BR112020010743A2 - regimes e composições de imunização de hepatite b - Google Patents

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Babak Bayat
Clarisse Lorin
Ventzislav Bojidarov Vassilev
Alessandra Vitelli
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Glaxosmithkline Biologicals S.A.
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Abstract

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas e suas combinações, que podem encontrar uso em regimes de imunização para o tratamento da hepatite B crônica. Uma composição imunogênica compreende um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd), compreendendo polinucleotídeos que codificam HBs, cadeia invariante humana (hli) de HBc fundida ao HBc. Outra composição imunogênica compreende um vetor do Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo polinucleotídeos que codificam HBs e HBc. Outra composição imunogênica compreende HBs recombinantes, HBc recombinante truncado no C-terminal e um adjuvante contendo MPL e QS-21.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REGIMES E COMPOSIÇÕES DE IMUNIZAÇÃO DE HEPATITE B".
CAMPO DE INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a novas composições que podem encontrar uso em esquemas de imunização para o tratamento da hepatite B crônica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é um grande pro- blema de saúde pública. Globalmente, aproximadamente 257 milhões de pessoas estão infectadas com o HBV [OMS, 2017]. O curso clínico e o resultado da infecção pelo HBV são amplamente influenciados pe- la idade da infecção e por uma interação complexa entre o vírus e a resposta imune do hospedeiro [Ott, 2012; Maini, 2016]. Assim, a expo- sição ao HBV pode levar a hepatite aguda que se resolve espontane- amente ou pode progredir para várias formas de infecção crônica, in- cluindo o estado do veículo do antígeno de superfície da hepatite B inativa (HBsAg), hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC) [Liaw, 2009 ] A prevalência de HBsAg na população adulta é > 2%, com taxas de 5-8% no Sudeste Asiático e na China e > 8% na Região Africana. Entre 15-40% das pessoas com infecção pela hepati- te B crônica (definida como HBsAg sérica sendo detectado por mais de 6 meses) desenvolverão sequelas hepáticas, das quais cirrose he- pática (CL), descompensação hepática e HCC são as principais com- plicações.
[0003] Embora a implementação da imunização profilática univer- sal contra hepatite B em lactentes tenha sido altamente eficaz na re- dução da incidência e prevalência de hepatite B em muitos países en- dêmicos, ainda não levou a uma forte diminuição na prevalência de infecção por hepatite B crônica (CHB) em adolescentes e adultos, e não espera-se que tenha impacto nas mortes relacionadas ao HBV até várias décadas após a introdução. Em 2015, a hepatite B foi respon- sável por 887.000 mortes, principalmente por cirrose hepática e HCC [OMS, 2017].
[0004] O gerenciamento clínico da hepatite B crônica visa a melho- rar a sobrevida e a qualidade de vida, prevenindo a progressão da do- ença e, consequentemente, o desenvolvimento de HCC [Liaw, 2013]. A estratégia de tratamento atual baseia-se principalmente na supres- são de longo prazo da replicação do DNA de HBV para alcançar a es- tabilização da doença hepática induzida pelo HBV e impedir a pro- gressão. O nível sérico de DNA de HBV é um desfecho fundamental de todas as modalidades de tratamento atuais. Atingir a perda de antí- geno e de hepatite B (detectável) (HBeAg) é outro biomarcador valio- so, porém a perda de HBsAg, com ou sem soroconversão anti-HBs, é geralmente considerada um desfecho ideal que representa "cura fun- cional", pois indica uma supressão profunda de replicação de HBV e expressão de proteínas virais [Block, 2017; Cornberg, 2017]. Atual- mente, existem duas opções principais de tratamento para pacientes com CHB: por interferon alfa peguilado (PeglFNa) ou por análogos de nucleotídeo(s) (NA) [NA) [EASL, 2017]. PeglFNa que tem o objetivo induzir um controle imune de longo prazo com um tratamento de dura- ção finita pode obter um controle prolongado fora do tratamento, mas a resposta virológica durável e a perda do antígeno de superfície da he- patite B (HBsAg) são limitadas a uma pequena razão de pacientes. Além disso, devido à sua baixa tolerabilidade e preocupações de segu- rança de longo prazo, um número significativo de pacientes é inelegí- vel para esse tipo de tratamento.
[0005] NAs atuam suprimindo a replicação do DNA através da ini- bição da atividade da transcriptase reversa da polimerase de HBV. NAs aprovados na Europa para o tratamento de HBV incluem enteca- vir (ETV), tenofovir disoproxil fumarato (TDF) e tenofovir alafenamida
(TAF) associados a alta barreira contra resistência ao HBV, bem como lamivudina (LAM), adefovir dipivoxil (ADV) e telbivudina (TBV) que es- tão associados a baixa barreira à resistência ao HBV. A principal van- tagem do tratamento com um NA potente com alta barreira à resistên- cia é sua alta eficácia antiviral previsível de longo prazo, levando à su- pressão do DNA de HBV na grande maioria dos pacientes aderentes, bem como seu perfil de segurança favorável. A desvantagem do tra- tamento com NA é seu regime terapêutico de longo prazo, porque uma NA normalmente não atinge a erradicação de HBV e a descontinuação de NA pode levar à recaída de HBV [Kranidioti, 2015]. A perda de HBsAg representando uma cura funcional é agora o desfecho do tra- tamento padrão-ouro em CHB [Block, 2017; Cornberg, 2017], que, no entanto, raramente é alcançado com o tratamento de NA [Zoutendi]k, 2011].
[0006] Devido a uma baixa taxa de HBsAg seroclrearance [Zou- tendijk, 2011] e um alto risco de recaída viral fora de NA [Kranidioti, 2015], a maioria dos pacientes é mantida sob terapia de NA de longo prazo ou mesmo indefinida, que pode estar associada à redução de adesão do paciente à terapia, aumento dos custos financeiros e au- mento do risco de toxicidade e resistência a medicamentos após ex- posição de longo prazo [Terrault, 2015]. Portanto, é necessária uma nova estratégia para complementar a terapia de NA para alcançar a "cura funcional" com um regime finito.
[0007] Novas estratégias de tratamento atualmente sendo explo- radas incluem novas estratégias antivirais, bem como novas estraté- gias imunoterapêuticas que aumentam a resposta imune adaptativa específica ao HBV ou ativam a imunidade intra-hepática inata [Duran- tel, 2016]. Até agora, nenhuma dessas experiências, os tratamentos demonstraram ser eficazes. Entre as estratégias de vacinação avalia- das, nenhuma foi capaz de induzir uma resposta robusta das células T
CD8+ polifuncionais ao antígeno núcleo de HBV (HBcAg), que é de fundamental importância para restaurar o controle imunológico do ví- rus [Lau, 2002; Li, 2011; Liang, 2011; Bertoletti, 2012; Boni, 2012]. Os esforços anteriores em vacinas recombinantes baseadas na superfície de HBV e/ou antígenos PreS induziram preliminarmente respostas de anticorpos, mas nenhuma resposta de células T CD8+ específicas de HBV, sem benefício clínico ou virológico [Jung, 2002; Vandepapeliêre, 2007]. Uma vacina de DNA que expressa o envelope de HBV falhou em restaurar a resposta das células T específicas ao HBsAg e HBcAg, portanto, não diminuiu o risco de recaída em pacientes após a descon- tinuação de NA [Fontaine, 2015]. Com os novos sistemas de entrega, uma vacina de DNA (vacina principal) e uma vacina de vetor viral MVA (vacina de reforço) que codifica S, preS1/S2 não mostraram indução de células T ou redução na viremia, sugerindo que PreS de HBV e an- tígenos de superfície isolados não são suficientes para curar pacientes [Cavenaugh, 2011]. Mais recentemente, estratégias de vacina direcio- nadas a múltiplos antígenos de HBV e novos sistemas de entrega fo- ram investigadas.
Uma vacina recombinante contra HBsAg/HBcAg le- vou a uma diminuição da carga viral para um nível muito baixo (isto é, — 50 IU/ml) em apenas metade dos pacientes [Al-Mahtab, 2013]. Uma vacina de DNA que codifica as proteínas S, preS1/S2, núcleo, polime- rase e X com IL-12 geneticamente adjuvante, em conjunto com a lami- vudina, induziu uma resposta de células T multiespecífica e uma dimi- nuição > 2 log10 na carga viral em metade dos pacientes.
No entanto, alterações na detecção quantitativa de HBsAg, perda de HBsAg ou soroconversão de HBsAg não foram observadas em nenhum paciente [Yang, 2012]. A vacina GS-4774, uma vacina de célula T à base de levedura que expressa proteínas S, núcleo e X grandes de HBV não proporcionou redução significativa no HBsAg em pacientes com CHB suprimidos por vírus [Lok, 2016].
[0008] Ainda existe uma necessidade não atendida de um trata- mento que possa eliminar o HBsAg, a fim de permitir que os pacientes descontinuem com segurança a terapia de NA sem recaída virológica ou clínica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] É fornecida uma composição imunogênica compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de su- perfície da hepatite B (HBs), um ácido nucleico que codifica um antí- geno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e um ácido nucleico que codifica a cadeia invariante humana (hli) fundida ao HBc. A composi- ção pode ser utilizada em um método para o tratamento da hepatite B crônica pela administração da composição em um regime de reforço primário com pelo menos uma outra composição imunogênica.
[0010] Em um aspecto adicional, é fornecida uma composição imu- nogênica compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc). A composição pode ser utiizada em um método para o tratamento da hepatite B crônica pela administração da composição em um regime de reforço primário com pelo menos uma outra composição imunogênica.
[0011] Em um aspecto adicional, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) recombinante, um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B re- combinante truncado no C-terminal (HBc) e um adjuvante contendo MPL (3D Monofosforil lipídio A) e OS-21 (um glicosídeo triterpeno puri- ficado da casca de Quillaja sapnoaria). A composição pode ser utiliza- da em um método para o tratamento da hepatite B crônica pela admi- nistração da composição em um regime de reforço primário com pelo menos uma outra composição imunogênica.
[0012] Em um aspecto adicional, é fornecida uma combinação imunogênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno de su- perfície da hepatite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) e um adjuvante.
[0013] A combinação imunogênica pode ser utilizada em um mé- todo para o tratamento da hepatite B crônica (CBH) pela administração das composições em um regime de reforço primário.
[0014] A combinação imunogênica pode ser útil em um método para o tratamento de CHB em um ser humano pela administração das composições sequencial ou concomitantemente. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
[0015] FIG. 1 - Respostas de células T CD8+ específicas de HBc (A) e específicas de HBs (B) 14 dias após a imunização primária com ChAd155-HBV (com e sem hli) e 7 dias após a imunização de reforço de MVA-HBV (animais individuais com mediana são representados).
[0016] FIG. 2 - Respostas de anticorpo específico de HBc 14 dias após a imunização primária com ChAd155-HBV (com e sem hli) e 7 dias após a imunização de reforço de MVA-HBV (animais individuais com titulações gemédias (GMT) são representados)
[0017] FIG. 3 - Respostas de células T CD4+ específicas de HBc e HBs aos 7 dias após a terceira dose de NaCl, HBc, HBs ou HBc-HBs formuladas em 50 ul de ASO01g4 (agrupamentos de 5 animais/grupo com medianas são representados)
[0018] FIG. 4 - Resposta de células T CD8+ específicas de HBs aos 7 dias após a terceira dose de NaCl. HBc, HBs ou HBc-HBs for- mulados em 50 ul de ASO01g-4 (agrupamentos de 5 animais/grupo com medianas são representados)
[0019] FIG. 5 - Respostas de anticorpos anti-HBc e anti-HBs aos 14 dias após a terceira dose de NaCl, HBc, HBs ou HBc-HBs formula- dos em 50ul de ASO01g-4 (animais individuais com geomédias e CI de 95% são representados)
[0020] FIG. 6 - Respostas de células T CD4+ específicas de HBs- (A) e HBc- (B) e CD8+ (C) específicas de HBs aos 7 dias após a ter- ceira dose de NaCl, HBc-HBs, HBc-HBs mais alúmen, HBc-HBs mais ASO01g-4 ou HBc-HBs mais ASO01e-4 (agrupamentos de 5 animais/grupo com medianas são representados)
[0021] FIG. 7 - Respostas de anticorpo específico de HBs- (A) e HBc- (B) aos 14 dias após a terceira dose de NaCl, HBc-HBs, HBc- HBs mais alúmen, HBc-HBs mais ASO01g4 ou HBc-HBs mais ASO01e+4 (animais individuais com geomédias e IC de 95% são representados)
[0022] FIG. 8 - Respostas de células T CD8+ específicas de HBc- (A) e HBs- (B) aos 7 dias após a segunda e quarta dose de NaCl, re- forço primário de vetor heterólogo com proteínas recombinantes sub- sequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com proteínas re- combinantes concomitantes (animais individuais com medianas)
[0023] FIG. 9 - Respostas de células T CD4+ específicas de HBc- (A) ou HBs- (B) aos 7 dias após a segunda e quarta dose de NaCl, re- forço primário de vetor heterólogo com proteínas recombinantes sub-
sequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com proteínas re- combinantes concomitantes (animais individuais com medianas)
[0024] FIG. 10 - Células T CD4+ (A) e CD8+ (B) específicas de HBc e HBs em linfócitos infiltrados no fígado 7 dias após a quarta dose de NaCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombi- nantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com concomitante proteínas recombinantes (grupos de 3 ou 4 animais com medianas)
[0025] FIG. 11 - Resposta de anticorpos específicos de HBc (A) e específicos de HBs (B) após regimes de vacina de reforço primário (animais individuais com geomédias são representados)
[0026] FIG. 12 - Respostas ELISpot de IFNy específicas de mli-, HBc e HBs, 2 semanas após a primeira e segunda injeções de PBS ou vetor ChAd155-mli-HBV (109 vp)
[0027] FIG. 13 - Respostas de anticorpos anti-mli (ELISA) desen- cadeadas por 2 administrações de ChAd155-mli-HBV (109vp) em ca- mundongos CB6F1, 2 semanas após a primeira e a segunda injeções
[0028] FIG. 14 - Células T CD8+ de baço (A) ou fígado (B) especí- ficas de HBc, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NacCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombi- nantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com pro- teínas recombinantes concomitantes (animais individuais com media- nas)
[0029] FIG. 15 - Células T CD4+ do baço (A) ou fígado (B) especí- ficas de HBc, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NaCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombi- nantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com pro- teínas recombinantes concomitantes (animais individuais com media- nas)
[0030] FIG. 16 - Células T CD8+ de baço (A) ou fígado (B) especí-
ficas de HBs, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NaCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombi- nantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com pro- teínas recombinantes concomitantes (animais individuais com media- nas)
[0031] FIG. 17 - Células T CD4+ de baço (A) ou fígado (B) especí- ficas de HBs, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NacCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombi- nantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com pro- teínas recombinantes concomitantes (animais individuais com media- nas)
[0032] FIG. 18 - Respostas de anticorpos anti-HBs (A) e anti-HBc (B) nos dias 23, 65 e 93 (pré-dosagem, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NaCl, reforço primário de vetor heterólo- go com proteínas recombinantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombinantes concomitantes)
[0033] FIG. 19 - Níveis de AST (A) e ALT (B) medidos em soros de camundongos (grupos 1, 2, 3 e 4) nos dias 38, 65 e 93 (7 dias após a primeira, segunda e pós-quarta dose de NaCl, reforço primário de ve- tor heterólogo com proteínas recombinantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com grupos de proteínas recombinantes concomitantes 1, 2, 3) ou no dia 93 (grupo 4)
[0034] FIG. 20 - Níveis de antígeno de HBs em soros de pré- dosagem de camundongos injetados com AAV2/8-HBV, 7 dias após a segunda dose e 7 dias após a quarta dose de NaCl, reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombinantes subsequentes ou reforço primário de vetor heterólogo com proteínas recombinantes concomitantes
[0035] FIG. 21 - Estrutura de construto HBc-2A-HBs
[0036] FIG. 22 - Estrutura de construto hli-HBc-2A-HBs
[0037] FIG. 23 - Frequência de células T CD4+ específicas de HBc e HBs nos leucócitos de camundongos CB6F1 7 dias após a 2º imuni- zação com HBc, HBs e HBc/HBs adjuvantes em várias proporções
[0038] FIG. 24 - Frequência de células T CD4+ específicas de HBc e HBs nos leucócitos de camundongos CB6F1 7 dias após a 3º imuni- zação com HBc, HBs e HBc/HBs adjuvantes em várias proporções
[0039] FIG. 25 — Frequência de células T CD8+ específicas de HBs nos leucócitos de camundongos CB6F1, 7 dias após a 2º e a 3º imunização com HBc, HBs e HBc/HBs adjuvantes em várias propor- ções
[0040] FIG. 26 - Respostas anti-HBc e HBs-humorais induzidas em camundongos CB6F1 aos 14 dias após a 2º imunização com HBc, HBs e HBc/HBs adjuvantes em várias proporções
[0041] FIG. 27 - Respostas anti-HBc e HBs-humorais induzidas em camundongos CB6F1 aos 14 dias após a 3º imunização com HBc, HBs e HBc/HBs adjuvantes em várias proporções
LISTAS DE SEQUÊNCIA
[0042] SEQ ID NO: 1: Sequência de aminoácidos de HBs
[0043] SEQ ID NO: 2: Sequência de aminoácidos de HBc truncado
[0044] SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácidos do espaçador que incorpora região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa
[0045] SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotídeos que codifica es- paçador que incorpora região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa
[0046] SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos de HBc-2A-HBs
[0047] SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotídeos que codifica HBc-2A-HBs
[0048] SEQ ID NO: 7: Sequência de aminoácidos de hli
[0049] SEQ ID NO: 8: Sequência de nucleotídeos que codifica hli
[0050] SEQ ID NO: 9: Sequência de aminoácidos de hli-HBc-2A- HBs
[0051] SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotídeos que codifica hli-HBc-2A-HBs
[0052] SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos de HBc
[0053] SEQ ID NO: 12: Sequência de aminoácidos da variante al- ternativa hli
[0054] SEQ ID NO: 13: Sequência de nucleotídeos que codifica variante alternativa hl!
[0055] SEQ ID NO: 14: Sequência de ácidos nucleicos alternativa de hli-HBc-2A-HBs
[0056] SEQ ID NO: 15: Sequência de aminoácidos alternativa de hli-HBc-2A-HBs
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[0057] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm os mesmos significa- dos que são comumente entendidos por um versado na técnica. Por exemplo, os termos aqui utilizados são definidos como descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommenda- tions)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e KIbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiça.
[0058] Ao longo desta especificação e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender" e variações como "compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qual- quer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
[0059] Vários documentos são citados ao longo do texto desta es- pecificação. Cada um dos documentos citados neste documento (in- cluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científi-
cas, especificações do fabricante, instruções, etc.), supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada neste docu- mento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de anteceder essa divulgação em virtude da inven- ção anterior. Todas as definições aqui fornecidas no contexto de um aspecto da invenção também se aplicam aos outros aspectos da in- venção.
[0060] Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usa- dos aqui de forma intercambiável e se referem a qualquer cadeia de aminoácidos ligada ao peptídeo, independentemente do comprimento, modificação cotraducional ou pós-tradução. Uma proteína de fusão (ou "proteína quimérica") é uma proteína recombinante compreendendo duas ou mais proteínas ligadas a peptídeos. As proteínas de fusão são criadas através da união de dois ou mais genes que originalmente co- dificaram para as proteínas separadas. A tradução deste gene de fu- são resulta em uma única proteína de fusão. Em relação a uma proteí- na ou polipeptídeo, recombinante significa que a proteína é expressa a partir de um polinucleotídeo recombinante.
[0061] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são usados aqui de forma intercambiável e se referem a uma macromolécula poli- mérica feita a partir de monômeros de nucleotídeos. Adequadamente, os polinucleotídeos da invenção são recombinantes. Recombinante significa que o polinucleotídeo é o produto de pelo menos uma das etapas de clonagem, restrição ou ligação ou outros procedimentos que resultam em um polinucleotídeo que é distinto de um polinucleotídeo encontrado na natureza.
[0062] Uma sequência heteróloga de ácido nucleico refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que não é isolada, derivada ou baseada em uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural encontrada no organismo hospedeiro. "Ocorrência natural" significa uma sequência encontrada na natureza e não preparada ou modifica- da sinteticamente. Uma sequência é "derivada" de uma fonte quando é isolada de uma fonte, mas modificada (por exemplo, por exclusão, substituição (mutação), inserção ou outra modificação), adequadamen- te, para não interromper a função normal do gene de origem.
