BR112020022010A2 - células exterminadoras naturais modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico com bloqueio de checkpoint imunológico - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para a produção de células NK que expressam receptores de antígeno quimérico e não têm expressão de CISH. Além disso, são fornecidos métodos de tratamento de doenças através da administração das células NK CAR.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLU- LAS EXTERMINADORAS NATURAIS MODIFICADAS PARA EX- PRESSAR RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO COM BLO- QUEIO DE CHECKPOINT IMUNOLÓGICO".

[001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos provisórios de patente US nsº 62/666.665, depositado no dia 3 de maio de 2018 e 62/666.965, depositado em 4 de maio de 2018, ambos aqui incorpora- dos na íntegra, a título de referência

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequências que está contida no arquivo cha- mado "UTFC1366WO.txt", que é de 2 KB (conforme medido no Micro- soft Windows) e foi criada em 3 de maio de 2019, é depositada aqui por apresentação eletrônica e é incorporada por referência.

ANTECEDENTES

1. Campo

[003] A presente invenção refere-se em geral aos campos da imunologia e medicina. Mais particularmente, diz respeito às células exterminadoras naturais (NK) modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico com uma expressão perturbada de um gene de checkpoint imunológico.

2. Descrição da técnica relacionada

[004] Nos últimos anos, a terapia de células adotiva que usa célu- las T autólogas transduzidas com receptor de antígeno quimérico (CAR) provou ser uma abordagem muito poderosa para o tratamento do câncer, levando a aprovações da Food and Drug Administration (FDA) para leucemia de células B e linfoma. No entanto, permanecem desafios, incluindo a desassociação da citotoxicidade contra as células tumorais da toxicidade sistêmica, encontrando soluções para as recidi- vas negativas do antígeno alvo, e desenvolvendo produtos universais de terapia celular disponíveis comercialmente para evitar os obstácu-

los logísticos da geração de produtos autólogos, ao mesmo tempo em que gerencia os desafios dos produtos de células T alogênicas, como a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) (Hartmann et al., 2017).

[005] As células exterminadoras naturais (NK) são contendores atraentes, uma vez que mediam a citotoxicidade eficaz contra as célu- las tumorais e, ao contrário das células T, não têm potencial para cau- sar GVHD no ambiente halogênico. Assim, as células NK poderiam ser disponibilizadas como um produto de terapia celular disponível comer- cialmente para uso clínico imediato (Daher et al., 2018). O sangue do cordão umbilical (CB) é uma fonte prontamente disponível de células NK halogênicas com potencial para ampla escalabilidade clínica. A ati- vidade potente das células NK transduzidas pelo CAR tem sido com- provada no ambiente pré-clínico em diferentes modelos de tumores, e ensaios clínicos de células NK halogênicas transduzidas pelo CAR es- tão atualmente em andamento (Mehta et al., 2018). Enquanto as mo- léculas do checkpoint imunológico, como PD-1, estão sendo direcio- nadas para melhorar a função das células T-CAR, nenhuma molécula do checkpoint imunológico foi direcionada nas células NK-CAR até o momento (Gay et al., 2017).

[006] As células NK funcionais podem ser derivadas de várias fontes. As células NK autólogas podem ser geradas in vitro de forma reprodutível, mas têm atividade limitada contra tumores autólogos, que podem não ser superados pela modificação de CAR. O sangue do cordão umbilical (CB) é uma fonte prontamente disponível de células NK halogênicas com vantagens claras. O CB está disponível como um produto congelado disponível comercialmente, uma vantagem que foi reforçada por métodos para gerar um grande número de células NK altamente funcionais a partir de unidades de CB congeladas ex vivo. A geração de células NK transduzidas por CAR a partir de unidades de

CB congeladas armazenadas em grandes inventários globais do ban- co de CB mantém a promessa de ampla escalabilidade que não pode ser replicada com doadores adultos individuais que exigem triagem e leucoferese. No entanto, uma grande desvantagem das células NK é a sua falta de persistência após a transferência adotiva, na ausência de suporte às citocinas. Portanto, a modificação de células NK-CAR para expressar citocinas para aumentar sua persistência é importante para sua atividade clínica. Ao fazê-la, as células NK-CAR podem modular positivamente as moléculas do checkpoint, o que pode limitar a sua funcionalidade. Portanto, é necessário eliminar moléculas do check- point nas células NK modificadas por CAR para melhorar a sua potên- cia e atividade clínica.

SUMÁRIO

[007] Em uma primeira modalidade, a presente divulgação forne- ce células exterminadoras naturais (NK) isolada projetada para ex- pressar (1) um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou um receptor de célula T (TCR) e (2) IL-15 humana (hIL-15) e para não ter essenci- almente nenhuma expressão de CISH. Em alguns aspectos, a célula NK foi modificada para expressar um CAR. Em certos aspectos, a cé- lula NK foi modificada para expressar um TCR. Em aspectos específi- cos, a célula NK foi modificada para expressar um CAR e TCR ou 3 ou 4 receptores de antígeno. Em alguns aspectos, as células NK são compatíveis com GMP. Em certos aspectos, as células NK são halo- gênicas ou autólogas.

[008] Em alguns aspectos, a célula NK é derivada do sangue do cordão umbilical, sangue periférico, medula óssea, células CD34+ ou iPSCs. Em certos aspectos, a célula NK é derivada do sangue do cor- dão umbilical. Em aspectos específicos, o sangue do cordão umbilical foi previamente congelado.

[009] Em certos aspectos, o CAR e/ou TCR tem especificidade antigênica para CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, ligantes NKG2D, MICA/MICB, antígeno carcinoembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumo- ral epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação ao folato, glicoproteína gp120 do envelope do HIV-1, glicoproteína gp41 do envelope do HIV-1, GD2, CD123, CD33, CD30, CD56, c-MET, mesotelina, GD3, HERV-K, IL- 11Ralpha, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, EG- FRvIII, TRAIL/DR4 e/ou VEGFR2.

[0010] Em aspectos adicionais, a célula NK expressa ainda uma segunda ou terceira citocina. Em aspectos específicos, a citocina é IL- 15, IL-21 ou IL-12.

[0011] Em outra modalidade, é fornecido um método para a pro- dução de células NK das modalidades compreendendo a obtenção de uma população inicial de células NK; a cultura da população inicial de células NK na presença de células apresentadoras artificiais (APCs); a introdução de um vetor de expressão CAR e/ou TCR nas células NK; expansão das células NK na presença de APCs, obtendo assim célu- las NK expandidas; e interrupção da expressão de CISH nas células NK expandidas.

[0012] Em alguns aspectos, a interrupção da expressão compre- ende o uso do silenciamento gênico mediado por CRISPR. Em certos aspectos, o silenciamento gênico mediado por CRISPR compreende colocar as células NK CAR em contato com sgRNA e Cas9. Em as- pectos específicos, o sgRNA tem como alvo o éxon 4 da CISH. Em aspectos específicos, o sgRNA compreende crRNA1 que tem a se- quência AGGCCACATAGTGCTGCACA (SEQ ID NO:1) e crRNA2 que tem a sequência TGTACAGCAGTGGCTGGTGG (SEQ ID NO:2).

[0013] Em alguns aspectos, a população inicial de células NK é obtida isolando células mononucleares usando um gradiente de densi-

dade ficoll-paque. Em aspectos específicos, as APCs são APCs com radiação gama. Em alguns aspectos, as APCs são APCs universais (uAPCs). Em aspectos específicos, as APCs são modificadas para ex- pressar 41BB e IL-21. Em alguns aspectos, as uAPCs são modificados para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL). Em aspectos es- pecíficos, as células NK e as APCs estão presentes em uma razão de 1:1 a 1:10, como uma razão de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. Em certos aspectos, as células NK e as APCs estão presen- tes em uma razão de 1:2.

[0014] Em certos aspectos, as células NK em cultura com APCs são ampliadas ainda mais na presença de IL-2. Em certos aspectos, a IL-2 está presente em uma concentração de 100-300 U/mL, como 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 ou 300 U/mL. Em alguns aspectos, a IL-2 está presente em uma concentração de 200 U/mL.

[0015] Em alguns aspectos, a introdução compreende a transdu- ção. Em certos aspectos, a construção de expressão de CAR e/ou TCR é um vetor lentiviral ou vetor retroviral.

[0016] Em aspectos específicos, o CAR e/ou TCR tem especifici- dade antigênica para CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, ligantes NKG2D, MICA/MICB, an- tígeno carcinoembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação ao folato, glicoprote- ína gp120 do envelope do HIV-1, glicoproteína gp41 do envelope do HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-MET, mesotelina, GD3, HERV-K, IL-11Ralpha, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4 e/ou VEGFR2.

[0017] Em alguns aspectos, a construção de expressão de CAR e/ou TCR expressa ainda uma citocina, como 2 ou 3 citocinas. Em al-

guns aspectos, a citocina é IL-15, IL-21 ou IL-12.

[0018] Em alguns aspectos, a célula NK ativou o alvo mamífero de sinalização de rapamicina (mTOR) em comparação com as células NK com expressão CISH. Em certos aspectos, a célula NK aumentou a sinalização JAK/STAT em comparação com uma célula NK com ex- pressão CISH.

[0019] Em aspectos adicionais, o método compreende adicional- mente a criopreservação da população de células NK expandidas.

[0020] Além disso, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma população de células NK das modalidades ou células NK produzidas pelo método das modalidades e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, é fornecida uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de células NK das modalidades ou células NK produzidas pelo método das modalidades para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

[0021] Em uma outra modalidade, é fornecido o uso de uma com- posição compreendendo uma quantidade eficaz de células NK, de acordo com as modalidades, ou células NK produzidas pelo método, de acordo com as modalidades para o tratamento de um distúrbio imunorrelacionado em um indivíduo.

[0022] Uma modalidade adicional fornece um método para tratar um distúrbio imune relacionado em um indivíduo compreendendo ad- ministrar uma quantidade eficaz de células NK, de acordo com as mo- dalidades, ou células NK produzidas pelo método, de acordo com as modalidades, ao indivíduo.

[0023] Em alguns aspectos das modalidades acima, o distúrbio imunorrelacionado é um câncer, um distúrbio autoimune, uma doença de enxerto-contra-hospedeiro, uma rejeição de aloenxerto, ou uma condição inflamatória. Em certos aspectos, o distúrbio imune relacio- nado é uma condição inflamatória e as células imunes não têm, es-

sencialmente, expressão de receptor glicocorticoide. Em certos aspec- tos, o indivíduo foi ou está sendo administrado com uma terapia de esteroide. Em alguns aspectos, as células NK são autólogas ou halo- gênicas. Em alguns aspectos, o distúrbio imune relacionado é um cân- cer. Em alguns aspectos, o câncer é um câncer sólido ou uma malig- nidade hematológica.

[0024] Em aspectos adicionais das modalidades acima, o método compreende ainda a administração de, pelo menos, um segundo agente terapêutico. Em alguns aspectos, o pelo menos segundo agen- te terapêutico compreende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radio- terapia ou bioterapia. Em alguns aspectos, as células NK e/ou pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados por via in- travenosa, intraperitoneal, intratraqueal, intratumoral, intramuscular, endoscopicamente, intralesional, percutaneamente, subcutaneamente, regionalmente ou por injeção direta ou perfusão.

[0025] Em alguns aspectos, as células NK com quase nenhuma expressão de CISH têm função melhorada em comparação com as células NK com expressão de CISH. Em certos aspectos, a função melhorada é medida pela coloração intracelular para IFN-γ e TNF-α, degranulação de CD107a e morte tumoral por ensaio de liberação de 51Cr. Em alguns aspectos, a função melhorada é medida pela expres- são aumentada de granzima-b, perforina, TRAIL, CD3z, Eomes, T-bet, DAP12, DNAM, CD25 e/ou Ki67.

[0026] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção serão visíveis a partir da seguinte descrição detalhada. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicando modalidades preferidas da invenção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que diversas mudan- ças e modificações dentro do espírito e o escopo da invenção se tor- nará evidente aos versados na técnica a partir desta descrição deta-

lhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais alguns aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais destes desenhos, em combinação com a des- crição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0028] Figuras 1A-1B: CIS é regulado positivamente em NK CAR19/IL-15 e correlaciona-se com a diminuição da função de forma dependente do tempo. (FIG. 1A) qPCR para o mRNA de CISH foi rea- lizada no dia 0 (células NK em repouso na linha de base) e no dia 7 e 14 após a transdução de CAR. 18S foi usado como gene constitutivo. O mRNA de CISH é regulado positivamente em conformidade com o tempo, seguindo a expansão NKCAR19/IL-15. (FIG. 1B) Ensaio de li- beração de cromo foi realizado para avaliar a citotoxicidade ou NK CAR19/IL-15 no dia 7 e no dia 14 após a transdução de CAR. Os re- sultados mostram diminuição da citotoxicidade com o tempo que se correlaciona com a regulação positiva de CISH.

[0029] Figuras 2A-2C: CISH KO eficiente usando CRISPR-CAS para direcionar o éxon 4 de CISH. O CRISPR-Cas9 foi usado para di- recionar o éxon 4 de CISH usando 2 gRNAs no dia 14, após a expan- são de NK. A eficiência da inativação foi avaliada por (FIGS. 2A) PCR para o gene CISH no dia 3 após KO, (FIG. 2B) western blot para prote- ína CIS no dia 7 (FIG. 2C) citometria de fluxo no dia 7.

[0030] Figuras 3A-3D: transdução de CISH KO e CAR19/IL-15 me- lhoram a função e a citotoxicidade sinergicamente. No dia 14 seguinte à transdução de CAR (FIGS. 3A, B) foram realizados estudos funcio- nais que mostraram aumento da produção e desgranulação de citoci- nas em CISH KO NT e CISH CAR19/IL-15 em relação às contrapartes do WT. (FIGS. 3C, D) Ensaio de liberação de cromo mostrando uma citotoxicidade melhorada nos grupos CISH KO.

[0031] Figuras 4A-4D: CISH KO nas células NK NT e NKCAR19/IL-15 melhora a formação da sinapse imune com as células do linfoma de Raji. No dia 14, após a transdução de CAR, foi realizada microscopia confocal para comparar a formação da sinapse imune contra as células Raji de CISH KO NT e CAR19/IL-15 vs cas9 contro- les (FIG. 4A) Acumulação de F-actina e CAR na sinapse é aumentada (FIG. 4B) MTOC para a distância da sinapse é encurtada (FIG. 4C) CAR com a colocalização de F-actina é aumentado na sinapse imune (FIG. 4D) tendência de aumento na colocalização de CD19, F-actina e CAR na sinapse imune.

[0032] Figuras 5A-5B: células CISH KO CAR19/IL-15 NK melho- ram o controle e a sobrevivência do tumor em um modelo de camun- dongo com linfoma de Raji. No dia 0, os camundongos foram injetados com células Raji (20K/camundongo) isoladamente no grupo 1 ou em combinação com as diferentes preparações NKCAR19/IL-15 (107 célu- las/camundongo WT, Cas9 controle ou CISH KO). (FIG. 5A) BLI mos- trou melhor controle tumoral no grupo que recebeu as células CISH KO. (FIG. 5B) Curva de sobrevivência mostrando aumento da sobrevi- vência no grupo que recebeu as células CISH KO.

[0033] Figura 6: No momento do sacrifício, a análise da citometria de fluxo foi realizada em sangue, baço, fígado, BM processados para avaliar a presença de Raji e NK CAR. No camundongo que recebeu células CISH KO CAR19/IL-15, não houve evidência de linfoma de Raji e uma população clara de células NK que expressam CAR foi detecta- da em PB e órgãos.

[0034] Figuras 7A-7E: CISH KO eficiente usando CRISPR-Cas9 para direcionar o éxon 4 de CISH. (FIG. 7A) resultados de RTqPCR mostrando aumento dependente do tempo na transcrição de CISH nos dias 14 e 21 em ambas as células NT e NK transduzidas com iC9/CAR19/IL-15. (FIG. 7B) representação esquemática de CISH KO mediado por CRISPR usando dois RNA guia diferentes (gRNA) (SEQ ID NOs:1-2) direcionando o éxon 4. (FIG. 7C) resultados de PCR reali- zada 2 dias após a eletroporação RNP, mostrando a eficiência de CISH KO com uma indel > 90%. (FIG. 7D) Western blot feito 7 dias após a eletroporação RNP mostrando perda percentual de proteína, β- actina foi usado como gene de referência. (FIG. 7E) resultados do se- quenciamento de Sanger que mostram picos múltiplos nas amostras NT CISH KO e CAR CISH KO em comparação com seus respectivos controles de simulação cas9, que correspondem aos eventos media- dos pela CRISPR de NHEJ. As setas indicam a posição do par de ba- se onde a edição genética começa.

[0035] Figuras 8A-8F: CISH KO melhora a função e a citotoxicida- de nas células NT e NK transduzidas por iC9/CAR19/IL-15. Estudos funcionais comparando a atividade de diferentes condições das células NK (NT, NT CISH KO, iC9/CAR19/IL-15, iC9/CAR19/il-15 CISH KO) com o linfoma de Raji (FIG. 8 A) Gráficos representativos de FACS da expressão IFNϒ, TNFα e CD107a. (FIG. 8B) gráficos de barras do per- centual de expressão de IFNϒ, TNFα e CD107a em células NK, setas representam SD (n = 6). (FIG. 8C) ensaio de liberação de cromo a diferentes razões E:T (5:1, 2:1, 1:1, 0.5:1) (n=3). (FIG. 8D) microscopia confocal mostrando formação de sinapse imune entre as células NK e as células do linfoma de Raji (n=3). (FIG. 8E) gráfico de MTOC para distância de sinapse. (FIG. 8F) experimento incucyte mostrando per- centual de morte do linfoma de Raji acima de 12 horas em razão dife- rente E:T 1:1, 1:2 e 1:4, comparando iC9/CAR19/IL-15 vs iC9/CAR19/il-15 CISH KO.

[0036] Figuras 9A-9H: Fenótipo e assinatura molecular das células CISH KO iC9/CAR19/Il-15 NK. (FIG. 9A) mapa de calor comparativo dos dados de citometria de massa exibindo a mediana da expressão do marcador em CISH KO iC9/CAR19/IL-15 em comparação com o Cas9 controle iC9/CAR19/IL-15 (n = 2) mostrando uma expressão infe- rior ou superior em amostras CISH KO. (FIG. 9B) gráficos representa- tivos de Visne de marcadores selecionados mostrando uma expressão aumentada em CISH KO iC9/CAR19/IL-15 em comparação com o Cas9 controle iC9/CAR19/IL-15. Inserir o tsne-1 vs. tsne2. (FIG. 9C) mapa de calor mostrando genes diferencialmente expressos nas célu- las iC9/CAR19/IL15 NK CTRL vs CISH KO (n=2). (FIG. 9D) gráficos de análise de enriquecimento do conjunto genético mostrando enriqueci- mento na sinalização de TNFα via resposta de NFKB e IFNϒ nas célu- las CISH KO iC9/CAR19/IL15 NK em comparação com as células Cas9 controle iC9/CAR19/IL15 NK. (FIG. 9E) gráfico Volcano mos- trando alguns dos genes que são regulados positivamente nas células CISH KO iC9/CAR19/IL15 NK em comparação com células Cas9 con- trole iC9/CAR19/IL-15 NK (n=2). (FIG. 9F) gráficos de análise de enri- quecimento do conjunto genético mostrando enriquecimento na sinali- zação de IL-2/STAT5, sinalização de STAT3/IL-6 e resposta inflamató- ria nas células CISH KO iC9/CAR19/IL15 NK comparadas com as cé- lulas Cas9 controle iC9/CAR19/IL15 NK. (FIG. 9G) Histogramas repre- sentativos mostrando melhora da regulação positiva de p-STAT5, p- STAT3 e p-PLCg1 nas células CISH KO iC9/CAR19/IL15 NK em com- paração com as células Cas9 controle iC9/CAR19/IL15 NK após cocul- tura com células do linfoma de Raji durante 30 min. (FIG. 9H) gráficos de barras mostrando MFI de p-STAT5, p-STAT3 e p-PLCg1 em células Cas9 controle vs CISH KO iC9/CAR19/IL15 NK.

[0037] Figuras 10A-10L: CISH KO reprograma o metabolismo das células iC9/CAR19/IL-15 NK. (FIG. 10A) análise GSEA mostrando en- riquecimento em conjuntos de genes de MTORC1, glicólise e hipóxia. (FIG. 10B) mapa térmico mostrando expressão diferencial de genes associados às diferentes vias metabólicas enriquecidas. (FIG. 10C)

análise de rede mostrando genes regulados positivamente (círculos) associados a vias metabólicas enriquecidas (nós): São mostradas as sinalizações de IL-2/STAT5 (marrom), mTORC1, glicólise e hipóxia, bordas entre a via e genes específicos. (FIG. 10D) Diagrama esque- mático representando a hipótese de como a deleção de CIS modula a via metabólica de iC9/CAR19/IL-15 através da regulação positiva de MTORC1, HIF-1a e glicólise. CISH KO modula a aptidão metabólica das células NK em resposta às células tumorais de Raji. (FIGS. 10E- 10F) Ensaios de cavalos-marinhos mostrando os resultados de ECAR para NT, NTKO, CAR, CARKO após cocultura com Raji durante 2 ho- ras. (FIG. 10G) Resultados do teste colorimétrico de glicose realizado no sobrenadante coletado de poços em que diferentes condições das células NK foram cocultivadas com Raji por 4h. (FIG. 10H) Via da gli- cólise gerou a via IPA mostrando a regulação positiva das enzimas de glicólise representadas pelos nós coloridos em vermelho. (FIG. 10I) Intensidade de fluorescência média (MFI) do fosfo-S6 no CAR e CAR CISH KO. (FIG. 10J) Ensaio de cavalos-marinho mostrando os resul- tados de OCR para NT, NTKO, CAR, CARKO. (FIGS. 10K-10L) Resul- tados de microscopia confocal avaliando lisossomos, mitocôndrias e núcleos e comparando estatisticamente seus números e volumes entre NTcas9 e NTKO, CAR cas9 e CAR KO.

[0038] As Figuras 11A-11I: células CISH KO iC9/CAR19/IL-15 NK melhoram o controle e a sobrevivência do tumor em um modelo de camundongo com linfoma de Raji mesmo em doses de infusão baixas. (FIG. 11A) Diagrama esquemático representando o cronograma dos experimentos in vivo. (FIG. 11B) Resultados de imagiologia biolumi- nescente (BLI) e (FIG. 11C) curvas de sobrevivência comparando os grupos de camundongos que receberam Raji sozinho (n = 5) vs Raji + NT (n = 5) vs Raji + NT cas9 CTRL (n = 5) vs Raji + NT CISH KO (n = 5). (FIG. 11 D) Percentagem de células NK fora das células CD45+ presentes no sangue periférico de camundongos comparando células Cas9 controle iC9/CAR19/IL-15 NK vs CISH KO em dias diferentes. (FIG. 11E) resultados de imagiologia BLI (FIG. 11F) radiação média (FIG. 11 G) curvas de sobrevivência e (FIG. 11H) curvas de peso cor- poral comparando os seguintes grupos de camundongos apenas com Raji (n=5) vs Raji+ iC9/CAR19/IL-15 3x10e6 cas9 controle (n=5) vs iC9/CAR19/IL-15 3x10e6 CISH KO (n=5) vs iC9/CAR19/IL-15 10x10e6 cas9 controle (n=5) vs iC9/CAR19/IL-15 10x10e6 CISH KO (n=3). h, imagens de patologia representativas do fígado (painéis esquerdos) e medula óssea (painéis direitos) com coloração H&E nos painéis supe- riores e coloração imuno-histoquímica CD20 em painéis inferiores comparando os grupos de Raji sozinho vs CAR19/IL-15 CTRL (10x10e6) vs CAR19/IL-15 CISH KO (10x10e6). (FIG. 11I) Gráficos de massa corporal de camundongos ao longo do tempo entre os diferen- tes grupos.

[0039] Figuras 12A-12D: Identificação de locais fora do alvo de Cas9 por GUIDE-Seq e quantificação de locais de clivagem fora do alvo de Cas9 potenciais usando a tecnologia rhAmpSeq™. (FIG. 12A) Sequências de locais fora do alvo identificadas por GUIDE-Seq para dois guias direcionando o locus CISH. A sequência guia é listada no topo com os locais fora do alvo mostrados abaixo. O local de destino é identificado com um quadrado preto. As disparidades com o guia são apresentadas e destacadas com as inserções apresentadas em cinza. O número de leituras de sequenciamento GUIDE-Seq é apre- sentado à direita de cada local. 10 µM Alt-R crRNA XT complexado com o Alt-R tracrRNA foi administrado nas células HEK293 que ex- pressam constitutivamente a nuclease Cas9 por nucleofecção. (FIG. 12B) Gráficos de pizza indicam a porcentagem fracionária das conta- gens de leitura específicas do CRISPR-Cas9 totais únicas que estão no alvo e fora do alvo. A edição total nos locais no alvo e fora do alvo identificada por GUIDE-Seq foi medida usando rhAmpSeq, uma abor- dagem de enriquecimento orientada multiplexada para NGS. Para ca- da um dos dois guias de direcionamento CISH, os amplicons foram modificados em torno de cada local de clivagem Cas9 com leituras > 1% das leituras GUIA-Seq alvo. Os complexos RNP formados com Cas9 WT ou Alt-R HiFi Cas9 foram fornecidos por eletroporação em células NK expandidas. (FIG. 12C) formação INDEL em cada um dos locais direcionados para o guia 1 de CISH (painel 1, 11-plex) e o guia 2 de CISH (painel 2, 70-plex) quando um único complexo RNP foi ad- ministrado. (FIG. 12D) formação INDEL em cada um dos locais alvo quando o CISH guia 1 e o CISH guia 2 foram coadministrados. O lo- cus no alvo é indicado com um asterisco

[0040] Figuras 13A-13C: transdução de iC9/CAR19/IL-15 e efici- ência de CISH KO são estáveis ao longo do tempo. (FIG. 13A) Análise de citometria de fluxo de CD56 em células transduzidas e de controle. (FIG. 13B) Viabilidade celular das células transduzidas. (FIG. 13C) Western blots de vários dias durante transdução.

[0041] As Figuras 14A-14D: Fenótipo e assinatura molecular das células CISH KO NT NK. (FIGS. 14A-14B) Mapa de calor da assinatu- ra gênica. (FIGS. 14C-14D) Análise das células CISH KO NT NK.

[0042] Figura 15: Dose única de CAR19/IL-15 prolonga a sobrevi- vência em um modelo de camundongo do linfoma de Raji, mas não leva a curas.

[0043] As Figuras 16A-16C: As células CISH KO iC9/CAR19/IL-15 NK podem ainda ser eliminadas com o dimerizador. (FIGS. 16A-16B) Análise de citometria de fluxo das células CISH KO NT NK. (FIG. 16C) Porcentagem de células NK CAR+ no sangue, fígado, baço ou medula óssea.

