BR112020007108A2 - composições e métodos para tratamento de doenças de liberibacter e outras doenças bacterianas - Google Patents

Abstract

A descrição fornece peptídeos antimicrobianos estáveis (por exemplo, antibacterianos ou antifúngicos ou ambos) (SAMPs) que podem ser usados em métodos de prevenção ou tratamento de uma doença bacteriana (por exemplo, uma doença de Liberibacter, como a doença de esverdeamento cítrico (da mesma forma chamada de Huanglongbing (HLB)) ) ou doença da Micropartícula da batata Zebra e outras doenças bacterianas tais como as causadas por Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma conhecida como Rhizobium radiobacter) e Pseudomonas syringae) em plantas (por exemplo, plantas cítricas ou plantas de batata). Os SAMPs descritos aqui podem ser estáveis ao calor, bem como estáveis em extratos de plantas e/ou em lisados de plantas (por exemplo, lisados cítricos).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-

POSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS DE LIBERIBACTER E OUTRAS DOENÇAS BACTERIANAS". ANTECEDENTE

[001] Huanglongbing (HLB), da mesma forma chamado de es- verdeamento cítrico, é uma das doenças mais devastadoras das plan- tas cítricas. Esta doença das plantas cítricas causa anualmente uma perda de bilhões de dólares somente nos Estados Unidos. Segundo uma pesquisa do Instituto de Ciências Alimentares e Agrícolas da Uni- versidade da Flórida, Flórida perdeu aproximadamente 162.200 acres de plantas cítricas e 7.513 empregos desde a detecção do HLB na Fló- rida em 2005. As previsões mais recentes da Associação Nacional de Academias de Ciências previu que a produção cítrica de 2016 a 2017 é aproximadamente 70% menor que os picos de produção de 1997 a

1998. Além disso, HLB da mesma forma se espalha rapidamente no Texas e na Califórnia. Recentemente, mais de 400 casos confirmados de árvores infectadas por HLB foram relatados no sul da Califórnia. HLB é causado pelas bactérias Gram-negativas limitadas ao floema das espécies Liberibacter, por exemplo, espécies Candidatus Liberi- bacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. L. asiati- cus)), transmitidas por insetos da família Psyllidae, por exemplo, psilí- deos cítricos asiáticos (ACP).

[002] Outra doença importante causada pela espécie Liberibacter é a doença da Microplaqueta de Zebra de Batata (ZC), da mesma for- ma chamada doença do complexo de Zebra de Batata. A doença de ZC está associada ao Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca. L. solanacearum), que é transmitido por psilídeos da batata (por exem- plo, Bactericera cockerelli). A doença ZC atingiu o nível epidêmico no norte do Texas em 2006 e se espalhou para o Arizona, Califórnia, Co- lorado, Idaho, Oregon, Kansas, Nebraska e Novo México. A doença

ZC causou perda de milhões de dólares para a indústria de batata no sudoeste dos Estados Unidos, particularmente no Texas. Além da ba- tata, outras culturas solanáceas, incluindo tomate, berinjela e pimenta, podem da mesma forma ser infectadas. Existe uma necessidade na técnica de composições e métodos inovadores para tratar doenças em plantas causadas por espécies de Liberibacter (por exemplo, espécies de Candidatus Liberibacter).

SUMÁRIO

[003] A descrição fornece peptídeos antimicrobianos estáveis (por exemplo, antibacterianos ou antifúngicos ou ambos) (SAMPs) que podem ser usados em métodos de prevenção ou tratamento de doen- ças bacterianas, como aquelas causadas por bactérias gram- negativas, por exemplo, uma doença de Liberibacter ( por exemplo, doença de esverdeamento cítrico (da mesma forma chamada de Hu- anglongbing (HLB)) ou doença da Microplaqueta de batata zebra) em plantas (por exemplo, plantas cítricas ou plantas de batata). Os SAMP's descritos aqui podem ser estáveis ao calor, bem como está- veis em extratos de plantas e/ou em lisados de plantas (por exemplo, lisados cítricos). Os SAMPs aqui descritos podem efetivamente inibir / matar diferentes espécies de bactérias, tais como espécies de bacté- rias Gram-negativas, por exemplo, espécies de Liberibacter, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (C.Las) que infecta citros, Candidatus Liberibacter solanacearum que infecta todas as plantas solanáceas, e Liberibacter crescens, que é uma bactéria cultivável que infecta o mamão. Liberibacter crescens pode ser usado como um substituto para as espécies de Candidatus Liberibacter incultiváveis (por exemplo, C.Las). Além disso, SAMPs descritos aqui podem da mesma forma inibir e matar outros patógenos bacterianos (por exem- plo, outros patógenos bacterianos Gram-negativos), tais como Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma conhecido como Rhizo-

bium radiobacter) e cepas de Pseudomonas syringae. Agrobacterium tumefaciens pode causar doença da galha da copa ou tumores em mais de 140 espécies de eudicot. Diferentes cepas de Pseudomonas syringae podem causar cancro bacteriano ou doenças da explosão em muitas colheitas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

[004] Em um aspecto, a descrição apresenta um peptídeo antimi- crobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano ou antifúngico ou ambos) (SAMP) compreendendo uma sequência que é substancial- mente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica) a uma sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37. Em algumas modalidades, o peptídeo compreende uma se- quência com pelo menos 75% de identidade de sequência (por exem- plo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37. Em modalidades par- ticulares, o peptídeo compreende uma sequência com pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identida- de de sequência) para uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 2.

[005] Em outro aspecto, a descrição apresenta um peptídeo an- timicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) compreendendo uma sequência de X1GX2X3V SK ENXsXGQAGFX7HX8gFEXoTFX10SX11 EGX12AEY X13X14HPX 15HVEX1sANX17X18LX19X20LEKX21LX22X23DYKPX24aTX25RV(SEQ ID NO:27), em que X1 é R, K, ou W; Xcé Kou E; Xgé Nou D; Xa é Toul; Xs é L, F, ou R; Xe é H ou Q; Xr é Pou T; Xs é l, L/ ou V; XKgé S ou F; X1w é E ou D; X11 é TouLl; Xi2 é Voul, X1i3 é Voul; Xm é S, A, ou D; X15Éé S, A, ou V; XK1w6 é Y ou F; XKir é Lou T; XKig é F, M, ou L; XKis É A,

P, ou T; X2o é N ou Q; X2; é Vou F; X>22 é Vou |; Xo3 é Vou |; Xm é T, E, ou Q; e Xos é VE, L.

[006] Em algumas modalidades deste aspecto, o SAMP isolado compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 27, em que X; em SEQ ID NO:27 é R Wo É K Xg é N Ma é |; KG É L; KG É H; Kin É E; XK11 é T; X12 é V; XKi3 é V; Ki é V; Ki7 É L; Kis É F; XKig É A; KXoo É N; Ko É VS X22 É V, Kog É l EXMÉT.

[007] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma composição agrícola compreendendo um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui. A composição agrícola pode ainda compreender pelo menos um dentre um herbicida, um protetor de herbicida, um tensoativo, um fungicida, um pesticida, um nematicida, um ativador de plantas, um sinergista, um regulador de crescimento de plantas, um repelente de insetos, um acaricida, um moluscicida ou um fertilizante.

[008] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui. Da mesma forma é fornecido um polinucleotídeo compreendendo um promotor operaci- onalmente ligado à molécula de ácido nucleico (opcionalmente onde o promotor é heterólogo à molécula de ácido nucleico). A descrição da mesma forma apresenta uma célula compreendendo a molécula de ácido nucleico do aspecto anterior. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana, de levedura, planta, inseto ou mamífero (por exemplo, humana). Em modalidades particulares, a célula é uma célu- la de planta.

[009] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma planta com- preendendo um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui ou o polinucleotídeo discutido acima ou a molécula de ácido nucleico que codifica um SAMP isolado descrito aqui. Em algumas modalidades, a planta é uma planta cítrica ou uma planta solanácea. Em algumas modalidades, a planta é mais tolerante a um patógeno bacteriano em comparação com uma planta de controle (de outra maneira idêntica) em que o SAMP está ausente.

[0010] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma planta com- preendendo um peptídeo antimicrobiano estável (SAMP) estável in situ alterado (por exemplo, antibacteriano) compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácidos correspondente a um aminoácido em qualquer uma das posições X; a X>s, como mencionado em SEQ ID NO: 27, em que o SAMP mutado fornece resistência à doença de Libe- ribacter (por exemplo, Huanglongbing (HLB)) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB), resistência à doença de Pseudo- monas (por exemplo, doenças bacterianas ou por explosão) ou tole- rância à doença de Pseudomonas, ou resistência a doenças de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumores) ou tolerância a doenças de Agrobacterium para a planta.

[0011] Em outro aspecto, a descrição apresenta um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui, em que a introdução do cassete de expressão em uma planta resulta na planta com resistência melhorada à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB), resis- tência à doença de Pseudomonas (por exemplo, doenças bacterianas ou por explosão) ou tolerância à doença de Pseudomonas ou doença de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumo- res) resistência ou tolerância à doença por Agrobacterium. Em algu- mas modalidades, o promotor de cassete de expressão é heterólogo ao polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o promotor é indutível. Em algumas modalidades, o promotor é específico de tecido de planta

(por exemplo, específico de floema, específico de tubérculo, específico de raiz, específico de caule, específico de tronco ou específico de fo- lha. Em algumas modalidades, o promotor específico de floema é o promotor da proteína transportadora de sacarose SUC?2.

[0012] Em outro aspecto, a descrição apresenta uma planta trans- gênica compreendendo o cassete de expressão do aspecto anterior, em que a planta possui maior resistência à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB), resistência a doença de Pseudomonas (por exemplo, doenças bacterianas ou por explosão) ou tolerância à doença de Pseudomonas ou resistência a doença de Agrobacterium (por exemplo, doença ou tumores de Galha da Copa) ou tolerância a doença de Agrobacterium, em comparação com uma instalação de controlo sem o cassete de ex- pressão. Em algumas modalidades, a planta transgênica é uma planta cítrica ou uma planta solanácea.

[0013] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenção ou tratamento de uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB), uma doença de Pseudomonas (por exemplo, doenças bacteria- nas ou por explosão) ou uma doença de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumores ) em uma planta entrando em contato com a planta com um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui ou uma composi- ção agrícola compreendendo um SAMP isolado. Em algumas modali- dades desses aspectos, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é injetado no tronco da planta. Em algumas modalidades, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é injetado no caule da planta. Em outras modalidades, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é pulverizado foliarmente na planta. Em outras modalidades, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é aplicada à raiz da planta. Em ou- tras modalidades, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é apli-

7IT6 cado à planta por irrigação de gotejamento para as raízes. Em outras modalidades, o peptídeo isolado ou a composição agrícola é aplicada por ablação a laser.

[0014] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenção ou tratamento da doença da microplaqueta da batata zebra (ZC) em uma planta, entrando em contato com a planta com um peptí- deo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui ou uma composição agrícola compreendendo um SAMP isolado. Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exem- plo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens) en- trando em contato com a planta com um SAMP isolado descrito aqui ou uma composição agrícola compreendendo um SAMP isolado. Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens) entrando em contato com a planta com um SAMP isolado descrito aqui ou uma composição agrícola compre- endendo um SAMP isolado. Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Pseudo- monas (por exemplo, espécies de Pseudomonas syringae) entrando em contato com a planta com um SAMP isolado descrito aqui ou uma composição agrícola que compreende um SAMP isolado.

[0015] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias no gênero Liberi- bacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens) em uma planta entrando em contato com a planta com um antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP)

descrito aqui ou uma composição agrícola compreendendo um SAMP isolado. Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias do gênero Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens) em uma planta entrando em contato com a planta com um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui ou uma composição agrícola compreendendo um SAMP isolado. Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias do gênero Pseudomonas (por exemplo, espécies de Pseudomonas syringae) em uma planta entrando em contato com a planta com um peptídeo anti- microbiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) des- crito aqui ou uma composição agrícola compreendendo um SAMP iso- lado.

[0016] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método para prevenir ou tratar uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) em uma planta ou prevenir ou tratar uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, es- pécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus) ou Liberibacter crescens) introduzindo um cassete de ex- pressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão com- preendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotí- deo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui na planta. Em outro aspecto, a descrição apresenta um método para prevenir ou tratar a doença de ZC da batata em uma planta ou prevenir ou tratar uma infecção bacte- riana em uma planta causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca L. solanacearum)) ou Liberibacter cres-

cens) introduzindo na planta um cassete de expressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um SAMP isolado descrito aqui).

[0017] Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método para prevenir ou tratar uma doença de Pseudomonas (por exemplo, cancro bacteriano ou doença da explosão) em uma planta ou prevenir ou tratar uma infecção bacteriana em uma planta causada por bacté- rias do gênero Pseudomonas ( por exemplo, espécies de Pseudomo- nas syringae) introduzindo um cassete de expressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um promotor ope- racionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui) na planta.

[0018] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método para prevenir ou tratar uma doença de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumores) em uma planta ou prevenir ou tratar uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens) através da introdução de cassete de expressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteri- ano) descrito aqui) na planta.

[0019] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias no gênero Liberi- bacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens) em uma planta através da introdução de um cassete de ex- pressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão com- preendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotí-

deo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui) na planta.

[0020] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias no gênero Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens) em uma planta através da introdução de um cassete de expressão descrito aqui (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifi- ca um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibac- teriano) descrito aqui) na planta.

[0021] Em ainda outro aspecto, a descrição apresenta um método para inibir o crescimento de bactérias ou matar bactérias do gênero Pseudomonas (por exemplo, espécies de Pseudomonas syringae) em uma planta através da introdução de um cassete de expressão des- crito aqui (por exemplo, um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteri- ano) descrito aqui) na planta.

[0022] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com maior resistência à doença de Liberibac- ter (por exemplo, HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) através da introdução de um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui ou um cas- sete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) isolado em uma plurali- dade de plantas; e selecionar uma planta que compreende o peptídeo isolado ou expressa o polinucleotídeo da pluralidade de plantas.

[0023] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com resistência à doença de ZC da batata ou tolerância à doença de ZC da batata através da introdução de um pep- tídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito neste documento ou um cassete de expressão com- preendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotí- deo que codifica um SAMP isolado em uma pluralidade de plantas; e selecionar uma planta que compreende o peptídeo isolado ou expres- sa o polinucleotídeo da pluralidade de plantas.

[0024] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com maior resistência à doença de Pseudo- monas (por exemplo, cancro bacteriano ou doença da explosão) ou tolerância à doença de Pseudomonas (por exemplo, cancro bacteriano ou doença da explosão) através da introdução de um peptídeo antimi- crobiano isolado estável (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui ou um cassete de expressão compreendendo um promotor operacional- mente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicro- biano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) em uma pluralida- de de plantas; e selecionar uma planta que compreende o peptídeo isolado ou expressa o polinucleotídeo da pluralidade de plantas.

[0025] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com maior resistência à doença de Agrobac- terium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumores) ou tole- rância à doença de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa ou tumores) através da introdução de um peptídeo antimicrobia- no isolado estável (por exemplo, antibacteriano) descrito aqui ou um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) isolado em uma plurali- dade de plantas; e selecionar uma planta que compreende o peptídeo isolado ou expressa o polinucleotídeo da pluralidade de plantas.

[0026] Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com maior resistência à doença de Liberibac- ter (por exemplo, HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) (isto é, resistência ou tolerância aprimorada a uma in- fecção bacteriana causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus) ou Liberibacter crescens)) introduzindo uma mutação em um polinucleotídeo na planta, em que o polinucleotídeo mutado codifica um antimicrobiano isolado estável (por exemplo, anti- bacteriano) descrito aqui (por exemplo, um SAMP isolado tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2). Em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta com resistência à doença de ZC da batata aumentada ou tolerância à doença da batata ZC (isto é, resistência ou tolerância aprimorada a uma infecção bacteriana causada por bacté- rias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberi- bacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca. L. solanacearum)) ou Liberibacter crescens) introduzindo uma mutação em um polinucleotídeo na planta, em que o polinucleotídeo mutado codifica um peptídeo antimicrobiano isolado estável (por exemplo, an- tibacteriano) (SAMP) descrito aqui (por exemplo, um SAMP isolado tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2). Em algumas modalidades desses aspectos, a introdução ocorre in situ no genoma de uma célula de planta. Em mo- dalidades particulares, a introdução compreende repetições palindrô- micas curtas regularmente espaçadas em cluster (CRISPR)/edição do genoma de Cas. Em algumas modalidades desses aspectos, a planta é uma planta cítrica ou uma planta solanácea (por exemplo, uma plan- ta de batata).

[0027] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método para produzir uma planta com resistência à doença por Agrobacterium aumentada ou tolerância a doenças por Agrobacterium (isto é, resis- tência ou tolerância aumentada a uma infecção bacteriana causada por bactérias do gênero Agrobacterium (por exemplo, doença de Ga- lha da Copa ou tumores causados por cepas de Agrobacterium)) intro- duzindo uma mutação em um polinucleotídeo na planta, em que o po- linucleotídeo mutado codifica um peptídeo antimicrobiano estável iso- lado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui (por exemplo, um SAMP isolado com pelo menos 75%) identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2). Em algumas modalidades desses aspectos, a introdução ocorre in situ no genoma de uma célula de planta. Em modalidades particulares, a introdução compreende repeti- ções palindrômicas curtas regularmente espaçadas em cluster (CRISPR) / edição do genoma de Cas. Em algumas modalidades des- ses aspectos, a planta é uma planta de eudicot.

[0028] Ainda em outro aspecto, a descrição apresenta um método de produção de uma planta tendo resistência à doença de Pseudomo- nas aumentada ou tolerância à doença de Pseudomonas (isto é, maior resistência ou tolerância a uma infecção bacteriana causada por bac- térias do gênero Pseudomonas (por exemplo, doenças bacterianas ou por explosões causadas por cepas de Pseudomonas)) introduzindo-se uma mutação em um polinucleotídeo na planta, em que o polinucleotí- deo mutado codifica um peptídeo antimicrobiano estável isolado (por exemplo, antibacteriano) (SAMP) descrito aqui (por exemplo, um SAMP isolado com pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2). Em algumas modalidades desses aspectos, a introdução ocorre in situ no genoma de uma célula de planta. Em modalidades particulares, a introdução compreende repeti- ções palindrômicas curtas regularmente espaçadas em cluster (CRISPR) / edição do genoma de Cas. Em algumas modalidades des-

ses aspectos, a planta é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea (por exemplo, uma planta de tomate).

