BR112020017492A2

BR112020017492A2 - Composição

Info

Publication number: BR112020017492A2
Application number: BR112020017492-0A
Authority: BR
Inventors: Pierre Dilda; Mathilde Latil; René Lafont; Stanislas Veillet
Original assignee: Biophytis; Sorbonne Universite
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2020-12-22
Also published as: KR20200128058A; WO2019166717A1; US20210369735A1; JP7386798B2; JP2021516228A; CN111954534A; FR3078252A1; EP3758709A1; FR3078252B1; US20230158046A1

Abstract

a invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos uma fitoecdisona ou pelo menos um derivado semissintético de uma fitoecdisona, para uso em mamíferos para prevenir a perda de força muscular durante a imobilização. mais particularmente, a invenção refere-se a uma composição para uso que compreende 20-hidroxiecdisona ou um derivado semissintético de 20-hidroxiecdisona. além disso, a invenção se refere a uma composição para uso que compreende um composto de fórmula geral (i).

Description

“COMPOSIÇÃO” CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao uso de fitoecdisonas e derivados das mesmas para uso na prevenção da perda de força muscular durante a imobilização.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] O risco de complicações após a imobilização de um membro ou a manutenção de uma posição deitada por longo prazo (decúbito) é alto e pode se manifestar por distúrbios musculares, mas também por problemas broncopulmonares, cardiovasculares ou osteoarticulares (Bodine 2013, Hermans & Van den Berghe 2015; De Jonghe et al. 2007; Wentworth et al. 2017; Iordens et al. 2017).

[003] A imobilização pode ser gradual ou abrupta e pode referir- se a um membro ou estender-se a todo o corpo nos casos mais extremos. As circunstâncias que resultam na imobilização são muitas, por exemplo: - fratura ou lesão de um membro que leva à colocação de um dispositivo de imobilização externo (suportes não engessados do colar cervical ou tipo faixa, uma atadura de imobilização, metal ou joelheiras, sindactilia ou suportes de gesso com imobilização completa ou incompleta de um membro), - ruptura parcial ou total do ligamento, exigindo ou não intervenção cirúrgica, levando à colocação de um dispositivo de imobilização externo, - colocação de uma prótese de quadril, - colocação de uma prótese de joelho, - acessórios ortopédicos que não permitem suporte imediato, - fratura da pelve em um período doloroso, - fratura do colo do fêmur, operado ou não operado, estável ou instável,

- ataque nervoso periférico parcial devido a um trauma, - ataque parcial da medula espinhal devido a um trauma, e - pacientes colocados em posição decúbito por um período prolongado.

[004] Em todos os casos, a imobilização levará a alterações no tecido muscular. Observa-se redução da massa muscular, juntamente com desgaste dos músculos ou amiotrofia, bem como redução da força e potência muscular, o que geralmente leva a um período de incapacidade e, em alguns casos, a um prolongamento do atendimento causando aumento nos custos hospitalares.

[005] A atrofia e a perda de força do músculo esquelético após a imobilização têm consequências funcionais, em particular na postura e no equilíbrio, o que aumenta o risco de queda, em particular em idosos (Onambele et al., 2006).

[006] Na França, estima-se que, por ano, ocorram entre 50.000 e

80.000 fraturas da extremidade superior do fêmur em idosos. A grande maioria dessas fraturas do fêmur são consecutivas após quedas (INSERM 2015). As fraturas do colo do fêmur levam a uma perda transitória da mobilidade, que pode causar a ocorrência de complicações. A fratura da extremidade do fêmur é uma das principais causas de mortalidade em pessoas com mais de 65 anos (Gillespie et al. 2012). No ano seguinte ao acidente, a mortalidade é de 10% a 20% maior do que em indivíduos da mesma idade e do mesmo sexo. Todas as causas tomadas em conjunto, de 20% a 30% dos pacientes com idade superior a 55 anos morrem no ano seguinte a uma fratura da extremidade superior do fêmur (Klop et al., 2014 e Lund et al., 2014).

[007] Em um indivíduo idoso, a atrofia muscular após imobilização tem consequências muito graves, que podem ser agravadas pela atrofia muscular em combinação com o envelhecimento (sarcopenia). Os mecanismos envolvidos na atrofia muscular relacionada ao envelhecimento e na atrofia muscular relacionada à imobilização são, no entanto, diferentes (revisado em Lynch et al., 2007; Romanick & Brown-Borg, 2013).

