BR112020005845A2

BR112020005845A2 - método de produção para células bacterianas

Info

Publication number: BR112020005845A2
Application number: BR112020005845-9A
Authority: BR
Inventors: Yasuyuki Morishita
Original assignee: Idemitsu Kosan Co., Ltd.
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2020-09-29
Also published as: JP2019058083A; EP3690025A4; MX2020003295A; TW201920650A; JP6996680B2; BR112020005845B1; KR102490149B1; US20200277564A1; BR112020005845B8; KR20200057018A; US11377632B2; WO2019059396A1; CN111133098A; CN111133098B; TWI757549B; CA3076989A1; EP3690025A1; CA3076989C

Abstract

A presente invenção provê um método para produzir células bacterianas, que compreende, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior. Consequentemente, as células bacterianas podem ser produzidas com boa produtividade enquanto suprimem o aparecimento de variantes que formam colônias anormais entre as bactérias obtidas depois da cultura.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO PARA CÉLULAS BACTERIANAS” Campo Técnico

[0001] A presente invenção se refere a um método para produzir células bacterianas com boa produtividade enquanto suprime a ocorrência e o crescimento de variantes formando colônias anormais, que podem ocorrer durante cultura líquida de múltiplos estágios de bactérias. Técnica Fundamental

[0002] Bactérias são usadas em vários campos tais como a produção de enzimas e substâncias úteis, produção de alimentos fermentados, decomposição de matéria orgânica, medicinas para distúrbios intestinais, pesticidas microbianos e fertilizantes microbianos.

[0003] Em qualquer campo, o cultivo de bactérias é requerido para a preparação de células bacterianas. Entretanto, existem casos onde variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia aparecem durante a cultura e crescem predominantemente em relação às células tendo as propriedades originais e assim as células perderam as propriedades úteis originais depois da conclusão da cultura.

[0004] Por exemplo, a Literatura Não Patentária 1 descreve um fenômeno observado no qual variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia etc., aparecem durante a passagem de diversos milhares de gerações de uma bactéria Bacillus no meio líquido e crescem em preferência às células originais, substituindo completamente deste modo as células originais. É presumido que um tal fenômeno seja causado pelo fato de que as variantes são especializadas em um ambiente de cultura específico para eliminar um sistema metabólico desnecessário e crescem predominantemente em relação às células originais.

[0005] A Literatura Não Patentária 2 descreve que uma variante deficiente na capacidade biossintética, que é deficiente na biossíntese de Bacilomicina L e Surfactina, de Bacillus subtilis cepa 916, exibe morfologia de colônia diferente daquela da cepa tipo selvagem. Bacilomicina L e Surfactina são conhecidos exibir efeitos de controle sobre algumas doenças de planta. Consequentemente, isto é considerado como um exemplo no qual uma mutação na morfologia de colônia e a perda de propriedades úteis estão ligadas.

[0006] Além disso, a Literatura Não Patentária 3 descreve um exemplo no qual a quantidade de produção de Itulina A é aumentada em uma cepa tendo morfologia de colônia alterada comparada com a cepa precursora no curso de reprodução para realçar a atividade antibacteriana da cepa G3 de Bacillus subtilis.

[0007] A Literatura Não Patentária 4 descreve que com respeito à Aneurinibacillus migulanus (classificação antiga: Bacillus brevis) cepa ATCC 9999, seis tipos de morfologia de colônia foram detectados na cepa do depósito da coleção de cultura e diferiram na produtividade de Gramicidina S.

[0008] Literatura Não Patentária 5 descreve um exemplo no qual as cepas de morfologia de colônia variante de Bacillus subtilis cepa VT30M e Bacillus licheniformis cepa VT3 exibiram produtividade de enzima e resistência a antibiótico diferindo daquelas das cepas tipo selvagem. Lista de Citação Literatura Não Patentária

[0009] [Literatura Não Patentária 1] Biotechnology progress 2005, 21, 4, 1026- 1031 [Literatura Não Patentária 2] Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 4 1897- 1910 [Literatura Não Patentária 3] Zhiwu Bingli Xuebao 2008, 38, 2, 185-191 [Literatura Não Patentária 4] Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 20, 6620- 6628 [Literatura Não Patentária 5] Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 3026-3028 Sumário da Invenção

[0010] Como descrito acima, na cultura líquida, particularmente cultura líquida de múltiplos estágios de bactérias é problemática em que variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia aparecem durante a cultura, crescem predominantemente em relação às células tendo propriedades originais e assim as propriedades úteis originais das células podem ser prejudicadas depois da conclusão da cultura. Nenhuma técnica eficiente para suprimir um tal fenômeno não foi relatada até agora.