[0029] Em qualquer uma das composições ou métodos descritos na presente descrição, a planta pode ser espécies do gênero Citrus (por exemplo, Citrus maxima, Citrus medica, Citrus micrantha, Citrus reticulate, Citrus aurantiifolia, Citrus aurantium, Citrus latifolia, Citrus limon, Citrus limonia, Citrus paradise, Citrus sinensis e Citrus tangeri- ne) ou espécies da família Solanaceae (por exemplo, Solanum Spp., Capsicum spp. e Nicotiana spp.). As espécies do gênero Solanum in- cluem, por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, So- lanum melongena, Solanum aviculare, Solanum capsicastrum, Sola- num crispum, Solanum laciniatum, Solanum laxum, Solanum pseudo- capsicum, Solanum rantonnetii, Solanum pestudocapsicum, Solanum rantonnetii, Solanum seaforthanum e Solanum wendlandii. Espécies do gênero Capsicum incluem, por exemplo, Capsicum annuum, Capsi- cum beccatum, Capsicum campylopodium, Capsicum cardenasii, Cap- sicum chacoense, Capsicum cornutum, Capsicum dusenii, Capsicum eximium, Capsicum friburgense, Capsicum frutescens, Capsicum ge- minifolium, Capsicum havanense, Capsicum lanceolatum, Capsicum Iycianthoides, Capsicum minultiflorum, Capsicum mositicum, Capsicum pubescens, Capsicum recurvatum, Capsicum schottianum, Capsicum spina-alba, Capsicum tovarii e Capsicum villosum. Espécies do gênero Nicotiana incluem, por exemplo, Nicotiana acuminate, Nicotiana ben- thamiana, Nicotiana glauca, Nicotiana longiflora, Nicotiana rustica, Ni- cotiana tabacum e Nicotiana occidentalis.

[0030] Em modalidades particulares, a planta é selecionada a par- tir do grupo consistindo em Citrus reticulata, Citrus sinensis, Citrus clementina, Capsicum annuum, Solanum tuberosum, Solanum lyco- persicum, Solanum melongena e Nitotiana benthamiana. Em modali- dades particulares, a planta é uma planta de laranja doce (Citrus si-

nensis). Em modalidades particulares, a planta é uma planta clementi- na (Citrus clementina). Em modalidades particulares, a planta é uma planta de batata (Solanum tuberosum). Em algumas modalidades, a planta é uma planta produtora de frutas ou vegetais.

[0031] Em qualquer um dos aspectos da descrição descritos aqui, em algumas modalidades, o SAMP é um peptídeo estável ao calor (HS).

[0032] Além disso, em qualquer um dos aspectos da descrição descritos aqui, em algumas modalidades, o SAMP pode da mesma forma fornecer resistência ou tolerância a doenças bacterianas causa- das por outros patógenos bacterianos, tais como Agrobacterium tume- faciens (da mesma forma conhecido como Rhizobium radiobacter) e Pseudomonas syringae. Definições

[0033] Quando aqui utilizado, o termo "doença Liberibacter" refere- se a uma doença, tal como uma infecção, causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens). Uma doença Liberibacter pode infectar plantas tal como plantas cítricas (por exemplo, laranja, toranja, tangerina, li- mão, lima, lima comum, papeda, cidra e pomelo) e plantas solanáceas (por exemplo, batata, tomate, berinjela e pimenta). Huanglongbing (HLB) é um tipo de doença Liberibacter que infecta plantas cítricas.

[0034] Quando aqui usado, os termos "doença de esverdeamento cítrico" e "Huanglongbing (HLB)" se referem a uma infecção bacteriana de plantas (por exemplo, plantas cítricas) causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibac- ter africanus e Candidatus Liberibacter americanus) ou Liberibacter crescens). A infecção é vetorizada e transmitida pelo psilídeo cítrico asiático, Diaphorina citri e pelo psilídeo cítrico africano, Trioza erytreae. Três tipos diferentes de HLB são atualmente conhecidos: a forma asiática tolerante ao calor e as formas africana e americana sensíveis ao calor.

[0035] Quando aqui utilizado, o termo "doença da batata-zebra (ZC)" refere-se a uma infecção bacteriana de plantas (por exemplo, plantas de batata) causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca. L. solanacearum)) ou Liberibacter crescens). A infecção é vetorizada e transmitida por psilídeos da bata- ta (por exemplo, Bactericera cockerelli).

[0036] Quando aqui utilizado, o termo "doença de Agrobacterium" refere-se a uma doença, tal como uma infecção, causada por bactérias do gênero Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens, da mesma forma conhecidas como Rhizobium radiobac- ter). As doenças de Agrobacterium podem compreender a doença de Galha da Copa, ou tumores, em mais de 140 espécies de eudicot.

[0037] Quando aqui utilizado, o termo "doença de Pseudomonas" refere-se a uma doença, tal como uma infecção, causada por bactérias do gênero Pseudomonas (por exemplo, espécies de Pseudomonas syringae). As doenças de Pseudomonas podem compreender cancro bacteriano ou doenças da explosão em muitas colheitas de dicotiledô- neas e monocotiledôneas (por exemplo, pontos bacterianos de tomate, manchas bacterianas de tomate e cancro bacteriano de tomate).

[0038] Quando aqui utilizado, o termo "resistência a doenças" refe- re-se à capacidade de uma planta não ser afetada por uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB), doença de Agrobacterium ou doença de Pseudomonas; ou infecção por bactérias Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens), bactérias Agrobacterium (por exemplo, espécies Agrobacterium tumefaciens) ou bactérias Pseudomonas (por exemplo, espécies Pseudomonas syrin-

gae).

[0039] Quando aqui utilizado, o termo "tolerância a doenças" refe- re-se à capacidade de uma planta crescer e sobreviver continuamente, apesar de estar infectada por bactérias (por exemplo, bactérias gram- negativas, tais como bactérias Liberibacter, bactérias Agrobacterium ou bactérias Pseudomonas).

[0040] Quando aqui utilizado, o termo "resistência à doença de Liberibacter" refere-se à capacidade de uma planta não ser afetada por uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) ou infecção por bactérias Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens).

[0041] Quando aqui utilizado, o termo "tolerância à doença de Li- beribacter" refere-se à capacidade de uma planta crescer e sobreviver continuamente, apesar de estar infectada por bactérias Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter cres- cens) ou ter uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB). Em al- gumas modalidades, uma planta com uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) pode mostrar sintomas menores da doença, como amarelamento das folhas, manchas das folhas, mancha semelhante à deficiência de Zinco, clorose e rendimento reduzido de frutas, porém ainda é capaz de crescer ou produzir frutas apesar da infecção.

[0042] Quando aqui utilizado, o termo "resistência à doença de ZC da batata" refere-se à capacidade de uma planta não ser afetada pela doença de ZC da batata ou infecção por Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Liberibac- ter solanacearum (Ca. L Solanacearum)) ou Liberibacter crescens).

[0043] Quando aqui utilizado, o termo "tolerância à doença de ZC da batata" refere-se à capacidade de uma planta crescer e sobreviver continuamente, apesar de estar infectada pelo Liberibacter (por exem- plo, espécies Candidatus Liberibacter (por exemplo, Candidatus Libe-

ribacter solanacearum (Ca. L. solanacearum)) ou Liberibacter cres- cens) ou com doença de ZC da batata. Em algumas modalidades, uma planta com doença de ZC da batata pode mostrar sintomas menores da doença de ZC da batata, tais como clorose, queima de folhas, nó- dulos inchados, escurecimento do tecido vascular, folhas enroladas, estolões colapsados, lenticelas aumentadas, escurecimento do tecido vascular, descoloração dos raios medulares, e esfoliação necrótica do tecido dos tubérculos, porém ainda é capaz de cultivar ou produzir ba- tata apesar da infecção.

[0044] Quando aqui utilizado, o termo "resistência a doenças de Agrobacterium" refere-se à capacidade de uma planta não ser afetada por uma doença de Agrobacterium (por exemplo, doença de Galha da Copa) ou infecção por bactérias de Agrobacterium (por exemplo, es- pécies de Agrobacterium tumefaciens, da mesma forma conhecidas como Rhizobium radiobacter).

[0045] Quando aqui utilizado, o termo "tolerância a doenças por Agrobacterium" refere-se à capacidade de uma planta crescer e so- breviver continuamente, apesar de estar infectada por bactérias Agrobacterium (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens, da mesma forma conhecida como Rhizobium radiobacter) ou ter uma doença de Agrobacterium (por exemplo, doença da Galha da Copa).

[0046] Quando aqui utilizado, o termo "resistência à doença de Pseudomonas" refere-se à capacidade de uma planta não ser afetada por uma doença de Pseudomonas (por exemplo, mancha bacteriana de tomate, mancha bacteriana de tomate e cancro bacteriano de toma- te) ou infecção por bactérias Pseudomonas (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens).

[0047] Quando aqui utilizado, o termo "tolerância à doença de Pseudomonas" refere-se à capacidade de uma planta crescer e sobre- viver continuamente, apesar de estar infectada pela bactéria Pseudo-

monas (por exemplo, espécies de Agrobacterium tumefaciens) ou ter uma doença de Pseudomonas (por exemplo, Manchas bacterianas de tomate, Mancha bacteriana do tomate e câncer bacteriano do tomate).

[0048] Quando aqui utilizado, o termo "peptídeos antimicrobianos estáveis" ou "SAMPs" refere-se a peptídeos identificados em plantas que são resistentes / tolerantes à doença de Liberibacter (por exemplo, resistentes / tolerantes ao HLB). Tais peptídeos são expressos em um nível mais alto em plantas resistentes / tolerantes à doença de Liberi- bacter (por exemplo, resistentes a HLB / tolerantes) do que plantas suscetíveis a doenças de Liberibacter (por exemplo, suscetíveis a HLB). Esses SAMPs podem ser injetados em plantas para prevenir ou tratar uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB). Em algumas modalidades, os SAMPs isolados descritos aqui têm propriedades an- tibacterianas ou antifúngicas ou ambas as propriedades. Em algumas modalidades, os SAMPs isolados descritos aqui são estáveis ao calor (por exemplo, peptídeos estáveis ao calor (HS)). Em algumas modali- dades, os SAMPs isolados descritos aqui são da mesma forma está- veis em extratos de planta. Em outras modalidades, os SAMPs isola- dos descritos aqui são da mesma forma estáveis em lisados de plan- tas (por exemplo, lisados cítricos).

[0049] Quando aqui utilizado, o termo "composição agrícola" refe- re-se a uma composição formulada para aplicação a uma planta ou parte de uma planta (por exemplo, semente, corte, brotos, etc.). Uma composição agrícola está tipicamente na forma líquida, por exemplo, para aplicação por pulverização ou imersão, porém pode estar em pó para reidratação ou aplicação (revestimento em pó ou seco) ou em forma gasosa (por exemplo, para ambientes fechados). A composição agrícola pode ser concentrada, por exemplo, para diluição ou água ou outro solvente. Uma composição agrícola pode da mesma forma incluir mais de um ingrediente ativo, por exemplo, um SAMP (por exemplo,

um peptídeo HS) descrito aqui, sozinho ou em combinação com um fungicida, herbicida, fertilizante, etc.

[0050] Quando aqui utilizado, o termo "tratar" ou "tratar" uma do- ença de Liberibacter (por exemplo, uma doença de HLB ou batata ZC) em plantas refere-se à redução ou erradicação dos sintomas causados pela doença de Liberibacter pelos métodos descrito aqui. Os sintomas do HLB incluem, porém não são limitados a amarelamento das folhas, manchas das folhas, manchas semelhantes à deficiência de zinco, clo- rose grave e rendimento reduzido de frutos. Os sintomas da doença de ZC da batata incluem, porém não são limitados a clorose, queima de folhas, nódulos inchados, escurecimento do tecido vascular, folhas en- roladas, estolões colapsados, lenticelas aumentadas, escurecimento do tecido vascular, descoloração dos raios medulares e manchas ne- cróticas do tecido dos tubérculos. Em algumas modalidades, os méto- dos descritos podem não resultar necessariamente na erradicação ou cura da doença de Liberibacter (por exemplo, doença de HLB ou bata- ta ZC), porém podem reduzir significativamente os sintomas causados pela doença.

[0051] Quando aqui utilizado, o termo "prevenir" ou "impedir" uma doença de Liberibacter (por exemplo, uma doença de HLB ou batata ZC) em plantas refere-se a proteger uma planta que corre o risco de desenvolver a doença ou diminuir o risco de uma planta desenvolver a doença. Uma planta pode ser contatada com um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui antes que a planta desenvolva a doen- ça ou mostre sinais da doença.

[0052] Quando aqui utilizado, o termo "planta" inclui plantas intei- ras, órgãos/estruturas vegetativas do broto (por exemplo, folhas, cau- les e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exem- plo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma e revestimento de semen-

tes) e frutas (ovário maduro), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido moído e similares) e células (por exemplo, células pro- tetoras, óvulos e similares) e descendência dos mesmos. As plantas que podem ser tratadas como descrito aqui incluem, por exemplo, plantas cítricas (por exemplo, laranja, toranja, tangerina, limão, lima, lima comum, papeda, cidra e pomelo) e plantas solanáceas (por exemplo, batata, tomate, berinjela e Pimenta).

[0053] O termo "planta" da mesma forma inclui mutantes de ocor- rência natural e plantas geneticamente modificadas. Uma "planta ge- neticamente modificada" ou "planta transgênica" refere-se àquela cujo genoma foi manipulado para que seja diferente de uma planta de tipo silvestre da mesma espécie, variedade ou cultivar, por exemplo, para adicionar um gene ou elemento genético, remover um gene ou ele- mento genético, modifica um gene ou elemento genético, altera a es- trutura da cromatina, altera os níveis de expressão de genes ou prote- ínas, etc. Uma planta transgênica pode conter um vetor ou cassete de expressão. O cassete de expressão tipicamente compreende uma se- quência de codificação de polipeptídeo ou um ácido nucleico de modu- lação (por exemplo, um antissentido, um siRNA ou ribozima) operacio- nalmente ligado (isto é, sob controle regulatório) a uma sequência re- guladora indutível ou constitutiva apropriada que permita a expressão de um polipeptídeo ou ácido nucleico de modulação. O cassete de ex- pressão pode ser introduzido em uma planta por transformação ou por reprodução após a transformação de uma planta parental. Tais méto- dos podem ser usados em uma planta inteira, incluindo mudas e plan- tas maduras, bem como em uma parte da planta, como sementes, fru- tas, folhas ou raiz, tecido da planta, células de planta ou qualquer ou- tro material de planta, por exemplo, um explante de planta, bem como a sua progênie, e a sistemas in vitro que imitam componentes ou pro- cessos bioquímicos ou celulares em uma célula. No contexto da pre-

sente divulgação, plantas geneticamente modificadas podem incluir modificações genéticas em um gene que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS). Em algumas modalidades, o gene modifi- cado na planta geneticamente modificada pode codificar um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui (por exemplo, um SAMP com pelo menos 75% de identidade de sequência ou pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2)).

[0054] Um "cassete de expressão" refere-se a uma construção de ácido nucleico que, quando introduzido em uma célula hospedeira, re- sulta na transcrição e/ou tradução de um RNA ou polipeptídeo, respec- tivamente.

[0055] Quando aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" refere-se a um oligonucleotídeo, ou nucleotídeo, e fragmentos ou porções dos mesmos, e à DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, que pode ser de filamento único ou duplo, e representa o filamento de sentido ou antissentido. Um único polinucleotídeo é traduzido em um único poli- peptídeo.

[0056] Quando aqui utilizado, os termos "peptídeo" e "polipeptí- deo" são usados de forma alternada e descrevem um único polímero em que os monômeros são resíduos de aminoácidos que são unidos por meio de ligações amida. Um polipeptídeo pretende abranger qual- quer sequência de aminoácidos, de ocorrência natural, recombinante ou produzida sinteticamente.

[0057] Quando aqui utilizado, o termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", usado no contexto de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, refere-se a uma sequência que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de referência. Como alternativa, a porcentagem de identidade pode ser qualquer número inteiro de 50% a 100%. Em algumas modalidades, uma sequência é substancialmente idêntica a uma sequência de referência se a se- quência tiver pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência com a sequência de referência, como determinado usando os métodos descritos aqui; de preferência BLAST usando pa- râmetros padrões, como descrito abaixo. Modalidades da presente descrição fornecem SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) que são substancialmente idênticos a qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (SEQ ID NOs: 1 e 2).

[0058] Para comparação de sequências, normalmente uma se- quência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrões podem ser usados ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula as identidades percentuais das se- quências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[0059] Uma janela de comparação inclui referência a um segmento de qualquer uma de várias posições contíguas, por exemplo, um seg- mento de pelo menos 10 resíduos. Em algumas modalidades, a janela de comparação possui de 10 a 600 resíduos, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 30 resíduos, cerca de 10 a cerca de 20 resíduos, cerca de 50 a cerca de 200 resíduos ou cerca de 100 a cerca de 150 resíduos, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de refe- rência com o mesmo número de posições contíguas após as duas se- quências estarem perfeitamente alinhadas.

[0060] Os algoritmos adequados para determinar a porcentagem de identidade e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, descritos em Altschul e outro (1990) J.

Mol.

Biol. 215: 403- 410 e Altschul e outro (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, res- pectivamente.

O software para realizar análises de BLAST está dispo- nível publicamente no site do National Center for Biotechnology Infor- mation (NCBI). O algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequência de alta pontuação (HSP's), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação limiar de valor positivo T quando alinha- das com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados.

T é referido como o limiar de pontuação da palavra adjacente (Altschul e outro, Supra). Esses acertos de palavras de vizi- nhança iniciais atuam como sementes para iniciar pesquisas para en- contrar HSPs mais longos que os contenham.

Os acertos da palavra são em seguida estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto em que a pontuação do alinhamento acumulado pode ser aumentada.

As pontuações acumuladas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontua- ção de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sem- pre <O). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa.

A extensão dos acertos da palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação do alinhamento acumulado diminui pela quantidade X de seu valor máxi- mo obtido; a pontuação cumulativa chega a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação ne- gativa; ou o fim de qualquer sequência é alcançado.

Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento.

