CN112470002A - 用于治疗子宫内膜异位症的组合物和方法 - Google Patents
用于治疗子宫内膜异位症的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文公开的是用于检测和诊断子宫内膜异位症的方法。更具体地讲，提供了用以检测从子宫内膜细胞获得的细胞群体中的特异性基因表达模式的灵敏的单细胞表达分析方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月20日提交的美国临时专利申请No.62/660,641的权益和优先权，将其全文以引用方式并入。
技术领域
本发明整体涉及检测和诊断子宫内膜异位症的方法。
背景技术
子宫内膜异位症是美国最常见的妇科疾病之一。这是一种痛苦的、通常会使人衰弱的疾病，影响着美国650多万15至44岁的女性(Buck Louis等人，Fertil Steril，96：360-365(2011))。当子宫内膜异位生长，最通常是在卵巢、输卵管、将子宫保持就位的组织以及子宫的外表面上异位生长时，发生子宫内膜异位。虽然较不常见，但子宫内膜生长也可见于阴道、子宫颈、外阴、肠、膀胱或直肠上。子宫内膜异位症最常见的症状包括疼痛、出血或生斑、不孕和消化问题，诸如腹泻、便秘、气胀或恶心。
子宫内膜异位症的原因未知。可能的原因包括经血逆流、遗传因素、免疫系统问题、荷尔蒙失调和手术并发症。由于子宫内膜异位症的病因尚不清楚，因此目前对子宫内膜异位症的治疗只治疗症状，而不治疗疾病本身。此外，除了外科手术移除子宫内膜异位病变外，无法治愈子宫内膜异位症。移除子宫内膜异位病变并不是该疾病的永久治愈方法，它只是暂时的治疗选项。
子宫内膜异位症很难诊断，因为其症状与影响腹部和肠的许多其他疾病重叠。目前，子宫内膜异位症的诊断依赖于临床病史以及侵入性和非侵入性测试的结合。盆腔检查、超声和MRI都是用于使潜在的子宫内膜异位病变可视化的技术。然而，目前仅能通过一种称为腹腔镜术的手术来确诊子宫内膜异位症，在腹腔镜术中医生可以从盆腔区域内直接观察子宫内膜组织。在腹腔镜术期间，医生还将切除发现的任何子宫内膜异位病变。因为腹腔镜术是一种侵入性方法，而且成本高昂，所以筛查子宫内膜异位症不切实际。因此，许多患有子宫内膜异位症的女性得不到诊断，或者未正确诊断，以及未得到治疗。需要用于诊断子宫内膜异位症的侵入性较小、较早检测的检测方法。
因而，本发明的一个目的是提供用于诊断子宫内膜异位症的更有效的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断子宫内膜异位症的侵入性较小的方法。
发明内容
本文公开了诊断和治疗患者中的子宫内膜异位症的方法。诊断子宫内膜异位症的当前方法要么效率低下要么是高度侵入性的。提供了诊断子宫内膜异位症的有效的、非侵入性的方法。
一个实施方案提供了一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，该方法通过如下进行：富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜基质细胞；使所述经富集或扩增的子宫内膜基质细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；以及对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
另一个实施方案提供了一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，该方法通过如下进行：富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜上皮细胞；使所述经富集或扩增的子宫内膜上皮细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜上皮细胞中的表达升高，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；以及对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
另一个实施方案提供了一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，该方法通过如下进行：富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜基质细胞和上皮细胞；使所述经富集或扩增的子宫内膜基质细胞和上皮细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低并且相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜上皮细胞中的表达升高，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；以及对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
子宫内膜细胞可以从月经血或子宫内膜活检获得。在一个实施方案中，通过使用子宫内膜基质细胞标志物CD10、CD146和CD13分选基质细胞来分离所述细胞。在另一个实施方案中，通过使用内皮上皮细胞标志物EpCam+、CD45和CD9分选子宫内膜上皮细胞来分离所述细胞。