[0063] Adequadamente, os polinucleotídeos utilizados na presente invenção são isolados. Um polinucleotídeo "isolado" é aquele que é removido de seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeo de ocorrência natural é isolado se for separado de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural. Um polinucleotídeo é considerado isolado se, por exemplo, for clonado em um vetor que não faz parte de seu ambiente natural ou se estiver incluído no cDNA.
[0064] O termo "tratamento", conforme usado aqui em relação à infecção crônica pela hepatite B, refere-se à administração de compo- sições com a intenção de reduzir os sintomas de CHB, impedir a pro- gressão de CHB ou reduzir o nível de um ou mais marcadores detec- táveis de CHB. O termo "tratamento" deve ser interpretado de acordo. Por exemplo, impedir a progressão de CHB pode incluir impedir o apa- recimento de doença hepática ou estabilizar doença hepática preexis- tente, como indicado pelos níveis de ALT (alanina transaminase), fi- brose hepática ou outros marcadores detectáveis adequados. Outros marcadores de CHB incluem o nível sérico de DNA de HBV, que é um indicador de replicação viral e o nível sérico de antígeno de HBs, que é um indicador da carga viral, assim, o tratamento de CHB pode incluir a redução do nível sérico de HBsAg (por exemplo, conforme determina- do por imunoensaio quantitativo) ou DNA de HBV (por exemplo, con- forme determinado pelo ensaio Cobas& HBV (Roche) ou equivalente) a níveis indetectáveis ("limpeza" de HBsAg ou DNA de HBV).
[0065] A administração "concomitante", conforme aqui utilizada, refere-se à administração durante a mesma resposta imune em anda-
mento e "concomitantemente" deve ser interpretada de acordo. Prefe- rivelmente, ambos os componentes são administrados ao mesmo tempo (tal como administração concomitante de uma composição compreendendo um vetor e uma composição compreendendo uma proteína); no entanto, um componente pode ser administrado dentro de alguns minutos (por exemplo, na mesma consulta médica ou visita médica), ou dentro de algumas horas do outro componente. Essa ad- ministração também é referida como coadministração. A administração concomitante de componentes separados pode ocorrer através da mesma via de administração, por exemplo, injeção intramuscular. Al- ternativamente, a administração concomitante de componentes sepa- rados pode ocorrer através de diferentes vias de administração, por exemplo, injeção intramuscular e injeção intradérmica, administração intramuscular e intranasal, administração inalatória e subcutânea etc. Em algumas modalidades, a administração concomitante pode se refe- rir à administração de um vetor adenoviral, e um componente proteico. Em outras modalidades, a coadministração refere-se à administração de um vetor adenoviral e outro vetor viral, por exemplo, um poxvírus como o MVA. Em outras modalidades, coadministração refere-se à administração de um vetor adenoviral e de um componente proteico, no qual o componente proteico é adjuvante.
[0066] A administração "sequencial" refere-se à administração de uma primeira composição, seguida pela administração de uma segun- da composição um tempo significativo posteriormente. O período de tempo entre duas administrações sequenciais é de 1 semana a 12 meses, por exemplo, entre 2 semanas e 12 semanas, por exemplo, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas 8 semanas ou 12 sema- nas, 6 meses ou 12 meses. Mais particularmente, ocorre entre 4 e 8 semanas, por exemplo, o período de tempo entre administrações se- quenciais pode ser de 4 semanas. Assim, a administração sequencial abrange uma primeira administração e uma subsequente em um am- biente de reforço primário, isto é, quando a administração da segunda composição não é realizada durante a resposta imune em andamento gerada pela primeira administração.
[0067] "Combinação imunogênica", conforme aqui utilizado, refere- se a uma pluralidade de composições imunogênicas formuladas sepa- radamente, administradas sequencial e/ou concomitantemente em um único regime de imunização, por exemplo um regime de reforço primá- rio, cada composição imunogênica formulada separadamente sendo um componente da combinação imunogênica.
[0068] No que diz respeito às homologias percentuais, observando um alinhamento pareado de duas sequências, podem ser observados resíduos idênticos alinhados ('identidades') entre as duas sequências, Uma porcentagem de identidade (ou homologia) pode ser calculada multiplicando por 100 (a) o quociente entre o número de identidades e o comprimento total da sequência de referência (ou seja, Percentual de identidade = (Número de identidades x 100)/Comprimento da se- quência de referência.
COMPOSIÇÕES E COMBINAÇÕES
[0069] Em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um vetor ChAd selecionado a partir do grupo que consiste em ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAd155, ChAd157, Pan 5, Pan 6, Pan 7 (também referido como C7) e Pan 9, em particular, ChAd63 ou ChAd155, que inclui uma inserção de vetor que codifica HBc e HBs. Em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalidades, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são sepa- rados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A de FMDV. Em certas modalidades, HBc é fun-
dido a hli.
Em uma modalidade específica, a composição compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinu- cleotídeo que codifica hli, HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 22. Em certas modalidades, a inserção de vetor codifica HBc (por exem- plo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), se- parados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em certas modalidades, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma ou SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor ChAd155. Em uma modalidade, a com- posição compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inser- ção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO.9. Em uma modalidade, a composição compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinu- cleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a composição compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifi- ca a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.15. Em uma modalida- de, a composição compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a sequência de nucle-
otídeos dada em SEQ ID NO: 14.
[0070] Em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um vetor MVA que inclui uma inserção de vetor que codifica HBc e HBs, separada por uma se- quência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalidades, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica um espa- çador que incorpora a região de clivagem 2A de FMDV. Em uma mo- dalidade específica, a composição compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 21. Em certas modalidades, a inserção de vetor codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em uma moda- lidade, a composição compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.5. Em uma modalidade, a composição compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 6.
[0071] Em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo um antígeno recombinante de superfície da hepatite B (HBs) de comprimento completo, um antí- geno recombinante do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) truncado no C-terminal e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, o HBc recombinante truncado compreende o domínio de montagem de HBc, por exemplo, incluindo 145-149 aminoácidos do domínio de montagem de uma proteína antigênica do núcleo do tipo selvagem, por exemplo aminoácidos 1-145, 1-146, 1-147, 1-148 ou aminoácidos 1-149 de uma proteína antigênica do núcleo da hepatite B de tipo selvagem.
Em uma modalidade, a composição compreende HBs recombinantes de comprimento total, aminoácidos 1-149 de HBc e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em certas modalida- des, a proteína recombinante HBs e antígenos HBc estão na forma de partículas semelhantes a vírus.
Em uma modalidade, a composição compreende HBc recombinante e HBs recombinante na razão de 1:1. Em outra modalidade, a razão de HBc para HBs na composição é maior que 1, por exemplo, a razão de HBc para HBs pode ser de 1,5:1, 2:1,2,5:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 4,5:1, 5:1, 5,5:1, 6:1 ou mais, especialmente 3:1 a 5:1, como 3:1, 4:1 ou 5:1, particularmente uma razão de 4:1. Em modalidades particulares, a composição compreende HBc recombi- nante e HBs recombinante em uma razão de 4:1 ou mais.
Em certas modalidades, a composição compreende um antígeno de superfície da hepatite B recombinante de comprimento total (HBs) (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) truncado no C-terminal e um adjuvante compre- endendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, o HBc recombinante truncado compreende o domínio de montagem de HBc, por exemplo, os aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, a composição pode compreender HBs recombinantes de comprimento total (SEQ ID NO: 1), aminoácidos 1-149 de HBc (SEQ ID NO: 2) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol em uma so-
lução salina tamponada com fosfato.
[0072] Em um aspecto adicional, é fornecida uma combinação imunogênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno de su- perfície da hepatite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) e um adjuvante.
[0073] Em uma modalidade, a composição da parte a) da combi- nação imunogênica compreende um vetor ChAd selecionado a partir do grupo que consiste em ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAd155, ChAd157, Pan 5, Pan 6, Pan 7 (também conhecido como C7) e Pan 9, em particular, ChAd63 ou ChAd155, que inclui uma inserção de vetor que codifica HBc e HBs. Em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalidades, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são sepa- rados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A de FMDV. Em certas modalidades, HBc é fun- dido a hli. Em uma modalidade específica, a composição da parte a) da combinação imunogênica compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica hi,
HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 22. Em certas modalidades, a inserção de vetor codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em certas mo- dalidades, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 98% homóloga à mesma ou SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor ChAd155. Em uma modalidade, a composição da parte a) da combinação imunogênica compreende um vetor ChAd155 que com- preende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO.9. Em uma modalidade, a composição da parte a) da combinação imunogênica compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleo- tídeo tendo a sequência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, a composição da parte a) da combinação imunogê- nica compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.15. Em uma modalidade, a composição da parte a) da combinação imunogênica compreende um vetor ChAd155 que com- preende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 14.
[0074] Em uma modalidade, a composição da parte b) da combi- nação imunogênica compreende um vetor MVA que inclui uma inser- ção de vetor que codifica HBc e HBs, separada por uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalidades, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica um espaçador que in- corpora a região de clivagem 2A de FMDV. Em uma modalidade espe- cífica, a composição da parte b) da combinação imunogênica compre- ende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de poli- nucleotídeo que codifica HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 21. Em certas modalidades, a inserção de vetor codifica HBc (por exem- plo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), se- parados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em uma modalidade, a composição da parte b) da combina- ção imunogênica compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO.5. Em uma modalidade, a composição da par- te b) da combinação imunogênica compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a se- quência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 6.
[0075] Em uma modalidade, a composição da parte c) da combi- nação imunogênica compreende um antígeno recombinante de super- fície da hepatite B (HBs), um antígeno recombinante do núcleo do ví- rus da hepatite B (HBc) truncado no C-terminal e um adjuvante com-
preendendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, o HBc recombi- nante truncado compreende o domínio de montagem de HBc, por exemplo, incluindo 145-149 aminoácidos do domínio de montagem de uma proteína antigênica do núcleo do tipo selvagem, por exemplo, aminoácidos 1-145, 1-146, 1-147, 1-148 ou aminoácidos 1-149 de uma proteína antigênica do núcleo da hepatite B de tipo selvagem.
Em uma modalidade, a composição da parte c) da combinação imunogênica compreende HBs recombinantes de comprimento total, aminoácidos 1- 149 de HBc e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, a proteína recombinante HBs e antígenos HBc estão na forma de partículas semelhantes a vírus.
Em uma modalidade, a com- posição compreende HBc recombinante e HBs recombinante na razão de 1:1. Em outra modalidade, a razão de HBc para HBs na composi- ção é maior que 1, por exemplo, a razão de HBc para HBs pode ser de 1,5:1, 2:1, 2,5:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 4,5:1, 5:1, 5,5:1, 6:1 ou mais, especi- almente 3:1 a 5:1, como 3:1, 4:1 ou 5:1, particularmente uma razão de 4:1. Em modalidades particulares, a composição da parte c) da combi- nação imunogênica compreende HBc recombinante e HBs recombi- nante em uma razão de 4:1 ou mais.
Em certas modalidades, a com- posição compreende um antígeno de superfície da hepatite B recom- binante de comprimento total (HBs) (por exemplo, SEQ ID NO: 1), um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) trunca- do no C-terminal e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, o HBc recombinante truncado compreende o do- mínio de montagem de HBc, por exemplo, aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Por exemplo, a composição da parte c) da combinação imunogênica compreende HBs recombinantes de comprimento total (SEQ ID NO: 1), aminoácidos 1-149 de HBc (SEQ ID NO: 2) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol, por exem-
plo, em uma solução salina tamponada com fosfato.
[0076] Assim, em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma combinação imunogênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifi- ca hli, HBc, 2A e HBs; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica HBc, 2A e HBs; e c) uma composição compreendendo uma proteína HBs recombinante, uma proteína HBc recombinante truncada e um adju- vante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de diole- oil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol.
[0077] Em uma dessas modalidades, a combinação imunogênica compreende: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifi- ca a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.5; e c) uma composição compreendendo uma proteína HBs re- combinante de SEQ ID NO: 1, uma proteína HBc truncada recombi- nante de SEQ ID NO: 2 e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e coleste- rol.
[0078] Em outra modalidade, a combinação imunogênica compre- ende: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 10 ou uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 14; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO.6; e c) uma composição compreendendo uma proteína HBs re- combinante de SEQ ID NO: 1, uma proteína HBc truncada recombi- nante de SEQ ID NO: 2 e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e coleste- rol.
[0079] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit que compreende os seguintes componentes: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno recom- binante de superfície da hepatite B (HBs), antígeno recombinante do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e um adjuvante, com instruções para administração dos componentes sequencial ou concomitantemente para o tratamento de CHB.
[0080] Em uma modalidade, a composição do componente a) do kit compreende um vetor ChAd selecionado a partir do grupo que con-
siste em ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAd155, ChAd157, Pan 5, Pan 6, Pan 7 (também conhecido como C7) e Pan 9, em particular, CRhAd63 ou ChAd155, que inclui uma inserção de vetor que codifica HBc e HBs.
Em uma modalidade, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalidades, os poli- nucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma se- quência que codifica um espaçador que incorpora a região de cliva- gem 2A de F MDV.
Em certas modalidades, HBc é fundido a hli.
Em uma modalidade específica, a composição do componente a) do kit compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de ve- tor de polinucleotídeo que codifica hli, HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 22. Em certas modalidades, a inserção de vetor codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 98% homóloga à mesma). Em certas modalidades, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 98% homóloga à mesma) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma ou SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor ChAd155. Em uma modalidade, a composição do componente a) do kit compre-
ende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.9. Em uma modalidade, a composição do componente a) do kit compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de ve- tor de polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade, o componente de composição a) do kit compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inser- ção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO.15. Em uma modalidade, a composição do compo- nente a) do kit compreende um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotí- deos dada em SEQ ID NO: 14.
[0081] Em uma modalidade, a composição do componente b) do kit compreende um vetor MVA que inclui uma inserção de vetor que codifica HBc e HBs, separada por uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV). Em certas modalida- des, os polinucleotídeos que codificam HBs e HBc são separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A de FMDV. Em uma modalidade específica, a composição do componente b) do kit compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica HBc, 2A e HBs, por exemplo, uma inserção que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 21. Em certas modalidades, a inserção do vetor codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de ami- noácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em uma modalidade, a compo-
sição do componente b) do kit compreende um vetor MVA que com- preende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO.5. Em uma modalidade, o componente de composição b) do kit compreende um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo tendo a se- quência de nucleotídeos dada em SEQ ID NO: 6.
[0082] Em uma modalidade, o componente de composição c) do kit compreende um antígeno recombinante de superfície da hepatite B (HBs), um antígeno recombinante do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) truncado no C-terminal e um adjuvante compreendendo MPL e QS- 21 Em certas modalidades, o HBc recombinante truncado com- preende o domínio de montagem de HBc, por exemplo, incluindo 145- 149 aminoácidos do domínio de montagem de uma proteína antigênica do núcleo do tipo selvagem, por exemplo aminoácidos 1-145, 1-146, 1- 147, 1-148 ou aminoácidos 1-149 de uma proteína antigênica do nú- cleo da hepatite B de tipo selvagem. Em uma modalidade, a composi- ção do componente c) do kit compreende HBs recombinantes de com- primento total, aminoácidos 1-149 de HBc e um adjuvante compreen- dendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, a proteína recombinante HBs e antígenos HBc estão na forma de partículas semelhantes a ví- rus. Em uma modalidade, a composição compreende HBc recombi- nante e HBs recombinante na razão de 1:1. Em outra modalidade, a razão de HBc para HBs na composição é maior que 1, por exemplo, a razão de HBc para HBs pode ser de 1,5:1, 2:1, 2,5:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 4,5:1, 5:1, 5,5:1, 6:1 ou mais, especialmente 3:1, 4:1 ou 5:1, particu- larmente uma razão de 4:1. Em modalidades particulares, a composi- ção do componente c) do kit compreende HBc recombinante e HBs recombinante em uma razão de 4: 1 ou mais. Em certas modalidades, a composição compreende um antígeno de superfície da hepatite B recombinante de comprimento total (HBs) (por exemplo, SEQ ID NO:
1), um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) truncado no C-terminal e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em certas modalidades, o HBc recombinante truncado compreende o domínio de montagem de HBc, por exemplo, aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Por exemplo, a composição do componente c) do kit compreende HBs recombinantes de comprimento total (SEQ ID NO: 1), aminoácidos 1-149 de HBc (SEQ ID NO: 2) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos por dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol, por exemplo, em uma so- lução salina tamponada com fosfato.
[0083] Em uma modalidade, o Kit compreende os seguintes com- ponentes: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 10 ou uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 14; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo de SEQ ID NO.6; e c) uma composição compreendendo uma proteína HBs re- combinante de SEQ ID NO: 1, uma proteína HBc truncada recombi- nante de SEQ ID NO: 2 e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e coleste- rol, com instruções para administração dos componentes sequencial ou concomitantemente para o tratamento de CHB.
REGIMES
[0084] A presente divulgação descreve um regime de vacina que fornece um esquema de reforço primário heterólogo com dois vetores virais que codificam os antígenos do núcleo da hepatite B (HBc) e da superfície da hepatite B (HBs), a fim de induzir uma forte resposta das células T CD8+, com administração sequencial ou concomitante de proteínas HBc e HBs recombinantes adjuvantes, a fim de induzir res- postas fortes de anticorpos e de células T CD4+ específicas de antí- geno. A presente divulgação descreve ainda composições e combina- ções imunogênicas que podem ser utilizadas como composições de vacina. Tais composições e combinações podem ser utilizadas nos regimes divulgados. As composições e regimes de vacina divulgados restauraram com sucesso as respostas de anticorpo específico de HBs e HBc T e de células CD8+, bem como respostas de células T CD4+ específicas de HBs, sem sinais associados de efeitos colaterais de al- teração hepática, em um modelo de camundongo que recapiítula ca- racterísticas virológicas e imunológicas de infecção por HBV crônica humana.
[0085] As composições imunogênicas e combinações imunogêni- cas descritas neste documento podem ser utilizadas em um método de tratamento de infecção crônica por hepatite B (CHB) em humanos, compreendendo as etapas de: a) administrar ao humano uma composição compreenden- do um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) administrar ao ser humano uma composição compreen- dendo um vetor de Vírus de Vaccinia Modificado (MVA) compreenden- do um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepa- tite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) administrar ao ser humano uma composição compreen- dendo um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) e um adjuvante.
[0086] Em uma modalidade, as etapas do método são realizadas sequencialmente, com a etapa a) etapa anterior b) e etapa b) etapa anterior c). Opcionalmente, a etapa c) pode ser repetida. Em certas modalidades, o período de tempo entre as etapas do método é de 2 a 12 semanas, por exemplo 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 se- manas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas ou 12 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre as etapas do método é de 4 a 8 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre administrações sequenciais de composições de acordo com o método é de 4 semanas. Em outra modalidade, a etapa c) é realizada concomitantemente com a etapa a) e/ou com a etapa b). Em certas modalidades, as etapas concomitantes b) e c) po- dem ser repetidas. Em uma outra modalidade, a etapa c é repetida e as etapas do método são realizadas na seguinte ordem: etapa a), eta- pa b), etapa c), etapa c). Em certas modalidades, o período de tempo entre as etapas do método é de 2 a 12 semanas, por exemplo 2 se- manas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas ou 12 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre as etapas do método é de 4 a 8 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre admi- nistrações sequenciais de composições de acordo com o método é de 4 semanas.
[0087] Em outro aspecto, as composições imunogênicas e combi- nações imunogênicas podem ser utilizadas em um método de trata- mento de infecção por hepatite B crônica (CHB) em humanos, com- preendendo as etapas de: a) administrar ao humano |) uma composição compreen- dendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e, concomitantemen- te, li) uma composição compreendendo um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepati- te B recombinante (HBc) e um adjuvante; e b) administrar ao ser humano i) uma composição compre- endendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) ou compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de su- perfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antí- geno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e, concomitantemente, uma composição compreendendo um antígeno de superfície da hepa- tite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) e um adjuvante.
