BR112020015821A2

BR112020015821A2 - Composições e métodos para induzir sinalização de proteína 16 contendo motivo tripartido

Info

Publication number: BR112020015821A2
Application number: BR112020015821-6A
Authority: BR
Inventors: Michael J. Gale Jr.
Original assignee: University Of Washington
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2021-03-09
Also published as: EP3746088A4; CN111836623A; KR20200116976A; JP2021512123A; US20210046168A1; AU2019215191A1; RU2020128838A; EP3746088A1; JP7409612B2; WO2019152884A1

Abstract

composições e métodos para induzir sinalização de proteína 16 contendo motivo tripartido. a revelação provê composições e métodos para induzir atividade de proteína 16 contendo motivo tripartido em uma célula. esta atividade pode se manifestar em morte celular programada em células de câncer. as composições compreendem molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (pamp). a molécula contendo pamp pode compreender uma região do braço 5 compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poliuracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3 compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico, em que a maior parte do resíduo de ácido nucleio em 5 da região do braço 3 não é uma uracila e em que a região do braço 3 é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila. as composições podem ser combinadas com ou usadas em combinação com outros agentes terapêuticos contra câncer, incluindo em combinação com agentes imunoterapêuticos adicionais.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA INDUZIR SINALIZAÇÃO DE PROTEÍNA 16 CONTENDO MOTIVO TRIPARTIDO

REFERÊNCIA CRUZADA DA PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório US No. 62/625623, depositado em 2 de fevereiro de 2018, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] A listagem de sequências associada com este pedido é apresentada em formato de texto em vez de cópia em papel, sendo aqui incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto contendo a listagem de sequência é 68142_Seq_final_2019-01-31.txt. O arquivo de texto tem 29 KB; ele foi criado em 31 de janeiro de 2019; e está sendo submetido via EFS-Web com o depósito do relatório descritivo.

DECLARAÇÃO DE DIREITOS DE LICENÇA DO GOVERNO

[0003] A invenção foi realizada com apoio governamental sob a Subvenção No. R01 AI118916, concedida pelo National Institutes de Health (NIH). O Governo possui determinados direitos na invenção.

FUNDAMENTOS

[0004] Cânceres são caracterizados pela perda, por uma célula, da capacidade de controlar o ciclo celular, resultando em crescimento celular anormal e descontrolado. As células transformadas perdem, com frequência, a capacidade de regular sua divisão e crescimento, bem como de responder aos sinais típicos que induzem morte celular programada (PCD) em células saudáveis. Estratégias tradicionais para tratar cânceres incluem cirurgia para remover tecidos cancerosos (por exemplo, tumores) e administração de composições tóxicas que afetam predominantemente as células de câncer no corpo. Grandes avanços foram alcançados no desenvolvimento de imunoterapêuticos que aproveitam as composições e/ou vias de sinalização do sistema imune do indivíduo para atacar as células de câncer. Tais abordagens terapêuticas incluem, por exemplo, administração de anticorpos específicos de câncer contendo cargas úteis tóxicas, administração de inibidores de ponto de controle que impedem as células de câncer de bloquear ou evitar respostas do hospedeiro contra as células de câncer e terapias de células adotivas, incluindo abordagens CAR T que usam células imunes alteradas para especificamente iniciar e direcionar respostas imunes do hospedeiro para as células de câncer.

[0005] No entanto, apesar dos muitos avanços nas terapias anticâncer, questões permanecem relacionadas aos efeitos colaterais tóxicos, resistência das células de câncer, recorrência da doença e ausência de abordabilidade e acessibilidade de muitos tratamentos. Consequentemente, permanece a necessidade para tratamentos para câncer que promovam a morte das células com toxicidade mínima fora do sítio. Além disso, para garantir acessibilidade aos cuidados de saúde e redução dos custos de atendimento, permanece a necessidade para tratamentos que possam ser amplamente aplicados a muitos tipos de cânceres e não precisem de personalização caso a caso. A presente exposição se dirige a essas e a necessidades relacionadas.

SUMÁRIO

[0006] Este sumário é dado para apresentar uma seleção de conceitos em uma forma simplificada, os quais são descritos adicionalmente abaixo na Descrição Detalhada. Este sumário não se destina a identificar as principais características da matéria reivindicada, nem se destina a ser usado como um auxílio na determinação do escopo da matéria reivindicada.

[0007] Em um aspecto, a exposição prevê um método de induzir atividade de proteína contendo motivo tripartite 16 (TRIM16) em uma célula. O método compreende contatar a célula com uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP). A molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende: uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poli-uracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico. O resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila.

[0008] Em algumas modalidades, o núcleo poli-uracila consiste em entre 8 e 30 resíduos de uracila. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ é um resíduo de citosina ou um resíduo de guanina. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ é pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de resíduos de uracila. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ compreende pelo menos 7 resíduos de uracila contíguos. Em algumas modalidades, a região do braço 5’ compreende adicionalmente um ou mais resíduos de ácido nucleico dispostos entre o trifosfato terminal e o núcleo poli-uracila. Em algumas modalidades, a região do braço 5’ consiste no trifosfato terminal, e em que o trifosfato terminal é ligado diretamente à extremidade 5' do núcleo poli-uracila. Em algumas modalidades, o trifosfato terminal, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’, e o núcleo poli-uracila não ocorrem naturalmente juntos em um vírus de Hepatite C.

[0009] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP induz interação do receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I) com TRIM16 na célula. Em algumas modalidades, a interação de RLR com TRIM16 induz sinalização de morte celular na célula. Em algumas modalidades, o RLR é RIG-I.

[0010] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente contatar a célula com interferon (IFN). Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente contatar a célula com um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor é capaz de induzir expressão de TRIM16 codificada na célula. Em algumas modalidades, a TRIM16 codificada tem uma sequência de aminoácido de pelo menos 90% identidade com a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:1.

[0011] Em algumas modalidades, atividade de TRIM16 compreende indução de morte celular programada.

[0012] Em algumas modalidades, a célula é uma célula de câncer. Em algumas modalidades, a célula de câncer é uma célula de câncer de tumor sólido. Em algumas modalidades, a célula de câncer é uma célula de câncer de tumor sólido selecionado dentre câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer hepatocelular, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer cervical, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, câncer do sistema nervoso central, tumores cerebrais, câncer ósseo e sarcoma de tecidos moles. Em algumas modalidades, a célula de câncer é uma célula de câncer hematológico.

[0013] Em algumas modalidades, a célula é contatada com a quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico contendo PAMP in vitro. Em algumas modalidades, a célula é contatada com a quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico contendo PAMP in vivo em um indivíduo mamífero. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma imunoterapia para o câncer. Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia de células CAR T. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.

[0014] Em outro aspecto, a exposição prevê um método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo. O método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP). A molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende: uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poli-uracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico. O resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila.

[0015] Em algumas modalidades, o núcleo poli-uracila consiste em entre 8 e 30 resíduos de uracila. Em algumas modalidades, o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ é um resíduo de citosina ou um resíduo de guanina. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ é pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de resíduos de uracila. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ compreende pelo menos 7 resíduos de uracila contíguos. Em algumas modalidades, a região do braço 5’ compreende adicionalmente um ou mais resíduos de ácido nucleico dispostos entre o trifosfato terminal e o núcleo poli-uracila. Em algumas modalidades, a região do braço 5’ consiste no trifosfato terminal, e em que o trifosfato terminal é ligado diretamente à extremidade 5' do núcleo poli-uracila. Em algumas modalidades, o trifosfato terminal, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’ e o núcleo poli-uracila não ocorrem naturalmente juntos em um vírus de Hepatite C.

[0016] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP induz interação do receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I) com TRIM16 em uma célula de câncer no indivíduo. Em algumas modalidades, a interação de RLR com TRIM16 induz sinalização de morte celular na célula de câncer. Em algumas modalidades, o RLR é RIG-I.

[0017] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar uma quantidade eficaz de interferon (IFN) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor é capaz de induzir expressão da TRIM16 codificada em uma célula de câncer dentro do indivíduo.

[0018] Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de tumor sólido selecionado dentre câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer hepatocelular, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer cervical, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, câncer do sistema nervoso central, tumores cerebrais, câncer ósseo e sarcoma de tecidos moles. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico.

[0019] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma imunoterapia para o câncer. Em algumas modalidades, a imunoterapia compreende anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia de células CAR T. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.

[0020] Em outro aspecto, a exposição prevê uma composição terapêutica compreendendo uma combinação de molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) descrita aqui e interferon (IFN). Em algumas modalidades, o IFN é IFN tipo 1. Em algumas modalidades, o IFN é IFN peguilado. Em algumas modalidades, o IFN é IFN lambda. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente um ácido nucleico codificando

TRIM16 operativamente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, a composição é formulada em um lipossoma.

[0021] Em outro aspecto, a exposição prevê uma composição terapêutica compreendendo uma combinação de molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) descrita aqui e um ácido nucleico codificando TRIM16 operativamente ligado a um promotor. Em algumas modalidades, a composição compreende adicionalmente interferon (IFN). Em algumas modalidades, o IFN é IFN tipo 1. Em algumas modalidades, o IFN é IFN peguilado. Em algumas modalidades, a composição é formulada em um lipossoma.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] Os aspectos acima e muitas das vantagens associadas desta invenção serão mais facilmente apreciados à medida que os mesmos forem melhor compreendidos por referência à seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunto com os desenhos em anexo, em que:

[0023] FIGURAS 1A-1D ilustram que PAMP RNA induz sinalização imune inata e atividade de caspase em um modo dependente de dose, mas em diferentes faixas de dose. FIGURA 1A é um western blot mostrando ativação dependente de dose de sinalização imune inata em células de carcinoma hepatocelular humano (Huh7) em todas as doses de PAMP RNA de HCV, e uma indução de apoptose dependente de dose. FIGURA 1B ilustra graficamente a análise de morte celular que revela uma indução de morte celular correspondendo à atividade de ativação de caspase. O gráfico em barras mostra a porcentagem de morte celular após 20h. FIGURA 1C é um western blot revelando um limiar diferencial para ativação induzida por

PAMP RNA de sinalização imune inata e ativação de caspase. FIGURA 1D ilustra graficamente análise de morte celular que revela um aumento dependente de dose em indução de morte celular até um limiar de 200ng. Gráfico em barras mostra a porcentagem de morte celular após 20h.

[0024] FIGURAS 2A-2C ilustram que indução de apoptose de PAMP RNA de HCV é dependente de RIG-I e ativada através da via dependente de caspase clássica. FIGURA 2A graficamente ilustra que nocaute de RIG-I resgata a indução de apoptose por PAMP RNA de HCV (FIGURA 2A-1). Apoptose é induzida por ativação de caspase dependente de RIG-I e apoptose é anulada por tratamento com zVAD, um composto inibidor de pan-caspase (FIGURA 2A-2). Comparado com simulação,* P < 0,05 e **** P < 0,0001. FIGURA 2B é um Western blot que ilustra que tratamento com zVAD resgata apoptose induzida por PAMP RNA de HCV, mas não altera sua ativação da resposta imune inata. FIGURA 2C graficamente ilustra que a ausência de RIG-I anula a ativação transcripcional dos genes pro-apoptóticos p53-dependentes NOXA e PUMA em resposta a PAMP RNA de HCV.