用于子宫内膜异位症的治疗可以选自抗炎药、激素疗法或外科手术移除受影响的组织。
在一个实施方案中，受试者具有子宫内膜异位症的症状。在另一个实施方案中，受试者先前已诊断患有子宫内膜异位症。
附图说明
图1A-1I示出了反映缝隙连接基因(连接蛋白)以及涉及细胞-细胞相互作用(紧密连接和粘附连接)的其他蛋白质和调节它们的各种激酶的基因表达水平的热图。在黑和白中，最高表达为灰色，中间表达为黑色，最低表达为白色。每个点对应于特定细胞(以列排列)中特定基因(以行排列)的表达。图1A-1E是从子宫内膜活检样品富集的基质细胞的基因表达谱，这些子宫内膜活检样品来自没有子宫内膜异位症的女性(正常；图1A)、患有早期子宫内膜异位症(I/II期；图1B)的女性和盆腔内有较广泛的子宫内膜异位病变的女性(III/IV期；图1C-1E)。这些样品是在月经周期的不同阶段获得的：ES，分泌早期(图1A-1C)；MS，分泌中期(图1D)；和P，增生期(图1E)。图1F-1I是从子宫内膜活检样品富集的上皮细胞的基因表达谱，这些子宫内膜活检样品来自没有子宫内膜异位症的女性(正常；图1F-G)、患有早期子宫内膜异位症的女性(I/II期；图1H)和有广泛子宫内膜异位的女性(III/IV期；图1I)。这些样品是在月经周期的不同阶段获得的：ES，分泌早期(图1F-H)和P，增生期(图1I)。
图2A-2BB是来自子宫刷拭活检的富集的基质细胞(图2A-2N)和上皮细胞(图2O-2BB)中大多数缝隙连接基因(在每个图上方用GJ指示)的单细胞微流控PCR表达数据的箱线图。患者通过沿每个图的X轴的数字来识别，代表正常受试者、早期子宫内膜异位症受试者和晚期子宫内膜异位症受试者，如实施例的表3中所示。Y轴表示Log10表达式。在两种细胞类型中，GJA1(编码Cx43蛋白)是表达最丰富的连接蛋白。然而，事实上所有连接蛋白在基质细胞中均随疾病进展显示出一致且显著的下降(以星号指示)(图2A-2N)，但是在上皮细胞中随疾病进展而增加(图2O-2BB)。
图3A-3N是箱线图，示出了来自子宫刷拭活检的富集的子宫内膜基质细胞(图3A-3G)和子宫内膜上皮细胞(图3H-3N)中，除了缝隙连接蛋白及其调节物以外的涉及细胞-细胞相互作用的其他数种基因的单细胞微流控PCR表达数据，如每个图的顶部所指示的(TJP1＝ZO1；Cav＝小窝蛋白；CDH2＝N-钙粘蛋白；Vim＝波形蛋白；CTNNB＝β连环蛋白；PRHACA-蛋白激酶A；PRKCB＝蛋白激酶C)。图的标记与图2A-2BB中一样。
图4A-4G示出了来自正常受试者和子宫内膜异位症受试者的原代子宫内膜基质细胞和上皮细胞中缝隙连接细胞间偶联的功能评估。图4A是示意图，示出了通过向“供体”细胞加载缝隙连接渗透性染料、将所述供体细胞滴到单层受体细胞上以及跟踪染料向所述单层的扩散来进行测定法的方式。图4B-4E是代表性图像，示出了使用来自正常受试者和晚期子宫内膜异位症患者的基质细胞的测定法的实例。图4F是线图，示出了钙黄绿素在供体和受体细胞之间随时间推移的转移速率(上图-正常；下图-子宫内膜异位症。X轴表示时间，Y轴表示每个供体细胞的标记的受体数量。斜率用作细胞间偶联效率(称为“偶联”)的量度。图4G-4H是柱状图，示出了上皮子宫内膜细胞(图4G)和基质子宫内膜细胞(图4H)彼此偶联(同型偶联-黑色条柱)或与单层LP9腹膜间皮细胞偶联(异型偶联-灰色条柱)的水平。首先，如根据表达谱所预期的，基质细胞彼此之间的偶联不如与上皮细胞的偶联。然而，当暴露于间皮细胞(在子宫内膜异位症中它们通常通过间皮细胞侵袭)时，可以看到偶联的显著增加，但是仅在来自子宫内膜异位症患者的基质细胞中可见(根据配对T检验显示出显著性)。
图5A-5F是荧光显微图像，示出了Cx43在单独的基质细胞(图5A-图5C)或暴露于间皮细胞的基质细胞(图5D-5F)中的表达，所述细胞来自子宫内膜活检样品，所述样品来自没有子宫内膜异位症的女性(167正常；图5A、图5D)、浅表型子宫内膜异位症女性(164子宫内膜异位症I-II；图5B、图5E)和深部浸润型子宫内膜异位症女性(169子宫内膜异位症III-IV；图5C、图5F)。箭头示出了暴露于间皮细胞的子宫内膜异位细胞中Cx43重新分布到细胞表面，这可能解释了图4A-4H中所见到的偶联的快速诱导。
图6是柱状图，示出了未经处理的样品(黑色条柱)或用Cx43siRNA处理以减少细胞偶联的样品(灰色条柱)或用针对戊二醛脱氢酶的对照siRNA处理的样品(GAPDH-带阴影线条柱)中通过间皮细胞单层侵袭的子宫内膜上皮细胞和基质细胞的数量。两种细胞类型都是侵袭性的，当Cx43表达被抑制时，这种侵袭性将大大消除。然而，基质细胞显示出侵袭性随疾病进展的显著增加，并且这仅取决于子宫内膜异位症样品中Cx43的表达。
具体实施方式
I.定义
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
如本文所用，“子宫”是指女性生殖系统的器官，也称为胞宫。子宫的主要功能是为胎儿提供容纳场所和营养直至其准备分娩为止。
如本文所用，“子宫内膜”是指子宫内衬的粘膜。子宫内膜在整个月经周期中发生变化。月经是响应荷尔蒙波动的周期性子宫内膜脱落。月经周期分为两个阶段，即卵泡期(或增生期)和黄体期(或分泌期)。增生期的特征在于卵泡的发育。分泌期通常长14天，从排卵后开始。
如本文所用，“子宫内膜细胞”是指来自子宫内膜的细胞。子宫内膜细胞可细分为基质细胞和上皮细胞。
