CN112218684A - 大麻素受体1型(cb1)结合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供分离的、工程改造的、非天然存在的CB1结合蛋白，包括抗CB1抗体或其抗原结合片段。所述CB1结合蛋白可用于治疗和诊断CB1介导的病况、疾病和病症。

Description

大麻素受体1型(CB1)结合蛋白及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年4月30日提交的美国临时申请第62/664,882号的优先权权益，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域本发明涉及大麻素受体1型(CB1)结合蛋白及其用途。

参考引用

可在本申请通篇中引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容出于任何目的以引用的方式整体明确地并入本文，就如同其中所引用的参考文献一样。除非另有指明，否则本发明将采用在本领域中众所周知的免疫学、分子生物学、细胞生物学、药物研发和药物递送的常规技术。

背景技术

大麻素受体1型(CB1)主要在大脑中以及外周地在肺脏、肝脏、肾脏和脂肪组织中表达的G蛋白质偶联受体总科中的7-跨膜细胞膜受体。CB1通过身体内部天然产生的大麻素(称作内源性类大麻酚(诸如，类花生酸))或引入身体内的大麻素(诸如，大麻属(cannabis))或相关合成化合物活化。大麻素可逆地且立体选择性地结合至CB1。在CB1接合之后，活化多个细胞内信号转导路径，导致腺苷酸环化酶的抑制和有丝分裂原活化的蛋白质(MAP)激酶的活化、突触前N和P/Q型钙通道和D型外向钾通道的抑制及内向整流和A型外向钾通道的活化。据信CB1表达以预防发展过度神经元活性、降低疼痛及其他发炎性症状以及调节食物摄入的方式调节神经传递素释放。

异常CB1活性已涉及多种疾病，包括肥胖症及相关病症，诸如血脂异常，糖尿病，纤维化，肝脏疾病，诸如肝脂肪变性，肾脏疾病，心血管疾病和癌症。

普拉德威利综合征(Prader Willi Syndrome，PWS)为某些父本基因损失造成的基因病症且通过肥胖症、2型糖尿病缓慢发展和肌无力表征。CB-1用反向激动剂利莫那班(Rimonabant)验证为PWS中的靶标(Motaghedi等人(2011)Eur.J.Med.Genet.54:14-18)。利莫那班(也称作SR141716、阿康普利亚(Acomplia)和紫木替(Zimulti))为Sanofi-Aventis研发且推出的作为口服中枢CB1拮抗剂的厌食减肥药物。该产品被指定用于结合饮食和运动来治疗具有相关风险因素如2型糖尿病或血脂异常的肥胖和超重患者。在2006年6月，EMEA批准所述药物用于肥胖症。在2008年，由于严重精神问题风险，包括自杀观念，Sanofi-Aventis针对所有适应症中断了所述药物的研发和营销。在2009年1月，EC撤回了所述药物的营销许可。

Merck研究另一反向激动剂特拉那班(taranabant)(MK-0364)，但由于高水平的副作用，包括抑郁症和焦虑症，停止了其3期临床试验。已经研究一些其他CB1反向激动剂(例如AM251、AM1387和AM4113)和拮抗剂(例如大麻萜酚、伊必那班(ibipinabant)、奥替那班(otenabant)、溴乙那班(surinabant)、四氢次大麻酚和维拉帕胺(virodhamine))，但其处于研究早期阶段或已经由于CNS副作用而被归入非人类研究。

正在研发多种CB-1反向激动剂/拮抗剂，其通过限制其跨越血脑屏障(BBB)的能力而主要靶向外周表达的CB1。例如，TM-38837为7TM Pharma A/S正在研发用于治疗肥胖症和代谢障碍的1期CB1反向激动剂/拮抗剂。尚未到临床阶段的其他外周选择性静默拮抗剂为AM6545。外周选择性CB-1拮抗作用可为靶向多个组织中的外周内源性类大麻酚作用的安全且更有效的方式：(1)肝脏-减少脂肪生成、脂肪储存和葡萄糖分泌；(2)肌肉-提高葡萄糖摄入和氧化；(3)脂肪细胞-减少脂肪生成和脂肪储存；减少脂联素合成；和(4)胃肠道(GI)-提高饱腹感、GI输送和吸收(Kloet和Woods(2009)Endocrinol.150:2531-2536)。

诸如抗体及相关结合蛋白的生物分子提供递送治疗剂且避免CNS受损和副作用的潜在安全且更有效的方式。一般而言，仅约0.1％的循环抗体跨越完整BBB(Poduslo等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5705-5709；Yu和Watts(2013)Neurotherapeut.10:459-472)。因此，功能性抗CB1生物本质上较低暴露于CNS提供排他性地外周接合CB-1的机会，由此限制CNS中由小分子的药理学驱动的不良事件。

针对CB1的抗体最近已经描述于本领域中，但其在临床中的优点未知。参见美国专利公开案第20170210797号和第20160145333号。

因此仍然需要鉴别不会明显渗透BBB以避免大脑中接合CB1的不良药理效应的安全且有效的外周受限抗CB1反向激动剂或拮抗剂。

发明内容

本发明提供可用于治疗和诊断疾病的结合大麻素1型受体(CB1)如抗体及其抗原结合片段的结合蛋白。

提供一种结合人类大麻素1型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白包含六个互补决定区(CDR)：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1具有氨基酸序列G-Y-T-F-T-D-Y-W(SEQ ID NO:329的残基26-33)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的G取代为S；位置3处的T取代为E；位置5处的T取代为S或N；位置6处的D取代为R或Y；位置7处的Y取代为H；且位置8处的W取代为A或N；CDR-H2具有氨基酸序列I-Y-P-Y-D-G-D-T(SEQ ID NO:329的残基51-58)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的I取代为F；位置2处的Y取代为D、S或T；位置3处的P取代为T；位置4处的Y取代为G、D或S；位置5处的D取代为Y或S；位置6处的G取代为S；位置7处的D取代为E、G或R；且位置8处的T取代为A、S或I；CDR-H3具有氨基酸序列A-R-G-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-W-X₁₀-X₁₁-Y(SEQ ID NO:329的残基98-113)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的A取代为S；位置3处的G取代为S；位置4处的X₁为Q、Y、K、R或G或不存在；位置5处的X₂为E、Y、L或G或不存在；位置6处的X₃为Y或P或不存在；位置7处的X₄为Y、R或E或不存在；位置8处的X₅为G或不存在；位置9处的X₆为T或不存在；位置10处的X₇为N或D或不存在；位置11处的X₈为Y、N、A或G或不存在；位置12处的X₉为N、Y、S、A或R或不存在；位置13处的W取代为Y、A或P；位置14处的X₁₀为L、M、F或G或不存在；位置15处的X₁₁为P、D、A或T或不存在；位置16处的Y取代为V；CDR-L1具有氨基酸序列Q-X₁-I-S-S-X₂-Y(SEQ ID NO:330的残基27-33)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的Q取代为S或E；位置2处的X₁为E、S、T、N、G或R；位置3处的I取代为V；位置4处的S取代为A、R或G；位置5处的S取代为G、N或T；位置6处的X₂为S、N、肽F-R-Y-S或不存在；且位置7处的Y取代为F、D或N；CDR-L2具有氨基酸序列：X₁-T-S(SEQ ID NO:330的残基51-53)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的X₁为A、Y、G、R、D或S；位置2处的T取代为A；位置3处的S取代为R；且CDR-L3具有氨基酸序列：Q-Q-Y-X₁-S-X₂-P-Y-T(SEQ ID NO:330的残基91-99)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的Q取代为L或H；位置2处的Q取代为H；位置3处的Y取代为S或G；位置4处的X₁为S、W、H、Y、N或I；位置5处的S取代为E、R、G、T或N；位置6处的X₂为Y、I、S、T、L或W；且位置8处的Y取代为P、L、F或不存在；且其中至少一个氨基酸残基的所述取代、添加或缺失不抑制所述抗体或其抗原结合片段结合人类CB1的能力。

表5和6提供本发明的示例性抗CB1抗体及其功能抗原结合片段。

提供一种结合人类大麻素I型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列的CDR和可变轻链(VL)结构域序列的CDR，其中VH结构域序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或其中VL结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

提供一种结合人类大麻素I型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列和可变轻链(VL)结构域序列，其中VH结构域序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或其中VL结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的VH/VL对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312和318/324。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的VH/VL对：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312和318/324。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCDR组(HCDR1、HCDR2、HCDR3)：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；和(320、321、322)；和选自由以下组成的组的LCDR组(LCDR1、LCDR2、LCDR3)：(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)；和(326、327、328)。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的(HCDR组/LCDR组)对：SEQ ID NO:(20、21、22/26、27、28)；(32、33、34/38、39、40)；(44、45、46/50、51、52)；(56、57、58/62、63、64)；(68、69、70/74、75、76)；(80、81、82/86、87、88)；(92、93、94/98、99、100)；(104、105、106/110、111、112)；(116、117、118/122、123、124)；(128、129、130/134、135、136)；(140、141、142/146、147、148)；(152、153、154/158、159、160)；(164、165、166/170、171、172)；(176、177、178/182、183、184)；(188、189、190/194、195、196)；(200、201、202/206、207、208)；(212、213、214/218、219、220)；(224、225、226/230、231、232)；(236、237、238/242、243、244)；(248、249、250/254、255、256)；(260、261、262/266、267、268)；(272、273、274/278、279、280)；(284、285、286/290、291、292)；(296、297、298/302、303、304)；(308、309、310/314、315、316)；和(320、321、322/326、327、328)。

在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HC/LC对：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311和317/323。

提供一种结合人类大麻素1型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列的CDR和可变轻链(VL)结构域序列的CDR，其中VH结构域序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性：SEQ IDNO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或VL结构域序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:114中且VL阐述于SEQ ID NO:120中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:126中且VL阐述于SEQ ID NO:132中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:138中且VL阐述于SEQ ID NO:144中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:150中且VL阐述于SEQ ID NO:156中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ IDNO:162中且VL阐述于SEQ ID NO:168中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:174中且VL阐述于SEQ ID NO:180中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:186中且VL阐述于SEQID NO:192中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:198中且VL阐述于SEQ ID NO:204中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:210中且VL阐述于SEQ ID NO:216中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:222中且VL阐述于SEQ ID NO:228中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:234中且VL阐述于SEQ ID NO:240中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQID NO:246中且VL阐述于SEQ ID NO:252中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:258中且VL阐述于SEQ ID NO:264中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:270中且VL阐述于SEQ ID NO:276中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:282中且VL阐述于SEQ ID NO:288中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:294中且VL阐述于SEQ ID NO:300中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:306中且VL阐述于SEQ ID NO:312中。在一个实施方案中，VH阐述于SEQ ID NO:318中且VL阐述于SEQ ID NO:324中。

在一个实施方案中，抗CB1抗体为人类或人源化抗体。

在一个实施方案中，抗CB1抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab)₂片段或scFv片段。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的人类Fc区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM Fc。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的修饰的人类Fc区：L234A/L235A(“LALA”)、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S和N297Q。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段抑制CB1信号传导活性或为CB1信号传导活性的拮抗剂。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段增强或活化CB1信号传导活性或为CB1信号传导活性的激动剂。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段为CB1信号传导活性的反向激动剂。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段为完全人类抗体。

提供抗CB1抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至与分离的抗人类CB1抗体或其抗原结合片段实质上相同的CB1抗原决定基。

提供抗CB1抗体或其抗原结合片段，其与分离的抗人类CB1抗体或其抗原结合片段竞争结合至CB1。

在一个实施方案中，结合至CB1的分离的抗体或其抗原结合片段对CB1具有约1μM或小于1μM的结合亲和力Kd。

在一个实施方案中，结合至CB1的分离的抗体或其抗原结合片段对CB1具有约100nM或小于100nM的结合亲和力Kd。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或抗原结合片段展现相比于利莫那班降低的脑渗透。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或抗原结合片段抑制相比于利莫那班高至少2倍的CB1信号传导。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或抗原结合片段展现相对于利莫那班降低的CNS副作用。

提供一种编码抗CB1抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。

提供一种包含编码抗CB1抗体或其抗原结合片段的核酸分子的表达载体。

提供一种包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码抗CB1抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

提供一种调节CB1信号传导的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与抗CB1抗体或其抗原结合片段接触。

提供一种拮抗CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与抗CB1抗体或其抗原结合片段接触。

提供一种促效CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与抗CB1抗体或其抗原结合片段接触。

提供一种反向促效CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与抗CB1抗体或其抗原结合片段接触。

提供一种包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

提供一种用于抑制有需要的受试者的CB1的生物活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物，由此抑制所述受试者中的CB1蛋白质的活性。

