BR112020012149A2

BR112020012149A2 - aditivo e composição para a água

Info

Publication number: BR112020012149A2
Application number: BR112020012149-5A
Authority: BR
Inventors: Leigh-Ann HASSELBACH
Original assignee: Integene (Pty) Limited
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2020-11-24
Also published as: CN111669975A; WO2019123233A1; AR114296A1; AU2018389776A1; WO2019123233A8; JP2021506340A; RU2020123362A; US11882853B2; US20200315216A1; RU2020123362A3; JP7354135B2; MX2020007211A; CA3085689A1; EP3731648A1; AU2018389776B2

Abstract

A presente invenção refere-se a um suplemento alimentar para adição à água potável, para melhorar a saúde dos animais. O suplemento alimentar inclui ácidos graxos de cadeia curta, um composto nitrogenado, uma fonte de inositol e uma fonte de xilanase. O suplemento alimentar reduz a necessidade de insumos farmacêuticos e aumenta a saúde e o rendimento do animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ADITIVO E COMPOSIÇÃO PARA A ÁGUA”.

CAMPO DE APLICAÇÃO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um aditivo para água para adição à água potável, e mais especificamente a um suplemento alimentício para adição à água potável contendo componentes nutritivos e microbiológicos, para melhorar a saúde animal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Animais de fazenda criados em sistemas extensivos sofrem de uma série de problemas, principalmente relacionados à densidade em que são criados, o que pode afetar sua saúde e o rendimento global. O primeiro é a doença, que se espalha rapidamente entre animais confinados (e frequentemente altamente homogêneos geneticamente) e pode induzir mortalidade e perda de rendimento. A segunda questão principal está relacionada com a composição e processamento de rações para animais, que geralmente carecem de micronutrientes essenciais necessários para uma saúde ideal. A terceira questão é o meio ambiente, que muitas vezes limita o movimento do animal e induz ao estresse devido à superpopulação e/ou a falta de interação social apropriada das espécies. Esse estresse junto com outros fatores de estresse ambiental tal como a elevação da temperatura global leva a um aumento acentuado de marcadores inflamatórios que afetam a produção de fatores de desempenho necessários para manter a agricultura.

[003] As abordagens tradicionais, como conhecidas na técnica, se concentram em minimizar esses problemas de maneira fragmentada. O uso generalizado de antibióticos entre os agricultores (geralmente em doses baixas devido ao seu efeito estimulador sobre o crescimento) tem levado a uma ampla resistência a antibióticos entre as bactérias patogênicas comuns, assim como a uma pressão crescente de desconfiança do público sobre os possíveis efeitos subsequentes que podem estar associados ao consumo permanente de quantidades residuais desses produtos químicos na carne em uma base contínua.

[004] Um exemplo bem estudado e economicamente importante dessas questões pode ser encontrado nos sistemas utilizados para a criação extensiva de frangos de corte. no presente documento, as exigências de economias de escala resultaram em sistemas agrícolas extensivos, que dependem muito de intervenção farmacêutica (principalmente antibióticos) e mecanização para melhorar a saúde e o rendimento de animais densamente confinados, criados com alimentos que minimizam os custos, cuidadosamente formulados com atenção aos requisitos de nutrientes. O tamanho e a natureza onipresente da indústria levaram a margens cada vez menores para os produtores que vendem seus produtos em um mercado lotado. Isso agravou a tendência em direção a sistemas cada vez maiores e mais intensivos e fez com que as questões de controle de doenças e rendimento acessível aumentassem cada vez mais.

[005] Um aspecto das questões acima mencionadas, que apenas recentemente se tornou aparente, é o papel da microflora intestinal no controle de microrganismos patogênicos, na absorção de nutrientes e na saúde geral dos animais. Mesmo na saúde humana, a microflora intestinal se tornou amplamente aceita como um componente essencial de uma série de questões relacionadas à saúde do hospedeiro e como uma lacuna pouco compreendida em nosso conhecimento médico. A microflora de outros animais, que se presume ser tão importante quanto aquela dos humanos, permanece ainda menos compreendida. A comunicação metabólica entre as espécies dentro do intestino está, no entanto, implicada na redução da inflamação, estresse térmico e no aumento de anticorpos em animais de criação.

[006] Os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) são os produtos finais primário da fermentação de carboidratos não digeríveis (NDCs) que se tornam disponíveis para a microbiota intestinal (Morrison e Preston, 2016). SCFAs são tipicamente produzidos através da fermentação sacarolítica de carboidratos que escapam da digestão e da absorção no trato intestinal. Os principais produtos são formato, acetato, propionato e butirato (Morrison e Preston, 2016).

[007] Ácidos carboxílicos orgânicos são ácidos da estrutura geral R-COOH que incluem ácidos graxos e aminoácidos. Eles são comumente identificados usando seus nomes triviais e geralmente têm o sufixo ácido -ico. O ânion carboxilato (R-COO-) geralmente é nomeado com o sufixo -ato. Os ácidos carboxílicos conhecidos na técnica incluem ácido carbônico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido valérico, ácido caproico, ácido enântico, ácido caprílico, ácido pelargônico, ácido cáprico, ácido undecílico, ácido laurico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácido pentadecílico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido nonadecílico e ácido araquídico.

[008] Nas espécies avícolas, as bactérias mais comuns que afetam a saúde intestinal das aves são Salmonella, Camphylobacter e E. coli. É sabido que essas espécies são controladas com bactérias benéficas da luz intestinal, especialmente Lactobacillus. no presente documento é sabido que os efeitos de SCFA carboxílico produzido por essas bactérias sobre bactérias intestinais negativas, tal como é mencionado, podem ter um efeito muito benéfico nas aves. SCFAs reduzem os níveis de patógenos na cultura/proventrículo; regulam a flora intestinal, aumentam a digestão dos alimentos para melhorar o desempenho.

[009] O papel do formato no intestino está ligado à metanogênese e parece estar naturalmente elevado em condições inflamatórias, implicando seu papel na redução da inflamação.

