BR112020000388A2

BR112020000388A2 - Método para produzir um embrião transgênico não humano tendo um genoma incluindo um gene com um sítio modificado

Info

Publication number: BR112020000388A2
Application number: BR112020000388-3A
Authority: BR
Inventors: Goo Jang; Won You Lee; Soo Young Yum; Gyeong Min Gim; Ji Hyun Park
Original assignee: Lart Bio Co., Ltd.
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2021-03-09
Also published as: AU2019275586B2; JP7430414B2; JP7060256B2; AU2021232801A1; KR20200045453A; KR102197703B1; KR102471750B1; KR20210003070A; KR102197707B1; JP7430413B2; KR20220163905A; KR20210004925A; KR102158428B1; JP2020534789A; AU2021232802A1; KR20200020579A; US20210337776A1; AU2019275586A1; JP2022095839A; KR102608838B1

Abstract

a presente relatório descritivo refere-se a um animal transgênico e a um embrião transgênico que produz componentes de uma nuclease manipulada. de acordo com a divulgação da presente relatório descritivo, o animal transgênico (ou embrião) que produz componentes de uma nuclease manipulada é um animal transgênico (ou embrião) que inclui uma primeira célula tendo um genoma incluindo uma primeira toolbox; e uma segunda célula tendo um genoma incluindo uma segunda toolbox, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox incluem pelo menos um de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por rna e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que é capaz de se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que a primeira toolbox é presente em um primeiro local do genoma da primeira célula; a segunda toolbox é presente em um segundo local do genoma da segunda célula; e o primeiro local é diferente do segundo local.

Description

1 / 353 “MÉTODO PARA PRODUZIR UM EMBRIÃO TRANSGÊNICO NÃO

HUMANO TENDO UM GENOMA INCLUINDO UM GENE COM UM SÍTIO MODIFICADO” CAMPO TÉCNICO

[001] Os detalhes divulgados no presente relatório descritivo referem- se a um animal transgênico e um embrião transgênico que produzem componentes de uma nuclease manipulada.

[002] Especificamente, os detalhes divulgados no presente relatório descritivo se referem a um animal transgênico quimérico e a um embrião transgênico quimérico, que tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada.

[003] Mais especificamente, os detalhes divulgados no presente relatório descritivo referem-se a um animal transgênico e um embrião transgênico, que incluem uma primeira célula que tem um genoma, no qual um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada, é localizado em um primeiro local; e uma segunda célula que tem um genoma, no qual um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada, é localizado em um segundo local, que é diferente do primeiro local.

[004] Adicionalmente, os detalhes divulgados no presente relatório descritivo se referem a um animal transgênico e um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma no qual um primeiro polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada é localizado em um primeiro local; e uma segunda célula que tem um genoma, no qual um segundo polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada, é localizado em um primeiro local. Neste caso, a sequência do primeiro polinucleotídeo é diferente da do segundo polinucleotídeo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

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[005] A tendência atual é que a manipulação genética usando uma ferramenta de edição gênica, incluindo CRISPR/Cas9, esteja sendo aplicada a várias espécies de animais e plantas.

[006] A manipulação genética convencional tem se com base em um método para prover uma ferramenta de edição gênica para uma célula ou indivíduo de fora. No entanto, este método tem um problema em que a eficiência da manipulação genética é baixa quando uma ferramenta de edição gênica é injetada em uma célula ou indivíduo de fora.

[007] Quando um animal transgênico tendo um genoma no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica é inserido é usado, uma ferramenta de edição gênica pode ser expressada em um animal ou célula, resultando assim em uma maior eficiência da manipulação genética.

[008] Adicionalmente, quando um animal transgênico tendo um genoma, no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica é inserido, é usada uma pluralidade de animais nos quais vários genes são inativados ou modificados podem ser preparados. Com o exposto acima, um animal transgênico tendo um genoma no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica é inserido pode ser usado como uma tecnologia de plataforma.

[009] Além disso, quando o animal transgênico é um animal grande, a utilidade pode ser melhor do que a de um animal pequeno.

[0010] Portanto, é necessário o desenvolvimento de um animal grande tendo um genoma no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica é inserido; no entanto, a manipulação genética em animais grandes está em um progresso lento devido a limitações técnicas em comparação com animais pequenos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [Problema técnico]

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[0011] Em uma forma de realização, a presente divulgação se refere a um animal transgênico que inclui um polinucleotídeo que codifica componentes de uma nuclease manipulada.

[0012] Em outra forma de realização, a presente divulgação refere-se a um embrião transgênico que inclui um polinucleotídeo que codifica componentes de uma nuclease manipulada.

[0013] Um objetivo da presente divulgação é permitir a manipulação genética mais eficaz usando o animal transgênico ou embrião transgênico, no qual componentes de uma nuclease manipulada podem ser expressados.

[0014] Outro objetivo da presente divulgação é preparar uma pluralidade de células, embriões e/ou animais, nos quais vários genes são submetidos à inativação ou à modificação usando o animal transgênico ou embrião transgênico, no qual componentes de uma nuclease manipulada podem ser expressados. [Solução técnica]

[0015] De acordo com um aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um animal transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox, e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox incluem pelo menos um dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo é um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR incluída no genoma do animal, em que a primeira toolbox é presente em um primeiro local do genoma da primeira célula, a segunda toolbox é presente em um segundo local do genoma da segunda célula, e o primeiro local é diferente do segundo local.

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[0016] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um animal transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox, e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox compreendem pelo menos um de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo é um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR incluídas no genoma do animal, em que a sequência da primeira toolbox é diferente da segunda toolbox, a primeira toolbox é presente em um primeiro local do genoma da primeira célula, a segunda toolbox é presente em um segundo local do genoma da segunda célula, e o primeiro local é o mesmo que o segundo local.

[0017] De acordo com um aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um embrião transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox incluem pelo menos um dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo é um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR incluída no genoma do embrião, em que a primeira toolbox é presente em um primeiro local do genoma da primeira célula, a segunda toolbox é presente em um segundo local do genoma da segunda célula, e o primeiro local é diferente do segundo local.

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[0018] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um embrião transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox, e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox incluem pelo menos um de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo é um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR incluída no genoma do embrião, em que o exopolinucleotídeo é posicionado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR no genoma do embrião transgênico, em que a sequência da primeira toolbox é diferente daquela da segunda toolbox, a primeira toolbox é presente em um primeiro local do genoma da primeira célula, a segunda toolbox é presente em um segundo local do genoma da segunda célula, e o primeiro local é o mesmo que o segundo local.

[0019] De acordo com um aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um animal transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e um local alvo, e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox e um sítio modificado, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox compreendem pelo menos um de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo inclui uma primeira região, uma segunda

6 / 353 região e uma terceira região, em que a primeira região está posicionada na extremidade 5’ da segunda região e a terceira região está posicionada na extremidade 3’ da segunda região, em que o sítio modificado inclui uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região, em que a quarta região está posicionada na extremidade 5’ da quinta região e a sexta região está posicionada na extremidade 3’ da quinta região, em que a sequência da primeira região é igual à sequência da quarta região, em que a sequência da terceira região é igual à sequência da sexta região, em que a sequência da segunda região é diferente da sequência da quinta região.

[0020] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um embrião transgênico compreendendo uma primeira célula, que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula, que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox e um sítio modificado, em que a primeira toolbox e a segunda toolbox compreendem pelo menos um de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, respectivamente, em que o sítio alvo inclui uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, em que a primeira região está posicionada na extremidade 5’ da segunda região, e a terceira região está posicionada na extremidade 3’ da segunda região,

7 / 353 em que o sítio modificado inclui uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região, em que a quarta região está posicionada na extremidade 5’ da quinta região, e a sexta região está posicionada na extremidade 3’ da quinta região, em que a sequência da primeira região é igual à sequência da quarta região, em que a sequência da terceira região é igual à sequência da sexta região, em que a sequência da segunda região é diferente da sequência da quinta região.

[0021] De acordo com um aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião transgênico, no qual um componente de uma nuclease manipulada é expressada, o método compreende uma microinjeção de um vetor em um zigoto ou embrião, em que o vetor inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica os componentes da nuclease manipulada, em que o vetor é um vetor plasmídico ou um vetor viral.

[0022] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião transgênico no qual um componente de uma nuclease manipulada é expressado, o método compreende: i) preparar uma célula doadora transgênica na qual o componente da nuclease manipulada é expressado; e ii) transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[0023] De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um animal transgênico no qual um componente de uma nuclease manipulada é expressado, o método compreende:

8 / 353 i) preparar um embrião transgênico no qual o componente da nuclease manipulada é expressado; e ii) transplantar do embrião transgênico no útero de uma mãe de substituição.

[0024] De acordo com um aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende prover um ácido nucleico guia capaz de se ligar ao sítio alvo em um zigoto ou embrião, em que o zigoto ou o embrião tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, em que o ácido nucleico guia é uma forma de RNA ou uma forma incorporada a um vetor plasmídico ou vetor viral.

[0025] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende: i) preparar uma célula doadora transgênica tendo um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e uma edição gênica que ocorreu em um sítio alvo presente no genoma; e ii) transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[0026] De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um animal tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende: i) preparar um embrião tendo um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e uma edição gênica que ocorreu em um sítio alvo presente no genoma; e

9 / 353 ii) transplantar o embrião no útero de uma mãe de substituição.

[0027] De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende prover pelo menos um dos materiais e condições capaz de afetar um elemento de controle de expressão em um zigoto ou embrião, em que o zigoto ou o embrião tem um genoma, incluindo: i) um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA; ii) um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia capaz de se ligar ao sítio alvo; e iii) um elemento de controle de expressão, que é posicionado em pelo menos um entre a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[0028] De acordo com um aspecto adicional da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um embrião tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende: i) preparar uma célula doadora transgênica tendo um genoma, em que o genoma inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia capaz de se ligar ao sítio alvo, um elemento de controle de expressão que é posicionado em pelo menos um entre a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica um Endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, em que o genoma inclui uma edição gênica, que ocorreu em um sítio alvo presente no genoma; e

10 / 353 ii) transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[0029] De acordo com ainda um aspecto adicional da presente divulgação, a presente invenção provê um método para preparar um animal tendo um genoma que inclui uma edição gênica ocorrida em um sítio alvo presente no genoma, o método compreende: i) preparar um embrião tendo um genoma, em que o genoma inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia capaz de se ligar ao sítio alvo, um elemento de controle de expressão que é posicionado em pelo menos um entre a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica um endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, em que o genoma inclui uma edição gênica, que ocorreu em um sítio alvo presente no genoma; e ii) transplantar o embrião no útero de uma mãe de substituição. [Efeitos da invenção]

[0030] De acordo com a tecnologia divulgada pelo presente relatório descritivo, ocorrem os seguintes efeitos.

[0031] De acordo com uma forma de realização divulgada pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um animal transgênico que inclui um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada. Adicionalmente, um animal transgênico no qual a manipulação genética pode ser realizada com mais eficácia pode ser provido. Além disso, pode ser provido um animal transgênico de plataforma para a preparação de células, embriões e/ou animais, nos quais vários genes são inativados ou modificados.

[0032] De acordo com outra forma de realização divulgada pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um embrião transgênico que inclui um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease

11 / 353 manipulada. Adicionalmente, um embrião transgênico no qual a manipulação genética pode ser realizada de forma mais eficaz pode ser provido. Além disso, pode ser provido um embrião transgênico de plataforma para a preparação de células, embriões e/ou animais, nos quais vários genes são inativados ou modificados. [BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]

[0033] A FIG. 1 ilustra uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada.

[0034] A FIG. 2 ilustra algumas formas de realização de um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada.

[0035] A FIG. 3 ilustra cromossomos formados a partir do genoma presente em uma célula.

[0036] A FIG. 4 ilustra várias formas de uma toolbox inserida no cromossomo.

[0037] A FIG. 5 ilustra uma célula somática e uma célula germinativa, que respectivamente têm um genoma no qual uma toolbox é inserida.

[0038] A FIG. 6 ilustra um zigoto no estágio de 1 célula que tem um genoma no qual uma toolbox é inserida; e um embrião de estágio de 2 células, um embrião de estágio de 4 células, um embrião de estágio de 8 células e um embrião de estágio de 16 células, que são divididos a partir do zigoto de estágio de 1 célula.

[0039] A FIG. 7 ilustra um embrião de estágio de 2 células, um embrião de estágio de 4 células, um embrião de estágio de 8 células e um embrião de estágio de 16 células, nos quais uma toolbox é inserida em cada genoma de algumas células.

[0040] A FIG. 8 ilustra: uma toolbox, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA sem um elemento de controle de expressão e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia; e uma

12 / 353 forma na qual o sítio alvo específico é clivado dentro de um genoma no qual a toolbox é inserida.

[0041] A FIG. 9 ilustra algumas formas de realização de uma toolbox que inclui um elemento de controle de expressão.

[0042] A FIG. 10 ilustra algumas formas de realização de um elemento de controle de expressão.

[0043] A FIG. 11 ilustra algumas formas de realização de uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[0044] A FIG. 12 ilustra um processo de edição gênica dentro de uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[0045] A FIG. 13 ilustra outro processo de edição gênica dentro de uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[0046] A FIG. 14 ilustra ainda outro processo de edição gênica dentro de uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[0047] A FIG. 15 ilustra um processo de modificação de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo e um polinucleotídeo que codifica um ligante para um polinucleotídeo doador; e um processo de produção de uma proteína alvo a partir de uma célula, na qual o polinucleotídeo doador é modificado, ou um animal transgênico que inclui a célula.

[0048] A FIG. 16 ilustra um método para selecionar células tendo um genoma no qual uma toolbox de superfície é inserida.

[0049] A FIG. 17 ilustra um método para selecionar células nas quais a edição gênica ocorreu em uma toolbox de superfície.

[0050] A FIG. 18 ilustra um genoma no qual uma toolbox autodestrutiva é inserida, uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox autodestrutiva é inserida, uma forma na qual a edição gênica ocorreu em uma toolbox autodestrutiva, e uma célula na qual a edição gênica ocorreu em uma toolbox autodestrutiva.

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[0051] A FIG. 19 ilustra uma forma de um genoma no qual uma toolbox de inativação de SRY é inserida e um genoma no qual um gene SRY é inativado em um genoma no qual uma toolbox de inativação de SRY é inserida.

[0052] A FIG. 20 ilustra genomas nos quais uma toolbox de classificação de cromossomos XY é inserida, e um processo no qual embriões tendo cromossomo XX e embriões tendo cromossomo XY são classificados pela toolbox de classificação de cromossomos XY.

[0053] A FIG. 21 ilustra uma forma de realização de uma toolbox de excisão na qual a expressão de uma transposase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[0054] A FIG. 22 ilustra outra forma de realização de uma toolbox de excisão na qual a expressão de uma transposase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[0055] A FIG. 23 ilustra uma forma de realização de uma toolbox de excisão na qual a expressão de uma recombinase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[0056] A FIG. 24 ilustra parte de um vetor no qual um gene que codifica a proteína fluorescente verde (gene da proteína fluorescente verde) é incluído e parte de um vetor no qual um gene que codifica a proteína fluorescente vermelha (gene da proteína fluorescente vermelha) é incluído.

[0057] A FIG. 25 mostra imagens que ilustram a expressão de uma proteína fluorescente em uma célula doadora tendo um genoma, na qual uma toolbox incluindo um gene que codifica a proteína fluorescente (gene da proteína fluorescente) é inserida.

[0058] A FIG. 26 mostra imagens que ilustram o resultado de RT-PCR, que mostra a presença/ausência de expressão de mRNA de um gene da proteína fluorescente verde ou um gene da proteína fluorescente vermelha em um embrião clonado; e o resultado da PCR de DNA, que confirma a inserção do

14 / 353 gene da proteína fluorescente verde ou do gene da proteína fluorescente vermelha no genoma de um embrião clonado.

[0059] A FIG. 27 mostra imagens que ilustram a expressão de uma proteína fluorescente em um embrião clonado tendo um genoma, no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente é inserida.

[0060] A FIG. 28 ilustra a constituição parcial de vários vetores nos quais cada vetor inclui um gene da proteína fluorescente.

[0061] A FIG. 29 mostra imagens que ilustram uma vaca transgênica tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene que codifica a proteína fluorescente amarela (gene da proteína fluorescente amarela) é inserida e os resultados confirmam a expressão de uma proteína fluorescente amarela na vaca transgênica.

[0062] A FIG. 30 mostra imagens que ilustram os resultados confirmando a expressão de uma proteína fluorescente verde na vaca transgênica tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene que codifica a proteína fluorescente verde é inserida.

[0063] A FIG. 31 mostra imagens que ilustram uma vaca transgênica tendo um genoma no qual uma toolbox, que inclui um elemento de controle de expressão, um gene da proteína fluorescente verde, e um gene da proteína fluorescente vermelho, é inserida; e os resultados da confirmação da expressão de uma proteína fluorescente vermelha quando a vaca transgênica é tratada com um material que afeta o elemento de controle da expressão.

[0064] A FIG. 32 mostra imagens que ilustram os resultados da PCR e RT-PCR do DNA confirmando a inserção e a transcrição de um gene da proteína fluorescente verde em uma vaca transgênica tendo um genoma no qual uma toolbox, que inclui um elemento de controle de expressão, um gene da proteína fluorescente verde, e um gene da proteína fluorescente vermelho, é inserida, e os resultados da PCR do DNA confirmam que o gene da proteína fluorescente verde é removido e apenas o gene da proteína fluorescente

15 / 353 vermelha é presente de acordo com o tratamento com um material que afeta o elemento de controle da expressão na vaca transgênica.

[0065] A FIG. 33 mostra imagens que ilustram uma vaca descendente tendo um genoma no qual uma toolbox, incluindo um gene da proteína fluorescente, é inserida, e a expressão de uma proteína fluorescente em células primárias da vaca descendente.

[0066] A FIG. 34 mostra imagens que ilustram os resultados da análise da PCR do DNA confirmando a presença de um gene da proteína fluorescente no genoma de uma vaca descendente tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene que codifica a proteína fluorescente é inserida.

[0067] A FIG. 35 mostra imagens que ilustram as diferenças no nível de expressão de uma proteína fluorescente de acordo com o número de toolboxes, incluindo um gene de proteína fluorescente verde, que são inseridos no genoma.

[0068] A FIG. 36 mostra imagens que ilustram os resultados visuais e resultados de ELISA confirmando a expressão de uma proteína fluorescente verde no leite de uma vaca, que tem um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente verde é inserida.

[0069] A FIG. 37 mostra diagramas esquemáticos que ilustram o vetor de expressão de sgRNA e o vetor de expressão de Cas9 para inativar um gene da proteína fluorescente verde inserido em um genoma de uma célula.

[0070] A FIG. 38 mostra imagens que ilustram os resultados visuais de que uma proteína fluorescente verde não é expressada e os resultados que confirmam os indels de um gene da proteína fluorescente verde, após a transfecção de um vetor de expressão de sgRNA e um vetor de expressão de Cas9 em um fibroblasto bovino, que tem um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente é inserida.

[0071] A FIG. 39 mostra imagens que ilustram os resultados nos quais o DNA doador é modificado, no caso em que células primárias tendo um

16 / 353 genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente verde é inserida, foram transfectadas com gRNA capaz de atingir o gene que codifica a proteína fluorescente verde, Cas9, e DNA doador (gene de resistência à puromicina).

[0072] FIG. 40 mostra imagens que ilustram que uma proteína fluorescente verde não é expressada em células primárias que foram transfectadas com o vetor de expressão de sgRNA, vetor de expressão CRISPR/Cas9 e vetor de expressão do DNA doador (gene de resistência à puromicina), que têm como alvo a proteína fluorescente verde.

[0073] A FIG. 41 mostra um diagrama esquemático que ilustra o processo no qual um polinucleotídeo doador, que tem como alvo um gene da proteína fluorescente verde presente no genoma de células primárias de bovinos, é modificado.

[0074] A FIG. 42 mostra imagens que ilustram que um gene da proteína fluorescente vermelha, que tem como alvo um gene da proteína fluorescente verde em células primárias bovinas tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente verde é inserido, é modificado e expressado.

[0075] A FIG. 43 mostra um diagrama esquemático que ilustra um vetor no qual uma toolbox incluindo o gene spCas9 está incluída, e imagens que ilustram um embrião transgênico e uma vaca transgênica, cada uma das quais tem um genoma no qual uma toolbox incluindo o gene spCas9 é inserida.

[0076] A FIG. 44 mostra resultados visuais que ilustram a expressão de uma proteína fluorescente vermelha em células primárias de uma vaca transgênica tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo o gene spCas9 é inserida; resultados de PCR de DNA que ilustram a inserção do gene spCas9 no genoma da vaca transgênica; e resultados de RT-PCR ilustrando a expressão do gene spCas9 que é inserido no genoma da vaca transgênica.

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[0077] A FIG. 45 mostra um diagrama esquemático que ilustra um processo de inativação de um gene alvo usando uma vaca tendo um genoma no qual o gene Cas9 está inserido.

[0078] A FIG. 46 mostra imagens que ilustram os resultados de inativação do gene de PRNP, gene da beta-lactoglobulina (BLG), gene do retinoblastoma 1 (Rb1), gene nanog, gene p53 e gene da beta-caseína (BCN), usando uma vaca tendo um genoma no qual o gene spCas9 é inserido.

[0079] A FIG. 47 mostra imagens que ilustram os resultados da eletroforese e análise de sequência confirmando a inativação do gene de PRNP, após a injeção de um ácido nucleico guia direcionado ao gene de PRNP em blastocistos que foram preparados usando gametas bovinos tendo um genoma no qual o gene spCas9 é inserido.

[0080] A FIG. 48 mostra imagens que ilustram que uma proteína fluorescente vermelha é expressada nas células primárias de uma vaca descendente obtida por reprodução natural de vacas tendo um genoma no qual o gene spCas9 é inserido; e a inserção do gene spCas9 e do gene Fat1 no genoma bovino descendente por PCR de DNA.

[0081] A FIG. 49 mostra imagens que ilustram os resultados da eletroforese confirmando os indels do gene de PRNP, após a transfecção de sgRNA direcionado ao gene de PRNP em células primárias de uma vaca transgênica tendo um genoma no qual o gene spCas9 é inserido.

[0082] A FIG. 50 mostra diagramas esquemáticos que ilustram parte de um vetor de polinucleotídeo doador para HDR e um vetor de polinucleotídeo doador para HITI.

[0083] A FIG. 51 mostra imagens ilustrando os resultados que confirmam a modificação do gene mcherry por HITI.

[0084] A FIG. 52 mostra imagens que ilustram os resultados que confirmam a modificação do gene mcherry por HDR.

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[0085] A FIG. 53 mostra imagens que ilustram um embrião no qual o gene mcherry, que é preparado por transferência nuclear de células somáticas, é modificado; e a expressão de mcherry no embrião em que o gene mcherry é modificado.

[0086] A FIG. 54 mostra um diagrama esquemático que ilustra parte do vetor de expressão final para permitir a expressão de spCas9 e sgRNA.

[0087] A FIG. 55 mostra imagens que ilustram a expressão de uma proteína fluorescente vermelha em células primárias de uma vaca transgênica tendo um genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo polinucleotídeos que codificam o gene spCas9 e o sgRNA; e os resultados do fPCR confirmando os indels do gene da beta-lactoglobulina nos fibroblastos da vaca transgênica.

[0088] A FIG. 56 mostra diagramas esquemáticos que ilustram parte dos vetores nos quais a expressão da endonuclease guiada por RNA pode ser controlada.

[0089] A FIG. 57 mostra uma imagem que ilustra os resultados confirmando, por PCR de DNA, a presença/ausência de indels de um gene alvo de acordo com a presença/ausência de tratamento da Cre recombinase para células, na qual a expressão de endonuclease guiada por RNA pode ser controlada.

[0090] A FIG. 58 mostra uma imagem que ilustra a sequência de um vetor doador para HDR, na qual as partes sombreadas entre as sequências inteiras representam o primeiro braço de homologia e o segundo braço de homologia, respectivamente.

MELHOR MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0091] De acordo com uma forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um embrião transgênico que tem um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

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[0092] Por exemplo, um zigoto transgênico ou embrião transgênico, que tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA que é incluída entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, pode ser provido. Especificamente, o embrião pode ser um embrião de um artiodáctilo. Além disso, um zigoto transgênico ou embrião transgênico, que inclui ainda um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, capaz de se ligar especificamente a um sítio alvo presente no genoma do zigoto ou embrião, entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR, pode ser provido. Neste momento, um elemento de controle de expressão pode ser incluído em pelo menos um entre a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleaotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[0093] Em um outro exemplo, um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma segunda célula que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente em um segundo local, e o primeiro local e o segundo local são diferentes, pode ser provido. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos uma dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo incluído no genoma do embrião e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Nesse momento, a sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[0094] Em um outro exemplo, um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente

20 / 353 em um segundo local e o primeiro local e o segundo local são iguais entre si, pode ser provido. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos uma dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo incluído no genoma do embrião e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. No momento, a sequência da primeira toolbox é diferente da sequência da segunda toolbox. O genoma da primeira célula pode incluir adicionalmente uma terceira toolbox que tem a mesma sequência que a primeira toolbox. O genoma da segunda célula pode incluir adicionalmente uma quarta toolbox que tem a mesma sequência que a segunda toolbox. O embrião transgênico pode incluir adicionalmente uma terceira célula tendo um genoma que não inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[0095] Em um outro exemplo, pode ser provido um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo, e uma segunda célula tendo um genoma que inclui o sítio alvo. A primeira toolbox pode incluir pelo menos um dentre um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo, e o genoma da segunda célula pode não incluir um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo. Adicionalmente, uma sequência de ITR pode adicionalmente ser incluída nas extremidades 5’ e 3’ da primeira toolbox. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e a sequência do polinucleotídeo que codifica a segunda endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra, e a sequência do

21 / 353 polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e a sequência do polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia podem ser iguais ou diferentes um do outro. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo. Especificamente, o sítio alvo pode ser uma sequência de bases de 18 pb a 25 pb presente no genoma do embrião transgênico. O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio alvo pode ser uma sequência adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM, e o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR.

[0096] De acordo com outra forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um método para preparar um embrião transgênico que tem um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

[0097] Um método para preparar o embrião transgênico pode incluir a microinjeção de um vetor, que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada, em um zigoto ou embrião. Adicionalmente, o método pode incluir a microinjeção de uma transposase, que pode interagir com o gene de transposon, em um zigoto ou embrião. A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e depois microinjetado no zigoto ou embrião. Um tipo de embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, pode incluir uma primeira célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro, e uma segunda célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma segunda

22 / 353 nuclease manipulada tem um genoma incluído em um segundo local que é diferente do primeiro local. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra. Outro tipo de embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, pode incluir uma primeira célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro local, e uma segunda célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma segunda nuclease manipulada tem um genoma incluído no primeiro local. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra.

