CN110573531A - 经修饰的Cκ和CH1结构域 - Google Patents

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Abstract

提供了具有经修饰的Cκ和CH1结构域的抗体和抗原结合片段，该经修饰的Cκ和CH1结构域仍然能够配对，但是与未经修饰的野生型CH1和Cκ结构域相比其配对减少。这些修饰对于制备具有两个不同对的Cκ和CH1结构域的双特异性抗体特别有用。

Description

经修饰的Cκ和CH1结构域
背景
双特异性单克隆抗体(BsMAb，BsAb)是可以同时结合两种不同类型的抗原或相同抗原的两种不同表位的人工蛋白质。BsAb可以以多种结构形式制造，并且目前已经在癌症免疫疗法和药物递送的应用进行了探索。
BsAb有许多种形式。除了两个Fab位点结合不同的抗原以外，IgG样BsAb保留了两个Fab臂和一个Fc区的传统单克隆抗体(mAb)结构。最常见的类型称为三功能抗体，因为它们在抗体上具有三个独特的结合位点：两个Fab区和Fc区。每对重链和轻链都来自一个独特的mAb。由两条重链制成的Fc区形成第三结合位点。这些BsAb通常用四源杂交瘤或杂交的杂交瘤方法制造。
然而，四源杂交瘤依赖于随机机会来形成可用的BsAb，并且可能是低效的。另一种制造IgG样BsAb的方法称为“杵臼”，并依赖于从一个mAb为重链中引入大的氨基酸突变，以及为另一个mAb重链中引入小的氨基酸突变。这允许目标重链(及其相应的轻链)更好地装配在一起，并使BsAb生产更可靠。
虽然这种杵臼方法解决了重链同二聚化问题，但它没有解决关于来自两种不同抗体的轻链和重链之间错配的问题。需要提供更容易制备的更好的BsAb，并且具有更好的临床稳定性和功效。
概要
本公开提供了具有经修饰的Cκ和CH1结构域的抗体和抗原结合片段，该经修饰的Cκ和CH1结构域仍然能够配对，但是与未经修饰的CH1和Cκ结构域相比其配对减少。这些修饰对于制备具有两个不同对的Cκ和CH1结构域的双特异性抗体特别有用。
如实验实施例中所证明的，两组氨基酸被鉴定为重要的界面残基，当其改变时，可以减少甚至破坏Cκ和CH1结构域的配对，除非进行适当的修饰以重建这样的界面。
其中一组包括Cκ结构域的Val26(Kabat编号：Val133)和Phe11(Kabat编号：Phe118)，以及CH1结构域的Leu11(Kabat编号：Leu124)。例如，当这些氨基酸中的一个被Ala取代时，可以破坏Cκ/CH1配对。另一个示例组包括Cκ的Gln17(Kabat编号：124)和CH1的Phe9(Kabat编号：122)。
然而，这些界面残基处的某些突变可以恢复配对，这也在实施例中得到证实。其中一个例子是Val26Trp(Cκ)与Leu11Trp(CH1)。表1和表2中显示了其他例子。
在一个实施方案中，提供了包括含L11W取代的人CH1片段和含V26W取代的人Cκ片段的抗体或其抗原结合片段。此类抗体或片段可任选地包括另外的取代，其进一步降低与野生型配对体的结合和/或增强取代片段之间的结合。
例如，另外一对取代可以是CH1中的K101E和Cκ中的D15K或D15H(D15K/H)。另一对取代是CH1中的K96D和Cκ中的E16R。另一个示例对是CH1中的K96E和Cκ中的E16K。因此，在一些实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述的CH1片段含L11W和K101E取代，并且所述的Cκ片段含V26W和D15K/H取代；所述的CH1片段含L11W和K96D取代，所述的Cκ片段含V26W和E16R取代；所述的CH1片段含L11W和K96E取代，所述的Cκ片段含V26W和E16K取代；或者，所述的CH1片段含L11W和K96E取代，并且所述的Cκ片段含V26W和E16R取代。
在一个实施方案中，提供了一种包含Cκ/CH1对的抗体或其抗原结合片段，其中Cκ和CH1片段包含选自以下群组的氨基酸残基：(a)Cκ中的26W，以及CH1中的11K和28N；(b)Cκ中的11W和26G，以及CH1中的11W；(c)Cκ中的26W和CH1中的11W；(d)Cκ中的17R和CH1中的9D；(e)Cκ中的17K和CH1中的9D；及其组合。
在一些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段还包含第二个Cκ/CH1对。第二个Cκ/CH1对可以为野生型或具有突变组。所述突变组可以与第一个Cκ/CH1对中的突变组相同，但优选不同，以保证两对之间不会发生错配。
本公开的另一个实施方案提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含在V26和/或F11位包含氨基酸修饰的Cκ结构域，和在Leu11位包含氨基酸修饰的CH1结构域，其中当所述Cκ结构域与CH1结构域配对时，修饰的氨基酸彼此相互作用。在一些实施方案中，权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段中，所述的Cκ结构域不与野生型CH1结构域相互作用，并且所述的CH1结构域不与野生型Cκ结构域相互作用。在一些实施方案中，所述的修饰的氨基酸选自表1。
另一个实施方案提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含在Q17位包含氨基酸修饰的Cκ结构域，和在F9位包含氨基酸修饰的CH1结构域，其中当所述Cκ结构域与CH1结构域配对时，修饰的氨基酸彼此相互作用。在一些实施方案中，所述的Cκ结构域不与野生型CH1结构域相互作用，并且所述的CH1结构域不与野生型Cκ结构域相互作用。在一些实施方案中，所述的修饰的氨基酸选自表2。
在一些实施方案中还提供一种包括第一个Cκ/CH1对和第二个Cκ/CH1对的双特异性抗体，其中所述的第一对的Cκ和CH1片段包含选自以下群组的氨基酸：(a)Cκ中的26W，以及CH1中的11K和28N；(b)Cκ中的11W和26G，以及CH1中的11W；(c)Cκ中的26W和CH1中的11W；(d)Cκ中的17R和CH1中的9D；(e)Cκ中的17K和CH1中的9D；及其组合；并且第二对的所述的Cκ和CH1片段为野生型或者包含选自(a)-(e)的不同组的氨基酸残基。
附图简要说明
图1为显示其相互作用的一对Cκ和CH1结构域(来自1CZ8)的晶体结构(参与氢键的残基以粉红色着色；盐桥以黄色着色；疏水相互作用残基是以蓝色或绿色着色的棒)。
图2显示了Cκ和CH1结构域中的一些残基，其对于维持结构域之间的相互作用可能是重要的。
图3显示了针对不同相互作用氨基酸对的ala/trp突变的还原SDS-PAGE凝胶的图片。
图4A-4D显示了实施例3中分析的各种突变对的还原SDS-PAGE凝胶的图片。
图5A-B为显示Cκ和CH1结构域之间的结合的还原SDS-PAGE(5A)和非还原SDS-PAGE(5B)凝胶的组分。
图6A-C为显示抗体重链和轻链之间的结合的凝胶图像，其中一些包括突变。
图7A-D展示了各种双特异性抗体的结构。
图8A-B的数据显示测试的双特异性抗体与其各自的结合靶标的结合和功能效力。
详细描述
定义
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
在本发明中，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也旨在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得。它可能以包括化学合成的任何方式产生。
本发明中关于细胞、核酸例如DNA或RNA所使用的术语“分离的”，是指分别与存在于大分子的天然来源中的其它DNA或RNA所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。
在本发明中，术语“重组”涉及多肽或多核苷酸，意指非天然存在的多肽或多核苷酸的形式，其非限制性实施例可以通过组合产生通常并不存在的多核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。术语“不相关的”或“非同源的”序列表示与本发明公开的序列之一有小于40％的同一性，但优选小于25％的同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。该比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序，比如Ausubelet al.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序来确定。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST。特别地，程序是BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多核苷酸是具有上述指定百分比的同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多核苷酸。
术语“等价的核酸或多核苷酸”是指具有与核酸或其互补序列的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。双链核酸的同源物意指包括具有与其或其互补序列具有一定同源性的核苷酸序列的核酸。一方面，核酸的同源物能够与核酸或其互补序列杂交。同样地，“等价的多肽”是指与参考多肽的氨基酸序列具有一定同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列同一性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些方面，与参考的多肽或多核苷酸相比，等价的多肽或多核苷酸具有1、2、3、4或5个添加、缺失、取代及其组合。在某些方面，等价的序列保留参考序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。
杂交反应可以在不同的“严谨性”条件下进行。通常在约40℃条件下，在约10×SSC或相同等离子强度/温度的溶液中进行低严谨的杂交反应。通常在约50℃条件下，在约6×SSC中进行中度严谨的杂交反应，通常在约60℃条件下，在约1×SSC中进行高度严谨的杂交反应。杂交反应也可以在本领域技术人员熟知的“生理条件”下进行。生理条件的非限制性实施例指在细胞中通常存在的温度、离子强度、pH和Mg2+浓度。
多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和当多核苷酸是RNA时胸腺嘧啶置换为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”是指多种形式的基因或其部分的共存，具有至少两种不同形式(即两种不同的核苷酸序列)的基因的一部分被称为“基因的多态性区域”。多态性区域可以是单核苷酸，在不同的等位基因中其具有不同的同一性。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物的任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是非限制性的多核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。
在本发明中，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白质或肽。该种实施例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。
在本发明中，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管其结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的同一抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。
“单链可变片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
