TW201920650A - 細菌菌體之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種細菌菌體之製造方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。藉此，可抑制培養後所得之細菌中形成異常型菌落之突變個體的出現，並可以良好生產性來製造細菌菌體。
Description
發明領域
本發明係有關於抑制細菌在多階段液體培養中會產生且形成異常型菌落之突變個體的發生及增殖，並以良好的生產性來製造細菌菌體的方法。
本發明係有關於抑制細菌在多階段液體培養中會產生且形成異常型菌落之突變個體的發生及增殖，並以良好的生產性來製造細菌菌體的方法。
發明背景
細菌可被利用於酵素及有用物質的生產、發酵食品的生產、有機物的分解、整腸劑、微生物農藥、微生物肥料等各種領域。
無論是哪種領域，為了製備菌體都必須要進行細菌的培養，然而其存在有以下的狀況：培養中出現菌落形態顯示出異常之突變個體，且其與擁有原本性質的個體相比以優勢增殖，因而在培養結束後之菌體中原本有用的性質受損。
細菌可被利用於酵素及有用物質的生產、發酵食品的生產、有機物的分解、整腸劑、微生物農藥、微生物肥料等各種領域。
無論是哪種領域，為了製備菌體都必須要進行細菌的培養，然而其存在有以下的狀況：培養中出現菌落形態顯示出異常之突變個體，且其與擁有原本性質的個體相比以優勢增殖，因而在培養結束後之菌體中原本有用的性質受損。
舉例來說，在非專利文獻1中觀察到下述現象：在桿菌(Bacillus
)屬細菌的液體培養基中之數千世代繼代培養中，出現菌落形態等顯示出異常的突變個體，且該等突變個體優先於原本個體增殖而完全將原本個體置換。此現象推測是因為特化於特定培養環境而使不必要的代謝系統排除之突變個體較原本個體佔優勢地增殖所致。
在非專利文獻2中揭示，枯草芽孢桿菌916(Bacillus subtilis 916)菌株之缺乏桿菌抗黴素L(Bacillomycin L)及表面活性素(Surfactin)之生物合成能力的突變株顯示出異於野生型菌株的菌落形態。已知桿菌抗黴素L及表面活性素對一部分的植物病害顯示出控制效果，因此認為這是菌落形態變異與有用性質喪失相關聯的案例。
再者，在非專利文獻3中揭示有下述例子：在用以強化枯草芽孢桿菌G3(Bacillus subtilis G3)菌株之抗菌活性的育種中，菌落形態較親代菌株有所改變的菌株中，伊枯草菌素A(Itulin A)之生產量增加。
在非專利文獻4中揭示，就硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillus migulanus )(舊分類為短芽孢桿菌(Bacillus brevis ))ATCC9999菌株而言，從菌種中心(Culture Collection)保管菌株中檢驗出6種類型的菌落形態，且該等菌株的短桿菌素S(Gramicidin S)生產性相異。
在非專利文獻5中揭示有下述例子：枯草芽孢桿菌VT30M (Bacillus subtilis VT30M)菌株及地衣芽孢桿菌VT3(Bacillus licheniformis VT3)菌株的菌落形態變異菌株，與野生型相比展現出不同的酵素生產性及抗生素抗性。
在非專利文獻2中揭示，枯草芽孢桿菌916(Bacillus subtilis 916)菌株之缺乏桿菌抗黴素L(Bacillomycin L)及表面活性素(Surfactin)之生物合成能力的突變株顯示出異於野生型菌株的菌落形態。已知桿菌抗黴素L及表面活性素對一部分的植物病害顯示出控制效果，因此認為這是菌落形態變異與有用性質喪失相關聯的案例。
再者，在非專利文獻3中揭示有下述例子：在用以強化枯草芽孢桿菌G3(Bacillus subtilis G3)菌株之抗菌活性的育種中，菌落形態較親代菌株有所改變的菌株中，伊枯草菌素A(Itulin A)之生產量增加。
在非專利文獻4中揭示，就硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillus migulanus )(舊分類為短芽孢桿菌(Bacillus brevis ))ATCC9999菌株而言，從菌種中心(Culture Collection)保管菌株中檢驗出6種類型的菌落形態，且該等菌株的短桿菌素S(Gramicidin S)生產性相異。
在非專利文獻5中揭示有下述例子：枯草芽孢桿菌VT30M (Bacillus subtilis VT30M)菌株及地衣芽孢桿菌VT3(Bacillus licheniformis VT3)菌株的菌落形態變異菌株，與野生型相比展現出不同的酵素生產性及抗生素抗性。
先前技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1：Biotechnology progress 2005, 21, 4, 1026-1031
非專利文獻2：Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 4 1897-1910
非專利文獻3：Zhiwu Bingli Xuebao 2008, 38, 2, 185-191
非專利文獻4：Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 20, 6620-6628
非專利文獻5：Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 3026-3028
非專利文獻
非專利文獻1：Biotechnology progress 2005, 21, 4, 1026-1031
非專利文獻2：Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 4 1897-1910
非專利文獻3：Zhiwu Bingli Xuebao 2008, 38, 2, 185-191
非專利文獻4：Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 20, 6620-6628
非專利文獻5：Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 3026-3028
發明概要
如上所述，細菌的液體培養中，特別是當進行多階段培養時存在下述情況之問題：培養中出現菌落形態顯示出異常之突變個體，且其與擁有原本性質的個體相比以優勢增殖，因而在培養結束後之菌體中原本有用的性質受損；至今仍未有為了抑制此現象而有效技術的報告。
因此，本發明課題為針對細菌的多階段液體培養步驟，提供一種可抑制培養後所得細菌中菌落形態顯示出異常之突變個體的出現，並可以良好生產性來製造細菌菌體之新方法。
如上所述，細菌的液體培養中，特別是當進行多階段培養時存在下述情況之問題：培養中出現菌落形態顯示出異常之突變個體，且其與擁有原本性質的個體相比以優勢增殖，因而在培養結束後之菌體中原本有用的性質受損；至今仍未有為了抑制此現象而有效技術的報告。
因此，本發明課題為針對細菌的多階段液體培養步驟，提供一種可抑制培養後所得細菌中菌落形態顯示出異常之突變個體的出現，並可以良好生產性來製造細菌菌體之新方法。
本案發明人為了解決上述問題而盡心研究的結果為發現在細菌的多階段液體培養步驟中，藉由在最終階段之前的階段使用含抗生素之培養基來培養，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養，可使培養結束後所得之細菌群中菌落形態顯示出異常之突變個體的出現顯著地降低，並可以良好生產性來製造細菌菌體，而終至完成本發明。
本發明係如下：
[1] 一種細菌菌體之製造方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
[2] 如[1]所記載之方法，其中細菌為芽孢形成細菌。
[3] 如[2]所記載之方法，其中芽孢形成菌為桿菌(Bacillus )屬細菌。
