BR112020013213A2 - plantas de cereais com propriedades melhoradas da parede celular - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere à planta de cevada ou a uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor reduzido de (1,3; 1,4)-ß-glucano. A planta de cevada pode transportar uma mutação no gene CslF6, em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante.

Description

PLANTAS DE CEREAIS COM PROPRIEDADES MELHORADAS DA PAREDE CELULAR CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a plantas de cevada que possuem propriedades melhoradas da parede celular. Em particular, a invenção se refere a plantas de cevada com propriedades de parede celular úteis para a produção de bebidas à base de cevada, por exemplo, cerveja. A invenção se refere ainda a métodos para a produção de bebidas à base de cevada, bem como a produtos preparados a partir das plantas de cevada da invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Nos processos comerciais de maltagem, os grãos de cevada são germinados, ou maltados, sob condições controladas que permitem a mobilização parcial das reservas de amido e proteína do endosperma amiláceo por um período de 4 - 6 d. O processo de maltagem é normalmente iniciado imergindo o grão de cevada seco em água. Esse processo é conhecido como maceração, onde o objetivo não é apenas limpar o grão, mas também aumentar seu conteúdo de umidade para cerca de 40 - 45% (p / p), para que a etapa de mobilização do endosperma a seguir ocorra mais rapidamente. Durante a absorção, a água é drenada uma vez para permitir a re-aeração do grão. Este passo é conhecido como 'descanso ao ar' e é considerado necessário, principalmente porque o grão submerso fica sem oxigênio após cerca de 16 h. Após um 'descanso ao ar' de cerca de 8 h, o grão é re-imerso em água para concluir o tratamento de maceração por mais um período de 8 horas - ou em uma série de etapas de maceração. O processo de maceração em duas etapas para aumentar o teor de umidade do grão seco para 40% ou mais, leva cerca de 32 h no total.

[003] O grão embebido é espalhado para germinação, durante o qual as enzimas secretadas pelas células epiteliais aleurona e escutelar - juntamente com algumas que já existem nas células endospermadas do amido - degradam as paredes celulares, o amido e as proteínas. O maltador geralmente visa induzir altos níveis de enzimas que degradam polissacarídeos da parede celular no grão de cevada, em particular os (1, 3; 1, 4)-B-glucanos e arabinoxilanos. Os (1, 3; 1, 4) -B-glucanos incompletamente degradados podem ser especialmente problemáticos para os fabricantes de cerveja, porque podem ser extraídos do malte em formas solúveis que formam soluções aquosas altamente viscosas que retardam os processos de filtragem na cervejaria e contribuem para indesejáveis neblina na cerveja final. Também foi demonstrado que a fabricação de cerveja com alto conteúdo de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos afeta negativamente o nível de extrato de malte. Assim, baixos níveis de solúvel (1, 3; 1, 4) -pB-glucano representam um importante parâmetro de qualidade do malte, enquanto altos níveis de enzimas (1, 3; 1, 4)-B-glucanase continuam sendo medidas importantes da qualidade do malte. Além disso, o maltador visa induzir rapidamente a síntese de tantas enzimas degradadoras de amido nos grãos quanto possível. As enzimas que degradam o amido - que incluem aàa- e -B-amilases, enzimas de remoção de amido (por exemplo, limite de dextrinase) e a-glucosidases - despolimerizam parcialmente as reservas de amido do grão para monossacarídeos, oligossacarídeos e glicose. Os produtos de despolimerização do amido são subsequentemente utilizados pelas células de levedura como fonte de carbono e são fermentados em etanol de cerveja.

[004] Como observado acima, o processo de germinação normalmente leva cerca de 5 dias. Após as etapas de germinação controlada, o malte úmido é seco a partir de um teor de umidade de 40% a 4 a 5%. Esse processo de secagem, denominado forno, consome muita energia e representa um custo importante para a indústria. Todo o processo, incluindo a secagem em estufa, é tipicamente 6 - 7 dias.

[005] Na cervejaria, o malte seco no forno é moído para abrir o grão e o conteúdo resultante é extraído com água quente em um processo conhecido como esmagamento. O material extraído inclui moléculas de amido, proteína e parede celular parcialmente degradadas, como descrito acima, e estas são ainda mais degradadas por enzimas endógenas de grãos que foram extraídas do malte. Nesta fase, alguns fabricantes de cerveja adicionam fontes de carbono adicionais - e geralmente mais baratas (adjuntos) - para apoiar o processo subsequente de fermentação de leveduras e para compensar os custos mais altos do malte. Os referidos adjuvantes podem ser farinhas de cevada, arroz, trigo ou outros cereais a partir de grãos não germinados, mas sua adição pode exigir a adição concomitante de enzimas hidrolíticas, porque existem enzimas endógenas insuficientes no malte para degradar os componentes do adjuvante. As enzimas adicionadas são geralmente de extratos não purificados e relativamente baratos de culturas de leveduras e / ou bactérias. A adição de enzimas exógenas não é legal em alguns países, particularmente, onde a cerveja deve ser produzida em ambientes rigorosamente regulamentados.

[006] Degradação adicional do amido e outros componentes do endosperma extraídos em água quente prosseguem em um processo conhecido como sacarificação. Após o esmagamento, os extratos são filtrados, geralmente em um modo mais seco, e resfriados. O extrato pode ser fervido na presença de lúpulo ou extrato de lúpulo, e após arrefecimento são adicionadas culturas de leveduras para a fermentação dos açúcares libertados em etanol. A cerveja produzida é geralmente amadurecida e filtrada antes do engarrafamento. A cerveja também pode ser gaseificada antes do engarrafamento.

[007] A cevada é o cereal mais popular usado para produzir cerveja. É a grande quantidade de amido contida em seus grãos que fez da cevada uma matéria-prima muito atraente para a indústria cervejeira. Para garantir que o potencial de fermentação do grão de cevada seja totalmente utilizado, é crucial ter uma degradação ideal das estruturas da parede celular que envolvem os grânulos de amido. Ao simplificar sua arquitetura, o núcleo de cevada é constituído em grande parte por um endosperma amiláceo, cercado por uma camada de aleurona. A aleurona da cevada e as paredes celulares do endosperma são compostas principalmente por polissacarídeos não amiláceos (NSP). O endosperma amiláceo consiste em 75% de (1-3,1-4)-B-glucanos (BGL) e 20% de arabinoxilano (AX), enquanto a aleurona é composta por 71% de AX e 26% de BGL. BGLs de cevada são sem ramificação, cadeias lineares longas de resíduos de glicose ligadas por ligações B- (1-3)

e B-(1-4). A cevada AX consiste em um esqueleto molecular D- xilanopiranosil ligado por ligações B-(1-4), aleatoriamente com L-arabinofuranose conectada através de ligações a-(1-2) e a-(1-3).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Conforme descrito acima, uma das etapas de produção de cerveja que consome tempo e energia é o malte. Um passo limitador da taxa no processo de maltagem é a redução dos níveis de (1, 3; 1, 4) -B-glucanos nos grãos de cevada em germinação para níveis baixos aceitáveis.

[009] Por conseguinte, é necessário fornecer materiais e métodos, o que pode reduzir o tempo necessário para a maltagem. Em particular, são necessárias plantas de cevada com baixos níveis de (1, 3; 1, 4) -B- glucanos. Entretanto, plantas de cevada com uma ausência completa de (1, 3; 1, 4) -B- glucanos apresentam redução na altura, vigor e rendimento das plantas (aproximadamente 70% do controle) (Taketa et al., 2012). De fato, Taketa et al. conclui que "à medida que as características agronômicas são reduzidas, a utilidade dos mutantes bgl no malte pode não ser boa ...". Hu et al. (2014) descreve um mutante de cevada m351 compreendendo níveis muito baixos de ligação mista de B-glucano de (1-3, 1-4) (< 1,6%). No entanto, o mutante m351 exibiu dureza de grão reduzida, como mostrado por um aumento de mais de quatro vezes na taxa de quebra de grão em comparação com seu parental, e sensibilidade a sais, resultando em germinação mais fraca sob condição de sal de 400 mM.

[0010] Consequentemente, são necessárias plantas de cevada com baixos níveis de (1, 3; 1, 4) B - glucanos, que ao mesmo tempo apresentam boas características agronômicas e dureza dos grãos.

[0011] A cevada (1, 3; 1, 4) -B-glucanas compreende resíduos de celotriosil (DP3) e celotetraosil (DP4) em proporções, que normalmente estão na faixa de 2,5 a 4. A proporção DP3 / DP4 tem um impacto nas propriedades de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos.

[0012] Em uma concretização, a invenção fornece plantas de cevada com um baixo nível de (1, 3; 1, 4)-bB- glucanos com uma razão DP3 / DP4 comparável à proporção DP3 / DP4 da cevada do tipo selvagem. Tais plantas de cevada podem ter um som agronômico e ter grãos de cevada com tendência reduzida à ruptura. Um problema técnico resolvido pela presente invenção é o fornecimento de plantas de cevada com um baixo nível de (1, 3; 1, 4) -3-glucanos, em que as plantas de cevada têm ao mesmo tempo características agronômicas aceitáveis, uma frequência aceitável de quebra dos grãos (por exemplo, < 2 vezes a da planta selvagem sem mutação CslF6, mas de outra forma com o mesmo genótipo) e, além disso, uma proporção DP3 / DP4 semelhante à cevada selvagem.

[0013] Em uma concretização, a invenção fornece plantas de cevada com um baixo nível de (1, 3; 1, 4)-6- glucanos com uma proporção DP3 / DP4 alta ou baixa. Tais plantas de cevada podem ter grãos agronômicos e podem ter um nível mais alto de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos insolúveis. (1 3; 1, 4)-B-glucanos insolúveis podem potencialmente ser removidos durante os processos de fabricação de cerveja e,

portanto, são preferíveis em algumas concretizações. Burton & Fincher 2014 especulou que a solubilidade das moléculas de (1, 3; 1, 4) - B - glucanos pode ser prevista a partir da razão DP3: DP4, e que razões altas e baixas podem resultar em agregados mais insolúveis.

[0014] Jobling et al. (2015) descrevem a expressão de CsIF em um sistema artificial na folha do tabaco e descrevem que um único aminoácido (Ile757) no quarto domínio transmembranar de CsIF controla a proporção DP3: DP4, no entanto, nem a modificação desse domínio nem a proporção DP3: DP4 são descritos como correlacionados com a quantidade de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos.

[0015] Um problema técnico resolvido pela presente invenção é o fornecimento de plantas de cevada com um baixo nível de (1, 3; 1, 4) -B-glucanos, em que as plantas de cevada têm ao mesmo tempo características agronômicas aceitáveis e, além disso, um DP3 útil / DP4.

[0016] Num aspecto, a invenção fornece plantas de cevada que transportam uma mutação de aminoácidos únicos nos domínios transmembranares. A invenção demonstra surpreendentemente que tais plantas de cevada compreendem um baixo nível de (1, 3; 1, 4) -3-glucanos (tipicamente na faixa de 1,7 a 5%) são viáveis, são sonoras agronômicas e têm rendimentos comparáveis com outras cultivares de cevada. Tais plantas de cevada são particularmente úteis para métodos de produção de bebidas à base de cereais com tempo de germinação reduzido.

[0017] Além disso, a presente invenção fornece métodos e ferramentas para fornecer plantas de cevada com um conteúdo fino (1, 3; 1, 4)-B-glucanos. Assim, as plantas de cevada da invenção não apenas têm um baixo conteúdo de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos, mas a razão DP3: DP4 das plantas de cevada também pode ser controlada.

[0018] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de cevada ou uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano, e, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no Gene CslF6, em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o referido Csl1F6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido em um domínio localizado na membrana do CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado Ou a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar, em que os domínios localizados na membrana de CslF6 consistem nos aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[0019] Também é um aspecto da invenção fornecer produtos vegetais preparados a partir da referida planta de cevada, bem como métodos de preparação de produtos vegetais a partir da referida planta de cevada. As plantas de cevada da presente invenção podem ser vantajosamente usadas para preparar produtos vegetais, por exemplo, mosto, com uma viscosidade reduzida em comparação com mosto preparado a partir de grãos de uma planta de cevada portando um gene Csl1F6 do tipo selvagem, mas com o mesmo genótipo da cevada planta de plantas de cevada da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A Figura 1 mostra o teor de (1, 3; 1, 4)-bB- glucanos (B-glucano ou BGL abreviado) dos mutantes identificados pelo método de Identificação de mutações digitais (DMI) (Mutl, 2, 3 e 4 com a referência correspondente 1) ou por sequenciação (Mut5 e referência correspondente). As barras representam +/- DP;

[0021] A Figura 2 mostra razão DP3: DP4 de mutantes identificados pelo método DMI (Mutl, 2, 3, 4 com a correspondente referência 1) ou por sequenciamento (Mut5 e a correspondente referência).

[0022] A Figura 3 mostra um modelo da proteína CslF6 incorporada na membrana plasmática. As mutações indicadas representam os mutantes DMI.

[0023] A Figura 4 mostra um exemplo de equipamento útil para preparar malte verde. O equipamento compreende um tanque (2) no qual os grãos podem ser imersos em uma solução aquosa e arejados continuamente. O equipamento compreende uma entrada para grãos de cereais (1), um tanque, por exemplo, um tanque de maceração (2); entradas de gás, por exemplo, pedras de sinterização (3); uma bomba, por exemplo, uma bomba de ar (4); uma saída para grãos de cereais (5); uma bomba de grãos (6); um equipamento para dividir finamente grãos de cereais, por exemplo, um moinho (7); uma entrada (8); uma embarcação, por exemplo, uma embarcação de esmagamento (9), e; uma tomada (10).

[0024] A Figura 5 mostra as atividades de a-amilase (a), B-amilase (b) e dextrinase de limite livre (c) medidas no Mutante 2 (Mutante) e no cv. Grãos paustianos (referência) durante a maltagem.

[0025] A Figura 6 mostra o conteúdo de (1, 3; 1, 4)- B-glucanos no Mutante 2 (Mutante) e na cv. Grãos paustianos (referência) amadurecem grãos de cevada (0 dia) e em malte verde aos 1, 2, 3, 4, 5, 6 dias, bem como nos maltes moídos. (7 dias)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0026] Como usado aqui, "um" pode significar um ou mais, dependendo do contexto em que é usado.

[0027] O termo "adjuvante", como aqui utilizado, se refere a fontes de matérias-primas ricas em carbono adicionadas durante a preparação da cerveja. O adjunto pode ser um grão de cereal não germinado, que pode ser moído juntamente com os grãos germinados preparados de acordo com a invenção. O adjunto também pode ser um xarope, açúcar ou semelhante.

[0028] O termo "aminoácido", conforme usado aqui, se refere a um aminoácido proteogênico. De preferência, os aminoácidos “proteogênicos são um dos 20 aminoácidos codificados pelo código genético padrão. Os códigos de uma e três letras da IUPAC são usados para nomear aminoácidos.

[0029] O termo "aminoácido correspondente a X" é usado aqui para descrever os aminoácidos de um determinado polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo Csl1F6 mutante) em relação aos aminoácidos de um polipeptídeo de referência (por exemplo, CslF6 da SEQ ID NO: 1). Após o alinhamento entre o referido polipeptídeo e o polipeptídeo de referência,

um aminoácido corresponde a X se estiver na mesma posição que X no referido alinhamento.

[0030] O termo "amilose" se refere a homopolímeros de D-glicose. A amilose tem uma estrutura molecular linear, pois suas unidades de glicose são quase exclusivamente ligadas por ligações a-l-4-glicosídicas.

[0031] o termo "amilopectina" se refere a homopolímeros de D-glicose. As moléculas de amilopectina contêm ligações a-l-6-glicosídicas frequentes. Eles introduzem pontos de ramificação nas cadeias de glicose ligadas por um a 1-4, resultando em aglomerados de cadeias paralelas aparecendo em intervalos regulares ao longo do eixo da molécula.

[0032] o termo "aproximadamente" quando aqui utilizado em relação a valores numéricos significa preferencialmente + 10%, mais preferencialmente, + 5%, ainda mais preferencialmente, + 1%.

[0033] O termo "cevada" em referência ao processo de fabricação de bebidas à base de cevada, como cerveja, particularmente quando usado para descrever o processo de maltagem, significa grãos de cevada. Em todos os outros casos, salvo indicação em contrário, "cevada" significa a planta de cevada (Hordeum vulgare, L.), incluindo qualquer linhagem, cultivar ou variedade, enquanto parte de uma planta de cevada pode ser qualquer parte de uma planta de cevada, por exemplo, qualquer tecido ou célula.

[0034] O termo "farinha de cevada", conforme aqui utilizado, se refere a grãos de cevada moídos.

[0035] Uma planta "cereal", como aqui definida, é um membro da família de plantas Poaceae, cultivada principalmente por suas sementes ou grãos contendo amido. As plantas de cereais incluem, entre outras, cevada (Hordeum), trigo (Triticum), arroz (Oryza), milho (Zea), centeio (Secale), aveia (Avena), sorgo (Sorghum) e Triticale, um centeio híbrido de trigo.

[0036] O termo "aminoácido carregado", conforme usado aqui, se refere a aminoácidos com cadeias laterais eletricamente carregadas. De preferência, o aminoácido carregado é selecionado do grupo consistindo em Arg, His, Lys, Asp e Glu. Os aminoácidos com carga negativa são preferencialmente selecionados do grupo que consiste em Asp e Glu.

[0037] O termo "rebento", como aqui utilizado, se refere ao broto de crescimento embrionário que é visível durante a fase de germinação de um grão de cereal.