提供一种用于治疗与CB1活性相关的疾病的方法，所述方法包括向罹患所述疾病的受试者施用包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

提供一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导调节有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括施用包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

提供一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导拮抗作用或反向促效作用有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

提供一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导促效作用有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

提供一种用于诊断与CB1相关的疾病或病症的方法，所述方法包括使细胞与抗CB1抗体或其抗原结合片段接触。

在一个实施方案中，所述疾病或病症选自由以下组成的组：肥胖症、综合征性肥胖症，包括普拉德-威利综合征(PWS)、阿尔斯特伦

综合征、巴德-毕德氏综合征(Bardet-Biedel syndrome，BBS)、奥尔布赖特遗传性骨营养不良(Albright HereditaryOsteodystrophy，AHO)和SIM1缺失综合征；糖尿病及相关并发症；血脂异常；肝脏疾病，诸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病和原发性胆汁性肝硬化；纤维化，例如肾脏纤维化；慢性肾脏疾病；糖尿病神经病变、病灶性区段性肾小球硬化症、肾病；代谢疾病、骨质疏松、动脉粥样硬化、发炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多发性硬化症痉挛、青光眼和尼古丁成瘾。

在一个实施方案中，所述疾病或病症为肾脏疾病(诸如病灶性区段性肾小球硬化症(FSGS)、糖尿病肾病变、奥尔波特(Alport)综合征、高血压肾脏疾病、肾病综合征、类固醇耐药性肾病综合征、微小病变、膜性肾病、特发性膜性肾病、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、免疫复合体介导的MPGN、补体介导的MPGN、狼疮性肾炎、感染后肾小球肾炎、薄基底膜疾病、肾小球膜增生性肾小球肾炎、淀粉样变性(原发性)、c1q肾病、快速进行性GN、抗GBM疾病、C3肾小球肾炎、高血压肾硬化、IgA肾病、蛋白尿肾脏疾病、微白蛋白尿或大量白蛋白尿肾脏疾病)、肺动脉高血压、疼痛(诸如神经性疼痛或内脏疼痛)、癌症(诸如化疗耐药性乳腺癌、阿霉素(adriamycin)耐药性乳腺癌、化疗耐药性结肠直肠癌、神经管胚细胞瘤或肿瘤血管生成)、焦虑症、抑郁症、移植相关FSGS、移植相关肾病综合征、移植相关蛋白尿、胆汁郁积性肝病、多囊性肾脏疾病、常染色体显性多囊性肾病(ADPKD)、肥胖症、胰岛素抵抗、II型糖尿病、前期糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病性胃轻瘫或胃轻瘫。

提供包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段的抗体缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的试剂缀合：治疗剂、细胞毒性剂、免疫粘附分子和显像剂。

提供一种包含分离的抗CB1抗体或其抗原结合片段及在免疫学测定中使用所述抗体的说明的试剂盒。

附图说明

将在阅读时自实施方案的以下描述以及附图更完整理解本发明的前述及其他特性和优势以及本发明自身，其中：

图1显示cAMP测定的结果。cAMP Hunter^TMCHO-K1 CNR1 Gi细胞用CB1抗体、同种型对照或小分子CB1拮抗剂JD5037处理，然后在毛喉素(forskolin)存在下用30nM CP-55,940(指示为“Plus CP”)进行激动剂激发。也在不添加CP-55,940的情况下测试拮抗剂以确定其是否自身具有促效活性。关键词：CAB＝细胞测定缓冲液，指示测定背景；CAB/F＝CAB加15μM毛喉素，表示测定中cAMP的最大量；CAB/F/CP＝CAB/F加30nM CP-55,940，对应于CP-55,940的～EC80。

图2显示p-ERK测定的结果。使用cAMP Hunter^TMCHO-K1CNR1 Gi细胞进行磷酸/全部ERK测定。细胞用小鼠抗CB1抗体或小分子CB1拮抗剂JD5037处理，然后在毛喉素存在下用30nM CP-55,940进行激动剂激发。在处理结束时，使用MesoScale Discovery(MSD)试剂盒针对p-ERK/全部ERK处理培养板。结果表示为最大响应百分比(最大％)。

图3A显示小鼠抗huCB1抗体结合至huCB1-CHO细胞。纯化的鼠抗CB1抗体的结合曲线在200nM抗体浓度下起始滴定3倍。所有抗体展示对huCB1-CHO细胞的特异性结合。

图3B显示小鼠抗huCB1抗体结合至moCB1-CHO细胞。所有抗体显示未结合至moCB1-CHO细胞。

图4显示分别在激动剂和拮抗剂CB1小分子CP5990和JD5037的存在和不存在下纯化的抗CB1抗体的结合的评价。

图5A显示衍生自杂交瘤抗体M1-M8的重链可变区氨基酸序列的比对的共有序列。

图5B显示衍生自杂交瘤抗体M1-M8的轻链可变区氨基酸序列的比对的共有序列。

图6A显示衍生自人源化抗体M7-H1至M7-H16、M5-H1和M5-H2的重链可变区氨基酸序列的比对的共有序列。

图6B显示衍生自人源化抗体M7-H1至M7-H16、M5-H1和M5-H2的轻链可变区氨基酸序列的比对的共有序列。

图7A展示在30μg/mL的单一抗体浓度下在克隆M5和M7的人源化CB-1抗体变体的CHO-huCB-1和CHO亲本细胞上的细胞结合。

图7B展示在30μg/mL的单一抗体浓度下在克隆M7的人源化CB-1抗体变体的CHO-huCB-1和CHO亲本细胞上的细胞结合。

图8A显示如实施例3中所描述的cAMP测定的结果。图8A显示M5抗体的不同骨架之间的并排比较。

图8B显示如实施例3中所描述的cAMP测定的结果。图8B显示M7抗体的不同骨架之间的并排比较。

图9A显示如实施例4中所描述的p-ERK测定的结果。图9A显示M5抗体的不同骨架之间的并排比较。

图9B显示如实施例4中所描述的p-ERK测定的结果。图9B显示M7抗体的不同骨架之间的并排比较。

图10显示使用与实施例3中描述的那些类似的方法进行反向促效作用的cAMP测定的结果。cAMP Hunter^TMCHO-K1 CNR1 Gi细胞用CB1抗体或同种型对照处理，然后添加毛喉素。紫色虚线表示在用毛喉素处理后cAMP释放水平，测定中cAMP的最大量。红线对应于用作测定对照的CB1小分子激动剂CP-55,940。具有反向促效作用活性的化合物具有在与激动剂相反方向上且位于CAB/F线之上的曲线。这个实验证实两种测试的M7变体均具有反向促效作用活性。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。在发生任何潜在分岐的情况下，本文所提供的定义优先于任何辞典或外来定义。除非另外被情形所需，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则词语“一个(a)”或“一个(an)”意指“至少一个”。短语“至少一个”的含义等效于短语“一个或多个”的含义。除非另外说明，否则词语“或”意指“和/或”。如本文所使用，术语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等可具有归属于美国专利法中的含义且可意指“包括(include)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“基本上由……组成(consistsessentially)”同样地具有归属于美国专利法中的含义且所述术语为开放式的，允许存在超过所叙述的内容，只要不改变基础或新颖特征即可，但排除现有技术实施方案。除非明确陈述或自上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“约”理解为在本领域中的一般公差范围内，例如在平均值的2倍标准偏差内。约可理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外自上下文清楚，否则本文所提供的所有数值均通过术语约修饰。

除非另外指明，否则本文所提供的方法和技术通常根据本领域中众所周知的常规方法且如本说明书通篇引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所描述来执行。本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学和杂交、分析化学、合成有机化学及医学和药学化学的命名法、实验工序和技术为本领域中众所周知且常用的那些。标准技术用于酶促反应和纯化技术、化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者治疗。

本文所提供的范围应理解为范围内所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数目、数目组合或子范围。

术语“大麻素受体I型”或“CB1”意指由CNR1基因编码且具有SEQ ID NO:1的典型氨基酸序列的7-跨膜细胞膜受体(参见https://www.uniprot.org/uniprot/P21554)。表1公开这个序列以及蛋白质的结构域中的每一种。

表1.大麻素受体I型氨基酸序列

术语“中枢CB1”意指定位于体内任何地方，包括大脑和CNS的CB1。

术语“外周CB1”意指不定位于大脑或CNS的CB1(例如外周限制CB1)。

术语“抗体”意指包含特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。所述术语包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂交抗体、突变抗体和接枝抗体。除非出于本发明的目的通过术语“完整”，如在“完整抗体”中另外修饰，否则术语“抗体”也包括抗体片段，诸如Fab、F(ab')₂、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能，即，特异性结合CB1的能力的其他抗体片段。通常，这类片段将包含抗原结合结构域。术语“抗体”包括包含四个多肽链、通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体。在全长抗体的一个实施方案中，各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成。CH由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。CL由单一CL结构域构成。VH和VL可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有称为框架区(FR)的更保守区。一般而言，每个VH和VL由按以下次序自氨基端至羧基端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施方案中，抗CB1抗体的FR可与人类生殖系序列一致或可被天然或人工修饰。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR和/或FR的并排分析确定。抗体分子可具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别。

术语“HCDR组”和“LCDR组”是指存在于分别能够结合抗原的重链或轻链的单一可变区中的三个CDR的组。术语“(HCDR组/LCDR组)对”是指HCDR组与LCDR的配对提供构成抗原结合位点的六个CDR。这些CDR的准确边界已根据不同系统以不同方式加以界定。Kabat(Kabat等人(1987)和(1991))所描述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且也提供界定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。术语“Kabat编号”意指比抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即，高变)的编号氨基酸残基的系统(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物编号91-3242)。对于重链可变区，CDR1的高变区在氨基酸位置31至35范围内，CDR2的高变区在氨基酸位置50至65范围内，且CDR3的高变区在氨基酸位置95至102范围内。对于轻链可变区，CDR1的高变区在氨基酸位置24至34范围内，CDR2的高变区在氨基酸位置50至56范围内，且CDR3的高变区在氨基酸位置89至97范围内。Chothia和同事(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883)发现，在Kabat CDR内的某些子部分采用几乎一致的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列的水平下具有极大的多样性。这些子部分表示为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区可被称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(1995)FASEB J.9:133-139和Maccallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45)所描述。又其他CDR边界定义可不严格遵循本文系统之一，但仍然将与Kabat CDR重叠，尽管其可根据特定残基或残基组或甚至全部CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现而被缩短或延长。本文所描述的组合物和方法可利用根据这些系统中的任一种定义的CDR。

术语“VH/VL对”是指配对且能够结合抗原的VH和VL。

术语“HC/LC对”是指配对且能够结合抗原的HC和LC。

术语“Fc区”意指免疫球蛋白重链的C端区，其可通过完整抗体的番木瓜蛋白酶消化产生。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。置换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应功能在本领域中已知(例如美国专利第5,648,260号和第5,624,821号)。Fc区介导一些重要效应功能，例如细胞因子诱导、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。在一些情况下，这些效应功能就治疗性免疫球蛋白而言为合乎需要的，但在其他情况下，可能视治疗目标而为不必要的或甚至有害的。

术语“结合CB1的抗体”和“抗CB1抗体”意指结合可溶性CB1蛋白质或其片段(例如CB1的细胞外结构域的一部分)和/或细胞表面表达的CB1的抗体及其抗原结合片段。表述“细胞表面表达的CB1”意指体外或体内在细胞表面上表达的CB1蛋白质或其部分，以使得CB1蛋白质的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧且可进入抗体的抗原结合部分。

术语“CB1结合蛋白”或“抗CB1结合蛋白”意指结合至CB1的蛋白质，其包含抗原结合片段的全部或一部分，且包括包含典型的抗体结构域或框架的替代性布置的蛋白质，诸如重组多价或多特异性免疫球蛋白以及缀合物和融合蛋白。本发明的CB1结合蛋白及其变体和突变体保留CB1结合和功能，或可提供额外或替代功能。这类CB1结合蛋白在本发明的范围内且是本领域技术人员众所周知的。

