EA031900B1 - Ингибитор репликации геминивируса - Google Patents

Abstract

Ингибитор репликации вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, где указанный ингибитор включает белок "цинковый палец", который может специфически связываться с полноразмерной ДНК области "стебель-петля" указанного вируса или с одним или более фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, и может ингибировать образование структуры "стебель-петля".

Description

Настоящее изобретение относится к эффективным средствам борьбы с инфекциями, вызываемыми растительными вирусами. Более конкретно, настоящее изобретение относится к ингибитору репликации растительных вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, таких как растительные вирусы; к растениям, обладающим резистентностью к инфекциям, вызываемыми растительными вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus и т.п.

Предшествующий уровень техники

Цинковый палец представляет собой один из ДНК-связывающих мотивов, таких как мотив спираль-складка-спираль и мотив лейциновая молния. Он имеет два цистеиновых остатка в аминоконцевой области и два гистидиновых остатка в карбоксиконцевой области и принимает трехмерную структуру, в которой цинк (Zn) координирует эти остатки. Поскольку цинковый палец обладает очень высокой ДНК-связывающей способностью, то было предложено создать искусственные ДНКсвязывающие белки, которые использовали бы указанный мотив для сильного связывания с ДНК (далее, в настоящем описании этот мотив также обозначается AZP), а также сообщалось, что был сконструирован AZP, который может распознавать специфическую нуклеотидную последовательность, с использованием невырожденного кода распознавания, представленного в таблице (имеющейся в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии (KOHYO); № 2004-519211 Biochemistry, 41, р. 7074-7081, 2002).

Один мотив цинковый палец может распознавать 3 или 4 п.н. и связываться с этими парами оснований, а благодаря связыванию цинковых пальцев с пептидным линкером можно регулировать длину нуклеотидной последовательности, необходимой для специфического связывания с цинковыми пальцами. Четвертой распознающей нуклеотидной последовательностью мотива цинковый палец является антисмысловая цепь, которая перекрывается с первой распознающей нуклеотидной последовательностью нижеследующего мотива цинковый палец, а поэтому N мотивов цинковый палец распознают нуклеотидную последовательность из 3N+1 п.н. и связываются с ней (см. фиг. 1).

Сообщалось, что инфицирование растительными ДНК-вирусами может быть предотвращено с использованием AZP (J. Virology, 79, р. 2614-2619, 2005). В этой публикации сообщалось, что действие AZP направлено на ингибирование инфекции у Arabidopsis thaliana, вызываемой растительным ДНКвирусом, а именно вирусом, вызывающим сильную курчавость листьев свеклы (BSCTV). В этом методе механизмом ингибирующего действия AZP является ингибирование связывания реплицирующегося белка (Rep) с Rep-связывающим сайтом (прямые повторы) на ориджине репликации, где указанное связывание необходимо для инициации репликации вируса, и этот метод включает конструирование AZP, ингибирующего репликацию вируса так, чтобы этот AZP обладал ДНК-связывающей способностью, превышающей связывающую способность Rep на основе прямых повторов ориджина репликации. Однако, поскольку ориджин репликации имеет вирус-специфическую нуклеотидную последовательность, такой метод, включающий блокирование прямых повторов Rep посредством AZP, имеет определенные недостатки, заключающиеся в том, что против каждого из различных растительных вирусов необходимо использовать различные AZP. Исходя из этого, желательно разработать средство для борьбы с инфекциями, вызываемыми различными растительными вирусами, под действием одного AZP.

Карликовость, пятнистость листьев, хлороз и гетероспороз пшеницы были обнаружены в Ханьчжуне, провинции Шэнси Китайский Народной Республики, и вирус карликовости пшеницы (WDV, этот вирус может далее сокращенно обозначаться WDV) был идентифицирован как вирус-возбудитель этого заболевания (Zhiwu Baohu (ISSN: 0529-1542), Vol. 34, No. 2, p. 17-21, 2008). Было также обнаружено, что геномные структуры WDV нескольких видов, выделенных в Ханьчжуне, являются одинаковыми и принадлежат к роду Mastrevirus семейства Geminiviridae. Что касается WDV, то его описание можно также найти в публикации Plant Pathology, 57, p. 838-841, 2008; Plant Pathology, 58, p. 1161-1169, 2009, а также в публикации Virus Genes, 34, p. 359-366, 2007 и т.п.

Геминивирус представляет собой родовое название вирусов, имеющих одну или две одноцепочечные циклические ДНК, которые инфицируют растения, и такими геминивирусами являются различные растительные вирусы, которые подразделяют приблизительно на четыре вида, принадлежащих к роду Begomovirus, Topocuvirus, Curtovirus и Mastrevirus. Примерами вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus, являются, например, вирус желтой курчавости листьев томатов (TYLCV), вирус желтой мозаики картофеля (PYMV), вирус золотистой мозаики фасоли (BGMV) и т.п. Примерами вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, являются, помимо WDV, упомянутых выше, вирус полосатости кукурузы (MSV), вирус полосатости мискантуса (MiSV), вирус желтой карликовости табака (TYDV), вирус мозаично-полосатого хлороза (CSMV) и т.п. Примерами вирусов, принадлежащих к роду Topocuvirus, являются вирус псевдокурчавости верхушки томатов (TPCTV), а примерами вирусов, принадлежащих к роду Curtovirus, является вирус ложной курчавости верхушки сахарной свеклы (BMCTV) (см. фиг. 3).

При проникновении геминивируса в растение он сначала преобразуется в двухцепочечную циклическую ДНК посредством эндогенного фактора растения. Затем белок репликации (Rep), происходящий от вируса, связывается с Rep-связывающим сайтом, расположенным выше структуры стебель-петля межгенной области (IR). Rep представляет собой мультифункциональный белок, который связывается с

- 1 031900

Rep-связывающим сайтом, вводит ник в 9-нуклеотидную последовательность петлевой части структуры стебель-петля и ковалентно связывается с 5'-концом ДНК, введенной вместе с ником. Затем от З'-конца начинается синтез ДНК на одной из цепей, служащей в качестве матрицы, и при синтезе одной копии генома ник вводится в только что образованную 9-нуклеотидную последовательность посредством Rep. Одновременно вырезанную ДНК, соответствующую одной копии генома, лигируют посредством Rep, в результате чего одноцепочечная циклическая ДНК реплицируется, a Rep ковалентно связывается с только что образованным 5'-концом. Репликация геминивируса достигалась при повторении такого процесса, а все материалы, необходимые для репликации, кроме Rep, было получены из растения (см. фиг. 2, а также публикацию Kagaku to Seibutsu (Bioscience & Biotechnology), 41, p. 311-317, 2003 и т.п.).

Известно, что Rep расщепляет только одноцепочечную ДНК, а для того чтобы Rep расщеплял вирусную ДНК, необходимо, чтобы вирусная ДНК образовывала структуру стебель-петля. Известно, что нуклеотидная последовательность, образующая такую структуру стебель-петля, является очень высококонсервативной в вирусах, принадлежащих к роду Begomovirus семейства геминивирусов. В общих чертах область стебля состоит из девяти пар GC и двух пар AT, а область петли состоит из 11 или 12 нуклеотидов и содержит ТТ, ТТТ, ТА или АТА, за которыми следует нуклеотидная последовательность ТААТАТТАС (см., Kagaku to Seibutsu, 41, p. 311-317, 2003, p. 313, Fig. 2 и т.п.).

Совершенно очевидно, что возможность получить средство, ингибирующее репликацию вируса и нацеленное на нуклеотидную последовательность, являющуюся консервативной в вирусах, принадлежащих к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, позволила бы, помимо инфекции, вызываемой вирусом WDV, также эффективно бороться с инфекцией, вызываемой различными растительными вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus. Хотя метод, описанный в публикации Международной патентной заявки WO 2004/101798 и т.п., известен как метод культивирования трансформированного растения, обладающего устойчивой резистентностью к геминивирусу, однако этот метод совершенно отличается от способа, предложенного в настоящем изобретении.

Прототипы изобретения

Патентные документы.

Патентный документ 1: Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии (KOHYO); № 2004519211.

Патентный документ 2: Публикация Международной патентной заявки WO2004/101798.

Непатентные документы.

Непатентный документ 1: Biochemistry, 41, р. 7074-7081, 2002.

Непатентный документ 2: J. Virology, 79, р. 2614-2619, 2005.

Непатентный документ 3: Zhiwu Baohu (ISSN: 0529-1542), Vol. 34, No. 2, p. 17-21, 2008.

Непатентный документ 4: Plant Pathology, 57, p. 838-841, 2008.

Непатентный документ 5: Plant Pathology, 58, p. 1161-1169, 2009.

Непатентный документ 6: Virus Genes, 34, p. 359-366, 2007.

Непатентный документ 7: Kagaku to Seibutsu (Bioscience & Biotechnology), 41, p. 311-317, 2003.

Описание сущности изобретения

Цель, которая может быть достигнута при осуществлении настоящего изобретения.

Целью настоящего изобретения является разработка эффективного средства для борьбы с инфекцией, вызываемой геминивирусом. Более конкретно, целью настоящего изобретения является получение средства для ингибирования репликации растительного вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus семейства геминивирусов; культивирование растения, обладающего резистентностью к растительному вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus, и т.п.

Средство для достижения поставленной цели.

Для разработки способа, посредством которого может быть осуществлено ингибирование, главным образом, репликации различных вирусов, принадлежащих к геминивирусам, авторами настоящего изобретения были проведены различные исследования, направленные на изучение структуры стебельпетля. В результате авторами настоящего изобретения было обнаружено, что если AZP специфически связывается с ДНК структуры стебель-петля и стабилизирует двухцепочечную структуру вирусной ДНК и, тем самым, ингибирует ее структурные изменения в области стебель-петля, то в этом случае будет успешно ингибироваться расщепление вирусной ДНК посредством Rep, который может расщеплять только одноцепочечную ДНК. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что действие, направленное на ингибирование репликации вируса, может быть успешно осуществлено в растении. В этом способе используется структура стебель-петля, которая является высококонсервативной, в частности, в геминивирусах, принадлежащих к роду Begomovirus, a поэтому такой способ является наиболее подходящим, например, для получения ингибитора репликации вируса, а главным образом вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus.

Авторами настоящего изобретения были проведены дополнительные исследования, в результате которых было обнаружено, что с применением аналогичного метода, где используется структура стебель-петля и пограничные области, которые являются консервативными в вирусах, принадлежащих к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, может быть получен ингибитор репликации вируса, наиболее

- 2 031900 подходящий для борьбы с вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus, включая вирус карликовости пшеницы (WDV) и т.п., и этот ингибитор может быть использован в настоящем изобретении.

Таким образом, настоящее изобретение относится к ингибитору репликации вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, где указанный ингибитор включает белок цинковый палец, который может специфически связываться с полноразмерной ДНК области стебель-петля данного вируса или с одним или несколькими фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, и может ингибировать образование структуры стебель-петля.

В соответствии со своими предпочтительными вариантами настоящее изобретение относится к вышеупомянутому ингибитору репликации, содержащему один белок цинковый палец, который может связываться с одним фрагментом ДНК, выбранным из полноразмерной ДНК области стебель-петля вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus; к вышеупомянутому ингибитору репликации, содержащему один белок цинковый палец, который может связываться с непрерывной ДНК, состоящей из одного ДНК-фрагмента, выбранного из полноразмерной ДНК области стебель-петля вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, и одной ДНК, выбранной из граничной области, связывающейся с полноразмерной ДНК; и к вышеупомянутому ингибитору репликации, содержащему белок цинковый палец, образованный благодаря связыванию двух или более белков цинковый палец посредством линкера или линкеров, обладающих способностью связываться с соответствующими двумя или более фрагментами ДНК, выбранными из области стебель-петля и граничной области, связывающейся с областью стебель-петля.

В соответствии со своим более предпочтительным вариантом настоящее изобретение относится к вышеупомянутому ингибитору репликации, где белок цинковый палец содержит 8-13, а предпочтительно 9-12 доменов белка цинковый палец.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеупомянутый белок цинковый палец, и к ингибитору репликации геминивируса, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый белок цинковый палец.

В соответствии со своим предпочтительным вышеупомянутым вариантом настоящее изобретение относится к вышеупомянутому ингибитору репликации, где вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, является вирус карликовости пшеницы (WDV).

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к средству против вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, где указанное средство включает вышеупомянутый белок цинковый палец или нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый белок цинковый палец; к средству для предупреждения инфицирования вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, где указанное средство включает вышеупомянутый белок цинковый палец или нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутые белок цинковый палец; и к агрохимикатам для борьбы с инфекцией, вызываемой вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, где указанные агрохимикаты включают вышеупомянутый белок цинковый палец или нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый белок цинковый палец.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к способу предупреждения инфицирования растения вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, где указанный способ включает стадию нанесения на растение профилактически эффективного количества вышеупомянутого белка цинковый палец или нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеупомянутый белок цинковый палец; и к способу борьбы с инфекцией, вызываемой вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, где указанный способ включает стадию нанесения на растение вышеупомянутого белка цинковый палец или нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеупомянутый белок цинковый палец, в количестве, эффективном для борьбы с указанной инфекцией.

Настоящее изобретение также относится к растению с рекомбинантным геном, где указанное растение обладает резистентностью к вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus, и может экспрессировать вышеупомянутый белок цинковый палец; к трансформированному растению, обладающему резистентностью к Еирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus, где в указанное растение был введен ген, кодирующий вышеупомянутый белок цинковый палец, и к способу придания растению резистентности к. вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus, где указанный способ включает стадию трансформации указанного растения геном, кодирующим вышеупомянутый белок цинковый палец.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый белок цинковый палец, и к вышеупомянутому рекомбинантному вектору, используемому в целях трансформации растения для придания ему резистентности к вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus. В качестве вектора может быть использован вирусный вектор для растений и т.п.

Эффект настоящего изобретения.

Ингибитор репликации согласно изобретению нацелен на область стебель-петля, которая является высококонсервативной в вирусах, принадлежащих к роду Mastrevirus семейства Geminiviridae, а поэтому он может действовать как ингибитор репликации, широко используемый для борьбы с инфекциями, вызываемыми различными вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus. В соответствии с этим ингибитор репликации согласно изобретению может обладать высокой эффективностью не только для борьбы с инфекцией, вызываемой вирусом WDV, который согласно изобретению может обладать высокой эффек- 3 031900 тивностью не только для борьбы с инфекцией, вызываемой вирусом WDV, который является типичным вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, но также и для борьбы с инфекцией, вызываемой другими вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus, а поэтому, такой ингибитор является наиболее подходящим средством для борьбы с различными вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1 - проиллюстрирована схема связывания мотива цинковый палец и ДНК.