[0038] O termo "a-amilase"

[0039] O termo "DP", conforme aqui utilizado, se refere ao grau de polimerização e indica o número de unidades de glicose ligadas oa-1,4 em cadeias laterais de amilopectina. Assim, a título de exemplo, DP3 se refere a cadeias laterais de amilopectina que consistem em uma sequência de 3 unidades de glicose ligadas por 3 a-l1 e 4. Da mesma forma, DP4 se refere a cadeias laterais de amilopectina que consistem em uma sequência de 4 unidades de glicose ligadas por a-1,4. O termo "razão DP3: DP4" de (1, 3; 1, 4) -B-glucanos, conforme aqui utilizado, se refere à proporção de cadeias laterais de amilopectina que consiste em uma sequência de 3 unidades de glicose ligadas por 3 a-1,4 e cadeias laterais de amilopectina que consistem em uma sequência de 4 a-l1,4 unidades de glicose ligadas dentro dos referidos (1, 3; 1, 4)-B-glucanos. A razão DP3:DP4 pode ser determinada digerindo (1, 3; 1, 4)-B-glucanos com liquenase seguida pela quantificação dos oligômeros DP3 e DP4 liberados, por exemplo, por HPAEC-PAD. Em particular, a razão DP3:DP4 pode ser determinada como descrita no Exemplo

3.

[0040] Por "codificação" ou "codificado", no contexto de um ácido nucleico especificado, entende-se que compreende a informação para tradução na proteína especificada. Um ácido nucleico ou polinucleotídeo que codifica uma proteína pode compreender sequências não traduzidas, por exemplo, íntrons, nas regiões traduzidas do ácido nucleico, ou podem não ter essas sequências não traduzidas intervenientes, por exemplo, no CDNA. A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons.

[0041] Como aqui utilizado, "expressão" no contexto de ácidos nucleicos deve ser entendida como a transcrição e acumulação de mRNA. "Expressão" usada no contexto de proteínas se refere à tradução de mRNA em um polipeptídeo.

[0042] O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia polipeptídica; inclui regiões que precedem e seguem a região de codificação (promotora e terminadora). Além disso, os genes das plantas geralmente consistem em éxons interrompidos por íntrons.

[0043] O termo "grão germinado" como aqui utilizado se refere a um grão que desenvolveu uma cavidade visível e uma haste visível.

[0044] O termo "iniciação da germinação", conforme aqui utilizado, se refere ao ponto no tempo em que os grãos de cevada com um teor de água inferior a 15% são contatados com água suficiente para iniciar a germinação.

[0045] O termo "B-glucanase" como aqui utilizado se refere a enzimas com potencial para despolimerizar B-glucano de cereais. Por conseguinte, a menos que seja especificado de outra forma, o termo "B-glucanase" se refere a uma endo- ou exo-enzima ou sua mistura caracterizada por atividade de (1, 3; 1, 4)-B- e/ou (l, 4) -B-glucanase.

[0046] "Teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano", conforme aqui utilizado, pode ser determinado por qualquer método útil. De preferência, o "teor de 1, 3; 1, 4)-B-glucanos " é determinado como a soma do conteúdo de QIo-bB- (1 -> 4) -QIo- B- (1 -> 3) -Glc (DP3) e QIo-bB- (1-> 4) -QIo-b- (1-> 4) - QIo-b- (1-> 3) -QIO (DP4) oligômeros. W0O conteúdo dos oligômeros DP3 e DP4 pode, por exemplo, ser determinado por digestão com liquenase de (1, 3; 1, 4) º - glucanos, seguido de quantificação, por exemplo, por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). De preferência, o conteúdo de (1, 3; 1, 4) º - glucano é determinado como descrito aqui abaixo no Exemplo 3.

[0047] O termo "(1, 3; 1, 4)-B-glucano sintase", como aqui utilizado, deve ser considerado como qualquer proteína que catalise a síntese de (1, 3; 1, 4)-fB-glucano e, opcionalmente, catalise a polimerização de monômeros de glucopiranosil. Por exemplo, a (1, 3; 1, 4) -B-glucano sintase pode ser um polipeptídeo codificado por um gene CsIF ou um seu homólogo funcional.

[0048] O termo "núcleo" é definido para incluir a cariopsia do cereal, também denominada semente interna. Além disso, o núcleo pode compreender o lema e a paleia. Na maioria das variedades de cevada, o lema e a paleia aderem à cariopsia e fazem parte do núcleo após a trilha. Contudo, também ocorrem variedades de cevada nua. Nestas, a cariopsia está livre do lema e da paleia e sai livre como no trigo. Os termos "núcleo" e "grão" são aqui usados indiferentemente.

[0049] O termo "maltagem", tal como aqui utilizado, se refere a uma germinação controlada de grãos de cereais (em particular grãos de cevada) ocorrendo sob condições ambientais controladas. Em algumas concretizações "maltagem" pode ainda compreender uma etapa de secagem dos referidos grãos de cereais germinados, por exemplo, por secagem em estufa.

[0050] O termo "malte verde", como aqui utilizado, se refere a grãos de cereais germinados, que não foram submetidos a uma etapa de secagem em estufa. Em geral, os referidos grãos de cereais foram germinados sob condições ambientais controladas. Em algumas concretizações, o malte verde é malte verde moído.

[0051] O termo "malte seco em estufa", como aqui utilizado, se refere a grãos de cereais germinados, que foram secos por secagem em estufa. Em geral, os referidos grãos de cereais foram germinados sob condições ambientais controladas. Em algumas concretizações, o malte seco em forno é malte seco em forno moído.

[0052] "Purificação" é a incubação de malte moído (por exemplo, malte verde ou malte seco em estufa) e / ou grãos de cereais não germinados em água. A trituração é preferencialmente realizada em temperatura (s) específica (s) e em um volume específico de água.

[0053] "Mutações" incluem deleções, inserções, substituições, transversões e mutações pontuais nas regiões codificantes e não codificantes de um gene. As deleções podem ser do gene inteiro ou apenas de uma parte do gene. As mutações pontuais podem dizer respeito a alterações de um par de bases e podem resultar em códons de parada prematuros, mutações de deslocamento de quadro, mutação de um local de emenda ou substituições de aminoácidos. Um gene compreendendo uma mutação pode ser referido como um "gene mutante". Se o referido gene mutante codificar um polipeptídeo com uma sequência diferente do tipo selvagem, o referido polipeptídeo pode ser referido como um "polipeptídeo mutante".

[0054] O termo "moído" se refere ao material (por exemplo, grãos de cevada ou malte), que foi finamente dividido, por exemplo, por corte, moagem, moagem ou trituração. Os grãos de cevada podem ser moídos enquanto úmidos usando, por exemplo, um moedor ou um moinho úmido. Os grãos de cevada moídos ou o malte moído são suficientemente finamente divididos para tornar o material útil para extratos aquosos. Os grãos de cevada moídos ou o malte moído não podem ser regenerados em uma planta intacta por métodos essencialmente biológicos.

[0055] O termo "aminoácido não polar", conforme aqui utilizado, se refere a aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas. De preferência, o aminoácido não polar é selecionado do grupo que consiste em Ala, Val, mentira, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp e Gly, mais preferencialmente do grupo que consiste em Ala, Val, mentira, Leu, Met, Phe, Trp e Gly.

[0056] O termo "produto vegetal" significa um produto resultante do processamento de uma planta ou material vegetal. O referido produto vegetal pode assim, por exemplo, ser malte verde, malte seco em estufa, mosto, uma bebida fermentada ou não fermentada, um alimento ou um produto alimentar.

[0057] O termo "aminoácido polar", conforme usado aqui, se refere a aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas. De preferência, o aminoácido polar é selecionado do grupo que consiste em Ser, Thr, Asn e Gin.

[0058] O termo "progênie", conforme usado aqui, significa uma planta, que direta ou indiretamente é originária de uma determinada planta. Assim, a progênie não se limita a direcionar a primavera, mas também inclui a primavera após várias gerações. Em geral, a progênie de uma planta de cevada portadora de uma mutação específica também carrega essa mutação específica. Assim, a progênie de uma planta de cevada portadora de uma mutação específica no gene Csl1F6 também carrega essa mutação específica.

[0059] O termo "identidade de sequência", conforme aqui utilizado, se refere à% de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos entre uma sequência candidata e uma sequência de referência após o alinhamento. Assim, uma sequência candidata que compartilha 80% de identidade de aminoácidos com uma sequência de referência requer que, após O alinhamento, 80% dos aminoácidos na sequência candidata sejam idênticos aos aminoácidos correspondentes na sequência de referência. A identidade de acordo com a presente invenção é determinada por meio de análise computacional, como, sem limitações, o programa de alinhamento por computador Clustal Omega para alinhamento de sequências polipeptídicas (Sievers et al. (11 de outubro de 2011) Molecular Systems Biology 7: 539, PMID: 21988835; Li et al. (06 de abril de 2015) Nucleic Acids Research 43 (Wl): W580-4 PMID: 25845596; McWilliam et al., (13 de maio de 2013) Nucleic Acids Research 41 (problema do servidor Web): W597-600 PMID: 23671338 e os parâmetros padrão sugeridos nela. 0O software Clustal Omega está disponível na EMBL-EBI em https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/. Usando este programa com suas configurações padrão, a parte madura (bioativa) de uma consulta e um polipeptídeo de referência são alinhados. O número de resíduos totalmente conservados é contado e dividido pelo comprimento do polipeptídeo de referência. Os algoritmos MUSCLE ou MAFFT podem ser utilizados para o alinhamento de sequências nucleotídicas. As identidades de sequência podem ser calculadas de maneira semelhante à indicada para sequências de aminoácidos. A identidade da sequência como aqui fornecida é assim calculada ao longo de todo o comprimento da sequência de referência.

[0060] O termo "amido", conforme usado aqui, se refere a uma composição de uma ou de ambas as macromoléculas discretas: amilose e amilopectina.

[0061] O termo "maceração", como aqui utilizado, se refere ao processo de aumentar o teor de água de um grão de cereal.

[0062] O termo "teor de água" de um grão, tal como aqui utilizado se refere à % em H20 p / p no referido grão.

[0063] O termo "tipo selvagem Csl1F6", conforme aqui utilizado, se refere a um gene que codifica um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[0064] As atividades enzimáticas dos grãos de cereais, conforme aqui utilizadas, se referem às atividades medidas na farinha preparada a partir do tipo de grão especificado. Por exemplo, 10 U / gq de atividade da a-amilase por grama de grão de cereal se refere à referida atividade de a-amilase (10 U) medida em um extrato aquoso derivado de 1 g de farinha (matéria seca) da atividade de a-amilase de cereal é determinada por A atividade da b-amilase K-CERA 01/12 (protocolo e kit disponível em Megazyme, Irlanda) é determinada pelo K-BETA3 (protocolo e kit disponível em Megazyme, Irlanda). A atividade de limite-dextrinase é determinada pelo T-LDZ1000 (protocolo e kit disponível na Megazyme, Irlanda).

[0065] O volume de um gás, como aqui indicado, se refere ao volume do referido gás a 1 atm e 20 º C.

[0066] O volume de 07 como aqui indicado se refere ao volume de 0; a 1 atm e 20 º C. Nas concretizações da invenção em que 07; é compreendido em uma mistura de gases, então o volume total da mistura de gases pode ser determinado e o volume de 07 pode ser calculado como a porcentagem do volume total constituído por 02 . A título de exemplo, o ar atmosférico compreende 21% de 07. Assim, o volume de O 2 no ar atmosférico, conforme aqui utilizado, é de 21% do volume total de ar atmosférico.

[0067] O termo "mosto" significa um extrato líquido de malte e / ou grãos de cereais, como malte moído e / ou grãos de cereais moídos e, opcionalmente, adjuvantes adicionais. O mosto é geralmente obtido por trituração, opcionalmente seguido de "aspersão", em um processo de extração de açúcares residuais e outros compostos dos grãos gastos após trituração com água quente. 0O sparking é tipicamente conduzido em um lauter tun, um filtro de mistura ou outro aparelho para permitir a separação da água extraída dos grãos gastos. O mosto obtido após o esmagamento é geralmente referido como "primeiro mosto", enquanto o mosto obtido após a aspersão é geralmente referido como "segundo mosto". Se não especificado, o termo mosto pode ser o primeiro, o segundo ou uma combinação de ambos. Durante a produção convencional de cerveja, o mosto é fervido juntamente com o mosto.

Cs1F6

[0068] A presente invenção fornece uma planta de cevada ou uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene Csl1F6 e em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante.

[0069] A sequência de uma sequência de codificação completa de CslF6 (CslF6) semelhante à celulose sintase do tipo selvagem da cultivar Sloop de cevada Hordeum vulgare é aqui fornecida como SEQ ID NO: 2.

[0070] A sequência de uma sequência polipeptídica Csl1F6 do tipo celulose sintase do tipo selvagem da cultivar Sloop de cevada Hordeum vulgare é aqui apresentada como SEQ ID NO: 1. Além da sequência aqui apresentada como SEQ ID NO: 1, o polipeptídeo CslF6 de tipo selvagem também pode transportar um polimorfismo ASSOT (Taketa et al. (2012)). Por conseguinte, o polipeptídeo CslF6 do tipo selvagem também pode ter a sequência aqui fornecida como SEQ ID NO: 3.

[0071] Apesar do esforço significativo de pesquisa, as funções particulares dos genes Csl individuais são amplamente desconhecidas. Os genes Csl foram subdivididos em oito grupos designados CslA a CsIH. De acordo com a presente invenção, foi revelado que as (1, 3; 1, 4)-B-glucano sintases são codificadas por membros da família de genes CsIF. Planta de cevada com mutação no gene CslF6

[0072] A presente invenção fornece uma planta de cevada ou uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene Csl1F6 e em que o referido gene Csl1F6 mutado codifica um polipeptídeo Csl1F6 mutante. A mutação no gene CslF6 pode ser qualquer uma das mutações aqui descritas, no entanto, nas concretizações preferidas da invenção, a mutação é uma mutação pontual na região de codificação do gene CslF6.

[0073] O polipeptídeo CslF6 mutante codificado pelo referido gene CslF6 mutante pode ser qualquer polipeptídeo CslF6 mutante, no entanto, de preferência, o referido polipeptídeo CslF6 mutante contém uma substituição de aminoácidos.

[0074] Em particular, o polipeptídeo CslF6 mutante pode compreender uma substituição de um aminoácido em um domínio localizado na membrana de CslF6. O polipeptídeo Csl1F6 mutante pode preferencialmente compreender uma ou mais das seguintes substituições em um domínio localizado na membrana: . substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado; e . substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar.

[0075] Conforme usado aqui, os termos "substituição do aminoácido XX pelo aminoácido YY" ou "substituição do aminoácido XX por aminoácido YY" se refere ao aminoácido XX em uma sequência de referência (normalmente a sequência do tipo selvagem CslF6) sendo substituída pelo aminoácido AA.

[0076] Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo Csl1F6 mutante pode compreender uma substituição de um aminoácido em qualquer um dos domínios localizados na membrana de CslF6. Os domínios localizados por membrana de Csl1F6 são mostrados aqui na Tabela 3.

[0077] Em uma concretização, o polipeptídeo CslF6 mutante pode compreender uma substituição de um aminoácido não polar a um aminoácido carregado, em um ou mais dos seguintes domínios localizados na membrana de CslF6: aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3.

[0078] Em uma concretização, a planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, resultando em um gene mutante CslF6 que codifica um polipeptídeo mutante CslF6 compreendendo uma substituição, em que a substituição pode ser a substituição de um aminoácido não polar a um aminoácido carregado, em um ou mais dos seguintes domínios localizados por membrana de CslF6: aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[0079] Em uma concretização, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste nos aminoácidos 835 a 857 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado. O referido aminoácido não polar pode, por exemplo, ser qualquer um dos aminoácidos 835 a 857, que estão sublinhados na Tabela 3. Por exemplo, a referida substituição pode ser uma substituição de um aminoácido não polar a um aminoácido carregado negativamente.

[0080] Por exemplo, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847 por um aminoácido carregado. Por exemplo, a referida substituição pode ser uma substituição da glicina (G) na posição 847 por um aminoácido carregado negativamente, por exemplo, Glu ou Asp.

[0081] De preferência, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é a substituição da glicina (G) na posição 847 por um ácido glutâmico (E)

[0082] Em uma concretização, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste nos aminoácidos 741 a 758 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado. O referido aminoácido não polar pode, por exemplo, ser qualquer um dos aminoácidos 741 a 758, que estão sublinhados na Tabela 3. Por exemplo, a referida substituição pode ser uma substituição de um aminoácido não polar a um aminoácido carregado negativamente.

[0083] Por exemplo, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748 por um aminoácido carregado. Por exemplo, a referida substituição pode ser uma substituição da glicina (G) na posição 748 por um aminoácido carregado negativamente, por exemplo, Glu ou Asp. De preferência, o polipeptídeo Csl1F6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que a referida substituição é substituição da glicina (G) na posição 748 por um ácido aspártico (D). Assim, a planta de cevada pode transportar um gene HvCsl1F6 mutado que codifica uma proteína HvCslF6 mutante compreendendo uma mutação GlyGAsp do aminoácido 748 da SEQ

ID NO: 1.

[0084] Em uma concretização, a planta de cevada pode transportar uma mutação GOA do nucleotídeo 2243 da sequência de codificação do gene HvCsl1F6 (SEQ ID NO 2).

[0085] Em uma concretização, o polipeptídeo CslF6 mutante pode compreender uma substituição de um aminoácido em qualquer um dos domínios localizados na membrana de Csl1F6. Por exemplo, a substituição pode ser a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar, em um ou mais dos seguintes domínios localizados na membrana do Csl F6: aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

[0086] O polipeptídeo CslF6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o CslF6 mutante compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste nos aminoácidos 700 a 731 de Csl1F6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido polar para um aminoácido não polar. O referido aminoácido polar pode, por exemplo, ser qualquer um dos aminoácidos 700 a 731, que está sublinhado na Tabela 3.