[0025] FIGURAS 3A-3C ilustram que a via de IFN tipo I desempenha um papel na indução de apoptose mediada por RIG- I. FIGURA 3A graficamente ilustra que abate da cadeia de receptor de IFN tipo I, IFNAR1, parcialmente anula indução de apoptose mediada por RIG-I. FIGURA 3B é um western blot que mostra a indução da resposta imune inata é prejudicada em ambas as células KO IFNAR e RIG-I. FIGURA 3C ilustra que o bloqueio da sinalização de IFN tipo I com B18R, um inibidor proteína purificado de sinalização de IFNAR que é codificada por vírus vaccínia, leva a um prejuízo de indução de apoptose mediada por RIG-I (esquerda). Um western blot revela o bloqueio de sinalização de IFN tipo I por B18R (direita). Comparado com Huh7 + PAMP,* P < 0,05.

[0026] FIGURAS 4A-4E ilustram que TRIM16 é um novo interator de RIG-I. FIGURA 4A esquematicamente ilustra que o trabalho se dirige para identificar proteínas para se ligar a RIG-I após ativação por vírus Sendai. FIGURA 4B mostra um Western blot que ilustra que o N-terminal de RIG-I é necessário para ligação a TRIM16. FIGURA 4C mostra um Western blot que ilustra que os domínios CARD de RIG-I são necessários e suficientes para ligação a TRIM16. FIGURA 4D mostra um Western blot que ilustra que os domínios N- terminais B-Box de TRIM16 são necessários e suficientes para ligação a RIG-I. * denota bandas não específicas. FIGURA 4B é um desenho mostrando um resumo da interação entre RIG-I e TRIM16.

[0027] FIGURAS 5A-5D ilustram que TRIM16 não está envolvida na resposta imune inata do hospedeiro. FIGURA 5A mostra um Western blot que ilustra que nocaute de TRIM16 não tem um efeito sobre a resposta imune inata mediada por PAMP. FIGURA 5B é um Western blot que ilustra que, em contraste, nocaute de TRIM25 anula resposta imune inata mediada por PAMP; o conjunto do painel à esquerda mostra um western blot onde as células de controle (EV) respondem a PAMP, mas as células KO TRM25 não respondem a PAMP. FIGURA 5B, painéis à direita, mostram gráficos apresentando a perda de sinalização de PAMP em células KO TRIM25. FIGURA 5C é um western blot que ilustra que TRIM16 não tem papel em resposta imune inata mediada por RIG-I induzida por N-RIG constitutivamente ativo. FIGURA 5D graficamente ilustra que

TRIM16 não tem papel sobre a resposta imune inata induzida por vírus Sendai.

[0028] FIGURAS 6A e 6B ilustram que TRIM16, mas não TRIM25, está envolvida em indução de apoptose mediada por RIG-I. FIGURA 6A ilustra que nocaute de TRIM16 prejudica a indução de apoptose por PAMP RNA de HCV. Comparado a EV + PAMP,* P < 0,05. Em contraste, FIGURA 6B ilustra que nocaute de TRIM25 não tem um efeito significante sobre a indução de apoptose.

[0029] FIGURAS 7A e 7B ilustram que tratamento com PAMP RNA induz destruição oncolítica de células de carcinoma hepatocelular HepG2 (FIGURA 7A) e Huh7 (FIGURA 7B), mas não tem efeito sobre os hepatócitos primários (FIGURA 7B). As células foram tratadas com a quantidade indicada de PAMP RNA ou xRNA (controle negativo) e monitoradas para captação de corante verde Sytox marcando as células permeáveis/morrendo ou mortas. Dados são mostrados em gráfico como o número de células mortas durante um curso de tempo de 20 h. Tratamento com PAMP especificamente induz a destruição oncolítica de células de tumor (células HepG2 e Huh7 são células derivadas de carcinoma humano), mas não células normais, não cancerosas (hepatócitos humanos primários).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0030] A presente exposição é baseada em pesquisas que revelaram que a indução de uma sinalização de receptor semelhante a RIG-1 (RLR) não somente pode resultar no desencadeamento de respostas imunes inatas, mas pode seletivamente induzir a apoptose em células de câncer. Esse trabalho apresenta uma nova estratégia terapêutica para combater câncer.

[0031] Imunidade inata é a primeira linha de defesa do corpo contra infecções. A resposta imune inata também é essencial para programar imunidade adaptativa eficaz e memória imune para uma resposta imune forte e durável, crítica para a eliminação de patógenos causadores de doenças. Um componente chave da resposta imune inata contra infecções virais é a ativação do fator regulador de interferon (IRF)3 e a indução do interferon tipo 1 (IFN). IRF3 induz a expressão de genes antivirais e também induz IFN. Os genes antivirais podem suprimir replicação do vírus na célula infectada, enquanto IFN direciona a supressão da replicação do vírus tanto na célula infectada como nas células ‘espectadoras’ vizinhas através da expressão de centenas de genes estimulados por interferon (ISGs) que têm atividades antivirais e imunomodulatórias. Além da supressão por IFN de infecções virais, morte programada de células infectadas por vírus pode servir para evitar a disseminação viral. Assim, a combinação de ações de IRF3, ações de IFN e sinalização de morte celular conferem um programa sinergístico de controle de vírus através de mecanismos ainda indefinidos. Essa exposição é baseada em uma investigação para determinar a interação entre IFN e sinalização de morte celular. Esses esforços estabeleceram que uma ligação entre as respostas de IFN e morte celular pode ser aproveitada para estratégias terapêuticas de modo a controlar o crescimento do tumor.

[0032] A indução da ativação de IRF e IFN é desencadeada no início da infecção viral pelo reconhecimento de padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) por receptores de reconhecimento de padrões celulares (PRRs), incluindo receptores semelhantes a Toll (TLR)s, receptores semelhantes a RIG-I (RLR)s, receptores semelhantes a Nod (NLR)s ou Sintase GMP-AMP cíclica (cGAS)/Estimulador de Genes de Interferon (STING). PRRs detectam PAMPs virais ou produtos de PAMP para desencadear cascatas de sinalização intracelular que, finalmente, ativam mecanismos de transcrição via o fator regulador de interferon (IRF)3/7 e Fator Nuclear Kappa B (NF-κB) para dirigir a ativação imune inata.

Em particular, vírus de RNA são detectados em grande parte através das ações de RLRs, que são helicases de RNA citossólicas que reconhecem e se ligam a motivos de PAMP RNA.

RIG-I é o membro fundador da família RLR, que também inclui MDA5 e LGP2. RIG-I reconhece RNA contendo trifosfatos 5’ (5'ppp) e motivos de estrutura de dsRNA curtos e/ou motivos de poli-uridina que marcam uma molécula de RNA como ‘não própria’. A estrutura da proteína RIG-I tem um domínio de helicase DExH-box centralmente localizado, dois domínios de recrutamento de caspase (CARDs) localizados no N-término e um domínio repressor C-terminal que regula a sinalização mantendo a molécula em um estado fechado, de sinalização desligada, até que a ligação do ligando leve à sua conformação alterada de um estado de sinalização ligado que aciona as defesas antivirais.

Um motivo PAMP foi previamente caracterizado para reconhecimento de RIG-I e ligação dentro do RNA do vírus da Hepatite C (HCV), que é marcado por poli- uridina e estrutura de RNA fita simples.

Quando formulado para entrega celular, uma modificação sintética deste motivo contendo 5'ppp (denominado PAMP-RNA) é um agonista de RIG-I potente e específico que é ligado por RIG-I para induzir a sinalização de RIG-I.

PAMP-RNA dirige as ações imunes inatas mediadas por RIG-I que proporcionam atividade antiviral e intensificadora da imunidade para controlar a infecção por vírus.

[0033] Quando do reconhecimento e ligação de PAMP-RNA, RIG-I sofre uma mudança de conformação que facilita sua interação com co-fatores de sinalização que conferem ligação de RIG-I à proteína de sinalização antiviral de mitocôndrias (MAVS) para ativação a jusante de fatores latentes de transcrição, incluindo IRF3, IRF7, e fatores de transcrição NF-κB, causando sua translocação ao núcleo e indução por programas transcripcionais. A via de sinalização de RIG-I é modulada por uma variedade de padrões de interação de MAVS ou RIG-I incluindo TRAF3, TRAF2, TRAF6, TANK, SIKE, NEMO/IKK, FADD, RIP1, HDAC6, TRADD, caspase 8/10, e STING/MITA/MPYS, assim como reguladores de sinalização negativa, tal como RNF125, ISG15, DAK, Atg12-Atg5, NLRX1, caspase-1, e várias enzimas de desubiquitinação, enzimas de acetilação, proteína quinases, e proteína fosfatases. Estudos também demonstraram que a sinalização RIG-I é também governada através de ubiquitinação de RIG-I ou interação com ubiquitina livre, e através de fosforilação e acetilação reversíveis.

[0034] A família de Motivos Tripartites (TRIM) de proteínas é composta por mais de 70 membros da família com atividade de ubiquitina ligase E3 e diversas funções biológicas, incluindo papéis em imunidade antiviral, autoimunidade e câncer. Os membros da família TRIM têm compartilhado sequências conservadas que incluem um domínio de gene (RING) que reconhece a enzima de conjugação E2, pelo menos um domínio B-Box que media a auto-associação em alguns membros, e um domínio de espira espiralada (EE) que é essencial para a dimerização de TRIM. Membros têm um domínio C-terminal variável que pode mediar interações específicas dos substratos. Muitos membros da família TRIM são conhecidos para regular as vias de sinalização TLR e RLR. O membro TRIM25 da família regula a sinalização RIG-I por K63- poliubiquitinação de RIG-I quando um domínio CARD de RIG-I exposto é ligado pelo domínio SPRY C-terminal de TRIM25. A poliubiquitinação de RIG-I promove sua interação com MAVS e subsequente sinalização a jusante, assim atribuindo TRIM25 como um co-fator crítico de ativação imune inata de RIG-I. A interação de RIG-I com outros membros da família TRIM não foi caracterizada.

[0035] Estudos anteriores mostraram que a ativação de RIG-I pode induzir a morte celular por vários mecanismos. Sinalização de RLR pode desencadear a morte celular programada via indução de Puma e Noxa, membros da família Bcl-2, que são reguladores apoptóticos essenciais. Outra série de estudos descreveu a via de apoptose mediada por IRF3 induzida por RLR (RIPA), que requer ativação de IRF3 pela via de sinalização de RLR, que se liga à proteína pró- apoptótica BAX e induz a mesma a translocar para a mitocôndria e desencadear a liberação de citocromo C e consequente ativação da caspase. De modo interessante, RIPA é independente da atividade transcripcional de IRF3 e dependente da ubiquitinação de IRF3 após o recrutamento para o complexo ubiquitinante LUBAC por um mecanismo dependente de TRAF2 e TRAF6. Ativação de RIG-I também pode desencadear a piroptose induzida por inflamassoma pela interação do domínio CARD de RIG-I com os componentes do inflamassoma para ativar caspase-1 e liberação de citocinas pró-

inflamatórias IL-1β e IL-18. Assim, embora seja claro que reconhecimento por PAMP de RIG-I possa desencadear morte celular programada, os mecanismos determinando se a ativação de RIG-I leva à sinalização imune inata versus morte celular não são atualmente compreendidos.