Фиг. 2 - проиллюстрирована концептуальная схема процесса репликации геминивируса.

Фиг. 3 - проиллюстрирована взаимосвязь между геминивирусом и TYLCV.

Фиг. 4 - проиллюстрирована область стебель-петля TYLCV.

Фиг. 5 - проиллюстрирована гомология областей стебель-петля вирусов нескольких видов, принадлежащих к геминивирусам.

Фиг. 6 - представлен пример ингибитора репликации, нацеленного только на TYLCV (верхняя часть), и пример ингибитора репликации, нацеленного на различные геминивирусы (нижняя часть).

Фиг. 7 - схематически проиллюстрирован способ получения AZP-2, используемого только для TYLCV.

Фиг. 8 - схематически проиллюстрирован способ получения AZP-3, который обычно используется для геминивирусов.

Фиг. 9 - представлены результаты анализа со сдвигом геля, осуществляемого для оценки способности AZP-2 связываться с ДНК-последовательностью-мишенью, где указанный анализ может быть применен только для TYLCV.

Фиг. 10 - представлены результаты анализа со сдвигом геля, осуществляемого для оценки способности AZP-3 связываться с ДНК-последовательностью-мишенью, где указанный анализ обычно используется для геминивирусов.

Фиг. 11 - для сравнения представлены результаты анализа со сдвигом геля, осуществляемого для оценки способности RepN связываться с ДНК-последовательностью-мишенью.

Фиг. 12 - проиллюстрирована способность GST-AZP (AZP-2) ингибировать расщепление ориджина репликации под действием Rep. Представлены результаты для ДНК-субстрата (дорожка 1), маркера продукта расщепления (дорожка 2) и продукта расщепления, полученного с использованием 2 мкМ GST-Rep (дорожка 3).

Фиг. 13 - проиллюстрирована способность GST-AZP (AZP-3) ингибировать расщепление ориджина репликации под действием Rep. Представлены продукты расщепления, осуществляемого в результате реакции, проводимой при температуре 25°C в течение 30 мин при концентрации GST-Rep, равной 2 мкМ.

Фиг. 14 - проиллюстрирован метод получения промотора, происходящего от вируса мозаики цветной капусты pUC35SO-TYLCV3/4/6:35S; NLS: сигнала локализации в ядре; Ω: 5'-лидерной последовательности для повышения эффективности трансляции, NOST: терминатора и TYLCV3/4/6: AZP, который связывается с консенсусной последовательностью в полноразмерном TYLCV (распознающей последовательностью является 5’-GGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGC-3’).

Фиг. 15 - проиллюстрирован метод получения экспрессионной плазмиды AZP для трансформации; NOS: промотора нопалин-синтазы (происходящего от Agrobacterium tumefaciens); NPT2: гена резистентности к канамицину; GUS: гена β-галактозидазы; RB (правой граничной области) и LB (левой граничной области) повторяющейся последовательности размером приблизительно 25 п.н. (область ДНК между этими последовательностями была перенесена в геном растения).

Фиг. 16 - представлен набор ПЦР-праймеров для детектирования структуры встроенного гена, гена резистентности к канамицину и гена AZP в трансформанте Т1.

Фиг. 17 - представлены результаты детектирования гена резистентности к канамицину и гена AZP в трансформанте Т1. Представлены результаты ПЦР, проводимой с использованием ДНК, экстрагированной из каждого растения Т1 (дорожки 1-4); ДНК, экстрагированной из томатов дикого типа (N), и бинарного вектора, используемого для трансформации (Р).

Фиг. 18 - представлен набор ПЦР-праймеров для подтверждения структуры встроенного гена в полноразмерной области экспрессионного кластера AZP и его встраивания в геном.

Фиг. 19 - представлены результаты подтверждения встраивания гена AZP в растение Т2, полученное путем введения AZP-2, где указанное подтверждение проводили с помощью ПЦР. Представлены результаты ПЦР, проводимой для детектирования экспрессионного кластера AZP с использованием ДНК, экстрагированной из каждого растения Т1 (дорожки 1-8); и бинарного вектора, используемого для трансформации (Р).

Фиг. 20 - представлены результаты определения числа копий встроенного гена AZP в трансформанте Т2, полученном путем введения AZP-2, где указанное определение осуществляли с помощью ПЦР. Представлены результаты ПЦР, проводимой с использованием ДНК, экстрагированных из растений Т2, полученных из специфического трансформанта Т1 (дорожки 1-18); ДНК, экстрагированной из томатов дикого типа (N), и бинарного вектора, используемого для трансформации (Р).

Фиг. 21 - представлены результаты подтверждения экспрессии AZP в растениях Т2, полученных

- 4 031900 путем введения AZP-2. AZP в экстрактах листьев растений Т2, представленных на фиг. 20, детектировали с помощью вестерн-блот-анализа с использованием анти-НА антител. Номера дорожек на этой фигуре соответствуют номерам дорожек на фиг. 20.

Фиг. 22 - представлены результаты идентификации гомозиготной линии Т2 по встроенному гену AZP, осуществляемой с помощью ПЦР для растений T3, полученных путем введения AZP-2. Представлены результаты ПЦР, проводимой с использованием ДНК, экстрагированных из растений T3, полученных из специфического трансформанта Т2 (дорожки 1-16). Растение Т2, для которого был подтвержден встроенный ген AZP во всех растениях T3, было отобрано как гомозиготное.

Фиг. 23 - представлены результаты подтверждения экспрессии AZP в растениях T3, полученных путем введения AZP-2. Представлены результаты детектирования AZP в экстрактах листьев растений T3 (дорожки 1-4), в экстракте листьев томатов дикого типа (N) и в экстракте листьев растения Т2 используемой линии (Р), где указанное детектирование осуществляли с помощью вестерн-блот-анализа с использованием анти-НА антител.

Фиг. 24 - представлены результаты инфицирования вирусом TYLCV растений томата дикого типа Micro-Tom путем инъекции бактерии Agrobacterium, имеющей геном TYLCV, в растение томата методом агноинокуляции. В культивированном растении (справа) наблюдались такие характерные симптомы TYLCV-инфекции, как закручивание и пожелтение листьев и заметное ингибирование роста.

Фиг. 25 - представлены результаты теста на TYLCV-инфицирование растения T3, полученного путем введения AZP-2. В этом трансформанте каких-либо симптомов инфекции не наблюдалось.

Фиг. 26 - представлены результаты ПЦР, проводимой на листьях, собранных с AZP-2трансформированных томатов через 30 дней после инфицирования вирусом, где указанную ПЦР проводили с использованием праймеров для детектирования TYLCV.

Фиг. 27 - представлены результаты теста на TYLCV-инфицирование растений T3, полученных из одного растения Т1, трансформированного путем введения AZP-3.

Фиг. 28 - показано, что вирусная ДНК не детектировалась в AZP-3-трансформантах.

Фиг. 29 - представлен мутант вируса карликовости пшеницы (WDV).

Фиг. 30 - представлены сайты-мишени для трех видов ингибиторов репликации вирусов трех видов, принадлежащих к роду Mastrevirus, включая WDV. AZP11 и AZP13 были сконструированы для распознавания смысловой цепи, a AZP12 был сконструирован на основе антисмысловой цепи (пример 1).

Фиг. 31 - проиллюстрирован способ получения AZP-11.

Фиг. 32 - проиллюстрирован способ получения AZP-12.

Фиг. 33 - проиллюстрирован способ получения AZP-13.

Фиг. 34 - представлена структура вектора-предшественника, используемого для получения бинарного вектора, имеющего экспрессионный кластер, содержащий AZP-11 или AZP-12.

Фиг. 35 - представлен набор праймеров для амплификации фрагмента промотора убихитина и AZP.

Фиг. 36 - представлен результат ПЦР-реакции амплификации фрагмента промотора убихитина и AZP.

Фиг. 37 - представлен набор праймеров для амплификации области, содержащей AZP.

Фиг. 38 - представлен результат, указывающий на высокий уровень экспрессии AZP в растениях Т1, в которые был введен AZP11 или AZP12.

Фиг. 39 - представлен результат детектирования геномной ДНК WDV посредством ПЦР-реакции у трансформантов Т1, полученных путем введения гена AZP11 или AZP12 и последующего инфицирования вирусом WDV.

Способы осуществления настоящего изобретения

Ингибитор репликации согласно изобретению представляет собой ингибитор вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus семейства Geminiviridae, и отличается тем, что он содержит белок цинковый палец, который может специфически связываться с полноразмерной ДНК области стебель-петля данного вируса или с одним или несколькими фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, и может ингибировать образование структуры стебель-петля.

Термин геминивирус, используемый в настоящем описании, означает ДНК-вирус, который инфицирует растения и имеет одну или две одноцепочечные циклические ДНК, а более конкретное объяснение этого термина приводится, например, в публикации Kagaku - Seibutsu, 41, p. 311-317, 2003 и др. Геминивирусы по структуре генома, спектру хозяев и типу насекомого-переносчика подразделяются на следующие четыре рода, а именно: Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus и Begomovirus. Ингибитор репликации согласно изобретению может быть нацелен, по существу, на любые вирусы, принадлежащие к роду Mastrevirus. Структуры геномов вирусов, принадлежащих к этим родам, конкретно описаны на фиг. 2 вышеупомянутой публикации (Kagaku-Seibutsu, 41, p.311-317, 2003). Кроме того, вирусы, принадлежащие к геминивирусам, и их сокращенные обозначения, подробно указанные, например, в таблицах, описаны в публикации Международной патентной заявки WO 2004/101798. Полное описание публикации Международной патентной заявки WO 2004/101798 вводится в настоящее описание посредством ссылки. При этом следует отметить, что геминивирусы включают известные геминивирусы и неизвестные геминивирусы, а также новые виды, такие как мутанты известных геминивирусов.

- 5 031900

Примерами таких геминивирусов являются, но не ограничиваются ими, вирусы, принадлежащие к роду Mastrevirus, такие как MSV (вирус полосатости кукурузы), WDV (вирус карликовости пшеницы) и BeYDV (вирус желтой карликовости фасоли); вирусы, принадлежащие к роду Curtovirus, такие как BCTV (вирус курчавости верхушки свеклы); вирусы, принадлежащие к роду Topocuvirus, такие как TPCTV (вирус псевдокурчавости верхушки томатов); вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, такие как BGMV (вирус золотистой мозаики фасоли), ACMV (вирус мозаики африканской кассавы), SLCV (вирус курчавости листьев тыквы), TGMV (вирус золотистой мозаики томатов), TYLCV (вирус желтой курчавости листьев томатов) и т.п. Ингибитор репликации согласно изобретению представляет собой ингибитор репликации вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, таких как MSV (вирус полосатости кукурузы), WDV (вирус карликовости пшеницы) и BeYDV (вирус желтой карликовости фасоли), причем из этих вирусов особенно предпочтительным является WDV.

Известно, что область стебель-петля, служащая в качестве связывающего сайт для ингибитора репликации, является высококонсервативной у вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus. Примерами вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus, являются, но не ограничиваются ими, TYLCCNV; TYLCGV, TYLCMalV; TYLCSV; TYLCTHV; TYLCV; ACMV; BGMV; CaLCuV; ToCMoV; TGMV; ToGMoV; ToMHV; ToMoTV; ToMoV, ToRMV; ToSLCV, ToSRV; вирусы закрученности или курчавости листьев хлопчатника (CLCrV; CLCuAV; CICuGV; CLCuKV, CLCuMV; CLCuRV); вирусы мозаики восточно-африканской кассавы (EACMCV, EACMMV; EACMV; EACMZV); вирусы желтой мозаики картофеля (PYMPV, PYMTV; PYMV); вирусы курчавости листьев тыквы (SLCCNV; SLCV; SLCYV); вирусы курчавости листьев сладкого картофеля (SPLCGV; SPLCV); вирусы курчавости листьев табака (TbLCJV; TbLCKoV; TbLCYNV; TbLCZV); вирусы курчавости листьев томатов (ToLCBV; ToLCBDV; ToLCGV; ToLCKV; ToLCLV; ToLCMV; ToLCNDV; ToLCSLV; ToLCTWV, ToLCW; ToLCV) и т.п. В частности, вирус TYLCV, принадлежащий к роду Begomovirus, может служить в качестве примера для объяснения метода конструирования, а также механизма действия и других свойств ингибитора репликации согласно изобретению, мишенью которого он является. Инклюзивная взаимосвязь между классами геминивирусов TYLCV и WDV представлена на фиг. 3.

Ингибитор репликации согласно изобретению содержит белок цинковый палец, который может специфически связываться с полноразмерной ДНК области стебель-петля вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, или с одним или более фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, и обладает способностью ингибировать образование структуры стебель-петля. Термин область стебельпетля геминивируса объясняется ниже для вируса TYLCV, принадлежащего к роду Begomovirus и используемого в качестве примера. Область стебель-петля представляет собой область длиной в 33 нуклеотида, состоящую из двух областей стебля, комплементарно связывающихся друг с другом (каждая область состоит из 11 нуклеотидов), и области петли, образующей петлю между областями стебля (области, состоящей из 11 нуклеотидов). Хотя известно, что существуют различные штаммы вируса TYLCV, однако во всех штаммах TYLCV нуклеотидная последовательность области стебель-петля является высококонсервативной. Область стебель-петля TYLCV представлена на фиг. 4. Эта область является высококонсервативной также и в других вирусах, принадлежащих к роду Begomovirus. Так, например, область стебель-петля, состоящая из 34 нуклеотидов, присутствующих в CR (общих областях) ДНК BGMV, и ее нуклеотидные последовательности имеют очень высокую гомологию с нуклеотидными последовательностями областей стебель-петля других вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus.