[0087] Por exemplo, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709 por um aminoácido não polar.

[0088] De preferência, o polipeptídeo CslF6 mutante pode ser CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição da treonina (T) na posição 709 por uma isoleucina (1).

[0089] Para os fins deste pedido de patente, sementes da planta de cevada (Hordeum vulgare) designada "Mutante 2" foram depositadas na NCIMB Ltd. Ferguson "Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA Escócia, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste. A planta de cevada Mutant 2 foi depositada em 12 de novembro de 2018 e recebeu o número de acesso NCIMB 43273.

[0090] Em uma concretização, a planta de cevada da invenção é a planta de cevada (Hordeum vulgare) depositada em 10-10-2018 no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 43273 e referida como "Mutante 2"; ou sua progênie. Assim, a planta de cevada da invenção pode ser a planta de cevada Mutante 2 depositada no NCIMB em 10-10-2018 e com o número de acesso NCIMB 43273, ou qualquer planta de cevada descendente, em que a planta de cevada carrega uma mutação GOA do nucleotídeo 2243 da sequência de codificação do gene HvCsl1F6 (SEQ ID NO 2) e / ou em que o gene HvCsl1F6 da referida planta de cevada codifica uma proteína HvCslF6 mutante compreendendo uma mutação GlyOAsp do aminoácido 748 da SEQ ID NO: 1.

[0091] Curiosamente, uma planta de cevada portando uma mutação no gene CslF6 levando a um gene mutante CslF6 que codifica um polipeptídeo mutante CslF6 portando uma mutação fora dos aminoácidos localizados na membrana (G732D) não mostrou nenhuma redução significativa do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano. Em uma planta de cevada que compreende uma mutação no gene CslF6, levando a um códon de parada prematuro (T676Stop), os níveis de (1, 3; 1, 4)-B-glucano eram extremamente baixos e essas plantas de cevada não tinham boas propriedades agronômicas. Assim, essas plantas reduziram significativamente a fertilidade e o crescimento das plantas. Planta de cevada

[0092] A planta de cevada de acordo com a invenção pode ser qualquer planta da espécie Hordeum vulgare, incluindo qualquer linhagem, cultivar ou variedade.

[0093] "Cevada selvagem", Hordeum vulgare ssp. spontaneun é considerado a progenitora das formas cultivadas atuais de cevada. Misturas de cevada domesticadas, mas heterogêneas, são chamadas de landraces de cevada. Hoje, a maioria das terras foi deslocada em agricultura avançada por cultivares de linhagem pura. Comparado com as variedades de terra, as cultivares modernas de cevada têm inúmeras propriedades melhoradas (Nevo, 1992; Pelger et al., 1992).

[0094] Dentro da presente invenção, o termo "planta de cevada" compreende qualquer planta de cevada, como raças de cevada ou cultivares modernas de cevada. Assim, a invenção se refere a qualquer planta de cevada compreendendo uma mutação no gene CslF6.

[0095] Contudo, as plantas de cevada preferidas para utilização com a presente invenção são cultivares de cevada modernas ou linhas puras. A cultivar de cevada a ser usada com a presente invenção pode, por exemplo, ser selecionada do grupo que consiste em Paustian, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym,

Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina e Jersey preferencialmente a partir do grupo consistindo de Haruna Nijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda e Power, preferencialmente a partir do grupo consistindo de Paustian, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett e Jersey, preferencialmente a partir do grupo consistindo de Paustian, Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class, Vintage, Applaus, Bowie, Broadway, Champ, Chanson, Charles, Chimbon, Cosmopolitan, Crossway, Dragoon, Ellinor, Embrace, Etoile, Evergreen, Flair, Highway, KWS Beckie, KWS Cantton, KWS Coralie, KWS Fantex, KWS Irina, KWS Josie, KWS Kellie, LG Diablo, LG Figaro, LG Nabuco, LG Tomahawk, Laureate, Laurikka, Lauxana, Luther, Odyssey, Ovation, Prospect, RGT Elysium, RGT Observer, RGT Planet, Rotator, Sarbi, Scholar, Subway e Golden Promise.

[0096] A planta de cevada pode estar em qualquer forma adequada. Por exemplo, a planta de cevada, de acordo com a invenção, pode ser uma planta de cevada viável, uma planta seca, uma planta homogeneizada ou um grão de cevada moído. A planta pode ser uma planta madura, um embrião, uma semente, uma semente germinada, uma semente maltada (por exemplo, na forma de malte verde ou malte seco em estufa), uma semente maltada moída, uma semente moída ou similar.

[0097] Partes de plantas de cevada podem ser qualquer parte adequada da planta, como grãos, embriões, folhas, caules, raízes, flores ou frações dos mesmos. Uma fração pode, por exemplo, ser uma seção de um caroço, embrião, folha, caule, raiz ou flor. Partes de plantas de cevada também podem ser uma fração de um homogenato ou uma fração de uma planta ou núcleo de cevada moída.

[0098] Em uma concretização da invenção, partes de plantas de cevada podem ser células da referida planta de cevada, tais como células viáveis que podem ser propagadas in vitro em culturas de tecidos. Em outras concretizações, no entanto, as partes de plantas de cevada podem ser células viáveis que não são capazes de amadurecer em uma planta de cevada inteira, isto é, células que não são um material reprodutivo.

Características de plantas de cevada portadoras de mutação em Cs1F6

[0099] A invenção fornece plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6. Uma grande vantagem de tais plantas de cevada é que os grãos da referida planta de cevada têm um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano.

[00100] Uma vantagem proporcionada pelas plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6 e com um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano é que o menor conteúdo de (1, 3; 1, 4)-B-glucano no grão pode ser benéfico no processo de fermentação, pois pode ajudar a garantir que a quantidade ideal de açúcar esteja disponível para a fermentação da levedura no final do esmagamento e, portanto, reduza o custo total da matéria-prima. Outra vantagem proporcionada pelas plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6 e com grãos com teor reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano é que o baixo teor de (1, 3; 1, 4)-bB- glucano na cevada pode melhorar procedimentos industriais, como filtrabilidade. Além disso, essas plantas de cevada são particularmente úteis para processos de maltagem com economia de energia. Enquanto a redução de (1, 3; 1, 4)-bB- glucano pode ser benéfica, níveis muito baixos de (1, 3; 1, 4) -B-glucano podem ser também problemáticas e podem resultar e fracas propriedades agronômicas.

[00101] Assim, em uma concretização, a planta de cevada portadora de uma mutação no gene CslF6 pode ser uma planta de cevada com grãos com teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano na faixa de 1 a 3% em peso seco do total de grãos .

[00102] As plantas de cevada da invenção portando uma mutação no gene CslF6 e tendo núcleos com um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano são caracterizadas ainda por terem boas qualidades agronômicas, como qualidades agronômicas comparáveis às tipo selvagem.

[00103] A planta de cevada pode ser uma planta de cevada com grãos com um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1 a 5% em peso seco do total de grãos, por exemplo, 1 a 3% em peso seco de núcleos totais, como 1,3 a 4% em peso seco de núcleos totais, por exemplo, 1,3 a 3% em peso seco de núcleos totais, de preferência 1,3 a 2% em peso seco de núcleos totais.

[00104] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido em um ou mais dos seguintes domínios localizados na membrana de Csl1F6: aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO: 3, em que a substituição é uma substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado ou a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar e em que os grãos da referida planta de cevada podem têm um teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano na faixa de 1,0 a 3,0 em peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1.0 a 3.0% em peso seco de grãos totais, como um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 2,5% em peso seco de grãos totais, de preferência um (1, 3; 1, 4) Teor de -3-glucano na faixa de 1,0 a 2,0% em peso seco de grãos totais, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4) -3-glucano na faixa de 1,3 a 3,0% em peso seco de grãos totais, tal como um teor de (1, 3; 1, 4)- B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso seco do total de grãos, preferencialmente um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,7 a 3,0% em peso seco do total de grãos. Teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso seco de grãos totais, preferencialmente um teor de (1, 3; 1,

4) -B-glucano na faixa de 1,7 a 3,0% em peso seco peso do total de grãos. Teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso seco de grãos totais, preferencialmente um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,7 a 3,0% em peso seco peso do total de grãos.

[00105] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene CslF6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido glutâmico (E), e os grãos da referida planta de cevada podem ter um (1, 3; 1, 4) -3-glucano conteúdo no intervalo de 1,0 a 3,0 peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4) -3-glucana no intervalo de 1,0 a 3,0% em peso seco do total de grãos, como um (1, 3; 1, 4) -3-glucano na faixa de 1,0 a 2,5% do peso seco do total de grãos, preferencialmente um teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano na faixa de 1,0 a 2,0% do peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,3 a 3,0% em peso total de grãos totais, como um teor de (11, 3; 1, 4)- B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso total núcleos, preferencialmente um teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano na faixa de 1,7 a 3,0% do peso seco do total de núcleos.

[00106] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido aspártico (D), e os núcleos da referida planta de cevada podem ter um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano no intervalo de 1,0 a 3,0 peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano no intervalo de 1,0 a 3,0% em peso seco do total de grãos, como um (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 2,5% em peso seco do total de grãos, de preferência um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 2,0%, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano no intervalo de 1,3 a 3.0% em peso seco de grãos totais como um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso seco de grãos totais, de preferência um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,7 a 3,0% em peso seco do total de grãos.

[00107] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene CslF6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição de uma treonina (T) por uma isoleucina (I), e os grãos da referida planta de cevada podem ter um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 3,0 peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 3,0% em peso seco do total de grãos, como um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 2,5% em peso seco do total de grãos, preferencialmente,

um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,0 a 2,0% em massa peso do total de grãos, como um teor (1, 3; 1, 4)-bB- glucano na faixa de 1,0 a 1,7% em peso seco do total de grãos, por exemplo, um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,2 a 3,0% em peso seco do total núcleos, como um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,5 a 3,0% em peso seco do total de núcleos, de preferência um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1,3 a 3,0% em peso seco do total de grãos.

[00108] Em uma concretização, a planta de cevada pode ter um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos, que é reduzido para no máximo 70%, de preferência no máximo 60%, como no máximo 55 % do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos de uma cevada que compreende um gene CslF6 do tipo selvagem, mas de outro modo o mesmo genótipo.

[00109] A planta de cevada, pode ser uma planta de cevada com um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos, reduzida para pelo menos 30% e, no máximo, 60%, preferencialmente, pelo menos, 40% e, no máximo, 60% , por exemplo, pelo menos 40% e, no máximo, 55% do conteúdo de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos de uma cevada que compreende um gene CslF6 do tipo selvagem, mas de outro modo do mesmo genótipo.

[00110] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada com um teor de (1, 3; 1, 4)-6- glucano nos grãos, reduzida para pelo menos 30% e, no máximo, 60%, de preferência pelo menos 40% e no máximo 60%, por exemplo, no mínimo 40% e no máximo 55% do teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano nos grãos de uma planta de cevada da cv. Paustian.

[00111] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido glutâmico (E), e os grãos da referida planta de cevada podem ter um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano reduzido a pelo menos 30% e, no máximo, 60%, como pelo menos 40% e, no máximo, 60% do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos de uma cevada que compreende um tipo selvagem Gene CslF6, mas de outro modo o mesmo genótipo.

[00112] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido aspártico (D), e os núcleos da referida planta de cevada podem ter um teor (1, 3; 1, 4)-B-glucano reduzido a pelo menos 30% e, no máximo, 60%, como pelo menos 40% e, no máximo, 60% do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos de uma cevada que compreende um tipo selvagem Gene CslF6, mas de outro modo o mesmo genótipo.

[00113] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição de uma treonina (T) por uma isoleucina (I), e os grãos da referida planta de cevada podem ter um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano reduzido para pelo menos 30% e, no máximo, 60%, como pelo menos 40% e, no máximo, 60% do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos de uma cevada que compreende um tipo selvagem CslF6 gene, mas caso contrário do mesmo genótipo.

[00114] As plantas de cevada da invenção portando uma mutação no gene CslF6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutado, e tendo núcleos com um teor reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano, podem ainda ser caracterizadas por núcleos com um determinado DP3 : DP4, como DP3: DP4 menor que a DP3: DP4 de uma planta selvagem ou maior que a DP3: DP4 de uma planta selvagem ou semelhante à DP3: DP4 de uma planta selvagem.

[00115] Dependendo de vários fatores, DP3:DP4 diferente pode ser desejável.

[00116] As plantas de cevada do tipo selvagem são geralmente caracterizadas por uma proporção DP3:DP4 na faixa de 2,5 a 4.

[00117] Em uma concretização, as plantas de cevada da invenção compreendem (1, 3; 1, 4)-B-glucano nos grãos que têm uma proporção DP3: DP4 de no máximo 2,5, como no máximo 2,2, por exemplo, no intervalo de 1,0 a 2,2.

[00118] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido glutâmico (E), e os grãos da referida planta de cevada podem ter uma proporção DP3: DP4 de no máximo 2,5, como em o máximo de 2,2, por exemplo, no intervalo de 1,0 a 2,2.

[00119] Em uma concretização, os grãos da referida planta de cevada podem ter uma razão DP3: DP4 na faixa de 2,5a 4.

[00120] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene Csl1F6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido aspártico (D), e os grãos da referida planta de cevada podem ter uma razão DP3:DP4 na faixa de 2,5 a 4.

[00121] Em uma concretização, os núcleos da referida planta de cevada podem ter uma razão DP3: DP4 de pelo menos 3,5, como pelo menos 4,0, por exemplo, pelo menos 4,5, como no intervalo de 4 a 6.

[00122] Em uma concretização, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada carregando uma mutação no gene CslF6 e codificando um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o polipeptídeo CslF6 é um polipeptídeo CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição de uma treonina (T) por uma isoleucina (I), e os núcleos da referida planta de cevada podem ter uma razão DP3: DP4 de pelo menos 3,5, como pelo menos 4.0, por exemplo, pelo menos, 4,5, como no intervalo de 4 a 6.

[00123] (1, 3; 1, 4)-B-glucano é um componente da parede celular e a redução no nível de (1, 3; 1, 4) -B-glucano pode influenciar as plantas de cevada. Por exemplo, reduções no nível de (1, 3; 1, 4) -B-glucano e / ou alterações na razão DP3 / DP4 de (11, 3; 1, 4)-B-glucano podem resultar em grãos de cevada frágeis uma alta porcentagem de grãos quebrados.

[00124] Em uma concretização, é preferido que as plantas de cevada da invenção tenham núcleos com uma dureza de grão aceitável. Assim, em uma concretização, as plantas de cevada podem ter grãos com uma frequência de grãos quebrados inferior a 5%, tal como inferior a 3% quando determinado como descrito no Exemplo 6 abaixo.

[00125] Em particular, é preferido que a frequência de grãos partidos após a debulha de grãos das plantas de cevada da invenção seja no máximo 3 vezes mais alta, mais preferencialmente, no máximo 2 vezes maior que a frequência de grãos partidos após a debulha de grãos de uma planta de cevada que não possui uma mutação no gene CslF6, mas é idêntica. Por exemplo, plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6 que codifica uma proteína HvCslF6 mutante compreendendo uma mutação (por exemplo, um G1yGOAsp) do aminoácido 748 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 têm uma frequência de grãos partidos após debulha de grãos, que é no máximo três vezes maior, mais preferencialmente, no máximo, duas vezes maior que a frequência de grãos quebrados após a debulha de grãos de uma planta de cevada que não carrega a referida mutação, mas é idêntica. Plantas de cevada que compreendem mais de uma mutação

[00126] Além das mutações aqui descritas, as plantas de cevada também podem compreender uma ou mais mutações adicionais. Por conseguinte, a planta de cevada pode compreender uma ou mais das seguintes mutações.

[00127] Além de uma ou mais das mutações descritas acima, a planta de cevada também pode compreender uma mutação no gene que codifica LOX-1, resultando em uma perda total de LOX-1 funcional. A referida mutação pode, por exemplo, ser uma das mutações descritas no pedido de patente internacional WO 2005/087934. Por exemplo, a planta de cevada pode compreender um gene que codifica LOX-l1 compreendendo um códon de parada prematuro, o códon correspondente à base nos. 3572- 3574 da SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/087934 ou uma mutação no local de união, a referida mutação correspondendo à base no. 231 1 da SEQ ID NO: 6 da SEQ ID NO: 2 do documento WO 2005/087934.

[00128] Além de uma ou mais das mutações descritas acima, a planta de cevada também pode compreender uma mutação no gene que codifica LOX-2, resultando em uma perda total de LOX-2 funcional. A referida mutação pode, por exemplo, ser uma das mutações descritas no pedido de patente internacional WO 2010/075860. Por exemplo, a planta de cevada pode compreender um gene que codifica LOX-2 compreendendo uma mutação na posição nucleotídica 2689 da SEQ ID NO: 1 da WO

2010/075860, levando à formação de um códon de parada prematuro.

[00129] Além de uma ou mais das mutações descritas acima, a planta de cevada também pode compreender uma mutação no gene que codifica MMT, resultando em uma perda total de MMT funcional. A referida mutação pode, por exemplo, ser uma das mutações descritas no pedido de patente internacional WO 2010/063288. Por exemplo, a planta de cevada pode compreender um gene que codifica MMT compreendendo uma mutação GOA da base no. 3076 da SEQ ID NO: 3 de WO 2010/063288 ou um gene que codifica MMT compreendendo uma mutação GOA da base no. 1462 da SEQ ID NO: 16 do documento WO 2010/063288.