[4] 如[3]所記載之方法，其中芽孢形成菌係選自於由下述構成群組：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus )、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex )、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus )、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus )、蜂疫桿菌(Bacillus alvei )、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae )、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )、短芽孢桿菌(Bacillus brevis )、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus )、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans )、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis )、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus )、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii )、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis )、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus )、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus )、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )、皮基諾伊芽孢桿菌(Bacillus pichinotyi )、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius )、好鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalicola )、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans )、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis )、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius )、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis )、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus )、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus )、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus )、深海芽孢桿菌(Bacillus abyssalis )、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii )、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa )及芽孢桿菌屬菌(Bacillus sp. )。
[5] 如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其中該抗生素為選自於由下述所構成群組之一種以上：鏈黴素(streptomycin)、林可黴素(lincomycin)、紅黴素(erythromycin)、利福平(rifampicin)、氯黴素(chloramphenicol)、放線菌素(actinomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、閏年黴素(lipiarmycin)、嘌黴素(puromycin)、大觀黴素(spectinomycin)、四環素(tetracycline)及硫鏈絲菌素(thiostrepton)。
[6] 如[5]所記載之方法，其中抗生素為鏈黴素。
[7] 如[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為0.001ppm~10,000ppm。
[8] 如[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為1.0~90 ppm。
[9] 一種使形成異常型菌落之突變個體的出現降低之細菌培養方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
[10] 一種抑制在細菌液體培養中形成異常型菌落之突變個體的出現及增殖的方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
[1] 一種細菌菌體之製造方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
[2] 如[1]所記載之方法，其中細菌為芽孢形成細菌。
[3] 如[2]所記載之方法，其中芽孢形成菌為桿菌(Bacillus )屬細菌。
[4] 如[3]所記載之方法，其中芽孢形成菌係選自於由下述構成群組：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus )、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex )、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus )、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus )、蜂疫桿菌(Bacillus alvei )、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae )、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )、短芽孢桿菌(Bacillus brevis )、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus )、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans )、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis )、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus )、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii )、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis )、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus )、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus )、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )、皮基諾伊芽孢桿菌(Bacillus pichinotyi )、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius )、好鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalicola )、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans )、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis )、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius )、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis )、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus )、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus )、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus )、深海芽孢桿菌(Bacillus abyssalis )、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii )、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa )及芽孢桿菌屬菌(Bacillus sp. )。
[5] 如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其中該抗生素為選自於由下述所構成群組之一種以上：鏈黴素(streptomycin)、林可黴素(lincomycin)、紅黴素(erythromycin)、利福平(rifampicin)、氯黴素(chloramphenicol)、放線菌素(actinomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、閏年黴素(lipiarmycin)、嘌黴素(puromycin)、大觀黴素(spectinomycin)、四環素(tetracycline)及硫鏈絲菌素(thiostrepton)。
[6] 如[5]所記載之方法，其中抗生素為鏈黴素。
[7] 如[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為0.001ppm~10,000ppm。
[8] 如[1]至[6]中任一項所記載之方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為1.0~90 ppm。
[9] 一種使形成異常型菌落之突變個體的出現降低之細菌培養方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
[10] 一種抑制在細菌液體培養中形成異常型菌落之突變個體的出現及增殖的方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
依據本發明，在多階段培養中使所用之培養基中含有抗生素來培養細菌，且在最終階段使抗生素之量降低來培養細菌，藉此可使細菌的液體培養結束時菌落形態顯示出異常之突變個體的比率降低，且可以良好的生產性來製造細菌菌體。由於菌落形態顯示出異常之突變個體喪失所欲性質的可能性為高，藉由如此的方式使突變個體降低，可使得利用培養所得之細菌菌體以良好狀態使用於酵素及有用物質之生產、發酵食品之生產、有機物之分解、整腸劑、微生物農藥及微生物肥料等用途。
本發明中，細菌種類只要是可以液體培養且在固體培養基上會形成菌落者即未特別受限，革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌皆可，例如可舉：埃希氏菌(Escherichia
)屬細菌、志賀氏菌(Shigella
)屬細菌、沙門氏菌(Salmonella
)屬細菌、克雷伯氏菌(Klebsiella
)屬細菌、耶爾辛氏菌(Yersinia
)屬細菌、腸桿菌(Enterobacter
)屬細菌、假單胞菌(Pseudomonas
)屬細菌、布魯氏菌(Brucella
)屬細菌、葡萄球菌(Staphylococcus
)屬細菌、鏈球菌(Streptococcus
)屬細菌、鏈黴菌(Streptomyces
)屬細菌、紅球菌(Rhodococcus
)屬細菌、醋酸桿菌(Acetobacterium
)屬細菌、甲烷桿菌(Methanobacterium
)屬細菌、腸球菌(Enterococcus
)屬細菌、芽孢桿菌(Bacillus
)屬細菌、梭菌(Clostridium
)屬細菌、棒桿菌(Corynebacterium
)屬細菌、分支桿菌(Mycobacterium
)屬細菌等。
其中較佳為芽孢桿菌(Bacillus )屬細菌、類芽孢桿菌(Paenibacillus )屬細菌、地芽孢桿菌(Geobacillus )屬細菌、梭菌(Clostridium )屬、芽孢八疊球菌(Sporosarcina )屬等芽孢形成細菌。
其中較佳為芽孢桿菌(Bacillus )屬細菌、類芽孢桿菌(Paenibacillus )屬細菌、地芽孢桿菌(Geobacillus )屬細菌、梭菌(Clostridium )屬、芽孢八疊球菌(Sporosarcina )屬等芽孢形成細菌。
芽孢桿菌(Bacillus
)屬細菌只要是可被分類為芽孢桿菌屬的細菌即未特別受限，例如可舉如：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis
)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens
)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus
)、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex
)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus
)、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus
)、蜂疫桿菌(Bacillus alvei
)、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae
)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis
)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis
)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus
)、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus
)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans
)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans
)、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis
)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus
)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii
)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium
)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis
)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus
)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus
)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis
)、皮基諾伊芽孢桿菌(Bacillus pichinotyi
)、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius
)、好鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalicola
)、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans
)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis
)、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius
)、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis
)、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus
)、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus
)、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus
)、深海芽孢桿菌(Bacillus abyssalis
)、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii
)、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa
)及芽孢桿菌屬菌(Bacillus sp.
)。
類芽孢桿菌(Paenibacillus
)屬細菌可舉如浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans
)、解澱粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus
)、peoriate類芽孢桿菌(Paenibacillus peoriate
)、elgii類芽孢桿菌(Paenibacillus elgii
)等。
地芽孢桿菌(Geobacillus
)屬細菌可舉如熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius
)、熱解木糖地芽孢桿菌(Geobacillus caldoxylosilyticus
)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus
)等。
梭菌(Clostridium
)屬細菌可舉如丁酸梭菌(Clostridium butyricum
)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri
)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum
)、胺基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum
)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii
)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum
)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum
)、楊氏梭菌(Clostridium ljungdahlii
)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum
)等。
芽孢八疊球菌(Sporosarcina
)屬細菌可舉如巴氏芽孢八疊球菌(Sporosarcina pasteurii
)、脲芽孢八疊球菌(Sporosarcina ureae
)、嗜冷芽孢八疊球菌(Sporosarcina psychrophila
)、耐熱芽孢八疊球菌(Sporosarcina thermotolerans
)等。
本發明的方法中被培養的細菌可為非基因重組細菌，也可為基因重組細菌，較佳為不含抗生素抗性基因之細菌。
再者，本發明的方法中被培養的細菌可為野生型也可為突變型，倘若是後者時，較佳為不具抗生素抗性突變之細菌。
再者，本發明的方法中被培養的細菌可為野生型也可為突變型，倘若是後者時，較佳為不具抗生素抗性突變之細菌。
本發明的細菌菌體之製造方法及細菌培養方法，包含以含抗生素之液體培養基培養細菌的步驟。
液體培養基可依據培養對象之細菌種類適宜地選擇，可使用包含適合細菌培養之濃度的碳源及氮源等培養基成分的一般液體培養基。
舉例來說，碳源可例示糖(澱粉、葡萄糖、乳糖、甘油、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、葡糖胺、N-乙醯葡萄胺糖、纖維雙醣、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等)或糖源原料、酒精、有機酸、有機酸鹽、烷烴或其他一般的碳源；氮源可例示大豆衍生成分、酵母衍生成分、玉米衍生成分、動植物蛋白脂及其分解物、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨等銨鹽、氨、硝酸鈉、硝酸鉀、麩胺酸鈉、尿素等。
碳源及氮源以外的培養基成分可舉如微量金屬鹽、胺基酸、維生素等，必要時可適宜地添加。
液體培養基可依據培養對象之細菌種類適宜地選擇，可使用包含適合細菌培養之濃度的碳源及氮源等培養基成分的一般液體培養基。
舉例來說，碳源可例示糖(澱粉、葡萄糖、乳糖、甘油、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、葡糖胺、N-乙醯葡萄胺糖、纖維雙醣、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等)或糖源原料、酒精、有機酸、有機酸鹽、烷烴或其他一般的碳源；氮源可例示大豆衍生成分、酵母衍生成分、玉米衍生成分、動植物蛋白脂及其分解物、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨等銨鹽、氨、硝酸鈉、硝酸鉀、麩胺酸鈉、尿素等。
碳源及氮源以外的培養基成分可舉如微量金屬鹽、胺基酸、維生素等，必要時可適宜地添加。
本發明的方法中，抗生素只要是與未添加時相比可降低異常型菌落出現率者即未特別受限，具體而言可例示如鏈黴素(streptomycin)、林可黴素(lincomycin)、紅黴素(erythromycin)、利福平(rifampicin)、氯黴素(chloramphenicol)、放線菌素(actinomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、閏年黴素(lipiarmycin)、嘌黴素(puromycin)、大觀黴素(spectinomycin)、四環素(tetracycline)及硫鏈絲菌素(thiostrepton)。其中尤佳為鏈黴素。