[0011] Portanto, um objetivo da presente invenção é prover um novo método para produzir células bacterianas com boa produtividade enquanto suprime o aparecimento de variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia entre as células bacterianas obtida depois da cultura em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias.

[0012] Como um resultado de estudos intensivos para se alcançar o objetivo acima, o presente inventor descobriu que as células bacterianas podem ser produzidas com boa produtividade enquanto significantemente reduz o aparecimento de variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia dentre uma população bacteriana obtida depois da conclusão da cultura, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios, cultivando-se uma bactéria usando um meio contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo-se a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que no estágio anterior. Consequentemente, o presente inventor completou a presente invenção.

[0013] A presente invenção é como segue.

[0014] [1] Um método para produzir células bacterianas, compreendendo, em uma processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final a um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior.

[0015] [2] O método de acordo com [1], em que a bactéria é uma bactéria formadora de esporo.

[0016] [3] O método de acordo com [2], em que a bactéria formadora de esporo pertence ao gênero Bacillus.

[0017] [4] O método de acordo com [3], em que a bactéria formadora de esporo é selecionada do grupo consistindo de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, Bacillus lentus, Bacillus laterosporus, Bacillus alvei, Bacillus popilliae, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alcalophilus, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus siamensis,

Bacillus lautus, Bacillus clausii, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus velezensis, Bacillus pichinotyi, Bacillus acidocaldarius, Bacillus alkalicola, Bacillus azotoformans, Bacillus anthracis, Bacillus badius, Bacillus bataviensis, Bacillus cycloheptanicus, Bacillus aneurinilyticus, Bacillus migulanus, Bacillus abyssalis, Bacillus aestuarii, Bacillus polymyxa e Bacillus sp.

[0018] [5] O método de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o antibiótico é pelo menos um antibiótico selecionado do grupo consistindo de estreptomicina, lincomicina, eritromicina, rifampicina, cloranfenicol, actinomicina, ácido fusídico, lipiamicina, puromicina, espectinomicina, tetraciclina e tioestreptona.

[0019] [6] O método de acordo com [5], em que o antibiótico é estreptomicina.

[0020] [7] O método de acordo com qualquer um de [1] a [6] em que a concentração do antibiótico no meio líquido no estágio anterior ao estágio final varia de 0,001 ppm a 10.000 ppm.

[0021] [81 O método de acordo com qualquer um de [1] a [6] em que a concentração do antibiótico no meio líquido no estágio anterior ao estágio final varia de 1,0 ppm a 90 ppm.

[0022] [9] Um método para cultivar uma bactéria exibindo o aparecimento reduzido de variantes formando uma colônia anormal, compreendendo, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior.

[0023] [10] Um método para suprimir um aparecimento e um crescimento de variantes formando uma colônia anormal durante a cultura líquida de bactérias, compreendendo, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior. Efeitos da Invenção

[0024] De acordo com a presente invenção, um antibiótico está contido em um meio a ser usado para cultura de múltiplos estágios para cultivar bactérias e depois a quantidade do antibiótico no estágio final é reduzida, de modo que as células bacterianas possam ser produzidas com boa produtividade enquanto reduz a proporção de variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia no momento da conclusão da cultura líquida de bactérias. Variantes exibindo anormalidades na morfologia de colônia são prováveis de terem perdido propriedades desejáveis. Consequentemente, através da redução de tais variantes, as células bacterianas assim cultivadas e obtidas podem ser usadas em um estado preferível para aplicações tais como a produção de enzimas e substâncias úteis, produção de alimentos fermentados, decomposição de matéria orgânica, remédios para distúrbios intestinais, pesticidas microbianos e fertilizantes microbianos. Breve Descrição do Desenho