[00130] Além de uma ou mais das mutações descritas acima, a planta de cevada também pode compreender qualquer uma das mutações que levam ao aumento da atividade da alfa- amilase descrita no pedido co-pendente intitulado "Cevada com atividade enzimática hidrolítica aumentada" atribuída ao mesmo depositante e com a mesma data de depósito do presente pedido.

Produtos vegetais

[00131] A invenção também fornece produtos vegetais preparados a partir de uma planta de cevada com um conteúdo reduzido de (1, 3; 1, 4) -3-glucana e portando uma mutação no gene CslF6, ou uma progênie do mesmo, em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo mutante CslF6, por exemplo, qualquer uma das plantas de cevada aqui descritas.

[00132] O produto vegetal pode ser qualquer produto preparado a partir de uma planta de cevada, por exemplo, um alimento, uma ração para animais ou uma bebida. Assim, o produto vegetal pode ser qualquer uma das bebidas descritas abaixo na seção "Bebida e método de produção".

[00133] O produto vegetal também pode ser um extrato aquoso da planta de cevada e / ou malte preparado a partir de grãos da referida planta de cevada, por exemplo, o produto vegetal pode ser mosto. O referido extrato aquoso pode, por exemplo, ser preparado como descrito aqui abaixo na seção "Extrato aquoso e métodos de produção dos mesmos".

[00134] Em uma concretização, o produto vegetal pode ser malte, por exemplo, malte verde ou malte seco em forno, como qualquer um dos maltes descritos abaixo na seção "Malte verde, malte seco em forno e métodos de produção ou um produto à base de malte, como bebidas à base de malte. Embora o uso principal do malte seja para a produção de bebidas ele também pode ser utilizado em outros processos industriais, por exemplo, como fonte de enzima na indústria de panificação ou na indústria de alimentos como agente aromatizante e corante, por exemplo, na forma de malte ou farinha de malte ou indiretamente como um xarope de malte, etc. Assim, o produto vegetal, de acordo com a invenção pode ser qualquer um dos produtos acima mencionados.

[00135] Em uma concretização da invenção, o produto vegetal é farinha de cevada, isto é, farinha de cevada preparada a partir de grãos de uma planta de cevada de acordo com a invenção.

[00136] Em outro aspecto, os produtos vegetais de acordo com a invenção compreendem, ou mesmo consistem em xarope, como um xarope de cevada ou um xarope de malte de cevada. O produto vegetal também pode ser um extrato de cevada ou malte. Assim, o produto vegetal pode ser mosto. Malte verde, malte seco em forno e métodos de produção

[00137] A invenção também fornece malte preparado a partir de uma planta de cevada portadora de uma mutação no gene CslF6, por exemplo, qualquer uma das plantas de cevada aqui descritas. O referido malte pode ser malte verde ou malte seco em estufa, preparado a partir de grãos de cevada de uma planta de cevada portadora de uma mutação no gene CslF6, ou descendência do mesmo. A referida mutação pode ser qualquer uma das mutações no gene Csl1F6 aqui descrito acima.

[00138] O malte verde pode ser preparado por maltagem, ou seja, por germinação de grãos de cereais em condições ambientais controladas. Tipicamente, a referida germinação pode compreender uma etapa de maceração de grãos de cevada, seguida por uma etapa de germinação. A maceração Ee a germinação também podem ser realizadas simultaneamente ou parcialmente ao mesmo tempo. Em algumas concretizações, a produção de malte pode compreender uma etapa de secagem dos grãos germinados. A referida etapa de secagem pode de preferência ser a secagem em estufa dos grãos germinados a temperaturas elevadas. Assim, o malte seco no forno pode ser preparado submetendo o malte verde a uma etapa de secagem no forno.

[00139] Assim, em uma concretização, um método de maltagem pode compreender as etapas de: (a) fornecer grãos de uma planta de cevada, especialmente uma planta de cevada, portando uma mutação no gene CslF6;

(b) embeber os referidos grãos de cevada; (c) germinar o referido grão de cevada; e (d) secagem dos referidos grãos de cevada germinados, de preferência por secagem em estufa.

[00140] Os grãos de cevada germinados podem ser preparados por um método que compreende as etapas de (a) fornecer grãos de uma planta de cevada, especialmente uma planta de cevada, portando uma mutação no gene Cs1F6; (b) embeber os referidos grãos de cevada; (c) germinar o referido grão de cevada.

[00141] As etapas de maceração e germinação podem ser realizadas sequencialmente, simultaneamente ou parcialmente ao mesmo tempo.

[00142] Em uma concretização preferida, a maceração e a germinação são realizadas simultaneamente em um processo de germinação, que compreende a incubação de grãos de cevada em uma solução aquosa tipicamente sob aeração por no máximo 72h.

[00143] A maceração pode ser realizada por qualquer método convencional conhecido pelo técnico versado no assunto. Um exemplo não limitativo envolve maceração à uma temperatura na faixa de 10 a 25 º C com alternância de condições de seca e umidade. Durante a maceração, por exemplo, os grãos de cevada podem ser incubados úmidos no intervalo de 30 min a 3 h, seguidos de incubação a seco no intervalo de 30 min a 3 h e, opcionalmente, repetir o referido esquema de incubação no intervalo de 2 a 5 vezes. O conteúdo final de água após embeber pode, por exemplo, estar na faixa de 40 a 50%, por exemplo, na faixa de 40 a 45%.

[00144] As plantas de cevada fornecidas pela invenção são caracterizadas por transportar uma mutação no gene Csl1F6 e codificando assim um polipeptídeo Csl1F6 mutado. Uma grande vantagem de tais plantas de cevada é que os grãos têm um teor reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano e uma proporção DP3: DP4 adequada. Grãos destas plantas de cevada com teor reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano podem ser vantajosamente germinados em um processo de germinação curto. Exemplos de processos de germinação curtos úteis são descritos no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065498, o qual é aqui incorporado por referência. Um exemplo de um processo de germinação curto útil é um processo de germinação compreendendo uma etapa em que os grãos de cevada são incubados em uma solução aquosa tipicamente sob aeração, em que todo o processo de germinação é realizado por no máximo 72 h. De fato, durante a germinação (1, 3; 1, 4)-B-glucanos são geralmente pelo menos parcialmente hidrolisados por enzimas, como a B-glucanase. As enzimas hidrolíticas específicas para (1, 3; 1, 4)-B-glucano estão geralmente presentes em menor quantidade no início do processo de germinação. A presença de enzimas hidrolíticas específicas para (1, 3; 1, 4)-B-glucano aumenta à medida que o processo de germinação continua. Um processo de germinação realizado no máximo por 72 h em geral não fornece tempo suficiente para hidrolisar os (1, 3; 1, 4)-B-glucano no nível baixo desejado, se os teores de (1, 3; 1, 4) -B-glucano é alto desde o início. Contudo, as plantas de cevada da invenção já possuem um baixo nível de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos desde o início e, portanto, a hidrólise de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos durante a germinação é menos crítico.

[00145] Como descrito acima, a germinação pode compreender uma etapa de incubação de grãos de uma planta de cevada carregando uma mutação no gene CslF6 em uma solução aquosa sob aeração. Os grãos de cevada podem ser incubados na referida solução aquosa por tempo suficiente para permitir a germinação da maioria dos referidos grãos de cevada. Os grãos de cevada também podem ser incubados na referida solução aquosa por tempo suficiente para obter um teor de água de pelo menos 35%, preferencialmente de pelo menos 37%, por exemplo na faixa de 35 a 60%. Normalmente, os grãos de cevada são incubados na solução aquosa por pelo menos 20 h, como pelo menos 24 h. Tipicamente, os grãos são incubados na referida solução aquosa por no máximo 72 h, tal como no máximo 60 h, por exemplo, no máximo 48 h.

[00146] Portanto, pode ser preferido que os grãos de cevada sejam completamente cobertos pela referida solução aquosa durante toda a incubação.

[00147] os referidos grãos de cevada são frequentemente —“incubados na referida solução aquosa, enquanto 07 é passada através da solução aquosa. O referido 02 pode ser adicionado à referida solução aquosa como 02 puro. Frequentemente, no entanto, o referido 07 está compreendido dentro de uma mistura gasosa. Em uma concretização, o referido 0,2 está compreendido no ar atmosférico.

[00148] Em geral, pelo menos 2 L, preferencialmente, pelo menos 3 L, mais preferencialmente, pelo menos 4 L, ainda mais preferencialmente, pelo menos 5 L, ainda mais preferencialmente, pelo menos 6 L de 07 passam através da referida solução aquosa por kg de grãos de cevada por h. O peso dos referidos grãos de cevada é o peso seco. Por exemplo, na faixa de 2 a 100 L, por exemplo, na faixa de 2 a 75 L, como na faixa de 2 a 50 L, por exemplo, na faixa de 4 a 100 L, por exemplo, na faixa de 4 a 75 L, como na faixa de 4 a 50 L, por exemplo, na faixa de 6 a 100 L, por exemplo, na faixa de 6 a 75 L, como na faixa de 6 a 50 L O 7 passa através da referida solução aquosa / mistura de grãos de cevada por kg de grãos de cevada (peso seco) por h.

[00149] Como observado acima, é frequentemente o ar atmosférico que passa através da solução aquosa. Assim, o método pode compreender passar pelo menos 10 L, preferencialmente pelo menos 15 L, mais preferencialmente pelo menos 20 L, ainda mais preferencialmente pelo menos 25 L, ainda mais preferencialmente pelo menos 30 L de ar atmosférico através da referida solução aquosa por kg de grãos de cevada por h. O peso dos referidos grãos de cevada é o peso seco. Por exemplo, na faixa de 10 a 500 L, por exemplo, na faixa de 10 a 375 L, como na faixa de 10 a 250 L, por exemplo, na faixa de 20 a 500 L, por exemplo, na faixa de 20 a 375 L, como na faixa de 20 a 250 L, por exemplo, na faixa de 30 a 500 L, por exemplo, na faixa de 30 a 375 L, como na faixa de 30 a 250 L atmosférica o ar é passado através da referida solução aquosa por kg de grãos de cevada (peso seco) por h.

[00150] Em algumas concretizações, a etapa de germinação compreende a. pelo menos uma etapa de incubação dos referidos grãos em uma solução aquosa, em que pelo menos 2 L O 2 por kg de grãos de cevada em peso seco são passados através da referida solução aquosa por h; e b. pelo menos uma etapa de incubação dos referidos grãos de cevada no ar.

[00151] Em algumas concretizações, após a incubação dos grãos de cevada na referida solução aquosa, os grãos de cevada têm um teor de água de pelo menos 20%, preferencialmente de pelo menos 30%, por exemplo, na faixa de 30 a 60%, como em a faixa de 30 a 50%, por exemplo, na faixa de 30 a 60%, como na faixa de 30 a 50%.

[00152] Durante a referida etapa de incubação dos referidos grãos de cevada ao ar, pelo menos 2 L 0 27 por kg de grãos de cevada de peso seco podem passar através dos referidos grãos de cevada por h. Por exemplo, a mesma quantidade de O 7 pode ser conduzida através dos grãos de cevada durante a incubação ao ar e durante a incubação na referida solução aquosa, como descrito acima.

[00153] Os núcleos de cevada germinados preparados por este método também são aqui referidos como malte verde.

[00154] O teor de água dos grãos de cevada pode ser determinado determinando o peso dos grãos de cevada, seguido de secagem dos referidos grãos de cevada e determinação do peso dos grãos de cevada secos. A diferença de peso dos grãos de cevada úmidos e secos é considerada água, e o teor de água é fornecido como o peso da água dividido pelo peso total dos grãos de cevada (grãos de cevada úmidos). O teor de água fornecido em % é, portanto, % p / p.

[00155] O grão de cevada pode ser incubado a qualquer temperatura útil, no entanto, pode ser preferida que a incubação seja realizada a uma temperatura suficientemente alta para permitir um rápido aumento no teor de água.

[00156] Em particular, nas concretizações da invenção, em que os grãos de cevada são incubados a uma temperatura na faixa de 20 a 30 º C, então os referidos grãos de cevada podem ser incubados na faixa de 20 a 48 h.

[00157] A germinação de grãos também pode ser realizada por qualquer método convencional conhecido pelo especialista. Um exemplo não limitativo envolve a germinação a uma temperatura na faixa de 10 a 25 º C, opcionalmente com a mudança de temperatura na faixa de 1 a 4 dias.

[00158] Como mencionado acima em algumas concretizações da invenção, os grãos de cevada germinados (isto é, o malte verde) podem ser secos em estufa. Em algumas concretizações, é preferido que o malte verde não seja seco em estufa. Em particular, é preferido que quando o malte verde é preparado por uma germinação compreendendo uma etapa de incubação dos referidos grãos de cevada em uma solução aquosa sob aeração, então o malte verde não é seco em estufa.

[00159] Se o malte verde for seco em estufa, isso pode ser feito em temperaturas convencionais, como pelo menos 75 º C, por exemplo, na faixa de 80 a 90 º C, como na faixa de 80 a 85 º C. Assim, o malte pode, por exemplo, ser produzido por qualquer um dos métodos descritos por Hough et al. (1982). No entanto, qualquer outro método adequado para a produção de malte também pode ser utilizado com a presente invenção, como métodos para a produção de maltes especiais incluindo, mas não limitado a, métodos de torrefação do malte.

[00160] O malte seco em estufa e o malte verde podem ser posteriormente processados, por exemplo, por moagem. Assim, o produto vegetal de acordo com a invenção pode ser qualquer tipo de malte, como malte não processado ou malte moído, como farinha. Assim, o produto vegetal pode, por exemplo, ser moído, malte seco em estufa ou malte verde moído. O malte moído e a sua farinha compreendem componentes químicos do malte e células mortas que não têm capacidade de re-germinar.

[00161] Em algumas concretizações, a cevada é cevada com casca, e o método compreende uma etapa de remoção de pelo menos parte do referido casco antes da incubação dos referidos grãos em uma solução aquosa. Os grãos de cereais descascados podem ser tratados para remover oO casco, submetendo os grãos a tratamento físico removendo o casco. O referido tratamento físico pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consiste em polir, lixar, descascar e alisar. De preferência, o tratamento físico resulta em perda do casco. A perda do casco pode ser determinada como uma perda geral de peso. Assim, o tratamento físico conduz, de preferência, a uma perda de 1 a 4%, tal como a uma perda de 1,5 a 3,0% do peso total dos grãos de cereais.

Extrato aquoso e seus métodos de produção

[00162] A invenção fornece bebidas à base de cevada, bem como métodos para prepará-las, em que a planta da cevada carrega uma mutação no gene CslF6, ou sua progênie. A invenção também fornece extratos aquosos de grãos de plantas de cevada portando uma mutação no gene CslF6. O referido extrato aquoso pode, por exemplo, ser preparado a partir de malte verde ou malte seco em estufa.

[00163] Frequentemente, os métodos para preparar uma bebida compreendem uma etapa de preparação de um extrato aquoso de grãos das plantas de cevada da invenção e / ou de maltes preparados a partir de plantas de cevada da invenção.

[00164] O extrato aquoso pode, em geral, ser preparado por incubação de farinha de cevada, farinha de malte verde e / ou farinha de malte seco em estufa em água ou em uma solução aquosa. A referida solução aquosa também é referida como "solução de trituração" neste documento. Em particular, o extrato aquoso pode ser preparado por trituração.

[00165] A presente invenção também fornece um método de produção de um extrato aquoso, o referido método compreendendo as etapas de: a. fornecer grãos de uma planta de cevada, em que a referida planta de cevada tem teor reduzido de (1, 3; 1, 4)- B-glucano e carrega uma mutação no gene CslF6, como aqui descrito; b. suometer os núcleos de cevada a uma etapa de germinação, obtendo assim núcleos germinados, em que a referida etapa de germinação compreende incubar os referidos núcleos em uma solução aquosa no máximo 72 h; c. dividir finamente os referidos núcleos germinados enquanto os referidos núcleos germinados têm um teor de água de pelo menos 20%, com a condição de que os referidos núcleos de cevada não tenham um teor de água abaixo de 20 a qualquer momento entre as etapas b) e c);

d. preparar um extrato aquoso dos referidos grãos germinados moídos, produzindo assim um extrato aquoso da cevada.

[00166] A etapa de germinação é descrita em detalhes na seção acima “Malte verde, malte seco em estufa e método de produção do mesmo”.

[00167] Em geral, a referida solução de trituração pode ser água, tal como água da torneira à qual um ou mais agentes “adicionais podem ser adicionados. W0Os agentes adicionais podem estar presentes na solução aquosa desde o início ou podem ser adicionados durante o processo de preparação de um extrato aquoso. Os referidos agentes adicionais podem ser enzimas. Assim, a solução de esmagamento pode compreender uma ou mais enzimas. As referidas enzimas podem ser adicionadas à solução aquosa desde o início, ou subsequentemente, durante o processo.

[00168] As referidas enzimas podem, por exemplo, ser uma ou mais enzimas hidrolíticas. Enzimas adequadas incluem lipases, enzimas de degradação do amido (por exemplo, amilases), glucanases [preferencialmente (1-4) - e / ou (1, 3; 1, 4) -B-glucanases)] e / ou xilanases (como arabinoxilanases) e / ou proteases ou misturas enzimáticas compreendendo uma ou mais das enzimas acima mencionadas, por exemplo, Cereflo, Ultraflo ou Ondea Pro (Novozymes). Por exemplo, a solução aquosa pode compreender uma ou mais enzimas hidrolíticas selecionadas do grupo que consiste em a-amilase, b-amilase, limite dextrinase, pululanase, b - glucanase (por exemplo, endo- (1, 3; 1, 4)-B-glucanase ou endo-1, 4-B-glucanase), xilanase (por exemplo, endo- ou exo-

1, 4-xilanase, uma arabinofuranosidase ou uma esterase de ácido ferúlico), glucoamilase e protease.