[0044] Figura 17: Nenhuma evidência de linfoma de Raji em ca- mundongos recebendo alta dose de células CISH KO iC9/CAR19/IL-15

NK. DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0045] O supressor da família de sinalização de citocinas (SOCS) de proteínas desempenha um papel importante na biologia de células NK, atenuando a sinalização de citocinas, a atividade funcional e a imunidade das células NK para o câncer. Um de seus membros, a pro- teína contendo SH2 induzida por citocinas (CIS), codificada pelo gene CISH, tem sido identificada como uma importante molécula de check- point intracelular nas células NK e é induzida por citocinas, incluindo a IL-15. Assim, os inventores buscaram determinar se as células NK modificadas estão sujeitas aos mesmos circuitos contrarreguladores que, fisiologicamente, desregulam a sinalização das citocinas em célu- las NK não modificadas, avaliando a expressão do CIS e as conse- quências da deleção de CISH nas células CB-NK transduzidas por CAR19/IL-15.

[0046] Os presentes estudos demonstraram uma nova abordagem para combinar o CAR modificado com CISH inativado (KO), o que re- sulta em um controle tumoral superior em comparação com qualquer uma das abordagens isoladamente. O CISH KO melhorou a atividade de células CB-NK transduzidas por iC9/CAR19/IL-15 aumentando a sinalização JAK/STAT. Além disso, foi demonstrado que o direciona- mento de CISH modula o metabolismo das células CAR-NK e melhora a sua "aptidão" através da ativação do alvo de mamíferos da via de sinalização da rapamicina (mTOR) e da indução de um interruptor gli- colítico no seu metabolismo. Esta é a primeira demonstração de que a edição gênica de uma molécula do checkpoint imunológico melhora a atividade e a aptidão das células CAR.NK modulando sua via metabó- lica.

[0047] Especificamente, os presentes estudos mostraram que CISH é induzido em células CB-NK transduzidas por CAR19/IL-15 após 7 dias de expansão, conforme determinado por mRNA qPCR (FIG. 1). Para examinar as consequências funcionais da deleção de CISH em células NK transduzidas por CAR.19/IL-15, foi desenvolvido um protocolo para a edição combinada de genes mediados por ribonu- cleoproteína Cas9 (Cas9 RNP) para silenciar o CISH e a transdução retroviral com a construção iC9/CAR.CD19/IL-15. Sete dias após a transdução das células CB-NK com a construção iC9/CAR.19/IL-15, as células NK transduzidas foram nucleosfectada com Cas9 sozinho (Cas9 controle) ou Cas9 pré-carregado com crRNA:tracrRNA duplex quimicamente sintetizado direcionando o éxon 4 de CISH. As células foram então cultivadas com clone 9.mbIL21 e IL-2 (100 iU/ml) por mais 7 dias para aumentar a expansão. A eficiência da edição genética foi quantificada por PCR (dia 2) e a redução dos níveis de expressão pro- teica foram determinadas pela citometria de fluxo (dia 7) nas células CAR-NK. A inativação de CISH resultou em uma função significativa- mente melhorada das células CB-NK transduzidas por iC9/CAR19/IL- 15 contra as células tumorais de Raji, especialmente em menor razões efetor:alvo, conforme avaliado pela coloração intracelular para IFN-ϒ e TNF-α, degranulação CD107a e morte tumoral por ensaio de liberação de 51Cr. Considerando os dados in vitro promissores, as células CAR- NK derivadas do CB foram testadas in vivo em um modelo de camun- dongo murino do linfoma de Raji. Os camundongos foram tratados com apenas uma injeção de 3 milhões ou 10 milhões de células NK e foi demonstrado que CISH KO em CB-NK transduzido por iC9/CAR19/IL-15 aumentou a sua persistência in vivo e melhorou a sobrevivência dos camundongos em ambos os níveis de dose, mas foi observada uma sobrevivência mais impressionante a longo prazo com o nível de dose de 10 milhões.

[0048] Dessa forma, em certas modalidades, a presente divulga- ção fornece métodos de produção de células NK, através da modifica-

ção para expressar um CAR, como por transdução de retrovirais, e interromper a expressão de CISH, como por exemplo através da inati- vação mediada por CISPR-Cas9 de CISH. A construção de CAR pode expressar uma citocina, como IL-15.

[0049] As células NK fornecidas aqui podem ser usadas para me- lhorar as terapias de células CAR adotivas através da melhoria da po- tência, permitindo assim uma infusão de um menor número de células NK CAR em pacientes com toxicidade reduzida. Assim, as modalida- des adicionais fornecem métodos de administração de terapia de célu- las adoptivas com células NK CAR para tratar pacientes oncológicos com uma malignidade hematológica, cânceres sólidos, doenças infec- ciosas ou doenças imunológicas, incluindo, mas não se limitando a, doença de enxerto-contra-hospedeiro. I. Definições

[0050] Conforme usado aqui, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que ne- nhum componente especificado foi formulado propositadamente em uma composição e/ou está presente somente como contaminante ou em quantidades vestigiais. A quantidade total do componente especifi- cado resultante de qualquer contaminação acidental de uma composi- ção é, por conseguinte, bastante inferior a 0,05%, de preferência infe- rior a 0,01%. A mais preferida é uma composição na qual nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com mé- todos analíticos padrão.

[0051] Conforme usado aqui na especificação, "a/o" ou "uma/um" pode significar uma ou mais. Como usado aqui na(s) reivindica- ção(ões), quando usado em conjunto com o termo "compreendendo", as palavras "a/o" ou "uma/um" podem significar uma ou mais de uma.

[0052] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para signi- ficar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para referir-se a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas a alternativas e "e/ou". Conforme usado aqui "outro" pode significar, pe- lo menos, um segundo ou mais. Os termos "cerca de", "substancial- mente" e "aproximadamente" significam, em geral, o valor indicado mais ou menos 5%.

[0053] Um "distúrbio imune," "distúrbio imune-relacionado," ou "distúrbio imune-mediado" refere-se a um distúrbio em que a resposta imune desempenha um papel chave no desenvolvimento ou na pro- gressão da doença. Os distúrbios imunomediados incluem distúrbios autoimunes, rejeição de aloenxerto, doença de enxerto-contra- hospedeiro e condições inflamatórias e alérgicas.

[0054] Uma "resposta imune" é uma resposta de uma célula do sistema imune, como uma célula B, ou uma célula T, ou uma célula imune inata a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é especí- fica para um determinado antígeno (uma "resposta específica do antí- geno").

[0055] Uma "doença autoimune" refere-se a uma doença em que o sistema imune produz uma resposta imune (por exemplo, uma respos- ta de células B ou T) contra um antígeno que faz parte do hospedeiro normal (isto é, um autoantígeno), com consequente lesão aos tecidos. Um autoantígeno pode ser derivado de uma célula hospedeira, ou po- de ser derivado de um organismo comensal como os microrganismos (conhecidos como organismos comensais) que normalmente coloni- zam as superfícies da mucosa.

[0056] "Tratamento" ou tratamento de uma doença ou condição refere-se à execução de um protocolo, que pode incluir a administra- ção de um ou mais fármacos a um paciente, em um esforço para alivi- ar sinais ou sintomas da doença. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão da doença, amenizar ou paliar o estado da doença, e remissão ou melhor prognóstico. O alívio pode ocorrer antes dos sinais ou sintomas da doença ou condição que apa- recem, bem como após a sua aparência. Assim, "tratar" ou "tratamen- to" pode incluir "prevenir" ou "prevenção" de doenças ou condições indesejáveis. Além disso, "tratar" ou "tratamento" não requer alívio completo dos sinais ou sintomas, não requer cura, e inclui especifica- mente protocolos que têm apenas um efeito marginal sobre o paciente.

[0057] O termo "benefício terapêutico" ou "terapeuticamente efi- caz", usado ao longo deste pedido, refere-se a qualquer coisa que promova ou melhore o bem-estar do indivíduo em relação ao trata- mento médico dessa condição. Isto inclui, mas não se limita a, uma redução da frequência ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, o tratamento do câncer pode envolver, por exemplo, uma redução do tamanho de um tumor, uma redução da in- vasividade de um tumor, redução da taxa de crescimento do câncer ou a prevenção de metástases. O tratamento do câncer pode também se referir a prolongar a sobrevivência de um indivíduo com câncer.

[0058] "Indivíduo" e "paciente" referem-se a um ser humano ou não humano, como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modalida- des específicas, o indivíduo é um ser humano.

[0059] As frases "farmaceuticamente ou farmacologicamente acei- tável" se referem a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou desagradável quando ad- ministradas a um animal ou ser humano, quando apropriado. A prepa- ração de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou um ingrediente ativo adicional será conhecida pelos versados na técnica conforme a presente divulgação. Além disso, para a adminis- tração de animais (por exemplo, humanos), será entendido que as preparações devem satisfazer as normas de esterilidade, pirogenici- dade, segurança geral e pureza exigidas pelo FDA Office of Biological

Standards.

[0060] Tal como usado aqui, o "carreador farmaceuticamente acei- tável" inclui todos e quaisquer solventes aquosos (por exemplo, água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenteral, como cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc), solventes não aquo- sos (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal, e éste- res orgânicos injetáveis, como etiloleato), meios de dispersão, reves- timentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agen- tes antibacterianos ou antifúngicos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes), agentes isotônicos, agentes retardadores de absorção, sais, fármacos, estabilizadores de fármacos, géis, aglutinantes, excipi- entes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, reabastecedores de fluidos e nutrien- tes, como materiais e combinações deles, como seria conhecido por um versado na técnica. O pH e a concentração exata dos vários com- ponentes em uma composição farmacêutica são ajustados de acordo com parâmetros conhecidos.

[0061] O termo "haplotipagem ou tipagem de tecidos" refere-se a um método usado para identificar o haplótipo ou tipos de tecido de um indivíduo, por exemplo, determinando qual locus (ou loci) de HLA é expressado nos linfócitos de um determinado indivíduo. Os genes HLA estão localizados no complexo principal de histocompatibilidade (MHC), uma região no braço curto do cromossomo 6, e estão envolvi- dos na interação célula-célula, resposta imune, transplante de órgãos, desenvolvimento de câncer e susceptibilidade à doença. Há seis loci genéticos importantes no transplante, designados HLA-A, HLA-B, HLA-C, e HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ. Em cada locus, pode haver qualquer um de vários alelos diferentes.

[0062] Um método amplamente usado para a haplotipagem usa a reação em cadeia da polimerase (PCR) para comparar o DNA do indi-

víduo, com segmentos conhecidos dos genes que codificam antígenos MHC. A variabilidade dessas regiões dos genes determina o tipo de tecido ou haplótipo do indivíduo. Os métodos sorológicos também são usados para detectar antígenos sorologicamente definidos nas super- fícies das células. Os determinantes HLA-A, -B e -C podem ser medi- dos por técnicas sorológicas conhecidas. Em resumo, os linfócitos do indivíduo (isolados de sangue periférico fresco) são incubados com antissoros que reconhecem todos os antígenos HLA conhecidos. As células são espalhadas por uma bandeja com poços microscópicos contendo vários tipos de antissoros. As células são incubadas durante 30 minutos, seguidas de uma incubação complementar adicional de 60 minutos. Se os linfócitos tiverem em suas superfícies antígenos reco- nhecidos pelos anticorpos no antissoro, os linfócitos são lisados. Pode ser adicionado um corante para mostrar alterações na permeabilidade da membrana da célula e morte da célula. O padrão de células destru- ídas pela lise indica o grau de incompatibilidade histológica. Se, por exemplo, os linfócitos de uma pessoa a ser testada para HLA-A3 fo- rem destruídos em um poço com antissoros para HLA-A3, o teste é positivo para este grupo de antígenos.

[0063] O termo "células apresentadoras de antígeno (APCs)" refe- re-se a uma classe de células capazes de apresentar um ou mais an- tígenos na forma de um complexo peptídeo-MHC reconhecível por cé- lulas efetoras específicas do sistema imune, induzindo assim uma res- posta imune celular eficaz contra o antígeno ou antígenos sendo apre- sentados. O termo "APC" abrange células inteiras intactas, como ma- crófagos, células B, células endoteliais, células T ativadas e células dendríticas, ou moléculas, de ocorrência natural ou sintéticas capazes de apresentar antígeno, como moléculas purificadas de MHC classe I complexadas para ÿ2-microglobulina. II. Células NK

[0064] Em certas modalidades, as células NK são derivadas de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC), produ- tos de leucoferese não estimulados (PBSC), células estaminais embri- onárias humanas (hESCs), células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), medula óssea ou sangue de cordão umbilical através de mé- todos bem conhecidos na técnica. Especificamente, as células NK po- dem ser isoladas do sangue do cordão umbilical (CB), do sangue peri- férico (PB), da medula óssea ou das células estaminais. Em modalida- des específicas, as células imunes são isoladas do CB agrupado. O CB pode ser agrupado a partir de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou mais unida- des. As células imunes podem ser autólogas ou halogênicas. As célu- las NK isoladas podem ser haplótipo compatíveis para o indivíduo a ser administrado com a terapia celular. As células NK podem ser de- tectadas por marcadores de superfície específicos, como CD16, CD56 e CD8 em humanos, sem a expressão de CD3.

[0065] Em certos aspectos, a população inicial de células NK é obtida isolando células mononucleares usando centrifugação de gradi- ente de densidade ficoll. A cultura de células pode estar esgotada em quaisquer células que expressem células CD3, CD14 e/ou CD19 e po- de ser caracterizada para determinar a percentagem de células CD56+/CD3- ou células NK.

[0066] As células são expandidas na presença das presentes APCs, como UAPCs. A expansão pode ser de cerca de 2-30 dias, co- mo 3-20 dias, particularmente 12-16 dias, como 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 dias, especificamente cerca de 14 dias. As células NK e as APCS podem estar presentes em uma razão de cerca de 3:1-1:3, co- mo 2:1, 1:1, 1:2, especificamente cerca de 1:2. A cultura de expansão pode incluir ainda citocinas para promover a expansão, como IL-2, IL- 21 e/ou IL-18. As citocinas podem estar presentes em uma concentra- ção de cerca de 10-500 U/mL, como 100-300 U/mL, particularmente cerca de 200 U/mL. As citocinas podem ser reabastecidas na cultura de expansão, como a cada 2-3 dias. As APCs podem ser adicionadas à cultura pelo menos uma segunda vez, como após a transdução de CAR.

[0067] Após a expansão, as células imunes podem ser infundidas imediatamente ou armazenadas, como, por exemplo, por criopreser- vação. Em certos aspectos, as células podem ser propagadas por di- as, semanas ou meses ex vivo como uma população em massa em cerca de 1, 2, 3, 4, 5 dias.

[0068] As células NK expandidas podem secretar citocinas do tipo I, como interferon-ϒ, fator de necrose tumoral-α e fator estimulante de colônias de granulócito e macrófago (GM-CSF), que ativam tanto as células imunes inatas como adaptativas, bem como outras citocinas e quimiocinas. A medição dessas citocinas pode ser usada para deter- minar o estado de ativação das células NK. Além disso, outros méto- dos conhecidos na técnica para determinação da ativação de células NK podem ser usados para a caracterização das células NK da pre- sente divulgação. A. CISH

[0069] Proteína contendo SH2 induzível por citocina (CIS) é codifi- cada pelo gene CISH. É um membro da família SOCS e é uma molé- cula de checkpoint intracelular nas células NK. CISH é rapidamente induzida em resposta à IL-15 e a deleção da CISH torna as células NK hipersensíveis à IL-15. As células NK inativadas CISH têm maior proli- feração, maior produção de IFNϒ e maior atividade citotóxica. A abla- ção de CIS libera um freio na atividade da célula NK.

[0070] As presentes células NK podem ter interrupção de CISH por qualquer método conhecido na técnica, como por nucleases espe- cíficas ou direcionadas de sequência, incluindo nucleases-alvo de liga- ção ao DNA, como nucleases de dedos de zinco (ZFN) e nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), e nucleases guia- das por RNA, como uma nuclease associada a CRISPR (Cas), especi- ficamente desenhadas para serem direcionadas para a sequência do gene ou para uma parte do mesmo. Em aspectos específicos, a ex- pressão de CISH é interrompida por interrupção mediada por CRISPR. B. IL-15

[0071] A interleucina-15 (IL-15) é restrita ao tecido e apenas em condições patológicas é observada em qualquer nível no soro ou sis- temicamente. A IL-15 possui vários atributos que são desejáveis para terapia adotiva. A IL-15 é uma citocina homeostática que induz o de- senvolvimento e a proliferação celular de células exterminadoras natu- rais, promove a erradicação de tumores estabelecidos ao aliviar a su- pressão funcional de células residentes tumorais e inibe o AICD.

[0072] Em uma modalidade, a presente divulgação refere-se à co- modificação de células imunes CAR e/ou TCR com IL-15. Além da IL- 15, outras citocinas são previstas. Estas incluem, mas não se limitam a, citocinas, quimiocinas e outras moléculas que contribuem para a ativação e proliferação de células usadas para aplicação humana. As células NK ou T que expressam a IL-15 são capazes de sinalização de citocina de suporte contínuo, o que é crítico para sua sobrevivência após a infusão.

[0073] Em algumas modalidades, foram desenvolvidos aAPC K562, expressando o antígeno desejado (por exemplo, CD19) junto com moléculas coestimulatórias, como CD28, IL-15, e CD3ζ, para se- lecionar células imunes (por exemplo, células NK) in vitro que são ca- pazes de propagação sustentada mediada por CAR. Esta poderosa tecnologia permite a fabricação de números clinicamente relevantes (até 1010) de células NK CAR+ adequadas para aplicação humana. Conforme necessário, podem ser realizados ciclos de estimulação adi- cionais para gerar um maior número de células NK geneticamente modificadas. Tipicamente, pelo menos 90% das células NK propaga- das expressam CAR e podem ser criopreservadas para infusão. Além disso, esta abordagem pode ser aproveitada para gerar células NK para diversos tipos de tumores, ao emparelhar a especificidade do CAR introduzido com a expressão do antígeno associado ao tumor (TAA) reconhecido pelo CAR no aAPC.

[0074] Após a modificação genética, as células podem ser imedia- tamente infundidas ou armazenadas. Em certos aspectos, após a mo- dificação genética, as células podem ser propagadas por dias, sema- nas ou meses ex vivo como uma população em massa em cerca de 1, 2, 3, 4, 5 dias ou mais após a transferência do gene para as células. Em um outro aspecto, os transfectantes são clonados e um clone de- monstrando a presença de uma cassete de expressão ou plasmídeo único integrado ou mantido episomalmente, e a expressão do receptor quimérico é expandida ex vivo. O clone selecionado para expansão demonstra a capacidade de reconhecer e lisar especificamente as cé- lulas-alvo que expressam o CD19. As células imunes recombinantes podem ser expandidas por estimulação com IL-2, ou outras citocinas que ligam a cadeia gama comum (por exemplo, IL-7, IL-12, IL-15, IL- 21 e outras). As células imunes recombinantes podem ser expandidas por estimulação com células apresentadoras de antígenos artificiais. Em outro aspecto, as células geneticamente modificadas podem ser criopreservadas. A. Receptores de antígeno geneticamente modificados

[0075] As células NK da presente divulgação podem ser geneti- camente modificadas para expressar receptores de antígeno como TCRs e/ou CAR modificados. Por exemplo, as células NK são modifi- cadas para expressar um TCR com especificidade antigênica para um antígeno do câncer. Múltiplos CARs e/ou TCRs, como antígenos dife- rentes, podem ser adicionados às células NK.

[0076] Métodos adequados de modificação são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook e Ausubel, supra. Por exemplo, as células podem ser transduzidas para expressar um TCR com espe- cificidade antigênica para um antígeno cancerígeno usando técnicas de transdução descritas em Heemskerk et al., 2008 e Johnson et al.,

2009.

[0077] A eletroporação do RNA codificante para as cadeias de comprimento total de TCR α e β (ou ϒ e δ) pode ser usada como al- ternativa para superar problemas a longo prazo com a auto-reatividade causada pelo emparelhamento de cadeias de TCR transduzidas retro- viralmente e endógenas. Mesmo que tal emparelhamento alternativo ocorra na estratégia de transfecção transiente, as células T auto reati- vas possivelmente geradas perderão essa autorreatividade após al- gum tempo, porque a cadeia de TCR α e β introduzida é expressada apenas transientemente. Quando a expressão introduzida da cadeia de TCR α e β é diminuída, apenas as células T autólogas normais são deixadas. Isso não ocorre quando cadeias de TCR de comprimento total são introduzidas por transdução de retrovirais estáveis, que nun- ca perderão as cadeias de TCR introduzidas, causando uma autorrea- tividade constante no paciente.

[0078] Em algumas modalidades, as células compreendem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos através da engenharia genética que codificam um ou mais receptores de antígenos e produtos geneti- camente modificados desses ácidos nucleicos. Em algumas modalida- des, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não presentes em uma célula ou amostra obtida a partir da célula, como uma obtida a partir de outro organismo ou célula, que, por exemplo, não é normalmente encontrado na célula que está sendo modificada e/ou em um organismo a partir do qual essa célula é derivada. Em al- gumas modalidades, os ácidos nucleicos não estão ocorrendo natu-

ralmente, como um ácido nucleico não encontrado na natureza (por exemplo, quimérico).

[0079] Em algumas modalidades, o CAR contém um domínio ex- tracelular de reconhecimento de antígenos que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína expressada na superfície das células. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR semelhante a TCR e o antígeno é um antígeno peptí- dico processado, como um antígeno peptídico de uma proteína intra- celular, que, como um TCR, é reconhecido na superfície da célula no contexto de uma molécula de complexo principal de histocompatibili- dade (MHC).

[0080] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs e TCRs recombinantes, bem como métodos de engenharia e introdução dos receptores em células, incluem os descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedidos de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de aplicação de patente US US2002131960, US2013287748, US20130149337, patentes US nºs: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592,

8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209,

7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 e 8.479.118, e o número de pedido de patente europeia EP2537416, e/ou os descritos por Sadelain et al., 2013; Davila et al., 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012. Em al- guns aspectos, os receptores de antígeno geneticamente modificados incluem um CAR conforme descrito na patente US nº: 7.446.190, e as descritas na publicação do pedido de patente internacional Nº: WO/2014055668 Al.

2. Receptores de antígeno quimérico

[0081] Em algumas modalidades, o CAR compreende: a) um do- mínio de sinalização intracelular, b) um domínio transmembranar e c)

um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação ao an- tígeno.

[0082] Em algumas modalidades, os receptores de antígeno modi- ficados incluem CARs, incluindo CARs ativadores ou estimuladores, CARs coestimuladores (ver WO2014/055668) e/ou CARs inibitórios (iCARs, ver Fedorov et al., 2013). Os CARs geralmente incluem um domínio de ligação do antígeno extracelular (ou ligante) ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos via ligantes e/ou domínio(s) transmembrana(s). Estas moléculas normal- mente imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antí- geno natural, um sinal através de um receptor desse tipo em combina- ção com um receptor coestimulatório e/ou um sinal através de um re- ceptor coestimulatório apenas.

[0083] Certas modalidades da presente divulgação referem-se ao uso de ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo CAR antígeno específico, incluindo um CAR que foi hu- manizado para reduzir a imunogenicidade (hCAR), compreendendo um domínio de sinalização intracelular, um domínio transmembranar, e um domínio extracelular compreendendo um ou mais motivos de sina- lização. Em determinadas modalidades, o CAR pode reconhecer um epítopo compreendendo o espaço compartilhado entre um ou mais antígenos. Em determinadas modalidades, a região de ligação pode compreender regiões determinantes complementares de um anticorpo monoclonal, regiões variáveis de um anticorpo monoclonal e/ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em outra modalidade, essa espe- cificidade é derivada de um peptídeo (por exemplo, citocina) que se liga a um receptor.

[0084] É contemplado que os ácidos nucleicos CAR humano po- dem ser genes humanos usados para melhorar a imunoterapia celular para pacientes humanos. Em uma modalidade específica, a invenção inclui um cDNA de CAR de comprimento total ou uma região de codifi- cação. As regiões ou domínio de ligação ao antígeno podem incluir um fragmento das cadeias VH e VL de um fragmento variável de cadeia única (scFV) derivado de um anticorpo monoclonal humano específico, como os descritos na patente US 7.109.304, incorporada aqui por refe- rência. O fragmento também pode ser qualquer número de diferentes domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo específico do antí- geno humano. Em uma modalidade mais específica, o fragmento é um scFV específico do antígeno codificado por uma sequência que é oti- mizada para o uso de códon humano para expressão em células hu- manas.

[0085] O arranjo poderia ser multimérico, como um diacorpo ou multímeros. Os multímeros são formados muito provavelmente pelo emparelhamento cruzado da porção variável das cadeias leves e pe- sadas em um diacorpo. A parte da dobradiça da construção pode ter múltiplas alternativas de ser totalmente deletada, de manter a primeira cisteína, de uma prolina em vez de uma substituição de serina, de ser truncada até a primeira cisteína. A porção Fc pode ser deletada. Qualquer proteína que seja estável e/ou dimerizada pode servir este propósito. Pode-se usar apenas um dos domínios Fc, por exemplo, o domínio CH2 ou CH3 da imunoglobulina humana. Pode-se também usar a dobradiça, a região CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana que foi modificada para melhorar a dimerização. Também poderia usar apenas a porção da dobradiça de uma imunoglobulina. Também poderia usar porções de CD8alfa.

[0086] Em algumas modalidades, o ácido nucleico do CAR com- preende uma sequência que codifica outros receptores coestimulató- rios, como um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular CD28 modificado. Outros receptores coestimulatórios in- cluem, mas não se limitam a, um ou mais dos CD28, CD27, OX-40

(CD134), DAP10, DAP12 e 4-1BB (CD137). Além de um sinal primário iniciado pelo CD3, um sinal adicional fornecido por um receptor coes- timulatório humano inserido em um CAR humano é importante para a ativação total das células NK e pode ajudar a melhorar a persistência in vivo e o sucesso terapêutico da imunoterapia adotiva.

[0087] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um determinado antígeno (ou marcador ou ligan- te), como um antígeno expressado em um determinado tipo de célula a ser alvo de terapia adoptiva, por exemplo, um marcador de câncer, e/ou um antígeno destinado a induzir uma resposta de atenuação, co- mo um antígeno expressado em um tipo de célula normal ou não do- ente. Assim, o CAR normalmente inclui em sua porção extracelular, uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno, como um ou mais fra- gmentos de ligação ao antígeno, domínio ou porção, ou um ou mais domínios variáveis do anticorpo, e/ou moléculas do anticorpo. Em al- gumas modalidades, o CAR inclui uma porção de ligação ao antígeno ou partes de uma molécula de anticorpo, como um fragmento de anti- corpo de cadeia única (scFV) derivado das cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).

