BR112020022035A2

BR112020022035A2 - proteínas de ligação de receptor de canabinoide tipo 1 (cb1) e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112020022035A2
Application number: BR112020022035-3A
Authority: BR
Inventors: Antara Banerjee; Andrea Fanjul; Robert J. Hoey; Kacey Sachen; Nikolai Suslov
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2018-04-30
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2021-02-02
Also published as: CL2020002793A1; KR20210005051A; JP2021525059A; EP3787746A1; JP2024059646A; MX2020011498A; PE20210419A1; CA3098416A1; ECSP20076576A; AR114436A1; AU2019264029A1; SG11202010388SA; CO2020014681A2; TW202003549A; EA202092593A1; PH12020551805A1; US20210198358A1; WO2019211665A1; CN112218684A; US20220396620A1

Abstract

  PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE RECEPTOR DE CANABINOIDE TIPO 1 (CB1) E USOS DAS MESMAS. A presente descrição refere-se a proteínas de ligação ao CB1 isoladas, modificadas geneticamente, de ocorrência não natural, que incluem anticorpos anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos. As proteínas de ligação ao CB1 têm utilidade no tratamento e diagnóstico de afecções, doenças e distúrbios mediados por CB1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO DE RECEPTOR DE CANABINOIDE TIPO 1 (CB1) E USOS DAS MESMAS”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório no U.S. 62/664.882, depositado em 30 de abril de 2018, em que a descrição do mesmo está incorporada no presente documento em sua totalidade a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se às proteínas de ligação de receptor de canabinoide tipo 1 (CB1) e usos das mesmas.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[003] O conteúdo de todas as referências citadas (que incluem as referências literárias, documentos de patente, pedidos de patente e sites da web) que pode ser citado ao longo deste pedido está expressamente incorporado aqui a título de referência em sua totalidade para quaisquer fins, assim como as referências citadas nas mesmas. A descrição empregará, a menos que seja indicado de outra forma, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, biologia celular, desenvolvimento de fármaco e entrega de fármaco, que são todas bem conhecidas na arte.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] O receptor de canabinoide tipo 1 (CB1) é um receptor de membrana de célula 7-transmembranar na superfamília de receptor acoplado à proteína G expressa principalmente no cérebro, assim como perifericamente nos pulmões, fígado, rim e tecido adiposo. CB1 é ativado por canabinoides gerados naturalmente dentro do corpo chamados endocanabinoides (tais como, eicosinoides) ou canabinoides introduzidos no corpo (tais como, cannabis), ou compostos sintéticos relacionados. Canabinoides se ligam de maneira reversa e estéreo seletiva ao CB1. Após CB1 ser engatado, múltiplas vias de transdução de sinal intracelular são ativadas, que resultam na inibição de adenilila ciclase e na ativação de proteína ativada por mitogênio (MAP) quinase, na inibição de canais de cálcio do tipo N e P/Q pré-sinápticos e canais de potássio externos do tipo D, e na ativação de canais de potássio externos tipo A e internamente retificadores. Acredita-se que a expressão de CB1 module a liberação de neurotransmissor de uma maneira que evite o desenvolvimento de atividade neuronal excessiva, assim, se reduz a dor e outros sintomas inflamatórios, assim como se modula a ingestão de alimentos.

[005] Atividade de CB1 aberrante esteve implicada em diversas doenças que incluem, obesidade e distúrbios relacionados, tais como dislipidemia, diabetes, fibrose, doenças hepáticas, tais como esteatose hepática, doenças renais, doenças cardiovasculares e câncer.

[006] Síndrome de Prader Willi (PWS) é um distúrbio genético provocado pela perda de determinados genes paternais e é caracterizada pela obesidade, desenvolvimento lento de diabetes tipo 2 e fraqueza muscular. CB-1 foi validado como um alvo em PWS com o agonista reverso Rimonabanto (Motaghedi et al. (2011) Eur. J. Med. Genet. 54: 14-18). Rimonabanto (também denominado SR141716, Acomplia e Zimulti) foi um fármaco antiobesidade anorexígeno desenvolvido e lançado pela Sanofi-Aventis como um antagonista de CB1 oral central. O produto foi indicado para o tratamento de pacientes obesos e com sobrepeso com fatores de risco associados, tais como diabetes tipo 2 ou dislipidemia, em combinação com dieta e exercício. Em junho de 2006, o fármaco foi aprovado para obesidade pela EMEA. Em 2008, Sanofi-Aventis interrompeu todo o desenvolvimento e a comercialização do fármaco para todas as indicações, devido ao risco de graves problemas psiquiátricos que incluem ideação suicida. E janeiro de 2009, o EC retirou a autorização de comercialização do fármaco.

[007] Outro agonista reverso, taranabante (MK-0364) foi investigado pela Merck, porém, seus ensaios clínicos de fase 3 foram paralisados devido a um alto nível de efeitos colaterais que incluem depressão e ansiedade. Diversos outros agonistas inversos de CB1 (por exemplo, AM251, AM1387 e AM4113) e antagonistas (por exemplo, canabigerol, ibipinabante, otenabante, surinabante, tetra- hidrocanabivarina e virodamina) foram estudados, porém, estão nos estágios precoces de pesquisa ou foram relegados à pesquisa não humana devido aos efeitos colaterais no CNS.

[008] Diversos agonistas inversos/antagonistas de CB-1 que alvejam principalmente CB1 perifericamente expresso restringindo-se sua habilidade em cruzar a barreira hematoencefálica (BBB) são desenvolvidos. Por exemplo, TM-38837 é um agonista reverso/antagonista de CB1 na Fase 1 que é desenvolvido pela 7TM Pharma A/S para o tratamento de obesidade e distúrbios metabólicos. Outro antagonista silencioso perifericamente seletivo que não está ainda em consultório é AM6545. Antagonismo de CB-1 perifericamente seletivo pode ser uma maneira mais segura e mais eficaz de alvejar ação de endocanabinoide periférico em diversos tecidos: (1) Fígado - diminuir lipogênese, armazenamento de gordura e secreção de glicose; (2) Músculo - aumentar admissão de glicose e oxidação; (3) Adipócitos - diminuir lipogênese e armazenamento de gordura; diminuir síntese de adiponectina; e (4) gastrointestinal (GI) - aumentar saciedade, trânsito e absorção GI (Kloet e Woods (2009) Endocrinol. 150: 2531-2536).

[009] Moléculas biológicas, tais como anticorpos e proteínas de ligação relacionadas fornecem uma maneira potencialmente mais segura e mais eficaz de entregar um produto terapêutico e evitar envolvimento de CNS e efeitos colaterais. De modo geral, apenas cerca de 0,1% dos anticorpos circulantes cruzam a BBB intacta (Poduslo et al.

(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 91: 5705-5709; Yu e Watts (2013) Neurotherapeut. 10: 459-472). Portanto, intrinsecamente a baixa exposição de um produto biológico anti-CB1 funcional ao CNS apresenta uma oportunidade de ativar exclusivamente CB-1 perifericamente, deste modo, se limitam eventos adversos conduzidos pela farmacologia de pequenas moléculas no CNS.

[010] Anticorpos para CB1 foram descritos recentemente na técnica, porém, suas vantagens na clínica não são conhecidas. Consultar as Publicações de Patente nº U.S. 20170210797 e

20160145333.

[011] Portanto, ainda permanece uma necessidade em identificar agonistas inversos ou antagonistas anti-CB1 perifericamente restritos seguros e eficazes que não penetram significativamente na BBB para evitar os efeitos farmacológicos adversos de ativar CB1 no cérebro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[012] A invenção fornece proteínas de ligação que ligam o receptor de canabinoide tipo 1 (CB1), tais como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos úteis, no tratamento e diagnóstico da doença.

[013] Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que liga receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1) é fornecido, sendo que a proteína de ligação compreende seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs): CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3, em que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos G-Y-T-F-T-D-Y-W (resíduos 26 a 33 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através de uma substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de G na posição 1 é S; a substituição de T na posição 3 é E; a substituição de T na posição 5 é S ou N; a substituição de D na posição 6 é R ou Y; a substituição de Y na posição 7 é H; e a substituição de W na posição 8 é A ou N; CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos I-Y-P-Y-D-G-D-T (resíduos 51 a 58 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através de uma substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de I na posição 1 é F; a substituição de Y na posição 2 é D, S, ou T; a substituição de P na posição 3 é T; a substituição de Y na posição 4 é G, D, ou S; a substituição de D na posição 5 é Y ou S; a substituição de G na posição 6 é S; a substituição de D na posição 7 é E, G, ou R; e a substituição de T na posição 8 é A, S, ou I; CDR-H3 tem uma sequência de aminoácidos A-R-G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-W- X10-X11-Y (resíduos 98 a 113 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de A na posição 1 é S; a substituição de G na posição 3 é S; X1 na posição 4 é Q, Y, K, R, ou G, ou não está presente; X2 na posição 5 é E, Y, L ou G, ou não está presente; X3 na posição 6 é Y ou P, ou não está presente; X4 na posição 7 é Y, R, ou E, ou não está presente; X5 na posição 8 é G, ou não está presente; X6 na posição 9 é T, ou não está presente; X7 na posição 10 é N ou D, ou não está presente; X8 na posição 11 é Y, N, A, ou G, ou não está presente; X9 na posição 12 é N, Y, S, A, ou R, ou não está presente; a substituição de W na posição 13 é Y, A, ou P; X10 na posição 14 é L, M, F, ou G, ou não está presente; X11 na posição 15 é P, D, A, ou T, ou não está presente; a substituição de Y na posição 16 é V; CDR-L1 tem uma sequência de aminoácidos Q-X1-I-S-S-X2-Y (resíduos 27 a 33 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de Q na posição 1 é S ou E; X1 na posição 2 é E, S, T, N, G, ou R; a substituição de I na posição 3 é V; a substituição de S na posição 4 é A, R, ou G; a substituição de S na posição 5 é G, N, ou T; X2 na posição 6 é S, N, o peptídeo F-R-Y-

S, ou não está presente; e a substituição de Y na posição 7 é F, D, ou N; CDR-L2 tem uma sequência de aminoácidos: X1-T-S (resíduos 51 a 53 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, sendo que X1 na posição 1 é A, Y, G, R, D ou S; a substituição de T na posição 2 é A; a substituição de S na posição 3 é R; e CDR-L3 tem uma sequência de aminoácidos: Q-Q-Y-X1-S-X2-P-Y- T (resíduos 91 a 99 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, sendo que a substituição de Q na posição 1 é L ou H; a substituição de Q na posição 2 é H; a substituição de Y na posição 3 é S ou G; X1 na posição 4 é S, W, H, Y, N ou I; a substituição de S na posição 5 é E, R, G, T ou N; X2 na posição 6 é Y, I, S, T, L ou W; e a substituição de Y na posição 8 é P, L, F, ou não está presente; e em que a dita substituição, adição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido não inibe a habilidade do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em ligar CB1 humano.

[014] Tabelas 5 e 6 fornecem anticorpos anti-CB1 exemplificativos e fragmentos de ligação ao antígeno de função dos mesmos da invenção.

[015] Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que liga receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1) é fornecido, sendo que o anticorpo compreende CDRs de uma sequência de domínio pesado variável (VH) e CDRs de uma sequência de domínio leve variável (VL), sendo que a sequência de domínio VH é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318, e/ou em que o domínio de VL é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216,

228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

[016] Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que liga receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1) é fornecido, sendo que o anticorpo compreende uma sequência de domínio pesado variável (VH) e uma sequência de domínio leve variável (VL), sendo que a sequência de domínio VH é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318, e/ou em que o domínio de VL é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

[017] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve de um par VH/VL selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18/24, 30/36, 42/48, 54/60, 66/72, 78/84, 90/96, 102/108, 114/120, 126/132, 138/144, 150/156, 162/168, 174/180, 186/192, 198/204, 210/216, 222/228, 234/240, 246/252, 258/264, 270/276, 282/288, 294/300, 306/312 e 318/324.

[018] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par VH/VL selecionado a partir do grupo que consiste nas: SEQ ID NOs: 18/24, 30/36, 42/48, 54/60, 66/72, 78/84, 90/96, 102/108, 114/120, 126/132, 138/144, 150/156, 162/168, 174/180, 186/192, 198/204, 210/216, 222/228, 234/240, 246/252, 258/264, 270/276, 282/288, 294/300, 306/312 e 318/324.

[019] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de HCDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em (20, 21, 22); (32, 33, 34); (44, 45, 46); (56, 57, 58); (68, 69, 70); (80, 81, 82); (92, 93, 94); (104, 105, 106); (116, 117, 118); (128, 129, 130); (140, 141,

142); (152, 153, 154); (164, 165, 166); (176, 177, 178); (188, 189, 190); (200, 201, 202); (212, 213, 214); (224, 225, 226); (236, 237, 238); (248, 249, 250); (260, 261, 262); (272, 273, 274); (284, 285, 286); (296, 297, 298); (308, 309, 310); e (320, 321, 322) e um conjunto de LCDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em (26, 27, 28); (38, 39, 40); (50, 51, 52); (62, 63, 64); (74, 75, 76); (86, 87, 88); (98, 99, 100); (110, 111, 112); (122, 123, 124); (134, 135, 136); (146, 147, 148); (158, 159, 160); (170, 171, 172); (182, 183, 184); (194, 195, 196); (206, 207, 208); (218, 219, 220); (230, 231, 232); (242, 243, 244); (254, 255, 256); (266, 267, 268); (278, 279, 280); (290, 291, 292); (302, 303, 304); (314, 315, 316); e (326, 327, 328).

[020] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par (conjunto de HCDR/conjunto de LCDR) selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: (20, 21, 22/ 26, 27, 28); (32, 33, 34/ 38, 39, 40); (44, 45, 46/ 50, 51, 52); (56, 57, 58/ 62, 63, 64); (68, 69, 70/ 74, 75, 76); (80, 81, 82/ 86, 87, 88); (92, 93, 94/ 98, 99, 100); (104, 105, 106/ 110, 111, 112); (116, 117, 118/ 122, 123, 124); (128, 129, 130/ 134, 135, 136); (140, 141, 142/ 146, 147, 148); (152, 153, 154/ 158, 159, 160); (164, 165, 166/ 170, 171, 172); (176, 177, 178/ 182, 183, 184); (188, 189, 190/ 194, 195, 196); (200, 201, 202/ 206, 207, 208); (212, 213, 214/ 218, 219, 220); (224, 225, 226/ 230, 231, 232); (236, 237, 238/ 242, 243, 244); (248, 249, 250/ 254, 255, 256); (260, 261, 262/ 266, 267, 268); (272, 273, 274/ 278, 279, 280); (284, 285, 286/ 290, 291, 292); (296, 297, 298/ 302, 303, 304); (308, 309, 310/ 314, 315, 316); e (320, 321, 322/ 326, 327, 328).

[021] Numa modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par HC/LC selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17/23, 29/35, 41/47, 53/59, 65/71, 77/83, 89/95, 101/107, 113/119, 125/131, 137/143, 149/155, 161/167, 173/179, 185/191, 197/203, 209/215, 221/227, 233/239, 245/251,

257/263, 269/275, 281/287, 283/289, 305/311 e 317/323.

[022] Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que liga receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1) é fornecido, sendo que o anticorpo compreende CDRs de uma sequência de domínio pesado variável (VH) e CDRs de uma sequência de domínio leve variável (VL), sendo que a sequência de domínio VH tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318 e/ou a sequência de domínio de VL que tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

[023] Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 114 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 120. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 126 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

132. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 138 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 144. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 150 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

156. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 162 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 168. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 174 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

180. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 186 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 192. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 198 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

204. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 210 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 216. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 222 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

228. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 234 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 240. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 246 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

252. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 258 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 264. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 270 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

276. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 282 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 288. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 294 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

300. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 306 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 312. Numa modalidade, o VH é apresentado na SEQ ID NO: 318 e o VL é apresentado na SEQ ID NO:

324.

[024] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 é um anticorpo humano ou humanizado.

[025] Numa modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno anti- CB1 compreende um fragmento de Fab, um fragmento de Fab’, um fragmento de F(ab)2 ou um fragmento de scFv.

[026] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região de Fc humana selecionada a partir do grupo que consiste num Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM.

[027] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região de Fc humana modificada selecionada a partir do grupo que consiste em L234A/L235A (“LALA”), S228P, A330S, P331S, E233P/L234V/L235A, A327G/A330S/P331S, L234F/L235E/P331S e N297Q.

[028] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe ou é um antagonista da atividade de sinalização de CB1.

[029] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aprimora ou ativa ou é um agonista para a atividade de sinalização de CB1.

[030] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um agonista reverso para a atividade de sinalização de CB1.

[031] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado.

[032] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo completamente humano.

[033] Anticorpos anti-CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao epítopo substancialmente igual de CB1 como um anticorpo anti-CB1 humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são fornecidos.

[034] Anticorpos anti-CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que competem pela ligação ao CB1 com um anticorpo anti- CB1 humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são fornecidos.