如本文所用，“基质细胞”是指任何器官的结缔组织细胞。基质细胞支持该器官的实质细胞的功能。子宫内膜基质细胞在妊娠的开始和维持中很重要。
如本文所用，“上皮细胞”是指形成粘着性细胞片层(称为上皮)的细胞。它们用作身体表面的覆盖物或衬里，以及用作分泌腺的功能单元。上皮细胞可特化用于吸收、分泌或充当屏障。
如本文所用，“子宫内膜异位症”是指一种妇科疾病，其中来自子宫的组织在子宫外部的腹腔中生长。子宫内膜异位症的两个主要症状包括疼痛和不育。引起疼痛和不育的主要原因是子宫内膜植入物和粘连。如本文所用，“子宫内膜植入物”是指在异位处存在的子宫内膜组织。植入物类似于盆腔区域的腹膜表面上的小的扁平斑块。这些植入物会引起周围组织的刺激和炎症，这可导致粘连的形成。如本文所用，“粘连”是指内部疤痕组织的带，其可以系结通常是可移动的组织和器官。
子宫内膜异位症根据该疾病的严重程度、该疾病的扩散程度、盆腔结构的累及、盆腔粘连的程度和输卵管的阻塞而以“期”分类。子宫内膜异位症的分期不一定反映患者所经历的症状的严重程度。
子宫内膜异位症的四个期等价于最轻、轻度、中度和重度。大多数患者处于最轻阶段和轻度阶段。最轻的子宫内膜异位症(称为I期)表征为分离的植入物和无明显粘连。轻度子宫内膜异位症(II期)表征为浅表植入物聚集体小于5厘米，而没有明显的粘连。I期和II期子宫内膜异位症通常合并为同一类别中，称为“浅表型子宫内膜异位症”。中度(III期)子宫内膜异位症表征为子宫内膜瘤的出现，子宫内膜瘤是一种当子宫内膜组织在卵巢中生长时形成的囊肿。重度子宫内膜异位症(IV期)表征为多个植入物、囊肿，以及严重的粘连，其导致输卵管和卵巢周围形成疤痕。具有IV期子宫内膜异位症的女性最有可能具有不孕问题。
如本文所用，“缝隙连接”是指细胞膜中蛋白质通道的有组织的聚集体，这些蛋白质通道允许离子和小分子在相邻细胞之间通过。
II.诊断和治疗子宫内膜异位症的方法
本文提供了用于诊断和治疗子宫内膜异位症的方法。本文所公开的是用以检测从子宫内膜细胞获得的细胞群体中的特异性基因表达模式的灵敏的单细胞表达分析方法。一种示例性的方法包括以下步骤：富集或扩增得自受试者的子宫内膜细胞；使所述细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自含有DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的群组的一种或多种基因的RNA基因表达；如果一种或多种基因的表达相对于一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫基质细胞中的表达升高，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；以及对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
A.子宫内膜细胞的富集和扩增
1.子宫内膜样品
在一个实施方案中，在常规健康检查期间从女性收集子宫细胞样品。在一些实施方案中，所述女性疑似患有子宫内膜异位症。在另一个实施方案中，所述女性先前已诊断患有子宫内膜异位症，并且将所公开的方法用于监测疾病的复发。
在一个实施方案中，子宫内膜细胞以非侵入性方式从受试者获得，诸如在收集于杯式过滤器(stericup)中的月经流体中获得。在另一个实施方案中，子宫内膜细胞以微创方法从受试者获得，诸如利用子宫内膜刷拭活检装置或子宫内膜抽吸导管。
患有子宫内膜异位症的女性可患有浅表型子宫内膜异位症(I/II期)或深部浸润型子宫内膜异位症(III/IV期)。活检标本可以在月经周期的不同阶段获得，包括但不限于分泌早期、分泌中期或增生期。
一些实施方案提供了使子宫细胞经受单细胞处理和微流控PCR的方法。所述子宫细胞可以是基质细胞或上皮细胞。
子宫内膜活检可以通过从组织中分离细胞来进行制备以供富集、扩增和单细胞处理。从子宫内膜活检分离细胞的方法是本领域已知的。示例性的方法包括但不限于胶原酶消化、胰蛋白酶消化和从整个活检组织中手动刮取表面上皮(
K.等人，HumanReproduction，31：844-853(2016)；Jividen，K.等人，J Vis Exp，87：e51513)。
月经流体通过从该流体中移除红细胞并分离子宫内膜细胞来进行制备以供富集、扩增和单细胞处理。
2.细胞富集
在一个实施方案中，富集来自活检的子宫内膜细胞群体的基质细胞或上皮细胞。富集子宫内膜细胞群体的基质细胞或上皮细胞的方法是本领域已知的。示例性的方法包括但不限于使用过滤装置的物理分离、流式细胞术、包被有特异性抗体的磁珠或微珠以及微流控。可以在单细胞处理之前在培养物中扩增富集的样品。
i.过滤
在一个实施方案中，通过使经消化的细胞悬浮液通过细胞培养过滤器，从子宫内膜细胞群体分离基质细胞。基质细胞将流过过滤器，而上皮细胞将保持聚集在未通过过滤器的组织内。可将上皮组织进一步消化成单细胞悬浮液。可培养富集的细胞悬浮液以供扩增或者可将富集的细胞悬浮液直接用于单细胞处理。
ii.FACS
荧光激活细胞分选术(FACS)是一种专用类型的流式细胞术，具有可分离单个细胞的分选能力。在分离之前，制备细胞悬浮液，并用荧光探针标记靶细胞。缀合有荧光团的单克隆抗体(mAb)是使用最广泛的荧光探针，其可识别靶细胞上的特异性表面标志物。当细胞悬浮液流过机器时，每个细胞都暴露于激光下，这使荧光检测器可基于所选特征识别细胞，尤其是抗体结合的细胞。该仪器对含有所关注细胞的小液滴施加电荷(正电荷或负电荷)，并且静电偏转系统有利于将带电的小液滴收集到适当的收集管中以供以后的分析。FACS还可以用于分选单个细胞。
