TW202003549A - 大麻受體第一型(cb1)結合蛋白及其用途 - Google Patents

大麻受體第一型(cb1)結合蛋白及其用途 Download PDF

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安卓拉 凡吉爾
羅伯特 Ｊ 霍伊
凱西 薩辰
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Abstract

本發明提供經分離、經工程改造、非天然存在之CB1結合蛋白，包括抗CB1抗體或其抗原結合片段。該等CB1結合蛋白可用於治療及診斷CB1介導之病況、疾病及病症。

Description

大麻受體第一型(CB1)結合蛋白及其用途
本發明係關於大麻受體第一型(CB1)結合蛋白及其用途。
大麻受體第一型(CB1)主要在大腦中以及肺臟、肝臟、腎臟及脂肪組織外周表現之G蛋白質偶合受體總科中之7-跨膜細胞膜受體。CB1藉由身體內部天然產生之大麻(稱作內源性類大麻酚(諸如，類花生酸))或引入至身體內之大麻(諸如，大麻屬(cannabis))或相關合成化合物活化。大麻可逆地且立體選擇性地結合至CB1。在CB1接合之後，活化多個細胞內信號轉導路徑，導致腺苷酸環化酶之抑制及有絲分裂原活化之蛋白質(MAP)激酶之活化、突觸前N及P/Q類型鈣通道及D類型外向鉀通道之抑制及內向整流及A類型外向鉀通道之活化。咸信CB1表現以預防發展過度神經元活性、降低疼痛及其他發炎性症狀以及調節食物攝入的方式調節神經傳遞素釋放。
異常CB1活性已涉及多種疾病，包括肥胖症及相關病症，諸如血脂異常、糖尿病、纖維化、肝臟疾病，諸如肝脂肪變性、腎臟疾病、心血管疾病及癌症。
普威二氏症候群(Prader Willi Syndrome，PWS)為某些父本基因損失造成之基因病症且藉由肥胖症、2型糖尿病緩慢發展及肌無力表徵。CB-1用反向促效劑利莫那班(Rimonabant)經驗證為PWS中之標靶(Motaghedi等人(2011) Eur. J. Med. Genet. 54: 14-18)。利莫那班(亦稱作SR141716、阿克立亞(Acomplia)及紫木替(Zimulti))為Sanofi-Aventis研發且推出的作為口服中樞CB1拮抗劑之厭食減肥藥物。產品指定用於治療具有相關風險因素，諸如2型糖尿病或血脂異常結合飲食及運動之肥胖及超重患者。在2006年6月，EMEA批准該藥物用於肥胖症。在2008年，由於嚴重精神問題風險，包括自殺觀念，Sanofi-Aventis針對所有適應症中斷所有藥物研發及營銷。在2009年1月，EC撤回該藥物之營銷許可。
Merck研究另一反向促效劑泰倫那班(taranabant) (MK-0364)，但歸因於高水準之副作用，包括抑鬱症及焦慮症，停止其3期臨床試驗。已研究若干其他CB1反向促效劑(例如AM251、AM1387及AM4113)及拮抗劑(例如大麻萜酚、伊必那班(ibipinabant)、奧替那班(otenabant)、溴乙那班(surinabant)、四氫次大麻酚及維洛胺(virodhamine))，但其在研究早期階段中或已歸因於CNS副作用而歸入非人類研究。
正在研發多種CB-1反向促效劑/拮抗劑，其藉由限制其跨越血腦障壁(BBB)之能力而主要靶向外周表現之CB1。舉例而言，TM-38837為7TM Pharma A/S正在研發用於治療肥胖症及代謝障礙之1期CB1反向促效劑/拮抗劑。尚未到臨床階段之其他外周選擇性靜默拮抗劑為AM6545。外周選擇性CB-1拮抗作用可為靶向多個組織中之外周內源性類大麻酚作用之安全且更有效的方式：(1)肝臟-減少脂肪生成、脂肪儲存及葡萄糖分泌；(2)肌肉-提高葡萄糖攝入及氧化；(3)脂肪細胞-減少脂肪生成及脂肪儲存；減少脂聯素合成；及(4)胃腸道(GI)-提高飽腹感、GI輸送及吸收(Kloet及Woods (2009) Endocrinol. 150: 2531-2536)。
諸如抗體及相關結合蛋白之生物分子提供遞送治療劑且避免CNS受損及副作用之潛在安全且更有效的方式。一般而言，僅約0.1%循環抗體跨越完整BBB (Poduslo等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5705-5709；Yu及Watts (2013) Neurotherapeut. 10: 459-472)。因此，功能性抗CB1生物本質上較低曝露於CNS提供排他性地外周接合CB-1之機會，由此限制CNS中之小分子之藥理學驅動之不良事件。
抗體至CB1最近已描述於此項技術中，但其在臨床中之優點未知。參見美國專利公開案第20170210797號及第20160145333號。
因此仍需要鑑別不會明顯穿透BBB以避免大腦中接合CB1之不良藥理效應之安全且有效的外周受限抗CB1反向促效劑或拮抗劑。
本發明提供結合大麻第一型受體(CB1)，諸如抗體及其抗原結合片段之結合蛋白，其適用於治療及診斷疾病。
提供一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該結合蛋白包含六個互補決定區(CDR)：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中CDR-H1具有胺基酸序列G-Y-T-F-T-D-Y-W (SEQ ID NO:329之殘基26-33)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之G取代為S；位置3處之T取代為E；位置5處之T取代為S或N；位置6處之D取代為R或Y；位置7處之Y取代為H；且位置8處之W取代為A或N；CDR-H2具有胺基酸序列I-Y-P-Y-D-G-D-T (SEQ ID NO:329之殘基51-58)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之I取代為F；位置2處之Y取代為D、S或T；位置3處之P取代為T；位置4處之Y取代為G、D或S；位置5處之D取代為Y或S；位置6處之G取代為S；位置7處之D取代為E、G或R；且位置8處之T取代為A、S或I；CDR-H3具有胺基酸序列A-R-G-X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 -W-X10 -X11 -Y (SEQ ID NO:329之殘基98-113)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之A取代為S；位置3處之G取代為S；位置4處之X1 為Q、Y、K、R或G或不存在；位置5處之X2 為E、Y、L或G或不存在；位置6處之X3 為Y或P或不存在；位置7處之X4 為Y、R或E或不存在；位置8處之X5 為G或不存在；位置9處之X6 為T或不存在；位置10處之X7 為N或D或不存在；位置11處之X8 為Y、N、A或G或不存在；位置12處之X9 為N、Y、S、A或R或不存在；位置13處之W取代為Y、A或P；位置14處之X10 為L、M、F或G或不存在；位置15處之X11 為P、D、A或T或不存在；位置16處之Y取代為V；CDR-L1具有胺基酸序列Q-X1 -I-S-S-X2 -Y (SEQ ID NO:330之殘基27-33)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之Q取代為S或E；位置2處之X1 為E、S、T、N、G或R；位置3處之I取代為V；位置4處之S取代為A、R或G；位置5處之S取代為G、N或T；位置6處之X2 為S、N、肽F-R-Y-S或不存在；且位置7處之Y取代為F、D或N；CDR-L2具有胺基酸序列：X1 -T-S (SEQ ID NO:330之殘基51-53)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之X1 為A、Y、G、R、D或S；位置2處之T取代為A；位置3處之S取代為R；且CDR-L3具有胺基酸序列：Q-Q-Y-X1 -S-X2 -P-Y-T (SEQ ID NO:330之殘基91-99)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之Q取代為L或H；位置2處之Q取代為H；位置3處之Y取代為S或G；位置4處之X1 為S、W、H、Y、N或I；位置5處之S取代為E、R、G、T或N；位置6處之X2 為Y、I、S、T、L或W；且位置8處之Y取代為P、L、F或不存在；且其中至少一個胺基酸殘基之該取代、添加或缺失不抑制該抗體或其抗原結合片段結合人類CB1之能力。
表5及6提供本發明之例示性抗CB1抗體及其功能抗原結合片段。
提供一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列之CDR及可變輕鏈(VL)域序列之CDR，其中VH域序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或其中VL域選自由以下組成之群：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
提供一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列及可變輕鏈(VL)域序列，其中VH域序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或其中VL域選自由以下組成之群：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的VH/VL對之重鏈及輕鏈CDR：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312及318/324。
在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的VH/VL對：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312及318/324。
在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的HCDR組(HCDR1、HCDR2、HCDR3)：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；及(320、321、322)；及選自由以下組成之群的LCDR組(LCDR1、LCDR2、LCDR3)：(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)；及(326、327、328)。
在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的(HCDR組/LCDR組)對：SEQ ID NO:(20、21、22/26、27、28)；(32、33、34/38、39、40)；(44、45、46/50、51、52)；(56、57、58/62、63、64)；(68、69、70/74、75、76)；(80、81、82/86、87、88)；(92、93、94/98、99、100)；(104、105、106/110、111、112)；(116、117、118/122、123、124)；(128、129、130/134、135、136)；(140、141、142/146、147、148)；(152、153、154/158、159、160)；(164、165、166/170、171、172)；(176、177、178/182、183、184)；(188、189、190/194、195、196)；(200、201、202/206、207、208)；(212、213、214/218、219、220)；(224、225、226/230、231、232)；(236、237、238/242、243、244)；(248、249、250/254、255、256)；(260、261、262/266、267、268)；(272、273、274/278、279、280)；(284、285、286/290、291、292)；(296、297、298/302、303、304)；(308、309、310/314、315、316)；及(320、321、322/326、327、328)。
在一個實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的HC/LC對：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311及317/323。
提供一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列之CDR及可變輕鏈(VL)域序列之CDR，其中VH域序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少95%一致性：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或VL域序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少95%一致性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:114中且VL闡述於SEQ ID NO:120中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:126中且VL闡述於SEQ ID NO:132中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:138中且VL闡述於SEQ ID NO:144中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:150中且VL闡述於SEQ ID NO:156中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:162中且VL闡述於SEQ ID NO:168中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:174中且VL闡述於SEQ ID NO:180中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:186中且VL闡述於SEQ ID NO:192中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:198中且VL闡述於SEQ ID NO:204中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:210中且VL闡述於SEQ ID NO:216中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:222中且VL闡述於SEQ ID NO:228中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:234中且VL闡述於SEQ ID NO:240中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:246中且VL闡述於SEQ ID NO:252中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:258中且VL闡述於SEQ ID NO:264中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:270中且VL闡述於SEQ ID NO:276中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:282中且VL闡述於SEQ ID NO:288中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:294中且VL闡述於SEQ ID NO:300中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:306中且VL闡述於SEQ ID NO:312中。在一個實施例中，VH闡述於SEQ ID NO:318中且VL闡述於SEQ ID NO:324中。
在一個實施例中，抗CB1抗體為人類或人類化抗體。
在一個實施例中，抗CB1抗原結合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab)2 片段或scFv片段。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM Fc。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的經修飾之人類Fc區：L234A/L235A (「LALA」)、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S及N297Q。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段抑制CB1信號傳導活性或為CB1信號傳導活性之拮抗劑。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段增強或活化CB1信號傳導活性或為CB1信號傳導活性之促效劑。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段為CB1信號傳導活性之反向促效劑。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段為人類化抗體。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段為完全人類抗體。
提供抗CB1抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至與經分離之抗人類CB1抗體或其抗原結合片段實質上相同的CB1抗原決定基。
提供抗CB1抗體或其抗原結合片段，其與經分離之抗人類CB1抗體或其抗原結合片段競爭結合至CB1。
在一個實施例中，結合至CB1之經分離之抗體或其抗原結合片段對CB1具有約1 µM或小於1 µM之結合親和力Kd。
在一個實施例中，結合至CB1之經分離之抗體或其抗原結合片段對CB1具有約100 nM或小於100 nM之結合親和力Kd。