[008] Durante a imobilização, pode-se observar que são as fibras do tipo I (oxidativas) que são particularmente afetadas pela atrofia (Bigard et al., 1998; Ohira et al., 2006). Por outro lado, a sarcopenia se manifesta em uma atrofia particular relativa às fibras do tipo II (glicolíticas), associada ao desenvolvimento de tecido conjuntivo (fibrose) e uma infiltração de células adiposas (por exemplo, Nilwik et al., 2013). A sarcopenia é caracterizada por uma redução do diâmetro das fibras e do número das mesmas (Lexell, 1993).

Por outro lado, em um contexto de atrofia relacionada à imobilização, o tamanho das fibras diminui, mas o número de fibras musculares permanece constante (Narici, 2010). Além disso, a atrofia envolve processos de autofagia, cuja regulação difere de acordo com o tipo de fibra (Yamada et al., 2012).

[009] Os mecanismos moleculares que fundamentam a atrofia muscular causada também são diferentes. Alguns genes conhecidos por causarem atrofia muscular, tais como MuRF1 e Atrogin, podem ser ativados por vias de sinalização bem conhecidas, tais como NF-κB. Essa via de sinalização é ativada em condições de atrofia relacionadas à caquexia ou à imobilização (Hunter et al., 2002), mas não em um contexto de sarcopenia (Bar-Shai et al., 2005; Phillips, 2005; Sakuma, 2012).

[010] A miostatina, um regulador negativo do crescimento muscular, aumenta durante a atrofia relacionada à caquexia e durante a imobilização, mas foi demonstrado que este não era o caso em animais idosos, nos quais o nível de miostatina permaneceu relativamente inalterado (Siriett et al., 2006; Lebrasseur et al., 2009).

[011] Nessas condições, o fato de uma substância ser eficaz no tratamento da sarcopenia não permite prever que ela será eficaz na prevenção de distúrbios musculares relacionados à imobilização.

[012] A imobilização também tem impacto na recuperação do desempenho físico máximo, em particular em atletas (Milsom et al. 2014).

[013] A imobilização engessada de um membro lesado provoca modificações estruturais dos músculos envolvidos na imobilização. Por exemplo, dois meses de imobilização do tornozelo levam a uma redução no volume do tríceps sural e do quadríceps de 21,9% e 24,1%, respectivamente.

Dois meses após o fim da imobilização, os dois músculos ainda estão 9,5% e 5,2% menos volumosos do que antes da imobilização (Grosset & Onambele- Pearson, 2008). Em termos de área de seção transversal (CSA) das fibras musculares, cinco semanas de imobilização reduzem a CSA em 10% a 20% dependendo do tipo de fibra e dos músculos em questão (Suetta et al. 2004; Berg et al. 2007). A CSA dos músculos que suportam o peso corporal diminui aproximadamente 2-3% por semana durante os primeiros meses de imobilização (Berg et al. 2007).

[014] A força muscular também é bastante reduzida após a imobilização. Em geral, uma imobilização da perna por duas semanas produz uma perda de um terço da força muscular em jovens, enquanto os idosos perdem aproximadamente um quarto de sua força. Neste último caso, a perda de potência muscular pode ser irreversível. Isso pode dar origem a uma perda de confiança e fraqueza, levando invariavelmente à dependência. Além disso, o aparecimento de uma síndrome de imobilização pode ocorrer após o confinamento ao leito ou simplesmente uma grande redução da atividade.

[015] Pacientes confinados ao leito por mais de uma semana apresentam perda de força muscular de seus músculos antigravitacionais da panturrilha e das costas (Hermans et Van den Berghe, 2015). Em uma pessoa saudável, durante a primeira semana de confinamento ao leito, foram observadas perdas de força entre 1% a 6% ao dia (Appell, 1990). Um período de 1 a 2 semanas de inatividade dos membros inferiores causa redução em 15% da força dos extensores do joelho em indivíduos com idade em torno dos 20 anos.

[016] Além disso, um estudo demonstrou que a colocação de gesso por 5 dias causou uma perda de força no quadríceps de 9% enquanto essa perda chegou a 23% após 14 dias de imobilização. O confinamento ao leito por 3 meses tem efeitos muito marcantes na força desenvolvida com uma redução de 31% a 60%, de acordo com o músculo em questão (Alkner & Tesch, 2004).

[017] A revelação do papel deletério da imobilização muscular levou a testar a viabilidade e eficácia de vários métodos preventivos. Assim, em alguns casos, a fim de superar os danos musculares causados pela imobilização, foram estabelecidos programas de remobilização ativa ou passiva precoce para pacientes. Esses programas têm a desvantagem de serem difíceis de serem introduzidos em grande escala. Além disso, o uso desses métodos é complicado ou até mesmo impossível em alguns pacientes cirúrgicos nos quais a mobilização prova ser dolorosa.

