CN111787788A

CN111787788A - 具有改善的细胞壁性质的谷类植物

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Publication number: CN111787788A
Application number: CN201880084920.2A
Authority: CN
Inventors: 索伦·克努森; S·博德文; 奥利·奥尔森; H·汤姆森; T·文特; J·哈尔霍尔特; 芬恩·洛克
Original assignee: Carlsberg AS
Current assignee: Carlsberg AS
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: AU2018394151A1; UY38036A; CA3085987A1; US11690341B2; CN111787788B; WO2019129736A1; AR114058A1; EA202091565A1; EP3731627A1; UA128692C2; MA51410A; JP7359768B2; BR112020013213A2; JP2021509807A; MX2020006854A; US20210062208A1

Abstract

本发明涉及大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)‑β‑葡聚糖含量。大麦植物可以在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽。

Description

具有改善的细胞壁性质的谷类植物

技术领域

本发明涉及具有改善的细胞壁性质的大麦植物。特别地，本发明涉及具有可用于生产基于大麦的饮料如啤酒的细胞壁性质的大麦植物。本发明还涉及生产基于大麦的饮料的方法，以及由本发明的大麦植物制备的产品。

背景技术

在商业性制麦(malting)过程中，大麦谷粒在受控条件下萌发或进行制麦，该受控条件允许在4-6天的时间内部分动员含淀粉胚乳的淀粉和蛋白质储备。制麦过程通常是通过将干燥的大麦谷粒浸入水中而开始的。该过程被称为浸泡(sweeping)，其目的不仅在于清洁谷粒，还在于将其含水量提高至约40-45％(w/w)，以便随后进行的胚乳动员步骤能更快地进行。浸泡期间，将水排干一次，以使谷粒重新通气。该步骤被称为“空气静置”(airrest)且被认为是必要的，主要是因为浸没的谷粒在约16h后变得缺氧。经过大约8h的“通风”后，将谷粒重新浸入水中以在另外8h的时间内-或经在一系列再浸泡步骤中完成浸泡处理。将干燥谷粒的含水量提高到40％或更高的两步浸泡过程总共需要大约32h。

将浸泡的谷粒铺开以进行萌发，在此过程中，糊粉粒(aleurone)和盾片(scutellar)上皮细胞分泌的酶以及淀粉质胚乳细胞中预先存在的酶一起降解细胞壁、淀粉和蛋白质。制麦者的目的通常是诱导高水平的酶，所述酶降解大麦谷粒中的细胞壁多糖，特别是(1,3；1,4)-β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖。未完全降解的(1,3；1,4)-β-葡聚糖对于啤酒酿造者尤其麻烦，因为这些糖可以以可溶形式从麦芽中提取出，形成高粘度的水溶液，从而减慢啤酒酿造过程中的过滤过程，并造成在最终的啤酒中的不期望的混浊。进一步显示，具有高(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的酿造会对麦芽提取物的水平产生负面影响。因此，低水平的可溶性(1,3；1,4)-β-葡聚糖代表着重要的制麦质量参数，而高水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶仍然是衡量麦芽质量的重要量度。此外，制麦者的目的还在于迅速诱导谷粒中合成尽可能多的淀粉降解酶。淀粉降解酶包括α-和β-淀粉酶、淀粉脱枝酶(例如极限糊精酶)和α-葡萄糖苷酶，将谷粒的淀粉储备部分地解聚为单糖、寡糖和葡萄糖。淀粉的解聚产物随后被酵母细胞用作碳源，并被发酵成啤酒乙醇。

如上所述，萌发过程通常花费约5天。在受控的萌发步骤之后，将湿麦芽从大约40％的含水量干燥至4至5％。该干燥过程，称为窑烤(kilning)，非常耗能，并且对该工业来说是主要的成本。包括窑烤干燥在内的整个过程通常为6-7天。

在啤酒厂中，将窑烤干燥后的麦芽碾碎以使谷粒破裂开，并且在称为糖化(mashing)的过程中用热水提取所得内容物。如上所述，提取的物质包括部分降解的淀粉、蛋白质和细胞壁分子，并且这些提取物还用从麦芽提取的内源性谷物酶进一步降解。在这个阶段，一些啤酒酿造者增加了额外的(并且通常更便宜的)碳源(辅料)来支持随后的酵母发酵过程，并抵消麦芽的较高成本。所述辅料可以是来自未萌发谷物的大麦、大米、小麦或其他谷粉，但是它们的加入可能需要同时添加水解酶，因为麦芽中的内源酶不足以降解该辅料的成分。添加的酶通常来自真菌和/或细菌培养物的未纯化且相对便宜的提取物。在某些国家，添加外源酶是非法的，特别是在必须在严格监管环境下生产啤酒的国家。

淀粉和其他在热水中提取的胚乳成分的进一步降解在称为糖变(saccharification)的过程中进行。糖化后，通常在过滤桶中过滤提取物，并冷却。可以在啤酒花或啤酒花提取物的存在下煮沸提取物，并在冷却后添加酵母培养物以将释放的糖发酵为乙醇。如此生产的啤酒通常在装瓶前先熟化并过滤。啤酒也可以在装瓶之前被充二氧化碳。

大麦是用于生产啤酒的最受欢迎的谷物。大麦籽粒中包含大量的淀粉，这使大麦成为酿造业极具吸引力的原料。为了确保大麦谷粒的酿造潜力得到充分利用，至关重要的是对包围淀粉颗粒的细胞壁结构进行最佳降解。如果简化其结构，则大麦籽粒主要由被糊粉粒层包围的淀粉质胚乳组成。大麦籽粒糊粉粒和胚乳细胞壁主要由非淀粉多糖(NSP)组成。淀粉质胚乳由75％的(1-3,1-4)-β-葡聚糖(BGL)和20％的阿拉伯糖基木聚糖(AX)组成，而糊粉粒由71％的AX和26％的BGL组成。大麦BGL是通过β-(1-3)和β-(1-4)键连接的无分支长直链葡萄糖残基。大麦AX由通过β-(1-4)键连接的D-木聚糖基吡喃糖基(D-xylanopyranosyl)分子主链组成，随机具有通过α-(1-2)和α-(1-3)键连接的L-阿拉伯呋喃糖。

发明内容

如上所述，啤酒生产的时间和能量消耗步骤之一是制麦。制麦过程中的限速步骤是将萌发的大麦籽粒中的(1,3；1,4)-β-葡聚糖水平降低至可接受的低水平。因此，需要提供可以减少制麦所需时间的材料和方法。特别地，需要具有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物。但是，完全不存在(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物的株高、植株活力和产量降低(约为对照的70％)(Taketa等，2012)。实际上，Taketa等的结论是“随着农艺学特征的降低，bgl突变体在制麦中的效用可能不好……”。Hu等(2014)描述了大麦突变体m351，其包含非常低水平的混合链(1-3,1-4)-β-葡聚糖(<1.6％)。然而，m351突变体表现出降低的谷粒硬度，与其亲代相比，其谷粒破碎率增加了四倍以上，并且对盐的敏感性导致在400mM盐条件下萌发较弱。

因此，需要具有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖，同时具有良好的农艺学特征和谷粒硬度的大麦植物。大麦(1,3；1,4)-β-葡聚糖包含比率通常在2.5至4的范围内的纤维三糖基(DP3)和纤维四糖基(DP4)残基。DP3/DP4比率对(1,3；1,4)-β-葡聚糖的性质有影响。

在一个实施方式中，本发明提供了具有DP3/DP4比率与野生型大麦的DP3/DP4比率相当的低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物。这样的大麦植物可能是农艺学合理的，并且大麦籽粒的破碎倾向降低。本发明解决的一个技术问题是提供具有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物，其中大麦植物同时具有可接受的农艺学性状，可接受的谷粒破碎频率(例如是没有CslF6突变但其他方面具有相同基因型的野生型植物的<2倍)，以及此外类似于野生型大麦的DP3/DP4比率。

在一个实施方式中，本发明提供具有高或低DP3/DP4比率的低水平(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物。这样的大麦植物可能有农艺学合理的谷粒，并且它们可能具有较高水平的不溶的(1,3；1,4)-β-葡聚糖。不溶的(1,3；1,4)-β-葡聚糖可以在酿造过程中被潜在地除去，并且因此在一些实施方式中是优选的。Burton&Fincher 2014推测，(1,3；1,4)-β-葡聚糖分子的溶解度可以通过DP3:DP4的比率预测，并且高和低的比率可能会导致更不溶的聚集体。

Jobling等(2015)描述了CslF在烟草叶中的人工系统中的表达，并描述了CslF的第四跨膜结构域中的单个氨基酸(Ile757)控制着DP3:DP4的比率，但是没有描述该结构域的修饰和DP3:DP4的比率与(1,3；1,4)-β-葡聚糖的量相关。

本发明解决的一个技术问题是提供具有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的大麦植物，其中该大麦植物同时具有可接受的农艺学性状和此外有用的DP3/DP4比率。

在一个方面，本发明提供了在跨膜结构域中携带单个氨基酸突变的大麦植物。本发明令人惊讶地证明，包含低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(通常在1.7至5％的范围内)的此种大麦植物是有活力的，是农艺学合理的并且具有与其他大麦栽培种相当的产量。这样的大麦植物对于萌发时间减少的基于谷物的饮料的生产方法特别有用。

此外，本发明提供了产生具有微调的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的大麦植物的方法和工具。因此，本发明的大麦植物不仅具有低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，而且大麦植物的DP3∶DP4比率还可以控制。

在一个方面，本发明提供了一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，并且其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，其中所述突变体CslF6是SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在CslF6的膜定位结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，其中CslF6的膜定位结构域由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882组成。

本发明的又一方面提供由所述大麦植物制备的植物产品以及由所述大麦植物制备植物产品的方法。本发明的大麦植物可以有利地用于制备植物产品，例如麦芽汁，其与由带有野生型CslF6基因但其他方面与发明的大麦植物具有相同基因型的大麦植物的籽粒制备的麦芽汁相比，粘度降低了。

附图说明

图1.通过数字突变鉴定(DMI)方法(Mut1、2、3和4，以及相应的参考1)或通过测序(Mut5和相应的参考)鉴定的突变体的(1,3；1,4)-β-葡聚糖(缩写为β-葡聚糖或BGL)的含量。条代表+/-SD。

图2.通过DMI方法(Mut1、2、3、4，以及相应的参考标记1)或通过测序(Mut5和相应的参考)鉴定的突变体的DP3:DP4比率。

图3.嵌入质膜的CslF6蛋白的模型。所示突变代表了DMI突变体。

图4显示了用于制备绿麦芽的设备的示例。该设备包括罐(2)，谷物可以在其中浸入水溶液中并连续通气。该设备包括谷物谷粒的入口(1)，罐(2)，例如浸泡罐；气体入口(3)，例如烧结石；泵(4)，例如气泵；谷物谷粒出口(5)；谷粒泵(6)；用于精细分割谷物谷粒的设备(7)，例如磨；入口(8)；容器(9)，例如糖化容器；以及出口(10)。

图5显示了在制麦过程中，突变体2(突变体)和在cv.Paustian(参考)谷粒中测得的α-淀粉酶(a)、β-淀粉酶(b)和游离极限糊精酶(c)活性。

图6显示了突变体2(突变体)和cv.Paustian(参考)谷粒的成熟大麦谷粒(0天)和在1、2、3、4、5、6天的绿麦芽以及窑烤麦芽(7天)中的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。

具体实施方式

定义

如本文所用，“一(a)”可以指一或更多，这取决于使用它的上下文。

如本文所用，术语“辅料”是指在啤酒制备过程中添加的富碳原料来源。辅料可以是未萌发的谷物谷粒，其可以与根据本发明制备的萌发的谷粒一起研磨。辅料也可以是糖浆、糖等。

本文所用的术语“氨基酸”是指蛋白氨基酸。优选地，蛋白氨基酸是由标准遗传密码编码的20个氨基酸之一。IUPAC单字母和三字母代码用于命名氨基酸。

术语“对应于X的氨基酸”在本文中用于相对于参考多肽(例如SEQ ID NO:1的Cs1F6)的氨基酸描述给定多肽(例如，突变体CslF6多肽)的氨基酸。在所述多肽和参考多肽之间进行比对之后，如果氨基酸在所述比对中与X位于相同位置，则该氨基酸对应于X。

术语“直链淀粉”是指α-D-葡萄糖的均聚物。直链淀粉具有线性分子结构，因为其葡萄糖单元几乎完全通过α-1-4-糖苷键连接。

术语“支链淀粉”是指α-D-葡萄糖的均聚物。支链淀粉分子含有频繁的α-1-6-糖苷键。这些将分支点引入另外的α-1-4-连接的葡萄糖链中，导致平行链簇沿着分子轴以规则间隔出现。

当在本文中相对于数值使用时，术语“约”优选是指±10％，更优选±5％，再更优选±1％。

在针对制备基于大麦的饮料，例如啤酒的过程，特别是用于描述制麦过程时，术语“大麦”是指大麦籽粒

。在所有其他情况下，除非另有说明，否则“大麦”是指大麦植物(Hordeumvulgare，L.)，包括任何育种系或栽培种或变种，而大麦植物的部分可以是大麦植物的任何部分，例如任何组织或细胞。

如本文所用，术语“大麦粉”是指碾碎的大麦籽粒。

如本文所定义的，“谷类”植物是禾本科(Poaceae)植物家族的成员，栽培它们主要为了它们的含淀粉种子或籽粒。谷类植物包括但不限于大麦(Hordeum)、小麦(Triticum)、稻(Oryza)、玉米(Zea)、黑麦(Secale)、燕麦(Avena)、高粱(Sorghum)和黑小麦(Rye-wheathybrid)。

如本文所用，术语“带电荷的氨基酸”是指具有带电荷的侧链的氨基酸。优选地，带电荷的氨基酸选自由Arg、His、Lys、Asp和Glu组成的组。带负电荷的氨基酸优选选自由Asp和Glu组成的组。

如本文所用，术语“嫩芽”是指在谷物谷粒的萌发阶段可见的胚胎生长芽。

术语“淀粉酶”

如本文所用，术语“DP”是指聚合度，并表示支链淀粉侧链中α-1,4-连接的葡萄糖单元的数目。因此，举例来说，DP3是指由3个α-1,4-连接的葡萄糖单元的序列组成的支链淀粉侧链。类似地，DP4是指由4个α-1,4-连接的葡萄糖单元的序列组成的支链淀粉侧链。如本文所用，术语(1,3；1,4)-β-葡聚糖的“DP3:DP4比率”是指所述(1,3；1,4)-β-葡聚糖内，由3个α-1,4-连接的葡萄糖单元的序列组成的支链淀粉侧链和由4个α-1,4-连接的葡萄糖单元的序列组成的支链淀粉侧链的比率。DP3∶DP4比率可通过用地衣酶消化(1,3；1,4)-β-葡聚糖，然后定量释放的DP3和DP4寡聚物(例如通过HPAEC-PAD)来确定。特别地，可以如实施例3中所述测定DP3∶DP4比率。

在特定核酸的上下文中，“编码”或“编码的”是指包含用于翻译成特定蛋白的信息。编码蛋白的核酸或多核苷酸可包含在核酸的翻译区内的非翻译序列，例如内含子，或可缺少此类插入的非翻译序列，例如在cDNA中。通过使用密码子来使编码蛋白的信息具体化。

如本文所用，在核酸的上下文中，“表达”应理解为mRNA的转录和积累。在蛋白的上下文中使用时，“表达”是指mRNA翻译成多肽。

术语“基因”是指与产生多肽链有关的DNA片段。它包括编码区之前和之后的区域(启动子和终止子)。此外，植物基因通常由被内含子打断的外显子组成。

如本文所用，术语“萌发的谷粒”是指已经发育出可见的嫩芽和可见的茎的谷粒。

如本文所用，术语“萌发的起始(起始萌发)”是指含水量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以引发萌发的时间点。

如本文所用，术语“β-葡聚糖酶”是指具有使谷物β-葡聚糖解聚的潜力的酶。因此，除非另有说明，否则术语“β-葡聚糖酶”是指以(1,3；1,4)-β-和/或(1,4)-β-葡聚糖酶活性为特征的内切酶或外切酶或其混合物。

如本文所用，“(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量”可以通过任何有用的方法确定。优选地，将“(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量”确定为Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)寡聚物的含量之和。DP3和DP4寡聚物的含量可以例如通过(1,3；1,4)-β-葡聚糖的地衣酶消化，然后例如通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)定量来确定。优选地，如本文下文实施例3中所述确定(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。