[0010] Os SCFA orgânicos são de natureza antimicrobiana e são conhecidos por afetar predominantemente as bactérias Gram- negativas. É sabido que os SCFAs são produzidos naturalmente por micróbios intestinais Gram-positivos. É sabido ainda que os SCFAs exercem uma ampla influência sobre a fisiologia do hospedeiro através de funções nutricionais, regulatórias e imunomoduladoras e também podem afetar a aptidão bacteriana como forma de estresse ácido (Sun e O'Riordan, 2013). O ácido fórmico e os formatos são conhecidos por aumentar as estruturas e o comprimento das vilosidades endoteliais das aves. O aumento da altura das vilosidades de diferentes segmentos do intestino delgado pode ser atribuído ao papel do epitélio intestinal como barreira natural contra bactérias patogênicas e substâncias tóxicas.

[0011] A utilização de enzimas como suplementos alimentares é conhecida na técnica como uma das estratégias usadas para melhorar o valor alimentar de alimentos indigestos em aves domésticas. Enzimas exógenas tais como a endo-1,4 β Xilanase (EC. 3.2.1 .8), que pertence às hemicelulases e geralmente são incorporadas em dietas à base de trigo para aves para degradar os arabinoxilanos anti-nutricionais (AX) e as frações de xilano de trigo, o que pode consequentemente melhorar a absorção de nutrientes e o crescimento de aves (Vandeplas et, al. 2009).

[0012] O inositol é um açúcar de seis carbonos, um isômero de glicose e um poliol carbocíclico presente em muitos compostos biológicos como o fosfatidilinositol (Rucker et aI, 2008) (Sosenko e Bancalari, 2012) (Corrado e Santamaria, 2015). O mio-lnositol, uma forma de inositol, está abundantemente presente nas plantas em formas que contêm fósforo - tipicamente como ácido fítico ou inositolhexafosfato (IP6). Muitas espécies de frangos, especialmente frangos de corte, são incapazes de recuperar o ácido fítico de plantas ou de fontes vegetais devido à falta da enzima digestiva, fitase, necessária para remover os grupos fosfato. A adição de enzimas, tal como a fitase (Klopfenstein, et al, 2002), é conhecida na técnica. No entanto, o modo de ação da fitase reduz o IP6 para inositolpenta (IP5), tetra- (IP4) e trifosfato (IP3) (também conhecido como fitatos). Isto é diferente para a estrutura isomérica de mio-inositol, que é livre de fosfato.

[0013] A forma mais proeminente de inositol (C6H12O6) é o mio- inositol e já foi considerada um membro do complexo de vitamina B (denominada vitamina B8). O mio-inositol é um componente da membrana plasmática e representa um papel fundamental em muitos processos biológicos, incluindo sinalização intracelular, controle da concentração intracelular de cálcio e manutenção do potencial da membrana celular. A combinação de enzimas digestivas para ração e doses elevadas de mio-inositol é conhecida na técnica por influenciar a expressão gênica e/ou comunidades microbianas em aves domésticas. O mio-inositol também é conhecido por desempenhar um papel no controle dos níveis de cortisol e corticosterona em aves.

[0014] As substâncias secretadas por patógenos são conhecidas por causar distúrbios na absorção de nutrientes pelo organismo do hospedeiro. Consequentemente, a diminuição da concentração dessas substâncias no intestino é conhecida por levar ao aumento da digestibilidade dos nutrientes; modificar o metabolismo e diminuir os processos inflamatórios crônicos de grau baixo na mucosa intestinal. A inflamação crônica em aves (denominada “queimação intestinal”) é amplamente conhecida na arte e contribui para baixos efeitos nutritivos de alimentos não digeríveis, tais como o ácido fítico e arabinoxilanos. Também é conhecido por levar a um crescimento excessivo de bactérias patogênicas no intestino, as quais contribuem para o aumento da suscetibilidade a doenças.

[0015] As espécies de Lactobacillus são conhecidas na técnica por serem componentes importantes de microbiomas intestinais saudáveis.

Em particular, Lactobacillus plantarum (L. plantarum), diferentemente de outros anaeróbios estritos, é aerotolerante. Esses organismos não possuem a enzima catalase, mas quase sempre têm superóxido dismutase. L. plantarum por natureza é capaz de controlar a flora patogênica negativa do trato gastrointestinal através da morte dependente de oxigênio de patógenos (Prescott et al, 2002). Estes incluem anaeróbios tais como Mycobacterium spp., Escherichia coli (E. coli.), Listeria spp., Clostridium spp. e Enterobacteriaceae incluindo Salmonella spp. (Prescott et al., 2002). De acordo com Vandeplas et. al, 2009, o probiótico L plantarum combinado com as enzimas xilanase têm a capacidade de reduzir os efeitos de Salmonella typhimurium através do processo de exclusão competitiva pela adição em rações para animais.

[0016] WO2010/117255 descreve uma formulação de aditivo alimentício ou suplemento alimentício obtida a partir de mais de uma cepa de bactérias do ácido láctico. Este suplemento é usado para alimentar animais monogástricos. As bactérias de ácido láctico reivindicadas são selecionadas do grupo que compreende Lactobacillus plantarum. Este pedido de patente reivindica ainda uma ração animal, que inclui nutrientes, bacteriocinas, vitamina (sic), ácidos orgânicos ou combinações dos mesmos. A vitamina reivindicada pode incluir vitamina B, enquanto que os ácidos orgânicos reivindicados podem incluir ácido fórmico, ácido acético e ácido lático. Deve ser observado no presente documento que a vitamina B e os constituintes do ácido orgânico, embora reivindicados, não foram demonstrados. As alterações demonstradas nas bactérias do ácido lático fecal e na contagem de Enterobacteriaceae a morfologia do intestino delgado e a concentração de VFA fecal são então claramente um produto da combinação de cepas bacterianas específicas do ácido láctico reivindicadas.