抗生素以不會抑制細菌生育(亞致死量以下)的濃度為佳，液體培養基中抗生素濃度較佳添加為0.001ppm以上10,000ppm以下。
抗生素濃度較佳為會對細菌抑制增殖之濃度以下，亦取決於細菌種類，舉例來說，宜為1,000ppm以下，較佳為300ppm以下，更佳為90ppm以下。另一方面，抗生素濃度之下限僅須為可抑制異常型菌落出現之濃度即可，宜為0.01ppm以上，較佳為0.1ppm以上，更佳為1ppm以上。
抗生素濃度較佳為會對細菌抑制增殖之濃度以下，亦取決於細菌種類，舉例來說，宜為1,000ppm以下，較佳為300ppm以下，更佳為90ppm以下。另一方面，抗生素濃度之下限僅須為可抑制異常型菌落出現之濃度即可，宜為0.01ppm以上，較佳為0.1ppm以上，更佳為1ppm以上。
抗生素在最終階段之前的階段添加至液體培養基。也可從培養開始時就使抗生素含在液體培養基中，也可在培養途中添加抗生素。當為培養途中添加時，宜在菌體已增殖一定程度之階段添加，舉例來說，較佳為從培養開始1~10小時之間添加為佳。再者，液體培養基中的抗生素濃度也可由在培養途中補充等而使其改變。
液體培養步驟由伴隨繼代培養之2階段以上培養所組成。只要是2階段以上則培養階段數為幾階段皆可，較佳可為2~4階段之多階段培養。
進一步地，可以第1階段為1個培養容器、第2階段為4個培養容器這樣的方式隨著進入後階段而增加培養容器數量。亦可以第1階段為1L、第2階段為10L這樣的方式隨著進入後階段而增加培養容器之容量。
就多階段培養的培養時間而言，例如，進行2階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為25~120小時，較佳為30~80小時。
例如，進行3階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第2階段培養所得之菌體的一部分接種至第3階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為30~160小時，較佳為35~110小時。
例如，進行4階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第2階段培養所得之菌體的一部分接種至第3階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第3階段培養所得之菌體的一部分接種至第4階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為35~200小時，較佳為60~140小時。
進一步地，可以第1階段為1個培養容器、第2階段為4個培養容器這樣的方式隨著進入後階段而增加培養容器數量。亦可以第1階段為1L、第2階段為10L這樣的方式隨著進入後階段而增加培養容器之容量。
就多階段培養的培養時間而言，例如，進行2階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為25~120小時，較佳為30~80小時。
例如，進行3階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第2階段培養所得之菌體的一部分接種至第3階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為30~160小時，較佳為35~110小時。
例如，進行4階段培養時，可舉下述態樣：將細菌接種至第1階段培養基進行10~40小時培養，較佳為進行20~30小時培養，將第1階段培養所得之菌體的一部分接種至第2階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第2階段培養所得之菌體的一部分接種至第3階段培養基進行5~40小時培養，較佳為進行10~30小時培養，將第3階段培養所得之菌體的一部分接種至第4階段培養基進行15~80小時培養，較佳為進行20~50小時培養，總培養時間宜為35~200小時，較佳為60~140小時。
如此以多階段進行液體培養時，在其中除最終階段之外的至少任1階段利用含抗生素之培養基進行培養，並在最終階段以較已使培養基含抗生素階段更低的抗生素濃度來進行培養即可。藉由在最終階段降低抗生素濃度，可排除引發抑制增殖及抑制芽孢形成的因子，因此可使培養步驟更迅速地進行。通常以多階段培養來生產微生物時，因為一般來說最終階段為最大規模，在最終階段降低抗生素濃度可牽涉到抑制製造成本。
舉例來說，可令最終階段中抗生素濃度為已使培養基含抗生素階段中抗生素濃度的1/2以下、1/5以下、1/10以下、1/50以下、或1/100以下，亦可令最終階段中抗生素濃度為零(檢測界限以下)。
舉例來說，如後述之實施例1，以3階段進行培養，第1階段及第2階段添加抗生素，第3階段未添加抗生素，而是將第2階段的培養液以1%繼代培養使抗生素濃度降低為第2階段的100分之1這樣的培養方法進行。
再者，亦可令抗生素濃度按階段逐漸減少，此時，最終階段中抗生素濃度可為最大濃度的1/2以下、1/5以下、1/10以下、1/50以下、或1/100以下。