[035] Numa modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se ligam ao CB1 tem uma afinidade de ligação Kd para CB1 de cerca de 1 µM ou menos.

[036] Numa modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se ligam ao CB1 tem uma afinidade de ligação Kd para CB1 de cerca de 100 nM ou menos.

[037] Numa modalidade, anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno exibe penetração cerebral reduzida em comparação com rimonabanto.

[038] Numa modalidade, anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno inibe a sinalização de CB1 que é pelo menos 2 vezes maior em comparação com rimonabanto.

[039] Numa modalidade, anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno exibe efeitos colaterais no CNS reduzidos em relação ao rimonabanto.

[040] Uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecida.

[041] Um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[042] Uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[043] Um método para modular a sinalização de CB1, sendo que o método compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[044] Um método para antagonizar CB1, sendo que o método compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[045] Um método para agonizar CB1, sendo que o método compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[046] Um método para agonizar inversamente CB1, sendo que o método compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido.

[047] Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecida.

[048] Um método para inibir a atividade biológica de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo é fornecido, sendo que o método compreende administrar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao indivíduo, deste modo, se inibe a atividade da proteína de CB1 no indivíduo.

[049] Um método para tratar uma doença associada à atividade de CB1 é fornecido, sendo que o método compreende administrar a composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um indivíduo que sofre com a doença.

[050] Um método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo à modulação de sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo é fornecido, sendo que o método compreende administrar a composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[051] Um método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo ao antagonismo ou agonismo inverso de sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo é fornecido, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[052] Um método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo ao agonismo de sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo é fornecido, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[053] Um método para diagnosticar uma doença ou um distúrbio associado ao CB1 é fornecido, sendo que o método compreende colocar uma célula em contato com um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[054] Numa modalidade, a doença ou o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em obesidade, obesidades sindrômicas que incluem síndrome de Prader-Willi (PWS), síndrome de Alstrom, síndrome de Bardet-Biedel (BBS), Osteodistrofia Hereditária de Albright (AHO), e síndrome de deleção de SIM1; diabetes e complicações relacionadas; dislipidemia; doenças hepáticas, tais como, por exemplo, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença do fígado gorduroso não alcoólica, e cirrose biliar primária; fibrose, por exemplo, fibrose renal; doença renal crônica; neuropatia diabética, glomeruloesclerose segmental focal, doença renal; doenças metabólicas, osteoporose, ateroesclerose, doença inflamatória, doença cardiovascular, câncer, dor, esclerose sistêmica, espasticidade de esclerose múltipla, glaucoma e vício em nicotina.

[055] Numa modalidade, a doença ou o distúrbio é uma doença renal (tal como Glomeruloesclerose Segmental Focal (FSGS), nefropatia diabética, síndrome de Alport, doença renal hipertensiva, síndrome nefrótica, síndrome nefrótica resistente a esteroide, doença de alteração mínima, nefropatia membranosa, nefropatia membranosa idiopática, glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN), MPGN mediada por complexo imunológico, MPGN mediada por complemento, Lúpus nefrite, glomerulonefrite pós-infecciosa, doença da membrana fina, glomerulonefrite proliferativa mesangial, amiloidose (primária), nefropatia clq, GN rapidamente progressiva, doença anti-GBM, glomerulonefrite C3, nefroesclerose hipertensiva, nefropatia de IgA, doença renal de proteinúrica, microalbuminuria, ou doença renal de macroalbuminuria), hipertensão arterial pulmonar, dor (tal como dor neuropática ou dor visceral), câncer (tal como carcinoma de mama quimiorresistente, câncer de mama resistente à adriamicina, câncer colorretal quimiorresistente, meduloblastoma, ou angiogênese tumoral), ansiedade, depressão, FSGS relacionada a transplante, síndrome nefrótica relacionada a transplante, proteinauria relacionada a transplante, doença hepática colestática, doença renal policística, doença renal policística dominante autossômica (ADPKD), obesidade, resistência à insulina, diabetes Tipo II, pré-diabetes, síndrome metabólica, doença do fígado gorduroso não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), gastroparesia diabética ou gastroparesia.

[056] Um conjugado de anticorpo que compreende um anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é fornecido, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado num agente selecionado a partir do grupo que consiste num agente terapêutico, um agente citotóxico, uma molécula de imunoadesão e um agente de imaginologia.

[057] Um kit que compreende o anticorpo anti-CB1 isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e orientações para o uso do anticorpo num ensaio imunológico é fornecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[058] O supracitado e outros recursos e vantagens da presente invenção, assim como a própria invenção, serão entendidos mais completamente a partir da seguinte descrição das modalidades quando lidar juntamente com os desenhos anexos, nos quais:

[059] A Figura 1 mostra os resultados de um ensaio de cAMP. Células cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi foram tratadas com anticorpos de CB1, um controle de isótipo, ou o antagonista de CB1 de molécula pequena JD5037, seguido por um desafio de agonista com 30 nM de CP-55,940 (indicado como “Mais CP”) na presença de forscolina. Antagonistas também foram testados sem a adição de CP-55,940, para estabelecer se tinham atividade agonística. Chave: CAB = Tampão de Ensaio Celular, indica antecedentes de ensaio; CAB/F = CAB mais 15 µM de forscolina, representa quantidade máxima de cAMP no ensaio; CAB/F/CP = CAB/F mais 30 nM de CP-55,940, corresponde a ~EC80 para CP-55,940.

[060] A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de p-ERK. Ensaios fosfo/ERK Total foram realizados com o uso de células cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi. Células foram tratadas com anticorpos anti- CB1 de camundongo ou o antagonista de CB1 de molécula pequena JD5037 seguido por um desafio de agonista com 30 nM de CP-55,940, na presença de forscolina. No fim do tratamento, placas foram processadas para p-ERK/ERK Total com o uso do kit MesoScale Discovery (MSD). Resultados são representados como uma porcentagem de resposta máxima (% máxima).

[061] A Figura 3 A mostra a ligação de anticorpos anti-huCB1 de camundongo às células huCB1-CHO. Curvas de ligação de anticorpos anti-CB1 murinos purificados foram tituladas 3 vezes a partir de concentrações de 200 nM de anticorpo. Todos os anticorpos mostram ligação específica nas células huCB1-CHO.

[062] A Figura 3B mostra a ligação de anticorpos anti-huCB1 de camundongo nas células moCB1-CHO. Todos os anticorpos mostram falta de ligação nas células moCB1-CHO.

[063] A Figura 4 mostra a avaliação de ligação de anticorpos anti- CB1 purificados na presença e ausência de moléculas pequenas de CB1 de agonista e antagonista CP5990 e JD5037, respectivamente.

[064] A Figura 5A mostra uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia pesada a partir de anticorpos de hibridoma M1-M8.

[065] A Figura 5B mostra uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia leve a partir de anticorpos de hibridoma M1-M8.

[066] A Figura 6A mostra uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia pesada de anticorpos humanizados M7-H1 a M7-H16, M5-H1 e M5-H2.

[067] A Figura 6B mostra uma sequência de consenso derivada de um alinhamento de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia leve de anticorpos humanizados M7-H1 a M7-H16, M5-H1 e M5- H2.

[068] A Figura 7A exibe a ligação celular numa concentração única de anticorpo de 30 µg/ml em células parentais CHO-huCB-1 e CHO de variantes de anticorpo de CB-1 humanizado de clones M5 e M7.

[069] A Figura 7B exibe a ligação celular numa concentração única de anticorpo de 30 µg/ml em células parentais CHO-huCB-1 e CHO de variantes de anticorpo de CB-1 humanizado de clone M7.

[070] A Figura 8A mostra os resultados do ensaio de cAMP conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 8A mostra uma comparação lado a lado entre diferentes cadeias principais para o anticorpo M5.

[071] A Figura 8B mostra os resultados do ensaio de cAMP conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 8B mostra uma comparação lado a lado entre diferentes cadeias principais para o anticorpo M7.

[072] A Figura 9A mostra os resultados do ensaio de p-ERK conforme descrito no Exemplo 4. A Figura 9A mostra uma comparação lado a lado entre diferentes cadeias principais para o anticorpo M5.

[073] A Figura 9B mostra os resultados do ensaio de p-ERK conforme descrito no Exemplo 4. A Figura 9B mostra uma comparação lado a lado entre diferentes cadeias principais para o anticorpo M7.

[074] A Figura 10 mostra os resultados do ensaio de cAMP para agonismo inverso com o uso dos métodos similares àqueles descritos no Exemplo 3. Células cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi foram tratadas com anticorpos de CB1 ou controle de isótipo seguido pela adição de forscolina. A linha roxa pontilhada representa o nível de cAMP liberado mediante tratamento com forscolina, a quantidade máxima de cAMP no ensaio. A linha vermelha corresponde ao agonista de molécula pequena de CB1 CP-55,940 usado como controle para o ensaio. Compostos que têm atividade de agonismo inverso têm curvas que vão na direção oposta ao agonista e sobre a linha CAB/F. Este experimento demonstra que ambas as variantes M7 testadas tiveram atividade de agonismo inverso.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[075] A menos que seja definido de outra forma, termos científicos e técnicos usados no presente documento têm os significados que são normalmente entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica. No caso de qualquer ambiguidade latente, definições fornecidas no presente documento prevalecem sobre qualquer definição de dicionário ou externa. A não ser que exigido de outro modo pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. A palavra “um” ou “uma” significa “pelo menos um” a menos que seja afirmado de outra forma. O significado da frase “pelo menos um” é equivalente ao significado da frase “um ou mais”. A palavra “ou” significa “e/ou” a menos que seja afirmado de outra forma. Conforme usado no presente documento, os termos “compreende”, “que compreende”, “que contém”, “que tem” e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na lei de patentes norte americana e podem significar “inclui”, “que inclui” e semelhantes; “que consiste essencialmente em” ou “consiste essencialmente” tem, da mesma forma, o significado atribuído na lei de patentes norte americana e o termo é aberto, o que permite a presença de mais daquilo que é citado, contato que características básicas ou inovadoras não sejam alteradas, porém, exclui modalidades da técnica anterior. A menos que seja especificamente afirmado ou esteja óbvio a partir do contexto, conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca de pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor afirmado. A menos que seja claro a partir do contexto, todos os valores numéricos fornecidos no presente documento são modificados pelo termo cerca de.

[076] Os métodos e técnicas fornecidos no presente documento são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e abordadas ao longo do presente relatório descritivo a menos que seja indicado de outra forma. As nomenclaturas, procedimentos e técnicas laboratoriais de cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteína e ácido nucleico, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos no presente documento são aqueles bem conhecidos e normalmente usados na técnica. Técnicas padrão são usadas para reações enzimáticas e técnicas de purificação, sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, entrega e tratamento de pacientes.

[077] Faixas fornecidas no presente documento são entendidas como estenografia para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, uma faixa de 1 a 50 é entendida por incluir qualquer número, combinação de números, ou subfaixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50.

[078] O termo “receptor de canabinoide tipo 1” ou ”CB1” significa o receptor de membrana de célula 7-transmembranar codificado pelo gene CNR1 e que tem a sequência de aminoácidos canonical da SEQ ID NO: 1 (Consultar https://www.uniprot.org/uniprot/P21554). A Tabela 1 descreve esta sequência, assim como cada um dos domínios da proteína.

TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE RECEPTOR DE CANABINOIDE TIPO 1 Domínio Resíduo de Aminoácido SEQ ID 1234567890123456789012345678901234567890 NO:

Completo 1

1 (Extracelular) Aminoácidos 1 a 116 da SEQ ID NO: 1 2

2 (Transmembrana) Aminoácidos 117 a 142 da SEQ ID NO: 1 3

3 (Citoplasmático) Aminoácidos 143 a 154 da SEQ ID NO: 1 4

4 (Transmembrana) Aminoácidos 155 a 175 da SEQ ID NO: 1 5

5 (Extracelular) Aminoácidos 176 a 187 da SEQ ID NO: 1 6

6 (Transmembrana) Aminoácidos 188 a 212 da SEQ ID NO: 1 7

7 (Citoplasmático) Aminoácidos 213 a 232 da SEQ ID NO: 1 8

8 (Transmembrana) Aminoácidos 233 a 255 da SEQ ID NO: 1 9

9 (Extracelular) Aminoácidos 256 a 273 da SEQ ID NO: 1 10

10 (Transmembrana) Aminoácidos 274 a 299 da SEQ ID NO: 1 11

11 (Citoplasmático) Aminoácidos 300 a 344 da SEQ ID NO: 1 12

Domínio Resíduo de Aminoácido SEQ ID 1234567890123456789012345678901234567890 NO: 12 (Transmembrana) Aminoácidos 345 a 365 da SEQ ID NO: 1 13 13 (Extracelular) Aminoácidos 366 a 377 da SEQ ID NO: 1 14 14 (Transmembrana) Aminoácidos 378 a 399 da SEQ ID NO: 1 15 15 (Citoplasmático) Aminoácidos 400 a 472 da SEQ ID NO: 1 16

[079] O termo “CB1 central” significa CB1 localizado em qualquer lugar no corpo, que inclui o cérebro e CNS.

[080] O termo “CB1 periférico” significa CB1 que não está localizado no cérebro ou CNS (por exemplo, CB1 perifericamente restrito).

[081] O termo “anticorpo” significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) que se liga especificamente a ou interage com um antígeno particular. O termo inclui, porém, sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados e enxertados. A menos que seja de outra forma modificado pelo termo “intacto”, como em “anticorpos intactos”, para os fins desta descrição, o termo “anticorpo” também inclui fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos de anticorpo Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, Fd, dAb e outros que retêm função de ligação ao antígeno, isto é, a habilidade de se ligar ao CB1 especificamente. Tipicamente, tais fragmentos compreenderiam um domínio de ligação ao antígeno. O termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, assim como multímeros dos mesmos. Numa modalidade de um anticorpo de comprimento completo, cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH). A CH é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). A CL é compreendida por um domínio de CL único. A VH e a VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FRs). De modo geral, cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino até ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs de um anticorpo anti-CB1 podem ser idênticas às sequências de linha genética humana, ou podem ser modificadas natural ou artificialmente. Uma sequência de consenso de aminoácido pode ser definida com base numa análise lado a lado de duas ou mais CDRs e/ou FRs. Moléculas de anticorpo podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou subclasse.

[082] Os termos “conjunto de HCDR” e “conjunto de LCDR” se referem a um grupo de três CDRs que ocorrem numa região variável única de uma cadeia pesada ou leve, respectivamente, que têm capacidade de ligação a um antígeno. O termo “par (conjunto de HCDR/conjunto de LCDR)” se refere ao pareamento de um conjunto de HCDR e uma LCDR que forma seis CDRs que constituem um sítio de ligação ao antígeno. Os limites exatos destas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al. (1987) e (1991)) não fornece somente um sistema de numeração de resíduo não ambíguo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites de resíduo precisos que definem as três CDRs.

Estas CDRs podem ser denominadas CDRs de Rabat.

O termo “numeração de Rabat” significa um sistema de numeração de resíduos de aminoácido que são mais variáveis (isto é, hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácido nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (Rabat et al. (1971) Ann.

NY Acad.

Sci. 190: 382-391 e Rabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S.

Department of Health and Human Services, nº de Publicação da NIH 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, as faixas de região hipervariável das posições de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posições de aminoácido 50 a 65 para CDR2, e posições de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para a região variável de cadeia leve, as faixas de região hipervariável das posições de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácido 50 a 56 para CDR2, e posições de aminoácido 89 a 97 para CDR3. Chothia e colegas (Chothia e Lesk (1987) J.

Mol.

Biol. 196: 901- 917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883) constataram que determinadas subporções dentro de CDRs de Rabat adotam conformações de cadeia principal de peptídeo quase idênticas, apesar de terem grande diversidade no nível de sequência de aminoácidos.

Estas subporções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3, em que o “L” e o “H” designam as regiões de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente.

Estas regiões podem ser denominadas CDRs de Chothia, que têm limites que se sobrepõem às CDRs de Rabat.

Outros limites que definem CDRs que se sobrepõem às CDRs de Rabat foram descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 e Maccallum (1996) J.

Mol.

Biol. 262(5):732-45). Ainda, outras definições de limite de CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas no presente documento, porém, não obstante, vão se sobrepor às CDRs de Rabat, embora possam ser encurtadas ou esticadas sob a luz de constatações de previsão ou experimentais de que resíduos ou grupos de resíduos particulares ou mesmo CDRs inteiras não impactam significativamente a ligação ao antígeno. As composições e métodos descritos no presente documento podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um destes sistemas.

[083] O termo “par de VH/VL” se refere a VH e VL que são pareadas e têm capacidade para se ligar a um antígeno.

[084] O termo “par de HC/LC” se refere a HC e LC que são pareadas e têm capacidade para se ligar a um antígeno.