[0017] Similarmente ao pedido de patente mencionado acima;

Thahn et al. descrevem o uso de metabolitos de Lactobacillus (produzidos como resultado da suplementação alimentar com combinações de cepas específicas de Lactobacillus) para melhorar a saúde intestinal em aves domésticas. Isto demonstra novamente os benefícios conhecidos da suplementação com probióticos na ração na melhoria da conversão alimentar em animais monogástricos. Como no pedido de patente acima mencionado, os ácidos orgânicos medidos pela concentração fecal de VFA (isto é, VFAs excretados) são usados como um marcador de proximidade da composição da microflora do intestino e nenhuma tentativa é feita para medir diretamente o efeito da concentração de suplementação de VFA (isto é: VFAs consumidos) na saúde intestinal, nem quantificar os efeitos sinérgicos de probióticos e intervenções nutricionais diretamente alimentadas.

[0018] Dado o exposto, é claro que existe uma necessidade atual de um aditivo ou suplemento não farmacológico que melhore o rendimento e a saúde de animais de fazenda (especificamente aves domésticas) e reduza o uso de antibióticos.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0019] Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer um suplemento alimentar para animais que reduza a necessidade de insumos farmacêuticos e forneça benefícios à saúde e ao rendimento dos animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um suplemento alimentar para adição à água potável, incluindo:

[0021] - ácidos graxos de cadeia curta

[0022] - um composto nitrogenado;

[0023] - uma fonte de inositol; e

[0024] - uma fonte de xilanase,

[0025] em que os ácidos graxos de cadeia curta são selecionados do grupo que compreende ácido fórmico, ácido propiônico e ácido butírico em qualquer combinação, o composto nitrogenado é selecionado do grupo que compreende amônia e propionato de amônia, em qualquer combinação, a fonte de inositol é o mio-inositol e a fonte de xilanase é selecionada do grupo que compreende Lactobacillus plantarum e xilanase isolada, em qualquer combinação.

[0026] Aqui a xilanase isolada seria preferivelmente do tipo resistente ao pH, como conhecida na técnica.

[0027] Em uma modalidade da invenção, o suplemento alimentar pode ainda incluir ácido lático.

[0028] Em uma modalidade da invenção, o suplemento alimentar pode incluir ainda ácidos graxos de cadeia média. Em uma modalidade preferida da invenção, os ácidos gordos de cadeia média podem incluir ácido láurico e ácido palmítico.

[0029] Em uma modalidade da invenção, o suplemento alimentar pode ainda incluir bactérias selecionadas do grupo que compreende Lactobacillus spp., Propionibacterium spp. e Bacillus spp., em qualquer combinação.

[0030] Em uma modalidade da invenção, o suplemento alimentar pode incluir ainda uma fonte de magnésio. Em uma modalidade preferida, a fonte de magnésio pode ser o bisglicinato de magnésio.

[0031] Em uma modalidade da invenção, o suplemento alimentar pode ser adicionado à água potável para consumo pelos animais de criação. Em uma modalidade preferida, os animais de criação podem ser animais monogástricos. Em uma outra modalidade preferida, os animais monogástricos podem ser peixes. Em uma modalidade alternativa, os animais monogástricos podem ser aves. Em uma modalidade alternativa preferida, as aves podem ser galinhas.

[0032] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um suplemento alimentar para adição à água potável para consumo pelas aves, o suplemento alimentar compreendendo:

[0033] - entre 30% e 50% em peso de ácido propiônico;

[0034] - entre 5% e 30% em peso de ácido lático;

[0035] - entre 1% e 15% em peso de ácido fórmico;

[0036] - entre 5% e 15% em peso de amônia;

[0037] - entre 10% e 15% em peso de propionato de amônia;

[0038] - entre 0,1% e 1% em peso de magnésio;

[0039] - entre 0,5% e 3% em peso de ácido cítrico;

[0040] - entre 0,5% e 15% em peso de mio-inositol;

[0041] - entre 1% e 10% em peso de cultura de Lactobacillus plantarum; e

[0042] - entre 0,5% e 6% em peso de xilanase.

[0043] Estes e outros objetivos, características e vantagens da invenção ficarão evidentes para aqueles versados na técnica após a descrição detalhada da invenção.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO

[0044] Um exemplo não limitante de uma modalidade preferida da invenção é descrito em mais detalhes abaixo. Exemplos Formulação e mistura de teste

[0045] Para produzir um suplemento alimentar de acordo com uma modalidade da invenção, 10 a 24% de ácido lático (ácido l-lático CAS 79-33-4), 35 a 50% de ácido propiônico (ácido propiônico puro CAS 79- 09-4) e ácido fórmico 2,5 a 9,9% (CAS 64-18-6) foram combinados e neutralizados com amônia (como hidróxido de amônia grau CP), conforme necessário para tamponar a solução e ajustar o pH inicial para 3,2 a 4,2.

[0046] Todos os produtos químicos foram comprados de fontes comerciais locais e globais.

[0047] Os ácidos carboxílicos são ácidos de Brønsted-Lowry porque são doadores de prótons (H+). Eles são o tipo mais comum de ácido orgânico. Os ácidos carboxílicos são tipicamente ácidos fracos, o que significa que eles se dissociam apenas parcialmente em cátions H+ e ânions RCOO- em solução aquosa neutra. Por exemplo, em temperatura ambiente, em uma solução 1 molar de ácido acético, apenas 0,4% das moléculas de ácido são dissociadas. pKa foi introduzido como um índice para expressar a acidez dos ácidos fracos, onde pKa é definido da seguinte forma: pKa = log10 Ka

[0048] O princípio acima foi usado, com valores variáveis de pKa de 3,86, 4,87 e 3,75 sendo aplicados para ácido lático, propiônico e fórmico, respectivamente a 25°C. Volumes de cada ácido foram então adicionados de acordo com a seguinte fórmula para concentração final para produzir uma solução de 1 L a 1 M e ajustada em água.

[0049] - entre 40% e 50% em peso de ácido propiônico;

[0050] - entre 15% e 30% em peso de ácido lático; e

[0051] - entre 1% e 15% em peso de ácido fórmico.

[0052] A solução foi então titulada com íons de amônio (NH4+) como NH4OH (solução de hidróxido de amônio) para fornecer entre 5% e 15% de amônia em volume uma vez na concentração final.