如本文所用，术语“(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶”应被视为催化(1,3；1,4)-β-葡聚糖合成并且任选地催化葡糖吡喃糖基单体的聚合的任何蛋白。例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶可以是由CslF基因或其功能同源物编码的多肽。

术语“籽粒(kernel)”定义为包括谷物颖果(caryopsis)，也称为内部种子(internal seed)。另外，籽粒可以包括外稃(lemma)和内稃(palea)。在大多数大麦变种中，外稃和内稃附着在颖果上，并且是脱粒后籽粒的一部分。但是，也会出现裸的大麦变种。在这些变种中，颖果没有外稃和内稃，并且像小麦中一样自由脱粒而出。术语“籽粒”和“谷粒”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“制麦”是指在受控的环境条件下发生的谷物籽粒(特别是大麦籽粒)的受控萌发。在一些实施方式中，“制麦”可进一步包括干燥所述萌发的谷物籽粒的步骤，例如窑烤干燥。

如本文所用，术语“绿麦芽”是指未经过窑烤干燥步骤的萌发的谷物籽粒。通常，所述谷物籽粒已经在受控环境条件下萌发。在一些实施方式中，绿麦芽是碾碎的绿麦芽。

如本文所用，术语“窑烤干燥的麦芽”是指已通过窑烤干燥而干燥的萌发的谷物籽粒。通常，所述谷物籽粒已经在受控环境条件下萌发。在一些实施方式中，窑烤干燥的麦芽是磨碎的窑烤干燥的麦芽。

“糖化(mashing)”是将碾碎的麦芽(例如绿麦芽或窑烤干燥的麦芽)和/或未萌发的谷物籽粒在水中孵育。糖化优选在特定温度和特定体积的水中进行。

“突变”包括基因的编码和非编码区中的缺失、插入、取代、颠换和点突变。缺失可以是整个基因的缺失，或仅基因的部分的缺失。点突变可涉及一个碱基对的变化，并可能导致过早的终止密码子、移码突变、剪接位点突变或氨基酸取代。包含突变的基因可以被称为“突变基因”。如果所述突变基因编码具有与野生型不同的序列的多肽，则所述多肽可以被称为“突变多肽”。

术语“碾碎的”是指已经精细分割的材料(例如大麦籽粒或麦芽)，例如通过切割、粉碎、研磨或压碎。大麦籽粒可以在潮湿的情况下使用例如研磨机或湿磨机碾碎。将碾碎的大麦籽粒或碾碎的麦芽充分进行精细分割，以使该材料可用于水提取。碾碎的大麦籽粒或碾碎的麦芽不能通过实质上的生物学方法再生为完整的植物。

如本文所用，术语“非极性氨基酸”是指具有疏水性侧链的氨基酸。优选地，非极性氨基酸选自由Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp和Gly组成的组，更优选地选自由Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Trp和Gly组成的组。

术语“植物产品”是指由植物或植物材料的加工产生的产品。因此，所述植物产品可以例如是绿麦芽、窑烤干燥的麦芽、麦芽汁、发酵的或非发酵的饮料、食品或饲料产品。

如本文所用，术语“极性氨基酸”是指具有极性、不带电荷侧链的氨基酸。优选地，极性氨基酸选自由Ser、Thr、Asn和Gln组成的组。

如本文所用，术语“后代”是指直接或间接是给定植物后代的植物。因此，后代不仅限于直接后代，还包括多代后的后代。通常，携带特定突变的大麦植物的后代也携带该特定突变。因此，在CslF6基因中携带特定突变的大麦植物的后代也携带该特定突变。

如本文所用，术语“序列同一性”是指比对后候选序列与参考序列之间相同氨基酸或核苷酸的百分比。因此，与参考序列具有80％氨基酸同一性的候选序列要求在比对之后，候选序列中80％的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。本发明的同一性利用计算机分析来确定，例如但不限于用于多肽序列比对的Clustal Omega计算机比对程序(Sievers等(2011年10月11日)Molecular Systems Biology 7：539，PMID：21988835；Li等(2015年4月6日)Nucleic Acids Research 43(W1)：W580-4PMID：25845596；McWilliam等，(2013年5月13日)Nucleic Acids Research 41(Web Server issue)：W597-600PMID：23671338，以及在其中建议的默认参数。可从https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/的EMBL-EBI获得Clustal Omega软件。通过以默认设置使用该程序，可以将查询的成熟(生物活性)部分与参考多肽比对。计算完全保守残基的数目，并除以参考多肽的长度。MUSCLE或MAFFT算法可用于核苷酸序列的比对。可以以与氨基酸序列所示相似的方式计算序列同一性。因此，在参考序列的整个长度上计算如本文提供的序列同一性。

如本文所用，术语“淀粉”是指离散大分子直链淀粉和支链淀粉的一个或两个的组合物。

如本文所用，术语“浸泡”是指增加谷物籽粒的含水量的过程。

如本文所用，术语谷粒的“含水量”是指所述谷粒中H₂O w/w的％。

如本文所用，术语“野生型CslF6”是指编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽的基因。

如本文所用，谷物谷粒的酶活性是指在由特定谷粒类型制备的面粉中测得的活性。例如，每克谷物谷粒中10U/g的α-淀粉酶活性是指在由1g来自所述谷物的粉(干物质)的水提取物中测得的所述α-淀粉酶活性(10U)。利用K-CERA 01/12(可从爱尔兰的Megazyme获得的规程和试剂盒)确定α-淀粉酶活性。利用K-BETA3(可从爱尔兰的Megazyme获得的规程和试剂盒)确定β-淀粉酶活性。利用T-LDZ1000(可从爱尔兰的Megazyme获得的规程和试剂盒)确定极限糊精酶活性。

如本文所示，气体的体积是指在1atm和20℃下所述气体的体积。

如本文所示，O₂的体积是指在1atm和20℃下的O₂的体积。在气体混合物中包含O₂的本发明的实施方式中，可以确定气体混合物的总体积，并且可以将O₂的体积计算为由O₂构成的总体积的百分比。举例来说，大气包含21％O₂。因此，如本文所用，大气中O₂的体积为大气总体积的21％。

术语“麦芽汁”是指麦芽和/或谷物籽粒，例如碾碎的麦芽和/或碾碎的谷物籽粒和任选的附加辅料的液体提取物。麦芽汁通常在糖化，任选地随后是在用热水糖化后从酒糟中提取残留的糖和其他化合物的过程中进行“鼓泡”(sparging)而获得。通常在过滤桶、糖化醪过滤器或其他设备中进行鼓泡，以使提取出的水与酒糟分离。糖化之后获得的麦芽汁通常被称为“第一麦芽汁”，而在鼓泡之后获得的麦芽汁通常被称为“第二麦芽汁”。如果未指定，术语麦芽汁可以是第一麦芽汁、第二麦芽汁或两者的组合。在常规啤酒生产过程中，麦芽汁与啤酒花一起煮沸。没有啤酒花的麦芽汁也可以称为“甜麦芽汁”，而与啤酒花煮过的麦芽汁可以称为“煮沸的麦芽汁”或简称为麦芽汁。

CslF6

本发明提供了一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，并且其中所述突变的CslF6基因编码突变CslF6多肽。

来自大麦Hordeum vulgare cv.Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6(CslF6)完整编码序列的序列在本文中提供为SEQ ID NO：2。

来自大麦Hordeum vulgare cv.Sloop的野生型纤维素合酶样CslF6多肽序列的序列在本文中提供为SEQ ID NO:1。除了本文提供为SEQ ID NO:1的序列外，野生型CslF6多肽还可以携带A590T多态性(Taketa等(2012))。因此，野生型CslF6多肽也可具有本文提供为SEQ ID NO:3的序列。

尽管进行了大量的研究工作，但各个Cs1基因的具体功能还是大部分未知的。将Cs1基因细分为八个组，命名为Cs1A至CslH。根据本发明，已经揭示了(1,3；1,4)-β-葡聚糖合酶由CslF基因家族的成员编码。

大麦植物携带CslF6基因中的突变

本发明提供了一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，并且其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽。CslF6基因中的突变可以是本文所述的任何突变，但是在本发明的优选实施方式中，该突变是CslF6基因的编码区域中的点突变。

由所述突变体CslF6基因编码的突变体CslF6多肽可以是任何突变体CslF6多肽，但是优选地，所述突变体CslF6多肽含有一个氨基酸取代。

特别地，突变体CslF6多肽可以在CslF6的膜定位结构域中包含一个氨基酸取代。突变体CslF6多肽可优选在膜定位结构域中包含一个或多个以下取代：

·将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸；和

·将极性氨基酸取代为非极性氨基酸。

如本文所用，术语“将氨基酸XX取代为氨基酸YY”或“将氨基酸XX取代至氨基酸YY”是指参考序列(通常为CslF6野生型序列)中的氨基酸XX被氨基酸YY取代。

在本发明的一个实施方式中，突变体CslF6多肽可以在CslF6的膜定位结构域的任何一个中包含一个氨基酸取代。CslF6的膜定位结构域在本文表3中显示。

在一个实施方式中，突变体CslF6多肽可以在CslF6的以下膜定位结构域中的一个或多个中包含非极性氨基酸至带电荷氨基酸的取代：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882。

在一个实施方式中，大麦植物在CslF6基因中携带突变，从而导致突变体CslF6基因，其编码包含取代的突变体CslF6多肽，其中所述取代可以是在CslF6的以下膜定位结构域中的一个或多个中将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882。

在一个实施方式中，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸835至857组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。所述非极性氨基酸可以例如是表3中加下划线的氨基酸835至857中的任何一个。例如，所述取代可以是将非极性氨基酸取代为带负电荷的氨基酸。

例如，突变体Cs1F6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的Cs1F6，除了突变体Cs1F6包含氨基酸847取代为带电荷的氨基酸。例如，所述取代可以是将位置847上的甘氨酸(G)取代为带负电荷的氨基酸，例如Glu或Asp。

优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将位置847的甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)。

在一个实施方式中，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸741至758组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸的取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。所述非极性氨基酸可以例如是表3中加下划线的氨基酸741至758中的任何一个。例如，所述取代可以是将非极性氨基酸取代为带负电荷的氨基酸。

例如，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748被取代为带电荷的氨基酸。例如，所述取代可以是将位置748的甘氨酸(G)取代为带负电荷的氨基酸，例如Glu或Asp。优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将位置748的甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)。因此，大麦植物可以携带突变的HvCslF6基因，该基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。

在一个实施方式中，大麦植物可以携带HvCslF6基因的编码序列(SEQ ID NO 2)的核苷酸2243的G→A突变。

在一个实施方式中，突变体CslF6多肽可以在CslF6的任何一个膜定位结构域中包含一个氨基酸取代。例如，取代可以是将CslF6的以下一个或多个膜定位结构域中的极性氨基酸取代为非极性氨基酸：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882。

突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸700至731组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将极性氨基酸取代为非极性氨基酸。所述极性氨基酸可以例如是表3中加下划线的氨基酸700至731中的任何一个。

例如，突变体Cs1F6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的Cs1F6，除了突变体Cs1F6包含氨基酸709取代为非极性氨基酸。

优选地，突变体CslF6多肽可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将位置709的苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)。

为了本专利申请的目的，根据《布达佩斯条约》的规定，已将命名为“突变体2”的大麦植物(Hordeum vulgare)的种子保藏在NCIMB Ltd.Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA，苏格兰。突变体2大麦植物于2018年11月12日保藏，登记号为NCIMB 43273。

在一个实施方式中，本发明的大麦植物是在2018年10月12日以登录号NCIMB43273保藏于NCIMB并被称为“突变体2”的大麦植物(Hordeum vulgare)；或其后代。因此，本发明的大麦植物可以是在2018年10月12日保藏于NCIMB且登录号为NCIMB 43273的大麦植物突变体2，或其任何后代大麦植物，其中该大麦植物携带HvCslF6基因的编码序列(SEQ IDNO:2)的核苷酸2243的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvCslF6基因编码包含SEQ IDNO:1的氨基酸748的Gly→Asp突变的突变体HvCslF6蛋白。

有趣的是，在CslF6基因中携带导致编码具有在膜定位氨基酸之外的突变(G732D)的突变体CslF6多肽的突变体CslF6基因的突变的大麦植物没有显示任何(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的显著降低。在CslF6基因中包含导致过早终止密码子(T676终止)的突变的大麦植物中，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的水平极低，并且这种大麦植物不具有良好的农艺学性质。因此，此类植物的可繁殖性和植物生长显著降低。

大麦植物

本发明的大麦植物可以是Hordeum vulgare种的任何植物，包括任何育种系或栽培种或变种。

“野生大麦”，Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)，被认为是当今大麦栽培形式的始祖。大麦的驯化但异质的混合物称为大麦地方品种。今天，大多数地方品种已经在先进农业中被纯种系栽培种取代。与地方品种相比，现代大麦栽培种具有许多改良的性质(Nevo，1992；Pelger等，1992)。

在本发明中，术语“大麦植物”包括任何大麦植物，例如大麦地方品种或现代大麦栽培种。因此，本发明涉及在CslF6基因中包含突变的任何大麦植物。

然而，用于本发明的优选大麦植物是现代大麦栽培种或纯种系。与本发明一起使用的大麦栽培种可以例如选自由Paustian、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、Swan Hals、Kanto NakateGold、Hakata No.2、Kirin–choku No.1、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、NewGolden、Satukio Nijo、Seijo No.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、NishinoGold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett、Rosalina和Jersey组成的组，优选选自由Haruna Nijo、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda和Power组成的组，优选选自由Paustian、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、Swan Hals、KantoNakate Gold、Hakata No.2、Kirin–choku No.1、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo No.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett和Jersey组成的组，优选选自由Paustian、Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power、Quench、NFC Tipple、Barke、Class、Vintage、Applaus、Bowie、Broadway、Champ、Chanson、Charles、Chimbon、Cosmopolitan、Crossway、Dragoon、Ellinor、Embrace、Etoile、Evergreen、Flair、Highway、KWS Beckie、KWS Cantton、KWS Coralie、KWS Fantex、KWSIrina、KWS Josie、KWS Kellie、LG Diablo、LG Figaro、LG Nabuco、LG Tomahawk、Laureate、Laurikka、Lauxana、Luther、Odyssey、Ovation、Prospect、RGT Elysium、RGTObserver、RGT Planet、Rotator、Sarbi、Scholar、Subway和Golden Promise组成的组。

大麦植物可以处于任何合适的形式。例如，本发明的大麦植物可以是有活力的大麦植物的植物、均质化的植物或碾碎的大麦籽粒。所述植物可以是成熟植物、胚、籽粒、萌发的籽粒、麦芽化的籽粒(例如以绿麦芽或窑烤干燥的麦芽的形式)、碾碎的麦芽化的籽粒、碾碎的籽粒等。

大麦植物的部分可以是植物的任何合适的部分，例如籽粒、胚、叶、茎、根、花或其级分。级分可以例如是籽粒、胚、叶、茎、根或花的部分。大麦植物的部分也可以是均质物的级分或碾碎的大麦植物或籽粒的级分。

在本发明的一个实施方式中，大麦植物的部分可以是所述大麦植物的细胞，例如可以在组织培养物中体外繁殖的活细胞。然而，在其他实施方式中，大麦植物的部分可以是不能成熟为整个大麦植物的活细胞，即不是生殖材料的细胞。

CslF6中携带突变的大麦植物的特征

本发明提供了在CslF6基因中携带突变的大麦植物。这类大麦植物的一个主要优点是所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。

在CslF6基因中携带突变并具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的大麦植物提供的一个优点是，谷粒中较低含量的(1,3；1,4)-β-葡聚糖在酿造过程中可能是有益的，因为它可以帮助确保糖化结束时有最佳糖量可用于酵母发酵，并从而降低原料的总成本。在CslF6基因中携带突变并具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的籽粒的大麦植物提供的另一个优点是低(1,3；1,4)-β-葡聚糖大麦可以改善工业工艺，例如可过滤性。此外，这类大麦植物对于节能制麦工艺特别有用。尽管减少(1,3；1,4)-β-葡聚糖可能是有益的，但过低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖水平也可能会带来问题，并能导致较差的农艺学性质。

因此，在一个实施方式中，在CslF6基因中携带突变的大麦植物可以是这样的大麦植物：其籽粒具有的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量在总籽粒干重的1至3％范围内。

