BR112020020870A2 - Pesticida - Google Patents

Abstract

pesticida. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de nanopartículas de quitosana. as nanopartículas de quitosana possuem molécula de rna aderida à sua superfície, preferencialmente rna dupla fita estruturado (dsrnast). o dsrnast é selecionado para ter a propriedade de silenciar genes de quitina sintase ii de anthonomus grandis. a invenção também apresenta nanopartícula de quitosana obtida pelo dito processo, seu uso no controle de pragas, como pesticida, e uma suspensão concentrada contendo as nanopartículas de quitosana.

Description

PESTICIDA Campo da invenção

[1] A presente invenção está relacionada às áreas da Biotecnologia e Biologia Molecular e fornece uma nanoformulação de dsRNA, particularmente RNA de fita dupla estabilizado em nanocápsulas/partículas de quitosana, contendo também surfactante catiônico ou neutro. Especialmente, a invenção relata o processo de fabricação de nanopartícula de quitosana com RNA aderido.

Estado da técnica

[2] O algodão é atualmente a fibra mais consumida no mundo, usada principalmente na confecção de têxteis, o que torna a cultura uma das commodities de maior importância econômica. O Brasil se destaca entre os cinco maiores produtores no mundo, após a China, Índia, os Estados Unidos e o Paquistão.

[3] Apesar das diversas estratégias de controle de pragas utilizadas, a produção de algodão ainda é severamente afetada por grande número de insetos praga. Os insetos mais prejudiciais para essa cultura são os lepidópteros, como a lagarta do cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) e a lagarta do algodão (Helicoverpa armigera), e o coleóptero bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis), o qual foi reportado pela primeira vez no Brasil em 1983 e é atualmente o inseto praga mais prejudicial às plantações brasileiras de algodoeiro. Nesse sentido, observa-se uma crescente necessidade de desenvolver inseticidas que proporcionem controle de pragas sem causar prejuízos ao meio ambiente, sendo os inseticidas contendo RNA uma opção viável nesse contexto. Ademais, a quitosana tem demonstrado propriedades adequadas como carreador de ácidos nucleicos, fornecendo proteção contra nucleases e compatibilidade para ser absorvido pela célula.

[4] O documento US 8 841 272 B2 apresenta uma nanopartícula útil como inseticida. A nanopartícula compreende uma matriz de biopolímero, na qual o RNA dupla fita do inseto é envolto e a matriz de biopolímero está na forma de nanopartículas. O documento US 2010/0015232 A1 relata nanoparticulas de quitosana envolvendo RNA e um método para fabricação de nanopartículas é descrito.O RNA adicionado nas nanopartículas é usado para modular a expressão de um mRNA alvo. O pedido de patente US 2013/0137747 A1 também descreve nanopartículas de matriz polimérica, neste caso com RNA fita dupla (dsRNA) para o silenciamento gênico de um gene de inseto, adicionado na partícula. Um método para fabricação de nanopartículas inclui etapas como: preparação da solução de matriz polimérica, uma solução RNA, mistura de duas soluções e aquecimento da solução antes de homogeinizar. Nanopartículas são formadas por automontagem via interação eletrostática entre o dsRNA e a matriz polimérica.

[5] Entretanto, mesmo se nanopartículas de quitosana contendo RNA, inclusive dsRNA, e métodos para preparação dessas nanopartículas são conhecidos no estado da técnica, ainda existe uma necessidade de aperfeiçoamento, especialmente no que se refere à estabilidade das partículas, eficiência da composição pesticida e métodos usados para sua fabricação.

[6] Na presente invenção é relatado um aperfeiçoamento específico, mas não restrito, de um efeito inseticida sobre o bicudo do algodoeiro. Este efeito se dá principalmente, devido ao aprimoramento e precisão do silenciamento gênico pela produção e aplicação de moléculas específicas de RNA dupla fita estabilizado (dsRNAst) complexado com partículas de quitosana. Os dados também mostram que o silenciamento gênico resultante do uso da invenção é causado, não somente pelas partículas administradas oralmente, mas também pela entrega via pulverização. O efeito é atribuído à inibição dos níveis de transcritos de quitina sintase 2 previamente validado (AgraCHS2) (Macedo et al., 2017), utilizados como um exemplo de concretização.

Sumário da invenção

[7] A presente invenção relata um processo de obtenção de nanopartículas de quitosana sobre as quais molécula de RNA é aderida. O processo de obtenção de tais nanopartículas propicia produtos mais estáveis e produz nanopartículas com maior rendimento. As nanopartículas com o RNA aderido, o qual pode ser um dsRNAst,

proporcionam um método eficiente para controle de inseto praga por meio de resistência da planta ao ataque do inseto, devido à supressão da expressão de gene(s) alvo.

[8] O RNA, tal como dsRNAst, administrado via nanopartículas, é capaz de penetrar no tegumento do inseto e é também entregue oralmente, quando o inseto se alimenta da planta pulverizada, levando à supressão da expressão do gene alvo.

[9] O polímero formador da nanopartícula, tal como quitosana, pode também ter a capacidade de aumentar a proteção contra a degradação pelas nucleases do intestino. Ele também contribui para a internalização de moléculas de dsRNAst pelas células do inseto.

[10] Um aspecto da invenção se refere a um processo para obtenção de nanopartículas de quitosana com RNA aderido que compreende as seguintes principais etapas: A. formação de micropartículas de quitosana; B. formação de nanopartículas de quitosana a partir de micropartículas; C. revestimento de RNA em nanopartículas de quitosana; e D. recuperação de nanopartículas de quitosana com o RNA aderido na superfície.

