BR112020018566A2 - Vacinas autólogas contra o câncer - Google Patents
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Abstract
vacinas autólogas contra o câncer . a invenção refere-se a uma vacina autóloga contra o câncer e também ao método para produção da mesma compreendendo as seguintes etapas: a) extrair as proteínas contidas em uma amostra de soro ou plasma obtida de um paciente que sofre de câncer; e b) trazer as proteínas extraídas na etapa a) em contato com partículas de hidroxiapatita e/ou fosfato tricálcico.
Description
VACINAS AUTÓLOGAS CONTRA O CÂNCER Campo técnico da invenção
[001] A presente invenção se refere ao tratamento de câncer por imunoterapia. A presente invenção refere-se, em particular, à produção de vacinas autólogas contra o câncer. Antecedentes tecnológicos
[002] A imunoterapia é uma alternativa terapêutica reconhecida e bem estabelecida para o tratamento do câncer. Ela agrupa várias terapias diferentes, todas com base na estimulação do sistema imunológico do paciente de modo a reconhecer e atacar sua doença.
[003] As células do sistema imunológico são normalmente capazes de monitorar e detectar a presença de anormalidades dentro das células do corpo. No entanto, a maioria dos tumores desenvolve vários mecanismos para escapar desse monitoramento; a tolerância do sistema imunológico em relação ao tumor é então observada. Estimular as células do sistema imunológico, como os linfócitos T, para que elas reconheçam especificamente as células tumorais, torna possível elevar essa tolerância.
[004] Esta estimulação pode, por exemplo, ser realizada colocando diretamente os antígenos tumorais em contato (in vitro ou in vivo) com os macrófagos ou células relacionadas, de modo que as células apresentadoras de antígenos (APCs) estimulem os linfócitos T. Este é o conceito de uma vacina terapêutica contra o câncer. Para uma estimulação in vivo, o princípio é retirar proteínas anormais do tumor e reinjetá-las em uma forma que seja visível ao sistema imunológico.
[005] As vacinas terapêuticas contra o câncer podem ser com base no uso de proteínas de choque térmico (HSPs), como gp 96 ou HSP 70. Essas proteínas são moléculas chaperonas e se associam a inúmeros peptídeos, incluindo os antígenos específicos para o tumor de cada paciente. Constituem, portanto, uma impressão digital molecular do tumor a ser erradicado e diferem de um paciente para outro e de um tumor para o outro. Para o mesmo tumor, esta impressão digital evolui com o tempo.
[006] Esta estratégia de vacinação obriga a purificar as proteínas vacinantes a partir de cada tumor contra o qual devem imunizar o paciente e em um determinado tempo. O protocolo de purificação é longo, difícil de industrializar e sujeito a múltiplas contaminações por endotoxinas. É convencional purificar HSPs a partir de um material tumoral moído que é submetido a uma série de centrifugação, precipitação, cromatografia em Con A, análise eletroforética e cromatografia em Mono Q FPLC. As patentes US nº 6,447,781, 6,436,404, 6,410,028, 6,383,494 e 6,030,618 descrevem métodos para purificar proteínas HSP, consistindo no uso de colunas cromatográficas de Con A Sepharose.
[007] O pedido de patente WO 2006/122914 descreveu a utilidade de empregar partículas de hidroxiapatita (HAP) para purificar as proteínas vacinantes a partir de extratos de tecido. Este pedido descreve mais particularmente um método de uma única etapa para produzir antígenos tumorais, destinado a dispô-los em uma forma reconhecível pelo sistema imunológico, de modo a ser capaz de aplicá-lo em larga escala por pessoas que não possuam qualificação de bioquímico. O documento WO 2006/122914 também descreve que os pós de HAP, assim como pós de outros sais de cálcio podem ser usados como adjuvantes de vacinação e que o pó de hidroxiapatita que adsorveu os antígenos tumorais específicos de um tumor pode ser usado como um medicamento contra o referido tumor. Assim, o mesmo pó de HAP pode ser usado tanto para purificar as proteínas específicas de um tumor quanto para estimular o sistema imunológico contra as referidas proteínas quando os pós e as proteínas são injetados juntos.