在一個實施例中，相比於利莫那班，抗CB1抗體或抗原結合片段展現降低的腦滲透。
在一個實施例中，抗CB1抗體或抗原結合片段抑制相比於利莫那班高至少2倍的CB1信號傳導。
在一個實施例中，抗CB1抗體或抗原結合片段展現相對於利莫那班降低的CNS副作用。
提供一種編碼抗CB1抗體或其抗原結合片段之經分離之核酸分子。
提供一種包含編碼抗CB1抗體或其抗原結合片段之核酸分子之表現載體。
提供一種包含表現載體之宿主細胞，該表現載體包含編碼抗CB1抗體或其抗原結合片段之核酸分子。
提供一種調節CB1信號傳導之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與抗CB1抗體或其抗原結合片段接觸。
提供一種拮抗CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與抗CB1抗體或其抗原結合片段接觸。
提供一種促效CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與抗CB1抗體或其抗原結合片段接觸。
提供一種反向促效CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與抗CB1抗體或其抗原結合片段接觸。
提供一種包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。
提供一種用於抑制有需要個體之CB1之生物活性之方法，該方法包含向該個體投與有效量之包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，由此抑制個體中之CB1蛋白質之活性。
提供一種用於治療與CB1活性相關之疾病之方法，該方法包含向罹患該疾病之個體投與包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。
提供一種治療有需要個體之對CB1信號傳導調節有反應之疾病或病症之方法，該方法包含投與包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。
提供一種治療有需要個體之對CB1信號傳導拮抗作用或反向促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包含向個體投與包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。
提供一種治療有需要個體之對CB1信號傳導促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包含向個體投與包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。
提供一種用於診斷與CB1相關之疾病或病症之方法，該方法包含使細胞與抗CB1抗體或其抗原結合片段接觸。
在一個實施例中，疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、綜合症狀肥胖症，包括普-威二氏症候群(PWS)、阿爾斯特倫(Alström)症候群、巴-比二氏症候群(Bardet-Biedel syndrome，BBS)、奧耳布賴特氏遺傳性骨失養症(Albright Hereditary Osteodystrophy，AHO)及SIM1缺失症候群；糖尿病及相關併發症；血脂異常；肝臟疾病，諸如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病及原發性膽汁性肝硬化；纖維化，例如腎臟纖維化；慢性腎臟疾病；糖尿病神經病變、病灶性區段性腎絲球硬化症、腎病；代謝疾病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、發炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多發性硬化症痙攣、青光眼及尼古丁成癮。
在一個實施例中，疾病或病症為腎臟疾病(諸如病灶性區段性腎絲球硬化症(FSGS)、糖尿病腎病變、奧爾波特(Alport)症候群、高血壓腎臟疾病、腎病症候群、類固醇耐藥性腎病症候群、微小病變、膜性腎病、特發性膜性腎病、膜增生性絲球體腎炎(MPGN)、免疫複合體介導之MPGN、補體介導之MPGN、狼瘡性腎炎、感染後絲球體腎炎、薄基底膜疾病、腎小球膜增殖性絲球體腎炎、澱粉樣變性(原發性)、c1q腎病、快速進行性GN、抗GBM疾病、C3絲球體腎炎、高血壓腎硬化、IgA腎病、蛋白尿腎臟疾病、微白蛋白尿或大量白蛋白尿腎臟疾病)、肺動脈高血壓、疼痛(諸如神經性疼痛或內臟疼痛)、癌症(諸如化療耐藥性乳癌、阿德力黴素(adriamycin)耐藥性乳癌、化療耐藥性結腸直腸癌、神經管胚細胞瘤或腫瘤血管生成)、焦慮症、抑鬱症、移植相關FSGS、移植相關腎病症候群、移植相關蛋白尿、膽汁鬱積性肝病、多囊性腎臟疾病、常染色體顯性多囊性腎病(ADPKD)、肥胖症、胰島素抗性、II型糖尿病、前期糖尿病、代謝症候群、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、糖尿病性胃輕癱或胃輕癱。
提供包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段之抗體共軛物，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由以下組成之群的試劑共軛：治療劑、細胞毒性劑、免疫黏附分子及顯影劑。
提供一種包含經分離之抗CB1抗體或其抗原結合片段及在免疫學分析中使用該抗體之說明的套組。
引用併入 可在本申請案通篇中引用的所有引用之參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請案及網站)之內容出於任何目的以全文引用之方式明確地併入本文中，就如同其中所引用之參考文獻一樣。除非另外指明，否則本發明將採用此項技術中眾所周知的免疫學、分子生物學、細胞生物學、藥物研發及藥物遞送之習知技術。
除非另外定義，否則本文所使用之科學及技術術語具有一般技術者通常所瞭解之含義。在發生任何潛在分岐之情況下，本文所提供之定義優先於任何辭典或外來定義。除非另外為情形所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另外說明，否則措詞「一(a)」或「一(an)」意謂「至少一個」。片語「至少一個」之含義等效於片語「一或多個」之含義。除非另外說明，否則措詞「或」意謂「及/或」。如本文所使用，術語「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有(containing)」、「具有(having)」及類似術語可具有歸屬於美國專利定律中之含義且可意謂「包括(includes)」、「包括(including)」及類似術語；「基本上由……組成(consisting essentially of)」或「基本上由……組成(consists essentially)」同樣地具有歸屬於美國專利定律中之含義且術語為開放式的，允許存在超過所敍述之內容，只要不改變基礎或新穎特徵即可，但排除先前技術實施例。除非明確陳述或為自上下文顯而易見的，否則如本文所使用，術語「約」理解為在此項技術中之一般公差範圍內，例如在平均值之2倍標準差內。約可理解為在陳述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非另外自上下文為清楚的，否則本文所提供之所有數值均藉由術語約修飾。
除非另外指明，否則本文所提供之方法及技術一般根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述來執行。本文所描述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交、分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學之命名法、實驗步驟及技術為此項技術中熟知且常用之彼等者。標準技術用於酶促反應及純化技術、化學合成、化學分析、醫藥製備、調配、遞送及患者治療。
本文所提供之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫。舉例而言，1至50之範圍應理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50組成之群的任何數目、數目組合或子範圍。
術語「大麻受體第一型」或「CB1」意謂由CNR1基因編碼且具有SEQ ID NO:1之典型胺基酸序列之7-跨膜細胞膜受體(參見https://www.uniprot.org/uniprot/P21554)。表1揭示此序列以及蛋白質之域中之每一者。
表 1. 大麻受體第一型胺基酸序列
Figure 108115125-A0304-0001
術語「中樞CB1」意謂定位於體內任何地方，包括大腦及CNS之CB1。
術語「外周CB1」意謂不定位於大腦或CNS之CB1(例如外周限制CB1)。
術語「抗體」意謂包含特異性結合至特定抗原或與特定抗原相互作用之至少一個互補決定區(CDR)的任何抗原結合分子或分子複合物。該術語包括(但不限於)多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、人類化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜交抗體、突變抗體及移植抗體。除非出於本發明之目的藉由術語「完整」，如在「完整抗體」中另外修飾，否則術語「抗體」亦包括抗體片段，諸如Fab、F(ab')2 、Fv、scFv、Fd、dAb及保留抗原結合功能，亦即，尤其結合CB1之能力的其他抗體片段。典型地，此類片段將包含抗原結合域。術語「抗體」包括包含四個多肽鏈、藉由二硫鍵互連之兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之免疫球蛋白分子以及其多聚體。在全長抗體之一個實施例中，各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)構成。CH由三個域CH1、CH2及CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)構成。CL由單一CL域構成。VH及VL可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)之更保守區。一般而言，各VH及VL由按以下次序自胺基端至羧基端排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在本發明之不同實施例中，抗CB1抗體之FR可與人類生殖系序列一致或可經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可基於兩個或多於兩個CDR及/或FR之並排分析確定。抗體分子可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類別。
術語「HCDR組」及「LCDR組」係指存在於分別能夠結合抗原之重鏈或輕鏈之單一可變區中之三個CDR之群組。術語「(HCDR組/LCDR組)對」係指HCDR組及LCDR之配對提供構成抗原結合位點之六個CDR。此等CDR之準確邊界已根據不同系統以不同方式加以界定。Kabat (Kabat等人(1987)及(1991))所描述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確殘基編號系統，且亦提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。術語「Kabat編號」意謂比抗體或其抗原結合片段之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更可變(亦即，高變)之編號胺基酸殘基之系統(Kabat等人(1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391及Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版物編號91-3242)。對於重鏈可變區，CDR1之高變區在胺基酸位置31至35範圍內，CDR2在胺基酸位置50至65範圍內，且CDR3在胺基酸位置95至102範圍內。對於輕鏈可變區，CDR1之高變區在胺基酸位置24至34範圍內，CDR2在胺基酸位置50至56範圍內，且CDR3在胺基酸位置89至97範圍內。Chothia及同事(Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia等人 (1989) Nature 342: 877-883)發現，在Kabat CDR內之某些子部分採用幾乎一致的肽主鏈構形，儘管在胺基酸序列之程度下具有極大的多樣性。此等子部分表示為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139及Maccallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45)所描述。又其他CDR邊界定義可不嚴格遵循本文系統中之一者，但仍然將與Kabat CDR重疊，儘管其可根據特定殘基或殘基基團或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現經縮短或延長。本文所描述之組合物及方法可利用根據此等系統中之任一者定義之CDR。
術語「VH/VL對」係指配對且能夠結合抗原之VH及VL。
術語「HC/LC對」係指配對且能夠結合抗原之HC及LC。
術語「Fc區」意謂免疫球蛋白重鏈之C端區，其可藉由完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生。Fc區可為天然序列Fc區或變異Fc區。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域，即CH2域及CH3域，且視情況包含CH4域。置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技術中已知(例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。Fc區介導若干重要效應功能，例如細胞介素誘導、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。在一些情況下，此等效應功能就治療性免疫球蛋白而言為合乎需要的，但在其他情況下，可能視治療目標而為不必要的或甚至有害的。
術語「結合CB1之抗體」及「抗CB1抗體」意謂結合可溶性CB1蛋白質或其片段(例如CB1之細胞外域之一部分)及/或細胞表面表現之CB1的抗體及其抗原結合片段。表述「細胞表面表現之CB1」意謂活體外或活體內在細胞表面上表現之CB1蛋白質或其部分以使得CB1蛋白質之至少一部分曝露於細胞膜之細胞外側且可進入抗體之抗原結合部分。
術語「CB1結合蛋白」或「抗CB1結合蛋白」意謂結合至CB1之蛋白質，其包含抗原結合片段之全部或一部分，且包括包含典型的抗體域或構架之替代性配置之蛋白質，諸如重組多價或多特異性免疫球蛋白以及共軛物及融合蛋白。本發明之CB1結合蛋白及其變體及突變體保留CB1結合及功能，或可提供額外或替代功能。此類CB1結合蛋白在本發明之範疇內且為熟習此項技術者熟知的。
關於諸如抗體之結合蛋白之術語「抗原結合域」及「抗原結合片段」意謂保留特異性結合至抗體之靶抗原之能力的抗體之部分或片段或其變體或突變體，且包括特異性結合抗原以形成複合物之任何天然存在、以酶促方式可獲得、合成或經基因工程改造之多肽或醣蛋白。抗體之抗原結合片段可例如使用任何適合之標準技術自完整抗體分子衍生，所述標準技術諸如蛋白水解消化或涉及操縱及表現編碼抗體可變域及視情況選用之恆定域的DNA之重組基因工程改造技術。一或多個可變域及/或恆定域可配置於適合的組態中，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，改變、添加或刪除胺基酸等。包含抗原結合片段之眾多片段、突變體或變異抗體型式為此項技術中已知的。抗原結合片段之非限制性實例包括：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為在鉸鏈區包含兩個藉由二硫橋鍵連接之Fab片段之二價片段；(iii) Fd片段，其包含VH及CH1域；(iv) Fv片段，其包含抗體之單一臂之VL及VH域；(v)單鏈Fv (scFv)分子；(vi) dAb片段，其包含單一可變域；及(vii)由模擬抗體之高變區之胺基酸殘基組成之最小識別單位(例如經分離之互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)或有限FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程改造之分子，諸如域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、線性抗體(包含一對串聯Fv鏈段；形成一對具有互補輕鏈多肽之抗原結合位點之VH-CH1-VH-CH1)、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模塊免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域亦涵蓋在如本文所使用之表述「抗原結合片段」內。術語「其抗原結合片段」不意謂為限制性的且包括可具有額外或重新配置抗體區域之變體分子內所含有之片段，例如保留對特定抗原之相同抗原結合之多特異性抗體及抗體共軛物。
