CN117442645A - 女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 - Google Patents
女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117442645A CN117442645A CN202311327342.XA CN202311327342A CN117442645A CN 117442645 A CN117442645 A CN 117442645A CN 202311327342 A CN202311327342 A CN 202311327342A CN 117442645 A CN117442645 A CN 117442645A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- evs
- sperm
- extracellular vesicles
- female
- medicament
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 21
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 21
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 abstract description 19
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 6
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 5
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 3
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 3
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 3
- 230000030120 acrosome reaction Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 3
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 2
- -1 TGF-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 208000005171 Dysmenorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010013935 Dysmenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010015535 Euphoric mood Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000613251 Homo sapiens Tumor susceptibility gene 101 protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 102100040879 Tumor susceptibility gene 101 protein Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-difluoro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(F)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O QOMNQGZXFYNBNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002743 euphoric effect Effects 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 229920002313 fluoropolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004811 fluoropolymer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004995 male reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2026—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2066—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2086—IL-13 to IL-16
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，提供了女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用。所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡从健康女性阴道分泌物中提取得到，其通过携带白介素10，一方面能够提高精子活力，另一方面能够改善Th17/Treg失衡，增加胚胎着床。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用。
背景技术
子宫内膜异位症（Endometriosis，EMS）是一种常见的妇科疾病，其主要症状之一是痛经和不孕。本疾病导致子宫内膜异位生长，可能影响受精卵的着床。关于EMS的相关治疗包括手术、药物等治疗，但不能有效提高妊娠率。目前关于EMS引起不孕的相关机制仍不明确，因此探索EMS相关性不孕的具体机制是目前研究的重要方向。
细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的小囊泡，内含有生物活性分子，它们在调节细胞之间的通信和信号传递中起到关键作用。最近的研究表明，细胞外囊泡可能在生殖系统中发挥重要作用，特别是在卵子和精子的相互作用中。这些囊泡可能携带影响受精和胚胎着床的信号分子，从而对生育能力产生影响。
精子作为男性生殖系统的核心组成部分，其数量、质量和活力对于成功受精至关重要。精子的活力决定了其是否能够成功穿越女性生殖道并与卵子结合。同时，胚胎是否能着床也是妊娠成功的关键。因此，精子活力、胚胎着床问题常常被认为是不孕的一个主要因素。
研究细胞外囊泡和精子在不孕问题中的作用有助于更好地理解不孕的病因，并有望为不孕患者提供更有效的治疗和辅助生殖技术。对于不孕的调查和治疗，细胞外囊泡和精子的研究都是重要的方向，有望改善不孕患者的生育机会。
发明内容
基于此，本发明提供女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用，至少解决现有技术中的一个问题。
第一方面，本发明提供女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡在制备治疗不孕症药物中的应用，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡从健康女性阴道分泌物中提取得到。
其中，所述健康女性是指20-40岁、黄体生成素（luteinizing hormone，LH） 2-7U/L、月经周期正常、子宫腔正常的女性。
在一些优选的实施例中，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：
将健康女性阴道分泌物离心处理，去除细胞和细胞碎片，得到上清液；
将所述上清液与Exo-spinTM沉淀剂混合，并在4℃孵育至少1 h，得到混合液；
将所述混合液离心处理，得到含有外泌体的沉淀，所述沉淀即为所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡。
在一些优选的实施例中，所述上清液与Exo-spinTM沉淀剂的体积比例为2:1。
第二方面，本发明提供一种用于治疗不孕症的药物，所述药物的活性成分为女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡从健康女性阴道分泌物中提取得到。
在一些优选的实施例中，所述药物还包含药学上可接受的载体。
在一些优选的实施例中，所述药学上可接受的载体为稀释剂，例如PBS缓冲溶液。
在一些优选的实施例中，所述药物还包含抗炎活性物质，例如白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素13(IL-13)。
由于采用了以上技术方案，本发明的实施例至少具有以下有益效果：本发明首先收集健康女性阴道分泌物，然后通过Exo-spinTM技术结合沉淀法和尺寸排除色谱法获得细胞外囊泡，该细胞外囊泡通过携带的IL-10提高精子活力和胚胎着床，为不孕提供了新的临床治疗方法及策略。
附图说明
图1为本发明实施例3中H-EVs和E-EVs的TEM照片。
图2显示了本发明实施例3中H-EVs和E-EVs的WB检测结果。
图3显示了本发明实施例3中利用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）检测H-EVs和E-EVs的颗粒大小。
图4显示了本发明实施例4中利用计算机辅助精子分析(CASA)测定H-EVs和E-EVs对精子活力的浓度效应。
图5显示了本发明实施例4中利用计算机辅助精子分析(CASA)测定H-EVs和E-EVs对精子活力的时间效应。
图6显示了本发明实施例5中利用伊红染色测定H-EVs和E-EVs对精子形态及存活率的时间效应。
图7显示了本发明实施例5中利用精子爬高实验测定H-EVs和E-EVs对精子活力的影响。
图8显示了本发明实施例6中稀释2倍、5倍、10倍的EVs对人类精子[Ca2+]i浓度的影响。
图9显示了本发明实施例6中EVs对人类精子[Ca2+]i浓度影响的统计分析。
图10显示了本发明实施例6中利用荧光染色法金霉素（CTC染色法）测定H-EVs和E-EVs影响精子顶体反应的统计分析。
图11显示了本发明实施例6中利用荧光染色法金霉素（CTC染色法）测定H-EVs和E-EVs影响精子顶体反应的浓度效应统计分析。
图12显示了本发明实施例8中利用计算机辅助精子分析(CASA)测定H-EVs和E-EVs对小鼠精子活力的时间效应。
图13为本发明实施例8中子宫内膜异位症小鼠模型中子宫内膜异位灶HE染色结果图。
图14显示了本发明实施例8中H-EVs和E-EVs对雌性小鼠妊娠率的影响。
图15为本发明实施例8中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠胚胎着床率的形态图。
图16显示了本发明实施例8中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠胚胎着床率的统计分析。
图17显示了本发明实施例9中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠的子宫组织形态的HE染色结果。
图18显示了本发明实施例9中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠子宫组织内免疫细胞的流式细胞术分析结果。
图19显示了本发明实施例9中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠子宫组织内免疫细胞的流式细胞术统计分析。