[0088] Em determinadas modalidades do receptor do antígeno quimérico, a porção específica do antígeno do receptor (que pode ser referida como um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação ao antígeno) compreende um antígeno associado ao tumor ou por um domínio de ligação ao antígeno específico do agente patogêni- co. Os antígenos incluem antígenos de carboidratos reconhecidos pe- los receptores de reconhecimento de padrões, como dectina-1. Um antígeno associado ao tumor pode ser de qualquer tipo desde que seja expressado na superfície celular das células tumorais. As modalida- des exemplares dos antígenos associados ao tumor incluem ligantes CD19, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, NKG2D,

MICA/MICB, antígeno carcinoembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-MET, AKT, Her2, Her3, antígeno tumoral epi- telial, antígeno associado ao melanoma, p53 modificado, ras modifica- do e assim por diante. Em determinadas modalidades, o CAR pode ser coexpressado com uma citocina para melhorar a persistência quando há uma pequena quantidade de antígeno associado ao tumor. Por exemplo, o CAR pode ser coexpressado com IL-15.

[0089] A sequência do quadro de leitura aberto que codifica o re- ceptor quimérico pode ser obtida a partir de uma fonte de DNA genô- mico, de uma fonte de cDNA ou pode ser sintetizada (por exemplo, através de PCR), ou suas combinações. Dependendo do tamanho do DNA genômico e do número de íntrons, pode ser desejável usar o cDNA ou uma combinação dele, pois é possível que íntrons estabili- zem o mRNA. Além disso, pode ser mais vantajoso usar regiões en- dógenas ou exógenas não codificadoras para estabilizar o mRNA.

[0090] É contemplado que a construção quimérica possa ser intro- duzida em células imunes como DNA nu (naked) ou em um vetor ade- quado. Os métodos de transferir células de forma estável por eletro- poração usando DNA nu são conhecidos na técnica. Ver, por exem- plo, a patente US nº 6.410.319. O DNA nu refere-se geralmente ao DNA que codifica um receptor quimérico contido em um vetor de ex- pressão de plasmídeo, na orientação adequada para a expressão.

[0091] Alternativamente, um vetor viral (por exemplo, um vetor re- troviral, um vetor adenoviral, um vetor viral adenoassociado ou um ve- tor lentiviral) pode ser usado para introduzir a construção quimérica em células imunes. Vetores adequados para uso de acordo com o méto- do da presente divulgação não são replicantes nas células imunes. Sabe-se que um grande número de vetores que se baseiam em vírus, onde o número de cópia do vírus mantido na célula é baixo o suficiente para manter a viabilidade da célula, como, por exemplo, vetores base-

ados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV.

[0092] Em alguns aspectos, a ligação específica do antígeno, ou componente de reconhecimento, está ligada a um ou mais domínios de sinalização transmembrana e intracelular. Em algumas modalida- des, o CAR inclui um domínio transmembranar fundido ao domínio ex- tracelular do CAR. Em uma modalidade, o domínio transmembranar que naturalmente é associado com um dos domínios no CAR é usado. Em alguns casos, o domínio transmembrana é selecionado ou modifi- cado pela substituição de aminoácidos para evitar a ligação desses domínios aos domínios transmembranares das mesmas ou diferentes proteínas de membrana de superfície para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.

[0093] O domínio transmembranar em algumas modalidades é re- sultante de uma fonte natural ou de origem sintética. Onde a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteí- na ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana- res incluem as derivadas da (ou seja, compreendem pelo menos a(s) região(ões) transmembrana(s) da) cadeia alfa, beta ou zeta do recep- tor de células T, moléculas CD28, CD3 zeta, CD3 épsilon, CD3 gama, CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D e DAP. Alternativamente, o domínio transmem- branar em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar sintético compreende predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético.

[0094] Em determinadas modalidade, as tecnologias de plataforma divulgadas aqui para modificar geneticamente as células imunes, co- mo as células NK, compreendem (i) a transferência de genes não vi-

rais usando um dispositivo de eletroporação (por exemplo, um nucleo- fector), (ii) CARs que sinalizam através de endodomínios (por exem- plo, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ, ou outras combinações), (iii) CARs com comprimentos variáveis de domínios extracelulares que conectam o domínio de reconhecimento do antígeno à superfície celular e, em alguns casos, (iv) células apresentadoras de antígeno artificial (aAPC) derivadas de K562 para poder expandir robustamente e numericamen- te as células imunes de CAR+ (Singh et al., 2008; Singh et al., 2011).

3. Receptor de células T (TCR)

[0095] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos ge- neticamente modificados incluem TCRs recombinantes e/ou TCRs clonados de células T que ocorrem naturalmente. Um "receptor de cé- lulas T" ou "TCR" refere-se a uma molécula que contém uma variável de cadeia a e β (também conhecida como TCRα e TCRβ, respectiva- mente) ou uma variável de cadeias ϒ e δ (também conhecida como TCRϒ e TCRδ, respectivamente) e isso é capaz de se ligar especifica- mente a um peptídeo antígeno ligado a um receptor MHC. Em algu- mas modalidades, o TCR é a forma αβ.

[0096] Normalmente, os TCRs que existem em formas αβ e ϒδ são geralmente estruturalmente semelhantes, mas as células T que os ex- pressam podem ter localizações ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma so- lúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados a moléculas de complexo principal de histocom- patibilidade (MHC). Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembranar e/ou uma pequena cauda citoplasmática (ver, por exemplo, Janeway et al, 1997). Por exemplo, em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável de imunoglobulina N-terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região transmembrana e uma pe- quena cauda citoplasmática na extremidade C-terminal Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteínas invariantes do com- plexo CD3 envolvidas na mediação da transdução de sinal. Salvo indi- cação em contrário, o termo "TCR" deve ser entendido para abranger os fragmentos funcionais de TCR dos mesmos. O termo abrange tam- bém TCRs intactos ou de comprimento total, incluindo TCRs na forma αβ ou ϒδ.

[0097] Assim, para o propósito aqui, a referência a um TCR inclui qualquer TCR ou fragmento funcional, como uma porção de ligação ao antígeno de um TCR que se liga a um peptídeo antigênico específico ligado em uma molécula MHC, ou seja, complexo peptídeo-MHC. Uma "porção de ligação ao antígeno" ou um fragmento de ligação ao antí- geno" de um TCR, que pode ser usado de forma intercambiável, refe- re-se a uma molécula que contém uma parte dos domínios estruturais de um TCR, mas que liga o antígeno (por exemplo complexo peptídeo- MHC) ao qual o TCR completo se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, co- mo a cadeia variável a e a cadeia variável β de um TCR, suficiente pa- ra formar um local de ligação para ligação a um complexo específico peptídeo-MHC, como, geralmente, onde cada cadeia contém três regi- ões de determinação da complementaridade.

[0098] Em algumas modalidades, os domínios variáveis das ca- deias TCR associam-se para formar loops, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) análogas às imunoglobulinas, que con- ferem o reconhecimento do antígeno e determinam a especificidade do peptídeo, formando o local de ligação da molécula TCR e determinam a especificidade do peptídeo. Tipicamente, como imunoglobulinas, as CDRs são separadas por regiões de estrutura (FRs) (ver, por exemplo, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003). Em algu-

mas modalidades, a CDR3 é o principal CDR responsável pelo reco- nhecimento do antígeno processado, embora a CDR1 da cadeia alfa também tenha demonstrado interagir com a parte N-terminal do peptí- deo antigênico, enquanto a CDR1 da cadeia beta interage com a parte C-terminal do peptídeo. Pensa-se que a CDR2 reconhece a molécula MHC. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia β pode conter ainda uma região de hipervariabilidade (HV4).

[0099] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio constante. Por exemplo, tipo imunoglobulinas, a porção extra- celular das cadeias de TCR (por exemplo, cadeia a, cadeia β) pode conter dois domínios de imunoglobulina, um domínio variável (por exemplo, Va ou Vp; tipicamente aminoácidos 1 a 116 baseados na numeração de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) no terminal N, e um domínio constante (por exemplo, um domínio constante de cadeia a ou Ca, tipicamente aminoácidos 117 a 259 baseados em Kabat, domínio constante de cadeia β ou Cp, tipicamente aminoácidos 117 a 295 ba- seados em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas ca- deias contém dois domínios constantes de membrana-proximais e dois domínios variáveis de membrana-distais contendo CDRs. O domínio constante do domínio de TCR contém sequências de conexão curtas em que um resíduo de cisteína forma uma ligação de dissulfeto, fa- zendo uma ligação entre as duas cadeias. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo adicional de cisteína em cada uma das cadeias α e β, de modo que o TCR contenha duas ligações de dissul- feto nos domínios constantes.

[00100] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR podem con- ter um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é positivamente carregado. Em alguns casos, as ca- deias de TCR contêm uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como o CD3. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região transmembranar pode ancorar a proteína na membrana da cé- lula e associar-se a subunidades invariantes do aparelho de sinaliza- ção ou complexo de CD3

[00101] Geralmente, a CD3 é um complexo multi-proteico que pode possuir três cadeias distintas γ, δ e ε) em mamíferos e a cadeia ζ. Por exemplo, em mamíferos, o complexo pode conter uma cadeia CD3, uma cadeia CD3, duas cadeias CD3 e um homodímero de cadeias CD3 ζ. As cadeias CD3, CD3e CD3 são proteínas de superfície de células altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulinas que contém um único domínio de imunoglobulina. As regiões trans- membranares das cadeias CD3, CD3e CD3 são negativamente car- regadas, o que é uma característica que permite que essas cadeias se associem às cadeias de receptores de células T positivamente carre- gadas. As caudas intracelulares das cadeias CD3, CD3e CD3 con- têm um único motivo conservado conhecido como motivo de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina ou ITAM, enquanto cada cadeia CD3ζ tem três. Em geral, os ITAMs estão envolvidos na capacidade de sinalização do complexo TCR. Estas moléculas acessórias têm regi- ões transmembranares com carga negativa e desempenham um papel na propagação do sinal do TCR para a célula. As cadeias CD3 e ζ, junto com o TCR, formam o que é conhecido como complexo receptor de células T.

[00102] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodíme- ro de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser uma construção de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero que contém duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, como por ligação de dissulfetos ou ligações de dissulfetos. Em algumas modalidades, um TCR para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno do câncer) é identificado e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o TCR pode ser obtido a partir de uma variedade de fon- tes, como através da amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) de sequências de DNA de TCR disponíveis publicamente. Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, por exemplo, de células como uma célula T (por exemplo, célula T ci- totóxica), hibridomas de células T ou outra fonte disponível publica- mente. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, um clone de células T de alta afinidade pode ser isolado de um paciente e o TCR isolado. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma de células T cultivadas ou um clone. Em algumas modalida- des, o clone TCR para um antígeno alvo foi gerado em camundongos transgênicos modificados com genes do sistema imune humano (por exemplo, o sistema de antígeno de leucócitos humanos ou HLA). Ver, por exemplo, antígenos tumorais (ver, por exemplo, Parkhurst et al., 2009 e Cohen et al., 2005). Em algumas modalidades, a exibição do fago é usada para isolar os TCRs contra um antígeno alvo (ver, por exemplo, Varela-Rohena et al., 2008 e Li, 2005). Em algumas modali- dades, a porção de TCR ou de ligação ao antígeno pode ser gerada sinteticamente a partir do conhecimento da sequência de TCR. B. Células apresentadoras de antígenos

[00103] As células apresentadoras de antígeno, que incluem macró- fagos, linfócitos B e células dendríticas, distinguem-se pela expressão de uma determinada molécula de MHC. As APCs internalizam o antí- geno e reexpressam uma parte desse antígeno, junto com a molécula MHC na membrana celular externa. O MHC é um grande complexo genético com múltiplos loci. Os loci de MHC codificam duas classes principais de moléculas de membrana de MHC, referidas como MHCs de classe I e classe II. Os linfócitos T auxiliares reconhecem geral- mente o antígeno associado às moléculas de MHC classe II e os linfó- citos T citotóxicos reconhecem o antígeno associado às moléculas de MHC de classe I. Em humanos, o MHC é referido como o complexo HLA e em camundongos o complexo H-2.

[00104] Em alguns casos, as APCs são úteis na preparação de composições terapêuticas e produtos de terapia celular das modalida- des. Para obter orientação geral sobre a preparação e uso de sistemas de apresentação de antígenos, consultar, por exemplo, a patente US Nºs. 6.225.042, 6.355.479, 6.362.001 e 6.790.662; publicação de pedi- do de patente US nºs. 2009/0017000 e 2009/0004142; e publicação internacional nº. WO2007/103009.

[00105] Os sistemas de aAPC podem incluir pelo menos uma molé- cula auxiliar exógena. Pode ser usado qualquer número e combinação adequados de moléculas auxiliares. A molécula auxiliar pode ser sele- cionada a partir de moléculas auxiliares, como moléculas coestimulató- rias e moléculas de adesão. Moléculas coestimulatórias exemplares incluem CD86, CD64 (FcγRI), ligante 41BB e IL-21. As moléculas de adesão podem incluir glicoproteínas de ligação a carboidratos, como selectinas, glicoproteínas de ligação transmembrana, como integrinas, proteínas dependentes de cálcio, como caderinas, e proteínas super- familiares de imunoglobulina transmembrana de passagem única (Ig), como moléculas de adesão intercelular (ICAMs), que promovem, por exemplo, contato célula-a-célula ou célula-matriz. Moléculas de ade- são exemplares incluem LFA-3 e ICAMs, como ICAM-1. As técnicas, os métodos e reagentes úteis para a seleção, clonagem, preparação e expressão de moléculas de assistência exemplares, incluindo molécu- las coestimulatórias e moléculas de adesão, são exemplificadas em,

por exemplo, patente US Nos. 6.225.042, 6.355.479 e 6.362.001. C. Antígenos

[00106] Entre os antígenos direcionados pelos receptores de antí- genos geneticamente modificados estão aqueles expressados no con- texto de uma doença, condição ou tipo de célula a ser direcionada através da terapia de células adotivas. Entre as doenças e condições estão as doenças e os distúrbios proliferativos, neoplásicos e malig- nos, incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imune, como linfomas, leucemias e/ou mielomas, como B, T e leucemias mieloides, linfomas e mielomas múltiplos. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expressado ou so- breexpressado em células da doença ou da condição, por exemplo, o tumor ou as células patogênicas, em comparação com células ou teci- dos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expressado em células normais e/ou é expressado nas células modi- ficadas.

[00107] Qualquer antígeno adequado pode ser usado no presente método. Antígenos exemplares incluem, mas não se limitam a, molé- culas antigênicas de agentes infecciosos, autoantígenos, antígenos associados ao tumor/câncer e neoplasias tumorais (Linnemann et al., 2015). Em aspectos específicos, os antígenos incluem NY-ESO, EG- FRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 e CEA. Em aspectos específicos, os antígenos dos dois ou mais receptores de antígenos incluem, entre outros, CD19, EBNA, WT1, CD123, NY-ESO, EGFRvIII, MUC1, Her2, CA-125, WT1, Mage- A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 e/ou CEA. As sequências para estes antígenos são conhecidas na técnica, por exemplo, CD19 (No. de acesso NG_007275.1), EBNA (No. de acesso NG_002392.2), WT1 (No. de acesso NG_009272.1), CD123 (No. de acesso NC_000023.11), NY-ESO (No. de acesso NC_000023.11), EGFRvIII

(No. de acesso NG_007726.3), MUC1 (No. de acesso NG_029383.1), HER2 (No. de acesso. NG_007503.1), CA-125 (No. de acesso NG_055257.1), WT1 (No. de acesso NG_009272.1), Mage-A3 (No. de acesso NG_013244.1), Mage-A4 (No. de acesso NG_013245.1), Mage-A10 (No. de acesso NC_000023.11), TRAIL/DR4 (No. de aces- so NC_000003.12), e/ou CEA (No. de acesso. NC_000019.10).

[00108] Os antígenos associados ao tumor podem ser derivados de cânceres da próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal, mesotelioma, ovário ou melanoma. Antígenos associados ao tumor exemplificadores ou antígenos derivados de células tumorais incluem MAGE 1, 3, e MAGE 4 (ou outros antígenos MAGE como aqueles di- vulgados na publicação Internacional de Patentes No. WO99/40188); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (também conhecido como NY ESO 1); SAGE; e HAGE ou GAGE. Estes exemplos não limitantes de antíge- nos tumorais são expressados em uma vasta gama de tipos de tumo- res, como melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga. Ver, por exemplo, a patente US nº 6.544.518. Os antígenos associados ao tumor do câncer da próstata incluem, por exemplo, o antígeno da membrana específico da próstata (PSMA), o antígeno es- pecífico da próstata (PSA), os fosfatos de ácido prostático, o NKX3.1 e o antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata (STEAP).

[00109] Outros antígenos associados ao tumor incluem Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto e Criptina. Além disso, um antígeno tumoral pode ser um hormônio de auto-peptídeo, como o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) de comprimento total, um peptídeo curto de 10 aminoácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cânce- res.

[00110] Os antígenos tumorais incluem antígenos tumorais deriva- dos de cânceres que são caracterizados pela expressão de antígenos associados ao tumor, como a expressão de HER-2/neu. Os antígenos associados ao tumor de interesse incluem antígenos tumorais especí- ficos da linhagem, como os antígenos da linhagem melanócito- melanoma MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinase e proteí- na relacionada à tirosinase.

Os antígenos ilustrativos associados ao tumor incluem, mas não se limitam a, antígenos tumorais derivados de ou que compreendam qualquer uma ou mais de p53, Ras, c-Myc, seri- na citoplasmática/cinases de treonina (por exemplo, A-Raf, B-Raf e C- Raf, cinases dependentes de ciclina), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART- 1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, Tirosinase, TRP-1, TRP-2, ART-4, CA- MEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, fosfoinositídeo 3-quinases (PI3Ks), receptores TRK, PRAME, P15, RU1, RU2, SART- 1, SART-3, Antígeno tumoral de Wilms (WT1), AFP, -catenina/m, Cas- pase-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART-2, TRP- 2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, fator regulador de interferon 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 1 (TACSTD1) TACSTD2, receptor de tirosina quinase (por exemplo, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (in particular, EGFRvIII), receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR)), tirosina quinase citoplasmática (por exemplo, família src, família syk-ZAP70), quinase ligada à integrina (ILK), transdutores de sinal e ativadores de transcri- ção STAT3, STATS e STATE, fator induzível por hipóxia (por exemplo, HIF-1 e HIF-2), Fator Nuclear-Kappa B (NF-B), receptores Notch (por exemplo, Notch1-4), c-Met, alvos mamíferos da rapamicina (mTOR), WNT, quinases extracelulares reguladas por sinal (ERKs), e suas su- bunidades regulatórias, PMSA, PR-3, MDM2, Mesotelina, carcinoma de células renais-5T4, SM22-alfa, anidrases carbônicas I (CAI) e IX (CAIX) (também conhecida como G250), STEAD, TEL/AML1, GD2, proteinase3, hTERT, pontos de interrupção de translocação de sarco- ma, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógeno, ciclina B1, ácido polissiáli- co, MYCN, RhoC, GD3, fucosil GM1, mesotélio, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY- TES1, proteína de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, legumaína, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, antígeno relacionado com fos 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 e idiotipo.

[00111] Os antígenos podem incluir regiões epitópicas ou peptídeos epitópicos derivados de genes mutados em células tumorais ou de ge- nes transcritos a diferentes níveis em células tumorais em comparação com células normais, como a enzima telomerase, survivina, mesoteli- na, ras mutada, rearranjo bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado ou do tipo selvagem, citocromo P450 1B1, e sequências de íntron anormalmente expressas, como N-acetilglucosaminiltransferase-V; rearranjos clonais de genes de imunoglobulina que geram idiótipos únicos em mieloma e linfomas de células B; antígenos tumorais que incluem regiões epitópi- cas ou peptídeos epitópicos derivados de processos oncovirais, como proteínas do vírus do papiloma humano E6 e E7; proteína do vírus Epstein bar LMP2; proteínas oncofetais não mutadas com expressão seletiva tumoral, como antígeno carcinoembrionário e alfa- fetoproteína.

[00112] Em outras modalidades, um antígeno é obtido ou derivado de um microrganismo patogênico ou de um microrganismo patogênico oportunista (também chamado aqui de microrganismo de doença in- fecciosa), como um vírus, fungo, parasita e bactéria. Em certas moda-

lidades, os antígenos derivados desse microrganismo incluem proteí- nas de comprimento total.

[00113] Os organismos patogênicos ilustrativos cujos antígenos são contemplados para uso no método descrito incluem vírus da imunode- ficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), vírus respirató- rio sincicial (VRS), citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), influenza A, B, E C, vírus da estomatite vesiculosa (VSV), vírus da es- tomatite vesiculosa (VSV), poliomavírus (por exemplo, vírus BK e vírus JC), adenovírus, espécies de Staphylococcus incluindo Staphylococ- cus aureus resistente à meticilina (MRSA) e espécies de Streptococ- cus, incluindo Streptococcus pneumoniae. Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas derivadas desses e de outros micro- organismos patogênicos para uso como antígeno, conforme descrito aqui, e as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas po- dem ser identificadas em publicações e em bancos de dados públicos como GENBANK®, SWISS-PROT® e TREMBL®.

[00114] Os antígenos derivados do vírus da imunodeficiência hu- mana (HIV) incluem qualquer uma das proteínas estruturais do vírion do HIV (por exemplo, gp120, gp41, p17, p24), protease, transcriptase reversa ou proteínas do HIV codificadas por tat, rev, nef, vif, vpr e vpu.

[00115] Os antígenos derivados do vírus do herpes simples (por exemplo, HSV1 e HSV2) incluem, mas não se limitam a, proteínas ex- pressadas a partir de genes HSV tardios. O grupo tardio de genes co- difica predominantemente proteínas que formam a partícula vírion. Es- sas proteínas incluem as cinco proteínas de (UL) que formam o capsí- deo viral: UL6, UL18, UL35, UL38 e a proteína principal do capsídeo UL19, UL45 e UL27, cada uma das quais pode ser usada como um antígeno, conforme descrito aqui. Outras proteínas ilustrativas do HSV contempladas para uso como antígenos aqui incluem as proteínas ICP27 (H1, H2), glicoproteína B (gB) e glicoproteína D (gD). O genoma do HSV compreende pelo menos 74 genes, cada um codificando uma proteína que poderia potencialmente ser usada como um antígeno.

[00116] Os antígenos derivados do citomegalovírus (CMV) incluem proteínas estruturais do CMV, antígenos virais expressados durante as fases inicial e inicial imediatas da replicação do vírus, glicoproteínas I e III, proteína do capsídeo, proteína de revestimento, proteína de matriz inferior pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 e 1E2 (UL123 e UL122), produtos proteicos do agrupamento de genes de UL128-UL150 (Ryk- man, et al., 2006), glicoproteína B de envelope (gB), gH, gN e pp150. Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas CMV para uso como antígenos descritos aqui podem ser identificadas em bancos de dados públicos como GENBANK®, SWISS-PROT® e TREMBL® (ver por exemplo, Bennekov et al., 2004; Loewendorf et al., 2010; Marschall et al., 2009).

[00117] Os antígenos derivados do vírus Epstein-Barr (EBV) que são contemplados para uso em determinadas modalidades incluem proteínas líticas EBV gp350 e gp110, proteínas EBV produzidas duran- te a infecção latente do ciclo, incluindo o antígeno nuclear de Epstein- Barr (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, proteína lí- der EBNA (EBNA-LP), e proteínas latentes de membrana (LMP)-1, LMP-2A e LMP-2B (ver, por exemplo, Lockey et al., 2008).

[00118] Os antígenos derivados do vírus respiratório sincicial (VRS) que são contemplados para uso aqui incluem qualquer uma das onze proteínas codificadas pelo genoma do VSR, ou fragmentos antigênicos do mesmo: NS1, NS2, N (proteína nucleocapsídeo), M (proteína de matriz) SH, G e F (proteínas de revestimento viral), M2 (segunda pro- teína de matriz), M2-1 (fator de alongamento), M2-2 (regulação de transcrição), RNA polimerase e fosfoproteína P.

[00119] Os antígenos derivados do vírus da estomatite vesicular (VSV) que são contemplados para uso incluem qualquer uma das cin-

co proteínas principais codificadas pelo genoma do VSV e seus frag- mentos antigênicos: proteína grande (L), glicoproteína (G), nucleopro- teína (N), fosfoproteína (P) e proteína matriz (M) (ver, por exemplo, Rieder et al., 1999).

[00120] Os antígenos derivados de um vírus influenza que são con- templados para uso em certas modalidades incluem hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteínas de matriz M1 e M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 e PB2.

[00121] Antígenos virais exemplares também incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de adenovírus, polipeptídeos de alfavírus, po- lipeptídeos de calicivírus (por exemplo, um antígeno de capsídeo de calicivírus), polipeptídeos de coronavírus, polipeptídeos do vírus da cinomose, polipeptídeos do vírus ebola, polipeptídeos de enterovírus, polipeptídeos do flavivírus, polipeptídeos do vírus da hepatite (AE) (um núcleo da hepatite B ou antígeno de superfície, um vírus da hepatite C E1 ou glicoproteínas do vírus E2, ou proteínas não estruturais), poli- peptídeos do herpesvírus (incluindo uma glicoproteína do vírus do her- pes simples ou vírus varicela zóster), polipeptídeos do vírus da perito- nite infecciosa, polipeptídeos do vírus da leucemia, polipeptídeos do vírus Marburg, polipeptídeos do ortomixovírus, polipeptídeos do vírus do papiloma, polipeptídeos do vírus da parainfluenza (por exemplo, polipeptídeos do vírus da hemaglutinina e da neuraminidase), polipep- tídeos do paramixovírus, polipeptídeos de parvovírus, polipeptídeos de pestivírus, polipeptídeos de vírus picorna (por exemplo, um polipeptí- deo do capsídeo de poliovírus), polipeptídeos de vírus pox (por exem- plo, um polipeptídeo do vírus vaccinia), polipeptídeos do vírus da raiva (por exemplo, uma glicoproteína G do vírus da raiva), polipeptídeos de reovírus, polipeptídeos de retrovírus e polipeptídeos de rotavírus.

[00122] Em determinadas modalidades, o antígeno pode ser antí- genos bacterianos. Em determinadas modalidades, um antígeno bac-

teriano de interesse pode ser um polipeptídeo secretado. Em certas modalidades, antígenos bacterianos incluem antígenos que têm uma porção ou porções do polipeptídeo exposto na superfície celular exter- na das bactérias.