[0088] Em uma modalidade, as etapas do método são realizadas sequencialmente, com a etapa a) anterior à etapa b). Opcionalmente, a etapa b) pode ser repetida. Opcionalmente, a etapa a) pode ser re- petida. Em uma modalidade, as etapas do método são realizadas na ordem: etapa a) seguida pela etapa a) seguida pela etapa b). Alternati- vamente, as etapas do método podem ser realizadas na ordem: etapa a) seguida pela etapa b) seguida pela etapa a). Opcionalmente, a eta- pa b) pode ser repetida. Em uma modalidade, as etapas do método são realizadas na ordem: etapa a) seguida pela etapa b) seguida pela etapa b). Em uma modalidade alternativa, as etapas do método são realizadas na ordem: etapa b) seguida pela etapa a) seguida pela eta- pa b). Opcionalmente, a etapa b) pode ser repetida mais de uma vez. Opcionalmente, as etapas a) e b) podem ser repetidas. Em uma moda- lidade, as etapas do método são realizadas na ordem: etapa a) segui- da pela etapa b) seguida pela etapa b) seguida pela etapa b). Em uma outra modalidade, as etapas do método são realizadas na ordem: eta- pa a) seguida pela etapa a) seguida pela etapa b) seguida pela etapa b), seguida pela etapa b), opcionalmente seguida pela etapa b). Em certas modalidades, o período de tempo entre as etapas do método é de 2 a 12 semanas, por exemplo, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 se- manas, 11 semanas ou 12 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre as etapas do método é de 4 a 8 semanas. Em uma modalidade, o período de tempo entre administrações sequenciais de composições de acordo com o método é de 4 semanas.
ANTÍGENOS
[0089] Pelo menos nove genótipos (A a |) de HBV foram identifica- dos, diferindo em seu genoma em mais de 8%. Dentro de um determi- nado genótipo do VHB, múltiplos geno-subtipos foram identificados, diferindo em 4-8%. Os antígenos para uso nos métodos divulgados são adequadamente selecionados para fornecer cobertura imunológica através de múltiplos, preferivelmente todos os genótipos de HBV. O antígeno da proteína do núcleo da hepatite B (HBc) é altamente con- servado entre os genótipos e subtipos e a sequência do antígeno da proteína da superfície da hepatite B (HBs) é adequadamente selecio- nada para incluir epítopos principais de células B preservadas por ge- nótipo cruzado que permitem a indução de amplas respostas neutrali- zantes. Adequadamente, as sequências do HBc e da HBs para uso nos métodos e composições divulgados são baseadas nas do genóti- po/subtipo A2.
[0090] Adequadamente, o antígeno de HBs para uso nos métodos e composições divulgados é derivado da proteína do antígeno de su- perfície pequena, média ou grande. Em particular, um antígeno de HBs adequado compreende a proteína (S) pequena da cepa adw2 de HBV, genótipo A. Por exemplo, um antígeno de HBs adequado possui os 226 aminoácidos da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1. Quando usado como proteína recombinante, o antígeno de HBs se agrupa preferivelmente em partículas semelhantes a vírus. Esse antí- geno está incluído nas vacinas profiláticas contra hepatite B comercia- lizadas e bem estudadas (Engerix B, Fendrix, Twinrix e outras) e de- monstrou ser protetor contra a hepatite B em todos os genótipos. Pre- ferivelmente, o antígeno da proteína de HBs recombinante é expresso a partir de levedura e purificado para uso nas composições de vacina e métodos da presente invenção. São conhecidos métodos adequados para expressão e purificação, por exemplo, de EP1307473B1.
[0091] A proteína do núcleo da hepatite B (HBc) é o principal com- ponente do invólucro de nucleocapsídeo que empacota o genoma vi- ral. Esta proteína (183-185 aa de comprimento) é expressa no cito- plasma das células infectadas e permanece não glicosilada. HBc com- preende um domínio de montagem de 149 resíduos e um domínio de ligação a RNA de 34-36 resíduos no C-terminal. O antígeno de HBc para uso nos métodos e composições divulgados pode ser de tama- nho completo ou pode compreender uma proteína truncada C- terminalmente (sem o C-terminal de ligação ao RNA), por exemplo, incluindo 145-149 aminoácidos do domínio de montagem de uma pro- teína antigênica de núcleo do tipo selvagem, por exemplo aminoácidos 1-145, 1-146, 1-147, 1-148 ou aminoácidos 1-149 de uma proteína an- tigênica do núcleo da hepatite B de tipo selvagem. A proteína truncada mantém a capacidade de se reunir em partículas de nucleocapsídeo. Um antígeno de HBc adequado para uso nos métodos e composições divulgados tem uma sequência de aminoácidos da cepa adw2 de HBV, genótipo A. Quando usado como proteína recombinante, o antígeno de HBc é adequadamente truncado a partir do tipo selvagem no C- terminal, em particular, o antígeno pode ser os aminoácidos 1-149 de HBc, por exemplo, pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, o antígeno recombinante da proteína HBc é expresso a partir de E. coli e purificado para uso nas composições de vacina e métodos da presente invenção. Os métodos para expressão recombinante de proteínas virais em E. coli são bem conhecidos na técnica.
[0092] Quando usado como proteína recombinante, o antígeno de HBc monta preferivelmente em partículas semelhantes a vírus. Quan- do expresso a partir de um vetor viral, o antígeno de HBc pode ser completo ou truncado, por exemplo, é adequadamente um antígeno de HBc completo (por exemplo, SEQ ID NO: 11). As doses adequadas de antígeno da proteína HBs recombinante para uso nos métodos aqui divulgados são de 10ug por dose a 100ug por dose, como 10ug, 15ug, 20ug, 25ug, 30ug, 35ug, 35ug, 40ug, 45ug, 50ug, 55ug, 60ug, 65ug, 7Oug, 75ug, 80ug, 85ug, 90ug, 95ug ou 100ug por dose. As doses adequadas de proteína do antígeno de HBc recombinante para uso nos métodos aqui divulgados são de 10ug por dose a 100ug por dose, como 10ug, 15ug, 20ug, 25ug, 30ug, 35ug, 35ug, 40ug, 45ug, 50ug, 55ug, 60ug, 65ug, 70ug, 75ug, 80ug, 85ug, 90ug, 95ug ou 100ug por dose.
[0093] Os antígenos são substâncias que induzem uma resposta imune no organismo, principalmente a produção de anticorpos. Os an- tígenos podem ser estranhos, isto é, patogênicos, originam-se ou pro- vêm do próprio organismo, sendo estes últimos referidos como auto ou auto antígenos. Os antígenos podem ser apresentados na superfície das células apresentadoras de antígenos pelas moléculas de MHC. Existem duas classes de moléculas de MHC, MHC de classe | (MHC-I) e MHC de classe Il (MHC-ll). As moléculas de MHC-II são receptores ligados à membrana que são sintetizados no retículo endoplasmático e deixam o retículo endoplasmático em um compartimento de MHC de classe Il. Para impedir que peptídeos endógenos, ou seja, autoantíge- nos, se liguem à molécula de MHC-Il e sejam apresentados para gerar uma resposta imune, a molécula nascente de MHC-Il combina-se com outra proteína, a cadeia invariante, que bloqueia a fenda de ligação do peptídeo da molécula MHC-Il. A cadeia invariante humana (hli, tam- bém conhecida como CD74 quando expressa na membrana plasmáti- ca), é uma proteína da membrana tipo Il evolutivamente conservada que tem vários papéis na célula e em todo o sistema imunológico [Borghese, 2011]. Quando o compartimento de MHC classe Il funde-se a um endossoma tardio contendo proteínas estranhas fagocitadas e degradadas, a cadeia invariante é clivada para deixar apenas a região CLIP ligada à molécula de MHC-ll. Em uma segunda etapa, CLIP é removido por uma molécula HLA-DM, deixando a molécula MHC-II li- vre para ligar fragmentos das proteínas estranhas. Os referidos frag- mentos são apresentados na superfície da célula apresentadora de antígeno quando o compartimento de MHC de classe || se funde com a membrana plasmática, apresentando assim os antígenos estranhos a outras células, principalmente as células T auxiliares.
[0094] Sabe-se que a resposta imune contra um antígeno aumenta quando um sistema de expressão de adenovírus que codifica uma fu- são de cadeia invariante e o referido antígeno é usado para vacinação (vide WO2007/062656, também publicado como US2011/0293704 e é incorporado por referência para o objetivo de divulgar sequências de ca- deia invariantes), isto é, a cadeia invariante aumenta a imunogenicidade do antígeno e cadeias invariantes como hli são algumas vezes chama- das de "adjuvantes genéticos" no reconhecimento desse efeito. Além disso, o referido construto adenoviral provou ser útil para iniciar uma resposta imune no contexto de regimes de vacinação de reforço primá- rio (vide WO2014/141176, também publicado como US2016/0000904; e WO2010/057501, também publicado como US2010/0278904 e é in- corporado por referência com o objetivo de revelar sequências em ca- deia invariantes e vetores adenovirais que codificam sequências em cadeia invariantes). Em particular, hli e a sequência hli têm o potencial de aumentar as respostas das células T CD8+ [Spencer, 2014; Capo- ne, 2014]. Em certas modalidades, uma sequência de nucleotídeos incluída dentro de um vetor para uso nos métodos, usos e composi- ções aqui divulgados pode incluir uma sequência de nucleotídeos que codifica hli. A sequência de aminoácidos para hli como pode ser inclu- ída no vetor adenoviral divulgado ChAd155-hli-HBV é apresentada em SEQ ID NO: 7 e uma sequência alternativa é apresentada em SEQ ID NO: 12. As sequências de nucleotídeos que codificam essas sequên- cias de aminoácidos são apresentadas em SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 13. Adequadamente, uma sequência de nucleotídeos que codifica hli é fundida com a sequência de nucleotídeos que codifica o antígeno de HBc, de modo a produzir uma proteína de fusão na qual um poli- peptídeo hi é fundido no N-terminal com o antígeno de HBc.
VETORES
[0095] Além do polinucleotídeo que codifica as proteínas antigêni- cas (também aqui referidas como "inserção"), os vetores para uso nos métodos e composições aqui divulgados também podem incluir ele- mentos de controle convencionais que estão operacionalmente ligados ao polinucleotídeo de codificação de uma maneira que permite a sua transcrição, tradução e/ou expressão em uma célula transfectada com o vetor. Assim, o polinucleotídeo de inserção de vetor que codifica os antígenos da proteína é incorporado em um cassete de expressão com elementos de controle adequados.
[0096] Os elementos de controle de expressão incluem sequên- cias apropriadas de iniciação, terminação, promotoras e intensificado- ras da transcrição; sinais eficientes de processamento de RNA, como sinais de emenda e poliadenilação (poli A), incluindo beta-globina poliA de coelho; sequências que estabilizam o mMRNA citoplasmático; se- quências que aprimoram a tradução eficiência de íons (por exemplo, sequência de consenso de Kozak); sequências que melhoram a esta-
bilidade das proteínas; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção do produto codificado.
[0097] Um promotor é uma sequência de nucleotídeos que permite a ligação de RNA polimerase e direciona a transcrição de um gene. Tipicamente, um promotor está localizado na região não codificadora 5' de um gene, proximal ao sítio inicial de transcrição do gene. Os elementos de sequência nos promotores que funcionam no início da transcrição são frequentemente caracterizados por sequências de nu- cleotídeos de consenso. Exemplos de promotores incluem, mas não estão limitados a, promotores de bactérias, leveduras, plantas, vírus e mamíferos (incluindo seres humanos). Um grande número de sequên- cias de controle de expressão, incluindo promotores internos, nativos, constitutivos, indutíveis e/ou específicos de tecido, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados.
[0098] Exemplos de promotores constitutivos incluem, o promotor TBG, o promotor LTR retroviral do vírus do sarcoma Rous (RSV) (op- cionalmente com o intensificador de RSV), o promotor do citomegalo- vírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV, vide, por exemplo, Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)), o promotor de CASI, o promotor de SV40, o promotor de dihidrofolato redutase, o promotor da B-actina, o promotor da fosfoglicerol quinase (PGK) e o promotor de EFia (Invitrogen). Adequadamente, o promotor é um promotor de CMV ou uma variante do mesmo, mais adequadamente um promotor de CMV humano (HCMV) ou uma variante do mesmo. Vetores adenovirais
[0099] Adenovírus tem sido amplamente utilizado para aplicações de transferência de genes devido à sua capacidade de obter transfe- rência de genes altamente eficiente em uma variedade de tecidos alvo e sua grande capacidade transgênica. Convencionalmente, os genes E1 do adenovírus são excluídos e substituídos por um cassete de transgene que consiste no promotor de escolha, sequência de CONA do gene de interesse e um sinal poli A, resultando em um vírus recom- binante defeituoso na replicação. Demonstrou-se que vetores de ade- novírus humanos são vetores potentes para a indução da resposta das células T CD8+ ao transgene, tanto em modelos animais quanto em humanos. Os adenovírus têm um amplo tropismo e têm a capacidade de infectar células replicantes e não replicantes. A principal limitação para aplicação clínica de vetores baseados em adenovírus humano é a alta prevalência de anticorpos neutralizantes na população em geral. Os adenovírus isolados de espécies alternativas foram considerados como possíveis vetores de vacina para contornar o problema da imu- nidade preexistente ao antiadenovírus em humanos. Entre eles, os adenovírus símios derivados de chimpanzés, gorilas ou bonobos po- dem ser adequados para uso na liberação de antígenos e na obtenção de células T direcionadas e/ou resposta humoral a esses antígenos em humanos. Os adenovírus simianos, incluindo os derivados de chimpanzés, foram testados em pesquisas clínicas. Os vetores adeno- virais do chimpanzé têm baixa/nenhuma soroprevalência na população humana, não são conhecidos por causar doenças patológicas em se- res humanos e alguns vetores ChAd podem ser cultivados com altas titulações em linhagens celulares usadas anteriormente para a produ- ção de material de nível clínico, como células renais embrionárias hu- manas 293 (HEK 293).
[00100] Um adenovírus incompetente na replicação ou defeituoso na replicação é um adenovírus incapaz de replicação porque foi proje- tado para compreender pelo menos uma exclusão funcional (ou muta- ção de "perda de função"), ou seja, uma exclusão ou mutação que pre- judica a função de um gene sem removê-lo completamente, por exem- plo introdução de códons de parada artificiais, exclusão ou mutação de sítios ativos ou domínios de interação, mutação ou exclusão de uma sequência reguladora de um gene etc. ou uma remoção completa de um gene que codifica um produto genético essencial para a replicação viral, como um ou mais dos genes adenovirais selecionados de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 e E4 (como E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF5, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2 e/ou E4 ORF1). Adequadamente, os genes E1 e E3 são excluídos. Mais adequada- mente, os genes E1, E3 e E4 são excluídos.
[00101] Os vetores adequados para uso nos métodos e composi- ções aqui divulgados são vetores adenovirais de chimpanzés com de- feito de replicação, por exemplo, ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAd83, ChAd155, ChAd157, Pan 5, Pan 6, Pan 7 (também referido como C7) ou Pan 9. Exemplos de tais cepas são descritos nos documentos WOO03/000283, WO2005/07 1093, WO2010/086189 e WO2016/198621. O vetor ChAd155 (vide WO2016/198621, que é incorporado por referên- cia para fins de divulgação de sequências e métodos de vetores ChAd155) pertence ao mesmo grupo de adenovírus filogenético que o vetor ChAd3 (grupo C). Em uma modalidade, um vetor para uso nos métodos e composições aqui divulgados é um vetor ChAd do grupo filogenético C, por exemplo ChAd3 ou ChAd155. Em uma modalidade específica, um método de tratamento da hepatite B crônica aqui divul- gada compreende a etapa de administrar a um ser humano uma com- posição compreendendo um vetor ChAd155 que compreende um poli- nucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc). Uma dose adequada de um vetor ChAd para uso nos métodos aqui divulgados é 1x10º - 1x10' partículas virais (vp) por dose, por exemplo, cerca de 1x108, 5x108, 1x10º, 5x10º, 1x10%%, 5x107º ou 1x10"' partículas virais (vp) por dose.
[00102] Mais especificamente, em uma modalidade, um vetor para uso nos métodos e composições aqui divulgados é um vetor ChAd155 de adenovírus de Chimpanzé com defeito de replicação que codifica uma fusão de sequências derivadas de duas proteínas HBV: HBc (nú- cleo, proteína nucleocapsídeo) e HBs (antígeno de superfície peque- na). Em certas modalidades específicas, o vetor é ChAd155 que codi- fica HBc e HBs, separados pela SEQ ID NO: 3, um espaçador que in- corpora uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (resultando em uma cauda de 23 aminoácidos no C- terminal da proteína a montante e uma única prolina no N-terminal da proteína a jusante), para processamento dos HBc e HBs em proteínas separadas. A clivagem do núcleo a partir dos antígenos de superfície permite dobrar adequadamente os HBs, permitindo a geração de uma resposta de anticorpo ao antígeno de superfície. Alternativamente, o vetor adenoviral pode ser um vetor de duplo promotor (bi-cistrônico) para permitir a expressão independente dos antígenos HBs e HBc.
[00103] Em certas modalidades, a parte N-terminal do gene que codifica a proteína HBc pode ser fundida ao gene que codifica a ca- deia Invariant associada à classe Il do Complexo Principal de Histo- compatibilidade (MHC) humana, isoforma p35 (ou seja, hli ou CD74). Assim, um vetor ChAd155 específico para uso nos métodos e compo- sições aqui divulgados compreende uma inserção de vetor de polinu- cleotídeo que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Fi- gura 22, compreendendo hli, HBc, 2A e HBs. A sequência de aminoá- cidos de tal construto é dada em SEQ ID NO: 9 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do construto é dada em SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos de uma alter- nativa de tal construto é dada em SEQ ID NO: 15 e uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos do construto é dada em SEQ ID NO: 14.
Vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA)
[00104] O Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), deficiente em replicação em humanos e outros mamíferos, é derivado do vírus vac- cinia. Pertence à família dos poxvírus e foi desenvolvido inicialmente para melhorar a segurança da vacinação contra a varíola pela passa- gem do vírus vaccinia por mais de 570 vezes em células de fibroblas- tos de embriões de galinha (CEF), resultando em várias exclusões após as quais o vírus foi altamente atenuado e com deficiência de re- plicação em humanos e outros mamíferos. O defeito de replicação ocorre em uma fase tardia da montagem do vírion, de modo a que a expressão gênica viral e recombinante não é prejudicada, tornando o MVA um vetor de expressão redondo único eficiente, incapaz de cau- sar infecção em mamíferos. O MVA foi subsequentemente utilizado extensivamente como vetor viral para induzir imunidade específica a antígenos contra transgenes, tanto em modelos animais quanto em humanos. Uma descrição do MVA pode ser encontrada em Mayr A, et.al. (1978) e em Mayr, A. et.al., (1975).
[00105] Em uma modalidade, o MVA é derivado do lote de semen- tes de vírus 460 MG obtido a partir da 571º passagem do vírus Vacci- nia em células CEF. Em outra modalidade, o MVA é derivado do lote de sementes de vírus MVA 476 MG/14/78. Em uma modalidade adici- onal, o MVA é derivado ou produzido antes de 31 de dezembro de 1978 e é livre de contaminação por príons. Uma dose adequada de um vetor MVA para uso nos métodos aqui divulgados é 1x10º - 1x10º uni- dades formadoras de placas (pfu) por dose, por exemplo, cerca de 1x106, 2x106, 5x108, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108 ou 1x10º pfu por dose.
[00106] Em uma modalidade específica, um vetor para uso nos mé- todos e composições aqui divulgados é o MVA que codifica uma fusão de sequências derivadas de duas proteínas de HBV: HBc (proteína de nucleocapsídeo núcleo) e HBs (antígeno de superfície pequena). Em certas modalidades, um vetor para uso nos métodos e composições aqui divulgados é o MVA que codifica HBc e HBs, separado por uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 3, um espaça- dor que incorpora uma sequência que codifica a região de clivagem 2A do vírus da doença aftosa (resultando em uma cauda de 23 aminoáci- dos no C-terminal da proteína a montante e uma única prolina no N- terminal da proteína a jusante), para processamento dos HBc e HBs em proteínas separadas. Assim, um vetor MVA particular para uso nos métodos e composições aqui divulgados compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica um construto tendo a estrutura mostrada na Figura 21, compreendendo HBc, 2A e HBs. A sequência de aminoácidos de tal construto é dada em SEQ ID NO.5 e uma se- quência de nucleotídeos que codifica o construto de inserção de ami- noácidos é dada em SEQ ID NO: 6.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00107] As composições imunogênicas aqui divulgadas, que encon- tram uso nos métodos divulgados, são composições farmaceuticamen- te aceitáveis adequadamente. Adequadamente, uma composição far- macêutica incluirá um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00108] As composições imunogênicas que compreendem vetores ChAd ou MVA podem ser preparadas para administração por suspen- são das partículas de vetores virais em um veículo farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável, como solução salina isotônica ou outra solução de sais isotônicos. O veículo apropriado será evidente para os especialistas na técnica e dependerá em grande parte da via de admi- nistração.