[11] Em outro aspecto, o processo para obtenção de nanopartículas de quitosana com RNA aderido é descrito mais especificamente, de forma que a etapa A, que trata da formação de micropartículas de quitosana, inclui as seguintes subetapas: i) fornecer uma solução aquosa de quitosana, em que a concentração de quitosana é de 0,01 a 5%; ii) ajustar de pH da solução para pH 5 a 6; iii) adicionar agente de reticulação na solução para a proporção agente de reticulação:quitosana de 1:1 a 1:4, sendo que as micropartículas de quitosana são formadas, preferencialmente, por gelificação iônica; e iv) fornecer uma suspensão aquosa das micropartículas de quitosana formadas por precipitação.

[12] A etapa B, de formação de nanopartículas de quitosana a partir de micropartículas, é descrita mais especificamente com a subetapa de: i) formar nanopartículas de quitosana, a partir das micropartículas de quitosana formadas pela gelificação iônica de (A. iii).

[13] A etapa C, de revestimento de RNA em nanopartículas de quitosana, inclui as subetapas de: i) adição de RNA para a solução aquosa das nanopartículas de quitosana; ii) adição de RNA para uma razão de RNA:quitosana de 1:80 na solução; em que são formadas as nanopartículas tendo o RNA aderido; e iii) adição de surfactante catiônico ou neutro para as nanopartículas de quitosana.

[14] Em outro aspecto da invenção, o processo para obtenção de nanopartículas de quitosana com RNA aderido ocorre de forma que a solução aquosa de quitosana compreende 0,01 a 5% por peso de quitosana, sendo tal concentração preferencialmente entre 0,01 a 3%.

[15] Em um aspecto da invenção em que o pH da suspensão é ajustado para pH entre 5 e 6.

[16] RNA é para estar adsorvido às nanopartículas. O RNA selecionado para ser adsorvido na nanoparticula visa ao silenciamento do AgraChSII.

[17] O RNA pode ser RNA linear padrão ou RNA dupla fita (dsRNAst), sendo preferencialmente RNA fita dupla estabilizado (dsRNAst), uma vez que o dsRNAst é mais estável e tem maior potencial para silenciamento, principalmente silenciamento de AgraChSII. Outras sequências são aquelas que possam ser construídas como descritas na presente invenção.

[18] Durante o referido processo, a concentração peso/peso de quitosana na solução aquosa é 0.01 a 5 %, sendo preferencialmente 0.1 a 0.3 % (peso/peso).

[19] Em um determinado aspecto da invenção, o agente de reticulação é selecionado de um grupo de sais de monofosfato, difosfato e polifosfatos. Um exemplo de polifosfatos é trifosfato.

[20] As micropartículas de quitosana formadas pela gelificação iônica são tratadas para formar nanopartículas. Há diferentes métodos disponíveis para formação de nanopartículas, como por exemplo a sonicação, homogenização, alta pressão de homogenização, e processo de ultrapressão.

[21] Em uma concretização da presente invenção, o RNA é um RNA fita dupla (dsRNAst) para silenciamento do gene de AgraChSII.

[22] Em outra concretização da presente invenção, a razão de peso do dsRNA para a nanopartícula é de 1:0,001 a 1:1000.

[23] Outro aspecto da invenção trata da adição de um surfactante catiônico ou neutro durante o processo, mais especificamente quando o RNA foi adicionado às nanopartículas de quitosana.

[24] Outro aspecto da invenção apresenta nanopartícula de quitosana com RNA aderido obtida pelo processo descrito acima.

[25] Em um aspecto adicional, a invenção é a nanopartícula aqui definida, para uso no controle de praga.

[26] Pela presente invenção é possível reduzir custos de produção, contribuindo para a redução de pesticida usado no meio ambiente e favorecendo o aumento da produção de algodão.

[27] A invenção aqui descrita possui grande potencial de aplicação em campo, com o transporte de dsRNAst, o qual possui maior eficiência que o dsRNA linear no silenciamento de genes em insetos praga.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[28] Figura 1 – Esquema da metodologia de três diferentes métodos para a produção de nanopartículas de quitosana:dsRNAst. Em todos os três métodos, uma nanopartícula de suspensão é obtida e o surfactante catiônico é adicionado na etapa final, como descrito nos exemplos 1, 2 e 3, respectivamente.

[29] Figura 2 – Comparação entre características de produção de nanopartícula obtida pelos três métodos descritos nesta patente. A - Tamanho da nanopartícula obtida por análise de dinâmica de espalhamento de luz (DLS); B - Eficiência de conversão de quitosana para nanopartículas; C - Análises de eficiência de encapsulamento de dsRNAst; D - Análise de silenciamento de AgraChSII por PCR em tempo real. O experimento foi realizado em três réplicas biológicas e técnicas. AgraActin e AgraTubulin foram usados como genes de referência.

[30] Figura 3 – Análises de degradação de dsRNAst associada a nanopartículas de quitosana contendo surfactante catiônico, por nucleases presentes no suco intestinal do bicudo do algodoeiro. A - Ensaio de digestão realizado com nanopartículas obtidas pelo Método I; B - Ensaio de digestão realizado com nanopartículas obtidas pelo método III. As proporções de quitosana:dsRNAst (massa/massa) utilizadas foram 0.05; 0.1; 0.2; 0.4;

0.8; 1.6; 3.2; 6.4; 12.8. 300 ng de dsRNAst foi utilizado para a síntese de nanopartícula. MM: marcador de massa molecular, GJ: suco intestinal, CH: quitosana, dsRNAst: dsRNAst-AgraChSII.

[31] Figura 4 – Silenciamento do gene AgraChSII mediado por nanopartículas aplicadas topicamente em insetos adultos do bicudo do algodoeiro. O experimento foi realizado em três diferentes réplicas técnicas e biológicas. AgraActin e AgraTubulin foram usadas com genes de referência.