抗體之抗原結合片段將典型地包含至少一個可變域。可變域可為任何尺寸或胺基酸組成且一般將包含至少一個與一或多個構架序列相鄰或同框之CDR。在具有與VL域相關聯之VH域的抗原結合片段中，VH及VL域可以任何適合之配置相對於彼此定位。舉例而言，可變區可為二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。替代地，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個共價連接至至少一個恆定域之可變域。可發現於本發明抗體之抗原結合片段內之可變域及恆定域之非限制性例示性組態包括：(i) VH-CH1；(ii) VH-CH2；(iii) VH-CH3；(iv) VH-CH1-CH2；(v) VH-CH1-CH2-CH3；(vi) VH-CH2-CH3；(vii) VH-CL；(viii) VL-CH1；(ix) VL-CH2；(x) VL-CH3；(xi) VL-CH1-CH2；(xii) VL-CH1-CH2-CH3；(xiii) VL-CH2-CH3；及(xiv) VL-CL。在可變域及恆定域之任何組態，包括上文所列之例示性組態中之任一者中，可變域及恆定域可直接彼此連接或可藉由完全或部分鉸鏈區或連接區連接。鉸鏈區可由至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多個)胺基酸組成，該等胺基酸在單一多肽分子中之相鄰可變域及/或恆定域之間產生可撓性或半可撓性連接。另外，本發明抗體之抗原結合片段可包含上文所列之任一可變域及恆定域組態之均二聚體或雜二聚體(或其他多聚體)，與彼此及/或與一或多個單體VH或VL域非共價締合(例如藉由雙硫鍵)。
如同完整抗體分子，抗原結合片段可為單特異性或多特異性的(例如雙特異性的)。抗體之多特異性抗原結合片段將典型地包含至少兩個不同可變域，其中各可變域能夠特異性結合至獨立抗原或相同抗原上之不同抗原決定基。任何多特異性抗體型式，包括本文所揭示之例示性雙特異性抗體型式可使用此項技術中可用之常規技術而適用於本發明抗體之抗原結合片段的情況下。
關於結合蛋白之術語「特異性」或「對……具有特異性」意謂例如以與任何其他標靶或抗原相比更大的親和力(亦即，較低Kd值)結合蛋白選擇性結合標靶或抗原之能力。
在某些實施例中，本發明之抗體可經由補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)起作用。CDC係指在補體存在下藉由本發明抗體溶解抗原表現細胞。ADCC係指細胞介導之反應，其中表現識別靶細胞上之結合抗體之Fc受體之非特異性細胞毒性細胞(FcR) (例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)，其導致靶細胞溶解。可使用此項技術中熟知且可用的分析量測CDC及ADCC。(參見例如美國專利第5,500,362號及第5,821,337號，及Clynes等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656)。
術語「小鼠抗體」意謂具有衍生自小鼠生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。小鼠抗體可例如在CDR中且尤其CDR3中包括不由小鼠生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，術語「小鼠抗體」並不意欲包括其中CDR序列衍生自已接枝於小鼠構架序列上之其他哺乳動物物種，諸如人類之生殖系的抗體。
術語「重組抗體」意謂藉由重組方式製備、表現、產生或分離之抗體，諸如使用經轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體；自重組組合抗體文庫分離之抗體；自針對藉由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離之免疫球蛋白基因或抗體轉基因之動物(例如小鼠)分離之抗體。在某些實施例中，此類重組抗體經受活體外突變誘發(或當使用針對免疫球蛋白序列轉基因之動物時，活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH區及VL區之胺基酸序列為儘管衍生自生殖系VH及VL序列且與其相關，可不天然存在於活體內特定抗體生殖系基因譜內之序列。
術語「經分離之抗體」意謂已自其天然環境之至少一種組分鑑別及分離及/或復原之抗體。舉例而言，自生物體之至少一種組分、或自其中抗體天然存在或天然產生之組織或細胞分離或移除之抗體出於本發明之目的為「經分離之抗體」。經分離之抗體亦包括重組細胞內之原位抗體。經分離之抗體為已經歷至少一個純化或分離步驟之抗體。根據某些實施例，經分離之抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。
術語「中和」或「阻斷」抗體意謂結合至其配位體或抗原抵消配位體或抗原之生物活性之抗體。在一個實施例中，中和結合蛋白結合至抗原(例如細胞介素)且其生物活性降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。結合至CB1之中和抗體：(i)干擾CB1或CB1片段與CB1配位體(例如大麻等)之間的相互作用，及/或(ii)使得抑制CB1之至少一個生物功能。起因於CB1中和或阻斷抗體之抑制無需完全，只要其可使用適當的分析偵測即可。本文描述用於偵測CB1抑制之例示性分析。
術語「親和力」意謂結合蛋白與其靶抗原之間的相互作用強度，且藉由結合蛋白之CDR之序列以及藉由抗原及抗體之性質，諸如其尺寸、形狀及/或電荷測定。結合蛋白之親和力可經選擇以提供所需治療端點同時使負面副作用減至最少。可使用熟習此項技術者已知的方法來量測親和力。
術語「親和力成熟抗體」意謂已在一或多個CDR或其FR中進行一或多個改變，使得相較於不具有彼等改變之未改變「親本」抗體之抗體對其靶抗原之親和力得到改良。例示性親和力成熟抗體將對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。藉由此項技術中已知的程序產生親和力成熟抗體。舉例而言，Marks等人(1992) BioTechnology 10: 779-783描述藉由VH及VL域改組之親和力成熟。Barbas等人(1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813；Schier等人(1995) Gene 169: 147-155；Yelton等人(1995) J. lmmunol. 155: 1994-2004；Jackson等人(1995) J. lmmunol. 154(7): 3310-9；Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896描述CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發，且在具有活性增強胺基酸殘基之選擇性突變誘發位置、接觸或超突變位置處之突變描述於美國專利第6,914,128號中。
術語「CDR接枝抗體」意謂包含重鏈及輕鏈可變區序列之抗體，其中VH及/或VL之CDR區中之一或多者之序列經其他抗體之CDR序列置換。舉例而言，兩個抗體可來自不同物種，諸如具有鼠重鏈及輕鏈可變區之抗體，其中鼠CDR序列中之一或多者已經人類CDR序列置換。
術語「人類化抗體」意謂來自已經改變以與人類生殖系序列更加類似的非人類物種之抗體。人類化抗體之一種類型為CDR移植抗體，其中一或多個CDR序列為非人類的，且構架區(FR)序列為人類或實質上人類，例如其與人類抗體之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致。人類化抗體可包含至少一個及典型地兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)之實質上全部，其中全部或實質上全部CDR區之序列與非人類免疫球蛋白之彼等者相對應，且FR區域之全部或實質上全部序列為人類免疫球蛋白之彼等者。人類化抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一個實施例中，人類化抗體亦包含人類免疫球蛋白Fc區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈之人類化可變域及/或重鏈之人類化可變域。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變域。在一些實施例中，人類化抗體含有重鏈以及至少輕鏈之可變域。
術語「效能」意謂結合蛋白實現所需作用之能力，且為其治療功效之量度。可使用熟習此項技術者已知之方法評定效能。
術語「有效量」意謂足以降低CB1之活性以改善患者之症狀或以實現所需生物學結果之劑量或量。所需生物學結果包括例如CB1活性之降低或提高。
術語「交叉反應」意謂結合蛋白結合除其針對培養之靶抗原外之能力。一般而言，結合蛋白將以適當高親和力結合其靶抗原，但可結合至其他物種之相同靶抗原或呈現針對非標靶抗原之較低親和力。一般選擇個別結合蛋白符合兩個準則：(1)適於抗體標靶之已知表現之組織染色；及(2)來自相同器官之人類與毒性研究物種(例如小鼠及食蟹獼猴)組織之間的類似染色圖案。熟習此項技術者已知評定交叉反應性之此等及其他方法。
術語「生物學功能」意謂無論天然存在或藉由重組方式實現之結合蛋白之特異性活體外或活體內活性。結合蛋白可靶向若干類別之抗原，且經由多種作用機制實現所需治療結果。結合蛋白可促效、拮抗或中和其標靶之活性。結合蛋白可幫助清除其結合之標靶，或可在結合至細胞時產生細胞毒性。兩種或多於兩種抗體之部分可合併為多價型式以於單一結合蛋白分子中達成不同功能。生物活性包括(但不限於)結合至受體、誘導細胞增殖、抑制細胞生長、誘導其他細胞介素、誘導細胞凋亡及酶活性。用以評定生物功能之活體外分析及活體內模型為熟習此項技術者已知。
術語「穩定」意謂能夠在給定時間段或儲存條件內保留其物理、化學及/或生物學完整性或活性。在各種溫度下活體外穩定達一段延長時間的結合蛋白一般為合乎需要的。穩定結合蛋白及評定其在各種溫度下之穩定性的方法為熟習此項技術者已知。
術語「溶解度」意謂蛋白質保持分散於水溶液內之能力。蛋白質於水性調配物中之溶解度視疏水性及親水性胺基酸殘基之適當分佈而定，且因此溶解性可與恰當摺疊之蛋白質之產生相關。熟習此項技術者將能夠使用常規HPLC技術及熟習此項技術者已知之方法偵測結合蛋白之溶解度的提高或降低。
術語「免疫原性」意謂物質誘發免疫反應之能力。投與治療結合蛋白可導致免疫反應之一定發生率。降低抗體及結合蛋白之免疫原性之方法為熟習此項技術者已知。
術語「可偵測標記」意謂連接至特異性結合對之成員，諸如抗體或其分析物以賦予可偵測的特異性結合對之成員之間的反應(例如結合)之部分。特異性結合對之經標記之成員稱為「可偵測地標記」。因此，術語「經標記之結合蛋白」係指具有提供結合蛋白鑑別併入之可偵測標記之蛋白質。在一個實施例中，可偵測標記可產生可藉由目視或儀器方式偵測的信號之可偵測標記，例如併入經放射性標記之胺基酸或將可藉由抗生物素蛋白(例如含有可藉由光學或比色方法偵測之螢光標記物或酶活性的抗生蛋白鏈菌素)偵測之生物素基部分連接至多肽。多肽之可偵測標記之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、、166 Ho或153 Sm)；色素原；螢光標記(例如FITC、若丹明、鑭系磷光體)；酶標記(例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；藉由二級報導子識別之預先確定的多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之鍵結位置、金屬結合域、抗原決定基標記物)；及磁性劑，諸如釓螯合物。通常用於免疫分析之標記之代表性實例包括產生光之部分(例如吖錠化合物)及產生螢光之部分(例如螢光素)。就此而言，該部分自身可能並非可偵測標記的，但可在與又一部分反應之後變為可偵測的。
術語「共軛物」係指化學上連接至其他功能分子或第二化學部分(諸如治療劑、細胞毒性劑、細胞生長抑制劑或顯影劑)之結合蛋白，諸如抗體(參見例如7,850,962)。術語「試劑」包括化學化合物、化學化合物之混合物、生物學大分子，諸如蛋白質之肽或由生物學材料製成之提取物。在一個實施例中，治療劑或細胞毒性劑包括(但不限於)抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞介素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴素、毒素及凋亡劑。適用的藥劑包括例如百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B、短桿菌素D、溴化乙錠、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。適用於製得抗CB1結合蛋白共軛物之顯影劑包括(但不限於)放射性標記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記及生物素。當在免疫分析之情況下採用時，共軛物抗體可為用作偵測抗體之可偵測標記之抗體。可藉由化學交聯或藉由重組方法連接抗體。抗體亦可以闡述於美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中之方式連接至多種非蛋白性聚合物中之一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。可藉由共價共軛至聚合物化學修飾抗體以例如提高其循環半衰期。將其附接之例示性聚合物及方法亦展示於美國專利第4,766,106號；第4,179,337號；第4,495,285號及第4,609,546號中。
術語「結晶」意謂以晶體形式存在之結合蛋白。晶體為物質之一種固態形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列構成。
術語「載體(vector)」係指能夠輸送另一核酸至其已連接之核酸之核酸分子。一種載體類型為「質體」，其係指其中可連接其他DNA片段之環形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中額外DNA片段可與病毒基因組連接。其他載體包括RNA載體。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體當引入至宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製(例如非游離型哺乳動物載體)。「重組表現載體」或「表現載體」能夠引導其可操作地連接之基因之表現。由於質體係載體之最常用形式，因而在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。然而，亦包括提供等效功能之其他表現載體形式，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」意謂已引入外源性DNA或RNA之細胞。此類術語不僅係指特定對象細胞，而且係指此類細胞之後代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而於後代中發生，此類後代可能實際上不與親本細胞相同，但仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。在一實施例中，宿主細胞包括原核及真核細胞。在一實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一實施例中，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NSO、SP2及PER.C6；昆蟲細胞株Sf9；及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )。
術語「轉染」意謂常用於外源性核酸引入至宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及類似技術。
術語「生物樣品」意謂來自生物或先前生物之一定數量之物質。此類物質包括(但不限於)血液、血漿、血清、尿液、羊膜液、滑液、內皮細胞、白血球、單核球、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。
術語「對照」係指已知不含有分析物(「陰性對照」)或含有分析物(「陽性對照」)之組合物。陽性對照可包含已知濃度之分析物或可用於確定分析效能特性且為試劑完整性之適用的指標。
術語「特異性結合對」意謂經由化學或物理方式彼此特異性結合之兩種不同分子。特異性結合對包括例如抗體及其抗原、生物素及抗生物素蛋白(或抗生蛋白鏈菌素)、碳水化合物及凝集素、互補核苷酸序列、效應子及受體分子、輔因子及酶、酶及抑制劑及酶及保留特異性結合之片段及其類似物。特異性結合對之一個實例為抗體之VH及VL區域(「VH/VL」)。
術語「連接子」意謂胺基酸殘基或包含兩個或多於兩個藉由用於連接兩個多肽(例如兩個VH或兩個VL域)之肽鍵接合之胺基酸殘基的多肽。連接子為此項技術中眾所周知的(參見例如Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2: 1121-1123)。
術語「抗原決定基」係指與稱為互補位之抗體分子之可變區中之特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定子。單一抗原可具有多於一個的抗原決定基。因此，不同抗體可結合至抗原上之不同區域且可具有不同生物效果。抗原決定基可為構形或線性的。構形抗原決定基藉由來自線性多肽鏈之不同鏈段之空間並置胺基酸產生。線性抗原決定基為由多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基產生之抗原決定基。在某些情形中，抗原決定基可包括抗原上之胺基酸、醣、磷醯基或磺醯基之部分，且可具有特定三維結構性特徵及/或特定電荷特徵。若結合蛋白結合至抗原上之相同胺基酸且亦可交叉競爭(一個抗體預防另一抗體之結合或調節作用)，則結合蛋白「結合至相同抗原決定基」。另外，抗原決定基之結構界定(重疊、相似、一致)具資訊性；且功能界定涵蓋結構(結合)及功能(調節、競爭)參數。
術語「藥物動力學」意謂生物體吸收、分佈、代謝及排出藥物之過程。
術語「生物可用性」意謂在投與後到達其標靶之活性藥物之量。生物可用性為若干特性之一個函數，包括穩定性、溶解度、免疫原性及藥物動力學，且可使用熟習此項技術者已知的方法評定。
術語「表面電漿子共振」意謂允許藉由例如使用BIAcore®系統(BIAcore International AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ；Jonsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26)偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度之改變來分析即時生物特異性相互作用之光學現象。