[00109] As composições que compreendem antígenos de proteínas recombinantes podem ser preparadas por isolamento e purificação das proteínas da cultura de células em que são expressas, suspensão em um tampão de formulação que inclui um ou mais sais, surfactantes e/ou crioprotetores e liofilizados. Por exemplo, um tampão de formula- ção adequado pode incluir um açúcar ou uma mistura de açúcares, por exemplo, sacarose, trealose ou sucralose como um crioprotetor e um copolímero não iônico, por exemplo, um poloxâmero como surfactante. Para administração, as formulações de proteínas recombinantes liofili- zadas são reconstituídas em um veículo farmaceuticamente ou fisiolo- gicamente aceitável, como solução salina isotônica ou outra solução de sais isotônicos para injeção ou inalação. O veículo apropriado será evidente para os especialistas na técnica e dependerá em grande par- te da via de administração. A composição reconstituída também pode incluir um adjuvante ou mistura de adjuvantes. Em uma modalidade, as proteínas recombinantes liofiizadas são reconstituídas em uma formulação de sistema adjuvante líquido.
[00110] O termo "veículo", como aqui utilizado, refere-se a uma substância farmacologicamente inativa, como, sem limitação, um dilu- ente, excipiente ou veículo com o qual o ingrediente terapeuticamente ativo é administrado. Os veículos líquidos incluem, mas não estão limi- tados a, líquidos estéreis, tais como soluções salinas em água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glice- rol também podem ser empregues como veículos líquidos, particular- mente para soluções injetáveis. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.
[00111] As composições para uso nos métodos aqui divulgados po- dem incluir, além do vetor ou proteínas recombinantes da composição, um sistema adjuvante. O termo "adjuvante" refere-se a um agente que aumenta, estimula, ativa, potencializa ou modula a resposta imune a um antígeno da composição no nível celular ou humoral, por exemplo. Adjuvantes imunológicos estimulam a resposta do sistema imunológico ao antígeno, mas não têm efeito imunológico por si mesmos. As com- posições imunogênicas aqui divulgadas podem incluir um adjuvante como ingrediente separado na formulação, independentemente de um vetor compreendido na composição também codificar um "adjuvante genético", como hi.
[00112] —Adjuvantes adequados são aqueles que podem melhorar a resposta imune em objetos com condições crônicas e competência imune subvertida. Os pacientes com CHB são caracterizados por sua incapacidade de montar uma resposta imune inata e adaptativa efici- ente ao vírus, o que torna desafiador o desenvolvimento eficiente da vacina. Nesses pacientes, uma função chave de uma formulação de vacina adjuvada deve ter como objetivo direcionar a resposta imune mediada por células para um perfil T Auxiliar 1 (Th1) reconhecido co- mo crítico para a remoção de patógenos intracelulares.
[00113] Exemplos de adjuvantes adequados incluem, entre outros, adjuvantes inorgânicos (por exemplo, sais de metais inorgânicos, co- mo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), adjuvantes orgâni- cos não peptídicos (por exemplo, saponinas, como QS21 ou esquale- no), adjuvantes à base de óleo (por exemplo, Freund's adjuvante com- pleto e adjuvante incompleto de Freund), citocinas (por exemplo, IL-16, IL-2, IL-7, 11-12, 11-18, GM-CFS e INF-y) adjuvantes particulados (por exemplo, complexos imunoestimuladores (ISCOMS), lipossomas ou microesferas biodegradáveis), virossomas, adjuvantes bacterianos (por exemplo, monofosforil lipídeo A (MPL), tal como monofosforil lipí- deo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) ou peptídeos de muramila), adjuvan- tes sintéticos (por exemplo, copolímeros de bloco não iônico, análogos de peptídeo de muramila ou lipídeo sintético A), adjuvantes de polinu- cleotídeos sintéticos (por exemplo, poliarginina ou polilisina) e oligonu-
cleotídeos imunoestimuladores contendo dinucleotídeos CpG não me- tilados ("CpG"). Em particular, os adjuvantes podem ser adjuvantes orgânicos não peptídicos (por exemplo, saponinas, tal como QS21, ou esqualeno) e/ou adjuvantes bacterianos (por exemplo, monofosforil lipídeo A (MPL), como monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL).
[00114] Um adjuvante adequado é o monofosforil lipídeo A (MPL), em particular o monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL). Qui- micamente, é frequentemente fornecido como uma mistura de mono- fosforil-lipídeo A 3-des-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Pode ser purificado e preparado pelos métodos ensinados no documento GB 21222048B, cuja referência também divulga a preparação do difosforil lipí- deo A e suas variantes desaciladas com 3-O. Outros foram descritos |i- popolissacarídeos purificados e sintéticos [U.S. Pat. 6,005,099 e EP0729473B1; Hilgers, 1986; Hilgers, 1987; e EPOS49074B1].
[00115] Saponinas também são adjuvantes adequados [Lacaille- Dubois, 1996]. Por exemplo, a saponina Quil A (derivada da casca da árvore da América do Sul Quillaja saponaria Molina) e frações da mesma são descritas na Pat. 5.057.540 e Kensil, 1996; e EP 0 362 279 B1. As frações purificadas de Quil A também são conhecidas co- mo imunoestimulantes, como QS21 e QS17; métodos da sua produ- ção são divulgados na Pat. 5.057.540 e EP O 362 279 B1. O uso de QS21 é ainda descrito em Kensil, 1991. Combinações de QS21 e po- lissorbato ou ciclodextrina também são conhecidas (WO 99/10008). Sistemas adjuvantes particulados compreendendo frações de QuilA, como QS21 e QS7, são descritos em WO 96/33739 e WO 96/11711.
[00116] —Adjuvantes como os descritos acima podem ser formulados juntamente com veículos, como lipossomas, emulsões de óleo em água e/ou sais metálicos (incluindo sais de alumínio, como hidróxido de alumínio). Por exemplo, 3D-MPL pode ser formulado com hidróxido de alumínio (EP O 689 454) ou emulsões de óleo em água (WO
95/17210); QS21 pode ser formulado com lipossomas contendo coles- terol (WO 96/33739), emulsões de óleo em água (WO 95/17210) ou alúmen (WO 98/15287).
[00117] As combinações de adjuvantes podem ser utilizadas nas composições divulgadas, em particular uma combinação de um mono- fosforil lipídeo A e um derivado de saponina (vide, por exemplo, WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), mais particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, conforme divulgado em WO 94/00153, ou uma com- posição em que QS21 é extinto em lipossomas contendo colesterol (DQ), conforme divulgado em WO 96/33739. Uma formulação adjuvan- te potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita em WO 95/17210 e é outra formulação que pode ser útil nas composições divulgadas. Assim, sistemas adjuvantes adequados incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente 3D-MPL, juntamente com um sal de alumí- nio (por exemplo, como descrito em WO00/23105). Um outro adjuvan- te exemplar compreende QS21 e/ou MPL e/ou CpG. QS21 pode ser arrefecido bruscamente em lipossomas contendo colesterol, como di- vulgado em WO 96/33739.
[00118] Por conseguinte, um adjuvante adequado para uso nas composições imunogênicas divulgadas é o ASO1, um adjuvante à base de lipossomo contendo MPL e QS-21. Os lipossomas, que são os veí- culos para os imunointensificadores de MPL e QS-21, são compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol em uma solução salina tamponada com fosfato. AS01g4 é uma variante particularmente prefe- rida do adjuvante ASO1, composta por imuno-intensificadores QS-21 (um glicosídeo triterpeno purificado a partir da casca de Quillaja sapo- naria) e MPL (monofosforil de lipídeo A), com lipossomas DOPC/coles- terol, como veículos para esses imuno-intensificadores, e sorbitol em uma solução de PBS. Em particular, uma dose humana única de ASO1g. (0,5 mL) contém 50 ug de QS-21 e 50 ug de MPL. ASO1Ie4s corresponde a uma diluição dupla de ASO01g-, isto é, contém 25 ug de QS-21 e 25 ug de MPL por dose humana.
[00119] Em uma modalidade, é fornecida uma composição imuno- gênica compreendendo um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) recombinante, um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) re- combinante truncado e um adjuvante compreendendo MPL e QS-21. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um HBs recombinante, um HBc recombinante truncado e um adjuvante ASO1. Em uma modalidade específica, a combinação imunogênica compre- ende uma composição compreendendo um HBc recombinante trunca- do e um HBs recombinante na razão de 4:1 ou mais, e um adjuvante ASO1, por exemplo AS01g-4 ou ASOT1Ee-s.
[00120] Em uma modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno recom- binante da superfície da hepatite B (HBs), antígeno recombinante do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina
(DOPC) e colesterol.
[00121] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus de Vaccinia Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nu- cleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan- te truncado e um HBs recombinante de comprimento total na razão de 4: 1 ou mais e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e liposso- mas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol.
[00122] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan-
te truncado e um HBs recombinante de comprimento total na razão de 4:1 ou mais e um adjuvante ASO1.
[00123] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan- te truncado que consiste nos aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ |D NO: 2) e HBs recombinantes de comprimento total (por exem- plo, SEQ ID NO: 1), na razão de 4:1 e ASO1g-a.
[00124] Em uma modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 com defeito na replicação compreendendo um polinucleotídeo que co- difica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nu- cleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotí- deo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno recom- binante da superfície da hepatite B (HBs), antígeno recombinante do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol.
[00125] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 com defeito de replicação compreendendo um polinucleotídeo que co- difica um HBs e um polinucleotídeo que codifica um HBc separado por polinucleotídeo que codifica um ligante que incorpora a região de cli- vagem 2A do vírus da febre aftosa; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende um polinucleotídeo que codifica um HBs e um polinucleo- tídeo que codifica um HBc separado por polinucleotídeo que codifica um ligante que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa; e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan- te truncado e um HBs recombinante de comprimento total na razão de 4:1 ou mais e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e liposso- mas compostos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol.
[00126] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 com defeito de replicação compreendendo um polinucleotídeo que co- difica um HBs e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia invariante humana (hli) fundida ao N-terminal do HBc; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende um polinucleotídeo que codifica um HBs e um polinucleo- tídeo que codifica um HBc separado por polinucleotídeo que codifica um ligante que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa; e c) uma composição compreendendo um HBc recombi- nante truncado e um HBs recombinante de comprimento total na razão de 4:1 ou mais e um adjuvante ASO1.
[00127] Em certas modalidades, a inserção de vetor do vetor ChAd do componente a) da combinação imunogênica codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separada por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Em certas modalidades, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma ou SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 7) ou HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11) é fundido a hli (por exemplo, SEQ ID NO: 12).
[00128] Em certas modalidades, a inserção de vetor do vetor de MVA do componente b) da combinação imunogênica codifica HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo me- nos 98% homóloga à mesma) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma), separada por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma). Por exemplo, a inserção do vetor codifica HBc (por exemplo,
SEQ ID NO: 11) e HBs (por exemplo, SEQ ID NO: 1), separados por uma sequência que codifica um espaçador que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (por exemplo, SEQ ID NO: 3).
[00129] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 com defeito de replicação, uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 15; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.5; e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan- te truncado que consiste nos aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 2) e HBs recombinantes de comprimento total (por exem- plo, SEQ ID NO: 1) em uma razão de 4:1 e ASO01g.4.
[00130] Em outra modalidade, é fornecida uma combinação imuno- gênica compreendendo: a) uma composição compreendendo um vetor ChAd155 com defeito de replicação, uma inserção de vetor de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 10 ou uma inserção de vetor de polinu- cleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 14; b) uma composição compreendendo um vetor MVA que compreende uma inserção de vetor de polinucleotídeo compreenden- do SEQ ID NO .6; e c) uma composição compreendendo um HBc recombinan- te truncado que consiste nos aminoácidos 1-149 de HBc (por exemplo, SEQ ID NO: 2) e HBs recombinantes de comprimento total (por exem- plo, SEQ ID NO: 1) em uma razão de 4: 1 e ASO01Ig.1.
Administração
[00131] Em certas modalidades, as composições imunogênicas di- vulgadas e combinações imunogênicas são administradas por via in- tranasal, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou tópica. Preferi- velmente, a administração é feita por via intramuscular.
[00132] Uma administração intranasal é a administração da compo- sição imunogênica na mucosa do trato respiratório completo, incluindo o pulmão. Mais particularmente, a composição é administrada à muco- sa do nariz. Em uma modalidade, uma administração intranasal é al- cançada por meio de spray ou aerossol. A administração intramuscular refere-se à injeção de uma composição em qualquer músculo de um indivíduo. Injeções intramusculares exemplares são administradas nas áreas deltóide, vasto lateral ou nas áreas ventroglútea e dorsoglútea. Preferivelmente, a administração é realizada no deltóide. A administra- ção subcutânea refere-se à injeção da composição na hipoderme. À administração intradérmica refere-se à injeção de uma composição na derme entre as camadas da pele. Administração tópica é a administra- ção da composição a qualquer parte da pele ou mucosa sem penetrar na pele com uma agulha ou um dispositivo comparável. A composição pode ser administrada topicamente na mucosa da boca, nariz, região genital e/ou reto. A administração tópica inclui meios de administração, como administração sublingual e/ou bucal. A administração sublingual é a administração da composição sob a língua (por exemplo, usando uma película fina oral (OTF)). Administração bucal é a administração do vetor através da mucosa bucal da bochecha.
[00133] As composições imunogênicas e combinações aqui divul- gadas podem ser utilizadas em um regime de imunização de reforço primário. Por conseguinte, aqui divulgadas são composições para uso em um método de tratamento de CHB que é um método de imuniza- ção de reforço primário. Em muitos casos, uma única administração de uma composição imunogênica não é suficiente para gerar o número de células imunes duradouras necessárias para a proteção eficaz ou para tratar terapeuticamente uma doença. Consequentemente, o desafio repetido com uma preparação biológica específica de um patógeno ou doença específica pode ser necessário a fim de estabelecer imunidade duradoura e protetora contra o referido patógeno ou doença ou para tratar ou curar funcionalmente uma dada doença. Um regime de admi- nistração compreendendo a administração repetida de uma composi- ção imunogênica ou vacina direcionada contra o mesmo patógeno ou doença é referido como "regime de reforço primário". Em uma modali- dade, um regime de reforço primário envolve pelo menos duas admi- nistrações de uma composição imunogênica direcionada contra a he- patite B. A primeira administração da composição imunogênica é refe- rida como "iniciador" e qualquer administração subsequente da mesma composição imunogênica ou uma composição imunogênica dirigida contra o mesmo patógeno, é chamada de "reforço". Deve ser entendi- do que 2, 3, 4 ou mesmo 5 administrações para aumentar a resposta imune também são contempladas. O período de tempo entre a inicia- dor e o reforço é, opcionalmente, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas. Mais particularmente, são 4 ou 8 semanas. E se mais de um reforço for realizado, o reforço subse- quente é administrado 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas, 6 meses ou 12 meses após o reforço ante- rior. Por exemplo, o intervalo entre dois reforços pode ser de 4 ou 8 semanas.
[00134] As composições imunogênicas aqui divulgadas podem ser administradas em um regime terapêutico que envolve a administração de um componente imunogênico adicional, cada um formulado em di- ferentes composições (por exemplo, uma combinação imunogênica). As composições são favoravelmente administradas em colocalizações próximas ou no mesmo sítio. Por exemplo, os componentes podem ser administrados por via intramuscular, no mesmo lado ou extremidade (administração "colateral") ou em lados ou extremidades opostos (ad- ministração "contralateral"). Por exemplo, na administração contralate- ral, uma primeira composição pode ser administrada ao músculo del- tóide esquerdo e uma segunda composição pode ser administrada, sequencial ou concomitantemente, ao músculo deltóide direito. Alter- nativamente, na administração colateral, uma primeira composição pode ser administrada ao músculo deltóide esquerdo e uma segunda composição pode ser administrada, sequencial ou concomitantemente, também ao músculo deltóide esquerdo.
PROCESSOS GERAIS DE FABRICO * —ChAd155-hli-HBV:
[00135] O fragmento de DNA inserido como transgene no vetor ChAd155 do grupo C do adenovírus de símio (derivado do chimpanzé) com defeito em replicação recombinante é derivado de dois antígenos da proteína HBV, o antígeno da proteína do nucleocapsídeo do núcleo HBc e o antígeno de superfície pequena HBs, separados pela região 2A de autoclivagem do vírus da febre aftosa (FMDV) [Donnelly et al. 2001]. A região 2A de FMDV permite o processamento da fusão HBc- HBs em antígenos proteicos separados. Além disso, a parte N-terminal do gene que codifica a proteína HBc foi fundida com o gene que codi- fica a isoforma p35 da cadeia invariável associada à classe |l do com- plexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe 1l (hli). Uma representação esquemática da sequência do transgene hli-HBV é fornecida em (Figura 22).
[00136] A região 2A (18 aminoácidos) foi suplementada com um espaçador de 6 aminoácidos no seu N-terminal; foi relatado que espa- çadores desta natureza aumentam a eficiência da clivagem mediada por 2A. A clivagem da protease mediada pela região 2A ocorre no C-
terminal de 2A logo à frente da última prolina na sequência de aminoá- cidos 2A. A prolina permanece no N-terminal da proteína HBs, en- quanto os 23 aminoácidos que precedem o sítio de clivagem da prolina permanecem com o polipeptídeo hli-HBc-2A.
[00137] A expressão do transgene resulta assim, após o processa- mento da protease, na produção de dois polipeptídeos separados: hli- HBc-espaçador-2A e HBs. Por questões de brevidade, o polipeptídeo hli-HBc-espaçador-2A é referido como a proteína hli-HBc. Quando ex- presso em cultura de células, o antígeno hli-HBc é detectado no so- brenadante da cultura de células, enquanto a proteína HBs é detecta- da na fração intracelular.
[00138] O cassete de expressão que codifica as proteínas antigêni- cas, operacionalmente ligadas aos componentes reguladores de uma maneira que permite a expressão em uma célula hospedeira, é mon- tado no construto do plasmídeo do vetor ChAd155, conforme descrito anteriormente (vide WO2016/198621, que é incorporado por referência com a finalidade de divulgar sequências e métodos de vetores ChAd155) para dar ChAd155-hli-HBV. O transgene hli-HBV está sob o controle transcricional do promotor do citomegalovírus humano (hCMV) e do sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (BGH pA). O cassete de expressão codifica as sequências de aminoácidos HBs, HBc e hli, nas quais a sequência hli é fundida ao N-terminal de HBc do HBs e as sequências HBs e HBc são separadas por um espaçador que incorpora uma região de clivagem 2A do vírus da doença aftosa, para processamento de HBc e HBs em proteínas separadas.
[00139] Para gerar adenovírus ChAd155 recombinante que são de- ficientes em replicação, a função da região genética excluída necessá- ria para replicação e infectividade do adenovírus deve ser fornecida ao vírus recombinante por um vírus auxiliar ou linhagem celular, ou seja, uma linhagem celular de complementação ou empacotamento. Uma linhagem celular de complementação particularmente adequada é a linhagem celular Procell92. A linhagem celular Procell92 é baseada em células HEK 293 que expressam genes adenovirais E1, transfectados com o repressor Tet sob controle do promotor de fosfoglicerato qui- nase-1 (PGK) humano e o gene de resistência a G418 (Vitelli et al. PLOS One (2013) 8 (e 55435):1-9). O Procell92.S é adaptado para crescimento em condições de suspensão e é útil para a produção de vetores adenovirais que expressam proteínas tóxicas. Produção da Substância do fármacoFármaco ChAd155-hli-HBV:
[00140] A fabricação das partículas virais de ChAd155-hli-HBV (substância de fármaco) envolve a cultura de células Procell-92.8 a 5e5 células/ml de densidade celular na infecção. As células são então infectadas com a Semente Viral Mestre (MVS) de ChAd155-hli-HBV usando uma multiplicidade de infecção de 200 vp/célula. A colheita do vírus ChAd155-hli-HBV é purificada após lise celular, clarificação do lisado e concentração (etapas de filtração) por um processo multietapa que inclui cromatografia de troca aniônica. Formulação e Preenchimento de Vacina
[00141] A substância de fármaco a granel de ChAd155-hli-HBV pu- rificada é subsequentemente processada da seguinte forma: - Diluição da substância de fármaco ChAd155-hli-HBV puri- ficada no tampão de formulação.
- Filtragem estéril.
- Preenchimento dos recipientes finais.
[00142] A vacina ChAd155-hli-HBV é uma formulação líquida conti- da em frascos. O tampão de formulação inclui Tris (1OmM), L-Histidina (10mM), NaCl (75mM), MgCI (ImM) e EDTA (0,1mMM) com sacarose (5% pv), polissorbato-80 (0,02% p/v) e etanol (0,5% p/v), ajustado pa- ra pH 7,4 com HCI (água para injeção até o volume final).