[00123] Os antígenos derivados de espécies de Staphylococcus incluindo Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) que são contemplados para uso incluem reguladores de virulência, como o sistema Agr, Sar e Sae, o sistema Arl, homólogos Sar (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ e TcaR), o sistema Srr e TRAP. Outras proteínas de Staphylococcus que podem servir como antígenos incluem proteínas Clp, HtrA, MsrR, aconitase, CcpA, SvrA, Msa, CfvA e CfvB (ver, por exemplo, Staphylococcus: Molecular Gene- tics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay). Os genomas de duas espécies de Staphylococcus aureus (N315 e Mu50) foram se- quenciados e estão publicamente disponíveis, por exemplo, em PA- TRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007). Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas de Staphylococcus para uso como antígenos também po- dem ser identificadas em outros bancos de dados públicos como Gen- Bank®, Swiss-Prot® e TrEMBL®.

[00124] Os antígenos derivados do Streptococcus pneumoniae que são contemplados para uso em certas modalidades descritas aqui in- cluem pneumolisina, PspA, proteína A de ligação à colina (CbpA), Na- nA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht e proteínas pilinas (RrgA; RrgB; RrgC). As proteínas antigênicas do Streptococcus pneumoniae tam- bém são conhecidas na técnica e podem ser usadas como antígeno em algumas modalidades (ver, por exemplo, Zysk et al., 2000). A se- quência completa do genoma de uma cepa virulenta do Streptococcus pneumoniae foi sequenciada e, como seria entendido pela pessoa qualificada, as proteínas de S. pneumoniae a serem usadas aqui tam-

bém podem ser identificadas em outros bancos de dados públicos co- mo GENBANK®, SWISS-PROT® e TREMBL®. As proteínas de inte- resse particular para antígenos de acordo com a presente divulgação incluem fatores de virulência e proteínas previstas para serem expos- tas à superfície dos pneumococos (ver, por exemplo, Frolet et al., 2010).

[00125] Exemplos de antígenos bacterianos que podem ser usados como antígenos incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Acti- nomyces, polipeptídeos de Bacillus, polipeptídeos de Bacteroides, po- lipeptídeos de Bordetella, polipeptídeos de Bartonella, polipeptídeos de Borrelia (por exemplo, B. burgdorferi OspA), polipeptídeos de Brucella, polipeptídeos de Campylobacter, polipeptídeos de Capnocytophaga, polipeptídeos de Chlamydia, polipeptídeos de Corynebacterium, poli- peptídeos de Coxiella, polipeptídeos de Dermatophilus, polipeptídeos de Enterococcus, polipeptídeos de Ehrlichia, polipeptídeos de Escheri- chia, polipeptídeos de Francisella, polipeptídeos de Fusobacterium, polipeptídeos de Haemobartonella, polipeptídeos de Haemophilus (por exemplo, proteína da membrana externa da H. influenzae tipo b), poli- peptídeos de Helicobacter, polipeptídeos de Klebsiella, polipeptídeos de bactérias de forma L, polipeptídeos de Leptospira, polipeptídeos de Listeria, polipeptídeos de Mycobacteria, polipeptídeos de Mycoplasma, polipeptídeos de Neisseria, polipeptídeos de Neorickettsia, polipeptí- deos de Nocardia, polipeptídeos de Pasteurella, polipeptídeos de Pep- tococcus, polipeptídeos de Peptostreptococcus, polipeptídeos de Pneumococcus (ou seja, polipeptídeos de S. pneumoniae) (ver descri- ção aqui), polipeptídeos de Proteus, polipeptídeos de Pseudomonas, polipeptídeos de Rickettsia, polipeptídeos de Rochalimaea, polipeptí- deos de Salmonella, polipeptídeos de Shigella, polipeptídeos de Sta- phylococcus, polipeptídeos de streptococcus do grupo A (por exemplo, proteínas M de S. pyogenes), polipeptídeos de streptococcus do gru-

poB (S. agalactiae), polipeptídeos de Treponema, e polipeptídeos de Yersinia (por exemplo, antígenos de Y pestis F1 e V).

[00126] Exemplos de antígenos fúngicos incluem, mas não se limi- tam a, Absidia polypeptides, Acremonium polypeptides, Alternaria polypeptides, Aspergillus polypeptides, Basidiobolus polypeptides, Bi- polaris polypeptides, Blastomyces polypeptides, Candida polypeptides, Coccidioides polypeptides, Conidiobolus polypeptides, Cryptococcus polypeptides, Curvalaria polypeptides, Epidermophyton polypeptides, Exophiala polypeptides, Geotrichum polypeptides, Histoplasma polypeptides, Madurella polypeptides, Malassezia polypeptides, Mi- crosporum polypeptides, Moniliella polypeptides, Mortierella polypepti- des, Mucor polypeptides, Paecilomyces polypeptides, Penicillium polypeptides, Phialemonium polypeptides, Phialophora polypeptides, Prototheca polypeptides, Pseudallescheria polypeptides, Pseudomi- crodochium polypeptides, Pythium polypeptides, Rhinosporidium polypeptides, Rhizopus polypeptides, Scolecobasidium polypeptides, Sporothrix polypeptides, Stemphylium polypeptides, Trichophyton polypeptides, Trichosporon polypeptides e Xylohypha polypeptides.

[00127] Exemplos de antígenos de protozoários parasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Babesia, polipeptídeos de Ba- lantídio, polipeptídeos de Besnoitia, polipeptídeos de Cryptosporidium, polipeptídeos de Eimeria, polipeptídeos de Encephalitozoon, polipeptí- deos de Entamoeba, polipeptídeos de Giardia, polipeptídeos de Hammondia, polipeptídeos de Hepatozoon, polipeptídeos de Isospora, polipeptídeos de Leishmania, polipeptídeos de Microsporidia, polipep- tídeos de Neospora, polipeptídeos de Nosema, polipeptídeos de Pen- tatrichomonas, polipeptídeos de Plasmodium. Exemplos de antígenos de helmintos parasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Acanthocheilonema, polipeptídeos de Aelurostrongylus, polipeptí- deos de Ancylostoma, polipeptídeos de Angiostrongylus, polipeptídeos de Ascaris, polipeptídeos de Brugia, polipeptídeos de Bunostomum, polipeptídeos de Capillaria, polipeptídeos de Chabertia, polipeptídeos de Cooperia, polipeptídeos de Crenosoma, polipeptídeos de Dictyo- caulus, polipeptídeos de Dioctophyme, polipeptídeos de Dipetalonema, polipeptídeos de Diphyllobothrium, polipeptídeos de Diplydium, poli- peptídeos de Dirofilaria, polipeptídeos de Dracunculus, polipeptídeos de Enterobius, polipeptídeos de Filaroides, polipeptídeos de Haemon- chus, polipeptídeos de Lagochilascaris, polipeptídeos de Loa, polipep- tídeos de Mansonella, polipeptídeos de Muellerius, polipeptídeos de Nanophyetus, polipeptídeos de Necator, polipeptídeos de Nematodi- rus, polipeptídeos de Oesophagostomum, polipeptídeos de Onchocer- ca, polipeptídeos de Opisthorchis, polipeptídeos de Ostertagia, poli- peptídeos de Parafilaria, polipeptídeos de Paragonimus, polipeptídeos de Parascaris, polipeptídeos de Physaloptera, polipeptídeos de Protos- trongylus, polipeptídeos de Setaria, polipeptídeos de Spirocerca, poli- peptídeos de Spirometra, polipeptídeos de Stephanofilaria, polipeptí- deos de Strongyloides, polipeptídeos de Strongylus, polipeptídeos de Thelazia, polipeptídeos de Toxascaris, polipeptídeos de Toxocara, po- lipeptídeos de Trichinella, polipeptídeos de Trichostrongylus, polipeptí- deos de Trichuris, polipeptídeos de Uncinaria e polipeptídeos de Wu- chereria. (Por exemplo, P.falciparum circunsporozoite (PfCSP)), prote- ína 2 da superfície de Sporozoite (PfSSP2), térmico carboxil do antí- geno do estado hepático 1 (PfLSA1 c-term) e proteína 1 exportada (PfExp-1), polipeptídeos de Pneumocistis, polipeptídeos de Sarcocys- tis, polipeptídeos de Schistosoma, polipeptídeos de Theileria, polipep- tídeos de Toxoplasma e polipeptídeos de Trypanosoma.

[00128] Exemplos de antígenos ectoparasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos (incluindo antígenos e alérgenos) de pulgas; carrapatos, incluindo carrapatos de carcaças duras e de carcaças ma- cias; moscas, como mosquitos, flebotomíneos, borrachudos, mutuca,

moscas-dos-chifres, moscas de veado, moscas tsé-tsé, moscas de estábulo, moscas causadoras de miíase e muruim; formigas; aranhas, piolhos; ácaros; e hemipteras, como percevejos e barbeiros. D. Genes suicidas

[00129] O CAR das células imunes da presente divulgação pode incluir um ou mais genes suicidas. O termo "gene suicida", como usa- do aqui, é definido como um gene que, após a administração de um profármaco, afeta a transição de um produto genético para um com- posto que mata a sua célula hospedeira. Exemplos de combinações de genes suicidas/profármacos dependentes que podem ser usados são o vírus da herpes simples-timidina quinase (HSV-tk) e ganciclovir, aciclovir ou FIAU; oxidoredutase e ciclo-heximida; citosina deaminase e 5-fluorocitosina; timidina quinase timidilato quinase (Tdk::Tmk) e de- soxicitidina quinase; e citosina arabinose.

[00130] A fosforilase nucleosídeo da purina de E. coli, um chamado gene suicida que converte o profármaco 6-metilpurina desoxirribose em purina 6-metilpurina tóxica. Outros exemplos de genes suicidas usados com a terapia profármaco são o gene da citosina deaminase de E. coli e o gene da timidina quinase de HSV.

[00131] Genes suicidas exemplares incluem CD20, CD52, EGFRv3 ou caspase 9 indutível. Em uma modalidade, pode ser usada uma versão truncada da variante III do EGFR (EGFRv3) como um antígeno suicida que pode ter sofrido ablação pelo cetuximabe. Outros genes suicidas conhecidos na técnica que podem ser usados na presente divulgação incluem purina nucleosídeo fosforilase (PNP), enzimas do citocromo p450 (CYP), carboxipeptidases (CP), carboxilesterase (CE), nitoredutase (NTR), guanina ribosiltransferase (XGRTP), enzimas gli- coidase, Metionina-α,γ-liase (MET) e timidina fosforilase (TP). E. Métodos de aplicação

[00132] Um profissional versado na técnica seria bem equipado pa-

ra construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001 e Ausubel et al., 1996, ambos in- corporados aqui por referência) para a expressão dos receptores de antígeno da presente divulgação. Os vetores incluem, mas não se li- mitam a, plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófago, vírus animais e vírus vegetais) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs), como vetores retrovirais (por exemplo, derivados de vetores do vírus da leu- cemia murina de Moloney (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV, etc), vetores lentivirais (por exemplo, derivados do HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV etc, vetores adenovirais (Ad), incluindo replicação competente, re- plicação deficiente e formas não intestinais, vetores virais adenoasso- ciados (AAV), vetores do vírus símio 40 (SV-40), vetores do vírus do papiloma bovino, vetores do vírus Epstein-Barr, vetores do vírus her- pes, vetores do vírus vaccinia, vetores do vírus do sarcoma murino de Harvey, vetores do vírus do tumor mamário murino, vetores do parvoi- vírus, vetores do vírus da poliomielite, vetores do vírus da estomatite vesiculosa, vetores do vírus maraba e vetores do adenovírus enadeno- tucirev do grupo B. a. Vetores virais

[00133] Os vetores virais que codificam um receptor de antígeno podem ser fornecidos em certos aspectos da presente divulgação. Na geração de vetores virais recombinantes, genes não essenciais são tipicamente substituídos por um gene ou sequência de codificação pa- ra uma proteína heteróloga (ou não nativa). Um vetor viral é uma es- pécie de construção de expressão que utiliza sequências virais para introduzir ácido nucleico e possivelmente proteínas em uma célula. A capacidade de certos vírus infectarem células ou entrarem em células através da endocitose mediada por receptores, e de se integrarem em genomas de células hospedeiras e expressarem genes virais de forma estável e eficiente, tornaram-nos candidatos atraentes para a transfe-

rência de ácidos nucleicos estranhos para células (por exemplo, célu- las de mamíferos). Exemplos não limitantes de vetores de vírus que podem ser usados para fornecer um ácido nucleico de certos aspectos da presente invenção são descritos abaixo.

[00134] Os lentivírus são retrovírus complexos, que, além dos ge- nes comuns retrovirais gag, pol e env, contêm outros genes com fun- ção regulatória ou estrutural. Os vetores lantivirais são bem conheci- dos na técnica (ver, por exemplo, as patentes US 6.013.516 e

5.994.136).

[00135] Os vetores lentivirais recombinantes são capazes de infec- tar células não divisórias e podem ser usados para a transferência de genes in vivo e ex vivo e para a expressão de sequências de ácidos nucleicos. Por exemplo, o lentivírus recombinante capaz de infectar uma célula não divisória - em que uma célula hospedeira adequada é transfectada com dois ou mais vetores que transportam as funções de empacotamento, nomeadamente gag, pol e env, bem como rev e tat - é descrito na patente US 5.994.136, incorporada aqui por referência. b. Elementos reguladores

[00136] As cassetes de expressão incluídas nos vetores úteis na presente divulgação contêm (em uma direção de 5' a 3') um promotor transcricional eucariótico ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação de proteínas, sinais de junção, incluindo sequências intervenientes, e uma sequência de terminação/poliadenilação trans- cricional. Os promotores e potenciadores que controlam a transcrição de genes codificantes de proteínas em células eucarióticas são com- postos por múltiplos elementos genéticos. A maquinaria celular é ca- paz de reunir e integrar a informação regulamentar transmitida por ca- da elemento, permitindo que diferentes genes evoluam padrões distin- tos, muitas vezes complexos, de regulação transcricional. Um promo- tor usado no contexto da presente divulgação inclui promotores consti-

tutivos, induzíveis e específicos do tecido. (i) Promotor/potencializadores

[00137] As construções de expressão fornecidas aqui compreen- dem um promotor para impulsionar a expressão do receptor de antí- genos. Um promotor é geralmente composto por uma sequência que funciona para posicionar o local de início para a síntese de RNA. O exemplo mais conhecido disto é a caixa TATA, mas em alguns promo- tores que não têm uma caixa TATA, como, por exemplo, o promotor do gene de desoxinucleotidil transferase terminal de mamífero e o promo- tor dos genes tardios SV40, um elemento discreto sobreposto ao sítio inicial ajuda a fixar o local de início. Os elementos promotores adicio- nais regulam a frequência da iniciação transcricional. Normalmente, estes estão localizados na região a 30110 pb a montante do local de partida, embora um número de promotores tenha sido demonstrado para conter elementos funcionais a jusante do local de partida tam- bém. Para apresentar uma sequência de codificação "sob o controle de” um promotor, um posiciona a extremidade 5’ do local de iniciação da transcrição da estrutura de leitura transcricional "a jusante" do (ou seja, 3’ do) promotor escolhido. O promotor "a montante" estimula a transcrição do DNA e promove a expressão do RNA codificado.

[00138] O espaçamento entre os elementos promotores é frequen- temente flexível, de modo que a função do promotor seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor tk, o espaçamento entre os elementos promoto- res pode ser aumentado para 50 bp antes da atividade começar a de- clinar. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um "potencializador", que se refere a uma sequência reguladora de ação cis envolvida na ativação transcricional de uma sequência de ácidos nucleicos.

[00139] Um promotor poderá ser um naturalmente associado com uma sequência de ácido nucleico, como pode ser obtido através do isolamento das sequências 5' não codificantes localizadas a montante do segmento de codificação e/ou éxon. Tal promotor pode ser referido como “endógeno”. Da mesma forma, um potencializador pode ser um naturalmente associado a uma sequência de ácidos nucleicos, locali- zada a jusante ou a montante dessa sequência. Alternativamente, cer- tas vantagens serão obtidas ao posicionar um segmento de codifica- ção de ácidos nucleicos sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não é normalmente associado com a sequência de ácido nucleico em seu ambiente natu- ral. Um potencializador recombinante ou heterólogo refere-se também a um potenciador normalmente não associado a uma sequência de ácidos nucleicos no seu ambiente natural. Tais promotores ou poten- ciadores podem incluir promotores ou potenciadores de outros genes, e promotores ou potenciadores isolados de qualquer outro vírus, ou células procarióticas ou eucarióticas, e promotores ou potenciadores que não "ocorrem naturalmente", ou seja, contendo elementos diferen- tes de diferentes regiões reguladoras transcricionais, e/ou mutações que alteram a expressão. Por exemplo, os promotores mais usados na construção de DNA recombinante incluem os sistemas de promoto- res de lactamase (penicilinase), lactose e triptofano (trp-). Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e potenciado- res de forma sintética, as sequências podem ser produzidas usando clonagem recombinante e/ou tecnologia de amplificação de ácidos nu- cléicos, incluindo PCR™, em conjunto com as composições descritas aqui. Além disso, é contemplado que as sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de or- ganelas não nucleares, como mitocôndrias, cloroplastos e similares,

também podem ser usadas.

[00140] Naturalmente, será importante usar um promotor e/ou po- tenciador que efetivamente direciona a expressão do segmento de DNA na organela, tipo de célula, tecido, órgão ou organismo escolhido para expressão. O versado na técnica da biologia molecular geral- mente conhece o uso de promotores, potenciadores e combinações de tipos de células para expressão de proteínas, (ver, por exemplo, Sam- brook et al. 1989, aqui incorporado por referência). Os promotores usados podem ser constitutivos, específicos para tecidos, induzíveis e/ou úteis nas condições apropriadas para direcionar a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido, como é vantajoso na pro- dução em larga escala de proteínas recombinantes e/ou peptídeos. O promotor pode ser heterólogo ou endógeno.

[00141] Além disso, qualquer combinação de promotor/potenciador (como, por exemplo, o banco de dados de promotor eucariótico EPDB, através do site epd.isb-sib.ch/) também pode ser usada para direcionar a expressão. O uso de um sistema de expressão citoplasmática T3, T7 ou SP6 é outra possível modalidade. As células eucarióticas po- dem suportar a transcrição citoplasmática de certos promotores bacte- rianos se for fornecida a polimerase bacteriana adequada, quer como parte do complexo de administração, quer como uma construção adi- cional de expressão genética.

[00142] Exemplos não limitantes de promotores incluem promotores virais precoces ou tardios, como promotores SV40 precoces ou tardi- os, promotores imediatos precoces do citomegalovírus (CMV), promo- tores precoces do vírus do sarcoma de Rous (RSV); promotores de células eucarióticas, como, por exemplo, promotor de beta actina, promotor GADPH, promotor de metalotioneina; e promotores de ele- mentos de resposta concatenados, como promotores de elementos de resposta AMP cíclicos (cre), promotor de elemento de resposta de so-

ro (sre), promotor de éster de forbol (TPA) e promotores de elementos de resposta (tre) perto de uma caixa TATA mínima. Também é possí- vel usar sequências de promotores de hormônio do crescimento hu- mano (por exemplo, o promotor mínimo do hormônio do crescimento humano descrito em Genbank, no. De acesso X05244, nucleotídeo 283-341) ou um promotor do tumor mamário do camundongo (disponí- vel a partir da ATCC, Cat No. ATCC 45007). Em certas modalidades, o promotor é CMV IE, dectina-1, dectina-2, CD11c humano, F4/80, SM22, VRS, SV40, Ad MLP, beta-actina, promotor MHC classe I ou MHC classe II, porém qualquer outro promotor que seja útil para dire- cionar a expressão do gene terapêutico é aplicável à prática da pre- sente divulgação.

[00143] Em certos aspectos, os métodos da divulgação também se referem a sequências de potenciadores, ou seja, sequências de ácidos nucleicos que aumentam a atividade de um promotor e que têm poten- cial para agir no cis, e independentemente da sua orientação, mesmo em distâncias relativamente longas (até vários quilobases longe do promotor alvo). No entanto, a função de potenciador não está neces- sariamente restrita a distâncias tão longas, pois também podem funci- onar próximo de um determinado promotor. (ii) Sinais de iniciação e expressão associada

[00144] Um sinal de iniciação específico também pode ser usado nas construções de expressão fornecidas na presente divulgação para uma tradução eficiente de sequências de codificação. Estes sinais in- cluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Podem ser necessários sinais de controle translacional exógenos, incluindo o códão de iniciação ATG. Um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar isso e fornecer os sinais necessários. Sabe-se que o códon de iniciação deve estar "dentro do quadro" com o quadro de leitura da sequência de codificação pretendida para garantir a tra-

dução de todo o elemento de inserção. Os sinais de controle transla- cional exógeno e os códons de iniciação podem ser naturais ou sintéti- cos. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos apropriados do potencializador de transcrição.

[00145] Em determinadas modalidades, o uso de elementos do sítio de entrada interno no ribossomo (IRES) é usado para criar mensagens multigene, ou policistrônico. Os elementos IRES são capazes de igno- rar o modelo de digitalização do ribossomo de tradução dependente de Cap metilado de 5' e começar a tradução em locais internos. Foram descritos elementos IRES de dois membros da família picornavirus (pólio e encefalomiocardite), bem como um IRES de uma mensagem de mamíferos. Os elementos IRES podem ser ligados a quadro de lei- tura aberto heterólogo. Podem ser transcritos vários quadros de leitu- ra abertos em conjunto, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada qua- dro de leitura aberto é acessível a ribossomos para uma tradução efi- ciente. Vários genes podem ser expressados de forma eficiente usan- do um único promotor/potenciador para transcrever uma única mensa- gem.

[00146] Além disso, certos elementos da sequência 2A podem ser usados para criar uma coexpressão ou ligação de genes nas constru- ções fornecidas na presente divulgação. Por exemplo, as sequências de clivagem poderiam ser usadas para coexpressar genes ligando quadros de leitura abertos para formar um único cístron. Uma sequên- cia de clivagem exemplar é a F2A (vírus da febre aftosa 2A) ou uma sequência "semelhante a 2A" (por exemplo, vírus Thosea asigna 2A; T2A). (iii) Origens da replicação

[00147] A fim de propagar um vetor em uma célula hospedeira, ele pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (frequente-

mente designados por "ori"), por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos correspondente ao oriP da EBV, como descrito acima, ou um oriP geneticamente modificado com uma função semelhante ou eleva- da na programação, que é uma sequência específica de ácidos nuclei- cos na qual a replicação é iniciada. Alternativamente, pode ser usada uma origem de replicação de outro vírus replicador extra- cromossômico, conforme descrito acima, ou uma sequência replicante de forma autônoma (ARS). c. Marcadores de seleção e de triagem

[00148] Em algumas modalidades, as células contendo uma cons- trução da presente divulgação podem ser identificadas in vitro ou in vivo, incluindo um marcador no vetor de expressão. Esses marcado- res confeririam uma alteração identificável à célula, permitindo uma fácil identificação das células contendo o vetor de expressão. Geral- mente, um marcador de seleção é aquele que confere uma proprieda- de que permite a seleção. Um marcador de seleção positivo é aquele em que a presença do marcador permite sua seleção, enquanto um marcador de seleção negativo é aquele em que sua presença impede sua seleção. Um exemplo de um marcador de seleção positivo é um marcador de resistência a fármacos.

[00149] Geralmente, a inclusão de um marcador de seleção de fár- macos auxilia na clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores de sele- ção úteis. Além de marcadores que conferem um fenótipo que permite a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, outros tipos de marcadores, incluindo marcadores de tria- gem, como GFP, cuja base é a análise colorimétrica, também são con- templados. Alternativamente, as enzimas triáveis como marcadores de seleção negativos, como vírus do herpes simples timidina quinase

(tk) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT) podem ser usados. Um profissional versado na técnica também saberia como usar marcado- res imunológicos, possivelmente em conjunto com a análise FACS. O marcador usado não é considerado importante, desde que seja capaz de ser expressado em simultâneo com o ácido nucleico que codifica um produto genético. Outros exemplos de seleção e marcadores triá- veis são bem conhecidos por um profissional versado na técnica. d. Outros métodos de aplicação de ácido nucleico

[00150] Além da administração viral dos ácidos nucleicos que codi- ficam o receptor do antígeno, a seguir são métodos adicionais de ad- ministração do gene recombinante a uma determinada célula hospe- deira, sendo assim considerados na presente divulgação.

[00151] A introdução de um ácido nucleico, como o DNA ou RNA, nas células imunes da presente divulgação pode usar quaisquer méto- dos adequados para a administração de ácidos nucleicos para a trans- formação de uma célula, tal como descrito aqui ou como seria conhe- cido por um versado na técnica. Tais métodos incluem, entre outros, a aplicação direta de DNA, como por transfecção ex vivo, por injeção, incluindo a microinjeção); por eletroporação; por precipitação de fosfa- to de cálcio; por uso de DEAE-dextrano seguido de polietilenoglicol; por carregamento sônico direto; por transfecção mediada por liposso- mo e transfecção mediada por receptor; por bombardeamento de mi- croprojétil; por agitação com fibras de carboneto de silício; por trans- formação mediada por Agrobacterium; pela absorção de DNA mediada por dessecação/inibição e qualquer combinação desses métodos. Através da aplicação de técnicas como estas, a(s) organela(s), a(s) célula(s), o(s) tecido(s) ou o(s) organismo(s) podem ser transformados de forma estável ou transitória. F. Modificação da expressão genética

[00152] Em algumas modalidades, as células imunes da presente divulgação são modificadas para terem uma expressão alterada de CISH. Em modalidades adicionais, as células podem ser modificadas posteriormente para terem a expressão interrompida do receptor de glicocorticoides e/ou do receptor TGFβ (por exemplo, TGFβ-RII). Em uma modalidade, as células imunes podem ser modificadas para ex- pressar um receptor TGFβ II (TGFβRIIDN) negativo dominante que pode funcionar como um depósito de citocinas para esgotar o TGFβ endógeno.

[00153] Em algumas modalidades, a expressão gênica alterada é realizada por meio de uma interrupção no gene, como uma inativação, inserção, detecção errada ou mutação frameshift, como mutação fra- meshift bialélica, deleção de todo ou parte do gene, por exemplo, um ou mais éxon ou parte do mesmo, e/ou knock-in. Por exemplo, a ex- pressão genética alterada pode ser afetada por por nucleases especí- ficas ou direcionadas de sequência, incluindo nucleases-alvo de liga- ção ao DNA, como nucleases de dedos de zinco (ZFN) e nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), e nucleases guia- das por RNA, como uma nuclease associada a CRISPR (Cas), especi- ficamente desenhadas para serem direcionadas para a sequência do gene ou para uma parte do mesmo.

[00154] Em algumas modalidades, a alteração da expressão, ativi- dade e/ou função do gene é realizada por interrupção do gene. Em alguns aspectos, o gene é modificado de modo que sua expressão se- ja reduzida em pelo menos 20, 30 ou 40%, geralmente pelo menos ou cerca de 50, 60, 70, 80, 90, ou 95% em comparação com a expressão na ausência da modificação genética ou na ausência dos componen- tes introduzidos para efeito da modificação.

[00155] Em algumas modalidades, a alteração é transitória ou re- versível, de modo que a expressão do gene seja restaurada posteri- ormente. Em outras modalidades, a alteração não é reversível ou tran-

sitória, por exemplo, é permanente.