本发明的在CslF6基因中携带突变并且具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的籽粒的大麦植物的特征还在于具有良好的农艺学品质，例如与野生型相当的农艺学品质。

大麦植物可以是具有(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量如下所示的籽粒的大麦植物：范围为总籽粒干重的1至5％，例如总籽粒干重的1至3％，例如总籽粒干重的1.3至4％，例如总籽粒干重的1.3至3％，优选总籽粒干重的1.3至2％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6在CslF6的以下一个或多个膜定位结构域中包含一个氨基酸的取代：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882，其中取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，并且其中所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.5％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.3至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.5至3.0％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.7至3.0％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)，并且所述大麦植物籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量范围可以为总籽粒干重的1.0至3.0，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.5％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.3至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.5至3.0％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.7至3.0％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)，并且所述大麦植物籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.5％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.3至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.5至3.0％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.7至3.0％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)，并且所述大麦植物籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.5％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0至2.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.0％至1.7％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.2％至3.0％，例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.5％至3.0％，优选地，(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1.3至3.0％。

在一个实施方式中，大麦植物可在籽粒中具有(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，其减少至包含野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的最多70％，优选最多60％，例如最多55％。

大麦植物可以是籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量降低到如下数值的大麦植物：包含野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，优选至少40％且至多60％，例如，至少40％且至多55％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量降低到如下数值的大麦植物：cv.Paustian的大麦植物的籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，优选至少40％且至多60％，例如至少40％且至多55％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)，并且所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量降低到包含野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，例如至少40％且至多60％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)，并且所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量降低到包含野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，例如至少40％且至多60％。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)，并且所述大麦植物籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量减少至包含野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦籽粒中(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，例如至少40％且至多60％。

本发明的在CslF6基因中携带突变并编码突变的CslF6多肽并具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的籽粒的大麦植物的特征还可以在于具有给定DP3:DP4比率，例如DP3:DP4比率低于野生型植物的DP3:DP4比率或高于野生型植物的DP3:DP4比率或类似于野生型植物的DP3:DP4比率。

根据各种因素，可能需要不同的DP3:DP4。

野生型大麦植物的特征通常在于DP3:DP4比率范围为2.5至4。

在一个实施方式中，本发明的大麦植物在籽粒中包含(1,3；1,4)-β-葡聚糖，其DP3:DP4比率至多为2.5，例如至多为2.2，例如范围是1.0到2.2。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)，并且所述大麦植物的籽粒的DP3:DP4比率可至多为2.5，例如至多为2.2，例如范围是1.0到2.2。

在一个实施方式中，所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率范围是2.5至4。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)，并且所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率范围是2.5至4。

在一个实施方式中，所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率可为至少3.5，例如至少4.0，例如至少4.5，例如范围是4至6。

在一个实施方式中，大麦植物可以是在CslF6基因中携带突变并编码突变体CslF6多肽的大麦植物，其中CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6多肽，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)，并且所述大麦植物的籽粒的DP3:DP4比率可以为至少3.5，例如至少4.0，例如至少4.5，例如范围是4到6。

(1,3；1,4)-β-葡聚糖是细胞壁成分，并且(1,3；1,4)-β-葡聚糖水平的降低可影响大麦植物。例如，(1,3；1,4)-β-葡聚糖水平的降低和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖的DP3/DP4比率的变化可导致脆性大麦谷粒，其具有高百分比的破碎谷粒。

在一个实施方式中，优选本发明的大麦植物具有可接受谷粒硬度的籽粒。因此，在一个实施方式中，当如下文实施例6中所述进行测定时，大麦植物可具有破碎谷粒频率小于5％，例如小于3％的籽粒。

特别地，优选本发明的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒频率比在CslF6基因中不携带突变但其他方面相同的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒频率高至多3倍，更优选地高至多2倍。例如，在CslF6基因中携带编码包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸748的突变(例如，Gly→Asp)的突变体HvCslF6蛋白的突变的大麦植物，在谷粒脱粒后具有破碎谷粒频率比不携带所述突变但在其他方面相同的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒频率高至多3倍，更优选高至多2倍。破碎谷粒频率优选如下文实施例6所述确定。

包含多于一个突变的大麦植物

除本文所述的突变外，大麦植物还可包含一种或多种其他突变。因此，大麦植物可包含以下突变中的一种或多种。

除上述一种或多种突变外，大麦植物还可在编码LOX-1的基因中包含突变，其导致功能性LOX-1完全丧失。所述突变可以例如是国际专利申请WO 2005/087934中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-1的基因，所述LOX-1包含过早终止密码子，所述密码子对应于WO2005/087934的SEQ ID NO：2的碱基编号3572-3574，或所述LOX-1包含剪接位点突变，所述突变对应于WO 2005/087934的SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：6的碱基编号2311。

除上述一种或多种突变外，大麦植物还可在编码LOX-2的基因中包含突变，其导致功能性LOX-2完全丧失。所述突变可以例如是国际专利申请WO 2010/075860中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-2的基因，所述LOX-2包含WO 2010/075860的SEQ IDNO:1的核苷酸位置2689处的突变，导致过早终止密码子的形成。

除上述一种或多种突变外，大麦植物还可在编码MMT的基因中包含突变，其导致功能性MMT完全丧失。所述突变可以例如是在国际专利申请WO 2010/063288中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码MMT基因，所述MMT包含WO 2010/063288的SEQ ID NO:3的碱基编号3076的G→A突变，或包含编码MMT的基因，所述MMT包含WO 2010/063288的SEQ IDNO:16的碱基编号1462的G→A突变。

除了上述一个或多个突变外，大麦植物还可以包含任何导致增加的α-淀粉酶活性的突变，其在转让给本申请的申请人且申请日期相同的发明名称为“具有增加的水解酶活性的大麦”的共同待决申请中描述。

植物产品

本发明还提供了由大麦植物或其后代制备的植物产品，所述大麦植物具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量并且在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，例如本文所述的任何大麦植物。

植物产品可以是由大麦植物制备的任何产品，例如食品、饲料或饮料。因此，植物产品可以是下文“饮料及其生产方法”部分中所述的任何饮料。植物产品也可以是大麦植物的水提取物和/或由所述大麦植物的籽粒制备的麦芽，例如植物产品可以是麦芽汁。所述水提取物可以例如如下文“水提取物及其生产方法”部分中所述制备。

在一个实施方式中，植物产品可以是麦芽，例如绿麦芽或窑烤干燥的麦芽，例如下文“绿麦芽、窑烤干燥的麦芽及其生产方法”一节中所述的任何麦芽，或基于麦芽的产品，例如基于麦芽的饮料。尽管麦芽的主要用途是用于饮料生产，它也可以用于其他工业过程中，例如用作烘焙业中的酶源，或用于食品业中作为调味剂和着色剂，例如以麦芽或麦芽粉的形式或间接地以麦芽糖浆等形式存在。因此，本发明的植物产品可以是任何上述产品。

在本发明的一个实施方式中，植物产品是大麦粉，即由本发明的大麦植物的谷粒制备的大麦粉。

在另一方面，本发明的植物产品包含糖浆，或甚至由其组成，例如大麦糖浆或大麦麦芽糖浆。植物产品也可以是大麦或麦芽的提取物。因此，植物产品可以是麦芽汁。

绿麦芽、窑烤干燥的麦芽及其生产方法

本发明还提供了由在CslF6基因中携带突变的大麦植物制备的麦芽，例如本文所述的任何大麦植物。所述麦芽可以是绿麦芽或窑烤干燥的麦芽，其由得自在CslF6基因中携带突变的大麦植物或其后代的大麦谷粒制备。所述突变可以是本文上文描述的CslF6基因中的任何突变。

可以通过制麦，即通过在受控的环境条件下使谷物谷粒萌发来制备绿麦芽。通常，所述萌发可包括浸泡大麦籽粒的步骤，然后是萌发步骤。浸泡和萌发也可以同时或部分同时进行。在一些实施方式中，麦芽的生产可以包括干燥萌发谷物的步骤。所述干燥步骤可以优选是在升高的温度下对萌发的籽粒进行的窑烤干燥。因此，可以通过使绿麦芽经过窑烤干燥的步骤来制备窑烤干燥的麦芽。

因此，在一个实施方式中，制麦方法可以包括以下步骤：

(a)提供在CslF6基因中携带突变的大麦植物的籽粒，特别是大麦植物；

(b)浸泡所述大麦籽粒；

(b)使所述大麦籽粒萌发；和

(c)干燥所述萌发的大麦籽粒，优选通过窑烤干燥。

可以通过包括以下步骤的方法制备萌发的大麦谷粒：

(a)提供在CslF6基因中携带的突变的大麦植物的籽粒，特别是大麦植物；

(b)浸泡所述大麦籽粒；

(b)使所述大麦籽粒萌发。

浸泡和萌发的步骤可以依次、同时或部分同时进行。

在一个优选的实施方式中，在萌发过程中同时进行浸泡和萌发，该过程通常包括将大麦谷粒在水溶液中在通气下孵育最多72h。

可以通过技术人员已知的任何常规方法进行浸泡。一个非限制性实例涉及在交替的干燥和湿润条件下在10至25℃范围内的温度下浸泡。例如，在浸泡过程中，可以将大麦籽粒湿润孵育30min至3h，然后干燥孵育30min至3h，并任选地重复上述孵育方案2至5次。浸泡后的最终含水量可以例如在40％至50％的范围内，例如在40％-45％的范围内。

本发明提供的大麦植物的特征在于在CslF6基因中携带突变，并因此编码突变的CslF6多肽。这样的大麦植物的一个主要优点是籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量和足够的DP3∶DP4比率。具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的这些大麦植物的谷粒可以在短的萌发过程中有利地萌发。有用的短萌发过程的例子在国际专利申请PCT/EP2017/065498中描述，其通过引用并入本文。有用的短萌发过程的一个例子是包括以下步骤的萌发过程：其中通常将大麦谷粒在通气下在水溶液中孵育，其中整个萌发过程最多进行72h。实际上，在萌发期间，(1,3；1,4)-β-葡聚糖通常至少部分地被例如β-葡聚糖酶的酶水解。对(1,3；1,4)-β-葡聚糖特异的水解酶通常在萌发过程开始时以少量存在。对(1,3；1,4)-β-葡聚糖特异的水解酶的存在随着萌发过程的继续而增加。如果从开始起(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量就高，则通常进行最多72小时的萌发过程无法提供足够的时间将(1,3；1,4)-β-葡聚糖水解至所需的低水平。然而，本发明的大麦植物从开始就已经具有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖，并且因此(1,3；1,4)-β-葡聚糖在萌发期间的水解是不太重要。

如上所述，萌发可包括在通气下在水溶液中孵育在CslF6基因中携带突变的大麦植物的谷粒的步骤。大麦谷粒可以在所述水溶液中孵育足够的时间以允许大多数所述大麦谷粒萌发。大麦谷粒也可以在所述水溶液中孵育足够的时间，以便获得至少35％，优选至少37％，例如35至60％范围内的含水量。通常，将大麦谷粒在水溶液中孵育至少20h，例如至少24h。通常，将谷粒在所水溶液中孵育最多72h，例如最多60h，例如最多48h。因此，在一些实施方式中，将大麦谷粒在所述水溶液中孵育20至72h，例如20至60h，例如20至48h，例如20至30h，例如22至26h。

可能优选的是，大麦谷粒在整个孵育过程中完全被所述水溶液覆盖。

所述大麦谷粒经常在所述水溶液中孵育，同时O₂通过该水溶液。可以将所述O₂以纯O₂的形式添加到所述水溶液中。然而，通常将所述O₂包含在气体混合物中。在一个实施方式中，所述O₂包含在大气中。

通常，每kg大麦谷粒每h至少有2L，优选至少3L，更优选至少4L，还更优选至少5L，甚至更优选至少6L O₂通过所述水溶液。所述大麦谷粒的重量是干重。例如，每h每kg大麦谷粒(干重)，有在2至100L的范围内，例如在2至75L的范围内，例如在2至50L的范围内，例如在4至100L的范围内，例如在4至75L的范围内，例如在4至50L的范围内，例如在6至100L的范围内，例如在6至75L的范围内，例如在6至50L的范围内的O₂通过所述水溶液/大麦谷粒混合物。

如上所述，通过水溶液的通常是大气。因此，该方法可以包括每h每kg大麦谷粒有至少10L，优选至少15L，更优选至少20L，还更优选至少25L，甚至更优选至少30L大气通过所述水溶液。所述大麦谷粒的重量是干重。例如，每h每kg大麦谷粒(干重)有在10至500L的范围内，例如在10至375L的范围内，例如在10至250L的范围内，例如在20至500L的范围内，例如在20至375L的范围内，例如在20至250L的范围内，例如在30至500L的范围内，例如在30至375L的范围内，例如在30至250L的范围内的大气通过所述水溶液。

在一些实施方式中，萌发步骤包括

a.在水溶液中孵育所述籽粒的至少一个步骤，其中每kg干重的大麦籽粒每h有至少2L O₂通过所述水溶液；和

b.在空气中孵育所述大麦籽粒的至少一个步骤。

在一些实施方式中，在将大麦谷粒在所述水溶液中孵育之后，大麦谷粒的含水量为至少20％，优选为至少30％，例如在30％至60％的范围内，例如在30至50％的范围内，例如在30至60％的范围内，例如在30至50％的范围内。

在将所述大麦籽粒在空气中孵育的所述步骤期间，每kg干重大麦籽粒每小时可以有至少2L O₂通过所述大麦籽粒。例如，如上所述，在空气中孵育期间通过大麦籽粒的量O₂可以与在如上所述所述水溶液中孵育期间通过大麦籽粒O₂量相同。

通过该方法制备的萌发的大麦籽粒在本文中也称为绿麦芽。

大麦谷粒的含水量可通过确定大麦谷粒的重量，然后干燥所述大麦谷粒并确定干燥的大麦谷粒的重量来确定。湿的和干的大麦谷粒的重量差被认为是水，并且含水量被提供为水的重量除以大麦谷粒(湿大麦谷粒)的总重量。因此，以％表示的含水量为w/w％。

大麦谷粒可以在任何有用的温度下孵育，但是优选在足够高以允许含水量快速增加的温度下进行孵育。

特别地，在本发明的实施方式中，其中将大麦谷粒在20至30℃的温度范围内孵育，然后可以将所述大麦谷粒孵育20至48h。

谷粒的萌发也可以通过技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例涉及在10至25℃范围内，任选地在变化温度的温度下萌发1至4天。

如上所述，在本发明的一些实施方式中，可以将萌发的大麦谷粒(即绿麦芽)窑烤干燥。在一些实施方式中，优选绿麦芽未被窑烤干燥。特别地，优选当通过萌发制备绿麦芽时，包括将所述大麦谷粒在水溶液中在通气下孵育的步骤，则不将绿麦芽窑烤干燥。

如果将绿麦芽窑烤干燥，则可以在常规温度下进行，例如至少75℃，例如在80至90℃的范围内，例如在80至85℃的范围内。因此，麦芽可以例如通过Hough等人(1982)描述的任何方法生产。然而，任何其他合适的生产麦芽的方法也可用于本发明，例如生产特殊麦芽的方法，包括但不限于烘焙麦芽的方法。

窑烤干燥的麦芽和绿麦芽可以进一步加工，例如通过研磨。因此，本发明的植物产品可以是任何种类的麦芽，例如未加工的麦芽或碾碎的麦芽，例如面粉。因此，植物产品可以例如是磨碎的、窑烤干燥的麦芽或磨碎的绿麦芽。磨碎的麦芽及其面粉包含麦芽和缺乏再萌发能力的死细胞的化学成分。

在一些实施方式中，大麦是去壳的大麦，并且该方法包括在将所述籽粒在水溶液中孵育之前除去至少部分所述壳的步骤。可通过对带壳谷物谷粒进行去壳的物理处理，而使带壳谷物谷粒经处理去除谷壳。所述物理处理可以例如选自由打磨、砂磨、剥离和平整组成的组。优选地，物理处理导致谷壳丧失。可以将谷壳丧失确定为总体重量损失。因此，物理处理优选导致谷物谷粒总重量损失范围为1至4％，例如损失范围为1.5至3.0％。

水(aqueous)提取物及其生产方法

本发明提供了基于大麦的饮料及其制备方法，其中大麦植物或其后代在CslF6基因中携带突变。本发明还提供了在CslF6基因中携带突变的大麦植物籽粒的水提物。所述水提取物可以例如由绿麦芽或窑烤干燥的麦芽制备。