[0098] Um outro método para preparar um embrião transgênico pode incluir a preparação de uma célula doadora transgênica, na qual um componente de uma nuclease manipulada é expressada, e o transplante do núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado. A preparação da célula doadora transgênica pode incluir a transformação de uma célula com um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica um gene de transposon e o componente da nuclease manipulada. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente a transformação da célula com uma transposase que pode interagir com o gene de transposon. A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo, ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral. Adicionalmente, os polinucleotídeos que codificam a transposase podem ser incorporados em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e, em seguida, microinjetado em um zigoto ou embrião.

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[0099] De acordo com ainda outra forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um animal transgênico tendo um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

[00100] Por exemplo, um animal transgênico tendo um genoma, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA que é incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, pode ser provido. Especificamente, o animal pode ser um artiodáctilo. Adicionalmente, um animal transgênico, no qual um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo presente no animal é incluído adicionalmente entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR. Neste momento, um elemento de controle de expressão pode ser incluído em um ou mais entre a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00101] Em um outro exemplo, um animal transgênico quimérico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma incluindo uma toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que não inclui uma toolbox, pode ser provida. Especificamente, pode ser provido um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo, e uma segunda célula tendo um genoma que inclui o sítio alvo. A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo, e o genoma da segunda célula pode não incluir um polinucleotídeo que codifica um segunda endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo. Adicionalmente, uma sequência de ITR pode ser incluída adicionalmente nas extremidades 5’ e 3’ da primeira toolbox. Neste momento, a sequência do

24 / 353 polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e a sequência do polinucleotídeo que codifica a segunda endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra e a sequência do polinucleotídeo que codifica o primeiro guia o ácido nucleico e a sequência do polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia podem ser iguais ou diferentes um do outro. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo. Especificamente, o sítio alvo pode ser uma sequência base de 18 pb a 25 pb presente no genoma do animal transgênico. O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio alvo pode ser uma sequência adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM, e o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR.

[00102] De acordo com outra forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um método para preparar um embrião transgênico que possui um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

[00103] Um método para preparar o embrião transgênico pode incluir a microinjeção de um vetor, que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada, em um zigoto ou embrião. Adicionalmente, o método pode incluir a microinjeção de uma transposase, que pode interagir com o gene de transposon, em um zigoto ou embrião. A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que está incluído em um vetor plasmídeo ou vetor viral. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e depois microinjetado no zigoto ou embrião. Um tipo de embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, pode incluir uma primeira célula, na qual um

25 / 353 polinucleotídeo que codifica um componente de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro local e uma segunda célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma segunda nuclease manipulada tem um genoma incluído em um segundo local que é diferente do primeiro local. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra. Outro tipo de embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, pode incluir uma primeira célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro local, e uma segunda célula, na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma segunda nuclease manipulada tem um genoma incluído no primeiro local. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica o componente da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra.

[00104] Outro método para preparar um embrião transgênico pode incluir a preparação de uma célula doadora transgênica, na qual um componente de uma nuclease manipulada é expressada, e o transplante do núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado. A preparação da célula doadora transgênica pode incluir a transformação de uma célula com um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica um gene de transposon e o componente da nuclease manipulada. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente a transformação da célula com uma transposase que pode interagir com o gene de transposon. A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que é incluído em um vetor plasmídeo ou vetor viral. Além disso, os polinucleotídeos que

26 / 353 codificam a transposase podem ser incorporados em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e, em seguida, microinjetados em um zigoto ou embrião.

[00105] De acordo com ainda outra forma de realização proporcionada pelo presente relatório descritivo, pode ser proporcionado um animal transgênico tendo um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

[00106] Por exemplo, um animal transgênico tem um genoma, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA que é incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, pode ser provido. Especificamente, o animal pode ser um artiodáctilo. Adicionalmente, um animal transgênico, no qual um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo presente no animal é adicionalmente incluído entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR. Neste momento, um elemento de controle de expressão pode ser incluído em um ou mais entre a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00107] Em outro exemplo, um animal transgênico quimérico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma incluindo uma toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que não inclui uma toolbox, pode ser provido. Especificamente, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo, e uma segunda célula tendo um genoma que inclui o sítio alvo, pode ser provido. A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia que pode se ligar ao local alvo, e o genoma da segunda célula pode não incluir um polinucleotídeo que codifica um segunda endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica

27 / 353 um segundo ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo. Adicionalmente, uma sequência de ITR pode ser adicionalmente incluída nas extremidades 5’ e 3’ da primeira toolbox. Neste momento, a sequência do polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e a sequência do polinucleotídeo que codifica a segunda endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra, e a sequência do polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e a sequência do polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia podem ser iguais ou diferentes uma da outra. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo. Especificamente, o sítio alvo pode ser uma sequência de bases de 18 pb a 25 pb presente no genoma do animal transgênico. O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio alvo pode ser uma sequência adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM, e o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR.

[00108] Em um outro exemplo, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma segunda célula que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente em um segundo local, e o primeiro local e o segundo local são diferentes, pode ser provido. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos um de polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo, que é incluído em um genoma do animal e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Nesse momento, a sequência da primeira toolbox e a sequência da segunda toolbox podem ser iguais ou diferentes uma da outra.

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[00109] Em um outro exemplo, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma segunda célula que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente em um segundo local, e o primeiro local e o segundo local são iguais um ao outro, podem ser providos. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos uma dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo, que é incluído em um genoma do animal e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. No momento, a sequência da primeira toolbox e a sequência da segunda toolbox são diferentes uma da outra. O genoma da primeira célula pode incluir adicionalmente uma terceira toolbox, que tem a mesma sequência que a primeira toolbox. O genoma da segunda célula pode incluir adicionalmente uma quarta toolbox, que tem a mesma sequência que a segunda toolbox. O animal transgênico pode incluir adicionalmente uma terceira célula, que tem um genoma que não inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00110] De acordo com outra forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um método para preparar um animal transgênico que tem um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica um componente de uma nuclease manipulada é inserido.

[00111] Um método para preparar o animal transgênico pode incluir a microinjeção de um vetor, que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica um componente da nuclease manipulada, em um zigoto ou embrião. Adicionalmente, a preparação do embrião transgênico pode

29 / 353 incluir adicionalmente a microinjeção de uma transposase, que pode interagir com o gene de transposon, no zigoto ou embrião.

[00112] Um outro método para preparar o animal transgênico pode incluir a preparação de uma célula doadora transgênica na qual um componente de uma nuclease manipulada é expressada, e o transplante do núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado do animal. A preparação da célula doadora transgênica pode incluir a transformação de uma célula com um vetor que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente a transformação da célula com uma transposase que pode interagir com o gene de transposon. A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral. Adicionalmente, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar na forma na qual o polinucleotídeo é incluído em um único vetor juntamente com o gene de transposon e o polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada.

[00113] De acordo com uma forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, um embrião transgênico, que tem um genoma editado por genes, pode ser provido.

[00114] Por exemplo, um embrião transgênico tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, e na qual um endopolinucleotídeo é inativado, pode ser provido. Neste momento, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao endopolinucleotídeo. A forma na qual o endopolinucleotídeo é inativado pode estar em i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo não está incluído na sequência do endopolinucleotídeo, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é

30 / 353 incluído na sequência do endopolinucleotídeo, e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é excluído da sequência do endopolinucleotídeo e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na mesma.

[00115] Em um outro exemplo, um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox e um sítio modificado, pode ser provido. A sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo. O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica. Especificamente, o sítio alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, e a sequência modificada pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Neste momento, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região, e a sequência da segunda região é diferente da quinta região. Cada uma da segunda região e da quinta região pode incluir uma sequência PAM. Cada uma da terceira região e da sexta região pode cada uma incluir uma sequência PAM. A sequência da quinta região pode estar em i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo não está incluído na sequência da segunda região, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na sequência da segunda região, ou iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é excluído da sequência da segunda região e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na mesma. Nos casos de ii) e iii), o pelo menos um nucleotídeo que é adicionalmente incluído pode incluir um ou mais de um componente de edição, um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido, um polinucleotídeo não traduzido, um íntron artificial e um elemento de controle de expressão.

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[00116] Em ainda um outro exemplo, um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo, e uma segunda célula, que não inclui uma toolbox, mas tem um genoma que inclui um gene modificado, pode ser provido. Neste momento, a primeira toolbox pode incluir um ou mais dentre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica. Especificamente, a sequência alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região, e uma terceira região, e a sequência modificada pode incluir uma quarta região, uma quinta região, e uma sexta região. Neste momento, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região, e a sequência da segunda região é diferente da quinta região. A sequência da quinta região pode estar em i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo não está incluído na sequência da segunda região, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é excluído da sequência da segunda região e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na mesma.

[00117] De acordo com outra forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, um animal transgênico que tem um genoma editado por genes pode ser provido.

[00118] Por exemplo, um animal transgênico tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, e no qual um endopolinucleotídeo é eliminado, pode ser provido. Neste momento, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao endopolinucleotídeo. A forma na qual o endopolinucleotídeo é eliminado pode ser qualquer uma de i) uma

32 / 353 forma na qual pelo menos um nucleotídeo não está incluído na sequência do endopolinucleotídeo, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicional incluído na sequência do endopolinucleotídeo, e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é excluído da sequência do endopolinucleotídeo e pelo menos um nucleotídeo é incluído na mesma.

[00119] Em um outro exemplo, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox e um sítio modificado, pode ser provido. A sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox. Neste momento, a primeira toolbox e/ou a segunda toolbox pode(m) incluir um ou mais de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo. O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica. Especificamente, a sequência alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, e a sequência modificada pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Neste momento, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região, e a sequência da segunda região é diferente da quinta região. A segunda região e a quinta região podem incluir uma sequência PAM. A terceira região e a sexta região podem incluir uma sequência PAM. A sequência da quinta região pode estar em i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo não está incluído na sequência da segunda região, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é excluído da sequência da segunda região e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente incluído na mesma. Nos casos de ii) e iii), o pelo menos um nucleotídeo que é incluído no mesmo pode incluir um ou mais de um componente de habilitação

33 / 353 de edição, um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido, um polinucleotídeo não traduzido, um íntron artificial, e um elemento de controle de expressão. O sítio alvo e o sítio modificado podem ser sequências adjacentes à sequência PAM. O sítio alvo e o sítio modificado podem cada um incluir uma primeira sequência de ITR na direção 5’ e cada um pode incluir uma segunda sequência de ITR na direção 3’.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [Definição de termos] Transformação (modificação genética)

[00120] Como usado na presente invenção, o termo “transformação (modificação genética)” refere-se à transformação artificial de um polinucleotídeo incluído em um genoma do animal em uma célula. A transformação inclui excluir e substituir parte do polinucleotídeo incluído no genoma do animal de uma célula, e inserir um nucleotídeo ou polinucleotídeo no genoma do animal.

[00121] Como usado na presente invenção, o termo “transformação (modificação genética)” inclui adição, modificação e exclusão de um(a) proteína ou RNA que pode ser expressado(o) em uma célula. Transformação sítio-específica

[00122] Como usado na presente invenção, o termo “transformação sítio-específica” refere-se à transformação que ocorre em um sítio específico em um genoma do animal em uma célula. A localização específica pode ser determinada por uma sequência de nucleotídeos em um genoma do animal. Por exemplo, uma endonuclease guiada por RNA pode reconhecer uma sequência de nucleotídeos, que é capaz de uma ligação complementar à parte do ácido nucleico guia, no genoma do animal, causando assim a transformação sítio- específica.

34 / 353 Célula transformada (célula transgênica)

[00123] Como usado na presente invenção, o termo “célula transformada (célula transgênica)” refere-se a uma célula que inclui uma parte transformada de um genoma do animal em uma célula.

[00124] Em um genoma do animal de uma célula, uma primeira célula incluindo uma parte transformada pode sofrer uma divisão celular. O genoma do animal de uma segunda célula obtida através da divisão celular da primeira célula pode incluir parte que tem a mesma sequência de nucleotídeos que da parte transformada da primeira célula. Como usado na presente invenção, o termo “célula transformada” inclui a primeira célula e a segunda célula. Animal transgênico (animal transformado)

[00125] Como usado na presente invenção, o termo “animal transgênico (animal transformado)” refere-se a um animal que inclui pelo menos uma célula transformada. Uma F0 de animal pode incluir uma primeira célula transformada. A F0 de animal pode produzir F1 de descendente. A pelo menos uma célula transformada que está incluída na F1 e um descendente de F1 podem incluir um genoma do animal que inclui parte tendo a mesma sequência de nucleotídeos que a da parte transformada no genoma do animal da primeira célula transformada. Como usado na presente invenção, o termo “animal transgênico” inclui a F0, a F1 e um descendente de F1.

[00126] Mesmo no caso em que a manipulação artificial direta para transformação não é aplicada durante a produção de um animal de F1 ou após a produção do animal de F1, se o animal de F1 inclui uma célula transformada, o animal de F1 pode ser considerado um animal transgênico.

[00127] No caso em que a F1 é obtida do animal de F0 após a manipulação artificial direta ser aplicada para transformação, o animal de F1 pode ser considerado como um animal transgênico. Endopolinucleotídeo

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[00128] Como usado na presente invenção, o termo “endopolinucleotídeo” refere-se a um polinucleotídeo que está incluído em um genoma do animal em uma célula na qual a transformação não ocorreu.

[00129] Uma primeira célula na qual a transformação não ocorreu pode sofrer uma divisão celular. Uma segunda célula que é obtida através da divisão celular da primeira célula pode ser uma célula transformada. A segunda célula pode incluir um polinucleotídeo que tem a mesma sequência que a do endopolinucleotídeo incluído na primeira célula. Como usado na presente invenção, o termo “endopolinucleotídeo” inclui um polinucleotídeo tendo a mesma sequência que a do endopolinucleotídeo da primeira célula entre os polinucleotídeos incluídos na segunda célula. Exopolinucleotídeo

[00130] Como usado na presente invenção, o termo “exopolinucleotídeo” refere-se a um polinucleotídeo que é introduzido em uma célula. A célula pode ou não ser uma célula transformada. O exopolinucleotídeo pode ser inserido em um genoma animal em uma célula ou pode estar presente independentemente de um genoma animal em uma célula.

[00131] Uma primeira célula na qual um exopolinucleotídeo é introduzido pode sofrer uma divisão celular. Uma segunda célula que é obtida através da divisão celular da primeira célula pode incluir um polinucleotídeo que tem a mesma sequência que a do exopolinucleotídeo. Como usado na presente invenção, o termo “exopolinucleotídeo” inclui um polinucleotídeo que tem a mesma sequência que a do exopolinucleotídeo da primeira célula entre os polinucleotídeos incluídos na segunda célula.

[00132] O animal (F0), incluindo uma célula na qual um exopolinucleotídeo é introduzido, pode produzir o descendente (F1). F1 e um descendente de F1 podem incluir uma célula que inclui um polinucleotídeo que tem a mesma sequência que a do exopolinucleotídeo da F0. Como usado na presente invenção, o termo “exopolinucleotídeo” inclui um polinucleotídeo que

36 / 353 tem a mesma sequência que a do exopolinucleotídeo da F0 entre os polinucleotídeos incluídos em uma célula da F1 e um descendente de F1. Inserção

[00133] Como usado na presente invenção, o termo “inserção” inclui “inserção de nucleotídeos” e “inserção de polinucleotídeos”. Como usado na presente invenção, o termo “inserção de nucleotídeo” refere-se à adição de um nucleotídeo no meio, na extremidade 5’ ou extremidade 3’ de um ácido nucleico. Como usado na presente invenção, o termo “inserção de polinucleotídeo” refere-se à adição de um polinucleotídeo no meio, na extremidade 5’ ou extremidade 3’ de um ácido nucleico. Exclusão

[00134] Como usado na presente invenção, o termo “exclusão” inclui “exclusão de nucleotídeos” e “exclusão de polinucleotídeos”. Como usado na presente invenção, o termo “exclusão de nucleotídeo” refere-se à exclusão de um nucleotídeo incluído em um ácido nucleico. Como usado na presente invenção, o termo “exclusão de polinucleotídeo” refere-se à exclusão de um polinucleotídeo incluído em um ácido nucleico. Substituição

[00135] Como usado na presente invenção, o termo “substituição” inclui “substituição de nucleotídeos” e “substituição de polinucleotídeos”. Como usado na presente invenção, o termo “substituição de nucleotídeo” refere-se à substituição de um nucleotídeo incluído em um ácido nucleico por outro nucleotídeo. Como usado na presente invenção, o termo “substituição de polinucleotídeo” refere-se à substituição de um polinucleotídeo incluído em um ácido nucleico por outro polinucleotídeo. Modificação (knock-in)

[00136] Como usado na presente invenção, o termo “modificação” refere-se à inserção ou substituição de um exopolinucleotídeo incluindo um gene em um genoma animal em uma célula.

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[00137] Por exemplo, um exopolinucleotídeo incluindo um gene de albumina humana pode ser inserido em um genoma de animal não humano em uma célula. Nesse caso, uma célula que inclui o genoma animal não humano pode ser capaz de expressar a albumina humana, e esse processo pode ser chamado de modificação do gene da albumina humana. Inativação (Knock-out)

[00138] Como usado na presente invenção, o termo “inativação” refere- se a tornar um gene presente em um genoma animal em uma célula incapaz de funcionar. Um gene pode ser inativado por transformação do polinucleotídeo no gene correspondente é localizado em um genoma animal em uma célula.

[00139] Por exemplo, um exopolinucleotídeo incluindo o gene da albumina humana pode ser inserido em uma sequência de nucleotídeos que corresponde a um éxon de um gene da albumina não humana presente em um genoma de animal não humano em uma célula. Nesse caso, a célula não pode expressar a albumina não humana e esse processo pode ser chamado de inativação do gene da albumina não humana.

[00140] Em um outro exemplo, parte de um éxon de um gene de albumina não humana presente no genoma de animal não humano em uma célula pode ser excluída usando uma nuclease manipulada, que tem como alvo a parte de um éxon de um gene de albumina não humana como um sítio alvo. Nesse caso, a célula não pode expressar a albumina não humana e esse processo pode ser chamado de inativação de um gene da albumina não humana. Nuclease manipulada

[00141] Como usado na presente invenção, o termo “nuclease manipulada” refere-se a uma proteína capaz de transformação sítio-específica no genoma animal, ou a um complexo que inclui a proteína. A proteína pode ser uma proteína não modificada descoberta na natureza ou proteína modificada/manipulada.

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[00142] A nuclease manipulada da presente divulgação pode incluir nuclease de dedo de zinco (ZFN), nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN) e sistema CRISPR/enzima, mas não está limitado às mesmas. Sítio alvo

[00143] Um sítio alvo de uma nuclease manipulada pode se referir a uma região de um ácido nucleico que pode ser reconhecido por um componente da nuclease manipulada.

[00144] Por exemplo, o sítio alvo do sistema CRISPR/enzima pode ser pelo menos uma sequência de nucleotídeos que é idêntica ou é capaz de ter uma ligação complementar à região parcial do ácido nucleico guia em um ácido nucleico.

[00145] Como usado na presente invenção, como um exemplo do termo “a mesma sequência de nucleotídeos”, a relação entre uracila (U) e timina (T) pode ser incluída. Como usado na presente invenção, como um exemplo do termo “sequência de nucleotídeos capaz de ligação complementar”, a relação entre uracila (U) e adenina (A) pode ser incluída.

[00146] Um sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo presente em um genoma.

[00147] Um sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo que é inserido em um genoma. Sistema CRISPR/enzima

[00148] O sistema CRISPR/enzima refere-se a um complexo que inclui uma proteína capaz de clivar parte de um sítio alvo por interação com o sítio alvo em um genoma animal em uma célula ou o sítio alvo de um exopolinucleotídeo.

[00149] O sistema CRISPR/enzima pode incluir um ácido nucleico guia e uma endonuclease guiada por RNA. Ácido nucleico guia

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[00150] Como usado na presente invenção, o termo “ácido nucleico guia” refere-se a um ácido nucleico que pode se ligar a um sítio alvo de um genoma animal em uma célula ou a um sítio alvo de um exopolinucleotídeo. Como usado na presente invenção, o termo “ácido nucleico guia” inclui um ácido nucleico guia de cadeia única (ácido nucleico guia de cadeia simples) e um ácido nucleico guia que consiste em um ácido nucleico de pelo menos duas fitas.

[00151] O ácido nucleico guia de cadeia única (ácido nucleico guia de cadeia simples) pode incluir um gRNA. O gRNA pode incluir pelo menos um dentre um domínio protoespaçador, um primeiro domínio complementar, um segundo domínio complementar, um domínio proximal e um domínio cauda.

[00152] O domínio protoespaçador é um domínio que inclui uma sequência de nucleotídeos que pode ter uma ligação complementar à parte de um sítio alvo de um genoma animal, ou parte de um sítio alvo de um exopolinucleotídeo.

[00153] O primeiro domínio complementar e o segundo domínio complementar são domínios que podem ter uma ligação complementar entre si, sendo capazes de interagir com uma endonuclease guiada por RNA. O segundo domínio complementar pode estar localizado a jusante do primeiro domínio complementar.

[00154] O domínio proximal pode estar localizado a jusante do segundo domínio complementar.

[00155] O domínio cauda pode estar localizado na extremidade 3’ de um gRNA.

[00156] O ácido nucleico guia que consiste em um ácido nucleico de pelo menos duas fitas pode incluir um gRNA duplo. O gRNA duplo pode incluir um crRNA e um tracrRNA. O crRNA pode incluir um domínio protoespaçador e um primeiro domínio complementar. O tracrRNA pode

40 / 353 incluir um segundo domínio complementar, um domínio proximal e um domínio cauda. Endonuclease guiada por RNA

[00157] Como usado na presente invenção, o termo “endonuclease guiada por RNA” refere-se a um(a) polipeptídeo ou proteína que inclui um domínio capaz de interagir com um polinucleotídeo e um domínio capaz de clivar um meio do polinucleotídeo.

[00158] Uma endonuclease guiada por RNA pode incluir proteína SpCas9, CjCas9, StCas9, SaCas9, NmCas9, Cpf1 e um mutante das mesmas, mas não está limitado às mesmas.

[00159] De acordo com a finalidade modificada/projetada, uma endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, Cas9 nickase, eSpCas9 e SpCas9-HF1 morta, mas não está limitado às mesmas.

[00160] A endonuclease guiada por RNA pode clivar uma fita dupla interagindo com um ácido nucleico ou pode clivar uma fita da fita dupla interagindo com um ácido nucleico. Alternativamente, a endonuclease guiada por RNA pode interagir com um ácido nucleico, mas pode não clivar o ácido nucleico.

[00161] No caso em que a endonuclease guiada por RNA interage com um ácido nucleico e, assim, cliva uma fita dupla ou uma fita da fita dupla, pode ocorrer a inserção de nucleotídeos ou a inserção de polinucleotídeos na região clivada. Alternativamente, no caso em que a endonuclease guiada por RNA interage com um ácido nucleico e assim cliva uma fita dupla ou uma fita da fita dupla, pode ocorrer a exclusão de nucleotídeos ou a exclusão de polinucleotídeos na região clivada. Sítio alvo do sistema CRISPR/enzima

[00162] Um sítio alvo de um genoma animal em uma célula ou um sítio alvo de um exopolinucleotídeo pode ser uma sequência de nucleotídeos

41 / 353 adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência de motivo adjacente a protoespaçador (PAM).

[00163] A sequência PAM pode incluir NGG, NNGRRT, NNAGAAW, NNNNGATT, NNNVRYAC e TTN, mas não está limitada às mesmas. O N pode ser qualquer um dentre A, T, U, G e C. O V pode ser qualquer um entre A, C e G. O W pode ser qualquer um entre A e T. O Y pode ser qualquer um entre C e T.

[00164] A sequência PAM pode variar dependendo da endonuclease guiada por RNA. Por exemplo, a sequência PAM para SpCas9 ou um mutante da mesma pode ser NGG. Por exemplo, a sequência PAM para SaCas9 ou um mutante da mesma pode ser NNGRRT. Por exemplo, a sequência PAM para StCas9 ou um mutante da mesma pode ser NNAGAAW. Por exemplo, a sequência PAM para NmCas9 ou um mutante da mesma pode ser NNNGATT. Por exemplo, a sequência PAM para CjCas9 ou um mutante da mesma pode ser NNNVRYAC. Por exemplo, a sequência PAM para Cpf1 e um mutante da mesma pode ser TTN. Sistema de transposon Transposon

[00165] Como usado na presente invenção, o termo “transposon” refere- se a um polinucleotídeo que pode ser translocado dentro de um genoma animal em uma célula. Além disso, o termo “transposon” refere-se a um polinucleotídeo que pode ser translocado entre um ácido nucleico e um genoma animal em uma célula.

[00166] O transposon pode ser dividido em transposon Classe I (retrotransposon) e transposon Classe II (transposon DNA).

[00167] O transposon de Classe I é operado de tal maneira que o RNA seja transcrito do DNA do transposon de um ácido nucleico ou em um genoma animal de uma célula e, em seguida, o DNA que é transcrito reversamente do RNA é inserido em uma localização diferente no genoma animal.

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[00168] O transposon Classe II é operado de tal maneira que o DNA do transposon em um ácido nucleico ou genoma animal é clivado em uma célula, e o DNA do transposon clivado é inserido em uma localização diferente no genoma animal.

[00169] O transposon de Classe II pode incluir um primeiro polinucleotídeo na extremidade 5’, um segundo polinucleotídeo na extremidade 3’, e um terceiro polinucleotídeo. O primeiro polinucleotídeo e o segundo polinucleotídeo podem incluir uma sequência de repetição terminal invertida (doravante, ITR). O terceiro polinucleotídeo pode estar localizado entre um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. O terceiro polinucleotídeo pode incluir um exopolinucleotídeo. O terceiro polinucleotídeo pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma transposase.

[00170] Salvo indicação em contrário, o termo “transposon” refere-se ao caso em que o transposon é transposon de Classe II; no entanto, no caso em que não há problemas do aspecto técnico, mesmo quando “transposon” é interpretado como transposon de Classe I, ele não será ser necessário interpretar o transposon como transposon da Classe II. Transposase

[00171] Como usado na presente invenção, o termo “transposase” refere-se a uma proteína, que pode clivar o transposon Classe II ou inserir o transposon Classe II em um genoma animal, por interação com sequências ITR localizadas em ambas as extremidades do transposon Classe II localizado em um núcleo ácido ou genoma animal em uma célula.

[00172] A transposase pode incluir hobo/Ac/Tam, elemento P, Bela Adormecida (SB), Frog Prince, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2 e um mutante dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.

[00173] A transposase pode clivar transposons presentes em um ácido nucleico ou genoma animal em uma célula.

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[00174] A transposase pode inserir um transposon de Classe II em um genoma animal.

[00175] A localização na qual a transposase insere o transposon de Classe II em um genoma animal pode não estar relacionado à sequência de nucleotídeos no genoma animal.

[00176] A localização na qual a transposase insere o transposon de Classe II em um genoma animal pode ser determinada por uma sequência de nucleotídeos específica no genoma animal que pode ser reconhecida pela transposase. Por exemplo, no caso da Bela Adormecida, a transposase Bela Adormecida pode inserir um transposon reconhecendo uma sequência TA no genoma animal. Além disso, a transposase piggyBac pode inserir um transposon, reconhecendo uma sequência TTAA no genoma animal.