图20显示了本发明实施例10中H-EVs和E-EVs影响雌性小鼠子宫组织内炎症细胞因子的qRT-PCR统计分析结果。
图21显示了本发明实施例10中小鼠子宫组织的WB结果。
图22显示了本发明实施例10中小鼠子宫组织的WB结果的统计分析。
具体实施方式
以下将对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。
在以下实施例中，健康女性为于2021年10月20日始收取来自南昌大学第二附属医院门诊体检正常的5例育龄女性（健康组）。健康女性的纳入标准：黄体生成素（luteinizinghormone，LH） 2-7U/L、20-40岁、月经周期正常、子宫腔正常。健康女性的排除标准：(1)认知功能障碍或患有精神类疾病；(2)伴有心、肝、肾等脏器功能障碍；(3)存在手术禁忌证；(4)存在药物禁忌证；(5)无法满足随访条件。
在以下实施例中，内异症不孕患者女性为自2021年10月20日至2022年10月20日在南昌大学第二附属医院接受治疗的5例子宫内膜异位症合并不孕患者（不孕组）。内异症不孕患者女性的纳入标准：(1)符合子宫内膜异位症诊断标准；(2)在未采取避孕措施情况下，超过1年未怀孕；(3)排除明显的子宫性、内分泌性、免疫性、排卵性不孕等其他不孕原因；(4)参与本研究前3个月内未使用激素类药物；（5）年龄20-45岁；(6)夫妇双方排除生殖器官解剖结构异常，无淋球菌、支原体和衣原体等感染、无男性不孕。内异症不孕患者女性的排除标准：(1)认知功能障碍或患有精神类疾病；(2)伴有心、肝、肾等脏器功能障碍；(3)存在手术禁忌证；(4)存在药物禁忌证；(5)无法满足随访条件。
健康组和不孕组妇女都是采集月经黄体中期（嘱入选的研究对象从月经第5-7天开始，通过B超动态检测卵巢排卵情况，于排卵后的7-9天考虑取材时间，期间嘱咐患者勿同房）的阴道分泌物，将收集的阴道分泌物标本放入4℃无菌PBS中，1 h内带回实验室，并放入-80℃冻存。
在健康组和不孕组妇女同意参与之前，每个预期的参与者都得到了一份参与者信息表，并向其解释研究的基本原理，所有参与者均提供书面知情同意书。所有的生物样本都被分配匿名的参与者身份号码，这些号码与参与者的名字在一个安全存储的链接文件中进行匹配，记录参与者姓名、年龄、性别、联系方式、病理诊断、组织学类型、手术时间、手术名称、原发或复发等。
实施例1：制备H-EVs
按照以下步骤制备健康女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡(H-EVs)：
(1) 将1 mL的健康女性的阴道分泌物样本置入离心管，以300 x g离心10 min去除细胞和细胞碎片；
(2) 将离心后的上清液置入新的离心管，并以16000 x g离心30 min去除剩余的细胞碎片；
(3) 将离心后的上清液置入新离心管中，并以2:1的比例加入Exo-spinTM沉淀剂；
(4) 上下倒置离心管数次将溶液混匀，并在4℃孵育至少1 h；取出混合液以16000x g离心1 h，小心吸出并弃去上清液（注意不要让沉淀物干燥，以免对外泌体造成损害）；
(5) 用100 µL PBS重悬含有外泌体的沉淀，所述沉淀即为H-EVs。
实施例2：制备E-EVs
按照以下步骤制备内异症不孕患者女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡(E-EVs)：
(1) 将1 mL的内异症不孕患者女性的阴道分泌物样本置入离心管，以300 x g离心10 min去除细胞和细胞碎片；
(2) 将离心后的上清液置入新的离心管，并以16000 x g离心30 min去除剩余的细胞碎片；
(3) 将离心后的上清液置入新离心管中，并以2:1的比例加入Exo-spinTM沉淀剂；
(4) 上下倒置离心管数次将溶液混匀，并在4℃孵育至少1 h；取出混合液以16000x g离心1 h，小心吸出并弃去上清液（注意不要让沉淀物干燥，以免对外泌体造成损害）；
(5) 用100 µL PBS重悬含有外泌体的沉淀，所述沉淀即为E-EVs。
实施例3：EVs形态、大小验证
将实施例1和2得到的EVs样品分别在PBS中以1:1000稀释，以获得每帧60-100个颗粒的浓度。进行纳米颗粒跟踪分析（NTA），使用ZetaView软件（版本8.05.14 SP7）测定尺寸分布和颗粒浓度数据。用透射电子显微镜（TEM）观察EVs形态。将重悬的细胞外囊泡样品逐滴添加到200目网格上，然后孵育10分钟；随后，用2%磷钨酸对格栅进行阴性染色，总共3分钟；除去过量的溶液，对样品进行空气干燥并进行TEM分析。
如图1-3所示，NTA和TEM分析表明，EVs为圆形或椭圆形，直径为50-200 nm的囊性结构；蛋白免疫印迹（WB）分析证实了囊泡上存在外泌体特异性标记物TSG101和CD9。以上结果表明女性阴道分泌物释放的EVs大多为外泌体。
实施例4：EVs影响正常精子活力相关实验
在本实施例中，精液样本来源于健康成年男性，每份精液样本的体积、细胞数和精子活动率等均符合世界卫生组织的第五版标准（精液体积参考值下限为1.5ml；精液pH值的参考值下限为7.2；精子密度的参考值下限为15×106/ml；总运动精子比例的参考值下限为40%，前向运动精子比例的参考值下限为32%；活精子（细胞膜完整精子）比例的参考值下限为58%；正常形态精子比例的参考值下限为4%）。
将精子分别与稀释2倍、5倍、10倍的EVs（实施例1和2得到）共培养1、4、6小时，并设置精子与PBS混合物为对照组，进行计算机辅助精子分析（CASA）。
如图4所示，计算机辅助精子分析（CASA）显示，与对照组相比，H-EVs处理后的总活力（>50%）、进行性活力水平（>40%）和平均线速度（>40µm/s）显著增加；而E-EVs处理的精子活力呈剂量依赖性下降，稀释2倍的E-EVs使精子活力最大下降（总活力，29.03% vs54.47%；精子进行性活力，22.68% vs 47.61%；线速度，20.79µm/s vs 40.42µm/s；p<0.0001）。