通常，制备饮料的方法包括制备本发明的大麦植物的籽粒的水提取物和/或从本发明的大麦植物制备的麦芽的水提取物的步骤。

通常，可通过将大麦的粉、绿麦芽的粉和/或窑烤干燥的麦芽的粉在水中或水溶液中孵育来制备水提取物。所述水溶液在本文中也称为“糖化溶液”。特别地，水提取物可以通过糖化制备。

本发明还提供了一种生产水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供大麦植物的籽粒，其中所述大麦植物具有如本文所述的降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量并在CslF6基因中携带突变。

b.使大麦籽粒经历萌发步骤，从而获得萌发的籽粒，其中所述萌发步骤包括将所述籽粒在水溶液中孵育至多72h；

c.精细分割所述萌发的籽粒，同时所述萌发的籽粒的含水量至少为20％，条件是在步骤b)和c)之间的任何时间，所述大麦籽粒的含水量均不低于20；

d.制备所述磨碎的萌发籽粒的水提取物，从而生产大麦的水提取物。

萌发步骤在以上“绿麦芽、窑烤干燥的麦芽及其生产方法”部分中有详细描述。

通常，所述糖化溶液可以是水，例如可以向其添加一种或多种其他试剂的自来水。其他试剂可以从一开始就存在于水溶液中，或者可以在制备水提取物的过程中添加它们。所述其他试剂可以是酶。因此，糖化溶液可以包含一种或多种酶。所述酶可以从过程开始时或随后在过程中添加到水溶液中。

所述酶可以例如是一种或多种水解酶。合适的酶包括脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶]和/或木聚糖酶(例如阿拉伯木聚糖酶)和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro(Novozymes)。例如，水溶液可包含选自由α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶(例如，内切-(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶)、木聚糖酶(例如内切或外切-1,4-木聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶或阿魏酸酯酶)、葡糖淀粉酶和蛋白酶组成的组的一种或多种水解酶。

在一个实施方式中，没有或仅有有限量的β-葡聚糖酶被添加到所述糖化溶液中。

所述其他试剂，优选地具有食品级质量，也可以是盐，例如CaCl₂，或酸，例如H₃PO₄。

通常通过在一个或多个预定温度下将大麦粉、绿麦芽粉和/或窑烤干燥的麦芽粉在糖化溶液中孵育来制备水提取物。所述预定温度在本文中也可以称为“糖化温度”。所述糖化温度可以例如是用于糖化的常规温度。通常将糖化温度保持恒定(等温糖化)，或逐渐升高，例如以顺序方式升高。在任一种情况下，大麦谷粒和/或麦芽中的可溶性物质都被释放到所述糖化溶液中，从而形成水提取物。

糖化温度通常为30至90℃范围内的温度，例如40至85℃范围内的温度，例如50至85℃范围内的温度。可以根据使用的大麦类型选择糖化温度。特别地，可以使用相对较低的内糖化(mashing-in)温度，例如温度范围为50至60℃。通常，与糖化液一起孵育包括加热至更高温度的最终加热步骤，例如至75至80℃范围内的温度。

在例如糖化容器中的水溶液中孵育后，可以将水溶液转移至另一个容器，例如过滤桶并在升高的温度下再孵育一段时间。

有用的糖化方案的非限制性实例可以在酿造的文献中找到，例如在Hough等人(同上)。

糖化(即将大麦粉、绿麦芽粉和/或窑烤干燥的麦芽粉在糖化溶液中孵育)可以在存在辅料(adjunct)的情况下进行，应理解为包含麦芽或萌发的大麦谷粒以外的任何碳水化合物来源，例如但不限于以完整籽粒或加工产品如磨料(grits)、糖浆或淀粉的形式存在的大麦、大麦糖浆或玉米或大米。所有上述辅料都可以主要用作提取物的其他来源(糖浆通常在麦芽汁加热期间添加)。酿造厂中处理辅料的要求取决于所用辅料的状态和类型。

在糖化溶液中孵育后，通常可以分离水提取物，例如通过过滤分离为水提取物和残留的不溶固体颗粒，后者也称为“酒糟”。过滤例如可以在过滤桶中进行。备选地，过滤可以是通过麦芽过滤器过滤。如此获得的水提取物也可以称为“第一麦芽汁”。在也称为鼓泡的过程中，可以将其他液体(例如水)添加到酒糟中。鼓泡并过滤后，可获得“第二麦芽汁”。可以通过重复该程序制备其他麦芽汁。因此，水提取物可以是麦芽汁，例如第一麦芽汁、第二麦芽汁、进一步的麦芽汁或其组合。

在一个实施方式中，可以使用国际专利申请PCT/EP2017/065498中描述的任何装置来进行制备水提取物的方法，例如，其中第20-22页中描述的任何装置。本文图4中提供了有用装置的非限制性示例。未完全降解的(1,3；1,4)-β-葡聚糖对于啤酒酿造者尤其麻烦，因为这些可以以可溶形式从麦芽中提取，形成高粘度水溶液，减慢了啤酒酿造过程中的过滤过程。有趣的是，本发明的大麦植物含有低水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖，并且因此，由此类大麦植物制备的麦芽汁通常具有低粘度。在一个实施方式中，本发明提供了由在CslF6基因中携带突变的大麦植物制备的麦芽汁，所述麦芽汁与由携带有野生型CslF6基因但在其他方面具有与本文公开的大麦植物相同的基因型的大麦植物制备的麦芽汁相比具有更低的粘度。所述麦芽汁通常通过提取大麦谷粒和/或麦芽来制备。

在一个实施方式中，本发明提供了一种麦芽汁，其中所述麦芽汁由如本文所述的在CslF6基因中携带任何突变的大麦植物制备，其中所述麦芽汁的粘度比以相同方式从携带野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物制备的麦芽汁的粘度低0.5至1.0mPa*s的范围，例如低0.5至0.8mPa*s的范围。在一个实施方式中，本发明提供了一种麦芽汁，其中所述麦芽汁是由如本文所述的在CslF6基因中具有任何突变的大麦植物制备的，并且所述麦芽汁的粘度范围为1.7至2.5mPa*s，例如1.8至2.5mPa*s，例如2.0至2.5mPa*s，例如2.1至2.5mPa*s，例如1.8至2.2mPa*s，例如约2mPa*s，例如约2.1mPa*s，例如约2.2mPa*s。特别地，大麦植物可以携带突变的HvCslF6基因，该基因编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸748的突变(例如，Gly→Asp)的突变体HvCslF6蛋白。

在一个实施方式中，本发明提供了一种麦芽汁，其中所述麦芽汁由得自如本文所述的在CslF6基因中具有任何突变的大麦植物获得的麦芽制备，其中所述麦芽汁具有至多2.2mPa*s的粘度。

由标准麦芽制备的麦芽汁的粘度为大约2mPa*s，所述标准麦芽通过浸泡1-2天并萌发5-7天，然后进行窑烤干燥而制备。

饮料及其生产方法

本发明还提供了基于大麦的饮料和生产此类饮料的方法，其中所述大麦植物具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量并且在CslF6基因或其后代中携带突变。本发明还提供了基于大麦的饮料，其由在CslF6基因携带突变的大麦植物或其后代中制备。

所述饮料可以是基于大麦的酒精饮料或基于大麦的非酒精饮料。基于大麦的酒精饮料可以例如是啤酒或蒸馏酒精。

所述啤酒可以是任何种类的啤酒，例如贮藏啤酒或淡啤酒。因此，啤酒例如可以选自由altbier、琥珀爱尔啤酒(Amber ale)、大麦啤酒(Barley wine)、柏林白啤酒(Berlinerweisse)、Bière de Garde、苦味啤酒(Bitter)、金色爱尔啤酒(Blonde Ale)、博克啤酒(Bock)、棕色爱尔啤酒(Brown ale)、加利福尼亚大众啤酒(California Common)、奶油爱尔啤酒(Cream Ale)、多特蒙德出口啤酒(Dortmunder Export)、双博克啤酒(Doppelbock)、Dunkel、Dunkelweizen、Eisbock、兰比克果啤酒(Fruit lambic)、黄金爱尔啤酒(GoldenAle)、Gose、Gueuze、Hefeweizen、Helles、印度淡色爱尔啤酒(India pale ale)、科隆啤酒

拉比克啤酒(Lambic)、淡色啤酒(Light ale)、五月博克啤酒(Maibock)、麦芽酒(Malt liquor)、Mild、

老爱尔啤酒(Old ale)、老棕色啤酒(Oud bruin)、淡色爱尔啤酒(Pale ale)、比尔森啤酒(Pilsener)、波特啤酒(Porter)、红色爱尔啤酒(Redale)、Roggenbier、赛松啤酒(Saison)、苏格兰爱尔啤酒(Scotch ale)、蒸汽啤酒(Steambeer)、司陶特啤酒(Stout)、Schwarzbier、拉格啤酒(lager)、Witbier、Weissbier和Weizenbock。

所述蒸馏酒精可以是任何种类的蒸馏酒精。特别地，蒸馏酒精可以基于大麦，例如大麦麦芽。这种蒸馏酒精的非限制性实例包括威士忌和伏特加。

饮料可以是非酒精饮料，例如基于大麦的非酒精饮料，例如非酒精啤酒或非酒精麦芽饮料，例如maltina。

饮料可以例如通过包括以下步骤的方法制备：

(i)提供本发明的大麦植物的籽粒和/或由本发明的大麦植物的籽粒制备的绿麦芽和/或窑烤干燥的麦芽

(ii)制备所述籽粒和/或所述麦芽的水提取物，例如本文上述制备水提取物部分中所述

(iii)将所述水提取物加工成饮料。

水提取物可以用或不用啤酒花煮沸，在此之后可以称为煮沸的麦芽汁。可以将第一、第二麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，然后进行煮沸。可以将水提取物煮沸任何合适的时间，例如60min到120min。

步骤(iii)可以包括

a.任选在啤酒花或啤酒花提取物的存在下加热所述水提取物；

b.冷却水提取物；

c.用酵母发酵所述水提取物，从而产生发酵饮料。

步骤(iii)可以特别地包括发酵所述水提取物，例如通过发酵麦芽汁。因此，可以通过用酵母发酵水提取物来制备饮料。

一旦制备了水提取物，就可以通过包括常规酿造方法在内的任何方法将其加工成啤酒。合适的酿造方法的实例的非限制性描述可以在例如Hough等人(1982)的出版物中找到。有许多定期更新的大麦和啤酒产品分析方法，例如但不限于美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists)(1995)、美国酿造化学家协会(AmericanSociety of Brewing Chemists)(1992)、欧洲啤酒啤酒酿造协会(European BreweryConvention)(1998)和酿造研究所(Institute of Brewing)(1997)。公认的是，给定的酿酒厂采用了许多特定的程序，其中最明显的变化与当地消费者的喜好有关。本发明可以使用任何此类生产啤酒的方法。

由水提取物生产啤酒的第一步优选包括煮沸如上所述的所述水提取物，然后是随后的冷却阶段和任选的涡流静置。可以将一种或多种其他化合物加入到水提取物中，例如下文“其他化合物”部分所述的一种或多种其他化合物。冷却后，可以将水提取物转移到装有酵母的发酵罐中，例如酿造酵母，例如巴斯德酵母(S.pastorianus)或酿酒酵母(S.cerevisiae)。可以将水提取物发酵任何合适的时间，通常在1至20天的范围内，例如1至10天。发酵在任何有用的温度下进行，例如在10至20℃的温度范围内。所述方法还可以包括添加一种或多种酶，例如可以在发酵之前或发酵期间向麦芽汁中添加一种或多种酶。特别地，所述酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶的非限制性实例是可从DSM获得的“Brewer's Clarex”。在其他实施方式中，在方法期间不添加外源酶。

在几天长的发酵过程中，糖转化为醇和CO₂，同时产生一些风味物质。发酵可以在任何期望的时间终止，例如一旦没有观察到％P进一步下降。

随后，啤酒可以被进一步处理，例如冷藏。它还可以过滤和/或贮藏-此过程会产生令人愉悦的芳香和更少的酵母样味道。也可以添加添加剂。此外，可以添加CO₂。最后，在包装啤酒之前(例如，将其转移到容器或小桶，瓶装或罐装)，可以将啤酒进行巴氏灭菌和/或过滤。啤酒也可以通过标准方法进行巴氏灭菌。

其他化合物

本发明的方法可以包括添加一种或多种其他化合物的步骤。所述其他化合物可以例如是风味化合物、防腐剂、功能成分、着色剂、甜味剂、pH调节剂或盐。pH调节剂可以例如是缓冲剂或酸，例如磷酸。

功能成分可以是为获得给定功能而添加的任何成分。优选地，功能成分使饮料更健康。功能成分的非限制性实例包括维生素或矿物质。

防腐剂可以是任何食品级防腐剂，例如可以是苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐(例如山梨酸钾)、亚硫酸盐和/或其盐。

其他化合物也可以是CO₂。特别地，可以添加CO₂以获得碳酸饮料。

用于本发明的风味化合物可以是任何有用的风味化合物。风味化合物可以例如选自由香料、植物提取物、植物浓缩物、植物部分和草药浸液组成的组。特别地，风味化合物可以是啤酒花。

制备在CslF6中携带突变的大麦植物的方法

可以以任何有用的方式制备在CslF6中携带突变，例如本文所述的任何特定突变的大麦植物。

例如，可以通过包括以下步骤的方法制备这类大麦植物：

·使多种大麦植物或大麦籽粒经受随机诱变，例如通过辐射或化学处理，例如用叠氮化钠处理；

·鉴别在CslF6中携带突变的大麦植物或大麦籽粒。

此类方法还可包括一个或多个繁殖所述大麦植物/大麦籽粒的步骤，以获得多个每个均携带随机突变的大麦植物/籽粒。

特别地，基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516中所述，通过使用设计用于识别CslF6基因中突变的引物和探针，可以制备和识别在CslF6中携带特定突变的大麦植物。表2提供了可用于识别在CslF6基因中携带突变的大麦植物的引物和探针的实例，所述突变导致所述基因编码携带突变G847E或G748D之一的突变体CslF6蛋白。技术人员基于公知常识和/或国际专利申请PCT/EP2017/065516中提供的指导(其通过引用并入本文)，能够设计用于识别其他突变体的有用的引物和探针。

也可以使用各种定点诱变方法来制备在CslF6基因中携带突变的大麦植物，其例如可以基于本文提供的CslF6基因的序列来设计。在一个实施方式中，如WO2017/138986中所述，使用CRISPR、TALEN、锌指、大范围核酸酶和DNA切割抗生素中的任一种制备大麦植物。在一个实施方式中，使用CRISPR/cas9技术制备大麦植物，例如使用RNA引导的Cas9核酸酶。如Lawrenson等人，Genome Biology(2015)16：258DOI10.1186/s13059-015-0826-7中所述，可以完成该步骤，除了单个引导RNA序列是根据本文提供的基因序列设计的。在一个实施方式中，使用TALEN和CRISPR/cas9技术的组合来制备大麦植物，例如，使用RNA引导的Cas9核酸酶。这可以如Holme等人，Plant Mol Biol(2017)95:111-121；DOI：10.1007/s11103-017-0640-6所述完成该步骤，除了TALEN和单个引导RNA序列是本文提供的基因序列设计的。

在一个实施方式中，使用同源性介导的修复(DNA切割核酸酶和供体DNA片段的组合)来制备谷物植物。这可以如Sun等人，Molecular Plant(2016)9：628-631；DOI：https：//doi.org/10.1016/j.molp.2016.01.001中所述进行，除了基于本文提供的基因序列设计DNA切割核酸酶，并基于本文提供的突变的谷物变体的编码序列设计供体DNA片段。

在本发明的一个实施方式中，目的是提供在CslF6基因中携带突变的农学上有用的大麦植物。除了CslF6基因中的突变外，在产生可用于制麦和/或酿造和/或用作饮料基础的商业大麦品种的领域中，还可以考虑其他因素，例如籽粒产量和大小，以及与制麦性能或酿造性能有关的其他参数。由于已经显示出许多(如果不是全部)相关性状处于遗传控制之下，因此本发明还提供了现代的纯合高产的制麦品种，其可以通过与本公开中公开的大麦植物杂交而制得。熟练的大麦育种者将能够选择和开发大麦植物，在与其他大麦植物杂交后，这将产生优良的品种。或者，育种者可以利用本发明的植物进行进一步诱变，以产生携带除了CslF6基因中的突变之外还有其他突变的新品种。