[00177] A transposase e o transposon de Classe II podem ser usados para inserção de um exopolinucleotídeo em um genoma animal em uma célula. Por exemplo, o exopolinucleotídeo pode ser inserido em um genoma animal em uma célula por dispensação, a uma célula, de um exopolinucleotídeo incluindo uma sequência de ITR, que é capaz de interagir com a piggyBac transposase e piggyBac, na extremidade 5’ e na extremidade 3’, respectivamente.

[00178] Neste caso, não há necessidade de determinar antecipadamente a localização na qual o exopolinucleotídeo deve ser inserido, ou alterar a sequência de nucleotídeos do exopolinucleotídeo, dependendo da localização onde o exopolinucleotídeo deve ser inserido.

[00179] Adicionalmente, não há limite para o número de exopolinucleotídeos que podem ser inseridos em um genoma animal em uma célula. Por conseguinte, o nível de expressão da proteína alvo de uma célula pode ser aumentado através da inserção de uma pluralidade de exopolinucleotídeos que codificam a proteína alvo em um genoma animal em uma célula.

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[00180] Adicionalmente, a localização na qual o exopolinucleotídeo é inserido por uma transposase pode ser uma localização na qual uma expressão gênica de uma célula não é inibida. Por exemplo, no caso da piggyBac transposase, um transposon pode ser inserido em um íntron, UTR 5’ ou UTR 3’ em um genoma animal. Recombinação sítio-específica

[00181] Como usado na presente invenção, o termo “recombinação sítio-específica” refere-se a um fenômeno no qual duas sequências de nucleotídeos da mesma propriedade ou propriedade idêntica em um ácido nucleico ou genoma animal formam um par e, assim, ocorre uma troca alternada entre o par de sequências de nucleotídeos. Nesse caso, a sequência de nucleotídeos em que ocorre a troca alternada é denominada sítio de reconhecimento de recombinase (RRS). Adicionalmente, a proteína que interage com um par de RRSs e promove a recombinação sítio-específica é chamada recombinase sítio-específica (SSR). Sítio de reconhecimento de recombinase

[00182] O sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) da presente divulgação pode incluir loxp, rox, FRT, attP, attB e um mutante dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos. O loxp mutante pode incluir loxp66, loxp71, loxp72, loxp2722, loxp5171 e loxpm2, mas não está limitado aos mesmos. O rox mutante pode incluir rox4R, rox6R e rox2N, mas não está limitado aos mesmos. O mutante de FRT pode incluir F3, F5, F10, F11, F12, F13, F14, F15 e F16, mas não está limitado aos mesmos.

[00183] No RRS, dois podem formar um par e, assim, interagir com a SSR. No loxp ou loxp mutante, dois dos mesmos RRSs podem formar um par. No rox ou rox mutante, dois dos mesmos RRSs podem formar um par. No FRT ou um mutante de FRT, dois dos mesmos RRSs podem formar um par. O attP pode formar um par com attB. Recombinase sítio-específica

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[00184] A recombinase sítio-específica (SSR) ou recombinase da presente divulgação pode incluir Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, lambda, HK022, HP1, gama delta, ParA, Tn3, Hin, Gin, Pin, phiC31, Bxb1, R4 ou um mutante da mesma, mas não está limitado ao mesmo.

[00185] A SSR pode interagir com um par de RRSs. A Cre ou mutante de Cre pode interagir especificamente com loxp ou um loxp mutante. A Dre ou mutante de Dre pode interagir especificamente com rox ou um rox mutante. O Flp ou mutante de Flp pode interagir especificamente com FRT ou um mutante de FRT. O PhiC31 ou um mutante de phiC31 podem interagir especificamente com attP e attB. Tipos de recombinação sítio-específica

[00186] A recombinação sítio-específica da presente divulgação pode incluir inserção, exclusão, inversão e troca.

[00187] A recombinação sítio-específica pode ser reversível ou irreversível. Inserção

[00188] Quando um de um par de RRSs é localizado em um primeiro ácido nucleico e o outro é localizado em um segundo ácido nucleico, uma inserção do segundo ácido nucleico pode ocorrer no primeiro ácido nucleico através de uma interação com uma SSR, que é específica para o par de RRSs.

[00189] Quando a inserção é reversível, o segundo ácido nucleico pode ser excluído por meio de uma interação com uma SSR. Exclusão

[00190] Quando um par de RRSs é localizado na mesma direção em relação a um ácido nucleico, uma exclusão de um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs pode ocorrer através de uma interação com uma SSR, que é específica para o par de RRSs.

[00191] Quando a exclusão é reversível, pode ocorrer uma inserção de um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs.

46 / 353 Inversão

[00192] Quando um par de RRSs é localizado em uma direção oposta em relação a um ácido nucleico, uma inversão de um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs pode ocorrer através de uma interação com uma SSR, que é específica para o par de RRSs.

[00193] Quando a inversão é reversível, pode ocorrer novamente uma inversão de um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs. Troca

[00194] Quando RRS A e RRS B formam um par e RRS C e RRS D formam um par, o RRS A e RRS C podem estar localizados em um primeiro ácido nucleico, e o RRS B e RRS D podem estar localizados em um segundo ácido nucleico. No primeiro ácido nucleico, o RRS C pode estar localizado mais a jusante do RRS A, e no segundo ácido nucleico, o RRS D pode estar localizado mais a jusante do RRS B. Nesse caso, uma interação com a SSR, que é específica para o primeiro par de RRSs, e uma interação com a SSR, que forma um par com o segundo par de RRSs, podem ocorrer. Pode ocorrer uma troca entre um polinucleotídeo localizado entre o RRS A e o RRS C e um polinucleotídeo localizado entre o RRS B e o RRS D.

[00195] Quando a troca é reversível, uma troca pode ocorrer novamente entre um polinucleotídeo, que é localizado entre o RRS A e o RRS C e um polinucleotídeo, que é localizado entre o RRS B e o RRS D. Gene marcador

[00196] Como usado na presente invenção, o termo “gene marcador” refere-se a um gene que é inserido em um genoma animal em uma célula, de modo a selecionar as células para as quais a transformação pretendida é alcançada. Quando um exopolinucleotídeo contendo um polinucleotídeo que codifica um gene marcador é introduzido em uma célula e então o exopolinucleotídeo é inserido em um genoma animal, o gene marcador pode ser expressado na célula, sendo útil na seleção de células.

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[00197] O gene marcador pode incluir um gene de resistência a antibióticos, gene de antígeno, gene de luciferase, gene de beta-galactosidase, um gene que codifica proteína fluorescente, gene marcador de superfície e gene autodestrutivo, mas não está limitado aos mesmos. Gene de resistência a antibióticos

[00198] Quando o gene marcador é um gene de resistência a antibióticos, a seleção de células pode ser realizada por cultura juntamente com um composto antibiótico. O composto antibiótico pode incluir ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina e canamicina, mas não está limitado aos mesmos. Gene de antígeno

[00199] Quando o gene marcador é um gene que codifica um antígeno ou um gene incluindo nucleotídeo que pode atuar como antígeno, a seleção de células pode ser realizada por cultura juntamente com um anticorpo que pode atuar especificamente sobre o antígeno. O antígeno pode incluir um antígeno de superfície. O antígeno de superfície pode incluir uma molécula de CD. O anticorpo pode interagir com uma partícula magnética ou um fluoróforo. Gene da luciferase

[00200] Quando o gene marcador é um gene da luciferase, a seleção de células pode ser realizada por cultura juntamente com a luciferina. Gene da beta-galactosidase

[00201] Quando o gene marcador é um gene da beta-galactosidase, a seleção de células pode ser realizada por cultura juntamente com 5-bromo-4- cloro-3-indolil-beta-d-galactopiranósido (X-gal). Gene que codifica proteína fluorescente (gene da proteína fluorescente)

[00202] Quando o gene marcador é um gene que codifica a proteína fluorescente, a seleção de células pode ser realizada medindo o sinal de fluorescência. A proteína fluorescente pode incluir uma proteína fluorescente verde (doravante, GFP), proteína fluorescente amarela (doravante, YFP) e

48 / 353 proteína fluorescente vermelha (doravante, RFP), mas não está limitada às mesmas. Gene autodestrutivo

[00203] Quando o gene marcador é um gene autodestrutivo, a seleção de células pode ser realizada por cultura juntamente com um pró-fármaco que forma um par com o gene autodestrutivo. O gene autodestrutivo pode incluir um gene da timidina quinase, gene da citosina desaminase, gene do citocromo P450, gene da nitrorredutase, gene da purina nucleosídeo fosforilase e gene da carboxipeptidase G2, mas não está limitado aos mesmos. O pró-fármaco pode incluir aciclovir, ganciclovir, 5-fluorocitosina, ciclofosfamida, ifosfamida, 5- [aziridin-1-il]-2,4-dinitrobenzamida (CB1954), 6-metilpurina-2- desoxirribosídeo (MeP-dR), monofosfato de arabinofuranosil-2-fluoroadenina (F-araA) e ácido N,N-[(2-cloroetil)(2-mesiloxietil)amino]benzoico) (CMDA), mas não está limitado aos mesmos. Elemento de controle de expressão

[00204] Como usado na presente invenção, o termo “elemento de controle de expressão” inclui um elemento de controle de transcrição, elemento de controle de processamento pós-transcrição, elemento de controle de tradução, e elemento de controle de modificação pós-tradução. Elemento de controle de transcrição

[00205] Como usado na presente invenção, o termo “elemento de controle de transcrição” refere-se a um material ou sequência de nucleotídeos que é capaz de iniciar, promover, inibir ou terminar a síntese de mRNA a partir de RNA ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[00206] O elemento de controle de transcrição pode incluir um intensificador, silenciador, repressor, ativador, inibidor, promotor, códon de parada de transcrição e códon de parada de transcrição de loxp-loxp (doravante, LTL), mas não está limitado a isso. O códon de parada da transcrição pode incluir uma sequência poli T (o termo “sequência poli T” é usado de forma

49 / 353 intercambiável com o termo “sequência poliA”.) e uma sequência AATAAA, mas não está limitada às mesmas. Elemento de controle de processamento pós-transcrição

[00207] Como usado na presente invenção, o termo “elemento de controle de processamento pós-transcrição” refere-se a um(a) composto químico, polinucleotídeo ou enzima que é capaz de causar uma modificação na estrutura de um mRNA sintetizado a partir de um polinucleotídeo.

[00208] O elemento de controle de processamento pós-transcrição pode incluir um(a) composto químico, polinucleotídeo ou enzima que pode causar capeamento em 5’, clivagem em 3’, poliadenilação 3’ ou splicing, mas não está limitado aos mesmos. Elemento de controle de tradução

[00209] Como usado na presente invenção, o termo “elemento de controle de tradução” refere-se a uma sequência de material ou nucleotídeo que é capaz de iniciar, promover, inibir ou terminar a síntese de um polipeptídeo a partir de um mRNA.

[00210] O elemento de controle de tradução pode incluir uma região não traduzida em 3’ (doravante, UTR 3’), uma região não traduzida em 5’ (doravante, UTR 5’), um éxon, um íntron, um códon de partida, um códon de parada, sequência Kozak, IRES, um polinucleotídeo que codifica o peptídeo 2A, loxp-códon de parada-loxp (doravante, LSL), mas não está limitado aos mesmos. Elemento de controle de modificação pós-tradução

[00211] Como usado na presente invenção, o termo “elemento de controle de modificação pós-tradução” refere-se a um(a) composto químico, polinucleotídeo ou enzima que pode causar modificação na estrutura de um polipeptídeo sintetizado a partir de mRNA.

[00212] O elemento de controle de modificação pós-tradução pode incluir um(a) composto químico ou enzima que pode causar glicosilação,

50 / 353 enovelamento, ubiquitinação, sumoilação, acetilação e fosforilação do polipeptídeo que é transcrito e traduzido do polinucleotídeo, mas não está limitado aos mesmos. Promotor

[00213] O “promotor” da presente divulgação é uma sequência de ácidos nucleicos que interage com uma RNA polimerase em um ácido nucleico e, assim, inicia a transcrição. O “promotor” da presente divulgação inclui um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. Promotor constitutivo

[00214] O “promotor constitutivo” da presente divulgação refere-se a um promotor que permite que a transcrição seja iniciada independentemente das mudanças ambientais em uma célula. O promotor constitutivo pode incluir o promotor CMV, o promotor CAG e o promotor U6, mas não está limitado aos mesmos. Promotor tecido-específico

[00215] O “promotor tecido-específico” da presente divulgação refere- se a um promotor que é capaz de iniciar a transcrição apenas em um tecido específico de um animal. O promotor tecido-específico pode incluir um promotor tecido-específico da glândula mamária ou promotor específico de órgão reprodutor, mas não está limitado aos mesmos.

[00216] O promotor tecido-específico da glândula mamária pode incluir promotor alfa-caseína, promotor beta-caseína, promotor capa-caseína, promotor mu-caseína e promotor beta-lactoglobulina, mas não está limitado aos mesmos.

[00217] O promotor específico de órgão reprodutivo pode incluir um promotor específico de ovário e promotor específico de testículo, mas não está limitado aos mesmos. Promotor induzível

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[00218] O “promotor induzível” da presente divulgação refere-se a um promotor que inicia a transcrição em resposta a mudanças no ambiente intracelular ou ambiente extracelular. O promotor induzível pode incluir um promotor quimicamente induzível, promotor induzível por temperatura e promotor induzível por luz, mas não está limitado aos mesmos.

[00219] O promotor quimicamente induzível pode incluir um promotor induzível por antibióticos, promotor induzível por álcool, promotor induzível por esteroide e promotor induzível por metais, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por antibióticos pode incluir o promotor Tet-on e o promotor Tet-off, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por esteroide pode incluir promotor induzível por estrogênio, mas não está limitado ao mesmo. O promotor induzível por metal pode incluir um promotor induzível por cobre, mas não está limitado ao mesmo.

[00220] O promotor induzível por temperatura pode incluir um promotor induzível por choque a quente e um promotor induzível ao choque a frio, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por choque a quente pode incluir o promotor Hsp, mas não está limitado ao mesmo. Dispensação

[00221] Como usado na presente invenção, o termo “dispensação” pode se referir à introdução de um exopolinucleotídeo no(a) órgão, tecido, célula ou organela subcelular de um organismo vivo.

[00222] Como usado na presente invenção, o termo “dispensação” também pode se referir à introdução de um(a) polipeptídeo ou proteína no(a) órgão, tecido, célula ou organela subcelular de um organismo vivo.

[00223] Na presente divulgação, o termo “dispensação” pode ser usado de forma intercambiável com o termo “provisão”. Dispensação não viral

[00224] A dispensação pode incluir dispensação não viral.

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[00225] A dispensação não viral pode usar um vetor de ácido nucleico nu. O vetor de ácido nucleico nu pode incluir um vetor circular de ácido nucleico e um vetor linear de ácido nucleico. O vetor circular de ácido nucleico pode incluir um vetor plasmídico, mas não está limitado ao mesmo.

[00226] A dispensação não viral pode usar um vetor não viral. O vetor não viral pode incluir cromossomo artificial, lipossomo, um polímero, um híbrido lipídeo-polímero, uma nanopartícula inorgânica, e uma nanopartícula orgânica, mas não está limitado aos mesmos.

[00227] A dispensação não viral pode incluir microinjeção, biolística, eletroporação, sonoporação, fotoporação, magnetofecção e hidroporação, mas não está limitada às mesmas. Dispensação viral

[00228] A dispensação do gene pode incluir dispensação viral.

[00229] A dispensação viral pode usar um vetor viral com base em RNA. O vetor viral com base em RNA pode incluir um vetor oncoretroviral, um vetor lentiviral e um vetor viral espumoso humano, mas não está limitado ao mesmo.

[00230] A dispensação viral pode usar um vetor viral com base em DNA. O vetor viral com base em DNA pode incluir vetor adenoviral, vetor viral adenoassociado, vetor viral de Epstein-Barr, vetor viral de herpes simplex e vetor poxviral, mas não está limitado aos mesmos.

[00231] No caso de dispensação viral, tem uma vantagem em que a eficiência de dispensação de um gene de tamanho grande é excelente. Microinjeção

[00232] Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção” refere-se à injeção de um material em um(a) órgão, tecido, célula ou organela subcelular de um organismo vivo. O material pode incluir um composto químico, polinucleotídeo ou polipeptídeo.

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[00233] Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção” pode incluir microinjeção de gametas, microinjeção de zigoto, microinjeção de embrião e microinjeção de células somáticas.

[00234] Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de gametas” refere-se à microinjeção de um material contendo um polinucleotídeo em um gameta. Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de gametas” inclui uma técnica de microinjectar um material contendo um polinucleotídeo em um gameta e obter um animal transgênico através de uma etapa de fertilização, uma etapa de diferenciação, etc.

[00235] Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de zigoto” refere-se à microinjeção de um material contendo um polinucleotídeo em um zigoto. Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de zigoto” inclui uma técnica de microinjectar um material contendo um polinucleotídeo em um zigoto e obter um animal transgênico através de uma etapa de diferenciação, etc.

[00236] Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de embrião” refere-se à microinjeção de um material contendo um polinucleotídeo em um embrião. Como usado na presente invenção, o termo “microinjeção de embrião” inclui uma técnica de microinjectar um material contendo um polinucleotídeo em um embrião e obter um animal transgênico através de uma etapa de diferenciação, etc.

[00237] A “microinjeção de células somáticas” da presente divulgação refere-se à material contendo um polinucleotídeo em uma célula somática. Transferência nuclear

[00238] Como usado na presente invenção, o termo “transferência nuclear” refere-se à remoção do núcleo de um oócito e à introdução de um núcleo doador obtido de outra célula no oócito. Como usado na presente invenção, o termo “transferência nuclear de célula somática (SCNT)” refere-se

54 / 353 a uma transferência nuclear na qual a célula que contém o núcleo doador é uma célula somática.

[00239] Como usado na presente invenção, o termo “transferência nuclear” inclui uma técnica de remover o núcleo de um oócito de um animal e obter um animal que inclui a mesma informação genética que a célula animal que contém um núcleo doador através de uma etapa de introdução do núcleo do doador obtido de uma célula animal, uma etapa de reprogramação, uma etapa de diferenciação e uma etapa de transplante através de uma mãe de substituição. Como usado na presente invenção, quando o animal, incluindo o núcleo do doador, é uma célula somática, o termo “transferência nuclear de célula somática (SCNT)” inclui uma técnica de obtenção de um animal que inclui a mesma informação genética que a célula somática através das etapas descritas acima.

[00240] Um animal transgênico pode ser preparado através de uma dispensação em uma célula, incluindo o núcleo do doador. Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por transferência nuclear de célula somática (SCNT) após a microinjeção de célula somática. Animal

[00241] O animal da presente divulgação pode incluir um animal não humano.

[00242] O animal pode incluir um mamífero.

[00243] O mamífero pode incluir um ungulado.

[00244] O ungulado pode incluir um perissodáctilo. O perissodáctilo pode incluir cavalos, mas não está limitado aos mesmos.

[00245] O ungulado pode incluir um artiodáctilo. O artiodáctilo pode incluir porcos, veados, vacas, ovelhas e cabras, mas não está limitado aos mesmos.

[00246] O mamífero pode incluir um roedor. O roedor pode incluir ratos e camundongos, mas não está limitado aos mesmos.

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[00247] O mamífero pode incluir um lagomorfo. O lagomorfo pode incluir coelhos e lebres, mas não está limitado aos mesmos. Biorreator

[00248] O “biorreator” da presente divulgação refere-se a um organismo que pode causar uma reação biológica ou química que ocorre em um organismo vivo.

[00249] O organismo pode incluir uma célula, uma linhagem celular e um animal. O organismo pode incluir uma célula transgênica, uma linhagem celular transgênica e um animal transgênico. Por exemplo, o biorreator pode ser um camundongo transgênico. Alternativamente, o biorreator pode ser um rato transgênico. Alternativamente, o biorreator pode ser uma vaca transgênica.

[00250] O biorreator pode ser usado para produzir um material alvo. O material alvo pode incluir uma proteína alvo. Por exemplo, quando o biorreator é uma vaca transgênica na qual é modificado o gene da albumina humana, a vaca transgênica pode ser usada para produzir albumina humana. [PARTE I] Toolbox

1. Definição de toolbox

[00251] Como usado na presente invenção, o termo “toolbox” refere-se a um exopolinucleotídeo que é inserido ou pode ser inserido em um genoma animal em uma célula. A célula na qual a toolbox pode ser inserida pode ou não ser uma célula transformada.

[00252] Como usado na presente invenção, o termo “toolbox” pode se referir a um exopolinucleotídeo para transformação de um genoma animal em uma célula. Por exemplo, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em um genoma animal em uma célula. Em um outro exemplo, a toolbox pode incluir componentes de uma nuclease manipulada ou um componente de codificação de polinucleotídeo de uma nuclease manipulada capaz de realizar a transformação sítio-específica em um genoma animal em uma célula. Em um outro exemplo, a toolbox pode incluir um transposon.

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2. Componentes da toolbox

[00253] Uma toolbox pode incluir uma primeira região de extremidade na extremidade 5’, uma segunda região de extremidade na extremidade 3’, e o domínio central localizado entre a primeira região de extremidade e a segunda região de extremidade.

[00254] A primeira região de extremidade e a segunda região de extremidade podem incluir pelo menos um componente de ativação de edição. A primeira região de extremidade e a segunda região de extremidade podem incluir o mesmo polinucleotídeo. A primeira região de extremidade e a segunda região de extremidade podem incluir um polinucleotídeo diferente um do outro.

[00255] Uma sequência de ITR pode ser incluída na primeira região de extremidade e na segunda região de extremidade, e um polinucleotídeo presente entre as sequências ITR pode ser incluído no domínio central.

[00256] O domínio central pode incluir um componente de habilitação de edição.

[00257] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA.

[00258] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo que codifica um peptídeo não funcional.

[00259] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo que codifica um íntron artificial.

[00260] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo que codifica um RNA não funcional.

[00261] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo não transcrito.

[00262] O domínio central pode incluir um polinucleotídeo não traduzido.

[00263] O domínio central pode incluir um elemento de controle de expressão.

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[00264] O domínio central pode incluir um promotor. 2-1. Edição do componente de ativação 2-1-1. Sítio de reconhecimento de recombinase

[00265] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um RRS. O RRS pode incluir loxp, rox, FRT, attP, attB e um mutante dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos. O loxp mutante pode incluir loxp66, loxp71, loxp72, loxp2722, loxp5171 e loxpm2, mas não está limitado aos mesmos. O rox mutante pode incluir rox4R, rox6R e rox2N, mas não está limitado aos mesmos. O mutante de FRT pode incluir F3, F5, F10, F11, F12, F13, F14, F15 e F16, mas não está limitado aos mesmos. 2-1-2. Sequência de repetição do terminal invertida (ITR)

[00266] Uma toolbox pode incluir pelo menos uma sequência de ITR. A sequência de ITR pode interagir com o hobo/Ac/Tam, elemento P, Bela Adormecida (SB), Príncipe sapo, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2 ou um mutante dos mesmos. 2-1-3. Sítio alvo da nuclease manipulada

[00267] Uma toolbox pode incluir pelo menos um sítio alvo de nuclease manipulada. O sítio alvo de nuclease manipulada pode incluir um sítio alvo do sistema CRISPR/enzima. O sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM.

[00268] Uma toolbox pode incluir parte do sítio alvo de uma nuclease manipulada em uma extremidade da mesma. Uma toolbox pode incluir outra parte do sítio alvo de uma nuclease manipulada e uma sequência PAM, na outra extremidade da mesma. 2-2. Proteína de codificação de polinucleotídeo ou RNA 2-2-1. Proteína alvo

[00269] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma proteína. O tipo da proteína alvo não é limitado, desde que a

58 / 353 proteína alvo possa ser produzida em um(a) célula ou animal que se torne objeto da tecnologia de transformação.

[00270] A proteína alvo pode incluir componentes de uma nuclease manipulada. Por exemplo, a proteína alvo pode incluir ZFN, TALEN, endonuclease guiada por RNA ou uma forma modificada/manipulada da mesma, mas não está à mesma.

[00271] A proteína alvo pode incluir uma proteína derivada de um animal não humano. Por exemplo, a proteína alvo pode incluir albumina não humana, uma interleucina não humana, uma insulina não humana, uma eritropoietina não humana, um anticorpo não humano, ômega-3 não humano, ou uma forma modificada/manipulada, mas não se limita aos mesmos.

[00272] A proteína alvo pode incluir uma proteína derivada de humanos. Por exemplo, a proteína alvo pode incluir albumina humana, uma interleucina humana, uma insulina humana, uma eritropoietina humana, uma cadeia gama humana, uma cadeia delta humana, uma cadeia alfa humana, uma cadeia mu humana, uma cadeia épsilon humana, uma cadeia capa humana, uma cadeia lambda humana ou uma forma modificada/manipulada das mesmas, mas não está limitada às mesmas. 2-2-2. Gene marcador

[00273] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um gene marcador. O gene marcador pode incluir um gene de resistência a antibióticos, gene de antígeno, gene de luciferase, gene de beta- galactosidase, um gene da proteína fluorescente e gene autodestrutivo, mas não está limitado aos mesmos. 2-2-3. Recombinase sítio-específica

[00274] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma SSR. A SSR pode incluir Cre, Dre, Flp, KD, B2, B3, lambda, HK022, HP1, gama delta, ParA, Tn3, Hin, Gin, Pin, phiC31, Bxb1, R4 ou um mutante das mesmas, mas não está limitado às mesmas.

59 / 353 2-2-4. Transposase

[00275] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma transposase. A transposase pode incluir hobo/Ac/Tam, elemento P, Bela Adormecida (SB), Príncipe Sapo, Hsmar1, Hsmar2, piggyBac (PB), Tol2 e um mutante dos mesmos, mas não estão limitados aos mesmos. 2-2-5. Endonuclease

[00276] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease. A endonuclease pode incluir ZFN, TALEN e endonuclease guiada por RNA, mas não está limitada às mesmas.

[00277] A toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9 ou um mutante de Cas9. A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cpf1 ou um mutante de Cpf1, mas não está limitado aos mesmos. 2-2-6. Ácido nucleico guia

[00278] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica pelo menos um entre crRNA, tracrRNA e gRNA. 2-3. Polinucleotídeo que codifica polipeptídeo não funcional

[00279] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional.

[00280] O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional pode incluir parte de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo, parte de um gene marcador, parte de um polinucleotídeo que codifica uma recombinase sítio-específica, parte de um polinucleotídeo que codifica uma transposase, e parte de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease, mas não está limitada às mesmas.

[00281] O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional pode incluir um códon de parada.

[00282] O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional pode incluir um LSL.

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[00283] O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional pode incluir um polinucleotídeo que codifica um peptídeo 2A.

[00284] O polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional pode incluir um IRES. 2-4. Polinucleotídeo que codifica RNA não traduzido

[00285] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica RNA não traduzido.

[00286] O polinucleotídeo que codifica o RNA não traduzido pode incluir um ácido nucleico guia.

[00287] O polinucleotídeo que codifica o RNA não traduzido pode incluir uma sequência AATAAA.

[00288] O polinucleotídeo que codifica o RNA não traduzido pode incluir um poli T.

[00289] O polinucleotídeo que codifica o RNA não traduzido pode não incluir um códon de partida.

