BR112020021372A2 - Método de diagnóstico de endometriose. - Google Patents

Abstract

método de diagnóstico e tratamento de endometriose . métodos para a detecção e diagnóstico de endometriose estão revelados neste documento. mais especificamente, são fornecidos métodos de análise de expressão de célula única sensível para detectar padrões de expressão de genes específicos em populações de células obtidas de células endometriais.

Description

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MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE ENDOMETRIOSE REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos nº U.S. 62/660,641 depositado em 20 de abril de 2018, que está incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A invenção é geralmente dirigida a métodos de detecção e diagnóstico de endometriose.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A endometriose é uma das doenças ginecológicas mais comuns nos Estados Unidos. É uma doença dolorosa, muitas vezes debilitante, que afeta mais de 6,5 milhões de mulheres na América entre as idades de 15 e 44 (Buck Louis, et al., Fertil Steril, 96:360-365 (2011)). A endometriose ocorre quando o revestimento do útero cresce ectopicamente, mais comumente nos ovários, nas trompas de falópio, nos tecidos que mantêm o útero no lugar e na superfície externa do útero. Embora menos comuns, crescimentos endometriais também podem ser encontrados na vagina, cérvix, vulva, intestino, bexiga ou reto. Os sintomas mais comuns da endometriose incluem dor, sangramento ou manchas, infertilidade e problemas digestivos, como diarreia, constipação, distensão abdominal ou náusea.

[004] A causa da endometriose é desconhecida. As possíveis causas incluem sangramento menstrual retrógrado, fatores genéticos, problemas do sistema imunológico, desequilíbrio hormonal e complicações cirúrgicas. Como a causa da endometriose não é conhecida, os tratamentos atuais para endometriose tratam apenas os sintomas, não a doença em si. Além disso, não há cura para a endometriose além da cirurgia para remover as lesões endometrióticas. A remoção das lesões endometrióticas não é uma cura permanente para a doença, é apenas uma opção terapêutica temporária.

[005] A endometriose é difícil de diagnosticar porque seus sintomas

2 / 30 se sobrepõem a muitas outras doenças que afetam o abdome e o intestino. Atualmente, o diagnóstico de endometriose depende de uma combinação de história clínica e testes invasivos e não invasivos. Exame pélvico, ultrassom e ressonância magnética são técnicas usadas para visualizar lesões endometrióticas potenciais. No entanto, um diagnóstico definitivo de endometriose atualmente só pode ser obtido por meio de um tipo de cirurgia chamada laparoscopia, em que o médico pode examinar diretamente o tecido endometrial de dentro da região pélvica. Durante uma laparoscopia, o médico também fará a ressecção de quaisquer lesões endometrióticas encontradas. Como a laparoscopia é um método invasivo e está associada a um alto custo, o rastreamento de endometriose não é prático. Como resultado, muitas mulheres com endometriose não são diagnosticadas ou são diagnosticadas incorretamente e não são tratadas. Há necessidade de métodos de detecção mais precoce e menos invasivos para o diagnóstico da endometriose.

[006] Portanto, é um objetivo dessa invenção fornecer métodos mais eficazes para o diagnóstico de endometriose.

[007] É também um objetivo da invenção fornecer um método menos invasivo para o diagnóstico de endometriose.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Métodos de diagnóstico e tratamento de endometriose em pacientes são divulgados neste documento. Os métodos atuais de diagnóstico de endometriose são de baixa eficiência ou altamente invasivos. Métodos eficientes e não invasivos de diagnóstico de endometriose são fornecidos.

[009] Uma modalidade fornece um método de diagnóstico e tratamento da endometriose em um sujeito em necessidade, enriquecendo ou expandindo as células do estroma endometrial obtidas do sujeito, submetendo as células do estroma endometrial enriquecidas ou expandidas ao processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado, submetendo o cDNA amplificado para PCR microfluídico para

3 / 30 detectar a expressão gênica de RNA de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e combinações destes, diagnosticando o sujeito com endometriose se a expressão de um ou mais genes for reduzida em relação à expressão de um ou mais genes no estroma endometrial células de um sujeito sem endometriose e administrar um tratamento para endometriose ao sujeito com diagnóstico de endometriose.

[0010] Outra modalidade fornece um método de diagnóstico e tratamento de endometriose em um sujeito em necessidade, enriquecendo ou expandindo células epiteliais endometriais obtidas do sujeito, submetendo as células epiteliais endometriais enriquecidas ou expandidas a processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado, submetendo o cDNA amplificado para PCR microfluídico para detectar a expressão gênica de RNA de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e combinações dos mesmos, diagnosticando o sujeito com endometriose se a expressão de um ou mais genes for elevada em relação à expressão de um ou mais genes no epitélio endometrial células de um sujeito sem endometriose e administração de um tratamento para endometriose ao sujeito com diagnóstico de endometriose.

[0011] Em ainda outra modalidade fornece um método de diagnóstico

4 / 30 e tratamento de endometriose em um sujeito em necessidade, enriquecendo ou expandindo células do estroma endometrial e células epiteliais obtidas do sujeito, submetendo as células estromais e epiteliais endometriais enriquecidas ou expandidas para processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado, submetendo o cDNA amplificado a PCR microfluídica para detectar a expressão gênica de RNA de um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e combinações destes, diagnosticando o sujeito com endometriose se a expressão de um ou mais genes for reduzida em relação à expressão de um ou mais genes nas células do estroma endometrial de um sujeito sem endometriose e elevado em relação à expressão de um ou mais genes em células epiteliais endometriais de um sujeito sem endometriose e administrando um tratamento para endometriose ao sujeito com diagnóstico de endometriose.

[0012] As células endometriais podem ser obtidas a partir do sangue menstrual ou biópsia endometrial. Em uma modalidade, as células estromais são isoladas por separação das células usando marcadores de células estromais endometriais CD10, CD146 e CD13. Em outra modalidade, as células epiteliais endometriais são isoladas por separação das células usando marcadores de células epiteliais endoteliais EpCam+, CD45 e CD9.

[0013] O tratamento para endometriose pode ser selecionado a partir do grupo que compreende drogas anti-inflamatórias, terapia hormonal ou remoção cirúrgica do tecido afetado.

[0014] Em uma modalidade, o sujeito tem sintomas de endometriose. Em outra modalidade, o sujeito foi previamente diagnosticado com

5 / 30 endometriose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0015] As Figuras 1A-1I mostram mapas de calor que refletem os níveis de expressão gênica para genes de junção gap (conexinas), bem como outras proteínas envolvidas em interações célula-célula (junções de oclusão e de adesão) e várias quinases que as regulam. Em preto e branco, a expressão mais alta é cinza, a expressão intermediária é preta e a expressão mais baixa é branca. Cada ponto corresponde à expressão de um determinado gene (ordenado em linhas) em uma célula particular (ordenado em colunas). As Figuras 1A-1E são perfis de expressão gênica de células estromais enriquecidas de amostras de biópsia endometrial uterina de mulheres sem endometriose (normal; Fig. 1A), endometriose precoce (estágio I/II; Fig. 1B) e lesões de endometriose mais extensas na pélvica cavidade (estágio III/IV; Figs. 1C-1E). Essas amostras foram obtidas em diferentes fases do ciclo menstrual: ES, secretora precoce (Figs. 1A-1C); MS, secretora intermediária (Fig. 1D); e P, proliferativa (Fig. 1E). As Figuras 1F-1I são perfis de expressão gênica de células epiteliais enriquecidas de amostras de biópsia endometrial uterina de mulheres sem endometriose (normal; Figs. 1F-G), endometriose precoce (estágio I/II; Fig. 1H) e endometriose extensa (estágio III/IV; Fig. 1I). Essas amostras foram obtidas em diferentes fases do ciclo menstrual: ES, secretora precoce (Figs. 1F-H) e P, proliferativa (Fig. 1I).