В настоящем описании выражение нуклеотидная последовательность области стебель-петля является высококонсервативной означает, что сравниваемые нуклеотидные последовательности являются гомологичными на 80% или более, предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 95% или более, еще более предпочтительно на 97% или более, а наиболее предпочтительно на 99% или более. Это определение также относится к вирусам, принадлежащим к роду Mastrevirus. Хотя гомология области стебель-петля вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, может быть в основном ниже, чем гомология вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus, однако нуклеотидная последовательность области стебель-петля вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, является также консервативной у вирусов, принадлежащих к роду Begomovirus, и такая гомология обычно составляет 60% или более, предпочтительно 70% или более более предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более, а наиболее предпочтительно 95% или более. Кроме того, область стебель-петля также является высококонсервативной и в вирусах, принадлежащих к другому роду геминивирусов. Гомология областей стебель-петля вирусов различных типов, принадлежащих к геминивирусам, представлена на фиг. 5.

Ингибитор репликации согласно изобретению может быть сконструирован так, чтобы он специфически связывался с полноразмерной ДНК области стебель-петля, которая является высококонсервативной у вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, или чтобы он связывался с одним фрагментом ДНК или с двумя или более фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, и мог ингибировать образование структуры стебель-петля в результате специфического связывания. Ингибитор репликации согласно изобретению может быть также сконструирован так, чтобы он, помимо своей способности специфически связываться с полноразмерной ДНК области стебель-петля или с одним или более фраг- 6 031900 ментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК, обладал способностью специфически связываться с ДНК фланкирующей области, локализованной выше и/или ниже ДНК, находящейся в области стебельпетля, и такой вариант является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Одним из особенно предпочтительных вариантов настоящего изобретения является (а) ингибитор репликации, содержащий один белок цинковый палец, который может связываться с непрерывной ДНК, состоящей из одного фрагмента ДНК, выбранного из полноразмерной ДНК области стебельпетля вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, и одной ДНК, выбранной из фланкирующей области, связывающейся с полноразмерной ДНК. Конкретные примеры ингибитора репликации согласно этому особенно предпочтительному варианту изобретения, т.е. AZP-11 и AZP-12, описаны в примере 1 данного документа (фиг. 30). Кроме того, другим особенно предпочтительным вариантом является (b) ингибитор репликации, содержащий белок цинковый палец, который специфически связывается с одним фрагментом ДНК, выбранным из полноразмерной ДНК области стебель-петля. Конкретный пример ингибитора репликации согласно этому особенно предпочтительному варианту изобретения, т.е. AZP-13, описан в примере 1 данного документа (фиг. 30). Кроме того, также предпочтительным является (с) вышеупомянутый ингибитор репликации, содержащий белок цинковый палец, образованный в результате связывания двух или более белков цинковый палец посредством линкера или линкеров, способных связываться с соответствующими двумя или более фрагментами ДНК, выбранными из ДНК, состоящей из области стебель-петля и граничной области (фланкирующей области), связывающейся с областью стебель-петля. Для ингибирования образования структуры стебель-петля посредством специфического связывания достаточно, чтобы двухцепочечная структура вирусной ДНК была стабилизирована посредством связывания ингибитора согласно изобретению с ДНК, выбранной из области стебель-петля, или ДНК, выбранной из области стебель-петля, и ДНК, выбранной из фланкирующей области, которая является граничной областью в области стебель-петля, и белок цинковый палец, который ингибирует образование структуры стебель-петля вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, может быть сконструирован путем подбора соответствующего домена цинковый палец исходя из нуклеотидной последовательности области стебель-петля и, если это необходимо, нуклеотидной последовательности граничной области.

Домен цинковый палец, присутствующий в белке цинковый палец, может быть сконструирован так, чтобы он мог распознавать специфическую нуклеотидную последовательность с использованием невырожденного кода распознавания, представленного в таблице. В настоящем описании термин домен цинковый палец означает домен, составляющий ДНК-связывающий сайт, присутствующий в белке цинковый палец, и этот домен может также называться просто пальцем. Белок цинковый палец обычно содержит приблизительно два, три, четыре, шесть или десять доменов цинковый палец. Невырожденный код распознавания, представленный в таблице, и метод конструирования белка цинковый палец, распознающего специфическую нуклеотидную последовательность и специфически связывающегося с этой последовательностью, описан, например, в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии (KOHYO) № 2004-519211. Полное описание вышеуказанной патентной публикации вводится в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, можно также обратиться к публикации Biochemistry, 41, p. 7074-7081, 2002. Как описано выше, может быть легко получена информация о нуклеотидной последовательности области стебель-петля геномной ДНК вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, и специалист в данной области может легко сконструировать и получить белок цинковый палец, который может специфически связываться, по меньшей мере, с полноразмерной ДНК области стебель-петля или с одним, или с двумя, или более фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК.

Для справки, метод конструирования, например, ингибитора репликации, нацеленного только на TYLCV, описан в сравнительном примере 1 в разделе Примеры. Для конструирования ингибитора репликации, нацеленного только на TYLCV, могут быть получены белки цинковые пальцы, которые могут связываться с ДНК, содержащей полноразмерную или почти полноразмерную ДНК области стебельпетля (состоящей из 33 нуклеотидов), которая является высококонсервативной в TYLCV, а с использованием белка цинковый палец одного вида, выбранного из указанных белков цинковые пальцы, в качестве ингибитора репликации согласно изобретению, можно ингибировать репликацию TYLCV всех типов. Так, например, может быть сконструирован собственно сам белок цинковый палец, например белок цинковый палец, содержащий десять доменов цинковые пальцы. Совершенно очевидно, что вышеупомянутый метод может быть с успехом применен для конструирования ингибитора репликации, нацеленного на другие вирусы, принадлежащие к семейству геминивирусов, но не на вирусы TYLCV.

Кроме того, для справки, метод конструирования ингибитора репликации, который, помимо TYLCV, нацелен на различные геминивирусы, включая вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, также описан в сравнительном примере 2 в разделе Примеры. Для конструирования ингибитора репликации, который, помимо TYLCV, нацелен на различные геминивирусы, может быть получен один белок цинковый палец, который связывается с двумя или более фрагментами ДНК, выбранными из полноразмерной ДНК области стебля и используемыми в качестве последовательностей, обычно содержащихся в геминивирусах-мишенях, либо могут быть сконструированы два или более белка цинковые

- 7 031900 пальцы, которые связываются с соответствующими фрагментами ДНК, упомянутыми выше, а также связываются друг с другом посредством соответствующего(их) линкера(ов), такого(их) как пептидный(ые) линкер(ы). В качестве линкера может быть использован пептидный линкер, содержащий приблизительно 1-40, предпочтительно, 1-20, а более предпочтительно, 1-10 аминокислотных остатков, а также синтетический линкер, состоящий из алкиленовой цепи, полиэтиленгликолевой цепи или т.п., сахарной цепи и т.п. Если два или более фрагмента ДНК выбраны из полноразмерной ДНК области стебель-петля, то предпочтительно, чтобы они не содержали фрагмента ДНК, который является неконсенсусной последовательностью областей стебель-петля различных геминивирусов, включая вирусы, принадлежащие к роду Mastrevirus и используемые в качестве мишени, и в основном желательно выбрать такие ДНК, которые представляли бы собой консенсусные последовательности, расположенные выше и ниже такой неконсенсусной последовательности, используемой в качестве фрагментов ДНК.

Для справки, пример ингибитора репликации, нацеленного только на TYLCV, и пример ингибитора репликации, нацеленного на различные геминивирусы, включая вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, представлены на фиг. 6. На этой фигуре пример ингибитора репликации, нацеленного только на TYLCV, представлен сверху, а пример ингибитора репликации, нацеленного на различные геминивирусы, включая вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, представлен снизу.

Так, например, (а) примерами ингибиторов репликации, нацеленных только на TYLCV, является ингибитор репликации, имеющий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей, а примерами ингибиторов репликации, нацеленных на различные геминивирусы, включая вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, является ингибитор репликации, имеющий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2. Кроме того, в качестве ингибитора репликации может быть использован (b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, но при этом также имеющий делецию, замену и/или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, а предпочтительно приблизительно 1-5 аминокислотных остатков, и который обладает, по существу, таким же ингибирующим репликацию действием, как и белок, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 или 2. Кроме того, в качестве ингибитора репликации может быть также использован (с) белок, который на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, а более предпочтительно на 90% или более гомологичен аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 1 или 2, и который обладает, по существу, таким же ингибирующим репликацию действием, как и белок, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 или 2.

В качестве нуклеиновой кислоты, используемой для получения ингибитора репликации, который нацелен только на TYLCV, или ингибитора репликации, который нацелен на различные геминивирусы, включая вирусы, принадлежащие к роду Begomovirus, может служить нуклеиновая кислота, содержащая ДНК, кодирующую вышеупомянутый белок (а) (ДНК, определенную как нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3 или 4 в списке последовательностей), а также ДНК, кодирующую вышеупомянутый белок (b) или (с). ДНК, кодирующая вышеупомянутые белки (b) или (с), включает, например, ДНК, способную гибридизироваться с ДНК, определенной как нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3 или 4, в жестких условиях и т.п. Примерами такой вышеупомянутой ДНК является ДНК, которая может быть идентифицирована путем гибридизации с использованием ДНК в качестве зонда и фильтра, на котором ДНК или ее фрагмент, происходящие от колоний или бляшек, фиксируют при 65°C в присутствии приблизительно 0,7-1,0 М NaCl в соответствии с методом гибридизации колоний, методом гибридизации бляшек или методом саузерн-блот-гибридизации, а затем фильтр промывают 0,1-2х SSC-раствором (1х SSC-раствором, содержащим 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия) при 65°C. Так, например, предпочтительно использовать ДНК, которая на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, а наиболее предпочтительно на 98% или более гомологична нуклеотидной последовательности ДНК, используемой в качестве зонда.

Ингибитор репликации согласно изобретению, направленный против вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, может быть получен следующим образом. В качестве типичного примера вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus, можно упомянуть WDV. Хотя мутант вируса, представленный на фиг. 29, известен как мутант WDV, однако в этом вирусе область стебель-петля является высококонсервативной и связывающиеся граничные области (фланкирующие области), расположенные ниже и выше области стебля, также являются высококонсервативными (описание геномной последовательности и мутанта WDV можно также найти в публикации Plant Pathology, 57, p. 838-841, 2008; Plant Pathology, 58, p. 1161-1169, 2009; Virus Genes, 34, p. 359-366, 2007 и т.п.). При конструировании ингибитора репликации согласно изобретению необходимо выбрать число нуклеотидов в каждой граничной области, например такое число нуклеотидов может составлять приблизительно 200 или менее, предпочтительно приблизительно 100 или менее, более предпочтительно приблизительно 50 или менее, а наиболее предпочтительно 30 или менее от конца области стебля. Эти области также являются консервативными и в других вирусах, принадлежащих к роду Mastrevirus, а гомология этой области обычно состав- 8 031900 ляет 60% или более, предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более, а наиболее предпочтительно 95% или более.

Поэтому для ингибирования репликации WDV может быть использован белок цинковый палец, который специфически связывается с областью стебель-петля WDV, или белок цинковый палец, который специфически связывается с частью области стебель-петля WDV и специфически связывается со связывающейся ДНК, расположенной выше и/или ниже области стебель-петля WDV. Так, например, сайты-мишени вирусов, принадлежащие к роду Mastrevirus, включая WDV для ингибиторов репликации согласно изобретению, представлены на фиг. 30. Для ингибирования репликации WDV, помимо белка цинковый палец, который специфически связывается со смысловой цепью, может быть также использован белок цинковый палец, который специфически связывается с антисмысловой цепью.

В примере 1 настоящего описания AZP11 и AZP13, в частности, представлены как белки цинковые пальцы, которые распознают смысловую цепь, a AZP12, в частности, представлен как белок цинковый палец, сконструированный на основе последовательности антисмысловой цепи. Кроме того, методы конструирования AZP11, AZP12 и AZP13 представлены на фиг. 31-33 соответственно, а аминокислотные последовательности AZP11, AZP12 и AZP13 представлены в SEQ ID NO: 5, 6 и 7 списка последовательностей соответственно. В качестве ингибитора репликации согласно изобретению может быть также использован (d) ингибитор репликации, содержащий белок, который имеет аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 5, 6 или 7, при этом также имеет делецию, замену и/или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, а предпочтительно приблизительно 1-5 аминокислотных остатков, и который обладает, по существу, таким же действием, ингибирующим репликацию вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, как и белок, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 5, 6 или 7. Кроме того, в качестве ингибитора репликации согласно изобретению может быть также использован (е) белок, который на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, а более предпочтительно на 90% или более гомологичен аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 5, 6 или 7, и который обладает, по существу, таким же ингибирующим репликацию действием, как и белок, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 5, 6 или 7.

В качестве нуклеиновой кислоты, используемой для получения ингибитора репликации вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus, например, могут быть также использованы ДНК, кодирующие AZP11, AZP12 и AZP13 (ДНК, представленные нуклеотидными последовательностями в SEQ ID NO: 8, 9 и 10 списка последовательностей соответственно), а также ДНК, кодирующая вышеупомянутый белок (d) или (е). ДНК, кодирующая вышеупомянутые белки (d) или (е), включает, например, ДНК, способную гибридизироваться с ДНК, определенной как нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 8, 9 и 10, в жестких условиях и т.п. Примерами такой вышеупомянутой ДНК является ДНК, которая может быть идентифицирована путем гибридизации с использованием ДНК в качестве зонда и фильтра, на котором ДНК или ее фрагмент, происходящие от колоний или бляшек, фиксируют при 65°C в присутствии приблизительно 0,7-1,0 М NaCl в соответствии с методом гибридизации колоний, методом гибридизации бляшек или методом саузерн-блот-гибридизации, а затем фильтр промывают 0,1-2х SSC-раствором (1х SSC-раствором, содержащим 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия) при 65°C. Так, например, предпочтительно использовать ДНК, которая на 70% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более, еще более предпочтительно на 95% или более, а наиболее предпочтительно на 98% или более гомологична нуклеотидной последовательности ДНК, используемой в качестве зонда.