[00290] O polinucleotídeo que codifica o RNA não traduzido pode não incluir uma sequência de Kozak. 2-5. Polinucleotídeo não transcrito

[00291] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo não transcrito.

[00292] O polinucleotídeo não transcrito pode ser um promotor.

[00293] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo não transcrito pode ser uma sequência de nucleotídeos que não é presente no genoma animal de uma célula. Neste caso, quando uma nuclease manipulada que visa o polinucleotídeo não transcrito como sítio alvo é usada, uma transformação sítio-específica pode ser realizada sem interagir com o genoma animal em uma célula.

[00294] A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo não transcrito pode ser a mesma que a de parte de um polinucleotídeo que codifica um(a)

61 / 353 proteína ou RNA, que pode ser normalmente expressado em células. Neste caso, um promotor não pode estar localizado a montante do polinucleotídeo não transcrito.

[00295] O polinucleotídeo não transcrito pode ser usado como um sítio alvo de nuclease manipulada. Por exemplo, no caso em que uma toolbox incluindo um polinucleotídeo não transcrito é inserida em um genoma animal em uma célula, uma transformação sítio-específica pode ocorrer no polinucleotídeo não transcrito, introduzindo Cas9 e gRNA, que é o mesmo que parte do polinucleotídeo não transcrito ou capaz de ligação complementar ao mesmo, em uma célula. 2-6. Íntron artificial

[00296] Uma toolbox pode incluir pelo menos um íntron artificial.

[00297] O íntron artificial pode ser incluído dentro de uma toolbox individualmente ou em combinação com um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00298] O íntron artificial pode estar localizado dentro de uma unidade de transcrição de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00299] O íntron artificial pode incluir um sítio doador de splice na extremidade 5’ e um sítio aceitador de splice na extremidade 3’.

[00300] Pelo menos um polinucleotídeo que codifica um RRS pode ser incluído entre o sítio doador de splice e o sítio do aceitador de splice do íntron artificial.

[00301] O íntron artificial pode incluir um códon de parada.

[00302] O íntron artificial pode incluir um intensificador.

[00303] O íntron artificial pode ser excluído por splicing.

[00304] O íntron artificial pode ser selecionado de qualquer grupo que consiste em a) um íntron que é derivado de um íntron natural de um próprio gene alvo; b) um íntron que é modificado por substituição, exclusão e/ou inserção de um nucleotídeo derivado do íntron natural, c) um íntron natural de

62 / 353 um gene alvo diferente; d) um íntron que é derivado de um íntron diferente; e) um íntron quimérico que consiste em diferentes sequências de íntron induzidas a partir de pelo menos uma sequência de íntron natural de um gene alvo e/ou gene diferente, f) um nóvulo íntron sintase sintetizado e g) uma combinação dos mesmos.

[00305] O íntron artificial pode aumentar ou diminuir a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00306] O íntron artificial pode aumentar ou diminuir a expressão de um polinucleotídeo dentro de um genoma. 2-7. Elemento de controle de expressão

[00307] Uma toolbox pode incluir pelo menos um elemento de controle de expressão.

[00308] O elemento de controle de expressão pode incluir um elemento de controle de transcrição. O elemento de controle de transcrição é o mesmo que sugerido acima.

[00309] O elemento de controle de expressão pode incluir um elemento de controle de processamento pós-transcrição. O elemento de controle de processamento pós-transcrição é o mesmo que sugerido acima.

[00310] O elemento de controle de expressão pode incluir um elemento de controle de tradução. O elemento de controle de tradução é o mesmo que sugerido acima.

[00311] O elemento de controle de expressão pode incluir um elemento de controle de modificação pós-tradução. O elemento de controle de modificação pós-tradução é o mesmo que sugerido acima. 2-8. Promotor

[00312] Uma toolbox pode incluir um promotor.

[00313] O promotor pode incluir um promotor constitutivo. O promotor constitutivo é o mesmo que sugerido acima.

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[00314] O promotor pode incluir um promotor tecido-específico. O promotor tecido-específico é o mesmo que sugerido acima.

[00315] O promotor pode incluir um promotor induzível. O promotor induzível é o mesmo que sugerido acima. 2-9. Construção da toolbox 2-9-1. Sequência de ITR-sítio de reconhecimento de recombinase ou sítio alvo de nuclease manipulada-sequência de ITR

[00316] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir uma sequência de ITR. O domínio central da toolbox pode incluir pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase.

[00317] A toolbox pode prover um sítio no qual uma inserção ou troca de um exopolinucleotídeo pode ser alcançada sem dar um efeito fatal na expressão gênica de um genoma animal em uma célula. 2-9-2. Sequência de ITR-sítio alvo de nuclease manipulada-sequência de

ITR

[00318] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir uma sequência de ITR. O domínio central da toolbox pode incluir pelo menos um sítio alvo de nuclease manipulada.

[00319] A toolbox pode prover um sítio no qual uma inserção ou troca de um exopolinucleotídeo pode ser alcançada sem dar um efeito fatal na expressão gênica de um genoma animal em uma célula. 2-9-3. Sequência de ITR-polinucleotídeo que codifica nuclease manipulada-sítio de reconhecimento de recombinase-sequência de ITR

[00320] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir uma sequência de ITR. O domínio central da toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma

64 / 353 endonuclease guiada por RNA. O domínio central da toolbox pode incluir pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase.

[00321] Um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia pode ser inserido na toolbox usando pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase. O sítio alvo no qual uma transformação sítio-específica pode ocorrer pode ser alterado usando sítio de reconhecimento de recombinase.

[00322] O pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase pode incluir o sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2). O sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) pode estar localizado a montante de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2) pode estar localizado a jusante de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA dentro da toolbox pode ser trocado por um exopolinucleotídeo diferente usando sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2). 2-9-4. Sequência de ITR-polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA-polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia- sítio de reconhecimento de recombinase-elemento de controle de expressão- sequência de ITR

[00323] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir uma sequência de ITR. O domínio central da toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. O domínio central da toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. O domínio central da toolbox pode incluir pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase. O domínio central da toolbox pode incluir pelo menos um de um elemento que controla a expressão de uma endonuclease guiada por RNA e um elemento que controla a expressão de um ácido nucleico guia.

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[00324] O pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase pode estar localizado a montante ou a jusante de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Um elemento que controla a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA pode ser inserido ou excluído usando o pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase.

[00325] O pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase pode estar localizado a montante ou a jusante de um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Um elemento que controla a expressão de um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia pode ser inserido ou excluído usando o pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase.

[00326] O pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase pode incluir o sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2). O sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) pode estar localizado a montante de um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2) pode estar localizado a jusante de um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia dentro da toolbox pode ser excluído usando sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1) e o sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2). 2-9-5. Sequência de ITR-gene-marcador-Sequência de ITR

[00327] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluem uma sequência de ITR. O domínio central da toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica pelo menos um gene marcador. O pelo menos um gene marcador pode incluir um gene autodestrutivo.

[00328] Um gene marcador pode ser inativado por transformação sítio- específica de um polinucleotídeo que codifica o gene marcador.

66 / 353 2-9-6. Sítio de reconhecimento de recombinase-polinucleotídeo que codifica transposase-sítio de reconhecimento de recombinase

[00329] Uma primeira região de extremidade de uma toolbox pode incluir um sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1). Uma segunda região de extremidade da toolbox pode incluir um sítio de reconhecimento de recombinase 2 (RRS2) que forma um par com o sítio de reconhecimento de recombinase 1 (RRS1). O domínio central da toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma transposase. A transposase pode incluir uma transposase apenas de excisão.

[00330] Um transposon incluído em um genoma animal em uma célula pode ser excluído usando a toolbox. 2-9-7. Sítio alvo da nuclease manipulada-sequência de ITR- exopolinucleotídeo- sequência de ITR-sítio alvo de nuclease manipulada

[00331] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir um sítio alvo de nuclease manipulada. O domínio central da toolbox pode incluir uma primeira sequência de ITR, uma segunda sequência de ITR, e um exopolinucleotídeo. O polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo pode estar localizado entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR.

[00332] Um exopolinucleotídeo pode ser inserido em um genoma animal em uma célula usando a toolbox enquanto realiza a transformação sítio- específica. Adicionalmente, apenas um exopolinucleotídeo pode ser excluído por uma transposase enquanto mantém a transformação sítio-específica em um genoma animal em uma célula.

3. Funções da toolbox

[00333] Uma toolbox pode ser usada para a expressão de uma proteína ou ácido nucleico necessário para a transformação de um genoma animal em uma célula. Por exemplo, uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica Cas9. Quando um gRNA, que tem parte de uma sequência de

67 / 353 nucleotídeos em um genoma animal, incluindo a toolbox como um sítio alvo, é introduzido em uma célula, o gRNA pode formar um complexo com Cas9 que é expressado em uma célula e, assim, induzir transformação sítio-específica no sítio alvo no genoma animal.

[00334] Uma toolbox pode ser usada para a modificação de um gene em um genoma animal em uma célula. Por exemplo, uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica a interleucina humana. A toolbox pode ser inserida em um genoma bovino em uma célula para que a célula expresse uma interleucina humana.

[00335] Uma toolbox pode ser usada para inativação de um gene presente em um genoma animal em uma célula. Por exemplo, uma toolbox pode ser inserida no meio de um polinucleotídeo que codifica um éxon de uma albumina bovina em um genoma bovino em uma célula e, assim, impedir que a célula expresse albumina bovina.

[00336] Uma toolbox pode prover um sítio capaz de se transformar em um genoma animal em uma célula. Por exemplo, uma toolbox pode incluir uma sequência de nucleotídeos que pode ser um sítio alvo de nuclease manipulada. Por exemplo, uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente verde (GFP). Quando o genoma bovino em uma célula inclui a toolbox, um gRNA, que tem como alvo parte da sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica a proteína fluorescente verde (GFP), e um Cas9 pode ser introduzido em uma célula e, portanto, a transformação sítio-específica pode ser induzida em parte da sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) dentro da toolbox, não em uma sequência de nucleotídeos fora da toolbox. [Parte II] Inserção da toolbox

1. Vetor de dispensação da toolbox

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[00337] Uma toolbox pode ser dispensada para inserção de uma toolbox em um genoma animal em uma célula. Um vetor de dispensação de ácido nucleico, incluindo a toolbox, pode ser um vetor de ácido nucleico nu, um vetor não viral, ou um vetor viral.

2. Método de inserção da toolbox 2-1. Uso de recombinação homóloga

[00338] Um primeiro braço de homologia pode estar localizado na extremidade 5’ de uma primeira região de extremidade de uma toolbox. Um segundo braço de homologia pode estar localizado na extremidade 3’ de uma segunda região de extremidade. O primeiro braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de um genoma animal em uma célula. O segundo braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de um genoma animal em uma célula.

[00339] O primeiro braço de homologia e o segundo braço de homologia podem interagir com parte do genoma em uma célula. Uma toolbox pode ser inserida em um genoma por meio da interação. 2-2. Uso de recombinação sítio-específica

[00340] Uma primeira região de extremidade de uma toolbox pode incluir um RRS1. Uma segunda região de extremidade da toolbox pode incluir um RRS2.

[00341] Pelo menos uma recombinase pode ser provida para a introdução da toolbox em uma célula. A recombinase pode incluir uma primeira recombinase que pode interagir com o RRS1. A recombinase pode incluir uma segunda recombinase que pode interagir com o RRS2. A primeira recombinase e a segunda recombinase podem ser iguais entre si. Por exemplo, quando o RRS1 é loxp e o RRS2 é um loxp mutante, a primeira recombinase e a segunda recombinase podem ser Cre.

[00342] Para a introdução da pelo menos uma recombinase em uma célula, um vetor de ácido nucleico nu, um vetor não viral, um vetor viral, cada

69 / 353 um dos quais inclui um polinucleotídeo que codifica uma recombinase, ou um polipeptídeo de recombinase pode ser usado.

[00343] Para a introdução da toolbox em uma célula, o ácido nucleico, incluindo a toolbox e a pelo menos uma recombinase, pode ser provido em uma forma individual. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox pode ser dispensado por um vetor plasmídico de DNA e a recombinase pode ser dispensada por um polipeptídeo de recombinase.

[00344] Para a introdução da toolbox em uma célula, o ácido nucleico, incluindo a toolbox e a pelo menos uma recombinase, pode ser provido por um vetor de dispensação. Por exemplo, o ácido nucleico, incluindo a toolbox e um polinucleotídeo que codifica uma recombinase, pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA. 2-3. Uso do sistema de transposon

[00345] Uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade de uma toolbox podem incluir uma sequência de ITR.

[00346] Para a introdução da toolbox em uma célula, uma transposase pode ser provida. A transposase pode interagir com a sequência de ITR.

[00347] Para a introdução da transposase em uma célula, pode ser usado um vetor de ácido nucleico nu, um vetor não viral, um vetor viral, cada um dos quais inclui um polinucleotídeo que codifica uma transposase, ou um polipeptídeo de transposase.

[00348] O ácido nucleico, incluindo a toolbox e a transposase, pode ser provido em uma forma individual. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox pode ser dispensado por um vetor plasmídico de DNA e a transposase pode ser dispensada por um polipeptídeo.

[00349] O ácido nucleico, incluindo a toolbox e a transposase, pode ser provido em uma forma individual. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo uma toolbox pode ser dispensado por um vetor plasmídico de DNA e a

70 / 353 transposase pode ser dispensada por um vetor plasmídico de DNA separado que inclui um polinucleotídeo que codifica uma transposase.

[00350] O ácido nucleico, incluindo a toolbox e a transposase, pode ser introduzido em uma célula por um vetor de dispensação. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox e um polinucleotídeo que codifica uma transposase pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA. 2-4. Uso de nuclease manipulada 2-4-1. Uso de reparo direcionado por homologia (HDR)

[00351] Um primeiro braço de homologia pode estar localizado na extremidade 5’ de uma primeira região de extremidade de uma toolbox. Um segundo braço de homologia pode estar localizado na extremidade 3’ de uma segunda região de extremidade da toolbox. O primeiro braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de um genoma animal em uma célula. O segundo braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de um genoma animal em uma célula.

[00352] Para a introdução da toolbox em uma célula, qualquer um dos vetores de dispensação de ácido nucleico, incluindo a toolbox, pode ser usado.

[00353] Para a introdução da toolbox em uma célula, uma nuclease manipulada pode ser provida. A nuclease manipulada pode atuar especificamente em um sítio alvo de nuclease manipulada presente em um genoma animal. O sítio alvo de nuclease manipulada presente no genoma animal pode estar localizado em uma sequência de nucleotídeos que é igual ou complementar ao primeiro braço de homologia; pode estar localizado em uma sequência de nucleotídeos que é igual ou complementar ao segundo braço de homologia; ou pode estar localizado entre uma sequência de nucleotídeos que é igual ou complementar ao primeiro braço de homologia, e uma sequência de nucleotídeos que é igual ou complementar ao segundo braço de homologia.

[00354] A pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provida em qualquer uma selecionada a partir de um vetor de ácido nucleico nu, um vetor

71 / 353 não viral, um vetor viral, cada um dos quais inclui um polinucleotídeo que codifica cada componente de uma nuclease manipulada, uma proteína de nuclease manipulada, um complexo incluindo uma proteína de nuclease manipulada e uma combinação dos mesmos.

[00355] Por exemplo, um complexo incluindo uma proteína Cas9 e um gRNA pode ser provido. Em um outro exemplo, um vetor de ácido nucleico nu que inclui um polinucleotídeo que codifica Cas9 e um polinucleotídeo que codifica um gRNA pode ser provido.

[00356] Para a introdução da toolbox em uma célula, um ácido nucleico incluindo a toolbox e pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provido em uma forma separada. Por exemplo, o ácido nucleico, incluindo a toolbox, pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA, e a nuclease manipulada pode ser provida como um complexo, incluindo a proteína Cas9 e o gRNA. Em um outro exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA, e a nuclease manipulada pode ser provida por um vetor de ácido nucleico nu, que inclui um polinucleotídeo que codifica Cas9 e um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00357] Para a introdução da toolbox em uma célula, o ácido nucleico, incluindo a toolbox e a nuclease manipulada, pode ser provido por um vetor. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox, um polinucleotídeo que codifica Cas9, e um polinucleotídeo que inclui um gRNA podem ser providos por um vetor plasmídico de DNA. 2-4-2. Uso de inserção de alvo independente de homologia (HITI)

[00358] Uma primeira região de extremidade de uma toolbox pode incluir um primeiro sítio alvo de nuclease manipulada. Uma segunda região de extremidade da toolbox pode incluir um segundo sítio alvo de nuclease manipulada. O primeiro sítio alvo de nuclease manipulada e o segundo sítio alvo de nuclease manipulada pode incluir a mesma sequência de nucleotídeos entre si.

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[00359] Para a introdução da toolbox em uma célula, pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provida. A nuclease manipulada pode incluir uma primeira nuclease manipulada que pode atuar especificamente no primeiro sítio alvo de nuclease manipulada. A nuclease manipulada pode incluir uma segunda nuclease manipulada que pode atuar especificamente no segundo sítio alvo de nuclease manipulada. A primeira nuclease manipulada e a segunda nuclease manipulada podem ser iguais entre si.

[00360] A pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provida em qualquer uma selecionada de um vetor de ácido nucleico nu, um vetor não viral, um vetor viral, cada um dos quais inclui um polinucleotídeo que codifica cada componente de uma nuclease manipulada, uma proteína de nuclease manipulada, um complexo incluindo uma proteína de nuclease manipulada, e uma combinação das mesmas.

[00361] Para a introdução da toolbox em uma célula, um ácido nucleico incluindo a toolbox e pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provido em uma forma separada. Por exemplo, o ácido nucleico, incluindo a toolbox, pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA, e a nuclease manipulada pode ser provida como um complexo, incluindo a proteína Cas9 e o gRNA. Em um outro exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox pode ser provido por um vetor plasmídico de DNA, e a nuclease manipulada pode ser provida por um vetor de ácido nucleico nu, que inclui um polinucleotídeo que codifica Cas9 e um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00362] Para a introdução da toolbox em uma célula, o ácido nucleico incluindo a toolbox e a pelo menos uma nuclease manipulada pode ser provida por um vetor. Por exemplo, o ácido nucleico incluindo a toolbox, um polinucleotídeo que codifica Cas9 e um polinucleotídeo que inclui um gRNA podem ser providos por um vetor plasmídico de DNA.

3. Sítio de inserção da toolbox 3-1. Inserção de toolbox única

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[00363] Um genoma animal em uma célula pode incluir uma toolbox.

[00364] A única toolbox pode ser incluída em qualquer um dos autossomos de um genoma animal.

[00365] A toolbox pode ser incluída em qualquer um dos cromossomos sexuais em um genoma animal. A toolbox pode ser incluída no cromossomo X de um genoma animal. A toolbox pode ser incluída no cromossomo Y de um genoma animal. 3-2. Inserção de múltiplas toolboxes

[00366] Um genoma animal em uma célula pode incluir duas ou mais toolboxes.

[00367] Todas as duas ou mais toolboxes podem ser idênticas.

[00368] Uma das duas ou mais toolboxes pode ser diferente de uma das demais.

[00369] A diferença entre toolboxes pode se referir a uma diferença da sequência entre essas toolboxes.

[00370] Por exemplo, uma primeira toolbox, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, e uma segunda toolbox, que inclui um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia capaz de se ligar a um sítio alvo, podem ser consideradas como duas toolboxes diferentes.

[00371] Todos os dois ou mais polinucleotídeos podem ser incluídos em um cromossomo. O cromossomo pode ser um autossoma ou cromossomo sexual.

[00372] As duas ou mais toolboxes podem incluir pelo menos uma primeira toolbox e uma segunda toolbox. Nesse caso, a primeira toolbox pode estar localizada em um primeiro cromossomo, e a segunda toolbox pode estar localizada em um segundo cromossomo, que é diferente do primeiro cromossomo.

[00373] O primeiro cromossomo pode ser um autossomo.

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[00374] O primeiro cromossomo pode ser um cromossomo sexual.

[00375] O segundo cromossomo pode ser um autossomo.

[00376] O segundo cromossomo pode ser um cromossomo sexual. 3-3. Características do sítio de inserção

[00377] Uma toolbox pode estar localizada entre sequências de nucleotídeos que podem interagir com uma transposase. As sequências de nucleotídeos que podem interagir com a transposase podem incluir TA e TTAA, mas não estão limitadas a elas.

[00378] Uma toolbox pode estar localizada em um polinucleotídeo que pode estar envolvido na expressão de qualquer proteína ou RNA em um genoma animal em uma célula.

[00379] Por exemplo, uma toolbox pode estar localizada em qualquer um selecionado de um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um promotor de um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, UTR 5’, íntron, éxon e UTR 3’. A toolbox pode eliminar a proteína ou o RNA em um genoma animal em uma célula. Por exemplo, quando a toolbox está localizada em um éxon do gene da beta-lactoglobulina em um genoma bovino, é possível impedir a expressão da beta-lactoglobulina na célula, incluindo o genoma bovino.

[00380] Uma toolbox pode estar localizada em um polinucleotídeo em um genoma animal em uma célula, que não está envolvido na expressão de qualquer proteína ou RNA.

[00381] Adicionalmente, uma toolbox pode estar localizada dentro de um porto seguro em um genoma animal em uma célula.

[00382] Quando o genoma animal é um genoma de camundongo, o porto seguro do genoma de camundongo pode incluir um sítio rosa26, que já é bem conhecido.

[00383] Quando o genoma animal é um genoma bovino, o porto seguro do genoma bovino pode incluir o sítio que já é bem conhecido no genoma

75 / 353 bovino.

O porto seguro do genoma bovino pode incluir os locais mostrados na Tabela 1 abaixo, mas não está limitado aos mesmos.

Cada um dos locais descritos na Tabela 1 abaixo pode estar localizado entre um gene localizado mais próximo da extremidade 5’ (gene 5’) e um gene localizado mais próximo da extremidade 3’ (gene 3’). [Tabela 1] Cromossoma do Sítio No.

Gene 5’ Gene 3’ Genoma Bovino 1-1 MIS184 HUNK 1 1-2 ENSBTAG00000025847.3 ENSBTAG00000011051.5 2 2-1 SLC38A11 COBLL1 3-1 GBP5 GBP4 3-2 PEX19 PEA15 3 3-3 PDE4B OB-R 3-4 PDE4B LEPR 4-1 GNAT3 PHTF2 4-2 TSGA13 MKLN1 4 4-3 NPVF C7orf31 4-4 ENSBTAG00000001198.5 ENSBTAG00000046257.1 5-1 ATXN7L3B CAPS2 5-2 TMEM5 AVPR1A 5 5-3 XRCC6BP1 CTDSP2 5-4 MPST KCTD17 6-1 DKK2 GIMD1 6 6-2 PLAC8 COQ2 6-3 LCORL SLIT2 7-1 ERAP2 LNPEP 7 7-2 C7H5orf30 NUDT12 9 9-1 STXBP5 SAMD5 10 10-1 ALDH6A1 VSX2 11-1 PTP LRRTM4 11 11-2 PSMD13 - 12 12-1 ENSBTAG00000010680.5 U2 14 14-1 CSMD3 CSMD3 15 15-1 SMAP INSC 17 17-1 ORAI1 RNF34

76 / 353 18 18-1 HSD17B2 CDH13 21 21-1 TRPM1 APBA2 22 22-1 bta-mir-2370 DENND6A 25 25-1 AUTS2 ENSBTAG00000047342 26-1 MKI67 EBF3 26 26-2 EMX2 RAB11FIP2 X-1 WWC3 DDX3Y X-2 ARAF SYN1

X X-3 PBDC1 MAGEE2

[00384] Quando uma toolbox está localizada em um polinucleotídeo, que não está envolvido na expressão de proteínas ou RNAs em um genoma do animal em uma célula, ou está localizada no porto seguro de um genoma do animal em uma célula, a toolbox pode ser utilizada como um porto seguro artificial para transformação adicional. Por exemplo, quando a toolbox localizada no porto seguro em um genoma bovino inclui um loxp, um exopolinucleotídeo pode ser inserido na toolbox dispensando o exopolinucleotídeo, incluindo o loxp e Cre recombinase, sem afetar a expressão de qualquer proteína ou RNA em um genoma do animal em uma célula.

4. Célula transformada na qual a toolbox é inserida 4-1. Célula única 4-1-1. Ploidia

[00385] Uma célula transformada incluindo pelo menos uma toolbox pode ser uma célula diploide. A célula diploide pode incluir uma célula-tronco, uma célula somática, uma célula-tronco oogonial, um oogônio, um oócito primário, uma célula-tronco espermatogonal, um espermatogônio, um espermatócito primário e um zigoto. A célula transformada, incluindo pelo menos uma toolbox, pode ser uma célula haploide. A célula haploide pode incluir um oócito secundário, um óvulo, um espermatócito secundário e um espermatozoide. 4-1-2. Zigosidade

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[00386] Uma célula transformada pode incluir pelo menos um par de cromossomos homólogos. O pelo menos um par de cromossomos homólogos pode incluir um primeiro cromossomo e um segundo cromossomo que estão na relação de cromossomos homólogos.

[00387] Uma célula transformada incluindo duas ou mais toolboxes pode ser um homozigoto.

[00388] Na célula transformada que é um homozigoto, todos do tipo, do número e da localização das toolboxes incluídas no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00389] Na célula transformada que é um homozigoto, tanto o tipo quanto o número de toolboxes incluídas no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00390] Na célula transformada que é um homozigoto, o tipo de toolboxes incluídas no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo pode ser o mesmo.

[00391] Na célula transformada que é um homozigoto, tanto o primeiro cromossomo quanto o segundo cromossomo podem não incluir nenhuma toolbox.

[00392] Uma célula transformada incluindo duas ou mais toolboxes pode ser um heterozigoto.

[00393] Na célula transformada que é um heterozigoto, um primeiro cromossomo pode não incluir uma toolbox e um segundo cromossomo pode incluir pelo menos uma toolbox.

[00394] Alternativamente, na célula transformada que é um heterozigoto, um segundo cromossomo pode não incluir uma toolbox que é a mesma que a incluída no primeiro cromossomo. 4-2. Colônia de células

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[00395] Uma célula transformada incluindo pelo menos uma toolbox pode formar uma colônia de células. A colônia de células pode ser uma população de células que é cultivada a partir de uma única célula. 4-2-1. Colônia de células homólogas

[00396] Cada célula incluída em uma colônia de células homólogas pode incluir uma única toolbox. A toolbox única possuída por cada célula pode ser a mesma. Em cada célula, a única toolbox pode estar localizada na mesma posição.

[00397] Cada célula incluída na colônia de células homólogas pode incluir duas ou mais toolboxes. As duas ou mais toolboxes podem incluir uma enésima toolbox (n> = 1, n é um número inteiro). Em cada célula, o tipo e o sítio da enésima toolbox podem ser os mesmos.

[00398] As duas ou mais toolboxes podem ser iguais entre si. Alternativamente, uma das duas ou mais toolboxes pode ser diferente da outra das toolboxes restantes,

[00399] Daqui em diante, a menos que especificado de outra forma, a expressão “a toolbox incluída em uma primeira célula é a mesma que incluída em uma segunda célula” significa que o tipo, o número e a localização das toolboxes incluídas na primeira célula são perfeitamente iguais aos o tipo, o número e o sítio das toolboxes incluídas na segunda célula. 4-2-2. Colônia de células quiméricas

[00400] Uma colônia de células quiméricas se refere a uma colônia de células que não seja uma colônia de células homólogas.