[00169] Em uma concretização, nenhuma ou apenas quantidades limitadas de fB-glucanase são adicionadas à referida solução de esmagamento.

[00170] os referidos agentes adicionais, de preferência de qualidade de grau alimentar, também podem ser um sal, por exemplo Cacl,, ou um ácido, por exemplo H;P0..

[00171] O extrato aquoso é geralmente preparado por incubação da farinha de cevada, farinha de malte verde e / ou farinha de malte seco em estufa na solução de trituração a uma ou mais temperatura (s) predeterminada (s). A referida temperatura predeterminada também pode ser referida como "temperatura de esmagamento" neste documento. As referidas temperaturas de esmagamento podem, por exemplo, ser temperaturas convencionais usadas para esmagar. A temperatura de esmagamento é geralmente mantida constante (esmagamento isotérmico) ou aumentada gradualmente, por exemplo, aumentada de maneira sequencial. Em qualquer um dos casos, substâncias solúveis nos grãos de cevada e / ou malte são liberadas na referida solução de trituração, formando assim um extrato aquoso.

[00172] A (s) temperatura (s) de trituração são tipicamente temperaturas na faixa de 30 a 90 º C, como na faixa de 40 a 85 º C, por exemplo, na faixa de 50 a 85 *º C. As temperaturas de trituração podem ser escolhidas de acordo com o tipo de cevada utilizado. Em particular, uma temperatura de esmagamento relativamente baixa pode ser usada, por exemplo, uma temperatura na faixa de 50 a 60 *º

C. Frequentemente, a incubação com a solução de trituração inclui uma etapa final de aquecimento para uma temperatura mais alta, por exemplo, para uma temperatura na faixa de 75 a 80 º C.

[00173] Após a incubação na solução aquosa em, por exemplo, um recipiente de esmagamento, a solução aquosa pode ser transferida para outro recipiente, por exemplo, um lauter tun e incubada por tempo adicional a temperatura elevada.

[00174] Exemplos não limitativos de protocolos de trituração úteis podem ser encontrados na literatura de fabricação de cerveja, por exemplo, em Hough et al. (supra).

[00175] O purê (ou seja, incubação da farinha de cevada, farinha de malte verde e / ou farinha de malte seco em forno em solução de trituração) pode ocorrer na presença de adjuvantes, que compreendem qualquer fonte de carboidrato que não seja malte ou grãos de cevada germinados, como como, mas não limitado a, cevada, xaropes de cevada ou milho ou arroz - como grãos inteiros ou produtos processados, como grãos, xaropes ou amido. Todos os adjuvantes acima mencionados podem ser utilizados principalmente como uma fonte adicional de extrato (os xaropes são tipicamente dosados durante o aquecimento do mosto). Os requisitos para o processamento do adjunto na cervejaria dependem do estado e do tipo de adjuvante utilizado.

[00176] Após a incubação na solução de trituração, o extrato aquoso pode ser tipicamente separado, por exemplo, através de filtração no extrato aquoso e em partículas sólidas não dissolvidas residuais, este último também denominado "grão gasto". A filtragem pode, por exemplo, ser realizada em um tuner lauter. Alternativamente, a filtragem pode estar filtrando através de um filtro de mash. O extrato aquoso assim obtido também pode ser denominado "primeiro mosto". Líquido adicional, como água, pode ser adicionado aos grãos gastos durante um processo, também indicado como aspersão. Após aspersão e filtração, pode ser obtido um "segundo mosto". Podem ser preparadas outras misturas repetindo o procedimento. Assim, o extrato aquoso pode ser mosto, por exemplo, um primeiro mosto, um segundo mosto, um mosto adicional ou uma combinação dos mesmos.

[00177] O método de preparação de um extrato aquoso pode, em uma concretização, ser realizado usando qualquer um dos aparelhos descritos no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065498, por exemplo, qualquer um dos aparelhos descritos na p. 20-22. Um exemplo não limitativo de um aparelho útil é fornecido aqui na figura 4.

[00178] (1, 3; 1, 4)-B-glucanos incompletamente degradados podem ser especialmente problemáticos para os fabricantes de cerveja, porque estes podem ser extraídos do malte em formas solúveis que formam soluções aquosas altamente viscosas que retardam os processos de filtragem na cervejaria. Curiosamente, as plantas de cevada da invenção contêm um baixo nível de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos, e, assim, o mosto preparado a partir de tais plantas de cevada tem em geral baixa viscosidade. Em uma concretização, a invenção fornece mosto preparado a partir de uma planta de cevada que possui uma mutação no gene CslF6, o mosto tendo uma viscosidade menor em comparação com o mosto preparado a partir de uma planta de cevada que possui um gene Csl1F6 do tipo selvagem, mas de outro modo o mesmo genótipo planta de cevada aqui divulgada. O referido mosto é geralmente preparado por extração de grãos de cevada e / ou malte.

[00179] Em uma concretização, a invenção fornece um mosto, em que o mosto é preparado a partir de uma planta de cevada que carrega qualquer uma das mutações no gene CslF6 aqui descrito, em que o mosto tem uma viscosidade na faixa de 0,5 a 1, O mPa * s menor, como na faixa de 0,5 a 0,8 mPa * s menor que à viscosidade do mosto preparada da mesma maneira a partir de uma planta de cevada portadora de um gene CslF6 do tipo selvagem, mas com o mesmo genótipo. Em uma concretização, a invenção fornece uma erva, em que a referida erva é preparada a partir de uma planta de cevada portando qualquer uma das mutações no gene CslF6 aqui descritas e a referida erva tem uma viscosidade na faixa de 1, 7 a 2,5 mPa's , como no intervalo de 1, 8 a 2,5 mPa's, por exemplo, de 2,0 a 2,5 mPa's, como 2,1 a 2,5 mPa'*s, por exemplo 1, 8 a 2,2 mPa's, como cerca de 2 mPa's, por exemplo, cerca de 2,1 mPa's, tal como cerca de 2,2 mPa * s. Em particular, a planta de cevada pode transportar um gene HvCslF6 mutado que codifica uma proteína HvCsl1F6 mutante compreendendo uma mutação (por exemplo, um GlyGAsp) do aminoácido 748 da SEQ ID NO: 1.

[00180] Em uma concretização, a invenção fornece um mosto, em que o mosto é preparado a partir de malte obtido de uma planta de cevada que transporta qualquer uma das mutações no gene CslF6 aqui descritas, em que o mosto tem uma viscosidade de no máximo 2,2 mPa's.

[00181] A viscosidade de um mosto preparado a partir de malte padrão preparado por maceração por 1-2 dias e germinação por 5-7 dias, seguido pela secagem em estufa, é de cerca de 2 mPa's. Bebida e método de produção

[00182] A presente invenção também fornece bebidas à base de cevada e métodos para a produção de tais bebidas, em que a planta de cevada reduziu o conteúdo de (1, 3; 1, 4) - 3-glucana e carrega uma mutação no gene CslF6, ou sua progênie. A invenção também fornece bebidas à base de cevada, preparadas a partir de plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6, ou progênie do mesmo.

[00183] A referida bebida pode ser uma bebida à base de cevada alcoólica ou uma bebida à base de cevada não alcoólica. As bebidas à base de cevada alcoólica podem, por exemplo, ser cerveja ou um álcool destilado.

[00184] A referida cerveja pode ser qualquer tipo de cerveja, por exemplo cerveja ou cerveja. Assim, a cerveja pode, por exemplo, ser selecionada do grupo que consiste em altbier, Amber ale, vinho de cevada, Berliner Weisse, Biere de Garde, Amargo, Blonde Ale, Bock, Brown ale, California Common, Cream Ale, Dortmunder Export, Doppelbock, Dunkerque, Dunkerque, Eisbock, Fruit lambic, Golden Ale, Goseuz, Gueuze, Hefeweizen, Helles, India pale ale, Kolsch, Lambic, Light ale, Maibock, Licor de malte, Suave, Marzenbier, Old ale, Oud bruin, Pale ale, Pilsener , Porteiro, Red ale, Roggenbier, Saison, Scotch ale, Cerveja a vapor, Stout, Schwarzbier, cerveja, Witbier, Weissbier e Weizenbock.

[00185] O referido álcool destilado pode ser qualquer tipo de álcool destilado. Em particular, o álcool destilado pode ser baseado em uma cevada, por exemplo, um malte de cevada. Exemplos não limitativos desse álcool destilado incluem uísque e vodka.

[00186] A bebida pode ser uma bebida não alcoólica, como uma bebida à base de cevada não alcoólica, por exemplo, cerveja não alcoólica ou bebidas de malte não alcoólicas, como maltina.

[00187] A bebida pode, por exemplo, ser preparada por um método compreendendo as etapas de: (i) fornecer grãos de uma planta de cevada, de acordo com a invenção e / ou malte verde e / ou malte seco em forno, preparado a partir de grãos de uma planta de cevada de acordo com a invenção (ii) preparar um extrato aquoso dos referidos grãos e / ou malte, por exemplo, como aqui descrito acima na seção de preparação de extrato aquoso (iii) processar o referido extrato aquoso em uma bebida.

[00188] O extrato aquoso pode ser fervido com ou sem lúpulo, onde depois pode ser chamado de mosto fervido. Primeiro, o segundo e outros mosto pode ser combinados e depois submetidos a ebulição. O extrato aquoso pode ser fervido por qualquer quantidade de tempo adequada, por exemplo, na faixa de 60 a 120 minutos.

[00189] A etapa (iii) pode compreender a. aquecer o referido extrato aquoso opcionalmente na presença de lúpulo ou extrato de lúpulo; b. arrefecer o extrato aquoso; c. fermentar o referido extrato aquoso com levedura, produzindo, assim, uma bebida fermentada.

[00190] A etapa (iii) pode, em particular, compreender a fermentação do referido extrato aquoso, por exemplo, por fermentação do mosto. Assim, a bebida pode ser preparada por fermentação do extrato aquoso com levedura.

[00191] Uma vez preparado o extrato aquoso, ele pode ser transformado em cerveja por qualquer método, incluindo métodos convencionais de fabricação de cerveja. Descrições não limitadas de exemplos de métodos adequados para fabricação de cerveja podem ser encontradas, por exemplo, nas publicações de Hough et al. (1982). Vários métodos atualizados regularmente para análises de produtos de cevada e cerveja estão disponíveis, por exemplo, mas não se limitando a, Associação Americana de Químicos de Cereais (1995), Sociedade Americana de Químicos de Fabricação de Cerveja (1992), Convenção Europeia da Cervejaria (1998) e Instituto de Brewing (1997). Reconhece-se que muitos procedimentos específicos são empregados para uma determinada cervejaria, com as variações mais significativas relacionadas às preferências dos consumidores locais. Qualquer método de produção de cerveja pode ser utilizado com a presente invenção.

[00192] A primeira etapa de produção de cerveja a partir do extrato aquoso envolve, de preferência, a ebulição do referido extrato aquoso, como descrito acima, seguido por uma fase subsequente de resfriamento e, opcionalmente, descanso em redemoinho. Um ou mais compostos adicionais podem ser adicionados ao extrato aquoso, por exemplo, um ou mais dos compostos adicionais descritos abaixo na seção "Compostos adicionais". Depois de resfriado, o extrato aquoso pode ser transferido para tanques de fermentação contendo leveduras, por exemplo, levedura de cerveja, como S. pastorianus ou S. cerevisiae. O extrato aquoso pode ser fermentado por qualquer período de tempo adequado, em geral na faixa de 1 a 20 dias, como 1 a 10 dias. A fermentação é realizada a qualquer temperatura útil, por exemplo, a uma temperatura na faixa de 10 a 20 º C. Os métodos também podem compreender a adição de uma ou mais enzimas, por exemplo uma ou mais enzimas podem ser adicionadas ao mosto antes ou durante a fermentação. Em particular, a referida enzima pode ser uma endoprotease específica de prolina. Um exemplo não limitativo de uma endoprotease específica de prolina é o "Brewer's Clarex" disponível na DSM.

[00193] Em outras concretizações, nenhuma enzima exógena é adicionada durante os métodos.

[00194] Durante o processo de fermentação em vários dias longos, o açúcar é convertido em álcool e CO 2 concomitantemente com o desenvolvimento de algumas substâncias de aroma. A fermentação pode ser terminada a qualquer momento desejável, por exemplo, uma vez que nenhuma outra queda em % P seja observada.

[00195] Posteriormente, a cerveja pode ser posteriormente processada, por exemplo, refrigerada. Também pode ser filtrada e / ou fermentada - um processo que desenvolve um aroma agradável e um sabor menos semelhante ao fermento. Aditivos também podem ser adicionados. Além disso, CO02 pode ser adicionado. Finalmente, a cerveja pode ser pasteurizada e / ou filtrada antes de ser embalada (por exemplo, transferida para recipientes ou barris, engarrafada ou enlatada). A cerveja também pode ser pasteurizada por métodos padrão. Compostos adicionais

[00196] Os métodos da invenção podem compreender a etapa de adição de um ou mais compostos adicionais. Os referidos compostos adicionais podem, por exemplo, ser um composto aromatizante, um conservante, um ingrediente funcional, uma cor, um adoçante, um agente regulador de pH ou um sal. O agente regulador do pH pode, por exemplo, ser um tampão ou um ácido, tal como ácido fosfórico.

[00197] Ingredientes funcionais podem ser qualquer ingrediente adicionado para obter uma determinada função.

[00198] De preferência, um ingrediente funcional torna a bebida mais saudável. Exemplos não limitativos de ingredientes funcionais incluem vitaminas ou minerais.

[00199] O conservante pode ser qualquer conservante de qualidade alimentar, por exemplo, pode ser ácido benzóico, ácido sórbico, sorbatos (por exemplo, sorbato de potássio), sulfitos e / ou sais dos mesmos.

[00200] O composto adicional também pode ser CO0;. Em particular, CO; pode ser adicionado para se obter uma bebida gaseificada.

[00201] O composto aromatizante a ser utilizado com a presente invenção pode ser qualquer composto aromatizante útil. O composto aromatizante pode, por exemplo, ser selecionado do grupo composto por aromas, extratos vegetais, concentrados vegetais, partes de plantas e infusões de ervas. Em particular, os compostos aromatizantes podem ser lúpulo.

Método de preparação de uma planta de cevada portadora de uma mutação em CslF6

[00202] As plantas de cevada portadoras de uma mutação em Csl1F6, por exemplo, qualquer uma das mutações específicas aqui descritas podem ser preparadas de qualquer maneira útil.

[00203] Por exemplo, essas plantas de cevada podem ser preparadas por um método que compreende as etapas de: . submeter uma pluralidade de plantas ou grãos de cevada a mutagênese aleatória, por exemplo, por irradiação ou tratamento químico, por exemplo, tratamento com azida de sódio; . identificar as plantas de cevada ou grãos de cevada portadores de uma mutação em Cs1F6.

[00204] Tais métodos também podem incluir uma ou mais etapas de reprodução das referidas plantas de cevada / núcleos de cevada, a fim de obter várias plantas / núcleos de cevada, cada uma carregando mutações aleatórias.

[00205] Em particular, plantas de cevada portadoras de uma mutação específica em CslF6 podem ser preparadas e identificadas essencialmente como descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516, usando iniciadores e sondas projetadas para identificar uma mutação no gene Csl1F6. Exemplos de iniciadores e sondas úteis para identificação de uma planta de cevada portadora de uma mutação no gene CslF6, resultando no referido gene que codifica a proteína CslF6 mutante portadora de uma das mutações G847E ou G748D são fornecidos na Tabela 2. Os técnicos versados no assunto irão basear-se no conhecimento geral e / ou as orientações fornecidas no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516, o qual é incorporado neste documento por referência, capaz de projetar iniciadores e sondas úteis para identificação de outros mutantes.

[00206] As plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6 também podem ser preparadas usando vários métodos de mutatênese direcionada ao local, que por exemplo podem ser projetados com base na sequência do gene CslF6 aqui fornecido. Em uma concretização, a planta de cevada é preparada usando qualquer um de CRISPR, um TALEN, um dedo de zinco, meganuclease e um antibiótico de corte de DNA, conforme descrito em WO 2017/138986. Em uma concretização, a planta de cevada é preparada usando a técnica CRISPR / cas9, por exemplo, usando nuclease Cas9 guiada por RNA. Isso pode ser feito como descrito em Lawrenson et al., Genome Biology (2015) 16: 258; DOI 10.1 186 / s13059-015-0826-7, exceto que a sequência de RNA guia único é projetada com base nas sequências de genes aqui fornecidas. Em uma concretização, a planta de cevada é preparada usando uma combinação das técnicas TALEN e CRISPR / cas9, por exemplo, usando nuclease Cas9º guiada por RNA. Isso pode ser feito como descrito em Holme et al., Plant Mol Biol (2017) 95:11 1-121; DOI: 10.1007/s11103-017-0640-6, exceto que a sequência TALEN e o RNA guia único são projetados com base nas sequências de genes aqui fornecidas.

[00207] Em uma concretização, a planta de cereal é preparada usando reparo direcionado à homologia, uma combinação de uma nuclease de corte de DNA e um fragmento de DNA doador. Isso pode ser feito como descrito em Sun et al., Molecular Plant (2016) 9: 628-631; DOI:

https://doi.Org/10.1016/j.molp.2016.01.001, exceto que a nuclease de corte de DNA é projetada com base nas sequências de genes aqui fornecidas e o fragmento de DNA do doador é projetado com base na sequência de codificação do cereal mutado variante aqui fornecida.