[32] Figura 5 – Análise da capacidade de espalhamento das nanopartículas contendo surfactante catiônico na superfície das folhas do algodoeiro. Neste experimento o polímero de quitosana foi marcado com Fluoresceína Isotiocianato (FITC). Tratamento A e B - com suspensão de nanopartículas não marcadas com FITC; Tratamento C e D- com suspensão de nanopartículas marcadas com o FITC sem o surfactante catiônico; E e F - tratamento com suspensão de nanopartículas marcadas com FITC com surfactante catiônico.

Definições

[33] O termo "RNA" é utilizado para referir-se tanto a RNA de cadeia dupla (dsRNA), bem como a pequeno RNA interferente (siRNA).

[34] O termo “agente de reticulação” deve ser entendido como um componente com capacidade de interagir eletrostaticamente com as cadeias de quitosana.

[35] Pelos termos "monofosfato", "difosfato" e "polifosfato" entende-se sais ou ésteres de oxianions poliméricos formados a partir de unidades estruturais de PO4 tetraédrico (fosfato) ligadas entre si por átomos de oxigênio. Os sais são formados com sódio, potássio ou cálcio. Entretanto a lista de contra-íons não é exaustiva.

[36] Pelo termo “TPP” entende-se tripolifosfato de sódio, um agente de reticulação que interage eletrostaticamente com a cadeia polimérica.

Descrição detalhada

[37] A presente invenção apresenta um processo para obtenção de nanopartículas de quitosana com RNA aderido que compreende as seguintes etapas: A. Formação de micropartículas de quitosana, por meio das seguintes subetapas: i) fornecer uma solução aquosa de quitosana, em que a concentração de quitosana é de 0,01 a 5%; ii) ajustar de pH da solução para pH 5 a 6; iii) adicionar agente de reticulação na solução para a proporção agente de reticulação:quitosana de 1:1 a 1:4, sendo que as micropartículas de quitosana são formadas, preferencialmente, por gelificação iônica; e iv) fornecer uma suspensão aquosa das micropartículas de quitosana formadas por precipitação; B. Formação de nanopartículas de quitosana a partir de micropartículas, por meio da seguintes subetapa: i) formar nanopartículas de quitosana, a partir das micropartículas de quitosana formadas pela gelificação iônica de (A. iii); C. Revestimento de RNA em nanopartículas de quitosana, por meio das seguintes subetapas: i) adicionar RNA à solução aquosa das nanopartículas de quitosana obtida em B;

ii) adicionar RNA à solução à uma proporção de RNA:quitosana de 1:80; em que são formadas nanopartículas de quitosana com RNA aderido; e iii) adição de surfactante catiônico às nanopartículas de quitosana.

B) formação de nanopartículas de quitosana a partir de micropartículas; iv) formação de nanopartículas de quitosana, a partir de micropartículas de quitosana formada pela gelificação iônica; C) Revestimento com RNA nas nanopartículas pela i) adição de RNA para solução aquosa de nanopartículas de quitosana, ii) adição de RNA para uma razão de RNA:quitosana de 1:80 na solução; em que nanopartículas de quitosana aderidas ao RNA são formadas; e iii) adição de surfactante para nanopartículas de quitosana.

[38] Preferencialmente, o referido processo ocorre de forma que a proporção agente de reticulação:quitosana da subetapa A.iii seja de 1:2.

[39] Em um aspecto da invenção, a solução aquosa de quitosana compreende 0,01 a 5% por peso de quitosana. A concentração dentro desta faixa depende do peso molecular do polímero. O peso molecular mais baixo (50-190 KDa) permite uma concentração mais alta de quitosana, por exemplo entre 0,1 a 10%. Quando o peso molecular da quitosana é alto, a concentração é selecionada entre 0,2 a 0,4 %, por exemplo, 0,2, 0,3 ou 0,4%. O limite superior é definido pela viscosidade da suspensão.

[40] O pH da suspensão é ajustado para o pH entre 5 e 6. O ajuste pode ser feito com adição de um ácido ou base comumente usado. Entretanto, quando a fonte de quitosana é um sal de quitosana, por exemplo a quitosana clorohidratada, o pH fica dentro do intervalo de pH desejado, não havendo necessidade de ajuste adicional de pH. É vantajoso fornecer a suspensão de pH 5 e 6 quando o processo é realizado em grandes escalas.

[41] A quantidade de agente de reticulação utilizado depende do pH da solução aquosa. Quando o pH é mais baixo, uma quantidade maior de agente de reticulação é requerida para a preparação das partículas. Já quando o pH é mais alto, uma menor quantidade de agente de reticulação é requerida para a precipitação de quitosana.

[42] O RNA deve ser adsorvido nas nanopartículas. O RNA selecionado para ser adsorvido na nanopartícula visa o silenciamento do gene AgraChSII.

[43] O RNA pode ser RNA de fita linear ou RNA de fita dupla (dsRNA), sendo preferencialmente RNA dupla fita estabilizado (dsRNAst). O dsRNAst é mais estável e tem maior potencial para silenciamento, especialmente silenciamento de AgraChSII.

[44] Preferencialmente, o dsRNAst tem uma sequência especificada nos Exemplos. As sequencias de dsRNAst são desenhadas baseadas na arquitetura do genoma do viróide, o qual é composto de RNA sem capa proteica. Viróides são altamente estáveis para degradação de ácido nucleico de planta (Ding, 2009). Os dsRNAst projetados foram avaliados e demonstraram um aumento de 10 vezes na eficiência de silenciamento gênico em insetos praga e nematoides.

