JP7354135B2

JP7354135B2 - 水添加剤及び組成物

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Publication number: JP7354135B2
Application number: JP2020552170A
Authority: JP
Inventors: ハッセルバッハレイ－アン
Original assignee: インテジェネ（プロプライアタリー）リミティド
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2023-10-02
Anticipated expiration: 2038-12-18
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Description

本発明は、飲料水に添加するための水添加剤に関し、より具体的には、動物の健康を向上するための、栄養成分及び微生物学的成分の両方を含有する飲料水に添加するための飼料サプリメントに関する。

大規模なシステムで飼育された家畜は、多くの問題を抱えていることが知られており、その多くは、飼育環境の密度に関連しており、健康及び全体的な収量に影響を与える可能性がある。その１つは、細密な（及び多くの場合、遺伝的に高度に均質な）動物の間で急速に広がり、死亡及び収量の損失を引き起こす可能性がある、疾患である。２番目の主要な問題は、最適な健康に必要な必須微量栄養素が不足していることが多い、飼料の組成及び加工に関する。３番目の問題は、環境である。この環境は、多くの場合動物の動きを制限し、過密状態及び／又は種に適切な社会的相互作用の欠如によるストレスを誘発する。このストレスは、地球の気温上昇等の他の環境ストレス要因と共に、持続可能な農業に必要な生産成績の要因に影響を与える、炎症性（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）マーカーの著しい増加をもたらす。

当該技術分野で知られている従来のアプローチは、これらの問題を少しずつ最小化することに向けられている。農家の間での抗生物質の広範な使用（多くの場合、成長に対する刺激効果のために低用量での使用）により、一般的な病原菌の間で抗生物質耐性が広範囲に広がっただけではなく、継続的に肉に含まれるこれら化学物質の微量の摂取に関連し得る潜在的な副作用に対する国民の疑いによる反発の増加をもたらす。

これらの問題のよく研究され経済的に重要な例は、ブロイラー鶏の大規模な飼育に使用されるシステムにある。これは、経済の規模の緊急性から大規模な農業システムが導入された。このシステムは、医薬品の介入（主に抗生物質）及び機械化に大きく依存しており、栄養所要量を考慮して慎重に配合されたコストを最小限に抑えた飼料で飼育された最密での動物の健康及び収量を向上させる。産業の規模及びユビキタス性により、混雑した市場で製品を販売する生産者の余裕は、ますます小さくなっている。これにより、システムはますます大規模で集中的になる傾向にあり、疾患管理及び無理の無い範囲での収量の増加の問題をこれまで以上に切迫したものにした。

上記問題のうち、最近になって明らかになってきたのは、病原性微生物の制御、栄養分の取り込み、並びに動物の健康全般における腸内マイクロフローラの役割である。人間の健康においても、腸内マイクロフローラは、健康に関連する様々な問題の重要な構成要素であると同時に、医学的な知識の中で十分に理解されていない空隙（ｌａｃｕｎａ）として広く受け入れられてきた。他の動物の細菌叢は、人間の細菌叢と同じくらい重要であると考えられており、さらに、それはよく理解されていない。しかしながら、腸内の種間の代謝コミュニケーションは、飼育されている動物の炎症、熱ストレスの軽減、及び抗体の増加に関係する。

短鎖脂肪酸（Ｓｈｏｒｔｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄ：ＳＣＦＡ）は、腸内細菌叢で利用可能となる非消化性炭水化物（ｎｏｎ－ｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ：ＮＤＣ）の発酵の主な最終産物である（Morrison and Preston, 2016）。ＳＣＦＡは通常、消化管での消化及び吸収を回避する炭水化物の糖分解発酵によって産生される。主な産物は、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、及び酪酸塩である（Morrison and Preston, 2016）。

有機カルボン酸は、脂肪酸及びアミノ酸を含む一般構造Ｒ－ＣＯＯＨの酸である。それらは一般に、それらの自明な名称を使用して識別され、通常、接尾語に「－ｉｃａｃｉｄ」が付く。カルボン酸アニオン（Ｒ－ＣＯＯ^－）は通常、接尾語に「－ａｔｅ」を付けて命名される。当該技術分野において周知のカルボン酸は、炭酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸及びアラキジン酸を含む。

家禽種において、家禽の量の健康に影響を与える最も一般的な細菌は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。これらの種は、有益な腸管内細菌、特にラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）によって制御されていることが知られている。ここで、言及されているような陰性腸内細菌に対するこれらの細菌によって産生されるカルボン酸ＳＣＦＡの影響は、家禽に非常に有益な影響を与える可能性があることが知られている。ＳＣＦＡは、そ嚢／前胃における病原体のレベルを低下させ、腸内フローラを調整し、飼料の消化を高めてパフォーマンスを向上させる。

腸内でのギ酸の役割は、メタン生成に関連しており、炎症状態において自然に上昇しているようであり、炎症の軽減における役割を担うことが示唆されている。

有機ＳＣＦＡ類は、本質的に抗菌性であり、主にグラム陰性菌に影響を与えることが知られている。ＳＣＦＡは、グラム陽性の腸内微生物によって自然に産生されることが知られている。さらに、ＳＣＦＡは、栄養機能、調節機能、及び免疫調節機能を通じて宿主の生理機能に広範な影響を及ぼし、酸化ストレスの形として細菌の健康に影響を与えることも知られている（Sun and O’Riordan, 2013）。