[00208] Em uma concretização da invenção, o objetivo é fornecer plantas de cevada agronômicas úteis que transportem uma mutação no gene CslF6. Além da mutação no gene CslF6, há fatores adicionais que também podem ser considerados na arte de gerar uma variedade comercial de cevada útil para maltagem e / ou fabricação de cerveja e / ou como base para bebidas, por exemplo, rendimento e tamanho de kernel, e outros parâmetros relacionados ao desempenho de maltagem ou desempenho de fermentação. Como muitas características relevantes, se não todas, demonstraram estar sob controle genético, a presente invenção também fornece cultivares de maltagem modernas, homozigotas e de alto rendimento, que podem ser preparadas a partir de cruzamentos com as plantas de cevada divulgadas na presente publicação. O criador experiente de cevada poderá selecionar e desenvolver plantas de cevada, que - após cruzamentos com outras plantas de cevada - resultará em cultivares superiores. Alternativamente, o criador pode utilizar plantas da presente invenção para mutagênese adicional para gerar novas cultivares portadoras de mutações adicionais além da mutação do gene Cs1lF6.

[00209] A invenção também compreende plantas de cevada portadoras de uma mutação no gene CslF6 preparada a partir do método de melhoramento de plantas, incluindo métodos de auto-reprodução, retrocruzamento, cruzamento para populações e similares. Os métodos de retrocruzamento podem ser utilizados com a presente invenção para introduzir em outra cultivar a mutação do gene CslF6.

[00210] Em uma concretização, a invenção se refere à descendência da planta de cevada depositada em 12-12-2018 no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 43273 e referida como "Mutante 2". A referida progênie pode ser preparada por qualquer método útil, incluindo, mas não se limitando a auto- reprodução, retrocruzamento ou cruzamento para outras populações. Em particular, a referida progênie também pode transportar uma mutação GOA do nucleotídeo 2243 da sequência de codificação do gene HvCsl1F6 (SEQ ID NO 2).

[00211] Uma maneira de acelerar o processo de melhoramento de plantas compreende a multiplicação inicial de mutantes gerados pela aplicação de técnicas de cultura e regeneração de tecidos. Assim, outro aspecto da presente invenção é o de fornecer células que, após crescimento e diferenciação, produzem plantas de cevada portadoras da mutação do gene CslF6. Por exemplo, o melhoramento pode envolver cruzamentos tradicionais, a preparação de plantas derivadas de anteras férteis ou a cultura de microporos.

[00212] Em uma concretização, a planta de cevada da invenção não foi obtida exclusivamente por meio de um processo essencialmente biológico. A progênie de uma planta de cevada obtida por um processo técnico é aqui considerada como não sendo obtida exclusivamente por meio de um processo essencialmente biológico, porque a planta-parental é obtida por um processo técnico.

[00213] Em uma concretização, a planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, em que a referida mutação foi induzida por agentes químicos e / ou físicos.

[00214] Em uma concretização, a planta de cevada foi preparada por um método que envolve uma etapa de mutagênese induzida ou a referida planta é descendente de uma planta preparada por um método que envolve uma etapa de mutagênese induzida. Assim, a planta de cevada pode ser uma planta de cevada preparada por um método que compreende as seguintes etapas ou descendência de uma planta preparada por um método que compreende as seguintes etapas: . aplicar mutagênese em plantas de cevada ou Suas partes, por exemplo, com um agente mutagênico químico como NaN;, . selecionar de plantas de cevada portadoras de qualquer uma das mutações mencionadas no gene CslF6.

[00215] Em uma concretização, a referida mutação do gene CslF6 resultando em um gene mutante CslF6 que codifica um polipeptídeo mutante Csl1F6, em que o referido polipeptídeo mutante CslF6 é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de amino ácido 847 a um aminoácido carregado, por exemplo, ao ácido glutâmico. Em particular, o referido gene CslF6 mutante pode conter uma mutação GOA do nucleotídeo 2243 da sequência de codificação do gene HvCsl1F6 (SEQ ID NO: 2).

Itens

[00216] A invenção pode ainda ser definida pelos seguintes itens:

1. Uma planta de cevada ou uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor reduzido de (1, 3; 1, 4)-B-glucano, e, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, em que o referido o gene Csl1F6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o referido CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido em um domínio localizado na membrana de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um não polar aminoácido para um aminoácido carregado ou substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar, em que os domínios localizados na membrana de CslF6 consistem nos aminoácidos 109 a 128, 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3.

2. Uma planta de cevada ou uma parte dela, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor reduzido de (1, 3; 1, 4) -B-glucano, e, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, em que o referido o gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o referido CslF6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1, exceto que o mutante CslF6 compreende pelo menos uma substituição de um aminoácido em um domínio localizado na membrana de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um não aminoácido polar a um aminoácido carregado ou substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar, em que o domínio localizado na membrana é selecionado a partir do grupo que consiste nos domínios localizados na membrana de CslF6 consistindo nos aminoácidos 835 a 857 ou dos aminoácidos 700 a 731 ou dos aminoácidos 741 a 758 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3.

3. Planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida planta de cevada tem um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano na faixa de 1 a 5% em peso seco do total de grãos, por exemplo 1,3 a 3% em peso seco do total de grãos, de preferência, 1,3 a 2% em peso seco do total de grãos.

4, A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano de pelo menos 30% e no máximo 60%, de preferência pelo menos 40% e no máximo 60% do teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucano de uma planta de cevada portadora de um gene CslF6 do tipo selvagem, mas com o mesmo genótipo.

[00217] 5. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucano de pelo menos 30% e no máximo 60%, preferencialmente pelo menos 40% e no máximo 60% do conteúdo de (1, 3; 1, 4)-B-glucano de uma planta de cevada portadora de um gene Csl1F6 do tipo selvagem, mas de outro modo do mesmo genótipo.

[00218] 6. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a planta de cevada compreende grãos que têm uma frequência de grãos quebrados após a debulha, que é no máximo três vezes maior que a frequência de grãos quebrados após a debulha de grãos de uma planta de cevada que não carrega a mutação no gene CslF6, mas de outra forma a mesma genótipo.

[00219] 7. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a planta de cevada compreende grãos que têm uma frequência de grãos quebrados após a debulha, que é no máximo duas vezes maior que a frequência de grãos quebrados após a debulha de grãos de uma planta de cevada que não carrega a mutação no gene CslF6, mas de outra forma a mesma genótipo.

[00220] 8. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado.

[00221] 9. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste nos aminoácidos 835 a 857 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado.

[00222] 10. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847 por um aminoácido carregado.

[00223] 11. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido polipeptídeo Cs1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é substituição de uma glicina (G) por um ácido glutâmico (E).

[00224] 12. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, em que o referido gene Csl1F6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante da SEQ ID NO: 27.

[00225] 13. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação GOA do nucleotídeo 2243 da sequência de codificação do gene HvCsl1F6.

[00226] 14. A planta de cevada, de acordo com o item 13, em que a sequência de codificação do gene HvCslF6 é a SEQ ID NO 2.

[00227] 15. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a planta de cevada é o Mutante 2 depositado no NCIMB sob o número de acesso NCI MB 43273, ou sua progênie.

[00228] 16. Uma planta de cevada ou progênie ou partes dela, em que o genoma da referida planta compreende o gene CslF6 do mutante 2 da planta de cevada depositado no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 43273.

[00229] 17. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de B-glucano na faixa de 1,7 a 5,0% em peso seco do total de grãos.

[00230] 18. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 de no máximo 2,5, como no máximo 2,1, por exemplo, na faixa de 1,0 a 2,1.

[00231] 19. A planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste nos aminoácidos 741 a 758 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado.

[00232] 20. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 19, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748 por um carregado aminoácido.

[00233] 21. Planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 19 a 20, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que a referida substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido aspártico (D).

[00234] 22. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 19 a 21, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de B-glucano na faixa de 1,7 a 3% em peso seco do total de grãos.

[00235] 23. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 19 a 22, em que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 na faixa de 2,5 a 4.

[00236] 24. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, em que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste dos aminoácidos 700 a 731 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar.

[00237] 25. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 24, em que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o CslF6 mutante compreende uma substituição de um aminoácido no domínio localizado na membrana que consiste nos aminoácidos 700 a 711 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar.

[00238] 26. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 24 a 25, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição do aminoácido 709 a um aminoácido não polar.

[00239] 27. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 24 a 26, em que o referido polipeptídeo Csl1F6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante Csl1F6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição de uma treonina (T) por uma isoleucina (II).

[00240] 28. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 24 a 27, em que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de B-glucano na faixa de 1,3 a 3% em peso seco do total de grãos.

[00241] 29. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8 e 24 a 28, em que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 de pelo menos 3,5,

como de pelo menos 4,0, por exemplo, pelo menos 4,5, como na faixa de 4 a 6.

[00242] 30. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens ou progênie anteriores, em que a referida planta de cevada não foi exclusivamente preparada por um método essencialmente biológico.

[00243] 31. A planta de cevada ou progênie dos mesmos, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a planta de cevada é preparada por um método que compreende as seguintes etapas: - aplicar mutagênese as plantas de cevada ou suas partes, por exemplo, com um agente químico de mutagênese; e — Selecionar de plantas de cevada portadoras de qualquer uma das mutações mencionadas no gene CslF6.

[00244] 32. Produto vegetal que compreende a planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens anteriores ou parte dele.

[00245] 33. O produto vegetal, de acordo com o item 32, em que o produto vegetal é malte verde ou malte seco em estufa, preparado a partir de grãos da referida planta de cevada.

[00246] 34. Produto vegetal de acordo com o item 32, em que o produto vegetal é preparado a partir de grãos da referida planta de cevada e / ou de malte verde ou malte seco em forno compreendendo caroço (s) processado (s) da referida planta de cevada.

[00247] 35. O produto vegetal, de acordo com qualquer um dos itens 32 a 34, em que o produto vegetal é mosto, e, em que o mosto tem uma viscosidade de no máximo 2,5 mPa's,

de preferência, de no máximo 2,2 mPa's.

[00248] 36. O produto vegetal, de acordo com o item 32, em que o produto vegetal é uma bebida preparada a partir da referida planta de cevada de suas partes.

[00249] 37. A bebida, de acordo com o item 32, em que a referida bebida é preparada a partir de grãos da referida planta de cevada e / ou de malte compreendendo caroço (s) processado (s) da referida planta de cevada.

[00250] 38. A bebida, de acordo com qualquer um dos itens 36 a 37, em que a bebida é cerveja.

[00251] 39. Um método de preparação de malte verde, o referido método compreendendo as etapas de a. fornecer grãos de uma planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31; b. embeber os ditos grãos; c. germinar os grãos mergulhados em condições predeterminadas.

[00252] 40. Um método de preparação de malte seco em estufa, o referido método compreendendo as etapas de a. fornecer de grãos de uma planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31; b. embeber os ditos grãos; c. germinar os grãos embebidos em condições predeterminadas; d. secar os referidos núcleos germinados.

[00253] 41. Método para produzir uma bebida, o referido método compreendendo as etapas de: a. fornecer grãos de uma planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31 e / ou malte, de acordo com o item 33 b. Preparar um extrato aquoso dos referidos núcleos e / ou do referido malte Cc. processar o referido extrato aquoso em uma bebida.

[00254] 42. Método para produzir um extrato aquoso, O referido método compreendendo as etapas de: a. fornecer grãos de uma planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31; b. suometer os núcleos de cevada a uma etapa de germinação, obtendo, assim, núcleos germinados, em que a referida etapa de germinação compreende incubar os referidos núcleos em uma solução aquosa por no máximo 72 h; c. dividir finamente os referidos núcleos germinados, enquanto os referidos núcleos germinados têm um teor de água de pelo menos 20%, com a condição de que os referidos núcleos de cevada não tenham um teor de água abaixo de 20% a qualquer momento entre as etapas b) e c);

[00255] d. preparar um extrato aquoso dos referidos grãos germinados moídos, produzindo, assim, um extrato aquoso da cevada.

[00256] 43. Método para produzir um extrato aquoso, O referido método compreendendo as etapas de: a. fornecer grãos de uma planta de cevada, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31; b. suometer os núcleos de cevada a uma etapa de germinação, obtendo assim núcleos germinados, em que a referida etapa de germinação compreende incubar os referidos núcleos em uma solução aquosa por no máximo 72 h; c. dividir finamente os referidos núcleos germinados,

enquanto os referidos núcleos germinados têm um teor de água de pelo menos 20%, com a condição de que os referidos núcleos de cevada não tenham um teor de água abaixo de 20% em nenhum momento após a germinação e até dividir finamente os núcleos germinados; d. preparar um extrato aquoso dos referidos grãos germinados moídos, produzindo assim um extrato aquoso da cevada.

[00257] 44, Método, de acordo com qualquer um dos itens 42 e 43, em que a referida etapa de germinação (b) compreende incubar os referidos grãos em uma solução aquosa até que os grãos tenham um conteúdo de água de pelo menos 30%, em que pelo menos 2 L de 07 por kg de peso seco de grãos de cevada é passado através da referida solução aquosa por h.

[00258] 45. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 44, em que os grãos da cevada são submersos na solução aquosa durante toda a etapa de germinação.

[00259] 46. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 45, em que a etapa de germinação compreende

[00260] a. pelo menos uma etapa de incubação dos referidos grãos em uma solução aquosa, em que pelo menos 2 L de 07 por kg de grãos de cevada em peso seco são passados através da referida solução aquosa por h; e

[00261] b. pelo menos uma etapa de incubação dos referidos grãos de cevada no ar.

[00262] 47. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 46, em que pelo menos 3 L, mais preferencialmente, pelo menos 4 L, ainda mais preferencialmente, pelo menos 5

L, ainda mais preferencialmente, pelo menos 6 L de 07 por kg de peso seco de grãos de cevada é passado através da referida solução aquosa por h.

[00263] 48. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 47, em que o referido 07 está compreendido dentro de uma mistura gasosa, em que a mistura gasosa é ar atmosférico.

[00264] 49. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 48, em que toda a etapa de germinação não excede 72h, mais preferencialmente, não excede 60h, ainda mais preferencialmente não excede 54h.

[00265] 50. O método, de acordo com qualquer um dos itens 42 a 49, em que a cevada é cevada descascada e o método compreende uma etapa de remoção de pelo menos parte da referida casca antes da incubação dos referidos grãos em uma solução aquosa.

[00266] 51. Um método para produzir uma bebida, o referido método compreendendo as etapas de:

[00267] a. preparar um extrato aquoso pelo método de acordo com qualquer um dos itens 42 a 50;

[00268] b. processar o referido extrato em uma bebida.

[00269] 52. O método de acordo com o item 51, em que a etapa b. compreende as etapas de: i. aquecer o referido extrato aquoso opcionalmente na presença de lúpulo ou extrato de lúpulo; ii. arrefecer o extrato aquoso; iii. fermentar o referido extrato aquoso com levedura, produzindo, assim, uma bebida fermentada.

[00270] 53. O método, de acordo com qualquer um dos itens 51 a 52, em que a bebida é cerveja.

[00271] 54. Método para preparar uma planta de cevada com um teor de b-glucana na faixa de 1 a 5% em peso seco do total de grãos, o método compreendendo as etapas de a. Fornecer grãos de cevada; e b. mutagenizar aleatoriamente os referidos grãos de cevada, introduzindo, assim, uma mutação no gene CslF6, em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o referido mutante CslF6 é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido em domínio transmembranar de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido não polar por um aminoácido carregado ou a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido não polar, em que os domínios transmembranares de CslF6 consistem nos aminoácidos 109 a 128 137 a 158, 700 a 731, 741 a 758, 835 a 857 e 864 a 882; e c. selecionar núcleos de cevada ou progênie dos mesmos portando um gene CslF6 mutado.

[00272] 55. O método, de acordo com o item 54, em que a planta de cevada ou a mutação é como definida em qualquer um dos itens 1 a 31.

[00273] 56. A planta de cevada de acordo com qualquer um dos itens 1 a 31, em que a planta de cevada compreende uma mutação em um ou mais genes adicionais, por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações: a. uma mutação no gene que codifica LOX-l, resultando em uma perda total de LOX-l funcional b. uma mutação no gene que codifica LOX-2, resultando em uma perda total de LOX-2 funcional c. uma mutação no gene que codifica o MMT, resultando em uma perda total de MMT funcional.