* MVA-HBV:
[00143] MVA-HBV é um vírus da vaccinia Ankara modificado (MVA) recombinante que transporta duas proteínas diferentes de HBV: prote- ínas Núcleo e S, separadas pelo peptídeo 2A. O construto de MVA- HBV foi gerado a partir do sistema de vetores MVA-Red [Di Lullo et al. 2010], derivado do lote de sementes do vírus MVA a partir da passa- gem de atenuação 571 (denominada MVA-571) que foi descrita pelo professor Anton Mayr [Mayr, A. et al. 1978].
[00144] O transgene MVA-HBV codifica a proteína do nucleocapsí- deo núcleo HBc e o antígeno de superfície pequena HBs de HBV. À sequência de HBc-HBs é separada pela região 2A de autoclivagem do vírus da febre aftosa que permite o processamento da proteína de fu- são em antígenos HBc e HBs separados, conforme descrito acima pa- ra o vetor adenoviral. Uma representação esquemática do transgene é fornecida na Figura 21.
[00145] A expressão do transgene, após o processamento da pro- tease, resulta na produção de dois polipeptídeos separados: HBc- espaçador-2A e HBs. Por uma questão de brevidade, o polipeptídeo HBc-espaçador-2A é referido como a proteína HBc.
[00146] O cassete de expressão foi subclonado no vetor shuttle MVA p94-elisaRen gerando o vetor de transferência p94-HBV. O p94- HBV contém o cassete de expressão de antígeno sob o controle do promotor precoce/tardio da vaccinia P7.5 e flanqueado pelas regiões Flanklll-2 e Flanklll-1 para permitir a inserção no del Ill de MVA por recombinação homóloga.
[00147] A produção do vírus recombinante foi baseada em dois eventos de recombinação in vivo em células CEF
[00148] Resumidamente, os fibroblastos do embrião de galinha pri- mários (CEF) foram infectados com MVA-Red e depois transfectados com p94-HBV transportando o transgene do antígeno (bem como o gene marcador EGFP sob controle do promotor sintético sP). O primei-
ro evento de recombinação ocorre entre sequências homólogas (regi- ões Flanklll-1 e -2) presentes no genoma MVA-Red e no vetor de transferência p94-HBV e resulta na substituição do gene da proteína Hcred com cassete transgene/eGFP. As células infectadas contendo o intermediário MVA-Green são isoladas por classificação FACS e usa- das para infectar CEF fresco. O MVA recombinante intermediário, re- sultante da primeira recombinação, transporta ambos o cassete eEGFP e de transgene, mas é instável devido à presença de regiões Z repeti- das.
[00149] Assim, ocorre um segundo evento espontâneo de recombi- nação envolvendo regiões Z e remove o cassete eEGFP. O MVA re- combinante resultante é incolor e transporta o cassete de transgene.
[00150] Finalmente, as células infectadas pelo vírus recombinante sem marcador (MVA-HBV) foram classificadas por FACS, MVA-HBV foi clonado por diluição terminal e expandido em CEF por métodos convencionais. Produção da Substância de Fármaco MVA-HBV
[00151] As partículas virais de MVA-HBV (substância de fármaco) são fabricadas em culturas celulares primárias de células de fibroblas- tos de embriões de galinha (CEF) até uma densidade celular entre 1E6 e 2E6 células/ml e, em seguida, são infectadas com a semente viral mestre de MVA-HBV (MVS) em uma multiplicidade de infecção entre 0,01 e 0,5 PFU/célula. A colheita do vírus MVA-HBV é purificada por um processo de multietapa baseado em granulação por etapas de centrifugação, ressuspensão e centrifugação de gradiente fracionário. Formulação e Preenchimento de Vacina
[00152] A substância de fármaco a granel de MVA-HBV purificada é subsequentemente processada da seguinte forma: - Diluição do MVA-HBV DS purificado no tampão de formu- lação.
- Preenchimento dos recipientes finais.
[00153] A vacina MVA-HBV é uma formulação líquida contida em frascos. O tampão de formulação inclui Tris (hidroximetil) amino meta- no pH 7,7 (10 mM), NaCl (140 mM) e água para injeção até o volume final. * —“Misturade proteínas recombinantes HBs-HBc: Produção de Substância de Fármaco de HBc
[00154] O processo de fabricação da proteína recombinante HBc (substância de fármaco) consiste em inocular um frasco de pré-cultura usando a semente de trabalho recombinante de E. coli, seguida por um processo de fermentação e um processo de purificação multietapa, incluindo colheita, extração, clarificação e múltiplas etapas de croma- tografia e filtração. Produção de Substância de Fármaco de HBs
[00155] O processo de fabricação da proteína recombinante de HBs (substância de fármaco) consiste em inocular um frasco de pré-cultura usando a semente de trabalho recombinante de S. cerevisiae, seguida por um processo de fermentação e um processo de purificação multie- tapa, incluindo colheita, extração, clarificação e múltiplas etapas de cromatografia e filtração. Formulação e Preenchimento de Vacina
[00156] A substância de fármaco de HBs purificada e a substância de fármaco de HBc são diluídas no tampão de formulação incluindo sacarose como crioprotetor e poloxâmero como surfactante, preenchi- da e liofilizada em frasco de vidro transparente de 4 mL.
EXEMPLOS Objetivos do Desenvolvimento Não Clínico:
[00157] Respostas fortes e funcionais das células T CD8+ e CD4+, particularmente ao HBcAg, têm sido associadas à depuração de HBV e à resolução de infecções [Boni, 2012; Li, 2011; Liang, 2011; Lau,
2002; Bertoletti, 2012]. Além disso, os anticorpos anti-S impedem a disseminação de HBV para hepatócitos não infectados e podem ser a chave para controlar a recuperação pós-tratamento da replicação de HBV [Rehermann 2005; Neumann 2010]. O regime de vacinação pro- posto inclui um esquema de reforço primário heterólogo com duas va- cinas vetoriais virais (ChAd155-hli-HBV e MVA-HBV) que codificam os antígenos do núcleo da hepatite B (HBc) e da superfície da hepatite B (HBs) para induzir uma forte resposta de células T CD8+, juntamente com administração sequencial ou concomitante de proteínas HBc-HBs com adjuvante em ASO01g4, a fim de induzir respostas fortes de células T CD4+ específicas de antígeno e anticorpos em pacientes com CHB. Esta resposta imune induzida por vacina deve, em última análise, tra- duzir-se em uma diminuição substancial na concentração de HBsAg ou na perda de HBsAg (isto é, concentração de HBsAg abaixo do nível detectável) considerado como um marcador para o controle completo e durável da infecção por HBV.
[00158] Os principais objetivos do desenvolvimento não clínico fo- ram: * "Demonstrar a imunogenicidade em camundongos puros e tolerantes a HBV dos componentes da vacina experimental, por exemplo, ChAd155-hli-HBV, MVA-HBV e HBc-HBs/ASO01g4 para orien- tar a escolha das construtos de vetores, a inclusão de hli, a composi- ção da formulação de proteínas, incluindo a seleção do Sistema Adju- vante e o esquema de imunização.
* “Demonstrar a segurança do regime completo de vacina em camundongos tolerantes ao VHB (estudo não GLP) e em um estu- do de toxicidade de GLP de dose repetida realizado em coelhos da Nova Zelândia * — Documentar a biodistribuição dos vetores em animais vacinados (estudos de BPL).
Estratégia não clínica e fundamental para a escolha dos modelos ani- mais
[00159] Um pacote de imunogenicidade foi primeiro gerado em ca- mundongos saudáveis, para orientar a escolha dos construtos de ve- tor, a formulação da proteína incluindo a seleção do Sistema Adjuvan- te e o cronograma de imunização.
[00160] A maioria das experiências pré-clínicas foi conduzida em camundongos CB6F1 (híbridos de camundongos C57BI/6 e BALB/c), um modelo usado anteriormente para avaliar as respostas das células T desencadeadas por vacinas candidatas adjuvantes ASO01 e vetores adenovirais [Lorin, 2015] para suportar a escolha dos construtos de vetores, a formulação de proteínas incluindo a seleção do Sistema Ad- juvante e o esquema de imunização.
[00161] —Camundongos HLA.A2/DR1 (transgênicos para as molécu- las humanas HLA-A2 e HLA-DR1) foram usados para avaliar a capaci- dade da vacina candidata em induzir respostas de células T CD8+ es- pecíficas de HBc, pois nenhuma resposta foi detectada contra esse antígeno em camundongos CB6F1 consanguíneos. Provavelmente, isso ocorre devido à ausência do epítopo imunodominante restrito a H2-Kº” MHC-I (MGLKFRQL) na sequência HBc da vacina experimental, que é baseada na sequência do genótipo HBV A/subtipo adw, com um uma diferença de aminoácidos em que uma isoleucina (1) substitui a fenilalanina (F) no epítopo (MGLKIRQL), conforme relatado por Riedl et al [Riedl, 2014]. As células T CD4+ específicas de HBV e os anti- corpos foram avaliados nos mesmos camundongos HLA.A2/DR1.
[00162] Os modelos animais disponíveis para avaliar a eficácia de uma vacina terapêutica são limitados, pois HBV infecta naturalmente apenas chimpanzés e humanos. Modelos de camundongos foram de- senvolvidos onde todo o genoma de HBV é expresso pela integração do genoma viral no genoma do hospedeiro (camundongos transgêni-
cos de HBV) ou por infecção com DNA de HBV replicativo, ou vetores que expressam o genoma de HBV. Embora estes não reproduzam a patogênese de HBV crônica, intermediários e proteínas replicativos virais podem ser detectados no fígado e é observada tolerância imuno- lógica.
[00163] O modelo murino HLA.A2/DR1 transduzido por AAV2/8- HBV recapitula características virológicas e imunológicas da infecção por HBV crônica e foi selecionado [Dion, 2013; Martin, 2015] * —parademonstrar que o regime de vacina pode superar a tolerância aos antígenos HBs e HBc.
* “Para avaliar o impacto das células T CD8+ específicas de HBc infiltradas no fígado, visando potencialmente aos hepatócitos que expressam o HBcAg, na histologia do fígado (coloração com He- matoxilina-eosina [H&E]) e níveis de ALT/AST.
[00164] Finalmente, modelos animais padrão para biodistribuição (ratos Sprague-Dawley) e estudos de toxicologia (coelhos NZW) foram selecionados para avaliar as vacinas candidatas porque, embora não sejam modelos de infecção, são capazes de montar respostas imunes farmacologicamente relevantes às proteínas recombinantes e expres- sas em vetores e são espécies bem aceitas para testes de toxicidade de vacinas. Essas espécies também foram usadas anteriormente nos programas de testes toxicológicos para o adjuvante ASO1B e seus imunointensificadores, MPL e QS-21.
Farmacologia Não Clínica
[00165] Vários estudos pré-clínicos foram conduzidos para demons- trar imunogenicidade em animais puros e tolerantes a VHB dos com- ponentes da vacina experimental, por exemplo, ChAd155-hli-HBV, MVA-HBV e HBc-HBs/ASO01g-4, após administração intramuscular. O perfil de imunogenicidade específico do antígeno foi avaliado primeiro separadamente para os vetores virais (ChAd155-hli-HBV e MVA-HBV)
e a vacina investigativa adjuvante à proteína recombinante de HBV (HBc-HBs/ASO01g-4). O perfil de imunogenicidade e segurança do regi- me completo de vacina, conforme previsto no FTiH (primeira vez em seres humanos), foi avaliado em uma segunda fase. Materiais Doses de Sistema Adjuvante ASO01 Usadas nos Estudos Não Clí- nicos de Imunogenicidade
[00166] O sistema adjuvante ASO01g-4 é composto por imunointensi- ficadores QS-21 (um glicosídeo triterpeno purificado da casca de Quil- laja saponaria) e MPL (monofosforil de lipídeo A), com lipossomas co- mo veículos para esses imunointensificadores e sorbitol. Em particular, uma dose humana única de ASO01g-1 (0,5 mL) contém 50 ug de QS-21 e 50 ug de MPL. 1/10-ésimo de uma dose humana, isto é, 50 ul é o volume injetado em camundongos (correspondendo a 5 ug de QS-21 e MPL).
[00167] O sistema adjuvante ASO1e4 corresponde a uma diluição dupla da diluição ASO01g4. 1/10-ésimo de uma dose humana, isto é, 50 pl é o volume injetado em camundongos (correspondendo a 2,5 ug de QS-21 e MPL). Resposta imune celular — Coloração intracelular de citocinas (ICS)
[00168] Agrupamentos frescos de leucócitos de sangue periférico (PBLs), esplenócitos ou linfócitos infiltrantes de fígado coletados em diferentes momentos foram estimulados ex vivo por 6 horas com agru- pamentos de 15 mers, sobreposição de 11aa, cobrindo a sequência HBc ou HBs. As respostas celulares específicas de HBc e HBs foram avaliadas por Cls medindo a quantidade de células T CD4+ ou CD8+ que expressam IFN-g e/ou IL-2 e/ou fator de necrose tumoral (TNF)-a. Os critérios de aceitação técnica para considerar os resultados de CIs incluem o número mínimo de células T CD8+ ou T CD4+ adquiridas sendo > 3000 eventos. Alternativamente, o IFN-y-ELIS pot foi realizado após reestimulação de esplenócitos com os mesmos peptídeos que para o Cls. Resposta imune humoral - Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
[00169] As respostas de anticorpo específico de HBc e HBs foram medidas por ELISA em soros de camundongos imunizados em dife- rentes momentos. Resumidamente, placas de 96 poços foram revesti- das com antígenos HBc ou HBs. Amostras de soro individuais foram então adicionadas em diluições em série e incubadas por 2 horas. Um fragmento F(ab)'2 anticamundongo biotinilado foi então adicionado e o complexo antígeno-anticorpo foi revelado por incubação com um com- plexo de estreptavidina peroxidase de rábano silvestre e um substrato de peroxidase dihidrocloreto de orto-fenilenodiamina/H2O02. Para cada ponto do tempo e cada antígeno (HBc, HBs), uma análise de variância (ANOVA) foi ajustada em titulações log10, incluindo grupo, estudo e interação como efeitos fixos e usando um modelo de variância hetero- gêneo (variações idênticas não foram assumidas entre os grupos). Es- te modelo foi usado para estimar médias geométricas (e seus Cls de 95%), bem como as razões médias geométricas e seus Cls de 95%. Como não foram definidos critérios pré-definidos, a análise é descritiva e foram calculados Cls de razão de 95% entre os grupos sem ajuste para multiplicidade. Medida ALT/AST
[00170] Os níveis de ALT e AST em soros de camundongos foram quantificados usando os seguintes kits comerciais: * Kitde Ensaio de Atividade de Alanina Aminotransferase Sigma Aldrich Cat % MAKO52 * Kitde Ensaio de Atividade de Aspartato aminotransfera- se Sigma Aldrich Cat tt! MAKO55
Quantificação do antígeno de HBs no soro
[00171] O antígeno de HBs circulante nos soros de camundongo foi quantificado usando o Monolisa Anti-HBs PLUS da BIO-RAD (cat t 72566) e um padrão internacional (Abbott Diagnostics). Análise Histopatológica
[00172] Os fígados (um lobo por fígado) foram coletados e preser- vados em fixador de formaldeído a 10%. Todas as amostras para exame microscópico foram cortadas com base nas diretrizes da RITA [Ruehl-Fehlert, 2003; Kittel 2004; Morawietz 2004], embebidas em pa- rafina, seccionadas com uma espessura de aproximadamente 4 mí- crons e coradas com H&E. A classificação da atividade histológica (le- sões necroinflamatórias) e fibrose foi realizada de acordo com o siste- ma de pontuação METAVIR [Bedossa, 1996; Mohamadnejad, 2010; Rammeh, 2014]. A classificação dos focos de células inflamatórias foi realizada de acordo com a pontuação de Desmet, conforme descrito por Buchmann et al [Buchmann, 2013].
[00173] A análise estatística realizada em cada estudo é detalhada nas seções referentes a cada estudo individual. Exemplo 1 - Avaliação de iniciador com ChAd155-HBV (com e sem hli) e reforço com MVA-HBV no modelo de camundongo transgênico HLA.A2/DR1 Objetivos
[00174] O principal objetivo desta experiência foi determinar se o iniciador com uma dose de ChAd155-HBV (com ou sem hli) seguida de uma dose de reforço de MVA-HBV foi capaz de induzir uma forte resposta das células T CD8+ contra HBc em HLA.A2/DR1 que são transgênicos para moléculas humanas de MHC-I/II. Além disso, uma comparação direta entre ChAd155-HBV com e sem hli foi realizada para investigar o potencial da sequência de hli para aumentar ainda mais a concentração específica de HBc Respostas de células T CD8+,
conforme relatado anteriormente para outros antígenos [Spencer, 2014; Capone, 2014]. As respostas das células T CD8+ específicas de HBs, bem como as células T CD4+ específicas de HBc e HBs e as respostas de anticorpos também foram avaliadas. Projeto de estudo
[00175] —“Camundongos HLA.A2/DR1 (11 camundongos por grupo) foram imunizados com 108 vp de ChAd155-HBV (com e sem hli) por via intramuscular no dia O e reforçados com 107 pfu de MVA-HBV (sem hli) no dia 28 (Tabela 1). Os camundongos foram sacrificados 14 dias após a primeira imunização (14dpl) (iniciador) ou 7 dias após a segun- da imunização (7dpll) (reforço) para determinar as respostas imunes humoral e celular específicas de HBc e HBs no soro e baço, respecti- vamente. Tabela 1 Projeto de estudo de experiência de iniciador com ChAd155-HBV (com e sem hli) / reforço com MVA-HBV (sem hli) em camundongos HLA.A2/DR1 [FF ERR O Análise Estatística
[00176] Um modelo ANOVA foi ajustado em frequências de células T log10 CD8+, incluindo 2 grupos (com ou sem hli) e experiências (re- sultados de 3 experiências pós-iniciador e resultados de 2 experiên- cias pós-reforço) como parâmetros fixos e usando um modelo de vari- ância heterogêneo. Este modelo foi usado para estimar médias geo- métricas (e seus Cls de 95%), bem como as razões médias geométri- cas e seus Cls de 95%.
Resultados Resposta de célula T específica de HBc e HBs
[00177] Os vetores ChAd1i55-HBV e ChAd155-hli-HBV induziram uma resposta de células T CD8+ específicas de HBc (Figura 1A). À presença de hli tende a induzir uma resposta mais alta das células T CD8+ contra o antígeno de HBc. O aumento de MVA-HBV de camun- dongos imunizados com ChAd155-hli-HBV induziu um aumento de 3 vezes nas respostas de células T CD8+ específicas de HBc, enquanto nenhum aumento foi observado no grupo ChAd155-HBV.
[00178] Ambos os vetores induziram respostas de células T CD8+ específicas de HBs e o efeito de reforço do MVA-HBV foi mais pronun- ciado em camundongos iniciados com o construto ChAd155-HBV (Fi- gura 1B).
[00179] As respostas de células T CD4+ específicas de HBc e HBs foram baixas (dados não mostrados).
[00180] Os resultados desta experiência foram consistentes com os de duas outras experiências independentes similares (dados não mos- trados). Embora cada estudo independente não tenha sido estatisti- camente desenvolvido para comparar grupos devido a limitações rela- cionadas à disponibilidade de animais, uma meta-análise nos 3 estu- dos foi conduzida para comparar as respostas de células T CD8+ es- pecíficas de HBc induzidas por ChAd155-HBV versus ChAd155-hli- HBV, após a iniciador e após o reforço com MVA-HBV.