术语“抗体”包括可以在生物化学上区分的各种广泛种类的多肽。本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等，已被充分表征并且已知其赋予的功能特异性。鉴于本公开的内容，本领域普通技术人员容易辨别这些种类和同种型中的每一种的修饰形式，因此都在本发明公开的保护范围内。所有的免疫球蛋白种类都显然在本发明公开的保护范围内，后面的讨论通常针对免疫球蛋白分子的IgG种类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的口开始并延续通过可变区包围重链。
本发明公开的抗体、抗原结合多肽、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)，包含VK或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明公开的LIGHT抗体的抗Id抗体)。本发明公开的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或者亚类。
轻链可以分为kappa或lambda(κ、λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”根据功能使用。就这点而言，应理解，轻链(Vκ)和重链(VH)链部分的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CK结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如上所述，可变区使得抗体能够选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的子集结合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。该抗体四级结构形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VK链中各自的三个CDR(即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)限定。在某些情况下，例如某些来源于骆驼科动物的免疫球蛋白分子或基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，没有轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是特异性地定位以形成抗原结合结构域的短的、非连续的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“构架”区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。构架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。由定位的CDR形成的抗原结合域界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以容易地鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸，因为其已经被精确定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)以及Chothia andLesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括其所有的含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过本发明引用其全部内容并入本文。
根据Kabat和Chothia定义的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。尽管如此，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR都在本发明所定义和使用的术语的范围内。包含以上引用的每个参考文献所定义的CDR的适量的氨基酸残基在下表中被列出进行比较。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地根据抗体的可变区氨基酸序列确定出哪些残基包含特定的CDR。
Kabat Chothia
CDR-H1 31-35 26-32
CDR-H2 50-65 52-58
CDR-H3 95-102 95-102
CDR-L1 24-34 26-32
CDR-L2 50-56 50-52
CDR-L3 89-97 91-96
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。本发明所使用的“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)中提出的编号系统。
除上述表格之外，Kabat编号系统如下述方式描述CDR区：CDR-H1在大约第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基之后的大约9个残基)开始，包括大约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-H2在CDR-H1结束后的第15个残基处开始，包括大约16-19个氨基酸残基，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处结束。CDR-H3从CDR-H2结束后的大约第33个氨基酸残基开始；包括3-25个氨基酸；并以序列W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。CDR-L1大约从第24个残基开始(即在半胱氨酸残基之后)；包括约10-17个残基；并在下一个色氨酸残基处结束。CDR-L2从CDR-L1结束后的大约第16个残基开始，包括大约7个残基。CDR-L3在CDR-L2结束后的大约第33个残基(即在半胱氨酸残基之后)开始；包括大约7-11个残基并且以序列F或W-G-X-G结束，其中X指任何氨基酸。
其他一些编号系统包括“IMGT编号”和“IMGT外显子编号”。例如，对于恒定域CH1和Cκ，下表显示了IMGT外显子编号系统和Kabat编号系统之间的相关性。
CH1的IMGT外显子编号和Kabat编号
Cκ的IMGT外显子编号和Kabat编号
本公开的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，所述抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，所述可变区可的起源可为软骨鱼(例如，来自鲨鱼)。
本公开所用的术语“重链恒定区”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包含以下中的至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。例如，用于本公开内容的抗原结合多肽可包括含CH1结构域的多肽链；含CH1结构域的多肽链、至少一部分铰链结构域和CH2结构域的多肽链；含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链；或含CH1结构域、至少一部分铰链结构域，CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本公开的多肽包括含CH3结构域的多肽链。此外，用于本公开内容的抗体可缺少至少一部分CH2结构域(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解，可以修饰重链恒定区，使其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
本申请公开的抗体的所述重链恒定区可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可包含衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，所述重链恒定区可包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含嵌合铰链，其部分衍生自IgG1分子，部分衍生自IgG4分子。
如本申请所用，术语“轻链恒定区”包括衍生自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一种。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，其可以通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
如前所述，各种免疫球蛋白类的所述恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。如本申请所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大多为氨基末端)恒定区结构域。所述的CH1结构域与所述的VH结构域相邻，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本申请所用，术语“CH2结构域”包括重链分子的一部分，其使用常规编号系统(Kabat编号系统：残基244至360；和EU编号系统：残基231-340；参见Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983).)时，自抗体的约残基244延伸至约残基360。所述CH2结构域的独特之处在于它与另一个结构域不紧密配对。相反，两个N-连接的支链碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还有充分数据证明CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C-末端并且包含大约108个残基。
如本申请所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包含约25个残基并且具有柔性，因此允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux et al.,J.Immunol161:4083(1998))。
如本申请所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二巯基形成二硫键或桥的巯基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和Cκ区域通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在对应于使用Kabat编号系统时的239和242(EU编号系统位置时为226或229)的位置处连接。
如本申请所用，术语“嵌合抗体”将被认为是指其中的免疫反应性区域或位点从第一物种(根据本公开，其可以是完整的、部分的或经修饰的)获得或衍生的，且恒定区是获自第二物种的任何抗体。在某些实施方案中，靶结合区或位点来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，且恒定区为人源。
如本申请所用，“人源化百分比”通过确定人源化结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差异(即，非CDR差异)的数量，从氨基酸总数中减去该数量后再除以氨基酸总数并乘以100计算得到。
“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且所述结合需要抗原结合结构域和表位之间的某种互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域更容易与目标表位而非随机的无关表位结合时，则该抗体被称为“特异性结合”表位。术语“特异性”在本申请中用于限定特定抗体与特定表位结合的相对亲和力。例如，对于给定的表位，抗体“A”可以被认为具有比抗体“B”更高的特异性；或者可以说抗体“A”与表位“C”结合时，比与相关表位“D”结合具有更高的特异性。