关于诸如抗体的结合蛋白的术语“抗原结合结构域”和“抗原结合片段”意指保留特异性结合至抗体的靶抗原的能力的抗体的部分或片段或其变体或突变体，且包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在、以酶促方式可获得、合成或经基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可例如使用任何适合的标准技术自完整抗体分子衍生，所述标准技术诸如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的重组基因工程改造技术。一个或多个可变结构域和/或恒定结构域可布置到适合的构型中，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。包含抗原结合片段的多种片段、突变体或变体抗体型式是本领域中已知的。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为在铰链区包含两个通过二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其包含VH和CH1结构域；(iv)Fv片段，其包含抗体的单一臂的VL和VH结构域；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段，其包含单一可变结构域；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽。其他工程改造的分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、双链抗体、线性抗体(包含一对串联Fv链段；形成一对具有互补轻链多肽的抗原结合位点的VH-CH1-VH-CH1)、三链抗体、四链抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所使用的表述“抗原结合片段”内。术语“其抗原结合片段”不意指为限制性的且包括可具有额外或重排的抗体区域的变体分子内所含的片段，例如保留对特定抗原的相同抗原结合的多特异性抗体和抗体缀合物。

抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成且通常将包含至少一个与一个或多个框架序列相邻或同框的CDR。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以任何适合的布置相对于彼此定位。例如，可变区可为二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有至少一个共价连接至至少一个恒定结构域的可变结构域。可发现于本发明抗体的抗原结合片段内的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型，包括上文所列的示例性构型中的任一种中，可变结构域和恒定结构域可直接彼此连接或可通过完全或部分铰链区或连接区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，这些氨基酸在单一多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接。另外，本发明抗体的抗原结合片段可包含上文所列的任一可变结构域和恒定结构域构型的均二聚体或杂二聚体(或其他多聚体)，与彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如通过双硫键)。

如同完整抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合至独立抗原或相同抗原上的不同抗原决定基。任何多特异性抗体型式，包括本文所公开的示例性双特异性抗体型式可使用本领域中可用的常规技术而适用于本发明抗体的抗原结合片段的情况下。

关于结合蛋白的术语“特异性”或“对……具有特异性”意指例如以与任何其他靶标或抗原相比更大的亲和力(即，较低Kd值)结合蛋白选择性结合靶标或抗原的能力。

在某些实施方案中，本发明的抗体可经由补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)起作用。CDC是指在补体存在下通过本发明抗体溶解抗原表达细胞。ADCC是指细胞介导的反应，其中表达识别靶细胞上的结合抗体的Fc受体的非特异性细胞毒性细胞(FcR)(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球和巨噬细胞)，其导致靶细胞溶解。可使用本领域中众所周知且可用的测定测量CDC和ADCC。(参见，例如美国专利第5,500,362号和第5,821,337号，和Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。

术语“小鼠抗体”意指具有衍生自小鼠生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。小鼠抗体可例如在CDR中且尤其CDR3中包括不由小鼠生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，术语“小鼠抗体”并不意欲包括其中CDR序列衍生自已接枝到小鼠框架序列上的其他哺乳动物物种如人类的生殖系的抗体。

术语“重组抗体”意指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，诸如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；自重组组合抗体文库分离的抗体；自针对通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的免疫球蛋白基因或抗体转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。在某些实施方案中，这类重组抗体经受体外突变诱发(或当使用针对免疫球蛋白序列转基因的动物时，体内体细胞突变诱发)，且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列为尽管衍生自生殖系VH和VL序列且与其相关，可不天然存在于体内特定抗体生殖系基因谱内的序列。

术语“分离的抗体”意指已自其天然环境的至少一种组分鉴别和分离和/或复原的抗体。例如，自生物体的至少一种组分、或自其中抗体天然存在或天然产生的组织或细胞分离或移除的抗体出于本发明的目的为“分离的抗体”。分离的抗体也包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体为已经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可实质上不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“中和”或“阻断”抗体意指结合至其配体或抗原抵消配体或抗原的生物活性的抗体。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合至抗原(例如细胞因子)且其生物活性降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％。结合至CB1的中和抗体：(i)干扰CB1或CB1片段与CB1配体(例如大麻等)之间的相互作用，和/或(ii)使得抑制CB1的至少一种生物功能。由CB1中和或阻断抗体引起的抑制无需完全，只要其可使用适当的测定检测即可。本文描述用于检测CB1抑制的示例性测定。

术语“亲和力”意指结合蛋白与其靶抗原之间的相互作用的强度，且通过结合蛋白的CDR的序列以及通过抗原和抗体的性质，诸如其尺寸、形状和/或电荷测定。结合蛋白的亲和力可经选择以提供所需治疗端点同时使负面副作用减至最少。可使用本领域技术人员已知的方法来测量亲和力。

术语“亲和力成熟抗体”意指已在一个或多个CDR或其FR中进行一种或多种改变，使得相较于不具有那些改变的未改变的“亲本”抗体的抗体对其靶抗原的亲和力得到改善。示例性亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域中已知的工序产生亲和力成熟抗体。例如，Marks等人(1992)Bio Technology 10:779-783描述通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813；Schier等人(1995)Gene 169:147-155；Yelton等人(1995)J.lmmunol.155:1994-2004；Jackson等人(1995)J.lmmunol.154(7):3310-9；Hawkins等人(1992)J.Mol.Biol.226:889-896描述CDR和/或框架残基的随机突变诱发，且在具有活性增强氨基酸残基的选择性突变诱发位置、接触或超突变位置处的突变描述于美国专利第6,914,128号中。

术语“CDR接枝抗体”意指包含重链和轻链可变区序列的抗体，其中VH和/或VL的CDR区中的一个或多个的序列被其他抗体的CDR序列置换。例如，这两种抗体可来自不同物种，诸如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中鼠CDR序列中的一个或多个已被人类CDR序列置换。

术语“人源化抗体”意指来自已经改变以与人类生殖系序列更加类似的非人类物种的抗体。人源化抗体的一种类型为CDR接枝抗体，其中一个或多个CDR序列为非人类的，且框架区(FR)序列为人类或实质上人类(例如，其与人类抗体的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致)。人源化抗体可包含至少一个和通常两个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)的实质上全部，其中全部或实质上全部CDR区的序列与非人类免疫球蛋白的那些相对应，且FR区域的全部或实质上全部的序列为人类免疫球蛋白的那些。人源化抗体也可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一个实施方案中，人源化抗体也包含人类免疫球蛋白Fc区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变结构域和/或重链的人源化可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。在一些实施方案中，人源化抗体含有重链以及至少轻链的可变结构域。

术语“效能”意指结合蛋白实现所需作用的能力，且为其治疗功效的量度。可使用本领域技术人员已知的方法评估效能。

术语“有效量”意指足以降低CB1的活性以改善患者的症状或实现所需生物学结果的剂量或量。所需生物学结果包括例如CB1活性的降低或提高。

术语“交叉反应”意指结合蛋白结合除其针对培养的靶抗原外的能力。一般而言，结合蛋白将以适当高的亲和力结合其靶抗原，但可结合至其他物种的相同靶抗原或展示针对非靶抗原的低亲和力。通常选择个别结合蛋白符合两个准则：(1)适于抗体靶标的已知表达的组织染色；和(2)来自相同器官的人类与毒性研究物种(例如小鼠和食蟹猕猴)组织之间的类似染色图案。本领域技术人员已知评估交叉反应性的这些和其他方法。

术语“生物学功能”意指无论天然存在或通过重组方式实现的结合蛋白的特异性体外或体内活性。结合蛋白可靶向一些类别的抗原，且经由多种作用机制实现所需治疗结果。结合蛋白可促效、拮抗或中和其靶标的活性。结合蛋白可帮助清除其结合的靶标，或可在结合至细胞时产生细胞毒性。两种或更多种抗体的部分可合并为多价型式以在单一结合蛋白分子中达成不同功能。生物活性包括(但不限于)结合至受体、诱导细胞增殖、抑制细胞生长、诱导其他细胞因子、诱导细胞凋亡和酶活性。用以评估生物功能的体外分析和体内模型是本领域技术人员已知的。

术语“稳定”意指能够在给定时间段或储存条件内保留其物理、化学和/或生物学完整性或活性。在各种温度下体外稳定达一段延长时间的结合蛋白通常是合乎需要的。稳定结合蛋白和评估其在各种温度下的稳定性的方法是本领域技术人员已知的。

术语“溶解度”意指蛋白质保持分散在水溶液内的能力。蛋白质在水性制剂中的溶解度根据疏水性和亲水性氨基酸残基的适当分布而定，且因此溶解性可与恰当折叠的蛋白质的产生相关。本领域技术人员将能够使用常规HPLC技术和本领域技术人员已知的方法检测结合蛋白的溶解度的提高或降低。

术语“免疫原性”意指物质诱发免疫响应的能力。施用治疗结合蛋白可导致免疫响应的一定发生率。降低抗体和结合蛋白的免疫原性的方法是本领域技术人员已知的。

术语“可检测的标记”意指连接至特异性结合对的成员，诸如抗体或其分析物以赋予可检测的特异性结合对的成员之间的反应(例如结合)的部分。特异性结合对的标记的成员称为“可检测地标记”。因此，术语“标记的结合蛋白”是指具有提供结合蛋白鉴别并入的可检测标记的蛋白质。在一个实施方案中，可检测标记可产生可通过目视或仪器方式检测的信号，例如并入放射性标记的氨基酸或将可通过抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记物或酶活性的抗生蛋白链菌素)检测的生物素基部分连接至多肽。多肽的可检测标记的实例包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)；色素原；荧光标记(例如FITC、若丹明、镧系磷光体)；酶标记(例如辣根过氧化酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基；通过二级报告子识别的预先确定的多肽抗原决定基(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位置、金属结合结构域、抗原决定基标签)；和磁性剂，诸如钆螯合物。通常用于免疫测定的标记的代表性实例包括产生光的部分(例如吖锭化合物)和产生荧光的部分(例如荧光素)。就此而言，所述部分自身可能并非可检测标记的，但可在与又一部分反应之后变为可检测的。

术语“缀合物”是指化学上连接至其他功能分子或第二化学部分(诸如治疗剂、细胞毒性剂、细胞生长抑制剂或显像剂)的结合蛋白，诸如抗体(参见例如7,850,962)。术语“剂”包括化学化合物、化学化合物的混合物、生物学大分子，诸如蛋白质的肽或由生物学材料制成的提取物。在一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂包括(但不限于)抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和凋亡剂。有用的剂包括例如百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌素D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睪酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和类似物或同源物。可用于制得抗CB1结合蛋白缀合物的显像剂包括(但不限于)放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。当在免疫测定的情况下采用时，缀合物抗体可为用作检测抗体的可检测标记的抗体。抗体可通过化学交联或通过重组方法连接。抗体也可以阐述于美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号中的方式连接至多种非蛋白性聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。抗体可通过共价缀合至聚合物被化学修饰以例如提高其循环半衰期。将其连接的示例性聚合物和方法也显示在美国专利第4,766,106号；第4,179,337号；第4,495,285号和第4,609,546号中。

术语“结晶”意指以晶体形式存在的结合蛋白。晶体为物质的一种固态形式，其不同于诸如非晶形固态或液晶态的其他形式。晶体由原子、离子、分子(例如蛋白质，诸如抗体)或分子组装体(例如抗原/抗体复合物)的规则、重复、三维阵列构成。

术语“载体(vector)”是指能够输送另一核酸至其已连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其是指其中可连接其他DNA片段的环形双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中额外DNA片段可与病毒基因组连接。其他载体包括RNA载体。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体在引入宿主细胞中时可整合到宿主细胞的基因组中，且进而与宿主基因组一起复制(例如非游离型哺乳动物载体)。“重组表达载体”或“表达载体”能够引导其操作性地连接的基因的表达。由于质粒是载体的最常用形式，因而在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用。然而，也包括提供等效功能的其他表达载体形式，诸如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指已引入外源性DNA或RNA的细胞。这类术语不仅是指特定受试者细胞，而且是指这类细胞的后代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而在后代中发生，这类后代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍包括在如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括原核和真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一实施方案中，宿主细胞包括(但不限于)原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NSO、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

术语“转染”意指常用于外源性核酸引入宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-聚葡萄糖转染等。

术语“生物样品”意指来自生物或先前生物的一定数量的物质。这类物质包括(但不限于)血液、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏。

术语“对照”是指已知不含有分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可包含已知浓度的分析物或可用于确定测定性能特征且是试剂完整性的有用指标。

术语“特异性结合对”意指通过化学或物理方式彼此特异性结合的两种不同分子。特异性结合对包括例如抗体及其抗原、生物素和抗生物素蛋白(或抗生蛋白链菌素)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物和受体分子、辅因子和酶、酶和抑制剂和酶以及保留特异性结合的片段和类似物。特异性结合对的实例为抗体的VH和VL区(“VH/VL”)。