[45] Durante a subetapa (A.i) do processo da presente invenção, a concentração de quitosana na solução aquosa é 0,01 a 5% em peso, sendo preferencialmente de 0.1 a 0.3% em peso.

[46] Outro parâmetro para ser considerado durante o processo é a razão de RNA para quitosana. Na etapa A, a razão de RNA:quitosana deverá estar entre 1:10:80 a 1:10:160. Na etapa B, a concentração deverá ser de até 10 microgramas de RNA, preferencialmente dsRNAst, para 1 mg de nanopartículas em suspensão. Do mesmo modo, na etapa C, a razão de dsRNAst para quitosana deverá estar entre 1:0,1 e 1:12,5, preferencialmente 1:1.

[47] As partículas de quitosana são ligadas por ação de um agente de reticulação. Aqui, o agente de reticulação é selecionado do grupo de monofosfato, difosfato e polifosfatos. Um exemplo de polifosfato é o trifosfato (TPP). Durante a formação de micropartículas, o trifosfato deve estar presente em uma concentração de pelo menos 10 mg/ml, preferencialmente 10 mg/ml. Outros agentes de reticulação são substâncias do grupo dos sulfatos, como por exemplo, o sulfato de sódio.

[48] Durante o processo objeto da presente invenção, o agente de reticulação deverá estar presente em uma quantidade apropriada em relação à quantidade de quitosana presente na suspensão. Em geral, a razão quitosana:TPP deverá ser de 2:1 até 6:1.

[49] A razão entre a quitosana e o agente de reticulação tem efeito sobre o tamanho das partículas formadas. Por exemplo, com uma razão de 16:1 pode-se obter partículas de quitosana de 100 a 200 nm, mas a um baixo rendimento. Com uma razão de 2:1 pode-se obter partículas de quitosana de 2 a 10 micrômetros, a um alto rendimento. Com o processo aqui descrito é possível obter micropartículas de 2 a 10 micrômetros.

[50] As micropartículas de quitosana são formadas por gelificação iônica.

[51] Em uma concretização, o processo de incorporação para formar nanopartículas de quitosana é realizado por sonicação, homogenização, homogenização por alta pressão e procedimento de pressão ultrapura. O tamanho da nanopartícula deve ser menor do que 1 micrômetro, preferencialmente menor que 0,5 micrômetro, tal como entre 100 e 400 nm.

[52] Um aspecto da invenção se dá com o RNA sendo um RNA fita dupla estabilizado (dsRNAst) visando ao silenciamento do gene AgraChSII. O dsRNAst também é definido nos Exemplos desse relatório descritivo.

[53] Outro aspecto da presente invenção apresenta uma razão em peso de dsRNA para nanopartículas de 1:0,001 a 1:1000. Preferencialmente, a razão é entre 1:0,1 e 1:10.

[54] Um surfactante é adicionado durante uma das etapas do processo aqui descrito, mais especificamente quando o RNA foi adicionado para as nanopartículas de quitosana preparadas. Um surfactante presente durante o processo fornece um efeito de estabilização para as nanopartículas tendo o RNA absorvido nelas.

[55] O surfactante deverá ser catiônico ou neutro, e um exemplo de catiônico ou neutro apropriado presente em uma concentração de 0,01 % para 0,5 % (massa/massa), por exemplo, em uma concentração de 0,05% (massa/massa) como concentração final para a suspensão obtida durante o processo.

[56] Outra vantagem da presença do surfactante nas nanopartículas é que ele, após o uso, pode ser uniformemente dispersado na superfície onde aplicado.

[57] Outra concretização da invenção se refere a nanopartículas de quitosana com RNA aderido obtidas pelo procedimento descrito acima.

[58] Em uma concretização adicional, a invenção trata da nanopartícula aqui definida, para uso no controle de insetos praga. Adicionalmente, a presente invenção fornece uma suspensão concentrada das nanopartículas de quitosana.

[59] O documento US 2016/0000086 A1 descreve a aplicação da tecnologia de RNAi para auxiliar no controle do bicudo do algodoeiro (CBW), Anthonomus grandis. Para a validação da invenção foi usado um dsRNA contendo a sequência de quitina sintase II do CBW. É colocado que, para a aplicação da tecnologia de RNAi visando ao controle efetivo de espécies de insetos praga, sequências de nucleotídeos altamente específicas são escolhidas, em regiões não conservadas do gene. Esta sequência específica não é observada em alinhamentos de diferentes sequências de espécies de insetos que coabitam o mesmo ambiente. Ou seja, sequências gênicas usadas para produzir dsRNA para CBW são diferentes das sequências de outros insetos.

[60] Nesta invenção, o método desenvolvido para aumentar a eficácia de supressão está em destaque. A sequência de quitina sintase II de A. grandis (AgraChSII) foi usada para a exemplificação e comparação do aumento do efeito causado pela aplicação da nanopartícula. A presente invenção, inclusive, é comparada às tecnologias descritas in US 2016/0000086 A1.

[61] Além disso, a presente invenção apresenta validação das nanopartículas com dsRNA aderido por bioensaios (administração oral e tópica) e análise do perfil de expressão gênica por PCR em tempo real. A metodologia aplicada demonstrou que a nanopartícula protege o dsRNA da degradação pelas nucleases e melhora sua internalização pelas células do intestino do inseto. Portanto, a presente invenção mostra uma vantagem para potencializar a eficácia de silenciamento gênico (RNAi), uma vez que mostra um aumento do efeito de supressão gênica quando comparado ao efeito apresentado na invenção aplicando o dsRNA não protegido, por administração oral e tópica.