利用计算机辅助精子分析技术（CASA）测定EVs在不同时间点（1小时、4小时和6小时）对人类精子活力的影响。如图5所示，与对照组（PBS混合物）相比，暴露于H-EVs 6小时后，精子活力显著增加（总活力，82.8% vs 47.1%；精子进行性活力，79.03% vs 41.06%；线速度，46.76µm/s vs 41.91µm/s；静止精子，17.19% vs 52.86%）；而E-EVs处理的精子在不同时间点的活力下降，在6小时时效果最大（总运动率，26.46% vs 47.1%；精子进行性运动率，18.78% vs 41.06%；线速度，21.98µm/s vs 41.91µm/s；静止精子，73.54% vs 52.86%）。
实施例5：伊红染色及爬高实验
在本实施例中，精液样本来源于健康成年男性，每份精液样本的体积、细胞数和精子活动率等均符合世界卫生组织的第五版标准（精液体积参考值下限为1.5ml；精液pH值的参考值下限为7.2；精子密度的参考值下限为15×106/ml；总运动精子比例的参考值下限为40%，前向运动精子比例的参考值下限为32%；活精子（细胞膜完整精子）比例的参考值下限为58%；正常形态精子比例的参考值下限为4%）。
首先，通过伊红Y染色评估精子活性。将人精子与实施例1和2得到的EVs（稀释2倍、5倍和10倍）在HTF中孵育1、4和6小时，并使用伊红-黑色素染色试剂盒（中国有限公司欣然生物技术有限公司）评估精子活力。未存活精子的精子头被染成红色，而存活精子保持未染色。
如图6所示，与对照组（PBS混合物）相比，在不同时间点暴露于E-EVs后，精子活性均下降，其中6小时下降最明显，而经H-EVs处理的精子活性增加。
通过爬高实验进一步研究EVs对精子穿透粘液能力的影响。将甲基纤维素与HTF培养基仔细混合，形成溶液，将其引入内径为1.0mm、长度为7.5cm的扁平毛细管中。管子的一端用橡胶粘土牢牢密封。首先，将人类精子和实施例1和2得到的EVs在37℃的温度下，在5%CO2的存在下共同孵育3小时。接下来，将毛细管引入培养混合物中，并在相同条件下共孵育1小时，然后取出。然后使用Leica DM2500立式显微镜（德国）对样品进行观察。
在离试管底部1厘米和2厘米的距离处，对照组（PBS混合物）的平均精子数分别约为88和32。如图7所示，与对照组相比，孕酮（P4）和-EVs组在1和2cm处的平均精子数量分别增加了约40%和20%。然而，E-EVs使精子的平均数量减少了约75%，P4处理逆转了这一趋势。
实施例6：测定单细胞钙离子浓度、顶体反应实验
在本实施例中，精液样本来源于健康成年男性，每份精液样本的体积、细胞数和精子活动率等均符合世界卫生组织的第五版标准（精液体积参考值下限为1.5ml；精液pH值的参考值下限为7.2；精子密度的参考值下限为15×106/ml；总运动精子比例的参考值下限为40%，前向运动精子比例的参考值下限为32%；活精子（细胞膜完整精子）比例的参考值下限为58%；正常形态精子比例的参考值下限为4%）。
检测EVs对人体精子[Ca2+]i的影响，研究EVs对人类精子功能影响的机制。精子用5μM Fluo-4 AM和0.05% Pluronic F-127（Molecular Probes，USA）处理，并在37℃下孵育30分钟。随后，用HTF培养基洗涤精子。然后将净化后的精子放置在96孔板中，并与不同浓度的实施例1和2得到的EVs（稀释2倍、5倍和10倍）孵育30分钟。使用多色V型分光光度计（TILLPhotonics GmbH，德国）对精子[Ca2+]i信号进行成像，通过带通滤波器（HQ540/50，Chroma，USA）筛选来自488nm激发和525nm发射的所得信号，这种组合在1秒的时间间隔内被仔细检查。
如图8所示，与对照组（PBS混合物）相比，H-EVs在1分钟内增加了人类精子[Ca2+]i浓度，而E-EVs导致精子[Ca2+]i浓度在2分钟后突然下降。如图9所示，精子[Ca2+]i浓度具有EVs浓度依赖性，在稀释至2倍的EVs浓度下，精子[Ca2+]i变化最大。
进一步分析EVs对人类精子获能和AR的影响。在Leica DM2500显微镜下使用340-380 nm滤光片过滤的汞激发光束观察染色精子，并使用400 nm的二色镜观察荧光发射。简言之，将人类精子在37℃下与不同浓度的EVs或PBS孵育4小时，用金霉素（CTC）染色30秒，在载玻片上并在室温下风干过夜。通过高功率荧光显微镜评估完整顶体的存在。
如图10所示，与对照组（PBS混合物）相比，H-EVs显著提高了AR比率，而E-EV降低了AR比率。此外，如图11所示，AR比率随着H-EVs的增加而增加，但随着E-EV的减少而降低，在稀释到2倍的EV浓度下显著影响了AR比率。
实施例7：ELISA检测H-EVs和E-EVs中IL-10表达水平
为了明确H-EVs和E-EVs是否通过携带IL-10改善精子活力，利用ELISA测定H-EVs和E-EVs表达水平，具体操作如下：
(1) 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃；
(2) 设置标准品孔(由ELISA试剂盒提供，标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48 pg/mL)和样本孔（H-EVs、E-EVs），标准品孔各加浓度为0、3、6、12、24、48 pg/mL的标准品 50μL；
(3) 样本孔先加待测样本（H-EVs、E-EVs） 10μL，再加样本稀释液 40μL；空白孔不加；
(4) 除空白孔外，标准品孔（S0-S5）和样本孔（H-EVs、E-EVs）中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；
(5) 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次；