[0053] O pH da composição final da base desta mistura de bases SCFA era de 3,2 a 4,2.

[0054] A mistura de suplemento alimentar básico, uma vez preparada, foi então alterada pela adição de outros compostos. Estes eram magnésio (como bisglicinato de magnésio) (quelato de aminoácido de magnésio totalmente reagido), inositol (como mio- inositol) e ácido cítrico. O produto foi adquirido localmente através de fontes comerciais.

[0055] A concentração final dos ingredientes acima era a seguinte:

[0056] - entre 0,1% e 1% em peso de magnésio;

[0057] - entre 0,5% e 3% em peso de ácido cítrico; e

[0058] - entre 0,5% e 15% em peso de mio-inositol.

[0059] Esta modalidade da invenção incluiu apenas L. plantarum como probiótico. A cepa probiótica utilizada foi adquirida comercialmente. O probiótico foi adicionado na forma líquida em uma concentração final entre 1% e 10% em peso, com xilanase adicionada como uma concentração entre 0,5% e 6% em peso. As cepas utilizadas foram a cepa de Lactobacillus plantarum da CWBI Germany Belgium. Entretanto, L. plantarum ATCC 1804 também foi testado com sucesso, juntamente com cepas de queijo de leite de vaca caseiro, queijo de leite de ovelha e soro de leite obtidos de laticínios locais. Devido à sua natureza aerotolerante, L. plantarum não foi afetado negativamente pelo transporte através de uma linha de água.

[0060] Todas as cepas foram mantidas a -80°C em um caldo de glicerol 30%. Os pós secos também podem ser obtidos por fermentação bacteriana em caldos de cultura relevantes, como conhecido na técnica. Esta modalidade da invenção utilizou o caldo MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) obtido de fornecedores globais relevantes. A fermentação ocorreu por 24h a 37°C. As culturas foram centrifugadas a 8000 rpm por 30 min a 4°C (7BZ-Neo 1600-001). Antes do uso, a viabilidade e as propriedades bioquímicas das contagens de células foram determinadas por API.

[0061] Uma vez preparado até a concentração final, o suplemento alimentar foi adicionado à água potável para aves. A dosagem foi alcançada por um sistema automatizado na fazenda ou manualmente através de tanques suspensos, que descarregam diretamente na água potável, de modo a aumentar a biodisponibilidade. Amostras de água foram coletadas regularmente para serem medidas quanto ao pH.

[0062] Os resultados de testes de alimentação em frangos de corte foram determinados para tratamento versus antibióticos e outras intervenções de tratamento. Ross 308 e Cobb 500 como aves nascidas, criadas para a produção de frangos de corte, foram usados nos ensaios. Contagens % Salmonella spp Tratamento Controle Contagem Detectada 1% 2% Contagem Não Detectada 99% 98% E.coli Percentual de diferença: Melhora com Tratamento 69,81% sobre o Controle A Tabela 1 mostra um sumário dos resultados.

[0063] Tabela 1: Resultados de dados de eficácia microbiana tradicionais para ensaios em fazendas realizados para tratamento e controle de frangos comerciais Ross 308 e Cobb 500 agrupados por tratamento e controle

[0064] Os grupos de tratamento tiveram melhor desempenho de eficácia do que os grupos tratados com antibióticos para Salmonella spp. e para E.coli spp. Grupos experimentais foram criados em alojamentos separadas, com uma capacidade de ~ 20.000 a ~ 46.000 por alojamento. Nada foi encontrado em aves controle e tratadas em relação a detecção de Camphylobacter e Clostridium perfrigens spp.

[0065] A iluminação era mantida constantemente em ambos os alojamentos de tratamento e controle. Todas os alojamentos de controle e tratamento receberam ração e água ad libitum.

[0066] Os alojamentos de tratamento foram tipicamente tratados com a mistura nos dias 1-4, dias 8-10, dias 18-24 e dias 28-32 do teste. O tratamento pode ser prolongado por ciclos superiores a 33 dias. Em média, os alojamentos de controle receberam tratamentos para os dias 1-4 e sempre que necessário, conforme prescrito. Todos os ciclos na fazenda foram testados durante um período de 24 meses.

[0067] O tratamento mostrou melhorias de 69,81% quanto a eficácia em relação a E.coli spp de acordo com o método ISO4832:2007 e teve melhor desempenho nos grupos de tratamento para eficácia em relação a Salmonella spp., de acordo com o método ISO6579:2003, conforme mostrado na Tabela 1.

[0068] Surpreendentemente, foi verificado que o suplemento alimentar encoraja o crescimento de bactérias intestinais de Lactobacillus e diminui ou elimina leveduras e mofos (medidos em amostras fecais), como é verificado pela análise 16S Metagenômica, o que impede simultaneamente o crescimento de flora intestinal negativa, tal como Salmonella spp, E. coli. e Clostridia spp. Um grande percentual de detecção de espécies desconhecidas permite o cultivo de novas espécies bacterianas. Surpreendentemente, foi verificado ainda que os alojamentos tratados mostraram Taxas de Conversão Alimentar (Feed Conversion Ratios, FCR) substancialmente diminuídas e padrões mais altos de Fator de Eficiência de Produção (Production Efficiency Factor, PFE) (Tabela 2). As taxas de mortalidade mostram uma melhora de 0,8% em comparação com os alojamentos de controle, o que significa que o tratamento tem um desempenho tão eficaz quanto a intervenção farmacêutica. Tratamento vs Controle No. de aves colocadas por alojamento 20.000 - 46.000 Raça da ave Cobb500, Ross 308 Idade do bando de aves (em semanas) 27 - 68 Destaques principais dos resultados do experimento (todas as melhorias) Diferenças nas Mortalidades % 0,80% Taxa de Conversão Alimentar 2,30% Fator de Eficiência de Produção 0,26%

[0069] Tabela 2: Sumário dos resultados consolidados na fazenda comparando os grupos de tratamento e controle para frangos comerciais. Os experimentos foram conduzidos durante um período de 2 anos em fazendas comerciais em tempo real. Os antibióticos foram efetivamente substituídos pelo tratamento e aperfeiçoamentos nas principais medidas foram observados nos grupos de tratamento.