[085] O termo “região de Fc” significa a região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, que pode ser gerada através da digestão de papaína de um anticorpo intacto. A região de Fc pode ser uma região de Fc de sequência nativa ou uma região de Fc variante. A região de Fc de uma imunoglobulina compreende, de modo geral, dois domínios constantes, um domínio de CH2 e um domínio de CH3, e opcionalmente compreende um domínio de CH4. Substituições de resíduos de aminoácido na porção de Fc para alterar a função efetora de anticorpo são conhecidas na técnica (por exemplo, documentos de Patente nº U.S. 5.648.260 e 5.624.821). A região de Fc media diversas funções efetoras importantes, por exemplo, indução de citocina, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e meia- vida/taxa de depuração de anticorpo e complexos de antígeno e anticorpo. Em alguns casos estas funções efetoras são desejáveis para uma imunoglobulina terapêutica, porém, em outros casos podem ser desnecessárias ou mesmo prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos.

[086] Os termos “anticorpo que liga CB1” e “anticorpo anti-CB1” significam anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que ligam proteína de CB1 solúvel ou um fragmento da mesma (por exemplo, uma porção do domínio extracelular de CB1) e/ou CB1 expresso em superfície celular. A expressão “CB1 expresso em superfície celular” significa uma proteína de CB1 ou porção da mesma que é expressa na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção da proteína de CB1 seja exposta ao lado extracelular da membrana celular e seja acessível a uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo.

[087] Os termos “proteína de CB1 de ligação” ou “proteína de ligação anti-CB1” significam proteínas que se ligam ao CB1 que compreendem todo ou uma porção de um fragmento de ligação ao antígeno e proteínas incluídas que compreendem uma disposição alternativa dos domínios de anticorpo típicos ou framework, tais como imunoglobulinas multivalentes ou multiespecíficas recombinantes, assim como conjugados e proteínas de fusão. As proteínas de ligação ao CB1 da invenção e variantes e mutantes das mesmas retêm ligação e função de CB1, ou podem fornecer funções adicionais ou alternativas. Tais proteínas de ligação ao CB1 estão dentro do escopo da presente invenção e são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[088] Os termos "domínio de ligação ao antígeno” e "fragmento de ligação ao antígeno” em referência a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, significa uma porção ou fragmento de um anticorpo, ou variante ou mutante do mesmo, que retém a habilidade de se ligar especificamente ao antígeno-alvo do anticorpo e inclui qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas com o uso de quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como técnicas de digestão proteolítica ou de engenharia genética recombinante que envolvem a manipulação e expressão de domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpo de decodificação de DNA.

Um ou mais domínios variáveis e/ou constantes podem estar dispostos numa configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.

Diversos formatos de fragmento, mutante ou anticorpo variante que compreendem fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos na técnica.

Exemplos sem limitação de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento de F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento de Fd que compreende os domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento de Fv que compreende os domínios de VL e VH de um braço único de um anticorpo; (v) uma molécula de Fv de cadeia única (scFv); (vi) um fragmento de dAb que compreende um domínio variável único; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada, tal como um peptídeo de CDR3), ou um peptídeo restrito FR3- CDR3-FR4. Outras moléculas modificadas geneticamente, tais como anticorpos de domínio específico, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, anticorpos lineares (que compreendem um par de segmentos de Fv em tandem; VH-CH1-VH- CH1 que formam um par de sítios de ligação ao antígeno com polipeptídeos de cadeia leve complementares), triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), e domínios de IgNAR variáveis de tubarão, também estão englobados na expressão “fragmento de ligação ao antígeno”, conforme usado no presente documento. O termo “fragmento de ligação ao antígeno do mesmo” não pretende limitar e inclui fragmentos contidos nas moléculas variantes que podem ter regiões de anticorpo adicionais ou redispostas, por exemplo, anticorpos e conjugados de anticorpo multiespecíficos que retêm o mesmo antígeno que se liga a um antígeno particular.

[089] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreenderá, tipicamente, pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e compreenderá, de modo geral, pelo menos uma CDR que é adjacente a ou enquadrada com uma ou mais sequências de framework. Em fragmentos de ligação ao antígeno que têm um domínio de VH associado a um domínio de VL, os domínios de VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio de VH ou VL monomérico.

[090] Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplificativas sem limitação de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2- CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL- CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, que incluem qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados uns aos outros ou podem ser ligados através de uma região de articulação ou ligante completa ou parcial. Uma região de articulação pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam numa ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes numa molécula de polipeptídeo única. Além disto, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios de VH ou VL monoméricos (por exemplo, através de ligação (ou ligações) de dissulfeto).

[091] Com relação às moléculas de anticorpo completo, fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois diferentes domínios variáveis, em que cada domínio variável tem capacidade para se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, que inclui os formatos de anticorpo biespecíficos exemplificativos descritos no presente documento, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção com o uso de técnicas de rotina disponíveis na técnica.

[092] O termo “especificidade” ou “específico para” em referência a uma proteína de ligação significa a habilidade da proteína de ligação em se ligar seletivamente a um alvo ou antígeno, por exemplo, com uma afinidade maior (isto é, um valor de Kd inferior) do que para qualquer outro alvo ou antígeno.

[093] Os anticorpos da presente invenção podem, em determinadas modalidades, funcionar através da citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). CDC se refere à lise de células de expressão de antígeno através de um anticorpo da invenção na presença de complemento. “ADCC” se refere a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Exterminadoras Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado numa célula-alvo e que resulta em lise da célula-alvo. CDC e ADCC podem ser medidas com o uso de ensaios que são bem conhecidos e estão disponíveis na técnica. (Consultar, por exemplo, documentos de Patente nº U.S. 5.500.362 e 5.821.337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.) 95: 652-656).

[094] O termo “anticorpo de camundongo” significa um anticorpo que tem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha genética de camundongo. Anticorpos de camundongo podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha genética de camundongo (por exemplo, mutações introduzidas através de mutagênese aleatória ou de sítio específico in vitro ou através de mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo “anticorpo de camundongo” não pretende incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha genética de outras espécies de mamífero, tais como um ser humano, foram enxertadas nas sequências de framework de camundongo.

[095] O termo “anticorpo recombinante” significa um anticorpo que é preparado, expresso, criado ou isolado através de meios recombinantes, tais como anticorpos expressos com o uso de um vetor de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira,

anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante, anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências de gene de imunoglobulina em outras sequências de DNA. Em determinadas modalidades, tais anticorpos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de imunoglobulina é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas às sequências de VH e VL de linha genética, podem não existir naturalmente dentro de um repertório de linha genética de anticorpo particular in vivo.

[096] O termo “anticorpo isolado” significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula na qual o anticorpo existe naturalmente ou é produzido naturalmente, é um “anticorpo isolado” para os fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com determinadas modalidades, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou produto químico.

[097] O termo anticorpo de “neutralização” ou “bloqueio” significa um anticorpo cuja ligação a seu ligante ou antígeno combate uma atividade biológica do ligante ou antígeno. Numa modalidade, a proteína de ligação de neutralização se liga a um antígeno (por exemplo, uma citocina) e reduz sua atividade biológica em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais. Um anticorpo de neutralização que se liga ao CB1: (i) interfere na interação entre CB1 ou um fragmento de CB1 e um ligante de CB1 (por exemplo, canabinoide, etc.), e/ou (ii) resulta na inibição de pelo menos uma função biológica de CB1. A inibição causada por um anticorpo de neutralização ou bloqueio de CB1 não precisa ser concluída contanto que seja detectável com o uso de um ensaio apropriado. Ensaios exemplificativos para detectar a inibição de CB1 são descritos no presente documento.

[098] O termo “afinidade” significa a força da interação entre uma proteína de ligação e seu antígeno-alvo, e é determinada pela sequência das CDRs da proteína de ligação, assim como pela natureza do antígeno e anticorpo, tal como seu tamanho, formato e/ou carga. Proteínas de ligação podem ser selecionadas por afinidades que fornecem pontos finais terapêuticos desejados enquanto minimizam efeitos colaterais negativos. Afinidade pode ser medida com o uso de métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[099] O termo “anticorpo de afinidade madura” significa que uma ou mais alterações foram realizadas numa ou mais CDRs ou FRs das mesmas que resultam num melhoramento na afinidade do anticorpo para seu antígeno-alvo, em comparação com o anticorpo “parente” não alterado que não tem esta alteração (ou alterações). Anticorpos de afinidade madura exemplificativos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno-alvo. Os anticorpos de afinidade madura são produzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, Marks et al. (1992) BioTechnology 10: 779-783 descreve a maturação de afinidade através de embaralhamento de domínio de VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de framework é descrita por Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci.

E.U.A. 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. lmmunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. lmmunol. 154(7): 3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889- 896 e mutações em posições de mutagênese seletiva, posições de contato ou hipermutação com uma atividade que aprimora resíduo de aminoácido são descritas no documento de patente nº U.S. 6.914.128.

[0100] O termo “anticorpo enxertado com CDR” significa um anticorpo que compreende sequências de região variável de cadeia pesada e leve nas quais as sequências de uma ou mais das regiões de CDR da VH e/ou VL são substituídas por sequências de CDR de outro anticorpo. Por exemplo, os dois anticorpos podem ser de diferentes espécies, tais como anticorpos que têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve murinas nas quais uma ou mais das sequências de CDR murina foram substituídas por sequências de CDR humana.

[0101] O termo “anticorpo humanizado” significa um anticorpo de uma espécie não humana que foi alterado para ser mais similar às sequências de linha genética humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo enxertado com CDR, no qual uma ou mais sequências de CDR são não humanas e as sequências de região de framework (FR) são humanas ou substancialmente humanas (por exemplo, são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à sequência de aminoácidos de um anticorpo humano). Um anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, FabC, Fv) nos quais a sequência de todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e a sequência de todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode incluir as regiões de CH1, articulação, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Numa modalidade, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região de Fc de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou um domínio variável humanizado de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém uma cadeia leve, assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém uma cadeia pesada, assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia leve.

[0102] O termo “potência” significa a habilidade de uma proteína de ligação em alcançar um efeito desejado, e é uma medição de sua eficácia terapêutica. Potência pode ser medida com o uso de métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0103] O termo “quantidade eficaz” significa uma dosagem ou quantidade que é suficiente para reduzir a atividade de CB1 para resultar na amenização de sintomas num paciente ou para alcançar um resultado biológico desejado. Resultados biológicos desejados incluem, por exemplo, redução ou aumento da atividade de CB1.

[0104] O termo “reativo de forma cruzada” significa a habilidade de uma proteína de ligação em se ligar a um antígeno-alvo diferente daquele contra o qual foi elevado. De modo geral, uma proteína de ligação se ligará a seu antígeno-alvo com uma afinidade apropriadamente alta, porém, pode se ligar ao mesmo antígeno-alvo de outra espécie ou exibir uma baixa afinidade para antígenos não alvo. Proteínas de ligação individuais são selecionadas, de modo geral, para corresponder a dois critérios: (1) tingimento de tecido apropriado para a expressão conhecida do alvo de anticorpo; e (2) modelo de tingimento similar entre tecidos de espécies de estudo humano e de toxicidade (por exemplo, camundongo e macaco cinomólogo) do mesmo órgão. Estes e outros métodos para avaliar reatividade cruzada são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0105] O termo “função biológica” significa as atividades in vitro ou in vivo específicas de uma proteína de ligação esteja presente naturalmente ou habilitada através de meios recombinantes. As proteínas de ligação podem alvejar diversas classes de antígenos e alcançar resultados terapêuticos desejados através de múltiplos mecanismos de ação. Proteínas de ligação podem agonizar, antagonizar ou neutralizar a atividade de seus alvos. Proteínas de ligação podem auxiliar na depuração dos alvos nos quais se ligam, ou podem resultar na citotoxicidade quando ligadas às células. Porções de dois ou mais anticorpos podem ser incorporadas num formato multivalente para alcançar funções distintas numa única molécula de proteína de ligação. As atividades biológicas incluem, porém sem limitação, ligar um receptor, induzir proliferação celular, inibir crescimento celular, induzir outras citocinas, induzir apoptose e atividade enzimática. Ensaios in vitro e modelos in vivo usados para avaliar função biológica são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0106] O termo “estável” significa ter capacidade para reter sua integridade física, química e/ou biológica ou atividade dentro de um dado período de tempo ou condições de armazenamento. Uma proteína de ligação que é estável in vitro em várias temperaturas durante um período de tempo estendido é geralmente desejável. Métodos de estabilização de proteínas de ligação e avaliação de sua estabilidade em várias temperaturas são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0107] O termo “solubilidade” significa a habilidade de uma proteína em permanecer dispersa dentro de uma solução aquosa. A solubilidade de uma proteína numa formulação aquosa depende da distribuição apropriada de resíduos de aminoácido hidrofóbicos e hidrofílicos e, portanto, a solubilidade pode se correlacionar com a produção de proteínas corretamente dobradas. Uma pessoa versada na técnica terá capacidade para detectar um aumento ou diminuição na solubilidade de uma proteína de ligação com o uso de técnicas e métodos de HPLC de rotina conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0108] O termo “imunogenicidade” significa a habilidade de uma substância em induzir uma resposta imunológica. Administração de uma proteína de ligação terapêutica pode resultar numa determinada incidência de uma resposta imunológica. Métodos para reduzir a imunogenicidade de anticorpos e proteínas de ligação são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0109] O termo “identificação detectável” significa uma porção química ligada a um membro de um par de ligação específico, tal como um anticorpo ou seu analito, para tornar uma reação (por exemplo, ligação) entre os membros do par de ligação específico detectável. O membro identificado do par de ligação específica é denominado "identificado de modo detectável". Assim, o termo "proteína de ligação identificada" se refere a uma proteína com uma identificação detectável incorporada que fornece a identificação da proteína de ligação. Numa modalidade, a identificação detectável pode produzir um sinal que é detectável por meios visuais ou instrumentais, por exemplo, incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de porções químicas de biotinila que podem ser detectadas através de avidina (por exemplo, estreptavidina que contém um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada através de métodos ópticos ou colorimétricos). Os exemplos de identificações detectáveis para polipeptídeos incluem, porém, sem limitação, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153 H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho ou Sm); cromogênios, identificações fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fosfatos de lantanídeo), identificações enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, luciferase, fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos biotinila; epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um segundo repórter (por exemplo, sequências de par de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo); e agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio. Exemplos representativos de identificações normalmente empregadas para imunoensaios incluem porções químicas que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções químicas que produzem fluorescência, por exemplo, fluoresceína. Neste sentido, a própria porção química pode não ser identificada de modo detectável, mas pode tornar-se detectável mediante reação com ainda outra porção química.

[0110] O termo “conjugado” se refere a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, que é quimicamente ligada a outra molécula funcional ou segunda porção química, tal como um agente terapêutico, agente citotóxico, agente citostático, ou agente de imaginologia (consultar, por exemplo, o documento nº 7.850.962). O termo “agente” inclui um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, tal como um peptídeo de proteína, ou um extrato produzido a partir de materiais biológicos. Numa modalidade, os agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, porém, sem limitação, um antimetabólito, um agente alquilante, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente antiangiogênico, um agente antimitótico, uma antraciclina, uma toxina e um agente apoptótico. Agentes úteis incluem, por exemplo, toxina de tosse convulsa, taxol,

citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes de imaginologia úteis na produção de conjugados de proteína de ligação anti-CB1 incluem, porém, sem limitação, uma radioidentificação, uma enzima, uma identificação fluorescente, uma identificação luminescente, uma identificação bioluminescente, uma identificação magnética e biotina. Quando empregado no contexto de um imunoensaio, o anticorpo conjugado pode ser um anticorpo identificado de modo detectável usado como o anticorpo de detecção. Anticorpos podem ser ligados através de reticulação química ou através de métodos recombinantes. Os anticorpos também podem ser ligados a um dentre uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada nos documentos de Patente nº U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;

4.670.417; 4.791.192; ou 4.179.337. Anticorpos podem ser quimicamente modificados através de conjugação covalente num polímero, por exemplo, para aumentar sua meia-vida de circulação. Polímeros exemplificativos e métodos para ligar os mesmos também são mostrados nos documentos de Patente nº U.S. 4.766.106;

4.179.337; 4.495.285 e 4.609.546.

[0111] O termo “cristalizado” significa uma proteína de ligação que existe na forma de um cristal. Cristais são uma forma do estado sólido da matéria, que é distinto de outras formas, tais como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Cristais são compostos por arranjos tridimensionais repetidos regulares de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas, tais como anticorpos), ou montagens moleculares (por exemplo, complexos de antígeno/anticorpo).

[0112] O termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucleico que tem capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual outros segmentos de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Outros vetores incluem vetores de RNA. Determinados vetores têm capacidade para replicação autônoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamífero epissomais). Outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e, deste modo, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro (por exemplo, vetores de mamífero não epissomais). “Vetores de expressão recombinantes” ou “vetores de expressão” têm capacidade para direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados intercambiavelmente, na medida em que o plasmídeo é a forma normalmente mais usada de vetor. No entanto, outras formas de vetores de expressão também são incluídas, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e adenovírus associados), que servem a funções equivalentes.