[0016] As Figuras 2A-2BB são box plots de dados de expressão de PCR microfluídica de célula única para a maioria dos genes de junção gap (indicados por GJ acima de cada gráfico) em células estromais enriquecidas (Figs. 2A-2N) e células epiteliais (Figs. 2O-2BB) de escova biposies uterinas. Os pacientes são identificados por um número ao longo do eixo X de cada gráfico e representam indivíduos com endometriose em estágio inicial e final normal, como indicado na Tabela 3 dos Exemplos. O eixo Y representa a expressão Log10. GJA1 (que codifica a proteína Cx43) é a conexina expressa

6 / 30 mais abundantemente em ambos os tipos de células. No entanto, virtualmente todas as conexinas mostram uma diminuição consistente e significativa (indicada por asteriscos) na expressão com a progressão da doença em células do estroma (Figs. 2A-2N), mas um aumento com a progressão da doença em células epiteliais (Figs. 2O-2BB).

[0017] As Figuras 3A-3N são box plot mostrando dados de expressão de PCR microfluídica de célula única para vários outros genes envolvidos em interações célula-célula, exceto junções gap e seus reguladores, conforme indicado no topo de cada gráfico (TJP1 = ZO1; Cav = caveolina; CDH2 = N- caderina; Vim = vimentina; CTNNB = catenina beta; PRHACA - proteína quinase A; PRKCB = proteína quinase C) em células do estroma endometrial enriquecidas. (Figs. 3A-3G) e células epiteliais endometriais (Figs. 3H-3N) de biópsias de escova do útero. A rotulagem dos gráficos é como nas Figs. 2A- 2BB.

[0018] As Figuras 4A-4G mostram a avaliação funcional do acoplamento intercelular de junção gap em células endometriais primárias do estroma e epiteliais de indivíduos normais e com endometriose. A Figura 4A é um esquema que mostra como o ensaio é realizado carregando células "doadoras" com um corante permeador de junção gap, soltando em uma monocamada de células receptoras e seguindo a propagação do corante para a monocamada. As Figuras 4B-4E são imagens representativas que mostram exemplos do ensaio usando células do estroma de indivíduos normais e um paciente com endometriose avançada. A Figura 4F é um gráfico linear que mostra a taxa de transferência de calceína entre as células doadora e receptora ao longo do tempo (gráfico superior - normal; gráfico inferior - endometriose. O eixo X representa o tempo e o eixo Y representa o número de destinatários rotulados por célula doadora. A inclinação é usada como uma medida da eficiência do acoplamento intercelular (referido como "acoplamento"). As Figuras 4G-4H são gráficos de barras que mostram os níveis de acoplamento

7 / 30 de células endometriais epiteliais (Fig. 4G) e células endometriais estromais (Fig. 4H) entre si (acoplamento homotípico - barras pretas) ou a uma monocamada de células mesoteliais peritoneais LP9 (heterotípico acoplamento - barras cinza). Em primeiro lugar, como esperado a partir dos perfis de expressão, as células do estroma são menos bem acopladas umas às outras do que as células epiteliais. No entanto, quando exposto a células mesoteliais (através das quais elas normalmente invadem na endometriose), um aumento dramático no acoplamento é visto, mas SOMENTE em células do estroma de pacientes com endometriose (a significância é mostrada em um teste T pareado).

[0019] As Figuras 5A-5F são imagens de microscopia de fluorescência que mostram a expressão de Cx43 em células estromais sozinhas (Fig. 5A - Fig. 5C) ou células estromais expostas a células mesoteliais (Figs. 5D-5F) a partir de amostras de biópsia endometrial uterina de mulheres sem endometriose (167 normal; Fig. 5A, Fig. 5D), endometriose superficial (164 Endo I-II; Fig. 5B, Fig. 5E) e endometriose infiltrativa profunda (169 Endo III-IV; Fig. 5C, Fig. 5F). As setas mostram a redistribuição de Cx43 para a superfície celular nas células da endometriose expostas às células mesoteliais, explicando potencialmente a rápida indução do acoplamento visto nas Figs. 4A-4H.

[0020] A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra o número de células epiteliais endometriais e células estromais que invadiram através de uma monocamada de células mesoteliais em amostras não tratadas (barras pretas) ou amostras tratadas com Cx43 siRNA para reduzir o acoplamento celular (barras cinza) ou controlar siRNA para glutaraldeído desidrogenase (GAPDH - barras tracejadas). Ambos os tipos de células são invasivos e essa capacidade de invasão é amplamente eliminada quando a expressão de Cx43 é suprimida. No entanto, as células do estroma mostram um aumento significativo na capacidade de invasão com a progressão da doença, e isso depende da expressão de Cx43 SOMENTE em amostras de endometriose.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0021] O uso dos termos "um", "uma", "o" e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção presentemente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.

[0022] A recitação de intervalos de valores neste documento se destina apenas a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado que cai dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado está incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado neste documento.

[0023] O uso do termo "cerca de" destina-se a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 1%. Os intervalos anteriores devem ser esclarecidos pelo contexto e nenhuma limitação adicional está implícita. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou de outra forma claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem de exemplo (por exemplo, "tal como") fornecido neste documento, destina-se meramente a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicado o contrário. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

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[0024] Conforme usado neste documento, "útero" se refere a um órgão do sistema reprodutor feminino, também conhecido como ventre. A principal função do útero é abrigar e nutrir o feto até que esteja pronto para o nascimento.

[0025] Conforme usado neste documento, "endométrio" se refere à membrana mucosa que reveste o útero. O endométrio muda ao longo do ciclo menstrual. A menstruação é a descamação cíclica do endométrio em resposta às flutuações hormonais. O ciclo menstrual é dividido em duas fases, a fase folicular ou proliferativa e a fase lútea ou secretora. A fase proliferativa é caracterizada pelo desenvolvimento de folículos ovarianos. A fase secretora dura normalmente 14 dias e começa após a ovulação.

[0026] Conforme usado neste documento, "células endometriais" referem-se a células do endométrio. As células endometriais podem ser subdivididas em células do estroma e células epiteliais.

[0027] Conforme usado neste documento, "células do estroma" referem-se a células do tecido conjuntivo de quaisquer órgãos. As células do estroma suportam a função das células parenquimatosas desse órgão. As células do estroma endometrial são importantes no início e manutenção da gravidez.