[018] Estudos de eletroestimulação muscular também têm sido realizados, mas esta abordagem não possibilita um efeito benéfico sistêmico da estimulação, podendo se mostrar ineficaz em pacientes que apresentam inexcitabilidade da membrana muscular e escolha do território muscular a ser estimulado é complicada em casos de imobilização prolongada.

[019] Além das alterações teciduais e mecânicas do músculo durante a imobilização, também surgem alterações metabólicas e moleculares importantes.

[020] Assim, a síntese de proteínas é reduzida, enquanto a imobilização causa um aumento no estresse oxidativo, inflamação, apoptose e ativação de vias proteolíticas que levam à degradação das proteínas musculares.

[021] As fitoecdisonas representam uma importante família de esteróis poli-hidroxilados. Essas moléculas são produzidas por várias espécies de plantas e participam da defesa dessas plantas contra pragas. A principal fitoecdisona no reino vegetal é a 20-hidroxiecdisona.

[022] Estudos têm destacado as propriedades antidiabéticas e anabólicas de algumas fitoecdisonas. Efeitos estimulantes na síntese de proteínas nos músculos são observados em ratos in vivo (Syrov, 2000; Tóth et al., 2008; Lawrence, 2012) e em miotubos C2C12 de camundongo in vitro (Gorelick-Feldman et al., 2008).

[023] Derivados semissintéticos de 20-hidroxiecdisona foram propostos na publicação do pedido de patente francesa da empresa depositante, publicado sob o número FR 3021318 A1.

OBJETO DA INVENÇÃO

[024] O objetivo da presente invenção é limitar tanto quanto possível a perda de força muscular durante a imobilização, em particular após, por exemplo, uma fratura, confinamento ao leito ou simplesmente uma grande redução na atividade.

[025] Os inventores descobriram que as fitoecdisonas e seus derivados protegem contra a perda de força muscular relacionada com a imobilização. A força muscular é definida pela força isométrica máxima absoluta e específica do músculo esquelético.

[026] Inesperadamente, as fitoecdisonas e seus derivados reduzem significativamente a perda de força muscular relacionada com a imobilização, sem que esta propriedade esteja relacionada a um efeito anabolizante no músculo esquelético.

[027] A presente invenção refere-se a fitoecdisonas e seus derivados destinados a serem usados no tratamento de distúrbios resultantes de uma alteração na função muscular causada por imobilização.

[028] No restante da descrição, as fitoecdisonas e seus derivados significam extratos de plantas ricos em 20-hidroxiecdisona, e composições incluindo 20-hidroxiecdisona como agente ativo.

[029] Os referidos extratos de plantas ricos em 20- hidroxiecdisona são, por exemplo, extratos de Stemmacantha carthamoides ou Cyanotis vaga.

[030] Os extratos obtidos são, de preferência, purificados para grau farmacêutico.

[031] A invenção se refere a uma composição incluindo um ecdiesteróide, para uso da mesma em mamíferos para prevenir a perda de força muscular durante a imobilização.

[032] Mais precisamente, a invenção refere-se a uma composição incluindo pelo menos uma fitoecdisona e pelo menos um derivado semissintético de uma fitoecdisona, para uso da mesma em mamíferos para prevenir a perda de força muscular durante a imobilização.

[033] Nas formas de realização, a composição inclui 20- hidroxiecdisona ou um derivado semissintético de 20-hidroxiecdisona. Um exemplo de tal composição é o extrato, purificado para grau farmacêutico, BIO101 que foi desenvolvido pela depositante. BIO101 é um extrato de planta, a referida planta sendo escolhida a partir de plantas contendo pelo menos 0,5% de 20-hidroxiecdisona em peso seco da referida planta, o referido extrato incluindo pelo menos 95%, e de preferência pelo menos 97% de 20- hidroxiecdisona.

[034] Nas formas de realização, a composição inclui um composto de fórmula geral (I):

(I) em que: R1 é escolhido a partir de: um grupo (C1-C6)W(C1-C6); um grupo (C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6); um grupo (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); um grupo (C1-C6)A, A representando um heterociclo, opcionalmente substituído por um grupo escolhido a partir de OH, OMe, (C1-C6), N(C1-C6), CO2(C1-C6); um grupo CH2Br; W sendo um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S, de preferência O e, ainda mais preferencialmente, S.