[0070] Análise dos Dados Metagenômicos 16S Bacterianos

Metodologia

[0071] Amostras de fezes, de alojamentos de frangos comerciais de controle e de tratamento, abrigando ~ 40.000 aves cada, foram coletadas aleatoriamente e colocadas em tubos de coleta estéreis (100 g).

[0072] As amostras foram transportadas a 5°C e foram imediatamente colocadas em tubos de coleta Zymo Research RNA/DNA Shield™. As amostras coletadas estavam então prontas para as análises microbiômicas sensíveis a jusante.

[0073] As amostras foram enviadas para um fornecedor comercial de serviços NGS e o DNA genômico foi extraído usando o kit ZymoBIOMICS. Resumidamente, as amostras de DNA genômico foram amplificadas por PCR usando um par de iniciadores universais (341 F e 785R – que atingem V3 e V4 do gene 16S rRNA). Os amplicons resultantes foram purificados em gel, reparados nas extremidades e a sequência adaptadora específica da Illumina foi ligada a cada amplicon.

[0074] Após a quantificação do DNA, as amostras foram indexadas individualmente e outra etapa de purificação com base em esferas foi realizada. Os amplicons foram então sequenciados na plataforma MiSeq da lllumina, usando um kit MiSeq v3 (600 ciclos). 20Mb de dados (leituras finais pareadas com 2x300bp de comprimento) foram produzidos para cada amostra. A análise de dados baseada em BLAST foi realizada usando o sistema de análise de dados desenvolvido internamente pelo laboratório.

[0075] Para cada amostra, os dados foram cortados e apenas leituras > q20 (isto é, de alta qualidade) foram utilizadas. Cada leitura foi analisada por BLAST e o arquivo de resultados salvo. A maior pontuação para cada resultado de BLAST (isto é, nome do gênero e da espécie) foi contada e foi mantido um registro de quantas vezes cada espécie apareceu como uma ocorrência. A contagem de leituras é o número de leituras que combinam com o organismo correspondente na Coluna 1 (nome do organismo/Nome da Ocorrência). Se no caso em que nenhum resultado de BLAST foi encontrado para uma leitura específica, registramos essa contagem de leitura em 'Sem ocorrências'. A informação de taxa para cada ocorrência de BLAST foi registrada.

[0076] Dois protocolos de tratamento foram seguidos para avaliar o impacto da presente invenção no metagenoma do microbioma. Estes são descritos abaixo:

[0077] – Tratamento 1: Dias 1 - 5: 4L:1000 L, Dias 18 - 20: 4L:1000L, Dias 25 - 27: 8L/1000L, Dias 30 - 31: 10L/1000L

[0078] – Tratamento 2: Dias 1 - 4: 1L:1000 L, Dias 21 – 24: 2L:1000L

[0079] – Controle: Tratamento com antibiótico: Dia 1 – 4 Resultados

[0080] Os resultados de 16S RNA mostraram um aumento acentuado em Firmicutes, 53,73% para o Tratamento 1 e 42,27% para o Tratamento 2, para ambos os protocolos de tratamento e uma diminuição acentuada em Actinobacteria e Bacteroidetes, quando comparados ao controle com 2,47% (Tabela 3). A proporção entre Firmicutes / Bacteroidetes (F/B) é importante, pois os Firmicutes são mais eficazes como fonte de energia que os Bacteroidetes, promovendo uma absorção mais eficiente de calorias e subsequente ganho de peso (Krajmalnik-Brown R, et al, 2012).

[0081] Foi demonstrado ainda que Firmicutes quando dominantes enriquecem genes conhecidos por estarem associados ao transporte de nutrientes e ganho de peso global, enquanto que uma maior abundância relativa de Actinobacteria e Bacteroidetes e um enriquecimento de genes ligados ao metabolismo de carboidratos foi encontrada em microbiomas de fenótipos magros (Dugas LR, et al, 2016). O metabolismo dos carboidratos é importante na nutrição dos frangos, mas devido aos efeitos anti-nutricionais dos ingredientes alimentícios,

tal como milho e trigo, é importante se concentrar na melhora dos microbiomas intestinais que são capazes de melhorar a utilização total de nutrientes, utilização que inclui o uso de gorduras e proteínas para melhorar ganho de peso corporal.

[0082] Um aumento significativo na abundância relativa de Firmicutes e uma proporção entre F/B mais alta, como é mostrado na presente invenção, é, portanto, uma nova abordagem para melhorar a conversão alimentar de frangos de corte sem intervenção farmacêutica. A administração tradicional de antibióticos terapêuticos pode ter sido associada ao aumento do peso médio do animal vivo (ALW) e ao ganho de peso, mas isso é atribuído principalmente ao metabolismo dos carboidratos e, diante das ameaças do aumento da resistência aos antibióticos, será importante focar em intervenções nutricionais que melhorem a utilização de todos os tipos de alimentos, incluindo aqueles com maiores quantidades de proteínas e gorduras. Classificação do Filo- Controle Contagem da Leitura % Desconhecido 66195 52,55 Proteobacteria 31730 25,19 Actinobacteria 22062 17,51 Firmicutes 3106 2,47 Cyanobacteria 1337 1,06 Bacteroidetes 725 0,58 Tracheophyta 487 0,39 Classificação do Filo -Tratamento 1 Contagem da Leitura % Firmicutes 28779 53,73 Desconhecido 23826 44,48 Proteobacteria 910 1,70 Actinobacteria 40 0,07 Bacteroidetes 7 0,01 Classificação do Filo -Tratamento 2 Contagem da Leitura % Desconhecido 32367 51,04 Firmicutes 26802 42,27 Actinobacteria 2549 4,02

Classificação do Filo- Controle Contagem da Leitura % Proteobacteria 1570 2,48 Bacteroidetes 68 0,11

[0083] Tabela 3: Resultados da classificação de filos por 16S metagenômico bacteriano para análise para o Tratamento 1 (Dias 1-5: 4L: 1000L, Dias 18-20: 4L: 1000L, Dias 25-27: 8L: 1000L, Dias 30-31: 10L: 1000L), Tratamento 2 (Dias 1-4: 1L:1000L, Dias 21-24: 2L: 000L), mostrando um aumento acentuado em Firmicutes e uma diminuição acentuada em Actinobacteria e Bacteroidetes em comparação ao controle do tratamento antibiótico terapêutico de rotina em frangos de corte comerciais.