[0028] Tal como utilizado neste documento, "células epiteliais" referem-se a células que formam folhas coesas de células referidas como epitélios. Funcionam como uma cobertura ou forro para as superfícies do corpo e como unidades funcionais das glândulas secretoras. As células epiteliais podem ser especializadas para absorção, secreção ou para atuar como uma barreira.

[0029] Tal como utilizado neste documento, "endometriose" refere-se a uma doença ginecológica em que o tecido do útero cresce na cavidade abdominal, fora do útero. Os dois principais sintomas da endometriose incluem dor e infertilidade. As principais causas de dor e infertilidade são implantes endometriais e aderências. Conforme usado neste documento, "implantes endometriais" referem-se ao tecido endometrial encontrado em localizações

10 / 30 ectópicas. Os implantes se assemelham a pequenas placas planas na superfície peritoneal da região pélvica. Esses implantes causam irritação e inflamação no tecido circundante, o que pode levar à formação de aderências. "Aderências", tal como utilizadas neste documento, referem-se a faixas de tecido cicatricial interno que podem ligar tecidos e órgãos que normalmente são móveis.

[0030] A endometriose é classificada em “estágios” com base na gravidade da doença, extensão da propagação da doença, envolvimento das estruturas pélvicas, extensão das aderências pélvicas e bloqueio das trompas de falópio. O estadiamento da endometriose não reflete necessariamente a gravidade dos sintomas experimentados pela paciente.

[0031] Os quatro estágios da endometriose são equivalentes a mínima, leve, moderada e grave. A maioria dos pacientes encontra-se em estágios mínimos e leves. A endometriose mínima, denominada Estágio I, é caracterizada por implantes isolados e sem aderências significativas. A endometriose leve, Estágio II, é caracterizada por implantes superficiais com menos de 5 cm no agregado, sem aderências significativas. Endometriose Estágio I e Estágio II são frequentemente combinados na mesma categoria chamada “endometriose superficial”. A endometriose moderada (Estágio III) é caracterizada pelo aparecimento de endometriomas, que são um tipo de cisto que se forma quando o tecido endometrial cresce nos ovários. A endometriose grave (Estágio IV) é caracterizada por vários implantes, cistos e aderências graves que levam a cicatrizes ao redor dos tubos e ovários. Mulheres com endometriose em Estágio IV são as mais propensas a ter problemas de infertilidade.

[0032] Tal como aqui utilizado, " junção gap" refere-se a um agregado organizado de canais de proteína em membranas celulares que permitem que íons e pequenas moléculas passem entre células adjacentes. II. Métodos de diagnóstico e tratamento da endometriose

[0033] Métodos para diagnosticar e tratar endometriose são fornecidos

11 / 30 aqui. São divulgados neste métodos de análise de expressão de célula única sensíveis para detectar padrões de expressão de genes específicos em populações de células obtidas de células endometriais. Um método de exemplo inclui etapas de enriquecimento ou expansão de células endometriais obtidas do sujeito, sujeitando as células a processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado, submetendo o cDNA amplificado a PCR microfluídico para detectar a expressão do gene de RNA de um ou mais genes selecionados do grupo que contém DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e combinações destes, diagnosticar o sujeito com endometriose se a expressão de um ou mais genes for elevada em relação à expressão de um ou mais genes em células do estroma uterino de um sujeito sem endometriose e administrar um tratamento para endometriose ao sujeito diagnosticado com endometriose. A. Enriquecimento e expansão de células endometriais

1. Amostras endometriais

[0034] Em uma modalidade, as amostras de células uterinas são coletadas de mulheres durante verificações de bem-estar de rotina. Em algumas modalidades, as mulheres são suspeitas de ter endometriose. Em outra modalidade, as mulheres foram previamente diagnosticadas com endometriose e os métodos divulgados são usados para monitorar a recorrência da doença.

[0035] Em uma modalidade, as células endometriais são obtidas do sujeito de uma maneira não invasiva, como no fluido menstrual coletado em colônias estereoquimicas. Em outra modalidade, as células endometriais são obtidas do sujeito em um método minimamente invasivo, como com um dispositivo de biópsia com escova endometrial ou cateter de sucção

12 / 30 endometrial.

[0036] As mulheres com endometriose podem ter endometriose superficial (Estágio I/II) ou endometriose profunda (Estágio III/IV). A amostra de biópsia pode ser obtida em diferentes fases do ciclo menstrual, incluindo, mas não se limitando a, fase secretora precoce, secretora intermediária ou proliferativa.

[0037] Algumas modalidades fornecem um método de submeter células uterinas ao processamento de uma única célula e PCR microfluídico. As células uterinas podem ser estromais ou epiteliais.

[0038] As biópsias endometriais podem ser preparadas para enriquecimento, expansão e processamento de uma única célula, isolando as células do tecido. Métodos para isolar células de biópsias endometriais são conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem, mas não estão limitados a, digestão com colagenase, digestão com tripsina e raspagem manual do epitélio de superfície de toda a biópsia (Krjutškov, K., et al. Human Reproduction, 31:844-853 (2016); Jividen, K., et al., J Vis Exp, 87:e51513).

[0039] O fluido menstrual é preparado para enriquecimento, expansão e processamento de uma única célula, removendo os glóbulos vermelhos e isolando as células endometriais do fluido.

2. Enriquecimento Celular

[0040] Em uma modalidade, a população de células endometriais da biópsia é enriquecida em células estromais ou células epiteliais. Métodos de enriquecimento de populações de células endometriais para células estromais ou epiteliais são conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem, mas não estão limitados a separação física usando dispositivos de filtração, citometria de fluxo, grânulos magnéticos ou micropérolas revestidas com anticorpos específicos e microfluídicos. As amostras enriquecidas podem ser expandidas em cultura antes do processamento de uma única célula. i. Filtração

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[0041] Em uma modalidade, as células do estroma são isoladas da população de células endometriais passando a suspensão de células digeridas através de um filtro de cultura de células. As células do estroma fluirão através do filtro, enquanto as células epiteliais permanecerão agregadas dentro do tecido que não passa pelo filtro. O tecido epitelial pode ser posteriormente digerido em uma única suspensão de células. As suspensões de células enriquecidas podem ser cultivadas para expansão ou usadas diretamente para processamento de uma única célula. ii. FACS

[0042] A Separação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) é um tipo especializado de citometria de fluxo com capacidade de separação que pode isolar células individuais. Antes da separação, uma suspensão de células é feita e as células-alvo são marcadas com sondas fluorescentes. Os anticorpos monoclonais conjugados com fluoróforo (mAb) são as sondas fluorescentes mais amplamente utilizadas que reconhecem marcadores de superfície específicos nas células alvo. À medida que a suspensão de células passa pela máquina, cada célula é exposta a um laser, o que permite que os detectores de fluorescência identifiquem as células com base nas características selecionadas, particularmente quais anticorpos estão ligados. O instrumento aplica uma carga (positiva ou negativa) à gota contendo uma célula de interesse e um sistema de deflexão eletrostática facilita a coleta das gotas carregadas em tubos de coleta apropriados para análise posterior. O FACS também pode ser usado para separar células individuais.