[035] Nas formas de realização, a composição inclui um composto escolhido a partir dos seguintes compostos: nº 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil- 17-(2-morfolinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-6-ona, nº 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(3- hidroxipirrolidin-1-il)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(4- hidroxi-1-piperidil)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2- hidroxietil)-1-piperidil]acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-dimetilaminopropil

(metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- deca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi- 10,13-dimetil-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-17-il]etil]sulfanilacetato de etila; nº 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-2,3,14- trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-6-ona; nº 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2- hidroxietilsulfanil)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H ciclopenta[a]fenantren-6-ona.

[036] Nas formas de realização, a composição inclui um composto de fórmula (II):

O S HO HO OH O (II).

[037] Em formas de realização, a composição é incorporada em uma formulação farmaceuticamente aceitável que pode ser administrada por via oral.

[038] Em formas de realização, as fitoecdisonas são administradas em uma dose entre 50 e 1000 miligramas por dia em humanos.

[039] Em formas de realização, o composto de fórmula (II) é administrado em uma dose entre 50 e 1000 miligramas por dia em humanos.

[040] Em formas de realização, a composição é administrada durante a imobilização. Preferencialmente, a composição é administrada a partir do primeiro dia de imobilização.

[041] Em formas de realização, a composição é administrada até o fim da imobilização.

[042] Em formas de realização, a composição é ainda administrada durante um período predeterminado após o final da imobilização.

[043] Em um exemplo de forma de realização, a duração predeterminada do tratamento após o término da imobilização corresponde ao tempo necessário para recuperar um limiar de força correspondente, por exemplo, a 80% ou 100% da força inicial estimada do indivíduo.

[044] Em um exemplo de forma de realização, o período de tratamento predeterminado corresponde a um período de pelo menos 28 dias.

[045] Em um exemplo de forma de realização, a duração predeterminada do tratamento é um período de três a seis meses.

[046] Preferencialmente, o tratamento após o término da imobilização é complementado com um programa de exercícios físicos.

APRESENTAÇÃO DAS FIGURAS

[047] Outras vantagens, objetivos e características particulares da presente invenção emergirão da seguinte descrição não limitativa de pelo menos uma forma de realização particular do objeto da presente invenção, no que diz respeito aos desenhos anexos, em que: - A Figura 1A é uma imagem que representa cortes histológicos coloridos com hematoxilina e eosina do músculo tibial anterior (AT) de um camundongo de fundo genético C57BL/6J não imobilizado; - A Figura 1B é uma imagem que representa cortes histológicos coloridos com hematoxilina e eosina do músculo tibial anterior (AT) de um camundongo de fundo genético C57BL/6J imobilizado e tratado com o veículo por 14 dias; - A Figura 1C é uma imagem que representa cortes histológicos coloridos com hematoxilina e eosina do músculo tibial anterior (AT) de um camundongo de fundo genético C57BL/6J imobilizado e tratado com o composto de fórmula (II) por 14 dias;

- A Figura 1D é um diagrama que representa a área das fibras musculares do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético

C57BL/6J não imobilizado (controle), imobilizado e tratado com o veículo por

14 dias ou imobilizado e tratado com um composto da fórmula (II) por 14 dias;

- A Figura 2A é um diagrama que representa o peso do músculo tibial anterior de grupos de camundongos de fundo genético C57BL/6J não imobilizados (controle), imobilizados e tratados com o veículo por 14 dias ou imobilizados e tratados com o composto de fórmula (II) por 14 dias;

- A Figura 2B é um diagrama que representa o peso do músculo gastrocnêmio de grupos de camundongos de fundo genético C57BL/6J não imobilizados (controle), imobilizados e tratados com o veículo por 14 dias ou imobilizados e tratados com o composto de fórmula (II) por 14 dias;

- A Figura 3A representa a força isométrica máxima absoluta do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J em vários momentos pós-imobilização: não imobilizado (J0), após 14 dias de imobilização (J14), após 14 dias de imobilização e 1 semana de remobilização

(J21) ou após 14 dias de imobilização e 2 semanas de remobilização (J28),

tratado com o veículo ou com o composto de fórmula (II);

- A Figura 3B representa a força isométrica máxima específica do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J em vários momentos pós-imobilização: não imobilizado (J0), após 14 dias de imobilização (J14), após 14 dias de imobilização e 1 semana de remobilização

(J21) ou após 14 dias de imobilização e 2 semanas de remobilização (J28), tratado com o veículo ou com o composto de fórmula (II);