术语“接头”意指氨基酸残基或包含两个或更多个通过用于连接两个多肽(例如两个VH或两个VL结构域)的肽键接合的氨基酸残基的多肽。接头为本领域中众所周知的(参见例如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2:1121-1123)。

术语“抗原决定基”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有多于一个的抗原决定基。因此，不同抗体可结合至抗原上的不同区域且可具有不同的生物效果。抗原决定基可为构象的或线性的。构象抗原决定基通过来自线性多肽链的不同链段的空间并置氨基酸产生。线性抗原决定基为由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的抗原决定基。在某些情形中，抗原决定基可包括抗原上的氨基酸、醣、磷酰基或磺酰基的部分，且可具有特定三维结构性特征和/或特定电荷特征。如果结合蛋白结合至抗原上的相同氨基酸且也可交叉竞争(一种抗体预防另一抗体的结合或调节作用)，则结合蛋白“结合至相同抗原决定基”。另外，抗原决定基的结构界定(重叠、相似、一致)具有信息性；且功能界定涵盖结构(结合)和功能(调节、竞争)参数。

术语“药物动力学”意指生物体吸收、分布、代谢和排出药物的过程。

术语“生物可用性”意指在施用后到达其靶标的活性药物的量。生物可用性为一些性质的函数，包括稳定性、溶解度、免疫原性和药物动力学，且可使用本领域技术人员已知的方法评估。

术语“表面等离子体共振”意指允许通过例如使用

系统(BIAcoreInternational AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,NJ；Jonsson等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析即时生物特异性相互作用的光学现象。

术语“K缔合”、“缔合速率常数”和“Ka”意指结合蛋白(例如抗体)与抗原缔合以形成结合蛋白/抗原复合物的缔合速率常数。这个值指示结合蛋白至其靶抗原的结合速率或结合蛋白与抗原之间的复合物形成速率，如以下等式所示：

抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→“Ab-Ag”

术语“K解离”和“解离速率常数”意指结合蛋白(例如抗体)自结合蛋白/抗原复合物解离的解离速率常数。这个值指示结合蛋白自其靶抗原的解离速率或Ab-Ag复合物随时间而分离成游离抗体和抗原，如以下等式所示：

Ab+Ag←Ab-Ag

术语“Kd”和“平衡解离常数”意指在均衡状态下滴定测量中所获得的值或解离速率常数(K解离)除以缔合速率常数(K缔合)。测定缔合和解离速率常数的方法是本领域中众所周知的。基于荧光的技术提供较高敏感性和检验在均衡状态下的生理缓冲剂中的样品的能力。可使用其他实验途径和仪器，诸如

测定(BIAcore international AB,Uppsala,Sweden)或

测定(Sapidyne Instruments,Boise,Idaho)。

术语“变体”意指因氨基酸的添加、插入、缺失或保守性取代而与氨基酸序列中的给定多肽不同，但保留给定多肽的生物活性的多肽(例如可与结合至其靶标的天然抗体竞争的变体抗体)。氨基酸的保守性取代用具有类似性质(例如带电荷区域的亲水性和程度及分布)的不同氨基酸置换氨基酸且在本领域中识别为通常涉及微小变化。如本领域中所理解，这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴别。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。蛋白质中的类似亲水指数的氨基酸可被取代且蛋白质仍保留蛋白质功能。在一个方面中，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于展现将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽的最大局域平均亲水性，此为已报导与抗原性和免疫原性充分关联的一种可用的量度。如本领域中所理解，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可产生保持生物活性(例如免疫原性)的肽。在一个方面中，取代是用亲水性值在彼此的±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为根据氨基酸且尤其那些氨基酸的侧链的如由疏水性、亲水性、电荷、尺寸及其他性质所展现的相对类似性而定。术语“变体”也包括已诸如通过蛋白分解、磷酸化或其他转译后修饰区别处理，但保留生物活性或抗原反应性的多肽或其片段。除非另外定义，否则术语“变体”涵盖变体的片段。变体可与野生型序列99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％或75％一致。

相比于衍生出抗体的对应生殖系序列，本文所公开的抗CB1抗体可包含重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失。这类突变可容易地通过比较本文所公开的氨基酸序列与可自公共抗体序列数据库获得的生殖系序列而确定。本发明包括衍生自本文所公开的氨基酸序列中的任一种的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变成衍生出抗体的生殖系序列的对应残基，或突变成其他人类生殖系序列的对应残基，或突变成对应生殖系残基的保守性氨基酸取代(这类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。本领域的普通技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列起始，可容易地产生许多包含一个或多个个别生殖系突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基全部突变回衍生出抗体的原始生殖系序列中所发现的残基。在其他实施方案中，仅某些残基突变回原始生殖系序列，例如仅FR1的前8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变残基。在其他实施方案中，框架区和/或CDR残基中的一个或多个突变成不同生殖系序列(即，不同于最初衍生出抗体的生殖系序列的生殖系序列)的对应残基。此外，本发明抗体可在框架区和/或CDR区内含有两个或多个生殖系突变的任何组合，例如其中某些个别残基突变成特定生殖系序列的对应残基，而不同于原始生殖系序列的某些其他残基维持不变或突变成不同生殖系序列的对应残基。在获得后，可容易地测试含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需性质，诸如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或促效生物性质(视具体情况而定)、降低的免疫原性等。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。

当提及核酸时，术语“实质上同一性”和“实质上一致”指示当与适当的核苷酸插入或缺失其他核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的核苷酸碱基中分别存在核苷酸序列同一性，如通过如下文所论述的序列同一性的任何众所周知算法，诸如FASTA、BLAST或Gap所测量。与参考核酸分子具有实质上同一性的核酸分子在某些情况下可编码具有与由参考核酸分子所编码的多肽相同或实质上类似的氨基酸序列的多肽。

当提及多肽时，术语“实质上相似性”和“实质上相似”意指当最佳比对时，诸如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT，两个多肽序列共有至少约95％序列同一性、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一个实施方案中，不一致的残基位置相差保守性氨基酸取代。本发明也包括抗CB1抗体，其包含具有一个或多个保守性取代的本文所公开的VH、VL和/或CDR氨基酸序列中的任一种的变体。例如，相对于本文所公开的VH、VL和/或CDR氨基酸序列中的任一种，本发明包括具有含例如10个或少于10个，8个或少于8个，6个或少于6个，4个或少于4个等保守性氨基酸取代的VH、VL和/或CDR氨基酸序列的抗CB1抗体。“保守性氨基酸取代”为一种氨基酸取代，其中氨基酸残基被侧链(R基团)具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一氨基酸残基取代。一般而言，保守性氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此间差异为保守性取代的情况下，可上调序列同一性或相似度百分比以根据保守取代性质加以校正。进行这种调节的方式是本领域技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，其以引用的方式并入本文中。含有具有类似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换为在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中所公开的PAM250对数似然性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”置换为在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，其也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用分配于各种取代、缺失及其他修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit的程序，其可在预设参数下使用以测定密切相关的多肽，诸如来自生物体的不同物种的同源多肽之间，或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG版本6.1。也可使用FASTA使用预设或推荐参数，GCG版本6.1的程序来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与检索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(上文Pearson(2000))。当比较本发明序列与含有来自不同生物体的大量序列的数据库时，另一优选算法为使用预设参数的电脑程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，各自以引用的方式并入本文中。

抗体的生物学特征

本发明包括以高亲和力结合CB1的抗CB1抗体及其抗原结合片段。

提供本发明的抗CB1抗体及其抗原结合片段，其具有选自由以下组成的组的CB1缔合速率常数(K_缔合)：至少约10²M^-1s^-1；至少约10³M^-1s^-1；至少约10⁴M^-1s^-1；至少约10⁵M^-1s^-1；和至少约10⁶M^-1s^-1，如通过表面等离子体共振所测量。

提供本发明的抗CB1抗体及其抗原结合片段，其对所述靶标具有选自由以下组成的组的解离速率常数(K_解离)：至多约10^-3s^-1；至多约10^-4s^-1；至多约10^-5s^-1；和至多约10^-6s^-1，如通过表面等离子体共振所测量。

提供本发明的抗CB1抗体及其抗原结合片段，其对所述靶标具有选自由以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10^-7M；至多约10^-8M；至多约10^-9M；至多约10^-10M；至多约10^-11M；至多约10^-13M；和至多10^-14M。抗CB1抗体及其片段可对CB1具有约0.01nM至约500nM、约0.02nM至约250nM、约0.02至约200nM、约0.05至约100nM、约0.05至约50nM范围内的结合亲和力Kd值。抗体及其片段可对CB1具有约500nM或小于500nM、约250nM或小于250nM、约200nM或小于200nM、约150nM或小于150nM、约100nM或小于100nM、约75nM或小于75nM、约50nM或小于50nM、约25nM或小于25nM、约10nM或小于10nM、约5nM或小于5nM、约1nM或小于1nM、约500pM或小于500pM、约250pM或小于250pM、约100pM或小于100pM、约50pM或小于50pM或约10pM或小于10pM的结合亲和力Kd值。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以小于约15pM、小于约10pM、小于约8pM、小于约6pM、小于约4pM、小于约2pM或小于约1pM的Kd结合CB1。

在一些实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段至少与诸如以下的小分子CB1受体调节剂同样有效：利莫那班、特拉那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奥替那班、溴乙那班、四氢次大麻酚和维拉帕胺及AM6545。在一些实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段具有比诸如以下的小分子CB1受体调节剂大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍的CB1拮抗剂或反向激动剂活性：利莫那班、特拉那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奥替那班、溴乙那班、四氢次大麻酚和维拉帕胺及AM6545。在一些实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段抑制CB1激动剂介导的信号转导。在一些实施方案中，通过测定细胞内cAMP水平和/或下游ERK磷酸化来测量CB1激动剂介导的信号转导抑制。

在一些实施方案中，抗CB1抗体及其抗原结合片段具有减少或不存在的BBB渗透或脑暴露的优势。在一些实施方案中，抗CB1抗体及其抗原结合片段的BBB渗透展现相对于小分子CB1激动剂、拮抗剂或反向激动剂(例如利莫那班、特拉那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奥替那班、溴乙那班、四氢次大麻酚和维拉帕胺及AM6545)减少的脑渗透。在一些实施方案中，本文所提供的抗CB1抗体及其抗原结合片段提供治疗益处与相对于小分子CB1受体激动剂、拮抗剂或反向激动剂降低的CNS副作用。与小分子CB1受体拮抗剂利莫那班相关的CNS副作用例如包括焦虑、抑郁、躁动、饮食障碍、易怒、攻击和失眠(Moreira(2009)Rev.Bras.Psiquiatr.31(2):145-153)。

抗原决定基定位及相关技术

本发明包括与人类CB1的细胞外结构域内(例如在氨基酸1-116和/或细胞外环e1(氨基酸176-187；SEQ ID NO:6)、e2(氨基酸256-273；SEQ ID NO:10)和/或e3(氨基酸366-377；SEQ ID NO:14)内)发现的一种或多种氨基酸相互作用的抗CB1抗体。抗体结合的抗原决定基可包含具有3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)位于CB1的细胞外结构域内的氨基酸的单一连续序列。或者，抗原决定基可由多个位于CB1的细胞外结构域内的非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。另外，CB抗体结合的抗原决定基可包含由于构象变化非细胞外或由于结合暴露的CB1的一部分。CB1的序列及其各种结构域阐述于表1中。

本领域的普通技术人员已知的各种技术可用于确定抗体是否在多肽或蛋白质内“与一种或多种氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定，诸如所描述的抗体、哈罗和泳道(Antibodies,Harlow and Lane)(Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harb.,N.Y.)、丙氨酸扫描突变分析、肽墨点分析(Reineke(2004)MethodsMol.Biol.248:443-463)和肽裂解分析。另外，可采用诸如抗原决定基切除、抗原决定基提取和化学修饰抗原的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。可用于鉴别多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及氘标记目标蛋白质，然后使抗体与氘标记的蛋白质结合。随后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中以允许氢-氘交换在除了被抗体保护的残基(其保持氘标记)以外的所有残基处发生。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，由此展现对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochem.267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。

本发明还包括结合至与本文所描述的特异性示例性抗体中的任一种相同的抗原决定基的抗CB1抗体(例如M1、M2、M3、M4、M5(及其人源化变体)、M6、M7(及其人源化变体)和M8)。同样地，本发明也包括与本文所描述的特异性示例性抗体中的任一种竞争结合至CB1的抗CB1抗体(例如M1、M2、M3、M4、M5(及其人源化变体)、M6、M7(及其人源化变体)和M8)。