[008] O desenvolvimento de um método aprimorado para a produção de um pó de hidroxiapatita e/ou fosfato tricálcico também foi descrito no pedido de patente WO 2014/184453. O pó assim obtido é colocado em contato com proteínas tumorais diretamente purificadas de biópsias tumorais, marcando assim a identidade celular do tumor, de modo a produzir uma vacina antitumoral terapêutica que aumenta o nível de imunidade inata sem toxicidade adicional ou efeito colateral.
[009] Esta técnica é segura, pode ser combinada com quimioterapia e não produz resíduos tóxicos. Os inventores demonstraram que os linfócitos T eram capazes de reconhecer as células tumorais após a vacinação. O ciclo de vacinação é muito similar àquele usado para a vacina anti-infecciosa. A vacina é injetada no tecido subcutâneo e várias injeções são necessárias (uma por semana por 4 semanas e uma por mês por 4 meses).
[010] Esse tipo de imunoterapia pode fazer a diferença entre a remissão e a recuperação de certos tipos de câncer com prognóstico ruim. Isso foi demonstrado, por exemplo, na medicina veterinária, onde essa vacinação aumenta a sobrevivência dos cães em comparação com a quimioterapia sozinha para um câncer mortal, como os linfomas B de alto grau (DLBCL). Excelentes resultados também foram obtidos para tumores sólidos, como câncer ósseo (osteossarcomas), mastocitomas ou então melanomas.
[011] No entanto, a produção dessas vacinas a partir de biópsias apresenta várias dificuldades que prejudicam consideravelmente um uso industrial. A primeira dessas dificuldades é a necessária biópsia do tumor em uma área que não seja necrótica e que seja representativa do nível antigênico de todo o tumor e quaisquer metástases possíveis do referido tumor.
[012] Além disso, pode nem sempre ser possível obter as biópsias, em particular se elas representarem por si mesmas um risco vital ou um risco de sequelas significativas em indivíduos para os quais existe um alto risco anestésico devido a condições patológicas múltiplas e danosas. Esse risco é particularmente alto para tumores como adenocarcinomas pancreáticos ou tumores cerebrais de difícil acesso ou mesmo tumores de próstata de alto grau devido ao risco de disseminação.
[013] Ademais, a partir de um ponto de vista regulatório, o manejo das biópsias é uma tarefa trabalhosa e complicada. Requer a criação de um banco de tecidos, seguindo normas rígidas, realizando o monitoramento da cadeia de frio e empreendendo uma logística complexa.
[014] O custo de uma biópsia e do manejo desta em um banco de tecidos pode, portanto, ser facilmente superior ao do tratamento em si.
[015] Seria, portanto, extremamente vantajoso e benéfico ser capaz de desenvolver uma vacina contra o câncer que pudesse ser produzida sem recurso a biópsias tumorais, ao mesmo tempo que se preservasse uma eficácia comparável às vacinas produzidas a partir de tumores. Breve descrição da invenção
[016] Surpreendentemente, os presentes inventores conseguiram desenvolver uma vacina contra o câncer que apresenta resultados que são comparáveis, ou mesmo superiores, aos obtidos com a vacina descrita no pedido WO 2014/184453 (com base em proteínas derivadas de biópsias tumorais e partículas de HAP), mas isso sendo sem recurso a uma biópsia do tumor.
[017] Os presentes inventores perceberam de fato que é possível desenvolver tal vacina extraindo diretamente as proteínas tumorais a partir do sangue, e em particular a partir do soro, de um indivíduo que sofre de câncer.
[018] Neste contexto, a presente invenção se refere a um método para produção de uma vacina autóloga contra o câncer, o referido método compreendendo as seguintes etapas: a) extrair as proteínas contidas em uma amostra de soro ou plasma obtida de um paciente que sofre de câncer; e b) colocar as proteínas extraídas na etapa a) em contato com partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico.
[019] A presente invenção também se refere à vacina autóloga obtida a partir do método de produção mencionado acima.
[020] Por fim, a presente invenção também se refere à vacina autóloga obtida a partir do método de produção mencionado acima, para uso em terapia, e particularmente no tratamento de câncer no paciente a partir do qual a amostra de soro e/ou plasma foi obtida (vacina autóloga). Descrição detalhada da invenção
[021] Os presentes inventores demonstraram que é possível desenvolver uma vacina eficaz contra o câncer com base em partículas de hidroxiapatita apresentando antígenos tumorais, os referidos antígenos tumorais tendo sido obtidos, não a partir de biópsias tumorais como era o caso no estado da técnica, mas a partir de amostras de plasma ou de soro do paciente.