[0084] Foi observado que os Tratamentos 1 e 2 apresentaram 40,71% e 53,58% de Lactobacillales em comparação com 2,38% do Controle. As espécies predominantes detectadas nas amostras de controle foram Rhodospirillales e Actinomycetes. Os Actinomycetes para o Tratamento 2 foram de 4% e para o Tratamento 1 foram de 0,04% e os Rhodospirillales para os Tratamento 1 e 2 foram de 0,02% e 0,01%, respectivamente. Demonstramos no presente documento o efeito da presente invenção e sua capacidade de alterar toda a infraestrutura microbiomica e demonstramos o efeito sinérgico da intervenção nutricional diretamente alimentada. É importante notar que, na técnica, é sabido que os SCFA melhoram a saúde intestinal; no entanto, nenhuma tentativa conhecida foi feita para entender as mudanças precisas de classificação após a alimentação de tais intervenções.

[0085] O experimento B foi projetado para validar os resultados de 16S RNA do experimento A e apenas o protocolo de Tratamento 1 foi usado no projeto. no presente documento, foi observado que Lactobacillales, como ordem, é novamente a cepa bacteriana predominante detectada. no presente documento é validado que Lactobacillales é a espécie predominante após tratamento versus aves de controle tratadas com antibióticos.

[0086] É observado ainda que ambas as amostras de tratamento se apresentaram com Lactobacillaceae mais elevados em 52,95% e 40,28%, respectivamente, em comparação com as amostras de controle com 2,37%. As amostras controle apresentaram 18,29% de Acetobacteraceae e 14,94% de Propionibacteriaceae.

[0087] A partir de ambos os experimentos e de ambas as ordens e classificações familiares, é observado que a administração com intervenção nutricional contendo SCFA e mio-inositol alterou a colonização microbiana da luz intestinal de aves de corte comerciais em favor de Firmicutes e, importantemente, de Lactobacillales spp, que melhoram a saúde. Consequentemente, foi demonstrado que a administração de doses elevadas mantém a alteração do padrão de colonização intestinal em favor de Lactobacillus, que é conhecido por impedir a colonização do intestino por patógeno entérico. A extensão em que essas alterações de colonização ocorrem não foi demonstrada precedentemente para a alimentação da combinação de SCFA no presente documento descrita.

[0088] Surpreendentemente, os resultados de BLAST output não mostram Lactobacillus plantarum spp. É inesperado que a alimentação com ácidos carboxílicos crie uniformidade dentro da luz intestinal, como é apresentado no Tratamento 1.

[0089] A Tabela 4 abaixo mostra os resultados de BLAST output para cada uma das experiências realizadas onde essa uniformidade é mostrada. É mantido que taxas mais altas de doses criam de fato mais uniformidade dentro do intestino e a exclusão de espécies patogênicas negativas que afetam negativamente as medidas, tais como FCR, PFE e mortalidade e os riscos de contaminação associados à produção de alimentos.

BLAST HIT- Tratamento 2 Contagem da Leitura % bacteria não cultivada 29441 44,36 Lactobacillus sp. 6374 9,60 Gallibacterium anatis 1108 1,67 Brachybacterium faecium 683 1,03 Brachybacterium paraconglomeratum 525 0,79 Lactobacillus reuteri 457 0,69 bacterium ii1222 378 0,57 Halomonas elongata 323 0,49 Corynebacterium glyciniphilum 279 0,42 Weissella thailandensis 226 0,34 Corynebacterium falsenii 224 0,34 BLAST HIT - Tratamento 1 Contagem da Leitura % bacteria não cultivada 23154 43,17 Lactobacillus sp. 8173 15,24 Lactobacillus reuteri 5267 9,82 Lactobacillus salivarius 1395 2,60 Lactobacillus aviarius 362 0,67 BLAST HIT Controle Contagem da Leitura % bacteria não cultivada 60476 46,65 Acetobacter sp. 8116 6,26 Brevundimonas sp.rp2 4934 3,81 Lactobacillus salivarius 1621 1,25 Tabela 4: Resultados resumidos de BLAST output para as Análises Metagenômicas 16S para tratamento de aves de corte comerciais tratadas com uma modalidade da invenção em comparação com aquelas tratadas com dosagem terapêutica inicial de antibióticos na fazenda.

[0090] Não encontramos resistência ao uso da invenção no tratamento de patógenos comensais naturais das aves. Entretanto, é notado que, em taxas de dose mais baixas da invenção, o patógeno Gallibacterium anatis é encontrado a 1,67%. Esse patógeno é uma doença emergente das aves domésticas. A crescente preocupação com G. anatis e sua cinética de crescimento pouco conhecida, marcadores de virulência, patogênese e vacina(s) para controle, vale a pena mencionar que mostramos que em doses mais altas, essa bactéria não está presente. Gallibacterium anatis (precedentemente conhecido como Pasteurella anatis) é comensal no trato respiratório superior e no trato genital inferior de galinhas saudáveis (Singh et al, 2016). Sua colonização no trato respiratório superior pode ter um papel na virulência de outras doenças emergentes, tais como as cepas da gripe aviária. Observamos no presente documento que, para o Tratamento 1, não havia evidências de 16S RNA genômico dessa bactéria patogênica. Nós extrapolamos que a alimentação em doses mais altas desempenha um papel na resistência à doença.