通过使用本领域中已知的常规方法，可容易地确定抗体是否结合至与参考抗CB1抗体相同的抗原决定基或与相同抗原决定基竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否结合至与本发明的参考抗CB1抗体相同的抗原决定基，使参考抗体结合至CB1蛋白质(例如CB1细胞外结构域或细胞表面表达的CB1的可溶性部分)。随后，评估测试抗体结合至CB1分子的能力。如果测试抗体在与参考抗CB1抗体饱和结合之后能够结合至CB1，则可推断出测试抗体结合至与参考抗CB1抗体不同的抗原决定基。另一方面，如果测试抗体不能够在与参考抗CB1抗体饱和结合之后结合至CB1分子，则测试抗体可结合至与本发明的参考抗CB1抗体所结合的抗原决定基相同的抗原决定基。随后可进行额外的常规实验(例如肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体的结合缺失实际上是否是由于与参考抗体结合至同一抗原决定基，或是否空间阻断(或另一现象)负责所观察到的结合缺乏。这类实验可使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中可用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行。根据本发明的某些实施方案，如果例如1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一抗体的结合至少50％，但优选75％、90％或甚至99％(如在竞争性结合测定中所测量)，则两种抗体结合至相同(或重叠)抗原决定基(参见例如Junghans等人(1990)Cancer Res.50:1495-1502)。或者，如果降低或消除一种抗体的结合的抗原中的基本上所有氨基酸突变降低或消除另一抗体的结合，则将两种抗体视为结合至相同抗原决定基。如果仅一个子集的减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除另一抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的抗原决定基”。

在一些实施方案中，本发明提供能够与本文所公开的抗体或其抗原结合片段竞争结合至CB1的抗CB1抗体或其抗原结合片段。这类抗体可使用常规竞争结合测定鉴别。例如，为了确定抗体是否与参考抗CB1抗体竞争结合，在两种定向中进行上文所描述的结合方法：在第一定向中，在饱和条件下使参考抗体结合至CB1蛋白质(例如CB1细胞外结构域或细胞表面表达的CB1的可溶性部分)，然后评估测试抗体对CB1分子的结合。在第二定向中，在饱和条件下使测试抗体结合至CB1分子，然后评估参考抗体对CB1分子的结合。在两种定向中，如果仅第一(饱和)抗体能够结合至CB1分子，则推断出测试抗体和参考抗体竞争结合至CB1。与参考抗体竞争结合的抗体可能未必结合至与参考抗体相同的抗原决定基，但可例如通过结合重叠或相邻抗原决定基来空间上阻断参考抗体结合。可通过ELISA、流式细胞术或表面等离子体共振(SPR)测定来测量竞争。另外，可使用Octet HTX系统(Pall ForteBioLLC,Fremont,CA 94538)进行交叉竞争和抗原决定基分组测定。

在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:20、32、44、56、68、80、92、104、116、128、140、152、164、176、188、200、212、224、236、248、260、272、284、296、308和320。在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:21、33、45、57、69、81、93、105、117、129、141、153、165、177、189、201、213、225、237、249、261、273、285、297、309和321。在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ IDNO:22、34、46、58、70、82、94、106、118、130、142、154、166、178、190、202、214、226、238、250、262、274、286、298、310和322。在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:26、38、50、62、74、86、98、110、122、134、146、158、170、182、194、206、218、230、242、254、266、278、290、302、314和326。在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:27、39、51、63、75、87、99、111、123、135、147、159、171、183、195、207、219、231、243、255、267、279、291、303、315和327。在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:28、40、52、64、76、88、100、112、124、136、148、160、172、184、196、208、220、232、244、256、268、280、292、304、316和328。

可独立地选择本文所提供的抗CB1抗体的重链和轻链CDR且匹配形成包含来自本文所提供的抗体的任何重链CDR1、CDR2和CDR3；和任何轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其抗原结合片段。也可独立地选择本文所提供的抗体的重链和轻链可变区且匹配形成包含来自本文所提供的抗体的任何重链和轻链的抗体或抗原结合片段。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)链序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含重链序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:17、29、41、53、65、77、89、101、113、125、137、149、161、173、185、197、209、221、233、245、257、269、281、283、305和317。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含轻链序列，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性：SEQ ID NO:23、35、47、59、71、83、95、107、119、131、143、155、167、179、191、203、215、227、239、251、263、275、287、299、311和323。

在某些实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段、CDR、VH、VL、重链和/或轻链包含至少约20％、至少约15％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％保守性变体氨基酸。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH CDR组：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；和(320、321、322)。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VL CDR组：SEQ ID NO:(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)；和(326、327、328)。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的VH/VL组：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312和318/324。

在另一实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链和轻链组：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311和317/323。

在一些实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段结合CB1且展现降低的效应功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、调理作用和转胞吞作用。在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段结合CB1且包含一个或多个降低、削弱或消除一种或多种效应功能的Fc区修饰。例如，在一个实施方案中，本文所公开的抗CB1抗体及其抗原结合片段结合CB1，但展现降低、削弱或不存在的C1q结合和/或CDC和/或ADCC。Fc修饰可为氨基酸插入、缺失或取代，或可被化学修饰。例如，可进行Fc区修饰以提高或降低补体结合，提高或降低ADCC或CDC，或修饰糖基化。各种Fc修饰是本领域中已知的且已描述于例如Labrijin等人(2009)NatureBiotech.27(8):767-771；Greenwood等人(1993)Eur.J.Immunol.23:1098-1104；Mueller等人(1997)Mol.Immunol.34:441-452；和Rother等人(2007)Nature Biotechnol.25:1256-1264中。本领域中已知的Fc修饰中的任一种可应用于本文所公开的示例性CB1抗体以改变效应功能。在一个实施方案中，抗CB1抗体或其抗原结合片段具有某些突变，例如L234A/L235A(“LALA”)、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S和N297Q。

本文所提供的结合蛋白可通过本领域中已知的多种技术中的任一种产生。例如，自宿主细胞表达，其中编码CB1结合蛋白的表达载体通过标准技术转染至宿主细胞中。尽管有可能在原核或真核宿主细胞中表达本文所提供的CB1结合蛋白，但与原核细胞相比哺乳动物宿主细胞更可能组装且分泌恰当折叠且免疫学上活性的结合蛋白。

在用于重组表达CB1结合蛋白的示例性系统中为编码CB1抗体重链和轻链两者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞中。在所述重组表达载体内，CB1抗体重链和轻链序列各自操作性地连接至CMV增强子和启动子调节元件以驱动高水平的基因转录。重组表达载体也携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达CB1抗体重链和轻链，且自培养基回收完整CB1抗体蛋白质。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞且自培养基回收CB1抗体蛋白质。

生物等效物

本发明的抗CB1抗体和抗体片段涵盖具有不同于所描述的抗体但保留结合人类CB1的能力的那些的氨基酸序列的蛋白质。当相比于亲本序列时，这类变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但展现基本上等效于所描述的抗体的生物活性的生物活性。同样地，本发明的编码抗CB1抗体的DNA序列涵盖如下序列：当相比于所公开的序列时，其包含一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，但编码基本上与本发明的抗CB1抗体或抗体片段生物等效的抗CB1抗体或抗体片段。这类变体氨基酸和DNA序列的实例论述于上文。

例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体为如下药物等效物或药物替代物：当在类似实验条件下以单次剂量或多剂量方式以相同摩尔剂量施用时，这些药物等效物或药物替代物的吸收速率和吸收程度不显示显著差异，则将这两种抗原结合蛋白或抗体视为生物等效的。如果这些抗体在吸收程度上而不是在吸收速率上相当，则将一些抗体视为等效的或药物替代物，且又可将其视为生物等效的，这是因为吸收速率的这种差异是故意的且反映在标记中，对于在例如慢性使用方面达到有效的主体药物浓度不是必要的，且对于所研究的特定药物而言被视为医疗上无关紧要的。

在一个实施方案中，两种抗原结合蛋白如果其安全性、纯度和效能方面不存在临床上有意义的差异，则其为生物等效的。在一个实施方案中，如果患者能够在参考产品与生物产品之间转换一次或多次，且相比于没有这类转换的持续疗法，不存在副作用风险的预期增加，副作用包括免疫原性的临床显著变化或有效性减弱，则两种抗原结合蛋白为生物等效的。在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白均通过一种或多种共同的作用机制在一种或多种使用条件下起作用，达到这类机制所已知的程度，则其为生物等效的。

生物等效性可通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括例如(a)人类或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其他生物流体中随时间而变的抗体或其代谢物中的一种或多种的浓度；(b)已与人类体内生物可用性数据相关且合理地预测人类体内生物可用性数据的体外测试；(c)人类或其他哺乳动物中的体内测试，其中测量随时间而变的抗体(或其靶标)的适当急性药理学效应；和(d)建立抗体的安全性、功效或生物可用性或生物等效性的良好对照的临床试验。

抗CB1抗体的生物等效变体可通过例如进行残基或序列的各种取代或使生物活性所不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建。例如，对于生物活性非必需的半胱氨酸残基可缺失或被其他氨基酸置换以阻止在复性后形成不必要或不恰当的分子内二硫桥键。在其他情况下，生物等效抗体可包括包含氨基酸改变的抗CB1抗体变体，这些氨基酸改变修饰抗体的糖基化特征，例如消除或移除糖基化的突变。

物种选择性和物种交叉反应性

本发明也包括结合至人类CB1和来自一种或多种非人类物种的CB1的抗CB1抗体。例如，本发明的抗CB1抗体可结合至人类CB1且可结合至小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、母牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩CB1中的一种或多种。根据本发明的某些实施方案，抗CB1抗体结合至人类CB1而非来自其他物种的CB1。

免疫缀合物

本发明涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)缀合的抗CB1抗体，诸如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。细胞毒性剂包括不利于细胞的任何试剂。用于形成免疫缀合物的适合的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域中已知的且描述于本文中。

多特异性结合蛋白

本发明的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可对一种靶多肽的不同抗原决定基具有特异性或可含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人(1991)J.Immunol.147:60-69；Kufer等人(2004)TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明的抗CB1抗体可连接至其他功能性分子(例如其他肽或蛋白质)或与其他功能性分子共表达。例如，抗体或其片段可功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或以其他方式)至一个或多个其他分子实体，诸如另一抗体或抗体片段以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂对人类CB1或其片段具有特异性，且免疫球蛋白的另一臂对第二治疗靶标具有特异性或与治疗部分缀合。

结合蛋白在各种疾病中的用途

本发明的抗体和结合蛋白可用于治疗、预防和/或改善与CB1表达或活性相关或通过CB1表达或活性介导或可通过阻断CB1与CB1配体(例如大麻素)之间的相互作用或另外抑制CB1活性和/或信号传导和/或促进受体内化和/或减少细胞表面受体治疗的任何疾病或病症。术语“CB1活性为不利的病症”意指罹患病症的受试者中的CB1的存在或活性(例如异常或过度活性)造成病症或疾病的病理生理学或为促进病症或疾病恶化的因子的病症或疾病。因此，CB1活性不利的病症为预期CB1活性降低可缓解病症的症状和/或进程的病症。

本文所提供的结合蛋白分子可用作治疗分子以治疗各种疾病或病况，例如其中CB1蛋白质为不利的。例如，本文所提供的结合分子包括通过过度表达、上调或提高的CB1活性或信号传导或可由其使得健康自我平衡调节机制失效表征的任何疾病或病况。这类疾病和病况包括肥胖症、综合症状肥胖症，包括普拉德-威利综合征、阿尔斯特伦综合征、巴德-毕德氏综合征(Bardet-Biedel syndrome，BBS)、奥尔布赖特遗传性骨营养不良(AHO)和SIM1缺失综合征；糖尿病及相关并发症；血脂异常；肝脏疾病，诸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病和原发性胆汁性肝硬化；纤维化，例如肾脏纤维化；慢性肾脏疾病；肾病；代谢疾病、骨质疏松、动脉粥样硬化、发炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多发性硬化症痉挛、青光眼和尼古丁成瘾。

药物组合物

本发明提供包含抗CB1结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物配制有适合的赋形剂、载剂、预防剂、治疗剂和改善抗CB1结合蛋白的稳定性、递送、耐受性和效果的其他剂。众多适当制剂可发现于所有药学化学家已知的处方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa中。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、冻胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子型或阴离子型)的泡囊(诸如LIPOFECTIN^TM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。也参见Powell等人(1998)J.Pharm.Sci.Technol.52:238-311。