Ингибитор репликации согласно изобретению получают в форме вышеупомянутого белка цинковый палец или нуклеиновой кислоты, кодирующей белок цинковый палец, и для борьбы с инфекцией, вызываемой вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, ингибитор репликации согласно изобретению наносят per se на растение в качестве агрохимиката. Хотя способ нанесения ингибитора репликации согласно изобретению не имеет конкретных ограничений, однако такой ингибитор может быть получен, например, в качестве композиции агрохимикатов, приготовленной с использованием препаратовдобавок, хорошо известных специалистам в данной области. Композиции агрохимикатов, содержащие белок или нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента, известны специалистам по промышленному производству агрохимикатов, и такие композиции агрохимикатов могут быть получены с применением соответствующих технологий. Примерами таких технологий являются, но не ограничиваются ими, например, метод введения вышеупомянутой нуклеиновой кислоты в клетку растения с использованием вектора, такого как плазмида, в которую была включена вышеупомянутая нуклеиновая кислота для временной трансформации данного растения; метод введения вышеупомянутой нуклеиновой кислоты в геном растения с использованием вектора и т.п. Векторами, используемыми в способе согласно изобретению, являются вирусные векторы, которые могут инфицировать растения.

Форма композиции агрохимикатов не имеет конкретных ограничений, и такая композиция может иметь любую форму, подходящую для ее промышленного изготовления. Так, например, могут быть использованы композиции в форме эмульсии, раствора, масла, водорастворимого препарата, смачиваемого порошка, текучего препарата, порошка, тонкодисперсных гранул, гранул, аэрозоля, фумигатора, пасты и

- 9 031900

т.п. Метод получения композиции агрохимикатов также не имеет конкретных ограничений, и могут быть применены любые методы, подходящие для приготовления таких композиций. Кроме того, в композицию агрохимикатов могут быть включены смеси активных ингредиентов других агрохимикатов, таких как другие противовирусные средства, пестициды, фунгициды, комбинации инсектицидов-фунгицидов и гербициды.

Настоящее изобретение относится к трансформированному растению, которое может экспрессировать вышеупомянутый ингибитор репликации. В настоящем изобретении растение, используемое для трансформации, не имеет конкретных ограничений, и могут быть использованы любые части растений, такие как целые растения, органы растений (например, листья, лепестки, стебель, корень, семена и т.п.), ткани растений (например, эпидермис, луб, паренхима, ксилема, сосудистые пучки, палисадная ткань, губчатая паренхима и т.п.), и клетки культивированных растений. Тип растения также не имеет конкретных ограничений, и в этих целях может быть использовано любое растение. При этом предпочтительно выбирать растение такого вида, которое, как было установлено, является основным объектом инфицирования вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus.

Более конкретно, примерами таких видов растений являются, но не ограничиваются ими, например, растения, принадлежащие к семействам Malvaceae (окра и т.п.), Chenopodiaceae (свекла, шпинат и т.п.), Brassicaceae (турнепс, цветная капуста, брокколи, капуста белокочанная, Brassica campestris, левкой, редька, бок-чой, китайская капуста, вассаби и т.п.), Iridaceae (ирис, гладиолус, фрезия и т.п.), Plumbaqinaceae (гвоздичник и т.п.), Роасеае (рис, газонная трава, кукуруза, пшеница и т.п.), Gesneriaceae (пентастемон и т.п.), Araliaceae (Aralia cordata и т.п.), Cucurbitaceae (тыква, огурец, сорт Cucumis melo, conomon, арбуз, дыня и т.п.), Ebenaceae (хурма и т.п.), Compositae (гербера, Chrysanthemum morifolium, календула настоящая, календула садовая, лопух, Senecio cruenta, Chrysanthemum coronarium, георгин, подсолнечник, Petasites japonicus, маргаритка многолетняя, Gymnaster savatiereri, латук и т.п.), Juglandaceae (грецкий орех и т.п.), Moraceae (инжир, шелковица, хмель и т.п.), Papaveraceae (исландский мак и т.п.), Scrophulariaceae (львиный зев и т.п.) Primulaceae (цикламен, примула и т.п.), Araceae (Amorphophallus rivieri, Colocasia antiquorum сорт esculenta и т.п.), Cactaceae (кактус и т.п.), Lamiaceae (сальвия, растения семейства губоцветных и т.п.,), Begoniaceae (бегония и т.п.), Zingiberaceae (имбирь, Zingiber mioga и т.п.), Nymphaeaceae (лотос и т.п.), Violaceae (фиалка трехцветная и т.п.), Umbelliferae (Oenanthe stolonifera, сельдерей, морковь, петрушка, воскоцветник японский и т.п.), Chloranthaceae (Sarcandra glabra и т.п.), Ericaceae (различные ягоды и т.п.), Theaceae (Thea sinensis и т.п.), Euphorbiaceae (цезальпиния и т.п.), Solanaceae (картофель, табак, томаты, баклажаны, перец душистый, Capsicum annuum, сорт angulosum и т.п.), Cariophyllaceae (гвоздика, Gypsophila paniculata и т.п.), Rosaceae (слива дикая, земляника, слива домашняя, вишня, Prunus salicina, японская груша, роза, Eriobotrya japonica, персик, Spiraea thunbergii, яблоня, груша и т.п.), Convolvulaceae (ипомея, батат и т.п.), Geraniaceae (герань и т.п.), Vitaceae (виноград и т.п.), Fagaceae (Castanea crenata и т.п.), Paeoniaceae (пион, Paeonia albiflora и т.п.), Actinidiaceae (плод киви и т.п.), Leguminosae (фасоль лучистая, Phaseolus vulgaris, фасоль настоящая, соя зеленая, Pisum sativum, сладкий горох, коричневая фасоль, соевые бобы, арахис и т.п.), Rutaceae (различные цитрусы и т.п.), Dioscoreaceae (китайский ямс и т.п.), Saxifragaceae (камнеломка и т.п.), Liliaceae (спаржа, лук, тюльпан, Allium tuberosum, чеснок, уэльский лук, гиацинт, лилия, шалот, лукшалот и т.п.), Orchidaceae (кэтлея, гортензия, фаленопсис и т.п.), Agavaceae (драцена и т.п.), Gentianaceae (Eustoma russellianum, Gentiana scabra, сорт buergeri и т.п.) и Poaceae (пшеница, рис и т.п.).

Предпочтительными примерами являются, но не ограничиваются ими, томаты, перец, табак, тыква, маниока, батат, хлопчатник, дыня, картофель, соя, виноградная лоза, кукуруза, пшеница, сахарный тростник, фасоль, свекла, арбуз, окра, кассава и т.п. Более предпочтительными растениями являются пшеница, рис и т.п., а особенно предпочтительным растением является пшеница.

Примерами трансформируемых источников растений являются протопласты, семена, ростки, рассада, каллус, культивированные клетки, целое растение и т.п., но эти источники не имеют конкретных ограничений. В зависимости от типа рассматриваемого растения, специалист может самостоятельно выбрать нужную часть растения и осуществить его трансформацию.

Хотя тип вектора, используемого для трансформации, не имеет конкретных ограничений, однако предпочтительно, чтобы этот вектор содержал промоторную и/или энхансерную последовательность, экспрессирующую ген, кодирующий вышеупомянутый белок цинковый палец. Типы промоторных и энхансерных последовательностей не имеют конкретных ограничений при условии, что такие последовательности способны индуцировать экспрессию вышеупомянутого гена в клетке растения, при этом могут быть использованы любые промоторные и энхансерные последовательности. Так, например, могут быть использованы промоторы и т.п., происходящие от целого растения, растительного вируса или бактерии, включая промоторы генов бактерий Agrobacterium или Risobium, экспрессируемых в клетке растения, и т.п. В качестве промотора могут быть использованы, например, промотор, происходящий от Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, промотор Smas, промотор циннамиловый спирт-дегидрогеназы, промотор NOS, промотор рибулозо-бифосфат-карбоксилазы-оксигеназы (Rubisco), промотор GRP1.8, промотор 35S, происходящий от вируса мозаики цветной капусты (CaMV), промотор и энхансер актина, гистона и т.п., происходящие от растения, и т.п., однако такие промоторы и энхансеры не ограничиваются выше- 10 031900 приведенными примерами.

Вектор может содержать любые последовательности различных генов резистентности к антибиотикам и другие маркерные гены, используемые в качестве селективного маркерного гена. Примерами маркерных генов являются, но не ограничиваются ими, ген резистентности к спектиномицину, ген резистентности к стрептомицину, ген резистентности к канамицину, ген резистентности к генетицину, ген резистентности к гигромицину, ген резистентности к гербициду, который ингибирует ацетолактатсинтетазу (ALS), ген резистентности к гербициду, который ингибирует глутамин-синтетазу (например, ген bar), ген β-глюкуронидазы, ген люциферазы и т.п.

Так, например, для повышения эффективности экспрессии гена может оказаться предпочтительным добавление ро1у(А)⁺-последовательности к З'-концу полинуклеотидной кодирующей области данного гена. В качестве ро1у(А)⁺-последовательности может быть использована последовательность, происходящая от различных растительных генов или от Т-ДНК, однако такая последовательность не ограничивается вышеприведенными примерами. В вектор может быть введена и другая последовательность, подходящая для экспрессии гена на высоком уровне, например интронная последовательность специфического гена, последовательность 5'-нетранслируемой области или т.п. Кроме того, для стимуляции миграции в ядро также может оказаться предпочтительным включение сигнала ядерной локализации (NLS) или т.п.

Векторы, используемые для экспрессии генов в высших растениях, хорошо известны специалистам, и в этих целях могут быть использованы любые из вышеуказанных векторов. Примерами векторов, которые могут вводить часть ДНК вектора в геном растения-хозяина, в случае, если этот вектор вводят в клетку растения, используемого в качестве хозяина, являются, но не ограничиваются ими, вектор, происходящий от плазмиды Ti Agrobacterium tumefaciens, а также векторы KYLX6, pKYLX7, pBI101, pBH2113, pBI121 и т.п., происходящие от плазмиды Ti.

Экспрессионный вектор может быть введен в нужную растительную клетку известным методом, применяемым для введения чужеродного гена в клетку растения, например методом выстреливания частиц, методом электропорации, методом с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ), методом с использованием фосфата кальция, методом с использованием DEAE-декстрана, методом микроинжекции, методом липофекции, методом трансфекции, опосредуемой микроорганизмами, таким как метод с использованием Agrobacterium, и т.п. Из этих методов предпочтительными являются метод выстреливания частиц, метод электропорации, метод с использованием полиэтиленгликоля, метод с использованием Agrobacterium и т.п., а наиболее предпочтительным является метод с использованием Agrobacterium (Methods Mol. Biol, 82, p. 259-266, 1998). В случае применения метода с использованием бинарного вектора может быть эффективно осуществлена рекомбинация генов.

Метод конструирования экспрессионного вектора и метод трансформации растения более подробно описаны в разделе Примеры. В соответствии с этим специалист может трансформировать нужное растение так, чтобы оно экспрессировало ингибитор репликации согласно изобретению в соответствии с вышеупомянутыми общими и конкретными инструкциями, приведенными в разделе Примеры, и соответствующим образом модифицировать или изменять тип вектора, последовательность, вводимую в этот вектор, метод трансформации и т.п.

Примеры

Далее приводится подробное описание настоящего изобретения со ссылками на нижеследующие примеры. Однако нижеследующие примеры не ограничивают объема настоящего изобретения.

Сравнительный пример 1.

1. Материалы и методы.

(1) Конструирование AZP.

Белки цинковые пальцы (в примерах белок цинковый палец будет сокращенно называться AZP), которые распознают нижеследующие соответствующие области ДНК двух видов, были сконструированы исходя из невырожденного кода распознавания, представленного в таблице, имеющейся в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии (KOHYO) № 2004-519211.

(a) Область стебель-петля является консервативной в TYLCV.

(b) Область стебель-петля является консервативной в геминивирусах.

В AZP, представленном в верхней части фиг. 6 (только для TYLCV), десять доменов цинковые пальцы были непосредственно связаны друг с другом. В AZP, представленном в нижней части фиг. 6 (для различных геминивирусов), AZP двух видов, которые распознают две консервативные области в геминивирусах в области стебель-петля, связаны посредством короткого пептида.

(2) Получение AZP-экспрессирующих плазмид.

AZP только для TYLCV (далее обозначаемый AZP-2) получали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 7. Сначала гены для трех связанных вместе цинковых пальцев синтезировали с помощью ПЦР и каждый из них клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-21а Escherichia coli (Novagen) в BamHI/HindIII-сайты, нуклеотидные последовательности полученных плазмид подтверждали, в результате чего были получены плазмиды рЕТ-TYLCV-3, pET-TYLCV-4 и pET-TYLCV-5. Затем три гена AZP цинковых пальцев в pET-TYLCV-3 и pET-TYLCV-4 амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали с получением pET-TYLCV3/4. Был получен ген цинкового пальца, который распознает 5'-ТАТА-3', и

- 11 031900 этот ген был лигирован с тремя генами цинковых пальцев AZP в pET-TYLCV5 методом, описанным выше для получения pET-TYLCV6. И, наконец, после амплификации шести генов цинковых пальцев

AZP и четырех генов цинковых пальцев AZP из pET-TYLCV3/4 и pET-TYLCV6 с помощью ПЦР соответственно и их лигирования получали плазмиду (pET-TYLCV3/4/6) для экспрессии AZP-2, который распознает 31 нуклеотид из 33 нуклеотидов, образующих последовательность области стебель-петля.

AZP, который обычно применяется против геминивирусов (далее обозначаемый AZP-3), получали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 8. Сначала для введения генов AZP двух видов, которые распознают две консервативные области в геминивирусах в области стебель-петля, и гена пептидного линкера получали плазмиду-предшественник (pET-MCS). Ген для шести цинковых пальцев AZP, который распознает более длинную консервативную область в геминивирусах, амплифицировали из рЕТ-TYLCV3/4 с помощью ПЦР, а затем клонировали в pET-MCS с получением pET-TYLCV3/4-MCS. После этого ген для трех цинковых пальцев AZP, который распознает более короткую консервативную область в геминивирусах, амплифицировали из рЕТ-TYLCV5 с помощью ПЦР, а затем клонировали в pET-TYLCV3/4-MCS с получением плазмиды, которая экспрессирует AZP-3, имеющий 6 аминокислотных остатков, составляющих линкерный пептид (рЕТ-TYLCV3/4-MCS-TYLCV5).

(3) Экспрессия AZP.

Клетки Escherichia coli BL21 (DE3) трансформировали каждой AZP-экспрессирующей плазмидой и полученный трансформант культивировали при 37°C в среде LB, содержащей ампициллин. Когда OD₆₀₀ достигала 0,6-0,7 добавляли IPTG в конечной концентрации 1 мМ для индуцирования экспрессии нужного белка. После культивирования еще в течение 3 ч, клетки Escherichia coli собирали путем центрифугирования и хранили при -80°C, после чего их использовали для очистки белков.