在一个实施方案中，使用FACS对来自子宫内膜活检的细胞进行分选。可将来自子宫内膜活检的细胞悬浮液与可识别基质细胞标志物(诸如CD10、CD146和CD13)的荧光探针一起温育。使该细胞悬浮液流过流式细胞仪，并在单独的容器中收集基质细胞。在另一个实施方案中，将细胞悬浮液与可识别上皮标志物(诸如EpCam+和CD9)的荧光探针一起温育。使该细胞悬浮液流过流式细胞仪，并在单独的容器中收集上皮细胞。在一个实施方案中，使用FACS富集子宫内膜细胞培养物的基质细胞或上皮细胞。
iii.磁珠
磁珠细胞分离是一种用于从混合细胞群体中富集特定细胞类型的技术。将与针对靶细胞上的细胞表面标志物的抗体缀合的磁珠或纳米颗粒与细胞群体混合。将容纳细胞的容器暴露于磁柱，所关注的细胞(其与磁珠缀合)则与其余细胞分开。在一个实施方案中，将磁珠用针对基质细胞标志物(诸如CD10、CD146和CD13)的抗体缀合，并用于从子宫内膜细胞悬浮液中分离基质细胞。
iv.微流控
在另一个实施方案中，使用微流控来增强来自子宫内膜活检的细胞。通过微流控芯片进行的细胞分选可分为四类：基于细胞亲和色谱的微流控分离、基于细胞的物理特征的微流控分离、基于免疫磁珠的微流控分离以及基于各种细胞类型的介电特性差异的分离方法。
基于细胞亲和色谱的微流控是用于微流控芯片分析的最常用方法。其基于抗原与抗体、配体与受体之间的高度特异性相互作用。在该过程的开始，将芯片中的微通道用能够结合细胞表面抗原或适体的特异性抗体修饰。一旦样品流过该微通道，其细胞表面抗原就可以与特异性抗体或适体结合，从而将细胞固定在芯片上，而其余的细胞则与缓冲液一起流出芯片。最后，使用不同的缓冲液，可洗脱所固定的细胞以供下游分析。在一个实施方案中，使用微流控富集子宫内膜细胞群体的基质细胞。在另一个实施方案中，富集上皮细胞。
3.细胞扩增
在其他实施方案中，将细胞在培养物中扩增而不富集特定亚型的细胞。子宫内膜活检可以通过从组织中分离细胞来进行制备以供在细胞培养物中扩增。从子宫内膜活检分离细胞的方法是本领域已知的。示例性的方法包括但不限于胶原酶消化、胰蛋白酶消化和从整个活检中手动刮取表面上皮(
K.等人，Human Reproduction，31：844-853(2016)；Jividen，K.等人，J Vis Exp，87：e51513)。用于培养子宫内膜细胞的方法是本领域已知的。参见例如Osteen，K.G.等人，Fertility and Sterility，52：966-972(1989)；Zhang，L.等人，J Cell Sci，108：323-331(1995)。在一些实施方案中，单细胞PCR的高灵敏度可克服在分析之前在培养物中扩增细胞的需要。
B.单细胞处理
在一个实施方案中，使富集的或扩增的基质细胞或子宫细胞经受单细胞处理。单细胞处理是从细胞群体中分离单个细胞并对单个细胞而不是整个细胞群体进行分析的方法。在一个实施方案中，使来自子宫内膜样品的单个细胞经受微流控PCR。
1.单细胞分离
在一个实施方案中，从子宫内膜细胞培养物中分离基质细胞。示例性的子宫内膜基质细胞标志物包括但不限于CD10、CD146和CD13。在另一个实施方案中，从子宫内膜细胞培养物中分离上皮细胞。示例性的上皮标志物包括但不限于EpCam+、CD45和CD9。
从总细胞培养物中分离单细胞的方法是本领域已知的。用于从大的细胞群体中分离单细胞的示例性方法包括手动细胞挑选、流式细胞术、磁激活细胞分选和微流控。
用于从群体中分离稀有细胞或从小样品中分离单个细胞的方法是本领域已知的。介电电泳(DEP)微流控系统使用带有介电电泳笼的微流控芯片来在用荧光标志物识别后通过电荷引导单个细胞。这些系统的优势在于，每个细胞都可以保留，甚至可以有效地在一组100,000个细胞中分离出单个细胞。示例性的DEP系统是DEP-ArrayTM系统(SiliconBiosciences公司)。在一个实施方案中，使用DEP系统将子宫内膜细胞分离成单细胞样品。可以用基质或上皮标志物标记细胞，以分离这两个细胞群体。DEP系统可以将单细胞每一者分配到微孔板中它们各自的独立孔中以供进一步处理。
2.微流控PCR
在一个实施方案中，将来自经处理的单细胞的cDNA用于微流控PCR。微流控是微型设备，其可以处理流体体积为纳升或皮升量级的样品。微流控PCR系统可以成功地从纳升大小的样品中检测核酸表达。在一个实施方案中，微流控PCR机器是单细胞微流控PCR机器。市场上的微流控PCR机器的一个实例是BioMarkTM HD单细胞系统(富鲁达公司(Fluidigm))或C1TM系统(富鲁达公司)。
i.缝隙连接
缝隙连接是细胞之间专门的细胞间连接。这些连接或通道可在两个细胞的胞质之间提供直接的细胞间通讯，从而允许离子和尺寸最高达约1kD的代谢物快速交换。缝隙连接由连接蛋白簇形成。示例性的缝隙连接基因包括但不限于GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7和GJC2。在一个实施方案中，缝隙连接基因的表达在来自患有子宫内膜异位症的女性的子宫内膜上皮细胞中升高，但在子宫内膜基质细胞中降低。