SEQUÊNCIAS

[00274] SEQ ID NO: 1, sequência Csl1F6 do tipo celulose sintase (com base no número GenBank NCBI: EU267181.1)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVA MGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIA FTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDOLPKLNPINRVPDLAVLRORFD RPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTY EALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQODEF VNDRRRVRKEYDE FKARINSLEHDIKORNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQOWEGTWVDASENHRRGDHAG IVLVLLNHPSHRROTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHOKKAGAMNA LTRASALLSNSPF ILNLDCDHY INNSQALRAGICEMVGRDSDTVAFVQFPORFEGVDPT DLYANHNRIFFDGTLRALDGMOGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGL FAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGF LPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYA AAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSR YCSIYPHAFIGTAPINLTERLFOVLRWSTGSLEIFF SKNNPLFGSTYLHPLORVAYINI TTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHF IVORPTTMEYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGV TVFEWF RNGOFWMTASCSAYLAAVCOVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLY VVRWIPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAK GILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYG WLH

[00275] SEQ ID NO: 2, CslF6 do tipo Hordeum vulgare celulose sintase (CslF6), CDs completos (com base no número do GenBank NCBI: EU267181.1)

ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGECCGCETECGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGECTGEC TGCCGCCGCEGCCEGCEGCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCT GCACGGGGTCGGCCECEGTEGCCTCCEGCCGCCTCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCC ATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAGCTCGGCGAAGA TGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGA AGATCAAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCC TTCACGCTGTTCGTGATCTGGCGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTG GGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTCTCGTGGCTGCTAGATCAGCTGC CCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCEGACCTGGECECGTCECTGCGGCAGCGCTTCGAC CGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGECTEGGACATCTITCGTCACCACGGCCGACCC CATCAAGGAGCCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACT ACCCCGTGGACCGCAACACATGCTACGTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTAC GAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTGCCCTTCTGCCGCAAGCA CGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATGG GGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAG TTCAAGGCCAGGATCAACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAA CGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCCCGECCCACCTGGATGGCGGACGGCACCC AGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGCGACCACGCCGGC ATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGEGCCCGCCGGCGAG CGCTGACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACG TGTCCCGTGAGAAGCGCCCCGGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCG CTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCCTTCATCCTCAACCTCGACTGCGA TCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTITCATGGTGGGACGGG ACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACC GACCTCTACGCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGEG CATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGCACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACG GCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGETCCCTGCTTCCCCAGGCTCGCCGGGECTC TTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAGGC CGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACG GCAAGTCGGACGCCTTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCC GCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAGGCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGAC GGCCGCCGCETTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGCTGGGTGTACGACA CCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGC TACTGCTCCATCTACCCACACGCCTICATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAG GCTCTTCCAGGTGCTCCGCTGETCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACA ACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTGCAGCGCGTCGCCTACATCAACATC ACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCGGCGCTATC CTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGG GCATCGTGCTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGCGGTC ACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAACGGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTA CCTCGCCGCCETCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTCCGGCGGGACATCTCCTTCA AGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTCTAC GTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCAT CGGATCCGCCGTGGCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGG TCGCCGGCGGCGTCTTCTTICAACTTCTGGGTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAG GGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTCTGGTGGGCATTCAC CTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCA AGCACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGC TGGCTCCATTGA

[00276] SEQ ID NO: 3, sequência Csl1F6 do tipo celulose sintase (contendo polimorfismo A590T)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVA MGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIA FTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDOLPKLNPINRVPDLAVLRORED RPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTY EALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEF VNDRRRVRKEYDE FKARINSLEHDIKORNDGYNAAIAHSOGVPRPTWMADGTOQWEGTWVDASENHRRGDHAG IVLVLLNHPSHRROTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHOKKAGAMNA LTRASALLSNSPF ILNLDCDHY INNSOALRAGICFMVGRDSDTVAFVQOFPORFEGVDPT DLYANHNRIFFDGTLRALDGMOGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGL FAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGF LPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYT AAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSR YCSIYPHAFIGTAPINLTERLFOVLRWSTGSLEIFF SKNNPLFGSTYLHPLORVAYINI TTYPEFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVORPTTMEYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGV TVFEWFRNGOFWMTASCSAYLAAVCOVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLY VVRWIPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAK GILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYG WLH

[00277] SEQ ID NO: 27, mutante 2 da parede celular (CW3a) com base na SEQ ID NO: 1, sequência CslF6 semelhante à celulose sintase (com base no número do GenBank NCBI: EU267181.1)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQOVCACTGSAAVASAASSLDMDIVA MGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIA FTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDOLPKLNPINRVPDLAVLRORED RPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTY EALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEF VNDRRRVRKEYDE FKARINSLEHDIKORNDGYNAAIAHSOGVPRPTWMADGTQOWEGTWVDASENHRRGDHAG IVLVLLNHPSHRROTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHOKKAGAMNA LTRASALLSNSPFILNLDCDHY INNSOALRAGICEMVGRDSDTVAFVQOFPORFEGVDPT DLYANHNRIFFDGTLRALDGMOGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGL FAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGF LPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYA AAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSR YCSIYPHAFIGTAPINLTERLFOQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLORVAYINI TTYPEFTAIFLIFYTTVPALSFEVTGHF IVORPTTMEYVYLDIVLSTLLVIAVLEVKWAGV TVFEWFRNGOFWMTASCSAYLAAVCOVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLY VVRWIPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFEFNFWVLFHLYPFAK GILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYG WLH.

EXEMPLOS Exemplo 1 Projeto de sondas de identificação de mutantes digitais

[00278] A sequência de codificação do gene HvCslF6 foi coletada no National Center for Biotechnology Information (NCBI) sob o número de acesso AB621332. Esta sequência foi usada para uma pesquisa BLAST em: http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/. O gene HvCs1F6 e as sequências de transcrição foram recuperados sob o número de acesso: MLOC 57200 usando: http://plants.ensembl .org/Hordeum vulgare/. As sondas de identificação digital de mutantes foram projetadas com base no DNA codificador e na sequência proteica de MLOC 57200.2. Exemplo 2 Triagem de mutantes de cevada com mutações específicas no gene para CslF6 semelhante à celulose sintase.

[00279] No total, foram identificados 5 mutantes com uma mutação específica, levando à substituição de um resíduo de aminoácido em CslF6 do tipo celulose sintase (HvCslF6) (Tabela 1).

Tabela 1. Mutantes identificados.

No. do Alteração de nucleotídeo | Alteração de Mutante na sequência de | aminoácido na proteína codificação (SEQ ID NO:2) | (SEQ ID NO:1)

[00280] O mutante 1, o mutante 2, o mutante 3 e o mutante 4 foram identificados usando um método de triagem de ddPCR essencialmente como descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516. Mais especificamente, foi preparado um conjunto de grãos de cevada mutagenizados aleatoriamente, seguido pela preparação de uma biblioteca ordenada, conforme descrito no pedido de patente internacional PCT / EP2017 / 065516 em WSl e WS2 na p. 66- 69, bem como nos Exemplos 1 a 2. Os mutantes 1, mutante 2, mutante 3 e mutante 4 foram identificados e selecionados conforme descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516 no WS3 e WS4 na p. 67-72, bem como nos Exemplos 3 a 15, usando os iniciadores e sondas especificados na Tabela 2 abaixo.

Em particular, a triagem foi realizada essencialmente como descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516 no WS3 e nos Exemplos 3 a 7 usando os iniciadores e sondas especificados na Tabela 2 abaixo.

Os grãos de cevada individuais portadores da mutação genética foram identificados essencialmente como descrito no pedido de patente internacional PCT/EP2017/065516 no WS4 (p. 69-72) e nos Exemplos 8 a 15 usando os iniciadores e sondas especificados na Tabela 2 abaixo.

Os iniciadores e sondas foram projetados especificamente para a identificação de mutantes específicos no locus HvCsl1F6. descrito na Tabela 2. Tabela 2. Iniciadores e sondas projetados para os mutantes específicos.

Mutante Iniciador Iniciador Sonda de detecção | Sonda de detecção dianteiro reverso específica para | específica de alvo- alvo- mutantes marcada com | referência marcada com específico | específico | 6-carboxifluoresceína hexaclorofluoresceína (FAM) (HEX) Mut1 TACACCCATC | CGAGAACCTT | ATCATCGAATCCGCCG (SEQ | CATCATCGGATCCGCCE (SEQ ATCATCATCT | GECGA (SEQ | ID NO:6) ID NO:7) (SEQ ID ID NO:5) NO:4) Mut2 CCGACCACCA | GECGATGACG | CTACCTGGACATCGTGC CTACCTGGGCATCGTG (SEQ TGTTCT AGCAG (SEQ | (SEQ ID NO:10) ID NO:11) (SEQ ID ID NO:9) NO:8) Mut3 ACTGCTCCAT | GTATGTGCTG | TGCTCCGCTGATCCA (SEQ TCCGCTGGTCCACG (SEQ CTACCCAC CCGAAGAG ID NO:14) ID NO:15) (SEQ ID (SEQ ID NO:12) NO:13) Mut4 CACCACCETG | CATGGTGGTC | CETCACCGACCACTTC (SEQ | TCACCGGCCACTTCA (SEQ CCG (SEQ GGGC (SEQ ID NO:18) ID NO:19) ID NO:16) ID NO:17)

[00281] O mutante 5 foi identificado usando uma abordagem de sequenciação direta de 6000 mutantes de cevada M3 mutagenizados usando iniciadores específicos (iniciador direto 5'- ACTGCTCCATCTACCCACAC-3 '; iniciador reverso 5'- GATGACGAAGGTGAATGCCC- 3') para amplificar partes do Locus HvCs1F6.

[00282] O mutante 1, o mutante 2, o mutante 3, o mutante 4 e o mutante 5 são também aqui referidos como Mutl, Mut2, Mut3, Mut4 e Mut5, respectivamente.

[00283] Para visualizar a localização das mutações, O programa Swissprot (swissmodel.expasy.org/) foi usado para modelar a proteína CslF6. Primeiro, toda a sequência de proteínas é carregada no "recurso de construção do modelo" e, em seguida, um modelo é calculado com base nos dados disponíveis. Para a sequência da proteína CslF6, é reconhecido como tendo incorporado na sequência uma estrutura semelhante à "Subunidade A da celulose sintase".

[00284] O programa utiliza então a sequência reconhecida (posição de polipeptídeo 109-883) para construir um modelo. Nesta fase, o programa SwissProt não reconhece que a proteína está ligada à membrana, embora as hélices estejam ordenadas para um lado no modelo. A literatura indica que a proteína ClsF6 está ligada à membrana. Portanto, para testar isso, foi utilizado o recurso QMEANBrane no SwissProt. Este programa de modelagem utiliza um arquivo PDB que cobre a posição 109-883 gerada durante a primeira modelagem e, em seguida, uma nova estrutura é construída modelando a membrana e parte selecionada da proteína Csl1F6 juntas. Os dois planos cinza pontilhados reamostram a membrana de duas camadas. As três mutações que direcionam um conteúdo mais baixo de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos residem em estruturas em hélice incorporadas na membrana (T7091I, G748D, G847E), enquanto a mutação não afetando o teor de (1, 3; 1, 4) -B-glucanos (G732D) está localizada em uma sequência de ligação voltada para o exterior e conectando dois domínios transmembranares (Figura 3). Os aminoácidos localizados na membrana em Csl1F6 estão indicados na Tabela 3. Tabela 3. Localização de sequências de aminoácidos localizadas na membrana na proteína Csl1F6

Posição do AA na SEQ ID A : : : NO:1 ou SEO Sequência AA Funcionalidade ID NO:3 109-128 RVLIFVRLIAFTLFVIWRIS Extensão da membrana (SEQ ID NO:20) Extensão da membrana 137-1 LWVTSICGEFWFGF SWLLDQOLP 3 58 SICG sPS Q (SEQ ID NO:21) Parte da extensão da 7100-711 LORVAYINITTY membrana (SEQ ID NO: 22) 7112-714 PTF Ligante da hélice na = membrana dando torção Parte da extensão da 715-731 AIFLIFYTTVPALSFVT membrana (SEQ ID NO:23) Extensão da membrana 741-758 TMFYVYLGIVLSTLLVIA ? sela aeee (SEQ ID NO:24) Extensão da membrana 835-857 ITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLD OT TA (SEQ ID NO:25) 864-882 LKVAGGVFFNFWVLFHLYPF Extensão da membrana (SEQ ID NO:26) Exemplo 3 Teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos e razão DP3:DP4 de grãos mutantes maduros

[00285] Os mutantes identificados como descrito no Exemplo 1 foram cultivados até a maturidade e grãos homozigotos foram plantados em fileiras. Na maturidade, as plantas foram colhidas e os grãos utilizados para propagação em pequenas parcelas de poucos metros quadrados. Os mutantes 1, 2, 4 e 5 tiveram um bom desempenho no campo, produzindo rendimentos semelhantes às referências. Portanto, esses mutantes têm características agronômicas aceitáveis. A referência foi cv. Paustian para os mutantes 1, 2, 3 e4, e cv. Têmpera para o mutante 5.) O mutante 3 exibiu fertilidade altamente reduzida e, portanto, não foi incluído nos testes de rendimento.

[00286] A Tabela 4 mostra o rendimento médio de pelo menos quatro parcelas de 7,5m2. A cevada foi propagada em Nr Aaby em 2017.

[Mo eo Motante | mutante | nencimento 1a) | ce Ls REA

LD me e RS

E EFE

[00287] Os grãos colhidos foram analisados quanto ao teor total de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos e determinada a razão DP3: DP4. Moeram-se dez ml de grãos de cevada num moinho de ciclone Retch. Todas as amostras foram analisadas em triplicatas. Vinte mg de farinha foram extraídos em tubos Eppendorf de 2 ml, aquecidos por 2 horas a 100 graus C em um forno, seguidos de resfriamento à temperatura ambiente. No total, foram adicionados 500 ml de metanol aquoso a 50% e à amostra foi agitada a 1400 rpm durante 1 hora. Após centrifugação a 16.000 g durante 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e a amostra foi seca durante a noite. Em seguida, foram adicionados 400 ml de NaHPO0s 20 mM a pH 6,5 com 1 U / ml de liquenase (Megazyme, International, Irlanda) por 10 mg de farinha e incubados a 50 graus C por 2,5 horas. A amostra foi centrifugada a 16000 g por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,45 pum e os oligômeros liberados Glc-B-(1->4)-Glc-B-(1->3)-Glc (DP3) e Glce-B-(1->4) -Glc-B-(1->4) -Glc-B-(1->3)-Glc (DP4) foram quantificados por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho detecção amperométrica (HPAEC-PAD). O oligômeros Gle-B-(1->4)-Gle-B-(1->3)-Gle (DP3) e Gle-B-(1->4)-Gle-B- (1->4) -Glc-B-(1->3) -Glc (DP4) foram quantificados com HPAEC- PAD usando um sistema Dionex ICS 5000+ DC equipado com uma coluna SA-10 às 16:00 com dimensões de 2x250 mm e uma pré- coluna. As condições de execução foram de 0,4 ml / min, temperatura da coluna 40 º C, eluente isocrático de NaOH 100 mM por 15 min. Os padrões de quantificação foram produzidos por digestão com 1 U / ml de nicenase (Megazyme International, Irlanda) de quantidades conhecidas de viscosidade média (1, 3; 1, 4) -B-glucanos (Megazyme International, Irlanda) em NaHPO4 20 mM pH 6,5 assumindo uma razão de resposta de PAD molar igual entre DP3 e DP4. O teor total de (1, 3; 1, 4)-B-glucano foi considerado a soma do teor dos oligômeros DP3 e DP4.

[00288] Resultados. O teor de (1-3; 1-4)-B-glucano dos mutantes 1, 2 e 5 estava na faixa de 1,4 a 2%, enquanto o mutante 3 quase não tinha (1-3; 1-4)-B-glucano (Figura 1 e Tabela 6). Examinando as razões DP3:DP4, o mutante 1 mostrou uma razão mais baixa do que as referências; o mutante 2 foi semelhante às referências; os mutantes 3 e 4 levemente maiores que a referência e o mutante 5 mostraram uma razão DP3:DP4 muito maior (Figura 2 e Tabela 6).

Exemplo 4 Teor de (1, 3; 1, 4)-B-glucanos de grãos mutantes durante a germinação acelerada

[00289] Grãos dos mutantes 1, 2 e 4, bem como da referência (a referência foi cv. Paustian para os mutantes 1, 2, 3 e4,ecv. O resfriamento do mutante 5) foi submetido a uma infusão e germinação de etapa única em um tanque essencialmente como descrito no Exemplo 1 do pedido de patente internacional PCT EP2017/065498. Amostras de grãos em germinação foram coletadas após 24 e 48 horas.

[00290] Todas as amostras foram analisadas usando o perfil abrangente de polímeros de microarrays (CoMPP) (Moller et al., 2007). Cada amostra foi analisada em triplicados de 20 mg extraída sequencialmente com 1 ml de H 20 a85 ºC durante 1 hora a 1000 rpm e 1 ml de NaOH 4 M e 0,1% v / v de NaBH; a 20 º C durante 2 horas a 1000 rpm. Cada extração foi realizada em tubos Eppendorf de 2 ml com uma bola de vidro de 3 mm, seguida por 10 min de centrifugação a 10.000 g e o sobrenadante coletado.