(4) Очистка AZP.

Каждый AZP очищали в основном одним и тем же методом. Клетки Escherichia coli хранили при -80°C, а затем к ним добавляли 10 мл буфера для лизиса (100 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ZnCl₂, 5 мМ DTT, рН 8,0), после чего проводили три цикла замораживания и оттаивания, в результате чего получали клеточные стенки клеток Escherichia coli, которые легко разрушались. Затем клетки Escherichia coli подвергали дизрупции на ультразвуковом устройстве и центрифугировали, после чего собирали супернатант, содержащий нужный белок. Этот супернатант наносили на катионообменную смолу Biorex-70 (Bio-Rad) для адсорбирования нужного белка на смоле и эту смолу в достаточной степени промывали промывочным буфером (50 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,2 мМ DTT, рН 8,0). Затем нужный белок элюировали элюирующим буфером (50 мМ Трис-HCl, 300 мМ NaCl, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,2 мМ DTT, рН 8,0). Были собраны только те фракции, которые содержали рассматриваемый белок, а затем эти фракции концентрировали с использованием мембраны для ультрафильтрации и добавляли равный объем глицерина, после чего смесь перемешивали и хранили при -80°C. Чистоту AZP определяли исходя из количества полос, окрашенных кумасси синим на ДСН-ПААГ-геле. Концентрации белков определяли с помощью анализа белка ESL (Roche).

(5) Получение RepN-экспрессирующей плазмиды.

RepN представляет собой N-концевую область реплицирующегося вирусного белка Rep (состоящего из 191 аминокислотного остатка) и обладает ДНК-связывающей активностью. RepN, для его использования в эксперименте на ингибирование связывания Rep с прямыми повторами под действием AZP, получали следующим способом. Ген RepN амплифицировали из генома TYLCV с помощью ПЦР с использованием генома TYLCV, взятого от инфицированного растения томата, и клонировали в рЕТ-21а в BamHI/HmdШ-сайты способом, аналогичным способу, применяемому для AZP. Нуклеотидная последовательность полученной плазмиды была подтверждена, и, таким образом, была создана RepN-экспрессирующая плазмида (pET-RepN).

(6) Экспрессия и очистка белка RepN.

Экспрессию RepN осуществляли способом, аналогичным способу экспрессии AZP, и получали экспрессированный белок в достаточном количестве. Полученные клетки Escherichia coli хранили при -80°C до очистки белка. RepN очищали способом, аналогичным способу очистки AZP. Затем проводили ионообменную хроматографию с использованием Biorex-70, где элюирование проводили элюирующим буфером (50 мМ трис-HCl, 250 мМ NaCl, 0,2 мМ DTT, рН 8,0), в результате чего с успехом был получен RepN с высокой степенью очистки.

(7) Оценка способности AZP и RepN связываться с ориджином репликации.

Способность каждого белка к связыванию с последовательностью ДНК-мишени оценивали с помощью анализа со сдвигом геля. Для этого получали ДНК-олигомер, содержащий последовательность ДНК-мишени, и этот олигомер метили ³²Р у 5'-конца. Затем добавляли буфер для связывания (10 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,05% BSA, 10% глицерин, рН 7,5), содержащий меченую ДНК вместе с предварительно определенным количеством белка, и реакцию продолжали в течение 1 ч на льду. Продукт реакции наносили на 6% неденатурированный акриламидный гель и проводили электрофорез при 4°C в течение 2 ч (рабочий буфер: 45 мМ трис-борат). После электрофореза гель помещали на хроматографическую бумагу и сушили. Бумагу хорошо высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой, после чего детектировали полосу меченой ДНК. Концентрация белка при отношении

- 12 031900 количества свободной ДНК и количества ДНК в комплексе с белком, составляющем 1:1, соответствовала константе диссоциации последовательности ДНК-мишени. Исходя из этой концентрации белка, сравнивали связывающие способности AZP и RepN.

(8) Оценка способности AZP ингибировать расщепление под действием вирусного реплицирующегося белка.

(a) Получение Rep-экспрессирующей плазмиды.

(1) Полноразмерный Rep, обладающий расщепляющей активностью, необходим для оценки способности ингибировать расщепление. В соответствии с этим была получена Rep-экспрессирующая плазмида. Ген Rep был амплифицирован из генома TYLCV с помощью ПЦР способом, аналогичным способу, применяемому для получения RepN-экспрессирующей плазмиды, и клонирован в рЕТ-21а в BamHI/HindIII-сайты. Была подтверждена нуклеотидная последовательность плазмиды, которая была получена для экспрессии Rep (pET-Rep).

(b) Получение Rep-экспрессирующей плазмиды (2).

После дизрупции клеток Escherichia coli один Rep в солюбилизированном состоянии может иногда не детектироваться. В соответствии с этим Rep был получен в форме гибридного белка с глутатион-Sтрансферазой (GST), который стимулирует солюбилизацию слаборастворимых белков и может быть легко очищен. Область ДНК, содержащую промотор Т7 и ген GST, амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды для экспрессии GST-гибридного белка (рЕТ-41а, Novagen) и клонировали в pET-Rep в BamHI/SphI-сайты. Была подтверждена последовательность ДНК плазмиды, которая была получена для экспрессии белка GST-Rep (pET-GST-Rep).

(c) Экспрессия гибридного белка GST-Rep.

Каждую из трех видов клеток Escherichia coli, а именно BL21(DE3), Rosetta 2(DE3)pLysS и BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL, трансформировали плазмидой pET-GST-Rep и экспрессию в каждом из полученных клонов индуцировали добавлением 1 мМ IPTG при 37°C способом, аналогичным способу, применяемому для экспрессии белка RepN. Хотя уровни экспрессии были одинаковыми для всех штаммов Escherichia coli, однако после дизрупции клеток BL21(DE3) Escherichia coli наблюдалось гораздо большее количество солюбилизированного GST-Rep. Поэтому экспрессию белка осуществляли с использованием трансформанта BL21(DE3) при 30°C.

(d) Очистка белка GST-Rep.

Осадок Escherichia coli суспендировали в 3 мл буфера для лизиса (4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,3, 0,1 мМ ZnCl₂, 5 мМ DTT) и обрабатывали ультразвуком. После солюбилизации белок GST-Rep был подтвержден с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, а затем этот белок центрифугировали и брали только супернатант. GST-связывающую смолу промывали 20-кратным объемом 1х промывочного буфера GST-Bind, затем переносили в 15-миллитровую коническую колбу и снова промывали 5 мл 1х промывочного буфера GST-Bind (4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,3) и центрифугировали при 400xg при 25°C в течение 5 мин, после чего супернатант осторожно удаляли. Супернатант, содержащий белок GST-Rep, полученный после обработки ультразвуком, как описано выше, фильтровали через 0,45 мкм-мембранный фильтр и добавляли к вышеуказанной предварительно обработанной смоле. Смесь встряхивали в течение ночи при 4°C для адсорбирования белка GST-AZP на смоле. Эту смолу помещали в колонку и промывали промывочным буфером (4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,1 мМ ZnCl₂), а затем элюировали элюирующим буфером (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 0,1 мМ ZnCl₂, 10 мМ восстановленного глутатиона). Проэлюированные фракции оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, а затем фракции, содержащие белок GST-Rep, собирали и концентрировали до общего объема 300 мкл на мембране для ультрафильтрации. Концентрацию белка определяли с использованием коммерчески доступного набора (Protein Assay ECL).

(e) Экспрессия гибридного белка GST-AZP.

Экспрессионный вектор, содержащий ген GST-AZP для гибридного белка AZP-глутатион-Sтрансфераза (GST), расположенный ниже промотора Т7, вводили в клетки Escherichia coli. Эти клетки Escherichia coli культивировали в жидкой среде LB-Amp (120 мл) до тех пор, пока OD₆₀o не составляла 0,65-0,75. После культивирования добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и культивирование продолжали еще 3 ч для индуцирования экспрессии белка GST-AZP. После индуцирования клетки Escherichia coli собирали центрифугированием и хранили при -80°C. Белок GST-AZP очищали способом, аналогичным способу, применяемому для очистки белка GST-Rep.

(f) Оценка способности AZP ингибировать расщепление под действием вирусного реплицирующегося белка.

К реакционному раствору, содержащему меченую ДНК (5 нМ), состоящую из 200 пар оснований, включая Rep-связывающий сайт (25 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 75 мМ NaCl, 2,5 мМ DTT), добавляли GST-AZP (или GST-RepN для проведения сравнительного эксперимента или GST для контрольного эксперимента), а затем содержимое смешивали и оставляли на 30 мин на льду. После этого к реакционной смеси добавляли GST-Rep и MgCl₂ в концентрациях 2 мкМ и 5 мМ соответственно и реакцию продолжали при 25°C.

- 13 031900

Через 30 мин реакцию прекращали добавлением 2 мкл 0,5 М EDTA, а затем смесь обрабатывали фенолом и осаждали этанолом. Образец, полученный путем растворения в 3 мкл загрузочного буфера (80% формамид, 10 мМ EDTA), подвергали электрофорезу в 8% денатурированном акриламидном геле.

2. Результаты.

(1) Оценка способности AZP связываться с последовательностью ДНК-мишени.

Способность очищенного AZP и RepN связываться с последовательностью ДНК-мишени оценивали в анализе со сдвигом геля. В этом эксперименте для проведения реакции связывания, к ³²Р-меченой ДНК добавляли указанный белок в различных концентрациях, а затем свободную ДНК и комплекс ДНК-белок разделяли в неденатурированном геле. Концентрацию белка определяли при отношении полос свободной ДНК и ДНК в комплексе с белком, составляющем 1:1 (что соответствовало константе диссоциации), и было обнаружено, что константа диссоциации AZP-2 только для TYLCV составляла 0,31 нМ (фиг. 9), а константа диссоциации AZP-3, направленного, главным образом, против геминивирусов, составляла менее чем 10 нМ (фиг. 10). При этом константа диссоциации RepN составляла 30 нМ (фиг. 11). В результате проведения этого эксперимента было выявлено, что способность сконструированных AZP-2 и AZP-3 связываться с последовательностью ДНК-мишени была выше, чем способность RepN к такому связыванию.

(2) Оценка способности AZP ингибировать расщепление под действием вирусного реплицирующегося белка.

Как показали результаты, проиллюстрированные на дорожках 4-7 на фиг. 12, очищенный GST-AZP только для TYLCV (AZP-2) эффективно ингибировал расщепление в ориджине репликации под действием Rep. Такое ингибирующее действие зависит от концентрации AZP, и полное ингибирование наблюдалось при концентрации 20 мкМ. С другой стороны, если RepN служит в качестве доминантной негативной формы Rep, то какого-либо ингибирования расщепления не наблюдалось (фиг. 12, дорожки 8-11). RepN имеет ДНК-связывающий домен, и совершенно очевидно, что он имеет абсолютно такой же ДНКсвязывающий домен, как и Rep, который необходим для ингибирования. В случае GST, какого-либо ингибирования расщепления не наблюдалось, как показал результат, представленный на дорожке 12. Поэтому, как показали результаты, проиллюстрированные на дорожках 4-7, совершенно очевидно, что ингибирующая расщепление активность GST-AZP обусловлена только присутствием AZP. Кроме того, аналогичным образом оценивали ингибирующую расщепление активность GST-AZP (AZP-3). Результаты представлены на фиг. 13.

Сравнительный пример 2.

1. Материалы и методы.

(1) Получение AZP-трансформированных томатов.

(a) Получение вектора для стабильной экспрессии AZP в растении.

Встраивание гена, кодирующего AZP-2, в геном растения осуществляли методом с использованием агробактерий. Для проведения эксперимента на протопластах, pUC35SO-TYLCV3/4/6 получали из pUC35SO-MCS методом, проиллюстрированным на фиг. 14, и область, содержащую промотор 35S, ген AZP и терминатор NOS, вырезали из этой плазмиды ферментами EcoRI и HindIII. Фрагмент очищали на агарозном геле и клонировали в бинарную плазмиду pBI121 в EcoRI/HmdnI-сайты с получением pBI-OTYLCV3/4/6. Правильность нуклеотидной последовательности подтверждали путем секвенирования. Ту же самую процедуру также осуществляли для AZP-3.

(b) Культивирование томата сорта Микротом.

Каждую лунку 72-луночного пластикового планшета заполняли окультуренной почвой, которую слегка увлажняли с использованием сосуда для орошения, а затем в почву в каждой лунке высевали одно зерно томата Микротом, которое затем покрывали небольшим количеством влажной земли, и весь планшет обертывали оберточной пленкой Saran. Затем планшет помещали в камеру с искусственным климатом (день: 25°C, 16 ч; ночь: 22°C, 8 ч) и осуществляли культивирование. Когда наблюдалось прорастание семян, оберточную пленку Saran снимали и культивирование продолжали в тех же условиях. Через две недели после посева каждый проросток переносили в пластиковый горшок диаметром 12 см и культивировали до сбора семян.

(c) Получение семян Микротом.

Созревшие красные плоды Микротома собирали, каждый плод разрезали ножом на две части по средней линии, а затем все семена собирали в 50-миллилитровую пластиковую пробирку с помощью шпателя. Семена слегка промывали водой, а затем промывали 1% водной соляной кислотой в течение 10 мин для растворения желатиновых слоев вокруг семян. Затем семена промывали проточной водой в течение 10 мин, избыточную влажность удаляли бумажным полотенцем и семена сушили на воздухе при комнатной температуре в течение двух дней. Высушенные семена хранили при 4°C.

(d) Перенос гена в семядолю томата Микротом.

10-20 семян томата Микротома стерилизовали в среде Хейтера (Као), разведенной до 10%, и 4 раза промывали стерилизованной водой. Эти семена выращивали в посевной среде (в 1х среде МурашигаСкуга (MS), 15 г/л сахарозы, 3 г/л гельрита), уложенной в ящик для выращивания растений, и культивирование продолжали в течение 6 дней при температуре 25°C и в режиме дневного освещения 16 ч. От- 14 031900 дельные растения, имеющие настоящие листья, достигшие размера приблизительно несколько миллиметров, использовали для трансформации.