[00401] Uma colônia de células quiméricas pode incluir uma célula, que tem um genoma no qual uma toolbox não está incluída, e uma célula, que tem um genoma no qual pelo menos uma toolbox está incluída.

[00402] Uma colônia de células quiméricas pode incluir uma primeira célula e uma segunda célula, cada uma das quais tem um genoma no qual pelo menos uma toolbox está incluída. Nesse caso, pelo menos um, do tipo, do

79 / 353 número e do sítio das toolboxes incluídas no genoma da primeira célula, pode não ser o mesmo que o tipo, o número e o sítio das toolboxes incluídas no genoma da segunda célula.

[00403] Por exemplo, no caso de uma colônia de células em que uma primeira toolbox é incluída no genoma de uma primeira célula e uma primeira toolbox do mesmo tipo é incluída no genoma de uma segunda célula, a colônia de células pode ser uma colônia de células quiméricas quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula for diferente do número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da segunda célula, ou ii) o local da primeira toolbox incluída no genoma da primeira célula é diferente daquele da primeira toolbox incluída no genoma da segunda célula.

[00404] Em um outro exemplo, no caso de uma colônia de células em que uma primeira toolbox é incluída no genoma de uma primeira célula e uma segunda toolbox de um tipo diferente é incluída no genoma de uma segunda célula, a colônia de células também pode ser uma colônia de células quimérica quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula é igual ao das segundas toolboxes incluídas no genoma da segunda célula; e ii) todos os locais da primeira toolbox incluída no genoma da primeira célula são iguais aos da segunda toolbox incluída no genoma da segunda célula.

[00405] Adicionalmente, no caso de uma colônia de células em que uma primeira toolbox é incluída no genoma de uma primeira célula e uma segunda toolbox de um tipo diferente é incluída no genoma de uma segunda célula, a colônia de células também pode ser uma colônia de células quiméricas quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula for diferente daquele das segundas toolboxes incluídas no genoma da segunda célula, ou ii) o local da primeira toolbox incluída no genoma da primeira célula é diferente daquele da segunda toolbox incluída no genoma da segunda célula.

[00406] Como usado na presente invenção, o termo “local” pode ser especificado por um ou mais dos genes endógenos localizados mais próximos

80 / 353 da extremidade 5’ e o gene endógeno localizado mais próximo da extremidade 3’ com referência à toolbox.

[00407] Como usado na presente invenção, o termo “local de uma toolbox” pode ser especificado por um ou mais dos genes endógenos localizados mais próximos à extremidade 5’ e pelos genes endógenos localizados mais próximos à extremidade 3’ com referência à toolbox.

[00408] Ou seja, quando o gene endógeno localizado mais próximo à extremidade 5’ da primeira toolbox é diferente daquele localizado mais próximo à extremidade 5’ da segunda toolbox, o local da primeira toolbox é diferente daquele da segunda toolbox. Além disso, quando o gene endógeno localizado mais próximo à extremidade 3’ da primeira toolbox é diferente daquele localizado mais próximo à extremidade 3’ da segunda toolbox, o local da primeira toolbox é diferente daquele da segunda toolbox.

5. Seleção da célula transformada na qual a toolbox é inserida 5-1. Seleção de células transformadas usando o gene de resistência a antibióticos

[00409] O domínio central de uma toolbox pode incluir um gene de resistência a antibióticos. As células animais, incluindo a toolbox, podem sobreviver quando a célula é tratada com o antibiótico. Por conseguinte, as células animais, incluindo a toolbox, podem ser separadas daquelas que não incluem a toolbox. 5-2. Seleção de células transformadas usando reação do anticorpo contra antígeno

[00410] O domínio central de uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um antígeno, ou um nucleotídeo que pode atuar como um antígeno. As células animais, incluindo a toolbox, podem interagir com anticorpos específicos para o antígeno. Por conseguinte, as células animais, incluindo a toolbox, podem ser distinguidas daquelas que não incluem a toolbox.

81 / 353 5-3. Seleção de células transformadas usando proteína fluorescente

[00411] O domínio central de uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente. As células animais, incluindo a toolbox, podem ser medidas do sinal de fluorescência. Por conseguinte, as células animais, incluindo a toolbox, podem ser distinguidas daquelas que não incluem a toolbox. 5-4. Seleção de células transformadas usando o gene marcador de superfície

[00412] O domínio central de uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um marcador de superfície. As células animais, incluindo a toolbox, podem interagir com anticorpos específicos para o marcador de superfície. Os anticorpos podem interagir com partículas magnéticas ou fluoróforos. Por conseguinte, as células animais, incluindo a toolbox, podem ser distinguidas daquelas que não incluem a toolbox, através de um(a) propriedade magnética ou sinal de fluorescência.

6. Animal transgênico no qual a toolbox é inserida 6-1. Animal transgênico individual no qual a toolbox é inserida

[00413] Um animal transgênico pode incluir uma ou mais célula(s) transformadas, onde cada célula transformada inclui pelo menos uma toolbox. 6-1-1. Homólogo

[00414] Cada uma das células incluídas em um animal transgênico homólogo pode incluir individualmente uma única toolbox. A toolbox única possuída por cada célula pode ser a mesma. Em cada célula, uma única toolbox pode estar localizada no mesmo cromossomo.

[00415] Cada uma das células incluídas em um animal transgênico homólogo pode incluir duas ou mais toolboxes. As duas ou mais toolboxes podem incluir uma enésima toolbox (n> = 1, n é um número inteiro). Em cada célula, todos os cromossomos nos quais a enésima toolbox está localizada podem ser os mesmos.

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[00416] As duas ou mais toolboxes podem ser iguais entre si. Alternativamente, uma das duas ou mais toolboxes pode ser diferente da outra das toolboxes restantes.

[00417] O animal transgênico homólogo pode incluir uma célula transformada que é um homozigoto.

[00418] O animal transgênico homólogo pode incluir uma célula transformada que é um heterozigoto. 6-1-2. Quimérico

[00419] Um animal transgênico quimérico refere-se a um animal transgênico que não seja um animal transgênico homólogo.

[00420] O animal transgênico quimérico pode incluir uma célula transformada em homozigoto.

[00421] O animal transgênico quimérico pode incluir uma célula transformada em heterozigoto.

[00422] O animal transgênico quimérico pode incluir tanto uma célula, que tem um genoma onde uma toolbox não está incluída, quanto uma célula, que tem um genoma no qual pelo menos uma toolbox está incluída.

[00423] O animal transgênico quimérico pode incluir uma primeira célula e uma segunda célula, cada uma das quais tem um genoma que inclui pelo menos uma toolbox. Nesse caso, em um animal transgênico quimérico, pelo menos um dentre o tipo, número e sítio das toolboxes incluídas no genoma da primeira célula pode não ser o mesmo que o tipo, o número e o sítio das toolboxes incluídas no genoma da segunda célula.

[00424] Por exemplo, no caso de um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui a primeira toolbox, o animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula é diferente daquele das primeiras toolboxes incluídas no genoma da segunda célula, ou ii) pelo

83 / 353 menos um dos locais da primeira toolbox incluída no genoma da primeira célula é diferente daquela da primeira toolbox incluída no genoma da segunda célula.

[00425] Em um outro exemplo, no caso de um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox que é um tipo diferente da primeira toolbox, o animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula é o mesmo que o das segundas toolboxes incluídas no genoma da segunda célula e ii) todos os locais da primeira toolbox incluídas no genoma da primeira célula são as mesmas da segunda toolbox incluídas no genoma da segunda célula.

[00426] Adicionalmente, em um caso de um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox que é um tipo diferente da primeira toolbox, o animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico quando i) o número das primeiras toolboxes incluídas no genoma da primeira célula for diferente daquele das segundas toolboxes incluídas no genoma da segunda célula, ou ii) pelo menos um dos locais da primeira A toolbox incluída no genoma da primeira célula é diferente daquela da segunda toolbox incluída no genoma da segunda célula. 6-2. Método de preparação de animais transgênicos individuais nos quais a toolbox é inserida

[00427] Um método para preparar um animal transgênico no qual uma toolbox é inserida inclui um método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal, um método para preparar um animal transgênico via dispensação de uma toolbox a um tecido ou órgão de um animal, e um método para preparar um animal transgênico através da reprodução entre animais transgênicos. O método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal inclui um método para preparar um animal transgênico a

84 / 353 partir de uma célula animal do tipo selvagem e um método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula de um animal transgênico.

[00428] O animal transgênico produzido por qualquer um dos métodos acima pode ser qualquer um de um animal transgênico quimérico ou um animal transgênico homólogo. 6-2-1. Método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal

[00429] Um animal transgênico pode ser preparado, incluindo um processo de dispensação de uma toolbox a uma célula animal do tipo selvagem.

[00430] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por injeção de um polinucleotídeo em uma célula somática do tipo selvagem por microinjeção de células somáticas seguida por transferência nuclear de células somáticas (daqui em diante, SCNT). O animal transgênico pode ser um animal transgênico homólogo.

[00431] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de gametas em um gameta do tipo selvagem. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00432] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de zigoto em um zigoto de tipo selvagem. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00433] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de embrião em um embrião do tipo selvagem. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00434] Um animal transgênico pode ser preparado usando uma célula animal transgênica.

[00435] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado via SCNT usando uma célula somática transgênica. O animal transgênico pode ser um animal transgênico homólogo.

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[00436] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado via SCNT após microinjeção de células somáticas em uma célula somática transgênica. O animal transgênico pode ser um animal transgênico homólogo.

[00437] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de gametas em um gameta transgênico. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00438] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de zigoto em um zigoto transgênico. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00439] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção de embrião em um embrião transgênico. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico. 6-2-2. Método para preparar um animal transgênico via dispensação de uma toolbox a um tecido ou órgão de um animal

[00440] Um animal transgênico pode ser preparado pela dispensação da toolbox a um tecido ou órgão de um animal.

[00441] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção a um tecido da glândula mamária de um animal. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00442] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado por microinjeção a um órgão reprodutivo de um animal. O descendente obtido de um gameta do animal transgênico também pode ser um animal transgênico. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico. 6-2-3. Reprodução de animais transgênicos

[00443] Um animal transgênico pode ser preparado através da reprodução entre um animal transgênico e um animal do tipo selvagem.

[00444] Alternativamente, um animal transgênico pode ser preparado através da reprodução entre um primeiro animal transgênico e um segundo animal transgênico.

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[00445] O segundo animal transgênico pode ser um descendente do primeiro animal transgênico ou pode ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico. Alternativamente, o segundo animal transgênico pode não ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico.

[00446] O animal transgênico obtido a partir da reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma parte das toolboxes incluídas em um genoma do animal do primeiro animal transgênico, na mesma localização.

[00447] O animal transgênico obtido a partir da reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma que parte das toolboxes incluídas em um genoma do animal do segundo animal transgênico, na mesma localização.

[00448] O animal transgênico obtido a partir da reprodução pode ser um animal transgênico homólogo.

[00449] O animal transgênico obtido a partir da reprodução pode incluir uma célula transformada, que é um homozigoto. O animal transgênico obtido a partir da reprodução pode incluir uma célula transformada, que é um heterozigoto.

7. Uso de animal transgênico no qual a toolbox é inserida 7-1. Animais com variedades melhoradas

[00450] Um animal transgênico no qual uma toolbox é inserida pode ser usado como um animal com variedades melhoradas. O animal com variedades melhoradas pode incluir uma vaca, na qual um polinucleotídeo que codifica beta-lactoglobulina é inativado, e uma vaca, na qual um polinucleotídeo que codifica ômega-3 é inativado, mas não está limitado às mesmas. 7-2. Modelo animal para a doença

[00451] Um animal transgênico no qual uma toolbox é inserida pode ser usado como modelo animal para a doença. O modelo animal para a doença pode incluir uma vaca na qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína supressora de tumor é inativado, mas não está limitado ao mesmo. 7-3. Animal resistente à doença

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[00452] Um animal transgênico no qual uma toolbox é inserida pode ser usado como um animal resistente à doença. O animal resistente à doença pode incluir uma vaca na qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína priônica é inativado, mas não está limitado ao mesmo. 7-4. Uso de subprodutos

[00453] Os órgãos, carne, pele, cabelos e fluidos corporais de um animal transgênico, nos quais uma toolbox é inserida, podem ser usados, mas partes do animal transgênico a ser usado não se limitam aos mesmos. 7-5. Biorreator

[00454] Um animal transgênico no qual uma toolbox é inserida pode ser usado como um biorreator. Os fluidos corporais do animal transgênico podem ser obtidos. Os fluidos corporais podem incluir leite, sangue ou urina. As biomoléculas podem ser obtidas a partir do fluido corporal do animal transgênico. A biomolécula pode incluir uma proteína. A proteína pode incluir uma proteína alvo. [Parte III] Transformação usando RRS na toolbox

1. Estrutura para inserção do RRS na toolbox

[00455] Uma célula transformada pode incluir pelo menos uma toolbox em um genoma animal. Qualquer uma das toolboxes pode incluir pelo menos um RRS. 1-1. O caso em que um RRS está incluído

[00456] Uma toolbox pode incluir um RRS.

[00457] Por exemplo, uma primeira região de extremidade de uma toolbox pode incluir um RRS. Em um outro exemplo, uma segunda região de extremidade de uma toolbox pode incluir um RRS. Ainda em outro exemplo, o domínio central de uma toolbox pode incluir um RRS. 1-2. O caso em que dois ou mais RRSs estão incluídos

[00458] Uma toolbox pode incluir dois ou mais RRSs. Os dois ou mais RRSs podem incluir RRS1 e RRS2. O RRS1 pode estar localizado em qualquer

88 / 353 um entre uma primeira região de extremidade, uma segunda região de extremidade e o domínio central de uma toolbox. O RRS2 pode estar localizado em qualquer um entre uma primeira região de extremidade, uma segunda região de extremidade e o domínio central de uma toolbox.

[00459] Por exemplo, o RRS1 e o RRS2 podem estar localizados no domínio central. Em um exemplo diferente, o RRS1 pode estar localizado em uma primeira região de extremidade e o RRS2 pode estar localizado em uma segunda região de extremidade.

[00460] O RRS1 e o RRS2 podem ser iguais entre si. O RRS1 e o RRS2 podem estar localizados na mesma direção um do outro. Alternativamente, o RRS1 e o RRS2 podem estar localizados na direção oposta entre si.

[00461] O RRS1 e o RRS2 podem ser diferentes um do outro. O RRS1 e o RRS2 podem estar localizados na mesma direção um do outro. Alternativamente, o RRS1 e o RRS2 podem estar localizados na direção oposta entre si.

[00462] O RRS1 e o RRS2 podem ser diferentes um do outro. Uma SSR 1, que pode interagir especificamente com o RRS1, e uma SSR 2, que pode interagir especificamente com o RRS2, podem ser iguais entre si ou diferentes um do outro.

[00463] O RRS1 e o RRS2 podem ser diferentes um do outro. O RRS1 e o RRS2 podem formar um par e, assim, uma troca mútua pode ocorrer. Alternativamente, o RRS1 e o RRS2 podem não formar um par e, portanto, uma troca mútua pode não ocorrer.

2. SSR para uso do RRS na toolbox 2-1. SSR provida a partir do genoma animal

[00464] Um genoma animal em uma célula pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma SSR que é específica para qualquer um dos RRSs incluídos na toolbox. O polinucleotídeo que codifica a SSR pode ser

89 / 353 incluído na toolbox, incluindo o RRS. O polinucleotídeo que codifica a SSR pode ser incluído em uma toolbox diferente. 2-2. SSR provida de outro que não o genoma animal

[00465] Quando um polinucleotídeo que codifica uma SSR, que pode interagir com qualquer um dos RRSs incluídos na toolbox, não é presente no genoma animal de uma célula, a SSR pode ser provida. A forma de prover a SSR pode ser um vetor de ácido nucleico nu, um vetor não viral, um vetor viral, cada um dos quais inclui um polinucleotídeo que codifica uma SSR ou um polipeptídeo de recombinase.

3. Recombinação sítio-específica usando RRS na toolbox 3-1. Inserção de polinucleotídeo usando RRS

[00466] Uma toolbox pode incluir pelo menos um RRS.

[00467] Um exopolinucleotídeo, que inclui um RRS que forma um par com qualquer um dos RRSs incluídos na toolbox, pode ser provido a uma célula incluindo a toolbox.

[00468] Neste caso, uma inserção do exopolinucleotídeo na toolbox pode ocorrer via interação com uma SSR que é específica para o par de RRSs. 3-2. Exclusão de polinucleotídeo usando RRS

[00469] Uma toolbox pode incluir dois ou mais RRSs. Os dois ou mais RRSs podem incluir RRS1 e RRS2.

[00470] O RRS1 e o RRS2 podem formar um par e podem estar localizados na mesma direção. Por exemplo, no domínio central da toolbox, dois loxps podem estar localizados na mesma direção.

[00471] Neste caso, um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs pode ser excluído por meio de uma interação com uma SSR que é específica para o par de RRSs. Por exemplo, quando o domínio central da toolbox inclui um polinucleotídeo que codifica um gRNA entre os dois loxps, o polinucleotídeo que codifica um gRNA pode ser excluído da toolbox, provendo Cre recombinase.

90 / 353 3-3. Inversão de polinucleotídeo usando RRS

[00472] Uma toolbox pode incluir dois ou mais RRSs. Os dois ou mais RRSs podem incluir RRS1 e RRS2.

[00473] O RRS1 e o RRS2 podem formar um par e podem estar localizados na direção oposta.

[00474] Neste caso, um polinucleotídeo localizado entre o par de RRSs pode ser invertido por meio de uma interação com uma SSR que é específica para o par de RRSs. 3-4. Troca de polinucleotídeos usando RRS

[00475] Uma toolbox pode incluir dois ou mais RRSs. Os dois ou mais RRSs podem incluir RRS1 e RRS2.

[00476] O RRS1 e o RRS2 não podem formar um par. Por exemplo, o domínio central da toolbox pode incluir loxp (RRS1) e loxp2722 (RRS2). O loxp pode estar localizado a montante do loxp2722.

[00477] Exopolinucleotídeos, cada um dos quais inclui RRS3 que forma um par com RRS1 e RRS4 que forma um par com RRS2, podem ser providos a uma célula incluindo a toolbox. Por exemplo, os exopolinucleotídeos podem incluir loxp (RRS3) e loxp2722 (RRS4). O loxp pode estar localizado a montante do loxp2722.

[00478] Nesse caso, pode ocorrer uma interação com uma SSR, que é específica para RRS1 e RRS3, e uma interação com uma SSR, que é específica para e RRS2 e RRS4. Adicionalmente, pode ocorrer uma troca entre um polinucleotídeo localizado entre RRS1 e RRS2 e um polinucleotídeo localizado entre RRS3 e RRS4.

[00479] Por exemplo, quando um polinucleotídeo não transcrito é localizado entre loxp e loxp2722 da toolbox e um polinucleotídeo que codifica um gRNA é localizado entre loxp e loxp2722 do exopolinucleotídeo, o polinucleotídeo não transcrito na toolbox e o polinucleotídeo que codifica um gRNA do exopolinucleotídeo pode ser trocado provendo Cre recombinase.

91 / 353 3-5. Recombinação sítio-específica usando duas ou mais RRS presentes em uma toolbox

[00480] Uma toolbox pode incluir dois ou mais RRSs. Os dois ou mais RRSs podem incluir RRS1 e RRS2.

[00481] O RRS1 e o RRS2 não podem formar um par. Por exemplo, o domínio central da toolbox pode incluir loxp (RRS1) e loxp2722 (RRS2). O loxp pode estar localizado a montante do loxp2722.

[00482] Um primeiro exopolinucleotídeo, que inclui RRS3 que forma um par com RRS1, e um segundo exopolinucleotídeo, que inclui RRS4 que forma um par com RRS2, podem ser providos a uma célula incluindo a toolbox.

[00483] Por exemplo, o primeiro exopolinucleotídeo pode incluir loxp (RRS3) e o segundo exopolinucleotídeo pode incluir loxp2722 (RRS4).

[00484] Nesse caso, pode ocorrer uma interação com uma SSR, que é específica para RRS1 e RRS3, e uma interação com uma SSR, que é específica para e RRS2 e RRS4. Além disso, o primeiro exopolinucleotídeo pode ser inserido no sítio do RRS1 e o segundo exopolinucleotídeo pode ser inserido no sítio do RRS2. Ou seja, todos os dois ou mais tipos de exopolinucleotídeos podem ser inseridos em uma célula que tem um genoma animal, incluindo uma toolbox que inclui dois ou mais RRSs.

[00485] Como descrito acima, não apenas os dois ou mais tipos de exopolinucleotídeos podem ser respectivamente inseridos na toolbox no momento desejado, mas também os dois ou mais tipos de exopolinucleotídeos já presentes na toolbox podem ser excluídos ou trocados.

[00486] Em uma forma de realização, a toolbox pode incluir loxp, loxp mutante, rox e attP.

[00487] Por exemplo, um primeiro exopolinucleotídeo que consiste em um variante de rox (que forma um par com o rox incluído na toolbox) e Cas9 pode ser provido a uma célula incluindo a toolbox. Neste caso, uma inserção

92 / 353 do primeiro exopolinucleotídeo na toolbox pode ocorrer por meio de uma interação com Dre que é específica para o rox e um variante de rox do mesmo.

[00488] Em um outro exemplo, um primeiro exopolinucleotídeo que consiste em um variante de rox (que forma um par com o rox incluído na toolbox) e Cas9; e um segundo exopolinucleotídeo que consiste em attB (que forma um par com o attP incluído na toolbox) e um gRNA pode ser provido a uma célula incluindo a toolbox. Nesse caso, uma inserção do primeiro exopolinucleotídeo e do segundo exopolinucleotídeo na toolbox pode ocorrer por meio de uma interação com Dre (que é específica para o rox e um variante de rox) e uma interação com PhiC31 (que é específica para o attP e attB). Nesse caso, como Cas9 e gRNA podem ser expressados simultaneamente em uma célula, incluindo a toolbox, o sistema CRISPR/enzima pode ser operado mesmo quando Cas9 ou gRNA não é dispensada separadamente.

[00489] Adicionalmente, em um outro exemplo, um primeiro exopolinucleotídeo que consiste em um variante de rox (que forma um par com o rox incluído na toolbox) e Cas9; e um segundo exopolinucleotídeo que é presente entre loxp ou um loxp mutante que forma um par com o loxp e um variante de loxp incluído na toolbox pode ser provido a uma célula incluindo a toolbox. Neste caso, uma inserção do primeiro exopolinucleotídeo na toolbox pode ocorrer por meio de uma interação com uma Dre, que é específica para o rox e um variante de rox do mesmo; e uma troca do segundo exopolinucleotídeo pode ocorrer por meio de uma interação com uma Cre, que é específica para o loxp e um variante de loxp do mesmo. 3-6. Recombinação sítio-específica na toolbox desejada entre uma pluralidade de toolboxes

[00490] Como descrito acima, quando um RRS incluído em qualquer toolbox presente em um genoma animal tem uma sequência que é diferente da de um RRS incluído em uma toolbox diferente no mesmo genoma animal, uma

93 / 353 recombinação sítio-específica pode ocorrer em uma toolbox localizada no sítio desejado.

[00491] Por exemplo, um exopolinucleotídeo, que inclui um RRS1 que forma um par com um RRS1 de uma primeira toolbox ou um variante de RRS1 do mesmo, pode ser provido a uma célula transformada incluindo um genoma animal, no qual a primeira toolbox que inclui o RRS1 e uma segunda toolbox que inclui um RRS2 são incluídas. Neste caso, uma inserção do exopolinucleotídeo na primeira toolbox pode ocorrer através de uma interação com uma SSR1 que é específica para o RRS1 ou um variante de RRS1 do mesmo.

[00492] Em um outro exemplo, um exopolinucleotídeo, que é localizado entre um RRS1 que forma um par com um RRS1 de uma toolbox ou um variante de RRS1 e um RRS2 que forma um par com um RRS2 de uma primeira toolbox ou um variante de RRS2, pode ser provido a uma célula transformada tendo um genoma animal, no qual a primeira toolbox que inclui o RRS1 e o RRS2 e uma segunda toolbox que inclui o RRS1 e um RRS3 estão incluídas. Nesse caso, uma troca entre um polinucleotídeo, localizado entre o RRS1 e o RRS2 da primeira toolbox, e um exopolinucleotídeo, localizado entre o RRS1 ou a seu variante de RRS1 e o RRS2 ou a seu variante de RRS2, pode ocorrer por meio de uma interação com uma SSR1 que é específica para o RRS1 ou seu variante de RRS1, e uma interação com uma SSR2 que é específica para o RRS2 ou a variante de RRS2 do mesmo.

[00493] Adicionalmente, em outro exemplo, um exopolinucleotídeo, que inclui um RRS1 que forma um par com um RRS1 de uma primeira toolbox ou um variante de RRS1 do mesmo, pode ser provida a uma célula transformada tendo um genoma animal, no qual a primeira toolbox que inclui dois ou mais RRS1s e uma segunda toolbox que inclui um RRS2.

[00494] Nesse caso, o RRS1 ou a variante de RRS1 do mesmo pode interagir com uma SSR1, que é específica para o RRS1 ou a variante de RRS1

94 / 353 do mesmo. Adicionalmente, após o polinucleotídeo localizado entre dois RRS1s na primeira toolbox ser excluído, pode ocorrer uma inserção de um exopolinucleotídeo, que inclui o RRS1 ou a variante de RRS1 na primeira toolbox.

4. Célula transformada com toolbox editada

[00495] Uma célula transformada pode incluir pelo menos uma toolbox. Qualquer uma das pelo menos uma toolbox pode incluir pelo menos um RRS. Uma transformação via recombinação sítio-específica pode ser possível usando pelo menos um RRS.

[00496] A célula transformada pode incluir uma toolbox editada. A toolbox editada refere-se a uma toolbox na qual ocorreu a recombinação sítio- específica. 4-1. Célula única 4-1-1. Ploidia

[00497] Uma célula transformada incluindo pelo menos uma toolbox editada pode ser uma célula diploide. A célula diploide é como descrita acima.

[00498] Uma célula transformada incluindo pelo menos uma toolbox editada pode ser uma célula haploide. A célula haploide é como descrita acima. 4-1-2. Zigosidade

[00499] Uma célula transformada incluindo duas ou mais toolboxes editadas pode ser um homozigoto.

[00500] Uma célula transformada incluindo duas ou mais toolboxes editadas pode ser um heterozigoto. 4-2. Colônia de células

[00501] Uma célula transformada, incluindo pelo menos uma toolbox editada, pode formar uma colônia de células. 4-2-1. Colônia de células homólogas

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[00502] Uma colônia de células homólogas é caracterizada pelo fato de que as toolboxes incluídas em cada célula são iguais entre si e as toolboxes editadas incluídas em cada célula também são iguais entre si. 4-2-2. Colônia de células quiméricas

[00503] Uma colônia de células quiméricas se refere a uma colônia de células que não seja uma colônia de células homólogas.