[0036] Como descrito em maiores detalhes abaixo, este trabalho abordou a capacidade de PAMP-RNA de induzir morte celular dentro de um estudo sistemático de sinalização de morte celular-RIG-I, a fim de definir os determinantes moleculares responsáveis pela morte celular induzida por RIG-I. Estudos de titulação de dose de PAMP-RNA definiram uma dose limiar para desencadear morte celular induzida por RIG-I versus ativação imune inata. RNA-PAMP induziu morte celular através da sinalização dependente de RIG-I e caspase que foi intensificada pelo tratamento com IFN. Usando uma triagem de base proteômica, um novo parceiro de ligação de RIG-I, TRIM16, foi identificado que é essencial para PAMP- RNA e morte celular induzida por RIG-I. Adicionalmente, TRIM16 foi demonstrado se ligar a CARDs RIG-I para dirigir a sinalização de morte celular em resposta a PAMP-RNA. Assim, TRIM16 é demonstrada como sendo um co-fator de sinalização de RIG-I que define uma nova via de morte celular sensível a PAMP. Isso é aproveitado para demonstrar que a sinalização de RLR é um novo alvo terapêutico para induzir morte celular especificamente em células de câncer.

[0037] De acordo com o acima, em um aspecto, a presente exposição prevê um método de induzir atividade de proteína contendo motivo tripartite 16 (TRIM16) em uma célula. Em algumas modalidades, a atividade de TRIM16 é induzida por contato da célula com uma quantidade eficaz de um ativador de receptor semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I). Em algumas modalidades, o ativador de RLR é uma molécula de ácido nucleico contendo um padrão molecular associado a patógeno (PAMP). Assim, em tais modalidades, o método compreende contatar a célula com uma quantidade eficaz de molécula de ácido nucleico contendo PAMP. A molécula de ácido nucleico contendo PAMP pode ser também geralmente mencionada aqui com um ácido nucleico PAMP. Como usado aqui, um PAMP é um padrão molecular associado a patógeno, isto é, um padrão na estrutura/sequência de uma molécula de ácido nucleico, que é reconhecido por RLR resultando na ativação do RLR em uma célula. Em algumas modalidades, o RLR é RIG-I. PAMPs e moléculas de ácido nucleico contendo PAMPs exemplares, englobados pela presente exposição, são divulgados em Publicações US Nos. 2015/0017207 e 2018/0104325, que se dirigem à indução por PAMP de sinalização de resposta imune inata e são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Elementos e modalidades exemplares do ácido nucleico contendo PAMP englobados pela exposição são aqui dirigidos.

[0038] Como uma questão preliminar, usada aqui, o termo "ácido nucleico" refere-se a um polímero de unidades de monômeros ou "resíduos". As subunidades de monômero, ou resíduos, dos ácidos nucleicos contêm, cada, uma base nitrogenosa (isto é, nucleobase) um açúcar de cinco carbonos, e um grupo fosfato. A identidade de cada resíduo é tipicamente indicada aqui com referência à identidade da estrutura de nucleobase (ou base nitrogenosa) de cada resíduo. As nucleobases canônicas incluem adenina (A), guanina (G), timina (T), uracil (U) (em RNA em vez de resíduos de timina (T)) e citosina (C). No entanto, os ácidos nucleicos da presente exposição podem incluir qualquer nucleobase modificada, análogos de nucleobases, e/ou nucleobase não canônica, como são bem conhecidos na arte. Modificações em monômeros de ácido nucleico, ou resíduos, englobam qualquer mudança química na estrutura do monômero de ácido nucleico, ou resíduo, que resulta em uma estrutura de subunidade não canônica. Tais mudanças químicas podem resultar de, por exemplo, modificações epigenéticas (tal como a RNA ou DNA genômico), ou dano resultante de radiação, produção químico ou outro meio. Os exemplos ilustrativos e não limitativos de subunidades não canônicas, que podem resultar de uma modificação, incluem uracila (para DNA), 5- metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formetilcitosina, 5-carboxicitosina b-glucosil-5-hidroxi-metilcitosina, 8- oxoguanina, 2-amino-adenosina, 2-amino-deoxiadenosina, 2-tiotimidina, pirrolo-pirimidina, 2-tiocitidina, ou uma lesão abásica. Uma lesão abásica é um local ao longo da espinha dorsal de deoxirribose, mas faltando uma base. Análogos conhecidos de nucleotídeos naturais hibridizam em ácidos nucleicos em um modo similar a nucleotídeos naturalmente ocorrendo, tal como peptídeos ácidos nucleicos (PNAs) e fosforotioato DNA.

[0039] O açúcar de cinco carbonos ao qual as nucleobases são fixadas pode variar dependendo do tipo de ácido nucleico. Por exemplo, o açúcar é deoxiribose em DNA e é ribose em RNA. Em alguns casos aqui, os resíduos de ácido nucleico podem ser também mencionados com relação à estrutura de nucleosídeo, tal como adenosina, guanosina, 5-metiluridina, uridina e citidina. Além disso, a nomenclatura alternativa para o nucleosídeo também inclui indicar um prefixo "ribo" ou deoxirrobo" antes da nucleobase para deduzir o tipo de açúcar de cinco carbonos. Por exemplo, "ribocitosina" como ocasionalmente usado aqui, é equivalente a um resíduo citidina porque ele indica a presença de um açúcar ribose na molécula de RNA nesse resíduo. O polímero de ácido nucleico pode ser ou compreender um polímero de deoxirribonucleotídeo (DNA), um polímero de ribonucleotídeo (RNA), incluindo mRNA. Os ácidos nucleicos também podem ser ou compreender um polímero de PNA, ou uma combinação de qualquer um dos tipos de polímeros descritos aqui (por exemplo, contém resíduos com diferentes açúcares).

[0040] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contendo PAMP é sintético. Nesse contexto, o termo "sintético" refere-se ao caráter não natural do ácido nucleico. Tais ácidos nucleicos podem ser sintetizados de novo usando técnicas de síntese padrão. Alternativamente, os PAMPs de ácidos nucleicos podem ser gerados ou derivados de sequências de patógenos ocorrendo naturalmente usando tecnologias recombinantes, que são bem conhecidas na arte. Em algumas modalidades, a sequência do construto sintético PAMP - ácido nucleico não está ocorrendo naturalmente.

[0041] Em algumas modalidades, o ácido nucleico contendo PAMP é um construto de RNA. Em algumas dessas modalidades, o ácido nucleico contendo PAMP é derivado da, ou reflete a sequência de, região poli-U/UC de HCV e, nesse contexto, pode ser geralmente referido como o construto PAMP RNA poli-U/UC. Em algumas modalidades, o construto PAMP RNA poli-U/UC é sintético.

[0042] O ácido nucleico contendo PAMP dessa exposição geralmente compreende (a) uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal; (b) um núcleo de poli- uracila (também referido como um núcleo poli-U); e (c) uma região do braço 3’. Em uma modalidade, as três regiões (a, b, e c) são covalentemente ligadas em uma macromolécula de polímero de ácido nucleico único. A ligação covalente pode ser direta (sem sequência(s) de ligador interdispersa(s)) ou indireta (com sequência(s) de ligador interdispersa(s)). Em uma modalidade, a região do braço 5’ é covalentemente ligada à extremidade 5' do núcleo poli-U. Em uma modalidade, a região do braço 3’ é covalentemente ligada à região do braço 3’ do núcleo poli-U. O polímero pode ser de fita simples ou fita dupla, ou pode aparecer com uma combinação de porções de fita simples ou fita dupla.

[0043] Em uma modalidade, o núcleo poli-U compreende pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos. Em modalidades adicionais, ele compreende entre 8 e 30 resíduos de uracila contíguos, tal como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 resíduos de uracila contíguos. Em uma modalidade, o núcleo poli-U compreende mais do que 8 resíduos de uracila contíguos. Em uma modalidade, o núcleo poli-U compreende 12 ou mais resíduos de uracila contíguos. Em algumas modalidades, o núcleo poli-U consiste em uma pluralidade de resíduos de uracila contíguos, tal como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 resíduos de uracila contíguos.

[0044] Em uma modalidade, a região do braço 3’ compreende um resíduo o mais em 5’ de ácido nucleico que não é um resíduo uracila. Ao contrário, o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ pode ser um resíduo de adenina, guanina ou citosina, ou qualquer resíduo não canônico. Em uma modalidade, o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ é um resíduo de citosina ou um resíduo de guanina.

[0045] Em uma modalidade, a composição de nucleotídeo da região do braço 3’ é pelo menos cerca de 40% dos resíduos de uracila. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ é pelo menos cerca de 45%, é pelo menos cerca de 50%, é pelo menos cerca de 60%, é pelo menos cerca de 70%, é pelo menos cerca de 80%, ou é pelo menos cerca de 90% dos resíduos de uracila. Em uma modalidade, a região do braço 3’ compreende uma pluralidade de trechos curtos (por exemplo, entre cerca de 2 e cerca de 15 nucleotídeos de comprimento) de resíduos de uracila contíguos com um ou mais resíduos de citosina interdispersos entre os mesmos. Em uma modalidade, a região do braço 3’ compreende um trecho de resíduos consecutivos de uracila que não excede o comprimento do núcleo poli-U da molécula de ácido nucleico contendo PAMP sintético. Em uma modalidade, a região do braço 3’ não compreende um trecho de resíduos consecutivos de uracila que excede o comprimento do núcleo poli-U da molécula de ácido nucleico contendo PAMP sintético. Em algumas modalidades, a região do braço 3’ compreende pelo menos 7 resíduos consecutivos de uracila, tal como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ou 29, resíduos de uracila contíguos.

[0046] Em um mínimo, a região do braço 5’ consiste em uma porção de tri-fosfato terminal (ppp). Em tal modalidade, o trifosfato está no 5'-término da molécula de ácido nucleico contendo PAMP sintético e pode ser representado como "5'-ppp". Em uma modalidade adicional, o trifosfato terminal é ligado diretamente à extremidade 5' da sequência de núcleo poli-U.

Em uma modalidade alternativa, a região do braço 5’ compreende o trifosfato terminal de extremidade 5' e um ou mais resíduos de ácido nucleico adicionais, cuja sequência termina com uma extremidade 3'. O um ou mais resíduos adicionais de ácido nucleico na região do braço 5’ desta modalidade são dispostos entre o trifosfato terminal e o resíduo de uracila o mais em 5’ do núcleo poli-U.

Pessoas versadas na técnica irão apreciar prontamente que o um ou mais resíduos adicionais de ácido nucleico na região do braço 5’ pode ser qualquer número de resíduos de ácido nucleico e pode apresentar qualquer sequência sem limitação.

A sequência do um ou mais resíduos adicionais de ácido nucleico na região do braço 5’ não afeta a funcionalidade da molécula de ácido nucleico contendo PAMP.

Por exemplo, como descrito em Publicações US Nos. 2015/0017207 e 2018/0104325, a adição de uma região de núcleo poli-U para um ácido nucleico não estimulatório que contém um 5'-trifosfato (tal como a região X de HCV) confere propriedades estimulatórias para a sinalização de sistema imune inato.

Em uma modalidade, a sequência do um ou mais resíduos adicionais de ácido nucleico na região do braço 5’ não consiste da porção completa de extremidade 5’ de uma sequência do genoma de HCV naturalmente ocorrendo HCV que naturalmente ocorre "a montante" ou 5' para o núcleo poli-U da região poli-U/UC para esta cepa de HCV.