[0113] Os termos “célula hospedeira recombinante” ou “célula hospedeira” significam uma célula na qual DNA ou RNA exógeno foi introduzido. Tais termos se referem não só à célula particular em questão, mas à progenitura de uma tal célula. Devido ao fato de que determinadas modificações podem ocorrer em gerações subsequentes devido à mutação ou influências ambientais, tal progenitura pode, de fato, não ser idêntica à célula parental, porém, ainda estão incluídas no escopo do termo “célula hospedeira” conforme usado no presente documento. Numa modalidade, células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas. Numa modalidade, células eucarióticas incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. Em outra modalidade, células hospedeiras incluem, porém, sem limitação, a linha de célula procariótica E. coli; linhas de célula de mamífero CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 e PER.C6; a linha de célula de inseto Sf9; e a célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

[0114] O termo “transfecção” significa uma variedade de técnicas normalmente usadas para a introdução de ácido nucleico exógeno numa célula hospedeira, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrana e semelhantes.

[0115] O termo “amostra biológica” significa uma quantidade de uma substância de um ser vivo ou ser recentemente vivo. Tais substâncias incluem, porém, sem limitação, sangue, plasma, soro, urina, fluido amniótico, fluido sinovial, células endoteliais, leucócitos, monócitos, outras células, órgãos, tecidos, medula óssea, nodos linfáticos e baço.

[0116] O termo "controle" se refere a uma composição conhecida por não conter um analito ("controle negativo") ou que contém analito ("controle positivo"). Um controle positivo pode compreender uma concentração conhecida de analito ou pode ser usado para estabelecer características de desempenho de ensaio e é um indicador útil da integridade de reagentes.

[0117] O termo “par de ligação específico” significa duas moléculas diferentes que se ligam especificamente entre si através de meios químicos ou físicos. Pares de ligação específica incluem, por exemplo, um anticorpo e seu antígeno, biotina e avidina (ou estreptavidina), um carboidrato e uma lectina, sequências de nucleotídeo complementares, moléculas efetoras e receptoras, cofatores e enzimas, enzima e inibidores e enzimas, e fragmentos e análogos dos mesmos que retêm ligação específica. Um exemplo de um par de ligação específica é uma região VH e VL de um anticorpo (“VH/VL”).

[0118] O termo “ligante” significa um resíduo de aminoácido ou um polipeptídeo que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido unidos por ligações peptídicas que são usadas para ligar dois polipeptídeos (por exemplo, dois domínios de VH ou dois domínios de VL). Ligantes são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0119] O termo “epítopo” se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas num antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido através de aminoácidos espacialmente justapostos a partir de diferentes segmentos da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido através de resíduos de aminoácido adjacentes numa cadeia de polipeptídeo. Em determinada circunstância, um epítopo pode incluir porções químicas de aminoácidos, sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Proteínas de ligação “se ligam ao mesmo epítopo” caso se liguem aos mesmos aminoácidos no antígeno e também podem competir de forma cruzada (um anticorpo evita o efeito de ligação ou modulação do outro). Além disto, definições estruturais de epítopos (sobreposição, similar, idêntica) são informativas; e definições funcionais englobam parâmetros estruturais (ligação) e funcionais (modulação, competição).

[0120] O termo “farmacocinética” significa o processo pelo qual um fármaco é absorvido, distribuído, metabolizado e excretado por um organismo.

[0121] O termo “biodisponibilidade” significa a quantidade de fármaco ativo que alcança sua administração-alvo seguinte. Biodisponibilidade é uma função das diversas propriedades que incluem estabilidade, solubilidade, imunogenicidade e farmacocinética, e podem ser avaliadas com o uso de métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0122] O termo “ressonância de plasmon em superfície” significa um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real através da detecção de alterações nas concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, com o uso do sistema BIAcore® (BIAcore International AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26).

[0123] Os termos “Kon”, “constante de taxa de associação” e “Ka” significam a constante de taxa de ativação para associação de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) a um antígeno para formar o complexo de proteína de ligação/antígeno. Este valor indica a taxa de ligação de uma proteína de ligação a seu antígeno-alvo ou a taxa de formação de complexo entre uma proteína de ligação e um antígeno conforme mostrado pela seguinte equação: Anticorpo (“Ab”) + Antígeno (“Ag”) → “Ab-Ag”

[0124] Os termos “Koff” e “constante de taxa de dissociação” significam a constante de taxa de desativação para dissociação de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo) de um complexo de proteína de ligação/antígeno. Este valor indica a taxa de dissociação de uma proteína de ligação de seu antígeno alvo ou a separação do complexo Ab-Ag ao longo do tempo em anticorpo e antígeno livres, conforme mostrado pela seguinte equação:

Ab + Ag ← Ab-Ag

[0125] Os termos “Kd” e “constante de dissociação de equilíbrio” significam o valor obtido numa medição de titulação em equilíbrio, ou dividindo-se a constante de taxa de dissociação (Koff) pela constante de taxa de associação (Kon). Métodos para determinar constantes de taxa de associação e dissociação são bem conhecidas na técnica. Técnicas com base em fluorescência oferecem alta sensibilidade e a habilidade em examinar amostras em tampões fisiológicos em equilíbrio. Outras abordagens experimentais e instrumentos, tais como um ensaio BIAcore® (BIAcore international AB, Uppsala, Suécia) ou um ensaio KinExA® (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) podem ser usados.

[0126] O termo “variante” significa um polipeptídeo que se difere de um dado polipeptídeo na sequência de aminoácidos através da adição, inserção, deleção ou substituição conservadora de aminoácidos, porém, que retém a atividade biológica do dado polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo variante pode competir com um anticorpo nativo pela ligação a seu alvo). Uma substituição conservadora de um aminoácido, trocar um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade e grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida na técnica por envolver tipicamente uma alteração menor. Estas alterações menores podem ser identificadas, em parte, considerando-se o índice hidropático de aminoácidos, conforme entendido na técnica. O índice hidropático de um aminoácido é com base numa consideração de sua hidrofobicidade e carga. Aminoácidos de índices hidropáticos similares numa proteína podem ser substituídos e a proteína ainda retém a função de proteína. Num aspecto, aminoácidos que têm índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que retêm função biológica.

Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilicidade média local daquele peptídeo, uma medição útil que foi relatada por se correlacionar bem com antigenicidade e imunogenicidade. A substituição de aminoácidos que têm valores de hidrofilicidade similares pode resultar em peptídeos que retêm atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, conforme entendido na técnica. Num aspecto, substituições são realizadas com aminoácidos que têm valores de hidrofilicidade dentro de ± 2 entre si. Tanto o índice de hidrofobicidade quanto o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular daquele aminoácido. Consistente com aquela observação, substituições de aminoácido que são compatíveis com a função biológica são entendidas por depender da similaridade relativa dos aminoácidos e, particularmente, as cadeias laterais daqueles aminoácidos, conforme descritas pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades. O termo “variante” também inclui polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos que foram diferencialmente processados, tal como através de proteólise, fosforilação ou outra modificação pós- translacional, ainda, retém atividade biológica ou reatividade de antígeno. O termo “variante” engloba fragmentos de uma variante a menos que seja definido de outra forma. Uma variante pode ser 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, ou 75% idêntica à sequência de tipo selvagem.

[0127] Os anticorpos anti-CB1 descritos no presente documento podem compreender uma ou mais substituições de aminoácido, adições, inserções e/ou deleções nas regiões de framework e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linha genética correspondentes das quais os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente determinadas comparando-se as sequências de aminoácidos descritas no presente documento com sequências de linha genética disponíveis a partir de bancos de dados públicos de sequência de anticorpos.

A presente invenção inclui anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas no presente documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de framework e/ou CDR são mutadas para o resíduo (ou resíduos) correspondente da sequência de linha genética a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou para o resíduo (ou resíduos) correspondente de outra sequência de linha genética humana, ou para uma substituição de aminoácido conservadora do resíduo (ou resíduos) de linha genética correspondente (tais alterações de sequência são denominadas coletivamente no presente documento “mutações de linha genética”). Uma pessoa de habilidade comum na técnica, a partir das sequências de região variável de cadeia pesada e leve descritas no presente documento, podem produzir facilmente diversos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linha genética individuais ou combinações das mesmas.

Em determinadas modalidades, todos os resíduos de framework e/ou CDR dentro dos domínios de VH e/ou VL são mutados de volta aos resíduos encontrados na sequência de linha genética original a partir da qual o anticorpo foi derivado.

Em outras modalidades, apenas determinados resíduos são mutados de volta para a sequência de linha genética original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos de framework e/ou CDR são mutados para o resíduo (ou resíduos) correspondente de uma sequência de linha genética diferente (isto é, uma sequência de linha genética que é diferente da sequência de linha genética a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Ademais, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linha genética dentro das regiões de framework e/ou CDR, por exemplo, em que determinados resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linha genética particular enquanto outros determinados resíduos que se diferem da sequência de linha genética original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linha genética diferente. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações de linha genética podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como, especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas melhoradas ou aprimoradas (como pode ser o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral são englobados na presente invenção.

[0128] Os termos “identidade substancial” e “substancialmente idêntico” ao se referirem a um ácido nucleico, indicam que, quando alinhados de maneira ideal com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há uma identidade de sequência de nucleotídeo, respectivamente, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% das bases de nucleotídeo, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido da identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme abordado abaixo. Uma molécula de ácido nucleico que tem identidade substancial a uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em determinados casos, codificar um polipeptídeo que tem sequência de aminoácidos igual ou substancialmente similar ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0129] Os termos “similaridade substancial” e “substancialmente similar” ao se referirem a um polipeptídeo significam que duas sequências de polipeptídeo, quando alinhadas de maneira ideal, tal como através dos programas GAP ou BESTFIT que usam pesos de vão padrão, compartilham pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência. Numa modalidade, as posições de resíduo que não são idênticas se diferem por substituições de aminoácido conservadoras. A presente invenção também inclui anticorpos anti-CB1 que compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos VH, VL, e/ou CDR descritas no presente documento que têm uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CB1 que têm sequências de aminoácidos VH, VL, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc., substituições de aminoácido conservadoras em relação a qualquer uma das sequências de aminoácidos VH, VL, e/ou CDR descritas no presente documento. Uma “substituição de aminoácido conservadora” é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos se diferem entre si por substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para produzir este ajuste são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Consultar, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, incorporado no presente documento a título de referência. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; (3) cadeias laterais que contêm amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais que contêm enxofre são cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservadora são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de probabilidade logarítmica PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, incorporado no presente documento a título de referência. Uma substituição “moderadamente conservadora” é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de probabilidade logarítmica PAM250.

[0130] Similaridade de sequência para polipeptídeos, que também é denominada identidade de sequência, é tipicamente medida com o uso de software de análise de sequência. O software de análise de proteína corresponde sequências similares com o uso de medições de similaridade atribuídas às várias substituições, deleções e outras modificações, que incluem substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, o software GCG contém programas, tais como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente ligados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma muteína da mesma. Consultar, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas com o uso de FASTA que usa parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e percentual de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de pesquisa e busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial ao comparar uma sequência da invenção com um banco de dados que contém um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, que usam parâmetros padrão. Consultar, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402, cada um incorporado no presente documento a título de referência.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DOS ANTICORPOS

[0131] A presente invenção inclui anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que ligam CB1 com alta afinidade.

[0132] São fornecidos anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção que têm uma constante de taxa de ativação (Kativação) para CB1 selecionada a partir do grupo que consiste em: pelo menos cerca de 102 M-1s-1; pelo menos cerca de 103 M-1s-1; pelo menos cerca de 104 M-1s-1; pelo menos cerca de 105 M-1s-1; e pelo menos cerca de 106 M-1s-1, conforme medido por ressonância de plasmon em superfície.

[0133] São fornecidos anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção que têm uma constante de taxa de desativação (Kdesativação) para o dito alvo selecionada a partir do grupo que consiste em: no máximo cerca de 10-3s-1; no máximo cerca de 10- 4 -1 s ; no máximo cerca de 10-5s-1; e no máximo cerca de 10-6s-1, conforme medido por ressonância de plasmon em superfície.

[0134] São fornecidos anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção que têm uma constante de dissociação (KD) para o dito alvo selecionada a partir do grupo que consiste em: no máximo cerca de 10-7 M; no máximo cerca de 10-8 M; no máximo cerca de 10-9 M; no máximo cerca de 10-10 M; no máximo cerca de 10-11 M; no máximo cerca de 10-13 M; e no máximo 10-14 M. Os anticorpos anti-CB1 e fragmentos dos mesmos podem ter um valor de afinidade de ligação Kd para CB1 na faixa de cerca de 0,01 nM a cerca de 500 nM, cerca de 0,02 nM a cerca de 250 nM, cerca de 0,02 a cerca de 200 nM, cerca de 0,05 a cerca de 100 nM, cerca de 0,05 a cerca de 50 nM. Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ter um valor de afinidade de ligação Kd para CB1 de cerca de 500 nM ou menos, cerca de 250 nM ou menos, cerca de 200 nM ou menos, cerca de 150 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 75 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 25 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos, cerca de 500 pM ou menos, cerca de 250 pM ou menos, cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos, ou cerca de 10 pM ou menos. Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção ligam CB1 com uma Kd menor que cerca de 15 pM, menor que cerca de 10 pM, menor que cerca de 8 pM, menor que cerca de 6 pM, menor que cerca de 4 pM, menor que cerca de 2 pM, ou menor que cerca de 1 pM.

[0135] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são pelo menos tão potentes quanto moduladores de receptor de CB1 de molécula pequena, tal como, por exemplo, rimonabanto, taranabanto, AM251, AM1387, AM4113, canabigerol, ibipinabanto, otenabanto, surinabanto, tetra-hidrocanabivarina e virodamina, e AM6545. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos têm atividade de antagonista ou agonista reverso de CB1 que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes maior que moduladores de receptor de CB1 de moléculas pequenas, tais como, por exemplo, rimonabanto, taranabanto, AM251, AM1387, AM4113, canabigerol, ibipinabanto, otenabanto, surinabanto, tetra-hidrocanabivarina e virodamina, e AM6545. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos inibem transdução de sinal mediada por agonista de CB1. Em algumas modalidades, a inibição de transdução de sinal mediada por agonista de CB1 é medida determinando-se níveis de cAMP intracelular e/ou fosforilação de ERK a jusante.

[0136] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos têm a vantagem de penetração de BBB reduzida ou ausente ou exposição cerebral. Em algumas modalidades, a penetração de BBB dos anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos exibe penetração cerebral reduzida em relação aos agonistas, antagonistas, ou agonistas inversos de CB1 de molécula pequena (por exemplo, rimonabanto, taranabanto, AM251, AM1387, AM4113, canabigerol, ibipinabanto, otenabanto, surinabanto, tetra-hidrocanabivarina e virodamina, e AM6545). Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento fornecem um benefício terapêutico com efeitos colaterais no CNS reduzidos em relação a um agonista, antagonista, ou agonista reverso de receptor de CB1 de molécula pequena. Efeitos colaterais no CNS associados ao antagonista de receptor de CB1 de molécula pequena rimonabanto, por exemplo, incluem ansiedade, depressão, agitação, distúrbios alimentares, irritabilidade, agressividade e insônia (Moreira (2009) Rev. Bras. Psiquiatr. 31(2): 145-153).

MAPEAMENTO DE EPÍTOPO E TECNOLOGIAS RELACIONADAS

[0137] A presente invenção inclui anticorpos anti-CB1 que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro dos domínios extracelulares de CB1 humano (por exemplo, dentro de aminoácidos 1 a 116, e/ou laços extracelulares e1 (aminoácidos 176 a 187; SEQ ID NO: 6), e2 (aminoácidos 256 a 273; SEQ ID NO: 10) e/ou e3 (aminoácidos 366 a 377; SEQ ID NO: 14)). O epítopo ao qual os anticorpos se ligam pode compreender uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos localizados dentro do domínio extracelular de CB1. Alternativamente, o epítopo pode consistir numa pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localizados dentro do domínio extracelular de CB1. Adicionalmente, o epítopo ao qual o anticorpo de CB se liga pode compreender uma porção de CB1 que não é extracelular devido à alteração de conformação ou exposição devido à ligação. A sequência de CB1 e seus vários domínios é apresentada na Tabela 1.

[0138] Várias técnicas conhecidas por pessoas de habilidade comum na técnica podem ser usadas para determinar se um anticorpo “interage com um ou mais aminoácidos” dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplificativas incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tais como aqueles descritos, Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., N. Y.), análise mutacional de varredura de alanina, análise de blots de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-463), e análise de clivagem de peptídeo. Além disto, métodos, tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada pela espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve identificação de deutério na proteína de interesse, seguido pela ligação do anticorpo à proteína identificada com deutério. A seguir, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para a água para permitir que a troca de hidrogênio e deutério ocorra em todos os resíduos exceto para os resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem identificados com deutério). Após dissociação do anticorpo, a proteína-alvo é submetida à clivagem de protease e análise de espectrometria de massa, deste modo, se revelam os resíduos identificados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Consultar, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochem. 267(2): 252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

[0139] A presente invenção inclui adicionalmente anticorpos anti- CB1 que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos específicos exemplificativos descritos no presente documento (por exemplo, M1, M2, M3, M4, M5 (e variantes humanizadas dos mesmos), M6, M7 (e variantes humanizadas dos mesmos), e M8). Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticorpos anti-CB1 que competem pela ligação ao CB1 com qualquer um dos anticorpos específicos exemplificativos descritos no presente documento (por exemplo, M1, M2, M3, M4, M5 (e variantes humanizadas dos mesmos), M6, M7 (e variantes humanizadas dos mesmos), e M8).