[0025] A Fig. 1 é uma fotografia mostrando um exemplo das formas de colônias anormais. As colônias anormais são indicadas com o. Descrição das Modalidades

[0026] Na presente invenção, os tipos de uma bactéria não são particularmente limitados. Contanto que a bactéria possa ser cultivada pela cultura líquida e seja capaz de formar colônias no meio sólido, a bactéria pode ser Gram positiva ou Gram negativa. Os exemplos da mesma incluem bactérias do gênero Escherichia, bactérias do gênero Shigella, bactérias do gênero Salmonella, bactérias do gênero Klebsiella, bactérias do gênero Yersinia, bactérias do gênero Enterobacter, bactérias do gênero Pseudomonas, bactérias do gênero Brucella, bactérias do gênero Staphylococcus, bactérias do gênero Streptococcus, bactérias do gênero Streptomyces, bactérias do gênero Rhodococcus, bactérias do gênero Acetobacterium, bactérias do gênero Methanobacterium, bactérias do gênero Enterococcus, bactérias do gênero Bacillus, bactérias do gênero Clostridium, bactérias do gênero Corynebacterium e bactérias do gênero Mycobacterium.

[0027] Destas bactérias, as bactérias formadoras de esporo tais como aquelas pertencentes ao gênero Bacillus, ao gênero Paenibacillus, ao gênero Geobacillus, ao gênero Clostridium, ou ao gênero Sporosarcina são mais preferíveis.

[0028] Os exemplos de bactérias do gênero Bacillus não são particularmente limitadas contanto que elas sejam classificadas sob o gênero Bacillus e incluam Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, Bacillus lentus, Bacillus laterosporus, Bacillus alvei, Bacillus popilliae, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alcalophilus, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus siamensis, Bacillus lautus, Bacillus clausii, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus velezensis, Bacillus pichinotyi, Bacillus acidocaldarius, Bacillus alkalicola, Bacillus azotoformans, Bacillus anthracis, Bacillus badius, Bacillus bataviensis, Bacillus cycloheptanicus, Bacillus aneurinilyticus, Bacillus migulanus, Bacillus abyssalis, Bacillus aestuarii, Bacillus polymyxa e Bacillus sp.

[0029] Os exemplos de bactérias do gênero Paenibacillus incluem Paenibacillus macerans, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus peoriate e Paenibacillus elgii.

[0030] Os exemplos de bactérias do gênero Geobacillus incluem Geobacillus thermoglucosidasius, Geobacillus caldoxylosilyticus e Geobacillus stearothermophilus.

[0031] Os exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem Clostridium butyricum, — Clostridium Kluyveri —Clostriddum acetobutylicum,y —Clostridium aminobutyricum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium thermocellum, Clostridium ljungdahfi e Clostridium botulinum.

[0032] Os exemplos de bactérias do gênero Sporosarcina incluem Sporosarcina pasteurii,, Sporosarcina ureae, Sporosarcina psychrophila e Sporosarcina thermotolerans.

[0033] Uma bactéria a ser cultivada no método da presente invenção pode ser uma bactéria recombinante não genética ou uma bactéria recombinante genética, mas preferivelmente aquelas não contendo nenhum gene de resistência a antibiótico.

[0034] Além disso, uma bactéria a ser cultivada no método da presente invenção pode ser uma cepa tipo selvagem ou variante, mas mesmo no último caso, a bactéria preferivelmente não tem nenhuma mutação na resistência a antibiótico.

[0035] O método para produzir células bacterianas e o método para cultivar bactéria da presente invenção compreendem cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico.

[0036] O meio líquido pode ser apropriadamente selecionado dependendo do tipo de uma bactéria a ser cultivada e um meio líquido genérico contendo componentes de meio tais como fontes de carbono e fontes de nitrogênio em concentrações adequadas para cultivar bactérias pode ser usado.