[022] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere, portanto, a um método para produzir uma vacina contra o câncer e, particularmente, uma vacina autóloga contra o câncer, o referido método de produção compreendendo as seguintes etapas: a) extrair as proteínas contidas em uma amostra de soro ou plasma obtida de um paciente que sofre de câncer; e b) colocar as proteínas extraídas na etapa a) em contato com partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico.
[023] Uma vacina "autóloga" denota uma vacina em que as proteínas/os antígenos tumorais são obtidos a partir do paciente destinado a ser vacinado.
[024] O "paciente" ou "indivíduo" é um ser humano ou um animal, por exemplo, um mamífero e, em particular, cães, cavalos ou gatos.
[025] Uma amostra de soro ou plasma é tipicamente obtida a partir de uma amostra de sangue retirada a partir do paciente a ser tratado. O sangue é submetido a uma centrifugação de modo a separar os componentes mais pesados do sobrenadante. Este sobrenadante constitui o plasma se envolver sangue anticoagulado ou o soro se o sangue coagular naturalmente.
[026] A noção de "proteínas/antígenos tumorais" é bem conhecida dos técnicos no assunto. São proteínas e/ou moléculas expressas especificamente pelas células tumorais e que podem ser reconhecidas pelos linfócitos T e B.
[027] De acordo com a presente invenção, as proteínas/os antígenos tumorais são extraídos diretamente a partir da amostra de soro ou plasma obtida do paciente a ser tratado. Normalmente, a massa das proteínas/os antígenos tumorais extraídos a partir da amostra de soro ou plasma está entre 60 kDa e 130 kDa, em particular entre 70 kDa e 110 kDa.
[028] Os técnicos no assunto estão cientes de um grande número de técnicas para extrair proteínas a partir de uma amostra de soro ou plasma. Tipicamente, as proteínas/os antígenos tumorais são extraídos por precipitação da amostra de soro em uma solução salina, a mistura assim obtida é então centrifugada e o pellet obtido representa as proteínas extraídas.
[029] Em uma modalidade particular, todas as proteínas/os antígenos extraídos do plasma/soro são usados e colocados em contato para produzir a vacina de acordo com a presente invenção. Isto quer dizer que todo o "pellet" de proteínas/antígenos extraídos do plasma/soro é colocado em contato com as partículas de hidroxiapatita.
[030] A “hidroxiapatita” é um mineral da família do fosfato de cálcio, de fórmula Ca10(PO4)6(OH)2, e a célula unitária da estrutura cristalina é hexagonal. A hidroxiapatita é o membro hidroxilado do grupo apatita. Os íons da célula unitária cristalina são substituíveis por outros íons de cargas e tamanhos similares; também existem túneis na célula unitária que podem receber pequenas moléculas, tais como certos aminoácidos. Estas são as características particulares que conferem a este mineral propriedades de adsorção muito específicas.
[031] As partículas de hidroxiapatita de acordo com a presente invenção são obtidas via o mesmo método que o descrito no pedido WO 2014/184453, cujo conteúdo é incorporado na presente invenção a título de referência. Este documento descreve, em particular, um método para a produção de partículas de hidroxiapatita de fosfato de cálcio Ca10(PO4)6(OH)2, consistindo em uma lenta precipitação em alta temperatura, obtida por dupla decomposição de um sal de cálcio e de um sal de fósforo em um meio básico. A reação é realizada à temperatura constante em um grande volume de reação e é seguida por uma fase de maturação e uma fase de lavagem com água. O precipitado assim obtido passa por mais uma etapa de transformação: separação sólido/solução. A última etapa é realizada por filtração, secagem por estufa e trituração, ou por secagem por pulverização usando um leito fluidizado. Independentemente da técnica de separação sólido/solução escolhida, o pó passará por duas etapas de transformação específicas para a aplicação da invenção: a etapa de seleção do tamanho de partícula por triagem a seco para reter apenas a banda de tamanho de partícula de interesse, inferior a 25 μm ou entre 25 e 45 μm, e então uma etapa final durante a qual o pó será sinterizado a uma temperatura ideal para assegurar a fusão dos grãos, resultando em acabamentos superficiais dos pós bastante particulares (preferencialmente maior ou igual a 30 m 2/g). Essas duas etapas finais podem ser invertidas: seleção e sinterização ou sinterização e seleção. A "sinterização" é um processo que consiste em aquecer um pó sem levá-lo à fusão. No contexto da presente invenção, a sinterização é, por exemplo, realizada a uma temperatura compreendida entre 400°C e 600°C. O HAP assim obtido pode estar na forma de pó e pode passar por uma ou mais lavagens.