(6) 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min；
(7) 每孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的OD 值。
在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。下表显示了测定结果，可以看出，与E-EVs相比，H-EVs中的IL-10的表达水平明显增加。
表1H-EVs和E-EVs表达水平
实施例8：动物实验
在本实施例中，所用的小鼠为雄性Bacl/c小鼠（鼠龄6-8周）和雌性Bacl/c小鼠（鼠龄6-8周）。保持温度、光照(12小时光照：12小时黑暗周期)和噪音、换气等条件控制在标准的实验室条件下，在实验期间小鼠自由进水和进食。动物饲养每天给予标准颗粒饲料，每日定时清洁。为保证实验结果的准确性，对它们进行了为期一周的适应性喂养。
收集雄性小鼠的精子，具体操作如下：解剖小鼠，取小鼠附睾尾部组织放于盛装High Solution（HS）培养液的35 mm培养皿中，用注射器针头挑碎，37℃孵育20min，1600rpm离心5 min沉淀精子，再用HS培养液wash两遍去除杂质。
为了探索EVs对小鼠精子的影响，在不同的时间点（1小时、4小时和6小时）将小鼠精子与实施例1得到的H-EVs或实施例2得到的E-EVs在精子获能液（HIF）中共培养（培养条件为37℃，5% CO2），并设置小鼠精子与PBS混合物为对照组。
如图12所示，CASA测量的运动参数显示，在6小时时，E-EVs组的精子总运动性、进行性运动性和线速度显著低于对照组，而H-EVs改善了精子运动。
为了进一步研究EVs对雌性生育能力的影响，建立子宫内膜异位症小鼠模型，该模型通过超声成像和HE染色进行了验证，图13显示了囊性子宫内膜异位病变的形成，随即将小鼠分组为空白对照组（NC）、模型组（M）、H-EVs阴道移植组（H-EVs-VT）、E-EVs阴道移植组（E-EVs-VT）。将H-EVs、E-EVs和PBS（对照组）分别移植到子宫内膜异位症模型小鼠的阴道中给药1个月和2个月。
1个月的结果如图14-16所示，与空白对照组（NC）相比，子宫内膜异位症小鼠模型组（M）的受孕率（100% vs 80%）和胚胎植入部位数量（10.3±2.41 vs 7.6±3.06）降低；E-EVs使内异症小鼠受孕率进一步降低约70%，平均植入部位数为4.5±3.21；用H-EVs治疗增加了子宫内膜异位症小鼠的平均植入位点数量，但没有统计学意义。2个月的结果与1个月的相似。
实施例9：流式细胞术及HE染色实验
通过收集和匀浆小鼠子宫组织，获得悬浮液并悬浮在1ml PBS中，然后通过200目筛网并以900rpm离心10分钟。为了消除红细胞，将沉淀物重悬在2ml红细胞裂解缓冲液（eBioscience，USA）中。然后，通过200目筛过滤细胞，并用荧光标记的抗体染色，包括抗CD4-FITC（eBioscience，11-0040-82，0.5μl/test）、抗CD25-APC（BioLegend，101909，0.5μl/test）、抗IL17A-PE（eBiocience，12-7177-81，0.5μl/test）和抗Foxp3-PE（4Abio，FMPFOX-01.050，10μl/test），然后用PBS洗涤。用PBS重悬样品，随后使用流式细胞仪（FACSAria II，BD，USA）进行检查。Th17细胞群通过计算IL-17A+/CD4+细胞的百分比来定量，调节性T细胞（Treg）群通过确定Foxp3+CD25+CD4+细胞的百分比进行评估。最后，计算IL-17A+/Foxp3+CD25+比率以指示Th17/Treg平衡，这反映了子宫组织的炎症状态与百分比的关系。使用CytExpert 2.5软件对数据进行分析。
如图17所示，HE染色结果显示，与空白对照组（NC）相比，模型组（M）或 E-EVs阴道移植组（E-EVs-VT）小鼠子宫组织中的炎症细胞浸润或纤维化。如图18所示，为了证实组织学分析的结果，将CD4+IL-17A+Th17细胞群与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞群进行了比较，以证实子宫中的炎症反应。如图19所示，与空白对照组（NC）相比，模型组（M）Th17/Treg细胞的比例增加了4倍，E-EVs通过增加CD4+IL-17A+Th17细胞的比例和减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例，进一步将Th17/Treg-细胞的比例提高了5倍，而H-EVs处理后使Th17/Treg细胞的比例降低了1.6倍。
实施例10：蛋白印迹法、qRT-pcr实验
为了在mRNA水平上研究EVs对子宫炎症细胞因子的影响，通过qRT-PCR测量相对mRNA表达。从子宫组织中提取总RNA，并使用市售的逆转录试剂盒（Yeasen，11141ES60，中国）进行逆转录。然后使用Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen，11184ES08）对所得互补DNA（cDNA）进行qRT-PCR，以检测白细胞介素6（IL-6）、IL-10、IL-17A、转化生长因子β1（TGFβ1）、ROR-γt、Foxp3和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。使用2-ΔΔCt方法评估和定量细胞因子表达水平。
如图20所示，与空白对照组(NC)相比，模型组（M）抗炎细胞因子IL-10的相对mRNA表达降低（p<0.05）；E-EVs降低了IL-10的表达，并增加了促炎细胞因子的相对mRNA表达，包括TGF-1β、IL-6、ROR-γt和IL-17A。而用H-EVs治疗增加了IL-10和Foxp3的表达。
