BR112020010141A2

BR112020010141A2 - método de fabricação de cápsulas formadas a partir de um envelope externo de hidrogel reticulado que circunda um núcleo central

Info

Publication number: BR112020010141A2
Application number: BR112020010141-9A
Authority: BR
Inventors: Maxime Feyeux; Kevin Alessandri; Pierre Nassoy
Original assignee: Universite de Bordeaux; Centre National De La Recherche Scientifique; Institut D'optique Théorique Et Appliquée
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2020-11-10
Also published as: CN111801156B; IL274789A; SG11202004780TA; WO2019101734A1; KR20200090200A; EP3713665B1; IL274789B; FR3073751B1; ES2895935T3; FR3073751A1; JP2021504132A; US20200360888A1; BR112020010141B1; US11511254B2; CN111801156A; RU2020120192A; EP3713665A1; KR102372693B1; JP7082358B2; DK3713665T3

Abstract

A invenção se refere a um método de fabricação de uma pluralidade de cápsulas que compreende, cada uma, um envelope externo de hidrogel reticulado que circunda um núcleo central, de acordo com o qual uma solução de hidrogel e uma composição de interesse, destinada a formar o núcleo central, são coextrudadas de maneira concêntrica para formar gotas mistas que compreendem, cada uma, uma camada de solução de hidrogel que circunda uma gota de composição líquida de interesse, caracterizada pelo fato de que a etapa de coextrusão é realizada sob um aerossol de reticulação a fim de que as gotas mistas atravessem o dito aerossol de reticulação, de modo que a camada de solução de hidrogel se reticule pelo menos parcialmente ao redor da gota de composição líquida de interesse em contato com o dito aerossol.

Description

“MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE CÁPSULAS FORMADAS A PARTIR DE UM ENVELOPE EXTERNO DE HIDROGEL RETICULADO QUE CIRCUNDA UM NÚCLEO CENTRAL”

[0001] A presente invenção refere-se a um método para a fabricação de cápsulas formadas por um envelope externo de hidrogel reticulado circundando um núcleo central que pode ser líquido. Mais precisamente, a invenção trata de um método de fabricação que permite encapsular uma composição de interesse para formar cápsulas nas quais as propriedades da dita composição de interesse são preservadas.

[0002] Os métodos de encapsulação evoluíram nos últimos anos com a finalidade de fabricar cápsulas constituídas por um envelope externo envolvendo uma composição central, mais frequentemente líquida. Essas cápsulas são utilizadas sobretudo no campo farmacêutico e cosmético. A composição central compreende então um princípio ativo protegido das agressões externas e cuja relargagem pode ser mais bem controlada.

[0003] Geralmente, as cápsulas são obtidas coextrudando concentricamente uma solução de hidrogel destinada, após a reticulação, a formar o envelope externo com uma composição de interesse a ser encapsulada. Na saída da extrusora, são obtidas gotas mistas, formadas por uma camada da solução de hidrogel que circunda uma gota da composição de interesse. Depois, as gotas mistas caem em um banho contendo agentes de reticulação, onde a reticulação da camada de hidrogel ocorre.

[0004] No entanto, observamos com frequência uma desestruturação das gotas mistas durante a sua queda da extrusora para o banho de reticulação e/ou no impacto das gotas mistas com o banho de reticulação. A camada externa de hidrogel se rompe parcialmente ou totalmente com a violência do impacto, o que gera uma mistura parcial da gota da composição de interesse com a camada líquida de hidrogel antes da reticulação, até mesmo a expulsão da gota da composição de interesse para o exterior da gota mista no curso da reticulação do hidrogel. Além disso, as cápsulas recuperadas não são de forma regular, nem possuem dimensões e/ou topologia controladas.

[0005] Em consequência, é frequente que seja necessário adicionar um tensoativo na solução de hidrogel para evitar que as gotas mistas não se fragmentem quando do seu impacto com o banho de reticulação. Os tensoativos podem entrar em contato com o conteúdo da cápsula e alterar suas propriedades. Assim, quando as cápsulas encerram princípios ativos ou células, isso pode gerar consequências negativas relevantes, especialmente diminuir a eficácia do princípio ativo ou provocar a morte celular. Do mesmo modo, quando as cápsulas abrigam uma composição agroalimentar, as propriedades organolépticas da dita composição podem ser modificadas pela interação com o tensoativo.

[0006] Além disso, a concentração dos agentes de reticulação é necessariamente elevada para solidificar a estrutura da gota no impacto. Em consequência, os agentes de reticulação atravessam a camada da solução de hidrogel no curso da reticulação e penetram no interior da cápsula. Assim como ocorre com a interação com os tensoativos, o contato do agente de reticulação com o interior da cápsula pode alterar as propriedades do seu conteúdo.

[0007] Esses agentes de reticulação e tensoativos podem,

ademais, ser irritantes para o corpo humano. Portanto, às vezes é necessário, sobretudo em função da destinação das cápsulas, realizar etapas de enxágue profundo a fim de eliminar qualquer traço do agente de reticulação e/ou do tensoativo na superfície e/ou no interior das cápsulas. Essas etapas de enxágue diminuem significativamente o rendimento e elevam o custo de produção das cápsulas.

[0008] Existe, portanto, a necessidade de um método de fabricação das cápsulas de hidrogel que abriguem uma composição de interesse, em particular uma composição líquida, que permita obter cápsulas de forma e de estrutura controladas, sem custo excessivo, em alta vazão. Resumo da invenção

[0009] Enquanto trabalhavam com essas questões, os inventores descobriram que é possível reticular pelo menos parcialmente a camada de hidrogel ao redor da gota da composição de interesse antes que as cápsulas colidam com o banho de recuperação no qual elas são recebidas. Essa pré- reticulação do hidrogel ao redor da gota da composição de interesse previne os riscos de desestruturação das cápsulas. Adicionalmente, os riscos de contato do conteúdo da cápsula com um agente de reticulação e/ou um eventual tensoativo são igualmente reduzidos. Para permitir a reticulação precoce, os inventores desenvolveram um método no qual as gotas mistas, obtidas classicamente pela coextrusão de uma solução de hidrogel e da composição de interesse, atravessam um aerossol formado por micropartículas (líquidas ou sólidas) contendo um agente de reticulação. As micropartículas então coalescem na superfície das gotas mistas no curso da sua queda através do dito aerossol, e permitem a reticulação pelo menos parcial do hidrogel. Vantajosamente, a camada mais externa do hidrogel é reticulada, formando uma casca rígida ou semirrígida ao redor da gota da composição de interesse. Uma pulverização ou nebulização por jatos favoreceria, ao inverso, a penetração das micropartículas do agente de reticulação no interior das gotas mistas, provocando assim uma mistura da camada externa de hidrogel com a gota da composição de interesse formando o centro da gota mista, favorecendo uma alteração na estruturação da gota mista. Inversamente a uma pulverização por jatos, o uso de uma névoa ou aerossol, no qual as micropartículas estão em suspensão no ar, favorece a deposição de uma fina camada do agente de reticulação ao redor das gotas mistas, provocando uma reticulação pelo menos parcial da superfície da camada de hidrogel. Esse método permite vantajosamente dispensar o uso de tensoativo, o que pode ser particularmente interessante para produzir cápsulas que contenham células. Se necessário, se a reticulação não for suficiente, esta pode ser conseguida com um banho de reticulação. De acordo com a invenção, a camada pré-reticulada de hidrogel protege as cápsulas no momento do impacto com o líquido no qual elas são recebidas após a queda. Além disso, no caso da imersão dessas cápsulas em um banho de reticulação, a presença da camada pré- reticulada, ainda que muito fina, é suficiente para proteger a estrutura da cápsula e prevenir a sua deformação. Os tempos de imersão nos eventuais banhos de reticulação também podem ser reduzidos, assim como as posteriores etapas de enxágue.

[0010] Portanto, a invenção tem por objeto um método para a fabricação de uma pluralidade de cápsulas compreendendo, cada uma, um envelope externo de hidrogel reticulado que circunda um núcleo central, de acordo com o qual uma solução de hidrogel e uma composição de interesse aquosa, destinada a formar o núcleo central, são coextrudadas de maneira concêntrica para formar gotas mistas compreendendo, cada uma, uma camada de solução de hidrogel que circunda uma gota da composição de interesse, caracterizado pelo fato de que que a etapa de coextrusão é realizada acima de um aerossol de reticulação a fim de que as gotas mistas atravessem o dito aerossol de reticulação, de modo que a camada de solução de hidrogel se reticule pelo menos parcialmente ao redor da gota da composição de interesse em contato com o dito aerossol.

[0011] A invenção também tem por objeto cápsulas, que podem ser obtidas pelo dito método, sendo que a superfície externa da camada de hidrogel tem a característica de entrar em contato com o aerossol de reticulação sob a forma de irregularidades superficiais causadas pelos impactos. Essas cápsulas se caracterizam, portanto, por uma camada externa de hidrogel reticulado que circunda um núcleo central constituído por uma gota da composição de interesse, nas quais a superfície externa da camada de hidrogel é alveolada, quer dizer, coberta por alvéolos.

[0012] A invenção também tem por objeto as cápsulas conforme descritas acima, nas quais o núcleo central compreende células com uma sobremortalidade causada pela encapsulação que é inferior a 20%, de preferência, inferior a 10%. Descrição detalhada

[0013] O método de acordo com a invenção se caracteriza por uma etapa de reticulação pelo menos parcial de uma camada de hidrogel ao redor de um núcleo central por meio de um aerossol de reticulação, cujas micropartículas coalescem na superfície da camada de hidrogel.

[0014] Mais precisamente, as gotas mistas formadas na saída da extrusora são projetadas pelo fluxo de extrusão em direção a uma superfície de recebimento e atravessam o aerossol disposto entre a saída da extrusora e a superfície de recebimento.

[0015] A superfície de recebimento significa o elemento sobre ou no qual as cápsulas caem depois de terem atravessado o aerossol de reticulação. Em uma modalidade de realização, a superfície de recebimento consiste em um banho de recuperação, eventualmente contendo uma solução de reticulação.

[0016] De acordo com a invenção, qualquer método de extrusão que permita coextrudar de maneira concêntrica uma solução de hidrogel e uma composição de interesse pode ser utilizado. Em particular, é possível produzir as gotas mistas adaptando o método e o dispositivo microfluido descritos em Alessandri et al., (PNAS, 10 de setembro de 2013 vol. 110 nº 37 14843-14848; Lab on a Chip, 2016, vol. 16, nº 9, p. 1593- 1604) ou em Onoe e al., (Nat Material 2013, 12(6):584-90), de maneira que todas as soluções sejam coextrudadas acima de um aerossol de reticulação. Por exemplo, o método de acordo com a invenção é implementado por meio de um dispositivo de extrusão com dois ou três envelopes concêntricos, tal como descrito na patente FR2986165.

[0017] De acordo com a invenção, entende-se por “gotas mistas”, as gotas obtidas na saída de uma extrusora por meio da qual uma solução de hidrogel periférica e uma composição de interesse central foram coextrudadas de maneira concêntrica. As gotas mistas são então formadas por uma camada da solução de hidrogel não reticulado que circunda uma gota da composição de interesse. Por “gota da composição de interesse”, entende-se um pequeno volume da composição de interesse, que pode ser um líquido, uma solução, um coloide ou uma suspensão, especialmente em forma de gel, de creme, etc. De uma maneira geral, a composição de interesse é vantajosamente aquosa. Pode ser ainda uma composição aquosa em forma de líquido, de gel, de creme, etc. No caso de uma composição de interesse em forma de gel, o dito gel é vantajosamente diferente do hidrogel utilizado para formar a camada externa das gotas mistas. De preferência, a composição de interesse não contém alginato, e de maneira mais geral, não contém compostos reticuláveis.

[0018] Ao inverno, entende-se por “cápsulas” os produtos derivados das gotas mistas, após a reticulação pelo menos parcial da camada de hidrogel. As cápsulas são então formadas por um envelope externo de hidrogel pelo menos parcialmente enrijecido por reticulação ao redor da gota da composição de interesse.

[0019] As gotas mistas, assim como as cápsulas, apresentam vantajosamente uma forma esférica.

[0020] No contexto da invenção, a expressão “o envelope externo de hidrogel reticulado” designa uma estrutura tridimensional formada a partir de uma matriz de cadeias de polímeros intumescida por um líquido e, de preferência, por água. O envelope externo de hidrogel reticulado é obtido por reticulação de uma solução de hidrogel. Vantajosamente, o ou os polímeros da solução de hidrogel são polímeros reticuláveis quando submetidos a um estímulo, tais como temperatura, pH, íons, etc. Vantajosamente, a solução de hidrogel utilizada é biocompatível por não ser tóxica às células. No caso em que a composição de interesse a ser encapsulada contém células, a camada de hidrogel permite vantajosamente a difusão de oxigênio e de nutrientes, bem como de dióxido de carbono e de resíduos metabólicos para alimentar as células e possibilitar a sua sobrevivência. Os polímeros da solução de hidrogel podem ser de origem natural ou sintética. Por exemplo, a solução de hidrogel contém um ou mais polímeros entre polímeros à base de sulfonato, como o poliestireno sulfonato de sódio, polímeros à base de acrilato, como o poliacrilato de sódio, o diacrilato de polietileno glicol, o composto metacrilato de gelatina, os polissacarídeos, e especialmente os polissacarídeos de origem bacteriana, como a goma gelana, ou de origem vegetal, como a pectina ou o alginato.

[0021] Em uma modalidade de realização, a solução de hidrogel contém pelo menos alginato. De preferência, a solução de hidrogel contém alginato exclusivamente. No contexto da invenção, entende-se por “alginato” os polissacarídeos lineares formados a partir de β-D- manuronato (M) e α-L-guluronato (G), os sais e derivados dessas substâncias. Vantajosamente, o alginato é um alginato de sódio formado por mais de 80% de G e menos de 20% de M, com uma massa molecular média de 100 a 400 kDa (por exemplo: PRONOVA® SLG100) e uma concentração total compreendida entre 0,5% e 5% em massa volumétrica (peso/volume).

[0022] De acordo com a invenção, o aerossol de reticulação compreende pelo menos um agente de reticulação adaptado para reticular um hidrogel contendo pelo menos um polímero hidrófilo, como o alginato, quando ele é colocado em contato com este. De preferência, o aerossol de reticulação é livre de tensoativos.

[0023] Em uma modalidade de realização, o aerossol de reticulação é formado por microgotas de uma solução de reticulação. Esse aerossol pode ser obtido por qualquer meio empregado classicamente para formar um aerossol a partir de uma solução líquida, e especialmente um nebulizador de membrana. Em outra modalidade de realização, o aerossol de reticulação é constituído por micropartículas sólidas do agente de reticulação, por exemplo, sob a forma de pós micronizados de carbonato e/ou de cloreto de cálcio.

[0024] A solução de reticulação compreende vantajosamente pelo menos um cátion divalente. A solução de reticulação também pode ser uma solução contendo outro agente de reticulação conhecido do alginato ou do polímero hidrófilo a ser reticulado, ou um solvente, por exemplo, a água ou um álcool, adaptado para permitir uma reticulação por irradiação ou por qualquer outro procedimento conhecido na técnica. Vantajosamente, a solução de reticulação é uma solução contendo pelo menos um cátion divalente. De preferência, o cátion divalente é um cátion que permita a reticulação do alginato em solução. Pode ser, por exemplo, um cátion divalente escolhido entre o grupo contendo Ca2+, Mg2+, Ba2+ e Sr2+, ou uma mistura de pelo menos dois desses cátions divalentes. O cátion divalente, por exemplo, o Ca2+, pode estar associado a um contraíon para formar, por exemplo, soluções do tipo CaCl2 ou CaCO3, bastante familiares ao indivíduo versado na técnica. A solução de reticulação também pode ser uma solução que contenha CaCO3 acoplado à Glucono delta-lactona (GDL), formando uma solução de CaCO3-GDL. A solução de reticulação também pode ser uma mistura de CaCO3- CaSO4-GDL. Em uma modalidade de execução particular do método de acordo com a invenção, o aerossol de reticulação é constituído por microgotas de uma solução de reticulação contendo cálcio, especialmente na forma Ca2+. O profissional da área é capaz de ajustar a natureza do cátion divalente e/ou do contraíon, assim como a sua concentração em relação aos demais parâmetros do método da presente invenção, em particular à natureza do polímero utilizado e à velocidade e/ou ao grau de reticulação desejado. Por exemplo, a concentração do cátion divalente na solução de reticulação está compreendida entre 10 e 1000 mM. A solução de reticulação pode englobar outros constituintes, perfeitamente conhecidos pelo indivíduo versado na técnica, em acréscimo aos descritos acima no intuito de aperfeiçoar a reticulação da bainha de hidrogel nas condições, especialmente de tempo e/ou temperatura, particulares.

[0025] Vantajosamente, o aerossol de reticulação é formado por microgotas da solução de reticulação, cujo diâmetro está compreendido vantajosamente entre 0,5 e 20 μm; preferencialmente entre 1 e 10 μm; mais preferencialmente igual a 5 μm, +/- 2μm.

[0026] Em uma modalidade de realização, as microgotas da solução de reticulação ou as micropartículas sólidas formando o aerossol têm uma velocidade de queda inferior à velocidade em que as gotas mistas são projetadas pelo fluxo de extrusão através do aerossol de reticulação.

[0027] De preferência, as microgotas da solução de reticulação ou as micropartículas sólidas formando o aerossol estão em suspensão estática no ar. Em uma modalidade de realização, as gotas mistas caem por gravidade através do aerossol de reticulação e a velocidade de queda das gotas mistas através do aerossol de reticulação é superior à velocidade de queda das microgotas ou das micropartículas sólidas de reticulação.

[0028] Em uma modalidade de realização, o aerossol de microgotas de solução de reticulação tem uma densidade de 3*103 microgotas por cm3.

[0029] Vantajosamente, o volume do aerossol de microgotas da solução de reticulação é mantido em uma câmara, com dimensões adaptadas para manter a densidade do aerossol e/ou a concentração desejadas. Esse confinamento permite ainda manter o dito aerossol estéril.

[0030] As microgotas da solução de reticulação coalescem, de preferência uniformemente, na superfície das gotas mistas, de maneira a favorecer a reticulação pelo menos parcial da camada de hidrogel em toda a superfície das ditas gotas mistas. Por exemplo, cada gota mista com um diâmetro compreendido entre 50 e 500 μm é circundada por pelo menos 100 microgotas da solução de reticulação antes de atingir a superfície que irá receber as gotas mistas pelo menos parcialmente reticuladas em cápsulas. O profissional qualificado é capaz de adaptar a altura da queda, a densidade das microgotas no aerossol e/ou a vazão do aerossol, de maneira a obter uma camada de microgotas ao redor de cada gota mista em função da sua superfície. A altura da queda significa a distância percorrida pelas gotas mistas através do aerossol entre a saída da extrusora e a superfície em que serão recebidas as ditas gotas mistas pelo menos parcialmente reticuladas em cápsulas.

[0031] Em um exemplo de realização particular, é utilizado um aerossol de microgotas da solução de reticulação com uma densidade de 3*103 microgotas por cm3, o dito aerossol sendo pulverizado com uma vazão de 20L/hora, no interior de uma câmara fechada com cerca de 20 cm de diâmetro que permite manter uma densidade do aerossol suficiente isolando o ar ambiente, definindo em 60 cm a altura de queda das gotas mistas no aerossol.

[0032] Em uma modalidade de realização particular, as microgotas da solução de reticulação são carregadas, de maneira que elas podem voltar a se empurrarem mutuamente, o que favorece a eletrodispersão das microgotas no aerossol. Para isso, podemos, por exemplo, aplicar uma corrente contínua à solução de reticulação antes da pulverização ou nebulização em aerossol.

[0033] Em alternativa ou como complemento, as gotas mistas, e mais particularmente a camada de solução de hidrogel, são carregadas. Assim, as gotas mistas se dispersam em um raio de seção maior atravessando o aerossol de reticulação. Isso permite reduzir a altura da queda requerida, aumentando o volume do aerossol útil à reticulação. Efetivamente, uma gota mista percorrendo a mesma trajetória que a anterior encontra menos microgotas de reticulação. Ademais, isso também reduz os riscos de aglomeração/fusão das gotas mistas durante o voo e no impacto.

[0034] No caso em que as microgotas da solução de reticulação e as gotas mistas são carregadas, as cargas são vantajosamente opostas, favorecendo a deposição das microgotas ao redor da superfície das gotas mistas.

[0035] Em uma modalidade de realização, o aerossol de reticulação tem uma osmolaridade, ou concentração osmótica, de 0,1 a 10 vezes superior à osmolaridade da composição de interesse formando o núcleo central das cápsulas. De preferência, o aerossol de reticulação tem uma osmolaridade, ou concentração osmótica, de 0,3 a 3 vezes superior à osmolaridade da composição de interesse formando o núcleo central das cápsulas. Em outra modalidade de realização, o aerossol de reticulação e a composição de interesse formando o núcleo central das cápsulas são iso-osmóticos, quer dizer, possuem concentrações osmóticas substancialmente iguais. Por exemplo, no caso em que a composição de interesse é uma composição de células, o aerossol de reticulação é formado a partir de uma solução de cálcio a 100 mM. De uma maneira geral, devemos evitar que o aerossol de reticulação seja hiper-osmótico para evitar a deformação da gota mista gerada pela pressão osmótica e preservar a estrutura das cápsulas.

[0036] De acordo com a invenção, é possível receber as cápsulas pré-enrijecidas após a passagem pelo aerossol de reticulação em um banho de recuperação. Nesse caso, o banho de recuperação é, de preferência, iso-osmótico com a composição de interesse formando o núcleo central das cápsulas.

[0037] Em uma modalidade de realização, o banho de recuperação pode conter uma solução de reticulação para obter, se necessário, a reticulação do hidrogel. A solução de reticulação, conforme o caso, pode conter um agente tensoativo. Do contrário, especialmente no caso em que a reticulação do hidrogel quando da queda através do aerossol de reticulação é suficiente, o banho de reticulação pode conter uma solução fisiológica simples.

[0038] Vantajosamente, as gotas mistas são desprovidas de agente tensoativo. Em particular, a composição de hidrogel é vantajosamente desprovida de tensoativo. Do mesmo modo, as cápsulas de acordo com a invenção são vantajosamente desprovidas de tensoativos, tanto na camada de hidrogel reticulado quanto no núcleo central.

[0039] Vantajosamente, as soluções de hidrogel e a composição de interesse são coextrudadas para formar gotas mistas, e em seguida cápsulas esféricas com um diâmetro compreendido entre 50 e 500 µm. Em uma modalidade de realização particular, a espessura do envelope externo de hidrogel representa 5 a 40% do raio das cápsulas. No contexto da invenção, “a espessura” é a dimensão que se estende radialmente em relação ao centro da cápsula. O indivíduo versado na técnica sabe adaptar os parâmetros de coextrusão para que essas dimensões sejam obtidas.

[0040] De acordo com a invenção, a composição de interesse significa qualquer composição própria para ser coextrudada junto com uma solução de hidrogel para formar cápsulas envolvendo uma gota da dita composição de interesse. Vantajosamente, a composição de interesse é uma composição líquida, aquosa ou gelificada. Em uma modalidade de realização, a composição aquosa é uma composição aquosa gelificada. Em especial, é possível utilizar uma composição contendo células, uma composição alimentar, uma composição cosmética ou uma composição farmacêutica. Por exemplo, a composição de interesse é um gel de proteínas e/ou um gel de células.

[0041] De acordo com a invenção, qualquer tipo de composição celular pode ser utilizado. Em particular, é possível produzir cápsulas de hidrogel circundando células- tronco pluripotentes humanas. Uma célula-tronco pluripotente, ou célula pluripotente, significa uma célula que é capaz de formar todos os tecidos presentes no organismo de origem completo, mas que não é capaz de formar um organismo completo como tal. Especialmente, as cápsulas de acordo com a invenção podem conter células-tronco pluripotentes induzidas (IPS), por exemplo, a partir de células somáticas. De uma maneira mais geral, no contexto da invenção, as composições de células não contêm células derivadas de um embrião humano.

[0042] Em uma modalidade de realização particular, a solução de hidrogel é uma solução de alginato (por exemplo, o SLG100), a composição de interesse destinada a formar o núcleo central contém células (por exemplo, células IPS ressuspendidas em Matrigel®), e o aerossol de reticulação contém microgotas de uma solução aquosa de cloreto de cálcio.

EXEMPLO Exemplo 1: Protocolo de obtenção de cápsulas de hidrogel envolvendo uma composição de células humanas pluripotentes induzidas. Soluções utilizadas:

[0043] Solução 1, base de meio DMEMF12 suplementada com Thiazovivin 2μM

[0044] Solução 2, PBS sem magnésio e sem cálcio suplementado com Thiazovivin 1μM

[0045] Solução 3, tampão de separação celular não enzimático: RelesR™ suplementado com Thiazovivin 2μM.

[0046] Solução 4, meio de cultura de células-tronco pluripotentes: meio celular hES/hIPS MTeSRl™ STEMCELL™).

[0047] Solução 4+, Solução 4 suplementada com Thiazovivin 2μM.

[0048] Solução 5, Matrigel™.

[0049] Solução 6, sorbitol 300mM com Thiazovivin 2μM. Solução celular:

[0050] Uma placa de Pétri com células IPS humanas de 25cm2 a 90% de confluência é utilizada em seguida para corresponder aos volumes recomendados. Todas as etapas seguintes são efetuadas a 4°C até a saída da extrusora.

[0051] Etapa 1: Enxaguar as células com a solução 1. Aguardar de 10 minutos a 1 hora.

[0052] Etapa 2: Enxaguar duas vezes com 4 mL da solução

2.

[0053] Etapa 3: Aspirar delicadamente a solução.

[0054] Etapa 4: Incubar as células com 4 mL da solução 3 por 5-10 minutos.

[0055] Etapa 5: Separar as células com 2mL da solução 4+ com uma pipeta de cone grande para reduzir o estresse de cisalhamento.

[0056] Etapa 6: Centrifugar a suspensão de células a 360 g durante 5 minutos.

[0057] Etapa 7: Aspirar o sobrenadante.

[0058] Etapa 8: Ressuspender com 0,5 mL da solução 4+.

[0059] Etapa 9: Centrifugar novamente a 360rcf e aspirar o sobrenadante.

[0060] Etapa 10: Ressuspender o pélete de células em 70μL da solução 5 e 100μL da solução 6 (o volume do pélete deve ser de 30μL). A solução celular está pronta. Encapsulação:

[0061] O dispositivo de encapsulação (extrusora) é preparado conforme descrito por Alessandri et al., 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)”, Lab on a Chip, 2016, vol. 16, nº 9, p. 1593-1604), com duas modificações: a ausência de tensoativo na solução de alginato e a presença de uma câmara fechada com 50cm de altura ao redor do banho de formação a fim de conter um aerossol proveniente da nebulização da mesma solução que a do banho de reticulação (CaCl2 300mosmol).

[0062] Em suma, as diferentes partes do dispositivo são esterilizadas (em autoclave); as três soluções necessárias são carregadas em três bombas de seringa, i) solução de alginato (PRONOVA®SLG100 a 2% em massa em água destilada), ii) solução intermediária (sorbitol a 300mM), iii) solução celular (preparada na etapa anterior); As três soluções são coinjetadas de maneira concêntrica graças a um injetor microfluido que permite formar um jato que se fraciona em gotas e cuja camada externa é a solução de alginato e o centro é a solução de células;

[0063] Para eletro-dispersar as gotas, o alginato foi carregado com uma corrente contínua a +2KV. Um anel com uma massa de 2cm de diâmetro é disposto a 2mm da ponta no plano perpendicular ao eixo do jato que sai do injetor microfluido para gerar o campo elétrico.