[032] Tipicamente, as proteínas/os antígenos tumorais são colocados em contato com partículas de hidroxiapatita, passando as referidas proteínas/os antígenos tumorais por uma coluna de partículas de hidroxiapatita, tal como uma coluna de cromatografia. Os antígenos tumorais podem, opcionalmente, ser colocados em contato em solução e então lavados por centrifugação. As proteínas/os antígenos tumorais são então adsorvidos na superfície das partículas de hidroxiapatita. As partículas de hidroxiapatita podem estar particularmente na forma de pó.
[033] Quando uma coluna de cromatografia é usada, ela pode, por exemplo, ser colocada sob pressão.
[034] Uma vez que as partículas de hidroxiapatita foram carregadas com proteínas/antígenos tumorais, elas são suspensas em um líquido para injeção e injetadas no paciente a partir do qual a amostra de soro/plasma foi obtida.
[035] Tipicamente, o líquido de injeção compreende um agente orgânico facilitando a injeção, tal como a carboximetilcelulose.
[036] Um aspecto da invenção refere-se a uma vacina autóloga compreendendo partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico que são carregadas com antígenos tumorais obtidos a partir de uma amostra de soro ou plasma de um paciente que sofre de câncer.
[037] Tipicamente, a vacina autóloga está na forma de uma suspensão.
[038] Tipicamente, o peso dos antígenos tumorais extraídos a partir da amostra de soro ou plasma está entre 60 kDa e 130 kDa, em particular entre 70 kDa e 110 kDa.
[039] De acordo com uma modalidade particular, a vacina autóloga é obtida de acordo com o método descrito acima.
[040] A vacina autóloga de acordo com a presente invenção compreende assim as partículas de HAP e/ou de fosfato tricálcico que adsorveram os antígenos tumorais específicos a partir do paciente (obtidos a partir de uma amostra de soro ou plasma do referido paciente) e que foram ressuspensas.
[041] Esta vacina é então preferencialmente administrada por injeção, por exemplo, por injeção subcutânea ou intradérmica. A vacina pode ser administrada por via oral ou por qualquer outro meio que permita a vacinação transmucosal.
[042] A presente invenção também se refere ao uso da vacina autóloga obtida de acordo com o método acima, para uso em terapia e, particularmente, no tratamento de câncer no paciente a partir do qual as proteínas/os antígenos tumorais foram obtidos.
[043] Outro aspecto da invenção também se refere a um método para tratar um paciente que sofre de câncer, o referido método compreendendo as seguintes etapas: a) extrair proteínas contidas em uma amostra de soro ou plasma obtida de um paciente que sofre de câncer; b) colocar as proteínas extraídas na etapa a) em contato com partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico; c) suspender, em um líquido de injeção, as partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico colocadas em contato com as proteínas da etapa b); d) injetar a mistura obtida na etapa c) no paciente a partir do qual a amostra de soro ou plasma usada na etapa a) foi obtida.
[044] No contexto da presente invenção, o câncer pode ser qualquer câncer para o qual a imunoterapia possa ser indicada. O câncer pode ser particularmente escolhido de uma lista não exaustiva que compreende melanomas, carcinomas ou adenocarcinomas que se desenvolvem a partir de células epiteliais e/ou células de uma glândula, os sarcomas se desenvolvendo a partir de células dos tecidos conjuntivos ou musculares, tumores do sistema nervoso central, tumores do sistema hematopoiético, como leucemias e linfomas. Os diferentes cânceres de origem infecciosa, os mais representativos dos quais são câncer cervical, câncer primário de fígado e câncer gástrico, também podem ser incluídos.
[045] Em uma modalidade particular, o câncer é escolhido do grupo que consiste em osteossarcomas, linfomas B ou T, tumores mamários, melanomas, hemangiossarcomas, mastocitomas, fibrossarcomas, tumores cerebrais ou do sistema nervoso central, schwannomas, mesoteliomas, seminomas, teratomas e blastomas.