本发明还包括在由植物育种方法制备的在CslF6基因中携带突变的大麦植物，所述方法包括自交、回交、与群体杂交等方法。回交方法可以与本发明一起使用，以将CslF6基因的突变引入另一个品种。在一个实施方式中，本发明涉及于2018年11月12日以保藏号NCIMB 43273保藏并被称为“突变体2”的大麦植物的后代。所述后代可以通过任何有用的方法来制备，包括但不限于自交、回交或与其他群体杂交。特别地，所述子代还可以携带HvCslF6基因的编码序列(SEQ ID NO 2)的核苷酸2243的G→A突变。

一种加速植物育种过程的方法包括通过使用组织培养和再生技术使产生的突变体初始繁殖。因此，本发明的另一方面是提供细胞，其在生长和分化时产生携带CslF6基因的突变的大麦植物。例如，育种可能涉及传统杂交，制备可育的花药衍生植物或使用小孢子培养。

在一个实施方式中，本发明的大麦植物并非仅通过基本生物学方法获得。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是仅通过基本生物学方法获得的，因为亲本植物是通过技术方法获得的。

在一个实施方式中，大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变已经由化学和/或物理试剂诱导。

在一个实施方式中，大麦植物已经通过包含诱导诱变步骤的方法制备，或者所述植物是通过包含诱导诱变步骤的方法制备的植物的后代。因此，大麦植物可以是通过包括以下步骤的方法制备的大麦植物，或者是通过包括以下步骤的方法制备的植物的后代：

·对大麦植物或其部分进行诱变，例如用化学诱变剂如NaN₃诱变

选择在CslF6基因中携带任何上述突变的大麦植物。

在一个实施方式中，所述CslF6基因的突变产生编码突变体CslF6多肽的突变体CslF6基因，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847至带电荷的氨基酸，例如谷氨酸的取代。特别地，所述突变体CslF6基因可以携带HvCslF6基因的编码序列(SEQ ID NO：2)的核苷酸2243的G→A突变。

项

本发明可以进一步由以下各项定义：

1.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，并且其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，其中所述突变体CslF6是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6在CslF6的膜定位结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，其中CslF6的膜定位结构域由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857以及864至882组成。

2.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，并且其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，其中所述突变体CslF6是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6在CslF6的膜定位结构域中包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性的氨基酸取代为带电荷的氨基酸取代或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，其中膜定位结构域选自由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸835至857或氨基酸700至731或氨基酸741至758组成的CslF6的膜定位结构域组成的组。

3.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量范围为总籽粒干重的1至5％，例如总籽粒干重的1.3至3％，优选总籽粒干重的1.3至2％。

4.根据前述项中任一项的任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量为携带野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，优选至少40％且至多60％。

5.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量为携带野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，优选至少40％且至多60％。

6.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中大麦植物含有的谷粒在脱粒后的破碎谷粒频率比在CslF6基因中不携带突变但其他方面具有相同基因型的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒的频率至多高3倍。

7.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中大麦植物含有的谷粒在脱粒后的破碎谷粒频率比在CslF6基因中不携带突变但其他方面具有相同基因型的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒频率至多高2倍。

8.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。

9.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸835至857组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸的取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。

10.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含将氨基酸847取代为带电荷的氨基酸。

11.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)。

12.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码SEQ ID NO：27的突变体CslF6多肽。

13.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物携带HvCslF6基因的编码序列的核苷酸2243的G→A突变。

14.根据项13所述的大麦植物，其中所述HvCslF6基因的编码序列是SEQ ID NO 2。

15.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物是以登录号NCIMB43273保藏在NCIMB的突变体2或其后代。

16.一种大麦植物或其后代或其部分，其中所述植物的基因组包含以登录号NCIMB43273保藏在NCIMB的大麦植物突变体2的CslF6基因。

17.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的β-葡聚糖含量范围为总籽粒干重的1.7至5.0％。

18.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率为至多2.5，例如至多2.1，例如在1.0至2.1的范围内。

19.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含由CslF6的氨基酸741至758组成的跨膜结构域中的一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。

20.根据项1至8和19中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含将氨基酸748取代为带电荷的氨基酸。

21.根据项1至8和19至20中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)。

22.根据项1至8和19至21中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的β-葡聚糖含量范围为总籽粒干重的1.7至3％。

23.根据项1至8和19至22中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率范围为2.5至4。

24.根据项1至8中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸700至731组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将极性氨基酸取代为非极性氨基酸。

25.根据项1至8和24中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸700至711组成的膜定位结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将极性氨基酸取代为非极性氨基酸。

26.根据项1至8和24至25中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含将氨基酸709取代为非极性氨基酸。

27.根据项1至8和24至26中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)。

28.根据项1至8和24至27中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的β-葡聚糖含量范围为总籽粒干重的1.3至3％。

29.根据项1至8和24至28中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率为至少3.5，例如至少4.0，例如至少4.5，例如在4到6的范围内。

30.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其后代，其中所述大麦植物并非仅通过基本生物学的方法制备。

31.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其后代，其中所述大麦植物通过包括以下步骤的方法制备：

о诱变大麦植物或其部分，例如使用化学诱变剂

о选择在CslF6基因中携带上述任何突变的大麦植物。

32.一种植物产品，其包含根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分。

33.根据项32所述的植物产品，其中所述植物产品是由所述大麦植物的籽粒制备的绿麦芽或窑烤干燥的麦芽。

34.根据项32所述的植物产品，其中所述植物产品是由所述大麦植物的籽粒和/或由包含所述大麦植物的经加工籽粒的绿麦芽或窑烤干燥的麦芽制备的麦芽汁。

35.根据项32至34中任一项所述的植物产品，其中所述植物产品是麦芽汁，并且其中所述麦芽汁具有至多2.5mPa*s，优选至多2.2mPa*s的粘度。

36.根据项32所述的植物产品，其中所述植物产品是由所述大麦植物或其部分制备的饮料。

37.根据项32所述的饮料，其中所述饮料由所述大麦植物的籽粒和/或由包含所述大麦植物的经加工籽粒的麦芽制备。

38.根据项36至37中任一项所述的饮料，其中所述饮料是啤酒。

39.一种制备绿麦芽的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供项1至31中任一项所述的大麦植物的籽粒；

b.浸泡所述籽粒；

c.在预定条件下使浸泡的籽粒萌发。

40.一种制备窑烤干燥的麦芽的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供项1至31中任一项所述的大麦植物的籽粒；

b.浸泡所述籽粒；

c.在预定条件下使浸泡的籽粒萌发；

d.干燥所述萌发的籽粒。

41.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供项1至31中任一项所述的大麦植物的籽粒和/或项33所述的麦芽；

b.制备所述籽粒和/或所述麦芽的水提取物；

c.将所述水提取物加工成饮料。

42.一种生产水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供项1至31中任一项所述的大麦植物的籽粒；

b.使所述大麦籽粒经历萌发步骤，从而获得萌发的籽粒，其中所述萌发步骤包括将所述籽粒在水溶液中孵育至多72h；

c.精细分割所述萌发的籽粒，同时所述萌发的籽粒的含水量至少为20％，条件是在步骤b)和c)之间的任何时间，所述大麦籽粒的含水量均不低于20％；

d.制备所述磨碎的萌发的籽粒的水提取物，从而产生大麦的水提取物。

43.一种生产水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供项1至31中任一项所述的大麦植物的籽粒；

c.精细分割所述萌发的籽粒，同时所述萌发的籽粒的含水量至少为20％，条件是所述大麦籽粒的含水量在萌发后且直至精细分割萌发的籽粒的任何时间均不低于20％；

44.根据项42和43中任一项所述的方法，其中所述萌发步骤(b)包括将所述籽粒在水溶液中孵育直到所述籽粒具有至少30％的含水量，其中每kg干重的大麦籽粒每h有至少2L O₂通过所述水溶液。

45.根据项42至44中任一项所述的方法，其中在整个萌发步骤中，将大麦籽粒浸入水溶液中。

46.根据项42至45中任一项所述的方法，其中所述萌发步骤包括：

a.至少一个在水溶液中孵育所述籽粒的步骤，其中每kg干重的大麦籽粒每h有至少2L O₂通过所述水溶液；和

b.至少一个在空气中孵育所述大麦籽粒的步骤。

47.根据项42至46中任一项所述的方法，其中每kg干重的大麦籽粒每h有至少3L，更优选至少4L，再更优选至少5L，甚至更优选至少6L O₂通过所述水溶液。

48.根据项42至47中任一项所述的方法，其中所述O₂包含在气体混合物中，其中所述气体混合物是大气。

49.根据项42至48中任一项所述的方法，其中整个萌发步骤不超过72h，更优选不超过60h，甚至更优选不超过54h。

50.根据项42至49中任一项所述的方法，其中所述大麦是脱壳的大麦，并且所述方法包括在将所述籽粒在水溶液中孵育之前除去至少部分所述谷壳的步骤。

51.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：

a.通过项42至50中任一项所述的方法制备水提取物；

b.将所述提取物加工成饮料。

52.根据项51所述的方法，其中步骤b.包括以下步骤：

i.任选在啤酒花或啤酒花提取物的存在下加热所述水提取物；

ii.冷却水提取物；

iii.用酵母发酵所述水提取物，从而产生发酵的饮料。

53.根据项51至52中任一项所述的方法，其中，所述饮料是啤酒。

54.一种制备大麦植物的方法，所述大麦植物的β-葡聚糖含量在总籽粒干重的1-5％范围内，所述方法包括以下步骤：

a.提供大麦籽粒；和

b.随机诱变所述大麦籽粒，从而引入CslF6基因中的突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，其中所述突变体CslF6是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含CslF6的跨膜结构域中的一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，其中CslF6的跨膜结构域由氨基酸109至128、137至158、700至731、741至758、835至857和864至882组成；和

c.选择携带突变的CslF6基因的大麦籽粒或其后代。

55.根据项54所述的方法，其中所述大麦植物或所述突变如项1至31中任一项所定义。

56.根据项1至31中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在一种或多种其他基因中包含突变，例如以下突变中的一个或多个：

a.编码LOX-1的基因中的突变，导致功能性LOX-1完全丧失

b.编码LOX-2的基因中的突变，导致功能性LOX-2完全丧失

c.编码MMT的基因中的突变，导致功能性MMT完全丧失。

序列

>SEQ ID NO:1，纤维素合酶样CslF6序列(基于GenBank号NCBI：EU267181.1)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH

SEQ ID NO：2，Hordeum vulgare纤维素合酶样CslF6(CslF6)，完整cds(基于GenBank号NCBI：EU267181.1)

ATGGCGCCAGCGGTGGCCGGAGGGGGCCGCGTGCGGAGCAATGAGCCGGTTGCTGCTGCTGCCGCCGCGCCGGCGGCCAGCGGCAAGCCCTGCGTGTGCGGCTTCCAGGTTTGCGCCTGCACGGGGTCGGCCGCGGTGGCCTCCGCCGCCTCGTCGCTGGACATGGACATCGTGGCCATGGGGCAGATCGGCGCCGTCAACGACGAGAGCTGGGTGGGCGTGGAGCTCGGCGAAGATGGCGAGACCGACGAAAGCGGTGCCGCCGTTGACGACCGCCCCGTATTCCGCACCGAGAAGATCAAGGGTGTCCTCCTCCACCCCTACCGGGTGCTGATTTTCGTTCGTCTGATCGCCTTCACGCTGTTCGTGATCTGGCGTATCTCCCACAAGAACCCAGACGCGATGTGGCTGTGGGTGACATCCATCTGCGGCGAGTTCTGGTTCGGTTTCTCGTGGCTGCTAGATCAGCTGCCCAAGCTGAACCCCATCAACCGCGTGCCGGACCTGGCGGTGCTGCGGCAGCGCTTCGACCGCCCCGACGGCACCTCCACGCTCCCGGGGCTGGACATCTTCGTCACCACGGCCGACCCCATCAAGGAGCCCATCCTCTCCACCGCCAACTCGGTGCTCTCCATCCTGGCCGCCGACTACCCCGTGGACCGCAACACATGCTACGTCTCCGACGACAGTGGCATGCTGCTCACCTACGAGGCCCTGGCAGAGTCCTCCAAGTTCGCCACGCTCTGGGTGCCCTTCTGCCGCAAGCACGGGATCGAGCCCAGGGGTCCGGAGAGCTACTTCGAGCTCAAGTCACACCCTTACATGGGGAGAGCCCAGGACGAGTTCGTCAACGACCGCCGCCGCGTTCGCAAGGAGTACGACGAGTTCAAGGCCAGGATCAACAGCCTGGAGCATGACATCAAGCAGCGCAACGACGGGTACAACGCCGCCATTGCCCACAGCCAAGGCGTGCCCCGGCCCACCTGGATGGCGGACGGCACCCAGTGGGAGGGCACATGGGTCGACGCCTCCGAGAACCACCGCAGGGGCGACCACGCCGGCATCGTACTGGTGCTGCTGAACCACCCGAGCCACCGCCGGCAGACGGGCCCGCCGGCGAGCGCTGACAACCCACTGGACTTGAGCGGCGTGGATGTGCGTCTCCCCATGCTGGTGTACGTGTCCCGTGAGAAGCGCCCCGGGCACGACCACCAGAAGAAGGCCGGTGCCATGAACGCGCTTACCCGCGCCTCGGCGCTGCTCTCCAACTCCCCCTTCATCCTCAACCTCGACTGCGATCATTACATCAACAACTCCCAGGCCCTTCGCGCCGGCATCTGCTTCATGGTGGGACGGGACAGCGACACGGTTGCCTTCGTCCAGTTCCCGCAGCGCTTCGAGGGCGTCGACCCCACCGACCTCTACGCCAACCACAACCGCATCTTCTTCGACGGCACCCTCCGTGCCCTGGACGGCATGCAGGGCCCCATCTACGTCGGCACTGGGTGTCTCTTCCGCCGCATCACCGTCTACGGCTTCGACCCGCCGAGGATCAACGTCGGCGGTCCCTGCTTCCCCAGGCTCGCCGGGCTCTTCGCCAAGACCAAGTACGAGAAGCCCGGGCTCGAGATGACCACGGCCAAGGCCAAGGCCGCGCCCGTGCCCGCCAAGGGTAAGCACGGCTTCTTGCCACTGCCCAAGAAGACGTACGGCAAGTCGGACGCCTTCGTGGACACCATCCCGCGCGCGTCGCACCCGTCGCCCTACGCCGCGGCGGCTGAGGGGATCGTGGCCGACGAGGCGACCATCGTCGAGGCGGTGAACGTGACGGCCGCCGCGTTCGAGAAGAAGACCGGCTGGGGCAAAGAGATCGGCTGGGTGTACGACACCGTCACGGAGGACGTGGTCACCGGCTACCGGATGCATATCAAGGGGTGGCGGTCACGCTACTGCTCCATCTACCCACACGCCTTCATCGGCACCGCCCCCATCAACCTCACGGAGAGGCTCTTCCAGGTGCTCCGCTGGTCCACGGGATCCCTCGAGATCTTCTTCTCCAAGAACAACCCGCTCTTCGGCAGCACATACCTCCACCCGCTGCAGCGCGTCGCCTACATCAACATCACCACTTACCCCTTCACCGCCATCTTCCTCATCTTCTACACCACCGTGCCGGCGCTATCCTTCGTCACCGGCCACTTCATCGTGCAGCGCCCGACCACCATGTTCTACGTCTACCTGGGCATCGTGCTATCCACGCTGCTCGTCATCGCCGTGCTGGAGGTCAAGTGGGCCGGGGTCACAGTCTTCGAGTGGTTCAGGAACGGCCAGTTCTGGATGACAGCAAGTTGCTCCGCCTACCTCGCCGCCGTCTGCCAGGTGCTGACCAAGGTGATATTCCGGCGGGACATCTCCTTCAAGCTCACATCCAAGCTACCCTCGGGAGACGAGAAGAAGGACCCCTACGCCGACCTCTACGTGGTGCGCTGGACGCCGCTCATGATTACACCCATCATCATCATCTTCGTCAACATCATCGGATCCGCCGTGGCCTTCGCCAAGGTTCTCGACGGCGAGTGGACGCACTGGCTCAAGGTCGCCGGCGGCGTCTTCTTCAACTTCTGGGTGCTCTTCCACCTCTACCCCTTCGCCAAGGGCATCCTGGGGAAGCACGGAAAGACGCCAGTCGTGGTGCTCGTCTGGTGGGCATTCACCTTCGTCATCACCGCCGTGCTCTACATCAACATCCCCCACATGCATACCTCGGGAGGCAAGCACACAACGGTGCATGGTCACCATGGCAAGAAGTTGGTCGACACAGGGCTCTATGGCTGGCTCCATTGA