[00156] Em algumas modalidades, a alteração genética é realizada pela indução de uma ou mais quebras de fita dupla e/ou uma ou mais quebras de fita simples no gene, normalmente de uma forma direcio- nada. Em algumas modalidades, as quebras de fita dupla ou de fita simples são feitas por uma nuclease, por exemplo, uma endonuclease, como uma nuclease direcionada ao gene. Em alguns aspectos, as quebras são induzidas na região codificadora do gene, por exemplo, em um éxon. Por exemplo, em algumas modalidades, a indução ocor- re perto da porção N-terminal da região de codificação, por exemplo, no primeiro éxon, no segundo éxon, ou em um éxon subsequente.

[00157] Em alguns aspectos, as quebras de fita dupla ou de fita simples são submetidas à reparação através de um processo de repa- ração celular, como, por exemplo, por junção de extremidade não ho- móloga (NHEJ) ou reparação dirigida por homologia (HDR). Em alguns aspectos, o processo de reparação é propenso a erros e resulta em interrupção do gene, como uma mutação frameshift, por exemplo, mu- tação frameshift bialélica, que pode resultar em completo nocaute do gene. Por exemplo, em alguns aspectos, a interrupção compreende a indução de uma deleção, mutação e/ou inserção. Em algumas modali- dades, a interrupção resulta na presença de um códon de parada pre- coce. Em alguns aspectos, a presença de uma inserção, deleção, translocação, mutação frameshift e/ou códon de parada prematura re- sulta em interrupção da expressão, atividade e/ou função do gene.

[00158] Em algumas modalidades, a alteração genética é obtida através de técnicas anti-sentido, como por interferência de RNA (RNAi), RNA interferente pequeno (siRNA), hairpin curto (shRNA), e/ou ribozimas são usadas para suprimir ou reprimir seletivamente a expressão do gene. A tecnologia siRNA é o RNAi que usa uma molé- cula de RNA de fita dupla tendo uma sequência homóloga com a se-

quência nucleotídica de mRNA transcrita do gene, e uma sequência complementar com a sequência de nucleotídeos. O siRNA geralmente é homólogo/complementar com uma região de mRNA transcrita do gene, ou pode ser o siRNA incluindo uma pluralidade de moléculas de RNA homólogas/complementares com diferentes regiões. Em alguns aspectos, o siRNA é composto por uma construção policistrônica.

1. ZFPs e ZFNs

[00159] Em algumas modalidades, a molécula de direcionamento do DNA inclui uma proteína de ligação ao DNA, como uma ou mais proteínas de dedo de zinco (ZFP) ou proteína tipo ativador de transcri- ção (TAL), fundida a uma proteína efetora, como uma endonuclease. Os exemplos incluem ZFNs, TALEs e TALENs.

[00160] Em algumas modalidades, a molécula de direcionamento do DNA compreende uma ou mais proteínas de dedo de zinco (ZFPs) ou domínios que se ligam ao DNA de forma específica de sequência. Uma ZFP ou domínio da mesma é uma proteína ou domínio dentro de uma proteína maior que liga o DNA de forma específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco, regiões de sequência de ami- noácidos no domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O termo proteína de ligação de DNA de dedo de zinco é frequentemente abreviado como proteína de dedo de zinco ou ZFP. Entre as ZFPs estão os domínios artificiais da ZFP que direcionam sequências específicas de DNA, normalmente com 9-18 nucleotídeos de comprimento, gerados pela montagem de dedos individuais.

[00161] As ZFPs incluem aquelas em que um domínio de dedo úni- co tem aproximadamente 30 aminoácidos de comprimento e contém uma hélice alfa contendo dois resíduos invariantes da histidina coor- denados através do zinco com duas cisteínas de uma única curva be- ta, e com dois, três, quatro, cinco ou seis dedos. Geralmente, a especi-

ficidade de sequência de uma ZFP pode ser alterada fazendo substi- tuições de aminoácidos nas quatro posições de hélice (-1, 2, 3 e 6) em uma hélice de reconhecimento de dedos de zinco. Assim, em algumas modalidades, a ZFP ou a molécula que contém a ZFP não ocorre natu- ralmente, por exemplo, foi concebida para se ligar a um local alvo de escolha.

[00162] Em algumas modalidades, a molécula direcionando o DNA é ou compreende um domínio de ligação do DNA do dedo de zinco fundido a um domínio de clivagem do DNA para formar uma nuclease do dedo de zinco (ZFN). Em algumas modalidades, as proteínas de fusão compreendem o domínio da clivagem (ou meio-domínio de cli- vagem) de pelo menos uma enzima de restrição do tipo liS e um ou mais domínios de ligação do dedo de zinco, que podem ou não ser modificados. Em algumas modalidades, o domínio de clivagem é en- donuclease Fok I de restrição do tipo liS. Fok I geralmente catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotídeos de seu local de re- conhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu local de reconhe- cimento no outro.

[00163] Muitos dedos de zinco modificados específicos para genes estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, a Sangamo Bioscien- ces (Richmond, CA, EUA) desenvolveu uma plataforma (CompoZr) para a construção de dedos de zinco em parceria com a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), permitindo que os investigadores contornem completamente a construção e validação do dedo de zinco, e fornece dedos de zinco especificamente orientados para milhares de proteínas (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). Em algu- mas modalidades, os dedos de zinco disponíveis no mercado são usados ou são desenhados sob medida. (Consultar, por exemplo, os números de catálogo de Sigma-Aldrich CSTZFND, CSTZFN, CTil-lKT e PZD0020).

2. TALs, TALEs e TALENs

[00164] Em algumas modalidades, a molécula alvo do DNA com- preende um domínio de ligação do DNA da proteína do tipo ativadora de transcrição (TAL) de ocorrência natural ou modificada (não ocor- rência natural), como em uma proteína efetora da proteína do tipo ati- vadora da transcrição (TALE), ver, por exemplo, a publicação de pa- tente US Nº 2011/0301073, incorporada por referência em sua totali- dade aqui.

[00165] Um domínio de ligação do DNA TALE ou TALE é um poli- peptídeo compreendendo um ou mais domínios/unidades de repetição de TALE. Os domínios de repetição estão envolvidos na ligação do TALE à sua sequência de DNA alvo cognato. Uma única "unidade de repetição" (também referida como "repetição") tem tipicamente 33-35 aminoácidos de comprimento e apresenta pelo menos alguma homo- logia de sequência com outras sequências de repetição de TALE den- tro de uma proteína TALE de ocorrência natural. Cada unidade de re- petição TALE inclui 1 ou 2 resíduos de ligação ao DNA, compondo o di-resíduo de repetição variável (RVD), normalmente nas posições 12 e/ou 13 da repetição. O código natural (canônico) para o reconheci- mento de DNA destes TALEs foi determinado de modo a que uma se- quência HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação à citosina (C), o NG se liga a T, NI a A, NN se liga a G ou A, e NO se liga a T e RVDs não canônicos (atípicos) também são conhecidos. Em algumas moda- lidades, TALEs podem ser direcionados a qualquer gene através do design de matrizes TAL com especificidade para a sequência de DNA alvo. Geralmente, a sequência alvo começa com uma timidina.

[00166] Em algumas modalidades, a molécula é uma endonuclease de ligação ao DNA, como uma nuclease TALE (TALEN). Em alguns aspectos, o TALEN é uma proteína de fusão compreendendo um do- mínio de ligação ao DNA derivado de um TALE e um domínio catalítico de nuclease para clivar uma sequência alvo de ácido nucleico.

[00167] Em algumas modalidades, o TALEN reconhece e cliva a sequência alvo no gene. Em alguns aspectos, a clivagem do DNA re- sulta em quebras de fita dupla. Em alguns aspectos, as quebras esti- mulam a taxa de recombinação homóloga ou de junção de extremida- de não homóloga (NHEJ). Geralmente, NHEJ é um processo de repa- ro imperfeito que muitas vezes resulta em mudanças na sequência de DNA no local da clivagem. Em alguns aspectos, os mecanismos de reparo envolvem a re-junção do que resta das duas extremidades do DNA através da re-ligação direta ou através da chamada junção de extremidade mediada pela microhomologia. Em algumas modalidades, a reparação através do NHEJ resulta em pequenas inserções ou dele- ções e pode ser usada para interromper e, assim, reprimir o gene. Em algumas modalidades, a modificação pode ser uma substituição, dele- ção, ou adição de pelo menos um nucleotídeo. Em alguns aspectos, as células em que ocorreu um evento de mutagênese induzido por cli- vagem, ou seja, um evento de mutagênese consecutivo a um evento NHEJ, podem ser identificadas e/ou selecionadas por métodos bem conhecidos na técnica.

[00168] Em algumas modalidades, as repetições de TALE são mon- tadas para direcionar especificamente um gene. (Gaj et al., 2013). Uma biblioteca de TALENs direcionando 18.740 genes de codificação de proteínas humanas foi construída (Kim et al., 2013). Matrizes de TALE personalizadas estão disponíveis comercialmente através de Cellectis Bioresearch (Paris, França), Transposagen Biopharmaceuti- cals (Lexington, KY, EUA) e Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). Especificamente, os TALENs que têm como alvo o CD38 estão disponíveis comercialmente (ver Gencopoeia, números de catálogo HTN222870-l, HTN222870-2 e HTN222870-3). Moléculas exemplares são descritas, por exemplo, nas publicações de patentes US Nºs.

2014/0120622 e 2013/0315884.

[00169] Em algumas modalidades, os TALENs são introduzidos como genes trans codificados por um ou mais vetores plasmídeos. Em alguns aspectos, o vetor plasmidial pode conter um marcador de sele- ção que fornece identificação e/ou seleção de células que receberam o dito vetor.

3. RGENs (sistemas CRISPR/Cas)

[00170] Em algumas modalidades, a alteração é realizada usando um ou mais ácidos nucleicos de ligação ao DNA, como alteração atra- vés de uma endonuclease guiada por RNA (RGEN). Por exemplo, a alteração pode ser realizada usando repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) e proteínas as- sociadas a CRISPR (Cas). Em geral, "sistema CRISPR" refere-se cole- tivamente a transcrições e outros elementos envolvidos na expressão ou direcionamento da atividade de genes associados ao CRISPR ("Cas"), incluindo sequências que codificam um gene Cas, uma se- quência tracr (trans-ativando CRISPR) (por exemplo, tracrRNA ou um tracrRNA ativo parcial), uma sequência tracr-mate (englobando uma "repetição direta" e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma se- quência guia (também referida como "espaçador" no contexto de um sistema CRISPR endógeno), e/ou outras sequências e transcrições de um locus CRISPR.

[00171] O sistema de nuclease CRISPR/Cas ou de nuclease CRISPR/Cas pode incluir uma molécula de RNA (guia) não codificada, que se liga especificamente pela sequência ao DNA, e uma proteína Cas (por exemplo, Cas9), com funcionalidade de nuclease (por exem- plo, dois domínios de nuclease). Um ou mais elementos de um siste- ma CRISPR pode derivar de um sistema CRISPR do tipo I, tipo II ou tipo III, por exemplo, derivado de um organismo específico que com-

preende um sistema CRISPR endógeno, como o Streptococcus pyo- genes.

[00172] Em alguns aspectos, uma nuclease Cas e um gRNA (inclu- indo uma fusão de crRNA específico para a sequência alvo e um tracrRNA fixo) são introduzidos na célula. Em geral, os locais-alvo na extremidade 5' do gRNA direcionam a nuclease Cas para o local-alvo, por exemplo, o gene, usando o emparelhamento de base complemen- tar. O local de destino pode ser selecionado com base em sua locali- zação imediatamente 5' de uma sequência de motivos adjacentes ao protoespaçador (PAM), como tipicamente NGG ou NAG. A este respei- to, o gRNA é direcionado para a sequência desejada modificando os primeiros 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 ou 10 nucleotídeos do RNA guia para corresponder à sequência de DNA alvo. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a for- mação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo. Normalmente, a "sequência alvo" refere-se geralmente a uma sequên- cia à qual uma sequência guia foi desenhada para ter complementari- dade, onde a hibridização entre a sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. A complementa- ridade total não é necessariamente necessária, desde que haja com- plementaridade suficiente para provocar a hibridização e promover a formação de um complexo CRISPR.

[00173] O sistema CRISPR pode induzir quebras de fita dupla (DSBs) no local alvo, seguido de interrupções ou alterações, conforme discutido aqui. Em outras modalidades, as variantes Cas9, considera- das "nicases", são usadas para cortar uma única fita no site alvo. Ni- cases emparelhadas podem ser usadas, por exemplo, para melhorar a especificidade, cada uma dirigida por um par de gRNAs diferentes di- recionando sequências tais que, após a introdução dos cortes simulta- neamente, uma saliência 5' é introduzida. Em outras modalidades, o

Cas9 catalisadamente inativo é fundido a um domínio efetor heterólo- go, como um repressor ou ativador transcricional, para afetar a ex- pressão gênica.

[00174] A sequência alvo pode incluir qualquer polinucleotídeo, co- mo os polinucleotídeos de DNA ou RNA. A sequência alvo pode estar localizada no núcleo ou citoplasma da célula, como numa organela da célula. Geralmente, uma sequência ou modelo que pode ser usado para recombinação no locus alvo compreendendo as sequências alvo é referido como um "modelo de edição" ou "edição de polinucleotí- deos" ou "sequência de edição". Em alguns aspectos, um polinucleotí- deo de modelo exógeno pode ser referido como um modelo de edição. Em alguns aspectos, a recombinação é recombinação homóloga.

[00175] Tipicamente, no contexto de um sistema de CRISPR endó- geno, a formação do complexo CRISPR (compreendendo a sequência guia hibridizada à sequência alvo e complexada com uma ou mais pro- teínas Cas) resulta nem uma clivagem de uma ou ambas as fitas den- tro ou perto (por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou mais pares de bases de) da sequência alvo. A sequência tracr, que pode incluir ou consistir em toda ou parte de uma sequência tracr do tipo selvagem (por exemplo, cerca de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 ou mais nucleotídeos de uma sequência tracr do tipo selvagem), tam- bém podem fazer parte do complexo CRISPR, como por hibridização ao longo de pelo menos uma porção da sequência tracr para toda ou uma parte de uma sequência tracr par que está ligada de maneira fun- cional à sequência guia. A sequência tracr tem complementaridade suficiente com uma sequência tracr par para hibridizar e participar na formação do complexo CRISPR, como pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr par quando perfeitamente alinha- da.

[00176] Um ou mais vetores que direcionam a expressão de um ou mais elementos do sistema CRISPR podem ser introduzidos na célula de tal forma que a expressão dos elementos do sistema CRISPR tem formação direta do complexo CRISPR em um ou mais locais alvo. Os componentes também podem ser fornecidos às células como proteí- nas e/ou RNA. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada a uma sequência tracr par e uma sequência tracr podem ser ligadas de maneira funcional a elementos reguladores separados em vetores separados. Alternativamente, dois ou mais elementos expres- sados a partir de elementos reguladores iguais ou diferentes podem ser combinados em um único vetor, com um ou mais vetores adicio- nais fornecendo quaisquer componentes do sistema CRISPR não in- cluídos no primeiro vetor. O vetor pode incluir um ou mais locais de inserção, como uma sequência de reconhecimento de endonuclease de restrição (também chamada de "local de clonagem"). Em algumas modalidades, um ou mais locais de inserção estão localizados a mon- tante e/ou a jusante de um ou mais elementos de sequência de um ou mais vetores. Quando várias sequências de guia diferentes são usa- das, uma única construção de expressão pode ser usada para direcio- nar a atividade CRISPR para várias sequências alvo diferentes e cor- respondentes dentro de uma célula.

[00177] Um vetor pode incluir um elemento regulador ligado de ma- neira funcional a uma sequência de codificação enzimática que codifi- ca a enzima CRISPR, como uma proteína Cas. Exemplos não limitan- tes de proteínas Cas incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos dos mesmos, ou versões modificadas dos mesmos. Estas enzimas são conhecidas; por exem- plo, a sequência de aminoácidos da proteína Cas9 de S. pyogenes pode ser encontrada no banco de dados SwissPrott com o número de admissão Q99ZW2.

[00178] A enzima CRISPR pode ser Cas9 (por exemplo, de S. pyo- genes ou S. pneumonia). A enzima CRISPR pode direcionar a cliva- gem de uma ou de ambas as fitas na localização de uma sequência alvo, como na sequência alvo e/ou no complemento da sequência al- vo. O vetor pode codificar uma enzima CRISPR que é mutada em re- lação a uma enzima tipo selvagem correspondente, de modo que a enzima CRISPR mutada não tem a capacidade de clivar uma ou am- bas as fitas de um polinucleotídeo alvo contendo uma sequência alvo. Por exemplo, uma substituição aspartato-para-alanina (D10A) no do- mínio catalítico de RuvC I de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que cliva ambas as fitas para uma nicase (cliva uma fita simples). Em algumas modalidades, uma Cas9 nicase pode ser usada em combinação com sequência(s) guia(s), por exemplo, duas sequên- cias-guia, que visam, respectivamente, fitas de sentido e anti-sentido do DNA alvo. Esta combinação permite que ambas as fitas sejam cor- tadas e usadas para induzir NHEJ ou HDR.

[00179] Em algumas modalidades, uma sequência de codificação enzimática que codifica a enzima CRISPR é otimizada por códon para expressão em células específicas, como células eucarióticas. As célu- las eucarióticas podem ser de ou derivadas de um organismo específi- co, como um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, humanos, camundongo, ratos, coelhos, cães ou primatas não humanos. Em ge- ral, a otimização do códon refere-se a um processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para maior expressão nas células hospedeiras de interesse pela substituição de pelo menos um códon da sequência nativa com códons que são usados mais frequentemente ou com mais frequência nos genes dessa célula hospedeira, mantendo a sequência de aminoácidos nativa. Diversas espécies apresentam viés particular para certos códons de um determinado aminoácido. O viés do códon (diferenças do uso do códon entre os organismos) mui- tas vezes se correlaciona com a eficiência da translação do RNA men- sageiro (mRNA) que, por sua vez, é acreditado ser dependente, entre outras coisas, das propriedades dos códons sendo traduzidos e a dis- ponibilidade de moléculas de RNA de transferência (tRNA). A predo- minância de tRNAs selecionados em uma célula geralmente é um re- flexo dos códons mais frequentemente usados na síntese do peptídeo. Nesse sentido, os genes podem ser adaptados para uma ótima ex- pressão gênica em um dado organismo baseada na otimização do có- don.

[00180] Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência de po- linucleotídeos que tenha uma complementaridade suficiente com uma sequência de polinucleotídeos alvo para hibridizar com a sequência alvo e a ligação direta específica da sequência do complexo CRISPR à sequência alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementari- dade entre uma sequência guia e a sua sequência alvo corresponden- te, quando perfeitamente alinhado usando um algoritmo de alinhamen- to adequado, é de cerca de ou mais de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais.

[00181] As sequências de gRNA exemplares para NR3CS (receptor de glicocorticoide) incluem Ex3 NR3C1 sG1 5-TGC TGT TGA GGA GCT GGA-3 (SEQ ID NO:1) e Ex3 NR3C1 sG2 5-AGC ACA CCA GGC AGA GTT-3 (SEQ ID NO:2). As sequências de gRNA exemplares para o receptor TGF-beta 2 incluem EX3 TGFBR2 sG1 5-CGG CTG AGG AGC GGA AGA-3 (SEQ ID NO:3) e EX3 TGFBR2 sG2 5-TGG-AGG- TGA-GCA-ATC-CCC-3 (SEQ ID NO:4). O promotor T7, a sequência alvo e a sequência de sobreposição podem ter a sequência TTAATA-

CGACTCACTATAGG (SEQ ID NO:5) + a sequência alvo + gttttagagc- tagaaatagc (SEQ ID NO:6).

[00182] O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, cujo exemplo não limitante inclui o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo Needle- man-Wunsch, algoritmos baseados na transformação Burrows- Wheeler (por exemplo, o Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn), e Maq (disponível em maq.sourceforge.net).

[00183] A enzima CRISPR pode fazer parte de uma proteína de fu- são compreendendo um ou mais domínios de proteínas heterólogas. Uma proteína de fusão enzimática CRISPR pode incluir qualquer se- quência de proteínas adicional e, opcionalmente, uma sequência ligan- te entre quaisquer dois domínios. Exemplos de domínios proteicos que podem ser fundidos a uma enzima CRISPR incluem, mas não se limi- tam a, etiquetas de epítopo, sequências de genes repórter e domínios proteicos com uma ou mais das seguintes atividades: atividade de me- tilase, atividade de desmetilase, atividade de ativação da transcrição, atividade de repressão da transcrição, atividade do fator de liberação da transcrição, atividade de modificação da histona, atividade de cliva- gem do RNA e atividade de ligação do ácido nucleico. Exemplos não limitantes de etiquetas de epítopo incluem etiquetas de histidina (His), etiquetas de V5, etiquetas de FLAG, etiquetas de hemaglutinina da influenza (HA), etiquetas de Myc, etiquetas de VSV-G e etiquetas de tioredoxina (Trx). Exemplos de genes repórter incluem, mas não se limitam a, glutationa-5-transferase (GST), peroxidase de rábano (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta galactosidase, beta- glucuronidase, luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), HcRed, DsRed, proteína fluorescente ciano (CFP), proteína fluorescente ama-

rela (YFP) e proteínas autofluorescentes incluindo proteína fluorescen- te azul (BFP). Uma enzima CRISPR pode ser fundida a uma sequên- cia genética que codifica uma proteína ou um fragmento de uma prote- ína que liga moléculas de DNA ou liga outras moléculas celulares, in- cluindo, mas não se limitando a, proteínas de ligação de maltose (MBP), S-tag, fusões do domínio de ligação do DNA Lex A (DBD), fu- sões do domínio de ligação de DNA GAL4A e fusões de proteína BP16 do vírus da herpes simples (HSV). Os domínios adicionais que podem fazer parte de uma proteína de fusão compreendendo uma enzima CRISPR são descritos em US 20110059502, incorporados aqui por referência. III. Métodos de tratamento

[00184] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de imunoterapia, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz das células NK da presente divulgação. Em uma modalidade, uma doença ou distúrbio médico é tratado pela transfe- rência de uma população de células NK que provoca uma resposta imune. Em determinadas modalidades da presente divulgação, o cân- cer ou a infecção é tratado através da transferência de uma população de células NK que provoca uma resposta imunológica. São fornecidos aqui métodos para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma terapia celular antígeno-específico. Os métodos atuais podem ser aplicados para o tratamento de distúrbios imunes, cânceres sólidos, cânceres hematológicos e infecções virais.

[00185] Os tumores para os quais os presentes métodos de trata- mento são úteis incluem qualquer tipo de célula maligna, como os en- contrados em um tumor sólido ou em um tumor hematológico. Tumo- res sólidos exemplares podem incluir, mas não se limitam a, um tumor de um órgão selecionado do grupo que consiste em pâncreas, cólon,

ceco, estômago, cérebro, cabeça, pescoço, ovário, rim, laringe, sar- coma, pulmão, bexiga, melanoma, próstata e mama. Os tumores he- matológicos exemplares incluem tumores de medula óssea, maligni- dades das células T ou B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas e similares. Outros exemplos de cânceres que podem ser tratados usando os métodos fornecidos aqui incluem, mas não se limitam a, câncer do pulmão (incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pul- mão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritôneo, câncer gástrico ou do estômago (incluindo câncer gastrointestinal e câncer do estroma gastrointestinal), câncer pancreático, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de ma- ma, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou ute- rino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncer de próstata, câncer da vulval, câncer de tiroide, vários tipos de câncer de cabeça e pescoço e melanoma.

[00186] O câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histo- lógico, embora não se limite a estes: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusiformes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de célu- las escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carci- noma pilomatrix; carcinoma de células de transição; carcinoma papilar de células de transição; adenocarcinoma; gastrinoma maligno; colan- giocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular com- binado e colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide cístico; adenocarcinoma do polipo adenomatoso; adenocar- cinoma, polipose coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide ma- ligno; adenocarcinoma bronquíolo-alveolar; adenocarcinoma de célu- las papilares; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarci- noma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras;

carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocar- cinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apêndice da pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebá- ceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide ; cis- tadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma muci- noso; carcinoma de células em anel de sinete; carcinoma do ducto in- filtrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamató- rio; doença de paget mamária; carcinoma de células acinares; carci- noma adenosquamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timomas malignos; tumor de estroma ovárico maligno; tecoma malig- no; tumor de células granulosa maligno; androblassoma maligno; car- cinoma de células sertoli; tumor de células de leydig maligno; tumor de células lipídicas maligno; paraganglioma extra mamário maligno; feo- cromocitoma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma expansivo superficial; melanoma lentigo ma- ligno; melanomas lentiginosos acrais; melanomas nodulares; melano- ma maligno em nevo pigmentado gigante; melanoma de células epite- lioides; nevo azul maligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibro- so maligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomi- ossarcoma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveo- lar; sarcoma estromal; tumor misto, maligno; tumor misto mulleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesênquimoma maligno; tumor de brenner, maligno; tumor filodes maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; teratoma maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefro- ma maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma maligno; sar- coma de kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiossarcoma; os- teossarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; con-

droblastoma maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigantes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrossarcoma ameloblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependi- moma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmático; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfatório; meningi- oma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma maligno; tumor de células granulares maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; hod- gkins; paragranuloma; linfoma maligno, pequeno linfocítico; linfoma maligno de células grandes, difuso; linfoma maligno folicular; micose fungoide ; outros linfomas não hodgkin especificados; linfoma de célu- las B; linfoma não Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocíti- co pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; LNH linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; do- ença volumosa NHL; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitose maligna; mi- eloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoproliferativa do intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide ; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfossarcoma; leucemia mieloide ; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leuce- mia monocítica; leucemia de mastócitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; leucemia de células pilosas; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); e leucemia mieloblástica crônica.

[00187] As modalidades específicas se referem a métodos de tra- tamento da leucemia. A leucemia é um câncer do sangue ou da medu- la óssea e é caracterizada por uma proliferação anormal (produção por multiplicação) de células sanguíneas, geralmente células sanguíneas brancas (leucócitos). Faz parte do grupo amplo de doenças chamadas neoplasias hematológicas. A leucemia é um termo amplo que abrange um espectro de doenças. A leucemia é clinicamente e patologicamen- te dividida em suas formas aguda e crônica.

[00188] Em determinadas modalidades da presente divulgação, as células imunes são entregues a um indivíduo que necessita dela, co- mo um indivíduo que tenha câncer ou uma infecção. As células, en- tão, melhoram o sistema imune do indivíduo para atacar o respectivo câncer ou as células patogênicas. Em alguns casos, o indivíduo é for- necido com uma ou mais doses das células imunes. Nos casos em que o indivíduo é fornecido com duas ou mais doses das células imu- nes, a duração entre as administrações deve ser suficiente para permi- tir tempo para propagação no indivíduo e, em modalidades específi- cas, a duração entre as doses é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou mais dias.

