BR112020009414A2

BR112020009414A2 - anticorpo, composição, e, célula isolada.

Info

Publication number: BR112020009414A2
Application number: BR112020009414-5A
Authority: BR
Inventors: Yongqiang Wang; Lei Fang; Zhengyi Wang; Bingshi Guo; Jingwu Zang
Original assignee: I-Mab Biopharma Us Limited
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2020-11-03
Also published as: KR20200059186A; SG11202005009RA; JP6996825B2; IL275943A; EP3577141A1; IL275943B; US20190389972A1; CA3084398A1; AU2019203917B2; AU2020203065A1; AU2019203917A1; EA202091053A1; KR102471868B1; CN110573531B; WO2019137552A1; CN110573531A; EP3577141A4; ZA202002567B; AU2020203065B2; MX2020006942A

Abstract

São providos anticorpo e fragmento de ligação de antígeno com domínios C¿ e CH1 modificados que ainda possibilitam o emparelhamento dos domínios C¿ e CH1, mas reduziram o emparelhamento, comparado aos domínios CH1 e C¿ tipo selvagem sem a modificação. Tais modificações são usadas particularmente para preparar anticorpos biespecíficos com dois pares diferentes de domínios C¿ e CH1.

Description

1 / 71 ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, E, CÉLULA ISOLADA

FUNDAMENTOS

[001] Um anticorpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) é uma proteína artificial que pode se ligar simultaneamente a dois tipos diferentes de antígeno ou dois epítopos diferentes do mesmo antígeno. BsAbs podem ser produzidos em vários formatos estruturais, e aplicações atuais foram exploradas em relação à imunoterapia para câncer e liberação de fármaco.

[002] Existem muitos formatos de BsAb. Um BsAb do tipo IgG mantém a estrutura tradicional de anticorpo monoclonal (mAb) de dois braços Fab e uma região Fc, exceto que os dois sítios dois sítios Fab se ligam aos antígenos diferentes. Os tipos mais comuns são denominados anticorpos tri- funcionais, uma vez que apresentam três sítios de ligação exclusivos no anticorpo: as duas regiões Fab, e a região Fc. Cada par de cadeia pesada e leve é a partir de um mAb exclusivo. A região Fc preparada a partir das duas cadeias pesadas forma o terceiro sítio de ligação. Estes BsAbs são frequentemente fabricados com o método de quadroma, ou o de hibridoma híbrido.

[003] Entretanto, o método de quadroma depende de alteração aleatória para formar BsAbs utilizáveis e pode ser ineficiente. Um outro método para fabricar BsAbs do tipo IgG é denominado “botões em buracos”, e depende da introdução de uma mutação para um aminoácido grande na cadeia pesada de um mAb, e uma mutação para um aminoácido pequeno na outras cadeia pesada de mAb. Isto permite que as cadeias pesadas alvo (e suas cadeias leves correspondentes) se ajustem melhor, e torna a produção de BsAb mais confiável.

[004] Embora esta abordagem botão-em-buracos solucione o problema de homodimerização de cadeia pesada, não abordou as questões relacionadas à má interpretação entre a cadeia leve e cadeias pesadas de dois anticorpos diferentes. Existe uma necessidade de prover melhor BsAbs, os

2 / 71 quais são mais fáceis de preparar, e apresentam melhor estabilidade e eficiência clínica.

SUMÁRIO

[005] A presente descrição provê anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno com domínios Cκ e CH1 modificados que ainda possibilitam o emparelhamento dos domínios Cκ e CH1, mas reduziram o emparelhamento com domínios CH1 e Cκ sem as modificações. Tais modificações podem ser particularmente usadas para preparar anticorpos biespecíficos com dois pares diferentes de domínios Cκ e CH1.

[006] Da maneira demonstrada nos exemplos experimentais, dois grupos de aminoácidos foram identificados como resíduos de interface importantes que, quando alterados, podem reduzir ou mesmo interromper o emparelhamento dos domínios Cκ e CH1, a menos que modificações apropriadas sejam realizadas para restabelecer tal interface.

[007] Um grupo como este inclui Val26 (numeração de Kabat: Val133) e Phe11 (numeração de Kabat: Phe118) do domínio Cκ e Leu11 (numeração de Kabat: Leu124) do domínio CH1. Quando um destes aminoácidos é substituído por Ala, por exemplo, o emparelhamento de Cκ/CH1 pode ser interrompido. Um outro grupo de exemplo inclui Gln17 (numeração de Kabat: 124) de Cĸ e Phe9 (numeração de Kabat: 122) de CH1.

[008] Certas mutações nestes resíduos de interface, entretanto, podem restabelecer o emparelhamento, o qual também é demonstrado nos exemplos. Um exemplo como este é Val26Trp (Cκ) com Leu11Trp (CH1). Exemplos adicionais são mostrados na tabela 1 e tabela 2.

[009] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo um fragmento CH1 de humano que compreende uma substituição L11W e um fragmento Cκ de humano compreendendo uma substituição V26W. Um anticorpo ou fragmento como este pode incluir opcionalmente substituições adicionais que

3 / 71 reduzem adicionalmente a ligação ao parceiro tipo selvagem, e/ou melhoram a ligação entre os fragmentos substituídos.

[0010] Por exemplo, um par adicional de substituições pode ser K101E em CH1 e D15K ou D15H (D15K/H) em Cκ. Um outro par de substituições são K96D em CH1 e E16R em Cκ. Ainda um outro exemplo de par é K96E em CH1 e E16K em Cκ. Dessa maneira, em algumas modalidades, é provido anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em que o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K101E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e D15K/H; o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96D, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16R; o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16K; ou o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16R.

[0011] Em uma modalidade, é provido um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo um par de Cκ/CH1, em que os fragmentos Cκ e CH1 compreendem resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) 26W em Cκ e 11K e 28N em CH1; (b) 11W e 26G em Cκ e 11W em CH1; (c) 26W em Cκ e 11W em CH1; (d) 17R em Cκ e 9D em CH1; (e) 17K em Cκ e 9D em CH1; e combinações dos mesmos.

[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende adicionalmente um segundo par de Cκ/CH1. O segundo par de Cκ/CH1 pode ser tipo selvagem ou com um grupo de mutação. O grupo de mutação pode ser o mesmo como no primeiro par de Cκ/CH1, mas é preferível ser diferente, de maneira tal que não ocorra incompatibilidade entre os pares.

[0013] Uma outra modalidade da presente descrição provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo

4 / 71 um domínio Cκ que compreende uma modificação de aminoácido na posição V26 e/ou F11, e um domínio CH1 compreendendo uma modificação de aminoácido na posição Leu11, em que os aminoácidos modificados interagem uns com os outros quando o domínio Cκ emparelha com o domínio CH1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo da reivindicação 8, em que o domínio Cκ não interage com um domínio tipo selvagem CH1, e o domínio CH1 não interage com um domínio tipo selvagem Cκ. Em algumas modalidades, os aminoácidos modificados são selecionados a partir da tabela 1.

[0014] Uma outra modalidade provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo um domínio Cκ que compreende uma modificação de aminoácido na posição Q17, e um domínio CH1 compreendendo uma modificação de aminoácido na posição F9, em que os aminoácidos modificados interagem uns com os outros quando o domínio Cκ emparelha com o domínio CH1. Em algumas modalidades, o domínio Cκ não interage com um domínio tipo selvagem CH1 e o domínio CH1 não interage com um domínio tipo selvagem Cκ. Em algumas modalidades, os aminoácidos modificados são selecionados a partir da tabela 2.

[0015] É também provido, em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro par de Cκ/CH1 e um segundo par de Cκ/CH1, em que os fragmentos Cκ e CH1 do primeiro par compreendem resíduos de aminoácido selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) 26W em Cκ e 11K e 28N em CH1; (b) 11W e 26G em Cκ e 11W em CH1; (c) 26W em Cκ e 11W em CH1; (d) 17R em Cκ e 9D em CH1; (e) 17K em Cκ e 9D em CH1; e combinações dos mesmos, e os fragmentos Cκ e CH1 do segundo par são tipo selvagem ou compreendem um conjunto diferente de resíduos de aminoácido selecionados a partir de (a)-(e).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0016] A FIGURA 1 mostra a estrutura cristalina de um par de

5 / 71 Domínios Cκ e CH1 (de 1CZ8), que mostram suas interações (os resíduos envolvidos na ligação de hidrogênio são coloridos em rosa; ponte salina em amarelo; resíduos de interação hidrofóbicas são bastões coloridos em azul ou verde).

[0017] A FIGURA 2 mostra alguns resíduos no domínio Cκ e CH1 que podem ser importantes para manter a interação entre os domínios.

[0018] A FIGURA 3 apresenta a figura de um gel SDS-PAGE reduzido para mutações de ala/trp para diferentes pares de aminoácido de interação.

[0019] A FIGURA 4A-4D mostra as figuras de géis de SDS-PAGE reduzido para vários pares de mutação analisados no exemplo 3.

[0020] A FIGURA 5A-B apresenta figuras de géis de SDS-PAGE (5A) reduzidos e SDS-PAGE (5B) não reduzidos que mostram a ligação entre domínios Cκ e CH1.

[0021] A FIGURA 6A-C apresenta imagens de gel que mostram a ligação entre as cadeias pesadas e leves de anticorpo, algumas das quais incluíram mutações.

[0022] A FIGURA 7A-D ilustra as estruturas de uma variedade de anticorpos biespecíficos.

[0023] A FIGURA 8A-B apresenta dados para mostrar a ligação e potência funcional dos anticorpos biespecíficos aos seus respectivos alvos de ligação.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0024] Observa-se que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais desta entidade; por exemplo, “um anticorpo”, é entendido para representar um ou mais anticorpos. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” pode ser usado aqui indiferentemente.

[0025] Da maneira aqui usada, o termo “polipeptídeo” é pretendido

6 / 71 para incluir um “polipeptídeo” singular, bem como “polipeptídeos” plurais, e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) ligada linearmente por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um tamanho específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, “proteína”, “cadeia de aminoácido”, ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos na definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser usado em vez de, ou indiferentemente com quaisquer destes termos. O termo “polipeptídeo” também é pretendido para se referir aos produtos de modificações pós- expressão do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico determinada. Pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo pela síntese química.

[0026] O termo “isolado”, da maneira aqui usada, com relação às células, ácidos nucleicos, tal como DNA ou RNA, se refere às moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula. O termo “isolado”, da maneira aqui usada, também se refere a um ácido nucleico ou peptídeo que é substancialmente livre de material celular, material viral, ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Além do mais, um “ácido nucleico isolado” significa incluir fragmentos de ácido nucleico que são de ocorrência não natural como fragmentos, e não pode ser observado no

7 / 71 estado natural. O termo “isolado” também é usado aqui para se referir às células ou polipeptídeos que são isolados a partir de proteínas ou tecidos celulares. Os polipeptídeos isolados significam incluir polipeptídeos tanto purificados quanto recombinantes.

[0027] Da maneira aqui usada, o termo “recombinante”, como pertence aos polipeptídeos ou polinucleotídeos, propõe uma forma do polipeptídeo ou polinucleotídeo que não existe naturalmente, um exemplo sem limitação do qual pode ser criado combinando polinucleotídeos ou polipeptídeos que não ocorrem normalmente juntos.

[0028] “Homologia”, ou “identidade” ou “similaridade” se refere à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada com propósitos de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nesta posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de combinações ou posições homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40 % de identidade, embora preferivelmente menos de 25 % de identidade, com uma das sequências da presente descrição.

[0029] Um polinucleotídeo ou região de polinucleotídeo (ou um polipeptídeo ou região de polipeptídeo) apresentar um certo percentual (por exemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 %) de “sequência identidade” com uma outra sequência significa que, quando alinhado, este percentual de bases (ou aminoácidos) é o mesmo na comparação das duas sequências. Este alinhamento, e a homologia percentual ou identidade de sequência pode ser determinado usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferivelmente,

8 / 71 parâmetros padrão são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento é BLAST, usando parâmetros padrões. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrões: Código genético = padrão; filtro= nenhum; fita = ambas; valor de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições= 50 sequências; ordenado por = HIGH SCORE; Bases de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Polinucleotídeos biologicamente equivalentes são aqueles com a homologia percentual especificada homologia percentual especificada anteriormente indicada, e que codifica um polipeptídeo com a mesma atividade biológica ou similar.

[0030] O termo “um ácido nucleico ou polinucleotídeo equivalente” se refere a um ácido nucleico com uma sequência de nucleotídeo com um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de nucleotídeo do ácido nucleico ou complemento da mesma. Um homólogo de um ácido nucleico de fita dupla é pretendido para incluir ácidos nucleicos com uma sequência de nucleotídeo que apresenta um certo grau de homologia com o mesmo, ou com o complemento do mesmo. Em um aspecto, homólogos de ácidos nucleicos são capazes de hibridizar no ácido nucleico ou complemento do mesmo. Da mesma forma, “um polipeptídeo equivalente” se refere a um polipeptídeo com um certo grau de homologia, ou identidade de sequência, com a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de referência. Em alguns aspectos, a identidade de sequência é pelo menos cerca de 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 %. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ou polinucleotídeo equivalente apresenta uma, duas, três, quatro ou cinco adições, eliminações, substituições e suas combinações dos mesmos, comparado ao polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. Em alguns aspectos, a sequência equivalente mantém a atividade (por exemplo, ligação ao epítopo) ou estrutura (por exemplo, ponte salina) da sequência de

9 / 71 referência.

[0031] Reações de hibridização podem ser realizadas em condições de “severidade” diferente. Em geral, uma reação de hibridização de severidade baixa é realizada em cerca de 40 °C, em cerca de 10 x SSC, ou uma solução de concentração iônica/temperatura equivalente. Uma hibridização de severidade moderada é realizada tipicamente em cerca de 50 °C, em cerca de 6 x SSC, e uma reação de hibridização de severidade alta é realizada em geral em cerca de 60 °C, em cerca de 1 x SSC. As reações de hibridização também podem ser realizadas em “condições fisiológicas”, que são bem conhecidas pelos versados na técnica. Um exemplo não limitante de uma condição fisiológica é a temperatura, concentração iônica, pH e concentração de Mg2+ normalmente encontrada em uma célula.

[0032] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica de quatro bases de nucleotídeo: adenina (a); citosina (C); guanina (G); timina (T), e uracila (U) por timina quando o polinucleotídeo é RNA. Assim, o termo “sequência de polinucleotídeo” é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética pode ser inserida em bases de dados em um computador com uma unidade de processamento central, e usada para aplicações de bioinformática, tal como genômica funcional e pesquisa de homologia. O termo “polimorfismo” se refere à coexistência de mais de uma forma de um gene ou porção do mesmo. Uma porção de um gene do qual existem pelo menos duas formas diferentes, isto é, duas sequências de nucleotídeo diferentes, é referida como uma “região polimórfica de um gene”. Uma região polimórfica pode ser um nucleotídeo único, a identidade do qual difere em alelos diferentes.

[0033] Os termos “polinucleotídeo” e “oligonucleotídeo” são usados indiferentemente e se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer tamanho, tanto desoxirribonucleotídeos quanto ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem apresentar qualquer

10 / 71 estrutura tridimensional, e podem realizar qualquer função conhecida ou desconhecida. Os exemplos a seguir são não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, oligonucleotídeo iniciador, marcação EST ou SAGE), éxons, íntrons, RNA mensageiro (RNAm), RNA de transferência, RNA ribossomal, ribozimas, DNAc, RNAds, RNAsi, RNAmi, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas ou oligonucleotídeos iniciadores de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, as modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não associados a nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere tanto às moléculas de dupla quanto única fita. A menos que de outra forma especificada ou exigida, qualquer modalidade desta descrição, que é um polinucleotídeo, inclui tanto a forma de dupla fita quanto cada uma das formas de fita simples complementares conhecidas ou previstas para constituir a foram de fita dupla.

[0034] O termo “codificar”, como é aplicado aos polinucleotídeos, se refere a um polinucleotídeo que é referido para “codificar” um polipeptídeo se, em seu estado natural ou quando manipulado pelos métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o RNAm para o polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A fita anti-sentido é o complemento de um ácido nucleico como este, e a sequência codificante pode ser deduzida a partir do mesmo.

[0035] Da maneira aqui usada, um “anticorpo” ou “peptídeo de ligação de antígeno” se refere a um polipeptídeo ou um complexo de

11 / 71 polipeptídeo reconhece especificamente e se liga a um antígeno. Um anticorpo pode ser um anticorpo completo, e qualquer fragmento de ligação de antígeno ou uma cadeia simples do mesmo. Assim, o termo “anticorpo” inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina com atividade biológica de ligação ao antígeno. Exemplos dos mesmos incluem, mas sem limitação, uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve, ou uma porção de ligação do ligante do mesmo, uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região de estrutura (FR), ou qualquer porção da mesma, ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.

[0036] Os termos “fragmento de anticorpo” ou “fragmento de ligação de antígeno”, da maneira aqui usada, é uma porção de um anticorpo tal como F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv e similares. Independente da estrutura, um fragmento de anticorpo se liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. O termo “fragmento de anticorpo” inclui aptâmeros, spiegelmers e anticorpos biespecíficos. O termo “fragmento de anticorpo” também inclui qualquer proteína sintética ou geneticamente modificada que atua como um anticorpo pela ligação a um antígeno específico para formar um complexo.

[0037] Um “fragmento variável de cadeia única”, ou “scFv”, se refere a uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) e leves (VL) de imunoglobulinas. Em alguns aspectos, as regiões são conectadas com um peptídeo ligador pequeno de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligador pode ser rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou treonina para solubilidade, e pode se conectar tanto com a terminação N da VH quanto com a terminação C da VL, ou vice versa. Esta proteína mantém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e a introdução do ligador. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são

12 / 71 descritas, por exemplo, na patente U.S. 5.892.019.