另外，通过蛋白质印迹检测了子宫中与Th17分化相关的关键蛋白的水平。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（Solarbio，R0010，中国）从裂解的小鼠子宫组织样品中分离蛋白质，用SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离并转移到含氟聚合物滤膜上，并用脱脂乳封闭2小时。随后，将膜与适当的一级抗体在4℃的温度下进行通宵孵育。随后用稀释度为1:5000的第二抗体孵育60分钟。主要抗体包括抗信号转导子和转录激活子-3（STAT3）（细胞信号技术（CST），9139S，稀释1:1000）、抗磷酸化STAT3（p-STAT3），抗CD9（Abclone，A1703，以1:1000稀释）和抗TSG101（Abcam，ab125011，以1:5000稀释）。使用抗GAPDH（CST5174S，1:1000稀释）使蛋白质表达正常化。
如图21和22所示，与空白对照组（NC）相比，模型组（M）增加了IL-17A的蛋白质表达水平和p-STAT3/STAT3比率，并降低了IL-10的表达（p＝0.0003）；E-EVs使IL-17A和p-STAT3/STAT3比率进一步增加了4倍以上，而用H-EVs治疗使IL-10的表达增加了约2倍。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同或等同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内，其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (9)
1.女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡在制备治疗不孕症药物中的应用，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡从健康女性阴道分泌物中提取得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的制备方法包括以下步骤：
将健康女性阴道分泌物离心处理，去除细胞和细胞碎片，得到上清液；
将所述上清液与Exo-spinTM沉淀剂混合，并在4℃孵育至少1 h，得到混合液；
将所述混合液离心处理，得到含有外泌体的沉淀，所述沉淀即为所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述上清液与Exo-spinTM沉淀剂的体积比例为2:1。
4.一种用于治疗不孕症的药物，所述药物的活性成分为女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡，所述女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡从健康女性阴道分泌物中提取得到。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为稀释剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为PBS缓冲溶液。
8.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包含抗炎活性物质。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抗炎活性物质为白细胞介素4、白细胞介素10、白细胞介素13中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311327342.XA CN117442645A (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311327342.XA CN117442645A (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117442645A true CN117442645A (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=89582690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311327342.XA Pending CN117442645A (zh) | 2023-10-13 | 2023-10-13 | 女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117442645A (zh) |
-
2023
- 2023-10-13 CN CN202311327342.XA patent/CN117442645A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qian et al. | Distinct pattern of Th17/Treg cells in pregnant women with a history of unexplained recurrent spontaneous abortion | |
| Helfrich et al. | Novel sampling procedure to characterize bovine subclinical endometritis by uterine secretions and tissue | |
| Esplin et al. | Amniotic fluid levels of immunoreactive monocyte chemotactic protein-1 increase during term parturition | |