[00189] Certas modalidades da presente divulgação fornecem mé- todos para tratar ou prevenir um distúrbio imunomediado. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença autoimune. Exemplos não limitantes de doenças autoimunes incluem: alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, doença de Addison autoimu- ne, doenças autoimunes da glândula adrenal, anemia hemolítica au- toimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocito- penia autoimune de Addison, doença autoimune da glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhosa, cardiomiopatia, dermatite em onda celíaca, síndrome de dis- função imunológica de fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmie- linizante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença de aglutinina fria, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-

fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, Guillain-Barré, tireoi- dite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitope- nia idiopática (ITP), neuropatia IgA, artrite juvenil, líquen plano, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1 ou imunomediada, miaste- nia gravis, síndrome nefrótica (como doença de alteração mínima, glomeruloesclerose focal ou nefropatia mebranosa), pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poli- glandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, aga- maglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psori- ásica, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reumatoide , sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso, colite ulcerativa, uveíte, vasculites (como poliarterite nodosa, arterite takayasu, arterite temporal / arterite de células gigantes, ou dermatite vasculite herpeti- forme), vitiligo e granulomatose de Wegener. Assim, alguns exemplos de uma doença autoimune que pode ser tratada pelos métodos divul- gados aqui incluem, mas não se limitam a, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso, diabetes mellitus tipo I, do- ença de Crohn; colite ulcerativa, miastenia gravis, glomerulonefrite, espondilite anquilosante, vasculite ou psoríase. O indivíduo também pode ter uma doença alérgica, como asma.

[00190] Em ainda outra modalidade, o indivíduo é o receptor de um órgão transplantado ou células-tronco e as células imunes são usadas para prevenir e/ou tratar a rejeição. Em modalidades específicas, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver doença de enxerto- contra-hospedeiro. O GVHD é uma possível complicação de qualquer transplante que usa ou contenha células estaminais de um doador re- lacionado ou não relacionado. Existem dois tipos de GVHD, aguda e crônica. A GVHD aguda aparece nos primeiros três meses após o transplante. Os sinais de GVHD aguda incluem uma erupção averme- lhada da pele nas mãos e nos pés que podem se espalhar e tornar mais severa, com pele descascando ou empolada. A GVHD aguda também pode afetar o estômago e os intestinos, caso em que estão presentes cólicas, náuseas e diarreia. O amarelecimento da pele e dos olhos (icterícia) indica que a GVHD aguda afetou o fígado. A GVHD crônica é classificada com base na sua gravidade: o estágio/grau 1 é leve; o estágio/grau 4 é grave. A GVHD crônica é desenvolvida três meses ou mais tarde após o transplante. Os sintomas da GVHD crôni- ca são semelhantes aos da GVHD aguda, mas, além disso, a GVHD crônica também pode afetar as glândulas mucosas nos olhos, glându- las salivares na boca e glândulas que lubrificam o revestimento do es- tômago e os intestinos. Qualquer uma das populações de células imu- nes divulgadas aqui pode ser usada. Exemplos de um órgão transplan- tado incluem um transplante de órgãos sólidos, como rim, fígado, pele, pâncreas, pulmão e/ou coração, ou um transplante celular, como ilho- tas, hepatócitos, mioblastos, medula óssea, células hematopoiéticas ou outras células estaminais. O transplante pode ser um transplante composto, como tecidos da face. As células imunes podem ser admi- nistradas antes do transplante, concomitantemente ao transplante, ou após o transplante. Em algumas modalidades, as células imunes são administradas antes do transplante, como pelo menos 1 hora, pelo menos 12 horas, pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, ou pelo menos 1 mês antes do transplante. Em um exemplo específico, não limitante, a administração da quanti- dade terapêutica eficaz de células imunes ocorre 3-5 dias antes do transplante.

[00191] Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser administra-

do com a quimioterapia linfodepletante não mieloablativa antes da te- rapia com células imunes. A quimioterapia linfodepletante não mieloa- blativa pode ser qualquer terapia adequada, que pode ser administra- da por qualquer via adequada. A quimioterapia linfodepletante não mi- eloablativa pode incluir, por exemplo, a administração de ciclofosfami- da e fludarabina, particularmente se o câncer for melanoma, que pode ser metastático. Uma via exemplar de administração de ciclofosfamida e fludarabina é intravenosa. Da mesma forma, qualquer dose adequa- da de ciclofosfamida e fludarabina pode ser administrada. Em especi- al, cerca de 60 mg/kg de ciclofosfamida é administrada durante dois dias, após os quais cerca de 25 mg/m2 de fludarabina é administrada durante cinco dias.

[00192] Em determinadas modalidades, um fator de crescimento que promove o crescimento e a ativação das células imunes é admi- nistrado ao indivíduo concomitantemente com as células imunes ou posteriormente às células imunes. O fator de crescimento da célula imune pode ser qualquer fator de crescimento adequado que promova o crescimento e a ativação das células imunes. Exemplos de fatores adequados de crescimento de células imunes incluem interleucina (IL)- 2, IL-7, IL-15 e IL-12, que podem ser usados isoladamente ou em vá- rias combinações, como IL-2 e IL-7, IL-2 e IL-15, IL-7 e IL-15, IL-2, IL-7 e IL-15, IL-12 e IL-7, IL-12 e IL-15, ou IL-12 e IL2.

[00193] As quantidades terapêuticas eficazes de células imunes podem ser administradas por diversas vias, incluindo administração parenteral, por exemplo, injeção intravenosa, intraperitoneal, intramus- cular, intrasternal ou intra-articular, ou infusão.

[00194] A quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes para o uso na terapia adotiva da célula é essa quantidade que alcança um efeito desejado em um indivíduo que está sendo tratado. Por exemplo, esta pode ser a quantidade de células imunes necessárias para inibir o avanço, ou para causar regressão de uma doença autoi- mune ou alo-imune, ou que é capaz de aliviar os sintomas causados por uma doença autoimune, como dor e inflamação. Pode ser a quan- tidade necessária para aliviar os sintomas associados à inflamação, como dor, edema e temperatura elevada. Também pode ser a quanti- dade necessária para diminuir ou impedir a rejeição de um órgão transplantado.

[00195] A população de células imunes pode ser administrada em regimes de tratamento consistentes com a doença, por exemplo, uma única ou algumas doses durante um a vários dias para melhorar um estado de doença ou doses periódicas durante um longo período de tempo para inibir a progressão da doença e prevenir a recorrência da doença. A dose precisa para ser usada em formulações também de- penderá também da via de administração, e da gravidade da doença ou do distúrbio, e deverá ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. A quantidade terapeuti- camente eficaz de células imunes será dependente do indivíduo que está sendo tratado, da gravidade e do tipo da aflição e da forma de administração. Em algumas modalidades, as doses que poderiam ser usadas no tratamento de indivíduos humanos variam de pelo menos 3,8 × 104, pelo menos 3,8 × 105, pelo menos 3,8 × 106, pelo menos 3,8 × 107, pelo menos 3,8 × 108, pelo menos 3,8 × 109, ou pelo menos 3,8 × 1010 células imunes/m2. Em uma certa modalidade, a dose usada no tratamento de indivíduos humanos varia de cerca de 3,8 × 109 a cerca de 3,8 × 1010 células imunes/m2. Em modalidades adicionais, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes pode variar de cerca de 5 × 106 células por kg do peso corporal a cerca de 7,5 × 108 células por kg do peso corporal, como cerca de 2 × 107 células a cerca de 5 × 108 células por kg do peso corporal, ou cerca de 5 × 107 células a cerca de 2 × 108 células por kg do peso corporal. A quantidade exata de células imunes é prontamente determinada por um profissional ver- sado na técnica baseada na idade, peso, sexo e condição fisiológica do indivíduo. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de cur- vas de dose-resposta derivadas dos sistemas de teste in vitro ou do modelo animal.

[00196] As células imunes podem ser administradas em combina- ção com um ou mais outros agentes terapêuticos para o tratamento do distúrbio imunomediado. As terapias combinadas podem incluir, mas não se limitam a, um ou mais agentes antimicrobianos (por exemplo, antibióticos, agentes anti-virais e agentes antifúngicos), agentes anti- tumores (por exemplo, fluorouracil, metotrexato, paclitaxel, fludarabina, etoposido, doxorrubicina ou vincristina), agentes de depleção imunoló- gica (por exemplo, fludarabina, etoposide, doxorubicina ou vincristina), agentes imunomopressores (por exemplo, azatioprina ou glicocorticoi- des, como dexametasona ou prednisona), agentes anti-inflamatórios (por exemplo, glicocorticoides, como hidrocortisona, dexametasona ou prednisona, ou agentes anti-inflamatórios não esteroides, como ácido acetilsalicílico, ibuprofeno ou naproxeno sódico), citocinas (por exem- plo, interleucina-10 ou fator de crescimento transformante beta), hor- mônios (por exemplo, estrogênio) ou uma vacina. Além disso, agentes imunossupressores ou tolerogênicos, incluindo, mas não se limitando a, inibidores de calcineurina (por exemplo, ciclosporina e tacrolimus); inibidores de mTOR (por exemplo, rapamicina); micofenolato mofetil, anticorpos (por exemplo, reconhecendo CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG ou células B); agentes quimioterápicos (por exemplo, me- totrexato, treossulfano, bussulfano) irradiação ou quimiocinas, interleu- cinas ou seus inibidores (por exemplo, BAFF, IL-2, anti-IL-2R, IL-4, ini- bidores da JAK quinase) podem ser administrados. Esses agentes farmacêuticos adicionais podem ser administrados antes, durante ou após a administração das células imunes, dependendo do efeito dese-

jado. Essa administração das células e do agente pode ser feita pela mesma via ou por vias diferentes e no mesmo local ou em um local diferente. B. Composições farmacêuticas

[00197] Também são fornecidas aqui composições e formulações farmacêuticas compreendendo células imunes (por exemplo, células T ou células NK) e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00198] As composições farmacêuticas e as formulações descritas aqui podem ser preparadas misturando os ingredientes ativos (como um anticorpo ou um polipeptídeo) com o grau de pureza desejado com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Re- mington's Pharmaceutical Sciences 22a edição, 2012), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceutica- mente aceitáveis são atóxicos para destinatários nas doses e concen- trações utilizadas, e incluem, mas não estão limitados a, tampões co- mo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e a metionina; conservantes (como, por exemplo, clo- reto de amônio octadecildimetilbenzil, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio; fenol, butil ou álcool benzílico; parabenos alquil como metil ou propilparabeno; catecol, resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (inferior a 10 resí- duos); proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como gli- cina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarí- deos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacaro- se, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como o sódio; complexos de metais (por exemplo Complexos protéicos de Zn); e/ou tensoativo não iônicos como o polietileno glicol (PEG). Veícu- los farmaceuticamente exemplares aceitáveis aqui incluem ainda agentes de dispersão de fármacos intersticiais, como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (sHASEGP), por exemplo, glico- proteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exempla- res e métodos de utilização, incluindo rHuPH20, estão descritas nas publicações de patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosamino- glicanases como condroitinases. C. Terapias de combinação

[00199] Em certas modalidades, as composições e os métodos das presentes modalidades envolvem uma população de células imunes em combinação com pelo menos uma terapia adicional. A terapia adi- cional pode ser uma radioterapia, cirurgia (por exemplo, tumorectomia e mastectomia), quimioterapia, terapia gênica, terapia do DNA, terapia viral, terapia do RNA, imunoterapia, transplante da medula óssea, na- noterapia, terapia com anticorpos monoclonais, ou uma combinação dos anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia ad- juvante ou neoadjuvante.

[00200] Em algumas modalidades, a terapia adicional é a adminis- tração de um inibidor enzimático de pequena molécula ou de um agen- te antimetastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de agentes limitantes de efeito colateral (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade dos efeitos colaterais do tratamento, como agentes antináusea, etc). Em algumas modalidades, a terapia adicional é radiação. Em algumas modalida- des, a terapia adicional é cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é uma combinação da radioterapia e da cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é radiação gama. Em algumas moda- lidades, a terapia adicional é a terapia que foca a via de PBK/AKT/mTOR, o inibidor de HSP90, o inibidor da tubulina, o inibidor do apoptose, e/ou o agente quimiopreventivo. A terapia adicional pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técni- ca.

[00201] Uma terapia celular imune pode ser administrada antes, durante, após, ou em várias combinações relativas a uma terapia adi- cional do câncer, como a terapia do checkpoint imunológico. As admi- nistrações podem estar em intervalos que variam simultaneamente de minutos a dias a semanas. Em modalidades em que a terapia da célu- la imune é fornecida a um paciente separadamente de um agente te- rapêutico adicional, garantiria geralmente que um período significativo de tempo não expiraria entre o momento de cada aplicação, de tal forma que os dois compostos ainda seriam capazes de exercer um efeito combinado vantajoso sobre o paciente. Em tais casos, está con- templado que um pode fornecer um paciente com a terapia do anticor- po e a terapia anticâncer dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 h de cada um e, mais particularmente, dentro de cerca de 6-12 h de cada um. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar significativamen- te o período de tratamento quando vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) se prolongarem por várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as res- pectivas administrações.

[00202] Podem ser usadas várias combinações. Para o exemplo abaixo uma terapia de célula imune é "A" e uma terapia do anticâncer é "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[00203] A administração de qualquer composto ou terapia das pre- sentes modalidades a um paciente seguirá protocolos gerais para a administração desses compostos, levando em conta a toxicidade, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades há uma eta-

pa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia combina- da.

1. Quimioterapia

[00204] Uma grande variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada de acordo com as presentes modalidades. O termo "quimio- terapia" refere-se ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um "agen- te quimioterápico" é usado para conotar um composto ou composição que é administrado no tratamento do câncer. Esses agentes ou fár- macos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célula, por exemplo, se e em que estágio eles afetam o ciclo da célula. Alternativamente, um agente pode ser caracterizado com base na sua capacidade de reticular o DNA, de intercalar no DNA ou de induzir aberrações cromossômicas e mitóticas, afetando a síntese de ácidos nucleicos.

[00205] Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes al- quilantes, como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietile- notiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sin- tético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmici- na (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleutero- bina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramusti- na, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosureias, como carmustina, clorozotocina, fo-

temustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, como os antibióticos enedina (por exemplo, calicheamicina, especialmente cali- cheamicina gammall e calicheamicina omegal1); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antiobióticos enedina relacionados a cromoproteína, aclacinomisinas, actinomicina, autrarni- cina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubi- cina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino- doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomi- cina, mitomicinas, como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnici- na, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina e zorrubicina; anti-metabólitos, como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, pte- ropterina e trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuri- dina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos, como calus- terona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e tes- tolactona; anti-adrenais, como mitotano e trilostano; reforçador de áci- do fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, como maitansina e ansamitoci- nas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil- hidrazida; procarbazina; complexo PSK -polissacarídeo; razoxano; ri-

zoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, ver- racurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabi- nósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complexos de coordenação de platina, como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vin- cristina; vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomici- na; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT- 11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, como ácido retinóico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plicomicina, gemcitabina, navelbina, inibidores de farne- sil-proteína tansferase, transplatina e sais, ácidos ou derivados farma- ceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.

2. Radioterapia

[00206] Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido usa- dos extensivamente incluem o que é comumente conhecido como rai- os γ, raios X e/ou a entrega direcionada de radioisótopos às células tumorais. Outras formas de fatores prejudiciais ao DNA também são contempladas, como micro-ondas, irradiação do feixe de próton (Pa- tentes US 5.760.395 e 4.870.287) e irradiação UV. É muito provável que todos estes fatores afetem uma vasta gama de danos no DNA, nos precursores do DNA, na replicação e reparação do DNA, bem co- mo na montagem e manutenção dos cromossomas. As faixas de do- sagem para raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens por períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas), até doses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para radioisótopos va- riam muito e dependem da meia-vida do isótopo, da intensidade e do tipo de radiação emitida e da absorção pelas células neoplásicas.

3. Imunoterapia

[00207] O versado na técnica compreenderá que as imunoterapias podem ser usadas em combinação ou em conjunto com os métodos das modalidades. No contexto do tratamento oncológico, os imunote- rapêuticos geralmente dependem do uso de células e moléculas imuni- tárias efetoras para alvejar e destruir células cancerosas. O rituximabe (RITUXAN®) é um exemplo deste tipo. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo, por si só, pode servir como efetor da terapia ou pode recrutar outras células para efetivamente afetar a morte das células. O anticorpo também pode ser conjugado a um fár- maco ou uma toxina (quimioterápicos, radionuclídeos, cadeia A de ri- cina, toxina da cólera, toxina da coqueluche, etc) e servir como agente de direcionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito que transporta uma molécula de superfície que interage, direta ou indi- retamente, com um alvo de células tumorais. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.

[00208] Os conjugados de anticorpos-fármacos surgiram como uma abordagem inovadora para o desenvolvimento da terapêutica do cân- cer. O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Os conjugados de anticorpos-fármacos (ADCs) incluem anticorpos mono- clonais (MAbs) que estão covalentemente ligados a fármacos que ma- tam células. Esta abordagem combina a elevada especificidade dos MAbs em relação aos seus antígenos alvo com substâncias citotóxicas altamente potentes, resultando em MAbs "armados" que fornecem a carga útil (fármaco) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A administração direcionada do fármaco também minimiza sua exposição em tecidos normais, resultando na diminuição da toxici- dade e melhora do índice terapêutico. A aprovação de dois fármacos ADC, ADCETRIS® (brentuximabe vedotina) em 2011 e KADCYLA®

(trastuzumabe entansina ou T-DM1) em 2013 pela FDA validou a abordagem. Existem atualmente mais de 30 candidatos a fármacos ADC em várias fases de ensaios clínicos para tratamento oncológico (Leal et al., 2014). À medida que a engenharia de anticorpos e a oti- mização da carga útil do ligante estão se tornando cada vez mais amadurecidas, a descoberta e o desenvolvimento de novos ADCs são cada vez mais dependentes da identificação e validação de novos al- vos que são adequados a essa abordagem e à geração de MAbs alvo. Dois critérios para alvos ADC são níveis de expressão eleva- dos/reguladas positivas em células tumorais e uma internalização ro- busta.

[00209] Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve ter algum marcador que seja passível de direcionamento, ou seja, não está presente na maioria das outras células. Existem muitos marcado- res tumorais e qualquer um destes pode ser adequado para direcio- namento no contexto das presentes modalidades. Os marcadores tu- morais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno de Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B e pg. 155. Um aspecto alternativo da imunoterapia é combinar os efeitos anticâncer com efeitos estimula- tórios imunológicos. Moléculas de estímulo imune também existem incluindo: citocinas, como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gama-IFN, quimi- ocinas, como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento, como o ligante FLT3.

[00210] Exemplos de imunoterapias atualmente sob investigação ou em uso são adjuvantes imunológicos, por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e compostos aro- máticos (patentes USs 5.801.005 e 5.739.169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); terapia de citocinas, por exemplo, interferons ,  e , IL-1, GM-CSF, e TNF (Bukowski et al., 1998; Da-

vidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); terapia gênica, por exem- plo, TNF, IL-1, IL-2 e p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; Patentes US 5.830.880 e 5.846.945); e anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-CD20, anti-ganglioside GM2, e anti-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; U.S. Patent 5,824,311). Está contempla- do que uma ou mais terapias anticâncer podem ser usadas com as terapias de anticorpos descritas aqui.

[00211] Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser um ini- bidor do checkpoint imunológico. Os checkpoints imunes aumentam um sinal (por exemplo, moléculas coestimulatórias) ou diminuem um sinal. Checkpoints imunes inibidores que podem ser direcionados pelo bloqueio do checkpoint imunológico na invenção incluem o receptor de adenosina A2A (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), o atenuador de linfócitos B e T (BTLA), proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4, também conhecida como CD152), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), imunoglobulina da célula killer (KIR), gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3 (TIM-3) e su- pressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA). Em par- ticular, os inibidores do ponto de verificação imune têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-4.

[00212] Os inibidores do ponto de verificação imune podem ser fármacos como moléculas pequenas, formas recombinantes de recep- tores ou ligantes ou, em particular, anticorpos, como anticorpos huma- nos (por exemplo, publicação de patente internacional WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252:64–2012; estan- do todos aqui incorporados por referência. Podem ser usados inibido- res conhecidos das proteínas do ponto de verificação imune ou seus análogos, em particular formas de anticorpos quimerizados, humani- zados ou humanos. Como o versado na técnica sabe, nomes alternati-

vos e/ou equivalentes podem ser usados para certos anticorpos men- cionados na presente divulgação. Esses nomes alternativas e/ou equi- valentes são intercambiáveis no contexto da presente divulgação. Por exemplo, sabe-se que o lambrovizumabe também é conhecido sob os nomes alternativos e equivalentes MK-3475 e pembrozumabe.

[00213] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD- 1 é uma molécula que inibe a ligação da PD-1 aos seus parceiros de ligação do ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do ligante da PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação PDL1 é uma molécula que inibe a ligação do PDL1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modali- dade, o antagonista de ligação do PDL2 é uma molécula que inibe a ligação do PDL2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto espe- cífico, um parceiro de ligação do PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo. Os anticorpos exemplares estão descritos nas patentes US Nos. US8735553, US8354509 e US8008499, todos aqui incorporados por referência. Ou- tros antagonistas do eixo PD-1 para uso nos métodos fornecidos aqui são conhecidos na técnica, como descrito no pedido de patente US No. US20140294898, US2014022021 e US20110008369, todos aqui incorporados por referência.

[00214] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo consistindo em nivolumabe, pembrolizumabe e CT-011. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação extracelu-

lar ou PD-1 do PDL1 ou PDL2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é AMP-224. Nivolumabe, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 e OPDIVO®, é um anticorpo anti-PD-1 des- crito em WO2006/121168. Pembrozumabe, também conhecido como MK-3475, Merck 3475, lambrozumabe, KEYTRUDA® e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/114335. CT-011, tam- bém conhecido como hBAT ou hBAT-1, é um anticorpo anti-PD-1 des- crito em WO2009/101611. AMP-224, também conhecido como B7- DCIg, é um receptor solúvel de fusão PDL2-Fc descrito em WO2010/027827 e WO2011/066342.

[00215] Outro ponto de verificação imune que pode ser direcionado nos métodos fornecidos aqui é a proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), também conhecida como CD152. A sequência completa de cDNA do CTLA-4 humano tem o número de acesso Gen- bank L15006. O CTLA-4 encontra-se na superfície das células T e age como um "interruptor de desligado" quando ligado ao CD80 ou CD86 na superfície das células que apresentam o antígeno. O CTLA4 é um membro da superfamília de imunoglobulinas que é expressada na su- perfície das células T auxiliares e transmite um sinal inibitório para as células T. O CTLA4 é semelhante à proteína coestimulatória de células T, CD28, e ambas as moléculas se ligam ao CD80 e CD86, também chamados B7-1 e B7-2, respectivamente, nas células apresentadoras de antígenos. O CTLA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto o CD28 transmite um sinal estimulante. O CTLA4 intracelular também é encontrado em células T reguladoras e pode ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de célu- las T e CD28 leva a uma expressão aumentada de CTLA-4, um recep- tor inibitório para moléculas B7.

[00216] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção imune é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[00217] Os anticorpos anti-humanos-CTLA-4 (ou domínios VH e/ou VL derivados deles) adequados para uso nos presentes métodos po- dem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Alter- nativamente, podem ser usados anticorpos anti-CTLA-4 reconhecidos pela técnica. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 divulgados em: US 8.119.129, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675,206, também conhecido como tremelimumabe; anteriormente ticilimumabe), patente US No. 6.207.156; Hurwitz et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Resumo nº 2505 (anticorpo CP-675206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304 pode ser usado nos métodos di- vulgados aqui. Os ensinamentos de cada uma das publicações menci- onadas anteriormente estão incorporados aqui por referência. Tam- bém podem ser usados anticorpos que concorrem com qualquer um destes anticorpos reconhecidos pela técnica para ligação ao CTLA-4. Por exemplo, um anticorpo CTLA-4 humanizado é descrito no pedido de patente Internacional No. WO2001014424, WO2000037504 e pa- tente US No. US8017114; todos aqui incorporados por referência.

[00218] Um anticorpo anti-CTLA-4 exemplificador é o ipilimumabe (também conhecido como 10D1, MDX-010, MDX-101 e Yervoy®) ou fragmentos de ligação do antígeno e suas variantes (ver, por exemplo, WO 01/14424). Em outras modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou VRS de ipilimumabe. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH de ipilimumabe e os domínios CDR1, CDR2 e

CDR3 da região VL de ipilimumabe. Nem outra modalidade, o anticor- po concorre para a ligação com e/ou liga-se ao mesmo epítopo da CTLA-4 que os anticorpos acima mencionados. Em outra modalidade, o anticorpo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos de região variável com os anticorpos mencionados acima (por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de iden- tidade de região variável com ipilimumabe).

[00219] Outras moléculas para modulação da CTLA-4 incluem li- gantes e receptores CTLA-4, como descritos nas patentes US Nos. US5844905, US5885796 e nos pedidos de patente Internacional WO1995001994 e WO1998042752; todos incorporados aqui por refe- rência, e imunoadesinas, como descrito na patente US8329867, incor- porada aqui por referência.

4. Cirurgia

[00220] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, di- agnóstica ou estadiamento, curativa e paliativa. A cirurgia curativa in- clui a ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisica- mente removido, excisado e/ou destruído e pode ser usado em conjun- to com outras terapias, como o tratamento das presentes modalidades, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia gênica, imunote- rapia e/ou terapias alternativas. A ressecção tumoral refere-se à remo- ção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção tu- moral, o tratamento cirúrgico inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletro- cirurgia e cirurgia microcontrolada (cirurgia de Mohs).

[00221] Após a excisão de parte ou de todas as células cancerosas, tecidos ou tumores, pode formar-se uma cavidade no corpo. O trata- mento pode ser realizado através da perfusão, injeção direta ou apli- cação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Esse tra- tamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem ser de doses varia- das também.