O programa BLASTN (para sequências de nucleotí- deos) usa como padrão um tamanho de palavra (W) de 28, uma ex-

pectativa (E) de 10, M=1,N=-2e uma comparação de ambos os fi- lamentos. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um tamanho de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de e a matriz de pontuação do BLOSUMG6?2 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 10915 (1989)).

[0061] O algoritmo BLAST da mesma forma realiza uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a me- nor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da pro- babilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é considerada semelhante a uma sequên- cia de referência se a menor probabilidade de soma em uma compa- ração da sequência de aminoácidos de teste com a sequência de ami- noácidos de referência for menor que cerca de 0,01, mais preferenci- almente menor que cerca de 10º, e mais preferencialmente menos do que cerca de 10º,

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0062] FIGS. 1A e 1B são gráficos de barras que mostram os ní- veis de expressão de peptídeos antimicrobianos estáveis (SAMPs) em plantas suscetíveis a HLB e tolerantes a HLB. FIG. 1C mostra varieda- des cítricas tolerantes a HLB ou parentes próximos expressam níveis elevados de SAMPs.

[0063] FIGS. 2A-2C são estruturas peptídicas que mostram os principais aminoácidos no circuito entre duas a-hélices de SAMPs. À predição da estrutura peptídica é realizada pelo modelo Swiss com AtSAMP1 como modelo (PDB ID: 1Q4R). As sequências de C9hSAM- Pa (da mesma forma referidas aqui como SAMPa) e CghSAMPb (da mesma forma aqui referidas como SAMPb) são mostradas na Tabela

1.

[0064] FIG. 3A mostra fotografias de Plantas Nb infectadas por Ca. L. solanacearum tratadas com peptídeo CgahSAMPa (SAMPa) ou CghSAMPb (SAMPb) ou solução simulada.

[0065] A FIG. 3B mostra os títulos bacterianos de Plantas Nb in- fectadas por Ca. L. solanacearum tratadas com peptídeo CghSAMPa (SAMPa) ou CghSAMPb (SAMPb) ou solução simulada.

[0066] A FIG. 4A-B mostra que SAMP efetivamente suprime o crescimento de C. Las (Candidatus Liberibacter asiaticus) em plantas cítricas positivas para HLB e as novos brotos não apresentam sinto- mas de HLB. FIG. 4A mostra que plantas cítricas positivas para HLB com título de C.Las semelhante foram tratadas com tampão (simulada) ou SAMP (a 100 nM ou 10 uM) uma vez por injeção no tronco. As fo- tos foram tiradas após 5 semanas de tratamento. FIG. 4B mostra que o título de C.Las foi medido por PCR em DNA genômico isolado de 8 novas folhas de cada planta cítrica simulada ou tratada com SAMP.

[0067] A FIG. 5A-C mostra que as plantas de batata pré-tratadas com SAMP cresceram melhor e produziram mais tubérculos após a infecção por C.Lso (Ca. L. solanacearum) por alimentação com psilí- deos da batata. FIG. 5A mostra plantas de batata foram pré-tratadas com SAMP (10 uM) ou apenas tampão (simulada) e em seguida foram expostas a psilídeos de batata com C.Lso positivo por 5 dias. As plan- tas são de 3 semanas após a infecção. FIG. 5B mostra tubérculos de batata colhidos a partir de plantas simuladas ou pré-tratadas com SAMP. FIG. 5C mostra o teste de fritura de tubérculos de batata colhi- dos no SAMP ou de plantas infectadas com C.Lso pré-tratadas por si- mulação e plantas saudáveis.

[0068] A FIG. 6A-B mostra que as plantas de tomate pré-tratadas com SAMP cresceram melhor após a infecção por C.Lso pela alimen- tação com psilídeos da batata. FIG. 6A mostra que as plantas de to-

mate foram pré-tratadas com SAMP ou apenas tampão (simulação) e depois foram expostas a psilídeos de batata com C.Lso positivo por 5 dias. As plantas são de 4 semanas após a infecção. FIG. 6B mostra biomassa acima do solo de plantas de tomate pré-tratadas com SAMP.

[0069] A FIG. 7 mostra os títulos bacterianos de plantas de tomate infectadas por Ca. L. solanacearum tratadas com peptídeo CghSAMPa ou CghSAMPb, ou solução simulada.

[0070] As FIGS. 8A-8C mostram que SAMPs tem efeitos primários em plantas cítricas e podem ser usados para vacinar as mudas no vi- veiro.

[0071] As FIGS. 9A e 9B mostram que os SAMPs têm baixa ativi- dade fitotóxica nas folhas cítricas.

[0072] A FIG. 10 mostra que os SAMPs são altamente expressos nos frutos de lima australiana, lima do deserto australiana, limão e Poncirus trifoliado (estoque de raiz comum).

[0073] A FIG. 11 mostra que os SAMPs são sensíveis à pepsina protease humana, uma importante enzima gástrica.

[0074] A FIG. 12 mostra que SAMPs são estáveis após armaze- namento em temperatura ambiente por 24 horas, ou a 60 ºC por 24 horas ou a 100 ºC por 20 minutos, e permanecem ativos para matar o Liberibacter crescens, como mostrado pelo ensaio de viabilidade / cito- toxicidade para visualização de células bacterianas vivas e mortas (DMAO (verde): uma tintura de DNA permeável à membrana para vi- sualização de bactérias vivas e EthD-lll (vermelho): uma tintura de DNA impermeável à membrana para visualização de bactérias mor- tas).

[0075] FIG. 13 mostra que os SAMPs são estáveis no lisado de células cítricas, o que indica que eles são da mesma forma estáveis nas árvores.

[0076] FIGS. 14A e 14B mostram que SAMPs exibem atividade antimicrobiana contra patógenos bacterianos Gram-negativos Pseu- domonas syringae e Agrobacterium tumefaciens no ensaio de difusão em ágar.

[0077] FIG. 15 mostra que os SAMPs, após armazenamento por 24 horas a 4 ºC, em temperatura ambiente ou 60 ºC, permanecem ati- vos para matar Agrobacterium tumefaciens, como mostrado pelo en- saio de viabilidade / citotoxicidade para visualizar células bacterianas vivas e mortas (DMAO (verde): uma tintura de DNA permeável à membrana para visualização de bactérias vivas e EthD-lll (vermelho): uma tintura de DNA impermeável à membrana para visualização de bactérias mortas).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES |. Introdução

[0078] A doença de esverdeamento cítrica ou "Huanglongbing" (HLB), causada pela bactéria Candidatus Liberibacter, é um tipo de doença de Liberibacter que infecta especificamente plantas cítricas. O HLB é uma das doenças mais destrutivas das espécies cítricas Liberi- bacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter (Ca. Liberibac- ter ou Ca. L.) ou Liberibacter crescens) é um patógeno bacteriano Gram-negativo restrito ao floema. O HLB causou uma redução signifi- cativa na qualidade e quantidade cítrica, resultando em bilhões de dó- lares em perdas de produtos cítricos a cada ano e afeta seriamente a viabilidade da indústria cítrica. Os métodos atuais de tratamento do HLB envolvem principalmente a remoção de plantas infectadas e tra- tamento químico contra o vetor de insetos e apenas levaram ao con- trole parcial da doença. Não foram encontrados métodos sustentáveis de controle de doenças para HLB. A expansão rápida e expansiva da doença para vários locais já tornou a remoção completa das árvores infectadas uma estratégia impraticável.

[0079] Para identificar e caracterizar importantes reguladores da defesa cítrica, uma análise comparativa de pequenos RNAs (sSRNAs) e SRNA tem como alvo genes entre variedades híbridas resistentes a HLB e tolerantes a HLB e variedades suscetíveis a HLB. Vários regu- ladores de defesa cítrica que respondem exclusivamente ao infecção por Ca. L. em variedades híbridas resistentes e tolerantes a HLB, po- rém não em variedades suscetíveis a HLB. Entre os reguladores de defesa cítrica identificados, verificou-se que genes putativos de bacté- rias que codificam proteínas antimicrobianas estáveis expressam em um nível muito mais alto nas variedades híbridas resistentes e toleran- tes a HLB e HLB do que nas variedades suscetíveis a HLB. Os porta- enxertos híbridos resistentes e tolerantes a HLB são de origens geo- gráficas e genéticas completamente diferentes.

[0080] Após a identificação dessas proteínas antimicrobianas es- táveis que fornecem resistência ao HLB ou tolerância ao HLB, uma análise funcional dessas proteínas antimicrobianas estáveis foi reali- zada na planta de Solanaceae Nicotiana benthamiana (Nb) que é in- fectada com Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca. L solanace- arum) transmitida por psilídeo da batata (Exemplo 2). O resultado mos- trou que a aplicação de SAMP's a plantas infectadas pode efetivamen- te inibir ou matar espécies de Liberibacter (por exemplo, espécies de Candidatus Liberibacter) e obter proteção de plantas.

[0081] A descrição inclui peptídeos antimicrobianos estáveis isolados (por exemplo, antibacterianos) (SAMP's) (por exemplo, peptí- deos estáveis ao calor (HS)), composições agrícolas contendo esses peptídeos, plantas que compreendem esses peptídeos, plantas trans- gênicas que expressam esses peptídeos, métodos de uso desses pep- tídeos para prevenir ou tratar doenças bacterianas, tal como as causa- das por bactérias Gram-negativas, por exemplo, doença de Liberibac- ter (por exemplo, uma doença de HLB ou batata ZC), doenças bacteri- anas causadas por Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma co-

nhecido como Rhizobium radiobacter) e doenças bacterianas causa- das por Pseudomonas syringae e métodos de produção de plantas que compreendem esses peptídeos ou expressam esses peptídeos. As SAMPs descritas aqui podem inibir e matar patógenos bacterianos, tal como patógenos bacterianos Gram-negativos, por exemplo, espé- cies de Liberibacter, Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma co- nhecido como Rhizobium radiobacter) e cepas Pseudomonas syrin- gae. Os SAMPs descritos aqui podem da mesma forma fornecer plan- tas com resistência ou tolerância a doenças bacterianas, tais como aquelas causadas por bactérias Gram-negativas, por exemplo, doen- ças bacterianas causadas por espécies de Liberibacter, Agrobacterium tumefaciens e cepas Pseudomonas syringae. Il. Peptídeos antimicrobianos estáveis (SAMPs)

[0082] A descrição fornece peptídeos antimicrobianos estáveis (por exemplo, antibacterianos) (SAMPs) que podem ser injetados em plantas para prevenir ou tratar uma doença bacteriana, tal como uma doença bacteriana Gram-negativa, por exemplo, uma doença de Libe- ribacter (por exemplo, HLB) . Os SAMPs descritos aqui podem da mesma forma ser utilizados para prevenir ou tratar doenças bacteria- nas causadas por outros patógenos bacterianos, tal como Agrobacte- rium tumefaciens (da mesma forma conhecido como Rhizobium ra- diobacter) e cepas de Pseudomonas syringae. As plantas podem da mesma forma ser geneticamente modificadas para expressar um ou mais dos SAMPs descritos aqui. A presente descrição identificou ge- nes em plantas que codificam SAMPs que são expressas diferencial- mente em plantas resistentes / tolerantes à doença de Liberibacter (por exemplo, resistentes / tolerantes a HLB) e plantas suscetíveis a doenças de Liberibacter (por exemplo, suscetíveis a HLB). Em algu- mas modalidades, os SAMP's descritos aqui são estáveis ao calor (por exemplo, peptídeos estáveis ao calor (HS)). Em algumas modalidades,

os SAMPs descritos aqui são da mesma forma estáveis em extratos de planta. Em outras modalidades, os SAMPs descritos aqui são da mesma forma estáveis em lisados de plantas (por exemplo, lisados cítricos). Como mostrado nas FIGS. 1A e 1B, esses SAMPs expressos em um nível muito mais alto em plantas resistentes / tolerantes a do- enças de Liberibacter (por exemplo, resistentes a HLB / tolerantes) do que em plantas suscetíveis a doenças de Liberibacter (por exemplo, suscetíveis a HLB). Ao comparar as sequências de aminoácidos de SAMP's de diferentes plantas cítricas e plantas solanáceas, foi consta- tado que os SAMPs expressos em algumas plantas cítricas tolerantes / tolerantes a HLB e pimenta (Ca: Capsicum annuum) são mais curtas, enquanto as SAMPs expressas em plantas solanáceas suscetíveis a HLB são mais longas. A Tabela 1 abaixo fornece sequências de ami- noácidos de SAMPs em várias plantas híbridas, plantas cítricas e plan- tas solanáceas. Tabela 1 SAMP |Fontede | Sequência de Sequência de Ácido Nucleico Planta Aminoácido CghSA | Eremocitrus| MCCNRGKNVSIENLHQ | ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT MPa |glaucax | GFTHIFESTFESTEGVA| GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT citrus sp. | EYVSHPSHVEYANLFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:1) ATCTCATCCGTCACATGTTGAATACGC

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC

AACAGTACGTGTCTGAGAAGGGTGGG CEGCECCEACCCAGCTTTCTTGTACAAA| GTTGGCATTATAAGAAAG (SEQ ID NO: 14) ou

ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT ATCTCATCCGTCACATGTTGAATACGC AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:28 CghSA | Eremocitrus,; MCCNRGKNVSIENLHOQ | ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT MPb —|glaucax | GFPHLFEFTFESTEGVA| GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT citrus sp. | EYVSHPAHVEYANLFL | CCOTCATCTTTTCGAATTTACCTTTGAG| ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:2 ATCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC pe Es mass Planta Aminoácido

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC

AACAGTACGTGTCTGAGAAGGGTGGG CGCGCCGACCCAGCTTTCTT (SEQ ID NO:15) or

ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT CCCTCATCTTTTCGAATTTACCTTTGAG; AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT ATCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:29 942SA | Citrus MCCNRGKNVSIENLHOQ | ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT MP1, reticulata x | GFTHIFESTFESTEGVA | GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT US-942 | Poncirus EYVAHPAHVEYANLFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG trifoliata ANLEKVLVIDYKPTTER | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:3) AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC|

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC

AACAGAACGTGTCTAAGGGTGGGCEGC GCCGACCCAGCTTTCTTGTACAA (SEQ ID NO:16) or

ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG

AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC|

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGAACGTGTCTAA (SEQ ID NO:30) CsSAM | Citrus MCCNRGKNVSIENLHOQ | ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT P1 sinensis GFTHIFESTFESTEGVA | GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT EYVAHPAHVEYANLFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:4) AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC|

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC

AACAGTACGTGTCTGAGTTGTACTAGT AGGGAA (SEQ ID NO:17) or

ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG

AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC|

AAACTTGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:31 CsSAM | Citrus MIAELIRSCCGLELLAV | ATGGAAGAAGCTAAAGGAGTGGTGAA P2 sinensis KYKGKNVSIENLHQGFT|] GCACGTACTTCTGGCCAAGTTCAAAGA; HIFESTFESTEGVAEYV | AGGGACTGCTCAAGATCAAATTGATCA AHPAHVEYANLFLANLE| GCTCATCAAMAGACTATGCAAATCTTGT ma [mma [atenas — Planta Aminoácido

KVLVIDYKPTTVRV GAATCTCATTGAACCCATGAAGTCTTT (SEQ ID NO:5) CCAATGGGGCAAGAATGTGAGCATTG

AGAATCTTCATCAGGGTTTCACTCATA TTTTTGAATCTACCTTTGAGAGCACAG AGGGTGTTGCAGAGTATGTAGCTCATC) CGGCACATGTTGAATACGCAAACTTGT TCCTGGCCAACTTGGAGAAAGTTCTCG

TGATTGACTACAAACCGACAACAGTAC GTGTCTGA (SEQ ID NO:18. CsSAM | Citrus MEEAKGVVKHVLLAKF | ATGGAAGAAGCTAAAGGAGTGGTGAA P3 sinensis KEGTAQDQIDQLIKDYA| GCACGTACTTCTGGCCAAGTTCAAAGA; NLVNLIEPMKSFQWGK | AGGGACTGCTCAAGATCAAATTGATCA DVSIENRHQGFTHIFES | GCTCATCAAAGACTATGCAAATCTTGT TFESTEGVAEYVAHPA | GAATCTCATTGAACCCATGAAGTCTTT HVEYANLFLANLEKVLV | CCAATGGGGCAAGAATGTGAGCATTG IDYKPTTVRV (SEQ ID | AGAATCTTCATCAGGGTTTCACTCATA NO:6) TTTTTGAATCTACCTTTGAGAGCACAG AGGGTGTTGCAGAGTATGTAGCTCATC)

CGGCACATGTTGAATACGCAAACTTGT TCCTGGCCAACTTGGAGAAAGTTCTCG

TGATTGACTACAAACCGACAACAGTAC GTGTCTGA (SEQ ID NO:19 CsSAM | Citrus MGEGEEAAMGEFKHLV| ATGGGTGAGGGTGAAGAGGCAGCAAT P4 sinensis IVKFKEGVVVEDIVKGM | GGGAGAGTTCAAGCACTTGGTGATTGT| KKLVSEIDAVKSFEWG | TAAGTTCAAGGAAGGTGTGGTTGTGGA QDVEGQEMLRQOGFTH | GGATATTGTCAAAGGGATGAAAAAGCT AFLMTFNKKEDYTTFAS| GGTTTCAGAGATTGATGCTGTCAAATC HPSHVEFSATFSAAIEKI] TITTGAATGGGGCCAAGATGTAGAAGG|

VLLDFPTVLGKAPAA GCAGGAGATGCTTAGGCAAGGCTTCA (SEQ ID NO:7) CACATGCATTCTTGATGACATTCAACA

AGAAGGAAGACTATACAACCTTTGCAA GCCATCCCAGCCACGTCGAATTCTCG GCTACATTTTCAGCTGCTATTGAGAAG ATTGTCCTGCTTGATTTCCCTACCGTG

CTTGGCAAAGCACCAGCAGCATGA SEQ ID NO:20 CcSAM | Citrus MKAETKGRDMEEAKG | ATGAMAGCCGAAACAAAAGGCAGAGA P1 clementina | VWKHVLLAKFKEGTAQ | TATGGAAGAAGCTAAAGGAGTGGTGA DQIDQLIKDYANLVNLIE | AGCACGTACTTCTGGCCAAGTTCAAAG PMKSFQWGKDVSIENL | AAGGGACTGCTCAAGATCAAATTGATC HQGFTHIFESTFESTEG| AGCTCATCAAAGACTATGCAAATCTTG VAEYVAHPAHVEYANL | TGAATCTCATTGAACCCATGAAGTCTT FLANLEKVLVIDYKPTT | TECAATGGGGCAAGGATGTGAGCATT VRV (SEQ ID NO:8) GAGAATCTTCATCAGGGTTTCACTCAT