- A Figura 4A é um diagrama que representa o peso do músculo tibial anterior de grupos de camundongos de fundo genético C57BL/6J não imobilizados (controle, medido em J0 em animais não imobilizados),

imobilizados e tratados com o veículo por 14 dias ou imobilizados e tratados com o composto BIO101 por 14 dias;

- A Figura 4B é um diagrama que representa o peso do músculo gastrocnêmio de grupos de camundongos de fundo genético C57BL/ 6J não imobilizados (controle), imobilizados e tratados com o veículo por 14 dias ou imobilizados e tratados com o composto BIO101 por 14 dias;

- A Figura 5A é um diagrama que representa a força isométrica máxima absoluta do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J não imobilizado (controle, medido em J0 em animais não imobilizados), imobilizado e tratado com o veículo por 7 dias ou imobilizado e tratado com o composto BIO101 por 7 dias;

- A Figura 5B é um diagrama que representa a força isométrica máxima específica do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J não imobilizado (controle, medido em J0 em animais não imobilizados), imobilizado e tratado com o veículo por 7 dias ou imobilizado e tratado com o composto BIO101 por 7 dias;

- A Figura 6A representa a força isométrica máxima absoluta do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J em vários momentos pós-imobilização: não imobilizado (J0), após 7 dias de imobilização (J7), após 14 dias de imobilização (J14), e após 14 dias de imobilização e depois 2 semanas de remobilização (J28), tratado com o veículo ou com o composto BIO101;

- A Figura 6B representa a força isométrica máxima específica do músculo tibial anterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J em vários momentos pós-imobilização: não imobilizado (J0), após 7 dias de imobilização (J7), após 14 dias de imobilização (J14), e após 14 dias de imobilização e depois 2 semanas de remobilização (J28), tratado com o veículo ou com o composto BIO101.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO MÉTODO PARA SINTETIZAR O COMPOSTO DE FÓRMULA (II)

[048] O composto de fórmula (II) ao qual é feita referência no resto da descrição é o seguinte:

O S HO HO OH O (II)

[049] O composto de fórmula (II) é obtido por semissíntese de 20-hidroxiecdisona e depois purificação para grau farmacêutico.

[050] O método para preparar o composto de fórmula (II) por semissíntese inclui, em particular: - uma etapa de corte de oxidação da cadeia lateral da 20- hidroxiecdisona entre os carbonos C20 e C22 a fim de obter pós-esterona, - uma etapa de introdução de um átomo de bromo na posição C21, e - uma etapa de reação do derivado de bromo com etanotiol.

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO COMPOSTO DE FÓRMULA (II)

[051] Um modelo de imobilização de uma pata posterior de um camundongo de fundo genético C57BL/6J foi implementado por meio de um tubo (Lang et al., 2012).

[052] Foram utilizados camundongos C57BL/6J fêmeas com 13 semanas de idade. Dez camundongos foram sacrificados em J0, esses camundongos não foram imobilizados para servir como controle.

[053] J0, J14, J21, J28 significa o tempo decorrido a partir do início do experimento, expresso em dias. Assim, J0 designa o início do experimento (antes do tratamento e antes da imobilização), J14 designa o 14º dia a partir do início do experimento etc.

[054] Dois grupos de camundongos foram formados, um grupo de teste e um grupo de referência. Cada grupo é exposto, oralmente, cronicamente ao veículo (grupo de referência) ou ao composto de fórmula (II) a uma dose de 50 mg/kg por dia (grupo de teste). O tratamento oral durante 28 dias consiste em alimentação por sonda durante cinco dias por semana e água potável durante dois dias por semana.

[055] Os animais de todos os grupos foram testados quanto à sua capacidade funcional in situ por meio de medições da força isométrica máxima absoluta e específica do músculo tibial anterior (AT) (Figuras 3A e 3B) após 14 dias de imobilização (n = 13 para o veículo, n = 10 para o composto de fórmula (II)), após 14 dias de imobilização e uma semana de remobilização (n = 7 para o veículo, n = 8 para o composto de fórmula (II)) e após 14 dias de imobilização e duas semanas de remobilização (n = 6 para o veículo, n = 8 para o composto de fórmula (II)).

HISTOLOGIA E ATROFIA DOS MÚSCULOS (FIGURA 1)

[056] Um estudo histológico do músculo tibial anterior é realizado em cortes coloridos com hematoxilina e eosina (HE). A área das fibras musculares é avaliada em músculos de camundongo de controle, ou tratada com o veículo ou com o composto de fórmula (II). O músculo em todos os casos apresenta histologia de tecido muscular saudável (Figuras 1A a C); por outro lado, como era de se esperar, após 14 dias de imobilização, a área média das fibras é muito reduzida nos animais que receberam o veículo em comparação com os animais controle (-24,4%, p = 0,006) que não foram imobilizados. A área das fibras musculares do grupo tratado com o composto de fórmula (II) também é reduzida em comparação com o grupo de controle (- 26,8%, p = 0,002).