经修饰的Cκ和CH1结构域
靶向两种抗原或表位的双特异性抗体(BsAb)将两种不同的单克隆抗体(mAb)的特异性和性质结合到单个分子中。当存在两组配对的VH-Ch1：VL-CL片段时，可能发生错配。为了避免衍生自两种不同抗体的VH-CH1：VL-CL片段的错配，已经使用了许多方法，例如Cross-Mab、普通轻链和FITIg。
实验实施例的目的是将突变引入Cκ和/或CH1结构域，特别是人结构域，以减少错配。优选地，突变体Cκ可显示与突变体CH1的良好结合，但所述的突变体Cκ与非突变的CH1结构域不结合或具有弱的结合，并且所述突变体CH1显示与未突变的Cκ弱结合或不结合。
首先，分析人Cκ和CH1的重要界面残基并发现5个热点。为了证实这些残基的重要性，对每种残基进行丙氨酸或色氨酸的突变。在Cκ的Gln17(Cκ_Q17)或CH1的Phe9(CH1_F9)的突变，以及在Cκ的Val26或Phe11(Cκ_V26_F11)的突变或CH1的Leu11(CH1_L11)的突变导致所述轻链和重链的配对大大减少。这些结果证实，Cκ_Q17/CH1_F9(在实施例中称为对1)和Cκ_V26_F11/CH1_L11组(在实施例中称为对2)对于Cκ和CH1的相互作用是重要的。随后，表达并分析了可能恢复配对的突变。这些修饰对于制备具有两个不同对的Cκ和CH结构域的双特异性抗体特别有用。
对于界面残基Cκ_V26_F11/CH1_L11(和任选的L28)，显示或预期以下突变能够恢复Cκ和CH1结构域的配对：
表1在Cκ的26位和任选地在11位以及在CH1的11位和任选在28位的突变组
No. Cκ(在26和/或11) CH1(在11和/或28)
1 26W 11W
2 26W 11K_和28N
3 11W和26G 11W
4 11W和26G 11K和28N
5 26F 11F
6 26W 11F
7 26F 11W
8 26L 11W
9 26M 11W
10 26E 11W
11 26W 11W和28R
12 11A和26W 11W
同样，对于界面残基Cκ_Q17/CH1_F9，显示或预期以下突变能够恢复Cκ和CH1结构域的配对：
表2在Cκ17/CH19的突变组
No. Cκ(在17) CH1(在9)
1 17R 9D
2 17K 9D
3 17R 9E
4 17K 9E
5 17D 9R
6 17D 9K
7 17H 9I
8 17R 9H
9 17H 9H
10 17R 9P
11 17D 9H
12 17I 9H
13 17H 9M
14 17R 9Q
15 17H 9Q
如实施例7中所示，破坏野生型Cκ和CH1结构域中的一个或多个现有盐桥并重新建立新的盐桥的另外的氨基酸取代可以进一步改善所需的配对特异性。野生型Cκ/CH1对在CH1_K96和Cκ_E16之间，CH1_K101和Cκ_D15之间以及CH1_H51和Cκ_D60之间具有盐桥。这些盐桥中的每一个都可以是合适的取代位点。
例如，在每个盐桥中，带正电荷的氨基酸(例如，K、R或H)可以被带负电荷的氨基酸(例如，E或D)取代，带负电荷的氨基酸(例如，E或D)可以被带正电的氨基酸(例如，K、R或H)取代。其中一个例子是CH1_K101E/Cκ_D15K或Cκ_D15H；另一个例子是CH1_K96D/Cκ_E16R；另一个例子是CH1_96E/Cκ_E16K；另一个例子是CH1_H51D/Cκ_D60K。这些和其他实例在表3中示出。可以独立地将每一个这些取代，或另外的本公开中描述的任何其他取代的盐桥用于制备新的CH1/Cκ配对。
表3破坏的和重建的盐桥
No. CH1 C<sub>K</sub>
1 K101E D15H
2 K101E D15K
3 K101E D15R
4 K101D D15H
5 K101D D15K
6 K101D D15R
7 K96D E16R
8 K96E E16K
9 K96D E16K
10 K96E E16R
11 K96D E16H
12 K96E E16H
13 H51D D60K
14 H51D D60R
15 H51D D60H
16 H51E D60K
17 H51E D60R
16 H51E D60H
在一个实施方案中，公开的抗体或其抗原结合片段包括具有取代L11W和K101E的CH1片段和具有取代V26W和D15K/H的Cκ片段。在一个实施方案中，公开的抗体或其抗原结合片段包括具有取代L11W和K96D的CH1片段和具有取代V26W和E16R的Cκ片段。在一个实施方案中，公开的抗体或其抗原结合片段包括具有取代L11W和K96E的CH1片段和具有取代V26W和E16K的Cκ片段。
这些突变组可用于制备能够彼此结合的突变的Cκ和CH1结构域，其不能与其野生型对应的CH1或Cκ结构域结合或具有降低的结合。抗体或抗原结合片段，特别是双特异性片段可以掺入这些Cκ和CH1结构域。
在一种情况下，双特异性抗体具有正常的IgG结构，其包括两个轻链-重链对。每条重链包括VH、CH1、CH2和CH3结构域，每条轻链包括VL和CL(例如Cκ)结构域。根据本公开的一个实施方案，Cκ/CH1对中的一对包括本公开的突变组而另一对不包括。在另一个实施方案中，Cκ/CH1对中的一对包括本公开的突变组，另一对包括不同的突变组。在一些实施方案中，两对中的任一对包括两个或更多个突变组(例如，表1中的一个组和表2中的另一个组)。
在另一种情况下，双特异性抗体具有正常IgG结构，其进一步在Fc片段的C末端融合至第二Fab片段的VH的N末端。这种抗体如图7A所示。根据本公开的一个实施方案，Fc片段的N末端侧的Cκ/CH1对或Fc片段的C末端侧的Cκ/CH1对中的任一对包括本发明的突变组，而另一对不包括。此外，所述突变组可以包括在Fc片段的N或C末端侧的Cκ/CH1对中。
在另一个实施方案中，所述的双特异性抗体具有如图7B所示的结构。在该结构中，每条重链和轻链包括两组串联的Cκ/CH1对。所述的突变组可以放在该抗体的任何位置，只要它们有利于所需的配对。另一种双特异性抗体在CH3结构域中具有已知的杵臼结构，如图7C所示。这里，本公开的突变组可以插入A和B Cκ/CH1对中的任一对或两对。图7D中示出了不具有CH2或CH3结构域的其他示例。
在一个实施方案中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包括人Cκ/CH1对，其中所述的Cκ结构域的氨基酸残基26为Trp，且所述的CH1结构域的氨基酸残基11为Trp。在一些方面，所述的抗体或其抗原结合片段还包含第二个人Cκ/CH1对，其中第二个Cκ结构域的氨基酸残基26不为Trp，第二个CH1结构域的氨基酸残基11不为Trp。在一些方面，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链可变区、轻链可变区、Fc区或其组合。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包括在Val26和/或Phe11位含氨基酸修饰的人Cκ结构域，并包含在Leu11位含氨基酸修饰的人CH1结构域。其中当所述的Cκ结构域与所述的CH1结构域配对时，修饰的氨基酸彼此相互作用。在一些实施方案中，所述的氨基修饰是与人IgG Cκ和CH1结构域相比。在一些实施方案中，所述的修饰的氨基酸选自表1。
在一些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段还包含第二个Cκ/CH1对，其中第二个Cκ结构域的氨基酸残基26为Val，第二个CH1结构域的氨基酸残基11为Leu。在一些方面，所述的第二个Cκ结构域的氨基酸残基11为Phe。
在另一个实施方案中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，其包括在Gln17位含氨基酸修饰的Cκ结构域，以及在Phe9位含氨基酸修饰的CH1结构域，其中当所述的Cκ结构域与所述的CH1结构域配对时，修饰的氨基酸彼此相互作用。在一些实施方案中，所述的氨基修饰是与人IgG Cκ和CH1结构域相比。在一些实施方案中，所述的修饰的氨基酸选自表2。
在一些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段还包含第二个Cκ/CH1对，其中第二个Cκ结构域的氨基酸残基17为Gln，第二个CH1结构域的氨基酸残基9为Phe。
在一些实施方案中，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其包括表1的突变组或表2的突变组。在一些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包括表1的突变组和表2的突变组。在一些实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段还包括表3的突变组。
所述的抗体或其抗原结合片段可以是任何已知类别的抗体，但优选为IgG类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型。所述的抗体或其片段可以为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
双特异性/双功能分子
在一些实施方案中提供了双特异性抗体。在一些实施方案中，上述的双特异性抗体对肿瘤抗原或微生物具有第一特异性。在一些实施方案中，所述的双特异性抗体对免疫细胞具有第二特异性。
在一些实施方案中，所述的免疫细胞选自由T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞构成的群组。所述的免疫细胞上的可靶向的分子包括例如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。其他实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3(也称为CD223)、CD28、CD122、4-1BB(也称为CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL，TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也称为CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和CD47。所述的双特异性的具体实例包括但不限于PD-L1/PD-1、PD-L1/LAG3、PD-L1/TIGIT和PD-L1/CD47。
“肿瘤抗原”是在肿瘤细胞中产生的抗原物质，即它在宿主中引发免疫应答。肿瘤抗原可用于鉴定肿瘤细胞，并且是用于癌症治疗的潜在候选物。体内的正常蛋白质不具有抗原性。然而，某些蛋白质在肿瘤发生过程中产生或过表达，因此对身体显得“陌生”。这可能包括与免疫系统隔离良好的正常蛋白质、通常以极少量产生的蛋白质、通常仅在某些发育阶段产生的蛋白质，或由于突变而结构被修饰的蛋白质。
本领域已知多种肿瘤抗原，并且可以通过筛选容易地鉴定新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和腱生蛋白。
还提供了不仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，PD-L1特异性的抗体或抗原结合片段，例如本申请所述的那些，可以任选地通过肽接头与免疫细胞因子或配体组合。连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。这种双功能分子可以将免疫检查点阻断效应与肿瘤部位局部免疫调节相结合。
编码抗体的多核苷酸和制备抗体的方法
本公开还提供了编码本公开的抗体、其变体或衍生物的分离的多核苷酸或核酸分子。本公开的所述多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的完整重链和轻链可变区。另外，本公开的所述多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或在不同的多核苷酸分子上编码抗原结合多肽、其变体或衍生物的重链和轻链可变区的部分。