包含本文所提供的CB1结合蛋白的药物组合物用于(但不限于)诊断、检测或监测病症，用于预防、治疗、处理或改善病症或其一种或多种症状，和/或用于研究。

各种递送系统为已知的且可用于施用本发明的药物组合物，例如囊封于脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。组合物可通过任何适宜途径施用，例如通过输液或快速注射、通过经由上皮或黏膜与皮肤衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收且可与其他生物学活性剂一起施用。可全身或局部施用。

施用本文所提供的预防剂或治疗剂的方法包括(但不限于)肠胃外施用(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用、黏膜施用(例如鼻内和口服途径)和经肺施用(例如用吸入器或喷雾器施用雾化化合物)。用于特定施用途径的药物组合物的制剂和各种施用方法所必需的材料和技术是本领域技术人员可用且已知的。

可调节剂量方案以提供最佳所需响应(例如治疗性或预防性响应)。例如，可单次施用大丸剂，可随时间分若干次施用多次剂量，或可如治疗情况的紧急需要所指示而按比例减少或增加剂量。就施用的简便性和剂量的均一性而言，将肠胃外组合物配制成单位剂型尤其有利。术语“单位剂型”是指适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单位；各单位含有经计算结合所需药物载剂产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本文所提供的单位剂型的规格是由以下决定且直接取决于：(a)活性化合物的独特特征和欲达成的特定治疗或预防作用，和(b)用于治疗个体过敏性的这类活性化合物的混配技术中的固有限制。

本发明的药物组合物可用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。另外，关于皮下递送，笔式递送装置易于在递送本发明的药物组合物时应用。这类笔式递送装置可为可再用或抛弃式的。可再用的笔式递送装置通常利用含有药物组合物的可替换套筒。在已施用套筒内的所有药物组合物且套筒为空之后，可容易地丢弃空套筒且用含有药物组合物的新套筒替换。随后可再使用笔式递送装置。在抛弃式笔式递送装置中，不存在可替换套筒。确切地讲，抛弃式笔式递送装置预填充有保存于装置内的储集器中的药物组合物。一旦清空储集器的药物组合物，即抛弃整个装置。

许多可再用笔式和自助注射器递送装置应用于本发明的药物组合物的皮下递送。实例包括(但不限于)AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,CH)、HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TM I、II和III(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPENSTARLET^TM和OPTICLIK^TM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)。应用于本发明的药物组合物的皮下递送的抛弃式笔式递送装置的实例包括(但不限于)SOLOSTAR^TM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)和KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、SURECLICK^TM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET^TM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRA^TM笔(AbbVie,Inc.,Abbott Park,IL)。

在某些情况下，药物组合物可在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201-240)。在另一实施方案中，可使用聚合材料(Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),1974,CRCPres.,Boca Raton,FL)。在另一实施方案中，控制释放系统可靠近组合物的靶标置放，因此仅需要全身性剂量的一部分(Goodson(1984)，Medical Applications of ControlledRelease，上文，2:115-138中)。其他控制释放系统由Langer(1990)Science 249:1527-1533论述于综述中。

可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输液等的剂型。这些可注射制剂可通过公开已知的方法制备。例如，可注射制剂可例如通过将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为注射液的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖及其他辅助剂的等渗溶液等，其可与适当助溶剂(诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物))等)组合使用。采用例如芝麻油、大豆油等作为油性介质，其可与助溶剂(诸如苯甲酸苯甲酯、苄醇等)组合使用。优选将由此制备的注射液填充在适当安瓿中。

有利地，将用于上文所描述的口服或肠胃外用途的药物组合物制备成呈适合于配合活性成分的剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的前述抗体的量通常为单位剂量中每剂型约5mg至约500mg；尤其呈注射液形式，优选地对于其他剂型而言所含的前述抗体为约5mg至约100mg和约10mg至约250mg。

向患者施用的抗体的剂量可根据所述患者的年龄和体型、目标疾病、疾病阶段、性别、医学并发症的存在、其他药物治疗、病况、施用途径等而变化。优选剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明抗体用于治疗与成年患者中的CB1活性相关的病况或疾病时，通常以约0.01至约100mg/kg体重的单次剂量静脉内施用本发明的抗体可为有利的。根据病况的严重程度，可调节治疗的频率和持续时间。施用抗CB1抗体的有效剂量和时程可凭经验确定；例如，可通过周期性评估监测患者进展，且相应地调节剂量。另外，可使用本领域中的众所周知方法进行剂量的种间类推(例如Mordenti等人(1991)Pharmaceut.Res.8:1351-1359)。应进一步理解，对任何特定受试者，特定剂量方案可根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人员的专业判断而随时间调整，且本文所阐述的剂量范围仅为示例性的，且不意欲限制所要求保护的组合物的范围或实践。

组合疗法

本文所提供的结合蛋白也可与一种或多种可用于治疗各种疾病的额外治疗剂一起施用，额外剂由本领域技术人员针对其预期目的进行选择。例如，额外剂可为本领域中公认为可用于治疗通过本文所提供的CB1结合蛋白治疗的疾病或病况的治疗剂。组合也可包括多于一种额外剂。

这类额外治疗活性组分的非限制性实例包括其他CB1拮抗剂(例如第二抗CB1抗体或CB1的小分子抑制剂(例如利莫那班、特拉那班、AM251、AM1387、AM4113、大麻萜酚、伊必那班、奥替那班、溴乙那班、四氢次大麻酚及维拉帕胺及AM6545)、其他CB1家族成员的拮抗剂。

本发明也包括包含本文所提及的抗CB1抗体和额外抑制剂中的任一种的治疗组合，其中所述抑制剂为适体、反义分子、核酶、siRNA、肽抗体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程改造的分子，诸如双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体和最小识别单元)。本发明的抗CB1抗体也可与额外治疗剂组合施用和/或共配制。额外治疗活性组分可在即将施用本发明的抗CB1抗体之前、与施用本发明的抗CB1抗体同时或在施用本发明的抗CB1抗体之后不久施用；(出于本发明的目的，这类施用方案被视为“与”额外治疗活性组分“组合”施用抗CB1抗体)。本发明包括药物组合物，其中本发明的抗CB1抗体与如本文中其他地方所描述的额外治疗活性组分中的一种或多种共配制。

本发明也包括包含“拮抗剂抗体”和“反向激动剂抗体”的组合的组合物和方法。“拮抗剂抗CB1抗体”意指抑制、减少或预防配体(例如大麻素)对CB1的信号传导活性的抗CB1抗体。本发明的拮抗剂抗体的非限制性实例为M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M7-H1、M7-H2、M7-H3、M7-H4、M7-H5、M7-H6、M7-H7、M7-H8、M7-H9、M7-H10、M7-H11、M7-H12、M7-H13、M7-H14、M7-H15、M7-H16、M5-H1、M5-H2。“反向激动剂抗CB1抗体”意指造成诱导与激动剂相反的药理学响应的抗CB1抗体。在激动剂将受体的活性提高至大于其基础水平的情况下，而反向激动剂将活性降低至低于基础水平。本发明的反向激动剂抗体的非限制性实例包括M7。本发明人已构想组合拮抗剂抗体和反向激动剂抗体以便协同或以其他方式改善疗效。因此，本发明包括包含至少一种拮抗剂抗体和至少一种反向激动剂抗体的药物组合物。本发明也包括治疗方法，其包括向受试者施用拮抗剂抗体与反向激动剂抗体的组合(以独立施用或共同制剂形式)。

组合疗法剂包括(但不限于)抗肿瘤剂、放射疗法、化学疗法，诸如DNA烷基化剂、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、抗微管蛋白剂、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(taxol)、多柔比星(doxorubicin)、吉西他滨(gerncitabine)、健择(gemzar)、蒽环霉素(anthracyclines)、阿霉素(adriamycin)、拓朴异构酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康(irinotecan)、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxlb))激酶抑制剂和siRNA。

诊断

本发明在本文中提供诊断应用，包括(但不限于)诊断测定方法、含有一种或多种CB1结合蛋白的诊断试剂盒和调适用于自动和/或半自动系统的方法和试剂盒。所提供的方法、试剂盒和调适可用于检测、监测和/或治疗个体中的疾病或病症。

例如出于诊断目的，也可使用本发明的抗CB1抗体来检测和/或测量样品中的CB1或CB1表达细胞。例如，抗CB1抗体或其片段可用于诊断通过CB1的异常表达(例如过度表达、低表达、缺乏表达等)表征的病况或疾病。CB1的示例性诊断测定可包括例如使获自患者的样品与本发明的抗CB1抗体接触，其中所述抗CB1抗体用可检测标记或报告子分子标记。或者，未标记的抗CB1抗体可与自身可检测地标记的二抗组合用于诊断应用中。适合的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、化学发光物质和放射性物质。适合的酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖、荧光素酶和乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光物质的实例包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白。发光物质的一个实例为鲁米诺(luminol)且适合的放射性物质的实例包括例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho和¹⁵³Sm。

本发明所提供的免疫测定可尤其包括夹心免疫测定、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶倍增免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)、荧光活化细胞分选(FACS)和同质化学发光测定。

可使用化学发光微粒免疫测定，其可使用

自动化分析器(AbbottLaboratories,Abbott Park,IL)。

本发明提供采用质谱的方法且包括(但不限于)MALDI(基质辅助激光解吸/离子化)或SELDI(表面增强激光解吸/离子化)。

使用免疫测定和质谱采集、操作、处理和分析生物学测试样品的方法是本领域技术人员众所周知的。

试剂盒

也提供用于测定测试样品的分析物或其在测试样品中的片段的存在、量或浓度的试剂盒。所述试剂盒包含至少一种用于测定测试样品的分析物或其片段的组分和用于测定测试样品的分析物或其片段的说明书。用于测定测试样品的分析物或其片段的至少一种组分可包括包含如本文所公开的结合蛋白的组合物和/或抗分析物结合蛋白(或片段、变体或其变体的片段)，其任选固定化在固相上。

任选，所述试剂盒可包含校准剂或对照物，其可包含分离或纯化的分析物。所述试剂盒可包含至少一种用于通过免疫测定和/或质谱测定测试样品的分析物的组分。包括分析物、结合蛋白和/或抗分析物结合蛋白或其片段的试剂盒组分可任选使用任何本领域已知的可检测标记标记。在实施本发明时提供的生产材料和方法将是本领域技术人员已知的。

所述试剂盒(或其组分)以及通过测定，诸如如本文所描述的免疫测定确定测试样品中的分析物的存在、量或浓度的方法可被调适用于多种自动化和半自动化系统中(包括其中固相包含微粒的那些)，如例如美国专利第5,089,424号和第5,006,309号中所描述，且如例如阿博特实验室(Abbott Laboratories)(Abbott Park,IL)商业上以

出售。可购自阿博特实验室中的其他平台包括(但不限于)

(参见例如美国专利第5,294,404号)、

EIA(珠粒)和量子TMII以及其他平台。额外地，可在其他型式中，例如在电化学或其他手持式或及时现场护理测定系统上采用测定、试剂盒和试剂盒组分。本发明例如适用于进行夹心免疫测定的市售阿博特及时现场护理(

Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。免疫感应器及其在一次性测试装置中的制造和操作方法描述于例如美国专利第5,063,081号、第7,419,821号、第7,682,833号、第7,723,099号和第9,035,027号；和美国公布第20040018577号和第20060160164号中。

本领域技术人员将容易地显而易知，本文所描述的方法的其他适合修改和改编是明显的且可在不偏离本文所公开的实施方案的范围的情况下使用适合等效物进行。现已详细描述某些实施方案，将自以下实施例更完整理解本发明的实施，本文中展示这些实施例仅用于说明且不应视为以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：针对功能性评价的抗CB1抗体的产生和选择