＞SEQ ID NO:3，纤维素合酶样CslF6序列(含有A590T多态性)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYTAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLGIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH

>SEQ ID NO：27，基于SEQ ID NO:1的细胞壁突变体2(CW3a)，纤维素合酶样CslF6序列(基于GenBank号NCBI：EU267181.1)

MAPAVAGGGRVRSNEPVAAAAAAPAASGKPCVCGFQVCACTGSAAVASAASSLDMDIVAMGQIGAVNDESWVGVELGEDGETDESGAAVDDRPVFRTEKIKGVLLHPYRVLIFVRLIAFTLFVIWRISHKNPDAMWLWVTSICGEFWFGFSWLLDQLPKLNPINRVPDLAVLRQRFDRPDGTSTLPGLDIFVTTADPIKEPILSTANSVLSILAADYPVDRNTCYVSDDSGMLLTYEALAESSKFATLWVPFCRKHGIEPRGPESYFELKSHPYMGRAQDEFVNDRRRVRKEYDEFKARINSLEHDIKQRNDGYNAAIAHSQGVPRPTWMADGTQWEGTWVDASENHRRGDHAGIVLVLLNHPSHRRQTGPPASADNPLDLSGVDVRLPMLVYVSREKRPGHDHQKKAGAMNALTRASALLSNSPFILNLDCDHYINNSQALRAGICFMVGRDSDTVAFVQFPQRFEGVDPTDLYANHNRIFFDGTLRALDGMQGPIYVGTGCLFRRITVYGFDPPRINVGGPCFPRLAGLFAKTKYEKPGLEMTTAKAKAAPVPAKGKHGFLPLPKKTYGKSDAFVDTIPRASHPSPYAAAAEGIVADEATIVEAVNVTAAAFEKKTGWGKEIGWVYDTVTEDVVTGYRMHIKGWRSRYCSIYPHAFIGTAPINLTERLFQVLRWSTGSLEIFFSKNNPLFGSTYLHPLQRVAYINITTYPFTAIFLIFYTTVPALSFVTGHFIVQRPTTMFYVYLDIVLSTLLVIAVLEVKWAGVTVFEWFRNGQFWMTASCSAYLAAVCQVLTKVIFRRDISFKLTSKLPSGDEKKDPYADLYVVRWTPLMITPIIIIFVNIIGSAVAFAKVLDGEWTHWLKVAGGVFFNFWVLFHLYPFAKGILGKHGKTPVVVLVWWAFTFVITAVLYINIPHMHTSGGKHTTVHGHHGKKLVDTGLYGWLH

实施例

实施例1

数字突变体识别探针的设计

HvCslF6基因的编码序列从美国国家生物技术信息中心(NCBI)收集，登录号为AB621332。该序列用于在http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/上BLAST搜索。使用http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/以登录号MLOC_57200检索HvCslF6基因和转录物序列。根据MLOC_57200.2的编码DNA和蛋白序列设计了数字突变体识别探针。

实施例2

筛选在纤维素合酶样CslF6基因中具有特定突变的大麦突变体。

鉴定出总共5个具有特定突变的突变体，其导致纤维素合酶样CslF6(HvCslF6)中的氨基酸残基的取代(表1)。

表1。

鉴定出的突变体。

使用基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516中描述的ddPCR筛选方法鉴定了突变体1、突变体2、突变体3和突变体4。更具体地说，准备了随机诱变大麦谷粒库，然后按照国际专利申请PCT/EP2017/065516第66至69页的WS1和WS2和实施例1至2所述制备有序文库。如国际专利申请PCT/EP2017/065516第67-72页的WS3和WS4以及实施例3至15所述，通过使用下表2中指定的引物和探针对突变体1、突变体2、突变体3和突变体4进行鉴定并选择。具体而言，基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516的WS3和实施例3至7所述，通过使用下表2中指定的引物和探针进行筛选。基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516的WS4(第69-72页)和实施例8至15所述，通过使用下表2中指定的引物和探针鉴定携带基因突变的单个大麦谷粒。

引物和探针是专门为鉴定HvCslF6基因座上的特定突变体而设计的，如表2所示。

表2.为特定突变体设计的引物和探针。

通过使用特异引物(正向引物5'-ACTGCTCCATCTACCCACAC-3'；反向引物5'-GATGACGAAGGTGAATGCCC-3')以扩增HvCslF6基因座的部分，利用6000个诱变的M3大麦突变体的直接测序方法，鉴定了突变体5。

突变体1、突变体2、突变体3、突变体4和突变体5在本文中也分别称为Mut1、Mut2、Mut3、Mut4和Mut5。

为了可视化突变的位置，程序Swissprot(swissmodel.expasy.org/)用于建模CslF6蛋白。首先将整个蛋白序列上传到“模型构建特征”(model building feature)中，然后根据可用数据计算模型。对于CslF6蛋白序列，公认其已在序列中嵌入类似于“纤维素合酶亚基A”的结构。然后，程序利用识别的序列(多肽位置109-883)构建模型。在这个阶段，SwissProt程序没有识别该蛋白是膜结合的，尽管螺旋被要求位于模型一侧。文献表明ClsF6蛋白是膜结合的。因此，为了对此进行进一步测试，使用了SwissProt中的QMEANBrane功能。该建模程序利用在第一次建模期间生成的覆盖位置109-883的PDB文件，然后构建一个新结构来一起对膜和CslF6蛋白的选定部分进行建模。两个点状的灰色平面重新采样了双层膜。介导较低(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的三个突变都位于嵌入膜中的螺旋结构中(T709I、G748D、G847E)，而不影响(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的突变(G732D)位于面向外部并连接两个跨膜结构域的连接子序列中(图3)。表3中显示了CslF6中的膜定位氨基酸。

表3.CslF6蛋白中膜定位氨基酸序列的定位

实施例3

成熟突变体谷粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量和DP3:DP4比率

如实施例1中所述鉴定的突变体生长至成熟，并且将纯合谷粒成行种植。成熟时收获植物，并且谷粒用于在几平方米的小块样地上进行繁殖。突变体1、2、4和5在该地块中均表现良好，给出与参考相似的产量。因此，这些突变体具有可接受的农艺学性状。对于突变体1、2、3和4而言参考是cv.Paustian，对于突变体5而言是cv.Quench。突变体3显示高度下降的生育力，并且因此不包括在产量试验中。

表4显示了至少四个7.5m²的样地的平均产量。大麦于2017年在Nr Aaby繁殖。

突变体No	突变体	产量(kg)	SD
				Mut1	CW2	6,0	0,2
Mut2	CW3	6,2	0,3
				Mut5	CW4	5,9	0,2
	Paustian	6,2	0,2

Mut4	CW7	6,0	0,5
					Quench	6,1	0,2

分析收获的谷粒的总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量并确定DP3:DP4比率。在Retch旋风磨上磨碎十毫升大麦谷粒。一式三份分析所有样品。在2毫升Eppendorf管中称出20毫克面粉，在烤箱中于100℃加热2小时，然后冷却至室温。总共加入500μl 50％甲醇水溶液，并将样品以1400rpm振摇1小时。在16000g下离心10分钟后，弃去上清液，并将样品干燥过夜。然后，每10mg面粉加入400μL、pH为6.5的20mM NaHPO4和1U/ml地衣酶(Megazyme，International，爱尔兰)，并在50℃下孵育2.5小时。样品以16000g离心10分钟，并且上清液通过0.45μm过滤器过滤，并且释放的Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)寡聚物通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)定量。Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)寡聚物利用使用配备4μm SA-10色谱柱(尺寸为2x250mm)和预色谱柱的Dionex ICS 5000+DC系统的HPAEC-PAD进行定量。运行条件为0.4ml/min，柱温40℃，无梯度的100mM NaOH洗脱液15分钟。定量标准品通过用1U/ml地衣酶(Megazyme International，爱尔兰)消化在20mM NaHPO4pH 6.5中的已知量的中等粘度(1,3；1,4)-β-葡聚糖(Megazyme International，爱尔兰)生产，假设DP3和DP4之间等摩尔PAD响应比率。总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量被认为是DP3和DP4寡聚物含量的和。

结果。突变体1、2和5的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量都在1.4至2％的范围内，而突变体3几乎没有(1,3；1,4)-β-葡聚糖(图1和表6)。检查DP3:DP4比率，突变体1显示低于参考的比率，突变体2与参考相似，突变体3和4略高于参考，而突变体5显示高得多的DP3:DP4比率(图2和表6)。

实施例4

加速萌发过程中突变体谷粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量

基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例1所述，将突变体1、2和4以及参考(对于突变体1、2、3和4而言，参考是cv.Paustian，对于突变体5而言，参考是cv.Quench)的谷粒在罐中进行单步浸泡和萌发。在24h和48h后采集萌发谷物样品。

使用综合微阵列聚合物分析(Comprehensive Microarray Polymer Profiling)(CoMPP)(Moller等人，2007)对所有样品进行分析。一式三份分析20mg的每个样品，所述样品依次用1ml H₂O在85℃下以1000rpm提取1小时，再用1ml 4M NaOH和0.1％v/v NaBH₄在20℃下以1000rpm提取2小时。每次提取均在带有3mm玻璃球的2ml Eppendorf管中进行，然后以10.000g离心10分钟，并收集上清液。

将提取物与arrayjet打印缓冲液(55.2％甘油、44％水、0.8％Triton X-100)50/50混合，并使用Arrayjet Sprint(Arrayjey，Roslin，英国)印迹在孔径0.45μm的硝酸纤维素膜上。每个样品都印有四个技术重复样品和3个五倍稀释液，并按照(Pedersen等人，2012)中所述进行探针检测。使用平台式扫描仪(CanoScan 9000MarkII，Canon，

丹麦)以2400dpi扫描阵列，并使用Array-Pro Analyzer 6,3(Media Cybernetics，Rockville,MD,USA)进行定量。对于每个样品，均基于四个稀释度和四个技术重复计算平均值，得出每个样品重复信号值的16次测量。数据集中的最高值设置为100，其余值进行相应调整。数据列于表5中，显示了三个样品重复的平均值。

表5.大麦突变体和参考的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。24h的最大值设置为100，其余值进行相应调整

	％葡聚糖–24h	％葡聚糖–48h
			突变体1	59	55
突变体2	84	69
			突变体4	100	95
参考1	98	85

分析表明，与参考和突变体4相比，突变体1和2在补充空气的罐中萌发后24h和48h具有较低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，证明突变体1和2固有的较低(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。

实施例6

谷粒强度分析

突变体1、2、3、4和5以及参考系cv.Paustian和cv.Quench在7.5m²的小块田地繁殖。它们通过试验性Wintersteiger Classic(Wintersteiger(WINTERSTEIGER AG,Johann-Michael-Dimmelstrasse 94910 Ried im Innkreis，奥地利)收获。使用2.5mm筛网在型号为SLN4的Pfeuffer样品清洁机(Pfeuffer GmbH,Flugplatzstraβe 70,97318Kitzingen,德国)上进行谷粒的进一步清洁。在大约10g的四个随机选择的样本中对破碎谷粒进行计数，并以重量为基础计算破碎谷粒的量。脱粒之后(Wintersteiger试验)和筛选之前的破碎谷粒数量表明了谷粒强度。脱粒后的破碎谷粒率计算为突变体植物相对于参考野生型植物(表6a中所示的参考植物)的破碎谷粒增加的倍数。

表6a突变体谷粒特征汇总

对来自新西兰2016-2017(Mut 1；Mut 2；Mut 4；Mut 5)和丹麦2018(Mut 2)种植的大麦植物的50g样品进行了类似的破碎谷粒百分比测定(脱粒破碎率)。如上所述确定脱粒后的破碎谷粒频率(脱粒破碎率)，并将其与野生型参考大麦植物(对于Mut 1、Mut 2和Mut4而言为cv.Paustian，对于Mut 5而言为cv.Quench)的频率进行比较。相对于野生型参考大麦植物的倍数增加在下表6b中显示。

表6b

有趣的是，Hu等人，2014年公开了一种大麦品系(m351)，该大麦品系在CslF6基因中携带突变，导致CslF6蛋白的A849T突变。与野生型对照相比，所述大麦品系的破碎谷粒率增加了4.2倍。

实施例7：麦芽样品中的水解酶活性

突变体2和参考(cv.Paustian)的大麦籽粒一式三份加工，每个样品50g。突变体2如以上实施例2中所述。根据标准方法，将置于不锈钢烧杯中的干大麦籽粒进行微制麦(micromalted)。简而言之，将大麦籽粒在第一天于15℃淡水中强制浸泡约7个小时，第二天3个小时，并且第三天1个小时，以在每次浸泡结束时分别达到35％、40％和45％的含水量。每次浸泡后，将装有样品的不锈钢烧杯移至15℃的萌发箱中，并保持在那里，直到过程中的下一步骤。在最后一次排出浸泡水时，将样品在平衡至45％水的萌发箱中保存120小时(第3-7天)，并进行喷雾以克服呼吸失水。

在萌发过程结束时(第7天)，使用以下温度斜坡程序将样品在放入Termaks孵育箱中的不锈钢箱中窑烤干燥21小时：

25℃-55℃(2℃/小时)

55℃-85℃(4℃/小时)

85℃ 1.5小时

在80％新鲜空气的循环气流下进行萌发和窑烤干燥的步骤。

在每个微制麦日结束时，一式三份收集样品进行分析，并冷冻干燥48小时。

在酶活性分析之前，使用标准的Foss Cyclotech研磨机磨碎麦芽样品，该研磨机配有碳化钨磨环(Foss 10004463)、镀镍叶轮(Foss 1000 2666)和1mm出口筛网(Foss10001989)。大麦麦芽的所有酶活性测定均在磨碎干燥样品后48小时内进行。使用来自Megazyme的Ceralpha试剂盒(K-CERA)并使用标准实验室设备测量α-淀粉酶活性。淀粉酶测定是根据制造商的规程(K-CERA 01/12)进行的。淀粉酶活性的计算基于Megazyme规程(K-CERA01/12)中的公式。使用来自Megazyme的Betamyl试剂盒(K-BETA3)并使用标准实验室设备测量β-淀粉酶的活性。淀粉酶测定是根据制造商的规程(K-BETA3 10/10)进行的。β-淀粉酶活性的计算基于Megazyme规程(K-BETA3 10/10)中的公式。使用来自Megazyme的支链淀粉酶/极限糊精酶测定试剂盒(PullG6方法)试剂盒(K-PullG6)并使用标准实验室设备，测量极限糊精酶活性测定。极限糊精酶测定是根据制造商的规程(K-PullG6 05/17)进行的。极限糊精酶活性的计算基于Megazyme规程(K-PullG6 05/17)中的公式。

结果：

在突变体2和参考大麦品系中，测量的α-淀粉酶、β-淀粉酶和游离极限糊精酶的总酶活性遵循相同的模式(图5)。令人惊讶的是，尽管极限糊精酶基因表达略低，但早在第3天开始，突变体中出现略高的极限糊精酶活性。

实施例8

(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量

分析如实施例7所述制备的萌发谷粒的总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。在Retch旋风磨上磨碎10mL大麦谷粒。一式三份分析所有样品。在2mL Eppendorf管中称出20mg面粉，在烤箱中于100℃加热2小时，然后冷却至室温。总共加入500μL 50％的甲醇水溶液，并将样品以1400rpm振摇1小时。以16000x g离心10分钟后，弃去上清液，并将样品干燥过夜。然后每10mg面粉添加400μL的pH 6.5的20mM NaHPO₄和1U/mL地衣酶(Megazyme，International，爱尔兰)，并在50℃下孵育2.5小时。将样品以16000xg离心10分钟，并将上清液通过0.45μm过滤器过滤，并且释放的Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)寡聚物通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)定量。Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)和Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)寡聚物利用使用配备4μm SA-10色谱柱(尺寸为2x250mm)和预色谱柱的Dionex ICS 5000+DC系统的HPAEC-PAD进行定量。运行条件为0.4ml/min，柱温40℃，无梯度的100mM NaOH洗脱液15分钟。定量标准品通过用1U/ml地衣酶(MegazymeInternational，爱尔兰)消化在20mM NaHPO4pH 6.5中的已知量的中等粘度(1,3；1,4)-β-葡聚糖(Megazyme International，爱尔兰)生产，假设DP3和DP4之间等摩尔PAD响应。总(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量被计算为DP3和DP4寡聚物的和。