| Zerbe et al. | A new model system for endometritis: basic concepts and characterization of phenotypic and functional properties of bovine uterine neutrophils | |
| Canadas et al. | Associations between postpartum phenotypes, cow factors, genetic traits, and reproductive performance in seasonal-calving, pasture-based lactating dairy cows | |
| JPH08507530A (ja) | トランスフォーミング成長因子βによる受胎能調節 | |
| Kayar et al. | Immune responses in women with periodontitis and preterm low birth weight: Levels of CD4+ and CD8+ T cells in gingival granulation tissue | |
| Giulini et al. | Chronic endometritis in recurrent implantation failure: Use of prednisone and IVF outcome | |
| EP1285273A1 (fr) | Detection de l'il-6 pour la prevision des risques d'accouchement premature | |
| RU2430379C1 (ru) | Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции | |
| CN117442645A (zh) | 女性阴道分泌物来源的细胞外囊泡的应用 | |
| Oliveira et al. | Vascular endothelial growth factor in the plasma, follicular fluid and granulosa cells of women with endometriosis submitted to in vitro fertilization–a pilot study | |
| Drudy et al. | The ultrastructure of mast cells in the uterus throughout the normal menstrual cycle and the postmenopause. | |
| JP6231658B2 (ja) | ａ２ｖ−ＡＴＰａｓｅ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ−１のレベルを測定することによる、男性不妊症の決定のためのキット、ならびに人工授精手順における生殖結果を改善するための方法およびキット | |
| Zhang et al. | Vaginal extracellular vesicles impair fertility in endometriosis by favoring Th17/Treg imbalance and inhibiting sperm activity | |
| AL-Khalidy et al. | Effect of Vaginal Trichomoniasis on Women who Suffer from Delayed Pregnancy | |
| RU2681219C1 (ru) | Способ прогнозирования рецидивирования эндометриоидных кист яичников после оперативного лечения при помощи иммуногистохимических маркеров | |
| RU2330286C1 (ru) | Способ диагностики герпес-вирусной инфекции у беременных путем подсчета герпесных телец в периферической крови | |
| Zhang et al. | Decreased CD56+ CD16‐CD94+ uNK cells in the mid‐luteal phase in women with recurrent implantation failure are associated with IL‐15 deficiency | |
| CN112708653B (zh) | 一种用月经血预测反复流产和/或诊断反复流产的原因的检测方法 | |
| RU2530586C1 (ru) | Способ прогноза анемии у беременных | |
| CN117643592B (zh) | 人参皂苷20(R)-25-OH-Rg2促进卵巢修复的用途 | |
| James et al. | Transfer of completely hatched euploid blastocysts results in signficiantly lower pregnancy outcomes compared to euploid expanded or hatching blastocysts | |
| Aiswarya | A study on causes of female infertility | |
| RU2531084C1 (ru) | Способ прогнозирования неразвивающейся беременности |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |