BR112019010512A2 - microcompartimento celular e processos de preparação - Google Patents

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Abstract

a invenção se refere a um microcompartimento celular que compreende sucessivamente, organizadas em torno de um lúmen, pelo menos uma camada de células pluripotentes, uma camada de matriz extracelular e uma camada externa em hidrogel. a invenção se refere igualmente aos processos de preparação de tais microcompartimentos celulares.

Description

MICROCOMPARTIMENTO CELULAR E
PROCESSOS DE PREPARAÇÃO [0001] A invenção refere-se a um microcompartimento celular que permite conservar o caráter pluripotente de células humanas. A invenção se refere igualmente a um processo de preparação que permite obter tais compartimentos de cultura celular em três dimensões (3D).
[0002] As células pluripotentes são consideradas como um recurso celular humano importante, e a sua cultura representa um interesse crescente, sobretudo no dominio médico e farmacêutico. Assim, a obtenção de células pluripotentes em grandes quantidades permitiría satisfazer às novas necessidades formuladas pela indústria farmacêutica que tende a reduzir a utilização de modelos animais e a utilizar modelos celulares mais pertinentes que as inúmeras linhagens celulares utilizadas atualmente. Os testes de alto fluxo desenvolvidos pelos grupos farmacêuticos já utilizam grandes quantidades de células pluripotentes humanas. Do mesmo modo, a engenharia dos tecidos e a terapia celular no ser humano são condicionadas pela disponibilidade de quantidades industriais de células pluripotentes humanas.
[0003] Atualmente, a cultura de células pluripotentes humanas é feita principalmente em um ambiente de duas dimensões (2D), tal como sobre as placas de Petri, muito diferente do meio em 3D no qual as células evoluem normalmente. A manipulação dessas células cultivadas em 2D é frequentemente delicada, e necessita sobretudo das etapas de purificação, destacamento enzimático, etc. Além disso, essas células são difíceis de conservar e apresentam uma
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2/24 taxa de sobrevivência muito baixa ao congelamento. Contudo, a possibilidade de enviar por transportador clássico as culturas de células pluripotentes congeladas em quantidades massivas, e compatíveis com a cultura liquida, representa um grande desafio tanto para os laboratórios de pesquisa quanto para as indústrias farmacêuticas.
[0004] Face a esse estado de fato, foram desenvolvidos sistemas de cultura em três dimensões, que buscam sobretudo aumentar o fluxo, a eficácia e a qualidade dos sistemas de cultura de células estaminais pluripotentes humanas.
[0005] No entanto, os sistemas de cultura em 3D existentes não são completamente satisfatórios. Observa-se frequentemente fenômenos de fusão não controlados que dão origem a agregados celulares cujo tamanho (>200 pm de diâmetro) torna a difusão do meio de cultura insuficiente. Assim, dentro de tais sistemas de cultura em 3D, a diferenciação celular é dificilmente dominada e/ou a taxa de morte celular é muito significativa. De maneira geral, a falta de homogeneidade dos produtos provenientes da cultura de células 3D, assim como o custo de tais técnicas, tornam essa tecnologia não competitiva comparativamente à cultura 2D que ainda assim não é satisfatória.
[0006] Existe, portanto, uma necessidade de sistema de cultura celular em 3D que permita fornecer grandes quantidades de células pluripotentes cujo fenótipo é dominado, e que possam ser utilizadas facilmente tanto para a pesquisa fundamental quanto no nivel industrial.
Sumário da invenção [0007] Ao trabalhar no desenvolvimento de microcompartimentos celulares para a cultura de células em
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3D, os inventores desenvolveram um sistema que permite uma cultura de massa em suspensão liquida de células pluripotentes humanas ao mesmo tempo que conserva o seu fenótipo. Os microcompartimentos desenvolvidos permitem cultivar as células em meio liquido, utilizando-se os meios classicamente utilizados em cultura 2D, ao mesmo tempo que protegem as células e controlam o seu fenótipo para evitar as diferenciações selvagens e manter a pluripotência. Mais precisamente, os microcompartimentos, ou cápsulas, desenvolvidos pelos inventores compreendem sucessivamente, organizadas de maneira substancialmente homocêntrica, uma casca em hidrogel, uma camada de matriz extracelular e uma ou várias camadas de células pluripotentes humanas que circundam um lúmen central. A casca em hidrogel das cápsulas de acordo com a invenção, contrariamente aos sistemas de cultura existentes, protege as células dos esforços mecânicos ligados às colisões ou fusões quando da cultura em suspensão liquida. De maneira particularmente vantajosa, a organização em cistos dos microcompartimentos de acordo com a invenção permite o seu congelamento com uma taxa de sobrevivência celular significativa. As células podem adicionalmente ser diferenciadas antes da utilização, diretamente dentro do microcompartimento, ou ser utilizadas no estágio pluripotente, em cultura 3D como em cultura 2D. Os inventores igualmente desenvolveram métodos de preparação de tais microcompartimentos celulares, garantindo a obtenção e a manutenção da forma de cisto, propicia tanto ao congelamento quanto ao controle do fenótipo das células que os mesmos contêm.
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[0008] A invenção tem como objeto, portanto, um
microcompartimento celular que compreende sucessivamente, organizadas em torno de um lúmen:
- pelo menos uma camada de células pluripotentes humanas;
- uma camada de matriz extracelular;
- uma camada externa em hidrogel.
[0009] Vantajosamente, o meio de cultura enche os espaços deixados entre as camadas.
[0010] A invenção tem igualmente como objeto um processo de preparação de um microcompartimento celular de acordo com a invenção, que compreende as etapas que consistem em (a) incubar células estaminais pluripotentes humanas em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
(b) misturar as células estaminais pluripotentes
provenientes da etapa (a) com uma matriz extracelular;
(c) encapsular a mistura da etapa (b) em uma camada de
hidrogel;
(d) cultivar as cápsulas obtidas na etapa (c) em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
(e) enxaguar as cápsulas provenientes da etapa (d), de
maneira a eliminar o inibidor das vias RHO/ROCK;
(f) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (e) durante 3 a 20 dias, preferencialmente 5 a 10 dias, em um meio de cultura desprovido de inibidor das vias RHO/ROCK, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
[0011] A invenção tem também como objeto um processo de preparação de um microcompartimento celular de acordo com a invenção, gue compreende as etapas que consistem em
(a) misturar células diferenciadas humanas com uma matriz
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5/24 extracelular e agentes de reprogramação celular;
(b) encapsular a mistura da etapa (a) em uma camada de hidrogel;
(c) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (b) durante 10 a 40 dias, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
Breve descrição das figuras [0012] Figura 1: Foto (A) e representação esquemática (B) de um microcompartimento celular que forma um cisto de acordo com a invenção (1: camada de hidrogel; 2: camada de matriz extracelular; 3: camadas de células pluripotentes; 4 : lúmen) .
Descrição detalhada [0013] A invenção tem como objeto um microcompartimento celular, em 3D, que compreende células pluripotentes humanas, no qual o caráter pluripotente das células é conservado.
Microcompartimento celular
[0014] 0 microcompartimento celular de acordo com a
invenção forma um cisto, cu j o centro oco, ou lúmen, é
preferencialmente aquoso. No contexto da invenção, um
cisto se entende de uma estrutura oca fechada, contendo camadas substancialmente homocêntricas, no sentido de que são organizadas sucessivamente em torno de um mesmo ponto, em que a camada externa envolve a camada de matriz que envolve a camada de células, que circunda o lúmen. De uma maneira geral, as células pluripotentes que constituem o cisto são polarizadas. A polaridade dessas células no interior do cisto pode ser evidenciada pelas proteínas TJP1 ou ZO-1, todas as duas localizadas sobre a face
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6/24 interna/apical da camada de células pluripotentes, que é contígua ao lúmen.
[0015] 0 lúmen é gerado, no momento da formação do cisto, pelas células que se multiplicam e se desenvolvem sobre a camada de matriz extracelular. Vantajosamente, o lúmen contém um líquido, e mais particularmente, o meio de cultura.
[0016] No contexto da invenção, a camada em hidrogel designa uma estrutura tridimensional formada a partir de uma matriz de cadeias de polímeros inchada por um líquido, e preferencialmente a água. Vantajosamente, o hidrogel utilizado é biocompatível, no sentido de que não é tóxico para as células. Além disso, a camada em hidrogel deve permitir a difusão de oxigênio e de nutrientes para alimentar as células contidas no microcompartimento e permitir a sua sobrevivência. Por exemplo, a camada externa em hidrogel contém o alginato. Preferencialmente, a camada externa só compreende o alginato. No contexto da invenção, entende-se por alginato os polissacarídeos lineares formados a partir de β-D-manuronato (M) e a-L-guluronato (G) , sais e derivados dos mesmos. Vantajosamente, o alginato é um alginato de sódio, composto de mais de 80% de G e menos de 20% de M, com uma massa molecular média de 100 a 400 KDa (por exemplo: PRONOVA® SLG100) e uma a concentração total compreendida entre 0,5% e 5% em massa. De acordo com a invenção, a camada em hidrogel é desprovida de células. Em uma modalidade do microcompartimento celular de acordo com a invenção, a camada externa compreende o alginato.
[0017] A camada de matriz extracelular pode, quanto a
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7/24 si, incluir algumas células. De fato, no momento da formação do cisto, as células cavam o seu espaço na matriz e se multiplicam, preenchendo o microcompartimento. A delimitação entre a camada de matriz extracelular e a camada de células pluripotentes pode, portanto, não ser perfeitamente nitida. No nivel da superfície em contato com a camada de células, a matriz extracelular pode assim conter algumas células pluripotentes. Em contrapartida, a superfície da camada de matriz extracelular em contato com a camada de hidrogel é isenta de células.
[0018] A camada de matriz extracelular é necessária à sobrevivência das células pluripotentes no microcompartimento e à criação do cisto.
[0019] Preferencialmente, a camada de matriz extracelular forma um gel sobre a face interna da camada em hidrogel, isto é, a face dirigida para o lúmen do microcompartimento. A camada de matriz extracelular compreende uma mistura de proteínas e de compostos extracelulares necessários à cultura celular, e mais particularmente de células pluripotentes. Preferencialmente, a matriz extracelular compreende proteínas estruturais, tais como lamininas contendo as subunidades al, a4 ou a5, as subunidades βΐ ou β2, e as subunidades γΐ ou γ3, a entactina, a vitronectina, as lamininas, o colágeno, assim como fatores de crescimento, tais como o TGF-beta e/ou o EGF. Em uma modalidade, a camada de matriz extracelular consiste em, ou contém o Matrigel® e/ou a Geltrex®.
[0020] De acordo com a invenção, o microcompartimento celular contém uma ou várias camadas de células estaminais
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8/24 pluripotentes humanas. Uma célula estaminal pluripotente, ou célula pluripotente, se entende de uma célula que tem a capacidade de formar todos os tecidos presentes no organismo de origem inteiro, sem, contudo, poder formar um organismo inteiro propriamente dito.
[0021] Em uma modalidade particular, as células encapsuladas são células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais pluripotentes induzidas (IPS), células MUSE (Multilineage-differentiating Stress Enduring) que se encontram na pele e na medula óssea dos mamíferos adultos, ou células estaminais embrionárias (ES).
[0022] No contexto da invenção, as células estaminais pluripotentes induzidas (CSPI ou IPS), se entendem de células estaminais pluripotentes obtidas por reprogramação genética de células somáticas diferenciadas, e que apresentam uma morfologia e um potencial de autorrenovação e de pluripotência em parte similares àqueles das células estaminais embrionárias. Essas células são sobretudo positivas para os marcadores de pluripotência, como a coloração à fosfatase alcalina e a expressão das proteínas NANOG, SOX2, OCT4 e SSEA3/4. Os processos que permitem a obtenção das células estaminais pluripotentes induzidas são bem conhecidos da pessoa versada na técnica e são sobretudo descritos nos artigos de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858): 1917 a 1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861 a 872) e Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101 a 106).
[0023] No caso de células estaminais embrionárias, as ditas células estaminais pluripotentes se entendem de células derivadas da massa celular interna do blastocisto e
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9/24 que têm a capacidade de conduzir à formação de todos os tecidos do organismo. A pluripotência das células estaminais embrionárias pode ser avaliada pela presença de marcadores tais como os fatores de transcrição OCT4 e NANOG e marcadores de superfície como SSEA3/4, Tra-1-60 e Tra-181. As células estaminais embrionárias podem ser obtidas sem destruição do embrião dos quais são provenientes, por exemplo com o auxilio da técnica descrita por Chung et ai. (Cell Stem Cell, 2008, 2 (2) : 113 a 117) . Em uma modalidade particular, e por razões legais ou éticas, as células estaminais se entendem à exclusão das células estaminais embrionárias humanas.
[0024] Em uma modalidade, as células estaminais pluripotentes humanas utilizadas para os microcompartimentos de acordo com a invenção são induzidas à pluripotência a partir de células somáticas.
[0025] Vantajosamente, a camada de células contém pelo menos 95% em volume, preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% de células e de matriz produzida pelas ditas células. As células são essencialmente células pluripotentes. Por essencialmente, entende-se que pelo menos 90% das células contidas na camada de células são células pluripotentes, preferencialmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, são células pluripotentes.
[0026] Vantajosamente, o lúmen do cisto contém o meio de cultura. Sobretudo, qualquer meio de cultura que permita a cultura em suspensão de células pluripotentes pode ser utilizado, e sobretudo qualquer meio de cultura classicamente utilizado em cultura 2D.
[0027] Preferencialmente, o microcompartimento celular é
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10/24 fechado. É a camada externa em hidrogel que confere seu tamanho e sua forma ao microcompartimento celular. O microcompartimento pode ter qualquer forma compatível com o encapsulamento de células.
[0028] Vantajosamente, as dimensões do microcompartimento celular são controladas. Em uma modalidade, o microcompartimento celular de acordo com a invenção tem uma forma esférica. Preferencialmente, o diâmetro de tal microcompartimento está compreendido entre 10 pm e 1 mm, mais preferencialmente entre 50 pm e 500 pm, ainda mais preferencialmente inferior a 500 pm, de maneira preferida inferior a 400 pm.
[0029] Em uma outra modalidade, o microcompartimento celular de acordo com a invenção tem uma forma alongada. Sobretudo, o microcompartimento pode ter uma forma ovoide ou tubular. Vantajosamente, a dimensão menor de tal microcompartimento ovoide ou tubular está compreendida entre 10 pm e 1 mm, mais preferencialmente entre 50 pm e 500 pm, ainda mais preferencialmente inferior a 500 pm, de maneira preferida inferior a 400 pm. Por dimensão menor, entende-se o dobre da distância minima entre um ponto situado sobre a superfície externa da camada em hidrogel e o centro do microcompartimento.
[0030] Em uma modalidade particular, a espessura da camada externa em hidrogel representa 5 a 40% do raio do microcompartimento. A espessura da camada de matriz extracelular representa 5 a 80% do raio do microcompartimento e está vantajosamente agarrada sobre a face interna da casca em hidrogel. A espessura da camada de células pluripotentes representa cerca de 10% do raio do
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microcompartimento. A camada de células pluripotente está
em contato, pelo menos em um ponto, com a camada de matriz extracelular, um espaço preenchido pelo meio de cultura
pode estar presente entre a camada de matriz e o cisto. 0
lúmen representa, então, de 5 a 30% do raio do
microcompartimento. No contexto da invenção, a espessura
de uma camada é a dimensão da dita camada estendendo-se
radialmente em relação ao centro do microcompartimento.
[0031] Em um exemplo particular, o microcompartimento celular tem uma forma esférica de raio igual a 100 pm. A camada em hidrogel tem uma espessura de 5 pm a 40 pm. A camada de matriz extracelular tem uma espessura de 5 pm a cerca de 80 pm. A camada de células pluripotentes tem uma espessura de 10 a 30 pm, em que o lúmen tem um raio de 5 a 30 pm, aproximadamente.
[0032] De uma maneira geral, a presença da camada externa em hidrogel impõe um tamanho máximo à camada de células e permite, por confinamento, limitar a proliferação descontrolada das células, que podería causar a morte por anóxia das células e/ou diferenciações descontroladas das células no nivel das camadas mais profundas, isto é, as mais próximas do lúmen do cisto. Em 2D, sobre uma placa de Petri, as colônias são discos, as células no centro do disco tendem a morrer (cada nova célula proveniente de uma divisão é excluída da colônia pela ausência de lugar) ou a se diferenciar sob as restrições das células que as circundam, as células da borda tendem a se diferenciar e somente uma faixa à boa distância apresenta o fenótipo ideal. A topologia do microcompartimento apresentado agui, a superfície interna da esfera formada pela cápsula,
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12/24 permite gerar uma colônia de células estaminais (a camada de células pluripotente) sem bordas em que todas as células são posicionadas de maneira ideal e equivalente tanto para a difusão das pequenas moléculas quanto em termos de esforços mecânicos. Vantajosamente, a densidade celular no microcompartimento está compreendida entre 1 e vários milhares de células por microcompartimento, preferencialmente entre 50 e 1.000 células por microcompartimento de 100 pm de raio.
Processos de preparação de microcompartimentos celulares [0033] A invenção tem igualmente como objeto os processos de preparação de microcompartimentos celulares que permitem obter o microcompartimento celular de acordo com a invenção. Mais particularmente, a invenção propõe fazer microcompartimentos celulares contendo células estaminais pluripotentes organizadas em cistos diretamente a partir de células estaminais pluripotentes, ou a partir de células diferenciadas que serão reprogramadas em células pluripotentes no interior da cápsula de hidrogel quando da formação dos microcompartimentos.
[0034] Qualquer método de produção de microcompartimentos celulares contendo, no interior de uma cápsula de hidrogel, a matriz extracelular e células estaminais pluripotentes pode ser utilizado para a implantação do processo de preparação de acordo com a invenção. Sobretudo, é possível preparar microcompartimentos adaptando-se o método e o dispositivo microfluidico descritos em Alessandri et al., 2016 (A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and
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13/24 differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC), Lab on a Chip, 2016, vol. 16, n° 9, páginas 1593 a 1604), em conformidade com as etapas descritas abaixo.
[0035] Em uma primeira modalidade, o processo de preparação de acordo com a invenção compreende as etapas que consistem em (a) incubar células estaminais pluripotentes humanas em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
(b) misturar as células estaminais pluripotentes provenientes da etapa (a) com uma matriz extracelular;
(c) encapsular a mistura da etapa (b) em uma camada de hidrogel;
(d) cultivar as cápsulas obtidas na etapa (c) em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
(e) enxaguar as cápsulas provenientes da etapa (d) , de maneira a eliminar o inibidor das vias RHO/ROCK;
(f) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (e) durante 3 a 20 dias, preferencialmente 5 a 10 dias, até a obtenção de um cisto, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
[0036] A etapa (a) de incubação e a etapa (d) de cultura em um meio contendo um ou vários inibidores das vias RHO/ROCK (Rho-associated protein kinase), tais como tiazovivina (C15H13N5OS) e/ou Y-27632 (C14H21N3O) , permitem promover a sobrevivência das células estaminais pluripotentes, e a aderência das células à matriz extracelular no momento da formação da camada externa de hidrogel em torno da dita matriz extracelular. No entanto, é desejável que essas etapas sejam limitadas no tempo, a fim que os inibidores das vias RHO/ROCK não impeçam a
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14/24 formação dos cistos.
[0037] Assim, preferencialmente, a incubação da etapa (a) é conduzida durante um tempo compreendido entre alguns
minutos e algumas horas, preferencialmente entre 2 minutos
e 2 horas, mais preferencialmente entre 10 minutos e 1 hora.
[0038] Do mesmo modo, preferencialmente, a etapa (d) de
cultura é conduzida durante um tempo compreendido entre 2 e 48 horas, preferencialmente durante um tempo compreendido entre 6 e 24 horas, mais preferencialmente durante um tempo compreendido entre 12 e 18 horas.
[0039] A etapa (e) é necessária para garantir a
eliminação de qualquer vestígio de inibidores das vias
RHO/ROCK. A etapa (e) é, por exemplo, realizada por
enxágue, e preferencialmente por vários enxágues, em meios
de cultura sucessivos isentos de inibidores das vias
RHO/ROCK.
[0040] Vantajosamente, a etapa (f) é conduzida durante
um tempo suficiente para obter um microcompartimento celular no qual a camada de células pluripotentes e o lúmen apresentam uma espessura acumulada igual a 10 a 95% do raio do microcompartimento, ou seja, durante um tempo suficiente para permitir passar de duas células a mil células, aproximadamente. Qualquer meio de cultura adaptado à cultura de células estaminais pluripotentes pode ser utilizado, e sobretudo o tampão fosfato salino tal como o meio Roswell Park Memorial Institute medium.
[0041] Em um modo de implantação, o processo de acordo
com a invenção compreende uma etapa intermediária (a') que consiste em dissociar as células estaminais pluripotentes
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15/24 provenientes da etapa (a) antes da etapa (b), preferencialmente por meio de um reagente isento de enzima. Vantajosamente, o dito reagente é inibido ou enxaguado antes da etapa de encapsulamento, sobretudo por enxágues sucessivos em um meio especifico para células pluripotentes. Por exemplo, o reagente utilizado é um tampão iso-osmótico contendo o EDTA ou o EGTA tal como o ReLeSR®. Evidentemente, é igualmente possivel utilizar a tripsina ou um reagente contendo uma enzima, mas a taxa de sobrevivência das células pluripotentes ao final dessa etapa pode, então, ser menor comparativamente à utilização de um reagente isento de enzima. Em todos os casos, a etapa de enxágue é necessária para eliminar qualquer vestigio do reagente utilizado para a dissociação das células.
[0042] Em um modo de implantação, pelo menos uma das etapas (a'), (b), (c), (d) ou (e) é realizada a uma temperatura compreendida entre 0 e 8 °C, preferencialmente o conjunto das etapas (a'), (b), (c), (d) e (e) . A manutenção de uma temperatura substancialmente igual a 4 °C permite colocar os processos biológicos das células em dormência, inclusive a transdução dos sinais oriundos do ambiente exterior. Assim, é possivel limitar o fenômeno de morte celular, que poderia ser induzido pelo destacamento celular.
[0043] Em uma outra modalidade, o processo de preparação de um microcompartimento celular, de acordo com a invenção, compreende as etapas que consistem em (a) misturar células humanas diferenciadas com uma matriz extracelular e agentes de reprogramação celular não permeantes relativamente à camada de hidrogel;
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16/24 (b) encapsular a mistura da etapa (a) em uma camada de hidrogel;
(c) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (b) durante 10 a 40 dias, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
[0044] Em uma outra modalidade, o processo de preparação de um microcompartimento celular, de acordo com a invenção, compreende as etapas que consistem em (a) misturar células humanas diferenciadas com uma matriz extracelular;
(b) encapsular a mistura da etapa (a) em uma camada de hidrogel;
(c) incubar as cápsulas provenientes da etapa (b) com agentes de reprogramação celular permeantes relativamente à camada de hidrogel e cultivar as cápsulas durante 10 a 40 dias, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
[0045] Por exemplo, as células diferenciadas utilizadas são fibroblastos.
[0046] A pessoa versada na técnica sabe proceder à reprogramação de uma célula diferenciada em uma célula estaminal reativando-se a expressão dos genes associados ao estágio embrionário por meio de fatores específicos, designados na presente invenção como agentes de reprogramação. A titulo de exemplos, pode-se citar os métodos descritos em Takahashi et al., 2006 (Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors Cell, 2006 Volume 126, páginas 663 a 676), Ban et al., 2009 (Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells
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17/24 using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009; 85(8) :348 a 362) e no pedido internacional W02010/105311 que tem como título Production of reprogrammed pluripotent cells.
[0047] Os agentes de reprogramação são vantajosamente coencapsulados com as células diferenciadas, de maneira a concentrar o produto e a favorecer o contato com o conjunto das células. No caso de agentes de reprogramação permeantes à camada de hidrogel, é possível adicionar os ditos agentes no meio de cultura após a etapa de encapsulamento.
[0048] Os agentes de reprogramação permitem impor às células uma sucessão de alterações fenotípicas até ao estágio pluripotente. Vantajosamente, a etapa (a) de reprogramação é realizada utilizando-se meios de cultura específicos, o que favorece essas alterações fenotípicas. Por exemplo, as células são colocadas em cultura em um primeiro meio que compreende 10% de soro humano, ou bovino, em um meio mínimo essencial de Eagle (DMEM) suplementado com um inibidor dos receptores serina/treonina proteína quinase (tal como o produto SB-431542 (C22H16N4O3) ) , um ou vários inibidores das vias RHO/ROCK (Rho-associated protein kinase), tais como a tiazovivina e/ou Y-27632, fatores de crescimento dos fibroblastos, tal como o FGF-2, o ácido ascórbico e antibióticos, tais como a Tricostatina A (C17H22N2O3) · Em seguida, o meio de cultura é substituído pelo meio que favorece a multiplicação das células pluripotentes, tal como o meio mTeSR®l.
[0049] Vantajosamente, as cápsulas provenientes da etapa (b) contêm, cada uma, entre 1 e 500 células diferenciadas,
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18/24 preferencialmente entre 50 e 200.
[0050] Em um modo de implantação, pelo menos uma das etapas (a) , (b) , (c) ou (d) é realizada a uma temperatura compreendida entre 0 e 4 °C, preferencialmente o conjunto das etapas (a), (b), (c) e (d). A manutenção de uma temperatura inferior ou igual a 4 °C permite colocar os processos biológicos das células em dormência, inclusive a transdução dos sinais oriundos do ambiente exterior. Assim, é possível limitar o fenômeno de morte celular, que podería ser induzido pelo destacamento celular.
[0051] Os microcompartimentos obtidos no decorrer da etapa (d) podem ser triados de maneira a isolar os microcompartimentos celulares que apresentam a forma em cisto desejada. Tal etapa de triagem pode ser feita em continuo, de maneira a separar os microcompartimentos celulares que já apresentam a forma em cisto desejada, dos microcompartimentos ainda em curso de formação. Tal etapa de triagem pode ser feita por simples análise morfológica, sem perturbar os outros microcompartimentos dentro dos quais a reprogramação ainda está em curso e/ou a organização em cisto ainda não foi completada.
[0052] De uma maneira geral, os microcompartimentos celulares obtidos de acordo com os processos da invenção podem, em seguida, ser congelados antes de qualquer utilização. De fato, a forma em cisto favorece a sobrevivência das células dentro do microcompartimento, e após descongelamento, a taxa de sobrevivência é superior a 80%. Vantajosamente, o congelamento é realizado utilizandose o nitrogênio liquido que permite vitrificar rapidamente os microcompartimentos e limitar os riscos de formação de
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19/24 cristais dentro das membranas lipidicas das células. Os microcompartimentos celulares podem ser colocados em suspensão em um tampão de congelamento que favorece a sobrevivência das células. É possível, por exemplo, utilizar os tampões de congelamento classicamente utilizados para congelar os embriões.
[0053] Os microcompartimentos celulares assim congelados podem, em seguida, ser descongelados de acordo com as necessidades.
Aplicações [0054] Os microcompartimentos celulares objetos da presente invenção podem ser utilizados para diversas aplicações. De fato, as células que os mesmos contêm podem ser facilmente recuperadas, por simples hidrólise e/ou dissolução da camada externa em hidrogel. Além disso, é possível diferenciar as células pluripotentes no interior da cápsula de hidrogel ou após hidrólise/dissolução da dita cápsula de hidrogel, de acordo com as necessidades, de maneira a obter grandes quantidades de linhagens celulares de interesse. Vantajosamente, as células são diferenciadas em um ou vários tipos celulares de interesse, dentro do microcompartimento, isto é, antes da hidrólise da camada externa em hidrogel.
[0055] Os microcompartimentos celulares, e mais precisamente as células que os mesmos contêm, podem ser utilizados para fins de pesquisa e desenvolvimento, tanto na forma de uma rede celular 3D quanto mais classicamente em cultura 2D. É igualmente possível utilizar os mesmos para fins terapêuticos, sobretudo para aplicações de terapia celular, engenharia de tecidos, etc.
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20/24
EXEMPLOS
Exemplo 1: Protocolo de obtenção de microcompartimentos celulares a partir de células humanas induzidas à pluripotência.
Soluções utilizadas:
[0056] Solução 1, base de meio DMEMF12 suplementada com μΜ de Tiazovivina [0057] Soluç ão 2, PBS sem magnésio e sem cálcio suplementado com 1 μΜ 2 μΜ de Tiazovivina [0058] Solução 3, tampão de destacamento celular não enzimático: RelesR™ suplementado com 2 μΜ de Tiazovivina.
[0059] Solução 4, meio de cultura células estaminais pluripotentes: MTeSRl™ hES/hIPS cell medium STEMCELL™).
[0060] Solução 4+, Solução 4 suplementada com 2 μΜ de
Tiazovivina.
[0061] Solução 5, Matrigel™.
[0062] Solução 6, sorbitol 30 0 mM com 2 μΜ de
Tiazovivina.
Solução celular:
[0063] Uma placa de Petri de células IPS humanas
(obtidas a partir de Primary Dermal Fibroblast; Normal,
Human, Adult ATCC® PCS-201-012™ e de CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (ref. A16517) utilizando-se a tecnologia apresentada no exemplo 2) de 25 cm2 a 90% de confluência é utilizada a seguir para corresponder aos volumes recomendados. Todas as etapas seguintes são efetuadas a 4 °C até a reticulação da casca em hidrogel no banho de cálcio.
[0064] Etapa 1: Enxaguar as células com a solução 1. Aguardar de 10 minutos a 1 hora.
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21/24 [0065] Etapa 2: Enxaguar duas vezes com 4 mL de solução 2 .
[0066] Etapa 3: Aspirar delicadamente a solução.
[0067] Etapa 4: Incubar as células com 4 mL de solução 3 durante 5 a 10 minutos.
[0068] Etapa 5: Destacar as células com 2 mL de solução 4+ com uma pipeta de cone largo para reduzir a tensão de cisalhamento.
[0069] Etapa 6: Centrifugar a suspensão de células a 3 60
g durante 5 minutos.
[0070] Etapa 7 : Aspirar o sobrenadante.
[0071] Etapa 8 : Ressuspender com 0,5 mL de solução 4+.
[0072] Etapa 9: Centrifugar novamente a 360g e aspirar o
sobrenadante.
[0073] Etapa 10: Ressuspender o sedimento de células em 70 pL de solução 5 e 100 pL de solução 6 (o volume do sedimento deveria ser de 30 pL) . A solução celular está pronta.
Encapsulamento:
[0074] O dispositivo de encapsulamento é preparado como descrito em Alessandri et al., 2016 (A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) , Lab on a Chip, 2016, vol. 16, n° 9, páginas 1593 a 1604).
[0075] Em suma, as diferentes partes do dispositivo são esterilizadas (por autoclave); As três soluções necessárias são carregadas em três bombas de seringa, i) solução de alginato (PRONOVAOSLGl00 a 2% em massa em água destilada), ii) solução intermediária (sorbitol a 300 mM), iii) solução
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22/24 celular (preparada na etapa anterior); As três soluções são coinjetadas de maneira concêntrica através de um injetor microfluidico que permite formar um jato que se fraciona em gotas cuja camada externa é a solução de alginato e o centro a solução de células; Essas gotas são coletadas em um banho de cálcio (a 100 mM) que enrijece a solução de alginato para formar a casca.
[0076] Para melhorar a monodispersividade dos microcompartimentos celulares, o alginato foi carregado com uma corrente continua a +2 KV. Um anel com a massa de 2 cm de diâmetro é disposto a 500 pm da ponta no plano perpendicular ao eixo geométrico do jato que sai do injetor microfluidico para gerar o campo elétrico.
[0077] Nota-se que, nessas condições de encapsulamento, a camada de Matrigel® se forma espontaneamente.
Tratamento após encapsulamento:
[0078] Etapa 1: As cápsulas são recuperadas com uma peneira celular de 40 pm, e então, após enxágue com a solução 1, as mesmas são armazenadas em um frasco de 75 cm2 com 20 mL de solução 4+.
[0079] Etapa 2 : 0 frasco é mantido durante 12 h na
incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
[0080] Etapa 3: Trocar 0 meio para a solução 4 para
permitir a formação dos cistos.
[0081] Etapa 4 : Após 24 a 72 h os cistos de algumas
dezenas de células se formam nas cápsulas. Os microcompartimentos celulares são maduros após 5 a 10 dias.
Exemplo 2: Protocolo de obtenção de microcompartimentos celulares a partir de fibroblastos humanos.
Soluções utilizadas:
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23/24
[0082] Solução 1, base de meio DMEMF12
[0083] Solução 2, PBS sem magnésio sem cálcio
suplementado
[0084] Solução 3, tampão de destacamento celular
tripsina EDTA
[0085] Solução 4, meio de cultura fibroblastos: 10% de
soro humano em uma base de meio DMEM
[0086] Solução 4 + , Solução 4 suplementada com 2 μΜ de
Tiazovivina.
[0087] Solução 5, Matrigel™.
[0088] Solução 6, sorbitol 30 0 mM com 2 μΜ de
Tiazovivina.
Solução celular:
[0089] Uma placa de Petri de fibroblastos humanos
(Primary Dermal Fibrobl ast; Normal, Human, Adult (ATCC®
PCS-201-012®) de 2 5 cm2 com baixa densidade de confluência
é utilizada a seguir para corresponder aos volumes
recomendados (1 a 2 milhões de células) . Todas as etapas seguintes são efetuadas a 4 °C até a reticulação da casca no banho de cálcio.
[0090] Etapa 1: Enxaguar as células com a solução 2.
[0091] Etapa 2: Aspirar delicadamente a solução.
[0092] Etapa 3: Incubar as células com 4 mL de solução 3 durante 5 a 10 minutos.
[0093] Etapa 4: Destacar as células com 2 mL de solução 4+ com uma pipeta de cone largo para reduzir a tensão de cisalhamento.
[0094] Etapa 6: Centrifugar a suspensão de células a 360 g durante 5 minutos.
[0095] Etapa 7: Aspirar o sobrenadante.
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24/24 [0096] Etapa 8: Ressuspender com 0,5 mL de solução 4+.
[0097] Etapa 9: Centrifugar novamente a 360g e aspirar o sobrenadante.
[0098] Etapa 10: Ressuspender o sedimento de células em 90 pL de solução 5 e 100 pL de solução 6 (o volume do sedimento deveria ser de 10 pL).
[0099] Etapa 11: Adicionar 1/10 do conteúdo do kit CytoTune® - IPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (contendo um virus de reprogramação) previsto para uma placa de 6 poços. A solução celular está pronta.
Encapsulamento:
[0100] O encapsulamento é realizado em conformidade com o protocolo do exemplo 1.
Tratamento após encapsulamento:
[0101] Etapa 1: As cápsulas são recuperadas com uma peneira celular de 40 pm, e então, após enxágue com a solução 1, as mesmas são armazenadas em um frasco de 75 cm2 com 20 mL de solução 4+.
[0102] Etapa 2: O frasco é mantido durante 24 h na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
[0103] Etapa 3: Trocar o meio todos os dias. Cada
cápsula contém de 1 a 10 fibroblastos à formação das
cápsulas 0 virus de reprogramação tem uma eficácia de
transformação da o rdem de 0,2%. A maioria das cápsulas
conterão, portanto, nenhuma ou muito poucas células reprogramadas. Os cistos começam a se formar após 15 a 40 dias. Os fibroblastos têm uma forma alongada e não formam cistos. Assim, todos os cistos que se formam são formados por IPS.

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Microcompartimento celular que compreende sucessivamente, organizadas em torno de um lúmen:
    - pelo menos uma camada de células pluripotentes humanas;
    - uma camada de matriz extracelular;
    - uma camada externa em hidrogel.
  2. 2. Microcompartimento celular, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito microcompartimento é fechado.
  3. 3. Microcompartimento celular, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a camada externa compreende o alginato.
  4. 4. Microcompartimento celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito microcompartimento tem uma forma esférica ou alongada.
  5. 5. Microcompartimento celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito microcompartimento tem um diâmetro ou uma dimensão menor compreendida entre 10 pm e 1 mm, preferencialmente entre 50 pm e 500 pm, mais preferencialmente inferior a 500 pm, ainda mais preferencialmente inferior a 400 pm.
  6. 6. Microcompartimento celular, de acordo com qualquer
    uma das reivindicações anteriores, ei n que a densidade celular está compreendida entre um e vários milhares de células, preferencialmente 50 a 1 .000 células por microcompartimentos. 7 . Processo de preparação de um microcompartimento celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
    6, que compreende as etapas que consistem em:
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    2/3 (a) incubar células estaminais pluripotentes humanas em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
    (b) misturar as células estaminais pluripotentes provenientes da etapa (a) com uma matriz extracelular;
    (c) encapsular a mistura da etapa (b) em uma camada de hidrogel;
    (d) cultivar as cápsulas obtidas na etapa (c) em um meio de cultura contendo um inibidor das vias RHO/ROCK;
    (e) enxaguar as cápsulas provenientes da etapa (d) , de maneira a eliminar o inibidor das vias RHO/ROCK;
    (f) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (e) durante 3 a 20 dias, preferencialmente 5 a 10 dias, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
  7. 8. Processo de preparação de um microcompartimento, de acordo com a reivindicação 7, que compreende uma etapa intermediária que consistem em (a') dissociar as células estaminais pluripotentes provenientes da etapa (a) antes da etapa (b), preferencialmente por meio de um reagente isento de enzima.
  8. 9. Processo de preparação de um microcompartimento celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende as etapas que consistem em (a) misturar células diferenciadas humanas com uma matriz extracelular e agentes de reprogramação celular;
    (b) encapsular a mistura da etapa (a) em uma camada de hidrogel;
    (c) cultivar as cápsulas provenientes da etapa (b) durante 10 a 40 dias, e opcionalmente recuperar os microcompartimentos celulares obtidos.
  9. 10. Processo de preparação de um microcompartimento
    Petição 870190048200, de 23/05/2019, pág. 37/40
    3/3 celular, de acordo com a reivindicação 9, em que cada cápsula proveniente da etapa (b) contém entre 1 e 500 células diferenciadas.
  10. 11. Processo de preparação de um microcompartimento celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, que compreende uma etapa posterior que consiste em congelar os microcompartimentos celulares obtidos na etapa (f), de acordo com a reivindicação 7, ou na etapa (c), de acordo com a reivindicação 9.
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