ATTTTTGAATCTACCTTTGAGAGCACA GAGGGTGTTGCAGAGTATGTAGCTCAT|

CCGGCACATGTTGAATACGCAAACTTG TTCCTGGCCAACTTGGAGAAAGTTCTC

GTGATTGACTACAAACCGACAACTGTA CGTGTCTGA (SEQ ID NO:21 CaSAM | Capsicum | MSYGRGKDVSTENLQ | ATGTCATATGGCAGGGGTAAGGATGT P annuum QGFTHVFESTFDSTEG | GAGCACAGAGAACCTCCAGCAAGGTT VAEYVSHPVHVEFANL | TCACTCATGTTTTTGAGTCAACGTTCG MLPQLEKVLVIDYKPEK | ACAGTACAGAAGGTGTTGCAGAGTATG| VGP (SEQ ID NO:9) TAAGTCATCCGGTTCATGTTGAATTTG

CAAATCTAATGCTTCCTCAGCTGGAGA pe Es [aee Planta Aminoácido AAGTCCTCGTCATCGACTACAAACCGG| AGAAAGTCGGTCCCTAA (SEQ |D NO:22 NbSAM | Nicotiana | MEGGKVKHILLAKFKD | ATGEGAGGGTGGTAAAGTGAAGCACAT P benthamian| GIPADQIDQLIKQYANL | ATTGCTGGCCAAGTTCAAAGATGGAAT a VNLIEPMKAFHWGENV | TECAGCAGACCAAATCGACCAACTGAT | SIENFHQGFTHVFESTF | TANGCAATATGCTAATCTTGTCAATCTC| DSTEGIAEYIDHPAHVE | ATCGAACCAATGAAAGCTTTTCATTGG YANTLLPQLEKVLVIDY | GGTGAGAATGTGAGCATAGAGAACTTCI KPEKVGP (SEQ ID CACCAAGGTTTCACTCATGTTTTTGAG NO:10) TCAACGTTCGACAGTACAGAAGGAATT

GCAGAGTATATAGATCATCCGGCTCAT GTTGAATATGCAAATACATTGCTTCCT CAGCTGGAGAAAGTCCTTGTCATCGACI

TACAAACCAGAGAAAGTTGGTCCC (SEQ ID NO:23) ou

ATGGAGGGTGGTAAAGTGAAGCACAT

ATTGCTGGCCAAGTTCAAAGATGGAAT TCCAGCAGACCAAATCGACCAACTGAT| TAAGCAATATGCTAATCTTGTCAATCTC|

ATCGAACCAATGAAAGCTTTTCATTGG GGTGAGAATGTGAGCATAGAGAACTTCI CACCAAGGTTTCACTCATGTTTTTGAG TCAACGTTCGACAGTACAGAAGGAATT GCAGAGTATATAGATCATCCGGCTCAT GTTGAATATGCAAATACATTGCTTCCT CAGCTGGAGAAAGTCCTTGTCATCGACI

TACAAACCAGAGAAAGTTGGTCCCTAA SEQ ID NO:32 SISAMP| Solanum MEGGKGGVVKHILLAK | ATGGAGGGTGGCAAAGGAGGAGTTGT Iycopersicu | FKDGIPPEQIDQLIKQY | GAAGCACATTTTGCTAGCAAAGTTCAA m ANLVNLVEPMKAFQWG| AGATGGGATCCCACCTGAACAGATTGA KDVSIENLHQGFTHVFE| TCAACTCATTAAGCAGTATGCTAATCTT| STFDSLEGVAEYIAHPV | GTCAATCTTGTTGAACCCATGAAGGCT HVEYANTLLPQLEKFLI | TITCAATGGGGTAAGGATGTGAGCATA VDYKPQ (SEQ ID GAAAATCTTCATCAAGGTTTCACTCAT NO:11) GTTTTCGAGTCTACGTTTGACAGTTTA

GAAGGTGTTGCAGAGTATATAGCTCAT CCTGTTCATGTTGAATATGCAAATACAT|

TGCTTCCTCAGCTGGAGAAATTCCTTA TCGTCGACTACAAACCACAG (SEQ ID NO:24) ou

ATGGAGGGTGGCAAAGGAGGAGTTGT

GAAGCACATTTTGCTAGCAAAGTTCAA AGATGGGATCCCACCTGAACAGATTGA| TCAACTCATTAAGCAGTATGCTAATCTT|

GTCAATCTTGTTGAACCCATGAAGGCT TTTCAATGGGGTAAGGATGTGAGCATA GAAAATCTTCATCAAGGTTTCACTCAT GTTTTCGAGTCTACGTTTGACAGTTTA

GAAGGTGTTGCAGAGTATATAGCTCAT CCTGTTCATGTTGAATATGCAAATACAT|

TGCTTCCTCAGCTGGAGAAATTCCTTA TCGTCGACTACAAACCACAGTAA (SEQ pre as [eae — Planta Aminoácido

EN RS RA DX RR SMSAM)| Solanum MNIAVFLPSSCPALPRS | ATGAATATTGCTGTCTTTCTCCCTTCGT| P melongena | KASRPSPPGQFPFLAK | CCETGCCCTGCCCTGCCCCGCTCAAAG NVQLLLVLRSYSSTARA| GCTTCCCGCCCATCCCcACCCGGCCA MSLRGENVSIENLHOG | ATTTCCGTTCCTAGCCAAGAATGTTCA FTHVFESTFDSVEGIAE | GCTTCTACTAGTCTTGAGGTCTTATAG YIDHPAHVEYANILLTQL| TTCCACCGCTCGTGCTATGTCACTTAG

EKVLVIDYKPEKLSP GGGTGAGAATGTGAGCATAGAGAACC (SEQ ID NO:12) TCCACCAAGGTTTCACTCACGTTTTCG AGTCAACGTTTGACAGTGTAGAAGGCA,

TTGCAGAGTATATAGATCATCCTGCTC

ATGTTGAATATGCAAATATATTGCTTAC TCAGCTGGAGAAAGTCCTTGTCATCGA;| CTACAAACCAGAGAAACTCAGCCCCTA,) A (SEQ ID NO:25 StSAMP| Solanum MEGGKGGVVKHILLAK | CTCATACAATCAACCAAATAAAGGACC tuberosum | FKDGIPPEQIDQLIKQY | CTTTTCTCTCCACTATTTTTGCOTTGTCT ANLVNLIEPMKAFQWG | AGTCAAGGAAGAAGAGTGATAAAATAG KDVSIENLHOQGFTHVFE| ASATGGAGGGTGGTAAAGGAGGAGTG STFDSLEGVAEYIAHPV | GTGAAGCACATTTTGCTAGCAAAGTTC HVEFANTMLPQLEKVLII| AMAGATGGGATCCCACCTGAACAAATT DYKPQ (SEQ ID NO:13)| GATCAACTCATTAAGCAGTATGCTAAT

CTTGTCAATCTTATTGAACCCATGAAG GCTTTTCAATGGGGCAAGGATGTGAG CATAGAAAACCTTCACCAAGGTTTCAC TCATGTTTTTGAGTCGACGTTTGACAG TTTAGAAGGCGTTGCAGAGTATATAGC TCATCCTGTTCATGTTGAATTTGCAAAT ACAATGCTTCCTCAGCTGGAGAAAGTOC) CTTATCATTGACTACAAACCACAGTAA CTCAGTCCCTAAACTGGATTCACAAAT TGATGCACTTGATGTAATAGGTATATC AGTTTTACTTTACTGTACTGAAATCCAA TAAGAACACAAACTTTTATTAAGGGTG TGTGTCTTGCTTGTTTGCAATTATTGTA TTCACTTCGTAGACGCTAATGCGAGTA ACTTATGGTCAGCTTGGGCTGTTTAAA CTCGAGGAAGAATGCTCTTCGTTCTTC TCTTCCCAGGGAGAATGAATGATGAAC

AACATATAAGTGCATCAATAAACTCAG ATTGGTGTTTCCATTTCCT (SEQ ID NO:26) ou

ATGGAGGGTGGTAAAGGAGGAGTGGT

GAAGCACATTTTGCTAGCAAAGTTCAA AGATGGGATCCCACCTGAACAAATTGA| TCAACTCATTAAGCAGTATGCTAATCTT|

GTCAATCTTATTGAACCCATGAAGGCT TTTCAATGGGGCAAGGATGTGAGCATA|

GAAAACCTTCACCAAGGTTTCACTCAT

GTTTTTGAGTCGACGTTTGACAGTTTA GAAGGCGTTGCAGAGTATATAGCTCAT| CCTGTTCATGTTGAATTTGCAAATACAA|

TGCTTCCTCAGCTGGAGAAAGTCCTTA TCATTGACTACAAACCACAGTAA (SEQ ID NO:34)

Fonte de | Sequência de Sequência de Ácido Nucleico Planta Aminoácido PtSAMP| Ponirus MCCNRGKNVSIENLHQ | ATGETGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT 1a trifoiata — | GETHIFESTFESTEGVA | GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT EYVAHPAHVEYANSFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:35) AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC|

AAACTCGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:38 PtSAMP| Ponirus MCCNRGKNVSIENLHQ | ATGETGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT 1b trifoiata — | GETHIFESTFESTEGVA | GAGCATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT EYVAHPAHVEYTNSFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:36) AGCTCATCCGGCACATGTTGAATACAC

AAACTCGTTCCTGGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:39) MCaSA | Microcitrus | MCCNRGKNVSIENLHQ | ATGTGCTGCAACAGGGGCAAGAATGT MP australasica, GETHIFESTFESTEGVA | GAGTATTGAGAATCTTCATCAGGGTTT EYVSHPAHVEYANLFL | CACTCATATTTTTGAATCTACCTTTGAG ANLEKVLVIDYKPTTVR | AGCACAGAGGGTGTTGCAGAGTATGT V (SEQ ID NO:37) ATCTCATCCGGCACATGTTGAATACGC

AAACTTGTTCCTCGCCAACTTGGAGAA

AGTTCTCGTGATTGACTACAAACCGAC AACAGTACGTGTCTGA (SEQ ID NO:40)

[0083] Além disso, SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) das plan- tas resistentes / tolerantes a doenças de Liberibacter (por exemplo, resistentes/tolerantes a HLB) contêm alguns aminoácidos diferentes dentro do domínio do barril a-B em comparação com os aminoácidos correspondentes nas plantas suscetíveis à doença de Liberibacter (por exemplo, suscetíveis ao HLB). Duas diferenças principais de aminoá- cidos entre as plantas resistentes / tolerantes à doença de Liberibacter (por exemplo, resistentes / tolerantes a HLB) e as plantas suscetíveis a doenças de Liberibacter (por exemplo, suscetíveis a HLB) são identifi- cadas na alça entre duas hélices a de SAMPs (FIGS 2A-2C). Estas duas posições de aminoácidos são indicadas em negrito e sublinhadas no alinhamento de sequência das SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37.

CORSAMPa mn TEEEETTEa STM NR E CGRSAMBD ===—mnmmameeaaaneaanaaaameaaananamaaaTmarMOCansemeeaea——NR 5 SIA2SAMPL === .—.——nm——————CLE———3. 5 CosMBI Consciente RnMCC-—=staa—-MR'S CSSAMP2 mana Tee ==MIAELIRSCC-— -GLELLAVKYK 20 CSSAMPI ——— ————— MEEAKGVVKHVLLAKPKEGTAQDOIDOL IKDYANLVN-—-LIEPMKSFOW 47 CSSAMPA -———MGEGEEAAMGEFKHLVIVKFKEGVVVEDIVKGMK---KLVS-=-" "EIDAVKSFEW 48 COSAMP] MKAETKGRDMEEAKGVVKHVLLAKF KEGTAQDOIDOLIKDYANIVN-— -LIEPMKSFOW 56 CaSsAMP a=———————m.=n—=—=m——-..—..n..==n=—————.————..“...=— PSY MOSAMP mpT===re= = =MEGGKVKHILLAKFKDGIPADOIDOLIKQYANLVN---—-LIEPMKAFHW 45 SI1SAMP ——====-MEGGKGGVVKHILLAKFKDGIPPEQIDQLIKQYANLVN=---LVEPMKAFQW 48 SmSAMP MMNIAV=-=--=-FLPSSCPALPRSKASRPSPPGQFPFLAKNVOLLLVLRSYSSTARAMSLR 54 StSAMP — ———— — MEGGKGGVVKHILLAKFEDGIPPEQIDOLIKOYANLVN----LIEPMKAFOW 48 PESAMPla m=occonnnrnnasaaanssnssssscaeaaeecssc as ses MOC cn==-NR 5 PESAMPlIb ==>——————— = ———-——.zupp Cc-—...—.—— a 5 MCASAMP cnc ennacaaerasssscacasasceacaseas esse MCCoemeeesssss=NR 5 CghSAMPa GKNVSI-ENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVSHPSHVEYANLYFLANLEKVLVIDYKPTT 64 CgnsaMPb GKNVSI-ENLHQGFPELFEFTFESTEGVAEYVSHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 64 942SAMP]1 GKNVSI-ENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 64 CSSAMP1 GKNVSI-ENLHOGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHBPARVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 64 CSSAMP2 GKNVSI-ENLHOGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 79 CSSAMP3 GKDVSI-ENRHQGPTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 106 CSSAMPA4 GQODVEGOEMLROGFTHAF LMTPNKKEDYTTFASHPSHVEFSATFSAAIEKIVLLDFPTVL 108 CeSAMP1 GKDVSI-ENLHOGPTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 115 CasAMP GKDVST-ENLOOGFTHVFESTPDSTEGVAEYVSHPVAVEFANLMLPOLEKVLVIDYKPEK 64 MoSAMP GENVSI-ENPRQOGPTHVFESTPDSTEGIAEY IDHPAHVEXANTLLPOLEKVLVIDYKPEK 104 SISAMP GKDVSI-ENLHQGFTHVFESTPFDSLEGVAEY IAHPVHVEYANTLLPQLEKFLIVDYKPQO- 106 SMSAMP — GENVSI-ENLHQGFTRVFESTFDSVEGIAEYIDHPAHVEYANILLTQLEKVIVIDYKPEK 113 StSAMP — GKDVSI-ENLHQGFTEVFESTFDSLEGVAEYIAHPVHVEFANTMLPQLEKVLIIDYKPQ- 106 PtSAMP1a GKNVSI-ENLHOGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANSFLANLEKVLVIDYKPTT 64 PLSAMPIb GKNVSI-ENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYTNSPLANLEKVLVIDYKPTT 64 MCaSAMP GKNVSI-ENLHOGFTHIFESTPESTEGVAEYVSHPAHVEYANLFLANLEKVLVIDYKPTT 64 NIRO A SAAB A Rui, Ao: ro ERCARASS po rap ciça consanea Si & Dot oro fm: CghsAMPb VRV=—- 67 942SAMP1 ERV--- 67 CSSAMP]1 VRV=—- 67 CSSAMP2 VRV--—-— 82 CSSAMPI VRV--- 109 CSSAMPA4 GKAPAA 114 COSAMP1 VRV--- 118 CaSsAMP VGP==- 67 NbSAMP VEGP=-- 107 SISAMP =m—— 106 SmSAMP —LSP--- 116 StSAMP —— 1086 PESAMP1a VRV=-- 67 PtSAMPIb VRV——- 67 MCasAMP VRV—— 67

[0084] Em particular, SAMPs descritos aqui incluem o seguinte: Poncirus trifoliata Flying Dragon 1, Kryder 55-5, Nanjing

MCCNRGKNVSIENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYANS FLANLEKVLVIDYKPTTVRV (SEQ ID NO: 35) Poncirus trifoliata Flying Dragon 2

MCCNRGKNVSIENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVAHPAHVEYTNS FLANLEKVLVIDYKPTTVRV (SEQ ID NO: 36) Microcitrus australasica e Poncirus trifoliate (Texas):

MCCNRGKNVSIENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVSHPAHVEYANL

FLANLEKVLVIDYKPTTVRV (SEQ ID NO: 37) Australian desert lime Eremocitrus glauca 1

MCCNRGKNVSIENLHQGFTHIFESTFESTEGVAEYVSHPSHVEYANL FLANLEKVLVIDYKPTTVRV (SEQ ID NO: 1)

[0085] A presente descrição fornece peptídeos antimicrobianos estáveis isolados (por exemplo, antibacterianos) (SAMPs) (por exem- plo, peptídeos HS) compreendendo uma sequência que é substanci- almente idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a) a uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5 e 9). Em algumas moda- lidades, os peptídeos isolados compreendem uma sequência com pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5 e 9). Em modalidades particulares, os peptídeos isolados compreendem uma sequência com pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para uma se- quência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 2.

[0086] A presente descrição fornece SAMPs isolados (por exem- plo, peptídeos HS) compreendendo uma sequência com pelo menos uma substituição de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos) em relação a uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5 e 9). Em modalidades particulares, os pep- tídeos isolados compreendem uma sequência com pelo menos uma substituição de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 13, 14 ou 15 aminoácidos substituições) em relação a uma se- quência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 2.

[0087] SAMPs isolado (por exemplo, peptídeos SH) da presente descrição podem da mesma forma compreender uma sequência de X1GX2X3VSXKa ENXsXsQAGFX7HX8gFEX9TFX10SX11 EGX12AEY X13X14HPX 15HVEX:sANX17X18LX19X20LEKX21LXK22X23DYKPX24aTX25RV (SEQ ID NO:27), em que X: é R, K, ou W; Xcoé Kou E; Xgé Nou D; XKa é Toul; XséL,F, ou R; Xçé Hou Q; Xx é Pou T; Xe é l, L, ou V; Xgé Sou F; XwéEou D; Xu é Tou L; X12 é V ou | Xiz é Vou [| XMéS, A, Ou D; X1ésS, A, ou V; Xi é Y ou F; Xir é L ou T; X18 é F, M, Ou L; X1néA, P, ou T; X2o é N ou Q; X2: é Vou F; X22 é Vou |; Xo3 é Vou |; Xm é T, E, ou Q; e Xos é V, E, L. Em modalidades particulares de SAMP's iso- lados (por exemplo, peptídeos HS) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 27, X1 pode ser R; X> pode ser K; X;3 pode ser N; X4 pode ser |; Xs pode ser L; Xs pode ser H; X1o pode ser E; X11 pode ser T; X12 pode ser V; X1:3 pode ser V; X1s pode ser Y; X17 pode ser L; X18 pode ser F; X19 pode ser A; X2o9 pode ser N; X2; pode ser V; X2>2> pode ser V, X23 pode ser |; e/ou X24 pode ser T.