细胞间的缝隙连接通讯已作为子宫内膜细胞与子宫内膜异位症中的侵袭靶标(间皮)之间的细胞通讯模式进行了研究。使用传统的细胞测定法以及单细胞分析，鉴定了可能涉及子宫内膜细胞侵袭性从而导致子宫内膜异位症病变发展的特异性缝隙连接蛋白(形成通道的连接蛋白)。除缝隙连接基因外，其他调节基因和激酶也涉及缝隙连接处的通讯。调节缝隙连接的示例性激酶包括但不限于酪氨酸激酶、蛋白激酶C、cAMP依赖性蛋白激酶、MAP激酶、cdc2/细胞周期蛋白B和酪蛋白激酶I(Warn-Cramer，B.J.和Lau，A.F.，BiochimBiophys Acta，1662：81-95(2004)；Lampe，P.D.和Lau，A.F.，Int J Biochem Cell Biol，36：1171-1186(2004))。
在一个实施方案中，通过微流控PCR测量来自单细胞样品的cDNA中的DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1和ZO2的RNA基因表达。
在另一个实施方案中，将所公开的基因中的一者在样品中表达水平与该相同基因在来自没有子宫内膜异位症的健康个体的样品中的表达水平进行比较。
C.子宫内膜异位症诊断
在所公开的方法中，如果来自含有DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1和ZO2的群组的一种或多种基因的表达相对于一种或多种所述基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜上皮细胞中的表达升高，或相对于一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低，则受试者被诊断患有子宫内膜异位症。
上述基因的表达水平随疾病严重程度而逐渐增加或降低。因此，在一个实施方案中，所述基因的表达水平可用于确定子宫内膜异位症的阶段。子宫内膜异位症的和正常的子宫内膜上皮细胞样品之间表达差异最大的基因包括CDH2、波形蛋白和CTNNB，如实施例(下表1)中所示。
表1.子宫内膜上皮细胞中各种基因的表达.
Log10表达式*：
波形蛋白
CTNNB
172：正常
164：子宫内膜异位症I/II期
172：子宫内膜异位症III/IV期
*表达式由2-ΔCt定义，其中Ct是每种基因的PCR循环阈值，而Δ(希腊字母，δ)是靶标基因与归一化看家基因(GAPDH)之间的差异。
在一个实施方案中，被测试子宫内膜异位症的女性具有子宫内膜异位症的症状或具有该疾病的家族病史。被测试子宫内膜异位症的女性可能正在接受生育治疗或患有不孕症。在一个实施方案中，被测试子宫内膜异位症的女性处于生育年龄。该女性年龄可能在15至45岁之间。
D.子宫内膜异位症治疗剂
在一个实施方案中，基于所公开的基因的表达水平，诊断受试者患有子宫内膜异位症，并随后治疗所述受试者的子宫内膜异位症。子宫内膜异位症的治疗旨在缓解该疾病的症状。该病最常见的症状包括疼痛、出血和不育。
I.镇痛药
一个实施方案提供了用于子宫内膜异位症引起的疼痛的治疗。止痛药可用于轻度疼痛和子宫内膜异位症的炎性症状。最常见类型的镇痛药是非甾体抗炎药(NSAID)。非甾体抗炎剂的代表性实例包括但不限于昔康类，诸如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康；水杨酸类，诸如阿司匹林、双水杨酸(disalcid)、贝诺酯、三水杨酸、痛热宁、可溶性阿司匹林(solprin)、二氟苯水杨酸和芬度柳；醋酸衍生物类，诸如双氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美汀、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛(acematacin)、芬替酸、佐美酸、克林酸(clindanac)、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸；芬那酯类，诸如甲灭酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟酸和托芬那酸；丙酸衍生物类，诸如布洛芬、萘普生、苯恶洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、噁丙嗪、普拉洛芬、咪洛芬、硫恶洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和噻洛芬酸(tiaprofenic)；吡唑类，诸如保泰松、羟基保泰松、非普拉宗、阿扎丙宗和曲保松。也可以采用这些非甾体抗炎剂的混合物。
还可将甾体抗炎药用于治疗疼痛。甾体抗炎药的代表性实例包括但不限于皮质类固醇诸如氢化可的松、羟基-曲安西龙、α-甲基地塞米松、磷酸地塞米松、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索、地奈德、脱氧米松、醋酸脱氧皮质酮、地塞米松、二氯松、二乙酸二氟拉松、戊酸二氟可龙、氟氢缩松、氟氯奈德、氟氢可的松、特戊酸氟地塞米松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟科汀丁酯(flucortine butylester)、氟可龙、醋酸氟泼尼定(醋酸氟甲叉龙)、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲泼尼龙、曲安奈德、可的松、可托多松、氟西奈德(flucetonide)、氟氢可的松、氟氢羟龙(fluradrenolone)、氟氢可的松、二醋酸二氟拉松(diflurosone diacetate)、氟羟奈德(fluradrenolone acetonide)、甲羟松、安西法尔、安西非特、倍他米松以及它们的酯作为余量、氯泼尼松、乙酸氯泼尼松、氯可托龙、可洛西龙(clescinolone)、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯、氟氯奈德、氟尼缩松、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松、曲安西龙以及它们的混合物。