[046] Em uma modalidade preferencial, o câncer é escolhido de um glioblastoma, um sarcoma (tal como osteossarcoma ou fibrossarcoma), um melanoma, um carcinoma ou um adenocarcinoma.
[047] Em uma modalidade particular, o câncer é um câncer disseminado, isto é, aquele que apresenta metástases (pacientes classificados na categoria NxMx de acordo com a classificação TNM).
[048] O paciente pode receber uma ou mais injeções, doses de vacina. Uma dose geralmente compreende entre 30 e 50 mg de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico e entre 1000 e 2000 μg de proteínas.
[049] Preferencialmente, o paciente pode receber várias injeções espaçadas ao longo do tempo, por exemplo, vários dias, semanas ou meses. Em uma modalidade preferencial, as injeções são separadas por uma semana durante o primeiro mês e então por um mês durante 4 meses.
[050] Cada injeção pode ser idealmente preparada a partir de uma nova retirada de amostra de proteínas tumorais do paciente em caso de sinal de escape da vacina ou de ineficácia, em particular quando há um aumento no nível dos marcadores tumorais.
[051] A presente vacina representa uma evolução considerável do protocolo em comparação com a técnica usando biópsia tumoral: as proteínas não precisam ser extraídas do setor intracitoplasmático.
[052] As eletroforeses de SDS Page das proteínas anexadas aos pós prontos para serem injetados mostram que as bandas de proteínas são diferentes daquelas obtidas por biópsia tumoral (como no pedido WO 2014/184453). Ademais, como demonstrado a seguir, os resultados obtidos com uma vacina de acordo com a presente invenção são tão bons, ou até melhores.
[053] A vacina autóloga de acordo com a presente invenção pode ser usada em combinação com outro tratamento anticâncer, tais como radioterapia, quimioterapia ou outro agente imunoterapêutico.
[054] A presente invenção é apresentada em mais detalhes nos exemplos abaixo. Estes exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não podem ser interpretados como limitando o escopo da presente invenção. Breve descrição das figuras
[055] Figura 1: SDS Page de proteínas destacadas da superfície do pó de vacinas fabricadas a partir de diferentes tumores. Da esquerda para a direita: adenocarcinoma mamário, linfoma difuso e osteossarcoma. Os resultados são ambos qualitativamente e quantitativamente variáveis. Escala em kDa.
[056] Figura 2: SDS Page de proteínas obtidas a partir de vacinas feitas a partir de soro. Da esquerda para a direita, melanoma (duas primeiras colunas), câncer de língua (próximas 2), hemangiossarcoma (próximas 2). Escala em kDa.
Existem muito menos contaminações; as bandas principais se encontram quantitativamente entre 160 e 110 kDa. Isso é muito reproduzível.
[057] Fig 3: Marcação de uma seção de glioblastoma usando anti-IgGs humanos mostrando que os anticorpos de células antitumorais estão presentes após a vacinação, como mostrado pela marcação de peroxidase (depósito marrom).
[058] O presente protocolo foi realizado em pacientes manifestando condições patológicas de muito mau prognóstico, que são incuráveis usando as terapias utilizadas à época. Os pacientes participaram do presente protocolo mediante solicitação expressa e assinatura do consentimento informado.
[059] O presente protocolo pode ser indicado para cânceres disseminados como tratamento de última linha após o fracasso das terapias convencionais, opcionalmente combinado com quimioterapia ou outra imunoterapia. A prevenção de recidivas de câncer sem terapia eficaz após cirurgia também pode ser considerada.
[060] Vinte e sete pacientes foram incluídos neste protocolo. Nove pacientes foram submetidos ao protocolo de imunoterapia sem qualquer tratamento quimioterápico adicionado. 10 pacientes tinham um glioblastoma, 2 tinham um sarcoma e 15 tinham um carcinoma ou adenocarcinoma. 22 pacientes tinham uma doença evolutiva no tempo da aplicação do protocolo de imunoterapia, 13 desses pacientes estavam livres de doença ou com uma doença estável ou regressão parcial 5 meses após o início do protocolo. Com o afastamento dos glioblastomas, 72% dos pacientes que sofriam de doença evolutiva no momento da vacinação evoluíram, dois meses após a vacinação, para o estado estável (SD) ou regressão parcial (PR). Nas conclusões, embora esta série seja heterogênea, uma porcentagem significativa de casos mostrou uma resposta clínica a essa técnica de última linha e nenhum efeito colateral ocorreu. Os cânceres disseminados podem ser estabilizados por esta técnica, mostrando que a resposta imunológica pode ser obtida em seres humanos, mesmo para uma doença de evolução rápida e avançada. EXEMPLO 1: Diferença entre a eletroforese das proteínas adsorvidas nos pós em contato com o soro ou com uma biópsia tumoral.