[62] Na presente invenção, as principais inovações que fazem desta patente uma patente singular, mesmo que seja feita com quitosana, é o uso de moléculas estruturadas de RNA (dsRNAst) e a adição de um surfactante catiônico e/ou neutro como suporte para aumentar a espalhabilidade das nanopartículas na superfície foliar, bem como ajudar a penetração do dsRNA na cutícula do inseto. Concluindo, as nanopartículas proporcionadas pela presente invenção aumentam o efeito de silenciamento gênico (RNAi) em espécies de insetos pragas.

[63] O uso de dsRNAst aderido a nanopartículas é refratário a degradação por nucleases e capaz de aumentar o efeito do silenciamento gênico em 10 vezes. Além disso, o processo reivindicado para a produção das nanopartículas é altamente eficiente, tanto no que diz respeito à taxa de conversão do biopolímero na nanopartícula, como na taxa de encapsulação do dsRNAst. Adicionalmente, a adição de surfactantes catiônicos e/ou neutros durante o processo, que mantêm na formulação apresentada alta compatibilidade com o biopolímero, permitem as nanopartículas se espalharem na superfície foliar e atuarem como pesticida.

Exemplos

[64] Os exemplos são fornecidos a título de ilustração e não devem ser tomados como uma limitação ao âmbito geral da invenção.

[65] Sequência de DNA (SEQ ID NO:1) usada para a síntese de dsRNAst de quitina sintase II de CBW(AgraChSII) e nos bioensaios de silenciamento gênico: 1 TAATACGACTCACTATAGGGTCGGGTTGTCAAGTAGACGCTCACGTATCCAG 53 AAGGAAAACCGTGGCGGACTTGGCGAAAAACAAAGACAGAAAACGTGCAGTC 105 ATCAACGACTTGGATTCCGCCTTTTAAAGCCCGTATGGCAAAAAATACGTAA 157 AGGAGAAGACGCGTGGAGTGGCTTTACCTAGGAAAACTTTGGCAGCAATTCA 209 CAGAAGAGGGGTTCTGCCATGGGGTAGAGCTTTAAATTCGGAGGATTCGACC 261 TTAAATCGTTCCTCCAAGAGCTCTTCCCCCAATCCCTTACTTGCGTAAGTAC 313 GGATCGGCGGATGTACCCCTCTTCTGTGAATTGCTGCCAAAGTTTTCCTAGG 365 TAAAGCCACTCCACGCGTCTTCTCCTTTACGTATTTTTTGCCATACGGGCTT 417 TAAAAGGCGGAATCCAAGTCGTTGATGACTGCACGTTTTCTGTCTTTGTTTT 469 TCGCCAAGTCCGCCACGGTTTTCCTTCTGGATACGTGAGCGTCTACTTGACA 521 ACCCGAGACCAGACTACCGTGACAAGCCACTACGTGCGGCCCCATAGGACAG 573 TAGCAAGGGCCCGACGGTGAGTTCGTCGACACCTCTGCCCCTCCCAGGTACT 625 ATCCTCTTTCAAGGATGTGTTCCCTAGGAGGGTGAGTGTACCTCTTTTCGGA 677 TTTCTCCGGTCTTCCGAGAGAGACAGAGGACGGCCTCTCCCCATAGGGCCCA 729 AAGTCACGGTAGTCTGGTC • Sequência 1 a 30 – Sequência do promotor T7;

• Sequência 31 a 215 – Sequência senso do gene AgraChSII ; • Sequência 216 a 331 – Sequência anel de incompatibilidade 1 ; • Sequência 332 a 516 – Sequência anti-senso do gene AgraChSII ; • Sequência 517 a 747 – Sequência anel de incompatibilidade 2.

[66] Exemplo 1 – Desenho e síntese de dsRNA estruturado visando ao silenciamento do gene AgraChSII.

[67] O desenho do dsRNA estruturado com arquitetura viroide foi validado pelo software RNAfold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). A construção contendo a sequência dsRNAst transcrita foi obtida por síntese e adquirida de empresa especializada. Nesta construção, a região a ser transcrita foi flanqueada pelo promotor T7. As construções contêm a sequência específica do gene da quitina sintase II do bicudo do algodoeiro (Anthonomus grandis).

[68] O dsRNAst foi sintetizado a partir de produtos de PCR flanqueados pelo promotor T7, e os produtos de PCR foram clonados e sequenciados. 1,0 μg de produto de PCR foi utilizado como molde para uma reação de transcrição de 20 μL, conforme descrito no protocolo do fabricante do kit MEGAscript® T7 High Yield (Ambion). A reação foi incubada por 16 horas a 37 °C, seguida por um tratamento com DNase I por 15 minutos. Para o alinhamento do dsRNAst, o produto da reação foi incubado a 70°C durante 5 minutos e resfriado à temperatura ambiente (22 °C). O produto da transcrição foi purificado por Fenol/Clorofórmio e precipitado com Isopropanol, como descrito pelo protocolo do fabricante. O dsRNAst foi ressuspendido em água tratada com DEPC e depois quantificado por espectrofotometria. A sequência senso e a respectiva sequência anti-senso do gene alvo podem ser substituídas, no lugar da sequência do gene AgraChSII.

[69] Exemplo 2 – Método I - Síntese de nanopartículas de quitosana e dsRNAst visando ao silenciamento do gene AgraChSII.

[70] A quitosana (95% desacetilada) foi dissolvida em ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de quitosana 0,2% (2 mg / mL) e filtrada em filtro de seringa 25 mm x 0,22 μg (FilterPro). Cerca de 25 μg de dsRNAst foram adicionados a 25 μL de solução de tripolifosfato de sódio (TPP) (10 mg / mL) e homogeneizados. Esta solução foi adicionada em alíquotas de 10 μL a 1 mL de solução de quitosana (2 mg / mL). O surfactante Isopropilamina foi adicionado a uma concentração final de 0,05%. As partículas foram centrifugadas e analisadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Um modelo esquemático de todo o procedimento metodológico da síntese de nanopartículas pode ser visto na Figura 1.