如果疼痛非常严重以致抗炎药无效，则可以给女性开具麻醉镇痛药，诸如但不限于吗啡、芬太尼、羟考酮、曲马多、氢吗啡酮和可待因。
ii.激素疗法
用于子宫内膜异位症相关的疼痛和出血的另一种治疗是激素治疗剂。由于异位子宫内膜组织经历类似于月经的周期，激素有时可有效用于治疗与该疾病相关的疼痛。激素可以以丸剂、注射剂、或鼻喷雾剂的形式递送。口服避孕药可用于递送激素。通常口服避孕药含有两种激素，即雌激素和孕激素。口服避孕药的示例性组合包括但不限于去氧孕烯/炔雌醇、地诺孕素/戊酸雌二醇、屈螺酮/炔雌醇、屈螺酮/炔雌醇/左亚叶酸盐、炔诺醇/炔雌醇、左炔诺孕酮/炔雌醇、炔雌醇甲醚/炔诺酮、炔诺酮/炔雌醇、诺孕酯/炔雌醇和甲基炔诺酮/炔雌醇。
孕激素是一组行为类似雌性激素孕酮的药物。孕激素可以作为丸剂服用、通过注射施用或通过宫内节育器(IUD)施用。尽管最常开具的口服避孕药是雌激素和孕激素的组合制剂，但也开具只含孕激素的避孕药。已证明它们可通过减少女性的周期或完全停止该周期而改善子宫内膜异位症的症状。
通常给患有子宫内膜异位症的女性开具促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂。GnRH激动剂有不同的形式，包括每三个月一次的注射剂、每月注射一次的注射剂、每日一次的注射剂和鼻喷雾剂。示例性的GnRH激动剂包括但不限于布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、亮脯利特(leuprolide)、那法瑞林(naferelin)和曲普瑞林。
达那唑是一种雄激素，已证明可有效治疗与子宫内膜异位症相关的盆腔疼痛。
在一个实施方案中，用激素治疗剂来治疗使用所公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的女性。
iii.外科手术治疗
已表明外科手术可显著缓解子宫内膜异位症带来的疼痛。腹腔镜术是一种外科手术，其中外科医生在腹部切一个小切口，并将一个称为腹腔镜的小型观察仪器插入腹部。这允许外科医生直接可见子宫内膜异位症病变。外科医生可以进行二次切口，以将激光或其他器械插入腹部以移除或破坏病变。在一个实施方案中，通过腹腔镜术来治疗用本文所公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的患者。
剖腹术是一项主要的腹部外科手术，其也可用于移除子宫内膜病变。在该手术中，外科医生在腹部开一个切口，以使腹腔和子宫可见。外科医生可在剖腹术期间移除子宫内膜异位病变。在一个实施方案中，通过剖腹术来治疗用本文所公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的患者。外科医生还可在剖腹术期间进行子宫切除术，其中移除整个子宫。患有极度疼痛或者晚期或复发性子宫内膜异位症的患者可以选择进行子宫切除术以根除子宫内膜异位症。在一个实施方案中，通过子宫切除术来治疗用本文所公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的患者。
腹部中心疼痛的女性可切断她们盆腔内的神经以减轻疼痛。这可以通过腹腔镜术或剖腹术来完成。有两种手术可切断不同的神经通路。骶前神经切除术可切断与子宫相连的神经。在一个实施方案中，通过骶前神经切除术来治疗用本文所公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的患者。第二种手术(称为腹腔镜子宫神经消融术)涉及切断固定子宫的韧带中的神经。在一个实施方案中，通过腹腔镜子宫神经消融术来治疗使用本文使用公开的方法诊断患有子宫内膜异位症的患者。
实施例
实施例1.缝隙连接基因在子宫内膜异位来源的子宫上皮细胞中升高而在子宫内膜异位来源的基质细胞中降低.
方法
从有或没有子宫内膜异位症的女性获取在位(来自子宫)的子宫内膜组织.
通过腹腔镜术证实子宫内膜异位的存在与否。所有在位子宫内膜样品均在月经周期的增生期从未接受激素药物治疗的月经周期正常的育龄女性(30-45岁)获得。子宫内膜异位样品获自根据美国生殖医学学会分类法分类为I-IV期的患者。在正常受试者的情况下，子宫内膜组织从经历输卵管绝育术的女性分离，这些女性没有服用口服避孕药并且通过腹腔镜术证明没有子宫内膜异位症，没有粘膜下肌瘤或子宫内膜息肉的迹象。使用由Kirk和Irwin开发的方法从活检中分离出原代子宫内膜上皮细胞(EEC)和基质细胞(ESC)，该方法显示出约97％的纯度，这已被先前的研究证实。此外，在这项研究中利用针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的染色和细胞角蛋白18的表达，证实EEC的上皮性质。通过波形蛋白染色验证ESC。表2示出了研究中使用的正常受试者和患者的列表。由于对单细胞进行了大量分析，因此数量受到限制，并且无需在分析之前使原代细胞大量传代。
表2.患者基础信息.