[0043] Em uma modalidade, as células da biópsia endometrial são separadas usando FACS. A suspensão de células da biópsia endometrial pode ser incubada com sondas fluorescentes que reconhecem marcadores de células estromais, como CD10, CD146 e CD13. A suspensão de células é executada através do citômetro de fluxo e as células do estroma são coletadas em um recipiente separado. Em outra modalidade, a suspensão de células é incubada

14 / 30 com sondas fluorescentes que reconhecem marcadores epiteliais, como EpCam+ e CD9. A suspensão de células é executada através de um citômetro de fluxo e as células epiteliais são coletadas em um recipiente separado. Em uma modalidade, a cultura de células endometriais é enriquecida para células estromais ou epiteliais usando FACS. iii. Esferas Magnéticas

[0044] O isolamento magnético de células de esferas é uma técnica usada para enriquecer um tipo específico de células de uma população mista de células. Esferas magnéticas ou nanopartículas conjugadas com anticorpos contra marcadores de superfície celular na célula alvo são misturadas com a população de células. O recipiente que contém as células é exposto a uma coluna magnética e as células de interesse (que são conjugadas com as esferas magnéticas) são separadas do restante das células. Em uma modalidade, os grânulos magnéticos são conjugados com anticorpos contra marcadores de células do estroma, como CD10, CD146 e CD13 e são usados para separar as células do estroma da suspensão de células endometriais. iv. Microfluídica

[0045] Em outra modalidade, as células da biópsia endometrial são aumentadas usando microfluídicos. A separação de células por um chip microfluídico pode ser dividida em quatro categorias: separação microfluídica baseada em cromatografia de afinidade celular, características físicas de separação microfluídica baseada em células, separação microfluídica baseada em grânulos imunomagnéticos e métodos de separação baseados em diferenças entre propriedades dielétricas de vários tipos de células.

[0046] A microfluídica baseada em cromatografia de afinidade celular é o método mais comumente usado para a análise de chip microfluídico. É baseado em interações altamente específicas entre antígeno e anticorpo, ligante e receptor. No início do processo, o microcanal no chip é modificado com anticorpos específicos capazes de se ligar ao antígeno de superfície celular ou

15 / 30 aptâmero. Uma vez que a amostra flui através dos microcanais, seu antígeno de superfície celular pode se ligar aos anticorpos específicos ou aptâmero imobilizando as células no chip, enquanto as células restantes fluem para fora do chip com o tampão. Finalmente, usando um tampão diferente, as células imobilizadas podem ser eluídas para análise a jusante. Em uma modalidade, a população de células endometriais é enriquecida para células do estroma usando microfluídicos. Em outra modalidade, as células epiteliais são enriquecidas.

3.Expansão Celular

[0047] Em outras modalidades, as células são expandidas em cultura sem serem enriquecidas para subtipos específicos de células. As biópsias endometriais podem ser preparadas para expansão em cultura de células, isolando as células do tecido. Métodos para isolar células de biópsias endometriais são conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem, mas não estão limitados a, digestão com colagenase, digestão com tripsina e raspagem manual do epitélio de superfície de toda a biópsia (Krjutškov, K., et al. Human Reproduction, 31:844-853 (2016); Jividen, K., et al., J Vis Exp, 87:e51513). Os métodos para cultivar células endometriais são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, K.G., et al., Fertility and Sterility, 52:966-972 (1989); Zhang, L., et al., J Cell Sci, 108:323-331(1995). Em algumas modalidades, a alta sensibilidade do PCR de célula única supera a necessidade de expandir as células em cultura antes da análise. B. Processamento de célula única

[0048] Em uma modalidade, as células estromais ou uterinas enriquecidas ou expandidas são submetidas a processamento de uma única célula. O processamento de uma única célula é o método de isolar uma única célula de uma população de células e realizar a análise na única célula em vez de em populações inteiras de células. Em uma modalidade, as células individuais das amostras endometriais são submetidas a PCR microfluídica.

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1. Isolamento de célula única

[0049] Em uma modalidade, as células do estroma são isoladas da cultura de células endometriais. Marcadores de células estromais endometriais de exemplo incluem, mas não estão limitados a CD10, CD146 e CD13. Em outra modalidade, as células epiteliais são isoladas da cultura de células endometriais. Os marcadores epiteliais exemplares incluem, mas não estão limitados a EpCam+, CD45 e CD9.

[0050] Métodos para isolar células individuais de uma cultura total de células são conhecidos na técnica. Métodos exemplares para isolar células únicas de grandes populações de células incluem coleta manual de células, citometria de fluxo, separação magnética de células ativadas e microfluídica.

[0051] Métodos para isolar células raras de uma população ou isolar células únicas de uma pequena amostra também são conhecidos na técnica. Os sistemas microfluídicos dieletroferéticos (DEP) usam um chip microfluídico com gaiolas dieletroferéticas para navegar pelas células individuais por carga após a identificação com marcadores fluorescentes. A vantagem desses sistemas é que todas as células são preservadas e até mesmo uma única célula em um pool de 100.000 pode ser isolada com eficiência. Um sistema DEP exemplar é o sistema DEP-Array™ (Silicon Biosciences). Em uma modalidade, as células endometriais são separadas em amostras de células únicas usando um sistema DEP. As células podem ser marcadas com marcadores estromais ou epiteliais para separar as duas populações de células. O sistema DEP pode distribuir as células individuais em seu próprio poço individual de uma microplaca para processamento posterior.

2. PCR microfluídico

[0052] Em uma modalidade, o cDNA das células únicas processadas é usado para PCR microfluídico. Microfluídicos são dispositivos microminiaturizados que podem processar amostras com volumes de fluido da ordem de nanolitros ou picolitros. Os sistemas de PCR microfluídico podem

17 / 30 detectar com sucesso a expressão de ácido nucleico de amostras de tamanho de nanolitro. Em uma modalidade, a máquina de PCR microfluídica é uma máquina de PCR microfluídica de célula única. Um exemplo de máquinas microfluídicas de PCR no mercado são o sistema de célula única BioMark™ HD (Fluidigm) ou o sistema C1™ (Fluidigm). i. Junções Gap

[0053] Junções gap são conexões intercelulares especializadas entre células. Essas conexões, ou canais, fornecem comunicação intercelular direta entre o citoplasma de duas células, permitindo a troca rápida de íons e metabólitos de até aproximadamente 1 kD de tamanho. As junções gap são formadas a partir de aglomerados de proteínas de conexina. Genes de junções gap exemplares incluem, mas não estão limitados a, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7 e GJC2. Em uma modalidade, a expressão de genes da junção gap é elevada em células epiteliais do endométrio, mas reduzida em células do estroma endometrial de mulheres com endometriose.