[0038] O termo anticorpo inclui várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Os versados na técnica entenderão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon (γ, µ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre as mesmas (por exemplo, γl-γ4). É a natureza desta cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc., são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos são prontamente discerníveis pelos versados na técnica, em vista da presente descrição e, dessa maneira, estão no escopo da presente descrição. Todas as classes de imunoglobulina estão evidentemente no escopo da presente descrição, a discussão a seguir será em geral direcionada à classe de IgG das moléculas de imunoglobulina. Com relação à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos, de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000-70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por pontes dissulfeto em uma configuração “Y”, em que as cadeias leves agrupam as cadeias pesadas, iniciando na foz do “Y” e continuando através da região variável.

[0039] Anticorpos, peptídeos de ligação de antígeno, variações, ou derivados dos mesmos da descrição incluem, mas sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, single cadeia anticorpos, ligação ao epítopo fragmentos, por exemplo, Fab, Fab’ e F(ab’)2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo tanto um domínio VK quanto VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, e anticorpos anti-idiotípicos

13 / 71 (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos LIGHT aqui descritos). As moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da descrição podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[0040] As cadeias leves são classificadas tanto como kappa quanto lambda (κ, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada tanto com uma cadeia leve kappa quanto lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas umas nas outras, e as porções “cauda” das duas cadeias pesadas são ligadas umas nas outras por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas tanto por hibridomas, células B quanto células hospedeiras geneticamente modificadas. Na cadeia pesada, a sequência de aminoácidos funciona a partir de uma terminação N nas extremidades bifurcadas da configuração Y para a terminação C na parte inferior de cada cadeia.

[0041] Tanto as cadeias leves quanto pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são usados de maneira funcional. Em relação a isso, será entendido que os domínios variáveis das porções de cadeia tanto leve (VK) quanto pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade de antígeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (CK) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem importantes propriedades biológicas tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios de região constante aumenta à medida que se torna mais distante do sítio de ligação-antígeno ou terminação amino do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável, e na porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CK compreendem na realidade as terminações carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.

14 / 71

[0042] Da maneira indicada anteriormente, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e ligue especificamente epítopos em antígenos. Isto é, o domínio VK e domínio VH, ou subconjunto das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternário forma o sítio de ligação de antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias de VH e VK (isto é, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3). Em alguns exemplos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécie de camelídeo ou geneticamente modificadas com base em imunoglobulinas de camelídeo, uma molécula completa de imunoglobulina, podem consistir em cadeias pesadas apenas, sem nenhuma das cadeias leves. Vide, por exemplo, Hamers- Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

[0043] Em anticorpos de ocorrência natural, as seis “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs” presentes em cada domínio de ligação de antígeno são sequências de aminoácidos curtas, não contíguas que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno, uma vez que o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de ligação de antígeno, referidos como regiões de “estrutura”, exibem menos variabilidade inter-molecular. As regiões de estrutura adotam amplamente uma conformação de folha β, e as CDRs formam alças que conectam a, e em alguns casos formam parte de, a estrutura de folha β. Assim, regiões de estrutura atuam para formar um andaime que provê o posicionamento das CDRs em orientação correta por interações inter-cadeia, não-covalentes. O domínio de ligação de antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma complementaridade de superfície com o epítopo no antígeno imunorreactivo.

15 / 71 Esta superfície de complementaridade promove a ligação não covalente do anticorpo com seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, podem ser rapidamente identificados por qualquer dada região variável de cadeia pesada ou leve pelos versados na técnica, uma vez que foram precisamente definidos (vide “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)).

[0044] No caso onde existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo da maneira aqui usada é pretendida para incluir todos os significados, a menos que declarado explicitamente o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo “região determinante de complementaridade” (“CDR”) para descrever os sítios de combinação de antígeno não contínuos encontrados na região variável tanto dos polipeptídeos de cadeia pesada quanto leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) e por Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987), que são aqui incorporados pela referência na sua íntegra. As definições de CDR, de acordo com Kabat e Chothia, incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparadas umas com as outras. Todavia, a aplicação de cada definição para se referir a uma CDR de um anticorpo, ou variações da mesma, é pretendida para estar no escopo do termo, da maneira definida e aqui usada. Os resíduos de aminoácido apropriados, que incluem as CDRs definidas por cada uma das referências citadas anteriormente, são apresentados na tabela a seguir como uma comparação. Os números exatos de resíduo que incluem uma CDR particular variarão, dependendo da sequência e tamanho da CDR. Os versados na técnica podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR particular fornecida pela sequência de aminoácido

16 / 71 de região variável do anticorpo. Kabat Chothia CDR-H1 31-35 26-32 CDR-H2 50-65 52-58 CDR-H3 95-102 95-102 CDR-L1 24-34 26-32 CDR-L2 50-56 50-52 CDR-L3 89-97 91-96

[0045] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para sequência de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Os versados na técnica podem atribuir sem ambiguidade este sistema de “numeração de Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem depender de nenhum dos dados experimentais, além da própria sequência. Da maneira aqui usada, “numeração de Kabat” se refere ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983).

[0046] Além da tabela anterior, o sistema de numeração Kabat descreve as regiões CDR da maneira a seguir: CDR-H1 começa em aproximadamente aminoácido 31 (isto é, aproximadamente 9 resíduos após o primeiro resíduo de cisteína), inclui aproximadamente 5-7 aminoácidos, e finaliza no próximo resíduo de triptofano. CDR-H2 começa no décimo quinto resíduo após o final de CDR-H1, inclui aproximadamente 16-19 aminoácidos, e finaliza no próximo resíduo de arginina ou lisina. CDR-H3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo de aminoácido após o final de CDR-H2; inclui 3-25 aminoácidos; e finaliza na sequência W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido. CDR-L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 10-17 resíduos; e finaliza no próximo resíduo de triptofano. CDR-L2 começa aproximadamente no décimo sexto resíduo, após o final de CDR-L1, e inclui aproximadamente 7 resíduos. CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo após o final de CDR-L2 (isto é, após um resíduo de cisteína); inclui aproximadamente 7-11 resíduos e finaliza na sequência F ou

17 / 71 W-G-X-G, onde X é qualquer aminoácido.

[0047] Alguns outros sistemas de numeração incluem “numeração de IMGT” e “numeração de éxon IMGT”. Por exemplo, para domínios constantes CH1 e Cĸ, a tabela a seguir mostra a correlação entre o sistema de numeração de éxon IMGT e o sistema de numeração de Kabat. Numeração de éxon IMGT e numeração de Kabat para CH1 Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de éxon IMGT Kabat éxon IMGT Kabat éxon IMGT Kabat 1 114 41 157 81 206 2 115 42 162 82 207 3 116 43 163 83 208 4 117 44 164 84 209 5 118 45 165 85 210 6 119 46 166 86 211 7 120 47 167 87 212 8 121 48 168 88 213 9 122 49 169 89 214 10 123 50 171 90 215 11 124 51 172 91 216 12 125 52 173 92 217 13 126 53 174 93 218 14 127 54 175 94 219 15 128 55 176 95 220 16 129 56 177 96 221 17 130 57 178 97 222 18 133 58 179 98 223 19 134 59 180 20 135 60 182 21 136 61 183 22 137 62 184 23 138 63 185 24 139 64 186 25 140 65 187 26 141 66 188 27 142 67 189 28 143 68 190 29 144 69 191 30 145 70 192 31 146 71 193 32 147 72 194 33 148 73 195 34 149 74 196 35 150 75 197 36 151 76 198 37 152 77 199 38 153 78 200 39 154 79 203 40 156 80 205 Numeração de éxon IMGT e Numeração de Kabat para Cĸ Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de Numeração de éxon IMGT Kabat éxon IMGT Kabat éxon IMGT Kabat 1 108 41 148 81 188

18 / 71 2 109 42 149 82 189 3 110 43 150 83 190 4 111 44 151 84 191 5 112 45 152 85 192 6 113 46 153 86 193 7 114 47 154 87 194 8 115 48 155 88 195 9 116 49 156 89 196 10 117 50 157 90 197 11 118 51 158 91 198 12 119 52 159 92 199 13 120 53 160 93 200 14 121 54 161 94 201 15 122 55 162 95 202 16 123 56 163 96 203 17 124 57 164 97 204 18 125 58 165 98 205 19 126 59 166 99 206 20 127 60 167 100 207 21 128 61 168 101 208 22 129 62 169 102 209 23 130 63 170 103 210 24 131 64 171 104 211 25 132 65 172 105 212 26 133 66 173 106 213 27 134 67 174 107 214 28 135 68 175 29 136 69 176 30 137 70 177 31 138 71 178 32 139 72 179 33 140 73 180 34 141 74 181 35 142 75 182 36 143 76 183 37 144 77 184 38 145 78 185 39 146 79 186 40 147 80 187

[0048] Os anticorpos aqui descritos podem ser de qualquer origem animal, incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos de humano, murino, burro, coelho, cabra, porquinho da Índia, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em uma outra modalidade, a região variável pode ser condrictoide em origem (por exemplo, a partir de tubarões).

[0049] Da maneira aqui usada, o termo “região constante de cadeia pesada” inclui sequências de aminoácido derivadas a partir de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma região constante de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média

19 / 71 e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variação ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um peptídeo de ligação de antígeno para uso na descrição pode compreender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo da descrição compreende uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH3. Adicionalmente, um anticorpo para uso na descrição pode carecer de pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Da maneira apresentada anteriormente, será entendido pelos versados na técnica que a região constante de cadeia pesada pode ser modificada, de maneira tal que varie na sequência de aminoácido a partir da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[0050] A região constante de cadeia pesada de um anticorpo aqui descrita pode ser derivada de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado a partir de uma molécula de IgG1 e uma região de dobradiça derivada a partir de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode compreender uma região de dobradiça derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

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[0051] Da maneira aqui usada, o termo “região constante de cadeia leve” inclui sequências de aminoácido derivadas de cadeia leve de anticorpo. Preferivelmente, a região constante de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio kappa constante ou domínio lambda constante.

[0052] Um “par de cadeia leve-cadeia pesada” se refere à coleção de uma cadeia leve e cadeia pesada que pode formar um dímero através de uma ligação dissulfeto entre o domínio CL da cadeia leve, e o domínio CH1 da cadeia pesada.

[0053] Da maneira previamente indicada, as estruturas de subunidade e configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Da maneira aqui usada, o termo “domínio VH” inclui o domínio variável amino terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, e o termo “domínio CH1” inclui o primeiro (amino mais terminal) domínio de região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH, e é amino terminal para a região de dobradiça de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0054] Da maneira aqui usada o termo “domínio CH2” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo, usando esquemas de numeração convencional (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração EU; vide Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983). O domínio CH2 é exclusivo, na medida em que não está intimamente emparelhado com um outro domínio. Preferivelmente, duas cadeias de carboidrato ramificadas ligadas ao N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG natural intacta. Também é bem documentado que o domínio CH3 se estende do domínio CH2 para a terminação C da molécula IgG, e compreende aproximadamente 108 resíduos.

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[0055] Da maneira aqui usada, o termo “região de dobradiça” inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de ligação de antígeno de terminação N se movam independentemente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de dobradiça superiores, médios e inferiores (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).

[0056] Da maneira aqui usada, o termo “ligação dissulfeto” inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol. Em moléculas de IgG de ocorrência mais natural, as regiões CH1 e CK são ligadas por uma ligação dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas por duas pontes dissulfeto nas posições que correspondem a 239 e 242, usando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU).

[0057] Da maneira aqui usada, o termo “anticorpo quimérico” será mantido para significar qualquer anticorpo no qual a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie, e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente descrição) é obtida de uma segunda espécie. Em certas modalidades, a região ou sítio de ligação alvo será a partir de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

[0058] Da maneira aqui usada, “humanização percentual” é calculada determinando o número de diferenças de aminoácido de estrutura (isto é, diferença não CDR) entre o domínio humanizado e o domínio da linhagem germinal, subtraindo este número do número total de aminoácidos, e a seguir dividindo este pelo número total de aminoácidos e multiplicando por 100.

[0059] “Se liga especificamente” ou “apresenta especificidade por”

22 / 71 significa, em geral, que um anticorpo se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação de antígeno, e que a ligação implica em alguma complementaridade entre o domínio de ligação de antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é referido como “se liga especificamente” a um epítopo quando se liga a este epítopo, por meio de seu domínio de ligação de antígeno mais rapidamente que se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo “especificidade” é aqui usado para qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo se liga a um certo epítopo. Por exemplo, anticorpo “A” pode ser considerado como tendo uma maior especificidade por um dado epítopo do que o anticorpo “B,” ou anticorpo “A” pode ser considerado por se ligar ao epítopo “C” com uma maior especificidade do que apresenta pelo epítopo relacionado “D”. Domínios Cκ e CH1 modificados

[0060] Anticorpos biespecíficos (BsAbs), que alvejam dois antígenos ou epítopos, incorporam as especificidades e propriedades de dois anticorpos monoclonais (mAbs) distintos em uma única molécula. O desemparelhamento pode ocorrer quando existir dois conjuntos de fragmentos de VH-Ch1:VL-CL emparelhados. Para evitar o desemparelhamento de fragmentos de VH- CH1:VL-CL, derivados de dois anticorpos distintos, muitos métodos foram usados, tais como Cross-Mab, cadeia leve comum e FITIg.

[0061] Um objetivo dos exemplos experimentais foi introduzir mutações no domínio Cκ e/ou CH1, em particular os domínios humanos, para reduzir o desemparelhamento. Preferivelmente, o Cĸ mutante pode mostrar boa ligação com o CH1 mutante, mas o Cĸ mutante não se liga ou apresenta ligação fraca ao domínio CH1 não mutado, e o CH1 mutante mostra ligação fraca ou nenhuma ligação ao Cĸ não mutado.

[0062] Primeiro, os resíduos de interface importantes de Cĸ de humano e CH1 foram analisados e cinco pontos de acesso foram descobertos. Para confirmar a importância destes resíduos, as mutações de cada resíduo em

23 / 71 alanina ou triptofano foram preparadas. As mutações em Gln17 de Cĸ (Cĸ_Q17) ou Phe9 de CH1 (CH1_F9), e mutações em Val26 ou Phe11 de Cĸ (Cĸ_V26_F11) ou Leu11 de CH1 (CH1_L11) resultaram em emparelhamento muito diminuído das cadeias leves e pesadas. Estes resultados confirmaram que os grupos Cĸ_Q17/CH1_F9 (referido como par 1 nos exemplos) e Cĸ_V26_F11/CH1_L11 (referido como par 2 nos exemplos) foram importantes para a interação de Cĸ e CH1. Subsequentemente, as mutações que poderiam restabelecer potencialmente o emparelhamento foram expressas e analisadas. Tais modificações podem ser particularmente usadas para preparar anticorpos biespecíficos com dois pares diferentes de domínios Cκ e CH1.

[0063] Para resíduos de interface Cĸ_V26_F11/CH1_L11 (e opcionalmente L28), as mutações a seguir são mostradas ou contempladas para serem capazes de restabelecer o emparelhamento dos domínios Cĸ e CH1: Tabela 1. Grupos de mutação de Cĸ em 26, e opcionalmente em 11, com CH1 em 11, e opcionalmente em 28 No. Cĸ (em 26 e/ou 11) CH1 (em 11 e/ou 28) 1 26W 11W 2 26W 11K_e 28N 3 11W e 26G 11W 4 11W e 26G 11K e 28N 5 26F 11F 6 26W 11F 7 26F 11W 8 26L 11W 9 26M 11W 10 26E 11W 11 26W 11W e 28R 12 11A e 26W 11W

[0064] Da mesma forma, para resíduos de interface Cĸ_Q17/CH1_F9, as mutações a seguir são mostradas ou contempladas para serem capazes de restabelecer o emparelhamento dos domínios Cĸ e CH1: Tabela 2. Grupos de mutação em Cĸ 17/CH1 9 No. Cĸ (em 17) CH1 (em 9) 1 17R 9D 2 17K 9D 3 17R 9E

24 / 71 4 17K 9E 5 17D 9R 6 17D 9K 7 17H 9I 8 17R 9H 9 17H 9H 10 17R 9P 11 17D 9H 12 17I 9H 13 17H 9M 14 17R 9Q 15 17H 9Q

[0065] Da maneira mostrada no exemplo 7, substituições de aminoácido adicional que interrompem uma ou mais pontes salinas existentes nos domínios tipo selvagem Cĸ e CH1, e restabelecem novas, podem melhorar adicionalmente a especificidade do emparelhamento desejado. Os pares de Cĸ/CH1 tipo selvagem apresentam pontes salinas entre CH1_K96 e Cĸ_E16, entre CH1_K101 e Cĸ_D15, e entre CH1_H51 e Cĸ_D60. Cada uma destas pontes salinas pode apresentar sítios adequados para substituições.

[0066] Por exemplo, em cada uma das pontes salinas, o aminoácido carregado positivamente (por exemplo, K, R ou H) pode ser substituído por um aminoácido carregado negativamente (por exemplo, E ou D), e o aminoácido carregado negativamente (por exemplo, E ou D) pode ser substituído por um aminoácido carregado positivamente (por exemplo, K, R, ou H). Um exemplo como este é CH1_K101E/Cĸ_D15K ou Cĸ_D15H; um outro exemplo é CH1_K96D/Cĸ_E16R; um outro exemplo é CH1_96E/Cĸ_E16K; e um outro exemplo é CH1_H51D/Cĸ_D60K. Estes e outros exemplos são ilustrados na Tabela 3. Cada uma de tais pontes salinas substituídas podem ser usadas independentemente para preparar o novo emparelhamento de CH1/Cĸ, ou além de qualquer uma das outras substituições descritas na presente descrição. Tabela 3. Pontes salinas Interrompidas e Restabelecidas No. CH1 Cĸ 1 K101E D15H 2 K101E D15K 3 K101E D15R 4 K101D D15H 5 K101D D15K 6 K101D D15R

25 / 71 7 K96D E16R 8 K96E E16K 9 K96D E16K 10 K96E E16R 11 K96D E16H 12 K96E E16H 13 H51D D60K 14 H51D D60R 15 H51D D60H 16 H51E D60K 17 H51E D60R 16 H51E D60H

[0067] Em uma modalidade, um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, inclui um fragmento CH1 com substituições L11W e K101E e um fragmento Cκ com substituições V26W e D15K/H. Em uma modalidade, um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, inclui um fragmento CH1 com substituições L11W e K96D e um fragmento Cκ com substituições V26W e E16R. Em uma modalidade, um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, inclui um fragmento CH1 com substituições L11W e K96E e um fragmento Cκ com substituições V26W e E16K.

[0068] Estes grupos de mutação podem ser usados para preparar domínios Cĸ e CH1 mutados que são capazes de se ligar uns nos outros, os quais não podem se ligar ou apresentam ligação reduzida aos seus domínios Cĸ e CH1 tipo selvagem correspondentes. Tais domínios Cĸ e CH1 podem ser incorporados em anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, em particular aqueles biespecíficos.

[0069] Em um cenário, um anticorpo biespecífico apresenta uma estrutura de IgG normal, que inclui dois pares de cadeia leve-cadeia pesada. Cada cadeia pesada inclui um dos domínios VH, CH1, CH2 e CH3, e cada cadeia leve inclui um domínio VL e um CL (por exemplo, Cĸ). De acordo com uma modalidade da presente descrição, um dos pares de Cĸ/CH1 inclui um grupo de mutação da presente descrição e o outro par não apresenta. Em uma outra modalidade, um dos pares de Cĸ/CH1 inclui um grupo de mutação da presente descrição e o outro par inclui um grupo de mutação diferente. Em

26 / 71 algumas modalidades, qualquer um dos dois pares inclui dois ou mais grupos de mutação (por exemplo, um grupo da tabela 1 e um outro grupo da tabela 2).

[0070] Em um outro cenário, um anticorpo biespecífico apresenta uma estrutura normal de IgG, que adicionalmente é fundida na terminação C do fragmento Fc, na terminação N da VH de um segundo fragmento Fab. Um anticorpo como este é ilustrado na FIGURA 7A. De acordo com uma modalidade da presente descrição, tanto os pares de Cĸ/CH1 no lado N- terminal do fragmento Fc quanto os pares de Cĸ/CH1 no lado C-terminal do fragmento Fc incluem um grupo de mutação da presente descrição, e os outros pares não. Além disso, o grupo de mutação pode ser incluído em ambos os pares de Cĸ/CH1 no lado N ou C-terminal do fragmento Fc.

[0071] Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico apresenta uma estrutura da maneira ilustrada na FIGURA 7B. Nesta estrutura, cada cadeia pesada e cadeia leve inclui dois conjuntos de pares de Cĸ/CH1 concatenado. Os grupos de mutação podem ser colocados em qualquer local neste anticorpo, contanto que favoreçam o emparelhamento desejado. Um outro anticorpo biespecífico, com um botão-em-buraco conhecido nos domínios CH3, é ilustrado na FIGURA 7C. Aqui, os grupos de mutação da presente descrição podem ser inseridos em um ou ambos dos pares de Cĸ/CH1 A e B. Ainda outros exemplos são ilustrados na FIGURA 7D, os quais não apresentam domínios CH2 ou CH3.

[0072] Em uma modalidade, a presente descrição provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que inclui um par de Cκ/CH1 humano, em que resíduo de aminoácido 26 do domínio Cκ é Trp e resíduo de aminoácido 11 do domínio CH1 é Trp. Em alguns aspectos, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui adicionalmente um segundo par de Cκ/CH1 de humano, em que o resíduo de aminoácido 26 do segundo domínio Cκ não é Trp, e o resíduo de aminoácido 11 do segundo

27 / 71 domínio CH1 não é Trp. Em alguns aspectos, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui adicionalmente uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região Fc, ou a combinação das mesmas.

[0073] Em uma outra modalidade, a presente descrição provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo um domínio Cκ de humano compreendendo uma modificação de aminoácido na posição Val26 e/ou Phe11, e um domínio CH1 de humano compreendendo uma modificação de aminoácido na posição Leu11, em que os aminoácidos modificados interagem uns com os outros quando o domínio Cκ emparelha com o domínio CH1. A modificação amino, em algumas modalidades, é comparada aos domínios Cκ e CH1 de IgG de humano. Em algumas modalidades, os aminoácidos modificados são selecionados a partir da tabela 1.

[0074] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui adicionalmente um segundo par de Cκ/CH1, em que resíduo de aminoácido 26 do segundo domínio Cκ é Val e resíduo de aminoácido 11 do segundo domínio CH1 é Leu. Em alguns aspectos, resíduo de aminoácido 11 do segundo domínio Cκ é Phe.

[0075] Em uma outra modalidade, a presente descrição provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo um domínio Cκ que compreende uma modificação de aminoácido na posição Gln17, e um domínio CH1 compreendendo uma modificação de aminoácido na posição Phe9, em que os aminoácidos modificados interagem uns com os outros quando o domínio Cκ emparelha com o domínio CH1. A modificação amino, em algumas modalidade, é comparada aos domínios Cκ e CH1 de IgG de humano. Em algumas modalidades, os aminoácidos modificados são selecionados a partir da tabela 2.

[0076] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação

28 / 71 de antígeno do mesmo inclui adicionalmente um segundo par de Cκ/CH1, em que resíduo de aminoácido 17 do segundo domínio Cκ é Gln e resíduo de aminoácido 9 do segundo domínio CH1 é Phe.

[0077] Em algumas modalidades, a presente descrição provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, que inclui um grupo de mutação da Tabela 1 ou um grupo de mutação da Tabela 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui um grupo de mutação da Tabela 1 e um grupo de mutação da Tabela 2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui adicionalmente um grupo de mutação da Tabela 3.

[0078] O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode ser de qualquer classe conhecida de anticorpos, mas é preferivelmente de classe IgG, incluindo os isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. O anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo completamente humano. Moléculas Biespecíficas/Bifuncionais

[0079] Anticorpos biespecíficos são providos em algumas modalidades. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico apresenta uma primeira especificidade com um antígeno de tumor ou um micro- organismo. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico apresenta uma segunda especificidade com uma célula imune.

[0080] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T, uma célula B, um monócito, um macrófago, um neutrófilo, uma célula dendrítica, um fagócito, uma célula exterminadora natural, um eosinófilo, um basófilo e uma mastócito. As moléculas na célula imune que podem ser alvejadas incluem, por exemplo, CD3, CD16, CD19, CD28 e CD64. Outros exemplos incluem PD-1, CTLA-4, LAG-3 (também conhecida como CD223), CD28, CD122, 4-1BB (também conhecida como CD137), TIM3, OX-40 ou OX40L, CD40 ou CD40L,

29 / 71 LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM ou BTLA (também conhecida como CD272), receptores do tipo imunoglobulina de célula exterminadora (KIRs), e CD47. Exemplos específicos de biespecificidade incluem, sem limitação, PD-L1/PD-1, PD- L1/LAG3, PD-L1/TIGIT, e PD-L1/CD47.

[0081] Um “antígeno de tumor” é uma substância antigênica produzida em células de tumor, isto é, ativa uma resposta imune no hospedeiro. Os antígenos de tumor são usados na identificação de células de tumor e são candidatos potenciais para uso na terapia de câncer. As proteínas normais no corpo não são antigênicas. Certas proteínas, entretanto, são produzidas ou superexpressas durante a tumorigênese e, assim, parecem “estranhas” ao corpo. Estas podem incluir proteínas normais que são bem sequestradas a partir do sistema imune, proteínas que são normalmente produzidas em quantidades extremamente pequenas, proteínas que são normalmente produzidas apenas em certos estágios de desenvolvimento, ou proteínas cuja estrutura é modificada em virtude da mutação.

[0082] Uma abundância de antígenos de tumor é conhecida na técnica e novos antígenos de tumor podem ser facilmente identificados por triagem. Exemplos não limitantes de antígenos de tumor incluem EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, CIX, PSMA, proteína de ligação ao folato, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, Integrina, αVβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP e Tenascina.

[0083] As moléculas bifuncionais que incluem não apenas anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno também são providas. Como uma molécula que alveja antígeno de tumor, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno específico de PD-L1, tais como aqueles aqui descritos, pode ser combinado com uma citocina imune ou ligante, opcionalmente por meio de um ligador peptídico. As citocinas imunes ligadas ou ligantes incluem, mas

30 / 71 sem limitação, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT e GITRL. Tais moléculas bifuncionais podem combinar o efeito de bloqueio do ponto de controle imune com modulação imune local do sítio do tumor. Polinucleotídeos que Codificam os Anticorpos e Métodos para Preparar os Anticorpos

[0084] A presente descrição também provê polinucleotídeos isolados ou moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos, variações ou derivações dos mesmos da descrição. Os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar a cadeia pesada completa e regiões variáveis leves dos peptídeos de ligação de antígeno, variações ou derivações dos mesmos na mesma molécula de polinucleotídeo, ou em moléculas separadas de polinucleotídeo. Adicionalmente, os polinucleotídeos da presente descrição podem codificar porções das regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos peptídeos de ligação de antígeno, variações ou derivações dos mesmos, na mesma molécula de polinucleotídeo ou em moléculas separadas de polinucleotídeo.

[0085] Os métodos de preparar anticorpos são bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Em certas modalidades, tanto as regiões variáveis quanto constantes dos peptídeos de ligação de antígeno da presente descrição são completamente humanas. Os anticorpos completamente humanos podem ser preparados usando técnicas descritas na tecnologia, e da maneira aqui descrita. Por exemplo, anticorpos completamente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados administrando o antígeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados. As técnicas exemplares que podem ser usadas para preparar tais anticorpos são descritas nas patentes U.S.: 6.150.584; 6.458.592; 6.420.140 que são incorporadas pela referência na sua íntegra.

31 / 71

[0086] Em certas modalidades, os anticorpos preparados não provocarão uma resposta imune prejudicial no animal a ser tratado, por exemplo, em um humano. Em uma modalidade, peptídeos de ligação de antígeno, variações, ou derivações dos mesmos da descrição são modificados para reduzir sua imunogenicidade usando técnicas reconhecidas na tecnologia. Por exemplo, os anticorpos podem ser anticorpos humanizados, primatizados, desimunizados ou quiméricos podem ser preparados. Estes tipos de anticorpos são derivados de um anticorpo não humano, tipicamente um anticorpo de murino ou primata, que mantém ou mantém substancialmente as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo parental, mas que é menos imunogênico em humanos. Isto pode ser atingido por vários métodos, incluindo (a) enxertar os domínios variáveis completos não humanos em regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos; (b) enxertar pelo menos uma parte de uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) não humana em uma das regiões de estrutura e constante de humano, com ou sem retenção de resíduos de estrutura importantes; ou (c) transplantar os domínios variáveis não humanos inteiros, mas “camuflar” os mesmos com uma seção do tipo humana pela substituição de resíduos de superfície. Tais métodos são descritos em Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), e patentes U.S.: 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e

6.190.370, todos os quais são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

[0087] A desimunização também pode ser usada para diminuir a imunogenicidade de um anticorpo. Da maneira aqui usada, o termo “desimunização” inclui alteração de um anticorpo para modificar epítopos de célula T (vide, por exemplo, pedidos de publicação internacional:

32 / 71 WO/9852976 A1 e WO/0034317 A2). Por exemplo, as sequências variáveis de cadeia pesada e variáveis de cadeia leve do anticorpo inicial são analisadas, e um epítopo de célula T de humano “map” de cada região V, que mostra o local de epítopos em relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e outros resíduos chaves na sequência, é criado. Os epítopos de célula T individuais do epítopo de célula T map são analisados, a fim de identificar substituições alternativas de aminoácido com um baixo risco de alteração de atividade do anticorpo final. Uma faixa de sequências alternativas variáveis pesadas e variáveis leves é determinada, compreendendo combinações de substituições aminoácido, e estas sequências são subsequentemente incorporadas em uma faixa de polipeptídeos de ligação. Tipicamente, entre 12 e 24 anticorpos de variação são gerados e testados em relação à ligação e/ou função. Os genes completos de cadeia pesada e leve, compreendendo regiões variáveis modificadas e constantes humanas, são então clonados em vetores de expressão e os plasmídeos subsequentes são introduzidos nas linhagens celulares para a produção de anticorpo completo. Os anticorpos são então comparados em ensaios bioquímicos e biológicos apropriados, e a variação ideal é identificada.

[0088] A especificidade de ligação de peptídeos de ligação de antígeno da presente descrição pode ser determinada por ensaios in vitro, tais como imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

[0089] Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de unidades de cadeia única (patente U.S. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 55:5879- 5883 (1988); e Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir unidades de cadeia única da presente descrição. As unidades de cadeia única são formadas pela ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv por meio de uma ponte de aminoácido, resultando em um

33 / 71 peptídeo de fusão de cadeia única. As técnicas para a montagem de fragmentos FV funcionais em E. coli também podem ser usadas (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)).

[0090] Exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única (scFvs) e anticorpos incluem aquelas descritas nas patentes U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. Estados Unidos 90:1995-1999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algumas utilizações, incluindo o uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de espécies de animal diferente, tal como anticorpos com uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina de humano. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); patentes U.S.

5.807.715; 4.816.567 e 4.816.397, que são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.

[0091] Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo derivadas de um anticorpo de espécie não humana, que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir da espécie não humana, e regiões de estrutura de uma molécula de imunoglobulina de humano. Frequentemente, resíduos de estrutura nas regiões de estrutura de humano serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente melhorar, a ligação ao antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por modelação das interações da CDR e resíduos de estrutura para identificar

34 / 71 resíduos de estrutura importantes para ligação de antígeno, e comparação de sequência para identificar resíduos de estrutura incomuns em posições particulares. (Vide, por exemplo, Queen et al., patente U.S. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que é aqui incorporada pela referência na sua íntegra). Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na tecnologia incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; patentes U.S.

5.225.539; 5.530.101 e 5.585.089), revestimento ou recapeamento (EP

592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. Estados Unidos 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeia (patente U.S. 5.565.332, que é incorporada pela referência na sua íntegra).

[0092] Os anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Os anticorpos de humanos podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fago usando bibliotecas de anticorpo derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Vide também, patentes U.S. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada uma das quais é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.

[0093] Anticorpos de humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulina humana de cadeia pesada e leve podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células do tronco embrionário de camundongo. Alternativamente, a região variável humana, região constante, a região de

35 / 71 diversidade podem ser introduzidas em células tronco embrionárias de camundongo, além dos genes de cadeia pesada e leve de humano. Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem se tornar não funcionais separadamente, ou simultaneamente, com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Em particular, a eliminação homozigota da região JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são então cruzados para produzir descendência homozigótica que expressa anticorpos de humano. Os camundongos transgênicos são imunizados da maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, toda ou uma porção de um polipeptídeo alvo desejado. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir dos camundongos transgênicos imunizados usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana carregados pelos camundongos transgênicos se reorganizam durante a diferenciação de célula B, e subsequentemente se submetem à alteração de classe e mutação somática. Assim, usando uma técnica como esta, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente usados. Para uma visão geral desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, vide Lonberg e Huszar Int. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos, e protocolos para produzir tais anticorpos, vide, por exemplo, publicações PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; patentes U.S.

5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318 e 5.939.598, que são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra. Além disso, companhias tais como Abgenix, Inc. (Freemont, Califórnia) e GenPharm (San Jose, Califórnia) pode ser acionada para prover anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado, usando tecnologia

36 / 71 similar àquela descrita anteriormente.

[0094] Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado também podem ser gerados usando uma técnica referida como “seleção guiada”. Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). Vide também, patente U.S. 5.565.332, que é incorporado pela referência na sua íntegra).

[0095] Em uma outra modalidade, DNA que codifica anticorpos monoclonais desejados pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma isoladas e subclonadas funcionam como uma fonte preferida de tal DNA. Um vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, os quais são então transfectados em células hospedeiras de procarioto ou eucarioto, tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de Hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra forma não produzem imunoglobulinas. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser sintético, da maneira aqui descrita) pode ser usado para clonar sequências de região constante e variável para a produção de anticorpos, da maneira descrita em Newman et al., patente U.S. 5.658.570, depositada em 25 de janeiro de 1995, que é aqui incorporada pela referência. Essencialmente, isto implica na extração de RNA a partir das células selecionadas, conversão em DNAc, e amplificação por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores específicos de Ig. Os oligonucleotídeos iniciadores adequados para este propósito também são descritos na patente U.S. 5.658.570. Como será discutido em mais detalhes a seguir, as células transformadas que expressam o

37 / 71 anticorpo desejado podem ser crescidas em quantidades relativamente grandes para prover fornecimento clínico e comercial da imunoglobulina.

[0096] Adicionalmente, usando técnicas de DNA recombinante de rotina, uma ou mais das CDRs dos peptídeos de ligação de antígeno da presente descrição podem ser inseridas nas regiões de estrutura, por exemplo, em regiões de estrutura de humano para humanizar um anticorpo não humano. As regiões de estrutura podem ser de ocorrência natural ou regiões de estrutura consensuais e, preferivelmente, regiões de estrutura de humano (vide, por exemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) para uma listagem de regiões de estrutura de humano). Preferivelmente, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e CDRs codifica um anticorpo que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de um polipeptídeo desejado, por exemplo, LIGHT. Preferivelmente, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser realizadas nas regiões de estrutura e, preferivelmente, as substituições de aminoácido melhoram a ligação do anticorpo ao seu antígeno. Adicionalmente, tais métodos podem ser usados para realizar substituições ou eliminações de aminoácido de um ou mais resíduos de região variável de cisteínas, os quais participam de uma ligação dissulfeto intra-cadeias, para gerar moléculas de anticorpo que não apresentam uma ou mais pontes dissulfeto intra-cadeias. Outras alterações no polinucleotídeo são incluídas pela presente descrição e são conhecidas pelos versados na técnica.

[0097] Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos” (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) emendando genes de uma molécula de anticorpo de camundongo, de especificidade antigênica apropriada, junto com genes de uma molécula de anticorpo de humano de atividade biológica apropriada, podem ser usadas. Da maneira aqui usada, um

38 / 71 anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de diferentes espécies de animal, tal como aquele com uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina de humano.

[0098] Ainda outros meios altamente eficientes para gerar anticorpos recombinantes são descritos por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). Especificamente, esta técnica resulta na geração de anticorpos primatizados que contêm domínios variáveis de macaco e sequências constantes de humanos. Esta referência é aqui incorporada pela referência na sua íntegra. Além do mais, esta técnica também é descrita em patentes comumente atribuídas U.S. 5.658.570, 5.693.780 e 5.756.096, cada uma das quais sendo aqui incorporada pela referência.

[0099] Alternativamente, as linhagens de célula que produz anticorpo podem ser selecionadas e cultivadas usando técnicas bem conhecidas pelos versados na técnica. Tais técnicas são descritas em uma variedade de manuais de laboratório e publicações principais. Em relação à isso, técnicas adequadas para uso na descrição, da maneira descrita a seguir, são descritas em Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1991) que é aqui incorporado pela referência na sua íntegra, incluindo os anexos.

[00100] Adicionalmente, técnicas padrões conhecidas pelos versados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo da presente descrição incluindo, mas sem limitação, mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácido. Preferivelmente, as variações (incluindo derivações) codificam menos de 50 substituições de aminoácido, menos de 40 substituições de aminoácido, menos de 30 substituições de aminoácido, menos de 25 substituições de aminoácido, menos de 20 substituições de aminoácido, menos de 15 substituições de aminoácido,

39 / 71 menos de 10 substituições de aminoácido, menos de 5 substituições de aminoácido, menos de 4 substituições de aminoácido, menos de 3 substituições de aminoácido, ou menos de 2 substituições de aminoácido com relação à região pesada de cadeia variável de referência, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, região leve de cadeia variável, CDR-L1, CDR-L2, ou CDR-L3. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificante, tal como por mutagênese por saturação, e os mutantes resultantes podem ser selecionados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que mantêm atividade.

[00101] A presente descrição também provê composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade eficiente de um anticorpo, e um carreador aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui adicionalmente um segundo agente anti-câncer (por exemplo, um inibidor de ponto de controle imune).

[00102] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência de regulamentação do Governo Federal ou Estadual, ou listado na Farmacopéia dos Estados Unidos ou outra Farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. Adicionalmente, um “carreador farmaceuticamente aceitável” em geral será um sólido não tóxico, carga semi- sólida ou líquida, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo.

[00103] O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções de salina e

40 / 71 soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cal, sílica gel, estearato de sódio, glicerol monoestearato, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejada, também pode conter menores quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento de pH tais como acetatos, citratos ou fosfatos. Agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetra-acético; e agentes para o ajuste de tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose também são previstos. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação contínua e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e carreadores tradicionais tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreadores padrões tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de carreadores adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin, aqui incorporado pela referência. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficiente do peptídeo de ligação de antígeno, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade adequada de carreador, de maneira a prover a forma para administração adequada ao paciente. A formulação pode se adequar ao modo de administração. A preparação parental pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla constituídos de vidro ou plástico.

[00104] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo

41 / 71 com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa em seres humanos. Tipicamente, composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar a dor no sítio da injeção. Em geral, os ingredientes são fornecidos tanto separadamente quanto misturados juntos na forma de dosagem única, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado sem água, em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição deve ser administrada por infusão, esta pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água ou salina estéril para injeção pode ser provida, de maneira tal que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00105] Os compostos da descrição podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions, tais como aqueles derivados de ácidos clorídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., e aqueles formados com cátions, tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

EXEMPLOS Exemplo 1: Análise de Interação de Interface de Cκ/CH1 de Quatro Fragmentos Fab

[00106] Este exemplo analisou alguns fragmentos Fab de anticorpo com relação às suas interações de interface de Cκ/CH1. Estrutura 1: Análise de interação de interface para Cĸ e CH1 de Fab 1F8

[00107] 1F8 é uma molécula Fab preparada a partir de um anticorpo

42 / 71 específico para CD47 de humano. A estrutura cristalina complexa de CD47 com anti-CD47 Fab 1F8 foi realizada em uma resolução de 3,1A em 2017 (a cadeia leve apresentou 219 aminoácidos, onde o Cĸ incluiu aminoácidos 114- 219; a cadeia pesada apresentou 220 aminoácidos, onde o CH incluiu aminoácidos119-220).

[00108] Na interface entre os domínios Cĸ e CH1 deste fragmento Fab existe um total de 32 resíduos a partir do domínio CH, e 35 resíduos a partir do domínio Cĸ. 1F8 apresenta resíduos contínuos entre Ser14 e Gly20 no domínio CH. Existe mais uma ligação de hidrogênio formada entre o átomo de oxigênio da cadeia principal Lys16 a partir do fragmento CH, e resíduo Lys100 a partir do fragmento Cĸ, comparado ao 4NYL (vide estrutura 4 a seguir). As interações hidrofóbicas são similares às outras estruturas, da maneira observada a seguir. Ligações de hidrogênio (corte de distância: 3,5 Å) Cĸ CH1 Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 16 LYS O 100 LYS NZ 3,4 30 LYS NZ 24 SER OG 2,7 51 HIS ND1 30 ASN OD1 3,3 54 PRO O 55 SER OG 2,7 57 LEU O 53 GLN NE2 3,4 102 SER OG 106 GLU O 2,6 Notas:

1. HD entre CH-Lys30 e Ser24 pode ser formado nas outras três estruturas, contanto que NZ de Lys30 seja girado.

2. HDs extras entre CH-Lys16/CK-Lys100 e CH-Ser102/CK-Glu106 são formados em decorrência da diferença na sequência, sem ser 3 pdbs.

Pontes salinas entre Cĸ e CH1 de 1F8 CH1 Cĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 96 LYS NZ 16 GLU OE2 3,1 101 LYS NZ 15 ASP OD2 3,8 Interface hidrofóbica CH1 Cĸ Notas Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 GLN Sanduíche, mais como Van der Waals 11 LEU 11, 26 PHE, VAL 12 ALA 11 PHE 24 ALA 9, 11 PHE 53 PHE 28, 68, 69 LEU, LEU, SER 68 VAL 28 LEU * Contatos hidrofóbicos envolvidos em ligações de hidrogênio e ligações de sal também são excluídos nesta tabela

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[00109] Análise de desvio de energia livre identificou que alguns resíduos em 1F8 CH1 apresentaram interações mais fortes com resíduos Cĸ (vide os primeiros 10 resíduos na tabela a seguir, em negrito). Resíduos de interface em 1F8 CH1: Posição Resíduo Ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 53 PHE 104,91 102,42 1,64 1,64 9 PHE 95,13 73,47 1,18 1,18 11 LEU 63,14 60,63 0,97 0,97 56 VAL 97,59 60,26 0,96 0,96 30 LYS H 74,1 57,96 -0,85 0,85 96 LYS S 71,12 24,42 -0,71 0,71 28 LEU 48,35 42,65 0,68 0,68 24 ALA 41,8 41,64 0,62 0,62 68 VAL 41,46 36,31 0,58 0,58 54 PRO H 118,8 51,46 0,53 0,53 16 LYS H 190,06 97,08 0,44 0,44 19 SER 87,49 29,98 0,37 0,37 10 PRO 67,03 38,95 0,23 0,23 70 THR H 74,01 32,39 -0,16 0,16 57 LEU H 101,62 7,97 -0,09 0,09 51 HIS H 125,59 86,42 0,08 0,08 58 GLN 49,39 19,38 0,08 0,08 17 SER H 44,25 44,25 0,06 0,06 18 THR H 54,47 19,11 -0,06 0,06 22 THR 61,97 7,01 -0,06 0,06 12 ALA 72,88 29,29 0,05 0,05 66 SER 30,01 25,56 -0,05 0,05 52 THR 60,18 4,28 -0,04 0,04 59 SER 129,9 3,35 -0,04 0,04 25 LEU 3,79 2,96 0,04 0,04 23 ALA 2,05 1,88 0,03 0,03 8 VAL 11,3 1,81 -0,02 0,02 65 LEU 13,88 1,01 0,02 0,02 14 SER 52,86 6,52 -0,01 0,01 15 SER 98,56 0,61 -0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

[00110] No domínio Cĸ, sete resíduos estão provavelmente envolvidos nas interações. Resíduos de interface em 1F8 Cĸ: Posição Resíduo Ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 11 PHE 103,34 103,03 1,65 1,65 9 PHE 85,86 83,98 1,34 1,34 100 LYS H 86,5 41,41 -1,06 1,06

44 / 71 57 THR 76,88 61,43 0,93 0,93 28 LEU 47,22 45,38 0,73 0,73 26 VAL 42,67 42,67 0,68 0,68 53 GLN H 153,38 81,8 -0,65 0,65 14 SER 63,01 48,31 0,47 0,47 30 ASN H 46,04 36,92 -0,44 0,44 102 PHE 43,9 22,09 0,35 0,35 12 PRO 78,85 40,42 0,31 0,31 16 GLU S 132,97 48,56 -0,31 0,31 101 SER 64,98 27,71 -0,31 0,31 31 ASN 71,04 16,15 -0,25 0,25 73 THR H 78,11 22,7 0,18 0,18 17 GLN 46,63 45,77 0,17 0,17 60 ASP 67,72 10,4 0,14 0,14 67 SER 21,05 20,24 0,13 0,13 69 SER 30,67 27,47 0,13 0,13 7 SER 56,42 8,61 0,12 0,12 54 GLU 92,77 11,21 -0,11 0,11 56 VAL 43,54 12,76 -0,1 0,1 71 THR 39,29 14,82 0,09 0,09 10 ILE H 28,88 27,62 -0,07 0,07 58 GLU 156,59 7,29 0,05 0,05 55 SER H 73,31 57,53 -0,04 0,04 24 SER H 30,01 29,28 0,03 0,03 8 VAL 9,41 1,5 -0,02 0,02 68 LEU 7,95 1,41 0,02 0,02 20 SER 98,75 8,4 -0,01 0,01 22 THR 59,56 11,35 -0,01 0,01 103 ASN 47,6 0,87 -0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

Estrutura 2: Análise de interação de interface para Cĸ e CH1 de 1CZ8

[00111] 1CZ8 (PDB ID 1CZ8) é uma molécula Fab preparada a partir de um anticorpo específico para VEGF. A estrutura cristalina complexa do VEGF e do Fab foi realizada em uma resolução de 2,4 A no ano 2000.

[00112] Os resíduos de aminoácido formaram três folhas beta antiparalelas no domínio CH e quatro folhas beta antiparalelas no domínio Cκ. Estas folhas beta formaram uma conformação face-a-face na interface. Na interface entre os domínios Cκ e CH1 deste fragmento Fab, existem no total 28 resíduos do domínio de CH e 30 resíduos de Cκ. Existem três ligações de hidrogênio entre os domínios Cκ e CH1. Por exemplo, em 1CZ8, resíduo de

45 / 71 CH His 51 e átomos de oxigênio da cadeia principal de Pro54 e Leu57 formaram estas três ligações de hidrogênio com resíduos de Cĸ Asn31, Ser55 e Gln53, respectivamente. Estas ligações de hidrogênio são localizadas em um lado da interface.

[00113] As interações hidrofóbicas são localizadas principalmente no lado central e no outro lado da interface, entre os resíduos de CH Phe9, Leu11, Phe53, Val68, e os resíduos de Cκ Gln17, Phe11, Val26, Phe69 e Val28. Duas pontes salinas foram formadas entre a terminação C dos resíduos de CH Lys96 e Lys101, e resíduo de Cκ Asp15 e Glu16 para estabilizar a estrutura complexa de CH e Cκ no outro lado da interface (FIGURA 1; resíduos envolvidos na ligação de hidrogênio coloridos de rosa; ponte salina em amarelo; resíduos de interação hidrofóbica são bastões coloridos de azul ou verde). Ligações de hidrogênio (corte de distância: 3,5 Å) CH1 Cκ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 51 HIS NE2 31 ASN OD1 2,86 54 PRO O 55 SER OG 2,6 57 LEU O 53 GLN NE2 2,9 Ligação de hidrogênio mediada por água 10 PRO O 12 PRO O 58 GLN OE1 24 SER OG 54 PRO O 71 THR OG1 Pontes salinas entre CH e Cκ CH1 Cκ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 96 LYS NZ 16 GLU* OE1 3,0 101 LYS NZ 15 ASP* OD1 2,8 Interface hidrofóbica (corte de distância: 4Å) CH1 Cκ Notas Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 Gln 11 LEU 11, 26 PHE, VAL 4A de Leu15 átomo de Ca 12 ALA 11 PHE 24 ALA 11 PHE Deslocado 53 PHE 28, 69 LEU, SER Sanduíche 68 VAL 28 LEU Sanduíche 5 resíduos principais de interface importantes para interação Cκ e CH1 CH1 Cκ Posição Resíduo Posição Resíduo 51 HIS 31 ASN 57 LEU 53 GLN

46 / 71 CH1 Cκ Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 GLN 53 PHE 69 SER 11 LEU 11,26 PHE, VAL Nota: Resíduos de ponte salina são excluídos

[00114] A análise de desvio de energia livre identificou alguns resíduos em CH1 1cz8 apresentando interações mais fortes com resíduos Cκ (vide os primeiros 9 resíduos na tabela a seguir, em negrito). Resíduos de interface: CH1 1cz8 Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 53 PHE 103,02 99,71 1,6 1,6 9 PHE 96,3 77,27 1,24 1,24 11 LEU 64,71 61,37 0,98 0,98 56 VAL 93,45 56,39 0,9 0,9 28 LEU 48,79 44,61 0,71 0,71 51 HIS H 114,24 93,31 0,68 0,68 54 PRO H 120,4 53,11 0,59 0,59 68 VAL 35,98 34,81 0,56 0,56 24 ALA 53,89 51,35 0,55 0,55 70 THR 64,58 33,59 0,43 0,43 96 LYS S 63,68 16,19 -0,39 0,39 101 LYS S 231,91 46,46 -0,39 0,39 30 LYS 62,59 47,59 0,29 0,29 10 PRO 66,28 37,49 0,26 0,26 12 ALA 47,32 20,55 -0,2 0,2 57 LEU H 101,85 12,03 -0,14 0,14 66 SER 28,08 23,48 0,13 0,13 58 GLN 41,61 13,28 0,11 0,11 8 VAL 16,24 6,24 -0,07 0,07 25 LEU 3,82 3,49 0,06 0,06 23 ALA 14,88 3,31 0,05 0,05 59 SER 132,12 3,5 -0,04 0,04 52 THR 59,64 4,29 -0,03 0,03 22 THR 97,5 16,73 0,02 0,02 64 SER 11,46 1,84 -0,02 0,02 13 PRO 5,85 0,5 0,01 0,01 14 SER 149,42 0,94 0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

[00115] No domínio Cĸ, cinco resíduos estão provavelmente envolvidos nas interações. Resíduos de interface: Cĸ 1cz8

47 / 71 Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 11 PHE 100,45 95,29 1,52 1,52 9 PHE 99,99 59,32 0,95 0,95 28 LEU 48,88 48,38 0,77 0,77 26 VAL 46,36 45,71 0,73 0,73 53 GLN H 152,03 80,54 -0,63 0,63 14 SER 62,19 48,96 0,49 0,49 30 ASN 45,99 39,43 -0,49 0,49 16 GLU S 133,88 61,31 -0,46 0,46 15 ASP S 118,39 37,99 -0,36 0,36 69 SER 37,96 30,45 0,3 0,3 31 ASN H 71 17,38 -0,27 0,27 67 SER 20,55 20,55 0,18 0,18 17 GLN 55,44 53,37 0,16 0,16 56 VAL 64,32 17,9 -0,14 0,14 71 THR 44,12 16,45 0,12 0,12 60 ASP 61,58 15,19 -0,11 0,11 54 GLU 92,25 12,17 -0,1 0,1 22 THR 65,41 8,27 0,07 0,07 57 THR 59,04 44,28 -0,07 0,07 68 LEU 7,25 2,72 0,04 0,04 20 SER 84,08 5,75 -0,02 0,02 58 GLU 146,27 4,53 0,02 0,02 10 ILE 25,87 0,86 -0,01 0,01 13 PRO 12,65 1,66 -0,01 0,01 24 SER 31,09 30,1 0,01 0,01 55 SER H 71,35 56,44 -0,01 0,01 73 THR 81,21 12,51 -0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

Estrutura 3: Análise de interação de interface para Cĸ e CH1 de 1L7I

[00116] 1L7I é uma molécula Fab conhecida (PDB ID: 1L7I) que alveja ErbB2. A estrutura cristalina deste Fab2C4 anti-ErbB2 foi resolvida em 1,8A no ano de 2002.

[00117] Na interface entre o domínio Cĸ e CH1 deste fragmento Fab (PDB ID 1L7i), existe um total de 33 resíduos do domínio CH e 35 resíduos de Cĸ.

[00118] Ligações de hidrogênio de 1L7i (corte de distância: 3,5 Å) Cĸ CH1 Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 16 LYS O 10 ILE N 3,16

48 / 71 Cĸ CH1 Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 16 LYS NZ 101 SER O 2,99 51 HIS ND1 31 ASN OD1 3,2 54 PRO O 55 SER OG 2,7 57 LEU O 53 GLN NE2 2,9 ligação de hidrogênio mediada por água 10 PRO O 12 PRO O 12 ALA O 10 ILE O 54 PRO O 71 THR OG1 Pontes salinas entre CK e CH de 1L7i CH1 Cĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 96 LYS NZ 16 GLU OE1, OE2 3,4-2,7 Nota: Os resíduos C-terminais Cys 103 de CH e Cys 107 de CK formaram uma ponte dissulfeto que quebra a ponte salina entre resíduo de CH Lys101 e resíduo de Ck Asp15, que foi observada em outras estruturas.