[0091] Embora a infecção por G. anatis seja tratável com antibióticos, a frequência de falha do tratamento é um problema recorrente e emergente, e as cepas de G. anatis têm mostrado resistência a fármacos de sulfa, novobiocina, tilosina, clindamicina, tetraciclina e penicilina. Mostramos no presente documento que nenhuma resistência é apresentada em taxas de dosagem mais altas e que a taxa de dose é uma consideração importante no tratamento com combinações de SCFA e de probióticos. O suplemento alimentar da invenção é capaz de prevenir efetivamente novos patógenos que estão surgindo com maior resistência a antibióticos conhecidos. Testes adicionais de modalidades específicas da invenção

[0092] Uma modalidade específica da invenção, feita como descrito no presente documento acima, foi testada em frangos de corte. Alojamentos tratados com antibióticos foram usados como controle positivo. A mistura foi preparada utilizando a seguinte proporção de constituintes:

[0093] - 47,2% em peso de ácido propiônico;

[0094] - 22,45% em peso de ácido lático;

[0095] - 8,75% em peso de ácido fórmico; 11,55% em volume de amônia;

[0096] - 0,27% em peso de magnésio;

[0097] - 1,08% em peso de ácido cítrico;

[0098] - 5,41% em peso de mio-inositol;

[0099] - 2,24% em peso de cultura de Lactobacillus plantarum; e

[00100] - 1,05% em peso de xilanase.

[00101] Sequenciamento de RNA

[00102] O sequenciamento de RNA (RNA Seq), também denominado sequenciamento shotgun de transcriptoma completo (WTSS), usa o Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) para revelar a presença e a quantidade de RNA em uma amostra biológica em um determinado momento no tempo. O RNA Seq é usado para analisar o transcriptoma celular em constante mudança (Chu e Corey, 2012). É amplamente considerado agora que o sequenciamento de RNA é uma ferramenta profunda de sequenciamento que permite alta cobertura e usa os mesmos conceitos que o sequenciamento de DNA, mas onde a preparação da biblioteca é bem diferente (Chu e Corey, 2012). A preparação da biblioteca de RNA Seq geralmente inclui a transcrição reversa. Mais importante ainda, RNA Seq facilita a capacidade de observar alterações na expressão de gene ao longo do tempo ou diferenças na expressão de gene em diferentes grupos ou tratamentos (Maher et al, 2009).

[00103] O objetivo da inclusão de RNA Seq para a presente invenção é entender quais vias são afetadas pela modalidade atualmente utilizada da invenção e identificar novas vias de expressão de gene ainda não entendidas. Até a presente data, desde o mapeamento do genoma da galinha em 2004, pouco esforço tem sido feito para entender e mapear as enzimas que regulam especificamente a função da proteína no nível do proteoma da galinha (banco de dados USDA). Para este fim, a presente invenção encontrou novas expressões de genes e elas foram vinculadas à novas enzimas em aves tratadas com a modalidade da invenção.

[00104] Sucesso reprodutivo, nutrição, crescimento e resistência a doenças são características importantes para a indústria e um entendimento em nível molecular permite que os pesquisadores desenvolvam novos produtos envolvidos na doença. É sabido que os ácidos orgânicos desempenham um papel na substituição de antibióticos, mas não no papel que desempenham no desenvolvimento de resistência a doenças ou sucesso reprodutivo. Metodologia

[00105] Para a presente invenção, foram gerados dados de RNA Seq, a fim de estabelecer vias desconhecidos que são iniciadas diferentemente entre as aves tratadas e de controle. Amostras de sangue foram coletadas de 2 aves de cada um dos alojamentos de controle e experimentais tratados. As amostras foram coletadas em tubos de DNA/RNA Shield (Zymo Research Corp, sob licença de Pangea Laboratory) como extrações de 3 ml. As mesmas aves foram usadas ao longo de um período de 33 dias, a fim de rastrear os dados do transcriptoma dentro desse período. A coleta e a preparação da amostra foram projetadas para ver alterações na expressão de gene ao longo do tempo e as diferenças entre o grupo tratado com antibióticos de rotina e aqueles tratados com uma modalidade da invenção, como mostrado na Tabela 5.

CONTROLE TRATAMENTO amostra1 dia 19, alojamento 2 rosa amostra 6 dia 20, alojamento 1 verde dia 19, alojamento 2 verde dia 20, alojamento 1 rosa amostra 2 dia 7, alojamento 2 verde amostra 7 dia 8, alojamento 1 verde dia 7, alojamento 2 rosa dia 8, alojamento 1 rosa amostra 3 dia 15, alojamento 2 verde amostra 8 dia 16, alojamento 1 verde dia 15, alojamento 2 rosa dia 16, alojamento 1 rosa amostra 4 dia 24, alojamento 2 verde amostra 9 dia 25, alojamento 1 verde dia 24, alojamento 2 rosa dia 25, alojamento 1 rosa amostra amostra 5 dia 29, alojamento 2 verde 10 dia 30, alojamento 1 verde dia 29, alojamento 2 rosa dia 30, alojamento 1 rosa

Tabela 5: Coleta de amostra e projeto do protocolo para as análises de Sequenciamento de RNA a fim de determinar as diferenças de expressão de gene ao longo do tempo e entre aves de controle (antibiótico) e tratadas.

[00106] Duas aves de cada alojamento (rosa e verde) tiveram amostras de sangue coletadas durante o período de 33 dias. As amostras foram agrupadas para fornecer um valor mais profundo de RNA e a randomização.

[00107] A preparação da amostra e o protocolo estavam de acordo com o sistema lllumina MiSeq. As amostras foram então enviadas para um fornecedor comercial de serviços NGS e o DNA genômico foi extraído usando o kit ZymoBIOMICS. Resumidamente, as amostras de DNA genômico foram amplificadas por PCR usando um par de iniciadores universais (341F e 785R – direcionados para V3 e V4 do gene de 16S rRNA). Os amplicons resultantes foram purificados em gel, reparados nas extremidades e a sequência adaptadora específica da Illumina foi ligada a cada amplicon.

[00108] Após a quantificação do DNA, as amostras foram indexadas individualmente e outra etapa de purificação baseada em esferas foi realizada. Os amplicons foram então sequenciados na plataforma MiSeq da lllumina, usando um kit MiSeq v3 (600 ciclos). 20Mb de dados (leituras finais pareadas com 2x300bp de comprimento) foram produzidos para cada amostra. A análise de dados baseada em BLAST foi realizada usando o sistema de análise de dados desenvolvido internamente pelo laboratório.