ギ酸及びギ酸塩は、家禽の内皮絨毛構造及び長さを増加させることが知られている。小腸の様々な部分の絨毛の長さの増加は、病原性細菌及び毒性物質に対する自然の障壁としての腸上皮の役割に貢献する可能性がある。

飼料サプリメントとしての酵素の使用は、家禽における難消化性飼料の飼料価値を向上させるために使用される戦略の1つとして、当該技術分野で知られている。ヘミセルラーゼに属するｅｎｄｏ－１，４βキシラーゼ（ＥＣ．３．２．１．８）等の外因性酵素は、抗栄養アラビノキシラン（ＡＸ）及びコムギのキシラン画分を分解するために家禽のコムギに基づく飼料に通常配合されており、その結果、家禽の栄養摂取及び成長を改善する可能性がある（Vandeplas et, al. 2009)）。

イノシトールは、六炭糖、グルコースの異性体及びホスファチジルイノシトール等の多くの生物学的化合物に存在する炭素環式ポリオールである(Rucker, eta l, 2008) (Sosenko and Bancalari, 2012) (Corrado and Santamaria, 2015)。イノシトールの一種であるミオイノシトールは、リン含有形態、典型的にフィチン酸又はイノシトール六リン酸（ＩＰ６）として植物に豊富に存在している。多くの鳥類、特にブロイラー鶏は、リン酸基を除去するために必要な消化酵素であるフィターゼが不足しているため、植物又は植物源からフィチン酸を回収できない。フィターゼ等の酵素の添加は、当該技術分野で周知である（Klopfenstein, et al, 2002）。しかしながら、フィターゼの作用機序は、ＩＰ６をイノシトールペンタ（ＩＰ５）、テトラ（ＩＰ４）及び三リン酸（ＩＰ３）の何れかに還元する（フィチン酸としても知られている）。これは、リン酸を含まないミオイノシトールの異性体構造とは異なる。

イノシトール（Ｃ_６Ｈ_１２Ｏ_６）の最も顕著な形態は、ミオイノシトールであり、かつては、ビタミンＢ複合体（すなわちビタミンＢ_８）の一員として考えられていた。ミオイノシトールは、原形質膜の成分であり、細胞内シグナル伝達、細胞内カルシウム濃度制御及び細胞膜電位の維持等、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。飼料消化酵素及び高用量ミオイノシトールを組み合わせることは、家禽における遺伝子発現及び／又は微生物群集に影響を与えるということが当該技術分野で周知である。ミオイノシトールは、家禽のコルチゾール及びコルチコステロンのレベルを管理する役割を担うことも知られている。

病原体分泌物質は、宿主生物の栄養吸収の障害の原因となることが知られている。従って、腸内のこれらの物質の濃度を下げると、栄養素の吸収率が向上すること、腸粘膜での代謝が改変されること及び慢性低悪性度炎症プロセスが減少することが知られている。家禽の慢性炎症（「腸のやけど（ｇｕｔｂｕｒｎ）」と呼ばれる）は、当該技術分野で広く知られており、フィチン酸及びアラビノキシラン等の難消化性飼料の栄養効果の低下に関与している。これは、腸内の病原菌の異常増殖を引き起こすことも知られており、それらの全てが疾患感受性の増加の一因となっている。

ラクトバチルス種は、健康な腸内微生物の重要な構成要素であることが当該技術分野で知られている。特に、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）（Ｌ．プランタルム）は、他の厳密な嫌気性菌とは異なり、空気に耐性がある。これらの生物は、カタラーゼ酵素を欠如しているが、ほぼ必ずスーパーオキシドジスムターゼを有する。Ｌ．プランタルムは、本来、酸素依存性の病原体の殺傷を通じて、消化管の病原性のフローラを抑制することができる（Prescott et al, 2002）。これらには、マイコバクテリウムｓｐｐ．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、リステリアｓｐｐ．（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｐｐ．）、クロストリジウムｓｐｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｐ．）及びサルモネラｓｐｐ．（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．）を含む腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｔｅｒｉａｃｅａｅ）等の嫌気性菌を含む（Prescott et al, 2002）。Ｖａｎｄｅｐｌａｓｅｔａｌ．２００９によると、Ｌ．プランタルムプロバイオティクスとキシラナーゼ酵素を組み合わせることで、飼料への添加による競合排除のプロセスを通して、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の影響を軽減することができる。

ＷＯ２０１０／１１７２５５は、乳酸菌の２つ以上の系統から得られた飼料添加剤又は食品補助製剤について記載する。このサプリメントは、単胃動物の飼料に用いられる。特許請求の範囲に記載される乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルムを含む群から選択される。この特許出願は、栄養素、バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）、ビタミン（ｓｉｃ）、有機酸又はそれらの組み合わせを含む動物飼料をさらに請求している。特許請求の範囲に記載されたビタミンには、ビタミンＢが含まれ得、特許請求の範囲に記載された有機酸には、ギ酸、酪酸及び乳酸が含まれ得る。ここで、ビタミンＢ及び有機酸成分が請求の範囲に記載されているが、実証されていないことに注意すべきである。従って、糞便中の乳酸菌及び腸内細菌科の数、小腸の形態及び糞便中のＶＦＡ濃度の実証された変化は、請求の範囲に記載された特定の乳酸菌系統の組み合わせの産物であることは、明らかである。