Interface hidrofóbica de 1L7i Cĸ CH1 Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 16 LYS O 100 LYS NZ 3,4 30 LYS NZ 24 SER OG 2,7 51 HIS ND1 30 ASN OD1 3,3 54 PRO O 55 SER OG 2,7 57 LEU O 53 GLN NE2 3,4 102 SER OG 106 GLU O 2,6

[00119] A análise de desvio de energia livre identificou alguns resíduos em CH1 1L7i com interações mais fortes com resíduos de Cĸ (vide os primeiros 12 resíduos na tabela a seguir, em negrito). Resíduos de interface: CH1 1L7i Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 103 CYS 113,02 79,88 2,31 2,31 53 PHE 104,25 101,74 1,63 1,63 9 PHE 99,04 80,13 1,28 1,28 101 LYS S 141,67 60,98 -1,2 1,2 56 VAL 92,31 59,34 0,95 0,95 11 LEU 61,26 57,09 0,91 0,91 54 PRO H 116,04 53,67 0,73 0,73 28 LEU 50,04 45,19 0,72 0,72 17 SER 37,12 37,12 0,55 0,55 68 VAL 34,63 33,97 0,54 0,54 24 ALA 33,93 33,93 0,52 0,52 96 LYS S 69,62 16,57 -0,52 0,52 70 THR 59,2 34,05 0,42 0,42 10 PRO 57,58 41,55 0,33 0,33 30 LYS 64,74 49,18 0,29 0,29 58 GLN 48,94 23,52 0,26 0,26 16 LYS H 154,48 98,09 0,21 0,21 12 ALA 37,27 23,91 -0,17 0,17 66 SER 26,68 23,26 0,14 0,14 22 THR 61,32 9,4 0,13 0,13

49 / 71 Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 102 SER 106,39 12,64 -0,12 0,12 57 LEU 109,6 10,1 -0,11 0,11 18 THR 47,02 7,72 -0,09 0,09 19 SER 89,59 40,33 -0,07 0,07 25 LEU 4,95 4,61 0,07 0,07 15 SER 83,74 3,93 -0,04 0,04 14 SER 15,02 4,4 -0,03 0,03 51 HIS 111,16 79,43 0,02 0,02 52 THR 62,51 3,83 -0,02 0,02 23 ALA 0,33 0,33 0,01 0,01 59 SER 127,52 1,31 -0,01 0,01 64 SER 9,13 0,61 -0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

[00120] No domínio Cĸ, nove resíduos estão provavelmente envolvidos nas interações. Resíduos de interface: Cĸ 1L7i Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 11 PHE 105,85 105,73 1,68 1,68 9 PHE 89,04 88,03 1,41 1,41 100 LYS H 85,84 42,05 -1,08 1,08 57 THR 74,5 58,15 0,89 0,89 107 CYS S 101,84 64,95 0,89 0,89 28 LEU 48,03 47,86 0,77 0,77 26 VAL 44,53 44,19 0,71 0,71 53 GLN 151,85 79,95 -0,58 0,58 12 PRO 56,22 48,12 0,54 0,54 30 ASN 43,79 36,72 -0,44 0,44 16 GLU S 108,76 56,23 -0,4 0,4 14 SER 53,87 41,73 0,39 0,39 69 SER 41 33,43 0,33 0,33 31 ASN 78,35 17,4 -0,27 0,27 101 SER 57,64 22,68 -0,26 0,26 102 PHE 21,99 16,51 0,26 0,26 73 THR 63,23 17,38 0,15 0,15 60 ASP 61,68 11,2 -0,14 0,14 7 SER 48,66 8,03 0,13 0,13 67 SER 16,14 16,14 0,13 0,13 56 VAL 37,56 12,43 -0,12 0,12 106 GLU 136 18,91 -0,12 0,12 55 SER H 69,61 59,4 0,11 0,11 13 PRO 14,76 6,87 -0,08 0,08 17 GLN 49,85 48,28 0,08 0,08 24 SER 24,37 22,04 0,08 0,08 54 GLU 96,84 10,59 -0,07 0,07

50 / 71 Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 8 VAL 15,41 5,63 -0,06 0,06 71 THR 41,6 14,33 0,06 0,06 58 GLU 156,39 9,76 0,04 0,04 10 ILE H 31,71 31,59 0,03 0,03 15 ASP 107,21 9,87 0,03 0,03 68 LEU 4,61 1,93 0,03 0,03 22 THR 52,89 8,19 0,02 0,02 20 SER 84,54 13,16 0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

Estrutura 4: Análise de interação de interface para Cĸ e CH1 de 4NYL

[00121] A quarta estrutura estudada foi 4NYL, uma molécula Fab conhecida (PDB ID: 4NYL), que alveja TNFa. A estrutura cristalina do fragmento FAB adalimumab foi resolvida em 2,8A no ano 2014 (solucionada com um R livre relativamente alto (R livre=35,8 %/R=27,5), o que significa que a estrutura não é adequada para análise detalhada). Adalimumab é anticorpo contra TNFa, usado para tratar pacientes com artrite reumatoide, artrite psoriática e espondilite anquilosante, e crianças com artrite idiopática juvenil. Na interface entre domínio Cĸ e CH1 de fragmento Fab de adalimumab (PDB ID 4NYL), existe um total de 24 resíduos de domínio CH1 e 28 resíduos de CK.

[00122] 4NYL apresenta a mesma ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica como aquela em 1CZ8. Em virtude da ausência de resíduos Ch, apenas uma ponte salina foi formada entre a terminação C de resíduo de CH Lys96 e resíduo de CK Glu15. Ligações de hidrogênio de 4NYL (corte de distância: 3,5 Å) CH1 Cĸ+Vĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 51 HIS NE2 30 ASN OD1 3,22 54 PRO O 55 SER OG 2,7 57 LEU O 53 GLN OE1 2,97 Nota: em virtude do limite da resolução, nenhuma das ligações de hidrogênio medidadas por água são encontradas.

51 / 71 Pontes salinas entre CK e CH de 4NYL CH1 Cĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 96 LYS NZ 16 GLU OE1, OE2 3,4-2,7 Nota: Uma vez que 4NYL apresenta ausência de resíduos 100-103 C-terminais, assim a ponte salina entre CH-Lys101 e CK-Asp15 está ausente.

Interface hidrofóbica de 4NYL CH1 Cĸ Notas Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 GLN Sanduíche 11 LEU 11, 26 PHE, VAL Sanduíche 12 ALA 11 PHE Deslocamento 24 ALA 9,11,28 PHE, LEU, LEU Sanduíche 68 VAL 28 LEU Sanduíche

[00123] A análise de desvio de energia livre identificou alguns resíduos em 4NYL CH1 com interações mais fortes com resíduos Cĸ (vide os primeiros nove resíduos na tabela a seguir, em negrito). Resíduos de interface: 4NYL CH1 Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 53 PHE 96,83 95,9 1,53 1,53 9 PHE 97,57 74,98 1,2 1,2 11 LEU 67,89 65,22 1,04 1,04 56 VAL 102,16 64,24 1,03 1,03 28 LEU 56,92 51,23 0,82 0,82 54 PRO H 117,72 48,38 0,65 0,65 68 VAL 38,86 38,35 0,61 0,61 24 ALA 56,65 54,38 0,59 0,59 51 HIS H 109,04 76,51 0,54 0,54 70 THR 65,96 30,78 0,47 0,47 12 ALA 65,59 34,43 -0,27 0,27 10 PRO 58,21 35,55 0,21 0,21 96 LYS 71,02 8,03 0,13 0,13 13 PRO 110,53 7,16 0,11 0,11 58 GLN 45,51 21,8 0,11 0,11 52 THR 68,63 7,32 -0,08 0,08 57 LEU H 105,07 6,99 -0,08 0,08 25 LEU 10,31 4,61 0,07 0,07 66 SER 27,04 21,25 0,07 0,07 23 ALA 20,19 3,62 0,06 0,06 22 THR 99,8 17,73 0,04 0,04 59 SER 129,22 4,43 -0,04 0,04 30 LYS 68,02 48,93 -0,03 0,03 64 SER 15,79 1,32 -0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

52 / 71

[00124] No domínio Cĸ, sete resíduos estão provavelmente envolvidos nas interações. Resíduos de interface: 4NYL Cĸ Posição Resíduo ligação ASA BSA DeltaG Abs de DeltaG 11 PHE 94,4 92,85 1,49 1,49 9 PHE 98,42 57,04 0,91 0,91 28 LEU 53,03 53,03 0,85 0,85 57 THR 77,07 52,33 0,81 0,81 26 VAL 46,03 45,87 0,73 0,73 53 GLN H 146,87 74,61 -0,59 0,59 30 ASN 53,19 42,51 -0,51 0,51 14 SER 73,33 53,83 0,41 0,41 16 GLU 81,87 23,61 0,36 0,36 69 SER 36,91 32,06 0,36 0,36 31 ASN H 68,16 17,44 -0,21 0,21 22 THR 53,37 11,88 0,19 0,19 67 SER 17,29 16,83 0,15 0,15 20 SER 77,72 8,53 0,14 0,14 12 PRO 72,19 25,45 0,12 0,12 56 VAL 66,37 16,66 -0,12 0,12 60 ASP 61,84 6,5 -0,11 0,11 73 THR 69,46 16,93 0,1 0,1 17 GLN 47,27 41,79 0,08 0,08 24 SER 37,71 35,01 0,05 0,05 54 GLU 93,02 10,6 -0,05 0,05 58 GLU 154,24 3,58 0,05 0,05 10 ILE 33,1 3,56 -0,04 0,04 55 SER H 70,17 60,32 0,04 0,04 13 PRO 16,67 1,84 0,03 0,03 68 LEU 7,35 1,92 0,03 0,03 71 THR 45,38 15,86 0,01 0,01 Ligação: tipo de ligação, se formou ligação de hidrogênio ou ponte salina, H: ligação de hidrogênio, S: ponte salina ASA: área de superfície acessível BSA: área de superfície enterrada DeltaG: Mudança de energia, positivo envolve interação mais hidrofóbica, enquanto negativo indica interação mais hidrofílica Abs de DeltaG: Valor absoluto de DeltaG, a tabela é classificada por esta chave. Resíduos (em negrito) com alteração de DeltaG acima de 0,5 podem ser considerados como os resíduos que mais contribuem para estabilizar a proteína.

Análise de interface para CH1_Cĸ de 1cz8, 4nyl, 1l7i, hCD47-1_1F8

[00125] A análise de interface para as quatro estruturas anteriores inclui ponte salina, ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica. Todos os DeltaG foram calculados e os aminoácidos foram classificados por DeltaG. Para esta estrutura, os 10 pares principais foram escolhidos para análise adicional. A análise focou na interação hidrofóbica, independente de outras interações. A seguir, os 5 pares principais foram selecionados como

53 / 71 candidatos principais.

Recodificação de sequência de CH1 Recodificação 1cz8 1l7i 4nyl 1F8 1 ALA ALA 124 ALA 114 ALA 122 ALA 119 2 SER SER 125 SER 115 SER 123 SER 120 3 THR THR 126 THR 116 THR 124 THR 121 4 LYS LYS 127 LYS 117 LYS 125 LYS 122 5 GLY GLY 128 GLY 118 GLY 126 GLY 123 6 PRO PRO 129 PRO 119 PRO 127 PRO 124 7 SER SER 130 SER 120 SER 128 SER 125 8 VAL VAL 131 VAL 121 VAL 129 VAL 126 9 PHE PHE 132 PHE 122 PHE 130 PHE 127 10 PRO PRO 133 PRO 123 PRO 131 PRO 128 11 LEU LEU 134 LEU 124 LEU 132 LEU 129 12 ALA ALA 135 ALA 125 ALA 133 ALA 130 13 PRO PRO 136 PRO 126 PRO 134 PRO 131 14 SER SER 137 SER 127 / SER 132 15 SER / SER 128 / SER 133 16 LYS / LYS 129 / LYS 134 17 SER / SER 130 / SER 135 18 THR / THR 131 / THR 136 19 SER / SER 132 / SER 137 20 GLY / GLY 133 / GLY 138 21 GLY GLY 144 GLY 134 GLY 142 GLY 139 22 THR THR 145 THR 135 THR 143 THR 140 23 ALA ALA 146 ALA 136 ALA 144 ALA 141 24 ALA ALA 147 ALA 137 ALA 145 ALA 142 25 LEU LEU 148 LEU 138 LEU 146 LEU 143 26 GLY GLY 149 GLY 139 GLY 147 GLY 144 27 CYS CYS 150 CYS 140 CYS 148 CYS 145 28 LEU LEU 151 LEU 141 LEU 149 LEU 146 29 VAL VAL 152 VAL 142 VAL 150 VAL 147 30 LYS LYS 153 LYS 143 LYS 151 LYS 148 31 ASP ASP 154 ASP 144 ASP 152 ASP 149 32 TYR TYR 155 TYR 145 TYR 153 TYR 150 33 PHE PHE 156 PHE 146 PHE 154 PHE 151 34 PRO PRO 157 PRO 147 PRO 155 PRO 152 35 GLU GLU 158 GLU 148 GLU 156 GLU 153 36 PRO PRO 159 PRO 149 PRO 157 PRO 154 37 VAL VAL 160 VAL 150 VAL 158 VAL 155 38 THR THR 161 THR 151 THR 159 THR 156 39 VAL VAL 162 VAL 152 VAL 160 VAL 157 40 SER SER 163 SER 153 SER 161 SER 158 41 TRP TRP 164 TRP 154 TRP 162 TRP 159 42 ASN ASN 165 ASN 155 ASN 163 ASN 160 43 SER SER 166 SER 156 SER 164 SER 161 44 GLY GLY 167 GLY 157 GLY 165 GLY 162 45 ALA ALA 168 ALA 158 ALA 166 ALA 163 46 LEU LEU 169 LEU 159 LEU 167 LEU 164 47 THR THR 170 THR 160 THR 168 THR 165 48 SER SER 171 SER 161 SER 169 SER 166 49 GLY GLY 172 GLY 162 GLY 170 GLY 167 50 VAL VAL 173 VAL 163 VAL 171 VAL 168 51 HIS HIS 174 HIS 164 HIS 172 HIS 169 52 THR THR 175 THR 165 THR 173 THR 170 53 PHE PHE 176 PHE 166 PHE 174 PHE 171

54 / 71 Recodificação 1cz8 1l7i 4nyl 1F8 54 PRO PRO 177 PRO 167 PRO 175 PRO 172 55 ALA ALA 178 ALA 168 ALA 176 ALA 173 56 VAL VAL 179 VAL 169 VAL 177 VAL 174 57 LEU LEU 180 LEU 170 LEU 178 LEU 175 58 GLN GLN 181 GLN 171 GLN 179 GLN 176 59 SER SER 182 SER 172 SER 180 SER 177 60 SER SER 183 SER 173 SER 181 SER 178 61 GLY GLY 184 GLY 174 GLY 182 GLY 179 62 LEU LEU 185 LEU 175 LEU 183 LEU 180 63 TYR TYR 186 TYR 176 TYR 184 TYR 181 64 SER SER 187 SER 177 SER 185 SER 182 65 LEU LEU 188 LEU 178 LEU 186 LEU 183 66 SER SER 189 SER 179 SER 187 SER 184 67 SER SER 190 SER 180 SER 188 SER 185 68 VAL VAL 191 VAL 181 VAL 189 VAL 186 69 VAL VAL 192 VAL 182 VAL 190 VAL 187 70 THR THR 193 THR 183 THR 191 THR 188 71 VAL VAL 194 VAL 184 VAL 192 VAL 189 72 PRO PRO 195 PRO 185 PRO 193 PRO 190 73 SER SER 196 SER 186 SER 194 SER 191 74 SER SER 197 SER 187 SER 195 SER 192 75 SER SER 198 SER 188 SER 196 SER 193 76 LEU LEU 199 LEU 189 LEU 197 LEU 194 77 GLY GLY 200 GLY 190 GLY 198 GLY 195 78 THR THR 201 THR 191 THR 199 THR 196 79 GLN GLN 202 GLN 192 GLN 200 GLN 197 80 THR THR 203 THR 193 THR 201 THR 198 81 TYR TYR 204 TYR 194 TYR 202 TYR 199 82 ILE ILE 205 ILE 195 ILE 203 ILE 200 83 CYS CYS 206 CYS 196 CYS 204 CYS 201 84 ASN ASN 207 ASN 197 ASN 205 ASN 202 85 VAL VAL 208 VAL 198 VAL 206 VAL 203 86 ASN ASN 209 ASN 199 ASN 207 ASN 204 87 HIS HIS 210 HIS 200 HIS 208 HIS 205 88 LYS LYS 211 LYS 201 LYS 209 LYS 206 89 PRO PRO 212 PRO 202 PRO 210 PRO 207 90 SER SER 213 SER 203 SER 211 SER 208 91 ASN ASN 214 ASN 204 ASN 212 ASN 209 92 THR THR 215 THR 205 THR 213 THR 210 93 LYS LYS 216 LYS 206 LYS 214 LYS 211 94 VAL VAL 217 VAL 207 VAL 215 VAL 212 95 ASP ASP 218 ASP 208 ASP 216 ASP 213 96 LYS LYS 219 LYS 209 LYS 217 LYS 214 97 LYS LYS 220 LYS 210 LYS 218 LYS 215 98 VAL VAL 221 VAL 211 VAL 219 VAL 216 99 GLU GLU 222 GLU 212 GLU 220 GLU 217 100 PRO PRO 223 PRO 213 PRO 218 101 LYS LYS 224 LYS 214 LYS 219 102 SER SER 215 SER 220 103 CYS CYS 216

Recodificação de sequência de Cĸ Recodificação 1cz8 1l7i 4nyl 1F8 1 ARG ARG 108 ARG 108 ARG 108 ARG 114 2 THR THR 109 THR 109 THR 109 THR 115 3 VAL VAL 110 VAL 110 VAL 110 VAL 116 4 ALA ALA 111 ALA 111 ALA 111 ALA 117