[00181] A análise estatística mostrou que as respostas de células T CDB8+ específicas de HBc induzidas pelo regime de reforço primário usando o construto ChAd155-hli-HBV foram significativamente maio- res do que as suscitadas pelo regime de reforço primário usando ChAd155-HBV, após o iniciador e depois o reforço com MVA-HBV, su- portando o uso da sequência de cadeia invariante humana fundida à sequência de HBc.
a. 14 dias após a dose |, a razão geométrica média (hli/sem hli) foi estimada em 3,27 (IC 95%: 1,57 - 6,79) b. 7 dias após a dose Il, a razão geométrica média (hli/sem hli) foi estimada em 6,25 (95% DE IC: 2,11 - 18,51) Respostas de anticorpo específico de HBc e HBs
[00182] A imunização com ChAd155-HBV, mas não com ChAd155- hli-HBV, induziu anticorpos específicos de HBc. Após o reforço com MVA-HBV, a resposta de anticorpo anti-HBc foi comparável entre os grupos iniciados com ChAd155-HBV ou ChAd155-hli-HBV (Figura 2). Nenhuma resposta de anticorpo específica de HBs foi detectada (da- dos não mostrados). Conclusão
[00183] —“ChAd155-hli-HBV induziu a resposta mais elevada de célu- las T CD8+ contra HBc quando comparado com ChAd155-HBV e essa resposta foi aumentada ainda mais após o reforço com MVA-HBV. Exemplo 2 - Estudo de imunogenicidade de HBc-HBs/AS013-4 em ca- mundongos consanguíneos (CB6F1) Objetivos
[00184] O principal objetivo deste estudo de imunogenicidade foi determinar se as proteínas HBc e HBs foram capazes de induzir res- postas humorais e de células T específicas de HBc e HBs quando co- formuladas em ASO0 1-4. Projeto de estudo
[00185] —Camundongos CB6F1 (30 camundongos por grupo), com 6 a 8 semanas de idade, foram imunizados três vezes intramuscular- mente nos dias 0, 14 e 28 com HBc, HBs ou HBc-HBs formulados em 50 ul de ASO01g-4 (listados na Tabela 2 abaixo). As respostas de células T específicas de HBc e HBs foram medidas em PBLs frescos 7 dias após a segunda e terceira dose, e as respostas de anticorpos anti-HBs e anti-HBc foram medidas 14 dias após a segunda e terceira dose.
Tabela 2: Grupos de tratamento [Brapos [antigas Análise estatística
[00186] A análise estatística foi realizada utilizando uma ANOVA nos valores do log10 com 1 fator (grupo), utilizando um modelo de va- riância heterogêneo, ou seja, variâncias idênticas não foram assumi- das para os diferentes níveis do fator. Esta análise foi realizada por ponto no tempo (pós 2º e pós 3º imunizações), por resposta de células T (células T CD4+ e CD8+) e especificidade de antígeno (HBs e HBc). As estimativas das razões médias geométricas entre os grupos e seus intervalos de confiança de 95% (CI) foram obtidas usando a retrotrans- formação nos valores log10. O ajuste para multiplicidade foi realizado usando o método de Tukey. Intervalos de confiança de 95% ajustados à multiplicidade foram fornecidos. Resultados Respostas de células T específicas de HBc e HBs
[00187] A imunização de camundongos com HBc/ASO01g4, HBs/ ASO1g4 ou HBc-HBs/ASO01g.4 induziu uma resposta potente de células T CD4+ contra ambos os antígenos (Figura 3). A magnitude da respos- ta das células T CD4+ específicas de HBc foi significativamente menor (2,3 vezes, valor P = 0,0468) para a formulação HBc-HBs/ASO01g84 em comparação com a HBc/ASO01g4, sugerindo uma interferência dos HBs na Respostas de células T específicas de HBc. No entanto, o nível de células T CD4+ específicas de HBc ainda era considerado forte, bem acima daquele do grupo de controle. Nenhuma interferência foi obser- vada no nível de resposta das células T CD4+ específicas de HBs.
[00188] As formulações HBs/ASO01g-4 ou HBc-HBs/ASO01g-« induzi- ram uma forte resposta de células T CD8+ específicas de HBs (Figura 4). Nenhum dos candidatos à vacina induziu uma resposta detectável de células T CD8+ específicas de HBc (dados não mostrados) confor- me o esperado com este modelo de camundongo devido à ausência na sequência HBc de nosso candidato à vacina do epítopo imunodo- minante restrito a H2-Kº MHC-I - MGLKFROQL- conforme relatado por outros [Riedl, 2014]. Resposta de anticorpos específicos de HBc e HBs
[00189] Altos níveis de anticorpos anti-HBc e/ou anti-HBs foram in- duzidos por cada uma das três formulações (vide Figura 5). Um nível significativamente inferior de resposta de anticorpo anti-HBc foi observa- do na formulação HBc-HBs/ASO01g4 em comparação com HBc/ASO01g+4 (2,35 vezes, P <0,0001). Por outro lado, a presença de HBc na combi- nação HBc-HBs/ASO01g4 não afetou negativamente a resposta de anti- corpo anti-HBs (Figura 5). Conclusão
[00190] Todas as formulações (HBs/ASO01g4, HBc/ASO01g-4 e HBc- HBs/ASO01g4) foram imunogênicas e induziram respostas celulares e humorais contra ambos os antígenos, exceto as respostas de células T CD8+ específicas de HBc (como esperado neste modelo). A resposta anti-HBc induzida pela formulação HBc-HBs/ASO01g.4 foi menor que a induzida por HBc/ASO01g-4, sugerindo interferência ligada à presença de HBs neste modelo de camundongo. Essa interferência foi avaliada posteriormente; vide Exemplo 7, em que uma razão 4 para 1 de HBc para HBs foi capaz de restaurar a resposta imune anti-HBc (anticorpo e células T CD4+ específicas) sem afetar a resposta de anticorpo anti- HBs. Esta formulação, HBc-HBs 4-1/ASO0 1g4, foi selecionada para es- tudos subsequentes de imunogenicidade não clínica com formulações de proteínas adjuvantes.
Exemplo 3 - Experiência de comparação de adjuvante em camundon- gos consanguíneos (CB6F1) Objetivos
[00191] O principal objetivo desta experiência foi comparar a capa- cidade dos antígenos HBc e HBs, na razão de 4 para 1, formulada com diferentes adjuvantes (Alúmen, ASO1g4 ou ASO01£4) ou sem adju- vante, para induzir uma célula T CD4+ forte e resposta humoral contra ambos os antígenos. Projeto de estudo
[00192] —“Camundongos CB6F1 (35 camundongos dos Grupos 1-4 e camundongos do Grupo 5), com 6 a 8 semanas de idade, foram imunizados três vezes intramuscularmente nos Dias O, 14 e 28 com antígenos HBc-HBs (4 pg-1 ug) formulados com alúmen, ASO1g-4 ou ASO1e4 (listados na Tabela 3 abaixo). O sistema adjuvante ASO1e4 contém metade das quantidades dos imunointensificadores QS-21 e MPL em comparação com o ASO01g+1. As respostas de células T espe- cíficas de HBc e HBs foram medidas em PBLs frescos 7 dias após a segunda e terceira dose, após reestimulação ex vivo de 6 horas com agrupamentos de peptídeos e as respostas de anticorpos anti-HBs e anti-HBc foram medidas por ELISA aos 14 dias após a segunda e ter- ceira dose. Tabela 3: Grupos de tratamento : : Análise estatística
[00193] Para a análise estatística, um modelo ANOVA foi ajustado nas frequências das células T log2 e nas titulações de anticorpos log10, incluindo o grupo como efeito fixo e usando um modelo de vari- ância heterogêneo (variações idênticas não foram assumidas entre os grupos, sendo excluído o grupo NaCl da análise). Este modelo foi usa- do para estimar médias geométricas (e seus Cls de 95%), bem como as razões médias geométricas (AS01B nos 3 outros grupos) e seus Cls de 95%. O ajuste de Dunnett foi aplicado para frequências de célu- las T CD4+ específicas de HBc e HBs (desfecho primário) e titulações de anticorpos anti-HBs (desfecho secundário) medidas 14 dias após a terceira dose. Para outras respostas/pontos no tempo, as análises são descritivas e nenhum ajuste foi aplicado. Resultados Respostas de células T específicas de HBc e HBs
[00194] As formulações com adjuvante ASO01 provocaram respostas de células T CD4+ específicas de HBc significativamente mais altas em comparação com formulações com alúmen-adjuvante e não adju- vante (Figura 6B). Não foi observada diferença estatisticamente signi- ficante entre as formulações ASO0 18-14 e ASO01e4. Como observado ante- riormente em camundongos CB6F1, a resposta das células T CD8+ específicas de HBc era indetectável, independentemente da formula- ção testada (dados não mostrados).
[00195] As respostas de células T CD4+ específicas de HBs (Figura 6A) e CD8+ (Figura 6C) foram significativamente maiores para as for- mulações com adjuvante AS01 em comparação com as formulações com adjuvante alúmen e não adjuvantes. Nenhuma diferença estatisti- camente significante foi observada entre as formulações ASO01g4 e ASOe4. Respostas de anticorpo específico de HBc e HBs
[00196] As formulações com adjuvante ASO1 provocaram respostas IgG totais anti-HBc e anti-HBs significativamente mais altas em com-
paração com formulações com adjuvante e sem adjuvante de alúmen (Figura 7). As respostas totais de anticorpos IgG induzidas pelas for- mulações com adjuvante ASO1g-º4 e ASO01e-4 não foram estatisticamen- te diferentes. Conclusão
[00197] No geral, o sistema adjuvante ASO01 (ASO010£4 ou ASO1g4) induziu as maiores respostas humorais e celulares contra HBc e HBs, em comparação com formulações baseadas em Alúmen ou não adju- vantes em camundongos CB6F1. Exemplo 4 - Avaliação da imunogenicidade de regimes de vacina ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV/HBs-HBc/AS0 184 em camundongos trans- gênicos HLA.A2/DR1 Objetivos
[00198] O objetivo deste estudo foi avaliar a imunogenicidade de diferentes regimes vacinais consistindo em um iniciador/reforço com vetores virais ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV, seguidos ou coadministra- dos com duas doses de proteínas HBc-HBs 4-1/AS01g+. Projeto de estudo
[00199] O primeiro grupo de camundongos (N = 16) foi imunizado no dia O com ChAd155-hli-HBV, seguido de MVA-HBV, 28 dias depois. Duas doses de HBc-HBs 4-1ug/AS01g-: foram injetadas com um inter- valo de 14 dias após este regime de vetor viral com iniciador/reforço (Tabela 4). O segundo grupo de camundongos (N = 16) foi imunizado no dia O com ChAd155-hli-HBV e HBc-HBs 4-1/ASO0 18-14, seguido de 28 dias depois por um reforço com MVA-HBV coadministrado com HBc- HBs 4-1/AS01B. Duas coimunizações subsequentes de MVA-HBV e HBc-HBs 4-1/AS01B foram realizadas com um intervalo de 14 dias (Tabela 4). O terceiro grupo de camundongos (N = 8) foi injetado com NaCl como controle negativo. Os camundongos foram sacrificados 7 dias pós-segunda (7dpll) e pós-quarta imunizações (7dplV) para de-
terminar as respostas imunes celulares humorais (soros) e imunológi- cas específicas de HBc e HBs (em esplenócitos e linfócitos infiltrantes do fígado).
[00200] Este estudo foi descritivo e não foram realizadas justificati- vas e análises estatísticas do tamanho da amostra. Tabela 4: Grupos de tratamento eua Jos Joss fora Joss Tomo 10º vp 10º vp Hês FÉ Vasos É VASO F VASO 64 je 1/ASO0184 Resultados Resposta de célula T CD8+ específica de HBc e HBs (esplenócitos)
[00201] A administração concomitante de HBc-HBs 4-1/AS01g+4 com o vetor ChAd155-hli-HBV como iniciador e com o vetor MVA-HBV como reforço (Grupo 2) induziu um aumento de 4 vezes a resposta de célula T CD8+ específica de HBc quando comparada à injeção de ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV (Grupo 1) a 7dpll (Figura 8). Resposta semelhante de células T CD8+ contra HBs foi induzida em ambos os grupos (Figura 8).
[00202] Em 7dplV, a resposta das células T CD8+ específicas de HBc, mas não de HBs, foi claramente aumentada após administrações subsequentes de HBc-HBs/AS01g-4 (aumento de 5 vezes em compa- ração com 7dpll) (Grupo 1). Nenhum aumento adicional de células T CD8+ específicas de HBc ou HBs foi observado quando duas doses adicionais de MVA-HBV/HBc-HBs 4-1/AS01g-4 foram coadministradas (Grupo 2).
Resposta de células T CD4+ específica de HBc e HBs (esplenóci- tos)
[00203] Níveis baixos de células T CD4+ específicas de HBc e HBs foram detectados após a imunização de reforço primário com ChAd 155-hli-HBV/MVA-HBV (mediana de 0,17% e 0,11%, respectivamente) (Grupo 1), enquanto uma resposta potente contra ambos os antígenos foi observada quando HBc-HBs 4-1/AS01g4 foram coadministrados com ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV (Grupo 2) a 7 dpll (Figura 9).
[00204] As administrações subsequentes de HBc-HBs 4-1/ASO01g+4 após o reforço primário com ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV (Grupo 1) melhoraram substancialmente as respostas das células T CD4+ espe- cíficas de HBc e HBs (mediana 1,64% e 2,32%, respectivamente) em TdplIV. Finalmente, um aumento robusto das células T CD4+ especiífi- cas de HBs foi observado quando duas doses adicionais de MVA-HBV e HBc-HBs/ASO01g-4 foram coadministradas aos camundongos já vaci- nados com o reforço primário de ChAd155-hli-HBV/O MVA-HBV co- administrado com HBc-HBs/ASO01g-4 (Grupo 2) no mesmo momento. As células T CD4+ específicas de HBc permaneceram no mesmo nível que a 7dpost || nesse mesmo grupo. Respostas de células T específicas de HBc e HBs medidas em lin- fócitos infiltrantes no fígado
[00205] 7 dias após a última imunização, a presença de respostas de células T induzidas por vacina no fígado foi investigada por Cls. À fim de ter um número suficiente de linfócitos infiltrantes no fígado para realizar a reestimulação in vitro e Cls, agrupamentos de células recu- peradas após perfusão de 3 ou 4 fígados foram constituídos para cada ponto de dados. Devido ao baixo número de pontos de dados, nenhu- ma análise estatística foi realizada e os resultados são descritivos.
[00206] Ambos os regimes de vacina provocaram células T CD4+ específicas de HBc e HBs detectáveis no fígado de camundongos va-
cinados (Figura 10). Fortes respostas de células T CD8+ específicas de HBc foram medidas nos fígados de animais vacinados com os dois esquemas de vacina, enquanto frequências muito mais baixas de célu- las T CD8+ específicas de HBs foram medidas. Resposta de Anticorpo Específica de HBc e HBs
[00207] —“Coadministração de ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV com HBc- HBs 4-1/AS01g- (Grupo 2) induziu a maior quantidade de anticorpos anti-HBc em 7dpll (Figura 11). As injeções subsequentes de MVA-HBV + HBc-HBs/ASO01g8-4 não aumentaram ainda mais o nível de resposta de anticorpos anti-HBc (7dplV). Um nítido aumento da resposta de an- ticorpos específicos anti-HBc foi observado em 7dpIV após injeções de HBc-HBs/ASO018-4 em camundongos imunizados preliminarmente com ChAd155-hli-HBV e MVA-HBV (Grupo 1). A presença do componente HBc-HBs/ASO01g-« parecia ser importante no cronograma para suscitar anticorpos anti-HBs potentes, pois nenhuma resposta de anticorpos anti-HBs foi detectada em animais após a imunização com ChAd155- hli-HBV/MVA-HBV (Figura 11). A maior magnitude de resposta foi ob- servada no grupo co-ad (Grupo 2) após a última imunização. Conclusões
[00208] Em camundongos transgênicos HLA.A2/DR1, ChAd155-hli- HBV/MVA-HBV suscitou respostas de células T CD4+ específicas de HBc, baixas mas detectáveis, que foram claramente melhoradas por HBc-HBs 4-1/AS01g.4. A imunização inicial de reforço primário com ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV induziu potentes respostas de células T CD8+ específicas de HBc e HBs, com as respostas específicas de HBc aumentadas ainda mais após o reforço com HBc-HBs/ASO01g+4 administrado sequencialmente.
[00209] Curiosamente, quando ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV foram coadministrados com HBc-HBs 4-1/ASO01g4, altos níveis de células T CD4+ e CD8+ específicas de HBc e HBs foram induzidos, bem como anticorpos após apenas duas imunizações. Outras imunizações com MVA-HBV + HBc-HBs/ASO01g.4 não aumentaram ainda mais os níveis dessas respostas.
[00210] Além disso, também foram detectadas células T CD4+ e CD8+ específicas de HBc e HBs induzidas pela vacina no fígado de animais vacinados com ambos os regimes de vacina.
Exemplo 5 - Avaliação da tolerância de células T e B à sequência de "cadeia invariante" li codificada pelo vetor ChAd155: Uso de um cons- truto ChAd155 que codifica a sequência li de camundongo (mli) em camundongos CB6F1 Objetivos
[00211] Um estudo de imunogenicidade foi realizado em camun- dongos CB6F1 para investigar a tolerância das células T e B à se- quência de "cadeia invariante" li em um modelo homólogo usando um construto ChAd155 que codifica a sequência li do camundongo (mli): ChAd155-ml/i-HBV.
Projeto de estudo
[00212] A indução de respostas imunes específicas de mli foi avali- ada por IFN-y ELISpot (em esplenócitos) e por ELISA (no soro sanguií- neo) após 2 imunizações intramusculares (dia O e 14) com alta dose (109 vp) de ChAd155-mli Vetor -HBV (Tabela 5).
Tabela 5: Grupos de tratamento [pas Fematet Métodos
[00213] Para respostas de células T, 15 peptídeos sobrepostos por 11 aminoácidos que abrangem a sequência li de murino e dispostos em um agrupamento foram utilizados como antígeno no ensaio IFN-y-
ELISpot. Para respostas de anticorpos, uma proteína recombinante |i de murino disponível comercialmente e um anticorpo monocilonal es- pecífico para li de murino foram respectivamente utilizados para reves- tir as placas de ELISA e como controle positivo. Como controle positi- vo da "tomada de vacina", as respostas das células T específicas de HBc e HBs foram monitoradas no ensaio IFN-y-ELISpot. Resultados
[00214] Uma resposta de célula T específica de HBc potente e uma resposta de célula T específica de HBs mais baixa e detectável foram medidas após a primeira e a segunda imunização com ChAd155-mli- HBV. Deve-se notar-se, o epítopo de Classe | dominante restrito a Kb de HBc (MGLKFRQL) foi adicionado neste construto para permitir a monitorização da resposta da célula T CD8+ específica de HBc nesta cepa de camundongo e os esplenócitos foram reestimulados com esta sequência específica no ELISpot ensaio. Não foram detectados anti- corpos anti-mli (Figura 13) e células T específicas de mli (Figura 12) em nenhum animal duas semanas após a primeira ou segunda imuni- zação, sugerindo que a tolerância imunológica à sequência de mli foi preservada. Exemplo 6 - Avaliação da imunogenicidade e segurança de regimes de vacina ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV/HBc-HBs/ASO0 184 em camundon- gos HLA.A2/DR1 transduzidos em AAV2/8-HBV Objetivos
[00215] O modelo murino HLA.A2/DR1 transduzido por AAV2/8- HBV recapitula características virológicas e imunológicas da infecção por HBV crônica. Neste modelo, o fígado de camundongos é transdu- zido com um vetor sorotipo 2/8 do vírus adenoassociado (AAV2/8), portando um genoma de DNA do VHB competente para replicação.
[00216] “Uma injeção na veia caudal de 5x10'ºvg (genoma viral) do vetor AAV2/8-HBV leva à replicação de HBV e à expressão gênica no fígado de camundongos transduzidos por AAV2/8-HBV [Dion; 2013]. Intermediários replicativos de DNA de HBV, transcritos de RNA de HBV e antígenos do HBc são detectados no fígado até 1 ano após a injeção, sem inflamação hepática significativa associada. Os antígenos HBs e HBe e o DNA HBV podem ser detectados nos soros por até 1 ano. Além disso, o estabelecimento de tolerância imunológica a antí- genos de HBV é observado neste modelo substituto de infecção crôni- ca pelo HBV.
[00217] Os objetivos deste estudo realizado em camundongos HLA.A2/DR1 transduzidos por AAV2/8-HBV foram * —“demonstrar que o regime vacinal pode superar a tole- rância aos antígenos HBs e HBc.
* Avaliar o impacto da infiltração hepática de células T CD8+ específicas de HBc, potencialmente visando a hepatócitos que expressam o HBcAg, na histologia do fígado (H&E níveis de AST e ALT, como parâmetros substitutos para a função hepática. Projeto de estudo
[00218] Doisesquemas de vacina diferentes, com base na imuniza- ção sequencial com ChAd155-hli-HBV e MVA-HBV (ambos codifican- do os antígenos de núcleo de HBV [HBc] e de superfície [HBs]), isola- damente ou em combinação com HBc-HBs 4-1/AS01g4 seguido de duas doses adicionais de HBc-HBs 4-1/AS01g-1 (isoladamente ou em combinação com MVA-HBV), foram testados (Tabela 6).