Em termos diferentes, nesta modalidade, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP sintético completa não é um genoma de HCV naturalmente ocorrendo, completa com o trifosfato 5', a região codificante completa, e a região 3' poli-U/UC não traduzida. Consequentemente, nessa modalidade, a região do braço 5’, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’, e o núcleo de poli-uracila não ocorrem naturalmente juntos em um genoma de HCV. No entanto, nessa modalidade, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’ pode compreender ou consistir em um subfragmento da sequência completa naturalmente ocorrendo que existe entre a região do braço 5’ e o núcleo de poli-uracila. Alternativamente, nessa modalidade, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’ pode compreender sequência além de uma porção ou a sequência de genoma de HCV naturalmente ocorrendo que existe entre a extremidade 5' e o núcleo de poli-uracila.

[0047] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende adicionalmente um domínio de ácido nucleico adicional que codifica um produto de gene funcional, tal como um polipeptídeo ou construto de RNA interferente. O domínio de ácido nucleico adicional pode ser parte do domínio do braço 3’, como o todo ou parte de um ou mais resíduos adicionais de ácido nucleico no mesmo. Em outra modalidade, o domínio de ácido nucleico adicional pode estar disposto entre qualquer um da região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, o núcleo de poli- uracila, e a região do braço 3’.

[0048] Exemplos não limitativos de sequências de ácido nucleico de PAMPs englobados pelos ácidos nucleicos contendo PAMP divulgados são divulgados em Publicações US Nos. 2015/0017207 e 2018/0104325 (incorporadas aqui por referência) e são especificados aqui como SEQ ID NOS:2-92.

Os ácidos nucleicos contendo PAMP divulgados podem compreender qualquer uma das sequências listadas aqui. Deve ser entendido que tais ácidos nucleicos contendo PAMP devem estar em conformidade com os parâmetros estruturais gerais das moléculas contendo PAMP, como descritas aqui, incluindo ter uma porção de terminal tri-fosfato (ppp). Em uma modalidade, a molécula contendo PAMP compreende sequência:

GGCCAUCCUGUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUCUCCUUUUUUUUUCCUCUUUUUUUCCUU UUCUUUCCUUU (SEQ ID NO:). Em outra modalidade, o ácido nucleico contendo PAMP compreende a sequência: GGCCAUUUUCUUUUUUUUUUCUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUAUUUUCUUUAAU (SEQ ID NO:). Novamente, será entendido que o ácido nucleico contendo PAMP exemplar com as sequências indicadas também possuirá as características descritas acima, incluindo uma porção de tri-fosfato terminal 5' (ppp).

[0049] Como descrito em Publicações US Nos. 2015/0017207 e 2018/0104325, ácidos nucleicos com PAMP RNAs derivados de HCV tendo sequências de núcleo de poli-uracila podem desencadear sinalização de receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I). Assim, em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP é capaz de induzir ativação de receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I). Em uma modalidade, o RLR é RIG-I. Pessoas versadas na técnica serão prontamente capazes de determinar a ativação de um RLR, tal como por ensaio da transcrição de genes regulados por RLR a jusante conhecidos, como descritos em maiores detalhes abaixo. Por exemplo, em algumas modalidades, ativação de RLR pode ser estabelecida por um aumento em expressão de IFN-β ou ISG54. Em outra modalidade, ativação de RLR pode ser estabelecida por um aumento na fosforilação de IRF-3.

[0050] Como descrito em maiores detalhes abaixo, análises proteômicas identificaram TRIM16 como um parceiro chave de ligação de RLR que especificamente leva à sinalização de morte celular. Assim, a sinalização de RLR induzida por PAMP (por exemplo, RIG-I) inclui uma interação RLR-TRIM16, que pode levar à morte celular programada. Consequentemente, o método engloba modalidade em que a molécula de ácido nucleico contendo PAMP induz interação do receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I) com TRIM16 na célula. Uma TRIM16 exemplar tem uma sequência de aminoácido como especificada em SEQ ID NO:1, ou uma variante funcional com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% identidade de sequência com a mesma. Variante funcional indica que, a despeito de qualquer variação de sequência na proteína, a proteína retém a atividade de TRIM16. Por exemplo, TRIM16, que é também conhecida como EBBP, foi previamente caracterizada e identificada como um gene respondente a estrogênio que estava envolvido em vários processos biológicos, incluindo inibição da progressão do tumor em vários al cânceres. O estudo descrito aqui demonstra que interação de RLR (por exemplo, RIG-I)/TRIM16 induz sinalização de morte celular programada. Consequentemente, a atividade de TRIM16 que é induzida pode, por fim, resultar em morte celular programada. Em algumas modalidades, o método compreende induzir a morte celular programada na célula. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP é contatada com a célula em uma concentração de cerca de 80ng/mL ou maior, para resultar na indução de morte celular programada na célula.

[0051] Consequentemente, em algumas modalidades, o método compreende contar a célula com a molécula de ácido nucleico contendo PAMP a uma concentração de pelo menos cerca de 80ng/mL a cerca de 500ng/mL, tal como entre 100ng/mL e 250ng/mL. Em algumas modalidades, o método compreende contatar a célula com a molécula de ácido nucleico contendo PAMP a uma concentração de pelo menos cerca de 80ng/mL, cerca de 90ng/mL, cerca de 100ng/mL, cerca de 110ng/mL, cerca de 120ng/mL, cerca de 130ng/mL, cerca de 140ng/mL, cerca de 150ng/mL, cerca de 160ng/mL, cerca de 170ng/mL, cerca de 180ng/mL, cerca de 190ng/mL, cerca de 200ng/mL, cerca de 210ng/mL, cerca de 220ng/mL, cerca de 230ng/mL, cerca de 240ng/mL, cerca de 250ng/mL, cerca de 260ng/mL, cerca de 270ng/mL, cerca de 280ng/mL, cerca de 290ng/mL, cerca de 300ng/mL, cerca de 310ng/mL, cerca de 320ng/mL, cerca de 330ng/mL, cerca de 340ng/mL, cerca de 350ng/mL, cerca de 360ng/mL, cerca de 370ng/mL, cerca de 380ng/mL, cerca de 390ng/mL, cerca de 400ng/mL, cerca de 410ng/mL, cerca de 420ng/mL, cerca de 430ng/mL, cerca de 440ng/mL, cerca de 450ng/mL, cerca de 460ng/mL, cerca de 470ng/mL, cerca de 480ng/mL, cerca de 490ng/mL, e cerca de 500ng/mL.

[0052] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente contatar a célula com interferon (IFN). Em algumas modalidades, o IFN é IFN tipo 1. Em algumas modalidades, o IFN é IFN peguilado. Em algumas modalidades, o IFN é IFN lambda.

[0053] Em algumas modalidades, a célula é contatada com cerca de 5 a cerca de 1500 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 100 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 100 a cerca de 500 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 200 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 300 a cerca de 700 unidades de IFN por ml, e tal como cerca de 500 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml. As doses exemplares de IFN incluem cerca de 100 unidades de IFN por ml, cerca de 200 unidades de IFN por ml, cerca de 300 unidades de IFN por ml, cerca de 400 unidades de IFN por ml, cerca de 500 unidades de IFN por ml, cerca de 600 unidades de IFN por ml, cerca de 700 unidades de IFN por ml, cerca de 800 unidades de IFN por ml, cerca de 900 unidades de IFN por ml, cerca de 1000 unidades de IFN por ml, cerca de 1200 unidades de IFN por ml, e cerca de 1500 unidades de IFN por ml. O uso aqui do termo "unidades" refere-se a unidades internacionais.

[0054] A atividade de TRIM16 pode ser facilitada ou adicionalmente intensificada ao prover também a célula com um ácido nucleico codificando TRIM16. Como indicado acima, uma sequência de proteína TRIM16 exemplar é especificada em SEQ ID NO:1 ou uma variante funcional com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% identidade de sequência para a mesma. Assim, o ácido nucleico pode ser qualquer ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido como especificada em SEQ ID NO:1 ou uma variante funcional com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% identidade de sequência para a mesma. O ácido nucleico pode ser operativamente ligado a uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor é capaz de induzir expressão de TRIM16 codificada na célula. O termo "promotor" refere-se a uma sequência de nucleotídeo regulatória que pode ativar a transcrição (expressão) de um gene e/ou isoformas de variante de emenda do mesmo. Um promotor está tipicamente localizado a montante de um gene, mas pode estar localizado em outras regiões proximais ao gene, ou mesmo dentro do gene. O promotor tipicamente contém sítios de ligação para RNA polimerase e um ou mais fatores de transcrição, que participam na montagem do complexo de transcrição. Como usado aqui, o termo "operativamente ligado" indica que o promotor e o ácido nucleico codificante são configurados e posicionados relativo a cada outro em um modo tal que o promotor pode ativar a transcrição do ácido nucleico codificante pelo maquinário de transcrição da célula. O promotor pode ser constitutivo ou indutível. Promotores constitutivos podem ser determinados com base no caráter da célula alvo e nos fatores particulares de transcrição disponíveis no citossol. Uma pessoa versada na técnica pode selecionar um promotor apropriado com base na pessoa desejada, como vários promotores são conhecidos e comumente usados na arte.

[0055] A célula pode ser qualquer célula para a qual a atividade de TRIM16 é desejada. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de câncer. A célula de câncer pode ser de um tumor sólido ou um câncer hematológico.

[0056] Os tumores sólidos representativos são câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer colorretal, câncer da mama, câncer da próstata, câncer renal (rim), câncer hepatocelular, câncer do pulmão, câncer ovariano, câncer cervical, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, cânceres do SNC, tumores do cérebro, câncer ósseo, sarcoma de tecido mole. Os cânceres hematológicos representativos incluem leucemias, linfomas e mielomas.

[0057] Em algumas modalidades, o método pode ser realizado de modo que a célula é contatada com a quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico contendo PAMP in vitro. Tipicamente, uma ou mais células são mantidas em um meio de cultura apropriado. A quantidade da molécula de ácido nucleico contendo PAMP é administrada às células no meio de cultura na concentração desejada em um carreador que pode levar a uma cultura contínua das células.

[0058] Em outras modalidades, o método pode ser realizado in vivo, tal como em um indivíduo mamífero humano ou não humano (tal como outro primata, cavalo, cachorro, gato, camundongo, rato, porquinho-da-índia, coelho e similares) com uma doença ou condição que iria se beneficiar da indução de atividade de TRIM16. Considerando que ativação de TRIM16 via sinalização de PAMP suficiente de RLR (por exemplo, RIG-I) leva à apoptose, o método é realizado com vantagem com a doença ou condição no indivíduo sendo um câncer, tal como câncer de tumor sólido ou câncer hematológico. Os cânceres exemplares englobados exposição incluem os descritos acima incluindo câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer colorretal, câncer da mama, câncer da próstata, câncer renal (rim), câncer hepatocelular, câncer do pulmão, câncer ovariano, câncer cervical, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, cânceres do SNC, tumores do cérebro, câncer ósseo, sarcoma de tecido mole, e mielomas. Nessas modalidades in vivo, a quantidade eficaz do ácido nucleico contendo PAMP é administrada ao indivíduo em um modo apropriado para a doença em particular (por exemplo, câncer). Em algumas modalidades, o método é um aspecto de uma terapia de combinação e, assim, compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma imunoterapia, tal como anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia com células T CAR.

[0059] Assim, em outro aspecto, a exposição prevê um método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo. O método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado a patógeno (PAMP).