術語「Kon」、「締合速率常數」及「Ka」意謂結合蛋白(例如抗體)與抗原締合以形成結合蛋白/抗原複合物之締合速率常數。此值指示結合蛋白至其靶抗原之結合速率或結合蛋白與抗原之間的複合物形成速率，如以下等式所示： 抗體(「Ab」)+抗原(「Ag」)→「Ab-Ag」
術語「Koff」及「解離速率常數」意謂結合蛋白(例如抗體)自結合蛋白/抗原複合物解離之解離速率常數。此值指示結合蛋白自其靶抗原之解離速率或Ab-Ag複合物隨時間推移分離至游離抗體及抗原，如以下等式所示： Ab + Ag ← Ab-Ag
術語「Kd」及「平衡解離常數」意謂在均衡狀態下滴定量測中所獲得之值或解離速率常數(Koff)除以締合速率常數(Kon)。測定締合及解離速率常數之方法為此項技術中眾所周知的。基於螢光之技術提供較高敏感性及檢驗在均衡狀態下之生理緩衝劑中之樣品之能力。可使用其他實驗途徑及儀器，諸如BIAcore®分析(BIAcore international AB, Uppsala, Sweden)或KinExA®分析(Sapidyne Instruments, Boise, Idaho)。
術語「變體」意謂因胺基酸之添加、插入、缺失或保守性取代而與胺基酸序列中之給定多肽不同，但保留給定多肽之生物活性的多肽(例如可與結合至其標靶之天然抗體競爭之變異抗體)。胺基酸之保守性取代用具有類似特性(例如帶電荷區域之親水性及程度及分佈)之不同胺基酸置換胺基酸且在此項技術中識別為典型地涉及微小改變。如此項技術中所理解，此等微小變化可部分地藉由考慮胺基酸之親水指數而鑑別。胺基酸之親水指數係基於其疏水性及電荷之考慮。蛋白質中之類似親水指數之胺基酸可經取代且蛋白質仍保留蛋白質功能。在一個態樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於揭示將產生保留生物功能之蛋白質的取代。在肽之情形下考慮胺基酸之親水性允許計算彼肽之最大局域平均親水性，此為已報導與抗原性及免疫原性充分關聯的一種適用量度。如此項技術中所理解，具有相似親水性值之胺基酸的取代可產生保持生物活性(例如免疫原性)之肽。在一個態樣中，取代係用親水性值在彼此之±2內的胺基酸進行。胺基酸之疏水性指數及親水性值均受該胺基酸之特定側鏈影響。與彼觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代理解為視胺基酸且尤其彼等胺基酸之側鏈之如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性展現的相對相似性而定。術語「變體」亦包括已諸如藉由蛋白分解、磷酸化或其他轉譯後修飾區別處理，但保留生物活性或抗原反應性之多肽或其片段。除非另外定義，否則術語「變體」涵蓋變體之片段。變體可與野生型序列99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%一致。
相比於衍生出抗體之對應生殖系序列，本文所揭示之抗CB1抗體可包含重鏈及輕鏈可變域之構架及/或CDR區中之一或多個胺基酸取代、添加、插入及/或缺失。此類突變可容易地藉由比較本文所揭示之胺基酸序列與可自公共抗體序列資料庫獲得的生殖系序列而確定。本發明包括衍生自本文所揭示之胺基酸序列中之任一者之抗體及其抗原結合片段，其中一或多個構架及/或CDR區內之一或多個胺基酸突變成衍生出抗體之生殖系序列之對應殘基，或突變成其他人類生殖系序列之對應殘基，或突變成對應生殖系殘基之保守性胺基酸取代(此類序列變化在本文中統稱為「生殖系突變」)。一般熟習此項技術者以本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區序列起始，可容易地產生許多包含一或多個個別生殖系突變或其組合之抗體及抗原結合片段。在某些實施例中，VH及/或VL域內之所有構架及/或CDR殘基全部突變回衍生出抗體之初始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅某些殘基突變回原始生殖系序列，例如僅FR1之前8個胺基酸內或FR4之最後8個胺基酸內發現之突變殘基，或僅CDR1、CDR2或CDR3內發現之突變殘基。在其他實施例中，構架區及/或CDR殘基中之一或多者突變成不同生殖系序列(亦即，不同於最初衍生出抗體之生殖系序列的生殖系序列)之對應殘基。此外，本發明抗體可在構架區及/或CDR區內含有兩個或多於兩個生殖系突變之任何組合，例如其中某些個別殘基突變成特定生殖系序列之對應殘基，而不同於初始生殖系序列之某些其他殘基維持不變或突變成不同生殖系序列之對應殘基。在獲得後，可容易地測試含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結合片段之一或多種所需特性，諸如改良之結合特異性、增加之結合親和力、改良或增強之拮抗或促效生物特性(視具體情況而定)、降低之免疫原性等。以此一般方式獲得之抗體及抗原結合片段涵蓋於本發明內。
當指代核酸時，術語「實質上一致性」及「實質上一致」指示當與適當的核苷酸插入或缺失其他核酸(或其互補鏈)最佳比對時，在至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之核苷酸鹼基中分別存在核苷酸序列一致性，如藉由如下文所論述之序列一致性之任何熟知算法，諸如FASTA、BLAST或Gap所量測。與參考核酸分子具有實質上一致性之核酸分子在某些情況下可編碼具有與由參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質上相似的胺基酸序列的多肽。
當指代多肽時，術語「實質上類似性」及「實質上類似」意謂當最佳比對時，諸如藉由使用默認空位權重之程式GAP或BESTFIT，兩個多肽序列共有至少約95%序列一致性、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一個實施例中，不一致之殘基位置相差保守性胺基酸取代。本發明亦包括抗CB1抗體，其包含具有一或多個保守性取代之本文所揭示之VH、VL及/或CDR胺基酸序列中之任一者的變體。舉例而言，相對於本文所揭示之VH、VL及/或CDR胺基酸序列中之任一者，本發明包括具有含例如10個或少於10個，8個或少於8個，6個或少於6個，4個或少於4個等保守性胺基酸取代之VH、VL及/或CDR胺基酸序列的抗CB1抗體。「保守性胺基酸取代」為一種胺基酸取代，其中胺基酸殘基經側鏈(R基團)具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之另一胺基酸殘基取代。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能特性。在其中兩個或多於兩個胺基酸序列彼此間差異為保守性取代的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。進行此調節的方式為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331，其以引用之方式併入本文中。含有具有類似化學特性之側鏈的胺基酸之群之實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸，及(7)含硫側鏈為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。替代地，保守性置換為在以引用之方式併入本文中之Gonnet等人(1992) Science 256: 1443-1445中所揭示之PAM250對數似然性矩陣中具有正值之任何變化。「適度保守」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值的任何改變。
典型地使用序列分析軟體來量測多肽之序列相似性，其亦稱為序列一致性。蛋白質分析軟體使用分配於各種取代、缺失及其他修飾，包括保守性胺基酸取代的相似性量度來匹配相似序列。舉例而言，GCG軟體含有諸如Gap及Bestfit之程式，其可在預設參數下使用以測定密切相關之多肽，諸如來自生物體之不同物種的同源多肽之間，或野生型蛋白與其突變蛋白之間的序列同源性或序列一致性。參見例如GCG版本6.1。亦可使用FASTA使用預設或推薦參數，GCG版本6.1之程式來比較多肽序列。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與檢索序列之間的最佳重疊區域之比對及序列一致性百分比(上文Pearson (2000))。當比較本發明序列與含有來自不同生物體之大量序列之資料庫時，另一較佳算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，尤其為BLASTP或TBLASTN。參見例如Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410及Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402，各自以引用之方式併入本文中。
抗體之生物學特徵 本發明包括以高親和力結合CB1之抗CB1抗體及其抗原結合片段。
提供本發明之抗CB1抗體及其抗原結合片段，其具有選自由以下組成之群的CB1締合速率常數(Kon )：至少約102 M-1 s-1 ；至少約103 M-1 s-1 ；至少約104 M-1 s-1 ；至少約105 M-1 s-1 ；及至少約106 M-1 s-1 ，如藉由表面電漿子共振所量測。
提供本發明之抗CB1抗體及其抗原結合片段，其對該標靶具有選自由以下組成之群的解離速率常數(Koff )：至多約10-3 s-1 ；至多約10-4 s-1 ；至多約10-5 s-1 ；及至多約10-6 s-1 ，如藉由表面電漿子共振所量測。
提供本發明之抗CB1抗體及其抗原結合片段，其對該標靶具有選自由以下組成之群的解離常數(KD)：至多約10-7 M；至多約10-8 M；至多約10-9 M；至多約10-10 M；至多約10-11 M；至多約10-13 M；及至多10-14 M。抗CB1抗體及其片段可對CB1具有約0.01 nM至約500 nM、約0.02 nM至約250 nM、約0.02至約200 nM、約0.05至約100 nM、約0.05至約50 nM範圍內之結合親和力Kd值。抗體及其片段可對CB1具有約500 nM或小於500 nM、約250 nM或小於250 nM、約200 nM或小於200 nM、約150 nM或小於150 nM、約100 nM或小於100 nM、約75 nM或小於75 nM、約50 nM或小於50 nM、約25 nM或小於25 nM、約10 nM或小於10 nM、約5 nM或小於5 nM、約1 nM或小於1 nM、約500 pM或小於500 pM、約250 pM或小於250 pM、約100 pM或小於100 pM、約50 pM或小於50 pM或約10 pM或小於10 pM之結合親和力Kd值。在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段以小於約15 pM、小於約10 pM、小於約8 pM、小於約6 pM、小於約4 pM、小於約2 pM或小於約1 pM之Kd結合CB1。
在一些實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段至少與諸如以下之小分子CB1受體調節劑同樣有效：利莫那班、泰倫那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奧替那班、溴乙那班、四氫次大麻酚及維洛胺及AM6545。在一些實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段具有比諸如以下之小分子CB1受體調節劑大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍之CB1拮抗劑或反向促效劑活性：利莫那班、泰倫那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奧替那班、溴乙那班、四氫次大麻酚及維洛胺及AM6545。在一些實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段抑制CB1促效劑介導之信號轉導。在一些實施例中，藉由測定細胞內cAMP水準及/或下游ERK磷酸化來量測CB1促效劑介導之信號轉導抑制。
在一些實施例中，抗CB1抗體及其抗原結合片段具有減少或不存在的BBB滲透或腦曝露之優勢。在一些實施例中，抗CB1抗體及其抗原結合片段之BBB穿透展現相對於小分子CB1促效劑、拮抗劑或反向促效劑(例如利莫那班、泰倫那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奧替那班、溴乙那班、四氫次大麻酚及維洛胺及AM6545)減少的腦滲透。在一些實施例中，本文所提供之抗CB1抗體及其抗原結合片段提供治療效益與相對於小分子CB1受體促效劑、拮抗劑或反向促效劑降低的CNS副作用。與小分子CB1受體拮抗劑利莫那班相關之CNS副作用例如包括焦慮、抑鬱、躁動、飲食障礙、易怒、攻擊及失眠(Moreira (2009) Rev. Bras. Psiquiatr. 31(2): 145-153)。
抗原決定基定位及相關技術 本發明包括與人類CB1之細胞外域內(例如在胺基酸1-116及/或細胞外環e1 (胺基酸176-187；SEQ ID NO:6)、e2 (胺基酸256-273；SEQ ID NO:10)及/或e3 (胺基酸366-377；SEQ ID NO:14)內)發現之一或多個胺基酸相互作用之抗CB1抗體。抗體結合之抗原決定基可包含具有3個或多於3個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個)位於CB1之細胞外域內之胺基酸的單一連續序列。替代地，抗原決定基可由複數個位於CB1之細胞外域內之非連續胺基酸(或胺基酸序列)組成。另外，CB抗體結合之抗原決定基可包含歸因於構形改變非細胞外或歸因於結合曝露之CB1之一部分。CB1之序列及其各種域闡述於表1中。
一般熟習此項技術者已知之各種技術可用於判定抗體是否在多肽或蛋白質內「與一或多個胺基酸相互作用」。例示性技術包括例如常規交叉阻斷分析，諸如所描述之抗體、哈羅及泳道(Antibodies, Harlow and Lane) (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., N.Y.)、丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-463)及肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及化學修飾抗原之方法(Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496)。可用於鑑別多肽內與抗體相互作用之胺基酸的另一方法為藉由質譜偵測之氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法涉及氘標記相關蛋白質，繼而使抗體與氘標記之蛋白質結合。隨後，將蛋白質/抗體複合物轉移至水中以允許氫-氘交換在除了經抗體保護之殘基(其保持經氘標記)以外的所有殘基處發生。在抗體解離之後，對靶蛋白進行蛋白酶裂解及質譜分析，藉此展現對應於與抗體相互作用之特定胺基酸的氘標記殘基。參見例如Ehring (1999) Analytical Biochem. 267(2): 252-259；Engen及Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A。
本發明進一步包括結合至與本文所描述之特異性例示性抗體中之任一者相同的抗原決定基之抗CB1抗體(例如M1、M2、M3、M4、M5 (及其人類化變體)、M6、M7 (及其人類化變體)及M8)。同樣地，本發明亦包括與本文所描述之特異性例示性抗體中之任一者競爭結合至CB1之抗CB1抗體(例如M1、M2、M3、M4、M5 (及其人類化變體)、M6、M7 (及其人類化變體)及M8)。
藉由使用此項技術中已知之常規方法，可容易地判定抗體是否結合至與參考抗CB1抗體相同之抗原決定基或與相同抗原決定基競爭結合。舉例而言，為了判定測試抗體是否結合至與本發明之參考抗CB1抗體相同之抗原決定基，使參考抗體結合至CB1蛋白質(例如CB1細胞外域或細胞表面表現之CB1之可溶性部分)。隨後，評定測試抗體結合至CB1分子之能力。若測試抗體在與參考抗CB1抗體飽和結合之後能夠結合至CB1，則可推斷出測試抗體結合至與參考抗CB1抗體不同的抗原決定基。另一方面，若測試抗體不能夠在與參考抗CB1抗體飽和結合之後結合至CB1分子，則測試抗體可結合至與本發明之參考抗CB1抗體所結合之抗原決定基相同的抗原決定基。隨後可進行其他常規實驗(例如肽突變及結合分析)，以確認所觀測到之測試抗體之結合缺失實際上是否係由於與參考抗體結合至同一抗原決定基，或是否空間阻斷(或另一現象)負責所觀測到之結合缺乏。此類實驗可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞測量術或此項技術中可用之任何其他定量或定性抗體結合分析來進行。根據本發明之某些實施例，若例如1、5、10、20或100倍過量之一種抗體抑制另一抗體之結合至少50%，但較佳75%、90%或甚至99% (如在競爭性結合分析中所量測)，則兩種抗體結合至相同(或重疊)抗原決定基(參見例如Junghans等人(1990) Cancer Res. 50:1495-1502)。替代地，若降低或消除一種抗體之結合的抗原中之基本上所有胺基酸突變降低或消除另一抗體之結合，則將兩種抗體視為結合至相同抗原決定基。若僅一個子集的減少或消除一種抗體之結合的胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則認為兩種抗體具有「重疊的抗原決定基」。