55 / 71 Recodificação 1cz8 1l7i 4nyl 1F8 5 ALA ALA 112 ALA 112 ALA 112 ALA 118 6 PRO PRO 113 PRO 113 PRO 113 PRO 119 7 SER SER 114 SER 114 SER 114 SER 120 8 VAL VAL 115 VAL 115 VAL 115 VAL 121 9 PHE PHE 116 PHE 116 PHE 116 PHE 122 10 ILE ILE 117 ILE 117 ILE 117 ILE 123 11 PHE PHE 118 PHE 118 PHE 118 PHE 124 12 PRO PRO 119 PRO 119 PRO 119 PRO 125 13 PRO PRO 120 PRO 120 PRO 120 PRO 126 14 SER SER 121 SER 121 SER 121 SER 127 15 ASP ASP 122 ASP 122 ASP 122 ASP 128 16 GLU GLU 123 GLU 123 GLU 123 GLU 129 17 GLN GLN 124 GLN 124 GLN 124 GLN 130 18 LEU LEU 125 LEU 125 LEU 125 LEU 131 19 LYS LYS 126 LYS 126 LYS 126 LYS 132 20 SER SER 127 SER 127 SER 127 SER 133 21 GLY GLY 128 GLY 128 GLY 128 GLY 134 22 THR THR 129 THR 129 THR 129 THR 135 23 ALA ALA 130 ALA 130 ALA 130 ALA 136 24 SER SER 131 SER 131 SER 131 SER 137 25 VAL VAL 132 VAL 132 VAL 132 VAL 138 26 VAL VAL 133 VAL 133 VAL 133 VAL 139 27 CYS CYS 134 CYS 134 CYS 134 CYS 140 28 LEU LEU 135 LEU 135 LEU 135 LEU 141 29 LEU LEU 136 LEU 136 LEU 136 LEU 142 30 ASN ASN 137 ASN 137 ASN 137 ASN 143 31 ASN ASN 138 ASN 138 ASN 138 ASN 144 32 PHE PHE 139 PHE 139 PHE 139 PHE 145 33 TYR TYR 140 TYR 140 TYR 140 TYR 146 34 PRO PRO 141 PRO 141 PRO 141 PRO 147 35 ARG ARG 142 ARG 142 ARG 142 ARG 148 36 GLU GLU 143 GLU 143 GLU 143 GLU 149 37 ALA ALA 144 ALA 144 ALA 144 ALA 150 38 LYS LYS 145 LYS 145 LYS 145 LYS 151 39 VAL VAL 146 VAL 146 VAL 146 VAL 152 40 GLN GLN 147 GLN 147 GLN 147 GLN 153 41 TRP TRP 148 TRP 148 TRP 148 TRP 154 42 LYS LYS 149 LYS 149 LYS 149 LYS 155 43 VAL VAL 150 VAL 150 VAL 150 VAL 156 44 ASP ASP 151 ASP 151 ASP 151 ASP 157 45 ASN ASN 152 ASN 152 ASN 152 ASN 158 46 ALA ALA 153 ALA 153 ALA 153 ALA 159 47 LEU LEU 154 LEU 154 LEU 154 LEU 160 48 GLN GLN 155 GLN 155 GLN 155 GLN 161 49 SER SER 156 SER 156 SER 156 SER 162 50 GLY GLY 157 GLY 157 GLY 157 GLY 163 51 ASN ASN 158 ASN 158 ASN 158 ASN 164 52 SER SER 159 SER 159 SER 159 SER 165 53 GLN GLN 160 GLN 160 GLN 160 GLN 166 54 GLU GLU 161 GLU 161 GLU 161 GLU 167 55 SER SER 162 SER 162 SER 162 SER 168 56 VAL VAL 163 VAL 163 VAL 163 VAL 169 57 THR THR 164 THR 164 THR 164 THR 170 58 GLU GLU 165 GLU 165 GLU 165 GLU 171 59 GLN GLN 166 GLN 166 GLN 166 GLN 172 60 ASP ASP 167 ASP 167 ASP 167 ASP 173 61 SER SER 168 SER 168 SER 168 SER 174 62 LYS LYS 169 LYS 169 LYS 169 LYS 175 63 ASP ASP 170 ASP 170 ASP 170 ASP 176 64 SER SER 171 SER 171 SER 171 SER 177

56 / 71 Recodificação 1cz8 1l7i 4nyl 1F8 65 THR THR 172 THR 172 THR 172 THR 178 66 TYR TYR 173 TYR 173 TYR 173 TYR 179 67 SER SER 174 SER 174 SER 174 SER 180 68 LEU LEU 175 LEU 175 LEU 175 LEU 181 69 SER SER 176 SER 176 SER 176 SER 182 70 SER SER 177 SER 177 SER 177 SER 183 71 THR THR 178 THR 178 THR 178 THR 184 72 LEU LEU 179 LEU 179 LEU 179 LEU 185 73 THR THR 180 THR 180 THR 180 THR 186 74 LEU LEU 181 LEU 181 LEU 181 LEU 187 75 SER SER 182 SER 182 SER 182 SER 188 76 LYS LYS 183 LYS 183 LYS 183 LYS 189 77 ALA ALA 184 ALA 184 ALA 184 ALA 190 78 ASP ASP 185 ASP 185 ASP 185 ASP 191 79 TYR TYR 186 TYR 186 TYR 186 TYR 192 80 GLU GLU 187 GLU 187 GLU 187 GLU 193 81 LYS LYS 188 LYS 188 LYS 188 LYS 194 82 HIS HIS 189 HIS 189 HIS 189 HIS 195 83 LYS LYS 190 LYS 190 LYS 190 LYS 196 84 VAL VAL 191 VAL 191 VAL 191 VAL 197 85 TYR TYR 192 TYR 192 TYR 192 TYR 198 86 ALA ALA 193 ALA 193 ALA 193 ALA 199 87 CYS CYS 194 CYS 194 CYS 194 CYS 200 88 GLU GLU 195 GLU 195 GLU 195 GLU 201 89 VAL VAL 196 VAL 196 VAL 196 VAL 202 90 THR THR 197 THR 197 THR 197 THR 203 91 HIS HIS 198 HIS 198 HIS 198 HIS 204 92 GLN GLN 199 GLN 199 GLN 199 GLN 205 93 GLY GLY 200 GLY 200 GLY 200 GLY 206 94 LEU LEU 201 LEU 201 LEU 201 LEU 207 95 SER SER 202 SER 202 SER 202 SER 208 96 SER SER 203 SER 203 SER 203 SER 209 97 PRO PRO 204 PRO 204 PRO 204 PRO 210 98 VAL VAL 205 VAL 205 VAL 205 VAL 211 99 THR THR 206 THR 206 THR 206 THR 212 100 LYS LYS 207 LYS 207 LYS 207 LYS 213 101 SER SER 208 SER 208 SER 208 SER 214 102 PHE PHE 209 PHE 209 PHE 209 PHE 215 103 ASN ASN 210 ASN 210 ASN 210 ASN 216 104 ARG ARG 211 ARG 211 ARG 211 ARG 217 105 GLY GLY 212 GLY 212 GLY 218 106 GLU GLU 213 GLU 213 GLU 219 107 CYS CYS 214

Tabela com resumo dos principais resíduos com energia livre de 1cz8, 4nyl, 1l7i e 1F8 1cz8 4nyl 1l7i 1F8 53 PHE 53 PHE 103 CYS 53 PHE CH1 9 PHE 9 PHE 53 PHE 9 PHE 11 LEU 11 LEU 9 PHE 11 LEU 56 VAL 56 VAL 101 LYS 56 VAL 28 LEU 28 LEU 56 VAL 30 LYS 51 HIS 54 PRO 11 LEU 96 LYS 54 PRO 68 VAL 54 PRO 28 LEU 68 VAL 24 ALA 28 LEU 24 ALA 24 ALA 51 HIS 17 SER 68 VAL 68 VAL 54 PRO 24 ALA 96 LYS

57 / 71 11 PHE 11 PHE 11 PHE 11 PHE Cκ 9 PHE 9 PHE 9 PHE 9 PHE 28 LEU 28 LEU 100 LYS 100 LYS 26 VAL 57 THR 57 THR 57 THR 53 GLN 26 VAL 107 CYS 28 LEU 14 SER 53 GLN 28 LEU 26 VAL 30 ASN 30 ASN 26 VAL 53 GLN 53 GLN 12 PRO Negrito: Resíduos Sublinhado: Resíduos pouco homólogos Sem marcação: Resíduos conservados Resíduos com muitos efeitos de estabilização 1cz8 4nyl 1l7i 1F8

CH 9 PHE 9 PHE 9 PHE 51 PHE 11 LEU 53 PHE 53 PHE 53 PHE 54 PRO 103 CYS

CK 9 PHE 9 PHE 9 PHE 11 PHE 11 PHE 11 PHE 11 PHE Cinco resíduos de interface importantes para a interação de Cκ e CH1 (com base na estrutura e energia livre) CH1 Cĸ Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 GLN 11 LEU 11, 26 PHE, VAL 24 ALA 9,11 PHE 51 HIS 31 ASN 53 PHE 69 SER Nota: Resíduos de ponte salina são excluídos Exemplo 2: Descoberta de Resíduos de Interface Importantes para Interação de Cκ e CH1

[00126] Com base na análise de interface de Cκ e CH1, este exemplo resumiu os principais resíduos de interface importantes para a interação de Cκ e CH1 (vide FIGURA 2 e Tabela 4 a seguir). Tabela 4. Pares de Resíduo que Impactam a Interação de Cκ/CH1 CH1 Cκ Número do par Posição Resíduo Posição Resíduo 9 PHE 17 GLN 1 11 LEU 11, 26 PHE, VAL 2 24 ALA 9, 11 PHE 3 51 HIS 31 ASN 4 53 PHE 69 SER 5 Nota: Resíduos de ponte salina são excluídos

[00127] A partir da tabela anterior, mutações simples em alanina ou

58 / 71 triptofano foram usadas para testar cada resíduo de interface. IgG(-Fv) sem VH e VL foi construída e expressa para selecionar Ala e Trp. A lista de mutação é listada da maneira a seguir. Seleção de Alanina Nome Descrição Cκ CH1 Cκ/CH1_001 Cκ/CH1 WT WT Cκ/CH1_002 Cκ_L28Y _S69W/CH1_H51A_ F53G L28Y _S69W H51A_ F53G Cκ/CH1_003 Cκ/CH1_H51A_ F53G WT H51A_ F53G Cκ/CH1_004 Cκ/CH1_ D31K_F53T_V68F WT D31K_F53T_V68F Cκ/CH1_005 Cκ/CH1_F9A_F53A WT F9A_F53A Cκ/CH1_006 Cκ _F9G_F11A_K100A/CH1 F9G_F11A_K100A WT Cκ/CH1_007 Cκ _F11A/CH1 F11A WT Cκ/CH1_008 Cκ _F9A_F11A/CH1 F9A_F11A WT Cκ/CH1_009 Cκ _F11A_K100A/CH1 F11A_K100A WT Cκ/CH1_010 Cκ _F9A_K100A/CH1 F9A_K100A WT Cκ/CH1_011 Cκ/CH1_F9A_ L11A WT F9A_ L11A Cκ/CH1_012 Cκ/CH1_L11A_ F53A WT L11A_ F53A Cκ/CH1_013 Cκ/CH1_F9A WT F9A Cκ/CH1_014 Cκ/CH1_L11A WT L11A Cκ/CH1_015 Cκ_F9A/CH1 F9A WT Cκ/CH1_016 Cκ_F9A_F11M/CH1 F9A_F11M WT Cκ/CH1_017 Cκ/CH1_A24F WT A24F Cκ/CH1_018 Cκ/CH1_A24L WT A24L Cκ/CH1_019 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24F F9A_F11A A24F Cκ/CH1_020 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24L F9A_F11A A24L Cκ/CH1_021 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24F F9A_F11M A24F Cκ/CH1_022 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24L F9A_F11M A24L Cκ/CH1_023 Cκ_V26A/CH1 V26A WT Cκ/CH1_024 Cκ _V26A_F11A/CH1 V26A_F11A WT Cκ/CH1_025 Cκ/CH1_L11F_L28G WT L11F_L28G Cκ/CH1_026 Cκ_V26A/CH1_L11F_L28G V26A L11F_L28G Cκ/CH1_027 Cκ_V26A_F11A/CH1_L11F_L28G V26A_F11A L11F_L28G Seleção de Triptofano Nome Descrição Cκ CH1 Cκ/CH1_028 Cκ/CH1_A24W WT A24W Cκ/CH1_029 Cκ/CH1_L11F WT L11F Cκ/CH1_030 Cκ/CH1_L11W WT L11W Cκ/CH1_031 Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F F9A_F11A L11F_A24F Cκ/CH1_032 Cκ_V26W/CH1 V26W WT

[00128] Da maneira mostrada na imagem de SDS-PAGE da FIGURA 3, para o Par 2 (Cκ_F11_V26 e CH1_L11), os dois mutantes Cκ_F11A/CH1 e Cκ_V26A/CH1 interromperam muito a interação de Cκ e CH1; os dois mutantes Cκ_V26W/CH1 e Cκ /CH1_L11W também interromperam a interação(FIG4). As mutações Cκ/CH1_L11A e Cκ/CH1_F9A (do par 1) também interromperam a interação. Os mutantes Cκ_F9A/CH1, Cκ/CH1_A24F e Cκ/CH1_A24L, ao contrário, não afetaram a interação de

59 / 71 Cκ e CH1. Isto sugere que o par 3 (Cκ_F9 e CH1_A24) não é importante para a ligação de Cκ e CH1. Par No. CH1 Cκ Importante Par 1 Phe9 Gln17 Sim Par 2 Leu11 Phe11, Val26 Sim Par 3 Ala24 Phe9 Não Exemplo 3: Desenvolvimento do Par de Mutação para o Par 1 por Discovery Studio

[00129] Mediante a identificação de pares de resíduo que são importantes para manter a interação entre Cκ e CH1, este exemplo testou pares de mutação que estabelecem novas interações. A justificativa deste desenvolvimento é que: Cκ mutante pode mostrar boa ligação ao CH1 mutante; mas Cκ mutante não se liga ou se liga fracamente ao CH1 tipo selvagem, e CH1 mutante mostra ligação fraca ou nenhuma ligação ao Cκ tipo selvagem. Desenvolvimento de Mutação Para Par 1

[00130] Os resíduos no par 1 são Cκ_Q17 e CH1_F9 (Tabela 4). Estas mutações de Cκ/ CH1_033 a 050 foram desenhadas e analisadas pelos inventores. Os pares de mutação Cκ/ CH1_051-066 foram desenvolvidos por um programa de software, Discovery Studio (DS), para desenhar mutações aleatórias para este sítio. Isto gerou oito pares para Cĸ_Q17 e CH1_F9 da maneira listada a seguir. Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:PHE9>ILE.L:GLN17>HIS 0,03 Neutro 0,15 0,03 -0,07 0 H:PHE9>HIS.L:GLN17>ARG 0,07 Neutro -1,42 1,4 0,09 0 H:PHE9>LYS.L:GLN17>ASP 0,09 Neutro 2,15 -3,23 0,72 0 H:PHE9>HIS.L:GLN17>HIS 0,19 Neutro 0,16 -0,07 0,17 0 H:PHE9>PRO.L:GLN17>ARG 0,25 Neutro 0,13 1,33 -0,55 0 H:PHE9>MET.L:GLN17>HIS 0,29 Neutro 0,12 0,09 0,21 0 H:PHE9>GLN.L:GLN17>ARG 0,3 Neutro -0,42 1,89 -0,49 0 H:PHE9>GLN.L:GLN17>HIS 0,33 Neutro -0,46 -0,12 0,7 0 Notas: Energia de mutação: diferença de energia após mutação; valor baixo significa mais estável; VDW: Van der Waals Cκ/CH1_033 Cκ_Q17R/CH1 Q17R WT Cκ/CH1_034 Cκ_Q17K/CH1 Q17K WT Cκ/CH1_035 Cκ_Q17D/CH1 Q17D WT Cκ/CH1_036 Cκ_Q17E/CH1 Q17E WT Cκ/CH1_037 Cκ/CH1_F9R WT F9R

60 / 71 Cκ/CH1_038 Cκ/CH1_F9K WT F9K Cκ/CH1_039 Cκ/CH1_F9D WT F9D Cκ/CH1_040 Cκ/CH1_F9E WT F9E Cκ/CH1_041 Cκ_F11E_V26A/CH1_L11R F11E_V26A L11R Cκ/CH1_042 Cκ_Q17K_F11K_V26A/CH1_F9E_L11E Q17K_F11K_V26A F9E_L11E Cκ/CH1_043 Cκ_Q17R/CH1_F9D Cκ_Q17R CH1_F9D Cκ/CH1_044 Cκ_Q17K/CH1_F9D Cκ_Q17K CH1_F9D Cκ/CH1_045 Cκ_Q17R/CH1_F9E Cκ_Q17R CH1_F9E Cκ/CH1_046 Cκ_Q17K/CH1_F9E Cκ_Q17K CH1_F9E Cκ/CH1_047 Cκ_Q17D/CH1_F9R Cκ_Q17D CH1_F9R Cκ/CH1_048 Cκ_Q17D/CH1_F9K Cκ_Q17D CH1_F9K Cκ/CH1_049 Cκ/CH1_F9D_L11A Cκ CH1_F9D_L11A Cκ/CH1_050 Cκ_Q17K/CH1_F9D_L11A Cκ_Q17K CH1_F9D_L11A Cκ/CH1_051 Cκ_Q17H/CH1_F9I Cκ_Q17H CH1_F9I Cκ/CH1_052 Cκ_Q17R/CH1_F9H Cκ_Q17R CH1_F9H Cκ/CH1_053 Cκ_Q17H/CH1_F9H Cκ_Q17H CH1_F9H Cκ/CH1_054 Cκ_Q17R/CH1_F9P Cκ_Q17R CH1_F9P Cκ/CH1_055 Cκ_Q17D/CH1_F9H Cκ_Q17D CH1_F9H Cκ/CH1_056 Cκ_Q17I/CH1_F9H Cκ_Q17I CH1_F9H Cκ/CH1_057 Cκ_Q17H/CH1_F9M Cκ_Q17H CH1_F9M Cκ/CH1_058 Cκ_Q17R/CH1_F9Q Cκ_Q17R CH1_F9Q Cκ/CH1_059 Cκ_Q17H/CH1_F9Q Cκ_Q17H CH1_F9Q Cκ/CH1_060 Cκ_Q17H/CH1 Cκ_Q17H CH1 Cκ/CH1_061 Cκ_Q17I/CH1 Cκ_Q17I CH1 Cκ/CH1_062 Cκ/CH1_F9I Cκ CH1_F9I Cκ/CH1_063 Cκ/CH1_F9H Cκ CH1_F9H Cκ/CH1_064 Cκ/CH1_F9P Cκ CH1_F9P Cκ/CH1_065 Cκ/CH1_F9M Cκ CH1_F9M Cκ/CH1_066 Cκ/CH1_F9Q Cκ CH1_F9Q

[00131] Dois bons pares de mutação são listados a seguir: Mutação ID Numeração da posição Numeração Kabat Cκ/CH1_043 Cκ_Q17R/CH1_F9D Cκ_Q124R/CH1_F122D Cκ/CH1_044 Cκ_Q17K/CH1_F9D Cκ_Q124K/CH1_F122D Exemplo 4: Desenvolvimento de Par de Mutação para Par 2 por Discovery Studio

[00132] Para o par 2, as mutações simples em alanina/triptofano foram testadas para cada resíduo de interface. IgG(-Fv) sem VH e VL foi construída e expressa para seleção de Ala e Trp. Este exemplo usou Discovery Studio para desenhar mutações aleatórias para este sítio.