За один день до инфицирования бактерией Agrobacterium глицериновый маточный раствор (20 мкл) бактерии Agrobacterium C58C1RifR (GV2260), трансформированной pBI-OTYLCV3/4/6, инокулировали в 2 мл среды LB (содержащей 100 мг/л канамицина и 50 мг/л ампициллина) и культивирование осуществляли при 30°C в течение 24 ч. На день инфицирования суспензию клеток бактерии Agrobacterium (1 мл) помещали в пробирку Эппендорфа, а затем клетки собирали путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 5 мин. Эти клетки суспендировали в 40 мл среды MS, содержащей 100 мкМ ацетосирингона и 10 мкМ меркаптоэтанола.

Семядолю томата Микротом вырезали бритвой и разрезали, начиная с верхушки, приблизительно на две равные части. Эти срезы семядоли погружали в вышеупомянутую суспензию бактерии Agrobacterium и оставляли на 10 мин для инфицирования. Затем срезы семядоли помещали на стерилизованное полотенце Kimtowel для абсорбции избытка суспензии и помещали в среду для совместного культивирования (среда для культивирования: 1х MS, 30 г/л сахарозы, 3 г/л гельрита, 1,5 мг/л третзеатина, 40 мкМ ацетосирингона, 0,1% MES, рН 5,7). Крышку сосуда для культивирования герметично закрывали хирургической повязкой и культивирование продолжали при 25°C с использованием алюминиевой фольги для защиты от действия света. Через 3-4 дня инфицированные срезы семядоли переносили в среду для индуцирования образования каллуса (1х MS, 30 г/л сахарозы, 3 г/л гельрита, 1,5 мг/л третзеатина, 100 мг/л канамицина, 667 мг/л аугментина, 0,1% MES, рН 5,7). Образование каллусов из части инфицированных срезов семядоли происходило приблизительно в течение двух недель, а некоторые из них давали побеги.

Каллусы субкультивировали в свежей среде для индуцирования образования каллусов через каждые две недели. Отдельное растение, которое было выращено из каллуса и имело 3-4 листа и из которого вырезали часть семядоли в виде среза, переносили в среду для индуцирования образования побегов (среду SIM, которая была эквивалентна среде CIM, но в которой концентрация трет-зеатина была снижена до 1,0 мг/л) в целях стимуляции роста побегов. Когда длина побегов составляла 1-2 см, их отделяли от каллуса в самом основании побега и субкультивировали в среде для укоренения (в среде RIM, эквивалентной среде 1/2х MS, 3 г/л гельрита, 50 мг/л канамицина, 375 мг/л аугментина, 0,1% MES, рН 5,7). У отдельных растений, которые давали корни в течение двухнедельного культивирования в среде для укоренения, эти корни отрезали и субкультивировали в среде для укоренения, плотно уложенной в ящики для выращивания растений в целях проведения второго отбора на укоренение. Отдельные растения, которые давали корни в ящиках для выращивания растений, использовали на следующей стадии кондиционирования.

Отдельные растения, которые не давали корни в течение двухнедельного культивирования в первой среде для укоренения (в планшете) и концы которых были осторожно отрезаны, субкультивировали на свежей среде для укоренения в целях повторного индуцирования образования корней. Отдельные растения, у которых наблюдалось образование корней в среде для укоренения, помещенной в ящики для культивирования растений, высевали в почву для получения плодов и семян. Эти отдельные растения кондиционировали путем медленного снижения влажности во избежание увядания, вызываемого изменением влажности окружающей среды и т.п. В частности, увлажненную почву помещали в ящик для культивирования растений, и в этот ящик высевали отдельные растения с корнями. Эти растения сначала помещали в условия высокой влажности, а затем влажность снижали путем постепенного приоткрывания крышки. Растения, которые были в достаточной степени кондиционированы в ящике для культивирования растений в течение приблизительно одного месяца, сажали в чашки и культивировали.

Подтверждение получения растений после второго отбора на укоренение осуществляли с помощью ПЦР для того, чтобы определить наличие встроенного гена-мишени. Один настоящий лист приблизительно в 5 мм отрезали и геномную ДНК экстрагировали методом СТАВ. Перенос гена подтверждали ПЦР-методом с использованием 1 мкл раствора геномной ДНК, суспендированной в 300 мкл ТЕ. Был сконструирован набор праймеров, которые были использованы для амплификации гена резистентности к канамицину (гена NPT2) и амплификации области, содержащей искусственно транскрибированный ген и терминатор NOS.

(e) Экстракция белков из трансформантов.

Каждый лист трансформированного растения размером от 1 до 2 см собирали в микропробирку. Эти листья замораживали путем добавления жидкого азота, а затем измельчали пестиком для гомогенизации. После испарения жидкого азота к остатку добавляли 200 мкл ДСН-буфера для образцов (0,125 М трис-HCl (рН 6,8), 4% ДСН, 20% глицерин, 0,01% ВРВ, 10% 2-ME) и снова измельчали. Полученную смесь оставляли на 10 мин при 95°C, а затем центрифугировали и супернатант переносили в новую микропробирку. Этот образец использовали в качестве белков, экстрагированных из растения.

- 15 031900 (f) Вестерн-блот-анализ.

Экстрагированный белок (1 мкл) подвергали электрофорезу в 12% полиакриламидном геле с ДСН. При этом одновременно подвергали электрофорезу маркер молекулярной массы для вестерн-блотанализа белков (Perfect Protein Western Marker) (Novagen). Белки подвергали блоттингу из акриламидного геля на ПВДФ-мембрану, а затем белки подтверждали с использованием реагента Ponceau S. Мембрану встряхивали вместе с блокирующим раствором (5% сепарированное молоко, 0,05% твин 20, PBS), а затем подвергали реакции с меченным пероксидазой анти-НА антителом. Также одновременно проводили реакцию с антителом для маркера молекулярной массы, а именно ПХ-антителом против S-белка. Рентгеновскую пленку экспонировали с использованием хемилюминесцентной системы ЭХЛ и детектировали сигналы. Экспрессию AZP в трансформированном растении подтверждали исходя из размера и интенсивности сигналов.

(2) Эксперимент по инфицированию вирусом.

(a) Получение плазмиды для инфицирования вирусом.

Инфицирование вирусом осуществляли с использованием инфекционности бактерий Agrobacterium. Для введения копии вирусного генома, имеющей два ориджина репликации, в бинарную плазмиду получали нужные плазмиды путем проведения двух стадий, описанных ниже для двух видов вирусов, TYLCV и аттенюированного TYLCV. Аттенюированный TYLCV отличался от TYLCV наличием последовательности прямых повторов, с которой связывается Rep, и этот вирус был оценен на возможность его применения для общей оценки геминивирусов.

ДНК-фрагмент, соответствующий 0,5 копии, содержащей ориджин репликации, амплифицировали из геномной ДНК вируса TYLCV с помощью ПЦР и клонировали в бинарную плазмиду pBI121 в EcoRI/HindШ-сайты с получением pBI-TYLCV (0,5). Правильность нуклеотидной последовательности подтверждали путем секвенирования. При клонировании ПЦР-амплифицированной ДНК в целях введения ДНК-фрагмента, соответствующего одной копии TYLCV, необходимо подтвердить нуклеотидную последовательность полученной плазмиды. Однако нужная плазмида содержит 1,5 копий вирусного генома, а поэтому необходимо, чтобы она имела перекрывающуюся область ДНК, а значит, правильность нуклеотидной последовательности не может быть подтверждена путем секвенирования. Поэтому было принято решение ввести только 1 копию вирусного генома в клонирующую плазмиду pBluescript II KS+, а затем подтвердить всю нуклеотидную последовательность и снова ввести ДНК-фрагмент, вырезанный посредством рестриктирующего фермента, в pBI-TYLCV (0,5) без проведения ПЦР.

ДНК-фрагмент, соответствующий 1 копии, содержащей ориджин репликации, амплифицировали с помощью ПЦР из вирусной геномной ДНК TYLCV и клонировали в pBluescript II KS+ в PstI/HindIIIсайты с получением плазмиды pBS-TYLCV. Правильность нуклеотидной последовательности подтверждали путем секвенирования. Затем ДНК-фрагмент, соответствующий 1 копии вирусного генома, вырезали из плазмиды pBS-TYLCV ферментами BsrGI и HindIII, очищали на агарозном геле, клонировали в плазмиду pBI-TYLCV (0,5) в BsrGI/HindIII-сайты и, наконец, получали нужную плазмиду pBI-TYLCV (1,5). Ту же самую процедуру осуществляли для аттенюированного TYLCV и, наконец, получали нужную плазмиду pBI-аттенюированный TYLCV (1,5).

(b) Подтверждение инфекционности плазмиды, используемой для инфицирования вирусом.

Были получены компетентные клетки бактерии Agrobacterium C58C1RifR (GV2260). В эти компетентные клетки был введен полученный бинарный вектор, содержащий 1,5 копии генома TYLCV или генома аттенюированного TYLCV, а затем приготавливали глицериновый маточный раствор бактерии Agrobacterium для агроинокуляции и этот раствор хранили при -80°C. За один день до инфицирования томатов дикого типа вышеуказанный глицериновый маточный раствор инокулировали в 6 мл среды LB (содержащей 100 мг/л канамицина и 50 мг/л ампициллина) и культивирование осуществляли при 30°C в течение одних суток. Затем клетки бактерии Agrobacterium собирали и суспендировали в 1 мл буфера. Эту суспензию вводили в семядолю проростков приблизительно через 10 дней после посева для инфицирования растений. После инфицирования отдельные растения наблюдали через определенные промежутки времени и регулярно детектировали вирусную ДНК в листьях. Образцы ДНК, используемые для этих целей, получали, как описано выше, и путем проведения анализа ПЦР-продукта, полученного с использованием набора праймеров, специфичных к каждому TYLCV, оценивали инфицирование вирусом на молекулярном уровне.

(3) Оценка резистентности к TYLCV-инфицированию.

Суспензию бактерии Agrobacterium, несущей вирусный бинарный вектор, инъецировали в проростки, полученные от трансформанта T3, и симптомы инфекции наблюдали на макроскопическом уровне в течение определенного периода времени. Затем из листьев инфицированных томатов экстрагировали ДНК и подтверждали пролиферацию вируса в целом растении с помощью ПЦР с применением метода, описанного в предыдущем разделе.

2. Результаты.

(1) Получение AZP-трансформированных томатов.

Каждый ген AZP вводили в томаты Микротом с использованием бактерии Agrobacterium. Бактерии Agrobacterium, трансформированные бинарным вектором, имеющим AZP-экспрессирующие класте- 16 031900 ры, представленные на фиг. 15, использовали для инфицирования срезов семядоли и введения гена.

Затем индуцировали образование каллуса с использованием среды, содержащей канамицин, после чего индуцировали образование побегов и корней. Во время индуцирования образования корней отдельные растения, дающие корневую систему, глубоко проникающую в агаровую среду, отбирали для последующего отбора трансформантов, кондиционировали и высаживали в почву для выращивания трансформантов.

С помощью ПЦР было подтверждено, что эти трансформанты Т1 имели ген AZP. Для детектирования гена резистентности к канамицину и гена AZP осуществляли ПЦР с использованием набора ПЦРпраймеров, представленных на фиг. 16 (на данной фигуре эти праймеры указаны оранжевыми и синими стрелками соответственно). Оба этих гена были детектированы в полученных трансформантах, как показано на фиг. 17, и было подтверждено, что процедура трансформации была осуществлена успешно. Затем проводили дополнительное подтверждение с использованием другого набора праймеров (показанных на фиг. 18 розовыми стрелками), в результате чего было определено, что вся область AZPэкспрессирующего кластера была встроена в геном томатов. Было подтверждено, что вся область AZPэкспрессирующего кластера, простирающаяся от промотора 35S до терминатора NOS, была введена в геном растения, как показано на фиг. 19.

(2) Получение растений Т2 и T3 и анализ каждой линии.

Число копий гена AZP в полученном растении Т1 определяли путем подсчета числа отдельных растений Т2, в которые был встроен ген AZP, и проведения анализа с применением критерия хи-квадрат. В частности, в отдельных растениях Т2, полученных путем сбора семян Т2 от каждой линии Т1 и их посева, присутствие или отсутствие гена AZP определяли с помощью ПЦР. Результаты для растений Т2, полученных путем введения AZP-2, представлены на фиг. 19 для одной линии в качестве примера. С помощью ПЦР было подтверждено, как показано, например, на фиг. 19, что из 18 отдельных растений Т2, полученных из специфической линии Т1, 13 отдельных растений имели ген AZP, и в этом случае соотношение расщепления составляло 13:5. Если линия Т1 имела 1 копию гена AZP, то соотношение расщепления становилось равным 3:1. Таким образом, если предположить, в случае применения критерия хиквадрат, что была введена 1 копия, то величина хи-квадрат будет составлять 0,074, а критическое значение для Р=0,01 будет составлять 6,63, а поэтому нулевая гипотеза не может быть отвергнута. С другой стороны, если допустить, что было введено 2 копии, то величина хи-квадрат будет составлять 14,2, что превышает критическое значение, а поэтому нулевая гипотеза может быть отвергнута. Исходя из результатов вышеописанного анализа, можно утверждать, что линия Т1 имела 1 встроенную копию. Отбор растений на 1 встроенную копию также осуществляли для других отдельных растений Т1 (фиг. 20).

Кроме того, экспрессию AZP в трансформантах, полученных в каждом из этих экспериментов, подтверждали с помощью вестерн-блот-анализа. К AZP-экспрессирующему кластеру, используемому в каждом эксперименте, предварительно присоединяли эпитопную НА-метку для того, чтобы экспрессия белка AZP в каждом трансформанте была успешно подтверждена с помощью вестерн-блот-анализа с использованием анти-НА антитела. Как показано на фиг. 21, было подтверждено, что белок AZP экспрессировался на высоком уровне также в растениях Т2, в которые был введен AZP-2.