在一些實施例中，本發明提供能夠與本文所揭示之抗體或其抗原結合片段競爭結合至CB1之抗CB1抗體或其抗原結合片段。此類抗體可使用常規競爭結合分析鑑別。舉例而言，為了判定抗體是否與參考抗CB1抗體競爭結合，在兩個定向中進行上文所描述之結合方法：在第一定向中，在飽和條件下使參考抗體結合至CB1蛋白質(例如CB1細胞外域或細胞表面表現之CB1之可溶性部分)，繼而評定測試抗體對CB1分子之結合。在第二定向中，在飽和條件下使測試抗體結合至CB1分子，繼而評定參考抗體對CB1分子之結合。在兩個定向中，若僅第一(飽和)抗體能夠結合至CB1分子，則推斷出測試抗體及參考抗體競爭結合至CB1。與參考抗體競爭結合之抗體可能未必結合至與參考抗體相同的抗原決定基，但可例如藉由結合重疊或相鄰抗原決定基來空間上阻斷參考抗體結合。可藉由ELISA、流式細胞測量術或表面電漿子共振(SPR)分析來量測競爭。另外，可使用Octet HTX系統(Pall ForteBio LLC, Fremont, CA 94538)進行交叉競爭及抗原決定基分組分析。
在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR1序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:20、32、44、56、68、80、92、104、116、128、140、152、164、176、188、200、212、224、236、248、260、272、284、296、308及320。在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR2序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:21、33、45、57、69、81、93、105、117、129、141、153、165、177、189、201、213、225、237、249、261、273、285、297、309及321。在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈CDR3序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:22、34、46、58、70、82、94、106、118、130、142、154、166、178、190、202、214、226、238、250、262、274、286、298、310及322。在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR1序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:26、38、50、62、74、86、98、110、122、134、146、158、170、182、194、206、218、230、242、254、266、278、290、302、314及326。在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR2序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:27、39、51、63、75、87、99、111、123、135、147、159、171、183、195、207、219、231、243、255、267、279、291、303、315及327。在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈CDR3序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:28、40、52、64、76、88、100、112、124、136、148、160、172、184、196、208、220、232、244、256、268、280、292、304、316及328。
可獨立地選擇本文所提供之抗CB1抗體之重鏈及輕鏈CDR且匹配形成包含來自本文所提供之抗體之任何重鏈CDR1、CDR2及CDR3；及任何輕鏈CDR1、CDR2及CDR3的抗體或其抗原結合片段。亦可獨立地選擇本文所提供之抗體之重鏈及輕鏈可變區且匹配形成包含來自本文所提供之抗體之任何重鏈及輕鏈的抗體或抗原結合片段。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含可變重(VH)鏈序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含可變輕(VL)鏈序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:17、29、41、53、65、77、89、101、113、125、137、149、161、173、185、197、209、221、233、245、257、269、281、283、305及317。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含輕鏈序列，其與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性：SEQ ID NO:23、35、47、59、71、83、95、107、119、131、143、155、167、179、191、203、215、227、239、251、263、275、287、299、311及323。
在某些實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段、CDR、VH、VL、重鏈及/或輕鏈包含至少約20%、至少約15%、至少約10%、至少約5%、至少約4%、至少約3%、至少約2%或至少約1%保守性變體胺基酸。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之VH CDR組：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；及(320、321、322)。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之VL CDR組：SEQ ID NO:(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)及(326、327、328)。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之VH/VL組：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312及318/324。
在另一實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之重鏈及輕鏈組：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311及317/323。
在一些實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段結合CB1且展現降低的效應功能，諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、助噬作用及轉胞吞作用。在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段結合CB1且包含一或多個降低、削弱或消除一或多個效應功能之Fc區修飾。舉例而言，在一個實施例中，本文所揭示之抗CB1抗體及其抗原結合片段結合CB1，但展現降低、削弱或不存在的C1q結合及/或CDC及/或ADCC。Fc修飾可為胺基酸插入、缺失或取代，或可經化學修飾。舉例而言，可進行Fc區修飾以提高或降低補體結合，提高或降低ADCC或CDC，或修飾糖基化。各種Fc修飾為此項技術中已知的且已描述於例如Labrijin等人(2009) Nature Biotech. 27(8):767-771；Greenwood等人(1993) Eur. J. Immunol. 23:1098-1104；Mueller等人(1997) Mol. Immunol. 34:441-452；及Rother等人 (2007) Nature Biotechnol. 25: 1256-1264中。此項技術中已知之Fc修飾中之任一者可應用於本文所揭示之例示性CB1抗體以改變效應功能。在一個實施例中，抗CB1抗體或其抗原結合片段具有某些突變，例如L234A/L235A (「LALA」)、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S及N297Q。
本文所提供之結合蛋白可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者產生。舉例而言，自宿主細胞表現，其中編碼CB1結合蛋白之表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。儘管有可能在原核或真核宿主細胞中表現本文所提供之CB1結合蛋白，但與原核細胞相比哺乳動物宿主細胞更可能組裝且分泌恰當摺疊且免疫學上活性之結合蛋白。
在用於重組表現CB1結合蛋白之例示性系統中為編碼CB1抗體重鏈之重組表現載體，且藉由磷酸鈣介導之轉染將輕鏈引入至dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體內，CB1抗體重鏈及輕鏈序列各自可操作地連接於CMV強化子及啟動子調節元件以驅動高水準之基因轉錄。重組表現載體亦攜帶DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增來選擇已經載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型體宿主細胞以允許表現CB1抗體重鏈及輕鏈，且自培養基回收完整CB1抗體蛋白質。標準分子生物學技術用於製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養宿主細胞且自培養基回收CB1抗體蛋白質。
生物等效物 本發明之抗CB1抗體及抗體片段涵蓋具有不同於所描述之抗體但保留結合人類CB1之能力之彼等者的胺基酸序列之蛋白質。當相比於親本序列時，此類變體抗體及抗體片段包含一或多個胺基酸添加、缺失或取代，但所展現之生物活性基本上等效於所描述之抗體之生物活性。同樣地，本發明之編碼抗CB1抗體之DNA序列涵蓋如下序列：當相比於所揭示之序列時，其包含一或多個核苷酸添加、缺失或取代，但編碼基本上與本發明之抗CB1抗體或抗體片段生物等效的抗CB1抗體或抗體片段。此類變體胺基酸及DNA序列之實例描述於上文。
舉例而言，若兩個抗原結合蛋白或抗體為如下藥物等效物或藥物替代物：當在類似實驗條件下以單次劑量或多劑量方式以相同莫耳劑量投與時，該等藥物等效物或藥物替代物之吸收速率及吸收程度不顯示顯著差異，則將兩個抗原結合蛋白或抗體視為生物等效的。若該等抗體在吸收程度上而不在吸收速率上相當，則將一些抗體視為等效的或藥物替代物，且又可將其視為生物等效的，此係因為吸收速率中之此差異係故意的且反映在標記中，對於在例如慢性使用方面達到有效的主體藥物濃度不是必要的，且對於所研究之特定藥物而言被視為醫療上無關緊要的。
在一個實施例中，兩個抗原結合蛋白若其安全性、純度及效能方面不存在臨床上有意義的差異，則其為生物等效的。在一個實施例中，若患者能夠在參考產品與生物產品之間轉換一或多次，且相比於無此類轉換之持續療法，不存在副作用風險之預期增加，副作用包括免疫原性之臨床顯著變化或有效性減弱，則兩個抗原結合蛋白為生物等效的。在一個實施例中，若兩個抗原結合蛋白均藉由一或多種共同的作用機制在一或多種使用條件下起作用，達到此類機制所已知的程度，則其為生物等效的。
生體相等性可藉由活體內及活體外方法證明。生體相等性量測包括例如(a)人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中量測血液、血漿、血清或其他生物流體中隨時間而變的抗體或其代謝物之濃度；(b)已與人類活體內生物可用性資料相關且合理地預測人類活體內生物可用性資料之活體外測試；(c)人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中量測隨時間而變的抗體(或其靶標)之適當急性藥理學效應；及(d)建立抗體之安全性、功效或生物可用性或生物等效性之良好對照的臨床試驗。
抗CB1抗體之生物等效變體可藉由例如進行殘基或序列之各種取代或使生物活性所不需要的末端或內部殘基或序列缺失來構築。舉例而言，對於生物活性非必需之半胱胺酸殘基可缺失或經其他胺基酸置換以阻止在複性後形成不必要或不恰當的分子內二硫橋鍵。在其他情況下，生物等效抗體可包括包含胺基酸改變之抗CB1抗體變體，該等胺基酸改變修飾抗體之糖基化特徵，例如消除或移除糖基化之突變。
物種選擇性及物種交叉反應性 本發明亦包括結合至人類CB1及來自一或多種非人類物種之CB1的抗CB1抗體。舉例而言，本發明之抗CB1抗體可結合至人類CB1且可結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、母牛、馬、駱駝、食蟹獼猴、狨猴、恆河猴或黑猩猩CB1中之一或多者。根據本發明之某些實施例，抗CB1抗體結合至人類CB1而非來自其他物種之CB1。
免疫共軛物 本發明涵蓋與治療部分(「免疫共軛物」)共軛之抗CB1抗體，諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素。細胞毒性劑包括不利於細胞之任何試劑。用於形成免疫共軛物之適合的細胞毒性劑及化學治療劑之實例為此項技術中已知的且描述於本文中。
多特異性結合蛋白 本發明之抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性的。多特異性抗體可對一種靶多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對多於一種靶多肽具有特異性之抗原結合域。參見例如Tutt等人(1991) J. Immunol. 147:60-69；Kufer等人(2004) Trends Biotechnol. 22:238-244。本發明之抗CB1抗體可連接至其他功能性分子(例如其他肽或蛋白質)或與其他功能性分子共表現。舉例而言，抗體或其片段可功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體或抗體片段以產生具有第二結合特異性之雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白之一個臂對人類CB1或其片段具有特異性，且免疫球蛋白之另一臂對第二治療劑標靶具有特異性或與治療部分共軛。
結合蛋白在各種疾病中之用途 本發明之抗體及結合蛋白適用於治療、預防及/或改善與CB1表現或活性相關或藉由CB1表現或活性介導或可藉由阻斷CB1與CB1配位體(例如大麻)之間的相互作用或另外抑制CB1活性及/或信號傳導及/或促進受體內化及/或減少細胞表面受體治療的任何疾病或病症。術語「CB1活性為不利的病症」意謂罹患病症之個體中之CB1之存在或活性(例如異常或過度活性)造成病症或疾病之病理生理學或為促進病症或疾病惡化之因子的病症或疾病。因此，CB1活性不利的病症為預期CB1活性降低可緩解病症之症狀及/或進程的病症。
本文所提供之結合蛋白分子用作治療分子以治療各種疾病或病況，例如其中CB1蛋白質為不利的。舉例而言，本文所提供之結合分子包括藉由過度表現、上調或提高的CB1活性或信號傳導或可由其使得健康恆穩調節機制失效表徵之任何疾病或病況。此類疾病及病況包括肥胖症、綜合症狀肥胖症，包括普-威二氏症候群、阿爾斯特倫症候群、巴-比二氏症候群(Bardet-Biedel syndrome，BBS)、奧耳布賴特氏遺傳性骨失養症(AHO)及SIM1缺失症候群；糖尿病及相關併發症；血脂異常；肝臟疾病，諸如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病及原發性膽汁性肝硬化；纖維化，例如腎臟纖維化；慢性腎臟疾病；腎病；代謝疾病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、發炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多發性硬化症痙攣、青光眼及尼古丁成癮。
醫藥組合物 本發明提供包含抗CB1結合蛋白，例如抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物調配有適合的賦形劑、載劑、預防劑、治療劑及改良抗CB1結合蛋白之穩定性、遞送、耐受性及效果之其他藥劑。眾多適當調配物可發現於所有醫藥化學家已知的處方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa中。此等調配物包括例如散劑、糊劑、軟膏、凍膠、蠟、油、脂質、含有脂質(陽離子型或陰離子型)之微脂粒(諸如LIPOFECTINT™, Life Technologies, Carlsbad,CA)、DNA共軛物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液聚乙二醇(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含有聚乙二醇之半固體混合物。亦參見Powell等人(1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52: 238-311。
包含本文所提供之CB1結合蛋白之醫藥組合物用於(但不限於)診斷、偵測或監測病症，用於預防、治療、處理或改善病症或其一或多個症狀，及/或用於研究。
各種遞送系統為已知的且可用於投與本發明之醫藥組合物，例如囊封於脂質體中、微米粒子、微膠囊、能夠表現突變病毒之重組細胞、受體介導之內飲作用(參見例如Wu等人, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。組合物可藉由任何適宜途徑投與，例如藉由輸液或快速注射、藉由經由上皮或黏膜與皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收且可與其他生物學活性劑一起投與。可全身或局部投與。
投與本文所提供之預防劑或治療劑之方法包括(但不限於)非經腸投與(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外投與、腫瘤內投與、黏膜投與(例如鼻內及經口途徑)及經肺投與(例如用吸入器或噴霧器投與霧化化合物)。用於特定投與途徑之醫藥組合物之調配物及各種投與方法所必需之材料及技術為熟習此項技術者可用且已知的。