[057] Nenhuma diferença significativa é, portanto, observada entre os grupos de animais tratados com o veículo e o grupo tratado com o composto de fórmula (II) (p = 0,73). Após 14 dias de imobilização, o composto de fórmula (II) não exerce nenhum efeito protetor contra a perda de volume muscular.

PESO DOS MÚSCULOS TIBIAL ANTERIOR (AT) E GASTROCNÊMIO (FIGURA 2)

[058] O peso dos músculos AT (Figura 2A) e músculos gastrocnêmios (Figura 2B) foram avaliados em camundongos não imobilizados (controle), e após 14 dias de imobilização em camundongos tratados com o veículo ou com o composto de fórmula (II), durante os 14 dias de imobilização.

[059] Como esperado, observa-se que a imobilização causa uma redução da massa muscular do AT e do gastrocnêmio em camundongos que receberam o veículo em comparação com o grupo controle (-34,9%, p < 0,001 e -29%, p < 0,001, respectivamente).

[060] Observa-se que o peso dos músculos AT e gastrocnêmio não varia significativamente no grupo de camundongos tratados com o composto de fórmula (II) em comparação com o veículo. Consistente com os resultados obtidos sobre o diâmetro das fibras musculares (Figura 1), o composto de fórmula (II), portanto, não exerce qualquer efeito protetor contra a perda de massa muscular após uma imobilização.

FORÇA ISOMÉTRICA MÁXIMA ABSOLUTA E ESPECÍFICA DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR (ESTUDO FUNCIONAL IN SITU (FIGURA 3))

[061] Uma avaliação da contratilidade in situ do músculo AT é realizada em diferentes momentos do protocolo: em camundongos controle não imobilizados (J0), em camundongos submetidos a uma imobilização da pata posterior por 14 dias (J14), imobilizados por 14 dias e então remobilizados por

1 semana (J21) e imobilizados por 14 dias e então remobilizados por 2 semanas (J28).

[062] No dia do sacrifício, o camundongo é anestesiado com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (55 mg/kg, 0,1 ml/10 g de peso corporal) antes de medir a força in situ do músculo tibial anterior (AT). A pele no topo da pata é incisada, revelando o tendão, que é cortado na extremidade distal do mesmo. O tendão distal do AT é preso à alavanca do servomotor (305B Dual-Mode Lever, Aurora Scientific). A pele na face lateral da coxa é incisada, o que revela o nervo ciático, entre dois grupos de músculos. O nervo ciático é estimulado com um eletrodo bipolar (pulso supramáximo com onda quadrada de 10 V, 0,1 ms). A força é medida durante as contrações em resposta à estimulação elétrica (frequência de 75-150 Hz, duração de 500 ms).

A temperatura do camundongo é mantida a 37 °C por meio de uma lâmpada radiante. A força isométrica máxima absoluta é medida (Figura 3A) e a força isométrica máxima específica (Figura 3B) é calculada comparando a força isométrica absoluta com o peso do músculo tibial anterior.

[063] Como esperado, verificou-se que os animais tratados com o veículo apresentam uma força de contração isométrica máxima absoluta significativamente menor do que a dos animais controle não imobilizados (- 65,6%, p < 0,001) (Figura 3A). Os animais tratados com o composto de fórmula (II) exibem uma menor perda de força absoluta (-26,9%, p = 0,015) em comparação com o controle, do que os animais tratados com o veículo.

[064] Surpreendentemente, observa-se que o tratamento com o composto de fórmula (II) permite que os animais imobilizados por 14 dias preservem uma força isométrica absoluta que é significativamente maior do que os animais tratados com o veículo e melhora seu desempenho (+112,1%, p = 0,0041). Isto apesar da ausência de qualquer efeito do composto de fórmula (II) na perda de massa e volume muscular observada anteriormente.

[065] Observa-se que os animais tratados com o veículo apresentam uma força de contração isométrica máxima específica (sP0; Figura 3B) significativamente menor que a dos animais controle não imobilizados (- 57,8%, p < 0,001). Notavelmente, a força específica dos animais tratados com o composto de fórmula (II) não é significativamente afetada pela imobilização: - 8% (p = 0,32) em comparação com os animais do grupo de controle que não foram imobilizados. O tratamento com o composto de fórmula (II) permite que os animais imobilizados por 14 dias preservem uma função muscular normal ao dobrar a força isométrica específica (+117,6%, p < 0,001) em comparação com os animais do grupo imobilizado, tratado com o veículo.