上記特許出願と同様に、Ｔｈａｈｎｅｔａｌ．は、家禽の腸の健康を向上させるためのラクトバチルス代謝産物（特定のラクトバチルス系統の組み合わせによる飼料サプリメントの結果として産生された）の使用について記載する。これは、単胃動物における飼料要求率を改善する上でのプロバイオティクス飼料サプリメントの既知の利点を再び示している。上記特許出願と同様に、糞便ＶＦＡ濃度（すなわち、排出されたＶＦＡ）を介して測定された有機酸は、腸内マイクロフローラの組成のプロキシマーカーとして使用され、腸の健康に対するＶＦＡ補給濃度（すなわち、消費されたＶＦＡ）の影響を直接測定する試みは行われず、プロバイオティクスと直接摂取による栄養介入の相乗効果を定量化する試みも行われていない。

上記のことから、家畜（特に家禽）の収量及び健康を向上させ、抗生物質の使用を減らす非薬理学的添加剤又はサプリメントが現在必要とされていることは明らかである。

発明の目的
従って、本発明の目的は、医薬品投入の必要性を減らし、動物の健康及び収量の両方に利益をもたらす動物飼料サプリメントを提供することである。

本発明の第１の態様によれば、以下：
－短鎖脂肪酸；
－窒素化合物；
－イノシトールの供給源；及び
－キシラナーゼの供給源
を含む、飲料水に添加するための飼料サプリメントであって、
ここで、前記短鎖脂肪酸が、ギ酸、プロピオン酸及び酪酸を含む群から選択され、何れかの組み合わせにおいて、前記窒素化合物が、アンモニア及びプロピオン酸アンモニウムを含む群から選択され、何れかの組み合わせにおいて、前記イノシトールの供給源が、ミオイノシトールであり、前記キシラナーゼの供給源が、ラクトバチルス・プランタルム及び単離されたキシラナーゼを何れかの組み合わせで含む群から選択される、飼料サプリメントが提供される。

ここで、単離されたキシラナーゼは、当該技術分野で知られているように、好ましくはｐＨ耐性タイプのものである。

本発明の一実施形態において、飼料サプリメントは、乳酸をさらに含み得る。

本発明の一実施形態において、飼料サプリメントは、中鎖脂肪酸をさらに含み得る。本発明の好ましい実施形態において、中鎖脂肪酸は、ラウリン酸及びパルミチン酸を含み得る。

本発明の一実施形態において、飼料サプリメントは、ラクトバチルスｓｐｐ．、プロピオニバクテリウムｓｐｐ．、バチルスｓｐｐ．を何れかの組み合わせて含む群から選択される最近をさらに含み得る。

本発明の一実施形態において、飼料サプリメントは、マグネシウム供給源をさらに含み得る。好ましい実施形態において、マグネシウム供給源は、ビスグリシン酸マグネシウムであり得る。

本発明の一実施形態において、飼料サプリメントは、家畜による摂取のための飲料水に添加され得る。好ましい実施形態において、家畜は、単胃動物であり得る。さらに好ましい実施形態において、単胃動物は、魚であり得る。他の実施形態において、単胃動物は、家禽であり得る。好ましい代替の実施形態において、家禽は、鶏であり得る。

本発明の第２の態様によれば、家禽が摂取するための飲料水に添加するためのサプリメントが提供され、このサプリメントは、以下を含む：
－３０重量％～５０重量％のプロピオン酸；
－５重量％～３０重量％の乳酸；
－１重量％～１５重量％のギ酸；
－５重量％～１５重量％のアンモニア；
－１０重量％～１５重量％のプロピオン酸アンモニウム；
－０．１重量％～１重量％のマグネシウム；
－０．５重量％～３重量％のクエン酸；
－０．５重量％～１５重量％のミオイノシトール；
－１重量％～１０重量％のラクトバチルス・プランタルム培養物；及び
－０．５重量％～６重量％のキシラナーゼ。

本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴及び利点は、以下の本発明の詳細な説明によって当業者に明らかになるだろう。

本発明の好ましい態様の説明

本発明の好ましい実施形態の非限定的な例を、以下でより詳細に説明する。

製剤及び混合物の試験

本発明の実施形態の飼料サプリメントを製造するために、１０～２４％乳酸（ｌ－乳酸ＣＡＳ７９－３３－４）、３５～５０％プロピオン酸（純粋なプロピオン酸ＣＡＳ８９－０９－４）及び２．５～９．９％ギ酸（ＣＡＳ６４－１８－６）を混合し、必要に応じてアンモニア（水酸化アンモニウムＣＰグレード）で中和し、溶液を緩衝し、初期ｐＨを３．２～４．２に調整した。

全ての化学物質を、ローカル及びグローバルな商業的供給源から購入した。

カルボン酸は、プロトン（Ｈ＋）ドナーであるため、ブレンステッド・ローリー酸である。それらは、最も一般的なタイプの有機酸である。カルボン酸は通常、弱酸であり、つまり、中性水溶液において、Ｈ＋カチオン及びＲＣＯＯ－アニオンに部分的にしか解離しない。例えば、室温では、１モル酢酸溶液中で、酸分子の０．４％のみが解離する。弱酸の酸性度を表す指標としてｐＫａが導入された。ｐＫａは、次のように定義される：
ｐＫ_ａ＝ｌｏｇ_１０Ｋ_ａ