[0140] Uma pessoa pode determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que, ou compete pela ligação com, um anticorpo anti-CB1 de referência com o uso de métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-CB1 de referência da invenção, se permite que o anticorpo de referência se ligue a uma proteína de CB1 (por exemplo, uma porção solúvel do domínio extracelular de CB1 ou CB1 expresso em superfície celular). A seguir, a habilidade de um anticorpo de teste em se ligar à molécula de CB1 é avaliada.

Se o anticorpo de teste tem capacidade para se ligar ao CB1 depois da ligação de saturação com o anticorpo anti-CB1 de referência, é possível concluir que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti-CB1 de referência.

Por outro lado, se o anticorpo de teste não tiver capacidade para se ligar à molécula de CB1 depois da ligação de saturação com o anticorpo anti-CB1 de referência, então, o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-CB1 de referência da invenção.

A experimentação de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação e ligação de peptídeo) pode, então, ser conduzida para confirmar se a observada falta de ligação do anticorpo de teste ocorre, de fato, devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada.

Experimentos deste tipo podem ser realizados com o uso de ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação ao anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica.

De acordo com determinadas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo (ou se sobrepõem ao) epítopo se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibir a ligação do outro em pelo menos 50%, porém, preferencialmente 75%, 90% ou mesmo 99% conforme medido num ensaio de ligação competitivo (consultar, por exemplo, Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados para se ligar ao mesmo epítopo se, essencialmente, todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos são considerados para ter “epítopos de sobreposição” se apenas um subconjunto das mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem a ligação do outro.

[0141] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que tem capacidade para competir com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento para ligação ao CB1. Tais anticorpos podem ser identificados com o uso de ensaios de ligação de competição de rotina. Por exemplo, para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo anti-CB1 de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: Numa primeira orientação, se permite que o anticorpo de referência se ligue a uma proteína de CB1 (por exemplo, uma porção solúvel do domínio extracelular de CB1 ou CB1 expresso em superfície celular) sob condições de saturação seguidas pela avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de CB1. Numa segunda orientação, se permite que o anticorpo de teste se ligue a uma molécula de CB1 sob condições de saturação seguidas pela avaliação da ligação do anticorpo de referência à molécula de CB1. Caso, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (de saturação) tenha capacidade para se ligar à molécula de CB1, então, se conclui que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem pela ligação ao CB1. Um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não se ligar necessariamente ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, porém, pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência, por exemplo, ligando-se um epítopo sobreposto ou adjacente. Competição pode ser medida por ensaio de ELISA, citometria de fluxo ou ressonância de plasmon em superfície (SPR).

Adicionalmente, ensaios de competição cruzada e ligação de epítopo podem ser realizados com o uso de um sistema Octet HTX (Pall ForteBio LLC, Fremont, CA 94538).

[0142] Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104, 116, 128, 140, 152, 164, 176, 188, 200, 212, 224, 236, 248, 260, 272, 284, 296, 308 e 320. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR2 de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105, 117, 129, 141, 153, 165, 177, 189, 201, 213, 225, 237, 249, 261, 273, 285, 297, 309 e 321. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22, 34, 46, 58, 70, 82, 94, 106, 118, 130, 142, 154, 166, 178, 190, 202, 214, 226, 238, 250, 262, 274, 286, 298, 310 e 322. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR1 de cadeia leve que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98, 110, 122, 134, 146, 158, 170, 182, 194, 206, 218, 230, 242, 254, 266, 278, 290, 302, 314, e

326. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR2 de cadeia leve que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99, 111, 123, 135, 147, 159, 171, 183, 195, 207, 219, 231, 243, 255, 267, 279, 291, 303, 315 e 327. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia leve que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28, 40, 52, 64, 76, 88, 100, 112, 124, 136, 148, 160, 172, 184, 196, 208, 220, 232, 244, 256, 268, 280, 292, 304, 316 e 328.

[0143] As CDRs de cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-CB1 fornecidos no presente documento podem ser selecionadas independentemente e correspondidas para formar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende qualquer CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada; e qualquer CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia leve dos anticorpos fornecidos no presente documento. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos fornecidos no presente documento também podem ser independentemente selecionadas e correspondidas para formar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende qualquer cadeia pesada e leve dos anticorpos fornecidos no presente documento.

[0144] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia pesada variável (VH) que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318.

[0145] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve variável (VL) que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

[0146] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de cadeia pesada que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101, 113, 125, 137, 149, 161, 173, 185, 197, 209, 221, 233, 245, 257, 269, 281, 283, 305 e 317.Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de leve pesada que tem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 23, 35, 47, 59, 71, 83, 95, 107, 119, 131, 143, 155, 167, 179, 191, 203, 215, 227, 239, 251, 263, 275, 287, 299, 311 e

323. Em determinadas modalidades, os anticorpos anti-CB1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, CDRs, VH, VL, cadeias pesadas e/ou cadeias leves compreendem pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 2%, ou pelo menos cerca de 1% de aminoácidos variantes conservadores.

[0147] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de CDR de VH que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (20, 21, 22); (32, 33, 34); (44, 45, 46); (56, 57, 58); (68, 69, 70); (80, 81, 82); (92, 93, 94); (104, 105, 106); (116, 117, 118); (128, 129, 130); (140, 141, 142); (152, 153, 154); (164, 165, 166); (176, 177, 178); (188, 189, 190); (200, 201, 202); (212, 213, 214); (224, 225, 226); (236, 237, 238); (248, 249, 250); (260, 261, 262); (272, 273, 274); (284, 285, 286); (296, 297, 298); (308, 309, 310); e (320, 321, 322).

[0148] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de CDR de VL que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: (26, 27, 28); (38, 39, 40); (50, 51, 52); (62, 63, 64); (74, 75, 76); (86, 87, 88); (98, 99, 100); (110, 111, 112); (122, 123, 124); (134, 135, 136); (146, 147, 148); (158, 159, 160); (170, 171, 172); (182, 183, 184); (194, 195, 196); (206, 207, 208); (218, 219, 220); (230, 231, 232); (242, 243, 244); (254, 255, 256); (266, 267, 268); (278, 279, 280); (290, 291, 292); (302, 303, 304); (314, 315, 316); e

[0149] (326, 327, 328).

[0150] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de VH/VL que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18/24, 30/36, 42/48, 54/60, 66/72, 78/84, 90/96, 102/108, 114/120, 126/132, 138/144, 150/156, 162/168, 174/180, 186/192, 198/204, 210/216, 222/228, 234/240, 246/252, 258/264, 270/276, 282/288, 294/300, 306/312 e 318/324.

[0151] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de cadeia pesada e leve que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: 17/23, 29/35, 41/47, 53/59, 65/71, 77/83, 89/95, 101/107, 113/119, 125/131, 137/143, 149/155, 161/167, 173/179, 185/191, 197/203, 209/215, 221/227, 233/239, 245/251, 257/263, 269/275, 281/287, 283/289, 305/311 e 317/323.

[0152] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo liga CB1 e exibe função efetora reduzida, tal como, por exemplo, ligação de C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor de Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, opsonização e transcitose. Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo liga CB1 e compreende uma ou mais modificações de região de Fc que reduzem, prejudicam ou eliminam uma ou mais funções efetoras. Por exemplo, numa modalidade, os anticorpos anti-CB1 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos no presente documento se ligam ao CB1, porém, exibem ligação ao C1q reduzida, prejudicada ou ausente e/ou CDC e/ou ADCC. Modificações de Fc podem ser inserções, deleções ou substituições de aminoácido, ou podem ser modificações químicas. Por exemplo, as modificações de região de Fc podem ser feitas para aumentar ou diminuir a ligação de complemento, para aumentar ou diminuir ADCC ou CDC, ou para modificar glicosilação.

Várias modificações de Fc são conhecidas na técnica e foram descritas, por exemplo, em Labrijin et al. (2009) Nature Biotech. 27(8):767-771; Greenwood et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1098-1104; Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441-452; e Rother et al. (2007) Nature Biotechnol. 25: 1256-1264. Qualquer uma das modificações de Fc conhecidas na técnica podem ser aplicadas nos anticorpos de CB1 exemplificativos descritos no presente documento para alterar a função efetora. Numa modalidade, o anticorpo anti-CB1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem determinadas mutações, por exemplo, L234A/L235A (“LALA”), S228P, A330S, P331S, E233P/L234V/L235A, A327G/A330S/P331S, L234F/L235E/P331S e N297Q.

[0153] As proteínas de ligação fornecidas no presente documento podem ser produzidas através de qualquer uma das diversas técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, a expressão de células hospedeiras, em que vetor (ou vetores) de expressão que codifica as proteínas de ligação ao CB1 é transfectado para uma célula hospedeira através de técnicas padrão. Embora seja possível expressar as proteínas de ligação ao CB1 fornecidas no presente documento em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, células hospedeiras de mamífero são mais prováveis do que células procarióticas a montar e secretar uma proteína de ligação apropriadamente dobrada e imunologicamente ativa.

[0154] Num sistema exemplificativo para expressão recombinante de proteínas de ligação ao CB1 é um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada de anticorpo de CB1 quanto a cadeia leve que é introduzida nas células dhfr-CHO pela transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, as sequências de cadeia pesada e leve de anticorpo de CB1 são, cada uma, operativamente ligadas ao aprimorador de CMV e elementos reguladores de promotor para acionar altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também carrega um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor com o uso de seleção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesadas e leves de anticorpo de CB1 e proteína de anticorpo de CB1 intacta é recuperada a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular padrão são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar a proteína de anticorpo de CB1 a partir do meio de cultura.

BIOEQUIVALENTES

[0155] Os anticorpos anti-CB1 e fragmentos de anticorpo da presente descrição englobam proteínas que têm sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, porém, que retêm a habilidade de se ligar ao CB1 humano. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando em comparação com sequência parente, porém, exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma forma, as sequências de DNA de codificação de anticorpo anti-CB1 da presente invenção englobam sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de nucleotídeos quando em comparação com a sequência descrita, porém, que codificam um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-CB1 ou fragmento de anticorpo da invenção. Exemplos de tais sequências de aminoácidos e DNA variantes são abordados acima.

[0156] Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e o grau de absorção não demonstrem uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, sejam doses únicas ou múltiplas doses. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes no grau de sua absorção, porém, não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes uma vez que tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e estão refletidas na identificação, não são essenciais para a obtenção de concentrações de fármaco de corpo eficaz durante, por exemplo, uso crônico, e são considerados medicamente insignificantes para o produto de fármaco particular estudado.

[0157] Numa modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas em sua segurança, pureza e potência. Numa modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se for possível trocar um paciente uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, que incluem uma alteração clinicamente significativa em imunogenicidade, ou eficácia reduzida, em comparação com a terapia contínua sem tal troca. Numa modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas aturarem através de um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, ao ponto de que tais mecanismos sejam conhecidos.

[0158] Bioequivalência pode ser demonstrada através de métodos in vivo e in vitro. Medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou um ou mais de seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que estava correlacionado aos dados de biodisponibilidade humana in vivo e é razoavelmente preditivo dos mesmos; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos nos quais o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) num ensaio clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0159] Variantes bioequivalentes dos anticorpos anti-CB1 podem ser construídas, por exemplo, realizando-se várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando-se resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes de dissulfeto intramolecular desnecessárias ou incorretas mediante renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo anti-CB1 que compreendem alterações de aminoácido que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.

SELETIVIDADE DE ESPÉCIES E REATIVIDADE CRUZADA DE ESPÉCIES

[0160] A presente invenção também inclui anticorpos anti-CB1 que se ligam ao CB1 humano e ao CB1 de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-CB1 da invenção podem se ligar ao CB1 humano e podem se ligar a um ou mais dentre CB1 de camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbo, porco, gato, cachorro, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, macaco cinomólgo, mico, macaco rhesus ou chimpanzé. De acordo com determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-CB1 se ligam ao CB1 humano, porém, não ao CB1 de outras espécies.

IMUNOCONJUGADOS

[0161] A invenção engloba anticorpos anti-CB1 conjugados com uma porção química terapêutica (“imunoconjugado”), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial às células. Exemplos de agentes citotóxicos e agentes quimioterapêuticos adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica e descritos no presente documento.

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS

[0162] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo-alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo-alvo. Consultar, por exemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-CB1 da presente invenção podem ser ligados à outra molécula funcional ou coexpressos com a mesma, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos, em que um braço de uma imunoglobulina é específico para CB1 humano ou um fragmento do mesmo, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo alvo terapêutico ou é conjugado com uma porção química terapêutica.

USO DE PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO EM VÁRIAS DOENÇAS

[0163] Os anticorpos e proteínas de ligação da invenção são úteis para o tratamento, prevenção e/ou amenização de qualquer doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de CB1 ou mediado pela mesma, ou tratável bloqueando-se a interação entre CB1 e um ligante de CB1 (por exemplo, um canabinoide) ou inibindo-se de outra forma a atividade de CB1 e/ou sinalizando, e/ou promovendo-se a internalização de receptor e/ou diminuindo-se o número de receptor de superfície celular. O termo “um distúrbio no qual a atividade de CB1 é prejudicial” significa um distúrbio ou uma doença na qual a presença ou atividade (por exemplo, atividade aberrante ou superatividade) de CB1 num indivíduo que sofre do distúrbio é responsável pela patofisiologia do distúrbio ou da doença ou um fator que contribui para um pioramento do distúrbio ou doença. Consequentemente, um distúrbio no qual a atividade de CB1 é prejudicial é um distúrbio no qual espera-se que a redução de atividade de CB1 alivie os sintomas e/ou a progressão do distúrbio.

[0164] Moléculas de proteína de ligação fornecidas no presente documento são úteis como moléculas terapêuticas para tratar várias doenças ou afecções, por exemplo, em que proteínas de CB1 são prejudiciais. Por exemplo, as moléculas de ligação fornecidas no presente documento incluem qualquer doença ou afecção caracterizada pela superexposição, regulação ascendente ou atividade ou sinalização aumentada de CB1 ou uma falha de mecanismos reguladores homeostáticos saudáveis que podem resultar na mesma. Tais doenças e afecções incluem obesidade, obesidades sindrômicas que incluem síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Bardet- Biedel (BBS), Osteodistrofia Hereditária de Albright (AHO), e síndrome de deleção de SIM1; diabetes e complicações relacionadas; dislipidemia; doenças hepáticas, tais como, por exemplo, esteato- hepatite não alcoólica (NASH), doença do fígado gorduroso não alcoólica, e cirrose biliar primária; fibrose, por exemplo, fibrose renal; doença renal crônica; doença renal; doenças metabólicas, osteoporose,

ateroesclerose, doença inflamatória, doença cardiovascular, câncer, dor, esclerose sistêmica, espasticidade de esclerose múltipla, glaucoma e vício em nicotina.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0165] A invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem a proteína de ligação anti-CB1, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com excipientes, carreadores, agentes profiláticos, agentes terapêuticos e outros agentes adequados que melhoraram a estabilidade, entrega, tolerância e eficácia da proteína de ligação anti-CB1. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas que contêm lipídeo (catiônico ou aniônico) (tais como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões de óleo em água e água em óleo, emulsões carbowax (polietilenoglicois de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas que contêm carbowax. Consultar também Powell et al. (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52: 238-

311.

[0166] As composições farmacêuticas que compreendem proteínas de ligação ao CB1 fornecidas no presente documento são para uso, porém, sem limitação, no diagnóstico, na detecção ou no monitoramento de um distúrbio, na prevenção, no tratamento, no controle ou na amenização de um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo, e/ou na pesquisa.

[0167] Vários sistemas de entrega são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes com capacidade para expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (consultar, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). A composição pode ser administrada através de qualquer rota conveniente, por exemplo, através da infusão ou injeção de bolo, por absorção através dos revestimentos epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistemática ou local.

[0168] Métodos para administrar um agente profilático ou terapêutico fornecido no presente documento incluem, porém, sem limitação, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), administração epidural, administração intratumoral, administração na mucosa (por exemplo, rotas intranasal e oral) e administração pulmonar (por exemplo, compostos em aerossol administrados com um inalador ou nebulizador). A formulação de composições farmacêuticas para rotas específicas de administração, e os materiais e técnicas necessários para os vários métodos de administração estão disponíveis e são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0169] Regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. O termo “forma unitária de dosagem”, conforme usada no presente documento, se refere a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados, sendo que cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico exigido. A especificação para as formas unitárias de dosagem fornecidas no presente documento é ditada por e diretamente dependente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser atingido, e (b) das limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

[0170] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser entregue por via subcutânea ou intravenosa com uma agulha padrão e seringa. Além disto, com relação à entrega subcutânea, um dispositivo de entrega por caneta tem, prontamente, aplicações na entrega de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de entrega por caneta pode ser reutilizável ou descartável. A dispositivo de entrega por caneta reutilizável utiliza, de modo geral, um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de entrega por caneta pode, então, ser reutilizado. Num dispositivo de entrega por caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disto, o dispositivo de entrega por caneta descartável chega pré-carregado com a composição farmacêutica mantida num reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo todo é descartado.