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO COMPOSTO BIO101

[066] Um segundo estudo foi realizado usando o mesmo método de imobilização das patas posteriores, em camundongos com a mesma idade (13 semanas) e o mesmo fundo genético (C57BL/6J) conforme descrito anteriormente, mas adicionando um ponto de análise após 7 dias de imobilização. Os pontos de análise são, portanto, J0, J7, J14 e J28.

[067] Dez camundongos foram sacrificados em J0, esses camundongos não foram imobilizados para servir de controle (grupo controle nas Figuras).

[068] J7, J14, J28 significa o tempo decorrido a partir do início do experimento, expresso em dias. Assim, J7 designa o 7º dia a partir do início do experimento etc.

[069] Dois grupos de camundongos foram formados, um grupo de teste e um grupo de referência. Cada grupo é exposto, por via oral, cronicamente ao veículo (grupo de referência) ou ao composto BIO101 a uma dose de 50 mg/kg por dia (grupo de teste). Composto BIO101 significa um extrato de planta, a referida planta sendo escolhida a partir de plantas contendo pelo menos 0,5% de 20-hidroxiecdisona em peso seco da referida planta, o referido extrato incluindo por meio de agente ativo 20-hidroxiecdisona em uma quantidade de pelo menos 95%, e de preferência pelo menos 97% em peso em relação ao peso total do extrato. O tratamento oral por 28 dias consiste em alimentação por sonda durante cinco dias por semana e administração em água potável durante dois dias por semana.

[070] Os animais de todos os grupos foram testados quanto à sua capacidade funcional in situ (as duas patas posteriores) por meio de medidas da força isométrica máxima absoluta e específica do músculo tibial anterior (AT) (Figuras 6A e 6B) após 7 dias de imobilização (n = 6 camundongos, dois valores por camundongo para o grupo de referência (veículo), n = 6 camundongos, dois valores por camundongo para o grupo de teste (BIO101), após 14 dias de imobilização seguida por duas semanas de remobilização (n = 6 por camundongo, dois valores por camundongo para o veículo (grupo de referência), n = 6 camundongos, dois valores por camundongo para o composto BIO101), e após 14 dias de imobilização seguido por duas semanas de remobilização (n = 6 por camundongo, dois valores por camundongo para o veículo (grupo de referência), n = 6 camundongos, dois valores por camundongo para o composto BIO101).

PESO DOS MÚSCULOS TIBIAL ANTERIOR (AT) E GASTROCNÊMIO (FIGURA 4)

[071] O peso dos músculos AT (Figura 4A) e gastrocnêmio (Figura 4B) foram avaliados em camundongos não imobilizados (grupo controle), e após 14 dias de imobilização em camundongos tratados pelo veículo ou pelo composto BIO101 ao longo da duração de imobilização. Como esperado, observa-se que a imobilização acarreta uma redução na massa muscular do AT (-21,7%, p < 0,001) em camundongos que receberam o veículo em comparação com um grupo de controle, não imobilizado (Figura 4A).

[072] Observa-se que o peso dos músculos AT e gastrocnêmio não varia significativamente no grupo de teste dos camundongos tratados com o composto BIO101 em comparação com o grupo de referência tratado com veículo (Figura 4A e 4B).

FORÇA ISOMÉTRICA MÁXIMA ABSOLUTA E ESPECÍFICA DO MÚSCULO TIBIAL ANTERIOR (ESTUDO FUNCIONAL IN SITU (FIGURAS 5 E 6))

[073] Uma avaliação da contratilidade in situ do músculo AT é feita em vários momentos do protocolo: em camundongos controle não imobilizados (grupo controle, J0), em camundongos submetidos à imobilização das patas posteriores por 7 dias (J7), 14 dias (J14), imobilizado por 14 dias e então remobilizado por 2 semanas (J28).

[074] Quando a força desenvolvida pelo músculo AT é considerada após sete dias de imobilização, como esperado, verifica-se que os animais tratados com o veículo (grupo de referência) têm uma força de contração isométrica máxima absoluta significativamente menor que a dos animais controle não imobilizados (-34,7%, p < 0,001) (Figura 5A). Os animais tratados com o composto BIO101 exibem uma perda de força absoluta que é menor (-21,1%, p = 0,001) em comparação com o controle, do que os animais tratados com o veículo (Figura 5A).