[0060] Como usado aqui, o termo "tratar" refere-se ao gerenciamento médico de uma doença, distúrbio ou condição (por exemplo, câncer, como descrito acima) de um indivíduo (por exemplo, um mamífero humano ou não humano, tal como outro primata, cavalo, cachorro, camundongo, rato, porquinho-da-índia, coelho e similares). Tratamento pode englobar qualquer indício de sucesso no tratamento ou melhora de uma doença ou condição (por exemplo, um câncer), incluindo qualquer parâmetro, como redução, remissão, diminuição dos sintomas ou tornar a doença ou condição mais tolerável para o indivíduo, diminuindo a taxa de degeneração ou declínio, ou tornando a degeneração menos debilitante. Especificamente no contexto do câncer, o termo tratar pode englobar a desaceleração ou inibição da taxa de crescimento do câncer ou a redução da probabilidade de recorrência, em comparação com não tendo disponível o tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento engloba resultar em algum grau detectável de morte de células de câncer no paciente. O tratamento ou melhora dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos, incluindo os resultados de um exame por um médico. Consequentemente, o termo "tratar" inclui a administração das composições da presente exposição para aliviar, interromper, ou inibir o desenvolvimento dos sintomas ou condições associadas à doença ou condição (por exemplo, câncer). O termo "efeito terapêutico" refere-se à melhora, redução ou eliminação da doença ou condição, sintomas da doença ou condição ou efeitos colaterais da doença ou condição no indivíduo. O termo "terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade da composição que resulta em um efeito terapêutico e pode ser prontamente determinada.

[0061] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poli- uracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico, em que o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila. Uma descrição detalhada da molécula de ácido nucleico contendo PAMP é dada acima não sendo aqui repetida por brevidade. Como descrito, molécula contendo PAMP é funcional para induzir interação do receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG- I) com TRIM16 em uma célula de câncer no indivíduo. Em algumas modalidades, o RLR é RIG-I. A interação de RLR com TRIM16 resulta em indução de sinalização de morte celular em uma célula de câncer no indivíduo.

[0062] Foi demonstrado que o interferon (IFN) pode interagir sinergisticamente com a sinalização de morte celular programada para resultar em destruição intensificada de células e mesmo tumores. De fato, o estudo descrito abaixo estabelece que a morte celular induzida por PAMP (via simulação da interação RLR/TRIM16) induz morte celular dependente de caspase que é intensificada ainda pela adição de tratamento com IFN. Consequentemente, em algumas modalidades, o método de tratamento compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de interferon (IFN) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o IFN é IFN tipo 1. Em algumas modalidades, o IFN é IFN peguilado. Em algumas modalidades, o IFN é IFN lambda.

[0063] IFN pode ser dosado em qualquer quantidade terapeuticamente eficaz como determinado pelas pessoas versadas na técnica. As faixas de doses exemplares incluem cerca de 5 a cerca de 1500 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 100 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 100 a cerca de 500 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 200 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml, tal como cerca de 300 a cerca de 700 unidades de IFN por ml, e tal como cerca de 500 a cerca de 1000 unidades de IFN por ml. As doses exemplares de IFN incluem cerca de 100 unidades de IFN por ml, cerca de 150 unidades de IFN por ml, cerca de 200 unidades de IFN por ml, cerca de 250 unidades de IFN por ml, cerca de 300 unidades de IFN por ml, cerca de 350 unidades de IFN por ml, cerca de 400 unidades de IFN por ml, cerca de 450 unidades de IFN por ml, cerca de 500 unidades de IFN por ml, cerca de 550 unidades de IFN por ml, cerca de 600 unidades de IFN por ml, cerca de 650 unidades de IFN por ml, cerca de 700 unidades de IFN por ml, cerca de 750 unidades de IFN por ml, cerca de 800 unidades de IFN por ml, cerca de 850 unidades de IFN por ml, cerca de 900 unidades de IFN por ml, cerca de 950 unidades de IFN por ml, cerca de 1000 unidades de IFN por ml, cerca de 1200 unidades de IFN por ml, e cerca de 1500 unidades de IFN por ml. O uso aqui do termo "unidades" refere-se a unidades internacionais.

[0064] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor. Como descrito acima, o ácido nucleico pode codificar uma proteína TRIM16 compreendendo uma sequência de aminoácido como especificada em SEQ ID NO:1, ou uma variante funcional com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% identidade de sequência para a mesma. O promotor pode ser selecionado de modo que ele seja operativo para induzir a expressão de TRIM na célula de câncer. Tal promotor pode ser configurado para expressão indutível ou constitutiva no tipo de célula de câncer alvo pretendida de acordo com conhecimento convencional na arte. O ácido nucleico (e o promotor) podem ser incorporados em um vetor apropriado para facilitar a entrega e a expressão do ácido nucleico codificante na célula de câncer. O vetor pode ser um vetor viral, construto de ácido nucleico circular (por exemplo, plasmídeo) ou nanopartícula. Vários vetores virais são conhecidos na arte e são englobados pela presente exposição. Ver, por exemplo, Machida, C. A. (ed.), Viral

Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey (2003); Muzyczka, N., (ed.), Current Topics in Microbiology and Immunology: Viral Expression Vectors, Springer-Verlag, Berlin, Alemanha (2012), cada incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor de vírus adeno associado (AAV), um vetor adenovírus, um vetor retrovírus ou um vetor lentivírus. Uma modalidade específica de um vetor AAV inclui o sorotipo AAV2.5.

[0065] O método pode ser utilizável para tratar qualquer forma de câncer (por exemplo, tumor sólido ou câncer hematológico) desde que as células cancerosas tenham mantido a requerida via de sinalização de TRIM16. Os cânceres exemplares englobados por este aspecto são descritos acima, e incluem, mas não são limitados a câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer colorretal, câncer da mama, câncer da próstata, câncer renal (rim), câncer hepatocelular, câncer do pulmão, câncer ovariano, câncer cervical, câncer gástrico, câncer do esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, cânceres do SNC, tumores do cérebro, câncer ósseo, sarcoma de tecido mole e mielomas.

[0066] Considerando que um efeito funcional do ácido nucleico contendo PAMP é a indução de sinalização de morte celular programada na célula, o método deste aspecto é particularmente aplicável à combinação com outras terapias anticâncer. Consequentemente, em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração ao indivíduo de um terapêutico anticâncer. O terapêutico anticâncer pode ser qualquer terapêutico de toxina, molécula pequena, molécula grande que tenha um efeito terapêutico demonstrável sobre as células de câncer em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração, ao indivíduo, de uma imunoterapia para o câncer, tal como anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia com células T CAR. O ácido nucleico contendo PAMP divulgado pode ser administrado simultaneamente com ou separado dos agentes terapêuticos anti-câncer adicionais, incluindo ácidos nucleicos codificando IFN e/ou TRIM16.

[0067] Em outro aspecto, a exposição prevê uma composição terapêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico contendo padrões moleculares associados a patógenos (PAMP) e um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poli-uracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico, em que o resíduo de ácido nucleico o mais em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila. Uma descrição mais detalhada da molécula de ácido nucleico contendo PAMP é dada acima, e não é repetida aqui por brevidade. Como descrito, a molécula contendo PAMP é funcional para induzir interação do receptor (RLR) semelhante a gene indutível por ácido retinóico I (RIG-I) com TRIM16 em uma célula de câncer no indivíduo. Em algumas modalidades, o RLR é RIG-I. A interação de RLR com TRIM16 resulta em indução de sinalização de morte celular em uma célula de câncer no indivíduo.

[0068] Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional pode ser interferon (IFN), conforme descrito acima em maiores detalhes. Em algumas modalidades, o IFN é IFN tipo 1. Em algumas modalidades, o IFN é IFN peguilado. Em algumas modalidades, o IFN é IFN lambda. Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um ácido nucleico codificante compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor. Como descrito acima, o ácido nucleico pode codificar uma proteína TRIM16 compreendendo uma sequência de aminoácido, como especificada em SEQ ID NO:1, ou uma variante funcional com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência para a mesma. O promotor pode ser selecionado de modo que ele seja operativo para induzir a expressão de TRIM na célula de câncer. Em outra modalidade, a composição terapêutica compreende o ácido nucleico contendo PAMP, IFN e um ácido nucleico codificando TRIM16 operativamente ligado a uma sequência de promotor.

[0069] A exposição engloba formulações da composição terapêutica configuradas em um modo apropriado para os métodos de administração para aplicação a cenários terapêuticos in vivo em indivíduos (por exemplo, indivíduos mamíferos com câncer). Administração pode ser por qualquer procedimento conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a, administração oral, parenteral, intraspinal, intracisternal, subdural, retal, intradérmica, transdérmica, intramuscular, ou tópica. Em uma modalidade específica, a administração é intratumoral. Para facilitar a entrega, a composição terapêutica pode ser formulada em várias composições com um carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente. "Farmaceuticamente aceitável" significa o carreador, excipiente ou diluente de escolha que não afeta adversamente a atividade biológica da molécula de ácido nucleico contendo PAMP e qualquer agente terapêutico adicional, ou o recipiente da composição.

[0070] De acordo com especialização e conhecimento comuns na arte, os ácido nucleico contendo PAMP e agente terapêutico adicional, incluindo IFN, ácidos nucleicos codificantes e/ou vetores compreendendo os ácidos nucleicos, toxinas, compostos de imunoterapia, etc. divulgados podem ser formulados em qualquer sistema de entrega ou formato terapeuticamente apropriado. Sistemas de entrega exemplares, não limitativos, podem incluir formulações de partícula, tal como emulsões, micropartículas e nanopartículas, que podem ser, por exemplo, partículas e/ou matrizes, e lipossomas e similares, que são vantajosos para a entrega de antígenos. Em uma modalidade, o ácido nucleico contendo PAMP divulgado e agente terapêutico adicional são formulados em um formato de entrega lipossomal. As aplicações exemplares de formulações lipossomais são descritas em Yallapu, U., et al., Liposomal Formulations in Clinical Use: A Updated Review, Pharmaceutics 9(2):12 (2017), incorporado aqui por referência em sua totalidade. Definições Gerais

[0071] Salvo especificamente definido aqui, todos os termos usados aqui têm o mesmo significado como conhecido dos versados na arte da presente exposição. Especialistas são particularmente dirigidos para Ausubel, F.M., et al.

(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010), Coligan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010), Mirzaei, H. e Carrasco, M. (eds.), Modern Proteomics – Sample Preparation, Analysis and Practical Applications in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International Publishing, 2016, e Comai, L, et al., (eds.), Proteomic: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, Springer International Publishing, 2017, para definições e termos na arte.

[0072] Por conveniência, alguns termos empregados aqui no relatório descritivo, exemplos e reivindicações em anexo são apresentados aqui. As definições são dadas para auxiliar na descrição de modalidades particulares e não se destinam a limitar a invenção reivindicada, porque o escopo da invenção é limitado apenas pelas reivindicações.

[0073] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", salvo explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a exposição suporte uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou."

[0074] As palavras "um" e "uma", quando usadas em conjunto com a palavra "compreendendo" nas reivindicações ou relatório descritivo, denotam um ou mais, salvo especificamente indicado.

[0075] Salvo se o contexto determinar claramente o contrário, ao longo da descrição e das reivindicações, as palavras "compreende", "compreendendo" e similares, devem ser interpretadas em um sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo ou exaustivo, que é para indicar, no sentido de "incluindo, mas não limitado a." Palavras que usam o número singular ou plural também incluem o número plural e singular, respectivamente. A palavra "cerca de" indica um número dentro da faixa de variação menor acima ou abaixo do número de referência declarado. Por exemplo, "cerca de" pode se referir a um número dentro de uma faixa de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% acima e/ou abaixo do número de referência indicado.