[0037] Os exemplos de fontes de carbono incluem açúcar (amido, glicose, lactose, glicerol, arabinose, ribose, xilose, galactose, frutose, manose, inositol, manitol, sorbitol, glicosamina, N-acetilglicosamina, celobiose, maltose, sacarose, trealose, xílitol, etc.) ou matérias primas fontes de açúcar, álcoois, ácidos orgânicos, sais de ácido orgânico, alcanos ou outras fontes de carbono comuns. Os exemplos de fontes de nitrogênio incluem componentes derivados da soja, componentes derivados de levedura, componentes derivados de milho, proteínas animais e vegetais e os produtos da sua decomposição, sais de amônio tais como nitrato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio e acetato de amônio, amônia, nitrato de sódio, nitrato de potássio, glutamato de sódio e ureia.

[0038] Os exemplos de componentes do meio outros que não fontes de carbono e fontes de nitrogênio incluem sais de metal traço, aminoácidos e vitaminas, que podem ser adicionados como apropriado quando necessário.

[0039] No método da presente invenção, o antibiótico não é particularmente limitado contanto que o mesmo possa reduzir a taxa de aparecimento de colônias anormais quando comparada com um caso no qual nenhum antibiótico é adicionado e seus exemplos específicos incluem estreptomicina, lincomicina, eritromicina, rifampicina, cloranfenicol, actinomicina, ácido fusídico, lipiamicina, puromicina, espectinomicina, tetraciclina e tioestreptona. Um exemplo particularmente preferido entre estes é estreptomicina.

[0040] O antibiótico tem preferivelmente uma concentração (menor do que uma dose subletal) que não iniba o crescimento bacteriano e é preferivelmente adicionado de modo que a concentração do antibiótico em um meio líquido seja de 0,001 ppm ou mais e 10.000 ppm ou menos.

[0041] A concentração do antibiótico é preferivelmente igual a ou menor do que a concentração de inibição do crescimento na qual o crescimento bacteriano é inibido. A concentração difere dependendo do tipo de bactérias e é por exemplo, preferivelmente de 1.000 ppm ou menos, mais preferivelmente 300 ppm ou menos e adicionalmente preferível de 90 ppm ou menos. Por outro lado, o limite mais baixo da concentração do antibiótico pode ser qualquer concentração que possa suprimir o aparecimento de colônias anormais e é preferivelmente 0,01 ppm ou mais, mais preferivelmente de 0,1 ppm ou mais e adicionalmente preferível de 1 ppm ou mais.

[0042] O antibiótico é adicionado a um meio líquido em um estágio anterior ao estágio final. O antibiótico pode estar contido no meio líquido no início da cultura ou pode ser adicionado durante a cultura. Quando o antibiótico é adicionado durante a cultura, é preferível adicionar quando as células tenham crescido até um certo grau, por exemplo, é preferível ser adicionado entre 1 e 10 horas depois do início da cultura. Além disso, a concentração do antibiótico no meio líquido pode ser variada, por exemplo, suplementando-se com o antibiótico durante a cultura.

[0043] A etapa de cultura líquida compreende dois ou mais estágios de cultura com uma subcultura(s) de células. O número de estágios de cultura pode ser qualquer número contanto que seja de dois ou mais estágios, mas preferivelmente pode ser uma cultura de múltiplos estágios de dois a quatro estágios.

[0044] O número de vasos de cultura pode ser aumentado conforme a cultura prossegue do primeiro ao último estágio, tal como um vaso de cultura é usado em um primeiro estágio, quatro vasos de cultura são usados em um segundo estágio e assim, por diante. Além disso, a capacidade do vaso de cultura pode ser aumentada conforme a cultura prossegue do primeiro para os últimos estágios, tal como 1 L no primeiro estágio, 10 L no segundo estágio e assim por diante.

[0045] Com respeito ao tempo de cultura da cultura de múltiplos estágios, por exemplo, uma modalidade de uma cultura de dois estágios envolve inocular células bacterianas em um meio do primeiro estágio, cultivar as células bacterianas durante a 40 horas e preferivelmente de 20 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do primeiro estágio em um meio do segundo estágio e depois cultivar as células bacterianas durante 15 a 80 horas e preferivelmente de 20 a 50 horas. O tempo de cultura total varia preferivelmente de 25 a 120 horas e mais preferivelmente de 30 a 80 horas.