制备抗体的方法是本领域熟知的并且在本申请中有所描述。在某些实施方案中，本公开的抗原结合多肽的可变区和恒定区都是全人源的。可以使用本领域描述的技术和如本申请所述的技术制备全人源抗体。例如，可以通过将抗原施用于转基因动物来制备针对特定抗原的全人源抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生这样的抗体，但其内源基因座已被失去功能。美国专利第6,150,584号、第6458592号和第6,420,140号描述了可用于制备此类抗体的示例性技术，其全部内容通过引用并入本申请。
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人)中引发有害的免疫应答。在一个实施方案中，使用本领域公认的技术修饰本公开的抗原结合多肽、其变体或衍生物以降低其免疫原性。例如，抗体可以是人源化的、灵长类化的、去免疫的、或可以制备的嵌合抗体。这些类型的抗体衍生自非人抗体，通常是鼠或灵长类动物抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性，但在人体中具有较低的免疫原性。这可以通过各种方法实现，包括(a)将整个非人可变结构域移植到人恒定区上以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人框架区和恒定区中，同时保留或不保留关键框架残基；或者(c)移植整个非人类可变结构域，但通过取代表面残基将它们“伪装”成类似人类的部分。这些方法在Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57:6851-6855(1984)；Morrison et al.,Adv.Immunol.44:65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.25:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31:169-217(1994)；以及U.S.Pat.Nos.:5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370中公开，所有这些专利均以引用的方式整体并入本申请。
去免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本申请所用，术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见，例如，国际申请公开：WO/9852976A1和WO/0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的可变重链和可变轻链序列，并且从每个V区创建一个人T细胞表位“图谱”，其显示表位相对于互补决定区(CDR)和其他关键残基的位置。分析来自T细胞表位图谱的单个T细胞表位，以鉴定对于改变最终抗体活性具低风险的可选择的氨基酸取代。设计了一系列备选的可变重链和可变轻链序列，其包含氨基酸取代的组合，随后将这些序列整合到一系列结合多肽中。通常，产生12种和24种变体抗体并测试其结合和/或功能。然后将包含修饰的可变区和人恒定区的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并将后续质粒导入到细胞系中以产生完整抗体。然后在适当的生物化学和生物学测定中比较抗体，并鉴定最佳变体。
本公开的抗原结合多肽的结合特异性可以通过体外测定来确定，例如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
或者，描述用于生产单链单元的技术(美国专利第4,694,778号；Bird,Science242:423-442(1988)；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55:5879-5883(1988)；和Ward et al.,Nature 334:544-554(1989))可适用于产生本公开的单链单元。通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用用于大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 242:1038-1041(1988))。
可用于产生单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括美国专利第4,946,778号和第5,258,498号；Huston et al.,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu et al.,Proc.Natl.Sci.USA 90:1995-1999(1993)；和Skerra et al.,Science 240:1038-1040(1988)中描述的那些。对于一些用途，包括人体内抗体的体内使用和体外检测测定，可优选使用嵌合、人源化或全人源抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al.,BioTechniques4:214(1986)；Gillies et al.,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；美国专利第5,807,715号、第4,816,567号和第4,816397号，其全部内容通过引用并入本申请。
人源化抗体是衍生自非人物种抗体的抗体分子，其结合所需抗原，并具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模，来鉴定对抗原结合和序列比对重要的框架残基，以鉴定特定位置的异常框架残基(参见，例如，Queen et al.,美国专利第5,585,089号；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)，其通过引用整体并入本申请)。可以使用本领域已知的多种技术对抗体进行人源化，包括，例如CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；StudniCκa et al.,ProteinEngineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.et al.,Proc.Natl.Sci.USA 91:969-973(1994))和链改组(shuffling)(美国专利第5,565,332号，其全部内容通过引用并入本申请)。
全人源抗体对于人类患者的治疗是特别理想的。全人源抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还参见美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及PCT公开文本WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其全部内容通过引用并入本申请。
还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生全人源抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组将人免疫球蛋白基因座引入该小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因而使之分别或同时失去功能。特别地，JH区域的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达全人源抗体的纯合子代。用选择的抗原，例如所需靶多肽的全部或部分，以正常方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关生产人抗体的技术的概述，参见Lonberg and HuszarInt.Rev.Immunol.73:65-93(1995)。关于用于产生全人源抗体和人单克隆抗体的该技术的详细讨论以及用于产生这种抗体的方案，参见例如PCT公开文本WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，通过引用其整体将它们并入本申请。此外，诸如Abgenix，Inc.(加利福尼亚州弗里蒙特)和Genpharm(加利福尼亚州圣何塞)等公司可以利用与上述技术类似的技术，提供针对选定抗原的全人源抗体。
还可以使用被称为“引导选择”的技术产生识别所选表位的全人源抗体。在该方法中，使用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体来指导选择识别相同表位的全人源抗体。(Jespers et al.,Bio/Technology 72:899-903(1988)。还参见美国专利第5,565,332号，其全部内容通过引用并入本申请。)
在另一个实施方案中，可以使用常规方法容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，可将所述的DNA置于表达载体中，然后将其转染到原核或真核宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，否则它们不产生免疫球蛋白。更特别地，分离的DNA(其如本申请所述可以为合成的)可以用于克隆用于制备抗体的恒定区和可变区序列，如Newman等于1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中所述，其通过引用结合到本申请中。本质上，这需要从所选细胞中提取RNA，转化为cDNA，并使用Ig特异性引物通过PCR进行扩增。用于此目的的合适的引物也描述于美国专利第5,658,570号。如下面将详细讨论的，可以以相对大的量培养表达所需抗体的转化细胞，以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
另外，使用常规重组DNA技术，可以将本公开内容的所述的抗原结合多肽的一个或多个CDR插入框架区内，例如插入人框架区，以对非人抗体进行人源化。所述的框架区可以是天然存在的或保守框架区，优选人框架区(参见，例如，Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)中用于人框架区的列表)。优选地，通过所述的框架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码特异性结合所需多肽的至少一个表位的抗体，例如LIGHT。优选地，可以在所述的框架区内进行一个或多个氨基酸取代，并且优选地，所述的氨基酸取代改善抗体与其抗原的结合。另外，此类方法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。本公开涵盖针对多核苷酸的其他改变，并且在本领域的技术范围内。
另外，可以使用通过剪接具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因以及来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因而开发的用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:851-855(1984)；Neuberger et al.,Nature 372:604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314:452-454(1985))。如本申请所用，嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的那些。
Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)中公开了另一种用于产生重组抗体的高效方法。具体地，该技术胡产生含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化抗体。该参考文献通过引用整体并入本申请。此外，该技术也在共同转让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号有所描述，其中的每一篇都通过引用并入本申请。
或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养抗体生成细胞系。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述。在这方面，适用于如下所述的本公开内容的技术在Current Protocols in Immunology,Coligan et al.,Eds.，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)中描述，其全文包括增补通过引用并入本申请。
此外，本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码本公开的抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的突变。优选地，所述的变体(包括衍生物)编码相对于参考可变重链区、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、可变轻链区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代，或少于2个氨基酸取代。或者，可以在全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
本公开还提供了药物组合物。此类组合物包含有效量的抗体和可接受的载体。在一些实施方案中，所述的组合物还包含第二种抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，特别是人类。此外，“药学上可接受的载体”通常是无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的制剂助剂。
术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油，芝麻油等。当静脉内施用所述的药物组合物时，水为优选的载体。盐溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述的组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖也可以使用。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。所述的组合物可以与传统的粘合剂和载体如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例由E.W.Martin在雷明登氏药学全书中描述，其通过引用并入本申请。此类组合物含有治疗有效量的抗原结合多肽，优选为纯化形式，以及合适量的载体，以便为患者提供合适的施药形式。所述的制剂应适合给药方式。母本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一个实施方案中，根据常规程序将所述的组合物配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗含水缓冲液。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式单独或混合在一起供应，例如，在指示活性剂的量的密封容器如安瓿或小药囊中以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式。当所述的组合物通过输注施用时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合成分。
本公开的化合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，例如那些衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺的阳离子、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
具体实施方式
实施例1四种Fab片段的Cκ/CH1界面相互作用分析
该实施例分析了一些抗体Fab片段的Cκ/CH1界面相互作用。
结构1：Fab 1F8的Cκ和CH1的界面相互作用分析
1F8是由对人CD47特异的抗体制备的Fab分子。2017年以的分辨率解析获得CD47与抗CD47 Fab 1F8的复合晶体结构(轻链具有219个氨基酸，其中Cκ包括第114-219位氨基酸；重链具有220个氨基酸，其中CH包括第119-220位氨基酸)。
在该Fab片段的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH结构域的32个残基和来自Cκ结构域的35个残基。1F8在CH结构域的Ser14和Gly20之间具有连续的残基。与4NYL相比，来自CH片段的Lys16主链氧原子和来自Cκ片段的残基Lys100之间形成另外一个氢键(参见下面的结构4)。疏水相互作用类似于如下所示的其他结构。
氢键(距离截值：
注：
1.只要旋转Lys30的NZ，CH-Lys30和Ser24之间的HD可以在其他三种结构中形成。
2.因为序列不同于其他3个pdb，在CH-Lys16/Cκ-Lys100和CH-Ser102/Cκ-Glu106之间形成额外HD。
1F8的Cκ和CH1之间的盐桥
疏水界面
*在该表中也排除了涉及氢键和盐键的疏水接触
自由能偏差分析确定1F8 CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前10个残基，用粗体表示)。
1F8 CH1中的界面残基
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
在Cκ结构域中，七个残基可能参与相互作用。
在1F8 Cκ中的界面残基
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正直涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
结构2：1CZ8的Cκ和CH1的界面相互作用分析
1CZ8是由对VEGF特异的抗体制备的Fab分子。2000年，以的分辨率解析获得VEGF与Fab的复合晶体结构。
氨基酸残基在CH结构域中形成三个反向平行β折叠，在Cκ结构域中形成四个反向平行β折叠。这些β折叠在界面中形成面对面的构象。在该Fab片段的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH的28个残基和来自Cκ结构域的30个残基。Cκ和CH1结构域之间存在三个氢键。例如，在1CZ8中，CH残基His 51以及Pro54和Leu57的主链氧原子分别与Cκ残基的Asn31、Ser55和Gln53形成三个氢键。这些氢键位于界面的一侧。
疏水相互作用主要位于界面的中心和另一侧，在CH残基Phe9、Leu11、Phe53、Val68和Cκ残基Gln17、Phe11、Val26、Phe69和Val28之间。在C末端的CH残基Lys96和Lys101与Cκ残基Asp15和Glu16之间形成两个盐桥，以稳定界面另一侧的CH和Cκ复合物结构(图1；与氢键相关的残基以粉红色着色；盐桥为黄色；疏水相互作用残基为蓝色或绿色的棍棒)。
氢键(距离截值：
Cκ和CH1之间的盐桥
疏水界面(距离截值：
对于Cκ和CH1相互作用最重要的5个界面残基
注意：排除了盐桥残基
自由能偏差分析确定1cz8 CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前9个残基，用粗体表示)。
界面残基：1cz8 CH1
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
在Cκ结构域中，五个残基可能参与相互作用。
界面残基：1cz8 Cκ
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
结构3：1L7I的Cκ和CH1的界面相互作用分析
1L7I是靶向ErbB2的已知Fab分子(PDB ID：1L7I)。该抗-ErbB2 Fab2C4的晶体结构在2002年以得到解析。
在该Fab片段(PDB ID 1L7i)的Cκ和CH1结构域之间的界面中，存在来自CH的总共33个残基和来自Cκ结构域的35个残基。
1L7i的氢键(距离截值：
1L7i的Cκ和CH1之间的盐桥
注意：CH的C末端残基Cys 107和Cκ的Cys 103形成二硫桥，其破坏在CH残基Lys101和Cκ残基Asp15之间的盐桥(其他结构中可见)。
1L7i的疏水界面
自由能偏差分析确定1L7i CH1中的一些残基与Cκ残基具有更强的相互作用(参见下表中的前12个残基，用粗体表示)。
界面残基：1L7i CH1
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
在Cκ结构域中，九个残基可能参与相互作用。
界面残基：1L7i Cκ
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
结构4：4NYL的Cκ和CH1的界面相互作用分析
所研究的第四种结构是4NYL，其为一种靶向TNFα的已知Fab分子(PDB ID：4NYL)。2014年以解析获得阿达木单抗FAB片段的晶体结构在(用相对高的Rfree(Rfree＝35.8％/R＝27.5)，这意味着该结构不适合于详细分析)。阿达木单抗是抗TNFα的抗体，用于治疗患有类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎的患者，以及患有幼年特发性关节炎的儿童。在阿达木单抗Fab片段(PDB ID 4NYL)的Cκ和CH1结构域之间的界面中，总共有来自CH1的24个残基和来自CK结构域的28个残基。
4NYL具有与1CZ8相同的氢键和疏水相互作用。由于缺乏C-末端Ch残基，在CH的C-末端的残基Lys96和Cκ残基Glu15之间仅形成一个盐桥。
4NYL的氢键(距离截值：
注意：由于分辨率限制，未发现水介导的氢键。
4NYL的Cκ和CH之间的盐桥
注意：由于4NYL缺失C-末端残基100-103，因此在CH-Lys101和Cκ-Asp15之间没有盐桥。
4NYL的疏水界面
自由能偏差分析发现4NYL CH1中的一些残基与CK残基具有更强的相互作用(参见下表中的前九个残基，表示为粗体)。
界面残基：4NYL CH1
位置 残基 键 ASA BSA DeltaG DeltaG的绝对值
53 PHE 96.83 95.9 1.53 1.53
9 PHE 97.57 74.98 1.2 1.2
11 LEU 67.89 65.22 1.04 1.04
56 VAL 102.16 64.24 1.03 1.03
28 LEU 56.92 51.23 0.82 0.82
54 PRO H 117.72 48.38 0.65 0.65
68 VAL 38.86 38.35 0.61 0.61
24 ALA 56.65 54.38 0.59 0.59
51 HIS H 109.04 76.51 0.54 0.54
70 THR 65.96 30.78 0.47 0.47
12 ALA 65.59 34.43 -0.27 0.27
10 PRO 58.21 35.55 0.21 0.21
96 LYS 71.02 8.03 0.13 0.13
13 PRO 110.53 7.16 0.11 0.11
58 GLN 45.51 21.8 0.11 0.11
52 THR 68.63 7.32 -0.08 0.08
57 LEU H 105.07 6.99 -0.08 0.08
25 LEU 10.31 4.61 0.07 0.07
66 SER 27.04 21.25 0.07 0.07