[00291] As extrações foram misturadas 50/50 com tampão de impressão arrayjet (55,2% de glicerol, 44% de água, 0,8% de Triton X-100) e manchadas em uma membrana de nitrocelulose, tamanho de poro de 0,45 pm (Whatman, Maidstone, Reino Unido) usando um Arrayjet Sprint ( Arrayjey, Roslin, Reino Unido). Cada amostra foi impressa com quatro repetições técnicas e três diluições de cinco vezes e sondada conforme descrito em (Pedersen et al., 2012). As matrizes foram digitalizadas usando um scanner de mesa (CanoScan 9000 Markll, Canon, Soborg, Dinamarca) a 2400 dpi e quantificadas usando o Array-Pro Analyzer 6,3 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA). Para cada amostra, uma média foi calculada com base nas quatro diluições e quatro réplicas técnicas, resultando em 16 medições por amostra de valor do sinal replicado. O valor mais alto no conjunto de dados foi definido como 100 e o restante ajustado de acordo. Os dados são apresentados na Tabela 5 mostrando a média de três amostras em replicada. Tabela 5. Teor de (1, 3; 1, 4)-fB-glucano dos mutantes e referências da cevada. O valor mais alto às 24h foi definido como 100 e o restante ajustado de acordo LJ Fossa ameas AA

FR FS o

[00292] A análise mostra que o Mutante 1 e 2 têm um conteúdo menor de (1, 3; 1, 4) -3-glucano após 24h e 48h durante a germinação em um tanque abastecido com ar em comparação com a referência e o Mutante 4 verifica o inerente inferior (1, 3; 1, 4) -3-glucano dos mutantes 1 e 2. Exemplo 6 Análise da resistência do grão

[00293] Os mutantes 1, 2, 3, 4 e 5, bem como as linhagens de referência cv. Paustian e cv. Quench foram propagadas no campo em parcelas de 7,5 mº. Eles foram colhidos com um teste Wintersteiger Classic (Wintersteiger (WINTERSTEIGER AG, Johann-Michael-Dimmelstrasse 94910 Ried im Innkreis, Áustria). Uma limpeza adicional dos grãos foi realizada em um limpador de amostras Pfeuffer, modelo SLN4 (Pfeuffer GmbH, Flugplatzstrabe 70, 97318 Kitzingen, Alemanha) usando uma peneira de 2,5 mm. Os grãos partidos foram contados em quatro amostras selecionadas aleatoriamente de aproximadamente 10g e a quantidade de grãos partidos foi calculada com base no peso. O número de grãos partidos após a trilha (teste de Wintersteiger) e antes de O rastreio é uma indicação da resistência dos grãos A taxa de grãos quebrados após a trilha foi calculada como um aumento dobrado de grãos quebrados em plantas mutantes em relação às plantas de referência do tipo selvagem (plantas de referência indicadas na Tabela 6a). Tabela 6a - Resumo das características dos grãos mutantes Notação de | Beta- Razão &% beta- | Grãos patente glucano DP3/DP4 |glucano de | quebrados dentro da | em p/p referência | (%) farinha (%) Ref 1 - Cv.|3,5 2,9 100 1,6 Paustian Ref 2 - Cv.|/3,2 2,8 100 2,1 Quench

[00294] Uma determinação semelhante da porcentagem de grãos quebrados (a taxa de debulha de debulha) foi realizada em amostras de 50 g de plantas de cevada cultivadas na Nova Zelândia 2016-2017 (Mut 1; Mut 2; Mut 4; Mut 5) e na Dinamarca 2018 (Mut 2) A frequência de grãos partidos após a debulha (taxa de debulha) foi determinada como descrito acima e comparada com a frequência das plantas de cevada de referência do tipo selvagem (cv. Paustian para Mut 1, Mut 2 e Mut 4 e cv. Quench para Mut. 5) O aumento de dobra em comparação com as plantas de cevada de referência do tipo selvagem é indicado na Tabela 6b abaixo.

Tabela 6b fa ss ERAS jam o de cevada |a SEQ ID NO:1 nos grãos dobra nos quebrados 2017 grãos quebrados 2018 [ME eae a | Mae 4 eta | mes menos

[00295] Interessante, Hu et al., 2014 divulgam uma linhagem de cevada (m351) carregando uma mutação no gene Csl1F6, resultando em uma mutação A849T da proteína CslF6. A referida linhagem de cevada tem um aumento de 4,2 vezes na taxa de grãos quebrados em comparação com o controle do tipo selvagem. Exemplo 7: Atividade da enzima hidrolítica em amostras de malte

[00296] Núcleos de cevada do mutante 2 e da referência (cv. Paustian) foram processados em triplicatas, 50 g cada amostra. O mutante 2 foi como descrito no Exemplo 2 acima). Os grãos de cevada seca colocados em provetas de aço inoxidável foram micromaltados de acordo com métodos padrão. Resumidamente, os grãos de cevada eram uma submissão forçada em água fresca a 15 º C por cerca de 7 horas no primeiro dia, 3 horas no segundo dia e uma hora no terceiro dia, atingindo um teor de água de 35%, 40 % e 45%, respectivamente, no final de cada maceração. Após cada embebimento, as provetas de aço inoxidável contendo as amostras foram movidas para uma caixa de germinação a 15 º C e mantidas ali até a etapa seguinte do processo. No final da última drenagem de água embebida, as amostras foram mantidas por 120 horas (dias 3 - 7) em caixas de germinação equilibradas em 45% de água e pulverizadas para superar a perda de água na respiração.

[00297] No final do processo de germinação (dia 7), as amostras foram secas em estufa nas caixas de aço inoxidável em uma incubadora Termaks por 21 horas, usando o seguinte programa de rampa de temperatura: ºC-55ºC(2ºC/h) 55 º C-85ºC(4º C/h) 85 º C por 1,5 horas

[00298] As etapas de germinação e secagem em estufa foram realizadas com um fluxo de ar recirculante de 80% de ar fresco.

[00299] Ao final de cada dia de micromaltagem, as amostras foram coletadas para análise, em triplicado e liofilizadas por 48 horas.

[00300] Antes da análise da atividade enzimática, as amostras de malte foram moídas usando um moinho Foss Cyclotech padrão equipado com um anel de moagem de carboneto de tungstênio (Foss 10004463), impulsor niquelado (Foss 1000 2666) e uma tela de saída de 1 mm (Foss 10001989). Todas as medições da atividade enzimática do malte de cevada foram realizadas dentro de 48 h após a moagem da amostra seca. Os ensaios de atividade da alfa-amilase foram medidos usando um kit Ceralpha (K-CERA) da Megazyme usando equipamento padrão de laboratório. Os ensaios de amilase foram feitos de acordo com o protocolo do fabricante (K-CERA 01/12). O cálculo da atividade da amilase foi baseado na fórmula do protocolo Megazyme (K-CERA 01/12). Os ensaios de atividade da beta- amilase foram medidos usando o kit Betamyl (K-BETA3) da

Megazyme usando equipamento padrão de laboratório. Os ensaios de amilase foram feitos de acordo com o protocolo do fabricante (K-BETA3 10/10). O cálculo da atividade da beta- amilase foi baseado na fórmula do protocolo Megazyme (K- BETA3 10/10). Os ensaios de atividade de limite de dextrinase foram medidos usando um kit Pullulanase / Limit Dextrinase Assay (Método —“PullG6) (K-PullG6) da Megazyme usando equipamento de laboratório padrão. Os ensaios de limite de dextrinase foram feitos de acordo com o protocolo do fabricante (K-PullG6 05/17). O cálculo da atividade limite da dextrinase foi baseado na fórmula do protocolo Megazyme (K-PullG6 05/17). Os ensaios de limite de dextrinase foram feitos de acordo com o protocolo do fabricante (K-PullG6 05/17). O cálculo da atividade limite da dextrinase foi baseado na fórmula do protocolo Megazyme (K-Pull1G6 05/17). Os ensaios de limite de dextrinase foram feitos de acordo com o protocolo do fabricante (K-PullG6 05/17). O cálculo da atividade limite da dextrinase foi baseado na fórmula do protocolo Megazyme (K-PullG6 05/17).

Resultados:

[00301] As atividades enzimáticas totais medidas para a-amilase, b-amilase e dextrinase de limite livre seguem o mesmo padrão no Mutante 2 e na linha de referência da cevada (Figura 5). Surpreendentemente, a atividade limite da dextrinase parece ser um pouco mais alta no mutante a partir do dia 3, embora a expressão do gene limite da dextrinase tenha sido ligeiramente menor.

Exemplo 8 Teor de (1 -3; 1 —4) B- glucano

[00302] Os grãos germinados preparados como descrito no Exemplo 7 foram analisados quanto ao teor total de (1, 3; 1, 4)-B-glucano. Moinhos de cevada de dez mL foram moídos em um moinho de ciclone Retch. Todas as amostras foram analisadas em triplicatas. Pesou-se 20 mg de farinha em tubos Eppendorf de 2 mL, aquecidos por 2 horas a 100 º C em um forno seguido de resfriamento à temperatura ambiente. No total, foram adicionados 500 pL de metanol aquoso a 50% e as amostras foram agitadas a 1400 rpm por 1 hora. Após centrifugação a 16000 xg durante 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e as amostras secas durante a noite. Então 400 pLof 20 mM de NaHPO sa pH 6,5 com 1 U // mL de liquenase (Megazyme, International, Irlanda) foi adicionado por 10 mg de farinha e incubado a 50 º C durante 2,5 horas. A amostra foi centrifugada a 16000 xqg por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,45 pm e os oligômeros liberados Glc-B-(1->4)-Glce-B-(1->3)-Glc (DP3) e Glc-B-(1- >4) -Glce-B-(1->4)-Glc-B-(1->3)-Glc (DP4) foram quantificados por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Os oligômeros Gle-B-(1->4) -Gle-B-(1->3)-Glc (DP3) e Glce-B-(1->4)-Gle-B- (1->4) -Glc-B-(1->3) -Glc (DP4) foram quantificados com HPAEC- PAD usando um sistema Dionex ICS 5000+ DC equipado com uma coluna SA-10 às 16:00 com dimensões 2x250 mm e uma pré- coluna.

[00303] As condições de execução foram de 0,4 mL / min, temperatura da coluna 40 º C, eluente isocrático de

NaOH 100 mM por 15 min. Um padrão para quantificação foi produzido por 1 L / mL liquenase (Megazyme International, Irlanda) a digestão de quantidades conhecidas de viscosidade média (1, 3; 1, 4)-B-glucanos (Megazyme International, Irlanda) em 20 NaHPO mM de 4 pH 6,5 assumindo uma razão de resposta molar PAD igual entre DP3 e DP4. O conteúdo total (1, 3; 1, 4)-B-glucano foi calculado como a soma dos oligômeros DP3 e DP4.

Resultados:

[00304] O teor (1-3; 1-4)-pB-glucano do Mutante 2 (Mutante) e cv. Paustian (referência) foi monitorado na cevada e no malte verde nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 6 do procedimento de maltagem (Figura 6), bem como nos maltes no forno (dia 7 na figura 6). Durante todo o processo de maltagem, o conteúdo de (1-3; 1-4)-B-glucano do Mutante 2 foi apenas 50% da referência e, no dia 5, o teor de glucano (1-3; 1-4) -B-glucano foi semelhante ao malte de referência. Exemplo 9 Viscosidade Maltagem:

[00305] As amostras de cevada foram maltadas em duplicado usando 50 g de cevada por copo de amostra.

[00306] As amostras de cevada foram mergulhadas como uma submissão forçada em água a 15 º C em uma câmara fechada da grade de amostras. O procedimento de maceração foi realizado durante os primeiros três dias para atingir, respectivamente, 35%, 40% e 45% do teor de água no final de cada maceração. As amostras foram mantidas pelos três dias seguintes a 15 º C em caixas de germinação e equilibradas em

45% de água e ajustadas por aspersão com água para superar a perda de água na respiração. Após esses seis dias, as amostras foram cozidas no forno por 21 horas em uma incubadora Termaks e curadas usando um sistema manual de remoção de raízes. Durante os três dias de malte verde, após o terceiro dia de maltagem, as amostras foram liofilizadas até um teor de água de 4%.

Trituração:

[00307] Antes da trituração, as amostras foram moídas em pó fino. 70 g de matéria seca foram misturados em uma proporção de watengrist 5: 1 e triturados em um equipamento de trituração Lochner de acordo com o seguinte programa de trituração: 10 minutos a 52 º C, 50 minutos a 65 º C e 5 minutos a 78 º C, espaçados -um aumento de temperatura de 1 grau / min. As amostras foram coletadas ao longo do programa de trituração.

[00308] Após o esmagamento, o mosto é filtrado através do filtro de papel MN 614 4, O 320 mm (Macherey-Nagel). O comportamento reológico do mosto filtrado é medido em um reômetro rotacional RheolaboC (Anton Paar GmbH), suportando um sistema de temperatura Peltier (C-PTD 180 / AIR / QC) e um sistema de medição de gap duplo (C-DG42 / SS, Anton Paar GmbH).

Resultados:

[00309] A viscosidade do mosto de 3 dias (cevada após 3 dias de maltagem) foi determinada e comparada ao controle (mosto de 3 dias de grãos do tipo selvagem micro maltado da ev. Paustian e cv. Quench). A viscosidade é significativamente menor no mosto preparado a partir de qualquer mutante em comparação com os controles, como mostrado na Tabela 7 e Figura 6. O “Platão foi comparável no mosto preparado a partir de mutantes ou referências.

[00310] A viscosidade de um mosto preparado a partir de malte padrão preparado por maceração por 1-2 dias e germinação por 5-7 dias, seguido de secagem em estufa, é de cerca de 2 mPa * s. Tabela 7 EL JF Jr ES (1-3;1-4)- 2,44 + 0,02 | 5,50 + 0,02 |2,78 + 0,01 |4,91 + 0,22 B-glucano (BTG) (mg/1) Viscosidade /2,01 + 0,02 2,95 + 0,01 |2,15 + 0,05 2,71 + 0,05 EEE pa come]

REFERÊNCIAS

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[00313] Holme IB, Wendt T, Gil-Humanes J, Deleuran LC, Staker CG, Voytas DF and Brinch-Pedersen H, (2017). Evaluation of the mature grain phytase candidate HvVPAPhy a gene in barley (Hordeum vulgare L.) using CRISPR/Cas9 and TALENs. Plant Mol Biol 95:111-121; (DOI: 10.1007/s11103-017- 0640-6).

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Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Planta de cevada ou uma parte dela caracterizada pelo fato de que os grãos da referida planta de cevada têm um teor reduzido de (1,3; 1,4)-B-glucano, e, em que a referida planta de cevada carrega uma mutação no gene CslF6, em que o referido gene CslF6 mutado codifica um polipeptídeo CslF6 mutante, em que o referido CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1, exceto que o mutante CslF6 compreende pelo menos uma substituição de um aminoácido em um domínio localizado na membrana de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido apolar para um aminoácido carregado ou substituição de um aminoácido polar por um aminoácido apolar, em que o domínio localizado na membrana é selecionado a partir do grupo que consiste nos domínios localizados na membrana de CslF6 que consiste nos aminoácidos 835 a 857 ou nos aminoácidos 700 a 731, ou dos aminoácidos 741 a 758, da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3.

2. Planta de cevada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida planta de cevada tem um teor de (1,3; 1,4)-B-glucano na faixa de 1 a 5% em peso seco do total de grãos, por exemplo, 1,3 a 3% peso seco do total de grãos, de preferência, 1,3 a 2% em peso total do total de grãos.

3. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações | e 2, caracterizada pelo fato de que os grãos da referida planta de cevada têm um teor de (1,3; 1,4)-EB- glucano de pelo menos 30% e no máximo 60%, de preferência, em pelo menos 40% e, no máximo, 60% do teor de (1,3; 1,4)- B-glucano de uma planta de cevada que transporta um gene

Csl1F6 do tipo selvagem, mas que não seja do mesmo genótipo.

4. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste dos aminoácidos 835 a 857 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido apolar por um aminoácido carregado.

5. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 847, em que a referida substituição é substituição de uma glicina (G) por um ácido glutâmico (E).

6. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 de no máximo 2,5, como no máximo 2,1, por exemplo, na faixa de 1,0 a 2,1.

7. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a planta de cevada compreende grãos com uma frequência de grãos quebrados após a separação, que é no máximo 2 vezes maior que a frequência de grãos quebrados após a separação de grãos de uma planta de cevada que não carrega a mutação no gene CsIF6, mas de utra forma do mesmo genótipo.

8. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste dos aminoácidos 741 a 758 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido apolar por um aminoácido carregado.

9. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é CslF6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 748, em que o referido substituição é a substituição de uma glicina (G) por um ácido aspártico (D).

10. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 8 a 9, caracterizada pelo fato de que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 na faixa de 2,5 a 4.

11. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1 OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição de um aminoácido no domínio transmembranar que consiste dos aminoácidos 700 a 731 de CslF6, em que a referida substituição é a substituição de um aminoácido polar por um aminoácido apolar.

12. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 11, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo CslF6 mutante é Csl1F6 da SEQ ID NO: 1

OU SEQ ID NO: 3, exceto que o mutante CslF6 compreende uma substituição do aminoácido 709, em que a referida substituição é a substituição de uma treonina (T) por uma isoleucina (1).

13. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 11 a 12, caracterizada pelo fato de que os grãos da referida planta de cevada têm uma razão DP3:DP4 de pelo menos 3,5, tal como de pelo menos 4,0, por exemplo, pelo menos 4,5, como na faixa de 4 a 6.

14. Planta de cevada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a planta de cevada compreende uma mutação em um ou mais genes adicionais, por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações: a. uma mutação no gene que codifica LOX-l, resultando em uma perda total de LOX-l1 funcional b. uma mutação no gene que codifica LOX-2, resultando em uma perda total de LOX-2 funcional c. uma mutação no gene que codifica MMT, resultando em uma perda total de MMT funcional.

15. Produto vegetal selecionado do grupo que consiste em malte verde, malte seco em forno, mosto e bebidas caracterizado pelo fato de que o produto vegetal é preparado a partir da planta de cevada ou uma parte da mesma, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Método para produzir um extrato aquoso, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer grãos de uma planta de cevada conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14;

b. submeter os núcleos de cevada a uma etapa de germinação, obtendo, assim, núcleos germinados, em que a referida etapa de germinação compreende incubar os referidos núcleos em uma solução aquosa por no máximo 72 h; c. dividir finamente os referidos núcleos germinados, enquanto os referidos núcleos germinados têm um teor de água de pelo menos 20%, com a condição de que os referidos núcleos de cevada não tenham um teor de água abaixo de 20% em nenhum momento após a germinação e até dividir finamente os núcleos germinados; d. preparar um extrato aquoso dos referidos grãos germinados moídos, produzindo, assim, um extrato aquoso da cevada.

17. Método para produzir uma bebida, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. Preparar um extrato aquoso de grãos de uma planta de cevada conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1al4e/ oumalte conforme definido pela reivindicação 15; ou preparar um extrato aquoso pelo método conforme definido pela reivindicação 16 Cc. processar o referido extrato aquoso em uma bebida.