[0088] Em certas modalidades, a descrição da mesma forma for- nece métodos de produção de uma planta (por exemplo, uma planta cítrica) com maior resistência à doença de Liberibacter (por exemplo, resistência ao HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exem- plo, tolerância ao HLB) (ou seja, resistência aprimorada ou tolerância a uma infecção bacteriana causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter) ou Liberibacter cres- cens) introduzindo uma mutação em um polinucleotídeo na planta, em que o polinucleotídeo mutado codifica um SAMP da presente descri- ção, como o SAMPs descritos acima (por exemplo, SAMPs com pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%

de identidade de sequência) ou pelo menos uma substituição de ami- noácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos) em relação à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5 e 9). Em particular, o polinucleotídeo mutado pode codificar um SAMP tendo pelo menos 75% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % de identidade de sequência) ou pelo menos uma substituição de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições de aminoácidos) em relação à sequência de qual- quer uma de SEQ ID NOs: 1 e 2.

[0089] Em outras modalidades, métodos de produção de uma planta (por exemplo, uma planta cítrica) com maior resistência à doen- ça de Liberibacter (por exemplo, resistência ao HLB) ou tolerância à doença de Liberibacter (por exemplo, tolerância ao HLB) (ou seja, maior resistência ou tolerância a uma infecção bacterian causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter) ou Liberibacter crescens) pode ser alcançada através da introdução de uma ou mais mutações em um polinucleotídeo na plan- ta, em que as mutações especificamente alteram os aminoácidos no SAMP nativo na planta que corresponde aos dois aminoácidos em ne- grito e sublinhado no alinhamento de sequência mostrado acima. Por exemplo, as posições em uma sequência polinucleotídica que codifica um SAMP nativo em uma planta que corresponde aos dois aminoáci- dos em negrito e sublinhado no alinhamento de sequência mostrado acima podem ser alteradas para codificar S, A ou D como o primeiro de dois aminoácidos em negrito e sublinhados e S, A ou V como o se- gundo dos dois aminoácidos em negrito e sublinhado.

[0090] Em algumas modalidades, alguém versado na técnica pode realizar o alinhamento de sequência de uma sequência polinucleotídi-

ca codificando um SAMP nativo em uma planta e uma sequência poli- nucleotídica que codifica um SAMP eficaz (por exemplo, SEQ ID NO: 14 ou 15) para determinar ácidos nucleicos específicos no polinucleo- tídeo da planta que necessitam ser mutados de modo que o polinucle- otídeo mutado resultante na planta codifique substancialmente a mesma sequência polinucleotídica que a de um SAMP eficaz (por exemplo, SEQ ID NO: 14 ou 15).

[0091] A descrição da mesma forma fornece métodos para preve- nir ou tratar uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB) e/ou pre- venir ou tratar uma infecção bacteriana causada por bactérias no gê- nero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens) em uma planta por entrar em contato com a planta com um SAMP descrito acima (por exemplo, SAMPs com pelo menos 75% de identidade de sequência ou pelo menos uma substitui- ção de aminoácidos em relação à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-5 e 9 (por exem- plo, SEQ ID NO: 1 e 2)). Sem ser ligado a qualquer teoria, SAMP's (por exemplo, peptídeos HS) podem alvejar e destruir células bacterianas e/ou induzir resposta de defesa em plantas, desse modo aumentando a resistência à doença de Liberibacter ou a tolerância às plantas de Liberibacter. Um exemplo de uma infecção bacteriana causada por bactérias do gênero Liberibacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens) que podem ser tratadas ou pre- venidas como descrito aqui é uma doença de microplaqueta da batata zebra. Por exemplo, a doença da batata zebra pode ser tratada ou evi- tada em plantas de batata ou tomate. Ill. Composições Agrícolas

[0092] A descrição da mesma forma fornece composições agríco- las que contêm um ou mais dos SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui para uso na prevenção ou tratamento de uma doença bacteriana (por exemplo, uma doença de Liberibacter (HLB) ou doença da micropartícula da batata zebra, e outras doenças bacterianas, tal como aquelas causadas por Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma conhecido como Rhizobium radiobacter) e Pseudomonas syrin- gae) em uma planta. Em algumas modalidades, a composição agrícola inclui ainda pelo menos uma dentre um herbicida, um protetor de her- bicida, um tensoativo, um fungicida, um pesticida, uma nematicida, um ativador de plantas, um sinergista, um regulador de crescimento de plantas, um repelente de insetos, um acaricida, um moluscicida ou um fertilizante.

[0093] Uma composição agrícola compreendendo um ou mais SAMP's (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui pode da mesma forma incluir um ou mais dentre: um agente ativo de superfície, um transportador inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um aglutinante, um emulsificante, um corante, um protetor UV, um tampão, um agente de fluxo, um fertilizante, um agente de fixação de nitrogênio, doadores de micronutrientes ou outras preparações que influenciam o cresci- mento da planta. A composição agrícola pode da mesma forma incluir um ou mais agroquímicos, incluindo: herbicidas, inseticidas, fungici- das, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaracidas, reguladores de crescimento de plantas, auxiliares de colheita e fertilizantes, que podem da mesma forma ser combinados com transportadores, tensoa- tivos ou adjuvantes, como apropriado para o agroquímico. Veículos e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias normalmente empregadas na tecnologia de formula- ção, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, sol- ventes, dispersantes, agentes umectantes, aderentes, aglutinantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente descrição são nor- malmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de colheita, planta ou semente a ser tratada. Por exemplo, as composições da presente descrição podem ser aplicadas durante o crescimento, semeadura ou armazenamento.

[0094] Os agentes tensoativos que podem ser utilizados com os SAMPs atualmente descritos (por exemplo, peptídeos HS) incluem compostos aniônicos, tal como um carboxilato de, por exemplo, um metal; carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um N- acilsarcosinato; mono ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais desses ésteres; sulfatos de álcool graxo, tais co- mo dodecilsulfato de sódio, octadecilsulfato de sódio ou cetilsulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etoxilado; sulfatos de alquilfenol etoxi- lados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arila, tal como sulfonatos de alquil benzeno ou sulfonatos de alquil naf- taleno inferiores, por exemplo, sulfonato de butil naftaleno; sais de condensados de naftaleno-formaldeído sulfonados; sais de condensa- dos de fenol-formaldeído sulfonados; sulfonatos mais complexos, tais como os sulfonatos de amida, por exemplo, o produto de condensação sulfonado de ácido oleico e N-metil taurina; ou os sulfossucinatos de dialquila, por exemplo, o sulfonato de sódio ou sucinato de dioctila. Os agentes não iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácidos graxos, álcoois graxos, amidas de ácidos graxos ou fenóis substituídos por alquila ou alquenila graxos com óxido de etileno, éste- res graxos de éteres de álcool poliídrico, por exemplo, ésteres de áci- dos graxos de sorbitano, produtos de condensação desses ésteres tal com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácidos graxos de poli- oxietileno sorbitar, copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos tal como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol ou glicóis acetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente tensoativo catiônico incluem, por exemplo, uma mono, di ou poliamina alifática, como acetato, naftenato ou oleato; ou amina contendo oxigênio, tal como um óxido de amina de polioxietileno alquilamina; uma amina |i- gada a amida preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma di ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.

[0095] Exemplos de materiais inertes ou veículos inertes que po- dem ser usados incluem, porém não são limitados a minerais inorgâni- cos tal como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos tal como cortiça, espigas de milho em pó, cascas de amendoim, cascas de arroz e nozes.

[0096] Herbicidas que podem ser usados com os SAMPs atual- mente descritos (por exemplo, peptídeos HS) incluem compostos que matam ou inibem o crescimento ou a replicação de plantas indeseja- das, tipicamente um subconjunto de plantas que é distinto da planta ou cultura desejada. Existem vários modos de ação: inibição da ACCase, inibição da biossíntese de carotenóides, inibição da síntese da parede celular, inibição de ALS, inibição da ESP sintase, inibição da glutamina sintase, inibição da HPPD, inibição da reunião de microtúbulos, inibi- ção da PPO, etc. Exemplos de herbicidas comercialmente disponíveis incluem TimeO, MSMA, CorvusO, VoluntárioO, EscaladeO, Q40, Rap- torO, AcumenO, SencorO, BulletO, TopNotchO, ValorO, PastureGardO, glicofosato (RoundupO), DSMA, Break-UpO, HyvarO, BarricadeO, etc. Herbicidas podem ser misturados com "agentes de proteção contra herbicidas" para reduzir a toxicidade geral do herbicida, como descrito, por exemplo, em Riechers e outro (2010) Plant Physiol. 153: 3.

[0097] Pesticidas (por exemplo, nematicidas, moluscicidas, inseti- cidas, miticidas/acaricidas) podem ser usados em combinação com os SAMP's atualmente divulgados (por exemplo, peptídeos HS) para ma- tar ou reduzir a população de pragas indesejáveis que afetam a planta. Os pesticidas podem da mesma forma ser usados com repelentes ou feromônios para interromper o comportamento de acasalamento. Inse- ticiudas são direcionados aos insetos e incluem, por exemplo, aqueles de origem botânica (por exemplo, alicina, nicotina, oximatrina, jasmoli- na | e Il, quassia, rodojaponina Ill e limoneno), inseticidas de carbama- to (por exemplo, carbarila, carbofurano, carbossulfano, oxamil nitrila- carbe, CPMC, EMPC, fenobucarbe), inseticidas de flúor, inseticidas de formamidina, fumigantes (por exemplo, óxido de etileno, brometo de metila, dissulfeto de carbono), inibidores da síntese de quitina, insetici- das macrocíclicos de lactona, inseticidas macrocíclicos de lactona, in- seticidas neonicotinóides, insetos organofósforo, uréia e tioureia, etc. Nematicidas afetam os nematódeos e incluem, por exemplo, nematici- das de organofósforo (por exemplo, diamidafos, fostiazato, heterofos, fosfamidon, triazofos), nematicidas fumigantes (por exemplo, dissulfeto de carbono, brometo de metila, iodeto de metila), abamectina, carva- crol, nematicidas de carbamato (por exemplo, benomila, oxamila), etc. Moluscicidas são direcionados a lesmas e caracóis e incluem, por exemplo, alicina, bromoacetamida, tiocarbe, trifenmorfo, fentina, sulfa- to de cobre etc. Muitos pesticidas têm como alvo mais de um tipo de peste, de modo que um ou dois podem ser selecionados para atingir insetos, moluscos, nematódeos, mitógenos etc.

[0098] Os fertilizantes normalmente fornecem macro e micronutri- entes de uma forma que podem ser utilizados pela planta ou por um organismo associado à planta. Estes incluem, por exemplo, nitrogênio, fósforo, potássio, enxofre, cálcio, potássio, boro, cloro, cobre, ferro, manganês, molibdênio, zinco, níquel e selênio. Os fertilizantes costu- mam ser adaptados às condições específicas do solo ou para determi- nadas colheitas ou plantas. Os fertilizantes que podem ser usados incluem materiais de ocorrência natural, modificados, concentrados e/ou quimicamente sintetizados, por exemplo, esterco, farinha de os- sos, composto, farinha de peixe, lascas de madeira, etc., ou podem ser quimicamente sintetizados, UAN, nitrato de amônio anidroso, uréia, potássio, etc. Os fornecedores incluem Scott&, SureCropO, BCFO,

RVRGO, Gardenline€& e muitos outros conhecidos na técnica.

[0099] Os fungicidas são compostos que podem matar fungos ou inibir o crescimento ou a replicação de fungos. Os fungicidas que po- dem ser utilizados com os SAMPs atualmente descritos (por exemplo, peptídeos HS) incluem fungicidas de contato, translaminares e sistê- micos. Exemplos incluem enxofre, óleo de nim, óleo de alecrim, jojoba, óleo da árvore de chá, Bacillus subtilis, Ulocladium, cinamaldeído, etc.

[00100] As composições agrícolas da descrição podem estar em uma forma adequada para aplicação direta ou como um concentrado de composição primária que requer diluição com uma quantidade ade- quada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração do SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) na composição agrícola va- riará dependendo da natureza da formulação específica, especifica- mente, se é um concentrado ou para ser usado diretamente, o tipo de planta e, em alguns casos, sobre a natureza do uso, por exemplo, para prevenir uma planta que esteja em risco de uma doença de Liberibac- ter (por exemplo, HLB) ou para tratar uma planta que já esteja infecta- da com uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB). IV. Métodos de prevenção ou tratamento de uma doença bacteri- ana

[00101] Como descrito aqui, os SAMPs podem ser usados para prevenir ou tratar uma doença bacteriana, por exemplo, uma doença bacteriana Gram-negativa. Uma doença de Liberibacter refere-se a uma infecção causada por bactérias Gram-negativas no gênero Liberi- bacter (por exemplo, espécies Candidatus Liberibacter ou Liberibacter crescens). Uma doença de Liberibacter pode infectar plantas tal como plantas cítricas (por exemplo, laranja, toranja, tangerina, limão, lima, lima comum, papeda, cidra e pomelo) e plantas solanáceas (por exemplo, batata, tomate, berinjela e pimenta). Huanglongbing (HLB) é um tipo de doença de Liberibacter que infecta plantas cítricas. A doen-

ça da micropartícula da batata zebra (ZC) é um tipo de doença de Li- beribacter que infecta plantas de batata. A infecção é vetorizada e transmitida por psilídeos da batata (por exemplo, Bactericera cockere- 1li). Os métodos de utilização dos SAMPs descritos aqui podem da mesma forma ser usados para prevenir ou tratar outras doenças bac- terianas (por exemplo, outras doenças bacterianas Gram-negativas), tal como aquelas causadas por Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma conhecido como Rhizobium radiobacter) e Pseudomonas syrin- gae.

HLB

[00102] A presente descrição da mesma forma fornece métodos de prevenção ou tratamento de HLB em plantas. Em algumas modalida- des dos métodos, as plantas com HLB podem ser contatadas com um SAMP's (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui (por exemplo, um SAMP compreendendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2) ou uma composição agrícola compreendendo um ou mais SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui. Em algumas modalidades, o SAMP ou a composição agrícola pode ser injetada no tronco da planta. Em outras modalida- des, o SAMP ou a composição agrícola pode ser injetado no caule da planta. Em ainda outras modalidades, o SAMP ou a composição agrí- cola pode ser pulverizada foliarmente na planta. Em ainda outras mo- dalidades, o SAMP ou a composição agrícola pode ser aplicada por irrigação por gotejamento para a planta. Uma vez que as plantas são contatadas com SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui, os peptídeos podem aumentar a resistência ao HLB ou a tolerância ao HLB das plantas, impedindo ou tratando o HLB nas plantas.

[00103] Os métodos descritos aqui podem ser usados para reduzir os sintomas causados pelo HLB, incluindo amarelamento das folhas, manchas das folhas, manchas semelhantes à deficiência de zinco, clo-

rose severa e produção de frutos reduzida. Será entendido que os sin- tomas do HLB variam de acordo com o tempo da infecção, estágio da doença, espécies de árvores e maturidade das árvores, entre outras coisas. Será ainda entendido que, em algumas modalidades, os méto- dos descritos podem não resultar necessariamente na erradicação ou cura da infecção, porém podem reduzir significativamente os sintomas causados pelo HLB.

[00104] Desse modo, em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos reduzem os sintomas de HLB, reduzindo o amarelamento das folhas, resultando em uma aparência mais verde, aumentando a taxa de crescimento da planta e/ou aumentando o rendimento de fru- tos da planta. Desse modo, em algumas modalidades, o rendimento de frutas é melhorado em 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500% ou mais em comparação com uma planta que não é tratada de acordo com os métodos. Em algumas mo- dalidades, o rendimento de frutas é aumentado para 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do rendimento de uma planta semelhante que não foi infectado por HLB.

[00105] Os métodos descritos aqui podem da mesma forma ser uti- lizados para prevenir a infecção por HLB em plantas. Por exemplo, uma planta que ainda não está infectada com o HLB, porém está em risco de infecção (ou seja, a planta está localizada em uma área em que o HLB é identificado nas plantas vizinhas) pode ser contatada por um ou mais SAMPs (por exemplo, peptídeos HS), como descrito nos métodos da descrição. A planta em risco para HLB pode da mesma forma ser geneticamente modificada para expressar um ou mais SAMP's (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui para prevenir HLB. Doença ZC da batata

[00106] A presente descrição da mesma forma fornece métodos para prevenir ou tratar a doença de ZC da batata em plantas de bata-

ta. Em algumas modalidades dos métodos, as plantas com doença de ZC da batata podem ser contatadas com um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui (por exemplo, um SAMP compreendendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 2) ou uma composição agrícola compreendendo um ou mais SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui. Em algumas modalidades, o SAMP ou a composição agrícola pode ser injetado no tubérculo da planta. Em outras modalidades, o SAMP ou a composi- ção agrícola pode ser aplicada às raízes das plantas. Em ainda outras modalidades, o SAMP ou a composição agrícola pode ser pulverizada foliarmente na planta. Uma vez que as plantas são contatadas com os SAMP's (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui, os peptídeos po- dem aumentar a resistência à doença de ZC da batata ou a tolerância à doença de ZC da batata das plantas, desse modo, prevenindo ou tratando a doença de ZC da batata nas plantas.

[00107] Os métodos descritos aqui podem ser usados para reduzir os sintomas causados pela doença de ZC da batata, incluindo clorose, queima de folhas, nódulos inchados, escurecimento do tecido vascu- lar, folhas enroladas, estolões colapsados, lenticelas aumentadas, es- curecimento do tecido vascular, descoloração dos raios medulares e esfoliação necrótica do tecido tubérculo. Será entendido que os sinto- mas da doença de ZC da batata variam de acordo com o tempo da infecção, estágio da doença, espécies de plantas e maturidade, entre outras coisas. Será ainda entendido que, em algumas modalidades, os métodos descritos podem não resultar necessariamente na erradica- ção ou cura da infecção, porém podem reduzir significativamente os sintomas causados pela doença de ZC da batata.