[0046] Por exemplo, uma modalidade de uma cultura de três estágios envolve inocular células bacterianas em um meio do primeiro estágio, cultivar células bacterianas durante 10 a 40 horas e preferivelmente de 20 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do primeiro estágio em um meio do segundo estágio, cultivar as células bacterianas durante 5 a 40 horas e preferivelmente 10 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do segundo estágio em um meio do terceiro estágio e depois cultivar as células bacterianas durante 15 a 80 horas e preferivelmente durante 20 a 50 horas. O tempo de cultura total varia de preferivelmente 30 a 160 horas e mais preferivelmente de 35 a 110 horas.

[0047] Por exemplo, uma modalidade de uma cultura de quatro estágios envolve inocular células bacterianas em um meio do primeiro estágio, cultivar células bacterianas durante 10 a 40 horas e preferivelmente 20 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do primeiro estágio em um meio do segundo estágio, cultivar células bacterianas durante 5 a 40 horas e preferivelmente 10 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do segundo estágio em um meio do terceiro estágio, cultivar as células bacterianas durante 5 a 40 horas e preferivelmente durante 10 a 30 horas, inocular uma porção das células bacterianas obtidas pela cultura do segundo estágio em um meio do quarto estágio e depois cultivar as células bacterianas durante 15 a 80 horas e preferivelmente durante 20 a 50 horas. O tempo de cultura total varia de preferivelmente 35 a 200 horas e mais preferivelmente 60 a 140 horas.

[0048] Como descrito acima, quando a cultura líquida é realizada em múltiplos estágios, a cultura é realizada usando um meio contendo um antibiótico em pelo menos um dos estágios exceto para o estágio final e no estágio final, a cultura é realizada com um antibiótico a concentração do qual é mais baixa do que aquela no estágio onde o antibiótico está contido. Diminuir a concentração do antibiótico no estágio final resulta na exclusão de fatores que causam a inibição do crescimento e inibição da esporulação, de modo que a etapa de cultura pode prosseguir mais rapidamente. No geral, quando microrganismos são produzidos pela cultura de múltiplos estágios, o estágio final pode ser o maior em escala. Consequentemente, diminuindo a concentração de um antibiótico no estágio final leva à supressão do custo de produção.

[0049] Por exemplo, a concentração de um antibiótico no estágio final pode ser 1/2 ou menos, 1/5 ou menos, 1/10 ou menos, 1/50 ou menos, ou 1/100 ou menos da concentração do antibiótico em um estágio anterior no qual o antibiótico está contido. A concentração de um antibiótico no estágio final também pode ser zero (abaixo do limite de detecção).

[0050] Por exemplo, como no Exemplo 1 descrito mais tarde, um método de cultura também pode ser utilizado, que envolve cultivar em três estágios incluindo o primeiro e segundo estágios com a adição de antibiótico e o terceiro estágio sem nenhuma adição de antibiótico e transferindo 1% da solução de cultura do segundo estágio para o terceiro estágio, de modo abaixar a concentração do antibiótico para um nível 1/100 daquele no segundo estágio.

[0051] Além disso, a concentração de um antibiótico pode ser gradualmente reduzida estágio por estágio conforme os estágios prosseguem. Neste caso, a concentração do antibiótico no estágio final pode ser 1/2 ou menos, 1/5 ou menos, 1/10 ou menos, 1/50 ou menos, ou 1/100 ou menos da concentração máxima.

[0052] O período para cultivar com um meio contendo um antibiótico é preferivelmente de 10 horas ou mais no total.

[0053] A temperatura da cultura pode ser apropriadamente selecionada dependendo do tipo de bactérias e varia de, por exemplo, 10ºC a 50ºC, preferivelmente 15ºC a 50ºC e mais preferivelmente 15ºC a 40ºC.