[061] Foram comparadas as eletroforeses das proteínas contidas nas vacinas efetuadas a partir de uma biópsia ou a partir das proteínas séricas.
[062] As partículas de HAP foram tipicamente obtidas de acordo com o método descrito no Exemplo 1 do pedido WO 2014/184453.
[063] As doses foram preparadas como se segue: - A partir de uma biópsia:
[064] O tecido tumoral e todos os materiais usados para preparar a vacina foram manipulados de forma estéril em uma capela de fluxo laminar. O tecido tumoral congelado (200 mg) foi homogeneizado usando um homogeneizador de bola de tecido. Adicionou-se 1 ml de NaHCO3 (30 mM, pH 7) por 1 ml de homogenato.
[065] O homogenato resultante foi então centrifugado a 1000 g durante 15 min a 4°C de modo a eliminar todos os resíduos de tecido. O sobrenadante é misturado a 50% em uma solução supersaturada com nitrato de amônio aquoso e colocado a 4°C por uma hora e então centrifugado. O pellet é ressuspenso em um tampão fosfato a 0,02 M, pH 7. Esta solução é então percolada em uma coluna de cromatografia contendo o pó de HAP. A coluna foi preenchida (colunas de cromatografia Poly-prep, Cat.731-1550, Bio Rad) com 0,2 g de HAP (0-25 μm), equilibrada com 10 volumes de tampão fosfato (20 mM, pH 7). O pellet ressuspenso foi então adicionado. A coluna foi então lavada com 3 ml de uma solução de NaCl a 100 mM. O pó foi então suspenso em 5 ml de solução de carboximetilcelulose (CMC) (2% em NaCl a 20 mM). 0,5 ml desta solução foi adicionado para cada injeção de vacina. - A partir do soro:
[066] O procedimento é muito mais simples, 3 cc de soro são diluídos a 50% em uma solução supersaturada de nitrato de amônio, colocados a 4°C por uma hora e depois centrifugados. O pellet é ressuspenso em um tampão fosfato a 0,02 M, pH 7. Esta solução é então percolada em uma coluna de cromatografia contendo o pó de HAP. A coluna foi preenchida (colunas de cromatografia Poly-prep, Cat.731-1550, Bio Rad) com 0,2 g de HAP (0-25 μm), equilibrada com 10 volumes de tampão fosfato (20 mM, pH 7). O pellet ressuspenso foi então adicionado. A coluna foi então lavada com 3 ml de uma solução de NaCl a 100 mM. O pó foi então suspenso em 5 ml de solução de carboximetilcelulose (CMC) (2% em NaCl a 20 mM). 0,5 ml desta solução foi usado para cada injeção de vacina.
[067] Nos dois casos de eletroforese, as proteínas adsorvidas nos pós são dessorvidas antes da eletroforese. 10 mg de pós de uma dose de vacina são centrifugados por dois minutos a 500 g. O sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em 0,5 ml de NaCl a 0,5 M. Os pós são agitados, ressuspensos e centrifugados a 500 g. 10 µl do líquido sobrenadante são então colocados nos poços de eletroforese, após terem sido diluídos a 50% em detergente e aquecidos a 70°C por 5 min. Resultados:
[068] Existem diferenças notáveis entre os perfis eletroforéticos obtidos pelos dois métodos. O mais marcante é a diminuição do número de bandas nas eletroforeses provenientes do sangue, em comparação com aquelas provenientes de biópsias (fig. 1, 2). As eletroforeses provenientes do sangue também são muito mais homogêneas, mostrando uma melhor reprodutibilidade da purificação. EXEMPLO 2: Resultados da administração da vacina de acordo com a invenção em um paciente que sofre de adenocarcinoma
[069] Essa paciente apresentava adenocarcinoma endometrial (TNM 7a) tratado no pré e pós-operatório com dois ciclos de paclitaxel e de carboplatina. 18 meses após a paciente manifestar uma miliária pulmonar e localizações secundárias em sítios retroperitoneais, ela recebeu tratamento hormonal (acetato de megestrol) e iniciou as vacinas. Aos três meses (IRM, PET) após a vacinação, mostrou uma estabilização de sua patologia pulmonar e uma ligeira regressão do volume das massas retroperitoneais, que então continuou, pois, aos 18 meses, as massas retroperitoneais praticamente desapareceram e a miliária pulmonária, que ainda estava presente, regrediu. Esta regressão parcial ainda é estável após dois anos e meio de observação.