[00108] Desse modo, em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos reduzem os sintomas da doença de ZC da batata como descrito acima, resultando em uma aparência mais saudável, aumen-

tando a taxa de crescimento da planta e/ou aumentando o rendimento da planta. Desse modo, em algumas modalidades, o rendimento é me- lhorado em 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500% ou mais comparado a uma planta que não é trata- da de acordo com os métodos. Em algumas modalidades, o rendimen- to é aumentado para 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do rendimento de uma planta semelhante que não foi infectada por doença de ZC da batata.

[00109] Os métodos descritos aqui podem da mesma forma ser usados para prevenir a infecção por doença de ZC da batata em plan- tas. Por exemplo, uma planta que ainda não está infectada com a do- ença de ZC da batata, porém está em risco de infecção (ou seja, a planta está localizada em uma área onde a doença de ZC da batata é identificada nas plantas vizinhas) pode ser contatada por um ou mais SAMP's (por exemplo, peptídeos HS) como descrito nos métodos da descrição. A planta em risco de doença de ZC da batata pode da mesma forma ser geneticamente modificada para expressar um ou mais SAMPs (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui para prevenir a doença de ZC da batata. V. Produção de plantas compreendendo SAMPs

[00110] Em outro aspecto, a presente descrição fornece plantas transgênicas compreendendo cassetes de expressão recombinantes para expressar um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) como des- crito aqui em uma planta. Em algumas modalidades, uma planta trans- gênica é gerada que contém uma sequência completa ou parcial de um polinucleotídeo que é derivado de uma espécie diferente das es- pécies da planta transgênica. Deve ser reconhecido que as plantas transgênicas abrangem a planta ou célula de planta em que o cassete de expressão é introduzido, bem como a progênie de tais plantas ou células de planta que contêm o cassete de expressão, incluindo a pro-

gênie que possui o cassete de expressão integrado de maneira estável em um cromossomo.

[00111] Um vetor de expressão recombinante compreendendo uma sequência de codificação SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) acio- nada por um promotor heterólogo pode ser introduzida no genoma do hospedeiro da planta desejado por uma variedade de técnicas con- vencionais. Por exemplo, o construtor de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de planta, ou o construtor de DNA pode ser introduzido diretamente no tecido de planta usando métodos balísticos, tais como o bombardeio de partículas de DNA. Um vetor exemplar é um vetor viral que pode expressar e opcionalmente replicar na planta. Exemplos de vetores virais podem incluir, por exemplo, vírus tristeza cítrico (CTV) para ex- pressar o peptídeo de maneira limitada ao floema em citros, ou vírus do chocalho do tabaco (TRV) para expressar os peptídeos antimicro- bianos em batata ou outras plantas. Alternativamente, o construtor de DNA pode ser combinado com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzida em um vetor hospedeiro convencional de Agrobacterium tumefaciens. As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens direcionarão a inserção do construtor e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula esti- ver infectada pela bactéria. Embora a expressão transitória do SAMP constitutivamente ativo seja abrangida pela descrição, geralmente, a expressão de um construtor da descrição será a partir da inserção de cassetes de expressão no genoma da planta, por exemplo, de modo que pelo menos algumas descendentes de plantas da mesma forma contenham o cassete de expressão integrado.

[00112] As técnicas de microinjeção são da mesma forma úteis pa- ra esse fim. Essas técnicas são bem conhecidas na técnica e descritas detalhadamente na literatura. A introdução de construções de DNA usando precipitação com polietileno glicol é descrita em PaszKkowski e outro EMBO J. 3: 2717-2722 (1984). As técnicas de eletroporação são descritas em Fromm e outro Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824 (1985). As técnicas de transformação balística são descritas em Klein e outro Nature 327: 70-73 (1987).

[00113] As técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch e ou- tro Science 233: 496-498 (1984) e Fraley e outro Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983).

[00114] As células de planta transformadas derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação acima pode ser cultivada para re- generar uma planta inteira que possui o genótipo transformado e, por- tanto, o fenótipo desejado, por exemplo, resistência ou tolerância a uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB). Tais técnicas de re- generação dependem da manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente confiando em um marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com as sequências nucleotídicas desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans e outro, Proto- plasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124- 176, MacMillilan Publishing Company, Nova lorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplast, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração pode da mesma forma ser obtida a partir de calos da planta, explantes, órgãos ou partes dos mesmos. Tais téc- nicas de regeneração são descritas geralmente em Klee e outro Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987).

[00115] Um especialista na técnica reconhecerá que após o cassete de expressão ser incorporado de maneira estável em plantas transgê-

nicas e confirmado como operável, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma das várias técnicas de criação padrões pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas.

[00116] Os cassetes de expressão e outras construções da descri- ção podem ser usados para conferir resistência ou tolerância à doença de Liberibacter em essencialmente qualquer planta. Desse modo, a descrição tem uso em uma ampla faixa de plantas, incluindo espécies do gênero Citrus (por exemplo, Citrus maxima, Citrus medica, Citrus micrantha, Citrus reticulate, Citrus aurantiifolia, Citrus aurantium, Citrus latifolia, Citrus limon, Citrus limonia, Citrus paraíso, Citrus sinensis e Citrus tangerine) ou espécies da família Solanaceae (por exemplo, So- lanum spp., Capsicum spp. e Nicotiana spp.). As espécies do gênero Solanum incluem, por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum lyco- persicum, Solanum melongena, Solanum aviculare, Solanum capsicas- trum, Solanum crispum, Solanum laciniatum, Solanum laxum, Solanum pseudocapsicum, Solanum rantonnetii, Solanum pestudocapsicum, Solanum rantonnetii. As espécies do gênero Capsicum incluem, por exemplo, Capsicum annuum, Capsicum baccatum, Capsicumcampylo- podium, Capsicum lanceolatum, Capsicum lycianthoides, Capsicum minutiflorum, Capsicum mositicum, Capsicum pubescens, Capsicum recurvatum, Capsicum schottianum, Capsicum spina-alba, Capsicum tovarii e Capsicum villosum. As espécies do gênero Nicotiana incluem, por exemplo, Nicotiana acuminate, Nicotiana benthamiana, Nicotiana glauca, Nicotiana longiflora, Nicotiana rustica, Nicotiana tabacum e Ni- cotiana occidentalis.

[00117] Em modalidades particulares, a planta é selecionada a par- tir do grupo consistindo em Citrus reticulata, Citrus sinensis, Citrus clementina, Capsicum annuum, Solanum tuberosum, Solanum lyco- persicum, Solanum melongena e Nitotiana benthamiana. Em modali-

dades particulares, a planta é uma planta de laranja doce (Citrus si- nensis). Em modalidades particulares, a planta é uma planta clementi- na (Citrus clementina). Em modalidades particulares, a planta é uma planta de batata (Solanum tuberosum). Em algumas modalidades, a planta é uma planta produtora de frutas ou vegetais.

[00118] Os especialistas reconhecerão que várias espécies de plan- tas podem ser usadas como modelos para prever os efeitos fenotípi- cos da expressão do transgene em outras plantas. Por exemplo, é bem reconhecido que as plantas de tabaco (Nicotiana) e Arabidopsis são modelos úteis de expressão de transgene, particularmente em ou- tras dicotiledôneas.

[00119] Em algumas modalidades, as plantas da descrição têm fe- nótipos mediados por SAMP aprimorados, por exemplo doença bacte- riana aprimorada (por exemplo, uma doença de Liberibacter (por exemplo, HLB e ZC) e outras doenças bacterianas, tais como as cau- sadas por resistência ou tolerância a Agrobacterium tumefaciens (da mesma forma conhecida como Rhizobium radiobacter) e Pseudomo- nas syringae), em comparação com plantas que são de outra maneira idênticas, exceto pela expressão do SAMP. CRISPR/Cas

[00120] As manipulações de genes de plantas agora podem ser adaptadas com precisão em organismos não transgênicos usando o método de edição do genoma CRISPR/Cas9. Neste sistema regulató- rio antiviral bacteriano e transcricional, um complexo de dois pequenos RNAs- o CRISPR-RNA (crRNA) e o crRNA de trans-ativação (tracrR- NA) - direciona a nuclease (Cas9) para uma sequência de DNA espe- cífica complementar ao crRNA (Jinek, M., e outro, Science 337, 816— 821 (2012)). A ligação desses RNAs ao Cas9 envolve sequências es- pecíficas e estruturas secundárias no RNA. Os dois componentes do RNA podem ser simplificados em um único elemento, o único RNA-

guia (sgRNA), que é transcrito a partir de um cassete contendo uma sequência alvo definida pelo usuário (Jinek, M., e outro Science 337, 816-821 (2012)). Este sistema tem sido usado para edição de genoma em humanos, peixe-zebra, Drosophila, camundongos, nematódeos, bactérias, leveduras e plantas (Hsu, P.D., e outro, Cell 157, 1262-1278 (2014)). Neste sistema, a nuclease cria quebras de filamento duplo na região alvo programada pelo saRNA. Estes podem ser reparados por recombinação não homóloga, que geralmente produz mutações de inativação. As quebras podem da mesma forma ser reparadas por re- combinação homóloga, que permite que o sistema seja usado para substituição de genes direcionados a genes (Li, J.-F., e outro Nat. Bio- technol. 31, 688-691, 2013; Shan, Q,, e outro, Nat. Biotechnol. 31, 686-688, 2013). Em algumas modalidades dos métodos na presente descrição, um gene que codifica um SAMP de tipo silvestre ou endó- geno em uma planta pode ser modificado usando o sistema CAS9 / CRISPR para corresponder à sequência de polinucleotídeo que codifi- ca um SAMP descrito aqui (por exemplo, uma sequência de polinucle- otídeos que codifica o SAMP possuindo pelo menos 75% de identida- de de sequência ou pelo menos uma substituição de aminoácidos em relação à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2)). Em algumas modalidades, um ge- ne que codifica um SAMP de tipo silvestre ou endógeno em uma plan- ta pode ser modificado usando o sistema CAS9 / CRISPR para cor- responder à sequência polinucleotídica de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-26, 28-34 e 38- 40 (por exemplo, SEQ ID NO: 14 e 15).

[00121] Desta maneira, algumas modalidades, em vez de gerar uma planta transgênica, uma sequência de codificação SAMP nativa em uma planta ou célula de planta pode ser alterada in situ para gerar uma planta ou célula de planta transportando um polinucleotídeo que codifica um SAMP descrito aqui (por exemplo, um SAMP com pelo menos 75% de identidade de sequência ou pelo menos uma substitui- ção de aminoácidos em relação à sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2)). Por exem- plo, em algumas modalidades, a tecnologia CRISPR é usada para in- troduzir uma ou mais mudanças nucleotídicas em uma sequência de codificação SAMP in situ para alterar o códon apropriado para fazer uma alteração correspondente às posições X; a X>5, como menciona- do na sequência de SEQ ID NO: 27 O sistema CRISPR / Cas foi modi- ficado para uso em sistemas procarióticos e eucarióticos para edição de genoma e regulação transcricional. O sistema "CRISPR / Cas" refe- re-se a uma classe generalizada de sistemas bacterianos para defesa contra ácido nucleico estranho. Sistemas CRISPR / Cas são encontra- dos em uma ampla faixa de organismos eubacterianos e archaeais. Sistemas CRISPR / Cas incluem subtipos do tipo |, Il e Ill. Sistemas CRISPR / Cas do tipo silvestre || utilizam nuclease mediada por RNA, Cas9, em complexo com RNA guia e ativador para reconhecer e clivar ácido nucleico estranho. Os homólogos do Cas9 são encontrados em uma ampla variedade de eubactérias, incluindo, entre outras, bactérias dos seguintes grupos taxonômicos: Actinobacteria, Aquificae, Bacte- roidetes-Chlorobi, Chlamydiae-Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobac- teria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes e Thermotogae. Uma proteína Cas9 exemplar é a proteína Cas9 de Streptococcus pyoge- nes. Proteínas Cas9 adicionais e homólogos das mesmas são descri- tas em, por exemplo, Chylinksi, e outro, RNA Biol. 2013 1 de maio; 10 (5): 726-737; Nat. Rev. Microbiol. Junho de 2011; 9 (6): 467-477; Hou, e outro, Proc Natl Acad Sci USA A. 24 de setembro de 2013; 110 (39): 15644-9; Sampson e outro, Nature. 9 de maio de 2013; 497 (7448): 254-7; e Jinek e outro, Science. 17 de agosto de 2012; 337 (6096): 816-21.

[00122] Desta maneira, em um aspecto, em um método é fornecido usando CRISPR / CAS9 para introduzir pelo menos uma mutação em uma célula de planta. Em algumas modalidades, um método para alte- rar um ácido nucleico (por exemplo, nativo) codificando SAMP em uma planta é fornecido. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução na célula de planta contendo e expressando uma molécula de DNA que possui um ácido nucleico alvo que codifica SAMP uma repetição palindrômica curta espaçada regularmente agrupada criada, de ocorrência não natural (CRISPR) - sistema de CRISPR associado (Cas) (CRISPR- Cas). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR- Cas compreende um ou mais vetores compreendendo: a) um primeiro elemento regulador operável em uma célula de planta operacional- mente ligada a pelo menos uma sequência de nucleotídeos codifican- do um RNA guia do sistema de CRISPR-Cas que hibridiza com a se- quência alvo, e b) um segundo elemento regulador operável em uma célula de planta operacionalmente ligada a uma sequência nucleotídi- ca que codifica uma proteína Cas9 Tipo Il, em que os componentes (a) e (b) estão localizados no mesmo ou em diferentes vetores do siste- ma, pelo qual o RNA guia tem como alvo a sequência alvo e a proteína Cas9 cliva a molécula de DNA, pela qual pelo menos uma mutação é introduzida no ácido nucleico alvo que codifica o SAMP, ou seja, uma ou mais mutações são introduzidas no ácido nucleico alvo que codifica os SAMPs para alterar a sequência do ácido nucleico alvo para cor- responder à sequência polinucleotídica que codifica um peptídeo anti- microbiano (por exemplo, antibacteriano) com a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2) Em algumas modalidades, o SAMP é selecionado a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-5 e 9, ou um polipeptídeo substancialmente idêntico do mesmo.

[00123] Em algumas modalidades, métodos de usar tecnologia CRISPR / CAS9 para introduzir pelo menos uma mutação em um áci-

do nucleico (por exemplo, nativo) que codifica SAMP podem ser apli- cados a uma ampla faixa de plantas, incluindo espécies do gênero Ci- trus (por exemplo, Citrus maxima, Citrus medica, Citrus micrantha, Ci- trus reticulate, Citrus aurantiifolia, Citrus aurantium, Citrus latifolia, Ci- trus limon, Citrus limonia, Citrus paradise, Citrus sinensis e Citrus tan- gerine) ou espécies da família Solanaceae (por exemplo, Solanum spp., Capsicum spp.

E Nicotiana Spp.). As espécies do gênero Sola- num incluem, por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum lycopersi- cum, Solanum melongena, Solanum aviculare, Solanum capsicastrum, Solanum crispum, Solanum laciniatum, Solanum laxum, Solanum pseudocapsicum, Solanum rantonnetii, Solanum seaforthianum e So- lanum wendlandii.

As espécies do gênero Capsicum incluem, por exemplo, Capsicum annuum, Capsicum baccatum, Capsicum campylopodium, Capsicum cardenasii, Capsicum chacoense, Capsi- cum cornutum, Capsicum dusenii, Capsicum eximium, Capsicum fri- burgense, Capsicum frutescens, Capsicum geminifolium, Capsicum havanense, , Capsicum lanceolatum, Capsicum Iycianthoides, Capsi- cum minutiflorum, Capsicum mositicum, Capsicum pubescens, Capsi- cum recurvatum, Capsicum schottianum, Capsicum spina-alba, Capsi- cum tovarii, e Capsicum villosum.

As espécies do gênero Nicotiana incluem, por exemplo, Nicotiana acuminate, Nicotiana benthamiana, Nicotiana glauca, Nicotiana longiflora, Nicotiana rustica, Nicotiana ta- bacum, e Nicotiana occidentalis.

Em modalidades particulares, a plan- ta é selecionada a partir do grupo consistindo em Citrus reticulata, Ci- trus reticulata, Citrus sinensis, Citrus clementina, Capsicum annuum, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, e Nitotiana benthamiana.

Em modalidades particulares, a planta é uma planta de laranja doce (Citrus sinensis). Em modalidades particulares, a planta é uma planta clementina (Citrus clementina). Em modalidades particulares, a planta é uma planta de batata (Solanum tuberosum).

Em algumas modalidades, a planta é uma planta produtora de frutas ou vegetais.

[00124] Em algumas modalidades, a(s) mutação(ões) introduzida(s) na sequência de ácido nucleico alvo altera o códon apropriado na se- quência para fazer alterações que correspondem às posições X: a X25, como mencionado na sequência de SEQ ID NO: 27. Por exemplo, de- pois de introduzir as mutações no ácido nucleico alvo para alterar os códons apropriados, a sequência de ácido nucleico modificada codifi- ca, em suas posições correspondentes, um ou mais aminoácidos, co- mo mencionado nas posições X, a X»s de SEQ ID NO: 27. Da mesma forma fornecido como uma planta ou célula de planta resultante do método acima descrito. Essa planta conterá uma sequência de ácido nucleico de ocorrência não natural que codifica o SAMP. VI. Cassetes de expressão

[00125] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece cassetes de expressão que compreendem um polinucleotídeo que co- difica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) da descrição, em que a introdução do cassete de expressão em uma planta resulta em uma planta transgênica que expressa o SAMP. Em algumas modalidades, um promotor pode estar operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica o SAMP. O promotor pode ser heterólogo ao polinucleotí- deo. Em algumas modalidades, o promotor pode ser indutível. Em al- gumas modalidades, o promotor pode plantar tecido-específico (por exemplo, específico de floema, específico de tubérculo, específico de raiz, específico de caule, específico de tronco ou específico de folha).

[00126] Qualquer um dos vários meios bem conhecidos na técnica pode ser usado para conduzir a expressão SAMP em plantas. Qual- quer órgão pode ser alvejado, tal como órgãos/estruturas vegetativas (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e ór- gãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, esta-

mes, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, en- dosperma e revestimento de sementes) e frutas. Alternativamente, o polinucleotídeo que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui pode ser expresso especificamente em certos tipos de células e/ou tecidos dentro de um ou mais órgãos (por exemplo, célu- las de guarda nas folhas usando um promotor específico da célula de guarda). Alternativamente, o polinucleotídeo que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui pode ser expresso cons- titutivamente (por exemplo, usando o promotor CaMV 358).