Для того чтобы подтвердить, содержит ли каждая линия Т2, полученная от растения Т1, встроенную 1 копию гена AZP, определяли гомозиготность или гетерозиготность с помощью ПЦР-анализа проростков растения T3, полученных от каждого растения Т2. Исходя из ПЦР-анализа образцов ДНК, экстрагированных из листьев проростков T3, полученных от каждой линии Т2 (для каждой линии были использованы проростки приблизительно от 20 растений), в том случае, если было подтверждено, что все проростки сохраняли ген AZP, можно сделать вывод, что родительское растение, линия Т2, является гомозиготным (если соотношение расщепления составляет 1:3, то родительское растение, линия Т2, является гетерозиготным). Поскольку все растения T3, полученные от одной и той же линии Т2, содержали ген AZP, то было обнаружено, что такая линия Т2 является гомозиготной (фиг. 22). С помощью статистического анализа было также подтверждено, что это растение является гомозиготным. Кроме того, с помощью вестерн-блот-анализа было также подтверждено, что AZP экспрессировался также в растениях T3 (фиг. 23). Тот же самый анализ был проведен для растений, трансформированных AZP-3 с использованием проростков ТЗ, полученных от каждого растения Т2, и были получены аналогичные результаты.

	AZP-2
Растение Т1 нормального типа	19
Т1 с одной встроенной копией	12
Т1 с множеством встроенных копий	2
(Т1 с неидентифицированным числом копий)	(5)
Т1, продуцирующие гомозиготные Т2	6
Т1, не продуцирующие гомозиготные Т2	1
(Т1, не идентифицированные как гомозиготные)	(5)

Примечание: Результат для линии Т1, продуцирующей гомозиготные Т2 был получен путем ана- 17 031900 лиза Т1 с 1 встроенной копией.

(3) Получение бинарной плазмиды TYLCV и подтверждение ее инфекционной способности.

Было проведено исследование для того, чтобы определить, можно ли инфицировать томаты Микротом методом агроинокуляции. Была предпринята попытка инфицировать множество растений Микротом дикого типа вирусом TYLCV путем введения в указанные растения бактерии Agrobacterium, содержащей геном TYLCV. Этот тест проводили несколько раз, и каждый раз инфицирование успешно достигалось с высокой эффективностью. На 10-й день после инфицирования наблюдалось сморщивание молодых листьев, характерное для инфекции, вызываемой вирусом TYLCV. У уже выросших растений наблюдалась явная курчавость и пожелтение листьев, что является характерными симптомами инфицирования вирусом TYLCV. У отдельных инфицированных растений наблюдалось явное ингибирование роста (фиг. 24), и хотя у многих отдельных растений наблюдалось появление цветков, однако вероятность образования плодов была крайне мала.

Инфицирование вирусом TYLCV, осуществляемое методом агроинокуляции, было также подтверждено на молекулярном уровне. После подтверждения инфекции листья собирали на каждой стадии роста, и во всех инфицированных листьях с помощью ПЦР была успешно детектирована геномная ДНК TYLCV. Кроме того, при проведении того же самого эксперимента для аттенюированного TYLCV симптомы инфекции были менее выраженными, чем в случае TYLCV. В частности, симптомами на ранних стадиях инфицирования являются лишь потеря окраски на периферических участках листьев, в этом случае возникают трудности в определении наличия инфекции по фенотипам. Поэтому, помимо определения по фенотипам, может быть осуществлено более точное определение путем идентификации репликации аттенюированного TYLCV у инфицированных растений на молекулярном уровне с помощью ПЦР.

(4) Приобретение резистентности к TYLCV-инфекции, достигаемое посредством экспрессии AZP.

Растения T3, полученные от гомозиготных линий Т2, каждая из которых происходила от 3 отдельных растений Т1, полученных путем введения AZP-2 (см. таблицу), инфицировали вирусом TYLCV с применением способа, описанного выше. Как показано на фиг. 25, сморщивание и пожелтение листьев, наблюдаемое у инфицированных растений дикого типа (на этой фигуре показано слева), не обнаруживалось у трансформированных томатов. Резистентность к инфекции также оценивали на молекулярном уровне с помощью ПЦР. Как показано на фиг. 26, ни одна из вирусных ДНК не детектировалась в гомозиготах T3. Кроме того, вирусная ДНК не детектировалась ни в гомозиготах, ни в гетерозиготах, а поэтому пролиферации данного вируса не наблюдалось.

Кроме того, если растения T3, происходящие от одного растения Т1, полученного путем введения AZP-3, были инфицированы вирусом TYLCV с применением способа, описанного выше, то сморщивание и пожелтение листьев, наблюдаемое у инфицированных растений дикого типа, не обнаруживалось у трансформированных томатов, как показано на фиг. 27. Кроме того, вирусная ДНК не детектировалась ни в одном из трансформантов, полученных с использованием AZP-3, как показано на фиг. 28.

Пример 1.

(1) Конструирование AZP, который нацелен на WDV.

Каждый из белков цинковый палец, который распознает нижеследующие соответствующие области ДНК двух видов, был сконструирован исходя из невырожденного кода распознавания, представленного в таблице, имеющейся в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии (KOHYO) № 2004-519211.

(a) Область стебля, расположенная выше, и ее фланкирующая область.

(b) Область стебель-петля.

(c) Область стебля, расположенная ниже, и ее фланкирующая область.

AZP-11 конструировали путем последовательного присоединения десяти доменов цинковые пальцы так, чтобы они могли распознавать 31 пару оснований, представленных на фиг. 30. AZP-12 конструировали путем последовательного присоединения 12 доменов цинковые пальцы так, чтобы они могли распознавать 37 пар оснований, представленных на фиг. 30 (AZP-12 конструировали на основе последовательности антисмысловой цепи). AZP-13 конструировали путем последовательного присоединения девяти доменов цинковые пальцы так, чтобы они могли распознавать 28 пар оснований, представленных на фиг. 30.

(2) Получение AZP-экспрессирующих плазмид.

AZP-11 получали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 31. Сначала гены для трех связанных вместе цинковых пальцев синтезировали с помощью ПЦР, а затем каждый из них клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-21а Escherichia coli (Novagen) в BamHI/HmdШ-сайты, и нуклеотидные последовательности полученных плазмид подтверждали, в результате чего были получены плазмиды pET-WDV3-1, pET-WDV3-2 и pET-WDV3-3. Затем три гена AZP цинковых пальцев в pET-WDV3-2 и pET-WDV3-3 амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали с получением pET-WDV6. Был получен ген цинкового пальца, который распознает 5'-GGGT-3', и этот ген был лигирован с тремя генами цинковых пальцев AZP в pET-WDV3-1 методом, описанным выше для получения pET-WDV4. И наконец, после амплификации шести генов цинковых пальцев AZP и четырех генов цинковых пальцев AZP из

- 18 031900 pET-WDV4 и pET-WDV6 с помощью ПЦР соответственно и их последующего лигирования получали плазмиду (pET-WDV10), кодирующую AZP-11, который распознает непрерывный фрагмент из 31 нуклеотида, включая вышерасположенную область стебля и ее фланкирующую область.

AZP-12 получали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 32. Сначала гены для трех связанных вместе цинковых пальцев синтезировали с помощью ПЦР, а затем каждый из них клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-21а Escherichia coli (Novagen) в BamHI/HindШ-сайты, и нуклеотидные последовательности полученных плазмид подтверждали, в результате чего были получены плазмиды pET-WDV3-4, pET-WDV3-5, pET-WDV3-6 и pET-WDV3-7. Затем три гена AZP цинковых пальцев в pET-WDV3-4 и pET-WDV3-5 амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали с получением pET-WDV6-2. Кроме того, три гена AZP цинковых пальцев в pET-WDV3-6 и pET-WDV3-7 амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали с получением pET-WDV6-3. И наконец, после амплификации шести генов цинковых пальцев AZP из рЕТ-WDV6-2 и pET-WDV6-3 с помощью ПЦР и их лигирования получали плазмиду (pET-WDV12), кодирующую AZP-12, который распознает непрерывный фрагмент из 37 нуклеотидов, включая вышерасположенную область стебля и ее фланкирующую область.

AZP-13 получали в соответствии со схемой, представленной на фиг. 33. Сначала гены для трех связанных вместе цинковых пальцев синтезировали с помощью ПЦР, а затем каждый из них клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-21а Escherichia coli (Novagen) в BamHI/HindnI-сайты, и нуклеотидные последовательности полученных плазмид подтверждали, в результате чего были получены плазмиды pET-WDV3-8, pET-WDV3-9 и pET-WDV3-10. Затем три гена AZP цинковых пальцев в pET-WDV3-9 и pET-WDV3-10 амплифицировали с помощью ПЦР и лигировали с получением pET-WDV6-4. И наконец, после амплификации шести генов цинковых пальцев AZP из pET-WDV6-4 с помощью ПЦР и их лигирования получали плазмиду (pET-WDV9), кодирующую AZP-13, который распознает 28 нуклеотидов области стебель-петля.

Пример 2.

1. Материалы и методы.

(1) Получение экспрессионного вектора для стабильной экспрессии AZP в растении.

Каждый из генных фрагментов, кодирующих AZP11 и AZP12, которые были сконструированы, как описано выше в примере 1, встраивали в бинарный вектор pUBIN-ZH2 в соответствующие сайты ферментативного расщепления области множественного клонирования. Бинарный вектор pUBIN-ZH2 соответствует производному плазмиды pPZP202 (P. Hajdukiewicz, Z. Svab, P. Maliga, Plant Molecular Biology, 25:989-994, 1994), в котором кластер, содержащий ген резистентности к гигромицину, расположенный между промотором 35S вируса мозаики цветной капусты и терминатором нопалин-синтазы, и экспрессионный генный кластер, имеющий сайт множественного клонирования, расположенный между промотором гена убихитина кукурузы (Plant Physiology, Vol. 100, 1992, Pages 1503-1507) и терминатором нопалин-синтазы, были встроены в молекулу Т-ДНК (фиг. 34). Как описано выше, были получены два вида экспрессионных векторов для стабильной экспрессии в растениях, содержащих AZP11 и AZP12.

(2) Введение гена AZP пшеницы в растение пшеницы с использованием бактерии Agrobacterium.

Бактерию Agrobacterium (штамм LBA4404) трансформировали трансформирующими векторами, полученными, как описано выше в (1), методом замораживания и оттаивания (Hofgen et al., Storage of competent cells for Agrobacterium transformation, Nucleic Acids Res., Oct 25; 16(20):9877, 1998). Кроме того, растение пшеницы (сорт Haruyokoi) было трансформировано с использованием трансформантов бактерии Agrobacterium, полученных вышеупомянутым методом. Для трансформации пшеницы был применен метод трансформации растений, описанный в патенте Японии № 4754968.

(3) Подтверждение встраивания в растение генерации Т0.

Отдельные трансформированные растения, полученные как описано в (2), переносили в горшки, содержащие окультуренную почву, и оставляли для роста при 23 °C в условиях длинного дня (период: день:ночь = 16 ч:8 ч). Присутствие введенного нужного гена было подтверждено с помощью ПЦР. После того как трансформированные растения генерации Т0 вырастали до стадии 6 листьев, приблизительно 5 мм одного настоящего листа вырезали и геномную ДНК экстрагировали методом СТАВ. Перенос гена подтверждали ПЦР-методом с использованием 1 мкл раствора геномной ДНК (10 нг/1 мкл). Был сконструирован набор праймеров, которые были использованы для амплификации области, содержащей промотор убихитина и AZP.

(4) Подтверждение встраивания гена в растение генерации Т1.

Отдельные растения генерации Т0, для которых результат ПЦР-анализа был подтвержден присутствием соответствующей полосы, культивировали и получали семена Т1. Полученные семена Т1 проращивали, после чего из листьев выращенных растений экстрагировали геном и осуществляли ПЦР. Эти процедуры проводили методами, описанными выше в (3).

(5) Экстракция РНК из трансформанта Т1 и синтез кДНК.

Листья (первый и второй листы) трансформантов растения генерации Т1 собирали в микропробирки и экстрагировали полноразмерную РНК с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Экстракцию осуществляли методом, описанным в инструкции, прилагаемой к набору. Из полученной полноразмерной РНК в количестве 1 мкг синтезировали кДНК с использованием набора для крупномас- 19 031900 штабного синтеза кДНК из РНК (High Capacity RNA-to-cDNA, зарегистрированный торговый знак) (Applied Biosystems).

(6) Подтверждение экспрессии встроенного гена (ОТ-ПЦР) в растении генерации Т1.

Экспрессию встроенного гена оценивали с помощью ПЦР с использованием 1 мкл раствора кДНК, полученного как описано в (5). ПЦР проводили в 30 циклов. Был сконструирован набор праймеров, которые были использованы для амплификации области, содержащей AZP. Кроме того, путем анализа последовательности было подтверждено, что полученная полоса соответствует фрагменту AZP.

2. Результаты.

(1) Получение AZP-трансформированной пшеницы.

Каждый из генов AZP встраивали в растение пшеницы с использованием бактерии Agrobacterium. Бинарный вектор, имеющий AZP-экспрессирующий кластер, получали путем введения каждого гена AZP в бинарный вектор, показанный на фиг. 34, и семена пшеницы инфицировали бактерией Agrobacterium, трансформированной этим вектором для встраивания гена. Семена, подвергнутые такой трансформации, переносили в горшки, содержащие окультуренную почву, и оставляли для роста при 25°C в условиях длинного дня (в режиме: день:ночь = 16 ч:8 ч).

(2) Подтверждение встраивания гена в растение генерации Т1.

Семена, полученные от отдельных растений, подвергнутых трансформации (семена Т1), проращивали, и с помощью ПЦР было подтверждено, что культивированные растения генерации Т1 имели ген АТР. Для амплификации фрагмента промотора убихитина и AZP осуществляли ПЦР с использованием набора ПЦР-праймеров, представленных на фиг. 35. Поскольку нужный фрагмент детектировали в нескольких растениях (№ 4, 5 и 7), как показано на фиг. 36, то необходимо было подтвердить, что процедура трансформации прошла успешно. Кроме того, с помощью анализа последовательностей было подтверждено, что полученный фрагмент представляет собой фрагмент промотора убихитина и гена AZP.

(3) Подтверждение экспрессии встроенного гена (ОТ-ПЦР) в растении генерации Т1.

Кроме того, экспрессию AZP в каждом трансформанте подтверждали с помощью ОТ-ПЦР. Был сконструирован набор праймеров, которые были использованы для амплификации области, содержащей AZP (фиг. 37). Как показано на фиг. 38, необходимо было подтвердить, что AZP экспрессируется на высоком уровне в растениях Т1, в которые были введены AZP11 или AZP12. Кроме того, с помощью анализа последовательностей было подтверждено, что полученный фрагмент представляет собой фрагмент гена AZP.