[0054] A comunicação da junção gap intercelular foi examinada como um modo de comunicação celular entre as células endometriais e o alvo da invasão na endometriose, o mesotélio. Usando ensaios de células tradicionais, assim como análise de uma única célula, proteínas de junção gap específicas (conexinas formadoras de canal) foram identificadas que podem estar envolvidas na invasão de células endometriais, levando ao desenvolvimento de lesões endometrióticas. Além dos genes da junção gap, outros genes reguladores e quinases estão envolvidos na comunicação nas junções gap. Quinases exemplares que regulam as junções gap incluem, mas não estão limitados a, tirosina quinases, proteína quinase C, proteína quinase dependente de AMPc, MAP quinases, cdc2/ciclinB e caseína quinase I (Warn-Cramer, B.J. e Lau, A.F., Biochim Biophys Acta, 1662:81-95 (2004); Lampe, P.D. e Lau, A.F., Int J Biochem Cell Biol, 36:1171-1186 (2004)).

18 / 30

[0055] Em uma modalidade, a expressão do gene de RNA de DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1 e ZO2 no cDNA de amostras de uma única célula são medidos por PCR microfluídico.

[0056] Em outra modalidade, o nível de expressão de um dos genes divulgados em uma amostra é comparado ao nível de expressão desse mesmo gene em uma amostra de um indivíduo saudável sem endometriose. C. Diagnóstico de Endometriose

[0057] Nos métodos divulgados, um sujeito é diagnosticado com endometriose se a expressão de um ou mais genes do grupo contendo DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1 e ZO2 são elevados em relação à expressão de um ou mais genes em células epiteliais endometriais de um sujeito sem endometriose ou reduzidos em relação à expressão de um ou mais genes em células estromais endometriais de um sujeito sem endometriose.

[0058] Os níveis de expressão dos genes acima mencionados aumentam ou diminuem progressivamente com a gravidade da doença. Portanto, em uma modalidade, o nível de expressão do gene pode ser usado para determinar o estágio da endometriose. Entre os genes com maior expressão diferencial entre endometriose e amostras de células epiteliais endometriais normais estão CDH2, Vimentina e CTNNB, como nos exemplos (Tabela 1, abaixo).

19 / 30 Tabela 1. Expressão de vários genes em células epiteliais endometriais. Expressão em Log10*: Amostra Intervalo Máx Min Mediana 25% 75% CDH2 172 2,923 -0,554 -3,477 -2,527 -2,904 -2,265 164 2,331 0,119 -2,212 -1,389 -1,685 -1,222 170 9,739 0,906 -8,834 -1,439 -1,667 -0,629 Vimentina 172 1,133 0,0835 -1,049 -0,355 -0,575 -0,247 164 0,998 0,586 -0,413 -0,0282 -0,160 0,125 170 1,217 1,016 -0,201 0,206 0,0115 0,347

CTNNB 172 1,044 -0,713 -1,757 -1,335 -1,448 -1,149 164 1,912 0,563 -1,350 -0,997 -1,143 -0,847 170 2,836 1,536 -1,301 -0,844 -1,068 -0,331 172: normal 164 endometriose estágio I/II 172: endometriose estágio III/IV *A expressão é definida por 2-∆Ct, onde Ct é o limite do ciclo de PCR de cada gene e ∆ (grego, delta) é a diferença entre o gene alvo e um gene normalizador de manutenção (GAPDH).

[0059] Em uma modalidade, a mulher sendo testada para endometriose tem sintomas de endometriose ou tem um histórico familiar da doença. A mulher que está sendo testada para endometriose pode estar passando por um tratamento de fertilidade ou sofrendo de infertilidade. Em uma modalidade, a mulher sendo testada para endometriose está em idade reprodutiva. A mulher pode ter entre 15 e 45 anos. D. Endometriose Terapêutica

[0060] Em uma modalidade, o sujeito é diagnosticado com endometriose com base nos níveis de expressão dos genes divulgados e é subsequentemente tratado para endometriose. Os tratamentos para endometriose são direcionados ao alívio dos sintomas da doença. Os sintomas mais comuns da doença incluem dor, sangramento e infertilidade. i. Analgésicos

[0061] Uma modalidade fornece tratamentos para a dor induzida por endometriose. A medicação para a dor pode ser usada para dor leve e sintomas inflamatórios da endometriose. O tipo mais comum de analgésico são os antiinflamatórios não esteroidais (AINE). Exemplos representativos de agentes anti-inflamatórios não esteroides incluem, sem limitação, oxicams, tais como

20 / 30 piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam; salicilatos, tais como aspirina, disalcid, benorilato, trilisato, safaprina, solprin, diflunisal e fendosal; derivados do ácido acético, tais como diclofenaco, fenclofenaco, indometacina, sulindaco, tolmetina, isoxepaco, furofenaco, tiopinaco, zidometacina, acematacina, fentiazaco, zomepiraco, clindanaco, oxepinaco, felbinaco e cetorolaco; fenamatos, tais como ácidos mefenâmico, meclofenâmico, flufenâmico, niflúmico e tolfenâmico; derivados de ácido propiônico, tais como ibuprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, indopropfen, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno e tiaprofeno; pirazolas, tais como fenilbutazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona e trimetazona. Também podem ser utilizadas misturas destes agentes anti-inflamatórios não esteróides.

[0062] Os agentes antiinflamatórios esteroides também podem ser usados para tratar a dor. Exemplos representativos de drogas antiinflamatórias esteroides incluem, sem limitação, corticosteroides, tais como hidrocortisona, hidroxil-triancinolona, alfa-metil dexametasona, dexametasona-fosfato, dipropionatos de beclometasona, valerato de clobetasol, desonida, desoximetasona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, diclorisona, dipropionato de valerasona de diflorasona, diflucetato de valerasona, fluadrenolona, acetonido fluclorolona, fludrocortisona, pivalato de flumetasona, fluosinolona acetonida, fluocinonida, butilésteres flucortina, fluocortolona, fluprednideno (fluprednilideno) etil, flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona butirato, metilprednisolona, acetonido de triamcinolona, cortisona, cortodoxona, flucetonide, fludrocortisona, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflurosona, acetonido de fluradrenolona, medrisona, amcinafel, amcinafida, betametasona e o equilíbrio de seus ésteres, cloroprednisona, acetato de clorprednisona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato,

21 / 30 flucloronida, flunisolida, fluorometalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, hidrocortisona, ciclopentilpropionato, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, prednisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triancinolona e misturas destes.

[0063] Se a dor for tão forte que os antiinflamatórios não sejam eficazes, podem ser prescritos analgésicos narcóticos às mulheres, como morfina, fentanil, oxicodona, tramadol, hidromorfona e codeína. ii. Terapêutica hormonal

[0064] Outro tratamento para dor e sangramento associados à endometriose é a terapêutica hormonal. Como o tecido endometrial ectópico passa por um ciclo semelhante ao da menstruação, os hormônios às vezes podem ser eficazes no tratamento da dor associada à doença. Os hormônios podem ser administrados na forma de uma pílula, uma injeção ou injeção ou um spray nasal. Os anticoncepcionais orais podem ser usados para fornecer hormônios. Normalmente, os contraceptivos orais contêm dois hormônios, estrogênio e progesterona. Os contraceptivos orais de combinação exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, Desogestrel/etinilestradiol, Dienogest/valerato de estradiol, Drospirenona/etinilestradiol, Drospirenona/etinilestradiol/levomefolato, Etinodiol/etinilestradiol, Levonorgestrel/etinilestradiol, Mestranol/etinilestradiol, Noretindrona/etinilestradiol, Norgestimato/etinilestradiol e Norgestrel/etinilestradiol.