[00219] Os camundongos HLA.A2/DR1 dos grupos 1, 2 e 3 foram transduzidos com 5x10ººvg do vetor AAV2/8-HBV (administração intra- venosa) no dia O, enquanto o grupo 4 serviu como controle positivo da imunogenicidade (nenhum estabelecimento de tolerância antes da va- cinação).
[00220] Os animais do Grupo 1 (N = 21) foram imunizados no dia 31 com ChAd155-hli-HBV, seguido de MVA-HBV no dia 58. Duas do-
ses de HBc-HBs 4-11ug/ASO01g-4 foram injetadas nos dias 72 e 86 após este regime de vetor viral iniciador/reforço (Tabela 6).
[00221] Os animais do Grupo 2 (N = 21) foram imunizados no dia 31 com ChAd155-hli-HBV e coadministrados com HBc-HBs 4-1/AS0 gx, seguidos no dia 58 por um reforço com MVA-HBV coadministrado com HBc-HBs 4-1/AS01B. Duas coimunizações subsequentes de MVA-HBV e HBc-HBs 4-1/AS01B foram realizadas nos dias 72 e 86 (Tabela 6).
[00222] Os animais do Grupo 3 (N = 21) foram injetados com NaCl nos dias 31, 58, 72 e 86 como controle negativo.
[00223] Os animais do Grupo 4 (N = 8) receberam o mesmo regime de vacina que o Grupo 2 (exceto que não foram transduzidos com AAV2/8-HBV).
[00224] Todas as vacinas foram administradas por via intramuscu- lar.
[00225] O nível de antígeno circulante de HBs foi medido nos soros nos dias 23, 65 e 93 (grupos 1,2 e3).
[00226] As respostas de anticorpo específico de HBs e HBc foram medidas em soros de todos os animais nos dias 23 (transdução após AAV2/8-HBV), 65 (7 dias após a segunda imunização) e 93 (7 dias após a quarta imunização) por ELISA. As respostas das células T CD4+ e CD8+ específicas de HBs e HBc foram avaliadas nos dias 65 (9 animais/grupo) e 93 (12 animais/grupo) em esplenócitos e linfócitos infiltrantes hepáticos, após reestimulação ex vivo e ICs (Grupos 12 e 3). Estas leituras de imunogenicidade foram realizadas apenas no dia 93 para animais do grupo 4 (8 animais).
[00227] Com relação aos parâmetros de segurança relacionados ao fígado, os níveis de AST e ALT foram medidos nos soros nos dias 38, 65 e 93 e o exame microscópico das seções hepáticas coradas com H&E foi realizado nos dias 65 e 93 para detectar possíveis alterações histo- patológicas relacionadas à vacina ou inflamação (Grupos 1,2 e3).
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Análise estatística Níveis AST e ALT
[00228] “Um modelo ANOVA para medidas repetidas, incluindo Gê- nero, Dia, Grupo e as três interações dois a dois, foi ajustado nos valo- res da atividade enzimática transformada em log10, usando a estrutura de covariância não estruturada. As premissas do modelo foram verifi- cadas. As interações insignificantes no nível de 5% foram removidas do modelo. Para ambas as enzimas, o modelo final incluiu Gênero, Dia, Grupo e a interação entre Grupo e Dia. As médias geométricas da atividade enzimática de cada grupo em cada ponto do tempo foram derivadas deste modelo. As comparações de grupos de interesse são relatadas por meio de razões médias geométricas (GMRs) que também foram derivadas desse modelo. Todas essas estatísticas são apresenta- das com um intervalo de confiança de 95% nos dois lados. A multiplici- dade não foi levada em consideração ao calcular esses GMRs.
[00229] Todas as análises foram realizadas usando SAS 9.2 Respostas humorais
[00230] Estatísticas descritivas foram realizadas para calcular o número de respondentes. O ponto de corte para resposta às respostas de anticorpos anti-HBc ou anti-HBs foi definido com base nas titula- ções médias geométricas calculadas no Grupo 3 (transdução AAV2/8- HBV, mas sem vacinação). Resposta celular
[00231] Análises descritivas foram realizadas para definir o número de respondentes para células T CD4+ ou CD8+ específicas de HBc-, HBs. O ponto de corte para responsividade foi definido como o percen- til 95 das medições feitas no Grupo 3 (transdução AAV2/8-HBV, mas sem vacinação).
Resultados Células T CD8+ e CD4+ específicas de HBc
[00232] Em camundongos HLA-A2/DR1 transduzidos por AAV2/8- HBV, o nível de fundo das células T CD8+ ou CD4+ específicas de HBc foi muito baixo a indetectável sem imunização em todos os mo- mentos testados (Grupo 3).
[00233] A imunização com os vetores ChAd155-hli-HBV e MVA- HBV, isoladamente (Grupo 1) ou em combinação com HBc-HBs 4- 1/ASO01g-4 (Grupo 2), induziu células T CD8+ específicas de HBc (6/7 e 9/9 respondedores respectivamente 7 dias após Il), demonstrando um desvio da tolerância ao antígeno de HBc (Figura 14A). As duas doses adicionais de HBc-HBs 4-1/ASO01g4, isoladamente ou em combinação com MVA-HBV, aumentaram modestamente essas respostas de célu- las T CD8+ específicas de HBc, medidas em 7 dias após a quarta do- se, atingindo frequências médias de 1 % no grupo 1 e 1,45% no grupo
2. As frequências de células T CD8+ específicas de HBc induzidas pe- lo mesmo regime vacinal que no grupo 2 foram maiores em camun- dongos HLA.A2/DR1 não transduzidos do grupo 4 (8/8 respondedores, com frequências — 4 vezes maiores aos 7 dias pós-IV), como esperado devido à tolerância imunológica ao antígeno de HBc. Também foram detectadas células T CD8+ específicas de HBc no fígado de camun- dongos vacinados, com o mesmo perfil que nos baços (Figura 14B).
[00234] Ambos os regimes de vacina suscitaram células T CD4+ específicas de HBc muito baixas a indetectáveis em camundongos HLA-A2/DR1 transduzidos por AAV2/8-HBV (Grupos 1 e 2), enquanto uma resposta robusta foi medida em camundongos não transduzidos (Grupo 4), sugerindo que o regime vacinal não superou a tolerância das células T CD4+ ao antígeno de HBc sob essas condições experi- mentais (Figura 15A, B).
Células T CD8+ e CD4+ específicas de HBs
[00235] A imunização com os vetores ChAd155-hli-HBV e MVA- HBV, isoladamente (Grupo 1) ou em combinação com HBc-HBs 4- 1/ASO01g-4 (Grupo 2), suscitou células T CD8+ específicas de HBs sem aumento adicional das intensidades após as duas doses adicionais de HBc-HBs 4-1/AS01g4, isoladamente ou em combinação com MVA- HBV, em camundongos transduzidos AAV2/8-HBV (Figura 16A). No final do esquema de vacinação (7 dias após a quarta dose), as fre- quências de células T CD8+ específicas de HBs, medidas em animais dos Grupos 1 e 2, eram próximas das detectadas no Grupo 4 (camun- dongos HLA.A2/DR1 não transduzidos, mediana em 7 dias pós-IV = 0,62%, 5/8 respondedores), sugerindo uma superação da tolerância das células T em relação ao antígeno de HBs. As células T CD8+ es- pecíficas de HBs foram detectadas nos fígados dos animais dos Gru- pos 1, 2 e 4 na maioria dos animais vacinados (Figura 16B).
[00236] As células T CD4+ específicas de HBs foram induzidas após a administração de HBc-HBs 4-1/AS013-4 isoladamente ou em combinação com vetores, a partir de 7 dias após a segunda vacinação no Grupo 2 e de 7 dias após a quarta vacinação no Grupo 1 (Figura 17A). O esquema vacinal usado em animais do Grupo 2 suscitou fre- quências cerca de três vezes mais altas de células T CD4+ específicas de HBs (mediana 7 dias após IV = 3,7%, 11/11 respondedores) em comparação ao esquema vacinal usado em animais do Grupo 1 (me- diana aos 7 dias pós-IV = 1,34%, 11/12 respondentes), atingindo ní- veis semelhantes aos do Grupo 4 (camundongos HLA.A2/DR1 não transduzidos, mediana aos 7 dias pós-IV = 3%, 8/8 respondedores), sugerindo uma superação completa da tolerância das células T em relação ao antígeno de HBs. De maneira semelhante às respostas sis- têmicas das células T CD4+, foram detectadas células T CD4+ especí- ficas de HBs nos fígados dos animais dos Grupos 1, 2 e 4 em todos os animais vacinados (Figura 17B). Respostas de anticorpo específico de HBs e HBc
[00237] —Aos23 dias após a injeção do vetor AAV2/8-HBV, nenhuma resposta de anticorpos anti-HBs foi detectada em camundongos HLA.A2/DR1, sugerindo uma forte tolerância humoral em relação ao antígeno de HBs. A imunização apenas com os vetores ChAd155-hli- HBV e MVA-HBV (Grupo 1) não quebrou essa tolerância, enquanto a imunização dos vetores em combinação com HBc-HBs 4-1/AS01g-1 levou à indução de respostas de anticorpo anti-HBs em 15 dos 21 animais no dia 65 (grupo 2) (Figura 18A). A administração adicional de 2 doses de HBc-HBs 4-1/ASO01g. no grupo 1 suscitou anticorpos anti- HBs detectáveis (titulações médias geométricas (GMT) de 116,8 e 8/12 respondedores no dia 93) e as 2 doses adicionais de MVA-HBV combinado com HBc-HBs 4-1/AS01g4 no Grupo 2 aumentou ainda mais a intensidade da resposta de anticorpo anti-HBs até um GMT de 775 com 11/11 respondedores, mantendo-se — 5 vezes menor do que no grupo não -AAV2/8-HBV transduziu animais do Grupo 4 (GMT = 3933) no dia 93.
[00238] Da mesma forma, as respostas de anticorpos anti-HBc fo- ram induzidas apenas quando o componente HBc-HBs 4-1/AS01g+4 estava presente no regime de vacina, com níveis 3 vezes mais altos medidos no dia 93 em animais do Grupo 2 (GMT = 1335,5; 11/11 res- pondedores) em comparação com o Grupo 1 (GMT = 442,8; 12/12 respondedores) Figura 18B). As titulações de anticorpos anti-HBc in- duzidos nos camundongos não transduzidos (Grupo 4) com o mesmo regime de vacina que no Grupo 2 foram maiores (- 27 vezes, GMT = 35782).
[00239] Estes resultados mostram que a presença do componente proteico adjuvante no regime de vacina é crítica para quebrar a tole- rância humoral aos antígenos HBc e HBs. Além disso, o regime de va-
cina usado no Grupo 2, contendo 4 administrações dos HBc-HBs 4- 1/ASO01g-4, suscitou as mais altas respostas de anticorpos anti-HBc e anti-HBs, permanecendo mais baixo do que nos camundongos não- AAV2/8-HBV transduzidos (Grupo 4). Níveis AST/ALT
[00240] “Como parâmetro de inflamação relacionado ao fígado, as atividades séricas de AST e ALT foram medidas nos dias 38 (7 dias após a primeira vacinação), 65 (7 dias após a segunda vacinação) e/ou 93 (7 dias após a quarta imunização) (todos os grupos). No geral, os níveis de AST e ALT permaneceram estáveis durante o curso dos regimes de vacina (Grupos 1 e 2) em camundongos HLA.A2/DR1 transduzidos por AAV2/8-HBV e semelhantes aos medidos em ca- mundongos que não receberam vacinas (Grupo 3) (Figura 19). Os ní- veis de AST foram encontrados estatística e significativamente mais altos nos animais dos grupos de vacinas (Grupos 1 e 2) quando com- parados ao grupo controle 3 no dia 65. No entanto, os níveis de AST foram surpreendentemente baixos no dia 65 nos animais do grupo 3 em comparação ao restante da cinética, sugerindo que essas diferen- ças se deviam aos valores particularmente inesperadamente baixos obtidos no grupo controle 3 neste momento, ao invés de um aumento dos níveis de AST nos grupos vacinais (Grupos 1 e 2) (Figura 19A).
[00241] Um nível de ALT ligeiramente mais baixo foi medido no dia 38 em animais do Grupo 1 em comparação com animais controle do Grupo 3, mas essa diferença não foi considerada clinicamente relevan- te (Figura 19B). Exame Microscópico do Fígado
[00242] O exame microscópico das seções hepáticas coradas com H&E foi realizado nos dias 65 e 93 para detectar possíveis alterações histopatológicas ou inflamação relacionadas à vacina (Grupos 1,2 e3) (Tabela 7).
[00243] Não houve achados microscópicos relacionados ao item de teste no dia 65 (7 dias após a injeção da segunda vacina vetor viral, MVA-HBV com ou sem HBc-HBs 4-1/AS01g+4) ou no dia 93 (7 dias após a última injeção) em camundongos HLA-A2/DR transduzidos por AAV2/8-HBV, ou seja, não houve alterações histopatológicas que pu- dessem estar associadas ao uso dos componentes da vacina ChAd155-hli-HBV, MVA-HBV e HBc-HBs 4-1/AS01g-4.
[00244] Além disso, exceto no animal de controle 3,13 (que apre- sentou necrose fragmentada focal de grau 1), nenhum dos animais apresentou sinais morfológicos de hepatite crônica.
[00245] Outros achados microscópicos observados em animais tra- tados foram considerados alterações incidentais, como também ocor- reram no grupo controle, eram de baixa incidência/magnitude e/ou são achados comuns em camundongos de idade semelhante [Mclnnes, 2012].
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[00246] Níveis de antígeno de HBs em soros de camundongos inje- tados em AAV2/8-HBV.
[00247] “Como já relatado em Dion et al [Dion, 2013], os níveis de antígeno de HBs foram mais altos nos homens quando comparados às mulheres, 23 dias após a injeção com os vetores AAV2/8-HBV. Esses níveis permaneceram estáveis em todos os grupos, sem impacto de- tectável dos esquemas de vacinação (Figura 20). No entanto, o ca- mundongo injetado com AAV2/8-HBV não é um modelo animal para estudar a eficácia da vacina no HBsAg. Conclusão
[00248] Em um modelo substituto de infecção por HBV crônica, on- de é estabelecida a tolerância imunológica ao antígeno de HBc e HBs, ou seja, camundongos HLA-A2/DR1 transduzidos por AAV2/8-HBV, ambos os regimes de vacina testados contornaram a tolerância ao in- duzir IgG específica de HBc e HBs e respostas de células T CD8+, bem como respostas de células T CD4+ específicas de HBs, embora em níveis mais baixos do que em camundongos não transduzidos, como esperado devido à forte tolerância imunológica. Quando os veto- res ChAd155-hli-HBV/MVA-HBV foram coadministrados com HBc-HBs 4-1/ASO0 1gx4, as intensidades das respostas de anticorpos e células T induzidas pela vacina foram maiores do que com o regime vacinal em que os vetores e proteínas adjuvantes foram administrados sequenci- almente. Além disso, ao avaliar a inflamação hepática associada à va- cina medindo as atividades séricas da AST e ALT e realizando a avali- ação histopatológica do fígado, não foi detectado aumento nas enzi- mas hepáticas nos grupos vacinais quando comparado ao não vacina- do e nenhum achado microscópico pôde ser relacionado aos tratamen- tos vacinais. No total, esses resultados mostram que os candidatos à vacina testados restauraram com sucesso as respostas de anticorpos T CD8+ e específicos de HBs e HBc, bem como as respostas de célu-
las T CD4+ específicas de HBs sem detecção de sinais associados de alteração hepática, nessas condições experimentais. Sumário de dados de imunologia não clínica dos Exemplos 1-6
[00249] “Estudos em camundongos CB6F1 vacinados com as prote- ínas da vacina (HBc-HBs) formuladas no Sistema Adjuvante ASO1g+4 sugeriram uma interferência negativa do antígeno de HBs no anticorpo induzido por HBc e nas respostas das células T CD4+. No entanto, a vacina combinada HBc-HBs/ASO01g+ foi capaz de montar respostas robustas de células T CD4+ específicas e anticorpos a ambos os antí- genos da vacina.
- Quando comparada à formulação baseada em alúmen ou não adjuvante, a formulação baseada na família ASO1 induziu células CD4+ significativamente mais altas e respostas de anticorpos a antí- genos HBc e HBs.
[00250] A administração de ChAd155-hli-HBV em camundongos transgênicos HLA.A2/DR1 induziu uma forte resposta de células T CD8+ ao antígeno de HBc e, em menor extensão ao antígeno de HBs. A resposta ao antígeno de HBc foi claramente melhorada pela presen- ça do hli no construto. A administração subsequente de MVA-HBV aumentou ainda mais a resposta das células T CD8+ contra o antígeno de HBc: após o reforço de MVA, uma maior frequência de células T CD8+ específicas de HBc foi observada em camundongos iniciados com ChAd155-hli-HBV versus camundongos iniciados com ChAd155- HBV, enquanto as respostas de células T CD8+ específicas de HBs não foram melhoradas.
[00251] — Quando administrados a camundongos transgênicos HLA.A2/ DR1, os regimes de vacinação completos (ou seja, administração se- quencial ou concomitante de vetores virais e proteínas adjuvantes) in- duziram respostas robustas de células T CD4+, células T CD8+ e anti- corpos a ambos os antígenos da vacina. Além disso, foram detectadas células T CD4+ e CD8+ específicas de HBs e HBc induzidas pela va- cina no fígado de animais vacinados com ambos os regimes de vaci- na.
[00252] Um estudo de imunogenicidade foi realizado em CB6F1 para investigar a tolerância das células T e B à sequência "cadeia in- variante" (li) em um modelo homólogo usando um construto ChAd155 que codifica a sequência li do camundongo (mli): CRAd155-mlIi-HBV. À indução de respostas imunes específicas de mli foi avaliada após 2 imunizações (dia O e 14) com uma dose alta (10º vp) do vetor ChAd 155-mli-HBV. Não foram detectados anticorpos anti-mli e células T es- pecíficas de mli em nenhum animal duas semanas após a primeira ou segunda imunização, sugerindo que a tolerância imunológica à se- quência de mi foi preservada.
[00253] Em um modelo de camundongo pré-clínico persistente a HBV (camundongos HLA.A2/DR1 transduzidos por AAV2/8-HBV), on- de a tolerância imunológica é observada a antígenos de HBV, os es- quemas de vacina foram capazes de quebrar a tolerância com indução de HBc e HBs específicos células T CD8+, células T CD4+ específicas de HBs e respostas de anticorpos a antígenos HBs e HBc, embora não tenha sido observada resposta de células T CD4+ específica de HBc. Os níveis de respostas induzidas pela vacina nos camundongos trans- duzidos por AAV foram, no entanto, (e como esperado) inferiores aos detectados em camundongos HLA.A2/DR1 puros. Além disso, ao ava- liar a inflamação hepática associada à vacina medindo as atividades séricas da aspartato aminotransferase (AST) e ALT e realizando a avaliação histopatológica do fígado, não foi detectado aumento das enzimas hepáticas nos grupos vacinais, quando comparado ao grupo não vacinado e nenhum achado microscópico pôde ser relacionado ao tratamento da vacina. No total, esses resultados mostram que os can- didatos à vacina testados restauraram com sucesso as respostas de anticorpos T e CD8+ específicos de HBs e HBc, bem como as respos- tas de células T CD4+ específicas de HBs sem detecção de sinais as- sociados de alteração hepática, nessas condições experimentais. Exemplo 7 - Avaliação da imunogenicidade de diferentes proporções de proteína recombinante HBc/HBs adjuvante Objetivos
[00254] O objetivo da experiência foi confirmar uma interferência negativa do antígeno de HBs na resposta das células T CD4+ induzida por HBc, como visto no Exemplo 2, 7 dias após a terceira imunização, onde os antígenos HBs e HBc foram misturados com uma razão de 1 para 1. Um outro objetivo foi avaliar várias razões de HBs/HBc para limitar essa interferência e garantir pelo menos uma resposta potente de células T CD4+ específica de HBc, ao mesmo tempo em que gera- va uma resposta robusta de anticorpos específicos de HBc e HBs. Projeto de estudo
[00255] —Camundongos CB6F1 (30 camundongos por grupo) de 6-8 semanas de idade foram imunizados três vezes intramuscularmente (músculo gastrocnêmico) nos dias 0, 14 e 28 com várias formulações contendo antígenos HBc e HBs (listados na Tabela 8) em 50 ul de ASO1B -3 ou ASO01g.4. Os camundongos CB6F1 foram aleatoriamente atribuídos para um dos grupos de estudo. A avaliação das respostas de células T específicas de HBc e HBs por Coloração Intracelular de Citocina (ICS) foi realizada usando leucócitos coletados 7 dias após a segunda e a terceira imunização de 6 agrupamentos de 5 camundon- gos/grupo. O soro foi coletado de camundongos individuais 14 dias após a segunda e terceira imunizações e apenas soro de 20 camun- dongos randomizados foram testados para avaliação das respostas de lg total de anticorpos específicos de HBc e HBs devido à análise esta- tística do tamanho da amostra.