[0064] Após o fracionamento do jato e a eletro-dispersão das gotas, as gotas atravessam o aerossol da solução de reticulação contida na câmara (da ordem de 3*10E9 gotículas por metro cúbico de gás aproximadamente, cada uma das gotículas tem um diâmetro de 1 a 10 µm e contém uma solução aquosa de cálcio a 100 mM). A coalescência de gotículas da solução de reticulação na superfície das gotas mistas enrijece a superfície das mesmas e permite a elas penetrar no banho de cálcio (banho de recuperação/reticulação) conservando a sua estrutura interna. Essas gotas são coletadas em um banho de cálcio (a 100mM) que finaliza a reticulação da solução de alginato para formar a casca.

[0065] Notamos que nessas condições de encapsulação, a reticulação da camada de alginato ocorre espontaneamente. Tratamento pós-encapsulação:

[0066] Etapa 1: As cápsulas são recuperadas com uma peneira celular 40 µm e depois, após o enxágue com a solução 1, elas são armazenadas em um frasco de 75cm2 com 20mL da solução 4+.

[0067] Etapa 2: O frasco é mantido por 12 horas em incubadora a 37°C e 5% de CO2.

[0068] Etapa 3: Trocar o meio para a solução 4 para permitir a formação de cistos.

[0069] Etapa 4: Depois de 24 a 72 horas, formam-se cistos de algumas dezenas de células nas cápsulas. Os microcompartimentos celulares estão maduros após 5 a 10 dias.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de fabricação de uma pluralidade de cápsulas que compreende, cada uma, um envelope externo de hidrogel reticulado que circunda um núcleo central, de acordo com o qual uma solução de hidrogel e uma composição de interesse aquosa, destinada a formar o núcleo central, são coextrudadas de maneira concêntrica para formar gotas mistas que compreendem, cada uma, uma camada de solução de hidrogel que circunda uma gota de composição de interesse, caracterizada pelo fato de que a etapa de coextrusão é realizada sob um aerossol de reticulação a fim de que as gotas mistas atravessem o dito aerossol de reticulação, de modo que a camada de solução de hidrogel se reticule pelo menos parcialmente ao redor da gota de composição de interesse no contato com o dito aerossol, sendo as ditas cápsulas esféricas e tendo um diâmetro compreendido entre 50 e 500 µm.

2. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com a reivindicação 1, no qual o aerossol de reticulação é formado de microgotas de solução de reticulação, em que um diâmetro é vantajosamente compreendido entre 0,5 e 20 µm, de preferência entre 1 e 10 µm, de preferência igual a 5 µm, +/- 2 µm.

3. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com a reivindicação 2, no qual as microgotas de solução de reticulação que formam o aerossol têm uma velocidade de queda inferior à velocidade na qual as gotas mistas são projetadas pelo fluxo de extrusão através do aerossol de reticulação.

4. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual as cápsulas são mergulhadas em um banho de recuperação após ter atravessado o aerossol de reticulação, em que o dito banho de recuperação compreende vantajosamente uma solução de reticulação.

5. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de acordo com o qual a gota mista é desprovida de agente tensoativo.

6. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de acordo com o qual a concentração osmótica do aerossol de reticulação é compreendido entre 0,1 e 10 vez a concentração osmótica da composição de interesse que forma o núcleo central das cápsulas, de preferência 0,3 a 3 vezes a concentração osmótica da composição de interesse que forma o núcleo central das cápsulas, ou de acordo com o qual o aerossol de reticulação e a composição de interesse que formam o núcleo central des cápsulas são iso-osmóticos.

7. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de acordo com o qual as gotas mistas são carregadas de maneira a se dispersar e o aerossol de reticulação é de carga oposta ou neutra.

8. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de acordo com o qual a composição de interesse destinada a formar o núcleo central é escolhida entre uma solução de células, uma composição alimentar, uma composição cosmética ou uma composição farmacêutica.

9. Método de fabricação de cápsulas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, de acordo com a qual a solução de hidrogel é uma solução de alginato, a composição de interesse destinada a formar o núcleo central compreende células e o aerossol de reticulação compreende microgotas de uma solução de cloreto de cálcio.