[0065] As progestinas são um grupo de drogas que se comportam como o hormônio feminino progesterona. Os progestágenos podem ser tomados na forma de pílula, injeção ou por meio de um dispositivo intrauterino (DIU). Embora os anticoncepcionais orais mais comumente prescritos sejam formulações combinadas de estrogênio e progestógeno, também são prescritos anticoncepcionais somente com progestógeno. Os mesmos mostraram melhorar os sintomas da endometriose, reduzindo o período da mulher ou

22 / 30 interrompendo-o completamente.

[0066] Os agonistas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) são comumente prescritos para mulheres com endometriose. Os agonistas de GnRH vêm em diferentes formas, incluindo injeção trimestral, injeção mensal, injeção diária e spray nasal. Agonistas de GnRH exemplares incluem, mas não estão limitados a, buserelina, goserelina, leuprorelina, leuprolida, naferelina e triptorelina.

[0067] O danazol é um andrógeno que se mostrou eficaz no tratamento da dor pélvica associada à endometriose.

[0068] Em uma modalidade, as mulheres diagnosticadas com endometriose usando os métodos divulgados são tratadas com terapêutica hormonal. iii. Tratamentos Cirúrgicos

[0069] Cirurgia demonstrou proporcionar alívio significativo da dor da endometriose. A laparoscopia é um tipo de cirurgia em que o cirurgião faz uma pequena incisão no abdômen e insere um pequeno instrumento de visualização chamado laparoscópio no abdômen. Isso permite que o cirurgião visualize diretamente as lesões endometrióticas. O cirurgião pode fazer incisões secundárias para inserir lasers ou outros instrumentos no abdômen para remover ou destruir as lesões. Em uma modalidade, a paciente que é diagnosticada com endometriose com os métodos divulgados neste documento é tratada por laparoscopia.

[0070] A laparotomia é uma cirurgia abdominal de grande porte que também pode ser usada para remover lesões endometriais. Nesse procedimento, o cirurgião faz uma incisão no abdome para visualizar a cavidade abdominal e o útero. O cirurgião pode remover lesões de endometriose durante uma laparotomia. Em uma modalidade, a paciente que é diagnosticada com endometriose com os métodos divulgados neste documento é tratada por laparotomia. O cirurgião também pode realizar uma histerectomia durante uma

23 / 30 laparotomia em que todo o útero é removido. Pacientes com dor extrema ou endometriose avançada ou recorrente podem optar por fazer uma histerectomia para erradicar a endometriose. Em uma modalidade, a paciente que é diagnosticada com endometriose com os métodos divulgados neste documento é tratada por histerectomia.

[0071] As mulheres com dor no centro do abdômen podem ter os nervos da pélvis cortados para diminuir a dor. Isso pode ser feito por meio de laparoscopia ou laparotomia. Existem dois procedimentos que cortam diferentes vias nervosas. A neurectomia pré-sacral rompe os nervos conectados ao útero. Em uma modalidade, a paciente que é diagnosticada com endometriose com os métodos divulgados neste documento é tratada por neurectomia pré-sacral. O segundo procedimento, denominado ablação laparoscópica do nervo uterino, envolve o corte de nervos nos ligamentos que protegem o útero. Em uma modalidade, a paciente que é diagnosticada com endometriose usando os métodos divulgados neste documento é tratada por ablação laparoscópica do nervo uterino.

EXEMPLOS Exemplo 1. Os genes de junção gap estão elevados nas células epiteliais uterinas derivadas da endometriose e reduzidos nas células do estroma derivadas da endometriose Métodos

[0072] Aquisição de tecido endometrial eutópico (do útero) de mulheres com e sem endometriose.

[0073] A presença ou ausência de endometriose foi confirmada por laproscopia. Todas as amostras endometriais eutópicas foram obtidas na fase proliferativa do ciclo menstrual de mulheres em idade reprodutiva com ciclo normal (faixa etária 30-45), que não estavam sob medicação hormonal. As amostras de endometriose foram obtidas de pacientes classificados como Estágio I-IV com base na classificação da Sociedade Americana de Medicina

24 / 30 Reprodutiva. No caso de indivíduos normais, o tecido endometrial foi isolado de mulheres submetidas à esterilização tubária, que não estavam tomando anticoncepcionais orais e foram demonstradas livres de endometriose por laparoscopia, sem evidência de miomas submucosos ou pólipos endometriais. O isolamento de células epiteliais endometriais primárias (EECs) e células estromais (ESCs) das biópsias foi realizado usando os métodos desenvolvidos por Kirk e Irwin que mostraram atingir pureza de cerca de 97%, o que foi confirmado por estudos anteriores. Além disso, a natureza epitelial das EECs foi confirmada neste estudo usando coloração contra a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) e expressão de citoqueratina 18. ESCs foram verificados por coloração com vimentina. A Tabela 2 mostra a lista de sujeitos normais e pacientes utilizados no estudo. Os números foram limitados devido às análises extensivas feitas em células individuais e à necessidade de não ter as células primárias passadas extensivamente antes da análise. Tabela 2. Base de pacientes.

1 Pro E M L pg/ ng/ - lif S S S ml ml 7 8- 1 1 2 14 5- 9- 4- 1 2 8 3 Nº Font Etnia Idad G P I Dura C M P E M L E2 P4 Leitura de e do e do M ção D S S S de Amo pacient Pacie C do histolog stra e nte ciclo ia (via)

CASOS NORMAIS ME- MA Caucas 23 1 1 32 26 1 X 94 9,8 Secreto 167 MC iano ,6 5 ra ME- MA -- 35 0 0 27 32- 2 X 224 10, Secreto 171 MC 35 8 7 ra ME- MA Hispân 25 1 0 28 28- 1 X 148 6,1 Secreto 172 MC ico ,3 30 4 ra precoce CASOS DE ENDOMETRIOSE DE ESTÁGIO I-II

25 / 30 ME- MA Habita 30 0 0 28 15 X 58 3,9 Secreto 164 MC ntes ra das precoce Ilhas do Pacífic o CASOS DE ENDOMETRIOSE DE ESTÁGIO III-IV ME- MA Caucas 23 0 0 25 31- 3 X 132 1,7 Secreto 163 MC iano 35 1 ra precoce ME- MA Caucas 37 0 0 23 28 2 X 168 26, Secreto 169 MC iano 0 8 ra ME- MA Caucas 30 0 0 22 28- 1 X 92 0,1 Prolifer 170 MC iano 30 0 ativa Cultura de células

[0074] EECs e ESCs endometriais primários foram cultivados em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 (1:1) (Sigma, St Louis, MO, EUA) contendo antibióticos e antimicóticos, 5 µg/ml de insulina (Sigma) e 10% de soro fetal de vitela (Hyclone, Logan, UT, EUA) conforme descrito anteriormente. Os experimentos foram realizados usando passagens baixas (≤ 4). Células LP9 estabelecidas (Corriell Cell Repositories, Camden, NJ) foram usadas como um modelo para células mesoteliais peritoneais. Para examinar a expressão da proteína conexina 43 (Cx43), a coloração de imunofluorescência típica foi usada para ESCs em cultura, usando anticorpo anti-Cx43 conjugado com fluorescência verde. Para suprimir experimentalmente a expressão de Cx43 em ESCs, o siRNA específico para Cx43 foi transfectado nas células.