上記の原理が用いられ、２５℃で、３．８６、４．８７及び３．７５の様々なｐＫａ値が、乳酸、プロピオン酸、ギ酸にそれぞれ適用された。次に、各酸の容量を最終濃度の次の式に従って加え、１Ｍの１Ｌ溶液を生成し、水で調整した：
－４０重量％～５０重量％のプロピオン酸；
－１５重量％～３０重量％の乳酸；及び
－１％～１５％のギ酸。

次に、この溶液をアンモニウムイオン（ＮＨ_４ ^＋）としてＮＨ_４ＯＨ（水酸化アンモニウム溶液）で滴定し、一旦最終濃度で５～１５容量％のアンモニアを提供する。

このＳＣＦＡに基づく混合物の最終的な塩基組成物のｐＨは、３．２～４．２であった。

次に、塩基性飼料サプリメントは、一旦作成され、さらなる化合物を加えることによって修正された。これらは、マグネシウム（ビスグリシン酸マグネシウムとして）（完全に反応したマグネシウムアミノ酸キレート）、イノシトール（ミオイノシトールとして）、及びクエン酸であった。この産物は、商業的供給源を通じてローカルで調達された。

上記成分の最終濃度は次の通りである：
－０．１重量％～１重量％のマグネシウム；
－０．５重量％～３重量％のクエン酸；及び
－０．５重量％～１５重量％のミオイノシトール。

本発明のこの実施形態は、プロバイオティクスとしてＬ．プランタルムのみを含む。使用したプロバイオティクス系統は、商業的に購入した。プロバイオティクスは、１重量％～１０重量％の最終濃度で液体の形態で加えられ、キシラナーゼは、０．５重量％～６重量％の濃度で加えられた。使用した系統は、ＣＷＢＩＧｅｒｍａｎｙＢｅｌｇｉｕｍのラクトバチルス・プランタルムであった。しかしながら、Ｌ．プランタルムＡＴＣＣ１８０４もまた、自家製のウシのチーズ、ヒツジのチーズ、及び地元の酪農家から入手したホエイからの系統と共に試験に成功した。Ｌ．プランタルムは、その空気耐性の性質により、送水管を介した輸送によって悪影響を受けることはなかった。

全ての系統を、グリセロールブロス（ｇｌｙｃｅｒｏｌｂｒｏｔｈ）で－８０℃に保った。乾燥粉末は、当該技術分野で知られているように、関連する培養液中での細菌発酵によっても得られ得る。本発明のこの実施形態は、関連するグローバルな供給業者から入手したＭＲＳブロスを使用した（ＤｅＭａｎＲｏｇｏｓａａｎｄＳｈａｒｐｅ）。３７℃で２４時間発酵させた。培養物は、８０００ｒｐｍで４℃３０分間遠心分離した（７ＢＺ－Ｎｅｏ１６００－００１）。使用前に、細胞の生存率及び生化学的特性が、ＡＰＩによって決定された。

最終濃度に達した後に、家禽用の飲料水に飼料サプリメントを加えた。用量は、自動化された農場システムによって、又は手動でオーバーヘッドタンクを介して送達され、バイオアベイラビリティを高めるために、飲料水に直接排出した。定期的に水サンプルを取得しｐＨを測定した。

ブロイラー鶏の飼料試験の結果は、抗生物質及びその他の処置介入に対する処置に関して測定された。ブロイラーの生産のために飼育された孵化した鶏としてＲｏｓｓ３０８及びＣｏｂｂ５００が試験に使用された。表１に結果をまとめた。

表１：市販のＲｏｓｓ３０８及びＣｏｂｂ５００ブロイラーを対象に、処置群及びコントロール群に分けて実施した農場内試験の従来の微生物有効性データの結果。サルモネラｓｐｐ．の有効性及び大腸菌ｓｐｐ．の有効性について、抗生物質処置群よりも処置群のほうが優れていた。実験群は、１つのハウス当たりの収容力が最大２００００～最大４６０００の別々のハウスで育てられた。カンピロバクター及びクロストリジウム・パーフリジェンスｓｐｐ．（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓｓｐｐ．）については、コントロールの鶏及び処置済の鶏では検出されなかった。

証明は、処置ハウス及びコントロールハウスの両方で常に維持された。全てのコントロール及び処置ハウスにおいて、飼料及び水を自由摂取させた。

処置ハウスは通常、試験の１～４日目、８～１０日目、１８～２４日目、及び２８～３２日目に混合物が投与された。処置は、３３日以上のサイクルで延長可能である。平均して、コントロールハウスでは、１～４日間、必要に応じて処方された通りに処置が施された。全ての農場でのサイクルは、２４か月間の期間にわたって試験された。

処置は、表１に示すように、ＩＳＯ４８３２：２００７の方法に準じた大腸菌ｓｐｐ．の有効性が６９．８１％向上し、ＩＳＯ６５７９：２００３の方法に準じたサルモネラｓｐｐ．の有効性は、処置群においてより良好な成績を示した。

驚くべきことに、飼料サプリメントは、１６Ｓメタゲノム解析で確認されているように、ラクトバチルス腸内細菌の増殖を促進し、酵母及びカビ（糞便サンプルで測定）を減少又は排除すると同時にサルモネラｓｐｐ．、大腸菌及びクロストリジウムｓｐｐ．等の陰性腸内フローラの増殖を防ぐことがわかった。未知の種の検出率が高いため、新しい細菌種の培養が可能である。さらに驚くべきことに、処置されたハウスでは、飼料要求率（ＦＣＲ）が大幅に低下し、生産効率係数規格（ＰＥＦ）が高くなっていることがわかった（表２）。死亡率は、コントロールハウスと比較して０．８％向上し、処置は、医薬品の介入と同等以上に効果的であることを意味する。