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Ê
Análise estatística
[00256] A não inferioridade dos grupos HBc-HBs em comparação com os grupos HBc correspondentes foi avaliada. Essa não inferiori- dade será alcançada se a UL do IC 95% das razões médias geométri- cas das frequências (em %) da célula T CD4+ específica de HBc ex- pressando pelo menos uma citocina (IL-2 e/ou IFN-y e/ou TNF-a) para os grupos HBc em relação aos grupos HBc-HBs correspondentes é inferior a 2 aos 7 dias após a dose Ill. Como se tratava de uma primei- ra avaliação e como os critérios não foram predefinidos, nenhum ajus- te para multiplicidade foi aplicado.
[00257] Um modelo ANOVA (Análise de Variância) foi usado para responder aos dois objetivos principais. Este modelo foi ajustado nas frequências log10 CD4+ após a dose Ill, incluindo o grupo (4 a 12), a interação como efeitos fixos e o uso de um modelo de variação hete- rogêneo (variações idênticas não foram assumidas entre os grupos). Este modelo foi usado para estimar médias geométricas (e seus CIs de 95%), bem como as razões médias geométricas e seus Cls de 95%, utilizando uma retrotransformação das médias e diferenças do log10. Resultados Respostas de células T CD4+ específicas de antígeno
[00258] Todas as formulações após a 2º imunização induziram for- tes respostas de células T CD4+ específicas de anti-HBc e HBs (+ 1%). Embora a magnitude da resposta das células T CD4+ específicas de HBc induzida pela formulação contendo uma quantidade igual de HBc e HBs no AS01g. tendesse a ser menor (Figura 23) quando com- parada ao grupo HBc/ASO01g-4 sozinho, essas diferenças não foram estatisticamente significantes porque a razão foi de + 1,4 (p = 0,143) (Figura 23). Após a 3º imunização, a magnitude da resposta das célu- las T CD4+ específicas de HBc suscitada pela formulação contendo uma quantidade igual de HBc e HBs no AS01g.4 foi estatisticamente menor (GMR 0,391 e IC 95% [0,184-0,828]) quando comparada ao grupo HBc/ASO01g-s sozinho (Figura 24). Isto confirmou a observação no Exemplo 2 da interferência de HBs nas respostas de células T CD4+ específicas de HBc. A interferência foi menos pronunciada quando os antígenos foram formulados em uma razão de 4 para 1 de HBc e antígeno de HBs. Não foi observado um impacto negativo ao se observar as respostas de células T CD4+ específicas de HBs (Figura 23 e Figura 24).
[00259] Ao aumentar ainda mais as razões de HBc/HBs, houve uma tendência, embora não estatisticamente significativa, de recuperação adicional dessa resposta de células T CD4+ específica de HBc com medianas de até 1,7% do total de células T CD4+ específicas de HBc que expressam IFN-y e/ou IL-2 e/ou TNFa.
[00260] As respostas de células T CD8+ específicas de HBs foram avaliadas após a 2º e a 3º imunizações (Figura 25). Uma resposta de faixa de dose específica de HBs foi observada após a 2º e a 3º imuni- zações. Após a terceira imunização, as respostas de células T CD8+ específicas de HBs tenderam a diminuir quando coformuladas com uma quantidade igual de antígeno de HBc (GMR 0,66 e IC 95% [0,337-1,295]), no entanto, essa razão não é estatisticamente significa- tiva (p = 0,1717). As respostas de células T CD8+ específicas de HBc foram baixas a indetectáveis (inferiores a 0,1%, dados não mostrados). Respostas de Anticorpo Específico de Antígenos
[00261] Todas as formulações após a 2º imunização induziram altas e similares respostas lg anti-HBc e HBs total sem impacto negativo ao coformular HBs e HBc na razão de 1 para 1 no sistema adjuvante ASO1g+ (Figura 26). As respostas lg específicas de anti-HBc totais fo- ram aumentadas após a terceira imunização (Figura 27). A interferên- cia de HBs foi observada no nível de respostas de anticorpo específico de HBc ao coformular HBs e HBc na razão de 1 para 1 no sistema ad- juvante ASO1g.4. As razões GMT e intervalo de confiança de 95% fo- ram de 1,88 [1,44; 2,44] com os valores de p < 0,0001. Aumentar a razão de HBc para HBs em quatro permite a recuperação das respos- tas humorais de HBc, razões de GMT e intervalo de confiança de 95% foi de 1,37 [1,04; 1,80] com p = 0,0262. HBc não teve impacto negativo no nível de resposta de anticorpos específicos de HBs, como relatado anteriormente (Figuras 26 e 27). Conclusão
[00262] Os resultados desta experiência indicam que a interferência negativa de HBs nas células T CD4+ específicas de HBc e as respos- tas humorais observadas quando ambos os antígenos foram coformu- lados em uma razão de 1/1 foram superados para formulações com uma razão de HBc/HBs 2 4. Como resultado, doses de 4 ug de HBc e 1 ug de HBs foram selecionadas para outras experiências pré-clínicas.
LISTAGENS DE SEQUÊNCIA SEQ ID NO:1: Sequência de aminoácido de HBs
MENITSGFLGPLLVLOAGFFLLTRILTIPOSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQONSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMC LRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI
PSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI SEQ ID NO:2: Sequência de aminoácido de HBc truncado
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRÇAILCWGELMTLATWVGNNL
EDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV SEQ ID NO:3: Sequência de aminoácido de espaçador incorporando região de clivagem 2A do vírus da doença aftosa
APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP SEQ ID NO:4: Sequência de nucleotídeo que codifica espaçador incorporando região de clivagem 2A do vírus da doença aftosa
GCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCEGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCT SEQ ID NO:5: Sequência de aminoácido de HBc-2A-HBs
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRÇAILCWGELMTLATWVGNNL EDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRR DRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCAPVKETLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLOAGF FLLTRILTIPOSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLL VLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFS
WLSLLVPEFVQWEFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI SEQ ID NO:6: Sequência de nucleotídeo que codifica HBc-2A-HBs
ATGGACATCGATCCCTACAAGGAATTTGGCGCCACCGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCA GCGTGAGGGACCTCCTGGACACCGCCAGCGCCCTEGTACAGGGAGGCCCTEGAATCTCCCGAGCACTGCAGCCCACA CCACACCGCACTGAGGCAGGCCATCCTGTGCTGGGGAGAGCTGATGACCCTCGCCACCTGGGTEGGGCAACAACCTG GAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTGAACTACGTCAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGT GGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTCGGCAGGGAGACCGTGCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAG GACACCTCCCGCCTACAGACCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACAGTGGTGAGGAGGAGE GACAGGGGCAGGTCACCCAGGAGGAGGACTCCAAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGAAGGAGGA GCCAGAGCAGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACET GGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAGAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTGCTGGTGCTGCAGGCAGGCTTC TTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATCCCCCAGAGCCTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCCTCGGECGEGA GCCCCETEGTEGCCTGGECCAGAACAGCCAGTCTCCCACCAGCAATCACAGCCCCACCAGCTGCCCCCCAATCTGTCC TGGCTACCGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTCCTGTGCCTGATCTTCCTGCTG GTGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCAGTGTGTCCCCTGATCCCCGGCTCAACCACCACTAACACCGGCCCCT GCAAAACCTGCACCACCCCCGCTCAGGGCAACAGCATGTTCCCAAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCACCGACGGCAA CTGCACCTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAGTATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGTGAGGTTCAGC TGGCTCAGCCTGCTGEGTGCCCTTCGTCCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCGTGTGGCTGAGCGCCATCTGGA TGATGTGGTACTGGGGCCCCAGCCTGTACTCCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTGCTGCCCATTTTCTTCTGCCT
GTGGGTGTACATC SEQ ID NO:7: Sequência de aminoácido de hli
MHRRRSRSCREDQOKPVMDDORDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGÇQATTAYFLYQOEQOG RLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMÇQALPMGALPQGPMONATKYGNMTEDHVMHLLONADPLK VYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVP
M SEQ ID NO:8: Sequência de nucleotídeo que codifica hli atgcacaggaggaggagcaggagctgcagggaggaccagaagecegtgatggacgaccagegegacetgatcagea acaacgagcagctgccaatgctgggcaggaggeceggageacecgaaageaagtgeageaggggegecetgtacac ecggetteageatectagtgacectectgetagecggecaggecaceacegectatttectataccageageaggge aggctegataagetgacegtgaceteceagaacetgcagetagagaacetgaggatagaagetgeccaagecececa agccegtgagcaagatgaggataggecacececetgctgatgcaggetetgcecatgggggecetgececagggece catgcagaacgccaccaaatacggcaacatgaccegaggaccacgtgatgcacctgetgcagaacgcegatecteta aaggtgtacceacecetgaaaggecagetteceegagaaceteaggeacetgaagaacaccatggagaccategact ggaaggtgttegagagetggatgcaccactaggetgctattegagatgagecggcacagectggagcagaageceac ecgacgccecteceaaggagagectegagetegaggacecaageageggectaggegtgaccaageaggacetggge ceegtgeecata SEQ ID NO:9: Sequência de aminoácido de hli-HBc-2A-HBs
MHRRRSRSCREDQOKPVMDDORDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQÇQATTAYFLYQOQOG RLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQOGPMONATKYGNMTEDHVMHLLONADPLK VYPPLKSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGGVTKQDLGPVP MMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRÇAILCWGELMTLATWVGNN LEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVAP VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLOAGFFLLTRILTIPQOSLDSWWT SLNFLGGSPVCLGQONSQO SPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQG NSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPEVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLY
SIVSPFIPLLPIFFCLWVYI SEQ ID NO:10: Sequência de nucleotídeo que codifica hli-HBc-2A- HBs
ATGCACAGGAGGAGGAGCAGGAGCTGCAGGGAGGACCAGAAGCCCEGTGATGGACGACCAGCGCGACCTGATCAGCA ACAACGAGCAGCTGCCAATGCTGGGCAGGAGGCCCGGAGCACCCGAAAGCAAGTGCAGCAGGGGCGCCCTGTACAC CGGCTTCAGCATCCTGGTGACCCTCCTGCTGGCCEGCCAGGCCACCACCGCCTATTTCCTGTACCAGCAGCAGGEGC AGGCTCGATAAGCTGACCGTGACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGAGGATGAAGCTGCCCAAGCCCCCCA AGCCCGTGAGCAAGATGAGGATGGCCACCCCCCTGCTGATGCAGGCTCTGCCCATGGGGGCCCTGCCCCAGEGCCC CATGCAGAACGCCACCAAATACGGCAACATGACCGAGGACCACGTGATGCACCTGCTGCAGAACGCCGATCCTCTG AAGGTGTACCCACCCCTGAAAGGCAGCTTCCCCGAGAACCTCAGGCACCTGAAGAACACCATGGAGACCATCGACT GGAAGGTGTTCGAGAGCTGGATGCACCACTGGCTGCTGTTCGAGATGAGCCGGCACAGCCTGGAGCAGAAGCCCAC CGACGCCCCTCCCAAGGAGAGCCTCGAGCTCGAGGACCCAAGCAGCGGCCTGEGCETEGACCAAGCAGGACCTGGEC CCCGTGCCCATGGACATTGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACCGTCGAACTGCTGAGCTTCCTCCCCAGCGACT TCTTCCCCTCCGETGAGEGATCTGCTGGACACAGCTAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTE CAGCCCCCACCACACAGCCCTGAGGCAGGCCATCCTCTGTTGGGGCGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGETEGECS AATAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGACCTGGTGGTCAACTACGTGAACACCAACATGGGCCTGAAGATCAGGC AGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTTGGCAGGGAGACCGTCCTGGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGT GTGGATCAGGACTCCCCCAGCCTACAGGCCCCCTAACGCCCCCATCCTGTCTACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTG AGGAGGAGGGACAGGGGCAGAAGCCCCAGGAGAAGGACCCCTAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGA GGAGGAGGAGCCAGAGCCGGGAGAGCCAGTGCGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGC CGGCGACGTGGAGAGCAATCCCGGCCCTATGGAAAACATCACCAGCGGCTTCCTGGGCCCCCTECTEGTGCTGCAG GCCGGCTTCTTCCTGCTGACCAGGATCCTGACCATTCCCCAGTCACTGGACAGCTGGTGGACCAGCCTGAACTTCC TCGGCEGEAGCCCCGTETEGCCTEGECCAGAATAGCCAGAGCCCCACCAGCAACCACTCTCCCACTTCCTGCCCCCCE TATCTGCCCCGGECTACAGGTGGATGTGCCTGAGGAGGTTCATCATCTTCCTGTTCATCCTGCTGCTGTGCCTGATC TTCCTGCTGGTEGCTGCTGGACTACCAGGGAATGCTGCCCGTEGTGTCCCCTGATCCCCGGAAGCACCACCACCAACA CCGGCCCCTGCAAGACCTGCACCACCCCCGCCCAGGGCAACTCTATGTTCCCCAGCTGCTGCTGCACCAAGCCCAC CGACGGCAACTGCACTTGCATTCCCATCCCCAGCAGCTGGGCCTTCGCCAAATATCTGTGGGAGTGGGCCAGCGETG AGGTTTAGCTGGCTGAGCCTGCTGGTGCCCTTCGTGCAGTGGTTTGTGGGCCTGAGCCCCACCETGTGGCTEAGCG CCATCTGGATGATGTGGTACTGGGGCCCCTCCCTGTACAGCATCGTGAGCCCCTTCATCCCCCTCCTGCCCATCTT
CTTCTGCCTGTGGGTEGTACATC SEQ ID NO:11: Sequência de aminoácido de HBc
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRÇAILCWGELMTLATWVGNNL EDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRR
DRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSÇSRESÇC SEQ ID NO:12: Sequência de aminoácido de cariante alternativa de hl!
MHRRRSRSCREDOKPVMDDORDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGOATTAYFLYQOÇCOG RLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMÇOALPMGAL POGPMONATKYGNMTEDHVMHLLONADPL KVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLG PVP
SEQ ID NO:13: Sequência de nucleotídeo que codifica cariante alternativa de h!l
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCA ACAATGAGCAACTGCCCATGCTGGGCCEGCGCCC TGGEGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACAC AGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTGGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGC CGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCA AGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGEGECC CATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTG AAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACT GGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCAC TGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGC
CCAGTCCCC SEQ ID NO:14: Sequência de ácido nucleico alternativa de hli-HBc-2A- HBs
ATGCACAGGAGGAGAAGCAGGAGCTGTCGGGAAGATCAGAAGCCAGTCATGGATGACCAGCGCGACCTTATCTCCA ACAATGAGCAACTGCCCATGCTGEGCCEGCECCCTEGEGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCCGCGGAGCCCTGTACAC AGGCTTTTCCATCCTGGTGACTCTGCTCCTCGCTEGCCAGGCCACCACCGCCTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGEGC CGGCTGGACAAACTGACAGTCACCTCCCAGAACCTGCAGCTGGAGAACCTGCGCATGAAGCTTCCCAAGCCTCCCA AGCCTGTGAGCAAGATGCGCATGGCCACCCCGCTGCTGATGCAGGCGCTGCCCATGGGAGCCCTGCCCCAGGEGECC CATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTG AAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACT GGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCAC TGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGC CCAGTCCCCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACT TCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTG CTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGÇCT AATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGC AACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGT GTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT AGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTC GCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTGCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGC CGGCGACGETGGAGAGCAATCCCGECCCTATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAG GCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCC AATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAATA CGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTAC GGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTC CGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAG CTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTT
CTTTTGTCTCTGGGTATACATT SEQ ID NO:15: Sequência de aminoácido alternativa de hli-HBc-2A-
HBs
MHRRRSRSCREDQOKPVMDDORDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGÇQATTAYFLYQOQOG RLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMONATKYGNMTEDHVMHLLONADPL KVYPPLKGSFPENLRHLKNTMET IDWKVFESWMHHWL LFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLG PVPMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRÇAILCWGELMTLATWVG NNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV RRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQOSPRRRRSQSRESQCAPVKEQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMENITSGFLGPLLVLO AGFFLLTRILTIPOSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGONSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLI FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASV
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Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de repli- cação (ChAd) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um an- tígeno de superfície da hepatite B (HBs), um polinucleotídeo que codi- fica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) e um polinu- cleotídeo que codifica a cadeia invariante humana (hli) fundida ao HBc.
2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o vetor ChAd é selecionado a partir do grupo que consiste em ChAd3, ChAd63, ChAd83, ChAd155, ChAd 157, Pan 5, Pan 6, Pan 7 e Pan 9.
3. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o vetor ChAd é ChAd155 e compreende um polinucleotídeo que codifica hli, HBc, 2A e HBs.
4. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o vetor com- preende polinucleotídeos que codificam um HBc compreendendo SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homó- loga à mesma fundida a um polinucleotídeo que codifica um hli com- preendendo SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma ou SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma, e um HBs com- preendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma, em que os polinucleotídeos que codi- ficam hli-HBc e HBs são separados por um polinucleotídeo que codifi- ca uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma, que incorpora a região de clivagem 2A do pé e vírus da doença bucal.
5. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o vetor com- preende um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.15.
6. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o vetor com- preende uma sequência de polinucleotídeo dada em SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de polinucleotídeo dada em SEQ ID NO: 14.
7. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de Vírus de Vaccinia Modificado (MVA) compre- endendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um polinucleotídeo que codifica um antígeno de nú- cleo do vírus da hepatite B (HBc).
8. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 7, caracterizada pelo fato de que os polinucleotídeos que codifi- cam HBs e HBc são separados por um polinucleotídeo que codifica a região de clivagem 2A do vírus da febre aftosa (FMDV)
9. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o vetor compreende polinu- cleotídeos que codificam um HBc compreendendo SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma e um HBs compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de ami- noácidos pelo menos 98% homóloga à mesma, em que os polinucleo- tídeos que codificam HBc e HBs são separados por um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 98% homóloga à mesma, que incorpora a região de clivagem 2A do vírus da febre af- tosa.
10. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 5.
11. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que o vetor compreende uma sequência de polinucleotídeo dada em SEQ ID NO:
6.
12. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) re- combinante, um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc) re- combinante truncado no C-terminal e um adjuvante contendo MPL e QS-21.
13. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que o HBc recombinante truncado compreende os aminoácidos 1-145, 1-146, 1-147, 1-148 ou aminoáci- dos 1-149 de uma proteína antigênica do núcleo da hepatite B do tipo selvagem.
14. Composição imunogênica, de acordo com a reivindica- ção 12 ou 13, caracterizada pelo fato de compreender HBc recombi- nante e HBs recombinante na razão de 1,5: 1, 2: 1, 2,5:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 4,5: 1, 5:1, 5.5:1, 6:1 ou mais (por exemplo, 3: 1 a 5: 1, como 4:1).
15. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que com- preende HBs recombinantes (SEQ ID NO: 1), aminoácidos 1-149 de HBc (SEQ ID NO: 2) e um adjuvante compreendendo MPL, QS-21 e lipossomas composto de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol em uma solução salina tamponada com fosfato.
16. Combinação imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um poli-
nucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Va- ccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno de super- fície da hepatite B (HBs) recombinante, antígeno do núcleo do vírus da hepatite B recombinante (HBc) e um adjuvante.
17. Combinação imunogênica de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a composição do componente a) da combinação é uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e a composição do componente b) da combi- nação é uma composição como definida em qualquer uma das reivin- dicações. 7 a 11 e a composição do componente c) da combinação é uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 12a15.
18. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende os se- guintes componentes: a) uma composição compreendendo um vetor adenoviral de chimpanzé com defeito de replicação (ChAd) compreendendo um poli- nucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBc); b) uma composição compreendendo um vetor de Vírus Va- ccinia Ankara Modificado (MVA) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de superfície da hepatite B (HBs) e um ácido nucleico que codifica um antígeno do núcleo do vírus da hepatite B
(HBc); e c) uma composição compreendendo um antígeno recombi- nante de superfície da hepatite B (HBs), antígeno recombinante do nú- cleo do vírus da hepatite B (HBc) e um adjuvante,
com instruções para administração dos componentes se- quencial ou concomitantemente para o tratamento de CHB.
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