[00127] Para usar um polinucleotídeo que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui nas técnicas acima, vetores de DNA recombinantes adequados para a transformação de células de planta são preparados. Técnicas para transformar uma grande varie- dade de espécies de planta superiores são bem conhecidas e descri- tas na literatura técnica e científica. Ver, por exemplo, Weising e outro Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Uma sequência de DNA que co- difica para o SAMP será preferencialmente combinada com as se- quências reguladoras da iniciação trancricional e translacional que di- recionarão a transcrição da sequência do gene nos tecidos pretendi- dos da planta transformada.

[00128] Por exemplo, um fragmento de promotor de planta pode ser empregado para direcionar a expressão do SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) em todos os tecidos de uma planta transgênica. Tais promotores são aqui referidos como promotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria das condições e estados ambientais de desenvol- vimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constituti- vos incluem a região de iniciação da transcrição do vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 358, o promotor 1' ou 2' derivado do T-DNA de Agrobacterium tumafaciens e outras regiões de iniciação da transcri- ção de vários genes de plantas conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00129] —Alternativamente, o promotor da planta pode direcionar a expressão do SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) em um tecido es- pecífico (promotores específicos do tecido) ou pode de outra maneira estar sob controle ambiental mais preciso (promotores indutíveis). Exemplos de promotores específicos de tecido sob controle do desen- volvimento incluem promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos, tais como floema, tubérculos, caules, troncos, folhas ou células de guarda. Exemplos de condições ambientais que podem afe- tar a transcrição por promotores induzíveis incluem, porém não são limitados a condições anaeróbicas, temperatura elevada e presença de luz.

[00130] Em algumas modalidades, uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação do SAMP pode ser incluída. À região de poliadenilação pode ser derivada de um gene SAMP de ocorrência natural, de uma variedade de outros genes de plantas ou de T-DNA.

[00131] O vetor compreendendo as sequências polinucleotídicas (por exemplo, promotores ou regiões codificadoras de SAMP) pode incluir um gene marcador que confere um fenótipo selecionável nas células de planta. Por exemplo, o marcador pode codificar resistência a biocidas, particularmente resistência a antibióticos, tal como resis- tência à canamicina, G418, bleomicina, higromicina ou resistência a herbicidas, tais como resistência ao clorosluforão ou Basta.

[00132] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) é expresso de forma recombi- nante nas células de planta. Uma variedade de construções de ex- pressão diferentes, tais como cassetes de expressão e vetores ade- quados para a transformação de células de planta pode ser preparada. Técnicas para transformar uma grande variedade de espécies de plan-

ta superiores são bem conhecidas e descritas na literatura técnica e científica. Veja, por exemplo, Weising e outro Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Uma sequência de DNA que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrita aqui pode ser combinada com as sequências reguladoras transcricionais de cis-ação (promotor) e trans- ação (intensificador) para direcionar o tempo, o tipo de tecido e os ní- veis de transcrição nos tecidos pretendidos da planta transformada. Elementos de controle translacional podem da mesma forma ser usa- dos.

[00133] “Modalidades da presente descrição da mesma forma forne- cem um polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptí- deo HS) para ser operacionalmente ligado a um promotor que, em al- gumas modalidades, é capaz de conduzir a transcrição da sequência de codificação SAMP em plantas. O promotor pode ser, por exemplo, derivado de fontes vegetais ou virais. O promotor pode ser, por exem- plo, constitutivamente ativo, induzível ou específico de tecido. Na construção de cassetes de expressão recombinantes, vetores, trans- gênicos, da descrição, um promotor diferente pode ser escolhido e empregado para direcionar diferencialmente a expressão gênica, por exemplo, em alguns ou todos os tecidos de uma planta ou animal. Promotores constitutivos

[00134] Um fragmento pode ser empregado para direcionar a ex- pressão de um polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) em todas as células ou tecidos transformados, por exemplo, como aqueles de uma planta transgênica. O termo "elemento regulador constitutivo" significa um elemento regulador que confere um nível de expressão a uma molécula nucleica operacionalmente ligada que é relativamente independente do tipo de célula ou tecido em que o elemento regulador constitutivo é expresso. Um elemento regulador constitutivo que é expresso em uma planta geralmente é amplamente expresso em um grande número de tipos de células e tecidos. Os promotores que dirigem a expressão continuamente sob condições fisiológicas são referidos como promotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular.

[00135] Uma variedade de elementos reguladores constitutivos úteis para a expressão ectópica em uma planta transgênica são bem conhecidos na técnica. O promotor do vírus do mosaico de couve-flor 35S (CaMV 358), por exemplo, é um elemento regulador constitutivo bem caracterizado que produz um alto nível de expressão em todos os tecidos vegetais (Odell e outro, Nature 313: 810-812 (1985)). O promo- tor CaMV 358 pode ser particularmente útil devido à sua atividade em diversas espécies de planta (Benfey e Chua, Science 250: 959-966 (1990); Futterer e outro, Physiol. Plant 79 154 (1990); Odell e outro, Supra, 1985). Um promotor 358 tandem, em que o elemento promotor intrínseco foi duplicado, confere níveis de expressão mais altos em comparação com o promotor 358 não modificado (Kay e outro, Scien- ce 236: 1299 (1987)). Outros elementos reguladores constitutivos úteis incluem, por exemplo, o promotor do vírus do mosaico de couve-flor 198; o promotor do vírus do mosaico Figwort; e o promotor do gene da nopalina sintetase (nos) (Singer e outro, Plant Mol. Biol. 14: 433 (1990); An, Plant Physiol. 81:86 (1986)).

[00136] Elementos reguladores constitutivos adicionais, incluindo aqueles para expressão eficiente em monocotiledôneas, são da mes- ma forma conhecidos na técnica, por exemplo, o promotor pEmu e os promotores baseados na região de arroz da actina-1 5' (Last e outro, Theor. Appl. Genet 81: 581 (1991); Mcelroy e outro, Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991); Mcelroy e outro, Plant Cell 2: 163 (1990)). Os ele- mentos reguladores quiméricos, que combinam elementos de genes diferentes, podem da mesma forma ser úteis para expressar ectopi-

camente uma molécula de ácido nucleico que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) descrito aqui (Comai e outro, Plant Mol. Biol. 15: 373 (1990)).

[00137] Outros exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor 1'- ou 2'- derivado do T-DNA de Agrobacterium tumafaciens (veja, por exemplo, Mengiste (1997) supra; O'Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29: 99 108); promotores de actina, tais como o promotor do gene de Arabidopsis actina (veja, por exemplo, Huang (1997) Plant Mol. Bi- ol. 1997 33: 125 139); promotores do gene de álcool desidrogenase (Adh) (veja, por exemplo, Millar (1996) Plant Mol. Biol. 31: 897 904); ACT11 de Arabidopsis (Huang e outro Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong e outro, Mol. Gen. Genet. 251: 196-203 (1996 )), o gene que codifica a proteína desaturase de veículo de estearoil-acila de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe e outro Plant Physiol. 104: 1167-1176 (1994)), GPc1 do milho (GenBank No. X:5596, Martinez e outro J. Mol. Biol 208: 551-565 (1989)), Gpc2 de milho (GenBank No. U45855, Man- junath e outro, Plant Mol. Biol. 33: 97-112 (1997)), outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes de planta conhecidos dos es- pecialistas. Veja da mesma forma Holtorf Plant Mol. Biol. 29: 637 646 (1995). Promotores induzíveis

[00138] Alternativamente, um promotor de planta pode direcionar a expressão do polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) sob a influência de mudanças nas condições ambientais ou condições de desenvolvimento. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, seca ou presença de luz. Tais promotores são aqui referidos como promotores "induzíveis". Em algumas modalidades, um promotor induzível é aquele que é indu-

zido por um ou mais estressores ambientais, incluindo, porém, não |i- mitado a seca, frio congelante e sal elevado. Por exemplo, a descrição pode incorporar um promotor específico da seca, tal como um promo- tor do milho induzido pela seca (por exemplo, o promotor induzido pela seca do milho rab17 (Vilardell e outro (1991) Plant Mol. Biol. 17: 985- 993; Vilardell e outro (1994) Plant Mol. Biol. 24: 561-569)); ou, alterna- tivamente, um promotor indutível a frio, seca e com sal elevado de ba- tata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897 909) ou de Arabidopsis (por exemplo, o promotor rd29A (Kasuga e outro (1999) Nature Biotechno- logy 17: 287-291) Outros promotores induzíveis ao estresse ambiental incluem promotores dos seguintes genes: Rab21, Wsi18, Lea3, Uge1, Dip1 e RIG1B no arroz (Yi e outro (2010) Planta 232: 743-754).

[00139] Em algumas modalidades, um promotor de planta é um promotor indutível ao estresse (por exemplo, um promotor indutível à seca, ao frio ou ao sal) que compreende um elemento responsivo à desidratação (DRE) e/ou um elemento responsivo à ABA (ABRE), in- cluindo, entre outros, o promotor rd29A.

[00140] —Alternativamente, promotores de plantas que são induzíveis após exposição a hormônios vegetais, tal como auxinas, são usados para expressar o polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS). Por exemplo, a descrição pode usar o fragmento de promotor E1 dos elementos de resposta de auxina (AuxREs) na soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397 407); o promotor Arabidopsis GST6 responsivo à auxina (da mesma forma responsivo ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955 966); o promotor parC indutível por auxina do tabaco (Sakai (1996) 37: 906 913); um elemento de resposta à biotina da planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933 937); e, o promotor responsivo ao ácido abscísico do hormônio do estresse (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

[00141] Os promotores de plantas indutíveis após exposição a rea- gentes químicos que podem ser aplicados à planta, tais como como herbicidas ou antibióticos, são da mesma forma úteis para expressar o polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS). Por exemplo, o promotor In22 do milho, ativado por promotores de herbicidas de benzenossulfonamida, pode ser usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568 577); aplicação de diferentes prote- tores de herbicidas diferentes induz padrões de expressão genética distintos, incluindo expressão na raiz, hidátodos e no meristema apical superior. Uma sequência de codificação SAMP (por exemplo, um pep- tídeo HS) pode da mesma forma estar sob o controle de, por exemplo, um promotor indutível à tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas que contêm o gene da arginina des- carboxilase Avena sativa L. (aveia) (Masgrau (1997 ) Plant J. 11: 465 473); ou, um elemento responsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315 1324; Uknes e outro, Plant Cell 5: 159-169 (1993); Bi e outro, Plant J. 8: 235-245 ( 1995)).

[00142] Exemplos de elementos reguladores indutíveis úteis inclu- em elementos reguladores indutíveis ao cobre (Mett e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4567-4571 (1993); Furst e outro, Cell 55: 705- 717 (1988)); elementos reguladores indutíveis à tetraciclina e à cloro- tetraciclina (Gatz e outro, Plant J. 2: 397-404 (1992); Róder e outro, Mol. Gen. Genet. 243: 32-38 (1994); Gatz, Meth Cell Biol. 50: 411-424 (1995)); elementos reguladores indutíveis por ecdisona (Christopher- son e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6314-6318 (1992); Kreu- tzweiser e outro, Ecotoxicol. Environ. Safety 28: 14-24 (1994)); ele- mentos reguladores indutíveis ao choque térmico (Takahashi e outro, Plant Physiol. 99: 383-390 (1992); Yabe e outro, Plant Cell Physiol. 35: 1207-1219 (1994); Ueda e outro, Mol. Gen. Genet. 250: 533-539 (1996)); e elementos operon /ac, que são usados em combinação com um repressor de /ac constitutivamente expresso para conferir, por exemplo, expressão induzível por IPTG (Wilde e outro, EMBO J. 11: 1251-1259 (1992)). Um elemento regulador indutível útil nas plantas transgênicas da descrição pode da mesma forma ser, por exemplo, um promotor induzível por nitrato derivado do gene nitrito-redutase do es- pinafre (Back e outro, Plant Mol. Biol. 17: 9 (1991)) ou um promotor induzível à luz, tal como aquele associado à pequena subunidade da RuBP carboxilase ou às famílias de genes LHCP (Feinbaum e outro, Mol. Gen. Genet. 226: 449 (1991); Lam e Chua, Science 248: 471 (1990)). Promotores específicos de tecidos

[00143] —Alternativamente, o promotor da planta pode direcionar a expressão do polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) em um tecido específico (promotores específicos do te- cido). Os promotores específicos de tecido são elementos de controle transcricionais que são ativos apenas em células ou tecidos especiífi- cos em momentos específicos durante o desenvolvimento da planta, como em tecidos vegetativos ou reprodutivos.

[00144] Exemplos de promotores específicos de tecidos sob contro- le de desenvolvimento incluem promotores que iniciam apenas a transcrição (ou principalmente apenas) em certos tecidos, tais como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes ou folhas ou tecidos reprodu- tivos, tais como frutas, óvulos, sementes, pólen, pístolas, flores ou qualquer tecido embrionário, epiderme ou mesofilo. Os promotores es- pecíficos do tecido reprodutivo podem ser, por exemplo, específicos ao óvulo, específicos ao embrião, específicos ao endosperma, específicos ao tegumento, específicos à semente e ao revestimento da semente, específicos ao pólen, específicos à pétala, específicos à sépala ou al- guma combinação destes. Em algumas modalidades, o promotor é es- pecífico do tipo de célula, por exemplo, específico da célula de guarda.

[00145] Os promotores epidérmicos específicos incluem, por exem- plo, o promotor Arabidopsis LTP1 (Thoma e outro (1994) Plant Physiol. 105 (1): 35-45), o promotor CER1 (Aarts e outro (1995) Plant Cell 7: 2115-27), o promotor CERG6 (Hooker e outro (2002) Plant Physiol 129: 1568-80) e o tomate ortólogo LeCER6 (Vogg e outro (2004) J. Exp Bot. 55: 1401- 10)

[00146] Os promotores específicos de células de guarda incluem, por exemplo, o promotor de DGP1 (Li e outro (2005) Science China C Life Sci. 48: 181-186).

[00147] Outros promotores específicos de tecido incluem promoto- res de sementes. Os promotores específicos de sementes adequados são derivados dos seguintes genes: MAC1 do milho (Sheridan (1996) Genetics 142: 1009-1020); Cat3 de milho (GenBank No. LO5934, Abler (1993) Plant Mol. Biol. 22: 10131-1038); vivparous-1 de Arabidopsis (Genbank No. U93215); atmyc1 de Arabidopsis (Urao (1996) Plant Mol. Biol. 32: 571-57; Conceicao (1994) Plant 5: 493-505); napA de Brassica napus (GenBank No. J02798, Josefsson (1987) JBL 26: 12196-1301); e a família do gene napin de Brassica napus (Sjodahl| (1995) Planta 197: 264-271).

[00148] Uma variedade de promotores especificamente ativos em tecidos vegetativos, tais como folhas, caules, raízes e tubérculos, pode da mesma forma ser usada para expressar SAMPs que codificam poli- nucleotídeos (por exemplo, peptídeos HS) descritos aqui. Por exem- plo, os promotores que controlam a patatina, a principal proteína de armazenamento do tubérculo de batata, podem ser utilizados, veja, por exemplo, Kim (1994) Plant Mol. Biol. 26: 603 615; Martin (1997) Plant J. 11:53 62. O promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que exi- be alta atividade nas raízes pode da mesma forma ser usado (Hansen (1997) Mol. Gen. Genet. 254: 337 343. Outros promotores específicos de tecido vegetativo úteis incluem: o promotor tarin do gene que codifi-

ca uma globulina de uma família de proteínas do milho taro principal (Colocasia esculenta L. Schott), tarin (Bezerra (1995) Plant Mol. Biol. 28: 137 144); o promotor da curculina ativo durante o desenvolvimento de milho taro (de Castro (1992) P Cell 4: 1549 1559) e o promotor para o gene específico da raiz do tabaco TobRB7, cuja expressão está lo- calizada no meristema da raiz e nas regiões imaturas do cilindro cen- tral (Yamamoto (1991) Plant Cell 3: 371 382).

[00149] Promotores específicos de folhas, tais como os promotores de ribulose-bifosfato carboxilase (RBCS), podem da mesma forma ser usados. Por exemplo, os genes RBCS1, RBCS2 e RBCS3A do tomate são expressos em folhas e sementes cultivadas a luz, apenas RBCS1 e RBCS2 são expressos no desenvolvimento de frutos de tomate (Meier (1997) FEBS Lett. 415: 91 95). Promotores de bifosfato carboxi- lase de ribulose expressos quase exclusivamente em células mesofilas em lâminas de folha e invólucros de folhas em altos níveis, descritos por Matsuoka (1994) Plant J. 6: 311 319, podem ser utilizados. Outro promotor específico da folha é o promotor do gene de ligação de prote- ína à clorofila a/b de colheita leve, veja, por exemplo, Shiina (1997) Plant Physiol. 115: 477 483; Casal (1998) Plant Physiol. 116: 1533

1538. O promotor do gene relacionado a Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5) descrito por Li (1996) FEBS Lett. 379: 117 121, é específico da folha. O promotor Atmyb5 é expresso no desenvolvimento de trico- mas de folhas, estípulas e células epidérmicas nas margens de folhas jovens de roseta e caulina e em sementes imaturas. O mRNA do Atmyb5 aparece entre a fertilização e o estágio de 16 células do de- senvolvimento embrionário e persiste além do estágio do coração. Um promotor de folhas identificado no milho pela Busk (1997) Plant J. 11: 1285 1295, pode da mesma forma ser utilizado.

[00150] Outra classe de promotores úteis específicos de tecido ve- getativo são os promotores meristemáticos (ponta da raiz e ápice su-

perior). Por exemplo, os promotores "SHOOTMERISTEMLESS" e "SCARECROW", que são ativos no desenvolvimento de meristemas apicais superiores ou raiz, descritos por Di Laurenzio (1996) Cell 86: 423-433; e Long (1996) Nature 379: 66-69; pode ser usado. Outro promotor útil é o que controla a expressão de genes 3-hidróxi-3- metilglutaril-coenzima A redutase HMG2, cuja expressão é restrita a tecidos meristemáticos e florais (zona secretora do estigma, grãos maduros de pólen, tecido vascular do ginecônio e óvulos fertilizados) (veja, por exemplo, Enjuto (1995) Plant Cell. 7: 517 527). Da mesma forma úteis são genes relacionados ao kn1 do milho e outras espécies que mostram expressão específica do meristema, veja, por exemplo, Granger (1996) Plant Mol. Biol. 31: 373 378; Kerstetter (1994) Plant Cell 6: 1877 1887; Hake (1995) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350: 45 51. Por exemplo, o promotor KNAT1 de Arabidopsis thali- ana (veja, por exemplo, Lincoln (1994) Plant Cell 6: 1859 1876).