可調節劑量方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。舉例而言，可單次投與大丸劑，可隨時間分若干次投與多次劑量，或可如治療情況之緊急需要所指示而按比例減少或增加劑量。就投與之簡便性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。術語「單位劑型」係指適合作為待治療之哺乳動物個體之單位劑量之物理離散單位；各單位含有經計算結合所需醫藥載劑產生所需治療效果之預定量之活性化合物。本文所提供之單位劑型之規格係由以下決定且直接取決於：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療或預防作用，及(b)用於治療個體過敏性之此類活性化合物之混配技術中的固有限制。
本發明之醫藥組合物可用標準針頭及注射器皮下或靜脈內遞送。另外，關於皮下遞送，筆式遞送裝置易於在遞送本發明之醫藥組合物時應用。此類筆式遞送裝置可為可再用或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組合物之可更換套筒。在已投與套筒內之所有醫藥組合物且套筒為空的後，可容易地丟棄空套筒且用含有醫藥組合物之新套筒替換。隨後可再使用筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可替換套筒。確切而言，拋棄式筆式遞送裝置預填充有保存於裝置內之儲集器中的醫藥組合物。一旦清空儲集器之醫藥組合物，即丟棄整個裝置。
許多可再用筆式及自助注射器遞送裝置應用於本發明之醫藥組合物的皮下遞送。實例包括(但不限於) AUTOPENTM (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK)、DISETRONICTM 筆(Disetronic Medical Systems, Bergdorf, CH)、HUMALOG MIX 75/25TM 筆、HUMALOGTM 筆、HUMALIN 70/30TM 筆(Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN)、NOVOPENTM I、II及III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark)、BDTM 筆(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)、OPTIPENTM 、OPTIPEN PROTM 、OPTIPEN STARLETTM 及OPTICLIKTM (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)。應用於皮下遞送本發明之醫藥組合物之拋棄式筆式遞送裝置之實例包括(但不限於) SOLOSTARTM 筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM (Novo Nordisk)及KWIKPENTM (Eli Lilly)、SURECLICKTM 自動注射器(Amgen, Thousand Oaks, CA)、PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany)、EPIPEN (Dey, L. P.)及HUMIRATM 筆(AbbVie, Inc., Abbott Park, IL)。
在某些情況下，醫藥組合物可在控制釋放系統中遞送。在一個實施例中，可使用泵(Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-240)。在另一實施例中，可使用聚合材料(Medical Applications of Controlled Release, Langer及Wise (編), 1974, CRC Pres., Boca Raton, FL)。在另一實施例中，控制釋放系統可靠近組合物之標靶置放，因此僅需要全身性劑量之一部分(Goodson (1984)於Medical Applications of Controlled Release,上文, 2: 115-138中)。其他控制釋放系統由Langer (1990) Science 249: 1527-1533論述於綜述中。
可注射製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、滴液輸液等之劑型。此等可注射製劑可藉由公開已知之方法製備。舉例而言，可注射製劑可例如藉由將上文所描述之抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知地用於注射之無菌水性介質或油性介質中來製備。作為注射液之水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他輔助藥劑之等滲溶液等，其可與適當助溶劑組合使用，諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子界面活性劑(例如聚山梨醇酯80、HCO-50 (氫化蓖麻油之聚氧化乙烯(50 mol)加合物))等。採用例如芝麻油、大豆油等作為油性介質，其可與助溶劑(諸如苯甲酸苯甲酯、苄醇等)組合使用。較佳將由此製備之注射液填充於適當安瓿中。
有利地，將用於上文所描述之經口或非經腸用途之醫藥組合物製備成呈適合於配合活性成分之劑量的單位劑量之劑型。此類呈單位劑量之劑型包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。所含有的前述抗體之量通常為於單位劑量中每劑型約5 mg至約500 mg；尤其呈注射液形式，較佳地對於其他劑型而言所含有的前述抗體為約5 mg至約100 mg及約10 mg至約250 mg。
向患者投與之抗體之劑量可視該患者之年齡及尺寸、目標疾病、疾病階段、性別、醫學併發症之存在、其他藥物治療、病況、投與途徑及其類似者而變化。較佳劑量典型地根據體重或體表面積計算。當本發明抗體用於治療與成年患者中之CB1活性相關之病況或疾病時，通常以約0.01至約100 mg/kg體重之單次劑量靜脈內投與本發明之抗體可為有利的。視病況之嚴重程度而定，可調節治療之頻率及持續時間。投與抗CB1抗體之有效劑量及時程可憑經驗確定；舉例而言，可藉由週期性評定監測患者進展，且相應地調節劑量。另外，可使用此項技術中之熟知方法進行劑量之種間按比例調整(例如Mordenti等人(1991) Pharmaceut. Res. 8: 1351-1359)。應進一步理解，對任何特定個體而言，特定劑量方案可根據個體需要及投與組合物或監督組合物之投與的人員的專業判斷而隨時間調整，且本文所闡述之劑量範圍僅為例示性的，且不意欲限制所主張之組合物的範疇或實踐。
組合療法 本文所提供之結合蛋白亦可與一或多種適用於治療各種疾病之額外治療劑一起投與，額外藥劑由熟習此項技術者針對其預期目的進行選擇。舉例而言，額外藥劑可為此項技術中公認為適用於治療藉由本文所提供之CB1結合蛋白治療之疾病或病況的治療劑。組合亦可包括多於一種額外藥劑。
此類額外治療活性組分之非限制性實例包括其他CB1拮抗劑(例如第二抗CB1抗體或CB1之小分子抑制劑(例如利莫那班、泰倫那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奧替那班、溴乙那班、四氫次大麻酚及維洛胺及AM6545)、其他CB1家族成員之拮抗劑。
本發明亦包括包含本文所提及之抗CB1抗體及額外抑制劑中之任一者之治療組合，其中該抑制劑為適體、反義分子、核糖核酸酶、siRNA、肽體、奈米抗體或抗體片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他經工程改造之分子，諸如雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體及最小識別單位)。本發明之抗CB1抗體亦可與額外治療劑組合投與及/或共調配。額外治療活性組分可在即將投與本發明之抗CB1抗體之前、與投與本發明之抗CB1抗體同時或在投與本發明之抗CB1抗體之後不久投與；(出於本發明之目的，此類投與方案視為「與」額外治療活性組分「組合」投與抗CB1抗體)。本發明包括醫藥組合物，其中本發明之抗CB1抗體與如本文中其他地方所描述之額外治療活性組分中之一或多者共調配。
本發明亦包括包含「拮抗劑抗體」及「反向促效劑抗體」之組合的組合物及方法。「拮抗劑抗CB1抗體」意謂抑制、減少或預防配位體(例如大麻)對CB1之信號傳導活性之抗CB1抗體。本發明之拮抗劑抗體之非限制性實例為M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M7-H1、M7-H2、M7-H3、M7-H4、M7-H5、M7-H6、M7-H7、M7-H8、M7-H9、M7-H10、M7-H11、M7-H12、M7-H13、M7-H14、M7-H15、M7-H16、M5-H1、M5-H2。「反向促效劑抗CB1抗體」意謂造成誘導與促效劑相反之藥理學反應的抗CB1抗體。在促效劑將受體之活性提高至大於其基礎水準之情況下，而反向促效劑將活性降低至低於基礎水準。本發明之反向促效劑抗體之非限制性實例包括M7。本發明人已構想組合拮抗劑抗體及反向促效劑抗體以便協同或以其他方式改良療效。因此，本發明包括包含至少一種拮抗劑抗體及至少一種反向促效劑抗體之醫藥組合物。本發明亦包括治療方法，其包含向個體投與拮抗劑抗體與反向促效劑抗體之組合(以獨立投與或共同調配物形式)。
組合療法藥劑包括(但不限於)抗腫瘤劑、放射線療法、化學療法，諸如DNA烷基化劑、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、抗微管蛋白劑、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(taxol)、小紅莓(doxorubicin)、吉西他濱(gerncitabine)、健擇(gemzar)、蒽環黴素(anthracyclines)、阿德力黴素(adriamycin)、拓樸異構酶I抑制劑、拓樸異構酶II抑制劑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、伊立替康(irinotecan)、受體酪胺酸激酶抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxlb))激酶抑制劑及siRNA。
診斷 本發明在本文中提供診斷應用，包括(但不限於)診斷分析方法、含有一或多種CB1結合蛋白的診斷套組及調適用於自動及/或半自動系統之方法及套組。所提供之方法、套組及調適可用於偵測、監測及/或治療個體中之疾病或病症。
例如出於診斷目的，亦可使用本發明之抗CB1抗體來偵測及/或量測樣品中之CB1或CB1表現細胞。舉例而言，抗CB1抗體或其片段可用於診斷藉由CB1之異常表現(例如過度表現、低表現、缺乏表現等)表徵之病況或疾病。CB1之例示性診斷分析可包含例如使獲自患者之樣品與本發明之抗CB1抗體接觸，其中該抗CB1抗體經可偵測標記或報導子分子標記。替代地，未經標記之抗CB1抗體可與自身可偵測地標記之二級抗體組合用於診斷應用中。適合的可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光物質、化學發光物質及放射性物質。適合的酶之實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖、螢光素酶及乙醯膽鹼酯酶；適合的輔基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；適合的螢光物質之實例包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素。發光物質之一個實例為魯米諾(luminol)且適合的放射性物質之實例包括例如3H、14 C、32 P、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho及153 Sm。
本發明所提供之免疫分析可尤其包括夾心免疫分析、放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、競爭性抑制免疫分析、螢光偏振免疫分析(FPIA)、酶倍增免疫分析技術(EMIT)、生物發光共振能量轉移(BRET)、螢光活化細胞分選(FACS)及均勻化學發光分析。
可使用化學發光微粒免疫分析，其可使用ARCHITECT®自動化分析器(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)。
本發明提供採用質譜之方法且包括(但不限於)MALDI (基質輔助雷射解吸附/離子化)或SELDI (表面增強雷射解吸附/離子化)。
使用免疫分析及質譜採集、操作、處理及分析生物學測試樣品之方法為熟習此項技術者眾所周知的。
套組 亦提供用於分析測試樣品之分析物或其在測試樣品中之片段之存在、量或濃度的套組。該套組包含至少一種用於分析測試樣品之分析物或其片段之組分及用於分析測試樣品之分析物或其片段之說明書。用於分析測試樣品之分析物或其片段之至少一種組分可包括包含如本文所揭示之結合蛋白之組合物及/或抗分析物結合蛋白(或片段、變體或其變體之片段)，其視情況固定化於固相上。
視情況，該套組可包含校準劑或對照物，其可包含經分離或純化之分析物。該套組可包含至少一種用於藉由免疫分析及/或質譜分析測試樣品之分析物的組分。包括分析物、結合蛋白及/或抗分析物結合蛋白或其片段之套組組分可視情況使用任何領域已知的可偵測標記標記。在實施本發明時提供之生產材料及方法將為熟習此項技術者已知的。
該套組(或其組分)以及藉由分析，諸如如本文所描述之免疫分析測定測試樣品中之分析物之存在、量或濃度之方法可經調適用於多種自動化及半自動化系統中(包括其中固相包含微粒之彼等者)，如例如美國專利第5,089,424號及第5,006,309號中所描述，且如例如阿博特實驗室(Abbott Laboratories) (Abbott Park, IL)商業上以ARCHITECT®出售。可購自阿博特實驗室中之其他平台包括(但不限於) AxSYM®、IMx® (參見例如美國專利第5,294,404號)、PRISM®、EIA (珠粒)及量子TM II以及其他平台。另外，可在其他型式中，例如在電化學或其他手持式或及時現場護理分析系統上採用分析、套組及套組組分。本發明例如適用於進行夾心免疫分析之市售阿博特及時現場護理(i-STAT®, Abbott Laboratories)電化學免疫分析系統。免疫感測器及其在一次性測試裝置中之製造及操作方法描述於例如美國專利第5,063,081號、第7,419,821號、第7,682,833號、第7,723,099號及第9,035,027號；及美國公開案第20040018577號及第20060160164號中。
熟習此項技術者將容易顯而易知，本文所描述之方法之其他適合修改及改編為明顯的且可在不偏離本文所揭示之實施例之範疇的情況下使用適合等效物進行。現已詳細描述某些實施例，將自以下實例更完整理解本發明之實施，本文中展示該等實例僅用於說明且不應視為以任何方式限制本發明。
實例 實例 1 ：針對功能性評估之抗 CB1 抗體之產生及選擇
在CB-1拮抗劑JD5037 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI；目錄號1205)存在或不存在下用人類CB-1抗原使CD2F1小鼠免疫以潛在地穩定化蛋白質以使得其在免疫期間在滿足要求的構形中呈現自身。在兩個齒爪中用約5 µg/30 µl/齒爪之抗原與效價最大金佐劑使小鼠免疫(St. Loui, MO; Sigma Aldrich；目錄號T2684)。隨後，小鼠一週兩次用CpG (InvivoGen, San Diego, CA；目錄號ODN1826)及鋁膠(Alhydrogel) (InvivoGen, San Diego, CA；目錄號vac-alu-250)免疫約30天。在第13天及第26天採集血清以測定抗體效價且其隨時間推移提高。在第30天處死小鼠且收集膕及腹股溝淋巴結以便融合且在培養基B (未添加養分之RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific-Gibco, San Diego, CA；目錄號11879020)與IMDM (Lonza, Anaheim, CA；目錄號12-722F)之1:1混合物)中洗滌，且製備單一細胞懸浮液。自培養物採集P3Ag8.563骨髓瘤細胞(ATCC, Manasas, VA；目錄號PTA-9393)且在培養基B中洗滌。以1:1之比率混合淋巴細胞及骨髓瘤細胞，且使用電融合BTX Harvard設備ECM 2001 (BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA；目錄號45-0012)融合。使融合細胞再懸浮於回收培養基C (Stem Cell Technologies, Seattle, WA；目錄號03803)中且在37℃下於T75 cm2 燒瓶中使其回收隔夜。第二天採集融合細胞且再懸浮於含有抗小鼠IgG FITC殖株偵測(Molecular Devices, San Jose, CA；目錄號K8220)之融合瘤選擇甲基纖維素培養基D (Stem Cell Technologies, Seattle, WA；目錄號03804)中。混合細胞且以每10 mL培養基D 1×106 個接種。在37℃下培育接種細胞7天。挑選融合瘤菌落且使用殖株Pix2 (Molecular Devices, San Jose, CA)，基於菌落之尺寸以及指示IgG產量之其呈現較強FITC鹵基之能力轉移至含有融合瘤生長培養基E (Stem Cell Technologies, Seattle, WA；目錄號03805)之96孔組織培養盤。當觀測到宏觀菌落時，使用CHO親本及CHO-huCB-1過度表現細胞篩選上清液之細胞結合。對此主要篩選，融合瘤親本CHO細胞用羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯(CFSE) (Invitrogen, Anaheim, CA；目錄號34554)標記且與非CFSE標記之CHO-huCB1過度表現細胞混合以允許兩種細胞株之有效及同時篩選且以鑑別huCB-1特異性結合物。選擇尤其結合CHO-huCB-1過度表現細胞且不結合親本CHO細胞之殖株且向前移動以便於驗證篩選。選擇總共97個殖株以向前移動以便小規模純化。相關融合及主要篩選之概述顯示於表2中。