5. Seleção da célula transformada na qual a toolbox editada é inserida 5-1. Seleção de células transformadas usando proteína fluorescente

[00504] Uma toolbox editada pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente.

[00505] Por exemplo, um exopolinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente pode ser inserido em uma toolbox incluindo pelo menos um RRS usando recombinação sítio-específica.

[00506] Por conseguinte, as células animais que incluem a toolbox editada podem ser distinguidas das células animais que não incluem a toolbox editada. 5-2. Seleção de células transformadas usando o gene de resistência a antibióticos

[00507] Uma toolbox editada pode incluir um gene de resistência a antibióticos. Um genoma do animal pode incluir a toolbox editada.

[00508] Por exemplo, um exopolinucleotídeo que codifica um gene de resistência a antibióticos pode ser inserido em uma toolbox incluindo pelo menos um RRS usando recombinação sítio-específica.

[00509] As células animais, incluindo a toolbox editada, podem sobreviver quando as células animais são tratadas com um antibiótico. Por conseguinte, as células animais que incluem a toolbox editada podem ser separadas das células animais que não incluem a toolbox editada. 5-3. Seleção de células transformadas usando reação do anticorpo contra antígeno

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[00510] Uma toolbox editada pode incluir um polinucleotídeo que codifica um antígeno ou um nucleotídeo capaz de atuar como um antígeno. Um genoma animal pode incluir a toolbox editada.

[00511] Por exemplo, um exopolinucleotídeo que inclui um nucleotídeo capaz de agir como um antígeno pode ser inserido em uma toolbox incluindo pelo menos um RRS usando recombinação sítio-específica.

[00512] A célula animal, incluindo a toolbox editada, pode interagir com um anticorpo específico para o antígeno. Por conseguinte, as células animais que incluem a toolbox editada podem ser distinguidas das células animais que não incluem a toolbox editada. 5-4. Seleção de células transformadas usando o gene marcador de superfície

[00513] Uma toolbox editada pode incluir um polinucleotídeo que codifica um marcador de superfície. Uma célula animal pode incluir a toolbox editada.

[00514] Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um marcador de superfície pode ser inserido em uma toolbox incluindo pelo menos um RRS usando recombinação sítio-específica.

[00515] A célula animal, incluindo a toolbox editada, pode interagir com um anticorpo específico para o marcador de superfície. O anticorpo pode interagir com uma partícula magnética ou fluoróforo. Por conseguinte, as células animais que incluem a toolbox editada podem ser distinguidas das células animais que não incluem a toolbox editada através de um(a) propriedade magnética ou sinal de fluorescência. 5-5. Seleção de células transformadas usando o gene autodestrutivo

[00516] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um gene autodestrutivo. Uma toolbox editada pode não incluir o polinucleotídeo que codifica o gene autodestrutivo.

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[00517] Por exemplo, o domínio central da toolbox pode incluir sequencialmente um loxp, um gene autodestrutivo e um variante de loxp. Neste caso, um exopolinucleotídeo que inclui o loxp na extremidade 5’ e inclui a variante de loxp na extremidade 3’ pode ser trocado com o gene autodestrutivo por recombinação sítio-específica.

[00518] Uma vez que as células animais, incluindo a toolbox editada, não incluem um gene autodestrutivo, a apoptose não ocorre nessas células animais, mesmo quando é provido um pró-fármaco às mesmas. Por conseguinte, as células animais que incluem a toolbox editada podem ser distinguidas das células animais que não incluem a toolbox editada.

6. Animal transgênico no qual a toolbox editada é inserida 6-1. Animal transgênico individual no qual a toolbox editada é inserida 6-1-1. Homólogo

[00519] Cada célula incluída em um animal transgênico homólogo pode incluir pelo menos uma toolbox. A pelo menos uma toolbox pode incluir pelo menos uma toolbox editada. 6-1-2. Quimérico

[00520] Um animal transgênico quimérico refere-se a um animal transgênico que não seja um animal transgênico homólogo. 6-2. Método para preparar animal transgênico no qual a toolbox editada é inserida

[00521] Um método para preparar um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode incluir um método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal, um método para preparar um animal transgênico através da dispensação de um exopolinucleotídeo ou introdução de uma SSR em um tecido ou órgão de um animal, e um método para preparar um animal transgênico através da reprodução entre animais transgênicos. O método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal pode incluir um método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula de um

98 / 353 animal transgênico no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido.

[00522] O animal transgênico produzido por qualquer um dos métodos acima pode ser qualquer um de um animal transgênico quimérico ou um animal transgênico homólogo. 6-2-1. Método para preparar um animal transgênico a partir de uma célula animal

[00523] Um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode ser preparado a partir de uma célula de um animal transgênico no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido.

[00524] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado através da introdução de uma SSR em uma célula somática na qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido, seguido por SCNT. Em um outro exemplo, um animal transgênico pode ser preparado pela introdução de uma SSR e um polinucleotídeo que inclui pelo menos um RRS, em uma célula somática na qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido por microinjeção de célula somática, seguida por SCNT. O animal transgênico pode ser um animal transgênico homólogo.

[00525] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado através da introdução, por microinjeção de gametas, de um polinucleotídeo incluindo uma SSR em um gameta no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. Em um outro exemplo, um animal transgênico pode ser preparado introduzindo, via microinjeção de gametas, um polinucleotídeo incluindo uma SSR e um polinucleotídeo incluindo pelo menos um RRS em um gameta no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00526] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado pela introdução de uma SSR em um zigoto no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. Em um outro exemplo, um animal transgênico pode

99 / 353 ser preparado através da introdução de um polinucleotídeo incluindo pelo menos um RRS, via microinjeção de zigoto, em um zigoto no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido, enquanto o zigoto é tratado com uma SSR. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00527] Por exemplo, um animal transgênico pode ser preparado através da introdução de uma SSR em um embrião no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. Em um outro exemplo, um animal transgênico pode ser preparado através da introdução de um polinucleotídeo que codifica uma SSR e um polinucleotídeo incluindo pelo menos um RRS, via microinjeção de embrião, em um embrião no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico. 6-2-2. Método para preparar um animal transgênico através da dispensação de um exopolinucleotídeo ou introdução de uma SSR em um tecido ou órgão de um animal

[00528] Um tecido ou órgão de um animal pode incluir células nas quais uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido. Um animal transgênico incluindo uma toolbox editada pode ser preparado pela introdução de uma SSR ou pela dispensação de um exopolinucleotídeo, em um tecido ou órgão do animal.

[00529] Por exemplo, um animal transgênico incluindo uma toolbox editada pode ser preparado por microinjeção de um polinucleotídeo que codifica uma SSR e um polinucleotídeo incluindo pelo menos um RRS em um tecido da glândula mamária do animal. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

[00530] Por exemplo, um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode ser preparado por microinjeção de uma SSR em um órgão reprodutivo do animal. O descendente obtido de um gameta do animal transgênico pode ser um animal transgênico. O animal transgênico pode ser um animal transgênico quimérico.

100 / 353 6-2-3. Reprodução de animais transgênicos

[00531] Um animal transgênico pode ser preparado via reprodução entre um primeiro animal transgênico e um segundo animal transgênico.

[00532] Por exemplo, um animal transgênico incluindo uma toolbox editada pode ser preparado através da reprodução entre um primeiro animal transgênico, no qual uma toolbox incluindo pelo menos um RRS é inserido, e um segundo animal transgênico, no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica uma SSR é inserida.

[00533] O segundo animal transgênico pode ser um descendente do primeiro animal transgênico ou pode ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico. Alternativamente, o segundo animal transgênico pode não ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico.

[00534] O animal transgênico obtido pela reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma parte da toolbox incluída no genoma animal do primeiro animal transgênico, na mesma localização.

[00535] O animal transgênico obtido pela reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma parte da toolbox incluída no genoma animal do segundo animal transgênico, na mesma localização.

[00536] O animal transgênico obtido pela reprodução pode ser um animal transgênico homólogo.

[00537] O animal transgênico obtido pela reprodução pode incluir uma célula transformada que é um homozigoto. O animal transgênico obtido pela reprodução pode incluir uma célula transformada que é um heterozigoto.

7. Uso de animal transgênico no qual a toolbox editada é inserida 7-1. Animais com variedades melhoradas

[00538] Um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode ser usado como um animal com variedades melhoradas. 7-2. Modelo animal para a doença

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[00539] Um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode ser usado como modelo animal para a doença. 7-3. Animal resistente à doença

[00540] Um animal transgênico no qual uma toolbox editada é inserida pode ser usado como um animal resistente à doença. 7-4. Uso de subprodutos

[00541] Os órgãos, carne, pele, cabelos e fluidos corporais de um animal transgênico, nos quais uma toolbox editada é inserida, podem ser usados, mas partes do animal transgênico a ser usado não se limitam a isso. 7-5. Biorreator

[00542] Um animal transgênico, no qual uma toolbox editada é inserida, pode ser usado como um biorreator. [Parte IV] Transformação usando CRISPR/componente do sistema enzimático

1. Introdução de endonuclease guiada por RNA e ácido nucleico guia nas células, incluindo a toolbox

[00543] Uma endonuclease guiada por RNA e um ácido nucleico guia podem ser introduzidos em um genoma animal em uma célula que inclui uma toolbox para transformação sítio-específica.

[00544] A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada à mesma. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 1-1. Introdução em forma separada

[00545] O Cas9 e o gRNA podem ser introduzidos em uma célula, incluindo uma toolbox em uma forma separada.

[00546] A forma na qual o Cas9 é provido pode incluir um plasmídeo de DNA, um fragmento linear de DNA, um fragmento linear de RNA, e uma proteína. O fragmento linear de RNA pode incluir um mRNA de Cas9.

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[00547] A forma na qual o gRNA é provido pode incluir um plasmídeo de DNA, um fragmento linear de DNA, e um fragmento linear de RNA.

[00548] A forma na qual o Cas9 e o gRNA são providos juntos pode incluir uma ribonucleoproteína (RNP). 1-2. Vetor de dispensação única

[00549] O Cas9 e o gRNA podem ser providos como um único vetor de dispensação em uma célula que inclui uma toolbox.

[00550] A forma na qual o Cas9 e o gRNA são providos pode incluir um fragmento linear de DNA e um fragmento linear de RNA.

2. Componentes do sistema CRISPR/enzima na toolbox

[00551] Uma toolbox que é incluída em um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos uma entre uma endonuclease guiada por RNA e um ácido nucleico guia.

[00552] Uma célula na qual ocorre a transformação sítio-específica pode expressar todos os, ou parte dos componentes, do sistema CRISPR/enzima e, portanto, a transformação sítio-específica pode ser facilmente realizada. 2-1. Endonuclease guiada por RNA na toolbox

[00553] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9 ou um Cas9 mutante, mas não está limitado aos mesmos. 2-1-1. Combinação de Cas9 e promotor

[00554] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica Cas9.

[00555] A toolbox pode incluir um promotor que pode iniciar a transcrição do Cas9. O promotor pode ser qualquer um selecionado de um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. 2-1-2. Combinação de Cas9, promotor e RRS

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[00556] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica Cas9. A toolbox pode incluir um promotor que pode iniciar a transcrição do Cas9. A toolbox pode incluir pelo menos um RRS.

[00557] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do promotor capaz de iniciar a transcrição do Cas9.

[00558] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS entre o promotor, que é capaz de iniciar a transcrição do Cas9 e o polinucleotídeo que codifica o Cas9.

[00559] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9.

[00560] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9 e pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem interagir com a mesma SSR. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem ser iguais entre si. 2-2. Ácido nucleico guia na toolbox

[00561] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 2-2-1. Combinação de gRNA e promotor

[00562] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00563] A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA. O promotor pode ser qualquer um selecionado de um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. O promotor constitutivo capaz de iniciar a transcrição do gRNA pode incluir o promotor U6, mas não está limitado ao mesmo.

104 / 353 2-2-2. Combinação de gRNA, promotor e RRS

[00564] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00565] A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA. A toolbox pode incluir pelo menos um RRS.

[00566] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA.

[00567] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS entre o promotor, que é capaz de iniciar a transcrição do gRNA e um polinucleotídeo que codifica o gRNA.

[00568] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA.

[00569] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA e pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem interagir com a mesma SSR. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e como qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem ser os mesmos entre si. 2-3. Endonuclease guiada por RNA e ácido nucleico guia na toolbox

[00570] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada ao mesmo. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 2-3-1. Combinação de Cas9, gRNA e promotor

[00571] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica Cas9.

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[00572] A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do Cas9. O promotor pode ser qualquer um selecionado de um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível.

[00573] A toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00574] A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA. O promotor pode ser qualquer um selecionado de um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico, e um promotor induzível. O promotor constitutivo capaz de iniciar a transcrição do gRNA pode incluir o promotor U6, mas não está limitado ao mesmo. 2-3-2. Combinação de Cas9, gRNA, promotor e RRS

[00575] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica Cas9. A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do Cas9. A toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um gRNA. A toolbox pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA. A toolbox pode incluir pelo menos um RRS.

[00576] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do promotor capaz de iniciar a transcrição do Cas9.

[00577] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS entre o promotor capaz de iniciar a transcrição do Cas9 e o polinucleotídeo que codifica o Cas9.

[00578] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9.

[00579] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9 e pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem interagir com a mesma SSR. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na

106 / 353 extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem ser iguais entre si.

[00580] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA.

[00581] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS entre o promotor capaz de iniciar a transcrição do gRNA e do polinucleotídeo que codifica o gRNA.

[00582] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA.

[00583] A toolbox pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA e pode incluir pelo menos um RRS na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem interagir com a mesma SSR. Nesse caso, qualquer um dos RRSs na extremidade 5’ e qualquer um dos RRSs na extremidade 3’ podem ser iguais entre si.

3. Controle de operação do sistema CRISPR/enzima 3-1. Controle da expressão da endonuclease guiada por RNA

[00584] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada ao mesmo. 3-1-1. Controle da transcrição de Cas9 usando o promotor

[00585] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica Cas9.

[00586] A toolbox pode incluir um promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9. O promotor pode incluir um promotor tecido-específico ou promotor induzível.

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[00587] No caso em que o promotor é um promotor tecido-específico, a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 incluído na toolbox pode ser iniciada quando a toolbox é incluída em uma célula de tecido específico.

[00588] No caso em que o promotor específico do tecido é um promotor específico do tecido da glândula mamária, a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 incluído na toolbox pode ser iniciada quando a toolbox é incluída em uma célula de um tecido da glândula mamária. O promotor tecido- específico da glândula mamária pode incluir um promotor alfa-caseína, um promotor beta-caseína, um promotor capa-caseína, um promotor mu-caseína e um promotor beta-lactoglobulina, mas não está limitado aos mesmos.

[00589] No caso em que o promotor tecido-específico é um promotor específico de órgão reprodutivo, a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 incluído na toolbox pode ser iniciada quando a toolbox é incluída em um gameta. O promotor específico de órgão reprodutivo pode incluir um promotor específico de ovário e um promotor específico de testículo, mas não está limitado aos mesmos.

[00590] No caso em que o promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 é um promotor tecido-específico, o sítio onde a transformação sítio-específica ocorre em um animal transgênico, incluindo a toolbox, pode ser limitado. Adicionalmente, a ocorrência de transformação sítio-específica desnecessária em outros tecidos do animal transgênico pode ser evitada.

[00591] No caso em que o promotor é um promotor induzível, a transcrição pode ser iniciada quando uma condição específica é satisfeita. O promotor induzível pode incluir um promotor induzível quimicamente, um promotor induzível por temperatura, e um promotor induzível leve, mas não está limitado aos mesmos.

[00592] O promotor quimicamente induzível pode iniciar a transcrição quando um composto químico específico é presente. O promotor quimicamente

108 / 353 induzível pode incluir um promotor induzível por antibióticos, um promotor induzido por álcool, um promotor induzível por esteroide, e um promotor induzível por metal, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por antibiótico pode incluir um promotor Tet-on e um promotor Tet-off, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por esteroide pode incluir um promotor induzido por estrogênio, mas não está limitado ao mesmo. O promotor induzível por metal pode incluir um promotor induzível ao cobre, mas não está limitado ao mesmo.

[00593] Um promotor induzível por temperatura pode iniciar a transcrição quando a condição de temperatura for satisfeita. O promotor induzível por temperatura pode incluir um promotor induzível por choque a quente e um promotor induzível por choque a frio, mas não está limitado aos mesmos. O promotor induzível por choque a quente pode incluir um promotor Hsp, mas não está limitado ao mesmo.

[00594] Um promotor induzível por luz pode iniciar a transcrição quando a condição de comprimento de onda da luz é satisfeita.

[00595] No caso em que o promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 é um promotor induzível, é possível controlar o tempo em que a transformação sítio-específica ocorre em um(a) célula ou animal transformada(o) que inclui a toolbox. 3-1-2. Inserção do promotor usando RRS

[00596] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica Cas9.

[00597] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o Cas9.

[00598] Um ácido nucleico pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor. O promotor pode incluir um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico ou um promotor induzível. O ácido nucleico pode incluir um RRS em uma extremidade ou em ambas as extremidades do polinucleotídeo

109 / 353 que codifica o promotor. O RRS pode formar um par com o RRS incluído na toolbox.

[00599] Uma SSR que pode interagir com o ácido nucleico e o RRS pode ser provido à toolbox. O polinucleotídeo que codifica o promotor pode ser inserido na toolbox. Neste caso, a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 pode não ser iniciada antes da inserção do polinucleotídeo que codifica o promotor e pode ser iniciada após a inserção do polinucleotídeo que codifica o promotor. 3-1-3. Controle da transcrição de Cas9 usando o códon de parada da transcrição

[00600] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica Cas9.

[00601] A toolbox pode incluir um promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9. O promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico, ou um promotor induzível.

[00602] A toolbox pode incluir um RRS1, um códon de parada da transcrição e um RRS2. O RRS1, o códon de parada da transcrição, e o RRS2, podem estar localizados sequencialmente entre o polinucleotídeo que codifica Cas9 e o promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica Cas9. O RRS1 e o RRS2 podem ser iguais entre si. O RRS1 e o RRS2 podem incluir um loxp, mas não estão limitados ao mesmo.

[00603] Uma SSR que pode interagir com o RRS1 e o RRS2 pode ser provido à toolbox. A SSR pode incluir uma Cre, mas não está limitado à mesma. Na toolbox, um polinucleotídeo incluindo um códon de parada da transcrição localizado entre o RRS1 e o RRS2 pode ser excluído. Neste caso, o mRNA transcrito do polinucleotídeo que codifica o Cas9 não pode ser transcrito antes que o códon de parada da transcrição seja excluído e pode ser transcrito após a exclusão do códon de parada da transcrição. 3-1-4. Controle da tradução de Cas9 usando o códon de parada

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[00604] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica Cas9.

[00605] A toolbox pode incluir um promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9. O promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico ou um promotor induzível.

[00606] A toolbox pode incluir um RRS1, um códon de parada e um RRS2. O RRS1, o códon de parada da transcrição, e o RRS2, podem ser localizados sequencialmente entre o promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o Cas9 e o polinucleotídeo que codifica o Cas9. O RRS1 e o RRS2 podem ser iguais entre si. O RRS1 e o RRS2 podem incluir um loxp, mas não estão limitados ao mesmo.

[00607] Uma SSR que pode interagir com o RRS1 e o RRS2 pode ser provida à toolbox. A SSR pode incluir Cre recombinase, mas não está limitada à mesma. Na toolbox, um polinucleotídeo incluindo um códon de parada localizado entre o RRS1 e o RRS2 pode ser excluído. Neste caso, o mRNA transcrito do polinucleotídeo que codifica o Cas9 não pode ser transcrito antes que o códon de parada seja excluído e pode ser transcrito após a exclusão do códon de parada. 3-2. Controle da expressão do ácido nucleico guia

[00608] Uma toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 3-2-1. Inserção de promotor usando RRS

[00609] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00610] A toolbox pode incluir um RRS na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o gRNA.

[00611] Um ácido nucleico pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor. O promotor pode incluir um promotor constitutivo, um promotor

111 / 353 tecido-específico ou um promotor induzível. O promotor constitutivo pode incluir um promotor U6. O ácido nucleico pode incluir um RRS em uma extremidade ou em ambas as extremidades do polinucleotídeo que codifica o promotor. O RRS pode formar um par com o RRS incluído na toolbox.

[00612] Uma SSR que pode interagir com o ácido nucleico e o RRS pode ser provido à toolbox. Um polinucleotídeo que codifica o promotor pode ser inserido na toolbox. Neste caso, a transcrição do polinucleotídeo que codifica um gRNA não pode ser iniciada antes da inserção do promotor e pode ser iniciada após a inserção do promotor e. 3-2-2. Controle da transcrição do gRNA

[00613] Uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um gRNA.

[00614] A toolbox pode incluir um promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o gRNA. O promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico ou um promotor induzível. O promotor constitutivo pode incluir um promotor U6.

[00615] A toolbox pode incluir um RRS1, um códon de parada da transcrição e um RRS2. O códon de parada da transcrição pode incluir uma sequência poli T. O códon de parada da transcrição pode incluir uma sequência AATAAA. O RRS1, o códon de parada da transcrição e o RRS2 podem ser localizados sequencialmente entre o promotor que inicia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o gRNA e o polinucleotídeo que codifica o gRNA. O RRS1 e o RRS2 podem ser iguais entre si. O RRS1 e o RRS2 podem incluir um loxp, mas não estão limitados ao mesmo.

[00616] Uma SSR que pode interagir com o RRS1 e o RRS2 pode ser provida à toolbox. A SSR pode incluir Cre recombinase, mas não está limitada à mesma. Na toolbox, um polinucleotídeo incluindo um códon de parada da transcrição localizado entre o RRS1 e o RRS2 pode ser excluído.

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[00617] Neste caso, o polinucleotídeo que codifica o gRNA pode não ser expressado antes da exclusão do códon de parada da transcrição e pode ser expressado após a exclusão do códon de parada da transcrição.

4. Sítio alvo do sistema CRISPR/enzima

[00618] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos uma toolbox.

[00619] A pelo menos uma toolbox pode incluir uma primeira toolbox. A primeira toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[00620] Alternativamente, a primeira toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, mas pode não incluir um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Neste caso, um ácido nucleico guia ou um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia pode ser introduzido em uma célula por um vetor de dispensação separado.

[00621] O ácido nucleico guia pode incluir um domínio protoespaçador. O domínio protoespaçador pode incluir uma sequência de nucleotídeos que é igual ou pode ter uma ligação complementar com um sítio alvo localizado em um genoma animal em uma célula ou exopolinucleotídeo.

[00622] A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada ao mesmo. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 4-1. Genoma animal

[00623] O genoma animal em uma célula pode incluir um sítio alvo para um gRNA. O sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM. A sequência PAM pode incluir NGG, mas não está limitada à mesma.

[00624] O sítio alvo pode estar localizado em um polinucleotídeo que pode estar envolvido na expressão de um polipeptídeo ou RNA no genoma animal em uma célula.

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[00625] O sítio alvo pode estar localizado em qualquer um dos promotores, UTR 5’, éxon, íntron e UTR 3’ de um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo ou RNA no genoma animal em uma célula.

[00626] Neste caso, o nível de expressão de um polipeptídeo ou RNA dentro da célula pode ser afetado através do sistema CRISPR/enzima.

[00627] O sítio alvo pode estar localizado dentro do porto seguro do genoma animal em uma célula.

[00628] No caso em que o genoma animal é um genoma de camundongo, o porto seguro do genoma de camundongo pode incluir o sítio rosa26 que já é bem conhecido.

[00629] No caso em que o genoma animal é um genoma bovino, o porto seguro do genoma bovino pode incluir os locais na Tabela 1, mas não está limitado aos mesmos.

[00630] Neste caso, é possível realizar uma transformação sítio- específica que não produz um efeito fatal nas células acima e nos animais transgênicos, incluindo essas células, através do sistema CRISPR/enzima. 4-2. Exopolinucleotídeo

[00631] Pelo menos uma toolbox que está incluída no genoma do animal pode incluir uma toolbox alvo.

[00632] Como usado na presente invenção, o termo “toolbox alvo” pode se referir a uma toolbox incluindo um sítio alvo, que pode ser reconhecido por um componente da nuclease manipulada, como um componente.

[00633] A toolbox alvo pode incluir pelo menos um sítio alvo para um gRNA. O sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM. A sequência PAM pode incluir NGG, mas não está limitada à mesma.

[00634] A toolbox alvo pode ser uma toolbox igual à primeira toolbox.

[00635] A toolbox alvo pode ser uma toolbox diferente da primeira toolbox.

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[00636] O sítio alvo pode estar localizado em qualquer um dos promotores, UTR 5’, éxon, íntron e UTR 3’ de um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo ou RNA dentro da toolbox alvo.

[00637] O polipeptídeo pode incluir parte de uma proteína alvo. Nesse caso, o nível de expressão da proteína alvo das células, incluindo a toolbox alvo e um animal transgênico, incluindo essas células, pode ser afetado através do sistema CRISPR/enzima.

[00638] O polipeptídeo pode incluir um polipeptídeo que é expressado por um gene marcador. Neste caso, o gene marcador pode ser inativado através do sistema CRISPR/enzima e, assim, pode ser usado para a seleção de células transformadas. Por exemplo, quando uma toolbox alvo que é incluída em um genoma animal em uma célula inclui um polinucleotídeo que codifica timidina quinase, a timidina quinase pode ser inativada por meio de transformação sítio- específica pelo sistema CRISPR/enzima, que visa parte dos éxons da timidina quinase como sítio alvo. As células nas quais ocorreu a transformação sítio- específica podem ser selecionadas tratando as células, incluindo a toolbox alvo com ganciclovir.

[00639] O polipeptídeo pode incluir parte de uma recombinase. Neste caso, a recombinação sítio-específica em uma célula pode ser inibida por inativação de um polinucleotídeo que codifica a recombinase através do sistema CRISPR/enzima.

[00640] O polipeptídeo pode incluir uma transposase. Neste caso, a inserção de transposon em uma célula ou a exclusão de transposon de uma célula podem ser inibidas por inativação de um polinucleotídeo que codifica uma transposase através do sistema CRISPR/enzima.

[00641] O polipeptídeo pode incluir parte de uma endonuclease guiada por RNA. Nesse caso, a transformação sítio-específica em uma célula pode ser evitada pela inativação da endonuclease guiada por RNA através do sistema CRISPR/enzima. Por exemplo, quando uma toolbox alvo que é incluída em um

115 / 353 genoma animal em uma célula inclui um polinucleotídeo que codifica Cas9, o Cas9 pode ser inativado por meio de transformação sítio-específica pelo sistema CRISPR/enzima, que visa parte dos éxons do Cas9 como um sítio alvo. Na célula, incluindo a toolbox, é possível impedir a ocorrência de transformação sítio-específica (atividade que não é alvo) em um local diferente do sítio alvo, reduzindo a expressão de Cas9 em uma célula e realizando simultaneamente a transformação sítio-específica dentro da toolbox alvo.