[00133] Três bons pares de mutação são Cκ/CH1_072, Cκ/CH1_079 e Cκ/CH1_107 listados a seguir: Mutação ID Numeração da posição Numeração Kabat Cκ/CH1_072 Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N Cκ_V133W/CH1_L124K_L141N Cκ/CH1_079 Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W Cκ_F118W_V133G/CH1_L124W Cκ/CH1_107 Cκ_V26W/CH1_L11W Cκ_V133W/CH1_L124W Desenvolvimento de Mutação Para Par 2

61 / 71

[00134] Os resíduos importantes para o par 2 são Cκ_F11_V26 e CH1_L11_L28 (vide tabela 4). A estratégia de desenvolvimento de mutação para este ponto de acesso é reparar a mutação V26W ou L11W. Este exemplo também testou introduzir mutações pontuais saturadas para Cκ_F11_V26 e CH1_L11_L28; a seguir aplicar DS para calcular todas as mutações potentes.

[00135] Estratégia I: com mutação corrigida V26W, mutações pontuais aleatórias foram introduzidas para CH1_L11_L28; a seguir o software DS foi usado para gerar alguns pares de mutação para este sítio. Alguns pares de mutação preferíveis são listados da maneira a seguir. Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP -0,14 Neutro -0,31 0,11 -0,04 0 H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP -0,08 Neutro -0,56 0,29 0,06 0 H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP -0,03 Neutro -0,46 0,32 0,04 0 H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP 0,18 Neutro -0,01 0,3 0,04 0 H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP 0,31 Neutro -0,83 0,58 0,49 0 H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP 0,38 Neutro -1,76 2,45 0,04 0 H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP 0,41 Neutro 0,16 0,18 0,27 0 Energia de Não Mutação mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia polar Estabi- H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP -0,54 -2,58 0,34 0,66 0 lizante H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP -0,5 Neutro -4,5 3,13 0,21 0 H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP -0,43 Neutro -2,26 0,37 0,58 0 H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP -0,21 Neutro -1,49 0,12 0,54 0 H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP -0,09 Neutro -1,22 0,3 0,42 0 H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP -0,06 Neutro -1,14 0,16 0,49 0 H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP 0,1 Neutro -1,04 0,12 0,64 0 H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP 0,38 Neutro -2,6 2,36 0,57 0 Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>ILE.H:LEU28>PHE.L:V Estabi- AL26>TRP -2,85 lizante -6,21 0,1 0,23 0 H:LEU11>ARG.H:LEU28>PRO.L: Estabi- VAL26>TRP -2,38 lizante -7,66 0,45 1,39 0 H:LEU11>ILE.H:LEU28>GLN.L:V Estabi- AL26>TRP -1,86 lizante -4,73 0,48 0,3 0 H:LEU11>ARG.H:LEU28>GLY.L: Estabi- VAL26>TRP -1,64 lizante -6,13 0,44 1,37 0 H:LEU11>ARG.H:LEU28>ASP.L: Estabi- VAL26>TRP -1,46 lizante -7,85 2,67 1,29 0 H:LEU11>LYS.H:LEU28>ASN.L: Estabi- VAL26>TRP -1,33 lizante -5,94 1,42 1,06 0 H:LEU11>THR.H:LEU28>HIS.L:V Estabi- AL26>TRP -1,32 lizante -4,18 0,55 0,56 0 H:LEU11>LEU.H:LEU28>THR.L: Estabi- VAL26>TRP -1,17 lizante -3,35 0,42 0,33 0

62 / 71 Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>ALA.H:LEU28>ARG.L: Estabi- VAL26>TRP -1,16 lizante -4,55 -0,57 1,59 0 H:LEU11>GLU.H:LEU28>GLN.L: Estabi- VAL26>TRP -1,12 lizante -5,43 2,65 0,31 0

[00136] Estratégia 2: com mutação corrigida L11W, as mutações pontuais aleatórias foram introduzidas em Cκ_F11_V26; a seguir o software DS foi usado para gerar alguns pares de mutação para este sítio. Alguns pares de mutação preferíveis são listados da maneira a seguir. Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>LEU -2,24 -4,78 0,32 -0,01 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>MET -1,89 -4,2 0,19 0,13 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>TRP -1,38 -3,01 0,58 -0,19 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLU -1,21 -3,88 0,87 0,34 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>LYS -0,9 -5,72 3,44 0,27 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>CYS -0,84 -1,95 0,12 0,09 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>SER -0,68 -2,65 0,42 0,49 0 lizante Estabi- H:LEU11>TRP.L:VAL26>ALA -0,6 -1,65 0,02 0,25 0 lizante H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLY -0,26 Neutro -1,66 0,16 0,56 0 H:LEU11>TRP.L:VAL26>PRO -0,19 Neutro -0,91 0,1 0,25 0 Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS -0,3 Neutro -1,46 0,14 0,41 0 Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>TRP.L:PHE11>TRP.L:V Estabi- -1,94 -7,43 3,17 0,22 0 AL26>LYS lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS.L:V Estabi- -1,68 -7,35 2,56 0,81 0 AL26>ARG lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>TRP.L:V Estabi- -1,64 -4,45 0,07 0,63 0 AL26>GLY lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS.L:V Estabi- -1,58 -4 0,3 0,31 0 AL26>LEU lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>ARG.L: Estabi- -1,56 -6,43 2,37 0,54 0 VAL26>TYR lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>ARG.L: Estabi- -1,34 -6,03 1,87 0,84 0 VAL26>GLU lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS.L:V Estabi- -1,25 -3,3 0,07 0,42 0 AL26>MET lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS.L:V Estabi- -1,21 -3,06 0,33 0,18 0 AL26>TRP lizante H:LEU11>TRP.L:PHE11>LEU.L:V Estabi- -1,16 -5,72 2,42 0,56 0 AL26>ARG lizante

63 / 71 Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>TRP.L:PHE11>ARG.L: Estabi- -1,09 -5,83 2,2 0,82 0 VAL26>LEU lizante

[00137] Estratégia 3: mutações pontuais saturadas foram introduzidas para Cκ_F11_V26 e CH1_L11_L28; a seguir utilizou-se DS para calcular todas as mutações potentes. Isto gerou 23 pares de mutação preferíveis listados a seguir. Energia de Não Mutação Efeito VDW Eletrostático Entropia mutação polar H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP -0,14 Neutro -0,31 0,11 -0,04 0 H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP -0,08 Neutro -0,56 0,29 0,06 0 H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP -0,03 Neutro -0,46 0,32 0,04 0 H:LEU11>MET.L:VAL26>GLU 0,14 Neutro -0,04 -0,17 0,28 0 H:LEU11>ASN.L:VAL26>GLU 0,16 Neutro -0,65 0,14 0,47 0 H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP 0,18 Neutro -0,01 0,3 0,04 0 H:LEU11>PRO.L:VAL26>GLU 0,28 Neutro 0,39 -0,52 0,39 0 H:LEU11>MET.L:VAL26>LEU 0,3 Neutro 0,78 0,05 -0,13 0 H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP 0,31 Neutro -0,83 0,58 0,49 0 H:LEU11>VAL.L:VAL26>GLU 0,34 Neutro 0,22 -0,32 0,44 0 H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP 0,38 Neutro -1,76 2,45 0,04 0 H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP 0,41 Neutro 0,16 0,18 0,27 0 H:LEU11>ILE.L:VAL26>GLU 0,43 Neutro 0,38 -0,22 0,4 0 H:LEU11>MET.L:VAL26>MET 0,44 Neutro 0,91 0,01 -0,02 0 Estabi- H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP -0,54 -2,58 0,34 0,66 0 lizante H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP -0,5 Neutro -4,5 3,13 0,21 0 H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP -0,43 Neutro -2,26 0,37 0,58 0 H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP -0,21 Neutro -1,49 0,12 0,54 0 H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP -0,09 Neutro -1,22 0,3 0,42 0 H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP -0,06 Neutro -1,14 0,16 0,49 0 H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP 0,1 Neutro -1,04 0,12 0,64 0 H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP 0,38 Neutro -2,6 2,36 0,57 0 H:LEU28>VAL.L:VAL26>GLU 0,42 Neutro -0,19 -0,07 0,62 0

[00138] Com base nos pares de mutação anteriores, para o par 1, todos os pares de mutação foram analisados por SDS-PAGE (Reduzida e não reduzida, FIGURA 4A-D); para o par 2, alguns pares de mutação potente com a menor energia livre foram escolhidos para análise. Entre todos os pares de mutação, três pares de mutação Cκ/CH1_107 são mais potentes. Os resultados podem ser comparáveis ao par de mutação publicado. IgG(-Fv) sem VH e VL foi construída e expressa para cada par de mutação. A lista de mutação é listada da maneira a seguir.

[00139] Três bons pares de mutação são Cκ/CH1_072, Cκ/CH1_079 e

64 / 71 Cκ/CH1_107 listados a seguir: Cκ/CH1_072 Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N Cκ/CH1_079 Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W Cκ/CH1_107 Cκ_V26W/CH1_L11W

[00140] Da maneira mostrada nas figuras do gel SDS-PAGE na FIGURA 5A-5B, o par de mutação Cĸ_V26W/ CH1_L11W restabeleceu a ligação entre Cκ e CH1 (Cĸ_L28Y_S69W/ CH1_H51A_F53G foi usado como controle). Cκ/CH1_067 Cκ_V26W/CH1_L11I_L28F Cκ_V26W CH1_L11I_L28F Cκ/CH1_068 Cκ_V26W/CH1_L11R_L28P Cκ_V26W CH1_L11R_L28P Cκ/CH1_069 Cκ_V26W/CH1_L11I_L28Q Cκ_V26W CH1_L11I_L28Q Cκ/CH1_070 Cκ_V26W/CH1_L11R_L28G Cκ_V26W CH1_L11R_L28G Cκ/CH1_071 Cκ_V26W/CH1_L11R_L28D Cκ_V26W CH1_L11R_L28D Cκ/CH1_072 Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N Cκ_V26W CH1_L11K_L28N Cκ/CH1_073 Cκ_V26W/CH1_L11T_L28H Cκ_V26W CH1_L11T_L28H Cκ/CH1_074 Cκ_V26W/CH1_L28T Cκ_V26W CH1_L28T Cκ/CH1_075 Cκ_V26W/CH1_L11A_L28R Cκ_V26W CH1_L11A_L28R Cκ/CH1_076 Cκ_V26W/CH1_L11E_L28Q Cκ_V26W CH1_L11E_L28Q Cκ/CH1_077 Cκ_F11W_V26K/CH1_L11W Cκ_F11W_V26K CH1_L11W Cκ/CH1_078 Cκ_F11H_V26R/CH1_L11W Cκ_F11H_V26R CH1_L11W Cκ/CH1_079 Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W Cκ_F11W_V26G CH1_L11W Cκ/CH1_080 Cκ_F11H_V26L/CH1_L11W Cκ_F11H_V26L CH1_L11W Cκ/CH1_081 Cκ_F11R_V26Y/CH1_L11W Cκ_F11R_V26Y CH1_L11W Cκ/CH1_082 Cκ_F11R_V26E/CH1_L11W Cκ_F11R_V26E CH1_L11W Cκ/CH1_083 Cκ_F11H_V26M/CH1_L11W Cκ_F11H_V26M CH1_L11W Cκ/CH1_084 Cκ_F11H_V26W/CH1_L11W Cκ_F11H_V26W CH1_L11W Cκ/CH1_085 Cκ_F11L_V26R/CH1_L11W Cκ_F11L_V26R CH1_L11W Cκ/CH1_086 Cκ_F11R_V26L/CH1_L11W Cκ_F11R_V26L CH1_L11W Cκ/CH1_087 Cκ/CH1_L11I_L28F Cκ CH1_L11I_L28F Cκ/CH1_088 Cκ/CH1_L11R_L28P Cκ CH1_L11R_L28P Cκ/CH1_089 Cκ/CH1_L11I_L28Q Cκ CH1_L11I_L28Q Cκ/CH1_090 Cκ/CH1_L11R_L28G Cκ CH1_L11R_L28G Cκ/CH1_091 Cκ/CH1_L11R_L28D Cκ CH1_L11R_L28D Cκ/CH1_092 Cκ/CH1_L11K_L28N Cκ CH1_L11K_L28N Cκ/CH1_093 Cκ/CH1_L11T_L28H Cκ CH1_L11T_L28H Cκ/CH1_094 Cκ/CH1_L28T Cκ CH1_L28T Cκ/CH1_095 Cκ/CH1_L11A_L28R Cκ CH1_L11A_L28R Cκ/CH1_096 Cκ/CH1_L11E_L28Q Cκ CH1_L11E_L28Q Cκ/CH1_097 Cκ_F11W_V26K/CH1 Cκ_F11W_V26K CH1 Cκ/CH1_098 Cκ_F11H_V26R/CH1 Cκ_F11H_V26R CH1 Cκ/CH1_099 Cκ_F11W_V26G/CH1 Cκ_F11W_V26G CH1 Cκ/CH1_100 Cκ_F11H_V26L/CH1 Cκ_F11H_V26L CH1 Cκ/CH1_101 Cκ_F11R_V26Y/CH1 Cκ_F11R_V26Y CH1 Cκ/CH1_102 Cκ_F11R_V26E/CH1 Cκ_F11R_V26E CH1 Cκ/CH1_103 Cκ_F11H_V26M/CH1 Cκ_F11H_V26M CH1 Cκ/CH1_104 Cκ_F11H_V26W/CH1 Cκ_F11H_V26W CH1 Cκ/CH1_105 Cκ_F11L_V26R/CH1 Cκ_F11L_V26R CH1 Cκ/CH1_106 Cκ_F11R_V26L/CH1 Cκ_F11R_V26L CH1 Cκ/CH1_107 Cκ_V26W/CH1_L11W Cκ_V26W CH1_L11W Exemplo 5: Melhoria do Par de Mutação Cκ_V26W/CH1_L11W por Discovery Studio

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[00141] Estratégia 4: Com mutação corrigida Cκ_V26W e CH1_L11W, mutações pontuais saturadas foram introduzidas para Cκ_F11 e CH1_L28; a seguir utilizou-se DS para calcular todas as mutações potentes. Isto gerou 23 pares de mutação preferíveis, listados a seguir. Mutação Energia efeito VDW ELETROS- ENTRO- Não Muta- de TÁTICO PIA polar ção mutação dupla H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS. ESTABI- L:VAL26>TRP -1,21 LIZANTE -3,06 0,33 0,18 0 1,17 H:LEU11>TRP.L:PHE11>ALA. L:VAL26>TRP -0,27 NEUTRO -0,35 -0,18 0 0 4,52 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG ESTABI- .L:VAL26>TRP -0,78 LIZANTE -3,18 0,44 0,67 0 0,72 H:LEU11>TRP.H:LEU28>PRO. L:VAL26>TRP 0,42 NEUTRO -0,63 0,6 0,49 0 2,86 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG H:0,72 .L:PHE11>CYS.L:VAL26>TRP -0,34 NEUTRO -2,12 -0,22 0,94 0 L:4,06 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG H:0,72 .L:PHE11>ILE.L:VAL26>TRP -0,25 NEUTRO -1,76 0,41 0,48 0 L:2,87 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG H:0,72 .L:PHE11>PRO.L:VAL26>TRP -0,14 NEUTRO -1,77 -0,07 0,89 0 L:3,18 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG H:0,72 .L:PHE11>ARG.L:VAL26>TRP -0,06 NEUTRO -5,26 2,92 1,26 0 L:3,37 H:LEU11>TRP.H:LEU28>ARG H:0,72 .L:PHE11>MET.L:VAL26>TRP 0,43 NEUTRO -1,35 0,13 1,18 0 L:2,97 Exemplo 6: Desenvolvimento de Par de Mutação