[070] Este exemplo mostra que o efeito clínico da vacinação a partir das proteínas do soro pode ser mantido por um período de tempo considerável superior a 30 meses. EXEMPLO 3: Resultados da administração da vacina de acordo com a invenção em um paciente que sofre de adenocarcinoma de cólon
[071] Esse paciente apresentou um adenocarcinoma de cólon tratado cirurgicamente e com adriamicina. Aos três anos, surgiram metástases pulmonares e hepáticas, localizadas em um lobo pulmonar e em um lobo hepático, o que permitiu uma cirurgia do pulmão e do fígado seguida de quimioterapia. Aos 5 anos, uma quimioterapia com gencitabina, capecitabina e bevacizumabe foi estabelecida após o reaparecimento de numerosas metástases hepáticas e retroperitoneais dos linfonodos. Apesar da quimioterapia, a doença continuou a progredir. Após a interrupção da quimioterapia após uma embolia pulmonar, os marcadores tumorais (ACE)
aumentaram fortemente. O paciente foi tratado por vacinação a partir das proteínas séricas (4 injeções com uma semana de intervalo durante o primeiro mês e, em seguida, uma injeção/mês) levando a uma diminuição acentuada no nível do marcador. Os marcadores voltaram a subir 3 meses depois, sugerindo escape da vacina pelo tumor com uma PET (tomografia por emissão de pósitrons) idêntica à feita antes da vacinação. Assim, outra preparação foi feita a partir de outra retirada de amostra de soro e injetada a cada três semanas, o que resultou em diminuição dos marcadores abaixo dos valores normais em menos de três meses. O PET revela necrose das metástases hepáticas um ano após o início da imunoterapia.
[072] Em conclusão: a vacina produzida a partir do sangue inibe a proliferação celular em uma primeira etapa, detectável pelos marcadores de proliferação celular, depois manifesta um efeito posterior, detectável pela PET por um período muito mais longo de vários meses a um ano. EXEMPLO 4: Anticorpo sérico anti-glioblastoma pós-vacinação com vacina preparada a partir do sangue
[073] Este paciente foi vacinado 6 meses após a descoberta e a biópsia cirúrgica de um glioblastoma de estágio IV temporal direito. O tratamento de primeira linha foi um protocolo Stupp (Stupp, R. et al., Radiotherapy plus Concomitant and Adjuvant Temozolomide for Glioblastoma, N Engl J Med 2005; 352: 987-996) com base em temodal alternado com radioterapia. A vacinação a partir das proteínas séricas foi realizada com frequência de 4 injeções, com intervalo de uma semana, por um mês e, a seguir, uma injeção por mês durante a sobrevida do paciente. O paciente permaneceu em remissão completa por 10 meses e em evolução (critérios RECIST) por 2 meses antes de morrer. A presença de anticorpos séricos (IgG) foi testada em seções da biópsia tumoral do paciente para verificar se existiam anticorpos contra as células tumorais.
[074] São utilizadas seções de tecido com 5 µm de espessura embebidas em parafina. São desparafinizadas em xilol e reidratadas em soluções redutoras de etanol. As peroxidases endógenas são inibidas com uma solução de H2O2. O soro do paciente foi diluído a 1/100 em um tampão Hepes e serve como anticorpo primário em um marcador usando um IgG anti-humano marcado com peroxidase como anticorpo secundário. A peroxidase é então demonstrada usando DAB (3,3'-diaminobenzidina) oxidado na presença de peróxido de hidrogênio, a referida peroxidase produzindo um depósito marrom insolúvel em álcool (figura 3). O controle negativo é uma seção tratada nas mesmas condições, sem o anticorpo primário (soro diluído).
[075] A rotulagem mostra que a maioria das células tumorais são positivas, mas deve-se notar que algumas delas não são. Isso sugere que a vacina provoca uma reação contra as células tumorais e que o período de tempo que existe entre a biópsia e a fabricação da vacina fez com que nem todos os clones estivessem representados na vacina.