[00642] O RNA pode incluir parte de um ácido nucleico guia. Nesse caso, a transformação sítio-específica em uma célula pode ser evitada por inativação do ácido nucleico guia através do sistema CRISPR/enzima. Por exemplo, quando uma toolbox alvo incluída em um genoma animal em uma célula inclui um polinucleotídeo que codifica um gRNA, o gRNA pode ser inativado por meio de transformação sítio-específica pelo sistema CRISPR/enzima, que tem como alvo um domínio protoespaçador do gRNA como um sítio alvo. Na célula, incluindo a toolbox, é possível impedir a ocorrência de transformação sítio-específica (atividade que não é alvo) em um local que não seja o sítio alvo, reduzindo a expressão de gRNA em uma célula e executando simultaneamente a transformação sítio-específica dentro a toolbox alvo. Adicionalmente, quando a célula que inclui a toolbox alvo pode expressar uma endonuclease guiada por RNA, é possível impedir a atividade que não é alvo sem afetar a expressão da endonuclease guiada por RNA.

[00643] O sítio alvo pode estar localizado em um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional dentro da toolbox alvo. Alternativamente, o sítio alvo pode estar localizado em um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido dentro da toolbox alvo. Alternativamente, o sítio alvo pode estar localizado em um polinucleotídeo não transcrito dentro da toolbox alvo.

[00644] Quando um genoma animal em uma célula inclui duas ou mais toolboxes alvo iguais entre si, é possível realizar várias transformações

116 / 353 idênticas específicas do sítio por meio de um único sistema CRISPR/enzima. Por exemplo, quando uma toolbox alvo é incluída em um genoma bovino em uma célula inclui um polinucleotídeo não transcrito, é possível realizar uma inserção sítio-específica de um polinucleotídeo que codifica ômega-3 por meio do sistema CRISPR/enzima, que tem como alvo parte do polinucleotídeo não transcrito como um sítio alvo. Quando o genoma bovino inclui duas ou mais das toolboxes alvo, um polinucleotídeo que codifica ômega-3 pode ser inserido em cada toolbox alvo e, portanto, é possível preparar uma célula ou vaca transgênica que tem um alto nível de expressão de ômega-3.

[00645] Quando um genoma animal em uma célula inclui duas ou mais toolboxes alvo que são diferentes umas das outras, é possível executar várias transformações diferentes específicas do sítio através do sistema CRISPR/enzima no qual os ácidos nucleicos guia são variados. Por exemplo, o genoma bovino em uma célula pode incluir uma primeira toolbox alvo e uma segunda toolbox alvo. A primeira toolbox alvo pode incluir um primeiro sítio alvo e a segunda toolbox alvo pode incluir um segundo sítio alvo. A sequência de nucleotídeos do primeiro sítio alvo pode ser diferente da do segundo sítio alvo. Um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina humana pode ser modificado na primeira toolbox através do sistema CRISPR/enzima que inclui um primeiro gRNA que é o mesmo ou que pode ter uma ligação complementar ao primeiro sítio alvo. Um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina humana pode ser introduzido na segunda toolbox através do sistema CRISPR/enzima que inclui um segundo gRNA que é igual ou que pode ter uma ligação complementar ao segundo sítio alvo. As células ou vaca transgênica incluindo essas células, que incluem a primeira toolbox alvo e a segunda toolbox alvo, podem produzir anticorpos humanos expressando a cadeia pesada de imunoglobulina humana e a cadeia leve de imunoglobulina humana.

5. Transformação sítio-específica usando o sistema CRISPR/enzima

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[00646] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos uma toolbox. A pelo menos uma toolbox pode incluir pelo menos qualquer uma entre uma primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox.

[00647] A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Neste caso, é possível realizar a transformação sítio-específica pelo sistema CRISPR/enzima via dispensação de um ácido nucleico ou polinucleotídeo guia que codifica o ácido nucleico guia em uma célula incluindo a toolbox.

[00648] A segunda toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Neste caso, é possível realizar a transformação sítio-específica através do sistema CRISPR/enzima, introduzindo uma endonuclease guiada por RNA ou dispensando um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, em uma célula incluindo a toolbox.

[00649] A terceira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Nesse caso, é possível realizar a transformação sítio-específica através do sistema CRISPR/enzima na célula.

[00650] O genoma animal na célula que inclui pelo menos uma toolbox pode incluir um sítio alvo para o ácido nucleico guia. O sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM.

[00651] A pelo menos uma toolbox pode incluir uma toolbox alvo. A toolbox alvo pode incluir um sítio alvo para o ácido nucleico guia. O sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM. A toolbox alvo pode ser uma toolbox igual à da primeira toolbox. Alternativamente, a toolbox alvo pode ser uma toolbox diferente da primeira toolbox.

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[00652] A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada ao mesmo. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo. 5-1. União da extremidade não homóloga (NHEJ)

[00653] No caso em que duas fitas duplas de DNA são clivadas, ou seja, uma ocorrência de uma ruptura de duas fitas, a ligação posterior das fitas de DNA clivadas pela DNA ligase é chamada união de extremidade não homóloga (NHEJ).

[00654] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos qualquer um entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. Cas9 pode ser expressado na célula ou pode ser dispensado na célula. Um gRNA pode ser expressado na célula ou dispensado na célula.

[00655] O gRNA pode ter uma ligação complementar com um sítio alvo do genoma animal em uma célula ou toolbox alvo. O Cas9 pode interagir com o gRNA e, assim, causar uma ruptura de fita dupla no sítio alvo.

[00656] Neste caso, um nucleotídeo ou polinucleotídeo pode ser inserido durante o processo de união de extremidade não homóloga (NHEJ). Alternativamente, um nucleotídeo ou polinucleotídeo pode ser excluído durante o processo de união de extremidade não homóloga (NHEJ). Devido à inserção ou exclusão, uma modificação pode ocorrer na sequência de nucleotídeos no sítio alvo. 5-2. Recombinação homóloga

[00657] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos qualquer uma entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. Cas9 pode ser expressado na célula ou dispensado na célula. Um gRNA pode ser expressado na célula ou dispensado na célula.

[00658] Um polinucleotídeo doador ou doador pode ser dispensado na célula. Um primeiro braço de homologia pode estar localizado na extremidade

119 / 353 5’ do doador. Um segundo braço de homologia pode estar localizado na extremidade 3’ do doador.

[00659] O primeiro braço de homologia pode ter uma sequência de nucleotídeos igual à parte de um genoma animal em uma célula e o segundo braço de homologia pode ter uma sequência de nucleotídeos igual à parte de um genoma animal em uma célula. Neste caso, o polinucleotídeo doador pode ser inserido entre a mesma sequência de nucleotídeos que a do primeiro braço de homologia e a mesma sequência de nucleotídeos que a do segundo braço de homologia, em um genoma animal em uma célula.

[00660] Alternativamente, o primeiro braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de uma toolbox alvo em uma célula e o segundo braço de homologia pode ter a mesma sequência de nucleotídeos como parte de uma toolbox alvo em uma célula. Neste caso, um doador pode ser inserido entre a mesma sequência de nucleotídeos que a do primeiro braço de homologia e a mesma sequência de nucleotídeos que a do segundo braço de homologia, em uma toolbox alvo em uma célula.

[00661] O doador pode incluir uma toolbox. 5-3. Integração direcionada independente da homologia (HITI)

[00662] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos qualquer um entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. Cas9 pode ser expressado na célula ou dispensado na célula. Um gRNA pode ser expressado na célula ou dispensado na célula.

[00663] Um doador pode ser dispensado na célula.

[00664] Um sítio alvo tendo a mesma sequência de nucleotídeos que a localizada no sítio alvo no genoma animal de uma célula pode estar localizado na extremidade 5’ e na extremidade 3’ do doador. Nesse caso, pode ocorrer uma ruptura de fita dupla, pelo sistema CRISPR/enzima, em um sítio alvo localizado no genoma animal na célula, um sítio alvo na extremidade 5’ de um doador, e um sítio alvo na extremidade 3’ de um doador. Um doador pode ser

120 / 353 inserido entre rupturas de fita dupla do genoma animal através de uma união de extremidade não homóloga (NHEJ).

[00665] Alternativamente, um sítio alvo com a mesma sequência de nucleotídeos que a localizada no sítio alvo na toolbox alvo em uma célula pode estar localizado na extremidade 5’ e na extremidade 3’ do doador. Nesse caso, pode ocorrer uma ruptura de fita dupla, pelo sistema CRISPR/enzima, em um sítio alvo localizado na toolbox alvo na célula, um sítio alvo na extremidade 5’ de um doador e um sítio alvo na extremidade 3’ de um doador. Um doador pode ser inserido entre rupturas de fita dupla da toolbox alvo através de uma união de extremidade não homóloga (NHEJ).

[00666] O doador pode incluir uma toolbox. 5-4. Modificação (Knockin)

[00667] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos qualquer um entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. Cas9 pode ser expressado na célula ou dispensado na célula. Um gRNA pode ser expressado na célula ou dispensado na célula.

[00668] Um polinucleotídeo doador pode ser dispensado na célula. Nesse caso, o doador pode ser inserido em um genoma animal em uma célula ou no interior de uma toolbox alvo por meio de recombinação homóloga. Alternativamente, o doador pode ser inserido em um genoma animal em uma célula ou no interior de uma toolbox alvo através da HITI.

[00669] Por exemplo, pelo menos um nucleotídeo da sequência presente no sítio alvo em um genoma animal ou no sítio alvo dentro da toolbox alvo em uma célula pode ser excluído, e o polinucleotídeo doador pode ser adicionado.

[00670] Em um outro exemplo, o polinucleotídeo doador pode ser adicionado à sequência presente no sítio alvo em um genoma animal ou no sítio alvo dentro da toolbox alvo em uma célula.

[00671] No caso em que o doador inclui um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, na célula na qual o doador é inserido, o polinucleotídeo

121 / 353 que codifica um(a) proteína ou RNA pode ser inativado e, assim, a proteína ou o RNA pode ser expressada(o). 5-5. Inativação (inativação)

[00672] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos qualquer um entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. Cas9 pode ser expressado na célula ou dispensado na célula. Um gRNA pode ser expressado na célula ou dispensado na célula.

[00673] Um polinucleotídeo doador pode ser dispensado na célula. Nesse caso, o doador pode ser inserido em um sítio alvo em um genoma animal ou em um sítio alvo dentro de uma toolbox alvo em uma célula através de recombinação homóloga. Alternativamente, o doador pode ser inserido em um sítio alvo em um genoma animal ou em um sítio alvo dentro de uma toolbox alvo em uma célula através da HITI.

[00674] Um polinucleotídeo doador não pode ser dispensado na célula. Nesse caso, a inserção de nucleotídeo, a inserção de polinucleotídeo, a exclusão de nucleotídeo ou a exclusão de polinucleotídeo podem ocorrer no sítio alvo em um genoma animal ou no sítio alvo dentro de uma toolbox alvo em uma célula.

[00675] Por exemplo, pelo menos um nucleotídeo presente em um sítio alvo em um genoma animal ou em um sítio alvo dentro de uma toolbox alvo em uma célula pode ser excluído.

[00676] Em um outro exemplo, pelo menos um nucleotídeo presente em um sítio alvo em um genoma animal ou em um sítio alvo dentro de uma toolbox alvo em uma célula pode ser excluído, e pelo menos um nucleotídeo pode ser adicionalmente adicionado ao mesmo.

[00677] No caso em que o sítio alvo no genoma animal ou o sítio alvo dentro da toolbox alvo na célula é localizado em um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, a proteína ou o RNA pode ser eliminada(o) e, assim, o nível de expressão pode ser reduzido.

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6. Célula transformada sítio-específica pelo sistema CRISPR/enzima

[00678] Um genoma animal de uma célula transformada pode incluir pelo menos uma toolbox. A pelo menos uma toolbox pode incluir qualquer uma entre a primeira toolbox, a segunda toolbox e a terceira toolbox. A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A segunda toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. A terceira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[00679] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir células nas quais a transformação sítio-específica ocorreu em um sítio alvo no genoma animal na célula.

[00680] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir células nas quais a transformação sítio-específica ocorreu em um sítio alvo dentro de uma toolbox alvo na célula. 6-1. Célula única 6-1-1. Ploidia

[00681] Uma célula transformada sítio-específica pode ser uma célula diploide. A célula diploide é como descrita acima.

[00682] Uma célula transformada sítio-específica pode ser uma célula haploide. A célula haploide é como descrita acima. 6-1-2. Zigosidade

[00683] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir pelo menos um par de cromossomos homólogos. O pelo menos um par de cromossomos homólogos pode incluir um primeiro cromossomo e um segundo cromossomo, que estão em uma relação de cromossomos homólogos.

[00684] A célula transformada sítio-específica pode ser um homozigoto.

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[00685] Na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, todos do tipo, do número e da localização da transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00686] Na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, tanto o tipo como o número da transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00687] Na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, o tipo de transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo pode ser o mesmo.

[00688] Na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, todos do tipo, do número e da localização das toolboxes e da transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00689] Na célula transformada sítio-específica, que é um homozigoto, tanto o tipo como o número de toolboxes e da transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00690] Na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, o tipo das toolboxes e a transformação sítio-específica incluída no primeiro cromossomo e no segundo cromossomo podem ser os mesmos.

[00691] Alternativamente, na célula transformada sítio-específica que é um homozigoto, o primeiro cromossomo e o segundo cromossomo podem não incluir nenhuma toolbox e o primeiro cromossomo e o segundo cromossomo podem não incluir nenhuma transformação sítio-específica.

[00692] A célula transformada sítio-específica pode ser um heterozigoto.

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[00693] Na célula transformada sítio-específica que é um heterozigoto, o primeiro cromossomo pode não incluir nenhuma toolbox e o segundo cromossomo pode incluir pelo menos uma toolbox.

[00694] Na célula transformada sítio-específica que é um heterozigoto, o primeiro cromossomo pode não incluir a transformação sítio-específica e o segundo cromossomo pode incluir pelo menos uma transformação sítio- específica.

[00695] Na célula transformada sítio-específica que é um heterozigoto, o segundo cromossomo pode não incluir uma toolbox que é a mesma que a incluída no primeiro cromossomo.

[00696] Na célula transformada sítio-específica que é um heterozigoto, o segundo cromossomo pode não incluir a transformação sítio-específica que é a mesma que a incluída no primeiro cromossomo. 6-2. Colônia de células

[00697] Uma célula transformada sítio-específica pode formar uma colônia de células. 6-2-1. Colônia de células homólogas

[00698] Uma colônia de células homólogas é caracterizada pelo fato de as toolboxes possuídas por cada célula serem iguais umas com as outras e todos do tipo, do número e do sítio da transformação sítio-específica incluída em cada célula também serem iguais entre si. 6-2-2. Colônia de células quiméricas

[00699] Uma colônia de células quiméricas se refere a uma colônia de células que não seja uma colônia de células homólogas.

[00700] Por exemplo, uma colônia de células quiméricas pode incluir uma primeira célula, que tem um genoma no qual ocorreu uma transformação sítio-específica em um primeiro sítio alvo pelo sistema CRISPR/enzima, e uma segunda célula, que não tem um genoma no qual transformação sítio-específica ocorreu em um primeiro sítio alvo pelo sistema CRISPR/enzima.

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7. Seleção de célula transformada sítio-específica usando o sistema CRISPR/enzima 7-1. Seleção de célula transformada usando proteína fluorescente

[00701] Uma célula transformada pode incluir pelo menos uma toolbox alvo. A célula transformada pode incluir pelo menos uma toolbox. Qualquer uma da pelo menos uma toolbox pode ser uma toolbox alvo que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo pode ser inserido na célula transformada através de transformação sítio-específica que usa os éxons de um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente como sítio alvo.

[00702] As células transformadas específicas do sítio podem ser diferentes das células nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu em relação ao sinal de fluorescência. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas.

[00703] A célula transformada sítio-específica pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente. Por exemplo, um doador incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína fluorescente pode ser inserido em uma célula transformada, incluindo pelo menos uma toolbox alvo através de transformação sítio-específica. O doador pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00704] As células transformadas específicas do sítio expressam proteínas fluorescentes e, portanto, os sinais de fluorescência podem ser medidos. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas das células animais nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu. 7-2. Seleção de células transformadas usando o gene de resistência a antibióticos

[00705] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir um gene de resistência a antibióticos.

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[00706] Por exemplo, um doador que inclui um polinucleotídeo que codifica um gene de resistência a antibióticos pode ser inserido em uma célula transformada, incluindo pelo menos uma toolbox alvo através de transformação sítio-específica. O doador pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00707] A célula transformada sítio-específica pode expressar um gene de resistência a antibióticos e, portanto, a célula pode sobreviver mesmo quando a célula é tratada com um composto antibiótico. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser separadas das células animais nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu. 7-3. Seleção de célula transformada usando reação do anticorpo contra antígeno

[00708] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir pelo menos uma toolbox alvo. A célula transformada sítio-específica pode incluir pelo menos uma toolbox. Qualquer uma de pelo menos uma toolbox pode ser uma toolbox alvo, que inclui um polinucleotídeo que codifica um antígeno ou um nucleotídeo capaz de atuar como um antígeno. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo pode ser inserido em uma célula transformada, o que inclui uma toolbox alvo que inclui um polinucleotídeo que codifica um antígeno, através da transformação sítio-específica na qual éxons de um polinucleotídeo que codifica um antígeno são usados como um sítio alvo.

[00709] As células transformadas específicas do sítio podem ser diferentes das células nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu, com relação ao nível de expressão de um antígeno. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas através da reação do anticorpo contra antígeno.

[00710] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir um polinucleotídeo que codifica um antígeno ou um nucleotídeo capaz de atuar como um antígeno. Por exemplo, um doador que inclui um nucleotídeo capaz

127 / 353 de atuar como um antígeno pode ser inserido em uma célula transformada que inclui um sítio alvo em um genoma animal através de transformação sítio- específica. O doador pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00711] O nucleotídeo capaz de atuar como um antígeno inserido na célula transformada sítio-específica pode interagir com um anticorpo específico. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas das células animais nas quais a transformação sítio- específica não ocorreu. 7-4. Seleção de células transformadas usando o gene marcador de superfície

[00712] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir pelo menos uma toolbox alvo. A célula transformada sítio-específica pode incluir pelo menos uma toolbox. Qualquer uma das pelo menos uma toolbox pode ser uma toolbox alvo que inclui um polinucleotídeo que codifica um gene marcador de superfície. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo pode ser inserido na célula transformada através de transformação sítio-específica, na qual os éxons de um polinucleotídeo que codifica um gene marcador de superfície são usados como um sítio alvo.

[00713] As células transformadas específicas do sítio podem ser diferentes das células nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu, em relação ao nível do marcador de superfície expressado na superfície. O marcador de superfície pode interagir com um anticorpo específico. O anticorpo pode interagir com partículas magnéticas ou fluoróforos. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas das células nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu, com base na propriedade magnética ou no sinal de fluorescência.

[00714] A célula transformada sítio-específica pode incluir um polinucleotídeo que codifica um marcador de superfície. Por exemplo, um

128 / 353 doador que inclui um polinucleotídeo que codifica um marcador de superfície pode ser inserido em uma célula transformada, que inclui pelo menos uma toolbox alvo, por meio de transformação sítio-específica. O doador pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo.

[00715] A célula transformada sítio-específica pode expressar o marcador de superfície na superfície da célula. O marcador de superfície pode interagir com um anticorpo específico. O anticorpo pode interagir com partículas magnéticas ou fluoróforos. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas das células nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu, com base na propriedade magnética ou no sinal de fluorescência. 7-5. Seleção de células transformadas usando o gene autodestrutivo

[00716] Uma célula transformada sítio-específica pode incluir um polinucleotídeo que codifica um gene autodestrutivo em um genoma animal ou dentro de uma toolbox. Uma célula transformada sítio-específica na qual o gene autodestrutivo é eliminado por meio da transformação sítio-específica pode ser preparada.

[00717] Por exemplo, quando a célula transformada inclui uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica a timidina quinase, um doador pode ser inserido por meio de transformação sítio-específica, na qual parte da sequência de nucleotídeos dos éxons do polinucleotídeo que codifica a timidina quinase é usada como sítio alvo.

[00718] A célula transformada sítio-específica é caracterizada por um gene autodestrutivo ser inativado e, assim, mesmo quando um pró-fármaco é tratado na mesma, não ocorre apoptose. Por conseguinte, as células transformadas específicas do sítio podem ser distinguidas das células animais nas quais a transformação sítio-específica não ocorreu.

8. Animal transgênico sítio-específico usando sistema CRISPR/enzima

129 / 353 8-1. Animal transgênico específico para sítio individual usando o sistema CRISPR/enzima 8-1-1. Homologia

[00719] Cada célula incluída em um animal transgênico sítio-específico homólogo pode incluir pelo menos uma toolbox. A pelo menos uma toolbox pode incluir pelo menos uma entre uma primeira toolbox, uma segunda toolbox e uma terceira toolbox. A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A segunda toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. A terceira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[00720] A endonuclease guiada por RNA pode incluir Cas9, mas não está limitada ao mesmo. O ácido nucleico guia pode incluir um gRNA, mas não está limitado ao mesmo.

[00721] Cada célula, que é incluída em um animal transgênico sítio- específico homólogo, pode incluir pelo menos uma transformação sítio- específica em um sítio alvo de um genoma do animal.

[00722] Cada célula, que é incluída em um animal transgênico sítio- específico homólogo, pode incluir pelo menos uma transformação sítio- específica em um sítio alvo dentro de uma toolbox. 8-1-2. Quimérico

[00723] Um animal transgênico sítio-específico quimérico refere-se a um animal transgênico que não seja um animal transgênico homólogo.

[00724] Por exemplo, um animal transgênico sítio-específico quimérico pode incluir tanto uma primeira célula, que tem um genoma no qual a transformação sítio-específica ocorreu em um primeiro sítio alvo pelo sistema CRISPR/enzima; e uma segunda célula, que não tem um genoma no qual

130 / 353 ocorreu a transformação sítio-específica no primeiro sítio alvo pelo sistema CRISPR/enzima. 8-2. Método de preparação de animal transgênico sítio-específico usando o sistema CRISPR/enzima

[00725] Os métodos de preparação de um animal transgênico sítio- específico incluem um método para preparar um animal transgênico sítio- específico a partir de uma célula animal, um método para preparar um animal transgênico sítio-específico através da dispensação de um exopolinucleotídeo em um tecido ou órgão de um animal, e um método para preparar um animal transgênico sítio-específico através da reprodução entre animais transgênicos. O método para preparar um animal transgênico sítio-específico a partir de uma célula animal inclui um método para preparar um animal transgênico sítio- específico a partir de uma célula de um animal transgênico no qual pelo menos uma toolbox é inserida.

[00726] O animal transgênico sítio-específico preparado por qualquer um dos métodos acima pode ser qualquer um de um animal transgênico sítio- específico quimérico ou um animal transgênico sítio-específico homólogo. 8-2-1. Método para preparar um animal transgênico sítio-específico a partir de uma célula animal

[00727] Um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado a partir de uma célula transformada, incluindo pelo menos uma toolbox.

[00728] Por exemplo, um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado executando uma transformação sítio-específica em um sítio alvo presente em um genoma animal ou dentro de uma toolbox alvo em uma célula somática via microinjeção de células somáticas de um gRNA na célula somática, na qual uma primeira toolbox é inserida, seguida por SCNT. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico homólogo.

131 / 353

[00729] Por exemplo, um animal transgênico sítio-específico, no qual um polinucleotídeo doador é inserido em um sítio alvo presente em um genoma animal ou dentro de uma toolbox alvo de um gameta incluindo uma terceira toolbox, pode ser preparado por microinjeção de gameta do polinucleotídeo doador no gameta. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico.

[00730] Por exemplo, um animal transgênico sítio-específico, no qual o NHEJ ocorreu em um sítio alvo presente em um genoma animal ou dentro de uma toolbox alvo de um zigoto, incluindo uma segunda toolbox, pode ser preparado via microinjeção de zigoto de um polinucleotídeo que codifica Cas9 no zigoto. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico.

[00731] Por exemplo, um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado pela indução de NHEJ em um sítio alvo presente dentro de uma toolbox alvo via microinjeção de embrião de um polinucleotídeo que codifica Cas9 e um polinucleotídeo que codifica um gRNA em um embrião, incluindo uma toolbox alvo. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico. 8-2-2. Método para preparar um animal transgênico sítio-específico por dispensação de um exopolinucleotídeo no tecido ou órgão de um animal

[00732] Um tecido ou órgão de um animal pode incluir uma célula incluindo pelo menos uma toolbox. Um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado através da introdução de Cas9, um gRNA ou um polinucleotídeo doador em um tecido ou órgão do animal.

[00733] Por exemplo, quando o tecido da glândula mamária do animal inclui uma célula na qual uma primeira toolbox é inserida, um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado, no qual uma proteína que é especificamente expressada na glândula mamária é inativada, por microinjeção de um gRNA que tem como alvo, como um sítio alvo, parte da sequência de

132 / 353 nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica a proteína expressada especificamente na glândula mamária de um genoma animal, no tecido da glândula mamária. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico.

[00734] Por exemplo, quando o tecido da glândula mamária do animal inclui uma célula na qual uma toolbox alvo é inserida, um animal transgênico sítio-específico no qual um doador é inserido na toolbox alvo pode ser preparado via microinjeção de um polinucleotídeo que codifica Cas9, um polinucleotídeo que codifica um gRNA, e um polinucleotídeo doador no tecido da glândula mamária. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico.

[00735] Por exemplo, quando um órgão reprodutor do animal inclui uma célula na qual uma segunda toolbox é inserida, uma transformação sítio- específica pode ser induzida em um sítio alvo presente em um genoma animal ou dentro de uma toolbox alvo em uma célula de um órgão reprodutor via microinjeção de um polinucleotídeo que codifica Cas9 no órgão reprodutivo do animal. O descendente obtido de um gameta do animal transgênico sítio- específico também pode ser um animal transgênico sítio-específico. O animal transgênico sítio-específico pode ser um animal transgênico sítio-específico quimérico. 8-2-3. Método de preparação de animais transgênicos via reprodução

[00736] Um animal transgênico sítio-específico pode ser preparado por meio de reprodução entre um primeiro animal transgênico e um segundo animal transgênico.

[00737] Por exemplo, um descendente, no qual a transformação sítio- específica ocorreu em um sítio alvo presente em um genoma animal ou dentro de uma toolbox alvo, pode ser preparado por meio de reprodução entre um primeiro animal transgênico, incluindo uma primeira toolbox e um segundo animal transgênico, incluindo uma segunda toolbox.

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[00738] O segundo animal transgênico pode ser um descendente do primeiro animal transgênico ou pode ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico. Alternativamente, o segundo animal transgênico pode não ter relação sanguínea com o primeiro animal transgênico.

[00739] O animal transgênico sítio-específico obtido através de reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma parte das toolboxes incluídas em um genoma animal do primeiro animal transgênico, na mesma localização.

[00740] O animal transgênico sítio-específico obtido através de reprodução pode incluir uma toolbox, que é a mesma parte das toolboxes incluídas em um genoma animal do segundo animal transgênico, na mesma localização.

[00741] O animal transgênico sítio-específico obtido através de reprodução pode ser um animal transgênico sítio-específico homólogo.