[71] Estas partículas também foram usadas para bioensaios, a fim de validar o efeito fenotípico de silenciamento gênico. Nos bioensaios, os insetos foram alimentados com a nanopartícula contendo o dsRNAst para o gene alvo AgraChSII.

[72] Exemplo 3 – Método II - Síntese de nanopartícula de quitosana e dsRNAst visando ao silenciamento do gene AgraChSII.

[73] No Método II, micropartículas de quitosana foram inicialmente geradas. Para isso, a quitosana (95% desacetilada) foi dissolvida em ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de quitosana 0,2% (2 mg / mL). O pH da solução foi ajustado para 5,5 e a solução foi filtrada em filtro de seringa 25 mm x 0,22 μg (FilterPro). Com o objetivo de produzir micropartículas, foram adicionados 2 mL de solução de trifosfato (10 mg / mL) na velocidade de 1 mL por minuto a 20 mL de solução de quitosana (2 mg / mL). Após esse período, a solução foi mantida em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente e centrifugada por 10 minutos a 5000 x g. Foram adicionados 2 mL de TPP ao sobrenadante, e o precipitado foi ressuspendido em 20 mL de água destilada e centrifugado por 10 minutos a 5000 x g. A etapa de lavagem foi repetida pelo menos três vezes. Alternativamente, a fim de formar micropartículas, adicionou-se solução de NaSO4 1M até 25 µM e seguiram-se os passos de lavagem. O precipitado foi finalmente ressuspendido em água e sonicado durante 5 minutos com amplitude de 30%, usando banho de gelo. 20 µg de dsRNAst foram adicionados à suspensão de nanopartículas e o surfactante Isopropolamina foi adicionado na concentração final de 0,05%. As partículas foram centrifugadas e analisadas por DLS. Essas partículas também foram utilizadas em bioensaios para validar os efeitos fenotípicos do silenciamento gênico por via oral (Figura 1).

[74] Exemplo 4 – Método III - Síntese de nanopartículas de quitosana e dsRNAst visando ao silenciamento do gene AgraChSII.

[75] A quitosana (95% desacetilada) foi dissolvida em ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de quitosana de 0,2% (2 mg / mL). A solução de pH foi ajustada para 5,5 e a solução foi filtrada em filtro de seringa 25 mm x 0,22 μg (FilterPro). O dsRNAst foi adicionado numa concentração constante de 300 ng. A razão quitosana /dsRNAst (massa / massa) foi: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4,0,8, 1,6, 3,2, 6,4 e 12,8 em um volume de reação de 20 μL em tampão tríplice pH 5,5 (Schaffer et al, 2004). O surfactante Isopropolamina foi adicionado na concentração final de 0,05% (Figura 1). Essas nanopartículas foram usadas para bioensaios para validar os efeitos fenotípicos do silenciamento gênico. Nos bioensaios, os insetos foram alimentados com nanopartículas contendo o dsRNAst para o gene alvo AgraChSII.

[76] Exemplo 5 - Comparação das características de produção de nanopartículas e eficiência de encapsulação de dsRNAst dos três métodos descritos.

[77] Para avaliar a taxa de conversão de biopolímeros em nanopartículas obtidas pelos três diferentes métodos descritos na presente invenção, utilizou-se quitosana marcado com fluoróforo FITC ativado. 100 mg de quitosana (95% desacetilada) foram dissolvidos em 50 mL de ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de quitosana a 0,2% (2 mg / mL) e a solução foi ajustada para pH 5,5. 1 mg de FITC foi dissolvido em metanol e adicionado à solução de quitosana. A mistura foi incubada em agitação durante 2 horas. Após esse período, a quitosana foi precipitada com quatro volumes de acetona, centrifugada e lavada duas vezes com acetona a 80%. O precipitado da quitosana foi liofilizado e depois ressuspenso em ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de 0,2% de quitosana (2 mg / mL). Nanopartículas marcadas com FITC foram preparadas seguindo os métodos I, II e III como descritos nesta patente. O sobrenadante obtido após a geração das nanopartículas foi utilizado para calcular a quantidade de quitosana ainda em solução, com base na curva padrão de quitosana-FITC, previamente estabelecida.

[78] Para validar a taxa de encapsulamento de dsRNAst pelas nanopartículas, 5μg do dsRNAst foram utilizados como uma quantidade de referência a ser encapsulada em 1 mL de quitosana a 0,2%. O dsRNAst presente no sobrenadante, após a síntese de nanopartículas, foi quantificado por espectrofotometria no Nanodrop TM. A taxa de encapsulação foi calculada com base na diferença entre as concentrações inicial e final, obtidas antes e após o encapsulamento. O experimento foi realizado em triplicata, em três lotes independentes de produção de nanopartículas, para cada método.

[79] Os três métodos de síntese geraram nanopartículas com diferentes tamanhos,variando entre 283 e 315 nanômetros (Figura 2A). Não foi verificado diferença significativa nos tamanhos de nanopartículas nos diferentes métodos. No entanto, a taxa de conversão de quitosana para nanopartículas foi de apenas 5% para o Método I, 98,5% para o Método II e 85% para o Método III (Figura 2B). No método III, a taxa obtida de conversão de quitosana para nanopartículas foi acima de 98% usando proporção quitosana / dsRNAst (massa/massa) de 0,2. A taxa de encapsulamento dsRNAst durante a formação de nanopartículas foi de apenas 25% para o Método I, 88% para o Método II e 98% para o Método III (Figura 2C).