23 ALA 20.19 3.62 0.06 0.06
22 THR 99.8 17.73 0.04 0.04
59 SER 129.22 4.43 -0.04 0.04
30 LYS 68.02 48.93 -0.03 0.03
64 SER 15.79 1.32 -0.01 0.01
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
在Cκ结构域中，七个残基可能参与相互作用。
界面残基：4NYL Cκ
位置 残基 键 ASA BSA DeltaG DeltaG的绝对值
11 PHE 94.4 92.85 1.49 1.49
9 PHE 98.42 57.04 0.91 0.91
28 LEU 53.03 53.03 0.85 0.85
57 THR 77.07 52.33 0.81 0.81
26 VAL 46.03 45.87 0.73 0.73
53 GLN H 146.87 74.61 -0.59 0.59
30 ASN 53.19 42.51 -0.51 0.51
14 SER 73.33 53.83 0.41 0.41
16 GLU 81.87 23.61 0.36 0.36
69 SER 36.91 32.06 0.36 0.36
31 ASN H 68.16 17.44 -0.21 0.21
22 THR 53.37 11.88 0.19 0.19
67 SER 17.29 16.83 0.15 0.15
20 SER 77.72 8.53 0.14 0.14
12 PRO 72.19 25.45 0.12 0.12
56 VAL 66.37 16.66 -0.12 0.12
60 ASP 61.84 6.5 -0.11 0.11
73 THR 69.46 16.93 0.1 0.1
17 GLN 47.27 41.79 0.08 0.08
24 SER 37.71 35.01 0.05 0.05
54 GLU 93.02 10.6 -0.05 0.05
58 GLU 154.24 3.58 0.05 0.05
10 ILE 33.1 3.56 -0.04 0.04
55 SER H 70.17 60.32 0.04 0.04
13 PRO 16.67 1.84 0.03 0.03
68 LEU 7.35 1.92 0.03 0.03
71 THR 45.38 15.86 0.01 0.01
键：键型，若形成氢键或盐桥，H：氢键，S：盐桥
ASA：可及表面积
BSA：掩埋表面积
DeltaG：能量变化，正值涉及更多疏水相互作用，而负值表示更多亲水相互作用
DeltaG的Abs：DeltaG的绝对值，表格按此键入值排序。DeltaG变化超过0.5的残基(粗体)可视为残基对稳定蛋白质的贡献更大。
1cz8、4nyl、1l7i、hCD47-1_1F8的CH1_Cκ界面分析
上述四种结构的界面分析包括盐桥、氢键和疏水相互作用。计算所有DeltaG并且通过DeltaG对氨基酸进行排序。对于每种结构，选择前10对并进行进一步分析。分析集中在疏水相互作用，而不考虑其他相互作用。然后选择前5对作为主要的候选。
CH1的序列重新编号
Cκ的重新编号
1cz8、4nyl、1l7i和1F8的最高自由能残基汇总表
加粗:独特的残基下划线:低同源性残基
没有标记:保守残基
具有最稳定作用的残基
对于Cκ和CH1相互作用重要的5个界面残基(基于结构和自由能)
注意：排除了盐桥残基
实施例2发现对Cκ和CH1相互作用重要的界面残基
基于Cκ和CH1的界面分析，本实施例总结了对Cκ和CH1相互作用最重要的界面残基(参见下面的图2和表4)。
表4影响Cκ/CH1相互作用的残基对
注意：排除了盐桥残基
根据上表，使用丙氨酸或色氨酸单突变来测试每个界面残基。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达以筛选Ala和Trp。突变列表如下所列。
丙氨酸筛选
色氨酸筛选
名称 描述 Cκ CH1
Cκ/CH1_028 Cκ/CH1_A24W WT A24W
Cκ/CH1_029 Cκ/CH1_L11F WT L11F
Cκ/CH1_030 Cκ/CH1_L11W WT L11W
Cκ/CH1_031 Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F F9A_F11A L11F_A24F
Cκ/CH1_032 Cκ_V26W/CH1 V26W WT
如图3的SDS-PAGE图像所示，对于第2对(Cκ_F11_V26和CH1_L11)，两个突变体Cκ_F11A/CH1和Cκ_V26A/CH1强烈干扰了Cκ和CH1的相互作用；两个突变体Cκ_V26W/CH1和Cκ/CH1_L11W也破坏了相互作用(图4)。突变Cκ/CH1_L11A和Cκ/CH1_F9A(来自第1对)也破坏了相互作用。相反，突变体Cκ_F9A/CH1、Cκ/CH1_A24F和Cκ/CH1_A24L不影响Cκ和CH1的相互作用。这表明第3对(Cκ_F9和CH1_A24)对于Cκ和CH1的结合不重要。
配对编号 CH1 Cκ 重要与否
第1对 Phe9 Gln17 是
第2对 Leu11 Phe11,Val26 是
第3对 Ala24 Phe9 否
实施例3通过Discovery Studio开发配对1的突变
在鉴定对维持Cκ和CH1之间的相互作用重要的残基对后，本实施例测试了建立新的相互作用的突变对。这种研究成果的理论基础是：突变体Cκ可以显示出与突变体CH1的良好结合；但突变体Cκ不与野生型CH1结合或为弱结合，突变体CH1与野生型Cκ结合弱或不结合。
第1对突变的研究
第1对中的残基是Cκ_Q17和CH1_F9(表4)。本发明人设计并分析了Cκ/CH1_033至050的这些突变。Cκ/CH1_051-066突变对由软件程序Discovery Studio(DS)开发，用于设计该位点的随机突变。它在CK_Q17和CH1_F9中生成了8对，如下所示。
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:PHE9>ILE.L:GLN17>HIS 0.03 中性 0.15 0.03 -0.07 0
H:PHE9>HIS.L:GLN17>ARG 0.07 中性 -1.42 1.4 0.09 0
H:PHE9>LYS.L:GLN17>ASP 0.09 中性 2.15 -3.23 0.72 0
H:PHE9>HIS.L:GLN17>HIS 0.19 中性 0.16 -0.07 0.17 0
H:PHE9>PRO.L:GLN17>ARG 0.25 中性 0.13 1.33 -0.55 0
H:PHE9>MET.L:GLN17>HIS 0.29 中性 0.12 0.09 0.21 0
H:PHE9>GLN.L:GLN17>ARG 0.3 中性 -0.42 1.89 -0.49 0
H:PHE9>GLN.L:GLN17>HIS 0.33 中性 -0.46 -0.12 0.7 0
注意：突变效能：突变后效能的差别；低值意味着更稳定；VDW：范德华力。
Cκ/CH1_033 Cκ_Q17R/CH1 Q17R WT
Cκ/CH1_034 Cκ_Q17K/CH1 Q17K WT
Cκ/CH1_035 Cκ_Q17D/CH1 Q17D WT
Cκ/CH1_036 Cκ_Q17E/CH1 Q17E WT
Cκ/CH1_037 Cκ/CH1_F9R WT F9R
Cκ/CH1_038 Cκ/CH1_F9K WT F9K
Cκ/CH1_039 Cκ/CH1_F9D WT F9D
Cκ/CH1_040 Cκ/CH1_F9E WT F9E
Cκ/CH1_041 Cκ_F11E_V26A/CH1_L11R F11E_V26A L11R
Cκ/CH1_042 Cκ_Q17K_F11K_V26A/CH1_F9E_L11E Q17K_F11K_V26A F9E_L11E
Cκ/CH1_043 Cκ_Q17R/CH1_F9D Cκ_Q17R CH1_F9D
Cκ/CH1_044 Cκ_Q17K/CH1_F9D Cκ_Q17K CH1_F9D
Cκ/CH1_045 Cκ_Q17R/CH1_F9E Cκ_Q17R CH1_F9E
Cκ/CH1_046 Cκ_Q17K/CH1_F9E Cκ_Q17K CH1_F9E
Cκ/CH1_047 Cκ_Q17D/CH1_F9R Cκ_Q17D CH1_F9R
Cκ/CH1_048 Cκ_Q17D/CH1_F9K Cκ_Q17D CH1_F9K
Cκ/CH1_049 Cκ/CH1_F9D_L11A Cκ CH1_F9D_L11A
Cκ/CH1_050 Cκ_Q17K/CH1_F9D_L11A Cκ_Q17K CH1_F9D_L11A
Cκ/CH1_051 Cκ_Q17H/CH1_F9I Cκ_Q17H CH1_F9I
Cκ/CH1_052 Cκ_Q17R/CH1_F9H Cκ_Q17R CH1_F9H
Cκ/CH1_053 Cκ_Q17H/CH1_F9H Cκ_Q17H CH1_F9H
Cκ/CH1_054 Cκ_Q17R/CH1_F9P Cκ_Q17R CH1_F9P
Cκ/CH1_055 Cκ_Q17D/CH1_F9H Cκ_Q17D CH1_F9H
Cκ/CH1_056 Cκ_Q17I/CH1_F9H Cκ_Q17I CH1_F9H
Cκ/CH1_057 Cκ_Q17H/CH1_F9M Cκ_Q17H CH1_F9M
Cκ/CH1_058 Cκ_Q17R/CH1_F9Q Cκ_Q17R CH1_F9Q
Cκ/CH1_059 Cκ_Q17H/CH1_F9Q Cκ_Q17H CH1_F9Q
Cκ/CH1_060 Cκ_Q17H/CH1 Cκ_Q17H CH1
Cκ/CH1_061 Cκ_Q17I/CH1 Cκ_Q17I CH1
Cκ/CH1_062 Cκ/CH1_F9I Cκ CH1_F9I
Cκ/CH1_063 Cκ/CH1_F9H Cκ CH1_F9H
Cκ/CH1_064 Cκ/CH1_F9P Cκ CH1_F9P
Cκ/CH1_065 Cκ/CH1_F9M Cκ CH1_F9M
Cκ/CH1_066 Cκ/CH1_F9Q Cκ CH1_F9Q
下面列出了两个好的突变对：
突变ID 位置编号 Kabat编号
Cκ/CH1_043 Cκ_Q17R/CH1_F9D Cκ_Q124R/CH1_F122D
Cκ/CH1_044 Cκ_Q17K/CH1_F9D Cκ_Q124K/CH1_F122D
实施例4通过Discovery Studio开发第2对的突变
对于第2对，测试每个界面残基的丙氨酸/色氨酸单突变。构建并表达不含VH和VL的IgG(-Fv)用于Ala和Trp筛选。此示例使用Discovery Studio为该位置设计随机突变。
三个良好的突变对为下面列出的Cκ/CH1_072、Cκ/CH1_079和Cκ/CH1_107：
突变ID 位置编号 Kabat编号
Cκ/CH1_072 Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N Cκ_V133W/CH1_L124K_L141N
Cκ/CH1_079 Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W Cκ_F118W_V133G/CH1_L124W
Cκ/CH1_107 Cκ_V26W/CH1_L11W Cκ_V133W/CH1_L124W
第2对突变的研究
第2对中重要的残基是Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28(参见表4)。该热点的突变开发策略是为修复突变V26W或L11W。本实施例还测试了引入Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28的饱和点突变；然后应用DS计算所有有效突变。
策略1：具有固定突变V26W的同时，针对CH1_L11_L28引入随机点突变；然后使用DS软件为该位置生成一些变异对。以下列出一些优选的突变对。
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP -0.14 中性 -0.31 0.11 -0.04 0