表２：市販のブロイラーの処置群とコントロール群を比較した集約した農場での結果の概要。試験は、実時間の商業農場で２年間にわたって実施された。抗生物質は、処置に効果的に置き換えられ、処置群では主要な指標の改善が観察された。

１６Ｓ細菌メタゲノムデータ分析

方法論
それぞれ～４００００羽の鶏を収容したコントロール群及び処置群の市販のブロイラーのハウスから糞便サンプルを無作為に採取し、滅菌した収集チューブに入れた（１００ｇ）。

サンプルを５℃で輸送し、すぐにＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈＲＮＡ／ＤＮＡＳｈｉｅｌｄ（商標）コレクションチューブに入れた。次に、取集されたサンプルは、センシティブダウンストリームマイクロバイオミック分析（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｍｉｃｒｏｂｉｏｍｉｃａｎａｌｙｓｅ）のための準備ができている状態である。

サンプルは、商用ＮＧＳサービスプロバイダーに送信され、ゲノムＤＮＡは、ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳキットを使用して抽出された。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡサンプルは、ユニバーサルプライマーペア（３４１Ｆ及び７８５Ｒ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３及びＶ４を標的とする）を使用してＰＣＲ増幅された。得られたアンプリコンをゲル精製し、末端を修復し、イルミナ特異的アダプター配列を各アンプリコンにライゲーションした。

ＤＮＡ定量に続いて、サンプルに個別に指標を付け、別のビーズに基づく精製工程を行った。アンプリコンは、ＭｉＳｅｑｖ３（６００サイクル）キットを使用して、イルミナのＭｉＳｅｑプラットフォームでシーケンスされた。

各サンプルについて、２０Ｍｂのデータ（２×３００ｂｐのロングペアエンドリード）が生成された。ＢＬＡＳＴに基づくデータ分析は、研究所内で開発されたデータ分析パイプラインを使用して行われた。

全てのサンプルについて、データがトリミングされ、＞ｑ２０（すなわち、高品質）のリードのみが使用された。全てのリードがＢＬＡＳＴにかけられ、結果をファイルに保存した。全てのＢＬＡＳＴ結果（すなわち、属及び種名）の上位ヒットが数えられ、各種がヒットとして出現した回数の記録が保存された。リードは、カラム１の対応する生物に一致したリードの数である（生物名／ヒット名）。特定のリードでＢＬＡＳＴ結果が見つからなかった場合、そのリード数を「ヒットなし」と記録した。全てのＢＬＡＳＴヒットの分類情報が記録された。

マイクロバイオームメタゲノムに対する本発明の影響を評価するために、２つの処置プロトコールを続けて実施した。以下が概要である：
－処置１：１～５日目：４Ｌ：１０００Ｌ、１８～２０日目：４Ｌ：１０００Ｌ、２５～２７日目：８Ｌ：１０００Ｌ、３０～３１日目：１０Ｌ：１０００Ｌ
－処置２：１～４日目：１Ｌ：１０００Ｌ、２１～２４日目：２Ｌ：１０００Ｌ
－コントロール：１～４日目に抗生物質処理

結果
１６ＳＲＮＡの結果は、両方の処置プロトコールで、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）が、処置１で５３．７３％及び処置２で４２．２７％と著しく増加し、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びバクテロイデテス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）が、コントロールの２．４７％と比較して、著しく減少したことを示した（表３）。ファーミキューテス／バクテロイデテスの比率（Ｆ／Ｂ）は、バクテロイデテスよりもファーミキューテスの方がカロリーの効率的な吸収を促進し、その後の体重増加を促進することで、エネルギー源としての効果が高いことから重要である（Krajmalnik-Brown R, et al, 2012）。

さらにファーミキューテスが優勢な場合、栄養素の輸送及び全体的な体重増加に関連することが知られている遺伝子が富化された一方、アクチノバクテリア及びバクテロイデテスの相対的に高い存在量並びに炭水化物代謝に関連する遺伝子の富化が、痩せた表現型のマイクロバイオームで見られた（Dugas LR, et al, 2016）。炭水化物の代謝は、ブロイラーの栄養にとって重要であるが、トウモロコシ及びコムギなどの飼料成分の反栄養効果により、体重増加を向上させるためには、脂肪及びタンパク質の利用を含めた総合的な栄養の利用を向上さえることができる腸内マイクロバイオームの改善に注力することが重要である。

本発明で示されているように、ファーミキューテスの相対的な存在量の顕著な増加及び高いＦ／Ｂ比は、故に、薬剤の介入なしにブロイラーの飼料要求率を改善するための新規なアプローチである。従来の治療用抗生物質の投与は、平均生体体重（ＡＬＷ）の増加及び体重増加に関連している可能性があるが、これは主に炭水化物代謝に起因し、抗生物質耐性の増加の脅威を考慮すると、タンパク質及び脂肪の量が多い飼料を含め、あらゆる種類の飼料の利用を向上する栄養給餌の介入に焦点を当てることが重要になる。