[80] Exemplo 6 - Análise de degradação de dsRNAst encapsulados em quitosana, pelo suco intestinal de bicudo do algodoeiro (CBW).

[81] A suspensão de nanopartícula quitosana:dsRNAst formulada em diferentes proporções de quitosana:dsRNAst (massa/massa) foi incubada por 30 minutos com 1 μg de suco intestinal do CBW. O suco intestinal foi coletado seguindo o protocolo descrito por Gillet et al (2017) em solução de 20 μL em tampão triplo pH 5,5. A integridade do dsRNAst associado à nanopartícula de quitosana foi analisada em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio (Figura 3). As suspensões de nanopartículas obtidas pelos três diferentes métodos foram capazes de proteger os dsRNAst da degradação da nuclease intestinal do CBW. Foi observado que nanocomplexos integrados com quitosana e dsRNAst ficaram retidos nos poços de gel. Em ensaios realizados com nanopartículas sintetizadas pelo Método II, descritas no Exemplo 3, observou-se que quando tratado com o suco intestinal do CBW, o dsRNAst do nanocomplexo não foi degradado pelas nucleases intestinais e que a maioria ficou retida no poço de gel (Figura 3A). Usando as nanopartículas sintetizadas pelo Método III, mesmo com pequenas quantidades de quitosana, o dsRNAst permanece intacto na presença de nucleases intestinais (Figura 3B). Em altas concentrações de quitosana, não há migração do dsRNAst e ele é retido no poço de gel, tanto no controle quanto na presença de nucleases intestinais. Sem quitosana, o dsRNAst é completamente degradado. Pode-se concluir que, in vitro, mesmo em pequenas quantidades, a quitosana promove a proteção do dsRNAst contra as nucleases intestinais do CBW.

[82] Exemplo 7- Administração oral e tópica de nanopartículas de quitosana:dsRNAst.

[83] 7.1. Administração de nanopartículas por meio da alimentação

[84] Insetos adultos foram mantidos em jejum por 48 horas (n = 10). Em seguida, as nanopartículas contendo 300 ng de dsRNAst (AgraChSII) e 500 ng de quitosana foram diluídas em sacarose a 5% e administradas por via oral aos insetos (Figura 7). Como controles, utilizou-se amostras contendo dsRNAst-AgraChSII (300 ng) e quitosana (500 ng). Após 72 horas, os insetos foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80°C para análise futura. O ensaio foi realizado em três repetições biológicas.

[85] 7.2. Administração de nanopartículas através de aplicação tópica

[86] Insetos adultos foram submetidos a pulverização com solução contendo nanopartículas sintetizadas pelo método III (dsRNAst AgraChSII 300ng/μL, quitosana 500 ng / μL). Como controle, foram utilizadas nanopartículas vazias (quitosana 500 ng/μL) e dsRNA (300 ng/μL). A aplicação foi realizada por pulverização e os insetos foram congelados em nitrogênio líquido após 72 horas e armazenados a -80°C para análise futura. O ensaio foi realizado em três repetições biológicas.

[87] Exemplo 8 - Análise da expressão gênica de AgraChSII por PCR em tempo real.

[88] Amostras de CBW previamente armazenadas a -80°C foram pulverizadas em nitrogênio líquido e a extração total de RNA foi realizada com TrIzol (Invitrogen), seguindo protocolo do fabricante. A síntese de cDNA foi realizada com 2,0 μg de RNA utilizando o kit MMLV (Invitrogen) e o oligonucleotídeo NvDt30, seguindo o protocolo do fabricante. A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando SYBR Green (Promega) como fluoróforo intercalante e oligos para os genes AgraChSII, AgraActin e AgraTubulin, que foram utilizados como genes de referência (Tabela 1). A reação foi ajustada de acordo com o protocolo do fabricante e o programa na máquina de PCR (Applied 7300 Real Time PCR System - Applied Biosystems) consistiu de 1 ciclo de 10 minutos a 95 °C, 40 ciclos de 20 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 e 30 segundos a 72. A análise da expressão relativa foi realizada no programa qBasePlus 2.0 pelo método Pfaffl (Hellemans et al, 2007). O ensaio foi realizado em três repetições biológicas (n = 10) e técnicas. A análise estatística foi realizada pelo método de Turkey com 0,05% de significância para comparação entre os tratamentos.

[89] A fim de validar o potencial da suspensão de nanopartículas para causar o silenciamento gênico no CBW, foi realizado um experimento de entrega oral de nanopartículas, como descrito no Exemplo 7. Após a análise do transcrito por PCR em tempo real, verificou-se que o gene alvo foi silenciado pelos três métodos descritos nesta patente. Verificou-se o silenciamento de 84%, 86% e 84% para as nanopartículas sintetizadas pelos métodos I, II e III, respectivamente (Figura 2D). O experimento de aplicação tópica de nanopartículas para o silenciamento do gene foi realizado com a pulverização da solução de nanopartículas no inseto adulto. Após 72 horas os insetos foram coletados para análise do gene alvo, verificando-se uma diminuição de 48,9% na expressão de AgraChSII (Figura 3).

[90] Exemplo 9 - Avaliação da molhabilidade da suspensão de nanopartícula quitosana:dsRNAst em folhas de algodão.