H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP -0.08 中性 -0.56 0.29 0.06 0
H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP -0.03 中性 -0.46 0.32 0.04 0
H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP 0.18 中性 -0.01 0.3 0.04 0
H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP 0.31 中性 -0.83 0.58 0.49 0
H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP 0.38 中性 -1.76 2.45 0.04 0
H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP 0.41 中性 0.16 0.18 0.27 0
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP -0.54 Stabilizing -2.58 0.34 0.66 0
H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP -0.5 Neutral -4.5 3.13 0.21 0
H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP -0.43 Neutral -2.26 0.37 0.58 0
H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP -0.21 Neutral -1.49 0.12 0.54 0
H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP -0.09 Neutral -1.22 0.3 0.42 0
H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP -0.06 Neutral -1.14 0.16 0.49 0
H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP 0.1 Neutral -1.04 0.12 0.64 0
H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP 0.38 Neutral -2.6 2.36 0.57 0
策略2：具有固定突变L11W的同时，针对Cκ1_F11_V26引入随机点突变；然后使用DS软件为该位置生成一些变异对。以下列出一些优选的突变对。
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:LEU11>TRP.L:VAL26>LEU -2.24 Stabilizing -4.78 0.32 -0.01 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>MET -1.89 Stabilizing -4.2 0.19 0.13 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>TRP -1.38 Stabilizing -3.01 0.58 -0.19 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLU -1.21 Stabilizing -3.88 0.87 0.34 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>LYS -0.9 Stabilizing -5.72 3.44 0.27 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>CYS -0.84 Stabilizing -1.95 0.12 0.09 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>SER -0.68 Stabilizing -2.65 0.42 0.49 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>ALA -0.6 Stabilizing -1.65 0.02 0.25 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>GLY -0.26 Neutral -1.66 0.16 0.56 0
H:LEU11>TRP.L:VAL26>PRO -0.19 Neutral -0.91 0.1 0.25 0
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:LEU11>TRP.L:PHE11>HIS -0.3 Neutral -1.46 0.14 0.41 0
策略3：针对Cκ_F11_V26和CH1_L11_L28引入饱和点突变；然后使用DS计算所有有效突变。产生了下面列出的23个优选的突变对。
突变 突变效能 影响 VDW 静电 熵 非极性
H:LEU11>VAL.L:VAL26>TRP -0.14 Neutral -0.31 0.11 -0.04 0
H:LEU11>ASN.L:VAL26>TRP -0.08 Neutral -0.56 0.29 0.06 0
H:LEU11>MET.L:VAL26>TRP -0.03 Neutral -0.46 0.32 0.04 0
H:LEU11>MET.L:VAL26>GLU 0.14 Neutral -0.04 -0.17 0.28 0
H:LEU11>ASN.L:VAL26>GLU 0.16 Neutral -0.65 0.14 0.47 0
H:LEU11>ILE.L:VAL26>TRP 0.18 Neutral -0.01 0.3 0.04 0
H:LEU11>PRO.L:VAL26>GLU 0.28 Neutral 0.39 -0.52 0.39 0
H:LEU11>MET.L:VAL26>LEU 0.3 Neutral 0.78 0.05 -0.13 0
H:LEU11>SER.L:VAL26>TRP 0.31 Neutral -0.83 0.58 0.49 0
H:LEU11>VAL.L:VAL26>GLU 0.34 Neutral 0.22 -0.32 0.44 0
H:LEU11>GLU.L:VAL26>TRP 0.38 Neutral -1.76 2.45 0.04 0
H:LEU11>GLY.L:VAL26>TRP 0.41 Neutral 0.16 0.18 0.27 0
H:LEU11>ILE.L:VAL26>GLU 0.43 Neutral 0.38 -0.22 0.4 0
H:LEU11>MET.L:VAL26>MET 0.44 Neutral 0.91 0.01 -0.02 0
H:LEU28>SER.L:VAL26>TRP -0.54 Stabilizing -2.58 0.34 0.66 0
H:LEU28>GLU.L:VAL26>TRP -0.5 Neutral -4.5 3.13 0.21 0
H:LEU28>ASN.L:VAL26>TRP -0.43 Neutral -2.26 0.37 0.58 0
H:LEU28>CYS.L:VAL26>TRP -0.21 Neutral -1.49 0.12 0.54 0
H:LEU28>THR.L:VAL26>TRP -0.09 Neutral -1.22 0.3 0.42 0
H:LEU28>VAL.L:VAL26>TRP -0.06 Neutral -1.14 0.16 0.49 0
H:LEU28>ALA.L:VAL26>TRP 0.1 Neutral -1.04 0.12 0.64 0
H:LEU28>ASP.L:VAL26>TRP 0.38 Neutral -2.6 2.36 0.57 0
H:LEU28>VAL.L:VAL26>GLU 0.42 Neutral -0.19 -0.07 0.62 0
基于上述突变对，对于第1对，通过SDS-PAGE(还原和未还原，图4A-D)分析所有突变对；对于第2对，选择具有最低自由能的一些有效突变对进行分析。在所有突变对中，三个突变对Cκ/CH1_107更有效。结果可与已发表的突变对相媲美。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达每个突变对。突变列表如下所示。
三个良好的突变对是以下列出的Cκ/CH1_072、Cκ/CH1_079和Cκ/CH1_107：
Cκ/CH1_072 Cκ_V26W/CH1_L11K_L28N
Cκ/CH1_079 Cκ_F11W_V26G/CH1_L11W
Cκ/CH1_107 Cκ_V26W/CH1_L11W
如图5A-5B中的SDS-PAGE凝胶图片所示，突变对Cκ_V26W/CH1_L11W重新建立了Cκ和CH1之间的结合(CK_L28Y_S69W/CH1_H51A_F53G用作对照)。
实施例5通过Discovery Studio改进突变对Cκ_V26W/CH1_L11W
策略4：具有固定突变Cκ_V26W和CH1_L11W的同时，针对Cκ_F11和CH1_L28引入饱和点突变；然后DS用于计算所有有效突变。产生了下面列出的23个优选的突变对。
实施例6突变对的开发
对于第2对，测试每个界面残基的丙氨酸/色氨酸单突变。构建不含VH和VL的IgG(-Fv)并表达，用于Ala和Trp筛选。突变列表如下所示。
名称 描述 Cκ CH1
Cκ/CH1_001 Cκ/CH1 WT WT
Cκ/CH1_002 Cκ_L28Y_S69W/CH1_H51A_F53G L28Y_S69W H51A_F53G
Cκ/CH1_003 Cκ/CH1_H51A_F53G WT H51A_F53G
Cκ/CH1_004 Cκ/CH1_D31K_F53T_V68F WT D31K_F53T_V68F
Cκ/CH1_005 Cκ/CH1_F9A_F53A WT F9A_F53A
Cκ/CH1_006 Cκ_F9G_F11A_K100A/CH1 F9G_F11A_K100A WT
Cκ/CH1_007 Cκ_F11A/CH1 F11A WT
Cκ/CH1_008 Cκ_F9A_F11A/CH1 F9A_F11A WT
Cκ/CH1_009 Cκ_F11A_K100A/CH1 F11A_K100A WT
Cκ/CH1_010 Cκ_F9A_K100A/CH1 F9A_K100A WT
Cκ/CH1_011 Cκ/CH1_F9A_L11A WT F9A_L11A
Cκ/CH1_012 Cκ/CH1_L11A_F53A WT L11A_F53A
Cκ/CH1_013 Cκ/CH1_F9A WT F9A
Cκ/CH1_014 Cκ/CH1_L11A WT L11A
Cκ/CH1_015 Cκ_F9A/CH1 F9A WT
Cκ/CH1_016 Cκ_F9A_F11M/CH1 F9A_F11M WT
Cκ/CH1_017 Cκ/CH1_A24F WT A24F
Cκ/CH1_018 Cκ/CH1_A24L WT A24L
Cκ/CH1_019 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24F F9A_F11A A24F
Cκ/CH1_020 Cκ_F9A_F11A/CH1_A24L F9A_F11A A24L
Cκ/CH1_021 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24F F9A_F11M A24F
Cκ/CH1_022 Cκ_F9A_F11M/CH1_A24L F9A_F11M A24L
Cκ/CH1_023 Cκ_V26A/CH1 V26A WT
Cκ/CH1_024 Cκ_V26A_F11A/CH1 V26A_F11A WT