在CB-1拮抗剂JD5037(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI；目录号1205)存在或不存在下用人类CB-1抗原使CD2F1小鼠免疫以潜在地稳定化蛋白质以使得其在免疫期间以满足要求的构象呈现自身。在两个齿爪中用约5μg/30μl/齿爪的抗原与效价最大金佐剂使小鼠免疫(St.Loui,MO；Sigma Aldrich；目录号T2684)。随后，小鼠一周两次用CpG(InvivoGen,San Diego,CA；目录号ODN1826)和铝胶(Alhydrogel)(InvivoGen,San Diego,CA；目录号vac-alu-250)免疫约30天。在第13天和第26天采集血清以测定抗体效价且其随时间而提高。在第30天处死小鼠且收集腘和腹股沟淋巴结以便融合且在培养基B(未添加养分的RPMI1640(Thermo Fisher Scientific-Gibco,San Diego,CA；目录号11879020)与IMDM(Lonza,Anaheim,CA；目录号12-722F)的1:1混合物)中洗涤，且制备单一细胞悬浮液。自培养物采集P3Ag8.563骨髓瘤细胞(ATCC,Manasas,VA；目录号PTA-9393)且在培养基B中洗涤。以1:1的比率混合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，且使用电融合BTX Harvard设备ECM 2001(BTX HarvardApparatus,Holliston,MA；目录号45-0012)融合。使融合细胞再悬浮于回收培养基C(StemCell Technologies,Seattle,WA；目录号03803)中且在37℃下于T75 cm²烧瓶中使其回收过夜。第二天采集融合细胞且再悬浮于含有抗小鼠IgG FITC克隆检测(MolecularDevices,San Jose,CA；目录号K8220)的杂交瘤选择甲基纤维素培养基D(Stem CellTechnologies,Seattle,WA；目录号03804)中。混合细胞且以每10mL培养基D1×10⁶个接种。在37℃下孵育接种细胞7天。挑选杂交瘤集落且使用克隆Pix2(Molecular Devices,SanJose,CA)，基于集落的尺寸以及指示IgG产量的其展示较强FITC卤基的能力转移至含有杂交瘤生长培养基E(Stem Cell Technologies,Seattle,WA；目录号03805)的96孔组织培养板。当观察到宏观集落时，使用CHO亲本和CHO-huCB-1过度表达细胞筛选上清液的细胞结合。对于这种主要筛选，杂交瘤亲本CHO细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)(Invitrogen,Anaheim,CA；目录号34554)标记且与非CFSE标记的CHO-huCB1过度表达细胞混合以允许两种细胞系的有效和同时筛选且以鉴别huCB-1特异性结合物。选择特异性结合CHO-huCB-1过度表达细胞且不结合亲本CHO细胞的克隆且向前移动以便于验证筛选。选择总共97个克隆以向前移动以便小规模纯化。相关融合和主要筛选的概述显示于表2中。

表2.细胞融合和主要筛选

实施例2：纯化鼠抗huCB-1特异性结合克隆

在50mL低Ig培养基(1:1IMDM(Lonza,Anaheim,CA；目录号12-722F):Ham's F12-K(Gibco,Anheim,CA；目录号21127022)培养基，其具有5％低Ig血清(Invitrogen,GrandIsland,NY；目录号1625007)，含有5mL 100mM丙酮酸钠溶液(Invitrogen,Grand Island,NY；目录号11360070)、5ml 100mM非必需氨基酸(Invitrogen,Grand Island,NY；目录号11140050)和5mL 100mM谷酰胺(Invitrogen,Grand Island,NY；目录号35050061))中于T75cm²烧瓶中进一步扩增基于验证主要筛选选择的杂交瘤克隆持续3-4周。使用标准蛋白质A纯化方法采集和纯化上清液。

实施例3：cAMP测定中小鼠抗CB1抗体的功能性特征

在cAMP测定中针对其拮抗剂活性评价分离的小鼠抗huCB-1抗体。使用过度表达天然Gi偶联野生型G蛋白偶联受体(GPCR)且被设计成检测对受体的激动剂刺激做出响应的细胞内cAMP水平提高的cAMP Hunter^TMCHO-K1 CNR1 Gi细胞系(DiscoverX/Eurofins,Fremont,CA；目录号95-0071C2)来进行cAMP测定。cAMP Hunter^TMCHO-K1 CNR1 Gi细胞用CB1抗体、同种型对照或小分子CB1拮抗剂JD5037处理，然后在毛喉素存在下用30nM CP-55,940(指示为“Plus CP”)进行激动剂激发。也在不添加CP-55,940的情况下测试拮抗剂以确定其是否自身具有促效活性。毛喉素活化酶腺苷酸环化酶且提高cAMP的细胞内水平。对于Gi受体，激动剂结合抑制毛喉素诱发的细胞内cAMP积聚。因此，为了测量Gi偶联受体，在毛喉素存在下添加激动剂化合物CP-55,940。Gi偶联受体的活化因此抑制毛喉素诱发的cAMP产生，且因此，在激动剂加毛喉素存在下产生的剂量响应曲线将具有负斜率。简言之，以1.5×10⁴个细胞/孔在96孔培养板(Costar,Fisher Scientific,San Diego,CA；目录号3909)中将细胞接种于细胞接种2培养基(DiscoverX/Eurofins；Fremont,CA；目录号93-0563R2A)中，且在37℃，5％CO₂下孵育隔夜。第二天，培养基替换为30μl细胞测定缓冲液(CAB；1×HBSS/10nM HEPES(ThermoFisher,Anaheim,CA；目录号分别为14025134和15630080)且用测试抗体或同种型对照(7.5μl 6×浓缩加工稀释液)处理。在37℃，5％CO₂下孵育培养板30分钟。将7.5μl激动剂激发物(0.18μM CP55,940在含有90μM毛喉素的CAB中)添加至各孔中，且在37℃，5％CO₂下再孵育培养板30分钟。遵循制造商说明书，使用

cAMP生物学测定检测试剂盒(DiscoverX/Eurofins；Fremont,CA；目录号90-0075LM25)处理培养板以便cAMP读取。分离的克隆的初始评估以30μg/mL的单一浓度进行。

在所测试的112个克隆中，仅八个克隆展示拮抗活性。在激动剂不存在下两个克隆显示一定程度的拮抗作用，M3和更低程度M1。通过滴定Ab的浓度进一步评价八种抗体M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8以获得剂量响应曲线和实际EC50值(表3和图1)。

实施例4：pERK测定中小鼠抗CB1抗体的功能性特征

在使用cAMP Hunter^TMCHO-K1 CNR1 Gi细胞系(DiscoverX/Eurofins,Fremont,CA；目录号95-0071C2)进行的pERK磷酸化测定中进一步评价在cAMP测定中为功能性拮抗剂的八种抗体。简言之，以2×10⁴个细胞/孔在来自试剂盒-107(DiscoverX/Eurofins,Fremont,CA；目录号92-3107G)加800μg/mL G418的测定完全细胞培养基中将细胞接种于96孔培养板中，且在37℃，5％CO₂下孵育。第二天，培养基替换为100μl/孔的无血清F-12K不足培养基(Invitrogen,Grand Island,NY；目录号11765054)。在37℃，5％CO₂下再孵育培养板一天。在处理当天，F-12K培养基替换为30μl/孔的新鲜F-12K培养基。随后将测试抗体或同种型对照(7.5μl 6×浓缩加工稀释液)添加至孔中，且在37℃，5％CO₂下孵育培养板10分钟。将7.5μl激动剂(包含0.18μM CP 55,940的6倍工作溶液在具有90μM毛喉素的CAB中)添加至各孔中，且在37℃，5％CO₂下再孵育培养板10分钟。遵循制造商说明书，使用中规模发现(MSD)试剂盒(Meso Scale Discovery,Rockville,Maryland；目录号K15107D)处理培养板以便p-ERK/全部ERK(表3和图2)。

表3.小鼠抗huCB-1抗体细胞测定数据的概述

实施例5：小鼠抗CB-1抗体对CB-1CHO过度表达细胞的EC50结合

对于小鼠抗CB1抗体结合亲本CHO细胞、人类CB-1过度表达CHO细胞和小鼠CB-1过度表达CHO细胞的能力，在基于荧光活化细胞分选(FACS)的测定中测试抗体结合以获得结合曲线和EC50值。以v形底96孔聚碳酸酯FACS培养板(Corning,Corning,NY,目录号3357)的每孔1×10⁵个细胞在50μl FACS缓冲剂(1×PBS/2mM EDTA和1％FBS(ThermoFisherScientific,Anaheim,CA；目录号10438-026)中采集、洗涤和分配三种细胞系。以2×浓度在200nM下开始制备的抗体的连续稀释且连续稀释3倍。将滴定抗体添加至含有三种不同细胞系(亲本、人类和小鼠CB-1CHO细胞)的培养板中且在4℃下孵育1小时。用FACS缓冲剂洗涤培养板3次。使细胞再悬浮于50μl山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson Immuno Research,WestGrove,PA；目录号115-035-003)的1/5,000稀释液中，在4℃下孵育30分钟，用FACS缓冲剂洗涤3次，且在BD FACS Canto(BD Biosciences,San Jose,CA；目录号338962)上收集数据，且使用FlowJo(FlowJo LLC,Ashland,OR)分析(表4)。所测试的八种功能性抗体中没有一种是小鼠交叉反应性的(图3)。

表4.用于CB1过度表达细胞的细胞结合亲和力小鼠克隆

克隆	M1	M2	M3	M4	M5	M6	M7	M8
									EC50(nM)	15.7	34.72	61.62	19.19	20.16	43.52	12.97	10.66

实施例6：功能性抗CB-1抗体的EC50分析和构象结合评价

这个实验的目的是确定在中性、拮抗剂或激动剂状态确认下抗CB1拮抗剂抗体是否对CB1具有差异性结合能力。使用四种不同细胞系制剂：CHO-huCB1(内部产生)；与反向激动剂JD5037(Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI；目录号1392116-14-1)一起预孵育的CHO-huCB1；与激动剂CP-55,940(TOCRIS,Minneapolis,MN；目录号0949)一起预孵育的CHO-huCB1和亲本CHO-S细胞(ThermoFisher Scientific,VA；目录号R80007)。将2×10⁷个亲本CHO-S和CHO-hu CB1细胞搁置于FACS缓冲剂中。另外，在4℃下孵育涂布有反向激动剂JD5037或激动剂CP-55,940的2×10⁷个CHO-huCB1细胞1小时。孵育后，在FACS缓冲剂中洗涤这两种涂布的细胞系2次，且在分别含有反向激动剂或激动剂分子的FACS缓冲剂中以2×10⁷再悬浮。在v形底FACS培养板(Corning,Corning,NY；目录号3357)中接种所有四种细胞系，且将预滴定的抗CB1测试抗体添加至细胞中，且通过BD FACS Canto(BD Biosciences,San Jose,CA；目录号338962)评价结合。如图4中所示，抗体未结合至CHO亲本细胞(蓝色曲线)，超过八种功能性Ab(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7和M8)在激动剂或拮抗剂存在下未展示优先结合，如在所有条件下观察到的结合所展示(红色、紫色和绿色曲线)。分别在拮抗剂存在下和在激动剂不存在下，仅2种在cAMP或pERK测定中为另外非功能性的测试抗体展示优先结合。这表明功能性抗CB1抗体可与在已知受体激动剂或拮抗剂存在下实现的结合构象无关。

实施例7：小鼠抗CB1抗体的序列鉴别和分析

八种鼠抗huCB-1抗体的杂交瘤采集为细胞团块，且使用标准小鼠同种型分析ELISA试剂盒(Pierce/ThermoFisher Scientific,San Diego,CA；目录号37503)，上清液用于测定杂交瘤中的每一种的同种型。抗体中的四种(M1、M3、M4和M6)为IgG2a,K，且抗体中的四种(M2、M5、M7和M8)为IgG2b,K。处理团块用于RNA和cDNA，且SMARTER RACE扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA；目录号634859)用于处理cDNA用于测序。抗体中的每一种的同种型用于设计重链恒定区和轻链κ恒定区的反向引物及SeqAmp聚合酶(CloneTech,Mountain View,CA；目录号638504)作为正向引物。包括MOPC21 PNA引物(基于序列合成)以预防通常在测序过程期间出现且可能干扰实际轻链可变区序列的鉴别的异常轻链扩增。鉴别总共8个单一序列和7个单一家族。八个克隆的序列提供于表5中。杂交瘤抗体的重链和轻链的共有序列分别提供于图5A和图5B中。

表5.小鼠-人类Fc嵌合CB1抗体的氨基酸序列

实施例8：针对人源化选择小鼠抗CB1抗体

基于功能数据，使用衍生自PHEnon^TM软件包(Xoma,Berkley,CA)(美国专利第5,766,886号)的预测人类工程改造工具，针对人源化选择小鼠抗huCB-1克隆M7和M5。在查询时提供各克隆的VH和VL序列，且基于来自Kabat数据库的最接近人类生殖系匹配产生输出序列。产生框架区中的突变清单以朝向人类框架匹配演变VH和VL序列。通过一系列准则(美国专利第5,766,886号)评估个别残基的突变风险。累积地，将突变分组以构成“低风险”和“中风险”克隆池。经由同源性建模电子杂交验证输出序列和引入的突变。将最终人源化VH和VL抗体序列克隆到CHO细胞中表达的人类IgG1载体骨架(TCAL DGV载体)中且通过蛋白质-A亲和性色谱根据标准方法纯化。人源化克隆的序列提供在表6中。人源化M7和M5抗体的重链和轻链的共有序列分别提供在图6A和图6B中。