[0076] Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" ou "proteína" refere-se a um polímero em que os monômeros são resíduos de aminoácido que são unidos juntos através de ligações amida. Quando os aminoácidos são alfa-aminoácidos, ou o isômero óptico L ou o isômero óptico D podem ser usados, os isômeros L sendo preferidos. O termo polipeptídeo ou proteína como usado aqui engloba qualquer sequência de aminoácido e inclui sequências modificadas, tal como glicoproteínas. O termo polipeptídeo é especificamente destinado a cobrir proteínas naturalmente ocorrendo, assim como as que são produzidas de modo recombinante ou sintético.

[0077] Uma pessoa versada irá reconhecer que que substituições, deleções ou adicionais individuais a um peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína que altera, adiciona ou deleta um aminoácido único ou uma porcentagem de aminoácidos na sequência é uma "variante conservativamente modificada" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição de aminoácido conservativa apresentando aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas do versado na técnica. Os seguintes seis grupos são exemplos de aminoácidos que são considerados como sendo substituições conservativas um do outro: (1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T), (2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E), (3) Asparagina (N), Glutamina (Q), (4) Arginina (R), Lisina (K), (5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V), e (6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[0078] Referência à identidade de sequência aborda o grau de similaridade de duas sequências poliméricas, como sequências de proteínas. Determinação da identidade de sequência pode ser prontamente obtida por pessoas versadas na técnica usando algoritmos e/ou técnicas aceitos. A identidade da sequência é tipicamente determinada pela comparação de duas sequências alinhadas de modo otimizado ao longo de uma janela de comparação, onde a porção da sequência de polinucleotídeo ou peptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições em que o resíduo de aminoácido idêntico ou base de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondidas, dividindo o número de posições correspondidas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicação do resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Vários algoritmos acionados por software estão prontamente disponíveis, como BLAST N ou BLAST P para realizar tais comparações.

[0079] São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Entende-se que, quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc., desses materiais são divulgados, cada uma das várias combinações individuais e coletivas é especificamente contemplada, embora a referência específica a cada uma e toda combinação e à permuta desses compostos possa não ser explicitamente divulgada. Este conceito se aplica a todos os aspectos desta exposição, incluindo, mas não se limitando a, etapas nos métodos descritos. Assim, elementos específicos de quaisquer modalidades anteriores podem ser combinados ou substituídos por elementos em outras modalidades. Por exemplo, se houver uma variedade de etapas adicionais que possam ser realizadas, entende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas de método específicas ou combinação de etapas de método dos métodos divulgados, e que cada combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplado e deve ser considerado divulgado. Adicionalmente, entende-se que as modalidades aqui descritas podem ser implementadas usando qualquer material apropriado, como os descritos em outro ponto aqui ou como conhecido na técnica.

[0080] As publicações citadas aqui e a matéria para a qual elas são citadas são aqui especificamente incorporadas por referência em suas totalidades.

[0081] O seguinte descreve um estudo demonstrando que a indução de sinalização RLR usando PAMP-RNA pode induzir morte celular programada e pode ser aplicada em um contexto específico de câncer. Introdução

[0082] O gene indutível por ácido retinóico-I (RIG-I) funciona como um receptor de reconhecimento de patógeno citossólico por ligação dos padrões moleculares associados a patógeno (PAMPs) em RNA viral. A assinatura molecular para reconhecimento de RIG-I de RNA viral foi identificada como motivos específicos contendo 5'-trifosfato (5'ppp), incluindo motivos de RNA ricos em poli-uridina (poli-U) e motivos de RNA fita dupla curta (ds) que são encontrados dentro dos produtos de RNA viral que se acumulam no citoplasma de células infectadas durante a replicação do vírus de RNA. O inventor previamente desenvolveu um ligando sintético 5'ppp RNA RIG-I com base no motivo poli-U do RNA do vírus de hepatite C (HCV) (PAMP-RNA) que é especificamente reconhecido e ligado por RIG-I. A ativação por PAMP-RNA de RIG-I desencadeia as cascatas de sinalização intracelular que mediam as funções efetoras de RIG-I para induzir imunidade inata e fornecer ações terapêuticas antivirais e adjuvantes imunes.

[0083] Este estudo demonstra a descoberta surpreendente de que a ativação por PAMP-RNA de RIG-I pode induzir morte celular apoptótica. Os estudos de faixa de dose das ações de PAMP-RNA revelaram que os níveis de baixas doses de PAMP-RNA desencadeam a ativação imune inata por RIG-I enquanto os níveis aumentados de PAMP-RNA mediaram a sinalização por RIG-I de morte celular. Isto revela uma nova via para morte celular de NA sensibilidade e ações de PAMP-R. As análises proteômicas identificaram TRIM16 como um padrão chave de ligação de RIG-I que especificamente dirige a morte celular induzida por PAMP-RNA através de sinalização de RIG-I. TRIM16 foi necessária para sinalização de morte celular, mas não ativação imune inata por RIG-I. Adicionalmente, a morte celular mediada por TRIM16 foi adicionalmente intensificada por interferon tipo I (IFN). Estes estudos demonstram que TRIM16 é um parceiro de ligação de RIG-I que dirige a morte celular em resposta a tratamento com PAMP-RNA. O eixo sinalização de PAMP-RNA e TRIM16/RIG-I/IFN é, assim, demonstrado como um novo programa de supressor de tumor de morte celular para aplicações em terapia de câncer. Resultados Apoptose induzida por PAMP RNA de HCV é dependente de dose

[0084] Estudos verificaram que agonistas de RIG-I podem induzir tanto a ativação da sinalização imune inata como a apoptose. Para confirmar isto com o PAMP-RNA, um estudo de titulação de dose foi realizado para avaliar a quantidade de PAMP-RNA requerida para induzir cada evento biológico em células Huh7 (FIGURAS 1A-1D). De modo interessante, sinalização imune inata foi induzida em um limiar de 10ng/mL e maior, como evidenciado por indução de expressão induzida por IRF3 de ISG56 e ISG15 e IFITM1 dependente de IFN, enquanto a análise IncuCyte® de morte celular induzida por PAMP-RNA ocorre em uma concentração mínima de 100ng/mL. Estes estudos de titulação indicam que PAMP-RNA induziu o maior nível de morte celular a 200 ng/mL (FIGURAS 1C e 1D). Assim, 200 ng/mL foram usados como a concentração ótima para induzir apoptose mediada por RIG-I- e para indução por PAMP-RNA de morte celular para o resto dos estudos.

Indução por PAMP-RNA de apoptose é dependente de RIG-I e caspase

[0085] Para confirmar que PAMP-RNA dirige a sinalização dependente de RIG-I, e para avaliar o papel de ativação de caspase na resposta de morte celular à sinalização de RIG-I _ENREF_27 induzida por PAMP-RNA, a extensão de morte celular e atividade de caspase induzida por PAMP HCV foi avaliada em células de abate de RIG-I e células de controle de vetor vazio, com ou sem tratamento com o inibidor de pan-caspase zVAD. De fato, perda de RIG-I nas células de nocaute RIG-I anulou a morte celular induzida por PAMP-RNA, enquanto o tratamento com zVAD de células de controle de vetor vazio antes do tratamento com PAMP-RNA, reduziu a frequência de morte celular induzida (FIGURA 2A-1,-2). A análise immunoblot de expressão de proteína de sinalização imune inata mostrou que tratamento com zVAD não impactou a indução por PAMP-RNA de ISG56, indicando que inibição de caspases não inibiu as respostas imunes inatas desencadeadas por PAMP- RNA nestas células (FIGURA 2B). Além disso, perda de RIG-I nas células diminuiu a expressão de genes pró-apoptóticos dependentes de p53 NOXA e PUMA (FIGURA 3C), que são conhecidos como sendo induzidos durante a apoptose dependente de RIG-I. Assim, PAMP-RNA pode dirigir a morte celular através de processos dependentes de caspase e RIG- I. Via de IFN tipo I está envolvida em morte celular mediada por PAMP-RNA

[0086] Para determinar o impacto de IFN em sinalização PAMP-RNA de morte celular, morte celular foi avaliada em células de controle Huh7 e células faltando IFNAR ou RIG-I.

A perda de IFNAR foi mostrada como anulando parcialmente a indução mediada por RIG- I de morte celular desencadeada por PAMP-RNA (FIGURA 3A). Esta descoberta foi confirmada adicionalmente com a deficiência parcial de indução mediada por RIG-I de apoptose em células Huh7 pré-tratadas com um inibidor de sinalização de IFN tipo I, B18R (FIGURA 3B). TRIM16 é um novo fator de ligação de RIG-I

[0087] Para identificar co-fatores possíveis de RIG-I envolvido em sinalização de célula imune inata ou de morte celular por PAMP-RNA, uma triagem proteômica de células P85CH8 foi realizada para proteínas de ligação de RIG-I após ativação de RIG-I por vírus Sendai (SeV) (FIGURA 4A). SeV é um potente ativador de RIG-I e foi, assim, usado nestes estudos como um substituto de PAMP-RNA para fornecer uma ativação forte e uniforme de RIG-I nas culturas celulares. As células foram transfectadas com um construto RIG-I marcado com FLAG ou controle de construto FLAG, e ou infectado por simulação ou infectado com SeV. 16 horas depois, RIG-I e proteínas associadas com RIG-I foram isolados por purificação por afinidade FLAG e identificados por LC/MS-MS. A triagem identificou interatores de RIG-I conhecidos de imunidade inata, tal como OASL. De modo importante, as análises identificaram 5 sequências de peptídeos singulares, associadas com FLAG-RIG-I, mas não contas de FLAG sozinhas correspondendo a TRIM16, uma E3 ubiquitina ligase. TRIM16 era não previamente conhecida como interagindo com RIG-I. O status de TRIM16 e RIG-I como parceiros de ligação foi confirmado usando co-imunoprecipitação em células HEK293 expressando construtos RIG-I-FLAG e TRIM16 V5, (FIGURA 4B). Os domínios essenciais para a interação de RIG-I e TRIM16 foram ainda mapeados por análise de co-imunoprecipitação de mutantes de truncagem co-expressados a partir de cada proteína. Essas análises revelaram que os domínios CARD de RIG-I (aa 1-176) são necessários e suficientes para a associação de RIG-I com TRIM16 (FIGURA 4C). Do mesmo modo, a co-imunoprecipitação recíproca com truncagens de TRIM16 revelou que os domínios B-Box de TRIM16 são necessários e suficientes para a associação de TRIM16 com RIG-I (FIGURA 4D). Perda de TRIM16 não impacta a indução por RIG-I de respostas imunes inatas

[0088] Para elucidar um possível papel de TRIM16 em sinalização imune inata, o impacto de perda de TRIM16 em ativação imune inata induzida por PAMP-RNA foi avaliada. Expressão de TRIM16 foi depletada em células Huh7 usando nocaute alvo marcado por CRISPR/cas9 de TRIM16. Em contraste com linhagens celulares de Huh7 modificadas para abater a expressão de RIG-I ou TRIM25 (um regulador positivo de sinalização de RIG-I), as linhagens celulares KO Huh7 TRIM16 de duas diferentes sequências de alvo-direcionamento CRISPR/cas9 exibiram, ambas, uma indução robusta da sinalização imune inata de RIG-I por PAMP-RNA, como evidenciado por indução dos genes responsivos a RIG-I, ISG56, ISG15, IFNβ, e TNFα (FIGURAS 5A e 5B). Além disso, perda de expressão de TRIM16 não impactou os programas de sinalização inata a jusante de RIG-I na presença de uma forma ativa dominante de RIG-I (N-RIG) ou após infecção por SeV (FIGURAS 5C e 5D). Juntos, estes experimentos demonstram que TRIM16 não está envolvida com os processos de sinalização imune inata do hospedeiro induzida por RIG-I.