[0075] Triagem de RNA de célula única da expressão do painel do gene da conexina por PCR microfluídica

[0076] Culturas primárias de EEC e ESC foram submetidas a isolamento e processamento de célula única C1 (Fluidigm Corp) para produzir cDNA amplificado de cada célula. O cDNA foi, então, submetido à análise de expressão gênica por PCR microfluídica, utilizando a plataforma Biomark (Fluidigm Corp). As sequências de iniciador de PCR correspondentes, conexina e painel regulador de junção gap, foram utilizadas para a detecção da expressão desses genes. Em cada ensaio de chip de PCR microfluídico, RNA

26 / 30 universal (200 pg) de tecidos humanos normais (cat # 4234565, BioChain, Newark, CA) e nenhum controle de modelo (NTC) serviram como controles positivo e negativo, respectivamente. Os produtos de PCR válidos foram determinados por curvas de temperatura de fusão do amplicon para cada amplicon do gene. Resultados

[0077] Um padrão de diminuição da expressão gênica da junção gap (porção superior de cada gráfico na Figura 1A-1I) foi observado nas células do estroma endometrial de pacientes com endometriose em comparação àquelas de indivíduos saudáveis, especialmente na doença de endometriose em estágio III/IV (Figuras 1A- 1E). É importante ressaltar que isso foi independente da fase menstrual em que as células foram colhidas.

[0078] Em contraste, um padrão de expressão aumentada de muitos genes de junção gap foi observado nas células epiteliais enriquecidas na endometriose em comparação com amostras derivadas normais (Figuras 1F- 1I). Um aumento progressivo na expressão gênica também é observado com o estágio da doença, mas para vários genes isso foi significativo mesmo nos estágios iniciais da endometriose.

[0079] Mudanças também foram observadas em outros genes envolvidos em contatos intercelulares adesivos e de vedação e as quinases que os regulam (parte inferior de cada gráfico na Figura 1A-1I), mas estes eram muito menos consistentes em comparação aos padrões de Connexina mencionados.

[0080] As Figuras 2A-2BB mostram a análise de PCR quantitativa de toda a expressão de conexina no nível de uma única célula de um sujeito normal e pacientes com endometriose em estágio inicial e tardio após a separação de células estromais (Figura 2A-2N) e epiteliais (Figura 2O-2BB). Os identificadores de amostra são descritos na Tabela 3. Praticamente todos os genes da conexina mostraram uma diminuição progressiva da expressão com a

27 / 30 progressão da doença nas células do estroma. As células epiteliais mostraram o padrão oposto, embora a conexina principal (GJA1) tenha mostrado pouca diferença entre os pacientes.

[0081] Tabela 3. Identificadores de amostra para as Figuras 2A-2BB e 3A-3N. Paciente Estado Estágio Ciclo Menstrual Secretora precoce precoce Secretora precoce precoce Secretora precoce precoce Proliferativo

[0082] A Figura 3A-3N mostra uma análise semelhante de genes envolvidos na regulação da atividade de junção gap (PRKAC, PRKCB, Cav), ou genes que codificam proteínas de ancoragem do citoesqueleto (Vim) ou outros tipos de interações célula-célula como adesão (CDH2, CTNNB) e junções de oclusão (TJP1). Enquanto alguns não mostraram nenhuma alteração com a doença (TJP1, Cav nas células epiteliais e outros não mostrados), outros mostraram padrões de expressão que mimetizaram as conexinas (diminui com a doença nas células do estroma, mas aumenta nas células epiteliais). Exemplo 2. Acoplamento de células epiteliais endometriais (E) e células estromais (S) com células mesoteliais (M) e capacidade de invasão Métodos Ensaios de comunicação intercelular de junção gap homotípica e heterotípica (GJIC) (também descritos como ensaios de acoplamento)

[0083] GJIC foi medido usando transferência intercelular do corante fluorescente Calcein, que é permeável através da junção gap. Os ensaios foram realizados em meios de cultura suplementados com FBS sem carvão (10%). As células doadoras foram incubadas com calceína AM durante 20 minutos à temperatura ambiente. Dentro da célula, a calceína AM é clivada por esterases não específicas em calceína, tornando-a impermeável à difusão através da membrana celular. As células receptoras são cultivadas até a confluência. As células do doador marcadas com calceína foram, então, descartadas

28 / 30 ("paraquedas") na camada de células do receptor, e a transferência de calceína entre as células do doador e receptor foi observada com imagens microscópicas fluorescentes. Para interações homotípicas, células doadoras do epitélio endometrial (EECs), do estroma endometrial (ESCs) e mesoteliais (LP9) foram colocadas de paraquedas em células receptoras do mesmo tipo, respectivamente. Para os ensaios GJIC heterotípicos, EECs (ou ESCs) foram lançados de pára-quedas em células receptoras LP9 e vice-versa. Ensaios de otimização iniciais mostraram que a transferência de corante em células EECs, ESCs e LP9 foi observada de forma otimizada 1,5 - 2 horas após o paraquedismo. Imagens fluorescentes de 10-15 campos por poço foram capturadas em um microscópio automatizado Operetta (Perkin Elmer). Um programa foi escrito por Perkin Elmer que permitiu a identificação de todas as células na placa, (a partir da imagem de contraste de fase), bem como doadores originais (100 ± 50 por poço) e receptores cheios de corante devido à transferência de calceína ao longo do tempo. Os dados são expressos como nº de células receptoras fluorescentes/nº de células doadoras para cada condição. Ensaio de Invasão Trans-mesotelial

[0084] O ensaio de invasão 3-D modelando a invasão trans-mesotelial foi descrito anteriormente. Resumidamente, as células mesoteliais peritoneais LP9 (PMCs) foram cultivadas até a confluência em inserções de câmara de invasão de 24 poços contendo MatrigelTM com fator de crescimento reduzido, revestidas em membranas de poros de 8 µm (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Em seguida, 20.000 células epiteliais endometriais (EECs) ou estromais (ESCs) foram plaqueadas, após marcação com CellTracker Green® (Molecular Probes-Invitrogen, Carlsbad, CA) e tratadas com o siRNA relevante, na camada confluente de LP9 PMCs no preparado inserções. Após 20 horas de incubação, as células que não invadiram, na superfície superior das membranas de inserção, foram removidas mecanicamente. As células invadidas, no fundo das membranas revestidas, foram coradas com DAPI, foram visualizadas em

29 / 30 microscópio de fluorescência com objetiva 20x. Os ensaios de invasão para cada tipo de célula foram realizados em triplicado. Resultados

[0085] O acoplamento de células foi medido usando um ensaio de paraquedas, em que a transferência de calceína entre células doadoras caindo em uma monocamada de células receptoras foi medida ao longo do tempo (Figura 4A-4F). Essa taxa de transferência foi determinada para acoplamento homotípico entre células epiteliais (EECs - Figura 4G) ou células do estroma (ESCs - Figura 4H) [barras pretas] e para acoplamento heterotípico dessas células com células mesoteliais peritoneais LP9 [barras cinzas] em normal Pacientes com endometriose (N), estágio inicial (I-II) e estágio tardio (III-IV). As células mesoteliais induziram o acoplamento em células do estroma de pacientes, mas não de indivíduos normais (Figura 4H), e não em células epiteliais de pacientes ou indivíduos normais (Figura 4G).