[00151] Um especialista reconhecerá que um promotor específico de tecido pode direcionar a expressão de sequências operacionalmen- te ligadas em tecidos que não sejam o tecido alvo. Desse modo, quando aqui utilizado, um promotor específico de tecido é aquele que dirige a expressão preferencialmente no tecido alvo, porém pode da mesma forma levar a alguma expressão em outros tecidos.

[00152] Em outra modalidade, o polinucleotídeo que codifica o SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) é expresso através de um ele- mento transponivel. Isto permite a expressão constitutiva, porém pe- riódica e pouco frequente do polipeptídeo constitutivamente ativo. À descrição da mesma forma fornece o uso de promotores específicos de tecidos derivados de vírus, incluindo, por exemplo, o promotor sub- genômico de tobamovírus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679 1683; o vírus bacilliforme de arroz tungro (RTBV), que se re- plica apenas nas células do floema em plantas de arroz infectadas,

71U7T6 com seu promotor que promove forte expressão de gene repórter es- pecífico do floema; o promotor do vírus do mosaico da veia da mandi- oca (CVMV), com maior atividade nos elementos vasculares, nas célu- las do mesófilo das folhas e nas pontas das raízes (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139).

[00153] Em outramodalidade, a presente descrição fornece vetores de expressão compreendendo um cassete de expressão da descrição (por exemplo, como descrito aqui). VII. Plantas

[00154] Em algumas modalidades, a planta é uma planta cítrica. Em algumas modalidades, a planta cítrica é uma laranjeira, um limoeiro, uma tilia ou uma árvore de toranja. Em uma modalidade, a planta cítri- ca é uma laranjeira, laranja Valência, laranja doce, mandarina ou la- ranja azeda. Em uma modalidade, a planta cítrica é um limoeiro. Em uma modalidade, a planta cítrica é uma tilia. Em algumas modalida- des, a planta é um parente de uma planta cítrica, tal como jasmim la- ranja, limeberry e laranja trifoliada. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de batata.

[00155] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece plantas (ou uma célula de planta, semente, flor, folha, fruta ou outra parte da planta dessas plantas ou alimento processado ou ingrediente alimentar de tais plantas) compreendendo um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um polinu- cleotídeo que codifica um SAMP (por exemplo, um peptídeo HS) da descrição (por exemplo, como descrito aqui). Em algumas modalida- des, a planta diminuiu a expressão ou atividade de UBC e/ou aumen- tou a expressão ou atividade de transportadores de Pi.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Expressão de genes SAMP antimicrobianos

[00156] Os níveisde expressão de SAMPs em plantas suscetíveis a

HLB e tolerantes a HLB foram detectados por RT-PCR quantitativa. O nível de expressão da actina cítrica foi utilizado como controle interno. O nível de expressão dos SAMPs é mais alto em duas variedades dife- rentes tolerantes/resistentes ao HLB, de origens geográficas e genéti- cas totalmente diferentes (um híbrido de Cleopatra mandarin (Citrus reticulata) e Poncirus trifoliado US942 e um híbrido Eremocitrus glau- ca) do que em seus correspondentes parentes próximos sensíveis a HLB (FIGS. 1A e 1B).

Exemplo 2 - Efeitos dos SAMPs na supressão da infecção por Candidatus Liberibacter solanacearum (Ca. L. solanacearum)

[00157] A planta de Solanaceae Nicotiana benthamiana (Nb) é co- mumente usada para estudos da função genética contra infecções por patógenos. Nb pode ser infectado por Ca. L. solanacearum por ser in- festado com. Psilídeo de batata positivo para Ca L. solanacearum, que é um patossistema altamente semelhante à doença de batata ZC e HLB cítrico. Os efeitos de duas SAMPs, CgãhSAMPa e CghSAMPb (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente, que são híbridos do cruzamento de Citrus glauca com Citrus sp.), foram testados usando o Patossiste- ma de Nb/psilídeo de batata/Ca. L. solanacearum. Os peptídeos CghSAMPa e CghSAMPb foram expressos e purificados em plantas Nb infectadas por E. coli. Ca. L. solanacearum foram tratadas com peptídeo CghSAMPa ou CghSAMPb 30 UM, ou solução simulada por injeção no caule. As fotos na FIG. 3A foram tiradas após 3 semanas de tratamento. FIG. 3A mostra que as plantas infectadas tratadas com os SAMPs foram capazes de crescer muito melhor do que as plantas que receberam tratamento simulado. Figs. 3B e 7 mostram ainda que as plantas tratadas com peptídeos CghSAMPa e CghSAMPb tiveram um título bacteriano muito menor em comparação com as plantas tra- tadas com solução simulada. Os resultados demonstraram que os dois SAMPs de porta-enxertos cítricos resistentes/tolerantes significativa-

mente controlaram o título de Ca. L. solanacearum em plantas Nb e promoveu o crescimento das plantas. Exemplo 3 - Efeitos de SAMPs liberados por meio de liberação de tronco

[00158] Testou-se o tratamento SAMP eficaz em plantas cítricas positivas para HLB, usando o método de liberação de tronco, e o título bacteriano de todas as árvores tratadas é bastante reduzido, cerca de a 100 vezes. Nenhuma bactéria foi detectada nas árvores tratadas. Todas as novas raízes e folhas das árvores tratadas não eram mais sintomáticos, e as novas raízes e folhas das plantas tratadas com si- mulação ainda apresentam sintomas de manchas amarelas (Figura 4) Exemplo 4 - Efeitos de SAMPs na supressão da infecção por Can- didatus Liberibacter solanacearum (Ca. L. solanacearum) em ba- tata e tomate

[00159] Da mesma forma realizou-se o tratamento SAMP eficaz em batatas infectadas com C.Lso. O sintoma da doença foi claramente inibido e o rendimento da produção de tubérculos aumentou. (Figura 5)

[00160] Da mesma forma testou-se o SAMP eficaz em tomates in- fectados com C.Lso, e o sintoma da doença foi da mesma forma am- plamente reduzido. (Figura 6) Exemplo 5 - Efeitos de SAMPs em plantas cítricas

[00161] O SAMP foi aplicado por foliar pulverizado com 5% de óleo de semente metilado Ag do Sul (MSO) nas sementes de 1 ano de ida- de. O nível de expressão dos genes marcadores de resposta de defe- sa CsSPR1, CsSPR2 e CAPAL foi avaliado por qRT-PCR com o gene ubiquitina como um controle interno por até 7 dias após o tratamento. As figs. 8A-B8C mostram que os SAMP's iniciaram as plantas cítricas aumentar a expressão dos genes marcadores da resposta de defesa.

[00162] Além disso, diferentes concentrações de soluções SAMP foram infiltradas em folhas de laranja doce. Não foi observada morte celular com tratamento com 30 UM. As figs. 9A e 9B mostram que os SAMP's têm baixa atividade fitotóxica nas folhas cítricas.

[00163] Além disso, a análise da expressão do mMRNA (FIG. 10) demonstra que os SAMPs são altamente expressos nos frutos de ca- viar cítrico australiano, limão do deserto australiano, limão e Poncirus trifoliado (matéria prima de raiz comum), que já foram consumidos por centenas de anos. A expressão do mRNA foi detectada por RT-PCR. Exemplo 6 - Digestão de proteases de SAMPs

[00164] AFIG.11 mostra que os SAMPs são sensíveis à protease humana pepsina, uma importante enzima gástrica. 20 ug de SAMP foram incubados com solução de pepsina a 0,4% em HCl 10 mM a 37 ºC. A reação foi analisada com gel de SDS PAGE a 18% e visualizada com coloração com azul de coomassie. O SAMP foi completamente digerido em 45 minutos. Exemplo 7 - Estabilidade dos SAMPs

[00165] — Os SAMP'ss foram incubados em temperatura ambiente (RT) por 24 horas, 60 ºC por 24 horas ou 100 “C por 20 minutos. Posterior- mente, os SAMPs foram utilizados para o ensaio de viabilida- defcitotoxicidade. O ensaio foi realizado incubando-se 107 células/mL de Liberbacter crescens com o SAMP pré-tratado ou tampão apenas como tratamento simulado por 2 horas. As amostras foram em seguida manchadas com DMAO (verde) e EthD-lll (laranja), que representam células vivas e mortas, respectivamente. FIG. 12 mostra que os SAMPs são estáveis até 100 º C.

[00166] Além disso, para investigar a estabilidade de SAMPs em plantas cítricas, 20 ug de SAMPs foram incubados com 200 ug de li- sado cítrico fresco em 1x tampão de PBS em temperatura ambiente. À reação foi analisada com 18% de Gel SDS-PAGE e visualizada com coloração azul de coomassie. FIG. 13 mostra que os SAMPs são está- veis no lisado de células cítricas, o que indica que eles são da mesma forma estáveis nas árvores. Exemplo 8 - Atividade antimicrobiana adicional de SAMPs

[00167] A atividade antimicrobiana de SAMPs contra outros pató- genos bacterianos Gram-negativos foi testada. Especificamente, a ati- vidade contra Pseudomonas syringae e Agrobacterium tumefaciens foi verificada pelo ensaio de difusão em ágar, FIG. 14A e FIG. 14B, res- pectivamente. Cada ensaio foi realizado aplicando 10 ul de SAMPs no meio com bactérias, onde a concentração para SAMP's foi de 100 uM para Pseudomonas syringae e 150 uM para Agrobacterium tumefaci- ens, respectivamente. As placas de cultura foram incubadas a 28 ºC e observadas após 24 horas. Os anéis sem crescimento bacteriano con- firmam a atividade antimicrobiana.

[00168] Além disso, os SAMPs foram incubados a 4 ºC por 24 ho- ras, RT por 24 horas ou a 60 ºC por 24 horas. Posteriormente, os SAMP's foram utilizados para o ensaio de viabilidade/citotoxicidade. O ensaio foi realizado incubando 107 células / mL de Agrobacterium tu- mefaciens com o SAMP pré-tratado ou tampão apenas como trata- mento simulado por 2 horas. As amostras foram em seguida mancha- das com DMAO (verde) e EthD-lll (laranja), que representam células vivas e mortas, respectivamente. FIG. 15 mostra que os SAMPs são estáveis e têm atividade antimicrobiana contra Agrobacterium tumefa- ciens até 60 ºC.

[00169] Uma ou mais características de qualquer modalidade aqui descrita ou nas figuras podem ser combinadas com uma ou mais ca- racterísticas de qualquer outra modalidade aqui descrita nas figuras sem se afastar do escopo da descrição.

[00170] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente cita- dos nesta especificação estão aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado estar incorporado por referência. Embora a descrição anterior tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será facilmente aparente para os versados na técnica, à luz dos ensina- mentos desta descrição, que certas mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações anexas.

Claims (61)

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo antimicrobiano estável isolado (SAMP), carac- terizado pelo fato de que compreende uma sequência que é substan- cialmente idêntica a uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37.

2. SAMP isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência que possui pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequên- cia de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 e 35-37.

3. SAMP isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência com pelo menos 75% de identidade de sequência com uma sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 e 2.

4. Peptídeo antimicrobiano estável isolado (SAMP) caracte- rizado pelo fato de que compreende uma sequência de X1IGX2X3VSKaENXsX6QGFX7HX8gFEXsTFX1o0SX11 EGX12AEY X13X1aHPX 158HVEX1sANX17X18LX19X20L EKX21LXK22X23DYKPX2aTX25RV (SEQ ID NO:27), em que X: é R, K, ou W; Xcé Kou E; Xgé Nou D; Xa é Toul; Xs é L, F, ou R; Xç é Hou Q; Xr é PouT; Xs é |, L, ou V; XKçé Sou F; Xn É E ou D; X11 é T ou L; X12 é V ou |; XK13 é V ou |; Xu é S, A, ou D; X1s É S, A, ou V; X16 é Y ou F; X17 é Lou T; Xi8 É F, M, ou L; X1s é A, P, ou T; X2o É N ou Q; X2a é Vou F; X22 É V ou 1; Xo3 é V ou 1 XxéT, E, ou Q; eXséV, E, L.

5. SAMP isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizado pelo fato de que X1 É R X20 é K Xg é NL Ma é | Xs é L; Kg é H; X1w é E; K11 É T; Xi2 é V; Ki3 é V; XKis É Y; XKi7 É L; XKig É F; Xi É A; X2o é N; Xo1 É V, Xi é V, Xiz É | E Xm É T.

6. SAMP isolado, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o SAMP isolado é um peptídeo estável ao calor (HS).

7. SAMP isolado, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o SAMP isolado é está- vel em extratos de planta e/ou em lisados de planta.

8. Composição agrícola, caracterizada pelo fato de que compreende um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Composição agrícola, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um den- tre um herbicida, um protetor de herbicida, um tensoativo, um fungici- da, um pesticida, um nematicida, um ativador de plantas, um sinergis- ta, um regulador de crescimento de plantas, um repelente de insetos, um acaricida, um moluscicida ou um fertilizante.

10. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

11. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 10.

12. Célula, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de planta.

13. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 10.

14. Planta, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta cítrica.

15. Planta, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta solanácea.

16. Planta transgênica compreendendo um peptídeo anti- microbiano estável mutado in situ (SAMP), caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos cor-

respondente a um aminoácido em qualquer uma das posições X; a X25, como mencionado em SEQ ID NO: 27, em que o SAMP mutado fornece resistência a doenças ou tolerância a doenças à planta trans- gênica.

17. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a doença é uma doença de Liberibac- ter.

18. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a doença é uma doença de Agrobacte- rium ou Pseudomonas syringae.

19. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a doença de Liberibacter é Huanglong- bing (HLB).

20. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que o SAMP é um peptídeo estável ao calor (HS).

21. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotí- deo que codifica um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a introdução do cassete de expres- são em uma planta resulta na planta com resistência à doença ou tole- rância à doenças aprimorada.

22. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença de Liberi- bacter.

23. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença de Agrobacterium ou Pseudomonas syringae.

24. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença de Liberibacter é HLB.

25. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o promotor é heterólogo ao polinu- cleotídeo.

26. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21 ou 25, caracterizado pelo fato de que o promotor é indutível.

27. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 21 ou 25, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico de tecido.

28. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de tecido é um promotor específico de floema.

29. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do floema é o promotor da proteína transportadora de sacarose SUC?2.

30. Planta transgênica compreendendo o cassete de ex- pressão como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizado pelo fato de que a planta possui resistência à doença ou tolerância a doenças aprimorada em comparação com uma planta de controle sem o cassete de expressão.

31. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a doença é uma doença de Liberibac- ter.

32. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a doença é uma doença de Agrobacte- rium ou Pseudomonas syringae.

33. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a doença de Liberibacter é HLB.

34. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16 ou 30, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta cítrica.

35. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 16 ou 30, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta solanácea.

36. Método para prevenir ou tratar uma doença em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da planta com um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 7 ou uma composição agrícola como definida na reivindi- cação 8 ou 9.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que a doença é uma doença de Liberibacter.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que a doença é uma doença de Agrobacterium ou Pseudomonas syringae.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que a doença de Liberibacter é HLB.

40. Método para prevenir ou tratar uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas, caracterizado pelo fato de que com- preende o contato da planta com um SAMP isolado,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma composição agrícola como definida na reivindicação 8 ou 9.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que o gênero Liberibacter é Candidatus Liberibacter.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteriza- do pelo fato de que as bactérias do gênero Liberibacter são Liberibac- ter crescens.

43. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o SAMP isolado ou composição agrícola é injetado no tronco da planta.

44. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o SAMP isolado ou composição agrícola é injetado no caule da planta.

45. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que o SAMP isolado ou a composição agrícola é pulve- rizada foliarmente na planta ou aplicada à planta por irrigação por go- tejamento nas raízes ou aplicada à planta por ablação a laser.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 45, caracterizado pelo fato de que a infecção bacteriana causa a doença da microplaqueta da batata zebra.

47. Método para prevenir ou tratar uma doença de Liberi- bacter, Agrobacterium ou Pseudomonas em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de um cassete de expres- são como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 29 na planta.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença de Liberibacter é HLB.

49. Método para prevenir ou tratar uma infecção bacteriana em uma planta causada por bactérias do gênero Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas, caracterizado pelo fato de que com- preende a introdução de um cassete de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 29 na planta.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que o gênero Liberibacter é Candidatus Liberibacter.

51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que as bactérias do gênero Liberibacter são Liberibac- ter crescens.

52. Método para produzir uma planta com maior resistência à doença de Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas ou tolerân- cia à doença de Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas, carac- terizado pelo fato de que compreende: introduzir um SAMP isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou um cassete de expressão, como defi-

nido em qualquer uma das reivindicações 21 a 29 em uma pluralidade de plantas; e selecionar uma planta que compreende o SAMP isolado ou expressa o polinucleotídeo da pluralidade de plantas.

53. Método de produção de uma planta com maior resistên- cia à doença de Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas ou tole- rância à doença de Liberibacter, Agrobacterium ou Pseudomonas, ca- racterizado pelo fato de que compreende a introdução de uma muta- ção em um polinucleotídeo na planta, em que o polinucleotídeo muta- do codifica um SAMP isolado como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que a introdução ocorre in situ no genoma de uma cé- lula de planta.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, carac- terizado pelo fato de que a introdução compreende repetições palin- drômicas curtas regularmente espaçadas em cluster (CRISPR) / edi- ção do genoma de Cas.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 55, caracterizado pelo fato de que a planta é resistente ou tolerante a uma infecção bacteriana causada por bactérias do gênero Liberibacter.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que o gênero Liberibacter é Candidatus Liberibacter.

58. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do pelo fato de que as bactérias do gênero Liberibacter são Liberibac- ter crescens.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 58, caracterizado pelo fato de que a doença de Liberibacter é HLB.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 55, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta cí- trica.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 55, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta so- lanácea.