TRIM16, mas não TRIM25, está envolvida em apoptose mediada por RIG-I

[0089] Para determinar se TRIM16 está especificamente envolvida em morte celular mediada por RIG-I induzida por PAMP-RNA, o impacto de perda de TRIM16 em morte celular induzida por PAMP-RNA foi avaliado. As células Huh7 KO TRIM16 e KO TRIM25 foram tratadas com ou PAMP-RNA, inibidor de caspase (ZVAD) ou ambos, e foram avaliadas por ensaio de morte celular com formação de imagens em tempo real. Perda de TRIM16 ou tratamento com ZVAD inibiram a morte celular induzida por PAMP-RNA comparado com controles (FIGURA 6A). Em contraste, perda de expressão de TRIM25 não impactou a extensão de morte celular induzida por PAMP-RNA (FIGURA 6B). Estes estudos revelam que PAMP-RNA especificamente assinala morte celular apoptótica mediada por RIG-I através do novo parceiro de ligação a RIG-I, TRIM16. Morte celular mediada por PAMP-RNA é específica para células de câncer

[0090] Para determinar se sinalização de morte celular programada mediada por RLR (por exemplo, RIG-I) terá igualmente impacto sobre células saudáveis e de câncer, PAMP RNA foi exposto a ambas as linhagens de células de câncer hepático e hepatócitos humanos primários normais. Especificamente, células de carcinoma hepatocelular HEPG2 e Huh7 e hepatócitos primários foram tratados com quantidades crescentes de PAMP RNA ou xRNA (uso como um controle negativo) e monitorados durante um curso de menos 24 horas para captação de corante verde Sytox marcando células permeáveis/morrendo ou mortas. O tratamento com PAMP foi observado para induzir especificamente a destruição oncolítica de células de tumor (isto é, as células HepG2 e Huh7, que são células derivadas de carcinoma humano), mas não hepatócitos humanos primários normais não cancerosos. Especificamente, FIGURAS 7A e 7B ilustram que tratamento com PAMP RNA inclui a destruição oncolítica de células de carcinoma hepatocelular HepG2 (FIGURA 7A) e Huh7 (FIGURA 7B), mas não tem efeito sobre os hepatócitos primários (FIGURA 7B).

[0091] Isto demonstra que células saudáveis são refratárias à sinalização de morte celular programada induzida por PAMP através de RLR (por exemplo, RIG-I). Consequentemente, células de câncer podem ser especificamente direcionadas ao alvo para destruição, enquanto minimizando ou prevenindo a toxicidade fora do sítio em células saudáveis. Discussão

[0092] Este estudo demonstra que TRIM16 é um efetor de sinalização de morte celular na via PAMP-RNA/RIG-I. Estes dados suportam um modelo de ações de TRIM16 em que PAMP-RNA, e outros ligandos de RIG-I, ativam RIG-I para conferir ligação a TRIM16. Como um resultado, TRIM16 dirige a ativação a jusante de caspases para mediar a morte celular apoptótica. Essa indução de morte celular mediada por RIG-I ocorre em uma dose maior de PAMP-RNA do que sinalização de RIG-I de ativação imune inata provavelmente sublinha ações diferenciais de imunidade inata para proteger a célula de infecção versus apoptose para deletar as células infectadas para proteção do tecido e organismo. Assim, o tratamento com PAMP-RNA em dose maior de células e tecido apresenta uma abordagem para estratégias para resultado de morte celular dirigida, em que TRIM16 media um eixo de morte celular de sinalização PAMP-RNA/RIG-I.

[0093] TRIM16 (também conhecida como EBBP) foi primeiro identificada como um gene respondente a estrogênio que tinha sido envolvido em vários processos biológicos. TRIM16 foi mapeada para a regulação de agregados de proteína induzidos por estresse e regulação de autofagia em homeostase de dano endomembrana. TRIM16 foi ligada à diferenciação de ceratinócitos e metabolismo de retinóides. Um estudo encontrou uma correlação entre expressão de TRIM16 e hiperplasia do sinóvio em artrite reumatóide. Outro estudo verificou que TRIM16 interage com componentes de inflamassoma caspase 1 e NLRP1 para intensificar a secreção de IL-1b, sugerindo que TRIM16 desempenha um papel em regulação de inflamassoma. No entanto, o mais notavelmente, TRIM16 tem estado proeminentemente ligado à supressão de tumor em câncer. Vários mecanismos de supressão tumoral mediada por TRIM16 foram elucidados. Estudos em sistemas de modelos de células de câncer de pulmão, ovário e mama descobriram que TRIM16 inibe a transição epitelial para mesenquimal (EMT) durante a progressão do tumor, regulando de modo negativo a via de ‘ouriço sônico’ que promove o tumor. Da mesma forma, modelos celulares de carcinoma hepatocelular e câncer de próstata mostraram que TRIM16 inibe EMT por supressão de inibidores de transcrição que regulam a expressão da molécula de adesão célula-célula E-caderina. Um estudo de TRIM16 em melanoma verificou que TRIM16 inibe proliferação e migração por regulação da produção de IFN- beta 1. Estudos também verificaram que TRIM16 regula a estabilidade do membro da família do filamento intermediário, vimentina, em tumores, reduz a migração de células de câncer de pele e tem demonstrado inibir o crescimento de neuroblastoma ao inibir o ciclo celular. Finalmente, estudos em linhagens de células de câncer de mama verificaram que a superexpressão de TRIM16 induziu apoptose através da ativação de caspase-2.

[0094] É conveniente notar que o gene FishTRIM16L, que foi clonado da garoupa manchada de laranja, tem 29% de identidade com o homo sapiens, e mostrou antagonizar a sinalização imune inata em células de peixes. Em contraste, este estudo verificou que a perda de TRIM16 humano não impactou a indução por PAMP-RNA/RIG de ativação imune inata. Provavelmente, essa diferença na função entre TRIM16 de peixes e de humanos na resposta imune inata é devido à falta de identidade de sequência, enquanto a proteína TRIM16L de peixe é desprovida do domínio B-box e não se espera que se ligue a RIG-I, mas provavelmente confere ações distintas em imunidade inata de peixes.

[0095] De modo interessante, os presentes estudos revelaram que a morte celular induzida por HCV PAMP era parcialmente dependente de IFN, o que está em contraste direto com um estudo anterior que mostrou que RIPA é independente de IFN. Sem estar limitado por qualquer teoria em particular, esta discrepância aparente é provavelmente devido ao uso de diferentes linhagens celulares nos dois estudos, mas serve para mostrar que IFN pode intensificar a sinalização de morte celular, consistente com ações proapoptóticas de IFN. Como o próprio RIG-I é um ISG, IFN pode servir para aumentar os níveis de RIG-I para intensificar a força de sinalização de PAMPR-RNA para o engajamento a jusante do TRIM16. Alternativamente, outros ISGs poderiam cooperar com a sinalização de PMPA-RNA para intensificar o fenótipo de morte celular de TRIM16.

[0096] Em resumo, este estudo identificou TRIM16 como um novo parceiro de ligação de RIG-I que medeia a sinalização de morte celular induzida por PAMP-RNA. O efeito foi observado como sendo específico para células de câncer e não afetou negativamente as células saudáveis do mesmo tecido de origem. Assim, o direcionamento desta nova via RIG-I/TRIM16 com PAMP-RNA para dirigir o resultado de morte celular é uma estratégia viável para abordagens terapêuticas destinadas a direcionar morte celular em células de câncer.

[0097] Os exemplos a seguir são dados com a finalidade de ilustrar, e não limitar, a exposição. Exemplo 1 Métodos e materiais exemplares Cultura celular, inibidores e vírus

[0098] Células de carcinoma hepatocelular Huh 7 humano, hepatócitos PH5CH8 humanos primários imortalizados e células HEK293 de rim embrionário humano foram cultivadas em "DMEM completo" (meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), L-glutamina 10 mM, piruvato de sódio 5 mM, solução antibiótico- antimicótico e 5x aminoácidos não essenciais). As células da cepa Cantell de vírus Sendai (SenV) foram mantidas de acordo com protocolos aceitos. Para ensaios, as células foram tratadas por simulação, transfectadas com ou PAMP ou XRNA formulados em lipossomas, transfectadas com RIG-I constitutivamente ativo (N-RIG) ou infectadas com SenV a 100 HAU/ml durante os tempos indicados antes de analisar a morte celular por análises tipo incucyte, atividade de caspase 3/7, ou coleta de lisados de células para análises de immunoblot e qRT-PCR (como descrito em Kentsis, A. & Borden, K.L. Construction of macromollecular assemblages in eukaryotic processes and their role in human disease: linking RINGs together. Curr Protein Pept Sci 1, 49-73 (2000), Diaz- Griffero, F., et al., A B-box 2 surface patch important for TRIM5alpha self-association, capsid binding avidity, and retrovirus restriction. J Virol 83, 10737-10751 (2009), cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade). Inibidores foram usados nas seguintes concentrações: zVAD (SM-Biochemicals) usado a 1:1000, TNFa (Peprotech) [0,5µL de TNF/cavidade com 400µL de meio total/cavidade], e proteína recombinante livre de carreador /Virus de Vaccínia B18R (eBioscience) [1 μg/ml]. Inibidores foram adicionados três horas antes da transfecção de PAMP ou X RNA. Análise de Immunoblot

[0099] Os extratos de proteína para análises de immunoblot foram preparados por lise de células em gelo em tampão de lise MCLB (50 mM Tris HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl,

0.5% NP-40) suplementados com 1 µM ácido okadaico, 1 µM coquetel de inibidor fosfatase II (Calbiochem), e 10 µM inibidor de protease (Sigma), seguido por centrifugação a 4°C e 16.000 x g durante 10 min para clarificar o lisado. Quantidades equivalentes de proteína foram separadas usando eletroforese de gel SDS-poliacrilamida seguido por immunoblotting. Os seguintes anticorpos primários foram usados para análise de immunoblot: PARP (Cell Signaling Technologies), RIG-I Alme-1 (Adipogen), ISG56 (rb-a-IFIT1

#971 obtido nas instalações de UT Southwestern Antibody Core), IFITM1 (Protein Tech), ISG15 (Cell Signaling Technologies), Actina (Millipore), pSTAT1 Y701 (Cell Signaling Technologies), FLAG (Sigma), V5 e (Life Technologies). Anti-coelho de jumento e anti-camundongo de jumento de Alexa Fluor 680/790 (Jackson Immunoresearch) foram usados como anticorpos secundários. Imunoprecipitação

[0100] Após a expressão exógena de construtos mutantes FLAG-RIG-I e TRIM16-V5 de comprimento completo em células PH5CH8 ou 293, os extratos celulares foram imunoprecipitados usando contas de agarose α-FLAG (Sigma) e contas de agarose conjugadas α-V5 (Sigma) durante a noite a 4oC. Após imunoprecipitação, amostras foram lavadas três vezes usando tampão de lise MCLB antes da eluição. O eluato foi fervido durante 5 minutos e separado usando eletroforese em gel de SDS e analisado por immunoblotting. α-V5 (Life Technologies) e α-FLAG (Sigma) foram usados como anticorpos primários e foram incubados durante a noite. Anti-coelho de jumento e anti-camundongo de jumento Alexa Fluor 680/790 (Jackson Immunoresearch) foram usados como anticorpos secundários. Análise de morte celular

[0101] Células foram semeadas em placas de 24 cavidades em células de 100 k por cavidade. As células foram tratadas com Sytox 100 nM (Sytox) (# S7020, Thermo Fischer) para testar a morte celular e/ou permeabilização ou em cavidades separadas com Syto-Green (S7559, Thermo Fischer) para testar o número total de células. Células foram fotografadas com plataforma de imagem IncuCyte (Essen Bioscience). Em cada ponto de tempo, nove imagens foram obtidas por cavidade.