[00109] Os metadados de RNA deveriam então realizar análise de mapa térmico. Isso agrupa simultaneamente amostras e recursos, mostrando um mapa térmico bidimensional dos valores de expressão. Cada coluna corresponde a uma amostra e cada fileira corresponde a uma característica (um gene ou transcrito). As amostras e as características são agrupadas hierarquicamente. Os metadados conhecidos sobre cada amostra são adicionados como uma superposição. A normalização de TMM foi usada para tornar as amostras comparáveis e a normalização do escore z para tornar as características comparáveis. O mapa térmico, uma vez gerado, foi usado para identificar genes de interesse.

[00110] As características de clusters hierárquicos agrupados são caracterizadas pela similaridade de seus perfis de expressão em relação ao conjunto de amostras e, para os fins de nossa investigação, o algoritmo exige que especifiquemos uma medida de distância e uma ligação de cluster na avaliação de dados. A distância euclidiana foi a medida de distância selecionada, em que a distância comum entre dois pontos é o comprimento do segmento que os conecta.

[00111] Se u=(u1, u2, …., un) e v= (v1, v2, …, vn), então a distância Euclideana entre u e v é

[00112] A ligação de Cluster selecionada para os fins da presente análise é Ligação Completa, onde a distância entre dois clusters é calculada como a distância máxima de objeto para objeto d (xi, yi), em que xi vem do primeiro cluster e yi vem do segundo cluster. Em outras palavras, a distância entre os dois objetos mais distantes no cluster.

[00113] Ferramentas de mapeamento foram usadas para alinhar as sequências ao genoma de referência da galinha (disponível em ftp://ftp.ensembl.orq/pub/release-94/fasta/gallus gallus /dna/: genoma de Gallus gallus construído em 5 de março de 2017). As contagens de leitura por gene foram calculadas. A fim de excluir genes com contagens muito baixas, foram excluídas características com menos de 20 leituras em pelo menos ambos, o controle e o tratamento.

Resultados

[00114] O sequenciamento de RNA produziu uma média de 15000 leituras por amostra. Números de transcritos diferencialmente abundantes, bem como seu agrupamento, foram visualizados. A ativação da via variou entre os grupos controle e tratamento; onde os grupos de tratamento indicam uma regulação positiva da via canônica para regulação do estresse térmico, desenvolvimento de resistência a doenças e manutenção do sistema nervoso.

[00115] Um mapa térmico do estudo longitudinal de RNA Seq d foi gerado comparando os frangos de corte comerciais transcriptômicos para tratamento com uma modalidade da invenção, em comparação com tratamentos com antibióticos. Isso mostrou uma taxa de expressão global mais alta do que a dos grupos controle para a via canônica essencial para a regulação positiva na regulação do estresse térmico (HSPA2), desenvolvimento de resistência a doenças (OASL, MACF1, OTUD1, BF1 e BF2) e manutenção do sistema nervoso (TMEM184B e EEF2) . O presente estudo demonstra ainda maior expressão das vias imunológicas celulares pela ativação das vias de MAP quinase através de TMEM184B, antígeno MHC Classe I através de BF1 e BF2, biossíntese de proteínas através de EEF2 pelas aves de tratamento versus controle.

[00116] Estes resultados fornecem prova de um efeito inesperado da invenção na regulação positiva aprimorada dos genes de gerenciamento de estresse, resistência a doenças e manutenção do sistema nervoso; proporcionam uma ligação mecanicista entre os resultados obtidos nos ensaios da invenção e a modalidade da própria invenção. A invenção representa, portanto, uma abordagem inovadora e inventiva para reduzir e substituir efetivamente a necessidade de insumos farmacêuticos e aumenta a saúde e o rendimento dos animais.

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Bacterial census of poultry intestinal microbiome.

Poult Sci, 2013, Vol 92, 671–83.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Suplemento alimentar para adição à água potável para consumo por animais monogástricos confinados, caracterizado pelo fato de o suplemento alimentar incluir: - ácidos graxos de cadeia curta; - um composto nitrogenado; - uma fonte de inositol; e - uma fonte de xilanase, em que os ácidos graxos de cadeia curta são selecionados do grupo que compreende ácido fórmico, ácido propiônico e ácido butírico em qualquer combinação, o composto nitrogenado é selecionado do grupo que compreende amônia e propionato de amônia, em qualquer combinação, a fonte de inositol é o mio-inositol e a fonte de xilanase é selecionada do grupo que compreende Lactobacillus plantarum e xilanase isolada, em qualquer combinação.

2. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de incluir ainda o ácido láctico.

3. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o suplemento inclui ainda ácidos graxos de cadeia média.

4. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos de cadeia média incluem ácido láurico e ácido palmítico.

5. Suplemento alimentar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o suplemento inclui ainda bactérias selecionadas di grupo que compreende Lactobacillus spp., Propionibacterium spp. e Bacillus spp., em qualquer combinação.

6. Suplemento alimentar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o suplemento inclui ainda uma fonte de magnésio.

7. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a fonte de magnésio é o bisglicinato de magnésio.

8. Suplemento alimentar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os animais monogástricos são peixes.

9. Suplemento alimentar de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os animais monogástricos são aves.

10. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as aves são galinhas.

11. Suplemento alimentar para adição à água potável para o consumo pelas aves, caracterizado pelo fato de compreender: - entre 30% e 50% em peso de ácido propiônico; - entre 5% e 30% em peso de ácido lático; - entre 1% e 15% em peso de ácido fórmico; - entre 5% e 15% em peso de amônia; - entre 10% e 15% em peso de propionato de amônia; - entre 0,1% e 1% em peso de magnésio; - entre 0,5% e 3% em peso de ácido cítrico; - entre 0,5% e 15% em peso de mio-inositol; - entre 1% e 10% em peso de cultura de Lactobacillus plantarum; e - entre 0,5% e 6% em peso de xilanase.

12. Suplemento alimentar de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizado pelo fato de ser substancialmente como aqui descrito e/ou exemplificado.