表 2. 細胞融合及主要篩選
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實例 2 ：純化鼠抗 huCB-1 特異性結合殖株 在50 mL低Ig培養基(1:1 IMDM (Lonza, Anaheim, CA；目錄號12-722F): Ham's F12-K (Gibco, Anheim, CA；目錄號21127022)培養基，其具有5%低Ig血清(Invitrogen, Grand Island, NY；目錄號1625007)，含有5 mL 100 mM丙酮酸鈉溶液(Invitrogen, Grand Island, NY；目錄號11360070)、5 ml 100mM非必需胺基酸(Invitrogen, Grand Island, NY；目錄號11140050)及5 mL 100 mM麩醯胺(Invitrogen, Grand Island, NY；目錄號35050061))中於T75 cm2 燒瓶中進一步擴增基於驗證主要篩選選擇之融合瘤殖株持續3-4週。使用標準蛋白質A純化方法採集及純化上清液。
實例 3 ： cAMP 分析中小鼠抗 CB1 抗體之功能性特徵 在cAMP分析中針對其拮抗劑活性評估經分離之小鼠抗huCB-1抗體。使用過度表現天然Gi偶合野生型G蛋白偶聯受體(GPCR)且被設計成偵測對受體之促效劑刺激做出反應的細胞內cAMP水準提高之cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞株(DiscoverX/Eurofins, Fremont, CA；目錄號95-0071C2)來進行cAMP分析。cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞用CB1抗體、同型對照或小分子CB1拮抗劑JD5037處理，繼而在毛喉素存在下用30 nM CP-55,940 (表示為「Plus CP」)進行促效劑刺激。亦在不添加CP-55,940之情況下測試拮抗劑以確定其是否自身具有促效活性。毛喉素活化酶腺苷酸環化酶且提高cAMP之細胞內水準。對於Gi受體，促效劑結合抑制毛喉素誘發之細胞內cAMP積聚。因此，為了量測Gi偶合受體，在毛喉素存在下添加促效劑化合物CP-55,940。Gi偶合受體之活化因此抑制毛喉素誘發之cAMP產生，且因此，在促效劑加毛喉素存在下產生之劑量反應曲線將具有負斜率。簡言之，以1.5×104 個細胞/孔在96孔板(Costar, Fisher Scientific, San Diego, CA；目錄號3909)中將細胞接種於細胞接種2培養基(DiscoverX/Eurofins; Fremont, CA；目錄號93-0563R2A)中，且在37℃，5% CO2 下培育隔夜。第二天，培養基替換為30 µl細胞分析緩衝液(CAB；1×HBSS/10 nM HEPES (ThermoFisher, Anaheim, CA；目錄號分別為14025134及15630080)且用測試抗體或同型對照(7.5 µl 6×濃縮加工稀釋液)處理。在37℃，5% CO2 下培育培養盤30分鐘。將7.5 µl促效劑刺激物(0.18 µM CP 55,940於含有90 µM毛喉素之CAB中)添加至各孔中，且在37℃，5% CO2 下再培育培養盤30分鐘。遵循製造商說明書，使用HitHunter® cAMP生物學分析偵測套組(DiscoverX/Eurofins; Fremont, CA；目錄號90-0075LM25)處理培養盤以便cAMP讀取。經分離之殖株之初始評定以30 µg/mL之單一濃度進行。 在所測試之112個殖株中，僅八個殖株展現拮抗活性。在促效劑不存在下兩個殖株展示一定程度之拮抗作用，M3及更低程度M1。藉由滴定Ab之濃度進一步評估八個抗體M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7及M8以獲得劑量反應曲線及實際EC50值(表3及圖1)。
實例 4 ： pERK 分析中小鼠抗 CB1 抗體之功能性特徵 在使用cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞株(DiscoverX/Eurofins, Fremont, CA；目錄號95-0071C2)進行之pERK磷酸化分析中進一步評估在cAMP分析中為功能性拮抗劑之八個抗體。簡言之，以2×104 個細胞/孔在來自套組-107 (DiscoverX/Eurofins, Fremont, CA；目錄號92-3107G)加800 µg/mL G418之分析完全細胞培養基中將細胞接種於96孔板中，且在37℃，5% CO2 下培育。第二天，培養基替換為100 µl/孔之無血清F-12K不足培養基(Invitrogen, Grand Island, NY；目錄號11765054)。在37℃，5% CO2 下培育培養盤另一天。在處理當天，F-12K培養基替換為30 µl/孔之新鮮F-12K培養基。隨後將測試抗體或同型對照(7.5 µl 6×濃縮加工稀釋液)添加至孔中，且在37℃，5% CO2 下培育培養盤10分鐘。將7.5 µl促效劑(包含0.18 µM CP 55,940之6倍工作溶液於具有90 µM毛喉素之CAB中)添加至各孔中，且在37℃，5% CO2 下再培育培養盤10分鐘。遵循製造商說明書，使用中規模發現(MSD)套組(Meso Scale Discovery, Rockville, Maryland；目錄號K15107D)處理培養盤以便p-ERK/全部ERK (表3及圖2)。
表 3 . 小鼠抗 huCB-1 抗體細胞分析資料之概述
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實例 5 ： 小鼠抗 CB-1 抗體對 CB-1 CHO 過度表現細胞之 EC50 結合 對於小鼠抗CB1抗體結合親本CHO細胞、人類CB-1過度表現CHO細胞及小鼠CB-1過度表現CHO細胞之能力，在基於螢光活化細胞分選(FACS)之分析中測試抗體結合以獲得結合曲線及EC50值。以v形底96孔聚碳酸酯FACS培養盤(Corning, Corning, NY,目錄號3357)之每孔1×105 個細胞在50 µl FACS緩衝劑(1× PBS/ 2 mM EDTA及1% FBS (ThermoFisher Scientific, Anaheim, CA；目錄號10438-026)中採集、洗滌及分配三個細胞株。以2×濃度在200 nM下開始製備之抗體之連續稀釋且連續稀釋3倍。將滴定抗體添加至含有三個不同細胞株(親本、人類及小鼠CB-1CHO細胞)之培養盤中且在4℃下培育1小時。用FACS緩衝劑洗滌培養盤3次。使細胞再懸浮於50 µl山羊抗小鼠IgG-HRP (Jackson Immuno Research, West Grove, PA；目錄號115-035-003)之1/5,000稀釋液中，在4℃下培育30分鐘，用FACS緩衝劑洗滌3次，且在BD FACS Canto (BD Biosciences, San Jose, CA；目錄號338962)上收集資料，且使用FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR)分析(表4)。所測試之八個功能性抗體中無一者為小鼠跨越反應性(圖3)。
表 4 . 用於 CB1 過度表現細胞之細胞結合親和力小鼠殖株
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實例 6 ： 功能性抗 CB-1 抗體之 EC50 分析及構形結合評估 此實驗之目的為判定在中性、拮抗劑或促效劑狀態確認下抗CB1拮抗劑抗體是否對CB1具有差異性結合能力。使用四個不同細胞株製劑：CHO-huCB1 (內部產生)；與反向促效劑JD5037 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI；目錄號1392116-14-1)一起預培育之CHO-huCB1；與促效劑CP-55,940 (TOCRIS, Minneapolis, MN；目錄號0949)一起預培育之CHO-huCB1及親本CHO-S細胞(ThermoFisher Scientific, VA；目錄號R80007)。將2 × 107 個親本CHO-S及CHO-hu CB1細胞擱置於FACS緩衝劑中。另外，在4℃下培育塗佈有反向促效劑JD5037或促效劑CP-55,940之2×107 個CHO-huCB1細胞1小時。培育後，在FACS緩衝劑中洗滌此兩種經塗佈之細胞株2次，且在分別含有反向促效劑或促效劑分子之FACS緩衝劑中以2×107 再懸浮。在v形底FACS培養盤(Corning, Corning, NY；目錄號3357)中接種所有四個細胞株，且將預滴定之抗CB1測試抗體添加至細胞中，且藉由BD FACS Canto (BD Biosciences, San Jose, CA；目錄號338962)評估結合。如圖4中所示，抗體未結合至CHO親本細胞(藍色曲線)，超過八個功能性Ab (M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7及M8)在促效劑或拮抗劑存在下未呈現優先結合，如在所有條件下觀測到之結合所展現(紅色、紫色及綠色曲線)。分別在拮抗劑存在下及在促效劑不存在下，僅2種在cAMP或pERK分析中為另外非功能性之測試抗體展現優先結合。此表明功能性抗CB1抗體可與在已知受體促效劑或拮抗劑存在下實現之結合構形無關。
實例 7 ：小鼠抗 CB1 抗體之序列鑑別及分析 八個鼠抗huCB-1抗體之融合瘤採集為細胞集結粒，且使用標準小鼠亞型分析ELISA套組(Pierce/ThermoFisher Scientific, San Diego, CA；目錄號37503)，上清液用於測定融合瘤中之每一者之同型。抗體中之四者(M1、M3、M4及M6)為IgG2a,K，且抗體中之四者(M2、M5、M7及M8)為IgG2b,K。處理集結粒用於RNA及cDNA，且SMARTER RACE擴增套組(Clontech, Mountain View, CA；目錄號634859)用於處理cDNA用於測序。抗體中之每一者之同型用於設計重鏈恆定區及輕鏈κ恆定區之反向引子及SeqAmp聚合酶(CloneTech, Mountain View, CA；目錄號638504)作為正向引子。包括MOPC21 PNA引子(基於序列合成)以預防通常在測序處理期間出現且可能干擾實際輕鏈可變區序列之鑑別之異常輕鏈擴增。鑑別總共8個特有序列及7個特有家族。八個殖株之序列提供於表5中。融合瘤抗體之重鏈及輕鏈之共同序列分別提供於圖5A及5B中。
表 5 . 小鼠人類 Fc 嵌合 CB1 抗體之胺基酸序列
Figure 108115125-A0304-0005
實例 8 ：針對人類化選擇小鼠抗 CB1 抗體 基於功能資料，使用衍生自PHEnon™軟件包(Xoma, Berkley, CA) (美國專利第5,766,886號)之預測人類工程改造工具，針對人類化選擇小鼠抗huCB-1殖株M7及M5。在查詢時提供各殖株之VH及VL序列，且基於來自Kabat資料庫之最接近人類生殖系匹配產生輸出序列。產生構架區中之突變清單以朝向人類構架匹配演變VH及VL序列。經由一系列準則(美國專利第5,766,886號)評定個別殘基之突變風險。累積地，將突變分組以構成「低風險」及「中風險」殖株池。經由同源性建模電子雜交驗證輸出序列及引入突變。將最終人類化VH及VL抗體序列選殖至CHO細胞中表現之人類IgG1載體主鏈(TCAL DGV載體)中且藉由蛋白質-A親和性層析根據標準方法純化。人類化殖株之序列提供於表6中。人類化M7及M5抗體之重鏈及輕鏈之共同序列分別提供於圖6A及6B中。
表 6. 人類化 CB1 抗體之胺基酸序列
實例 9 ： 細胞結合及功能性分析中之人類化抗 CB1 抗體之再評估 再評估人類化抗CB1變體結合CHO-huCB-1細胞之能力且與小鼠親本殖株M5及M7 (圖7A及圖7B)進行比較以確保結合保留。所使用之分析條件與描述於實例5中之彼等者類似。在結合分析之後，根據實例3及4 (圖8A、8B、9A及9B)，亦針對作為cAMP及pERK分析中之拮抗劑之功能評估測試變體以確保在人類化之後保持結合及活性。所有殖株保留其結合及拮抗劑活性。圖10展示藉由人類化抗CB1 Ab M7-H5及IgG2b型式展現之反向促效作用。
等效物 在不偏離本發明精神或基本特徵之情況下，本發明可以其他特定形式體現。前述實施例因此在所有態樣中均欲視為說明性而非限制本發明。本發明之範疇因此由所附申請專利範圍而非由前述描述來指示，且具有申請專利範圍等效性之含義及範圍內的所有變化因此均意欲包括於本文中。
將在閱讀時自實施例之以下描述以及附圖更完整理解本發明之前述及其他特性及優勢以及本發明自身，其中： 圖1展示cAMP分析之結果。cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞用CB1抗體、同型對照或小分子CB1拮抗劑JD5037處理，繼而在毛喉素(forskolin)存在下用30 nM CP-55,940 (表示為「Plus CP」)進行促效劑刺激。亦在不添加CP-55,940之情況下測試拮抗劑以確定其是否自身具有促效活性。略語表：CAB=細胞分析緩衝液，指示分析背景；CAB/F=CAB加15 µM毛喉素，表示分析中cAMP之最大量；CAB/F/CP=CAB/F加30 nM CP-55,940，對應於CP-55,940之~EC80。 圖2展示p-ERK分析結果。使用cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞進行磷酸/全部ERK分析。細胞用小鼠抗CB1抗體或小分子CB1拮抗劑JD5037處理，繼而在毛喉素存在下用30 nM CP-55,940進行促效劑刺激。在處理結束時，使用中尺度Discovery(MSD)套組針對p-ERK/全部ERK處理培養盤。結果表示為最大反應百分比(最大%)。 圖3A展示小鼠抗huCB1抗體結合至huCB1-CHO細胞。經純化鼠抗CB1抗體之結合曲線在200 nM抗體濃度下起始滴定3倍。所有抗體展示對huCB1-CHO細胞之特異性結合。 圖3B展示小鼠抗huCB1抗體結合至moCB1-CHO細胞。所有抗體展示未結合至moCB1-CHO細胞。 圖4展示分別在促效劑及拮抗劑CB1小分子CP5990及JD5037存在及不存在下經純化之抗CB1抗體之結合之評估。 圖5A展示衍生自融合瘤抗體M1-M8之重鏈可變區胺基酸序列之比對的共同序列。 圖5B展示衍生自融合瘤抗體M1-M8之輕鏈可變區胺基酸序列之比對的共同序列。 圖6A展示衍生自人類化抗體M7-H1至M7-H16、M5-H1及M5-H2之重鏈可變區胺基酸序列之比對的共同序列。 圖6B展示衍生自人類化抗體M7-H1至M7-H16、M5-H1及M5-H2之輕鏈可變區胺基酸序列之比對的共同序列。 圖7A呈現在30 µg/mL之單一抗體濃度下在殖株M5及M7之人類化CB-1抗體變體之CHO-huCB-1及CHO親本細胞上之細胞結合。 圖7B呈現在30 µg/mL之單一抗體濃度下在殖株M7之人類化CB-1抗體變體之CHO-huCB-1及CHO親本細胞上之細胞結合。 圖8A展示如實例3中所描述之cAMP分析之結果。圖8A展示M5抗體之不同主結構之間的並排比較。 圖8B展示如實例3中所描述之cAMP分析之結果。圖8B展示M7抗體之不同主結構之間的並排比較。 圖9A展示如實例4中所描述之p-ERK分析之結果。圖9A展示M5抗體之不同主結構之間的並排比較。 圖9B展示如實例4中所描述之p-ERK分析之結果。圖9B展示M7抗體之不同主結構之間的並排比較。 圖10展示使用與實例3中描述之彼等者類似的方法進行反向促效作用之cAMP分析之結果。cAMP Hunter™ CHO-K1 CNR1 Gi細胞用CB1抗體或同型對照處理，繼而添加毛喉素。紫色虛線表示在用毛喉素處理後cAMP釋放水準，分析中cAMP之最大量。紅線對應於用作分析對照之CB1小分子促效劑CP-55,940。具有反向促效作用活性之化合物具有在與促效劑相反方向上且位於CAB/F線之上的曲線。此實驗展現兩種測試M7變體均具有反向促效作用活性。
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Claims (63)

  1. 一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該結合蛋白包含六個互補決定區(CDR)：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中 CDR-H1具有胺基酸序列G-Y-T-F-T-D-Y-W (SEQ ID NO:329之殘基26-33)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之G取代為S；位置3處之T取代為E；位置5處之T取代為S或N；位置6處之D取代為R或Y；位置7處之Y取代為H；且位置8處之W取代為A或N； CDR-H2具有胺基酸序列I-Y-P-Y-D-G-D-T (SEQ ID NO:329之殘基51-58)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之I取代為F；位置2處之Y取代為D、S或T；位置3處之P取代為T；位置4處之Y取代為G、D或S；位置5處之D取代為Y或S；位置6處之G取代為S；位置7處之D取代為E、G或R；且位置8處之T取代為A、S或I； CDR-H3具有胺基酸序列A-R-G-X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 -W-X10 -X11 -Y (SEQ ID NO:329之殘基98-113)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之A取代為S；位置3處之G取代為S；位置4處之X1 為Q、Y、K、R或G或不存在；位置5處之X2 為E、Y、L或G或不存在；位置6處之X3 為Y或P或不存在；位置7處之X4 為Y、R或E或不存在；位置8處之X5 為G或不存在；位置9處之X6 為T或不存在；位置10處之X7 為N或D或不存在；位置11處之X8 為Y、N、A或G或不存在；位置12處之X9 為N、Y、S、A或R或不存在；位置13處之W取代為Y、A或P；位置14處之X10 為L、M、F或G或不存在；位置15處之X11 為P、D、A或T或不存在；位置16處之Y取代為V； CDR-L1具有胺基酸序列Q-X1 -I-S-S-X2 -Y (SEQ ID NO:330之殘基27-33)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之Q取代為S或E；位置2處之X1 為E、S、T、N、G或R；位置3處之I取代為V；位置4處之S取代為A、R或G；位置5處之S取代為G、N或T；位置6處之X2 為S、N、肽F-R-Y-S或不存在；且位置7處之Y取代為F、D或N； CDR-L2具有胺基酸序列：X1 -T-S (SEQ ID NO:330之殘基51-53)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之X1 為A、Y、G、R、D或S；位置2處之T取代為A；位置3處之S取代為R；且 CDR-L3具有胺基酸序列：Q-Q-Y-X1 -S-X2 -P-Y-T (SEQ ID NO:330之殘基91-99)或藉由至少一個胺基酸殘基取代之該胺基酸序列之修飾，其中位置1處之Q取代為L或H；位置2處之Q取代為H；位置3處之Y取代為S或G；位置4處之X1 為S、W、H、Y、N或I；位置5處之S取代為E、R、G、T或N；位置6處之X2 為Y、I、S、T、L或W；且位置8處之Y取代為P、L、F或不存在；且其中至少一個胺基酸殘基之該取代、添加或缺失不抑制該抗體或其抗原結合片段結合人類CB1之能力。