表３：処置１（１～５日目：４Ｌ：１０００Ｌ、１８～２０日目：４Ｌ：１０００Ｌ、２５～２７日目：８Ｌ：１０００Ｌ、３０～３１日目：１０Ｌ：１０００Ｌ）、処置２（１～４日目：１Ｌ：１０００Ｌ、２１～２４日目：２Ｌ：１０００Ｌ）の分析のための１６Ｓメタゲノム細菌系統分類結果は、市販のブロイラーの通常の治療用抗生物質処置と比較して、ファーミキューテスの顕著な増加並びにアクチノバクテリア及びバクテロイデテスの顕著な減少を示す。

処置１及び２は、コントロールでの２．３８％と比較して４０．７１％及び５３．５８％のラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）を示したことが観察される。コントロールサンプルで検出された優勢な種は、ロドスピリラム目（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）及びアクチノミセス類（Ａｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）であった。処置２のアクチノミセス類は、４％、処置１は、０．０４％であり、処置１及び２のロドスピリラム目はそれぞれ、０．０２％及び０．０１％であった。ここで、本発明の効果及び微生物学的基盤構造全体を変更する能力を実証し、直接給餌された栄養介入の相乗効果を示した。当該技術分野ではＳＣＦＡが腸の健康を向上することが知られている可能性があることに注意する必要があるが、そのような介入の後に正確な分類の変化を解明する試みは行われていない。

実験Ｂは、実験Ａからの１６ＳｒＲＮＡの結果を検証するように設計されており、設計では、処置１のプロトコールのみが使用された。ここで、目としてラクトバチルス目が再び検出された優勢な細菌系統であることが指摘されている。ここでは、抗生物質で処理したブロイラー鶏に対して処置後のラクトバチルス目が優勢な種であることが検証された。

さらに、コントロールサンプルでの２．３７％と比較して、両処置サンプルとも５２．９５％及び４０．２８％のより高いラクトバチルス科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）を示した。コントロールサンプルは、１８．２９％のアセトバクター科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及び１４．９４％のプロピオニバクテリア科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を示した。

両方の実験及び目及び科の分類の両方から、ＳＣＦＡ及びミオイノシトールを含む栄養療法を行うことにより、市販のブロイラー鶏の腸管内腔の微生物のコロニー形成が変化し、健康を促進するファーミキューテス及び重要なラクトバチラレスｓｐｐ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓｓｐｐ）に有利になったことに注意すべきである。従って、高用量投与は、腸内病原菌の腸内コロニー形成を防ぐことが知られているラクトバチルスに有利に、腸内コロニー形成パターンを変化させ続けることが示されている。これらのコロニー形成の変化が発生する程度は、本明細書に記載されるＳＣＦＡの組み合わせの摂取のためにこれまで実証されていなかった。

驚くべきことに、ＢＬＡＳＴアウトプットの結果は、ラクトバチルス・プランタルムｓｐｐ．は示されていない。カルボン酸の供給が、処置１に示されるように提示されるように、腸管内腔に均一性をもたらすことは予想していなかった。

以下の表４は、この均一性が示されている場合に行われた各事件のＢＬＡＳＴアウトプットの結果を示す。用量比率を上げることで、腸内の均一性が高まり、ＦＣＲ、ＰＥＦ、死亡率等の農場の指標及び関連する食品生産の汚染リスクに悪影響を及ぼすことが知られている負の病原菌種を排除することが維持される。

表４：本発明の実施形態で処置された市販のブロイラー鶏の処置のための１６Ｓメタゲノム解析の要約されたＢＬＡＳＴアウトプットの結果を、初期の農場での治療用抗生物質投与で処置されたものと比較した。

自然共生型鳥類病原体の処置における本発明の使用することに抵抗はないことがわかった。しかしながら、本発明のより低い用量比率では、病原体ガリバクテリウム・アナティスが、１．６７％見られることに留意されたい。この病原体は、家禽の新たな疾患である。Ｇ．アナティス並びに成長速度、病原性マーカー、病原性及びコントロールするためのワクチンが十分に理解されていないことへの懸念が高まっていることから、より高い用量比率では、この細菌は存在しないということを示す必要がある。ガリバクテリウム・アナティス（以前はパスツレラ・アナティス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａａｎａｔｉｓ）として知られていた）は、健康な鶏の上気道及び下部生殖管に共生する（Singh et al, 2016）。上気道でのコロニー形成は、鳥インフルエンザ系統等の他の疾患発症の病原性に関与する可能性がある。ここで、処置１の場合、この病原菌の１６ＳＲＮＡゲノム上の証拠はなかったことに留意されたい。より高い用量比率での給餌が耐病性に役割を果たすと推定する。

Ｇ．アナティスの感染症は、抗生物質で治療できるが、治療失敗の頻度は、新たに発生する再発性の問題、及びサルファ剤、ノボビオシン、タイロシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びペニシリンに対する耐性を示すＧ．アナティスの多剤耐性系統の発生の問題となる。ここでは、より高い用量比率では、耐性が示されず、ＳＣＦＡとプロバイオティクスの組み合わせで処置する場合、用量比率が重要な考慮事項であることを示す。本発明の飼料サプリメントは、既知の抗生物質に対する耐性が増加して発生する新しい病原体を効果的に防ぐことができる。