[0054] Outras várias condições tais como concentração de oxigênio e pH podem ser condições que sejam utilizadas para cultura líquida genérica de bactérias, tais como condições onde as bactérias são cultivadas durante agitação sob condições aeróbicas (por exemplo, concentração de oxigênio de 15% a 50%). O pH do meio varia de preferivelmente 6,5 a 8,5 e mais preferivelmente 7,0 a 8,0.

[0055] Se colônias anormais aparecem ou não pode ser confirmado coletando-se uma porção de células obtidas depois da cultura líquida usando um antibiótico(s), diluindo a porção a uma concentração que impeça as colônias de aderirem umas às outras e possibilite a identificação da morfologia de colônia, aplicando o resultante sobre um meio sólido tal como meio de ágar para cultivar e depois observando a morfologia das colônias que aparecem.

[0056] O termo “colônias anormais” se refere às colônias exibindo morfologia diferente daquela das colônias bacterianas do tipo selvagem. Por exemplo, como mostrado na Tabela 3, as colônias normais são aproximadamente circulares no formato, os lados estão na forma de lentes e a superfície é lisa ou mucóide, enquanto as colônias anormais são irregulares no formato e têm lados planos e superfície rugosa. Quando uma colônia tem pelo menos uma de morfologia anormal, lados anormais e superfície anormal, a mesma pode ser determinada como uma colônia anormal. A Fig. 1 representa um exemplo da morfologia de colônias anormais e as colônias circundadas são colônias anormais. Exemplos

[0057] A presente invenção será descrita especificamente com referência aos Exemplos abaixo, mas a presente invenção não é limitada a estes Exemplos. (Exemplo 1)

[0058] Usando um frasco Erlenmeyer de 500 mL (com um defletor), 100 mL de cada um dos meios líquidos contendo os componentes do meio listado na Tabela 1 foram preparados e depois a esterilização pela autoclave foi realizada. De modo a evitar a reação de Maillard, glicose foi separadamente esterilizada e assepticamente misturada. Tabela 1 Composição de Meio Industries Ltda. desengordurada Co., Inc.

o mr | Extrato de levedura Roquette MnCl2.4H20 Dfico 0,18 Nac! Wako Pure Chemical 1,0 Industries Ltda. KH2POa Wako Pure Chemical 0,50 Industries Ltda. MgSO4.7H20 Wako Pure Chemical 0,63 Industries Ltda. CaCl2 Wako Pure Chemical 0,19 Industries Ltda. FeSO. Wako Pure Chemical 0,00038 Industries Ltda.

[0059] As seções de teste foram ajustadas como descrito na Tabela 2. De acordo com as condições para cada seção teste, uma solução aquosa de estreptomicina esterilizada em filtro foi assepticamente adicionada ao meio.

[0060] Uma alça de platina foi tirada de uma colônia de Bacillus subtilis cepa ITB 105 (NITE BP-01727) cultivada sobre um meio de ágar comum e inoculada e depois a cultura agitada foi realizada a 30ºC e 150 rpm (primeiro estágio). Dezoito horas mais tarde, 1 mL de cada solução de cultura foi aliquotado e transferido para um meio fresco e depois a cultura sob agitação foi realizada na mesma maneira (segundo estágio). Depois de 24 horas, 1 mL de cada solução de cultura foi aliquotado e depois transferido para um meio fresco e depois a cultura sob agitação foi realizada na mesma maneira (terceiro estágio). A solução de cultura no terceiro estágio foi amostrada depois de 30 horas. Tabela 2 Cenário da sessão de teste Nº da sessão | Cultura do primeiro estágio Cultura do segundo estágio Cultura do terceiro estágio de teste Tipo de Concentração | Tipo de Concentração | Tipo de Concentração antibiótico para adição antibiótico para adição antibiótico para adição adicionado ppm adicionado ppm adicionado ppm 1 |- E de e dede 2 Estreptomicina Estreptomicina 5 E = = = | 3 — | Estreptomicina Estreptomicina 10 Ed = 4 Estreptomicina Estreptomicina 15 eo = = | Estreptomicina Estreptomicina 20 eo = = | 6 Estreptomicina Estreptomicina 30 eo = = | Estreptomicina Estreptomicina

[0061] As soluções de cultura resultantes foram cada uma diluídas 1 x 107 vezes com água estéril e 100 ul da solução diluída foram aplicadas a um meio de ágar comum e depois as células foram cultivadas durante a noite a 37ºC.