  2. 一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列之CDR及可變輕鏈(VL)域序列之CDR，其中該VH域序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或其中該VL域選自由以下組成之群：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
  3. 一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列及可變輕鏈(VL)域序列，其中該VH域序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或其中該VL域選自由以下組成之群：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
  4. 如請求項3之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的VH/VL對之重鏈及輕鏈CDR：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312及318/324。
  5. 如請求項4之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的VH/VL對：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312及318/324。
  6. 如請求項3之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的HCDR組(HCDR1、HCDR2、HCDR3)：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；及(320、321、322)；及選自由以下組成之群的LCDR組(LCDR1、LCDR2、LCDR3)：(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)；及(326、327、328)。
  7. 如請求項6之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的(HCDR組/LCDR組)對：SEQ ID NO:(20、21、22/26、27、28)；(32、33、34/38、39、40)；(44、45、46/50、51、52)；(56、57、58/62、63、64)；(68、69、70/74、75、76)；(80、81、82/86、87、88)；(92、93、94/98、99、100)；(104、105、106/110、111、112)；(116、117、118/122、123、124)；(128、129、130/134、135、136)；(140、141、142/146、147、148)；(152、153、154/158、159、160)；(164、165、166/170、171、172)；(176、177、178/182、183、184)；(188、189、190/194、195、196)；(200、201、202/206、207、208)；(212、213、214/218、219、220)；(224、225、226/230、231、232)；(236、237、238/242、243、244)；(248、249、250/254、255、256)；(260、261、262/266、267、268)；(272、273、274/278、279、280)；(284、285、286/290、291、292)；(296、297、298/302、303、304)；(308、309、310/314、315、316)；及(320、321、322/326、327、328)。
  8. 如請求項7之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的HC/LC對：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311及317/323。
  9. 一種結合人類大麻第一型受體(CB1) (SEQ ID NO:1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含可變重鏈(VH)域序列之CDR及可變輕鏈(VL)域序列之CDR，其中VH域序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少95%一致性：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306及318，及/或VL域序列與選自由以下組成之群的胺基酸序列具有至少95%一致性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312及324。
  10. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:114中且該VL闡述於SEQ ID NO:120中。
  11. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:126中且該VL闡述於SEQ ID NO:132中。
  12. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:138中且該VL闡述於SEQ ID NO:144中。
  13. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:150中且該VL闡述於SEQ ID NO:156中。
  14. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:162中且該VL闡述於SEQ ID NO:168中。
  15. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:174中且該VL闡述於SEQ ID NO:180中。
  16. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:186中且該VL闡述於SEQ ID NO:192中。
  17. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:198中且該VL闡述於SEQ ID NO:204中。
  18. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:210中且該VL闡述於SEQ ID NO:216中。
  19. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:222中且該VL闡述於SEQ ID NO:228中。
  20. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:234中且該VL闡述於SEQ ID NO:240中。
  21. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:246中且該VL闡述於SEQ ID NO:252中。
  22. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:258中且該VL闡述於SEQ ID NO:264中。
  23. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:270中且該VL闡述於SEQ ID NO:276中。
  24. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:282中且該VL闡述於SEQ ID NO:288中。
  25. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:294中且該VL闡述於SEQ ID NO:300中。
  26. 如請求項9之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:306中且該VL闡述於SEQ ID NO:312中。
  27. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該VH闡述於SEQ ID NO:318中且該VL闡述於SEQ ID NO:324中。
  28. 如請求項1至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人類或人類化抗體。
  29. 如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab)2 片段或scFv片段。
  30. 如請求項1至29中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群的人類Fc區：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM Fc。
  31. 如請求項1至29中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經修飾之人類Fc區。
  32. 如請求項31之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含經修飾之人類Fc區，其包含選自由以下組成之群的突變：L234A/L235A、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S及N297Q。
  33. 一種多特異性結合蛋白，其包含如請求項1至32中任一項之抗原結合片段。
  34. 如請求項1至33中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段抑制CB1信號傳導活性。
  35. 如請求項1至33中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段增強或活化CB1信號傳導活性。
  36. 如請求項1至33中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為CB1信號傳導活性之反向促效劑。
  37. 如請求項1至36中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人類化抗體。
  38. 如請求項1至36中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為完全人類抗體。
  39. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至38中任一項之經分離之抗人類CB1抗體或其抗原結合片段競爭結合至CB1。
  40. 如請求項39之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中競爭結合之該抗體或其抗原結合片段為人類或人類化抗體。
  41. 一種抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至與如請求項1至38中任一項之抗體或抗原結合片段實質上相同的CB1抗原決定基。
  42. 如請求項41之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中特異性結合至與CB1抗原決定基實質上相同的抗體或其抗原結合片段為人類或人類化抗體。
  43. 一種結合至大麻第一型受體(CB1)之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對CB1具有約1 µM或小於1 µM之結合親和力Kd。
  44. 如請求項43之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對CB1具有約100 nM或小於100 nM之結合親和力Kd。
  45. 如請求項1至44中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現相比於利莫那班(rimonabant)降低的腦滲透。
  46. 如請求項1至44中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段抑制相比於利莫那班高至少2倍的CB1信號傳導。
  47. 如請求項1至44中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現相對於利莫那班降低的CNS副作用。
  48. 一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  49. 一種表現載體，其包含如請求項48之核酸分子。
  50. 一種宿主細胞，其包含如請求項49之表現載體。
  51. 一種調節CB1信號傳導之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  52. 一種拮抗CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  53. 一種促效CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  54. 一種反向促效CB1之方法，該方法包含使表現CB1之細胞與如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  55. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至47中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  56. 一種用於抑制有需要個體之CB1之生物活性之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項55之醫藥組合物，由此抑制該個體中之CB1蛋白質之活性。
  57. 一種用於治療與CB1活性相關之疾病之方法，該方法包含向罹患該疾病之個體投與如請求項55之醫藥組合物。
  58. 一種治療有需要個體之對CB1信號傳導調節有反應之疾病或病症之方法，該方法包含投與如請求項55之醫藥組合物。
  59. 一種治療有需要個體之對CB1信號傳導之拮抗作用或反向促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與如請求項55之醫藥組合物。
  60. 一種治療有需要個體之對CB1信號傳導之促效作用有反應之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與如請求項55之醫藥組合物。
  61. 一種用於診斷與CB1相關之疾病或病症之方法，該方法包含使細胞與如請求項1至47中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
  62. 如請求項61之方法，其中該疾病或病症選自由以下組成之群：肥胖症、綜合症狀肥胖症，包括普-威二氏症候群(Prader-Willi syndrome，PWS)、阿爾斯特倫(Alström)症候群、巴-比二氏症候群(Bardet-Biedel syndrome，BBS)、奧耳布賴特氏遺傳性骨失養症(Albright Hereditary Osteodystrophy，AHO)及SIM1缺失症候群；糖尿病及相關併發症；血脂異常；肝臟疾病，諸如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病及原發性膽汁性肝硬化；纖維化，例如腎臟纖維化；慢性腎臟疾病；糖尿病神經病變、病灶性區段性腎絲球硬化症、腎病；代謝疾病、骨質疏鬆、動脈粥樣硬化、發炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多發性硬化症痙攣、青光眼及尼古丁成癮。
  63. 一種包含如請求項1至47中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段的抗體共軛物，其中該抗體或其抗原結合片段與選自由以下組成之群的藥劑共軛：治療劑、細胞毒性劑、免疫黏附分子及顯影劑。
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