本発明の特定の実施形態のさらなる試験

本明細書で上述したように、構成された本発明の実施形態は、ブロイラー鶏で試験された。抗生物質で処置されたハウスをネガティブコントロールとして使用した。混合物は、以下の成分比率を使用して構成された：
－４７．２重量％のプロピオン酸；
－２２．４５重量％の乳酸；
－８．７５重量％のギ酸；
－１１．５５容量％のアンモニア；
－０．２７重量％のマグネシウム；
－１．０８重量％のクエン酸；
－５．４１重量％のミオイノシトール；
－２．２４重量％のラクトバチルス・プランタルム培養物；及び
－１．０５重量％のキシラナーゼ。

ＲＮＡシーケンシング
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡＳｅｑ）は、全トランスクリプトームショットガンシーケンシング（ＷＴＳＳ）とも呼ばれ、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、特定の瞬間における生体サンプル内のＲＮＡの存在及び量を明らかにする。ＲＮＡＳｅｑは、継続的に変化する細胞のトランスクリプトームを分析するために使用される（Chu and Corey, 2012）。ＲＮＡシーケンシングは、高いカバレッジを可能にし、ＤＮＡシーケンシングと同じコンセプトを用いるディープシーケンシングツールであると広く考えられているが、ライブラリーの準備は大きく異なる（Chu and Corey, 2012）。ＲＮＡＳｅｑライブラリーの調製は通常、逆転写を含む。最も重要なこととして、ＲＮＡＳｅｑは、経時的な遺伝子変化又は異なる群又は処置における遺伝子発現の違いを調べることを容易にする（Maher et al, 2009）。

本発明にＲＮＡＳｅｑを含めることの目的は、本発明の現在使用されている実施形態によって影響を受ける経路を解明し、まだ解明されていない新規な遺伝子発現経路を同定することである。これまでに、２００４年のトリゲノムのマッピングが行われて以来、トリのタンパク質機能を特異的に制御する酵素をプロテオームレベルで解明し、マッピングすることは、あまり行われていない（ＵＳＤＡデータベース）。この目的のために、本発明は、新規な遺伝子発現を見出し、これを本発明の実施形態で処置された鳥類において新規の酵素に関連付けた。

繁殖成功度、栄養、成長及び耐病性は、業界にとって重要な特性であり、分子レベルで解明することにより、研究者たちは、疾患に関与する新しい製品を開発することが可能となる。有機酸は、抗生物質の代わりの役割を果たすが、耐病性又は繁殖成功度の開発に関与しないことが知られている。

方法論
本発明では、処置された鳥及びコントロールの鳥の間で別に開始される未知の経路を確立するために、ＲＮＡＳｅｑデータを生成した。血液サンプルは、コントロール及び処置された実験ハウスのそれぞれから２羽の鳥より採取された。サンプルは、ＤＮＡ／ＲＮＡＳｈｉｅｌｄチューブ（ＺｙｍｏＲｅｓｓｅａｒｃｈＣｏｒｐ、Ｐａｎｇｅａラボラトリーのライセンスに基づく）に３ｍｌの吸引量として吸引された。この期間内にトランスクリプトームデータを追跡させるために、３３日間にわたって同じ鳥を使用した。サンプルの回収及び調製は、表５に示すように、遺伝子発現の経時的変化、及び通常の抗生物質で処置された群及び本発明の実施形態で処置された群との違いを見るために設計された。

表５：コントロール（抗生物質）鳥及び処置済鳥との間の遺伝子発現の経時的な違いを確認するためのＲＮＡシーケンシング分析のためのサンプル採取及びプロトコールの設計。各ハウス２羽（ピンク及びグリーン）を３３日間かけて採血した。サンプルは、より深いＲＮＡ値及びランダム化を用意するためにプールされた。

サンプルの前処理及びプロトコールは、イルミナのＭｉＳｅｑシステムに従った。サンプルは、その後、商用ＮＧＳサービスプロバイダーに送られ、ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳのキットを使用してゲノムＤＮＡを抽出した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡサンプルは、ユニバーサルプライマーペア（３４１Ｆ及び７８５Ｒ－１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３及びＶ４を標的とする）を用いたＰＣＲ増幅した。得られたアンプリコンをゲル精製し、末端を修復し、イルミナ特異的アダプター配列を各アンプリコンにライゲーションした。

ＤＮＡの定量に続いて、サンプルに個別に指標を付け、別のビーズに基づく精製工程を実行した。アンプリコンは、ＭｉＳｅｑｖ３（６００サイクル）キットを使用して、イルミナのＭｉＳｅｑプラットフォームでシーケンスされた。各サンプルについて２０Ｍｂのデータ（２×３００ロングペアエンドリード）が生成された。ＢＬＡＳＴに基づくデータの分析は、研究所内で開発されたデータ分析パイプラインを使用して実行された。

次に、ＲＮＡメタデータを用いてヒートマップ分析を行った。これにより、サンプル及び機能が同時にクラスター化され、発現の値の２次元ヒートマップが示される。ここで、各列は１つのサンプルに対応し、各行は、特徴（遺伝子又は転写物）に対応する。サンプル及び特徴は、両方とも階層的にクラスター化されている。各サンプルに関する既知のメタデータがオーバーレイとして加えられる。ＴＭＭ正規化を使用してサンプルを比較可能にし、ｚ－スコア正規化を使用して特徴を比較可能にした。生成されたヒートマップは、目的の遺伝子を同定するために使用された。