Пример 3.

1. Материалы и методы.

(1) Конструирование плазмиды для инфицирования вирусом WDV.

WDV типа Yunnnan Kunming (регистрационный номер: EU541489) был использован для инфицирования. Бинарная WDV-содержащая плазмида для инфицирования была сконструирована в три стадии, как описано ниже.

Сначала ДНК-фрагмент, соответствующий одной копии WDV, клонировали в клонирующую плазмиду pBluescript II KS+. То есть, ДНК-фрагмент, соответствующий одной копии WDV, реконструировали и синтезировали из синтетического ДНК-олигомера с помощью ПЦР, а затем ДНК-концы гидролизовали ферментами BsaI и HindIII, и полученный ДНК-фрагмент клонировали в pBluescript II KS+ в Acc65I/HindШ-сайтах с получением pBS-WDV. Правильность нуклеотидной последовательности подтверждали путем секвенирования.

Затем ДНК-фрагмент, соответствующий 0,5 копии, включая ориджин репликации, амплифицировали с помощью ПЦР из вирусной геномной ДНК WDV на PBS-WDV и клонировали в бинарную плазмиду pBI121 в ClaI/EcoRI-сайты, с получением pBI-WDV(0.5). Правильность нуклеотидной последовательности подтверждали путем секвенирования.

При клонировании ДНК, амплифицированной с помощью ПЦР, необходимо было подтвердить нуклеотидную последовательность полученной плазмиды. Однако при введении ДНК-фрагмента, соответствующего одной копии WDV, нужная плазмида будет содержать 1,5 копии вирусного генома, а поэтому она будет иметь перекрывающуюся область ДНК, и, следовательно, правильность нуклеотидной последовательности не может быть подтверждена путем секвенирования. В соответствии с этим ДНКфрагмент, вырезанный из полученной pBS-WDV рестриктирующими ферментами без проведения ПЦР, вводили в pBI-WDV (0,5). Более конкретно, ДНК-фрагмент, соответствующий одной копии вирусного генома, вырезали из pBS-WDV ферментами BsiWI и HindIII, очищали на агарозном геле, а затем клонировали в pBI-WDV (0,5) в BsiWI/HindIII-сайты и, наконец получали нужную плазмиду pBI-WDV (1,5).

(2) Инфицирование вирусом WDV.

Были получены компетентные клетки бактерии Agrobacterium C58C1RifR (GV2260). Полученную бинарную плазмиду, содержащую 1,5 копии генома WDV, встраивали в компетентные клетки, а затем приготавливали глицериновый маточный раствор бактерии Agrobacterium для агроинокуляции и хранили при -80°C. За один день до инфицирования пшеницы этот глицериновый маточный раствор инокулировали в 6 мл среды LB (100 мг/л канамицина и 50 мг/л ампициллина) и культивирование осуществляли при 30°C в течение целого дня и ночи. Затем клетки бактерии Agrobacterium собирали и суспендировали

- 20 031900 в 1 мл буфера. Эту суспензию инъецировали в стебель проростков приблизительно через 20 дней после посева культуры для ее инфицирования. После инфицирования детектировали вирусную ДНК в листьях растения. Образцы ДНК для этих целей получали, как описано выше, и инфицирование вирусом оценивали на молекулярном уровне с помощью анализа ПЦР-продукта, осуществляемого с использованием набора праймеров, специфичных к WDV типа Yunnnan Kunming.

(3) Оценка резистентности к инфицированию вирусом WDV.

Суспензию клеток бактерии Agrobacterium, несущих бинарную плазмиду вируса WDV, инъецировали в проростки растения-трансформанта Т1, полученного путем введения гена AZP11 или AZP12. Из листьев инфицированной пшеницы экстрагировали ДНК, и пролиферацию вируса в растении подтверждали с помощью ПЦР методом, описанным в предыдущем разделе.

2. Результаты.

(1) Конструирование бинарной плазмиды WDV и подтверждение инфицирования вирусом.

Был проведен анализ, для того чтобы подтвердить, можно ли осуществить инфицирование пшеницы методом агроинокуляции. Бактерию Agrobacterium, имеющую геном WDV, инъецировали во множество растений пшеницы дикого типа (сорт: Haruyokoi) для стимуляции инфицирования вирусом WDV. На 20-й день после инъецирования бактерии Agrobacterium, молодые листья собирали и экстрагировали ДНК. С помощью ПЦР, проводимой с использованием такого образца ДНК, можно детектировать геномную ДНК WDV в собранных листьях растений пшеницы дикого типа, в которые была инъецирована бактерия Agrobacterium. Пример такого растения представлен на фиг. 39.

(2) Приобретение резистентности к инфицированию вирусом WDV посредством экспрессии AZP.

WDV инокулировали методом, описанным выше для трех растений, произвольно выбранных из трансформантов Т1, полученных путем введения гена AZP11 или AZP12, и на 20-й день после инокуляции собирали листья, затем эти листья детектировали с помощью ПЦР на присутствие геномной ДНК WDV. Как показано на фиг. 39, ни в одном из трансформированных растений пшеницы вирусная ДНК WDV не детектировалась и пролиферации этого вируса не наблюдалось.

Промышленное применение

Ингибитор репликации согласно изобретению может обладать высокоэффективным действием, направленным против WDV и других вирусов, принадлежащих к роду Mastrevirus. Поэтому такой ингибитор является очень эффективным средством для борьбы с различными вирусами, принадлежащими к роду Mastrevirus.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> SERA, Takashi <120> ИНГИБИТОР РЕПЛИКАЦИИ ГЕМИНИВИРУСА <130> 121668M <150> JP 2011-235960 <151> 2011-10-27 <160>10 <170> PatentIn version 3.1 <210>1 <211>283 <212> PRT <213> Искусственная <400>1 <400>1

Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro 15

Ser Ser Asp Leu Gln Glu His Gln 20

Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys

3540

Gln Thr His Gln Arg Thr His Thr

5055

Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln 6570

Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro

Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg

1015

Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro

2530

Ser Phe Ser Arg Ser Ser His Leu 45

Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro 60

Ser Asn His Leu Gln Arg His Gln 75 80

Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys

95

- 21 031900

Ser

Phe

Ser Glu 100

Ser Asp

Asp

Leu

Gln 105

Gln

His

Gln

Arg

Thr 110

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Thr

115

120

125

Ser

Thr

Ser

Leu

Gln

Gln

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

130

135

140

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Thr

Ser

Thr

Asn

Leu

145

150

155

160

Gln

Gln

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

165

170

175

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Thr

Ser

Thr

Asn

Leu

Gln

Thr

His

Gln

180

185

190

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

195

200

205

Ser

Phe

Ser

Arg

Ser

Asn

Asp

Leu

Gln

Glu

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

210

215

220

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Thr

225

230

235

240

Ser

Ser

Asn

Leu

Gln

Glu

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

245

250

255

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Glu

Ser

Ser

His

Leu

260

265

270

Gln

Arg

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

275

280

<210>

2

<211>

264

<212>

PRT

<213>

Искусственная

<400>

2

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Arg

1

5

10

15

Ser

Ser

Asp

Leu

Gln

Glu

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

20

25

30

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Arg

Ser

Ser

His

Leu

35

40

45

Gln

Thr

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

50

55

60

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Phe

Ser

Gln

Ser

Asn

His

Leu

Gln

Arg

His

Gln

65

70

75

80

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Cys

Pro

Glu

Cys

Gly

Lys

85

90

95

Ser

Phe

Ser

Glu

Ser

Asp

Asp

Leu

Gln

Gln

His

Gln

Arg

Thr

His

Thr

100

105

110

- 22 031900

Gly Glu

Ser Thr

130

Tyr Lys

145

Gln Gln

Ser Gly

Arg Ser

Pro Tyr

210

Leu Gln

225

Pro Glu

Gln Arg

Lys Pro

115

Ser Leu

Cys Pro

His Gln

Glu Lys

180

Asn Asp

195

Lys Cys

Glu His

Cys Gly

Thr His

260

Tyr Lys

Gln Gln

Glu Cys

150

Arg Thr

165

Pro Tyr

Leu Gln

Pro Glu

Gln Arg

230

Lys Ser

245

Thr Gly

Cys Pro

120

His Gln

135

Gly Lys

His Thr

Lys Cys

Glu His

200

Cys Gly

215

Thr His

Phe Ser

Glu Lys

Glu Cys

Arg Thr

Ser Phe

Gly Glu

170

Pro Glu

185

Gln Arg

Lys Ser

Thr Gly

Glu Ser

250

Gly Lys

His Thr

140

Ser Thr

155

Lys Arg

Cys Gly

Thr His

Phe Ser

220

Glu Lys

235

Ser His

Ser Phe

125

Gly Glu

Ser Thr

Thr Gly

Lys Ser

190

Thr Gly

205

Thr Ser

Pro Tyr

Leu Gln

Ser Thr

Lys Pro

Asn Leu

160

Thr Gly

175

Phe Ser

Glu Lys

Ser Asn

Lys Cys

240

Arg His

255 <210>3 <211>849 <212> ДНК <213> Искусственная <400>3 ggggagaagc cgtataaatg tccggaatgt ggtaaaagtt ttagccgtag ctctgatttg caggaacatc agcgtaccca taccggtgaa aaaccataca aatgtccaga gtgcggcaaa tctttctctc gttcttctca tcttcagact catcagcgta ctcacactgg cgagaagcct tacaagtgcc ctgaatgcgg gaagagcttt agtcaaagta atcatttaca acgtcaccaa cgcacgcaca cgggggagaa gccgtataaa tgtccggaat gtggtaaaag ttttagcgaa agcgatgatt tgcagcaaca tcagcgtacc cataccggtg aaaaaccata caaatgtcca gagtgcggca aatctttctc tacttctact tctcttcagc aacatcagcg tactcacact ggcgagaagc cttacaagtg ccctgaatgc gggaagagct ttagtactag tactaattta caacaacacc aacgcacgca cacgggggag aagccgtata aatgtccgga atgtggtaaa agttttagca cttctactaa tcttcagact caccaacgca cgcacacggg ggagaagccg tataaatgtc cggaatgtgg taaaagtttt agccgtagca atgatttgca ggaacatcag cgtacccata ccggtgaaaa accatacaaa tgtccagagt gcggcaaatc tttctctact tcttctaatc ttcaggaaca tcagcgtact cacactggcg agaagcctta caagtgccct gaatgcggga agagctttag tgaaagttct catttacaac gtcaccaacg cacgcacacg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

- 23 031900 ggggagaag

849

<210> 4
<211> 792 <212> ДНК <213> Искусственная <400> 4 ggggagaagc cgtataaatg	tccggaatgt	ggtaaaagtt	ttagccgtag	ctctgatttg	60
caggaacatc	agcgtaccca	taccggtgaa	aaaccataca	aatgtccaga	gtgcggcaaa	120
tctttctctc	gttcttctca	tcttcagact	catcagcgta	ctcacactgg	cgagaagcct	180
tacaagtgcc	ctgaatgcgg	gaagagcttt	agtcaaagta	atcatttaca	acgtcaccaa	240
cgcacgcaca	cgggggagaa	gccgtataaa	tgtccggaat	gtggtaaaag	ttttagcgaa	300
agcgatgatt	tgcagcaaca	tcagcgtacc	cataccggtg	aaaaaccata	caaatgtcca	360
gagtgcggca	aatctttctc	tacttctact	tctcttcagc	aacatcagcg	tactcacact	420
ggcgagaagc	cttacaagtg	ccctgaatgc	gggaagagct	ttagtactag	tactaattta	480
caacaacacc	aacgcacgca	cacgggggag	aagcgtacgg	gtaccggatc	cggggagaag	540
ccgtataaat	gtccggaatg	tggtaaaagt	tttagccgta	gcaatgattt	gcaggaacat	600
cagcgtaccc	ataccggtga	aaaaccatac	aaatgtccag	agtgcggcaa	atctttctct	660
acttcttcta	atcttcagga	acatcagcgt	actcacactg	gcgagaagcc	ttacaagtgc	720
cctgaatgcg	ggaagagctt	tagtgaaagt	tctcatttac	aacgtcacca	acgcacgcac	780

acgggggaga ag 792

Claims (10)

1. Ингибитор репликации вируса, принадлежащего к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, где указанный ингибитор содержит белок типа цинковый палец, который может специфически связываться с непрерывной последовательностью фрагмента полноразмерной ДНК области стебель-петля указанного вируса и ДНК, выбранной из фланкирующей области, связанной с указанной полноразмерной ДНК, и способен ингибировать образование структуры стебель-петля, причем указанный белок выбран из:

(a) белка, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, 6 или 7;

(b) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, 6 или 7, которая включает делецию, замену и/или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков, и обладающего, по существу, такой же ингибирующей репликацию вируса активностью, что и белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, 6 или 7;

(c) белка, аминокислотная последовательность которого на 70% или более гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 6 или 7 и который обладает, по существу, той же ингибирующей репликацию вируса активностью, что и белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, 6 или 7.

2. Ингибитор репликации по п.1, где указанный белок содержит 9-12 доменов цинковый палец.

3. Ингибитор репликации по п.1 или 2, где указанным вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus, является вирус карликовости пшеницы.

4. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок цинковый палец по любому из пп.1-3.

5. Рекомбинантный вектор для трансформации растения, содержащий нуклеиновую кислоту по п.4.

6. Композиция агрохимиката для борьбы с инфекцией, вызванной вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, содержащая белок по любому из пп.1-3 или нуклеиновую кислоту по п.4 в качестве активного ингредиента.

- 24 031900

7. Способ предупреждения инфицирования растения вирусом, принадлежащим к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, включающий стадию нанесения на растение профилактически эффективного количества белка по любому из пп.1-3 или нуклеиновой кислоты по п.4.

8. Растение, обладающее резистентностью к вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, способное экспрессировать белок по любому из пп.1-3.

9. Растение, обладающее резистентностью к вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus, трансформированное путем введения нуклеиновой кислоты по п.4, способное экспрессировать белок по любому из пп.1-3.

10. Способ придания растению резистентности к вирусу, принадлежащему к роду Mastrevirus семейства геминивирусов, включающий стадию трансформации указанного растения нуклеиновой кислотой по п.4.