表6.人源化CB1抗体的氨基酸序列

实施例9：细胞结合和功能性测定中的人源化抗CB1抗体的再评价

再评价人源化抗CB1变体结合CHO-huCB-1细胞的能力且与小鼠亲本克隆M5和M7(图7A和图7B)进行比较以确保结合保留。所使用的测定条件与描述于实施例5中的那些类似。在结合分析之后，根据实施例3和4(图8A、图8B、图9A和图9B)，也针对作为cAMP和pERK测定中的拮抗剂的功能评价测试变体以确保在人源化之后保持结合和活性。所有克隆保留其结合和拮抗剂活性。图10显示通过人源化抗CB1 Ab M7-H5和IgG2b型式展示的反向促效作用。

等效物

在不偏离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式体现。前述实施方案因此在所有方面中都将被视为说明性的而非限制本发明。本发明的范围因此由所附权利要求而非由前述描述来指示，且具有权利要求等效性的含义和范围内的所有变化因此都意欲包括在本文中。

Claims (63)

1.一种结合人类大麻素I型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白包含六个互补决定区(CDR)：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中

CDR-H1具有氨基酸序列G-Y-T-F-T-D-Y-W(SEQ ID NO:329的残基26-33)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的G取代为S；位置3处的T取代为E；位置5处的T取代为S或N；位置6处的D取代为R或Y；位置7处的Y取代为H；且位置8处的W取代为A或N；

CDR-H2具有氨基酸序列I-Y-P-Y-D-G-D-T(SEQ ID NO:329的残基51-58)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的I取代为F；位置2处的Y取代为D、S或T；位置3处的P取代为T；位置4处的Y取代为G、D或S；位置5处的D取代为Y或S；位置6处的G取代为S；位置7处的D取代为E、G或R；且位置8处的T取代为A、S或I；

CDR-H3具有氨基酸序列A-R-G-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-W-X₁₀-X₁₁-Y(SEQ ID NO:329的残基98-113)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的A取代为S；位置3处的G取代为S；位置4处的X₁为Q、Y、K、R或G或不存在；位置5处的X₂为E、Y、L或G或不存在；位置6处的X₃为Y或P或不存在；位置7处的X₄为Y、R或E或不存在；位置8处的X₅为G或不存在；位置9处的X₆为T或不存在；位置10处的X₇为N或D或不存在；位置11处的X₈为Y、N、A或G或不存在；位置12处的X₉为N、Y、S、A或R或不存在；位置13处的W取代为Y、A或P；位置14处的X₁₀为L、M、F或G或不存在；位置15处的X₁₁为P、D、A或T或不存在；位置16处的Y取代为V；

CDR-L1具有氨基酸序列Q-X₁-I-S-S-X₂-Y(SEQ ID NO:330的残基27-33)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的Q取代为S或E；位置2处的X₁为E、S、T、N、G或R；位置3处的I取代为V；位置4处的S取代为A、R或G；位置5处的S取代为G、N或T；位置6处的X₂为S、N、肽F-R-Y-S或不存在；且位置7处的Y取代为F、D或N；

CDR-L2具有氨基酸序列：X₁-T-S(SEQ ID NO:330的残基51-53)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的X₁为A、Y、G、R、D或S；位置2处的T取代为A；位置3处的S取代为R；且

CDR-L3具有氨基酸序列：Q-Q-Y-X₁-S-X₂-P-Y-T(SEQ ID NO:330的残基91-99)或通过至少一个氨基酸残基取代实现的所述氨基酸序列的修饰，其中位置1处的Q取代为L或H；位置2处的Q取代为H；位置3处的Y取代为S或G；位置4处的X₁为S、W、H、Y、N或I；位置5处的S取代为E、R、G、T或N；位置6处的X₂为Y、I、S、T、L或W；且位置8处的Y取代为P、L、F或不存在；且其中至少一个氨基酸残基的所述取代、添加或缺失不抑制所述抗体或其抗原结合片段结合人类CB1的能力。

2.一种结合人类大麻素1型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列的CDR和可变轻链(VL)结构域序列的CDR，其中所述VH结构域序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或其中所述VL结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

3.一种结合人类大麻素I型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列和可变轻链(VL)结构域序列，其中所述VH结构域序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或其中所述VL结构域选自由以下组成的组：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

4.如权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的VH/VL对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312和318/324。

5.如权利要求4所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的VH/VL对：SEQ ID NO:18/24、30/36、42/48、54/60、66/72、78/84、90/96、102/108、114/120、126/132、138/144、150/156、162/168、174/180、186/192、198/204、210/216、222/228、234/240、246/252、258/264、270/276、282/288、294/300、306/312和318/324。

6.如权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCDR组(HCDR1、HCDR2、HCDR3)：(20、21、22)；(32、33、34)；(44、45、46)；(56、57、58)；(68、69、70)；(80、81、82)；(92、93、94)；(104、105、106)；(116、117、118)；(128、129、130)；(140、141、142)；(152、153、154)；(164、165、166)；(176、177、178)；(188、189、190)；(200、201、202)；(212、213、214)；(224、225、226)；(236、237、238)；(248、249、250)；(260、261、262)；(272、273、274)；(284、285、286)；(296、297、298)；(308、309、310)；和(320、321、322)；以及选自由以下组成的组的LCDR组(LCDR1、LCDR2、LCDR3)：(26、27、28)；(38、39、40)；(50、51、52)；(62、63、64)；(74、75、76)；(86、87、88)；(98、99、100)；(110、111、112)；(122、123、124)；(134、135、136)；(146、147、148)；(158、159、160)；(170、171、172)；(182、183、184)；(194、195、196)；(206、207、208)；(218、219、220)；(230、231、232)；(242、243、244)；(254、255、256)；(266、267、268)；(278、279、280)；(290、291、292)；(302、303、304)；(314、315、316)；和(326、327、328)。

7.如权利要求6所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的(HCDR组/LCDR组)对：SEQ ID NO:(20、21、22/26、27、28)；(32、33、34/38、39、40)；(44、45、46/50、51、52)；(56、57、58/62、63、64)；(68、69、70/74、75、76)；(80、81、82/86、87、88)；(92、93、94/98、99、100)；(104、105、106/110、111、112)；(116、117、118/122、123、124)；(128、129、130/134、135、136)；(140、141、142/146、147、148)；(152、153、154/158、159、160)；(164、165、166/170、171、172)；(176、177、178/182、183、184)；(188、189、190/194、195、196)；(200、201、202/206、207、208)；(212、213、214/218、219、220)；(224、225、226/230、231、232)；(236、237、238/242、243、244)；(248、249、250/254、255、256)；(260、261、262/266、267、268)；(272、273、274/278、279、280)；(284、285、286/290、291、292)；(296、297、298/302、303、304)；(308、309、310/314、315、316)；和(320、321、322/326、327、328)。

8.如权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HC/LC对：SEQ ID NO:17/23、29/35、41/47、53/59、65/71、77/83、89/95、101/107、113/119、125/131、137/143、149/155、161/167、173/179、185/191、197/203、209/215、221/227、233/239、245/251、257/263、269/275、281/287、283/289、305/311和317/323。

9.一种结合人类大麻素1型受体(CB1)(SEQ ID NO:1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重链(VH)结构域序列的CDR和可变轻链(VL)结构域序列的CDR，其中所述VH结构域序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性：SEQ IDNO:18、30、42、54、66、78、90、102、114、126、138、150、162、174、186、198、210、222、234、246、258、270、282、294、306和318，和/或所述VL结构域序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312和324。

10.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:114中且所述VL阐述于SEQ ID NO:120中。

11.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:126中且所述VL阐述于SEQ ID NO:132中。

12.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:138中且所述VL阐述于SEQ ID NO:144中。

13.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:150中且所述VL阐述于SEQ ID NO:156中。

14.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:162中且所述VL阐述于SEQ ID NO:168中。

15.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:174中且所述VL阐述于SEQ ID NO:180中。

16.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:186中且所述VL阐述于SEQ ID NO:192中。

17.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:198中且所述VL阐述于SEQ ID NO:204中。

18.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:210中且所述VL阐述于SEQ ID NO:216中。

19.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:222中且所述VL阐述于SEQ ID NO:228中。

20.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:234中且所述VL阐述于SEQ ID NO:240中。

21.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:246中且所述VL阐述于SEQ ID NO:252中。

22.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:258中且所述VL阐述于SEQ ID NO:264中。

23.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:270中且所述VL阐述于SEQ ID NO:276中。

24.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:282中且所述VL阐述于SEQ ID NO:288中。

25.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:294中且所述VL阐述于SEQ ID NO:300中。

26.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:306中且所述VL阐述于SEQ ID NO:312中。

27.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH阐述于SEQ ID NO:318中且所述VL阐述于SEQ ID NO:324中。

28.如权利要求1至27中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人类或人源化抗体。

29.如权利要求1至28中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab)₂片段或scFv片段。

30.如权利要求1至29中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的人类Fc区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM Fc。

31.如权利要求1至29中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含修饰的人类Fc区。

32.如权利要求31所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含修饰的人类Fc区，其包含选自由以下组成的组的突变：L234A/L235A、S228P、A330S、P331S、E233P/L234V/L235A、A327G/A330S/P331S、L234F/L235E/P331S和N297Q。

33.一种多特异性结合蛋白，其包含如权利要求1至32中任一项所述的抗原结合片段。

34.如权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制CB1信号传导活性。

35.如权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段增强或活化CB1信号传导活性。

36.如权利要求1至33中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为CB1信号传导活性的反向激动剂。

37.如权利要求1至36中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。

38.如权利要求1至36中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为完全人类抗体。

39.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与如权利要求1至38中任一项所述的分离的抗人类CB1抗体或其抗原结合片段竞争结合至CB1。

40.如权利要求39所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中竞争结合的所述抗体或其抗原结合片段为人类或人源化抗体。

41.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至与如权利要求1至38中任一项所述的抗体或抗原结合片段实质上相同的CB1抗原决定基。

42.如权利要求41所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中特异性结合至与CB1抗原决定基实质上相同的抗体或其抗原结合片段为人类或人源化抗体。

43.一种结合至大麻素1型受体(CB1)的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对CB1具有约1μM或小于1μM的结合亲和力Kd。

44.如权利要求43所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对CB1具有约100nM或小于100nM的结合亲和力Kd。

45.如权利要求1至44中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段展现相比于利莫那班降低的脑渗透。

46.如权利要求1至44中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段抑制相比于利莫那班高至少2倍的CB1信号传导。

47.如权利要求1至44中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段展现相对于利莫那班降低的CNS副作用。

48.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

49.一种表达载体，其包含如权利要求48所述的核酸分子。

50.一种宿主细胞，其包含如权利要求49所述的表达载体。

51.一种调节CB1信号传导的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。

52.一种拮抗CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。

53.一种促效CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。

54.一种反向促效CB1的方法，所述方法包括使表达CB1的细胞与如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。

55.一种药物组合物，其包含如权利要求1至47中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。

56.一种用于抑制有需要的受试者的CB1的生物活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求55所述的药物组合物，由此抑制所述受试者中的CB1蛋白质的活性。

57.一种用于治疗与CB1活性相关的疾病的方法，所述方法包括向罹患所述疾病的受试者施用如权利要求55所述的药物组合物。

58.一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导调节有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括施用如权利要求55所述的药物组合物。

59.一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导的拮抗作用或反向促效作用有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求55所述的药物组合物。

60.一种治疗有需要的受试者的对CB1信号传导的促效作用有响应的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求55所述的药物组合物。

61.一种用于诊断与CB1相关的疾病或病症的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：肥胖症、综合症状肥胖症，包括普拉德-威利综合征(PWS)、阿尔斯特伦综合征、巴德-毕德氏综合征(BBS)、奥尔布赖特遗传性骨营养不良(AHO)和SIM1缺失综合征；糖尿病及相关并发症；血脂异常；肝脏疾病，诸如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病和原发性胆汁性肝硬化；纤维化，例如肾脏纤维化；慢性肾脏疾病；糖尿病神经病变、病灶性区段性肾小球硬化症、肾病；代谢疾病、骨质疏松、动脉粥样硬化、发炎疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、全身性硬化症、多发性硬化症痉挛、青光眼和尼古丁成瘾。

63.一种包含如权利要求1至47中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的抗体缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自由以下组成的组的剂缀合：治疗剂、细胞毒性剂、免疫粘附分子和显像剂。

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