água purificada q.s.até 100 g (x) Creme Tópico 1 % em peso "Composto X" 5% Cera de abelha branca 10% Parafina líquida 30% Álcool! benzílico 5% Água purificada q.s.até 100 g

[00227] m (xi) Creme Tópico 2 % em peso "Composto X" 5% Ácido esteárico 10% Monoestearato de glicerila 3% Éter estearílico de polioxietileno 3% Sorbitol 5% Palmitato de isopropila 2% Metil parabeno 0,2% Água purificada q.s. até 100 g

[00228] Estasformulações podem ser preparadas por procedimentos convencionais bem conhecidos na técnica farmacêutica. Será apreciado que as composições farmacêuticas acima podem ser variadas de acordo com técnicas farmacêuticas bem conhecidas para acomodar di- ferentes quantidades e tipos do ingrediente ativo 'Composto X'. A for- mulação em aerossol (vi) pode ser usada em conjunto com um dispen- sador de aerossol dosimetrado. Além disso, os ingredientes e propor- ções específicos são para fins ilustrativos. Os ingredientes podem ser trocados por equivalentes adequados e as proporções podem ser vari- adas, de acordo com as propriedades desejadas da forma de dosagem de interesse.

[00229] Embora modalidades específicas tenham sido descritas acima com referência às modalidades e exemplos descritos, tais moda- lidades são apenas ilustrativas e não limitam o escopo da invenção. Al- terações e modificações podem ser feitas de acordo com a habilidade comum na técnica sem se afastar da invenção em seus aspectos mais amplos como definidos pelas reivindicações a seguir.

[00230] Todas as publicações, patentes e documentos de patentes estão incorporados aqui por referência, como se fossem individual- mente incorporados por referência. Nenhuma limitação inconsistente com esta descrição deve ser entendida a partir dela. A invenção foi des- crita com referência a várias modalidades e técnicas específicas e pre- feridas. No entanto, deve ser entendido que muitas variações e modifi- cações podem ser feitas, permanecendo dentro do espírito e escopo da invenção.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula |: Gi

DE (O Rº a (I= R2 x R O), ou seu sal ou solvato; na qual R', R R$ e Rº são cada um independentemente H, halo, -OR?, -SRº, -N(Rº)>, alquila, cicloalquila, heterociclila, arila ou he- teroarila; A, A?, A? e Aº são cada um independentemente H, halo, ou alquila; G' é halo, -OR8, -SR8, -S(=O)2R, ou alquila; G? é halo, -ORº, -SRº, -S(=O)2Rº, ou alquila; XeZ são cada um independentemente O, S, ou -NRº; e Rô, RB, Rº e R? são cada um independentemente H ou al- quila, em que quando presentes, -ORº e -ORº não são ambos -OH; em que cada alquila, cicloalquila, heterociclila, arila ou hete- roarila é opcionalmente substituída com um ou mais substituintes.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o enantiômero (S).

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é o enantiômero (R).

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R4, R8, Rº e RP são cada um independentemente H ou -(C1-Ce)alquila e R', R?º, Rº e Rº são cada um independentemente H, halo, ou -(C1-Cse)alquila.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que A', A?, Aô e Aº são cada um independentemente H ou halo e G' é -ORº.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xé -NRP e Zé O.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R* é CH3, CH2CH3, CF3, CHF2, CH2CF3, CF2C Ha, ou CF2CF3.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que G'? é -ORº, e RE é CH3, CH2CH3, CF3, CHF2, CH2CF3, CF2CH3, ou CF2CF3.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um composto de Fórmula Il ou Fórmula Ill:

G G (O O Rê A A (Oo (Oo R? N R? N RU RA (11) ou RU RA (11).

10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que o composto é um composto de Fórmula IV: G! O nº

O

E E (V), na qual

G' é -OR8 e Rº e R' são cada um independentemente alquila ou cicloalquila, sendo que a alquila e a cicloalquila são opcionalmente subs- tituídas com um ou mais grupos halo.

11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que um ou mais átomos de hidrogênio são deutério ou trítio, um ou mais átomos de carbono é um isótopo de carbono ou uma combinação desses.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que é qualquer um dos compostos (S)- ou (R)-2, 4, 6, 8 ou 105:

DE CH ás CF3 ás CH ás CF3 a CHa a (S)-2, (S)-4, (S)-6, (S)-105, (S)8, D So D So DS So SD So Db SO

E CH CF3 CH CF3 CcHz (R)-2, (R)-A4, (R)-6, (R)-105, ou (R)8.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que é levorotatório.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que é dextrorotatório.

15. Composto, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que é o composto (R)-105 ou (S)-105.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 15, caracteri- zado pelo fato de que é o composto é (R)-105.

17. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que apresenta uma afinidade de ligação pelo receptor alfa de estrogênio (ERa) e a IC5o da afinidade de ligação é menor do que cerca de 500 nM.

18. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e um segundo fármaco.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 17, em combinação com um diluente, veículo, excipiente ou tampão farmaceuticamente aceitável.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 19, caracterizada pelo fato de que o composto é uma mistura racê- mica de (R)-105 e (S)-105: Ho F;CO O O OCF; ÕO O OH CF (R)-105 CF (S)-105.

21. Uso do composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer em indivíduo com um câncer positivo para ERa em necessidade do mesmo.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreendendo o composto mata ou inibe o crescimento de câncer positivo para ERa pela hiperativação da resposta de proteína não dobrada (UPR) no retículo endoplasmático.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto é uma mistura racêmica de (R)-105 e (S)-

105: Ho F3CO O O OCF3 O O OH CF (R)105 CF (S)-105.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer ERa positivo é um câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical ou câncer endometrial.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreendendo o composto contém instruções para administração por via oral ou por injeção.

26. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ERa positiva em um indivíduo em necessidade do mesmo.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença ERa positiva é câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical ou câncer endometrial.

28. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um câncer em um indivíduo com um câncer positivo para ERa em ne- cessidade do mesmo.

29. Composto, de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pelo fato de que a doença ERa positiva é câncer de mama, câncer de ovário, câncer uterino, carcinoma cervical ou câncer endometrial.