[91] A fim de verificar a molhabilidade da nanopartícula de quitosana:dsRNAst nas algodão folhas, nanopartículas foram marcadas com fluoróforo ativado FITC. 100 mg de quitosana (95% desacetilada) foi dissolvida em 50 mL de ácido acético 0,1 M,

gerando uma solução de quitosana a 0,2% (2 mg/mL) e o pH da solução foi ajustado para 5,5. 1 mg de FITC foi dissolvido em metanol e adicionado à solução de quitosana. A mistura foi mantida em agitação durante 2 horas. Após esse período, a quitosana foi precipitada com quatro volumes de acetona, centrifugou-se e lavou-se duas vezes com acetona a 80%. O precipitado de quitosana foi liofilizado e a quitosana marcada foi ressuspendida em ácido acético 0,1 M, gerando uma solução de 0,2% de quitosana. As nanopartículas marcadas com FITC foram preparadas seguindo o protocolo do Método II descrito nesta patente. A suspensão de nanopartículas contendo surfactante catiônico e controles sem surfactante foi aplicada com pulverizador manual nas folhas de algodão. Após uma hora, as folhas foram extirpadas e analisadas em estereomicroscópio binocular de fluorescência (Figura 5).

[92] Verificou-se que a suspensão de nanopartículas contendo surfactante catiônico espalhou uniformemente sobre a superfície da folha. Ao contrário, nanopartículas sem surfactante ficaram agregadas na folha. Portanto, o uso de surfactante catiônico, como a Isopropilamina, estabiliza a suspensão de nanopartículas e permite sua dispersibilidade acima dos tecidos vegetais.

[93] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com o que é atualmente, considerado as formas mais práticas de realizações, deve ser considerado que a invenção não se limita às formas de realização divulgadas, mas, pelo contrário, destina- se a abranger várias modificações e equivalências incluídas dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas.

Referências: • DING, B. The biology of viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. Volume 47, 105-131, 2009. • GILLET, FX., GARCIA, RA., MACEDO, LLP., ALBUQUERQUE, EVS., SILVA, MCM, GROSSI-DE-SA, MF., Investigating engineered ribonucleoprotein particles to improve oral RNAi delivery in crop insect pests. Frontiers in Plant Physiology, v. 8, n. 256, p. 1-15, 2017.

• HELLEMANS, J., MORTIER, G., DE PAEPE, A., SPELEMAN, F., VANDESOMPELE, J., QBASE relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.

Genome Biology, v. 8, n. 2, p. 1-14, 2007. • MACEDO, LLP, ANTONINO-DE-SOUZA JÚNIOR, JD, COELHO, RR, FONSECA, FCA, FIRMINO, AAP, SILVA, MCM, FRAGOSO, RR, ALBUQUERQUE, EVS, SILVA, MS, DE ALMEIDA ENGLER, J, TERRA, WR, GROSSI-DE-SA, MF.

Knocking down chitin synthase 2 by RNAi is lethal to the cotton boll weevil.

Biotechnology Research and Innovation, p. 1 - 15. 2017. • SCHAFER P., SCHOLZ, SR, GIMADUTDINOW, O, CYMERMAN, IA, BUJNICKI, JM, RUIZ-CARRILLO, A, PINGOUD, A, MEISS, G, Structural and functional characterization of mitochondrial EndoG, a sugar non-specific nuclease which plays an important role during apoptosis.

Journal of Molecular Biology, v. 338, p. 217-228, 2004.

Claims (12)

Reivindicações

1. Processo para obtenção de nanopartículas de quitosana com RNA aderido caracterizado por compreender as seguintes etapas: A. Formação de micropartículas de quitosana, por meio das seguintes subetapas: i) fornecer uma solução aquosa de quitosana, em que a concentração de quitosana é de 0,01 a 5%; ii) ajustar de pH da solução para pH 5 a 6; iii) adicionar agente de ligação cruzada na solução para a proporção agente de ligação cruzada:quitosana de 1:1 a 1:4, preferencialmente 1:2, sendo que as micropartículas de quitosana são formadas, preferencialmente, por gelificação iônica; e iv) fornecer uma suspensão aquosa das micropartículas de quitosana formadas por precipitação; B. Formação de nanopartículas de quitosana a partir de micropartículas, por meio da seguintes subetapa: i) formar nanopartículas de quitosana, a partir das micropartículas de quitosana formadas pela gelificação iônica de (A. iii); C. Revestimento de RNA em nanopartículas de quitosana, por meio das seguintes subetapas: i) adicionar RNA à solução aquosa das nanopartículas de quitosana obtida em B; ii) adicionar RNA à solução à uma proporção de RNA:quitosana de 1:80; em que são formadas nanopartículas de quitosana com RNA aderido; e iii) adição de surfactante catiônico às nanopartículas de quitosana.

2. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o RNA aderido ser RNA de fita dupla estabilizado (dsRNAst), preferencialmente um dsRNAst conforme SEQ ID NO: 1.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a concentração de quitosana na solução aquosa ácida ser de 0,01 a 5% (peso/peso), preferencialmente 0,1 a 0,3% (peso/peso).

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado por o agente de reticulação ser selecionado de um grupo consistindo de sais de monofosfato, difosfato e polifosfatos.

5. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a formação de nanopartículas de quitosana ocorrer por sonicação, homogeneização ou homogeneização a alta pressão.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por o dsRNAst ser um dsRNA alvo para o silenciamento gênico de AgraChSII.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a razão em peso de dsRNAst para nanopartículas ser de 1: 0,001 a 1 : 1000.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por o surfactante catiônico ser selecionado de isopropilamina e o surfactante neutro ser selecionado de um polisorbato.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por o surfactante catiônico estar presente numa concentração peso/peso de 0,01 a 0,2%; numa concentração peso/peso de 0,05%.

10. Nanopartícula de quitosana tendo RNA aderido caracterizada por ser obtida por processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Nanopartícula de acordo com a reivindicação 10 caracterizada por ser para uso em controle de pragas.

12. Uma suspensão concentrada caracterizada por compreender a nanopartícula de quitosana conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 11.