结果：

在制麦过程的第1、2、3、4、5、6天的大麦和绿麦芽(图6)中以及窑烤麦芽中(图6中第7天)监测突变体2(突变体)和cv.Paustian(参考)的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量。在整个制麦过程中，突变体2的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量仅是参考的50％，并且在第5天，突变体(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量与参考窑烤麦芽相似。

实施例9

粘度

制麦：

使用每个样品杯50g大麦一式两份对大麦样品进行制麦。将大麦样品在封闭的样品栅室内于15℃水中强制浸泡。前三天进行浸泡程序，以在每次浸泡结束时含水量分别达到35％、40％和45％。接下来的三天将样品在15℃的萌发箱中保存，平衡至45％的水，并通过喷水进行调节以克服呼吸失水。在这六天之后，将样品在Termaks孵育箱中窑烤21小时，并使用手动除根系统进行烘干。对于三天的绿麦芽，在制麦的第三天后，将样品冷冻干燥至4％的含水量。

糖化：

在糖化之前，将样品研磨成细粉。按照以下糖化程序，将70g干物质以5：1的水：谷粉(grist)比率混合，并在Lochner糖化设备中根据以下糖化程序进行糖化：52℃下10分钟，65℃下50分钟和在78℃下5分钟，以1度/分钟的温度斜坡退出。随糖化程序收集样品。

糖化后，麦芽汁通过MN 614¹/₄，

(Macherey-Nagel)滤纸过滤。过滤后的麦芽汁的流变行为在RheolabQC旋转流变仪(Anton Paar GmbH)中进行测量，该流变仪支持Peltier温度系统(C-PTD 180/AIR/QC)和双间隙测量系统(C-DG42/SS，Anton Paar GmbH)。

结果：

测定微制麦的Mut 2和Mut 5突变体的3天麦芽汁(制麦3天后的大麦)的粘度，并将其与对照(cv.Paustian和cv.Quench的微制麦的野生型谷粒的3天麦芽汁)进行比较。如表7和图6所示，与对照相比，从任一突变体制备的麦芽汁的粘度均显著更低。由突变体或参考制备的麦芽汁的柏拉图度(°Plato)相当。

由标准麦芽制备的麦芽汁的粘度为约2mPa*s，所述标准麦芽通过浸泡1-2天并萌发5-7天，然后窑烤干燥而制备。

表7

参考文献

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Jobling SA(2015).Membrane pore architecture of the CslF6proteincontrols(1-3,1-4)-b-glucan structure.Sci.Adv.1:e1500069.

Holme IB,Wendt T,Gil-Humanes J,Deleuran LC,Staker CG,Voytas DF andBrinch-Pedersen H,(2017).Evaluation of the mature grain phytase candidateHvPAPhy_a gene in barley(Hordeum vulgare L.)using CRISPR/Cas9and TALENs.PlantMol Biol 95:111-121；(DOI:10.1007/s11103-017-0640-6).

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序列表

<110> 嘉士伯有限公司（Carlsberg A/S）

<120> 具有改善的细胞壁性质的谷类植物

<130> P4744PC00

<150> 17210954.8

<151> 2017-12-28

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 947

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 1

Met Ala Pro Ala Val Ala Gly Gly Gly Arg Val Arg Ser Asn Glu Pro

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Gly Lys Pro Cys Val

20 25 30

Cys Gly Phe Gln Val Cys Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser

35 40 45

Ala Ala Ser Ser Leu Asp Met Asp Ile Val Ala Met Gly Gln Ile Gly

50 55 60

Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Val Gly Val Glu Leu Gly Glu Asp Gly

65 70 75 80

Glu Thr Asp Glu Ser Gly Ala Ala Val Asp Asp Arg Pro Val Phe Arg

85 90 95

Thr Glu Lys Ile Lys Gly Val Leu Leu His Pro Tyr Arg Val Leu Ile

100 105 110

Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile Trp Arg Ile Ser

115 120 125

His Lys Asn Pro Asp Ala Met Trp Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly

130 135 140

Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp Leu Leu Asp Gln Leu Pro Lys Leu

145 150 155 160

Asn Pro Ile Asn Arg Val Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Gln Arg Phe

165 170 175

Asp Arg Pro Asp Gly Thr Ser Thr Leu Pro Gly Leu Asp Ile Phe Val

180 185 190

Thr Thr Ala Asp Pro Ile Lys Glu Pro Ile Leu Ser Thr Ala Asn Ser

195 200 205

Val Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Asp Arg Asn Thr Cys

210 215 220

Tyr Val Ser Asp Asp Ser Gly Met Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Ser Ser Lys Phe Ala Thr Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His

245 250 255

Gly Ile Glu Pro Arg Gly Pro Glu Ser Tyr Phe Glu Leu Lys Ser His

260 265 270

Pro Tyr Met Gly Arg Ala Gln Asp Glu Phe Val Asn Asp Arg Arg Arg

275 280 285

Val Arg Lys Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Arg Ile Asn Ser Leu Glu

290 295 300

His Asp Ile Lys Gln Arg Asn Asp Gly Tyr Asn Ala Ala Ile Ala His

305 310 315 320

Ser Gln Gly Val Pro Arg Pro Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr Gln Trp

325 330 335

Glu Gly Thr Trp Val Asp Ala Ser Glu Asn His Arg Arg Gly Asp His

340 345 350

Ala Gly Ile Val Leu Val Leu Leu Asn His Pro Ser His Arg Arg Gln

355 360 365

Thr Gly Pro Pro Ala Ser Ala Asp Asn Pro Leu Asp Leu Ser Gly Val

370 375 380

Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro

385 390 395 400

Gly His Asp His Gln Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Thr Arg

405 410 415

Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asn Ser Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys

420 425 430

Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Gln Ala Leu Arg Ala Gly Ile Cys Phe

435 440 445

Met Val Gly Arg Asp Ser Asp Thr Val Ala Phe Val Gln Phe Pro Gln

450 455 460

Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Thr Asp Leu Tyr Ala Asn His Asn Arg

465 470 475 480

Ile Phe Phe Asp Gly Thr Leu Arg Ala Leu Asp Gly Met Gln Gly Pro

485 490 495

Ile Tyr Val Gly Thr Gly Cys Leu Phe Arg Arg Ile Thr Val Tyr Gly

500 505 510

Phe Asp Pro Pro Arg Ile Asn Val Gly Gly Pro Cys Phe Pro Arg Leu

515 520 525

Ala Gly Leu Phe Ala Lys Thr Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Leu Glu Met

530 535 540

Thr Thr Ala Lys Ala Lys Ala Ala Pro Val Pro Ala Lys Gly Lys His

545 550 555 560

Gly Phe Leu Pro Leu Pro Lys Lys Thr Tyr Gly Lys Ser Asp Ala Phe

565 570 575

Val Asp Thr Ile Pro Arg Ala Ser His Pro Ser Pro Tyr Ala Ala Ala

580 585 590

Ala Glu Gly Ile Val Ala Asp Glu Ala Thr Ile Val Glu Ala Val Asn

595 600 605

Val Thr Ala Ala Ala Phe Glu Lys Lys Thr Gly Trp Gly Lys Glu Ile

610 615 620

Gly Trp Val Tyr Asp Thr Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg

625 630 635 640

Met His Ile Lys Gly Trp Arg Ser Arg Tyr Cys Ser Ile Tyr Pro His

645 650 655

Ala Phe Ile Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Glu Arg Leu Phe Gln

660 665 670

Val Leu Arg Trp Ser Thr Gly Ser Leu Glu Ile Phe Phe Ser Lys Asn

675 680 685

Asn Pro Leu Phe Gly Ser Thr Tyr Leu His Pro Leu Gln Arg Val Ala

690 695 700

Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Phe Leu Ile Phe

705 710 715 720

Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val Thr Gly His Phe Ile Val

725 730 735

Gln Arg Pro Thr Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser

740 745 750

Thr Leu Leu Val Ile Ala Val Leu Glu Val Lys Trp Ala Gly Val Thr

755 760 765

Val Phe Glu Trp Phe Arg Asn Gly Gln Phe Trp Met Thr Ala Ser Cys

770 775 780

Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Cys Gln Val Leu Thr Lys Val Ile Phe

785 790 795 800

Arg Arg Asp Ile Ser Phe Lys Leu Thr Ser Lys Leu Pro Ser Gly Asp

805 810 815

Glu Lys Lys Asp Pro Tyr Ala Asp Leu Tyr Val Val Arg Trp Thr Pro

820 825 830

Leu Met Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser

835 840 845

Ala Val Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp Gly Glu Trp Thr His Trp Leu

850 855 860

Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His Leu

865 870 875 880

Tyr Pro Phe Ala Lys Gly Ile Leu Gly Lys His Gly Lys Thr Pro Val

885 890 895

Val Val Leu Val Trp Trp Ala Phe Thr Phe Val Ile Thr Ala Val Leu

900 905 910

Tyr Ile Asn Ile Pro His Met His Thr Ser Gly Gly Lys His Thr Thr

915 920 925

Val His Gly His His Gly Lys Lys Leu Val Asp Thr Gly Leu Tyr Gly

930 935 940

Trp Leu His

945

<210> 2

<211> 2844

<212> DNA

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 2

atggcgccag cggtggccgg agggggccgc gtgcggagca atgagccggt tgctgctgct 60

gccgccgcgc cggcggccag cggcaagccc tgcgtgtgcg gcttccaggt ttgcgcctgc 120

acggggtcgg ccgcggtggc ctccgccgcc tcgtcgctgg acatggacat cgtggccatg 180

gggcagatcg gcgccgtcaa cgacgagagc tgggtgggcg tggagctcgg cgaagatggc 240

gagaccgacg aaagcggtgc cgccgttgac gaccgccccg tattccgcac cgagaagatc 300

aagggtgtcc tcctccaccc ctaccgggtg ctgattttcg ttcgtctgat cgccttcacg 360

ctgttcgtga tctggcgtat ctcccacaag aacccagacg cgatgtggct gtgggtgaca 420

tccatctgcg gcgagttctg gttcggtttc tcgtggctgc tagatcagct gcccaagctg 480

aaccccatca accgcgtgcc ggacctggcg gtgctgcggc agcgcttcga ccgccccgac 540

ggcacctcca cgctcccggg gctggacatc ttcgtcacca cggccgaccc catcaaggag 600

cccatcctct ccaccgccaa ctcggtgctc tccatcctgg ccgccgacta ccccgtggac 660

cgcaacacat gctacgtctc cgacgacagt ggcatgctgc tcacctacga ggccctggca 720

gagtcctcca agttcgccac gctctgggtg cccttctgcc gcaagcacgg gatcgagccc 780

aggggtccgg agagctactt cgagctcaag tcacaccctt acatggggag agcccaggac 840

gagttcgtca acgaccgccg ccgcgttcgc aaggagtacg acgagttcaa ggccaggatc 900

aacagcctgg agcatgacat caagcagcgc aacgacgggt acaacgccgc cattgcccac 960

agccaaggcg tgccccggcc cacctggatg gcggacggca cccagtggga gggcacatgg 1020

gtcgacgcct ccgagaacca ccgcaggggc gaccacgccg gcatcgtact ggtgctgctg 1080

aaccacccga gccaccgccg gcagacgggc ccgccggcga gcgctgacaa cccactggac 1140

ttgagcggcg tggatgtgcg tctccccatg ctggtgtacg tgtcccgtga gaagcgcccc 1200

gggcacgacc accagaagaa ggccggtgcc atgaacgcgc ttacccgcgc ctcggcgctg 1260

ctctccaact cccccttcat cctcaacctc gactgcgatc attacatcaa caactcccag 1320

gcccttcgcg ccggcatctg cttcatggtg ggacgggaca gcgacacggt tgccttcgtc 1380

cagttcccgc agcgcttcga gggcgtcgac cccaccgacc tctacgccaa ccacaaccgc 1440

atcttcttcg acggcaccct ccgtgccctg gacggcatgc agggccccat ctacgtcggc 1500

actgggtgtc tcttccgccg catcaccgtc tacggcttcg acccgccgag gatcaacgtc 1560

ggcggtccct gcttccccag gctcgccggg ctcttcgcca agaccaagta cgagaagccc 1620

gggctcgaga tgaccacggc caaggccaag gccgcgcccg tgcccgccaa gggtaagcac 1680

ggcttcttgc cactgcccaa gaagacgtac ggcaagtcgg acgccttcgt ggacaccatc 1740

ccgcgcgcgt cgcacccgtc gccctacgcc gcggcggctg aggggatcgt ggccgacgag 1800

gcgaccatcg tcgaggcggt gaacgtgacg gccgccgcgt tcgagaagaa gaccggctgg 1860

ggcaaagaga tcggctgggt gtacgacacc gtcacggagg acgtggtcac cggctaccgg 1920

atgcatatca aggggtggcg gtcacgctac tgctccatct acccacacgc cttcatcggc 1980

accgccccca tcaacctcac ggagaggctc ttccaggtgc tccgctggtc cacgggatcc 2040

ctcgagatct tcttctccaa gaacaacccg ctcttcggca gcacatacct ccacccgctg 2100

cagcgcgtcg cctacatcaa catcaccact taccccttca ccgccatctt cctcatcttc 2160

tacaccaccg tgccggcgct atccttcgtc accggccact tcatcgtgca gcgcccgacc 2220

accatgttct acgtctacct gggcatcgtg ctatccacgc tgctcgtcat cgccgtgctg 2280

gaggtcaagt gggccggggt cacagtcttc gagtggttca ggaacggcca gttctggatg 2340

acagcaagtt gctccgccta cctcgccgcc gtctgccagg tgctgaccaa ggtgatattc 2400

cggcgggaca tctccttcaa gctcacatcc aagctaccct cgggagacga gaagaaggac 2460

ccctacgccg acctctacgt ggtgcgctgg acgccgctca tgattacacc catcatcatc 2520

atcttcgtca acatcatcgg atccgccgtg gccttcgcca aggttctcga cggcgagtgg 2580

acgcactggc tcaaggtcgc cggcggcgtc ttcttcaact tctgggtgct cttccacctc 2640

taccccttcg ccaagggcat cctggggaag cacggaaaga cgccagtcgt ggtgctcgtc 2700

tggtgggcat tcaccttcgt catcaccgcc gtgctctaca tcaacatccc ccacatgcat 2760

acctcgggag gcaagcacac aacggtgcat ggtcaccatg gcaagaagtt ggtcgacaca 2820

gggctctatg gctggctcca ttga 2844

<210> 3

<211> 947

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 3

Met Ala Pro Ala Val Ala Gly Gly Gly Arg Val Arg Ser Asn Glu Pro

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Gly Lys Pro Cys Val

20 25 30

Cys Gly Phe Gln Val Cys Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser

35 40 45

Ala Ala Ser Ser Leu Asp Met Asp Ile Val Ala Met Gly Gln Ile Gly

50 55 60

Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Val Gly Val Glu Leu Gly Glu Asp Gly

65 70 75 80

Glu Thr Asp Glu Ser Gly Ala Ala Val Asp Asp Arg Pro Val Phe Arg

85 90 95

Thr Glu Lys Ile Lys Gly Val Leu Leu His Pro Tyr Arg Val Leu Ile

100 105 110

Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile Trp Arg Ile Ser

115 120 125

His Lys Asn Pro Asp Ala Met Trp Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly

130 135 140

Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp Leu Leu Asp Gln Leu Pro Lys Leu

145 150 155 160

Asn Pro Ile Asn Arg Val Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Gln Arg Phe

165 170 175

Asp Arg Pro Asp Gly Thr Ser Thr Leu Pro Gly Leu Asp Ile Phe Val

180 185 190

Thr Thr Ala Asp Pro Ile Lys Glu Pro Ile Leu Ser Thr Ala Asn Ser

195 200 205

Val Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Asp Arg Asn Thr Cys

210 215 220

Tyr Val Ser Asp Asp Ser Gly Met Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Ser Ser Lys Phe Ala Thr Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His