[0171] Diversos dispositivos de entrega por caneta e autoinjetores reutilizáveis têm aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, porém, sem limitação, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, R.U.), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, CH), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly e Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha). Exemplos de dispositivos de entrega por caneta descaráveis que têm aplicações em entrega subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, porém, sem limitação, a caneta SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), a FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e a KWIKPEN™ (Eli Lilly), o autoinjetor SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), a PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), a EPIPEN (Dey, L. P.), e a caneta HUMIRA™ (Abb Vie, Inc., Abbott Park, IL)

[0172] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser entregue num sistema de liberação controlada. Numa modalidade, uma bomba pode ser usada (Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-240). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, FL). Em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado próximo do alvo da composição, assim, se exige apenas uma fração da dose sistemática (Goodson (1984) em Medical Applications of Controlled Release, supra, 2: 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são abordados na revisão por Langer (1990) Science 249: 1527-1533.

[0173] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas através de métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsificando- se o anticorpo ou seu sal descrito acima num meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, se tem, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica que contém glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização apropriado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um tensoativo não iônico (por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)), etc. Como o meio oleoso, se emprega, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização, tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferencialmente preenchida numa ampola apropriada.

[0174] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem numa dose unitária adequada para servir uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem numa dose unitária incluem, por exemplo, tabletes, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo mencionado acima contido é de geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem numa dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferencial que o anticorpo mencionado acima esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem.

[0175] A dose de anticorpo administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paciente, da doença-alvo, do estágio da doença, gênero, da presença de complicações médicas, outra medicação, afecções, rota de administração e semelhantes. A dose preferencial é tipicamente calculada de acordo com o peso do corpo ou a área da superfície do corpo. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para tratar uma afecção ou doença associada à atividade de CB1 num paciente adulto, pode ser vantajoso administrar o anticorpo da presente invenção por via intravenosa normalmente numa dose única de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg em peso do corpo. Dependendo da gravidade da afecção, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Dosagens eficazes e programações para administrar anticorpos anti-CB1 podem ser determinadas empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado através de avaliação periódica, e a dose consequentemente ajustada. Além disto, o dimensionamento de dosagens entre espécies pode ser realizado com o uso de métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al. (1991) Pharmaceut. Res. 8: 1351-1359). Deve ser adicionalmente entendido que, para qualquer indivíduo específico, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o discernimento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem apresentadas no presente documento são apenas exemplificativas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

TERAPIA DE COMBINAÇÃO

[0176] Uma proteína de ligação fornecida no presente documento também pode ser administrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento de várias doenças, sendo que o agente adicional é selecionado pelo especialista por seu fim desejado. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na técnica como útil para tratar a doença ou afecção que é tratada pelas proteínas de ligação ao CB1 fornecidas no presente documento. A combinação também pode incluir mais de um agente adicional.

[0177] Exemplos sem limitação de tais componentes terapeuticamente ativos adicionais incluem outros antagonistas de CB1, por exemplo, um segundo anticorpo anti-CB1 ou inibidor de molécula pequena de CB1 (por exemplo, rimonabanto, taranabanto, AM251, AM1387, AM4113, canabigerol, ibipinabanto, otenabanto, surinabanto, tetra-hidrocanabivarina e virodamina, e AM6545), um antagonista de outro membro da família CB1.

[0178] A presente invenção também inclui combinações terapêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-CB1 mencionados no presente documento e um inibidor adicional, em que o inibidor é um aptâmero, uma molécula antissentido, uma ribozima, um siRNA, a pepticorpo, um nanocorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de Fab; fragmento de F(ab’)2; fragmento de Fd; fragmento de Fv; scFv; fragmento de dAb; ou outras moléculas modificadas geneticamente, tais como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos e unidades de reconhecimento mínimo). Os anticorpos anti-CB1 da invenção também podem ser administrados e/ou coformulados em combinação com agentes terapêuticos adicionais. O componente terapeuticamente ativo adicional (ou componentes terapeuticamente ativos adicionais) pode ser administrado imediatamente antes de, simultaneamente com ou logo após a administração de um anticorpo anti-CB1 da presente invenção; (para os fins da presente descrição, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo anti-CB1 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional). A presente invenção inclui composições farmacêuticas nas quais um anticorpo anti-CB1 da presente invenção é coformulado com um ou mais dentre os componentes terapeuticamente ativos adicionais, conforme descrito em outra parte no presente documento.

[0179] A presente invenção também inclui composições e métodos que compreendem uma combinação de um “anticorpo de antagonista” e um “anticorpo de agonista reverso”. Um “anticorpo de antagonista anti- CB1” significa um anticorpo anti-CB1 que inibe, diminui ou evita a atividade de sinalização de um ligante (por exemplo, um canabinoide) para CB1. Exemplos sem limitação de anticorpos antagonistas da presente invenção são M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M7-H1, M7- H2, M7-H3, M7-H4, M7-H5, M7-H6, M7-H7, M7-H8, M7-H9, M7-H10, M7-H11, M7-H12, M7-H13, M7-H14, M7-H15, M7-H16, M5-H1, M5-H2. Um “anticorpo de agonista reverso anti-CB1” significa um anticorpo anti- CB1 que induz uma resposta farmacológica oposta de um agonista. Em que um agonista aumenta a atividade de um receptor acima de seu nível basal, enquanto um agonista reverso diminui a atividade abaixo do nível basal. Exemplos sem limitação de anticorpos de agonista reverso da presente invenção incluem M7. Os presentes inventores conceberam combinação de um anticorpo de antagonista e um anticorpo de agonista reverso, de modo a melhorar a eficácia sinergicamente ou de outra forma. Consequentemente, a presente invenção inclui composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um anticorpo de antagonista e pelo menos um anticorpo de agonista reverso. A presente invenção também inclui métodos terapêuticos que compreendem administrar a um indivíduo uma combinação de um anticorpo de antagonista e um anticorpo de agonista reverso (seja como administrações separadas ou como coformulações).

[0180] Agentes de terapia de combinação incluem, porém, sem limitação, agentes antineoplásticos, radioterapia, quimioterapia, tal como agentes de alquilação de DNA, cisplatina, carboplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxel, taxol, doxorrubicina, gerncitabina, genzar, antraciclinas, adriamicina, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, 5-fluorouracila (5-FU), leucovorina, irinotecano, inibidores de receptor tirosina quinase (por exemplo, erlotinibe, gefitinibe), inibidores de COX-2 (por exemplo, celecoxlb), inibidores de quinase e siRNAs.

DIAGNÓSTICO

[0181] A descrição no presente documento fornece aplicações de diagnóstico que incluem, porém, sem limitação, métodos de ensaio de diagnóstico, kits de diagnóstico que contêm uma ou mais proteínas de ligação ao CB1, e adaptação dos métodos e kits para uso em sistemas automatizados e/ou semiautomatizados. Os métodos, kits e adaptações fornecidos podem ser empregados na detecção, monitoramento e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio num indivíduo.

[0182] Os anticorpos anti-CB1 da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir CB1, ou células de expressão de CB1 numa amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-CB1, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma afecção ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de CB1. Ensaios de diagnóstico exemplificativos para CB1 podem compreender, por exemplo, colocar uma amostra, obtida a partir de um paciente, em contato com um anticorpo anti-CB1 da invenção, em que o anticorpo anti-CB1 é identificado com uma identificação detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-CB1 não identificado pode ser usado nas aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é, ele mesmo, detectavelmente identificado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais quimioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, luciferase e acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila e ficoeritrina. Um exemplo de um material luminescente é luminol e exemplos de materiais radioativos adequados incluem (por exemplo, 3H, 14 C, 32 P, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177Lu, 166HO e 153Sm.

[0183] Imunoensaios fornecidos pela presente descrição podem incluir imunoensaios de sanduíche, radioimunoensaio (RIA), imunoensaio enzimático (EIA), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), imunoensaios de inibição competitiva, imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), técnica de imunoensaio de enzima multiplicada (EMIT), transferência de energia de ressonância por bioluminescência (BRET), classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), e ensaios quimioluminescentes homogêneos, dentre outros.

[0184] Um imunoensaio de micropartícula quimioluminescente pode ser usado, que pode usar o analisador automatizado ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

[0185] Métodos que empregam espectrometria de massa são fornecidos pela presente descrição e incluem, porém, sem limitação MALDI (dessorção/ionização a laser de matriz assistida) ou por SELDI (dessorção/ionização a laser de superfície aprimorada).

[0186] Métodos para coletar, manusear, processar e analisar amostras de teste biológico com o uso de imunoensaios e espectrometria de massa são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

KITS

[0187] Um kit para ensaio de uma amostra de teste para a presença, quantidade ou concentração de um analito, ou fragmento do mesmo, numa amostra de teste também é fornecido. O kit compreende pelo menos um componente para ensaio da amostra de teste para o analito, ou fragmento do mesmo, e instruções para ensaio da amostra de teste para o analito, ou fragmento do mesmo. O pelo menos um componente para ensaio da amostra de teste para o analito, ou fragmento do mesmo, pode incluir uma composição que compreende uma proteína de ligação, conforme descrito no presente documento, e/ou uma proteína de ligação antianalito (ou um fragmento, uma variante, ou um fragmento de uma variante da mesma), que é opcionalmente imobilizada numa fase sólida.

[0188] Opcionalmente, o kit pode compreender um calibrador ou controle, que pode compreender analito isolado ou purificado. O kit pode compreender pelo menos um componente para ensaio da amostra de teste para um analito através de imunoensaio e/ou espectrometria de massa. Os componentes de kit que incluem o analito, a proteína de ligação e/ou a proteína de ligação antianalito, ou fragmentos da mesma, podem ser opcionalmente identificados com o uso de qualquer identificação detectável conhecida na técnica. Os materiais e métodos para a criação fornecida na prática da presente descrição seriam conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

[0189] O kit (ou componentes do mesmo), assim como o método para determinar a presença, quantidade ou concentração de um analito numa amostra de teste através de um ensaio, tal como um imunoensaio conforme descrito no presente documento, pode ser adaptado para uso numa variedade de sistemas automatizados e semiautomatizados (que incluem aqueles em que a fase sólida compreende uma micropartícula), conforme descrito, por exemplo, nos documentos de Patente nº U.S.

5.089.424 e 5.006.309, e conforme comercializado, por exemplo, pela

Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®. Outras plataformas disponíveis pela Abbott Laboratories incluem, porém, sem limitação, AxSYM®, IMx® (consultar, por exemplo, documento de Patente nº U.S. 5.294.404, PRISM®, EIA (bead), e QuantumTM II, assim como outras plataformas. Adicionalmente, os ensaios, kits e componentes de kit podem ser empregados em outros formatos, por exemplo, em sistemas eletroquímicos ou outros sistemas portáteis ou de ensaio em local de atendimento. A presente descrição é, por exemplo, aplicável no sistema de imunoensaio eletroquímico Abbott Point of Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) comercial que realiza imunoensaios de sanduíche. Imunossensores e seus métodos de fabricação e operação em dispositivos de teste de utilização única são descritos, por exemplo nos documentos de Patente nº U.S. 5.063.081,

7.419.821, 7.682.833, 7.723.099 e 9.035.027; e nas Publicações de Patente nº U.S. 20040018577 e 20060160164.

[0190] Será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos descritos no presente documento são óbvias e podem ser feitas com o uso de equivalentes adequados sem que se afaste do escopo das modalidades descritas no presente documento. Depois de ter descrito determinadas modalidades em detalhes, a prática da invenção será entendida mais completamente a partir dos seguintes exemplos, que são apresentados no presente documento apenas para fins de ilustração e não devem ser interpretados como limitantes da invenção de forma alguma.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: GERAÇÃO E SELEÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CB1

PARA AVALIAÇÃO FUNCIONAL

[0191] Camundongos CD2F1 foram imunizados com antígeno de CB-1 humano na presença ou ausência de antagonista de CB-1 JD5037

(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI; nº de Cat. 1205), para potencialmente estabilizar a proteína, de modo que a mesma se apresente numa conformação adequada durante imunização.

Camundongos foram imunizados em ambos jarretes com aproximadamente 5 µg/30 µl/jarrete de antígeno com adjuvante Titer Max Gold (St.

Loui, MO; Sigma Aldrich; nº de Cat.

T2684). Subsequentemente, camundongos foram imunizados duas vezes por semana com CpG (InvivoGen, San Diego, CA; nº de Cat.

ODN1826) e Alhidrogel (InvivoGen, San Diego, CA; nº de Cat. vac-alu- 250) por aproximadamente 30 dias.

Soro foi coletado nos dias 13 e 26 para determinar o título de anticorpo e seu aumento ao longo do tempo.

Camundongos sofreram eutanásia no dia 30 e gânglios linfáticos popliteal e inguinal foram coletados para fusão e lavados no Meio B (uma mistura de 1: 1 de RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific-Gibco, San Diego, CA; nº de Cat. 11879020) e IMDM (Lonza, Anaheim, CA; nº de Cat. 12-722F) sem nutrientes adicionados) e suspensões celulares únicas foram preparadas.

Células de mieloma P3Ag8.563 (ATCC, Manasas, VA; nº de Cat.

PTA-9393) foram coletadas da cultura e lavadas no Meio B.

Os linfócitos e as células de mieloma foram misturadas numa razão de 1: 1 e fundidas com o uso de um aparelho de eletrofusão BTX Harvard ECM 2001(BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA; nº de Cat. 45-0012). Células fundidas foram ressuspensas em Meio de recuperação C (Stem Cell Technologies, Seattle, WA; nº de Cat. 03803) e deixadas para recuperar num frasco T75 cm2 de um dia para o outro a 37°C.

No dia seguinte as células fundidas foram coletadas e ressuspensas no Meio de metilcelulose de seleção de hibridoma D (Stem Cell Technologies, Seattle, WA; nº de Cat. 03804) que contém Detector de Clone de IgG de anti-camundongo FITC (Molecular Devices, San Jose, CA; nº de Cat.

K8220). As células foram misturadas e colocadas em placa em 1x106 por 10 ml de Meio D.

As células colocadas em placa foram incubadas a 37°C por 7 dias.