细胞培养
如前所述，在含有抗生素和抗真菌剂、5μg/ml胰岛素(西格玛公司(Sigma))和10％胎牛血清(美国犹他州洛根市(Logan，UT，USA)的Hyclone公司)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)/F12(1∶1)(美国密苏里州圣路易斯市(St Louis，MO，USA)的西格玛公司)中培养原代子宫内膜EEC和ESC。使用低传代数(≤4)进行实验。将确立的LP9细胞(新泽西州肯顿市(Camden，NJ)的Corriell Cell Repositories公司)用作腹膜间皮细胞的模型。为了检查连接蛋白43(Cx43)的蛋白质表达，使用绿色荧光缀合的抗Cx43抗体，将典型的免疫荧光染色用于培养物中的ESC。为了实验性地抑制ESC中的Cx43表达，将对Cx43特异的siRNA转染到细胞中。
通过微流控PCR进行的连接蛋白基因组套(gene panel)表达的单细胞RNA筛选
使原代EEC和ESC培养物经受C1(富鲁达公司(Fluidigm Corp))单细胞分离和处理，以从每个细胞产生扩增的cDNA。然后使用Biomark平台(富鲁达公司)，使所述cDNA经受微流控PCR基因表达分析。将相应的PCR引物序列连接蛋白和缝隙连接调节物组合用于检测这些基因的表达。在每个微流控PCR芯片测定法中，来自人正常组织(目录号4234565，加利福尼亚州纽瓦克市(Newark，CA)的BioChain公司)的通用RNA(200pg)和无模板对照(NTC)分别用作阳性对照和阴性对照。通过每个基因扩增子的扩增子解链温度曲线来确定有效的PCR产物。
结果
当与来自健康受试者的那些相比时，在来自子宫内膜异位症患者的子宫内膜基质细胞中观察到缝隙连接基因表达减少的模式(图1A-1I中每个图的上部)，尤其是在III/IV期子宫内膜异位症疾病中(图1A-1E)。重要的是，这与收获细胞时所处的月经期无关。
相比之下，与正常来源的样品相比，在子宫内膜异位症中的富集的上皮细胞中观察到许多缝隙连接基因表达增加的模式(图1F-1I)。还观察到基因表达随疾病阶段的逐渐增加，但是对于几种基因，即使在子宫内膜异位症的最早阶段，这也是显著的。
在涉及粘附和密封细胞间接触的其他基因以及调节它们的激酶中也观察到变化(图1A-1I中每个图的下部)，但是与刚才提到的连接蛋白模式相比，它们的一致性要差得多。
图2A-2BB示出了在分离基质细胞(图2A-2N)和上皮细胞(图2O-2BB)后，来自正常受试者以及早期和晚期子宫内膜异位症患者的单细胞水平上的所有连接蛋白表达的定量PCR分析。表3中描述了样品标识符。几乎所有连接蛋白基因在基质细胞中均显示出随疾病进展表达逐渐降低。上皮细胞显示出相反的模式，但主要连接蛋白(GJA1)在患者之间几乎没显示出差异。
表3.图2A-2BB和3A-3N的样品标识符.
图3A-3N示出了涉及缝隙连接活性调节的基因(PRKAC、PRKCB、Cav)或编码细胞骨架锚定蛋白的基因(Vim)或编码其他类型的细胞-细胞相互作用如粘附(CDH2、CTNNB)和紧密连接(TJP1)的基因的类似分析。尽管有些没有显示随疾病的变化(上皮细胞中的TJP1、Cav，以及未示出的其他基因)，但其他则显示出模仿连接蛋白的表达模式(在基质细胞中随疾病降低，但在上皮细胞中增加)。
实施例2.子宫内膜上皮细胞(E)和基质细胞(S)与间皮细胞(M)的偶联及侵袭性
方法
同型和异型缝隙连接细胞间通讯(GJIC)测定法(也称为偶联测定法)
使用荧光染料钙黄绿素的细胞间转移来测量GJIC，钙黄绿素可经由缝隙连接渗透。在补充有炭吸附FBS(10％)的培养基中进行测定法。将供体细胞与钙黄绿素AM在室温下温育20分钟。在细胞内部，钙黄绿素AM被非特异性酯酶切割成钙黄绿素，从而使其不可渗透来通过细胞膜扩散。让受体细胞生长至汇合。然后将钙黄绿素标记的供体细胞滴落(‘降落’)到受体细胞层上，并利用荧光显微成像观察钙黄素在供体和受体细胞之间的转移。对于同型相互作用，将子宫内膜上皮供体细胞(EEC)、子宫内膜基质供体细胞(ESC)和间皮供体细胞(LP9)分别降落到相同类型的受体细胞上。对于异型GJIC测定法，将EEC(或ESC)降落在LP9受体细胞上，反之亦然。最初的优化测定法显示，在降落后1.5至2小时最佳地观察到染料在EEC、ESC和LP9细胞中的转移。在Operetta自动显微镜(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上采集每孔10-15个视场的荧光图像。珀金埃尔默公司编写了一个程序，该程序允许识别平板上的所有细胞(根据相差图像)及原始供体(每孔100±50个)，以及由于钙黄绿素随时间推移转移而充满染料的受体。对于每种条件，数据表示为荧光受体细胞数/供体细胞数。
经间皮侵袭测定法
此前描述了3-D侵袭测定法，该测定法模拟了经间皮侵袭。简而言之，让LP9腹膜间皮细胞(PMC)在含有低生长因子MatrigelTM的24孔侵袭室插入物中生长至汇合，MatrigelTM包被在8μm孔膜(美国加利福尼亚州圣荷西市(San Jose，CA，USA)的BD生物科学公司(BD Bioscience))上。然后，将20,000个子宫内膜上皮细胞(EEC)或基质细胞(ESC)在用CellTracker
(分子探针-加利福尼亚州卡尔斯巴德市(Carlsbad，CA)的英伟杰公司(Invitrogen))标记以及用相关siRNA处理后，平板接种于所制备的插入物中的LP9PMC汇合层上。温育20小时后，将插入物膜的上表面上未侵袭的细胞以机械方法移除。将包被的膜的底部上的侵袭细胞用DAPI染色，并使用具有20倍物镜的荧光显微镜观察。一式三份进行每种细胞类型的侵袭测定法。
结果
使用降落测定法测量细胞的偶联，其中随时间推移测量钙黄绿素在滴落于受体细胞单层上的供体细胞之间的转移(图4A-4F)。在正常受试者(N)、早期(I-II)子宫内膜异位症患者和晚期(III-IV)子宫内膜异位症患者中，对于上皮细胞(EEC-图4G)或基质细胞(ESC-图4H)之间的同型偶联[黑色条柱]，以及对于这些细胞与LP9腹膜间皮细胞的异型偶联[灰色条柱]，测定了这种转移速率。间皮细胞在来自患者的基质细胞中诱导了偶联，但在来自正常受试者的基质细胞中未诱导(图4H)，在来自患者或正常受试者的上皮细胞中未诱导(图4G)。
Cx43的免疫荧光染色揭示Cx43在来自所有受试者的基质细胞的内部分布(注意，染色并不集中在细胞边缘周围以及细胞-细胞界面处-图5A-C)。随着子宫内膜异位症进展这更加明显，不过令人惊讶地是没有明显的表达降低(图5A-5C)。然而，基质细胞暴露于间皮细胞会导致Cx43重新分布至子宫内膜异位样品中的细胞表面(箭头)(图5E和5F)，但在来自正常受试者的细胞中程度要低得多(图5D)。Cx43的细胞内储存在暴露于间皮细胞后的这种激活可以解释图4B-4E中所见的异型偶联的急剧快速增加。