[076] Esta histologia mostra que a vacinação pelas proteínas séricas desencadeia uma reação imune anti-tumor humoral. EXEMPLO 5: A diferença entre a porcentagem de ELISPOTs positivos induzidos pelas vacinas fabricadas a partir de uma biópsia tumoral e aquelas fabricadas a partir do soro.
[077] A estimulação de CD8 induzida pelas vacinas fabricadas a partir do sangue ou de uma biópsia foi comparada. Isso foi realizado em uma série de pacientes com várias condições patológicas cancerosas para os quais uma biópsia ou uma retirada de amostra de soro foi coletada dependendo da disponibilidade das biópsias. Deve-se notar que a estimulação da imunidade celular detectada pelo Elispot nem sempre se correlaciona com o resultado clínico. O Elispot não detecta todos os estados de estimulação de CD8. O teste ELISPOT foi realizado em cada paciente na quinta injeção, isso quer dizer, três meses após a primeira vacinação.
[078] 10 ml de sangue são coletados em um tubo citratado e centrifugados, em ficoll 400, dentro de 4 horas após a retirada da amostra. As células nucleadas são então lavadas em meio RPMI e dispostas em cultura em poços revestidos com proteínas de vacina a uma concentração de 2×105 células/poço. As proteínas da vacina são obtidas conforme descrito anteriormente para a realização das eletroforeses das vacinas. 10 mg de pós carregados de proteínas são lavados em 0,5 ml de NaCl a 0,2 M. Para revestir as placas, a solução é levada de volta a 0,02 M. As células são então cultivadas durante a noite em meio RPMI suplementado com 5% de soro fetal de vitelo a 37°C em uma incubadora a 5% de CO2. As células são então lavadas por 10 min em PBS contendo 0,1% de detergente tween20. Os poços são então incubados por uma hora em um ml de PBS com 0,1% de BSA e o anticorpo anti-gama- interferon marcado com peroxidase diluído a 1/1000. A peroxidase é então revelada como no exemplo 4.
[079] 15 pacientes foram vacinados com vacinas produzidas a partir do soro e 13 foram vacinados com vacinas produzidas a partir de biópsias tumorais. Os ELISPOTs foram realizados no momento da 5ª injeção, ou seja, no terceiro mês de vacinação. O controle negativo é o sangue de um paciente não vacinado com um tumor do mesmo tipo. 14/15 pacientes vacinados a partir do soro têm ELISPOTs positivos, enquanto apenas 6/13 dos pacientes vacinados a partir das biópsias têm um ELISPOT positivo. Isso constitui uma diferença estatisticamente diferente.
[080] Diante desses diferentes resultados, dadas as diferenças de composição visíveis pela eletroforese e os resultados observados clínica e biologicamente, há um efeito surpreendente da vacina obtida por meio desse método.
Claims (10)
1. Método para produzir uma vacina autóloga contra o câncer compreendendo partículas de hidroxiapatita e/ou fosfato tricálcico carregado com antígenos tumorais, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as seguintes etapas: a) extrair as proteínas contidas em uma amostra de soro ou plasma obtida de um paciente que sofre de câncer; e b) trazer as proteínas extraídas na etapa a) em contato com partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico, a fim de obter a vacina autóloga.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um humano.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente é um cachorro, um cavalo ou um gato.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é escolhido a partir de melanomas, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, tumores do sistema nervoso central, leucemias, linfomas e cânceres de origem infecciosa.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é escolhido a partir do grupo que consiste em osteossarcomas, linfomas B ou T, tumores mamários, melanomas, hemangiossarcomas, mastocitomas, fibrossarcomas, tumores cerebrais ou do sistema nervoso central, schwannomas, mesoteliomas, seminomas, teratomas e blastomas.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o câncer é um glioblastoma, um sarcoma, um melanoma, um carcinoma ou um adenocarcinoma.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,
caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer que exibe metástases.
8. Vacina autóloga compreendendo partículas de hidroxiapatita e/ou de fosfato tricálcico carregado com antígenos tumorais, caracterizada pelo fato de que a vacina autóloga é obtida a partir de um método de produção definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Uso da vacina autóloga definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de uma vacina para o tratamento de câncer no paciente do qual a amostra de soro e/ou plasma foi obtida.
10. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.
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