Cada tratamento foi executado em duplicata ou triplicata. A percentagem de morte celular foi calculada calculando a média de contagens de Syto-Green durante duas horas perto do início do ciclo. Estas foram calculadas em média com réplicas e usadas para normalizar contagens Sytox para calcular a porcentagem de morte celular. Ensaio de Caspase 3/7

[0102] A atividade de caspase 3/7 foi medida usando o reagente verde de ensaio de apoptose Caspase 3/7 (Essen) na plataforma de imagens IncuCyte (descrita acima) e o sistema de ensaio Caspase-Glo® 3/7 (Promega). Uso e análise foram conduzidos de acordo com as instruções do fabricante. Construtos e transfecção celular

[0103] Construtos mutantes de truncagem de RIG-I foram produzidas e descritos anteriormente (PMID: 16585524, PMID: 17190814). Mutantes de truncagem de TRIM16 foram produzidos usando uma estratégia de clonagem baseada em PCR. As sequências de oligonucleotídeos usadas para a produção de cDNA de TRIM16 estão disponíveis mediante solicitação. As células foram transfectadas com 2 µg/mL de PAMP-RNA10 conforme descrito (PMID: 18548002), XRNA de controle (motivo de RNA contendo 5'ppp derivado do genoma do vírus da hepatite C adjacente e equivalente em comprimento a PAMP-RNA, mas não se liga a RIG-I nem induz a sinalização de RIG-I10, construtos de cDNA que codificam TRIM16 (mutantes de comprimento total ou truncados), ou RIG-I (mutante de comprimento total ou truncado) usando o kit TransIT®-mRNA Transfection (Mirus Bio LLC). RT-qPCR

[0104] Células foram colhidas em tampão RLT (Qiagen) e

RNA celular total foi purificado usando o kit RNeasy (Qiagen). cDNA foi sintetizado a partir de RNA purificado por iniciação tanto aleatória como oligo(dT) usando o kit de síntese de cDNA iScript (Bio-rad). Os níveis de RNA foram medidos pelo método de quantificação relativa SYBR-Green usando ou uma máquina de RT-PCR 7300 ou Viia 7 (Applied Biosystems). Amostras foram normalizadas por subtração dos valores de CT respectivos de genes ‘domésticos’ RPLPO ou POLRA, e indução múltipla de genes específicos calculada com relação ao controle não tratado. As sequências de iniciador são listadas em Tabela 1. Geração de linhagens celulares nocaute

[0105] Células Huh7 expressando CRISPR e RNA guia não de direcionamento (controle) ou RNA guia para nocaute de RIG-I ou a cadeia de receptor de IFN- (IFNAR) foram descritos previamente (PMID: 27841874). As células Huh7 expressando CRISPR e RNA guia específico para TRIM16 ou TRIM25 foram selecionadas usando o seguinte conjunto de RNAs guias para produzir cada abate específico da população de células nocaute: TRIM16 RNAs guias 5' a 3'; cada direciona exon 6 GTCGGTGTCAGAGGTCAAAG (SEQ ID NO:) GGTGTCAGAGGTCAAAGCGG (SEQ ID NO:) GTCGGTGTCAGAGGTCAAAG (SEQ ID NO:) TRIM25 RNAs guias 5' a 3'; cada direciona exon 3 GATGACTGCAAACAGAAAGG (SEQ ID NO:) TCAGATGACTGCAAACAGAA (SEQ ID NO:) GCAGCTACCAACAAGAATACA (SEQ ID NO:)

[0106] Tipicamente, 3 gRNAs independentes foram selecionados por gene. Sequências de gRNA foram subclonadas em vetor pRRL-empty-gRNA-Cas9-T2A-Puro vector32 via clonagem tipo InFusion (TaKaRa). Construtos foram transduzidos em células Huh7 por infecção viral por meio de centrifugação e populações policlonais foram isoladas por seleção de Puromicina. As células resistentes a Puromicina foram então triadas por RNA e análises immunoblot para verificar que o gene de interesse foi nocauteado de modo suficiente. Análise proteômica

[0107] As células PH5CH8 foram transfectadas com de comprimento completo FLAG-RIG-I como descrito acima e ou infectadas por simulação ou infectadas com Sendai vírus para ativar RIG-I (100 HAU/mL) durante 16 horas. Células foram então coletadas para produzir extratos de proteína. 200 ug de cada extrato de proteína foram misturados com contas de afinidade anti-FLAG- (Sigma) e incubadas a 4ºC durante 2 horas. As contas foram então lavadas 3 vezes em solução salina tamponada com Tris contendo 150 mM NaCl seguido por três lavagens adicionais em solução salina tamponada com Tris contendo 250 mM NaCl. As proteínas ligadas foram, então, eluídas através de incubação das contas com peptídeo FLAG em excesso. A solução de eluato foi então submetida a análises de cromatografia líquida em tandem - espectrometria de massa (LC-MS/MS) para identificação de RIG-I e complexos de proteína-RIG-I. Cinco peptídeos singulares para TRIM16 foram identificados. Análises estatísticas

[0108] As análises estatísticas foram realizadas usando software GraphPad Prism 6 (GraphPad, La Jolla, CA). Dependendo do número de variáveis e pontos no tempo em cada experimento, análises estatísticas de diferenças médias entre grupos foram realizadas por ou um teste de Student ou uma análise de variância de múltiplas vias (ANOVA) seguido por uma análise de Bonferroni post hoc. Análises de sobrevivência de Kaplan-Meier foram analisadas pelo teste de log-rank. Uma comparação de sobrevida média e sintomas clínicos foi analisada pelo teste t não pareado. Os testes estatísticos específicos, valores P e tamanho de amostra são indicados nas Legendas das FIGURAS.

[0109] Embora as modalidades ilustrativas tenham sido ilustradas e descritas, será apreciado que várias alterações podem ser feitas aqui sem sair do espírito e do escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de induzir atividade de proteína 16 contendo motivo tripartido em uma célula, o método caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula com uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), em que a molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende: uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poliuracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico, em que a maior parte do resíduo de ácido nucleio em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o núcleo de poliuracila consiste entre 8 e 30 resíduos de uracila.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a maior parte do resíduo de ácido nucleico em 5’ da região do braço 3’ é um resíduo de citosina ou um resíduo de guanina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% resíduos de uracila.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região do braço 3’ compreende pelo menos 7 resíduos de uracila contíguos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região do braço 5’ compreende adicionalmente um ou mais resíduos de ácido nucleico dispostos entre o trifosfato terminal e o núcleo de poliuracila.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região do braço 5’ consiste no trifosfato terminal, e em que o trifosfato terminal é ligado diretamente à extremidade 5' do núcleo de poliuracila.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o trifosfato terminal, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’, e o núcleo de poliuracila não ocorrem naturalmente juntos em um vírus de Hepatite C.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico contendo PAMP induz interação do receptor semelhante a gene indutível por ácido retinoico I (RIG I) com TRIM16 na célula.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a interação de RLR com TRIM16 induz sinalização de morte celular na célula.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o RLR é RIG-I.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente contatar a célula com interferon (IFN).

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente contatar a célula com um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor é capaz de induzir expressão da TRIM16 codificada na célula.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a TRIM16 codificada tem uma sequência de aminoácido de pelo menos 90% identidade com a sequência de aminoácido especificada em SEQ ID NO:1.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que atividade de TRIM16 compreende indução de morte celular programada.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de câncer.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula de câncer é uma célula de câncer de tumor sólido.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula de câncer é uma célula de câncer de tumor sólido selecionado dentre câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer hepatocelular, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer do colo do útero, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, câncer no sistema nervoso central, tumores cerebrais, câncer ósseo e sarcoma de tecidos moles.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula de câncer é uma célula de câncer hematológico.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula é contatada com a quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico contendo PAMP in vitro.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizado pelo fato de que a célula é contatada com a quantidade eficaz da molécula de ácido nucleico contendo PAMP in vivo em um indivíduo mamífero.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo uma imunoterapia para o câncer.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a imunoterapia compreende anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia com células T CAR.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

25. Método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), em que a molécula de ácido nucleico contendo PAMP compreende: uma região do braço 5’ compreendendo um trifosfato terminal, um núcleo de poliuracila compreendendo pelo menos 8 resíduos de uracila contíguos, e uma região do braço 3’ compreendendo pelo menos 8 resíduos de ácido nucleico, em que a maior parte do resíduo de ácido nucleio em 5’ da região do braço 3’ não é uma uracila e em que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 30% de resíduos de uracila.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o núcleo de poliuracila consiste em entre 8 e 30 resíduos de uracila.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a maior parte do resíduo de ácido nucleio em 5’ da região do braço 3’ é um resíduo de citosina ou um resíduo de guanina.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a região do braço 3’ é constituída de pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% resíduos de uracila.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a região do braço 3’ compreende pelo menos 7 resíduos de uracila contíguos.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a região do braço 5’ compreende adicionalmente um ou mais resíduos de ácido nucleico dispostos entre o trifosfato terminal e o núcleo de poliuracila.

31. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a região do braço 5’ consiste no trifosfato terminal, e em que o trifosfato terminal é ligado diretamente à extremidade 5' do núcleo de poliuracila.

32. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o trifosfato terminal, o um ou mais resíduos de ácido nucleico da região do braço 5’, e o núcleo de poliuracila não ocorrem naturalmente juntos em um vírus de Hepatite C.

33. Método, de acordo com a reivindicação 25,

caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico contendo PAMP induz interação do receptor semelhante a gene indutível por ácido retinoico I (RIG I) com TRIM16 em uma célula de câncer no indivíduo.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a interação de RLR com TRIM16 induz sinalização de morte celular na célula de câncer.

35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o RLR é RIG-I.

36. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar uma quantidade eficaz de interferon (IFN) ao indivíduo.

37. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando TRIM16 operativamente ligada a uma sequência de promotor, em que a sequência de promotor é capaz de induzir expressão da TRIM16 codificada em uma célula de câncer dentro do indivíduo.

38. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de tumor sólido selecionado dentre câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer hepatocelular, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer do colo do útero, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, cânceres neuroendócrinos, câncer no sistema nervoso central, tumores cerebrais, câncer ósseo e sarcoma de tecidos moles.

39. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer hematológico.

40. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar ao indivíduo uma imunoterapia para o câncer.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a imunoterapia compreende anticorpos específicos de câncer ou fragmentos funcionais dos mesmos, inibidores de pontos de controle imunes, e terapias celulares adotivas, incluindo terapia com células T CAR.

42. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

43. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8, e interferon (IFN).

44. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ácido nucleico codificando TRIM16 operativamente ligado a um promotor.

45. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada em um lipossoma.

46. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de molécula de ácido nucleico contendo padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8, e um ácido nucleico codificando TRIM16 operativamente ligado a um promotor.

47. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente interferon (IFN).

48. Composição terapêutica, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada em um lipossoma.