Colônias de hibridoma foram escolhidas e transferidas para as placas de cultura de tecido de 96 poços que contêm Meio E de crescimento de hibridoma (Stem Cell Technologies, Seattle, WA; nº de Cat. 03805) com o uso de Clone PiX2 (Molecular Devices, San Jose, CA) com base no tamanho da colônia juntamente com sua habilidade em exibir um forte FITC halo que foi indicativo de produção de IgG. Quando colônias macroscópicas foram observadas, os sobrenadantes foram examinados para ligação celular com o uso de células de superexpressão CHO-huCB-1 e CHO parental. Para este exame primário, células CHO parental de hibridoma foram identificadas com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) (Invitrogen, Anaheim, CA; nº de Cat. 34554) e misturadas com células de superexpressão de CHO-huCB1 não identificadas por CFSE para permitir exame eficiente e simultâneo em ambas as linhas celulares e para identificar ligantes huCB-1 específicos. Os clones que ligam especificamente células de superexpressão CHO- huCB-1 e não ligam as células CHO parental foram selecionados e avançados para um exame de confirmação. Um total de 97 clones foram selecionados para avançar para a purificação em pequena escala. O resumo das fusões relevantes e exame primário é mostrado na Tabela 2. TABELA 2. FUSÕES DE CÉLULA E EXAME PRIMÁRIO Imunização de Jarrete Imunizações de Jarrete de antígeno huCB1 de antígeno huCB1 + JD5037 Campanha 9 de Campanha 10 nº de Camundongos 7 7 Linfócitos 100x106 100x106 Células Fundidas 30x106 36X106 Hibridomas Examinados ~2400 ~2880 Ligantes huCB1-CHO 91 83 Primários Ligantes huCB1-CHO 47 50 Confirmados Clones de Reação Cruzada 14 16 moCB1-CHO EXEMPLO 2: PURIFICAÇÃO DE CLONES DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA ANTI-huCB-1 MURINOS

[0192] Os clones de hibridoma que foram selecionados com base no exame primário confirmatório foram adicionalmente expandidos em 50 ml de meio de baixo teor de Ig (1: 1 IMDM (Lonza, Anaheim, CA; nº de Cat. 12-722F): Ham’s F12-K (Gibco, Anheim, CA; nº de Cat. 21127022) meio com 5% de soro de baixo teor de Ig (Invitrogen, Grand Island, NY; nº de Cat. 1625007), que contém 5 ml de uma solução de 100 mM de piruvato de sódio (Invitrogen, Grand Island, NY; nº de Cat. 11360070), 5 ml de 100 mM de aminoácidos não essenciais (Invitrogen, Grand Island, NY; nº de Cat. 11140050) e 5 ml de 100 mM de glutamina (Invitrogen, Grand Island, NY; nº de Cat. 35050061)) num frasco de T75 cm2 por 3 a 4 semanas. Sobrenadantes foram coletados e purificados com o uso de métodos de purificação de Proteína A padrão. EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE ANTICORPOS ANTI-CB1 DE CAMUNDONGO NUM ENSAIO DE CAMP

[0193] Os anticorpos anti-huCB-1 de camundongo isolados foram avaliados por sua atividade de antagonista num ensaio de cAMP. Ensaios de cAMP foram realizados com o uso de uma linha celular cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi (DiscoverX/Eurofms, Fremont, CA; nº de Cat. 95-0071C2), que superexpressa receptores naturalmente Gi acoplados, de proteína G acoplada de tipo selvagem (GPCRs) e são projetados para detectar aumentos em níveis de cAMP intracelular em resposta ao estímulo de agonista do receptor. Células cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi foram tratadas com anticorpos de CB1, um controle de isótipo, ou o antagonista de CB1 de molécula pequena JD5037, seguido por um desafio de agonista com 30 nM de CP-55,940 (indicado como “Mais CP”) na presença de forscolina. Antagonistas também foram testados sem a adição de CP-55,940, para estabelecer se tinham atividade agonística. Forscolina ativa a enzima adenilato ciclase e aumenta níveis intracelulares de cAMP. Para um receptor de Gi, a ligação de agonista inibe acúmulo de cAMP intracelular induzido por forscolina. Assim, de modo a medir receptores de Gi acoplado, o composto de agonista CP-55,940 foi adicionado na presença de forscolina. Ativação do receptor de Gi acoplado, portanto, inibe a produção induzida por forscolina de cAMP e, como resultado, a curva de resposta de dose gerada na presença de agonista mais forscolina terá uma inclinação negativa. Brevemente, células foram semeadas em Meio de Colocação de Célula em Placa de 2 (DiscoverX/Eurofms; Fremont, CA; nº de Cat. 93-0563R2A) em 1,5 x 104 células/poço em placas de 96 poços (Costar, Fisher Scientific, San Diego, CA; nº de Cat. 3909) e incubadas de um dia para o outro a 37°C, 5% de CO2. No dia seguinte, o meio de cultura foi substituído por 30 µl de Tampão de Ensaio Celular (CAB; 1x HBSS/HEPES 10 nM (ThermoFisher, Anaheim, CA; nº de Cat. 14025134 e 15630080, respectivamente) e tratado com anticorpos de teste ou um controle de isótipo (7,5 µl de uma diluição de trabalho 6x concentrada). Placas foram incubadas por 30 minutos a 37°C, 5% de CO2. 7,5 µl de desafio de agonista (0,18 µM de CP 55,940 em CAB que contém 90 µM de forscolina) foram adicionados em cada poço e placas foram incubadas por mais 30 minutos a 37°C, 5% de CO2. Placas foram processadas para leitura de cAMP com o uso do Kit de Detecção de Ensaio de cAMP HitHunter® para Biologies (DiscoverX/Eurofms; Fremont, CA; nº de Cat. 90-0075LM25) seguindo as instruções do fabricante. A avaliação inicial dos clones isolados foi realizada numa concentração única de 30 µg/ml.

[0194] Dos 112 clones testados, apenas oito clones exibiram atividade antagonista. Dois clones mostraram algum grau de antagonismo na ausência do agonista, M3 e num grau menor M1. Os oito anticorpos M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, e M8 foram adicionalmente avaliados titulando-se a concentração do Abs para obter curvas de resposta à dose e valores EC50 reais (Tabela 3 e Figura 1). EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE ANTICORPOS ANTI-CB1 DE CAMUNDONGO NUM ENSAIO DE PERK

[0195] Os oito anticorpos que foram antagonistas funcionais no ensaio de cAMP foram adicionalmente avaliados num ensaio de fosforilação de pERK realizado com o uso da linha celular cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi (DiscoverX/Eurofms, Fremont, CA; nº de Cat. 95-0071C2). Brevemente, células foram semeadas em placas de 96 poços em 2 x 104 células/poço no Meio de Cultura Celular de Ensaio Completo do Kit-107 (DiscoverX/Eurofms, Fremont, CA; nº de Cat. 92- 3107G) mais 800 µg/ml de G418 e incubadas a 37°C, 5% de CO2. No dia seguinte, o meio de cultura foi substituído por 100 µl/poço de meio de privação de F-12K isento de soro (Invitrogen, Grand Island, NY; nº de Cat. 11765054). Placas foram incubadas por mais um dia a 37°C, 5% de CO2. No dia do tratamento, o meio de F-12K foi substituído por 30 µl/poço de meio fresco de F-12K.

Um anticorpo de teste ou controle de isótipo (7,5 µl de uma diluição de trabalho 6x concentrada) foi, então, adicionada nos poços e as placas foram incubadas por 10 minutos a 37°C, 5% de CO2. 7,5 µl de agonista (uma solução de 6 vezes de trabalho que compreende 0,18 µM de CP 55,940 em CAB com 90 µM de forscolina) foram adicionados em cada poço e as placas incubadas por mais 10 minutos a 37°C, 5% de CO2. Placas foram processadas por p-ERK/ERK Total com o uso de um kit Meso Scale Discovery (MSD) (Meso Scale Discovery, Rockville, Maryland; nº de Cat.

K15107D) seguindo as instruções do fabricante (Tabela 3 e Figura 2). TABELA 3. RESUMO DOS DADOS DE ENSAIO CELULAR DE ANTICORPO ANTI-HUCB-1 DE CAMUNDONGO cAMP P-ERK EC50 (nM) IC50 (nM) Anticorpo de CB1 cAMP Médio (% de Conjunt Dados Dados P-ERK Médio (% de Conjunt Dados Amgen) o de Conjunt Conjunt inibição) o de Conjunt Dados 1 o 2 o3 Dados 1 o 2 M1 75 43 170 150 68 163 165 M2 49 380 340 270 59 219 211 M3 71 290 290 330 59 296 534 M4 41 180 320 430 70 97 890 cAMP P-ERK EC50 (nM) IC50 (nM) Anticorpo de CB1 cAMP Médio (% de Conjunt Dados Dados P-ERK Médio (% de Conjunt Dados Amgen) o de Conjunt Conjunt inibição) o de Conjunt Dados 1 o 2 o3 Dados 1 o 2 M5 61 91 170 170 101 191 50 M6 21 310 290 640 42 144 300 M7 61 78 120 120 95 117 170 M8 29 96 190 370 64 36 47 EXEMPLO 5: LIGAÇÃO DE EC50 DE ANTICORPOS ANTI-CB-1 DE

CAMUNDONGO EM CÉLULAS DE SUPEREXPRESSÃO CHO DE CB-1

[0196] Ligação de anticorpo foi testada num ensaio com base em classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) para a habilidade dos anticorpos anti-CB1 de camundongo em se ligar às células CHO parentais, células CHO de superexpressão de CB-1 humano e células CHO de superexpressão de CB-1 de camundongo para obter curvas de ligação e valores de EC50. As três linhas celulares foram coletadas, lavadas e dispensadas em 1 x 105 células por poço de placas de FACS de policarbonato de 96 poços com fundo em v (Coming, Corning, NY, nº de Cat. 3357) em 50 µl de tampão de FACS (1X PBS/ 2 mM EDTA e 1% de FBS (ThermoFisher Scientific, Anaheim, CA; nº de Cat. 10438-026). Diluições em série dos anticorpos foram preparadas em concentrações de 2X a partir de 200 nM e diluídas em série 3 vezes. Os anticorpos titulados foram adicionados nas placas que contêm as três diferentes linhas celulares (células CHO de CB-1 parental, humana e de camundongo) e incubados a 4°C por 1 hora. As placas foram lavadas 3X com tampão de FACS. As células foram ressuspensas em 50 µl de diluição de 1/5000 de IgG-HRP anti-camundongo de cabra (Jackson Immuno Research, West Grove, PA; nº de Cat. 115-035-003), incubadas a 4°C por 30 minutos, lavadas 3X com tampão de FACS e os dados coletados no BD FACS Canto (BD Biosciences, San Jose, CA; nº de Cat. 338962) e analisados com o uso de FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR) (Tabela 4). Nenhum dos oito anticorpos funcionais testados foram reativos de forma cruzada com camundongo (Figura 3). TABELA 4. CLONES DE CAMUNDONGO DE AFINIDADE DE

LIGAÇÃO CELULAR PARA CÉLULAS DE SUPEREXPRESSÃO DE CB1 Clone M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 EC50 15,7 34,72 61,62 19,19 20,16 43,52 12,97 10,66 (nM) EXEMPLO 6: ANÁLISE DE EC50 DE ANTICORPOS ANTI-CB-1

FUNCIONAIS E AVALIAÇÃO PARA LIGAÇÃO CONFORMACIONAL

[0197] O objetivo deste experimento foi determinar se anticorpos de antagonista anti-CB1 têm capacidades de ligação diferenciais para CB1 em confirmações de estado neutro, antagonista ou agonista. Quatro diferentes preparações de linha celular foram usadas: Células CHO- huCB1 (geradas domesticamente), pré-incubadas CHO-huCB1 com agonista reverso JD5037 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI; nº de Cat. 1392116-14-1), pré-incubadas CHO-huCB1 com agonista CP-55,940 (TOCRIS, Minneapolis, MN; nº de Cat. 0949), e CHO-S parente (ThermoFisher Scientific, VA; nº de Cat. R80007). 2 x 107 células de CB1 CHO-S e CHO-hu parentais foram definidas aparte no tampão de FACS. Além disto, 2 x 107 células CHO-huCB1 revestidas com agonista reverso JD5037 ou agonista CP-55,940 foram incubadas a 4°C por 1 hora. Após incubação estas duas linhas celulares revestidas foram lavadas 2X em tampão de FACS e ressuspensas a 2 x 107 em tampão de FACS que contém as moléculas de agonista reverso ou agonista, respectivamente. Todas as quatro linhas celulares foram colocadas em placa em placas de FACS de fundo em v (Coming, Coming, NY; nº de Cat. 3357) e anticorpos de teste anti-CB1 pré-titulados foram adicionados nas células e avaliados para ligação por BD FACS Canto

(BD Biosciences, San Jose, CA; nº de Cat. 338962). Conforme mostrado na Figura 4, os anticorpos não se ligam às células CHO parentais (curva azul), os oito Abs funcionais acima (M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7 e M8) não exibem uma ligação preferencial na presença de agonista ou antagonista conforme exibido através da ligação observada sob todas as condições (curvas vermelha, roxa e verde). Apenas 2 anticorpos de teste que foram de outra forma não funcionais nos ensaios de cAMP ou pERK, exibiram uma ligação preferencial na presença de antagonista e ausência de agonista, respectivamente. Isto sugere que um anticorpo anti-CB1 funcional pode não estar associado a uma conformação de ligação que ocasionada na presença de um agonista ou antagonista de receptor conhecido. EXEMPLO 7: IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA E ANÁLISE DE ANTICORPOS ANTI-CB1 DE CAMUNDONGO

[0198] As hibridomas dos oito anticorpos anti-huCB-1 murinos foram coletadas como pelotas de célula e os sobrenadantes foram usados para determinar o isótipo de cada uma das hibridomas com o uso de um kit ELISA de isotipagem de camundongo padrão (Pierce/ThermoFisher Scientific, San Diego, CA; nº de Cat. 37503). Quatro dos anticorpos (M1, M3, M4 e M6) são IgG2a,K e quatro dos anticorpos (M2, M5, M7 e M8) são IgG2b,K. As pelotas foram processadas para RNA e cDNA e o kit de amplificação SMARTER RACE (Clontech, Mountain View, CA; nº de Cat. 634859) foi usado para processar o cDNA para sequenciação. O isótipo de cada um dos anticorpos foi usado para projetar os iniciadores reversos para a região constante das cadeias pesadas e da região constante kappa de cadeia leve e SeqAmp polimerase (CloneTech, Mountain View, CA; nº de Cat. 638504) como o iniciador dianteiro. Um iniciador MOPC21 PNA (sintetizado com base na sequência) foi incluído para evitar amplificação da cadeia leve aberrante que frequentemente aparece durante o processo de sequenciação e pode interferir na identificação da sequência de região variável de cadeia leve real.

Um total de 8 sequências únicas e 7 famílias únicas foram identificadas.

As sequências dos oito clones são fornecidas na Tabela 5. Uma sequência de consenso das cadeias pesadas e leves dos anticorpos de hibridoma é fornecida nas Figuras 5 A e 5B, respectivamente.

TABELA 5. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE CAMUNDONGO - ANTICORPOS DE CB1 QUIMÉRICO DE FC HUMANO Nome Região de Sequência de Aminoácidos SEQ ID de Proteína 1234567890123456789012345678901234567890 NO Código

M1 HC 17

VH 18

CH 19

CDR-H1 20

CDR-H2 21

CDR-H3 22

Nome Região de Sequência de Aminoácidos SEQ ID de Proteína 1234567890123456789012345678901234567890 NO Código

LC 23

VL 24

CL 25

CDR-L1 26

CDR-L2 27

CDR-L3 28

M2 HC 29

VH 30

CH 31

CDR-H1 32

CDR-H2 33

CDR-H3 34

LC 35

VL 36

CL 37

CDR-L1 38

CDR-L2 39

CDR-L3 40

M3 HC 41

VH 42

CH 43

CDR-H1 44

CDR-H2 45

CDR-H3 46

LC 47

VL 48

CL 49

CDR-L1 50

CDR-L2 51

CDR-L3 52

M4 HC 53

VH 54

CH 55

CDR-H1 56

CDR-H2 57

CDR-H3 58

LC 59

VL 60

CL 61

CDR-L1 62

CDR-L2 63

CDR-L3 64

Nome Região de Sequência de Aminoácidos SEQ ID de Proteína 1234567890123456789012345678901234567890 NO Código M5 HC 65 VH 66 CH 67 CDR-H1 68 CDR-H2 69 CDR-H3 70

LC LC 71

VL VL 72 CL 73 CDR-L1 CDR-L1 74 CDR-L2 CDR-L2 75 CDR-L3 CDR-L3 76 M6 HC 77 VH 78 CH 79

CDR-H1 80

CDR-H2 81

CDR-H3 82

LC 83

VL 84

CL 85

CDR-L1 86

CDR-L2 87

CDR-L3 88

M7 HC 89

VH 90

CH 91

CDR-H1 92

CDR-H2 93

CDR-H3 94

LC 95

VL 96

CL 97

CDR-L1 98

CDR-L2 99

CDR-L3 100

M8 HC 101

Nome Região de Sequência de Aminoácidos SEQ ID de Proteína 1234567890123456789012345678901234567890 NO Código VH 102 CH 103 CDR-H1 104 CDR-H2 105 CDR-H3 106 LC 107 VL 108 CL 109 CDR-L1 110 CDR-L2 111 CDR-L3 112 EXEMPLO 8: SELEÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CB1 DE

CAMUNDONGO PARA HUMANIZAÇÃO

[0199] Com base nos dados funcionais, clones anti-huCB-1 de camundongo M7 e M5 foram selecionados para humanização com o uso de uma ferramenta de engenharia humana preditiva derivada do pacote de software PHEnon™ (Xoma, Berkley, CA) (documento de Patente nº U.S. 5.766.886). Sequências de VH e VL para cada clone foram submetidas como consultas e sequências de saída foram geradas com base nas correspondências de linha genética humana a partir do banco de dados de Kabat.

Uma lista de mutações na região de framework foi gerada para desenvolver as sequências de VH e VL em direção à correspondência de framework humano.

O risco mutacional de resíduos individuais foi avaliado através de diversos critérios (documento e Patente nº U.S. 5.766.886). Acumulativamente, mutações foram agrupadas para constituir agrupamento de clone de “Baixo Risco” e “Médio Risco”. Sequências de saída e mutações introduzidas foram validadas em sílico por meio de modelagem de homologia.

Sequências de anticorpo de VH e VL humanizadas finais foram clonadas numa cadeia principal de vetor de IgG1 humano (vetor TCAL DGV), expressas em células CHO e purificadas através de cromatografia de afinidade de proteína A de acordo com métodos padrão.

As sequências dos clones humanizados são fornecidas na Tabela 6. Uma sequência de consenso das cadeias pesadas e leves dos anticorpos M7 e M5 humanizados é fornecida nas Figuras 6A e 6B, respectivamente.