進一步地，使用含抗生素之培養基培養的時期較佳為總共10小時以上。
舉例來說，可令最終階段中抗生素濃度為已使培養基含抗生素階段中抗生素濃度的1/2以下、1/5以下、1/10以下、1/50以下、或1/100以下，亦可令最終階段中抗生素濃度為零(檢測界限以下)。
舉例來說，如後述之實施例1，以3階段進行培養，第1階段及第2階段添加抗生素，第3階段未添加抗生素，而是將第2階段的培養液以1%繼代培養使抗生素濃度降低為第2階段的100分之1這樣的培養方法進行。
再者，亦可令抗生素濃度按階段逐漸減少，此時，最終階段中抗生素濃度可為最大濃度的1/2以下、1/5以下、1/10以下、1/50以下、或1/100以下。
進一步地，使用含抗生素之培養基培養的時期較佳為總共10小時以上。
培養溫度可依據細菌種類適宜地選擇，例如為10℃~50℃，較佳為15℃~50℃，更較佳為15℃~40℃。
就其他如氧濃度、pH等各種條件而言，僅須為被使用於一般細菌液體培養之條件即可，舉例來說，可例示為在好氧條件(例如氧濃度15~50%)下一邊攪拌一邊進行培養之條件。培養基的pH宜為6.5~8.5，較佳為7.0~8.0。
就其他如氧濃度、pH等各種條件而言，僅須為被使用於一般細菌液體培養之條件即可，舉例來說，可例示為在好氧條件(例如氧濃度15~50%)下一邊攪拌一邊進行培養之條件。培養基的pH宜為6.5~8.5，較佳為7.0~8.0。
在使用了抗生素之液體培養後，採集所得菌體的一部分，將其稀釋至菌落互相不附著而可識別菌落形態之程度的濃度，塗佈於洋菜培養基等固體培養基上培養，藉由觀察出現的菌落之形態可確認是否出現異常型菌落。
異常型菌落係指顯示出與野生型細菌之菌落形態相異之菌落。舉例來說，如表3所示，正常型菌落的形態為近乎圓形、側面為透鏡狀、表面為平滑或黏液狀，然而異常型菌落則可舉如有形態為不規則、側面為扁平、表面為粗糙表面的情形。形態方面的異常、側面的異常、表面的異常中，若是符合1個以上則可稱之為異常型菌落。圖1顯示異常型菌落之形態的一例，以圓形圈起者為異常型菌落。
實施例
異常型菌落係指顯示出與野生型細菌之菌落形態相異之菌落。舉例來說，如表3所示，正常型菌落的形態為近乎圓形、側面為透鏡狀、表面為平滑或黏液狀，然而異常型菌落則可舉如有形態為不規則、側面為扁平、表面為粗糙表面的情形。形態方面的異常、側面的異常、表面的異常中，若是符合1個以上則可稱之為異常型菌落。圖1顯示異常型菌落之形態的一例，以圓形圈起者為異常型菌落。
實施例
以下，舉實施例俾具體地說明本發明，本發明並不侷限於以下的實施例。
實施例1
使用500mL三角燒瓶(附檔板)，將含有表1所載培養基成分之液體培養基分別製作100mL，進行高壓蒸氣釜滅菌。此外，為了避免梅納反應，葡萄糖係另行滅菌後以無菌方式混合。
使用500mL三角燒瓶(附檔板)，將含有表1所載培養基成分之液體培養基分別製作100mL，進行高壓蒸氣釜滅菌。此外，為了避免梅納反應，葡萄糖係另行滅菌後以無菌方式混合。
表1
如表2所載般設定試驗區。依各試驗區之條件，將經過濾器滅菌之鏈黴素水溶液以無菌方式添加至培養基。
自生長在普通洋菜培養基上之枯草芽孢桿菌ITB105菌株(NITE BP-01727)之菌落刮取1接種環並植菌後，於30℃且150rpm下進行振盪培養(第1階段)。18小時之後，各別分取1mL繼代培養至新培養基，以同樣方式進行振盪培養(第2階段)。進而在24小時之後，各別分取1mL繼代培養至新培養基，以同樣方式進行振盪培養(第3階段)。就第3階段的培養液於30小時之後進行採樣。
自生長在普通洋菜培養基上之枯草芽孢桿菌ITB105菌株(NITE BP-01727)之菌落刮取1接種環並植菌後，於30℃且150rpm下進行振盪培養(第1階段)。18小時之後，各別分取1mL繼代培養至新培養基，以同樣方式進行振盪培養(第2階段)。進而在24小時之後，各別分取1mL繼代培養至新培養基，以同樣方式進行振盪培養(第3階段)。就第3階段的培養液於30小時之後進行採樣。
表2
就所得培養液以滅菌水稀釋至1×107
倍後，將100μL塗佈於普通洋菜培養基並以37℃培養一晚。計測菌落之出現數並算出CFU。且就所出現的菌落，依表3的基準，以與親代菌株之菌落形態明顯不同者作為異常型菌落來進行其出現數的計測，並算出對全體的佔有比率。該結果示於表4。結果，在3階段培養中，完全未添加抗生素時出現約5%異常型菌落，在第1階段及第2階段中添加鏈黴素、第3階段未添加而培養時則未見異常型菌落的出現。並且，在第1階段、第2階段、第3階段之全部中添加鏈黴素時，雖然未出現異常型菌落，但是與試驗區編號2~6相比，菌落出現數及正常型菌落之出現數為低，細菌菌體的生產性較低。
表3
表4
(無)
圖1是顯示異常型菌落形態之例子的圖(相片)。以○標示出異常型菌落。
Claims (10)
- 一種細菌菌體之製造方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
- 如請求項1之細菌菌體之製造方法，其中細菌為芽孢形成細菌。
- 如請求項2之細菌菌體之製造方法，其中芽孢形成菌為桿菌(Bacillus )屬細菌。