[0086] A coloração imunofluorescente de Cx43 revela uma distribuição interna de Cx43 em células do estroma de todos os indivíduos (observe que a coloração não se concentra em torno das bordas das células e nas interfaces célula-célula - Figuras 5 A-C). Isso é mais acentuado à medida que a endometriose progride, embora surpreendentemente nenhuma redução perceptível na expressão seja evidente (Figura 5A-5C). No entanto, a exposição de células estromais a células mesoteliais causa uma redistribuição de Cx43 para a superfície celular (setas) em amostras de endometriose (Figuras 5E e 5F), mas em um grau muito menor em células de indivíduos normais (Figura 5D). Essa ativação das reservas intracelulares de Cx43 após a exposição às células mesoteliais poderia explicar o aumento dramático e rápido no acoplamento heterotípico visto nas Figuras 4B-4E.

[0087] A invasão de células epiteliais endometriais (E) e células estromais (S) através de uma monocamada de células mesoteliais também foi medida em uma câmara de Boyden para imitar o processo invasivo

30 / 30 característico da endometriose (Figura 6). As células endometriais foram deixadas sem tratamento [barras pretas] ou tratadas com siRNA direcionado a Cx43 [barras cinza] ou uma proteína de controle, GAPDH [barras tracejadas]. As células epiteliais eram invasivas de um modo dependente de Cx43, mas isso era variável entre os pacientes e não se correlacionava com o estado da doença (Figura 6). As células estromais, em contraste, mostraram invasividade crescente com a progressão da doença, mas isso era dependente apenas de Cx43 no estado da doença.

[0088] Embora no relatório descritivo acima esta invenção tenha sido descrita em relação a determinadas modalidades da mesma, e muitos detalhes tenham sido definidos para fins de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que alguns dos detalhes descritos neste documento podem variar consideravelmente sem se afastarem dos princípios básicos da invenção.

[0089] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência na sua totalidade. A presente invenção pode ser concretizada de outras formas específicas sem se afastar do espírito ou dos atributos essenciais da mesma e, consequentemente, deve ser feita referência às reivindicações anexas, em vez de ao relatório descritivo acima, para saber-se o escopo da invenção.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de diagnóstico e tratamento de endometriose em um indivíduo em necessidade dos mesmos, caracterizado por compreender enriquecer ou expandir células do estroma endometrial obtidas do indivíduo; submeter as células do estroma endometrial enriquecidas ou expandidas ao processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado; submeter o cDNA amplificado a PCR microfluídico para detectar a expressão do gene de RNA de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e suas combinações; e diagnosticar o indivíduo com endometriose se a expressão de um ou mais genes for reduzida em relação à expressão de um ou mais genes em células do estroma endometrial de um indivíduo sem endometriose; e administrar um tratamento para endometriose ao indivíduo com diagnóstico de endometriose.

2. Método de diagnóstico e tratamento de endometriose em um indivíduo em necessidade dos mesmos, caracterizado por compreender enriquecer ou expandir as células epiteliais endometriais obtidas do indivíduo; submeter as células epiteliais endometriais enriquecidas ou expandidas ao processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado; submeter o cDNA amplificado a PCR microfluídico para detectar a expressão do gene de RNA de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e suas combinações; diagnosticar o indivíduo com endometriose se a expressão de um ou mais genes for elevada em relação à expressão de um ou mais genes em células epiteliais endometriais de um indivíduo sem endometriose; e administrar um tratamento para endometriose ao indivíduo diagnosticado com endometriose.

3. Método de diagnóstico e tratamento de endometriose em um indivíduo em necessidade dos mesmos, caracterizado por compreender enriquecer ou expandir células do estroma endometrial e células epiteliais obtidas do indivíduo; submeter as células do estroma endometrial enriquecidas ou expandidas e as células epiteliais ao processamento de célula única em câmaras microfluídicas para produzir cDNA amplificado; submeter o cDNA amplificado a PCR microfluídico para detectar a expressão do gene de RNA de um ou mais genes selecionados dentre o grupo que consiste em DBN1, CAV1, CDH, CDK1, CD45, CK19, CSNK, CTNNB1, Cx43, EpCAM, GAPDH, GJA1, GJA3, GJA5, GJA8, GJA9, GJB1, GJB2, GJB3, GJB4, GJB5, GJB6, GJB7, GJC2, GUSB, KRT18, MAPK1, MAPK3, MME, Notch1, NOV1, PECAM, PRKACA, PRKACB, PRKACG, PRKCA, SNAI1, SRC, TGFBR2, TJAP1, TJP1, TJP2, Twist 1, VEGFR1, VIM, Zeb2, ZO1, ZO2 e suas combinações; diagnosticar o indivíduo com endometriose se a expressão de um ou mais genes for reduzida em relação à expressão de um ou mais genes em células do estroma endometrial de um indivíduo sem endometriose e elevada em relação à expressão de um ou mais genes em células epiteliais endometriais de um indivíduo sem endometriose; e administrar um tratamento para endometriose ao indivíduo diagnosticado com endometriose.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as células endometriais serem obtidas do sangue menstrual.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as células endometriais serem obtidas a partir de uma biópsia do endométrio.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o tratamento para endometriose ser selecionado dentre o grupo que compreende fármacos anti-inflamatórios, terapia hormonal ou remoção cirúrgica do tecido afetado.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o diagnóstico do indivíduo com endometriose compreender adicionalmente o estadiamento da endometriose.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a endometriose ser endometriose superficial (estágio I/II) ou endometriose profunda infiltrativa (estágio III/IV).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o indivíduo ter sintomas de endometriose.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o indivíduo ter sido previamente diagnosticado com endometriose.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a endometriose ser endometriose superficial (estágio I/II) ou endometriose profunda infiltrativa (estágio III/IV).

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células do estroma endometrial serem isoladas classificando as células usando marcadores de células do estroma endometrial CD10, CD146 e CD13.

13. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as células epiteliais endometriais serem isoladas classificando as células usando marcadores de células epiteliais endoteliais EpCam+, CD45 e CD9.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um ou mais genes cuja expressão é reduzida em relação à expressão de um ou mais genes em células do estroma endometrial de um indivíduo sem endometriose incluírem Cx43, MAPK, TGFBR2, ZO2 e ZO1.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um ou mais genes cuja expressão é reduzida em relação à expressão de um ou mais genes em células do estroma endometrial de um indivíduo sem endometriose incluírem SNAI1, Twist 1 Zeb2, Notch1, VEGFR1 e CD45.