5. Outros agentes

[00222] É contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Esses agentes adicio- nais incluem agentes que afetam a regulação positiva de receptores de superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferen- ciação, inibidores da adesão celular, agentes que aumentam a sensibi- lidade das células hiperproliferativas aos indutores apoptóticos ou ou- tros agentes biológicos. O aumento da sinalização intercelular pela elevação do número de junções GAP aumentaria os efeitos anti- hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com certos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos trata- mentos. Os inibidores da adesão celular são contemplados para me- lhorar a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de inibidores de adesão celular são inibidores da cinase de adesão focal (FAKs) e Lovastatina. Além disso, é contemplado que outros agentes que au- mentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apoptose, como o anticorpo c225, poderiam ser usados em combinação com cer- tos aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento. IV. Artigos de fabricação ou kits

[00223] Um artigo de fabricação ou um kit é fornecido compreen- dendo células imunes. O artigo de fabricação ou o kit podem adicio- nalmente incluir uma bula que compreendendo instruções para usar as células imunes para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo ou realçar a função imune de um indivíduo que tenha o cân- cer. Qualquer uma das células imunes específicas do antígeno descri- tas aqui pode ser incluída no artigo de fabricação ou kits. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, como vidro, plástico (como cloreto de polivinila ou poliolefina) ou liga metálica (como aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalida- des, o recipiente contém a formulação e o rótulo no, ou associado a ele, pode indicar as direções de uso. Os kits ou artigos de fabricação podem incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para o uso. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação inclui ainda um ou mais de outro agente (por exemplo, um agente quimioterápico e um agente antineo- plásico). Recipientes adequados para um ou mais agente incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas. V. Exemplos

[00224] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar mo- dalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por os versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção, e, assim, podem ser considerados modos preferenciais para a sua prática. No entanto, os versados na técnica deveriam, à luz da atual divulgação, entender que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante sem que se desvie do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1 - Células NK CAR com inativação de CISH

[00225] As células NK foram isoladas por seleção negativa de 3 unidades diferentes de sangue de cordão umbilical (CB) e expandidas.

As células NK foram então transduzidas com a construção CAR e CISH KO foi realizado para cada CB em diferentes pontos temporais. Foram obtidos quatro grupos diferentes de células para cada unidade CB, incluindo NT, NT CISH KO, CAR19/IL-15 e CAR19/IL-15 CISH KO.

[00226] Especificamente, no dia 1, NK foi isolada com seleção ne- gativa, cocultivada com APCs irradiadas (K562 expressando 41BB e IL-21 em sua superfície) na razão de 1:2 (NK:APC) em SCGM com IL- 2 200 unidades/ml. Os meios foram mudados a cada 2 dias com SCGM fresco e IL-2 200 unidades/ml.

[00227] No dia 5, as células NK foram selecionadas novamente pa- ra obter células NK puras e realizar a transdução do CAR. Neste mo- mento, as células não transduzidas (NT) e as células NK CAR esta- vam presentes. A eficiência de transdução de CAR foi medida 3 dias após a transdução.

[00228] No dia 7, APCs irradiadas foram adicionadas para expandir novamente as células NK (tanto NT quanto NK CAR). As células NK foram cultivadas em SCGM com IL-2 200 U/ml. Os meios foram mu- dados a cada 2 dias com SCGM fresco e IL-2 200 U/ml.

[00229] No dia 14, CRISPR Cas9 foi usado para CISH KO em célu- las NK CAR usando eletroporação Neon. Dois sgRNAs foram dese- nhados para o direcionamento do éxon 4 do gene CISH. Cerca de 15- 30 minutos antes da eletroporação, a proteína Cas9 e o sgRNA foram incubados à temperatura ambiente em uma reação de 1:1 com 10 ug Cas9 e 10 ug sgRNA (5000ng de sgRNA # 1 e 5000ng de sgRNA # 2). O produto de incubação (ou seja, sgRNA e Cas9 ligados em conjunto) foi eletroporado em 1-2 milhões de células com uma ponta de eletro- poração de 100 uL. As condições de eletroporação foram 1600V, 10ms, 3 pulsos, usando o tampão T. As diferentes preparações de cé- lulas (células NK CAR eletroporadas, células NK CAR de controle e células NK NT) foram cocultivadas com APCs irradiada a uma razão de 1:2 (NK:APC) em SCGM com IL-2 20 U/mL. Os meios foram muda- dos a cada 2 dias com SCGM fresco e IL-2 200 U/ml. No dia 15, a PCR foi realizada para verificar a eficiência do KO.

[00230] Finalmente, foram realizados estudos funcionais no dia 21. As células dos 4 grupos foram cocultivadas em placa de 96 poços com BFA e Raji na razão de 2:1 por 6 horas. A coloração foi então realiza- da para comparar a produção de citocinas (IFNγ, TNFα e CD107α), que foram avaliadas pela citometria de fluxo. O ensaio de liberação de cromo foi realizado no dia 21 para comparar a citotoxicidade dos 4 grupos diferentes de células para cada CB. A análise estatística foi re- alizada usando a ANOVA de dois fatores, com comparações múltiplas, usando o teste de Bonferroni.

[00231] A edição genética das células NK é mais desafiante do que a das células T. Ao contrário das células T, as células NK precisam de células de alimentação para crescer bem in vitro, o que torna o pro- cesso de edição genética mais complexo. As células NK também são mais frágeis e historicamente têm sido conhecidas por terem baixa vi- albilidade após manipulação genética. A viabilidade presente após a transdução de CAR e CISH KO foi mais de 95%. Exemplo 2 - Caracterização in vivo de células NK

[00232] Para caracterizar as células NK CAR com CISH KO in vivo, foram estudados camundongos fêmeas NSG nulas com 10 semanas de idade. Os camundongos foram injetados com células 20x103 Raji- FFLuc. Para as células efetoras, foram injetadas células #1 - célula # 3, 3x106 ou 107 células/animal, dependendo dos grupos abaixo.

[00233] Categorias do grupo: 5 camundongos/grupo, 7 grupos e 35 camundongos no total, - Grupo # 1: Apenas Raji-FFLuc - Grupo # 2: Raji-FFLuc + Células # 1 3x106 células/animal

- Grupo # 3: Raji-FFLuc + Células # 1 107 células/animal - Grupo # 4: Raji-FFLuc + Células # 2 3x106 células/animal - Grupo # 5: Raji-FFLuc + Células # 2 107 células/animal - Célula # 1: NKCAR19 cas9+ eletroporação - Célula # 3: NKCAR19 CISH KO

[00234] Camundongos foram administrados com células Raji isola- damente ou em combinação com células NK CAR. As células NK CAR eram do tipo selvagem, apenas cas9, ou tinham inativação de CISH. Verificou-se que camundongos que receberam as células NK CAR ina- tivadas por CISH tinham maior sobrevivência, não mostraram evidên- cia de linfoma de Raji, e não mostraram CRS. As células NK inativa- das por CISH também persistiram mais tempo in vivo e poderiam ser detectadas até 7 semanas após a infusão. Exemplo 3 - Deleção de checkpoint de CIS modula a capacidade de células exterminadoras naturais transduzidas por CAR deriva- das do sangue do cordão umbilical

[00235] Funcionalidade in vitro melhorada em células NK iC9/CAR19/IL-15 deficientes de CIS: Os níveis de expressão de CIS foram avaliados para determinar se as células CB-NK iC9/CAR19/IL- 15 estão sujeitas aos mesmos circuitos contrarreguladores que regu- lam negativamente fisiologicamente a sinalização das citocinas em cé- lulas NK não modificadas. As células CB-NK foram cultivadas com uma linhagem celular de alimentação K562, modificada para expressar IL21 ligado à membrana, ligante 4-1BB e CD48 (uAPC) na presença de IL-2 por 21 dias. As células NK foram transduzidas no dia +4 com um vetor retroviral expressando iC9/CAR19/IL-15 como descrito em materiais e métodos ou não foram transduzidas (NT, controle). A ex- pressão de CIS aumentou significativamente durante a expansão in vitro do NT controle e das células CB-NK iC9/CAR19/IL-15 ao longo do tempo (FIG. 7A). Notavelmente, os níveis de expressão de CIS foram mais proeminentes nas células iC9/CAR19/IL-15 em comparação com as células NT CB-NK, provavelmente devido ao efeito adicional da IL- 15 na indução de CIS (FIG. 7A).

[00236] As consequências funcionais da deleção de CISH foram examinadas em seguida nas células CB-NK iC9/CAR19/IL-15. Uma vez que o CIS é um potente checkpoint imunológico nas células NK, foi possível supor que a inativação do gene CISH poderia melhorar a sua função efetora de forma semelhante ao bloqueio da PD-1 nas cé- lulas T. Para testar essa ideia, um protocolo foi desenvolvido pela pri- meira vez para transdução combinada de retrovirais com a construção iC9/CAR19/IL15 e a edição de genes mediados por Cas9 ribonucleo- proteína (Cas9 RNP) para silenciar CISH. No dia 7, as células NK transduzidas para CAR foram nucleofectadas com Cas9 sozinho (mo- delo Cas9) ou Cas9 pré-carregadas com éxon 4 de CISH direcionando o duplex crRNA: tracrRNA (CISH KO) (FIGS. 7A-B). A eficiência de transdução e a viabilidade das células iC9/CAR19/IL-15 no dia 7 foram superiores a 90% e permaneceram estáveis ao longo do tempo (FIG. 13). A eficiência do CISH KO foi superior a 80% nas células NK que expressam NT e CAR, avaliada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) (FIG. 7A) e análise de Western blot (FIG. 7B). Estas conclusões foram também confirmadas pela sequenciação de Sanger (FIG. 7C).

[00237] Para determinar o efeito da CISH KO na atividade antitumo- ral das células NK, a resposta das células NT e CB-NK iC9/CAR19/IL- 15 foi testada sete dias após a eletroporação com Cas9 acoplado a um gRNA não alvo (CTRL) ou com Cas9 acoplado a um gRNA direcio- nando o gene CISH (CISH KO) contra alvos das células do linfoma de Raji. As células CISH CAR.NK produziram quantidades significativa- mente maiores de IFN-γ e TNF-α, exibiram degranulação melhorada (CD107a) e exerceram maior citotoxicidade contra Raji em compara- ção com os respectivos controles NT ou iC9/CAR19/IL-15 (FIGS. 8A-

8C). Notavelmente, entre todos os grupos, as células CISH KO iC9/CAR19/IL-15 CB-NK apresentaram a maior produção de citocinas e citotoxicidade em relação aos alvos Raji, apoiando a ideia de que a combinação de transdução CAR com o silenciamento CISH resulta em função de célula NK melhorada (FIGS. 8A-8C).

[00238] O efeito de CISH KO foi então examinado na formação de sinapse imunológica (IS) entre as células NK NT ou iC9/CAR19/IL-15 e as células Raji. A polarização do centro organizador de microtúbulos (MTOC) foi aumentada por CISH KO, refletida por uma distância redu- zida de MTOC para IS em comparação com os controles (FIG. 8E). Em conjunto, esses achados sugerem que CISH KO fortalece a sinap- se imunológica entre as células NK (NT e iC9/CAR19/IL-15) e as célu- las tumorais, que se correlacionam com o aumento da função efetora e citotoxicidade.

[00239] Fenótipo e assinatura molecular das células NK CISH KO NT e iC9/CAR19/IL-15: Para entender o mecanismo pelo qual CISH KO nas células NK aumenta sua função contra as células tumo- rais, foi usada a citometria por tempo de voo (CyToF) e um painel de 32 anticorpos contra receptores inibitórios e ativadores, bem como marcadores de diferenciação, homing e ativação, para obter insights sobre sua composição fenotípica. CISH KO nas células NK iC9/CAR19/IL-15 induziu um fenótipo funcional com uma expressão significativamente mais elevada de marcadores de citotoxicidade, in- cluindo granzima-b, perfurina, TRAIL, CD3z, fatores de transcrição e moléculas adaptadoras, como Eomes, T-bet, DAP12, e ativação de marcadores de correceptores/proliferação, como DNAM, CD25 e Ki67, em comparação com o controle da sua contraparte (FIG. 9A). Da mesma forma, a deleção de CISH nas células NK NT resultou na regu- lação positiva de vários marcadores de ativação em comparação com as células NK NT de controle (FIG. 14A). viSNE, um algoritmo de in-

corporação estocástica de vizinhos distribuídos em t (tSNE) foi usado para analisar mais aprofundadamente esses marcadores de células NK ativados seguindo CISH KO e observou uma segregação conside- rável entre o controle e as células NK CISH KO iC9/CAR19/IL-15, com um fenótipo predominantemente ativado (expressão aumentada de CD25, Ki67, CD3z, perforia e granzima-b) dominando as células NK CISH iC9/CAR19/IL-15 (FIG. 9B).

[00240] A sequência de RNA foi realizada em seguida para obter uma compreensão mais profunda do perfil transcriptômico da célula NK, seguindo CISH KO. Notavelmente, os resultados divulgaram um perfil distinto de expressão genética entre CISH KO e as células NK de controle iC9/CAR19/IL-15 (FIG. 9C). CISH KO em células NK NT levou à regulação positiva de um número limitado de genes relacionados a genes estimulados com interferon (ISGs) e STAT-1, incluindo OSA-1, OSA-2 (FIGS. 14A-14C). Em contraste, CISH KO nas células NK iC9/CAR19/IL-15 levou à regulação positiva de múltiplos genes relaci- onados com a ativação JAK/STAT e a via MAPK/ERK (FIG. 9).

[00241] Para obter maior conhecimento da base mecanicista para o aumento da função e citotoxicidade induzida por CISH KO em células NK iC9/CAR19/IL-15, análise de enriquecimento do conjunto de genes (GSEA) foi usada para identificar conjuntos de genes ou vias biológi- cas que poderiam contribuir para o fenótipo. A análise revelou enri- quecimento na sinalização de TNF-α, IFN-γ, IL-2/STAT5 e IL-6/ST3, bem como genes relacionados à resposta inflamatória (FIG. 9F). Os achados foram confirmados ao nível de proteína, mostrando a fosfori- lação aumentada de STAT5, STAT3 e fosfolipase C gama 1 (PLCg1) nas células CISH KO iC9/CAR19/il-15 CB-NK (FIG. 9G, H). Juntos, esses dados indicam que a IL-15 aciona a ativação de CISH e que CISH KO nas células NK iC9/CAR19/IL-15 induz uma assinatura mo- lecular compatível com um fenótipo ativado.

[00242] CISH KO reprograma o metabolismo das células iC9/CAR19/IL-15 NK: Como mostrado na FIG. 10A, os dados da seq de RNA e os resultados de GSEA também mostraram a nova observa- ção de que CISH KO resulta em enriquecimento em genes de mTORC1, hipóxia e glicólise.

A atividade de mTORC1 é essencial para a reprogramação glicolítica das células NK ativadas e tem sido consi- derada como pré-requisito para as funções das células NK efetoras.

Assim, procurou-se determinar se a deleção de CISH modula a ativi- dade metabólica das células NK iC9/CAR19/IL-15. Foi hipotetizado que CISH KO melhora a atividade citotóxica das células NK iC9/CAR19/IL-15 modulando seu metabolismo e aumentando o con- sumo de oxigênio e glicose.

Para testar essa hipótese, foi realizada uma série de ensaios de Seahorse para medir as vias energéticas nas células NK e mostrou que em resposta ao linfoma de Raji, as células NK CISH KO iC9/CAR19/IL-15 apresentaram maior reserva glicolítica, medida pela maior taxa de acidificação extracelular (ECAR) quando comparadas às células NK iC9/CAR19/IL-15 de controle Cas9. Esses dados funcionais foram ainda apoiados pela análise de via de enge- nhosidade (IPA) mostrando a regulação positiva das enzimas de glicó- lise.

Além disso, as células NK CISH KO iC9/CAR19/IL-15 apresenta- ram um consumo de glicose mais elevado em comparação com os seus controles Cas9, conforme demonstrado pelo teste colorimétrico de glicose realizado no sobrenadante de células CAR-NK cocultivadas com células tumorais Raji durante 3 horas.

Isto sugere que CISH KO aumentou a atividade metabólica das células CAR-NK aumentando sua capacidade de consumir glicose e usando-a para a glicólise.

Além disso, as células NK CISH KO iC9/CAR19/IL-15 demonstraram um aumento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) por ensaio de Seaho- rse em comparação com as células NK iC9/CAR19/IL-15 de controle.

Isto indica que o CISH KO também melhora o metabolismo das células

CAR-NK ao acelerar a sua atividade mitocondrial. De fato, em uma série de estudos de microscopia confocal especializada, observou-se que o número de mitocôndrias e a razão volume mitocondrial/nuclear são significativamente maiores nas células CISH KO iC9/CAR19/IL-15 em comparação aos controles Cas9 (FIG. 10).

[00243] Com base nestes dados, foi possível supor que, ao aumen- tar a ativação de JAK/STAT, CISH KO leva a uma maior atividade de MTORC1 e a uma regulação positiva da atividade de HiF1a, culminan- do em um aumento da capacidade glicolítica e na aptidão das células NK. De fato, descobriu-se que, após cocultura com células Raji duran- te 2 horas, a fosforilação da proteína ribossomal S6 (S6), um alvo a jusante da ativação da via mTOR1, foi significativamente maior em CISH KO iC9/CAR19/il-15 em comparação com os controles Cas9.

[00244] Combinação da interrupção do checkpoint de CIS e modificação de iC9/CAR19/IL-15 melhoram o controle e a sobrevi- vência do tumor em um modelo de camundongo com linfoma de Raji: Usando um modelo agressivo de camundongo NSG do linfoma de Raji (FIG. 11A), investigou-se se a transferência adotiva das células CISH KO CB-NK poderia aumentar seu controle tumoral in vivo. Em primeiro lugar, os camundongos receberam uma infusão i.v (10x106/camundongo) de células NT CB-NK de controle que foram ele- troporadas com Cas9 (Cas9 CTRL) ou tinham CISH KO (5 camundon- gos por grupo). O crescimento do tumor foi monitorado com alterações na imagem da bioluminescência tumoral (BLI) ao longo do tempo. A carga tumoral aumentou ao longo do tempo sem diferença significativa na sobrevivência entre os grupos (FIGS. 11B-C), sugerindo que, na ausência de transdução de CAR, CISH KO não aumenta a atividade das células NK contra o tumor de Raji. O efeito in vivo de CISH KO foi investigado em seguida sobre a atividade anti tumoral das células NK iC9/CAR19/IL-15. Uma vez que as células CISH KO iC9/CAR19/IL-15 são mais potentes para matar as células tumorais alvo, mesmo com baixas razões E:T, foi hipotetizado que também serão mais eficazes no controle do tumor em doses de infusão mais baixas. De fato, a in- fusão de apenas 3 x 106 células, as células NK CISH KO iC9/CAR19/IL-15 melhoraram significativamente a sobrevivência e o controle do linfoma de Raji em comparação com as células CB-NK CTRL iC9/CAR19/IL-15, mas eventualmente os camundongos sucum- bem ao tumor após 46 dias (FIGS. 11E-G). Quando uma dose mais elevada de 10 x 106 células CAR-NK foi infundida, o grupo que rece- beu células CISH KO não apresentou qualquer evidência de tumor por BLI (FIG. 11) ou em patologia e apresentou uma sobrevida significati- vamente prolongada por até 341 dias, em comparação com as células CTRL iC9/CAR19/IL-15 CB-NK (FIGS. 11E-H, 16). Isto foi associado à persistência melhorada das células NK em camundongos que recebe- ram CISH KO iC9/CAR19/IL-15 em comparação com animais que re- ceberam células CTRL iC9/CAR19/IL-15 CB-NK (FIG. 11D). Para ob- servar, CISH KO não foi associado a sinais de toxicidade aumentada em camundongos, como perda de peso (FIG. 11I). Em conjunto, estes dados indicam que o silenciamento de CISH melhorou a capacidade das células iC9/CAR19/IL-15 CB-NK de exercer o controle in vivo do tumor in vivo sem aumentar a toxicidade.

[00245] Tradução clínica de células NK disponíveis comercial- mente CISH iC9/CAR19/IL-15 para malignidade das células B reci- divadas/refratárias: Embora não tenha sido observada toxicidade in vivo aumentada em camundongos tratados com células CISH KO CAR.NK, o aumento da sinalização IL-15 pode potencialmente resultar em aumento da liberação de citocinas inflamatórias. Assim, a caspase 9 induzível (iC9) foi usada como gene suicida na construção para con- firmar que as células NK transduzidas por CISH KO CAR poderiam ser induzidas a sofrer apoptose na presença de um dimerizador de pe-

quenas moléculas AP1903. A adição de apenas 10 nM de AP1903 a culturas de células NK iC9/CAR.19/IL-15 induziu apoptose de células NK transduzidas em até 4 h, e CISH KO não afetou a ação do dimeri- zador (FIG. 17A). O gene suicida também foi eficaz na eliminação das células CAR in vivo tanto em CISH KO quanto no controle das células iC9/CAR.19/IL-15 CB-NK (FIG. 16B). Camundongos enxertados com tumor de Raji receberam controle ou células CISH KO iC9/CAR.19/IL- 15 CB-NK seguidas de tratamento com o dimerizador nos dias 7 e 9 após infusão NK (n = 5 camundongos por grupo). Os animais foram sacrificados no dia 12. A administração do dimerizador de pequenas moléculas resultou em uma redução impressionante das células iC9/CAR.19/IL-15 CB-NK (controle e CISH KO) no sangue e nos teci- dos (fígado, baço e medula óssea) dos camundongos tratados (FIGS. 17B-C).

[00246] A identificação de inserções/deleções de nuclease guiadas por RNA (RGN) fora do alvo CRISPR é crucial antes desta abordagem poder ser levada para a clínica. Assim, as tecnologias GuideSeq e Rhampseq foram usadas para avaliar os efeitos fora do alvo dos RNAs guia CISH específicos usados nos experimentos. Experimentos de GuideSeq usando células HEK293 que expressam constitutivamente a nuclease Cas9 identificaram múltiplos locais potenciais fora do alvo para ambos os crRNAs direcionando o locus CISH, e até frequências mais altas de eventos fora do alvo foram notadas com crRNA2 (FIGS. 12A-B).

[00247] Em resumo, este é o primeiro relatório de uma estratégia de engenharia genética que combina a transdução de CAR e o bloqueio do checkpoint nas células NK derivadas do sangue do cordão umbili- cal. Este produto de terapia de células NK está disponível comercial- mente, é seguro e potente para eliminar células tumorais CD19+, mesmo em doses baixas.

Exemplo 4 - Material e Métodos

[00248] Linhagens celulares e meios de cultura: Raji (linhagem celular do linfoma de Burkitt) foi adquirido da American Type Culture Collection (Manassa, VA, EUA). As células de alimentação baseadas em K562 foram transduzidas para coexpressar 4-1BLL, CD48 e IL-21 9uAPCs ligados à membrana). As células de Raji transduzidas por lu- ciferase de vaga-lume (Raji-FFLUC) usadas para os experimentos in vivo foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Gianpietro Dotti (Universi- dade da Carolina do Norte).

[00249] Todas as linhagens celulares foram cultivadas em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 5% soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 1% L-glutamina. As células NK foram cultivadas em meio de crescimento de células-tronco (SCGM) suplementado com 5% soro fetal bovino (SFB), 1% penicilina- estreptomicina e 1% L-glutamina.

[00250] Expansão da célula NK do sangue do cordão umbilical: As unidades de CB para pesquisa foram fornecidas pelo MD Anderson Cancer Center CB Bank. Os CB foram isolados por técnica de gradien- te de densidade (Ficoll-Histopopaco; Sigma, St Louis, MO, EUA). Célu- las NK CD56+, purificadas com um kit de isolamento NK (Miltenyi Bio- tec, Inc., San Diego, CA, EUA), foram estimuladas com uAPC irradiado (100 Gy) (razão célula de alimentação: NK 2:1) e IL-2 humana recom- binante (Proluecina, 200 U/ml; Chiron, Emeryville, CA, EUA) em meio de crescimento completo de células estaminais (CellGenix GmbH, Freiburg, Alemanha) no dia 0. As células NK ativadas foram transduzi- das com sobrenadantes de retrovirais no dia +4 em placas revestidas de fibronectina humana (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA). No dia +7 e no dia +14, as células NK foram novamente estimuladas com uAPC e IL-2 irradiadas. No dia +21, foram coletadas células NK transduzidas por CAR.

[00251] Transfecção e transdução do retrovírus: Os vetores de retrovirais que codificando iC9.CAR19.CD28-zeta-2A-IL-15 já foram descritos anteriormente (Vera et al., 2006). Sobrenadantes temporá- rios de retrovirais foram produzidos como descrito anteriormente (Vera et al., 2006). As células NK ativadas foram transduzidas com sobrena- dantes de retrovirais no dia +4 em placas revestidas de fibronectina humana (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EUA). Três dias mais tarde (dia +7), a eficiência de transdução de CAR foi medida por citometria de fluxo e as células NK foram estimuladas novamente com uAPC e IL-2 irradiadas.

[00252] Edição do gene CRISPR/Cas9 de CISH: CISH KO foi rea- lizado no dia +7, usando o complexo ribonucleoproteico (RNP), tanto em células NK transduzidas por NT quanto CAR. As sequências de protoespaçadores para o gene CISH foram identificadas usando o CRISPRscan (Moreno-Mateos et al., 2015). Modelos de DNA para gRNAs foram feitos usando o protocolo descrito por Li et al. Foram usados dois gRNAs direcionando o éxon 4 do gene CISH: gRNA1: AGGCCACATAGTGCTGCACA (SEQ ID NO:1), gRNA2: TGTACAG- CAGTGGCTGGTGG (SEQ ID NO:2). A proteína Cas9 (PNA bio) e o gRNA foram incubados à temperatura ambiente por 15 min em uma reação de 1:1 com 10ug Cas9 e 10ug gRNA (5000ng de sgRNA # 1 e 5000ng de sgRNA # 2). O produto de incubação (gRNA e Cas9 ligados entre si) foi então usado para eletroporar 1-2 milhões de células NK transduzidas por NT ou CAR usando o sistema de transfecção Neon (Thermo Fisher Scientific). As condições de eletroporação otimizadas foram 1600V, 10ms, 3 pulsos, usando o tampão T. As diferentes pre- parações de células foram então cocultivadas com uAPC irradiado na razão de 1:2 (NK:uAPC) em meio de SCGM com IL-2 200 U/ml.

[00253] PCR quantitativa em tempo real (RT Q-PCR): O RNA to- tal foi isolado usando o kit RNeasy Plus Mini kit (Qiagen Inc., Hilden,

Alemanha) e a síntese de cDNA realizada com ReadyScript cDNA Synthesis Mix (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As reações de PCR foram realizadas em 20 μL; 10 μL de TaqMan 2X Advanced Fast PCR MasterMix (Ap- plied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA), 1 μL de CISH TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems), 2 μL de cDNA e 7 μL de água livre de nuclease. Foram descritas as sequências de primers e as condições de PCR (Kolesnik et al., 2013). A Q-PCR em tempo real foi realizada em um sistema de PCR rápida em tempo real ABI 7500 (Ap- plied Biosystems). Os níveis de mRNA foram quantificados em relação às curvas padrão geradas por diluições sequenciais de um oligonucle- otídeo correspondente a cada fragmento de PCR amplificado e utili- zando 7500 Fast v2.3 Software (Applied Biosystems). A expressão re- lativa foi determinada normalizando a quantidade de cada gene de in- teresse para o gene constitutivo 18S.