階層的クラスタリングは、サンプルの集合上の発現プロファイルの類似性によって特徴をクラスタリングするものであり、本研究の目的のために、アルゴリズムでは、データ評価の際に距離尺度及びクラスターリンケージを指定する必要がある。ユークリッド距離は、２点間の通常の距離がそれらを結ぶセグメントの長さである距離の尺度として選択された。

仮に、ｕ＝（ｕ１，ｕ２，．．．，ｕｎ）及びｖ＝（ｖ１，ｖ２，．．．，ｖｎ）の場合、ｕ及びｖの間のユークリッド距離は、

である。

本分析の目的で選択されたクラスターリンケージは、完全連鎖であり、ここで、２つのクラスター間の距離は、オブジェクト－オブジェクト間の最大の距離ｄ（ｘ_ｉ，ｙ_ｉ）として計算され、ここで、ｘ_ｉは第１のクラスターに由来し、ｙ_ｉは、第２のクラスターに由来する。つまり、クラスター内の最も遠い２つのオブジェクト間の距離である。

マッピングツールを使用して、配列を鶏のリファレンスゲノムに対しアライメントさせた（以下で利用可能、ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-94/fasta/gallus_gallus/dna/: Gallus gallus genome build 5、２０１７年３月）。遺伝子当たりのリードカウントを計算した。カウントが非常に少ない遺伝子を排除するために、コントロール及び処置の両方で２０未満のリードを有する特徴が除外された。

結果
ＲＮＡシーケンシングにより、サンプル当たり１５０００のリードを得た。異なる豊富な転写物の数並びにそれらのクラスタリングを可視化した。活性化経路は、コントロール群及び処置群で異なった；ここで、処置群は、熱ストレスの調節、耐病性の発現、神経系の維持のための標準的な経路の上方制御を示す。

抗生物質による処置と比較して、本発明の実施形態による処置のための市販のブロイラーのトランスクリプトミクスを比較するために、継続的研究ＲＮＡＳｅｑヒートマップを作成した。これは、熱ストレスの調節（ＨＳＰＡ２）、耐病性の発現（ＯＡＳＬ、ＭＡＣＦ１、ＯＴＵＤ１、ＢＦ１及びＢＦ２）及び神経系の維持（ＴＭＥＭ１８４Ｂ及びＥＥＦ２）の上方制御の主要な標準経路について、コントロール群よりも全体的に高い発現を示した。本研究はさらに、処置によるＴＭＥＭ１４８Ｂを介したＭＡＰキナーゼ経路の活性化、ＢＦ１及びＢＦ２を介したＭＨＣクラスＩ抗原の活性化、ＥＥＦ２を介したタンパク質生合成等の細胞免疫経路の発現が、コントロールの鳥と比較して増加していることが明らかになった。

これらの結果は、ストレスの管理、耐病性及び神経系維持の遺伝子の増強された上方制御における本発明の予想外の効果の証拠を提供する；本発明の試験で得られた結果及び実施形態との間のメカニズム的な関連を与えるものである。従って、本発明は、医薬品投入の必要性を低減し、効果的に置き換えるための新規かつ、進歩性を有するアプローチを開示し、動物の健康と収量の両方を増加させるものである。

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Claims

－短鎖脂肪酸；
－窒素化合物；
－イノシトールの供給源；及び
－キシラナーゼの供給源、
を含む飼育されている家禽が摂取する飲料水に添加するための飼料サプリメントであって、
ここで、前記短鎖脂肪酸が、ギ酸、プロピオン酸及び酪酸を含む群から何れかの組み合わせで選択され、前記窒素化合物が、アンモニア及びプロピオン酸アンモニウムを含む群から何れかの組み合わせで選択され、前記イノシトールの供給源が、ミオイノシトールであり、及び前記キシラナーゼの供給源が、ラクトバチルス・プランタルム及び単離されたキシラナーゼを含む群から何れかの組み合わせで選択される、飼料サプリメント。
前記サプリメントが、乳酸をさらに含む、請求項１に記載の飼料サプリメント。
前記サプリメントが、中鎖脂肪酸をさらに含む、請求項１又は２に記載の飼料サプリメント。
前記中鎖脂肪酸が、ラウリン酸及びパルミチン酸を含む、請求項３に記載の飼料サプリメント。
前記サプリメントが、ラクトバチルスｓｐｐ．、プロピオニバクテリウムｓｐｐ．及びバチルスｓｐｐ．を含む群から何れかの組み合わせで選択される細菌をさらに含む、請求項１～４の何れか１項に記載の飼料サプリメント。
前記サプリメントが、ビスグリシン酸マグネシウムをさらに含む、請求項１～５の何れか１項に記載の飼料サプリメント。
前記マグネシウムの供給源が、ビスグリシン酸マグネシウムである、請求項６に記載の飼料サプリメント。
前記家禽が、鶏である、請求項１に記載の飼料サプリメント。
家禽が摂取するための飲料水に添加するための飼料サプリメントであって、前記サプリメントが、
－３０重量％～５０重量％のプロピオン酸；
－５重量％～３０重量％の乳酸；
－１重量％～１５重量％のギ酸；
－５重量％～１５重量％のアンモニア；
－１０重量％～１５重量％のプロピオン酸アンモニウム；
－０．１重量％～１重量％のマグネシウム；
－０．５重量％～３重量％のクエン酸；
－０．５重量％～１５重量％のミオイノシトール；
－１重量％～１０重量％のラクトバチルス・プランタルム培養物；及び
－０．５重量％～６重量％のキシラナーゼ、
を含む、飼料サプリメント。