[00142] Para o par 2, as mutações simples em alanina/triptofano foram testadas para cada resíduo de interface. IgG(-Fv) sem VH e VL foi construída e expressa para selecionar Ala e Trp. A lista de mutação é listada da maneira a seguir. Nome Descrição Cκ CH1 Cκ/CH1_001 Cκ/CH1 WT WT Cκ/CH1_002 Cκ_L28Y _S69W/CH1_H51A_ F53G L28Y _S69W H51A_ F53G Cκ/CH1_003 Cκ/CH1_H51A_ F53G WT H51A_ F53G Cκ/CH1_004 Cκ/CH1_ D31K_F53T_V68F WT D31K_F53T_V68F Cκ/CH1_005 Cκ/CH1_F9A_F53A WT F9A_F53A Cκ/CH1_006 Cκ _F9G_F11A_K100A/CH1 F9G_F11A_K100A WT Cκ/CH1_007 Cκ _F11A/CH1 F11A WT Cκ/CH1_008 Cκ _F9A_F11A/CH1 F9A_F11A WT Cκ/CH1_009 Cκ _F11A_K100A/CH1 F11A_K100A WT Cκ/CH1_010 Cκ _F9A_K100A/CH1 F9A_K100A WT Cκ/CH1_011 Cκ/CH1_F9A_ L11A WT F9A_ L11A Cκ/CH1_012 Cκ/CH1_L11A_ F53A WT L11A_ F53A Cκ/CH1_013 Cκ/CH1_F9A WT F9A Cκ/CH1_014 Cκ/CH1_L11A WT L11A Cκ/CH1_015 Cκ_F9A/CH1 F9A WT Cκ/CH1_016 Cκ_F9A_F11M/CH1 F9A_F11M WT Cκ/CH1_017 Cκ/CH1_A24F WT A24F Cκ/CH1_018 Cκ/CH1_A24L WT A24L

66 / 71 Nome Descrição Cκ CH1 Cκ/CH1_019 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24F F9A_F11A A24F Cκ/CH1_020 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24L F9A_F11A A24L Cκ/CH1_021 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24F F9A_F11M A24F Cκ/CH1_022 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24L F9A_F11M A24L Cκ/CH1_023 Cκ_V26A/CH1 V26A WT Cκ/CH1_024 Cκ _V26A_F11A/CH1 V26A_F11A WT Cκ/CH1_025 Cκ/CH1_L11F_L28G WT L11F_L28G Cκ/CH1_026 Cκ_V26A/CH1_L11F_L28G V26A L11F_L28G Cκ/CH1_027 Cκ_V26A_F11A/CH1_L11F_L28G V26A_F11A L11F_L28G Cκ/CH1_028 Cκ/CH1_A24W WT A24W Cκ/CH1_029 Cκ/CH1_L11F WT L11F Cκ/CH1_030 Cκ/CH1_L11W WT L11W Cκ/CH1_031 Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F F9A_F11A L11F_A24F Cκ/CH1_032 Cκ_V26W/CH1 V26W WT Exemplo 7: Alteração de Pontes Salinas

[00143] A análise de interação de interface para Ck e CH1 no exemplo 1 mostrou que a ponte salina comum entre CH1 e Ck de 1F8, 1CZ8, 1L7I e 4NYL é da maneira a seguir: CH1 Cĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 96 LYS NZ 16 GLU OE2 2,7-3,4

[00144] Existe mais uma ponte salina em 1F8 e 1CZ8: CH1 Cĸ Distância (Å) Posição Resíduo Nome do átomo Posição Resíduo Nome do átomo 101 LYS NZ 15 ASP OD2 2,7-3,8

[00145] Portanto, este exemplo focou em CH1 e Ck de 1F8 com duas pontes salinas, e utilizou o Discovery Studio para desenhar novos pares de ponte salina em CH1 e Ck que desfavorecem a ligação de CH1 ou Ck mutado com seu WT correspondente, e reconstrói a ligação entre o CH e Ck mutado com uma nova ponte salina.

[00146] O desenho na ponte salina CH1_LYS96 e Ck_GLU16. Da maneira mostrada na tabela a seguir, dois pares mostraram estabilizar CH1mut e Ckmut com nova ponte salina: CH1: LYS96>ASP mutação e Ck: GLU16>ARG mutação; CH1: LYS96>GLU mutação e Ck: GLU16>ARG mutação; Mutação Energia de Efeito VDW Eletros- Entropia Não Mutação mutação tático polar simples H:LYS96>ASP.L:GL -1,06 Estabilizante -2,86 1,02 -0,16 0 1,02 1,32 U16>ARG H:LYS96>GLU.L:G -0,52 Estabilizante -2,38 0,98 0,21 0 1,28 1,32 LU16>ARG

67 / 71 Mutação Energia de Efeito VDW Eletros- Entropia Não Mutação mutação tático polar simples H:LYS96>ASP.L:GL -0,41 Neutro -2,06 1,08 0,09 0 1,02 1,84 U16>LYS H:LYS96>GLU.L:GL 0,12 Neutro -0,24 1,74 -0,72 0 1,28 0,79 U16>HIS H:LYS96>GLU.L:GL 0,26 Neutro -1,6 1,43 0,39 0 1,28 1,84 U16>LYS

[00147] Discovery Studio foi usado adicionalmente para encontrar nova ponte salina, que poderia estar em sinergia com novo Cκ_V26W e CH1_L11W para desfavorecer a ligação de CH1 ou Ck mutado ao seu WT correspondente, e reconstruir a ligação entre o CH e Cκ mutado. Da maneira mostrada nas tabelas a seguir: três pares mostraram estabilizar CH1mut e Ckmut em sinergia com Cκ_V26W e CH1_L11W: CH1: mutação de LEU11>TRP; LYS96>GLU e Ck: mutação de GLU16>LYS; VAL26>TRP CH1: mutação de LEU11>TRP; LYS96>GLU e Ck: mutação de GLU16>ARG; VAL26>TRP CH1: mutação de LEU11>TRP; LYS101>GLU e Ck: mutação de ASP15>LYS; VAL26>TRP Tabela 5: Mutações em CH1_K96/Cκ_E16 Energia de Eletros- Não Mutação Mutação Efeito VDW Entropia mutação tático polar dupla H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. -1,06 Estabi- -4,09 1,61 0,2 0 -0,34 3,39 L:GLU16>LYS.L:VAL26>TRP lizante H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. -0,57 Estabi- -1,6 1,94 -0,84 0 -0,34 2,03 L:GLU16>ARG.L:VAL26>TRP lizante H:LEU11>TRP.H:LYS96>GLU. -0,5 Neutro -0,79 2,11 -1,32 0 -0,34 1,11 L:GLU16>HIS.L:VAL26>TRP Tabela 6: Mutações em CH1_K101/Cκ_D15 Mutação Energia de Efeito VDW Eletros- Entropia não Mutação mutação tático polar dupla H:LEU11>TRP.H:LYS101>GLU Estabi- -0,65 -2,28 2,18 -0,68 0 0,58 1,57 L:ASP15>LYS.L:VAL26>TRP lizante H:LEU11>TRP.H:LYS101>GLU. -0,06 Neutro -1,66 2,08 -0,31 0 0,58 1,66 L:ASP15>HIS.L:VAL26>TRP H:LEU11>TRP.H:LYS101>ASP. 0,27 Neutro 1,33 1,91 -1,53 0 0,62 1,57 L:ASP15>LYS.L:VAL26>TRP H:LEU11>TRP.H:LYS101>ASP. 0,44 Neutro 1,46 1,96 -1,44 0 0,62 1 L:ASP15>ARG.L:VAL26>TRP Exemplo 8: Direcionamento de Pontes Salinas Alteradas

[00148] Os plasmídeos contendo polinucleotídeos que codificam CH1-

68 / 71 CH2-CH3 ou Cκ foram construídos. As mutações foram introduzidas em alguns dos domínios, da maneira listada a seguir.

[00149] Os plasmídeos foram transfectados de maneira transiente em células 293F para a expressão de proteína. As proteínas foram purificadas em colunas de proteína A e gel de afinidade anti-FLAG, e as proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE (5 µg por canaleta). Uma vez que a proteína A se liga apenas à cadeia pesada, a densidade das cadeias leves indicou força de ligação entre a cadeia pesada e a cadeia leve.

[00150] No primeiro lote, 13 anticorpos foram testados. As mutações incluídas nestes anticorpos são listadas na Tabela 7. Tabela 7. Anticorpos teste com mutações No. Nome da proteína CH1-CH2CH3 Cκ 1 Cκ/CH1_001 WT WT 2 Cκ/CH1_200 WT E16R 3 Cκ/CH1_201 K96D WT 4 Cκ/CH1_202 K96E WT 5 Cκ/CH1_203 K96D E16R 6 Cκ/CH1_204 K96E E16R 7 Cκ/CH1_107 L11W V26W 8 Cκ/CH1_205 L11W; K96E WT 9 Cκ/CH1_206 WT E16K; V26W 10 Cκ/CH1_207 L11W; K96E E16K; V26W 11 Cκ/CH1_208 L11W; K96D WT 12 Cκ/CH1_209 WT V26W; E16R 13 Cκ/CH1_210 L11W; K96D V26W; E16R

[00151] Os resultados são mostrados na FIGURA 6A. Boas ligações foram observadas para Cκ/CH1_001 (tipo selvagem) e Cκ/CH1_107 (L11W em CH1 e V26W em Cκ). Cκ/CH1_203 incluiu um par de mutação positiva- para-negativa e negativa-para-positiva que interrompeu a ponte salina tipo selvagem (K96-E16). A ligação em Cκ/CH1_210 (L11W e K96D em CH1 e V26W e E16R em Cκ) foi acentuadamente mais forte que entre K96D e E16R. Cada uma das cadeias mutantes, ao contrário, falhou mais evidentemente em se ligar ao correspondente tipo selvagem (vide, Cκ/CH1_208 e Cκ/CH1_209).

[00152] As cadeias mutantes em Cκ/CH1_207, CH1 com L11W e K96E, e Cκ com E16K e V26W também exibiram mais ligação em mutantes

69 / 71 do que seus correspondentes tipo selvagem (vide, Cκ/CH1_205 e Cκ/CH1_206).

[00153] No segundo lote, sete anticorpos foram testados. As mutações incluídas nestes anticorpos são listadas na Tabela 8. Tabela 8. Test anticorpos com mutações Nome da proteína CH1-CH2CH3 Ck 1 Cκ/CH1_001 Wt Wt 2 Cκ/CH1_211 Wt E16K 3 Cκ/CH1_202 K96E Wt 4 Cκ/CH1_212 K96E E16K 5 Cκ/CH1_205 L11W, K96E Wt 6 Cκ/CH1_209 Wt E16R,V26W 7 Cκ/CH1_213 L11W, K96E E16R,V26W

[00154] Os resultados são mostrados na FIGURA 6B. As cadeias mutantes em Cκ/CH1_213, CH1 com L11W e K96E, e Cκ com E16R e V26W exibiram mais ligação em mutantes do que seus correspondentes tipo selvagem (vide, Cκ/CH1_205 e Cκ/CH1_206).

[00155] No terceiro lote, quinze anticorpos foram testados. As mutações incluídas nestes anticorpos são listadas na Tabela 9. Tabela 9. Anticorpos de teste com mutações No. Nome da proteína CH1-CH2CH3 Cκ 1 Cκ/CH1_001 WT WT 2 Cκ/CH1_030 L11W WT 3 Cκ/CH1_032 WT V26W 4 Cκ/CH1_107 L11W V26W 5 Cκ/CH1_201 K96D WT 6 Cκ/CH1_214 WT C16R, Q17A 7 Cκ/CH1_217 K96D E16R, Q17A 8 Cκ/CH1_208 L11W, K96D WT 9 Cκ/CH1_225 WT E16R, Q17A, V26W 10 Cκ/CH1_226 L11W, K96D E16R, Q17A, V26W 11 Cκ/CH1_221 WT D15K, V26W 12 Cκ/CH1_222 WT D15H, V26W 13 Cκ/CH1_220 L11W, K101E WT 14 Cκ/CH1_223 L11W, K101E D15K, V26W 15 Cκ/CH1_224 L11W, K101E D15H, V26W

[00156] Da maneira mostrada na FIGURA 6C, as pontes salinas restabelecidas em Cκ/CH1_223 (K101E-D15K) e Cκ/CH1_224 (K101E- D15H) resultaram em interações fortes entre as cadeias pesadas e leves mutadas, e cada uma delas individualmente foi mais evidentemente incapaz de se ligar ao correspondente tipo selvagem, comparado com Cκ/CH1_107

70 / 71 (L11W em CH1 e V26W em Cκ). A ligação forte entre os mutantes, da maneira mostrada na figura, também é baseada na interação hidrofóbica entre L11W e V26W. Em outras palavras, a sinergia entre a interação hidrofóbica e a nova ponte salina provoca ligação forte e alta especificidade, que serão usadas para o projeto de anticorpos multiespecíficos. Exemplo 9: Construção de Anticorpo Biespecífico

[00157] Para avaliar adicionalmente o efeito de mutações CH1/Ck em incompatibilidade de cadeia leve, utilizou-se o formato biespecífico de heterodímero do tipo IgG usando mutações DE/EE em domínio CH3 (J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706–14717). Construiu-se anticorpos biespecíficos usando o par PDL1/CD73.

[00158] O desenho do par PDL1/CD73 é descrito na tabela a seguir: Proteína B5021 B5022 B5023 B5024 CH3 DE/KK DE/KK DE/KK DE/KK Fab PDL1 CD73 PDL1 CD73 PDL1 CD73 PDL1 CD73 CH1 K96D L11W K96D WT L11W/K96D WT L11W/K96E WT Ck E16K V26W E16K WT V26W/E16R WT V26W/E16K WT

[00159] Da maneira mostrada na FIGURA 8A, nenhum dos pares desenhados afetou a ligação de parte de PDL1 por ELISA, enquanto a eficiência de ligação de CD47 foi prejudicada. Mutações B5024 Cκ/CH1_207 (CH1:L11W/K96E; Cκ: E16K/V26W) e mutações B5023 Cκ/CH1_210 (CH1:L11W/K96D; Cκ: E16R/V26W) podem restabelecer a ligação da parte CD73 do antígeno por ELISA. Além disso, o ensaio de seleção de PDL1 e ensaio de atividade enzimática de CD73 mostraram padrão similar com ELISA de ligação (FIGURA 8B). Em relação a isso, toda a parte de PDL1 mostrou atividade antagonista por PDL1 similar, e apenas B5024 e B5023 mostraram atividade antagonista por CD73 potente. Neste par, a cadeia leve de PDL1 prejudicou significativamente a função do braço CD73, enquanto a cadeia leve de CD73 apresentou pouco efeito no braço PDL1. Tanto as mutações Cκ/CH1_207 quanto Cκ/CH1_210 podem restabelecer a função de CD73, e não afetaram o braço PDL1, sugerindo que mutações CH1/Ck podem

71 / 71 prevenir a incompatibilidade de cadeia leve.

[00160] A presente descrição não é limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas, as quais são pretendidas como ilustrações simples de aspectos individuais da descrição, e quaisquer das composições ou métodos que são funcionalmente equivalentes estão no escopo desta descrição. Será evidente aos versados na técnica que várias modificações e variações podem ser realizadas nos métodos e composições da presente descrição, sem fugir do espírito ou escopo da descrição. Assim, pretende-se que a presente descrição inclua as modificações e variações desta descrição, desde que estejam no escopo das reivindicações em anexo e seus equivalentes.

[00161] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporados pela referência na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento CH1 de humano compreendendo uma substituição L11W, e um fragmento Cκ de humano compreendendo uma substituição V26W.

2. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K101E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e D15K/H.

3. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96D, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16R.

4. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16K.

5. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 compreende substituições L11W e K96E, e o fragmento Cκ compreende substituições V26W e E16R.

6. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um segundo fragmento CH1 de humano que não inclui a substituição L11W, e um segundo fragmento Cκ de humano que não inclui a substituição V26W.

7. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os segundos fragmentos humanos de CH1 e os segundos de Cκ são tipo selvagem.

8. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região Fc, ou a combinação das mesmas.

9. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é da classe IgG.

10. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o isotipo é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

11. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um par de fragmento CH1 de humano para fragmento Cκ de humano, em que os fragmentos CH1 e Cκ compreendem substituições selecionadas do grupo que consiste em: (a) L11K e L28N em CH1, e V26W em Cκ; (b) L11W em CH1, e F11W e V26G em Cκ; (c) F9D em CH1, e Q17R ou Q17K em Cκ; e combinações dos mesmos.

12. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os fragmentos CH1 e Cκ compreendem adicionalmente substituições selecionadas do grupo que consiste em (a) K101E em CH1 e D15K/H em Cκ, (b) K96D em CH1 e E16R em Cκ, (c) K96E em CH1 e E16K em Cκ e (d) K96E em CH1 e E16R em Cκ.

13. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento CH1 de humano compreendendo uma substituição de aminoácido na posição Leu11, e um fragmento Cκ de humano compreendendo uma substituição de aminoácido na posição V26 e/ou F11, em que os aminoácidos substituídos interagem uns com os outros quando o fragmento CH1 emparelha com o fragmento Cκ.

14. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 de humano não interage com um domínio Cκ de humano tipo selvagem, e o domínio Cκ de humano não interage com um fragmento CH1 de humano tipo selvagem.

15. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácido são selecionadas a partir da tabela 1.

16. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento CH1 de humano compreendendo uma substituição de aminoácido na posição F9, e um fragmento Cκ de humano compreendendo uma substituição de aminoácido na posição Q17, em que os aminoácidos substituídos interagem uns com os outros quando o fragmento CH1 emparelha com o fragmento Cκ.

17. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o fragmento CH1 não interage com um fragmento Cκ tipo selvagem de humano, e o fragmento Cκ não interage com um fragmento CH1 tipo selvagem de humano.

18. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácido são selecionadas a partir da tabela 2.

19. Anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região Fc, ou a combinação das mesmas.

20. Anticorpo biespecífico compreendendo um primeiro par de

CH1/Cκ e um segundo par de CH1/Cκ, caracterizado pelo fato de que os fragmentos CH1 e Cκ do primeiro par compreendem substituições de aminoácido L11W em CH1 e V26W em Cκ, e os fragmentos CH1 e Cκ do segundo par não incluem as substituições L11W e V26W.

21. Anticorpo biespecífico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os fragmentos CH1 e Cκ do primeiro par compreendem adicionalmente substituições selecionadas do grupo que consiste em (a) K101E em CH1 e D15K/H em Cκ, (b) K96D em CH1 e E16R em Cκ, e (c) K96E em CH1 e E16K em Cκ, e os fragmentos CH1 e Cκ do segundo par não incluem as substituições de (a)-(c).

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

23. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.