O número de colônias que apareceram foi determinado para calcular CFU.

As colônias que apareceram e claramente diferiram na morfologia de colônia comparada com a cepa precursora com base nos critérios na Tabela 3 foram determinadas como colônias anormais e o número das colônias anormais que aparecem foi determinado e depois a sua proporção no número total de colônias foi calculada.

Os resultados são mostrados na Tabela 4. Como um resultado, na cultura de três estágios, as colônias anormais que aparecem foram responsáveis por cerca de 5% quando nenhum antibiótico foi adicionado.

Entretanto, quando as células foram cultivadas pela adição de estreptomicina no primeiro e segundo estágios e nenhum no terceiro estágio, nenhum aparecimento de colônias anormais foi observado.

Além disso, quando estreptomicina foi adicionada em todos do primeiro, segundo e terceiro estágios, embora nenhuma colônia anormal aparecesse, o número de colônias aparecendo e o número de colônias parecendo normais foram baixos e a produtividade de células bacterianas foi mais baixa do que aquelas da seções de teste Nos 2 a 6. Tabela 3 Critérios de Determinação para Morfologia de Colônias Item Tipo Selvagem Tipo Selvagem Anormal (Estágio inicial de | (Estágio final de cultura cultura Formato Circular Circular Circular ou irregular Lado Formato de lente | Formato de depressão ou angular Tabela 4 Resultados de Teste Seção | Estágio | Tempo de Número | Número Aparecimento CFU de de (%) de de teste | da Cultura An An ai o (/mL) colônias | colônias | colônias N Cultura | (horas) ; ; ; normais | anormais | anormais 1º | Terei | 39 | ogog| oa 5 5,1% Estágio Terceiro + o [E TESS so [ess | [o om

TE

E EEE fame e [o | am ES as fame e [o am Es Tee e [o

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir células bacterianas caracterizado pelo fato de que compreende, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria formadora de esporo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria formadora de esporo pertence ao gênero Bacillus.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria formadora de esporo é selecionada do grupo consistindo de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, Bacillus lentus, Bacillus laterosporus, Bacillus alvei, Bacillus popilliae, Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alcalophilus, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus siamensis, Bacillus lautus, Bacillus clausii, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus velezensis, Bacillus pichinotyi, Bacillus acidocaldarius, Bacillus alkalicola, Bacillus azotoformans, Bacillus anthracis, Bacillus badius, Bacillus bataviensis, Bacillus cycloheptanicus, Bacillus aneurinilyticus, Bacillus migulanus, Bacillus abyssalis, Bacillus aestuarii, Bacillus polymyxa e Bacillus sp.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é pelo menos um antibiótico selecionado do grupo consistindo de estreptomicina, lincomicina, eritromicina, rifampicina, cloranfenicol, actinomicina, ácido fusídico, lipiamicina, puromicina, espectinomicina, tetraciclina e tioestreptona.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o antibiótico é estreptomicina.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração do antibiótico no meio líquido no estágio anterior ao estágio final varia de 0,001 ppm a 10.000 ppm.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração do antibiótico no meio líquido no estágio anterior ao estágio final varia de 1,0 ppm a 90 ppm.

9. Método para cultivar uma bactéria exibindo o aparecimento reduzido de variantes formando uma colônia anormal, caracterizado pelo fato de que compreende, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior.

10. Método para suprimir um aparecimento e um crescimento de variantes formando uma colônia anormal durante a cultura líquida de bactérias, caracterizado pelo fato de que compreende, em um processo de cultura líquida de múltiplos estágios para bactérias, cultivar uma bactéria em um meio líquido contendo um antibiótico em um estágio anterior ao estágio final e depois diminuindo a concentração do antibiótico no estágio final até um nível mais baixo do que aquele no estágio anterior.