[00254] Western blot: As células NK foram pré-tratadas com 10 μM MG132 por 4 h para bloquear a degradação proteasomal. As células NK foram então lisadas em tampão de lise (IP Lysis Buffer, Pierce Bio- technology Inc., Rockford, IL) suplementadas com inibidores de pro- tease (comprimidos de coquetel sem EDTA mini completo, Roche Hol- ding, Basel, Suíça) e incubadas durante 30 minutos em gelo. As con- centrações de proteínas foram determinadas pelo ensaio BCA (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). Foram usados os seguintes anticor- pos primários: Anticorpo CIS (Clone D4D9) e anticorpo B-actina (Clone 8H10D10), ambos os anticorpos foram obtidos da tecnologia de sinali- zação de células.

[00255] Medição das frequências de modificação dos alelos usando PCR e sequenciação de Sanger: O DNA foi extraído e purifi- cado (QIAamp DNA Blood Mini Kit, Qiagen Inc., Hilden, Alemanha) de células NK NT expandidas ex vivo e transduzidas por CAR (condições de controle e CISH KO). Os primers de PCR utilizados para a amplifi- cação do locus alvo foram os seguintes:

[00256] Éxon 4 do primer direto: CGTCTGGACTCCAACTGCTT (SEQ ID NO:7)

[00257] Éxon 4 do primer inverso: GTACAAAGGGCTGCACCAGT (SEQ ID NO:8)

[00258] Os produtos de PCR purificados foram enviados para se- quenciação de Sanger na instalação principal de MD Anderson usando ambos os primers de PCR, e cada cromatograma de sequência foi analisado.

[00259] Ensaio funcional: No dia 14 ou no dia 21 da cultura, NT expandida por controle ex vivo (Controle ou CISH KO) e células NK CAR19/IL-15 (controle ou CISH KO) a 100 × 10e3 células/poço foram cocultivadas na presença de Brefeldin A por 6 h em placas de fundo redondo de 96 poços com células Raji ou alvos K562 (Controle positi- vo) em uma razão de cálula efetora:alvo (E:T) de 2:1. Para medir a degranulação, o anticorpo CD107a (Brilliant Violet 785™ anti-humano CD107A (LAMP-1), Biolegend, San Diego, CA, EUA) foi adicionado aos poços no início da cocultura. Degranulação medida por CD107a e produção intracelular de citocinas (TNFα (Anticorpo monoclonal alfa de TNF (MAb11), Alexa Fluor 700, eBioscience Inc., San Diego, CA, EUA) e IFN-γ (BD Horizon™ V450 camundongo anti-humano IFN-γ, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) foram avaliados por citometria de fluxo conforme descrito anteriormente (Rouce et al., 2016).

[00260] Ensaio de liberação de cromo: Para avaliar a citotoxici- dade, as células NK NT expandidas ex-vivo (controle e CISH KO) e as transdução de CAR (controle e CISH KO) foram cocultivadas com al- vos Raji marcados com 51Cr em múltiplas razões E:T; a citotoxicidade foi medida pela liberação de 51Cr conforme descrito anteriormente (Rouce et al., 2016).

[00261] Microscopia confocal para estudar a sinapse imunoló- gica: As células efetoras 0,5x106 , conforme descrito acima, foram conjugadas com 0,25x106 células de Raji em 250 ml de SCGM com 10% FBS inativado pelo calor contendo meio, por 40 minutos a 370C e manchadas como demonstrado em outro lugar (Banarjee et al., 2010). Em resumo, após a incubação, as células foram aderidas a uma lâmi- na revestida com poli-A-lisina (Electron Microscopy Sciences) e man- chadas para proteínas de interesse. Para a detecção de CAR, foi usa- do o anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-humano fragmento F(ab')2 puri- ficado por afinidade, conjugado com Alexa Fluor 647. Foram usadas farinha Alexa anti-CD19 (AF) 488 (clone HIB19, BD BioSciences), Phalloidin AF 568 (Invitrogen) para detecção de F-actina e anti- perforina 488 (clone δ G9; BioLegend). Os conjugados foram monta- dos em meios contendo anti-desbotamento (ouro prolongado, Invitro- gen) e foram fotografados por varredura sequencial com microscópio confocal de disco giratório Yokogawa equipado com câmera Zyla

4.2sCMOS e com objetivo de 63x. As imagens foram exportadas para Imaris (Bitplane) para medidas quantitativas. A distância do centroide de perforina até a sinapse é medida como descrito anteriormente. Citometria de massa

[00262] Conjugação de anticorpos: Um painel compreendendo 38 anticorpos marcados com metal foi usado para a caracterização apro- fundada das células NK. A lista de anticorpos com os isótopos das eti- quetas metálicas correspondentes. Todos os anticorpos não rotulados foram adquiridos sem suporte e conjugados internamente com a eti- queta metálica correspondente usando o polímero Maxpar X8 de acor- do com as instruções do fabricante (Fludigm). Todos os isótopos metá- licos foram adquiridos do Fludigm, exceto o cloreto de índio (III) (Sig- ma-Aldrich, St. Louis, MO). A concentração de anticorpos foi determi- nada medindo a quantidade de proteína A280 usando Nanodrop 2000

(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Os anticorpos conjugados foram então diluídos em solução de estabilização de anticorpos a base de PBS ou LowCross-Buffer (Candor Bioscience GmbH, Wangen, Alemanha) suplementados com 0,05% de azida de sódio (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) para uma concentração final de 0,5 mg/ml. Fo- ram realizados experimentos de titulação em série para determinar a concentração com a razão sinal/ruído ideal para cada anticorpo.

[00263] Preparação e aquisição da amostra: As células NK NT (Controle ou CISH KO) e as células NK transduzidas para CAR (Con- trole ou CISH KO) foram colhidas, lavadas duas vezes com tampão de coloração de células (0,5% de albumina de soro bovino/PBS) e incu- badas com 5 µl de solução de bloqueio de receptor Fc humano (Trus- tain FcX, Biolegend, San Diego, CA) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram então manchadas com uma mistura de an- ticorpos recentemente preparada contra os marcadores de superfície das células durante 30 minutos à temperatura ambiente em um agita- dor (100 rpm). Durante os últimos 3 minutos de incubação, as células foram incubadas com 2,5 µM de cisplatina (Sigma Aldrich, St Louis, MO), lavadas duas vezes com tampão de coloração de células e fixa- das/permeabilizadas com solução BD Cytofix/Cytoperm durante 30 minutos em escuro a 4oC. As células foram lavadas duas vezes com tampão perm/de lavagem, coradas com anticorpos dirigidos contra marcadores intracelulares e após uma etapa adicional de lavagem, armazenadas durante a noite em 500 µl de paraformaldeído a 1,6% (EMD Biosciences)/PBS com 125 nM intercalador de ácido nucleico irídio (Fluidigm). No dia seguinte, as amostras foram lavadas duas ve- zes com tampão de coloração de células, ressuspensas em 1 ml de MilliQ dH2O, filtradas através de uma malha de nylon de 35 µm (tubos de tampa de filtro de células, BD, San Jose, CA) e contadas. Antes da análise, as amostras foram suspensas em MilliQ dH2O suplementado com esferas de calibração de quatro elementos EQTM na concentra- ção de 0,5x105/ml. As amostras foram adquiridas em 300 even- tos/segundo em instrumento Helios (Fluidigm) utilizando o software de aquisição Helios 6.5.358 (Fluidigm).

[00264] Análise de dados: Os dados de citometria de massa foram normalizados com base na mudança de sinal de quatro elementos EQTM ao longo do tempo, usando o software de normalização Flui- digm 2. O controle inicial da qualidade dos dados foi realizado usando a versão 10.2 de Flowjo. As contas de calibração foram fechadas e os singletos foram escolhidos com base na coloração de irídio 193 e no comprimento do evento. As células mortas foram excluídas pelo canal Pt195 e foi realizado um novo gating para selecionar as células CD45+ e, em seguida, a população de células NK de interesse (CD3-CD56+). Um total de 320.000 células foram amostradas proporcionalmente de todas as amostras para a realização de agrupamento automatizado. Os dados foram analisados usando a redução automatizada da di- mensão incluindo (viSNE) em combinação com FlowSOM para agru- pamento para a fenotipagem profunda de células imunes, conforme publicado anteriormente (Van Gassen et al., 2015).

[00265] Sequenciamento de RNA: O RNA foi extraído e purificado (RNEasy Plus Mini Kit, Qiagen) de células NK NT expandidas ex vivo e transduzidas por CAR (condições de controle e CISH KO) e enviado para RNAseq a Novogene, onde foram realizados controle de qualida- de, construção de bibliotecas e sequenciamento. A análise dos dados RNAseq foi realizada pelo departamento de Bioinformática do MD An- derson. As leituras de sequenciamento foram alinhadas com o genoma de referência humano (hg38) usando TOPHAT2 v2.0.13 (Kim et al., 2013). Os níveis de expressão gênica foram medidos pela contagem das leituras mapeadas usando HTSEQ baseado no modelo de gene hg38 GENCODE v25. Os genes diferencialmente expressos foram identificados usando o pacote EdgeR, com corte FDR (falsa taxa de descoberta) < 0,01 e mudança de dobra > 2 (Robinson et al., 2010). Imageamento de mitocôndrias e lisossomas

[00266] Rotulagem de células NK: As células NK foram incubadas a 37 °C durante 40 minutos em solução 1:1 (v/v) de tampão de colora- ção de células vivas (abcam) e RPMI (Corning) contendo concentra- ções finais de 500 nM MitoTracker™ Deep Red FM (Invitrogen™), 250 nM LysoRed (abcam) e 1 µm Hoechst 33342 (Sigma) para rotulagem de mitocôndrias, lisossoma e núcleo respectivamente. As células fo- ram lavadas com solução salina equilibrada de Hanks (Cellgro) + 10% HEPES (Corning) primeiro e meio de cultura completo RPMI + 10% FBS (R10) para a segunda lavagem.

[00267] Microscopia confocal: 50.000 das células NK foram car- regadas em poços individuais de 96 placas de fundo de vidro. Um mi- croscópio invertido Nikon A1/TIE equipado com uma objetiva 100x, 1,45 NA foi utilizado para a obtenção de imagens. As imagens 3D (pi- lhas z, etapas de 0,3 µm, ~ 40 cortes) foram obtidas a partir de diferen- tes campos de visualização, usando canais DAPI (404.0 nm), TXRed (561.8 nm) e Cy5 (641.0 nm).

[00268] Análise de imagens confocais: Pilhas Z de imagens de 16 bits foram extraídas para cada canal e processadas no ImageJ (Natio- nal Institutes of Health (NIH), EUA) usando uma série de plugins. Pri- meiro, as imagens foram segmentadas para cada canal antes de apli- car um limite. Em seguida, o plug-in 3D Objects Counter foi aplicado à imagem para determinar regiões mitocondriais e lisossomas de inte- resse (ROIs). Estas ROIs foram sobrepostas na imagem original e as medições foram recolhidas posteriormente. Da mesma forma, o plugin 3D Objects Counter também foi usado no núcleo, mas usando apenas a imagem original. Por fim, o rastreamento do movimento de uma úni- ca célula foi feito usando o plug-in TrackMate1 para filtrar células ins-

táveis em seu movimento. Todas as medidas foram consolidadas em R, onde mitocôndrias, lisossoma e núcleo foram combinados à célula correspondente.

[00269] Modelos de linfoma xenogenênico: Para avaliar o efeito antitumoral das células CB-NK transduzidas por CAR in vivo, foi usado um modelo de xenoenxerto de NOD/SCID IL-2Rγnull (NSG), com a linhagem celular agressiva de Raji resistentes a NK. Os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as recomenda- ções do NIH sob protocolos aprovados pelo Comitê de uso e cuidado animal institucional. Camundongos NSG (10-12 semanas; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, EUA) foram irradiados com 300 cGy no dia -1 e inoculados por via intravenosa com células Raji marcadas com luciferase de vaga-lume (2 × 10e4) no dia 0. Quando indicado, células NT (controle ou CISH KO) ou CB-NK transduzidas por CAR (Controle ou CISH KO) (controle ou CISH KO) expandidas frescas foram injeta- das através da veia da cauda no dia 0. Os camundongos foram sub- metidos a exames semanais de bioluminescência (Xenogen-IVIS 200 Imaging system; Caliper, Waltham, MA, EUA). A quantificação do sinal em fótons/segundo foi realizada através da determinação da taxa de fluxo de fótons dentro de regiões de interesse padronizadas usando o software Living Image (Caliper). O tráfico, a persistência e a expansão das células NK foram medidos por citometria de fluxo.

[00270] Ativação do gene suicida in vitro e validação in vivo: O dimerizador de pequenas moléculas AP1903 (10 nM) foi adicionado às culturas de células CB-NK durante 4 horas. A eliminação das células transduzidas foi avaliada pela coloração de Annexin-V/viva morta. A eficácia do gene suicida também foi testada in vivo tratando camun- dongos portadores de tumores que receberam células NK iC9/CAR.19/IL-15 (controle ou CISH KO) com duas doses de AP1903 (50 μg cada) intraperitonealmente, 2 dias de intervalo nos 7 e 9 dias.

Dois outros grupos de camundongos (controle e CISH KO) serviram como controle sem tratamento com AP1903. Todos os camundongos foram sacrificados no dia 12, e sangue e órgãos (fígado, baço e medu- la óssea) foram coletados, processados e a citometria de fluxo foi rea- lizada para determinar a fração CAR-NK e a viabilidade.

[00271] Identificação fora do alvo: O método GUIDE-seq foi usa- do para a descoberta imparcial de eventos de edição fora do alvo (Tsai et al., 2015). Neste estudo, as células HEK293 que expressam consti- tutivamente a nuclease Cas9 de S pyogenes (células "HEK293-Cas9") foram a fonte de Cas9. Os complexos de gRNA de Alt-R® foram for- mados pela combinação de Alt-R tracrRNA e Alt-R crRNA XT a uma razão molar de 1:1. Os complexos de gRNA foram administrados por nucleofecção usando o sistema Shuttle™ Amaxa™ Nucleofector™ de 96 poços (Lonza, Basel, Suíça). Para cada nucleofecção, 3,5 x 105 cé- lulas HEK293-Cas9 foram lavadas com 1X PBS, ressuspensas em so- lução de 20 µL SF (Lonza) e combinadas com 10 µm de gRNA junto com 0.5 µm fragmento doador de dsDNA GUIDE-seq. Esta mistura foi transferida para um poço de Nucleocuvette™ Plate (Lonza) e eletropo- rada pelo protocolo 96-DS-150. O DNA foi extraído 72 horas após a eletroporação usando o kit de purificação de DNA genômico GeneJET (Thermo Fisher Scientific). A preparação, sequenciação e operação da biblioteca NGS do software GUIDE-seq foi realizada como descrito an- teriormente, exceto que o alinhamento Needleman-Wunch foi incorpo- rado (Tsai et al., 2016).

[00272] Enriquecimento do alvo através de rhAmpSeq para PCR multiplexada: Para melhor quantificar a edição em locais fora do alvo encontrados com GUIDE-seq, a PCR multiplex acoplada ao NGS am- plicon foi realizada com rhPCR (PCR executada na presença de RNaseH2) (Dobosy et al., 2011) com primers bloqueados-cliváveis. Os primers foram projetados por um algoritmo (IDT) para a comparação e seleção cruzada de primers com base na compatibilidade com outros primers no multiplex.

Esta tecnologia de amplificação requer que o primer hibridize adequadamente para um local alvo antes da amplifica- ção.

Os erros de correspondência entre alvo e primer impedem o des- bloqueio, aumentando assim a especificidade e eliminando os dímeros iniciadores.

Esta abordagem permite uma produção eficiente de ampli- cons de PCR altamente multiplexados em um único tubo.

Para esses experimentos, complexos de gRNA foram administrados em células HEK293-Cas9 como descrito anteriormente ou complexado com Alt-R HiFi Cas9 nuclease v3 para formar um complexo ativo de ribonucleo- proteína (RNP) que foi então diretamente nucleosado em células HEK293 a 2 µM junto com Eletroporation Enhancer 2 µM Alt-R Cas9 (IDT). O DNA foi extraído 48 horas após a eletroporação usando a so- lução de extração de DNA QuickExtract (Epicentre). A amplificação específica do locus com os primers rh foi realizada por 10 ciclos, se- guida de uma limpeza da esfera SPRI 1,5x.

Uma rodada de indexação da PCR foi realizada por 18 ciclos para incorporar os índices P5 e P7 únicos da amostra, seguidos de uma limpeza de esfera SPRI 1x e quantificação de bibliotecas por qPCR (IDT). Os amplicons de PCR foram sequenciados em um instrumento Ilumina MiSeq (química v2, leituras finais pareadas de 150 bp) (Illumina, San Diego, CA, EUA). Os dados foram analisados usando um pipeline personalizado.

Os dados foram demultiplexados (Picard Tools v2.9); as leituras na direção e re- versas foram mescladas em amplicons estendidos (flash v1.2.11) (Ma- goc et al., 2011); as leituras foram alinhadas com a referência genômi- ca GRCh38 (bwa mem v0.7.15) e foram atribuídas a alvos no pool multiplex do primer (etiquetas bedtools v2.25) (Quinlan et al., 2010). As leituras com qualquer pontuação de qualidade base < 10 foram filtra- das.

Em cada alvo, a edição foi calculada como a porcentagem de lei- turas totais contendo em INDEL dentro de uma janela de 10bp do local de corte.

[00273] Estatísticas: O teste ANOVA de dois fatores foi usado para comparar diferenças quantitativas (média ± s.d.) entre os grupos; os valores de P foram de dois lados e P < 0,05 foi considerado significati- vo. Para todos os experimentos de bioluminescência, os sinais de in- tensidade foram resumidos como médias ± s.d. na linha de base e em múltiplos pontos temporais subsequentes para cada grupo de camun- dongos (Shah et al., 2013). As probabilidades de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier. Os testes estatísticos indi- cados foram realizados usando o software Prism (GraphPad versão

7.0c). Para a análise da microscopia confocal, os conjuntos de dados foram analisados usando o teste t-caudal não pareado. Média dos pre- sentes dados ± intervalo de confiança de 95%. As imagens foram montadas usando o ImageJ. * * *

[00274] Todos os métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida conforme a pre- sente divulgação. Embora as composições e os métodos dessa in- venção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para os versados na técnica que as variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem que se afaste do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes, tanto quimicamente como fisiologicamente relacionados, po- dem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, enquanto que os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam obtidos. Todas essas modificações e substituições semelhantes evidentes aos versa- dos na técnica são consideradas dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas. Referências

[00275] As seguintes referências, na medida em que fornecem de- talhes processuais exemplares ou outros adicionais aos aqui definidos, são especificamente incorporadas neste documento por referência. Austin-Ward and Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845, 1998. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Gre- ene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Banerjee et al., J Immunol Methods 355(1-2): 1-13, 2010. Bennekov et al., Mt. Sinai J. Med. 71 (2): 86-93, 2004. Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347,

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No. 6,103,470 Patente U.S.

No. 6,207,156 Patente U.S.

No. 6,225,042 Patente U.S.

No. 6,355,479 Patente U.S.

No. 6,362,001 Patente U.S.

No. 6,410,319 Patente U.S.

No. 6,416,998 Patente U.S.

No. 6,544,518 Patente U.S.

No. 6,790,662 Patente U.S.

No. 7,109,304 Patente U.S.

No. 7,442,548 Patente U.S.

No. 7,446,190 Patente U.S.

No. 7,598,364 Patente U.S.

No. 7,989,425 Patente U.S.

No. 8,008,449 Patente U.S.

No. 8,017,114 Patente U.S.

No. 8,058,065 Patente U.S.

No. 8,071,369 Patente U.S.

No. 8,119,129 Patente U.S.

No. 8,129,187 Patente U.S.

No. 8,183,038 Patente U.S.

No. 8,268,620 Patente U.S.

No. 8,329,867 Patente U.S.

No. 8,354,509 Patente U.S.

No. 8,546,140 Patente U.S.

No. 8,691,574 Patente U.S.

No. 8,735,553 Patente U.S.

No. 8,741,648 Patente U.S.

No. 8,900,871

Patente U.S.

No. 9,175,268 Publicação de patente U.S.

No. 2010/0210014 Publicação de patente U.S.

No. 12/478,154 Publicação de patente U.S.

No. 2002131960 Publicação de patente U.S.

No. 2003/0211603 Publicação de patente U.S.

No. 2005/0260186 Publicação de patente U.S.

No. 2006/0104968 Publicação de patente U.S.

No. 2009/0004142 Publicação de patente U.S.

No. 2009/0017000 Publicação de patente U.S.

No. 2009/0246875 Publicação de patente U.S.

No. 2011/0104125 Publicação de patente U.S.

No. 2011/0301073 Publicação de patente U.S.

No. 20110008369 Publicação de patente U.S.

No. 2012/0276636 Publicação de patente U.S.

No. 2013/0315884 Publicação de patente U.S.

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Claims (54)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula exterminadora natural (NK) isolada, caracterizada pelo fato de que é projetada para expressar (1) um receptor de antíge- no quimérico (CAR) e/ou um receptor de célula T (TCR) e (2) IL-15 humana (hIL-15) e para não ter essencialmente nenhuma expressão de CISH.

2. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que é modificada para expressar um CAR.

3. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que é modificada para expressar um TCR.

4. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que é modificada para expressar um CAR e TCR.

5. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que é derivada do sangue do cordão umbilical, sangue periférico, medula óssea, células CD34+ ou iPSCs.

6. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que é derivada do sangue do cordão umbilical.

7. Célula NK, de acordo com a reivindicação 6, caracteriza- da pelo fato de que o sangue do cordão umbilical foi previamente con- gelado.

8. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que o CAR e/ou TCR tem especificidade antigênica para CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, ligantes NKG2D, MICA/MICB, antígeno carci- noembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epi- telial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação ao folato, glicoproteína gp120 do envelope do HIV-1, glicoproteína gp41 do envelope do HIV-1, GD2, CD123, CD33, CD30, CD56, c-MET, mesotelina, GD3, HERV-K, IL- 11Ralpha, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, EG-

FRvIII, TRAIL/DR4 e/ou VEGFR2.

9. Célula NK, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- da pelo fato de que o CAR tem especificidade antigênica para CD19.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula NK expressa ainda uma segunda citocina.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a citocina é IL-21 ou IL-12.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a célula NK tem alvo de mamífero ativado da sinalização da rapamicina (mTOR).

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que a célula NK tem aumento da sinalização de JAK/STAT.

14. Método para produzir células NK, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obtenção de uma população inicial de células NK; (b) cultura da população inicial de células NK na presença de células apresentadoras artificiais (APCs); (c) introduzir um vetor de expressão CAR e/ou TCR nas células NK; (d) expansão das células NK na presença de APCs, obten- do assim células NK expandidas; e (e) interromper a expressão da CISH nas células NK ex- pandidas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a interrupção da expressão compreende o uso do silenciamento gênico mediado por CRISPR.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o silenciamento gênico mediado por CRISPR compreende colocar as células NK CAR em contato com sgRNA e Cas9.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que sgRNA direciona o éxon 4 de CISH.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o sgRNA compreende a SEQ ID NO: 1-2.

19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a população inicial de células NK é obtida isolando células mononucleares usando um gradiente de densidade ficoll- paque.

20. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que os APCs são APCs gama irradiados.

21. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que os APCs são APCs universais (uAPCs).

22. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que os APCs são modificados para expressar 41BB e IL-21.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que os uAPCs são modificados para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL).

24. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as células NK e os APCs estão presentes em uma razão de 1:2.

25. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as células NK das etapas (b) e (d) são expandidas ainda na presença de IL-2.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 100- 300 U/mL.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracteriza- do pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 200 U/mL.

28. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a introdução compreende transdução.

29. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a construção de expressão de CAR e/ou TCR é um vetor lentiviral ou vetor retroviral.

30. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as células NK são compatíveis com GMP.

31. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as células NK são halogênicas.

32. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as células NK são autólogas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o CAR e/ou TCR tem especificidade antigênica para CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, CD5, CD7, CD22, CD70, CD30, BCMA, CD25, ligantes NKG2D, MICA/MICB, antígeno carci- noembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epi- telial, antígeno associado a melanoma, p53 mutado, ras mutado, HER2/Neu, ERBB2, proteína de ligação ao folato, glicoproteína gp120 do envelope do HIV-1, glicoproteína gp41 do envelope do HIV-1, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-MET, mesotelina, GD3, HERV-K, IL- 11Ralpha, cadeia kappa, cadeia lambda, CSPG4, ERBB2, WT-1, EG- FRvIII, TRAIL/DR4 e/ou VEGFR2.

34. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o CAR tem especificidade antigênica para CD19.

35. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a construção da expressão de CAR e/ou TCR ex- pressa ainda uma citocina.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que a citocina é IL-15, IL-21 ou IL-12.

37. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que ainda compreende a criopreservação da popula- ção de células NK expandidas.

38. Composição farmacêutica, caraterizada pelo fato de que compreende uma população de células NK, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou células NK produzidas pe- lo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 37, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

39. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de uma quantidade eficaz de células NK, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou células NK produzidas pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 37, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

40. Uso de uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de células NK, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou células NK produzidas pe- lo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 37 para o tratamento de um distúrbio imunorrelacionado em um indivíduo.

41. Método para tratar um distúrbio imunorrelacionado em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de células NK, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou células NK produzidas pelo método, como definido em qualquer das reivindicações 14 a 37 ao indivíduo.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio imunorrelacionado é um câncer, um dis- túrbio autoimune, uma doença de enxerto-contra-hospedeiro, uma re- jeição de aloenxerto, ou uma condição inflamatória.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza-

do pelo fato de que o distúrbio imunorrelacionado é uma condição in- flamatória e as células imunes não têm, essencialmente, expressão de receptor glicocorticoide.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo foi ou está sendo administrado com uma terapia de esteroide.

45. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que as células NK são autólogas.

46. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que as células NK são halogênicas.

47. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio imunorrelacionado é um câncer.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é um câncer sólido ou uma malignidade hematológica.

49. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a administração de pelo menos um segundo agente terapêutico adicional.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos o segundo agente terapêutico com- preende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radioterapia ou biotera- pia.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que as células NK e/ou pelo menos um segundo agen- te terapêutico são administrados por via intravenosa, intraperitoneal, intratraqueal, intratumoral, intramuscular, endoscopicamente, intralesi- onalmente, percutaneamente, subcutaneamente, regionalmente ou por injeção direta ou perfusão.

52. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que as células NK com quase nenhuma expressão de

CISH têm função melhorada em comparação com as células NK com expressão de CISH.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que a função melhorada é medida pela coloração intra- celular para IFN-γ e TNF-α, desgranulação de CD107a e morte tumo- ral por ensaio de liberação de 51Cr.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do pelo fato de que a função melhorada é medida pela expressão au- mentada de granzima-b, perforina, TRAIL, CD3z, Eomes, T-bet, DAP12, DNAM, CD25 e/ou Ki67.