- 如請求項3之細菌菌體之製造方法，其中芽孢形成菌選自於由下述所構成群組：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus )、單純芽孢桿菌(Bacillus simplex )、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus )、側孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus )、蜂疫桿菌(Bacillus alvei )、日本甲蟲芽孢桿菌(Bacillus popilliae )、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis )、短芽孢桿菌(Bacillus brevis )、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus )、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus )、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans )、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans )、西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis )、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus )、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii )、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis )、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus )、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus )、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis )、皮基諾伊芽孢桿菌(Bacillus pichinotyi )、酸熱芽孢桿菌(Bacillus acidocaldarius )、好鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalicola )、產氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans )、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis )、栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius )、巴達維亞芽孢桿菌(Bacillus bataviensis )、環庚烷芽孢桿菌(Bacillus cycloheptanicus )、解硫胺素芽孢桿菌(Bacillus aneurinilyticus )、米氏芽孢桿菌(Bacillus migulanus )、深海芽孢桿菌(Bacillus abyssalis )、海岸芽孢桿菌(Bacillus aestuarii )、多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa )及芽孢桿菌屬菌(Bacillus sp. )。
- 如請求項1至4中任一項之細菌菌體之製造方法，其中抗生素為選自於由下述所構成群組之一種以上：鏈黴素(streptomycin)、林可黴素(lincomycin)、紅黴素(erythromycin)、利福平(rifampicin)、氯黴素(chloramphenicol)、放線菌素(actinomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、閏年黴素(lipiarmycin)、嘌黴素(puromycin)、大觀黴素(spectinomycin)、四環素(tetracycline)及硫鏈絲菌素(thiostrepton)。
- 如請求項5之細菌菌體之製造方法，其中抗生素為鏈黴素。
- 如請求項1至4中任一項之細菌菌體之製造方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為0.001ppm~10,000ppm。
- 如請求項1至4中任一項之細菌菌體之製造方法，其中前述最終階段之前的階段之液體培養基中抗生素濃度為1.0~90ppm。
- 一種使形成異常型菌落之突變個體的出現降低之細菌培養方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
- 一種抑制在細菌的液體培養中形成異常型菌落之突變個體的出現及增殖的方法，包含：在細菌的多階段液體培養步驟中，在最終階段之前的階段以含抗生素之液體培養基來培養細菌，且在最終階段使抗生素濃度相較於前階段降低來培養之步驟。
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