[075] Curiosamente, observa-se que o tratamento com o composto BIO101 permite que os animais imobilizados por 7 dias mantenham uma força isométrica máxima absoluta significativamente maior e melhora seu desempenho (+21%, p = 0,01) em comparação com os animais tratados com o veículo, e isto apesar da ausência de qualquer efeito do composto BIO101 na perda de massa.

[076] Observa-se que os animais tratados com o veículo apresentam uma força de contração isométrica máxima específica (sP0; Figura 5B) significativamente menor que a dos animais controle não imobilizados (- 13,2%, p < 0,01). Notavelmente, a força isométrica máxima específica dos animais tratados com o composto BIO101 não é significativamente afetada por

7 dias de imobilização: isso ocorre porque o tratamento com o composto BIO101 permite que os animais imobilizados por 7 dias mantenham uma função muscular normal em comparação com os animais do grupo imobilizado, tratados com o veículo (+24,3%, p < 0,001).

[077] No momento em que a imobilização é interrompida, em J14, os camundongos que recebem o tratamento BIO101 perderam apenas 22,4% (p < 0,001) da força isométrica máxima absoluta em comparação com os camundongos controle não imobilizados (J0), contra 34% (p < 0,001) para os camundongos que receberam o veículo. O tratamento com BIO101 limita a perda de força isométrica máxima absoluta (+17,5%, p < 0,05) em comparação com camundongos tratados com o veículo (Figura 6A).

[078] No que diz respeito à força isométrica máxima específica, os camundongos que receberam o tratamento com BIO101 não perdem nenhuma força 14 dias após a imobilização em comparação com os camundongos controle não imobilizados (+5%, 2,94 g/mg versus 2,80 g/mg, respectivamente, p = ns).

[079] Os camundongos tratados com o veículo, por sua vez, perdem 11,3% de sua força específica em comparação com os camundongos não imobilizados (p = 0,06).

[080] Após 14 dias de imobilização, o tratamento com BIO101 tende a limitar a perda de força máxima específica (+18,4%, ns) em comparação com camundongos tratados com o veículo (Figura 6B).

CONCLUSÃO

[081] Devido às propriedades das fitoecdisonas e seus derivados na função muscular de mamíferos submetidos à imobilização, o uso de fitoecdisonas e seus derivados pode, portanto, ser proposto para preservar a função muscular, em particular no que diz respeito à força muscular, e assim retardar a perda das funções musculares relacionadas com a imobilização.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. COMPOSIÇÃO caracterizada por incluir pelo menos uma fitoecdisona e pelo menos um derivado semissintético de uma fitoecdisona, para uso da mesma em mamíferos para prevenir a perda de força muscular durante a imobilização.

2. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender 20-hidroxiecdisona ou um derivado semissintético de 20-hidroxiecdisona.

3. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender um composto de fórmula geral (I): (I) em que: R1 é escolhido a partir de: um grupo (C1-C6)W(C1-C6); um grupo (C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6); um grupo (C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6); um grupo (C1-C6)A, A representando um heterociclo, opcionalmente substituído por um grupo escolhido a partir de OH, OMe, (C1-C6), N(C1-C6), CO2(C1-C6); um grupo CH2Br; W sendo um heteroátomo escolhido a partir de N, O e S, de preferência O e, ainda mais preferencialmente, S.

4. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por incluir um composto escolhido a partir dos seguintes compostos:

nº 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil- 17-(2-morfolinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-6-ona, nº 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(3- hidroxipirrolidin-1-il)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(4- hidroxi-1-piperidil)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2- hidroxietil)-1-piperidil]acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro- 1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-dimetilaminopropil (metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17- deca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; nº 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi- 10,13-dimetil-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-17-il]etil]sulfanilacetato de etila; nº 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-2,3,14- trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-deca-hidro-1H-ciclopenta[a] fenantren-6-ona; nº 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2- hidroxietilsulfanil)acetil]-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H ciclopenta[a]fenantren-6-ona.

5. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por incluir um composto de fórmula (II):

O

S

HO

HO OH O (II).

6. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser em uma forma incorporada em uma formulação farmaceuticamente aceitável adequada para administração oral.

7. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelas fitoecdisonas serem administradas em uma dose entre 50 e 1000 miligramas por dia em humanos.

8. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por ser administrada durante a imobilização.

9. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por ser administrada até o fim da imobilização.

10. COMPOSIÇÃO para uso da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizada por também ser administrada durante um período pré-determinado após o término da imobilização.