TABELA 6. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE ANTICORPOS DE CB1 HUMANIZADOS

M7- HC 113 H1

VH 114

CH 115

CDR-H1 116

CDR-H2 117

CDR-H3 118

LC 119

VL 120

CL 121

CDR-L1 122

CDR-L2 123

CDR-L3 124

M7- HC 125 H2

VH 126

CH 127

CDR-H1 128

CDR-H2 129

CDR-H3 130

LC 131

VL 132

CL 133

CDR-L1 134

CDR-L2 135

CDR-L3 136

M7- HC 137 H3

VH 138

CH 139

CDR-H1 140

CDR-H2 141

CDR-H3 142

LC 143

VL 144

CL 145

CDR-L1 146

CDR-L2 147

CDR-L3 148

M7- HC 149 H4

VH 150

CH 151

CDR-H1 152

CDR-H2 153

CDR-H3 154

LC 155

VL 156

CL 157

CDR-L1 158

CDR-L2 159

CDR-L3 160

M7- HC 161 H5

VH 162

CH 163

CDR-H1 164

CDR-H2 165

CDR-H3 166

LC 167

VL 168

CL 169

CDR-L1 170

CDR-L2 171

CDR-L3 172

M7- HC 173 H6

VH 174

CH 175

CDR-H1 176

CDR-H2 177

CDR-H3 178

LC 179

VL 180

CL 181

CDR-L1 182

CDR-L2 183

CDR-L3 184

M7- HC 185 H7

VH 186

CH 187

CDR-H1 188

CDR-H2 189

CDR-H3 190

LC 191

VL 192

CL 193

CDR-L1 194

CDR-L2 195

CDR-L3 196

M7- HC 197 H8

VH 198

CH 199

CDR-H1 200

CDR-H2 201

CDR-H3 202

LC 203

VL 204

CL 205

CDR-L1 206

CDR-L2 207

CDR-L3 208

M7- HC 209 H9

VH 210

CH 211

CDR-H1 212

CDR-H2 213

CDR-H3 214

LC 215

VL 216

CL 217

CDR-L1 218

CDR-L2 219

CDR-L3 220

M7- HC 221 H10

VH 222

CH 223

CDR-H1 224

CDR-H2 225

CDR-H3 226

LC 227

VL 228

CL 229

CDR-L1 230

CDR-L2 231

CDR-L3 232

M7- HC 233 H11

VH 234

CH 235

CDR-H1 236

CDR-H2 237

CDR-H3 238

LC 239

VL 240

CL 241

CDR-L1 242

CDR-L2 243

CDR-L3 244

M7- HC 245 H12

VH 246

CH 247

CDR-H1 248

CDR-H2 249

CDR-H3 250

LC 251

VL 252

CL 253

CDR-L1 254

CDR-L2 255

CDR-L3 256

M7- HC 257 H13

VH 258

CH 259

CDR-H1 260

CDR-H2 261

CDR-H3 262

LC 263

VL 264

CL 265

CDR-L1 266

CDR-L2 267

CDR-L3 268

M7- HC 269 H14

VH 270

CH 271

CDR-H1 272

CDR-H2 273

CDR-H3 274

LC 275

VL 276

CL 277

CDR-L1 278

CDR-L2 279

CDR-L3 280

M7- HC 281 H15

VH 282

CH 283

CDR-H1 284

CDR-H2 285

CDR-H3 286

LC 287

VL 288

CL 289

CDR-L1 290

CDR-L2 291

CDR-L3 292

M7- HC 293 H16

VH 294

CH 295

CDR-H1 296

CDR-H2 297

CDR-H3 298

LC 299

VL 300

CL 301

CDR-L1 302

CDR-L2 303

CDR-L3 304

M5- HC 305 H1

VH 306

CH 307

CDR-H1 308

CDR-H2 309

CDR-H3 310

LC 311

VL 312

CL 313

CDR-L1 314

CDR-L2 315

CDR-L3 316

M5- HC 317 H2

VH 318

CH 319

Nome Região de Sequência de Aminoácidos SEQ ID de Proteína 1234567890123456789012345678901234567890 NO Código CDR-H1 320 CDR-H2 321 CDR-H3 322 LC 323 VL 324 CL 325 CDR-L1 326 CDR-L2 327 CDR-L3 328 EXEMPLO 9: REAVALIAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-CB1

HUMANIZADOS EM ENSAIOS FUNCIONAIS E DE LIGAÇÃO CELULAR

[0200] As variantes anti-CB1 humanizadas foram reavaliadas para sua habilidade em ligar células CHO- huCB-1 e em comparação com clones de camundongo parental M5 e M7 (Figuras 7A e 7B) para assegurar que a ligação foi retida. As condições de ensaio usadas foram similares àquelas descritas no Exemplo 5. Depois da análise de ligação, variantes de teste também foram avaliadas para função como antagonistas nos ensaios de cAMP e pERK de acordo com os Exemplos 3 e 4 (as Figuras 8A, 8B, 9A e 9B) para assegurar que a ligação e a atividade fossem mantidas após humanização. Todos os clones retiveram sua atividade antagonista e de ligação. A Figura 10 mostra o agonismo inverso exibido pelos formatos anti-CB1 Ab M7-H5 e IgG2b humanizados.

EQUIVALENTES

[0201] A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características essenciais da mesma. As modalidades anteriores devem ser, portanto, consideradas em todos os aspectos como ilustrativas em vez de limitantes à descrição. O escopo da descrição é, assim, indicado pelas reivindicações anexas em vez de pela descrição anterior, e todas as mudanças que estejam dentro do significado e abrangência de equivalência das reivindicações, são, portanto, destinadas a serem abrangidas no presente documento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1), compreendendo seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs): CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que CDR-H1 tem uma sequência de aminoácidos G-Y-T-F-T-D- Y-W (resíduos 26 a 33 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através de uma substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de G na posição 1 é S; a substituição de T na posição 3 é E; a substituição de T na posição 5 é S ou N; a substituição de D na posição 6 é R ou Y; a substituição de Y na posição 7 é H; e a substituição de W na posição 8 é A ou N; CDR-H2 tem uma sequência de aminoácidos I-Y-P-Y-D-G- D-T (resíduos 51 a 58 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através de uma substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de I na posição 1 é F; a substituição de Y na posição 2 é D, S ou T; a substituição de P na posição 3 é T; a substituição de Y na posição 4 é G, D ou S; a substituição de D na posição 5 é Y ou S; a substituição de G na posição 6 é S; a substituição de D na posição 7 é E, G ou R; e a substituição de T na posição 8 é A, S ou I; CDR-H3 tem uma sequência de aminoácidos A-R-G-X1-X2- X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-W-X10-X11-Y (resíduos 98 a 113 da SEQ ID NO:329) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de A na posição 1 é S; a substituição de G na posição 3 é S; X1 na posição 4 é Q, Y, K, R ou G, ou não está presente; X2 na posição 5 é E, Y, L ou G, ou não está presente; X3 na posição 6 é Y ou P, ou não está presente; X4 na posição 7 é Y, R, ou E, ou não está presente; X5 na posição 8 é G, ou não está presente; X6 na posição 9 é T, ou não está presente; X7 na posição 10 é N ou D, ou não está presente; X8 na posição 11 é Y, N, A, ou G, ou não está presente; X9 na posição 12 é N, Y, S, A, ou R, ou não está presente; a substituição de W na posição 13 é Y, A, ou P; X10 na posição 14 é L, M, F ou G, ou não está presente; X11 na posição 15 é P, D, A ou T, ou não está presente; a substituição de Y na posição 16 é V; CDR-L1 tem uma sequência de aminoácidos Q-X1-I-S-S-X2- Y (resíduos 27 a 33 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de Q na posição 1 é S ou E; X1 na posição 2 é E, S, T, N, G, ou R; a substituição de I na posição 3 é V; a substituição de S na posição 4 é A, R ou G; a substituição de S na posição 5 é G, N ou T; X2 na posição 6 é S, N, o peptídeo F-R-Y-S, ou não está presente; e a substituição de Y na posição 7 é F, D ou N; CDR-L2 tem uma sequência de aminoácidos: X1-T-S (resíduos 51 a 53 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que X1 na posição 1 é A, Y, G, R, D ou S; a substituição de T na posição 2 é A; a substituição de S na posição 3 é R; e CDR-L3 tem uma sequência de aminoácidos: Q-Q-Y-X1-S- X2-P-Y-T(resíduos 91 a 99 da SEQ ID NO:330) ou uma modificação da dita sequência de aminoácidos através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido, em que a substituição de Q na posição 1 é L ou H; a substituição de Q na posição 2 é H; a substituição de Y na posição 3 é S ou G; X1 na posição 4 é S, W, H, Y, N ou I; a substituição de S na posição 5 é E, R, G, T ou N; X2 na posição 6 é Y, I, S, T, L ou W; e a substituição de Y na posição 8 é P, L, F, ou não está presente; em que a dita substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido não inibe a habilidade do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em ligar CB1 humano.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1), em que o anticorpo compreende CDRs de uma sequência de domínio pesado variável (VH) e CDRs de uma sequência de domínio leve variável (VL), em que a sequência de domínio VH é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318, e em que o domínio de VL é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1), em que o anticorpo compreende uma sequência de domínio pesado variável (VH) e uma sequência de domínio leve variável (VL), em que a sequência de domínio VH é selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318, e/ou em que o domínio de VL é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e 324.

4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve de um par VH/VL selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18/24, 30/36, 42/48, 54/60, 66/72, 78/84, 90/96, 102/108, 114/120, 126/132, 138/144, 150/156,

162/168, 174/180, 186/192, 198/204, 210/216, 222/228, 234/240, 246/252, 258/264, 270/276, 282/288, 294/300, 306/312 e 318/324.

5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par VH/VL selecionado a partir do grupo que consiste nas: SEQ ID NOs: 18/24, 30/36, 42/48, 54/60, 66/72, 78/84, 90/96, 102/108, 114/120, 126/132, 138/144, 150/156, 162/168, 174/180, 186/192, 198/204, 210/216, 222/228, 234/240, 246/252, 258/264, 270/276, 282/288, 294/300, 306/312 e 318/324.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de HCDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em (20, 21, 22); (32, 33, 34); (44, 45, 46); (56, 57, 58); (68, 69, 70); (80, 81, 82); (92, 93, 94); (104, 105, 106); (116, 117, 118); (128, 129, 130); (140, 141, 142); (152, 153, 154); (164, 165, 166); (176, 177, 178); (188, 189, 190); (200, 201, 202); (212, 213, 214); (224, 225, 226); (236, 237, 238); (248, 249, 250); (260, 261, 262); (272, 273, 274); (284, 285, 286); (296, 297, 298); (308, 309, 310); e (320, 321, 322) e um conjunto de LCDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em (26, 27, 28); (38, 39, 40); (50, 51, 52); (62, 63, 64); (74, 75, 76); (86, 87, 88); (98, 99, 100); (110, 111, 112); (122, 123, 124); (134, 135, 136); (146, 147, 148); (158, 159, 160); (170, 171, 172); (182, 183, 184); (194, 195, 196); (206, 207, 208); (218, 219, 220); (230, 231, 232); (242, 243, 244); (254, 255, 256); (266, 267, 268); (278, 279, 280); (290, 291, 292); (302, 303, 304); (314, 315, 316); e (326, 327, 328).

7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par (conjunto de HCDR/conjunto de LCDR) selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: (20, 21, 22/ 26, 27, 28); (32, 33, 34/ 38, 39, 40); (44, 45, 46/ 50, 51, 52); (56, 57, 58/ 62, 63, 64); (68, 69, 70/ 74, 75, 76); (80, 81, 82/ 86, 87, 88); (92, 93, 94/ 98, 99, 100); (104, 105, 106/ 110, 111, 112); (116, 117, 118/ 122, 123, 124); (128, 129, 130/ 134, 135, 136); (140, 141, 142/ 146, 147, 148); (152, 153, 154/ 158, 159, 160); (164, 165, 166/ 170, 171, 172); (176, 177, 178/ 182, 183, 184); (188, 189, 190/ 194, 195, 196); (200, 201, 202/ 206, 207, 208); (212, 213, 214/ 218, 219, 220); (224, 225, 226/ 230, 231, 232); (236, 237, 238/ 242, 243, 244); (248, 249, 250/ 254, 255, 256); (260, 261, 262/ 266, 267, 268); (272, 273, 274/ 278, 279, 280); (284, 285, 286/ 290, 291, 292); (296, 297, 298/ 302, 303, 304); (308, 309, 310/ 314, 315, 316); e (320, 321, 322/ 326, 327, 328).

8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende o par de HC/LC selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17/23, 29/35, 41/47, 53/59, 65/71, 77/83, 89/95, 101/107, 113/119, 125/131, 137/143, 149/155, 161/167, 173/179, 185/191, 197/203, 209/215, 221/227, 233/239, 245/251, 257/263, 269/275, 281/287, 283/289, 305/311 e 317/323.

9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de canabinoide humano tipo 1 (CB1) (SEQ ID NO: 1), em que o anticorpo compreende CDRs de uma sequência de domínio pesado variável (VH) e CDRs de uma sequência de domínio leve variável (VL), em que a sequência de domínio VH tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 30, 42, 54, 66, 78, 90, 102, 114, 126, 138, 150, 162, 174, 186, 198, 210, 222, 234, 246, 258, 270, 282, 294, 306 e 318;

e a sequência de domínio de VL tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312 e

324.

10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 114 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 120.

11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 126 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 132.

12. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 138 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 144.

13. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 150 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 156.

14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 162 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 168.

15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 174 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 180.

16. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 186 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 192.

17. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 198 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 204.

18. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 210 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 216.

19. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 222 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 228.

20. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 234 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 240.

21. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 246 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 252.

22. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 258 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 264.

23. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 270 e o VL é apresentado na

SEQ ID NO: 276.

24. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 282 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 288.

25. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 294 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 300.

26. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 306 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 312.

27. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o VH é apresentado na SEQ ID NO: 318 e o VL é apresentado na SEQ ID NO: 324.

28. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado.

29. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende um fragmento de Fab, um fragmento de Fab’, um fragmento de F(ab)2 ou um fragmento de scFv.

30. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região de Fc humana selecionada a partir do grupo que consiste num Fc de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM.

31. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região de Fc humana modificada.

32. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região de Fc humana modificada que compreende uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em L234A/L235A, S228P, A330S, P331S, E233P/L234V/L235A, A327G/A330S/P331S, L234F/L235E/P331S e N297Q.

33. Proteína de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende um fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.

34. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe atividade de sinalização de CB1.

35. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aprimora ou ativa a atividade de sinalização de CB1.

36. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um agonista reverso para atividade de sinalização de CB1.

37. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36,

caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado.

38. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo completamente humano.

39. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compete pela ligação ao CB1 com um anticorpo anti-CB1 humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38.

40. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete pela ligação é um anticorpo humano ou humanizado.

41. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epítopo substancialmente igual de CB1 como o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 38.

42. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao epítopo substancialmente igual de CB1 é um anticorpo humano ou humanizado.

43. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga ao receptor de canabinoide tipo 1 (CB1), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma afinidade de ligação Kd para CB1 de cerca de 1 µM ou menos.

44. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem uma afinidade de ligação Kd para CB1 de cerca de 100 nM ou menos.

45. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe penetração cerebral reduzida em comparação como rimonabanto.

46. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno inibe a sinalização de CB1 que é pelo menos 2 vezes maior em comparação com rimonabanto.

47. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno exibe efeitos colaterais no CNS reduzidos em relação ao rimonabanto.

48. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

49. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 48.

50. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão, como definido na reivindicação 49.

51. Método para modular sinalização de CB1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

52. Método para antagonizar CB1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

53. Método para agonizar CB1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

54. Método para agonizar inverso CB1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula que expressa CB1 em contato com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

55. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

56. Método para inibir a atividade biológica de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 55, ao indivíduo, inibindo, deste modo, a atividade da proteína de CB1 no indivíduo.

57. Método para tratar uma doença associada à atividade de CB1, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 55, a um indivíduo que sofre com a doença.

58. Método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo à modulação de sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica, como definida na reivindicação

55.

59. Método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo ao antagonismo ou agonismo inverso da sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 55.

60. Método para tratar uma doença ou um distúrbio responsivo ao agonismo da sinalização de CB1 num indivíduo que necessita do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 55.

61. Método para diagnosticar uma doença ou um distúrbio associado ao CB1, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em obesidade, obesidades sindrômicas que incluem síndrome de Prader-Willi (PWS), síndrome de Alstrom, síndrome de Bardet-Biedel (BBS), Osteodistrofia Hereditária de Albright (AHO), e síndrome de deleção de SIM1; diabetes e complicações relacionadas; dislipidemia; doenças hepáticas, tais como, por exemplo, esteato- hepatite não alcoólica (NASH), doença do fígado gorduroso não alcoólica, e cirrose biliar primária; fibrose, por exemplo, fibrose renal; doença renal crônica; neuropatia diabética, glomeruloesclerose segmental focal, doença renal; doenças metabólicas, osteoporose, ateroesclerose, doença inflamatória, doença cardiovascular, câncer, dor, esclerose sistêmica, espasticidade de esclerose múltipla, glaucoma e vício em nicotina.

63. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado num agente selecionado a partir do grupo que consiste num agente terapêutico, um agente citotóxico, uma molécula de imunoadesão e um agente de imaginologia.