245 250 255

Gly Ile Glu Pro Arg Gly Pro Glu Ser Tyr Phe Glu Leu Lys Ser His

260 265 270

Pro Tyr Met Gly Arg Ala Gln Asp Glu Phe Val Asn Asp Arg Arg Arg

275 280 285

Val Arg Lys Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Arg Ile Asn Ser Leu Glu

290 295 300

His Asp Ile Lys Gln Arg Asn Asp Gly Tyr Asn Ala Ala Ile Ala His

305 310 315 320

Ser Gln Gly Val Pro Arg Pro Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr Gln Trp

325 330 335

Glu Gly Thr Trp Val Asp Ala Ser Glu Asn His Arg Arg Gly Asp His

340 345 350

Ala Gly Ile Val Leu Val Leu Leu Asn His Pro Ser His Arg Arg Gln

355 360 365

Thr Gly Pro Pro Ala Ser Ala Asp Asn Pro Leu Asp Leu Ser Gly Val

370 375 380

Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro

385 390 395 400

Gly His Asp His Gln Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Thr Arg

405 410 415

Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asn Ser Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys

420 425 430

Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Gln Ala Leu Arg Ala Gly Ile Cys Phe

435 440 445

Met Val Gly Arg Asp Ser Asp Thr Val Ala Phe Val Gln Phe Pro Gln

450 455 460

Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Thr Asp Leu Tyr Ala Asn His Asn Arg

465 470 475 480

Ile Phe Phe Asp Gly Thr Leu Arg Ala Leu Asp Gly Met Gln Gly Pro

485 490 495

Ile Tyr Val Gly Thr Gly Cys Leu Phe Arg Arg Ile Thr Val Tyr Gly

500 505 510

Phe Asp Pro Pro Arg Ile Asn Val Gly Gly Pro Cys Phe Pro Arg Leu

515 520 525

Ala Gly Leu Phe Ala Lys Thr Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Leu Glu Met

530 535 540

Thr Thr Ala Lys Ala Lys Ala Ala Pro Val Pro Ala Lys Gly Lys His

545 550 555 560

Gly Phe Leu Pro Leu Pro Lys Lys Thr Tyr Gly Lys Ser Asp Ala Phe

565 570 575

Val Asp Thr Ile Pro Arg Ala Ser His Pro Ser Pro Tyr Thr Ala Ala

580 585 590

Ala Glu Gly Ile Val Ala Asp Glu Ala Thr Ile Val Glu Ala Val Asn

595 600 605

Val Thr Ala Ala Ala Phe Glu Lys Lys Thr Gly Trp Gly Lys Glu Ile

610 615 620

Gly Trp Val Tyr Asp Thr Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg

625 630 635 640

Met His Ile Lys Gly Trp Arg Ser Arg Tyr Cys Ser Ile Tyr Pro His

645 650 655

Ala Phe Ile Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Glu Arg Leu Phe Gln

660 665 670

Val Leu Arg Trp Ser Thr Gly Ser Leu Glu Ile Phe Phe Ser Lys Asn

675 680 685

Asn Pro Leu Phe Gly Ser Thr Tyr Leu His Pro Leu Gln Arg Val Ala

690 695 700

Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Phe Leu Ile Phe

705 710 715 720

Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val Thr Gly His Phe Ile Val

725 730 735

Gln Arg Pro Thr Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser

740 745 750

Thr Leu Leu Val Ile Ala Val Leu Glu Val Lys Trp Ala Gly Val Thr

755 760 765

Val Phe Glu Trp Phe Arg Asn Gly Gln Phe Trp Met Thr Ala Ser Cys

770 775 780

Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Cys Gln Val Leu Thr Lys Val Ile Phe

785 790 795 800

Arg Arg Asp Ile Ser Phe Lys Leu Thr Ser Lys Leu Pro Ser Gly Asp

805 810 815

Glu Lys Lys Asp Pro Tyr Ala Asp Leu Tyr Val Val Arg Trp Thr Pro

820 825 830

Leu Met Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser

835 840 845

Ala Val Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp Gly Glu Trp Thr His Trp Leu

850 855 860

Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His Leu

865 870 875 880

Tyr Pro Phe Ala Lys Gly Ile Leu Gly Lys His Gly Lys Thr Pro Val

885 890 895

Val Val Leu Val Trp Trp Ala Phe Thr Phe Val Ile Thr Ala Val Leu

900 905 910

Tyr Ile Asn Ile Pro His Met His Thr Ser Gly Gly Lys His Thr Thr

915 920 925

Val His Gly His His Gly Lys Lys Leu Val Asp Thr Gly Leu Tyr Gly

930 935 940

Trp Leu His

945

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tacacccatc atcatcatct 20

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

cgagaacctt ggcga 15

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 6

atcatcgaat ccgccg 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 7

catcatcgga tccgcc 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccgaccacca tgttct 16

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ggcgatgacg agcag 15

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 10

ctacctggac atcgtgc 17

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 11

ctacctgggc atcgtg 16

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

actgctccat ctacccac 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtatgtgctg ccgaagag 18

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 14

tgctccgctg atcca 15

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 15

tccgctggtc cacg 14

<210> 16

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

caccaccgtg ccg 13

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

catggtggtc gggc 14

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 18

cgtcaccgac cacttc 16

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 19

tcaccggcca cttca 15

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 20

Arg Val Leu Ile Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile

1 5 10 15

Trp Arg Ile Ser

20

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 21

Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp

1 5 10 15

Leu Leu Asp Gln Leu Pro

20

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 22

Leu Gln Arg Val Ala Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 23

Ala Ile Phe Leu Ile Phe Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val

1 5 10 15

Thr

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 24

Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Gly Ile Val Leu Ser Thr Leu Leu Val

1 5 10 15

Ile Ala

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 25

Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser Ala Val

1 5 10 15

Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp

20

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡肽片段

<400> 26

Leu Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His

1 5 10 15

Leu Tyr Pro Phe

20

<210> 27

<211> 947

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<400> 27

Met Ala Pro Ala Val Ala Gly Gly Gly Arg Val Arg Ser Asn Glu Pro

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Gly Lys Pro Cys Val

20 25 30

Cys Gly Phe Gln Val Cys Ala Cys Thr Gly Ser Ala Ala Val Ala Ser

35 40 45

Ala Ala Ser Ser Leu Asp Met Asp Ile Val Ala Met Gly Gln Ile Gly

50 55 60

Ala Val Asn Asp Glu Ser Trp Val Gly Val Glu Leu Gly Glu Asp Gly

65 70 75 80

Glu Thr Asp Glu Ser Gly Ala Ala Val Asp Asp Arg Pro Val Phe Arg

85 90 95

Thr Glu Lys Ile Lys Gly Val Leu Leu His Pro Tyr Arg Val Leu Ile

100 105 110

Phe Val Arg Leu Ile Ala Phe Thr Leu Phe Val Ile Trp Arg Ile Ser

115 120 125

His Lys Asn Pro Asp Ala Met Trp Leu Trp Val Thr Ser Ile Cys Gly

130 135 140

Glu Phe Trp Phe Gly Phe Ser Trp Leu Leu Asp Gln Leu Pro Lys Leu

145 150 155 160

Asn Pro Ile Asn Arg Val Pro Asp Leu Ala Val Leu Arg Gln Arg Phe

165 170 175

Asp Arg Pro Asp Gly Thr Ser Thr Leu Pro Gly Leu Asp Ile Phe Val

180 185 190

Thr Thr Ala Asp Pro Ile Lys Glu Pro Ile Leu Ser Thr Ala Asn Ser

195 200 205

Val Leu Ser Ile Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Val Asp Arg Asn Thr Cys

210 215 220

Tyr Val Ser Asp Asp Ser Gly Met Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Ser Ser Lys Phe Ala Thr Leu Trp Val Pro Phe Cys Arg Lys His

245 250 255

Gly Ile Glu Pro Arg Gly Pro Glu Ser Tyr Phe Glu Leu Lys Ser His

260 265 270

Pro Tyr Met Gly Arg Ala Gln Asp Glu Phe Val Asn Asp Arg Arg Arg

275 280 285

Val Arg Lys Glu Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Arg Ile Asn Ser Leu Glu

290 295 300

His Asp Ile Lys Gln Arg Asn Asp Gly Tyr Asn Ala Ala Ile Ala His

305 310 315 320

Ser Gln Gly Val Pro Arg Pro Thr Trp Met Ala Asp Gly Thr Gln Trp

325 330 335

Glu Gly Thr Trp Val Asp Ala Ser Glu Asn His Arg Arg Gly Asp His

340 345 350

Ala Gly Ile Val Leu Val Leu Leu Asn His Pro Ser His Arg Arg Gln

355 360 365

Thr Gly Pro Pro Ala Ser Ala Asp Asn Pro Leu Asp Leu Ser Gly Val

370 375 380

Asp Val Arg Leu Pro Met Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro

385 390 395 400

Gly His Asp His Gln Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Thr Arg

405 410 415

Ala Ser Ala Leu Leu Ser Asn Ser Pro Phe Ile Leu Asn Leu Asp Cys

420 425 430

Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Gln Ala Leu Arg Ala Gly Ile Cys Phe

435 440 445

Met Val Gly Arg Asp Ser Asp Thr Val Ala Phe Val Gln Phe Pro Gln

450 455 460

Arg Phe Glu Gly Val Asp Pro Thr Asp Leu Tyr Ala Asn His Asn Arg

465 470 475 480

Ile Phe Phe Asp Gly Thr Leu Arg Ala Leu Asp Gly Met Gln Gly Pro

485 490 495

Ile Tyr Val Gly Thr Gly Cys Leu Phe Arg Arg Ile Thr Val Tyr Gly

500 505 510

Phe Asp Pro Pro Arg Ile Asn Val Gly Gly Pro Cys Phe Pro Arg Leu

515 520 525

Ala Gly Leu Phe Ala Lys Thr Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Leu Glu Met

530 535 540

Thr Thr Ala Lys Ala Lys Ala Ala Pro Val Pro Ala Lys Gly Lys His

545 550 555 560

Gly Phe Leu Pro Leu Pro Lys Lys Thr Tyr Gly Lys Ser Asp Ala Phe

565 570 575

Val Asp Thr Ile Pro Arg Ala Ser His Pro Ser Pro Tyr Ala Ala Ala

580 585 590

Ala Glu Gly Ile Val Ala Asp Glu Ala Thr Ile Val Glu Ala Val Asn

595 600 605

Val Thr Ala Ala Ala Phe Glu Lys Lys Thr Gly Trp Gly Lys Glu Ile

610 615 620

Gly Trp Val Tyr Asp Thr Val Thr Glu Asp Val Val Thr Gly Tyr Arg

625 630 635 640

Met His Ile Lys Gly Trp Arg Ser Arg Tyr Cys Ser Ile Tyr Pro His

645 650 655

Ala Phe Ile Gly Thr Ala Pro Ile Asn Leu Thr Glu Arg Leu Phe Gln

660 665 670

Val Leu Arg Trp Ser Thr Gly Ser Leu Glu Ile Phe Phe Ser Lys Asn

675 680 685

Asn Pro Leu Phe Gly Ser Thr Tyr Leu His Pro Leu Gln Arg Val Ala

690 695 700

Tyr Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Phe Leu Ile Phe

705 710 715 720

Tyr Thr Thr Val Pro Ala Leu Ser Phe Val Thr Gly His Phe Ile Val

725 730 735

Gln Arg Pro Thr Thr Met Phe Tyr Val Tyr Leu Asp Ile Val Leu Ser

740 745 750

Thr Leu Leu Val Ile Ala Val Leu Glu Val Lys Trp Ala Gly Val Thr

755 760 765

Val Phe Glu Trp Phe Arg Asn Gly Gln Phe Trp Met Thr Ala Ser Cys

770 775 780

Ser Ala Tyr Leu Ala Ala Val Cys Gln Val Leu Thr Lys Val Ile Phe

785 790 795 800

Arg Arg Asp Ile Ser Phe Lys Leu Thr Ser Lys Leu Pro Ser Gly Asp

805 810 815

Glu Lys Lys Asp Pro Tyr Ala Asp Leu Tyr Val Val Arg Trp Thr Pro

820 825 830

Leu Met Ile Thr Pro Ile Ile Ile Ile Phe Val Asn Ile Ile Gly Ser

835 840 845

Ala Val Ala Phe Ala Lys Val Leu Asp Gly Glu Trp Thr His Trp Leu

850 855 860

Lys Val Ala Gly Gly Val Phe Phe Asn Phe Trp Val Leu Phe His Leu

865 870 875 880

Tyr Pro Phe Ala Lys Gly Ile Leu Gly Lys His Gly Lys Thr Pro Val

885 890 895

Val Val Leu Val Trp Trp Ala Phe Thr Phe Val Ile Thr Ala Val Leu

900 905 910

Tyr Ile Asn Ile Pro His Met His Thr Ser Gly Gly Lys His Thr Thr

915 920 925

Val His Gly His His Gly Lys Lys Leu Val Asp Thr Gly Leu Tyr Gly

930 935 940

Trp Leu His

945

PCT/RO/134表

Claims

1.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物的籽粒具有降低的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量，并且其中所述大麦植物在CslF6基因中携带突变，其中所述突变的CslF6基因编码突变体CslF6多肽，其中所述突变体CslF6是SEQ ID NO:1的CslF6，除了突变体CslF6在CslF6的膜定位结构域中包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸或将极性氨基酸取代为非极性氨基酸，其中膜定位结构域选自由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸835至857或氨基酸700至731或氨基酸741至758组成的CslF6的膜定位结构域组成的组。

2.根据权利要求1所述的大麦植物，其中所述大麦植物的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量范围为总籽粒干重的1至5％，例如总籽粒干重的1.3至3％，优选总籽粒干重的1.3至2％。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的(1,3；1,4)-β-葡聚糖的含量为携带野生型CslF6基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物的(1,3；1,4)-β-葡聚糖含量的至少30％且至多60％，优选至少40％且至多60％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸835至857组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸的取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸847的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为谷氨酸(E)。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率至多为2.5，例如至多为2.1，例如在1.0至2.1的范围内。

7.根据前述权利要求任一项中所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含谷粒，所述谷粒的脱粒后的破碎谷粒频率比在CslF6基因中不携带突变但其他方面具有相同基因型的大麦植物的谷粒脱粒后的破碎谷粒频率高至多2倍。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸741至758组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将非极性氨基酸取代为带电荷的氨基酸。

9.根据权利要求1至3和8中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸748的取代，其中所述取代是将甘氨酸(G)取代为天冬氨酸(D)。

10.根据权利要求1至3和8至9中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3∶DP4比率为2.5至4。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6在由CslF6的氨基酸700至731组成的跨膜结构域中包含一个氨基酸取代，其中所述取代是将极性氨基酸取代为非极性氨基酸。

12.根据权利要求1至3和11中任一项所述的大麦植物，其中所述突变体CslF6多肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的CslF6，除了突变体CslF6包含氨基酸709的取代，其中所述取代是将苏氨酸(T)取代为异亮氨酸(I)。

13.根据权利要求1至3和11至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的籽粒的DP3:DP4比率为至少3.5，例如至少4.0，例如至少4.5，例如在4到6的范围内。

14.根据前述权利要求中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在一个或多个其它基因中包含突变，例如以下突变中的一个或多个：

a.编码LOX-1的基因中的突变，导致功能性LOX-1的完全丧失

b.编码LOX-2的基因中的突变，导致功能性LOX-2的完全丧失

c.编码MMT的基因中的突变，导致功能性MMT的完全丧失。

15.一种植物产品，其选自由绿麦芽、窑烤干麦芽、麦芽汁和饮料组成的组，其中所述植物产品由权利要求1至14中任一项所述的大麦植物或其部分制备。

16.一种生产水提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供权利要求1至14中任一项所述的大麦植物的籽粒；

b.使所述大麦籽粒经历萌发步骤，从而获得萌发的籽粒，其中所述萌发步骤包括将所述籽粒在水溶液中孵育最多72小时；

c.精细分割所述萌发的籽粒，同时所述萌发的籽粒的含水量为至少20％，条件是所述大麦籽粒在萌发后直至精细分割萌发籽粒的任何时候含水量均不低于20％；

d.制备所述磨碎的萌发籽粒的水提取物，从而产生大麦的水提取物。

17.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：

a.制备权利要求1-14中任一项所述的大麦植物的籽粒的和/或权利要求15所述的麦芽的水提取物；或通过权利要求16所述的方法制备水提取物

c.将所述水提取物加工成饮料。