还在Boyden室中测量了子宫内膜上皮细胞(E)和基质细胞(S)通过间皮细胞单层的侵袭，以模拟子宫内膜异位症特征性的侵袭过程(图6)。子宫内膜细胞未经处理[黑色条柱]或用靶向Cx43的siRNA处理[灰色条柱]或用对照蛋白GAPDH处理[带阴影线条柱]。上皮细胞以Cx43依赖的方式侵袭，但这在患者之间是可变的，并且与疾病状态不相关(图6)。相反，基质细胞显示出随疾病进展而渐增的侵袭性，但这仅在疾病状态下取决于Cx43。
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有额外实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。
Claims (15)
1.一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，包括
富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜基质细胞；
使所述经富集或扩增的子宫内膜基质细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；
使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；并且
如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；
并且对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
2.一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，包括
富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜上皮细胞；
使所述经富集或扩增的子宫内膜上皮细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；
使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；
如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜上皮细胞中的表达升高，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；
并且对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
3.一种在有需要的受试者中诊断和治疗子宫内膜异位症的方法，包括
富集或扩增得自所述受试者的子宫内膜基质细胞和上皮细胞；
使所述经富集或扩增的子宫内膜基质细胞和上皮细胞在微流控室中经受单细胞处理以产生扩增的cDNA；
使所述扩增的cDNA经受微流控PCR以检测选自DBN1、CAV1、CDH、CDK1、CD45、CK19、CSNK、CTNNB1、Cx43、EpCAM、GAPDH、GJA1、GJA3、GJA5、GJA8、GJA9、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB5、GJB6、GJB7、GJC2、GUSB、KRT18、MAPK1、MAPK3、MME、Notch1、NOV1、PECAM、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、SNAI1、SRC、TGFBR2、TJAP1、TJP1、TJP2、Twist 1、VEGFR1、VIM、Zeb2、ZO1、ZO2以及它们的组合的一种或多种基因的RNA基因表达；
如果所述一种或多种基因的表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低并且相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜上皮细胞中的表达升高，则诊断所述受试者患有子宫内膜异位症；
并且对诊断患有子宫内膜异位症的所述受试者施用用于子宫内膜异位症的治疗。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述子宫内膜细胞得自月经血。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述子宫内膜细胞得自子宫内膜活检。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述用于子宫内膜异位症的治疗选自抗炎药、激素疗法或外科手术移除受影响的组织。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中诊断所述受试者患有子宫内膜异位症还包括对所述子宫内膜异位症进行分期。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述子宫内膜异位症是浅表型子宫内膜异位症(I/II期)或深部浸润型子宫内膜异位症(III/IV期)。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者具有子宫内膜异位症的症状。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已诊断患有子宫内膜异位症。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述子宫内膜异位症是浅表型子宫内膜异位症(I/II期)或深部浸润型子宫内膜异位症(III/IV期)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用子宫内膜基质细胞标志物CD10、CD146和CD13分选所述子宫内膜基质细胞来分离所述细胞。
13.根据权利要求2所述的方法，其中通过使用内皮上皮细胞标志物EpCam+、CD45和CD9分选所述子宫内膜上皮细胞来分离所述细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中其表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低的所述一种或多种基因包括Cx43、MAPK、TGFBR2、ZO2和ZO1。
15.根据权利要求1所述的方法，其中其表达相对于所述一种或多种基因在来自没有子宫内膜异位症的受试者的子宫内膜基质细胞中的表达降低的所述一种或多种基因包括SNAI1、Twist 1、Zeb2、Notch1、VEGFR1和CD45。
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Legal Events
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