Cκ/CH1_025 Cκ/CH1_L11F_L28G WT L11F_L28G
Cκ/CH1_026 Cκ_V26A/CH1_L11F_L28G V26A L11F_L28G
Cκ/CH1_027 Cκ_V26A_F11A/CH1_L11F_L28G V26A_F11A L11F_L28G
Cκ/CH1_028 Cκ/CH1_A24W WT A24W
Cκ/CH1_029 Cκ/CH1_L11F WT L11F
Cκ/CH1_030 Cκ/CH1_L11W WT L11W
Cκ/CH1_031 Cκ_F9A_F11A/CH1_L11F_A24F F9A_F11A L11F_A24F
Cκ/CH1_032 Cκ_V26W/CH1 V26W WT
实施例7盐桥改造
实施例1中Cκ和CH1的界面相互作用分析表明，1F8、1CZ8、1L7I和4NYL的CH1和Cκ之间的共同盐桥如下：
在1F8和1CZ8中还有一个盐桥：
因此，该实施例集中于具有两个盐桥的1F8的CH1和Cκ，并利用Discovery Studio在CH1和Cκ内设计新的盐桥对，其不利于突变的CH1或Cκ与其WT对应物的结合，并利用新的盐桥重建在突变的CH和Cκ之间的结合。
盐桥CH1_LYS96和Cκ_GLU16的设计。如下表所示，两对显示用新盐桥稳定CH1mut和Cκmut：
CH1：LYS96>ASP突变和Cκ：GLU16>ARG突变；
CH1：LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>ARG突变；
Discovery Studio进一步用于发现新的盐桥，其可以与新的Cκ_V26W和CH1_L11W协同作用，以破坏突变的CH1或Cκ与其WT对应物的结合，并重建突变的CH和Cκ之间的结合。如下表所示：三对显示与Cκ_V26W和CH1_L11W协同作用稳定CH1mut和Cκmut：
CH1：LEU11>TRP；LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>LYS；VAL26>TRP突变
CH1：LEU11>TRP；LYS96>GLU突变和Cκ：GLU16>ARG；VAL26>TRP突变
CH1：LEU11>TRP；LYS101>GLU突变和Cκ：ASP15>LYS；VAL26>TRP突变
表5：在CH1_K96/Cκ_E16中的突变
表6：在CH1_K101/Cκ_D15中的突变
实施例8改变盐桥的测试
构建含有编码CH1-CH2-CH3或Cκ的多核苷酸的质粒。在下面列出的一些结构域中引入突变。
将质粒瞬时转染到293F细胞中用于蛋白质表达。通过蛋白A柱和抗FLAG亲和凝胶纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE(每泳道5μg)分析纯化的蛋白质。由于蛋白A仅与重链结合，轻链的密度表明重链和轻链之间的结合强度。
在第一批中，测试了13种抗体。表7列出了这些抗体中包含的突变。
表7测试具有突变的抗体
结果显示在图6A中。对于Cκ/CH1_001(野生型)和Cκ/CH1_107(CH1中的L11W和Cκ中的V26W)观察到良好的结合。Cκ/CH1_203包括破坏野生型盐桥(K96-E16)的正-负和负-正突变对。Cκ/CH1_210中的结合(CH1中的L11W和K96D和Cκ中的V26W和E16R)明显强于K96D和E16R之间的结合。相反，每个突变体链更明显地不能与野生型对应部分结合(参见，Cκ/CH1_208和Cκ/CH1_209)。
Cκ/CH1_207中的突变体链，具有L11W和K96E的CH1，以及具有E16K和V26W的Cκ在突变体内也显示出比其野生型对应物更强的结合(参见，Cκ/CH1_205和Cκ/CH1_206)。
在第二批中，测试了七种抗体。表8中列出了这些抗体中包含的突变。
表8测试具有突变的抗体
蛋白名称 CH1-CH2CH3 Ck
1 Cκ/CH1_001 Wt Wt
2 Cκ/CH1_211 Wt E16K
3 Cκ/CH1_202 K96E Wt
4 Cκ/CH1_212 K96E E16K
5 Cκ/CH1_205 L11W,K96E Wt
6 Cκ/CH1_209 Wt E16R,V26W
7 Cκ/CH1_213 L11W,K96E E16R,V26W
结果显示在图6B中。Cκ/CH1_213中的突变体链，具有L11W和K96E的CH1，以及具有E16R和V26W的Cκ在突变体内表现出比其野生型对应部分更强的结合(参见，Cκ/CH1_205和Cκ/CH1_206)。
在第三批中，测试了15种抗体。表9列出了这些抗体中包含的突变。
表9测试具有突变的抗体
如图6C所示，在Cκ/CH1_223(K101E-D15K)和Cκ/CH1_224(K101E-D15H)中重建的盐桥导致突变的重链和轻链之间的强相互作用，并且相比于Cκ/CH1_107(CH1中的L11W和Cκ中的V26W)，它们各自更明显地不能结合野生型的对应物。如图所示，突变体之间的强结合也基于L11W和V26W之间的疏水相互作用。换句话说，疏水相互作用和新盐桥之间的协同作用产生强结合和高特异性，这将有助于设计多特异性抗体。
实施例9双特异性抗体构建
为了进一步评估CH1/Cκ突变对轻链错配的影响，我们通过使用CH3结构域中的DE/EE突变使用IgG样异二聚体双特异性形式(J.Biol.Chem.(2017)292(35)14706–14717)。我们使用PDL1/CD73对构建了双特异性抗体。
PDL1/CD73对设计在下表中描述：
如图8A所示，通过ELISA发现，所有设计的对都不影响PDL1部分的结合，而CD47的结合效力受损。可以通过ELISA发现，B5024 Cκ/CH1_207突变(CH1：L11W/K96E；Cκ：E16K/V26W)和B5023Cκ/CH1_210突变(CH1：L11W/K96D；Cκ：E16R/V26W)恢复了CD73部分抗原结合。此外，PDL1单一测定和CD73酶活性测定显示与ELISA结合相似的模式(图8B)。在这方面，所有PDL1部分显示出相似的PDL1拮抗活性，并且仅B5024和B5023显示出有效的CD73拮抗活性。在该对中，PDL1的轻链显著损害CD73臂的功能，而CD73轻链对PDL1臂的作用很小。Cκ/CH1_207和Cκ/CH1_210突变均可恢复CD73的功能，并且不影响PDL1臂，表明CH1/Ck突变可以阻止轻链错配。
本公开内容不限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为本公开的各个方面的单一说明，并且功能上等同的任何组合物或方法都在本公开的范围内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对本公开的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。

Claims (23)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包括含L11W取代的人CH1片段和含V26W取代的人Cκ片段。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段含L11W和K101E取代，且所述的Cκ片段含V26W和D15K/H取代。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段含L11W和K96D取代，且所述的Cκ片段含V26W和E16R取代。
4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段含L11W和K96E取代，且所述的Cκ片段含V26W和E16K取代。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段含L11W和K96E取代，且所述的Cκ片段含V26W和E16R取代。
6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其还包括第二个人CH1片段和第二个人Cκ片段，且所述人Cκ片段不含L11W取代，所述人Cκ片段不含V26W取代。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的第二个人CH1片段和所述的第二个人Cκ片段为野生型。
8.如权利要求1～7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包括重链可变区、轻链可变区、Fc区或者其组合。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其为IgG。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其为IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4同种型。
11.一种抗体或其抗原结合片段，其包括人CH1片段和人Cκ片段对，其特征在于，所述的CH1和Cκ片段含选自以下群组的取代：
(a)CH1中的L11K和L28N，以及Cκ中的V26W；
(b)CH1中的L11W，以及Cκ中的F11W和V26G；
(c)CH1中的F9D，以及Cκ中的Q17R和Q17K；
以及其组合。
12.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1和Cκ片段还包含选自以下群组的取代：(a)CH1中的K101E和Cκ中的D15K/H，(b)CH1中的K96D和Cκ中的E16R，(c)CH1中的K96E和Cκ中的E16K以及(d)CH1中的K96E和Cκ中的E16R。
13.一种抗体或其抗原结合片段，其包括在Leu11位含氨基酸取代的人CH1片段和在V26和/或F11位含氨基酸取代的人Cκ片段，其中，当所述的CH1片段与所述的Cκ片段配对时，取代的氨基酸相互作用。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段不与野生型的人Cκ结构域相互作用，且所述的人Cκ结构域不与野生型的人CH1片段相互作用。
15.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的氨基酸取代选自表1。
16.一种抗体或其抗原结合片段，其包含在F9位含有氨基酸取代的人CH1片段，和在Q17位含有氨基酸取代的人Cκ片段，其中，当所述的CH1片段与所述的Cκ片段配对时，取代的氨基酸相互作用。
17.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的CH1片段不与野生型的人Cκ结构域相互作用，且所述的人Cκ结构域不与野生型的人CH1片段相互作用。
18.如权利要求16所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的氨基酸取代选自表2。
19.如权利要求10～18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包括重链可变区、轻链可变区、Fc区或其组合。
20.包含第一对CH1/Cκ和第二对CH1/Cκ的双特异性抗体，其中第一对的CH1和Cκ片段包含CH1中的氨基酸取代L11W和Cκ中的氨基酸取代V26W，且第二对的CH1和C片段不包含L11W和V26W取代。
21.如权利要求20的双特异性抗体，其特征在于，所述的第一对的CH1和Cκ片段还包含选自以下群组的取代：(a)CH1中的K101E和Cκ中的D15K/H，(b)CH1中的K96D和Cκ中的E16R和(c)CH1中的K96E和Cκ中的E16K，且所述第二对的CH1和Cκ片段不包含(a)～(c)中的所述取代。
22.一种组合物，其包含权利要求1～21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体。
23.一种分离的细胞，其包含一种或多种编码权利要求1～21中任一项的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
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