[00742] O animal transgênico sítio-específico obtido a partir da reprodução pode incluir uma célula transformada sítio-específica homozigótica. O animal transgênico obtido através de reprodução pode incluir uma célula transformada sítio-específica heterozigótica.

9. Uso de animal transgênico sítio-específico usando o sistema CRISPR/enzima 9-1. Animais com variedades melhoradas

[00743] O animal transgênico sítio-específico pode ser usado como um animal com variedades melhoradas. 9-2. Modelo animal para a doença

[00744] O animal transgênico sítio-específico pode ser usado como um modelo animal para a doença. 9-3. Animal resistente à doença

[00745] O animal transgênico sítio-específico pode ser usado como um animal resistente à doença.

134 / 353 9-4. Uso de subprodutos

[00746] Os órgãos, a carne, a pele, os cabelos e os fluidos corporais do animal transgênico sítio-específico podem ser usados, mas partes do animal transgênico sítio-específico a ser usado não se limitam aos mesmos. 9-5. Biorreator

[00747] O animal transgênico sítio-específico pode ser usado como um biorreator. [PARTE V] Excisão de toolbox

1. Excisão de toolbox por transposase

[00748] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos uma toolbox. Uma toolbox de transposon entre a pelo menos uma toolbox pode incluir um polinucleotídeo de ITR em uma primeira região de extremidade e uma segunda região de extremidade. 1-1. Uso de transposase no genoma animal 1-1-1. Construção para excisão de toolbox

[00749] O genoma animal pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma transposase que pode interagir com o polinucleotídeo de ITR. A transposase pode incluir uma transposase apenas de excisão.

[00750] O polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar localizado dentro de uma toolbox de transposon.

[00751] Como usado na presente invenção, o termo “toolbox de transposon” pode se referir a uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica um transposon como um componente.

[00752] O polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar localizado dentro de uma toolbox diferente da toolbox do transposon.

[00753] O polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar localizado fora da toolbox.

[00754] Um promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar localizado a montante do polinucleotídeo que

135 / 353 codifica a transposase. O promotor pode ser qualquer um entre um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível.

[00755] Um LSL pode estar localizado entre o promotor que controla a transcrição da transposase e o polinucleotídeo que codifica a transposase. 1-1-2. Mecanismo de excisão de toolbox

[00756] A transposase expressada em uma célula pode excluir a toolbox de transposon presente na célula do genoma animal.

[00757] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a transposase é um promotor tecido-específico, a transposase pode ser expressada em uma célula de tecido particular de um animal transgênico, incluindo o genoma animal. Neste caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula incluída em tecido particular pode ser excluída por meio de interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon.

[00758] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a transposase é um promotor induzível, a transposase pode ser expressada apenas quando certas condições são satisfeitas. Neste caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula que satisfaz certas condições pode ser excluída através da interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon.

[00759] No caso em que um LSL é localizado entre o promotor que controla a transcrição da transposase e o polinucleotídeo que codifica a transposase, a transposase pode ser expressada apenas quando o códon de parada presente no LSL é excluído por meio de recombinação sítio-específica, introduzindo Cre recombinase na célula. Neste caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula incluindo Cre recombinase pode ser excluída através da interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon. 1-2. Uso de transposase fora do genoma animal 1-2-1. Construção para excisão de toolbox

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[00760] O genoma animal pode não incluir o polinucleotídeo que codifica uma transposase que pode interagir com o polinucleotídeo de ITR.

[00761] Neste caso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser dispensado na célula. Um promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar localizado a montante do polinucleotídeo que codifica a transposase. O promotor pode ser qualquer um entre um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. Um LSL pode estar localizado entre o promotor que controla a transcrição da transposase e o polinucleotídeo que codifica a transposase.

[00762] A própria transposase pode ser introduzida na célula.

[00763] A transposase pode incluir uma transposase apenas de excisão. 1-2-2. Mecanismo de excisão de toolbox

[00764] A transposase introduzida na célula pode excluir a toolbox do transposon presente na célula do genoma animal.

[00765] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica uma transposase é um promotor tecido-específico, a transposase introduzida em um determinado tecido de um animal transgênico, incluindo o genoma animal, pode ser expressada. Nesse caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula onde a transposase é introduzida pode ser excluída através da interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon.

[00766] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a transposase é um promotor induzível, a transposase introduzida na célula pode ser expressada apenas quando certas condições são satisfeitas. Neste caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula que satisfaz certas condições pode ser excluída através da interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon.

[00767] No caso em que um LSL é localizado entre o promotor que controla a transcrição da transposase e o polinucleotídeo que codifica a

137 / 353 transposase, a transposase pode ser expressada apenas quando o códon de parada presente no LSL é excluído por recombinação sítio-específica, introduzindo junto com Cre recombinase. Neste caso, a toolbox de transposon no genoma animal em uma célula incluindo Cre recombinase pode ser excluída através da interação com o polinucleotídeo de ITR da toolbox de transposon.

2. Excisão de toolbox por recombinase sítio-específica

[00768] Um genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos uma toolbox. Entre a pelo menos uma toolbox, uma primeira região de extremidade da toolbox de RRS pode incluir um RRS1 e uma segunda região de extremidade pode incluir um RRS2.

[00769] Conforme usado neste documento, o termo “toolbox de RRS” pode se referir a uma toolbox que inclui um RRS como um componente.

[00770] O RRS1 e o RRS2 podem ser iguais ou diferentes um do outro.

[00771] O RRS1 e o RRS2 podem ser um par entre si.

[00772] Uma SSR 1, que pode interagir com o RRS1, e uma SSR 2, que pode interagir com o RRS2, podem ser a mesma SSR entre si. 2-1. Uso de recombinase sítio-específica no genoma animal 2-1-1. Construção para excisão de toolbox

[00773] O genoma animal em uma célula pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que codifica a SSR.

[00774] O polinucleotídeo que codifica a SSR pode estar localizado dentro de uma toolbox de SSR.

[00775] O polinucleotídeo que codifica a SSR pode estar localizado em uma toolbox diferente da toolbox de SSR.

[00776] O polinucleotídeo que codifica a SSR pode estar localizado fora da toolbox.

[00777] Um promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR pode estar localizado a montante do polinucleotídeo que codifica a SSR. O promotor pode ser qualquer um entre um promotor

138 / 353 constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. Um LSL pode estar localizado entre o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR e o polinucleotídeo que codifica a SSR. 2-1-2. Mecanismo de excisão de toolbox

[00778] A SSR expressada em uma célula pode excluir a toolbox do RRS de um genoma animal através da interação com o RRS1 e o RRS2.

[00779] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR é um promotor tecido-específico, a SSR pode ser expressada em um determinado tecido de um animal transgênico, incluindo o genoma animal. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal em uma célula incluída em um determinado tecido pode ser excluída através da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS.

[00780] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR é um promotor induzível, a SSR pode ser expressada apenas quando certas condições são satisfeitas. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal em uma célula, que satisfaz determinadas condições, pode ser excluída por meio da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS.

[00781] No caso em que um LSL é localizado entre o promotor que controla a transcrição da SSR e o polinucleotídeo que codifica a SSR, a SSR pode ser expressada apenas quando o códon de parada presente no LSL é excluído por meio de recombinação sítio-específica, introduzindo Cre recombinase na célula. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal em uma célula incluindo Cre recombinase pode ser excluída através da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS. 2-2. Uso de recombinase sítio-específica fora do genoma animal 2-2-1. Construção para excisão de toolbox

[00782] O genoma animal pode não incluir o polinucleotídeo que codifica a SSR.

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[00783] Neste caso, o polinucleotídeo que codifica a SSR pode ser dispensada na célula. Um promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR pode estar localizado a montante do polinucleotídeo que codifica a SSR. O promotor pode ser qualquer um entre um promotor constitutivo, um promotor tecido-específico e um promotor induzível. Um LSL pode estar localizado a montante do polinucleotídeo que codifica a SSR.

[00784] Alternativamente, a própria SSR pode ser introduzida na célula. 2-2-2. Mecanismo de excisão de toolbox

[00785] A SSR introduzida na célula pode excluir a toolbox de RRS do genoma animal através da interação com o RRS1 e o RRS2.

[00786] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR é um promotor tecido-específico, a SSR introduzida em uma célula de determinado tecido de um animal transgênico, incluindo o genoma animal, pode ser expressado. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal na célula, na qual a SSR é introduzida, pode ser excluída por meio da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS.

[00787] No caso em que o promotor que controla a transcrição do polinucleotídeo que codifica a SSR é um promotor induzível, a SSR introduzida em uma célula pode ser expressada apenas quando certas condições são satisfeitas. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal em uma célula que satisfaz determinadas condições pode ser excluída por meio da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS.

[00788] No caso em que um LSL é localizado entre o promotor que controla a transcrição da SSR e o polinucleotídeo que codifica a SSR, a SSR pode ser expressada apenas quando o códon de parada presente no LSL é excluído por recombinação sítio-específica, introduzindo junto com Cre recombinase. Nesse caso, a toolbox de RRS no genoma animal em uma célula

140 / 353 incluindo Cre recombinase pode ser excluída através da interação com o RRS1 e o RRS2 nas duas extremidades da toolbox de RRS.

[00789] A seguir, formas de realização específicas de acordo com os detalhes divulgados pela presente divulgação serão descritas. [Toolbox incluindo pelo menos uma entre endonuclease guiada por RNA e ácido nucleico guia]

1. Construção da toolbox

[00790] As toolboxes divulgadas por algumas formas de realização da presente divulgação podem incluir uma primeira sequência de ITR, pelo menos uma entre o polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, e uma segunda sequência de ITR.

[00791] Desde a primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia e uma segunda sequência de ITR foram descritos acima, a explicação detalhada é omitida.

[00792] A construção da toolbox será descrita em detalhes com referência à FIG. 1.

[00793] A toolbox (100) pode incluir um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada (110) entre uma primeira sequência de ITR (101) e uma segunda sequência de ITR (107).

[00794] A FIG. 2 ilustra várias formas de realização do polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada (110).

[00795] O polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada (110) pode incluir pelo menos um entre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (102) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (104).

[00796] A endonuclease guiada por RNA pode ser uma proteína Cas9 ou proteína Cpf1 que constitui o complexo de nuclease manipulada; e o ácido

141 / 353 nucleico guia pode ser um gRNA que constitui o complexo de nuclease manipulada.

[00797] Adicionalmente, o polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada (110) pode incluir adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um promotor (106) para a expressão da endonuclease guiada por RNA e/ou ácido nucleico guia.

[00798] A toolbox (100) pode incluir adicionalmente um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS).

[00799] O tipo e o número do sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) podem ser um ou mais.

[00800] A localização na qual o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) pode estar presente dentro da toolbox (100) pode ser várias. Por exemplo, o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) pode estar localizado em uma ou mais localizações entre os 1 a 24 indicadas na FIG. 2).

[00801] O tipo, o número e/ou a localização do sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) podem ser projetados considerando as mudanças na construção de uma toolbox.

[00802] As mudanças na construção podem incluir a troca ou a exclusão do polinucleotídeo incluído na toolbox, e pode incluir a inserção do polinucleotídeo que não está incluído na toolbox para a toolbox.

[00803] Usando a FIG. 2, algumas formas de realização nas quais a construção da toolbox é alterada de acordo com a construção da toolbox, que inclui um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), são descritas abaixo.

[00804] Por exemplo, no caso em que uma toolbox é projetada para incluir um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) na direção 5’ e na direção 3’ com referência ao polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA (102), o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA incluída na toolbox pode ser trocada com um tipo diferente de um polinucleotídeo por recombinação sítio-específica. Especificamente, quando

142 / 353 diferentes tipos de sítios de reconhecimento de recombinase (RRSs) são incluídos nas localizações 4 e 5 da FIG. 2, o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA incluída na toolbox pode ser trocado por um tipo diferente de polinucleotídeo por meio de recombinação sítio-específica.

[00805] Em um outro exemplo, no caso em que uma toolbox é projetada para incluir um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) que pode formar um par na direção 5’ e na direção 3’ com referência ao polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA (102), o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA incluída na toolbox pode ser excluído por recombinação sítio-específica. Especificamente, no caso em que um polinucleotídeo que codifica um loxp é incluído nas localizações 4 e 5 da FIG. 2, o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA incluída na toolbox pode ser excluído por recombinação sítio-específica.

[00806] Em ainda um outro exemplo, no caso em que uma toolbox é projetada para incluir um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) na direção 5’ e/ou na direção 3’ com referência a um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (102), um polinucleotídeo que não é incluído na toolbox pode ser inserido na toolbox por meio de recombinação sítio-específica. Especificamente, no caso em que um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) está incluído no sítio 5 da FIG. 2, um polinucleotídeo que não está incluído na toolbox pode ser inserido na toolbox por recombinação sítio-específica.

[00807] Adicionalmente, o tipo, o número e/ou a localização do sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) podem ser projetados considerando o controle da expressão de um RNA ou proteína, que é codificado por um polinucleotídeo que constitui a toolbox.

[00808] Usando a FIG. 2, algumas formas de realização nas quais a expressão de um RNA ou uma proteína é controlado(a) de acordo com a

143 / 353 construção da toolbox, que inclui um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), são descritas abaixo.

[00809] O controle da expressão de um(a) RNA ou proteína codificado(a) por um polinucleotídeo que constitui a toolbox pode incluir a inserção do polinucleotídeo que codifica um promotor em um estágio posterior usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS).

[00810] Por exemplo, no caso em que um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) é incluído na direção 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA, é possível controlar a expressão da endonuclease guiada por RNA inserindo um promotor para transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA através de recombinação sítio-específica.

[00811] Especificamente, no caso em que um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) está incluído em 17 da FIG. 2, é possível controlar a expressão da endonuclease guiada por RNA inserindo um promotor para transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA por recombinação sítio-específica.

[00812] O controle da expressão de um(a) RNA ou proteína codificado(a) por um polinucleotídeo que constitui a toolbox pode incluir a terminação temporária da expressão pelo polinucleotídeo que codifica o promotor já presente na toolbox usando um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS).

[00813] Por exemplo, no caso em que um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) – códon de parada - um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) (daqui em diante, RSR1); ou um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) – códon de parada de recombinase - polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) (doravante, RTR1) está incluído entre o polinucleotídeo

144 / 353 que codifica a endonuclease guiada por RNA (102) e o promotor (106) para transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA, a endonuclease guiada por RNA não pode ser expressada até que um polinucleotídeo que codifique o RSR1 e/ou o RTR1 seja excluído por recombinação sítio-específica e, finalmente, um complexo de nuclease manipulada não possa ser formado.

[00814] Especificamente, no caso em que um polinucleotídeo que codifica o RSR1 ou RTR1 está incluído em 21 da FIG. 2, a endonuclease guiada por RNA não pode ser expressada até que um polinucleotídeo que codifique o RSR1 e/ou RTR1 seja excluído por recombinação sítio-específica e, finalmente, um complexo de nuclease manipulada não possa ser formado.

[00815] Como descrito acima, a toolbox pode ter várias constituições e os efeitos que podem ser exibidos em células ou animais tendo um genoma no qual uma toolbox é inserida também podem variar de acordo com a construção da toolbox.

[00816] A seguir, serão descritas células e zigotos tendo um genoma no qual a toolbox é inserida.

2. Célula e zigoto, incluindo genoma, no qual a toolbox é inserida 2-1. Constituição de célula e zigoto, incluindo genoma, no qual a toolbox é inserida 2-1-1. Genoma ou cromossomo no qual a toolbox é inserida

[00817] A toolbox provida pela presente divulgação pode ser inserida no genoma de uma célula.

[00818] A localização de um genoma no qual a toolbox pode ser inserida pode ser aleatória.

[00819] O número da toolbox que pode ser inserida em um genoma pode ser um.

[00820] O número da toolbox que pode ser inserida em um genoma pode ser dois ou mais.

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[00821] O tipo da toolbox que pode ser inserida em um genoma pode ser um ou mais.

[00822] Por exemplo, uma primeira toolbox e uma segunda toolbox podem ser inseridas no genoma. Nesse caso, a sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[00823] Quando a célula é uma célula eucariótica, a toolbox provida pela presente divulgação pode ser inserida no cromossomo.

[00824] A localização do cromossomo na qual a toolbox pode ser inserida pode ser aleatória.

[00825] O número da toolbox que pode ser inserida no cromossomo pode ser um.

[00826] O número da toolbox que pode ser inserida no cromossomo pode ser dois ou mais.

[00827] O tipo da toolbox que pode ser inserida no cromossomo pode ser um ou mais.

[00828] Por exemplo, uma primeira toolbox e uma segunda toolbox podem ser inseridas no cromossomo. Nesse caso, a sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[00829] A seguir, assumindo o caso em que um tipo de toolbox é inserido no cromossomo, as localizações do cromossomo, no qual a toolbox é inserida serão descritos em detalhes.

[00830] Para maior comodidade da explicação, a descrição a seguir assume que existem quatro cromossomos que são formados a partir de um genoma presente em uma célula. A FIG. 3 ilustra 4 cromossomos formados a partir do genoma presente em uma célula.

[00831] Como ilustrado na FIG. 3, o primeiro cromossomo (210) e o segundo cromossomo (220) ilustrados na FIG. 3 estão em uma relação de cromossomos homólogos, e o terceiro cromossomo (230) e o quarto cromossomo (240) também estão em uma relação de cromossomos homólogos.

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[00832] O primeiro cromossomo (210) consiste em um primeiro cromatídeo (CT1) e um segundo cromatídeo (CT2), e o segundo cromossomo (220) consiste em um terceiro cromatídeo (CT3) e um quarto cromatídeo (CT4). Além disso, o terceiro cromossomo (230) consiste em um quinto cromatídeo (CT5) e um sexto cromatídeo (CT6), e o quarto cromossomo (240) consiste em um sétimo cromatídeo (CT7) e um oitavo cromatídeo (CT8).

[00833] A FIG. 4 ilustra algumas formas de realização de uma toolbox na qual a toolbox (100) é inserida em qualquer um de um primeiro cromatídeo a um oitavo cromatídeo (CT1 a CT8).

[00834] A toolbox (100) pode ser inserida em apenas uma entre o primeiro cromatídeo à oitava cromatídeo (CT1 a CT8).

[00835] A toolbox (100) pode ser inserida em duas ou mais entre o primeiro cromatídeo à oitava cromatídeo (CT1 a CT8).

[00836] Por exemplo, a toolbox (100) pode ser inserida apenas no primeiro cromatídeo (CT1) entre os cromossomos de uma célula (ver FIG. 4 (a)).

[00837] Em um outro exemplo, a toolbox (100) pode ser inserida no primeiro cromatídeo (CT1) e no segundo cromatídeo (CT2) do primeiro cromossomo (210) entre os cromossomos de uma célula (ver FIG. 4 (b)).

[00838] Em ainda um outro exemplo, a toolbox (100) pode ser inserida no primeiro cromatídeo (CT1) do primeiro cromossomo (210) e no terceiro cromatídeo (CT3) do segundo cromossomo (220) entre os cromossomos de uma célula (ver FIG. 4 (c)). Nesse caso, o primeiro cromossomo (210) e o segundo cromossomo (220) podem estar em uma relação de cromossomos homólogos.

[00839] Em ainda um outro exemplo, a toolbox (100) pode ser inserida no primeiro cromatídeo (CT1) do primeiro cromossomo (210) e no quinto cromatídeo (CT5) do terceiro cromossomo (230) entre os cromossomos de uma célula (ver FIG. 4 (d)). Nesse caso, o primeiro cromossomo (210) e o terceiro

147 / 353 cromossomo (230) podem não estar em uma relação de cromossomos homólogos. 2-1-2. Tipo de células com genoma ou cromossomo no qual a toolbox é inserida

[00840] Uma toolbox pode ser inserida no genoma e/ou cromossomo de uma célula somática, de um gameta ou de uma célula-tronco.

[00841] Para facilitar a explicação, a descrição a seguir pressupõe que o tipo de uma toolbox inserida no genoma e/ou cromossomo de uma célula somática, um gameta ou uma célula-tronco seja um tipo, e a toolbox seja a toolbox (100) descrita acima.

[00842] A FIG. 5 ilustra uma célula somática (301) e um gameta, que respectivamente têm um genoma no qual a toolbox (100) é inserida. O gameta pode ser um óvulo (303) e um espermatozoide (305).

[00843] O genoma e/ou cromossomo, no qual a toolbox (100) está inserida, pode ser incluído no núcleo (302) da célula somática, no núcleo (304) do óvulo, e no núcleo (306) do espermatozoide.

[00844] A toolbox (100), que é inserida no genoma da célula, pode ser transcrita e/ou traduzida de acordo com o mecanismo de expressão de cada célula. Nesse caso, a expressão do endopolinucleotídeo, que já estava presente no genoma da célula, pode não ser afetada. 2-1-3. Zigoto, incluindo genoma, no qual a toolbox é inserida

[00845] Uma toolbox pode ser inserida no genoma ou cromossomo de um zigoto (óvulo fertilizado) ou embrião.

[00846] De acordo com uma forma de realização do presente relatório descritivo, pode ser provido um zigoto transformado ou embrião transgênico, que tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA que é incluída entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Especificamente, o embrião pode ser um embrião de um artiodáctilo.

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[00847] Adicionalmente, um zigoto transformado ou embrião transgênico, que inclui adicionalmente polinucleotídeos que codificam um ácido nucleico guia, capaz de se ligar especificamente a um sítio alvo presente no genoma do zigoto ou embrião, entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR, pode ser provida. Em particular, um elemento de controle de expressão pode ser incluído em pelo menos um entre a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00848] A FIG. 6 ilustra um zigoto que tem um genoma no qual a toolbox (100) é inserida; e um embrião de estágio de 2 células, um embrião de estágio de 4 células, um embrião de estágio de 8 células e um embrião de estágio de 16 células pela divisão celular do zigoto no qual a toolbox (100) é inserida.

[00849] No caso em que o estágio em que a toolbox (100) começou a ser inserida no genoma do zigoto é um zigoto de 1 célula, o zigoto de 1 célula (401), no qual a toolbox (100) é inserida pode ser homólogo (ver a FIG. 6).

[00850] Quando o zigoto no estágio de 1 célula (401) tendo um genoma, no qual a toolbox (100) é inserida, sofre uma divisão celular, o zigoto (401) pode ser desenvolvido em um embrião no estágio de 2 células (403), um embrião de estágio de 4 células (405), um embrião de estágio de 8 células (407), um embrião de estágio de 16 células (409), uma mórula, uma blástula (blastocisto) ou um gástrula, cada um dos quais consiste em células tendo um genoma no qual a toolbox (100) é inserida.

[00851] No entanto, o número e a localização da toolbox (100), que é inserida no genoma do embrião de estágio de 2n células, podem ser diferentes do número e da localização da toolbox (100), que é inserida no genoma do embrião de estágio de 2n+1 células (n é um número inteiro igual a 0 ou superior). Adicionalmente, a localização e o número da toolbox (100), que é inserida nos

149 / 353 genomas das 2n+1 células que constituem o embrião de estágio de 2 n+1 células, podem ser diferentes entre si.

[00852] Isso ocorre porque, embora a localização e o número da toolbox, que é inserida no núcleo do zigoto de estágio de 1 célula (401), possam ser mantidos no embrião do estágio de 2 células (403), mais toolboxes podem ser adicionalmente inseridas devido à interação entre um primeiro vetor plasmídico, uma transposase e os genomas do embrião de estágio de 2 células (403), como descrito acima, mesmo em um estado do embrião de estágio de 2 células 403. Além disso, isso ocorre porque parte da toolbox (100) já inserida no genoma pode ser excluída devido à interação entre os genomas do embrião de estágio de 2 células (403) e a transposase.

[00853] Ou seja, de acordo com uma forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox, na qual no embrião transgênico, a primeira toolbox pode estar presente em um primeiro local e a segunda toolbox pode estar presente em um segundo local diferente do primeiro local. Cada uma da primeira toolbox e da segunda toolbox pode incluir pelo menos uma entre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo é um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo incluído no genoma do embrião, e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Em particular, a sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[00854] De acordo com outra forma de realização provida pelo presente relatório descritivo, um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox, pode ser provido, no qual no

150 / 353 embrião transgênico, a primeira toolbox pode estar presente em um primeiro local e a segunda toolbox pode estar presente em um segundo local onde o primeiro local e o segundo local são iguais entre si. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem cada uma incluir pelo menos uma entre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo é um endopolinucleotídeo do embrião ou um exopolinucleotídeo incluído no genoma do embrião, e pode ser incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Em particular, a sequência da primeira toolbox é diferente da sequência da segunda toolbox.

[00855] Por exemplo, o genoma da primeira célula pode incluir adicionalmente uma terceira toolbox, na qual a sequência da terceira toolbox é igual à da primeira toolbox.

[00856] Em um outro exemplo, o genoma da segunda célula pode incluir adicionalmente uma quarta toolbox, na qual a sequência da quarta toolbox é igual à da segunda toolbox.

[00857] O embrião transgênico pode incluir adicionalmente uma terceira célula tendo um genoma que não inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00858] A FIG. 7 ilustra um embrião de estágio de 2 células, um embrião de estágio de 4 células, um embrião de estágio de 8 células e um embrião de estágio de 16 células, nos quais a toolbox (100) é inserida em cada genoma de algumas células. Na FIG. 7, um primeiro núcleo (501) representa um núcleo que tem um genoma no qual uma toolbox (100) é inserida, e o segundo núcleo (503) representa um núcleo que tem um genoma no qual uma toolbox (100) não é inserida.

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[00859] No caso em que o estágio em que a toolbox (100) começou a ser inserida no genoma é um embrião de estágio de 2m células, uma toolbox (100) pode ser inserida apenas no genoma de algumas células entre as células que composto após o estágio celular v (é um número natural de 1 ou maior). Também neste caso, uma toolbox pode ser inserida em todos os genomas como células que produzem os embriões. No entanto, isso pode ser explicado a partir dos exemplos acima e, portanto, as explicações são incluídas apenas nos casos em que a toolbox é inserida no genoma de algumas células entre as células que usam os embriões.

[00860] Por exemplo, nenhum caso em que o estágio em que a toolbox (100) começou a ser inserido no genoma do zigoto é um embrião de estágio de 2 células, a toolbox (100) pode ser inserida no genoma da primeira célula (511) entre as células que constituem o embrião de estágio de 2 células (411).

[00861] Quando o embrião de estágio de 2 células (411), no qual a toolbox (100) é inserida no genoma de uma célula, sofre uma divisão celular, ou o embrião de estágio de 2 células (411) pode ser desenvolvido em um embrião de estágio de 4 células (413), um embrião de estágio de 8 células (415), um embrião de estágio de 16 células (417), uma mórula, uma cápsula ou uma gástrula, na qual uma toolbox é inserida apenas no genoma de algumas células.

[00862] Ou seja, de acordo com algumas formas de realização incluídas no presente registro, um embrião transgênico quimérico pode ser provido, no qual o embrião transgênico quimérico pode incluir uma primeira célula, que tem um genoma que inclui uma toolbox, e uma segunda célula, que tem um genoma que não inclui uma toolbox

[00863] Especificamente, um embrião transgênico pode ser provido, no qual o embrião transgênico inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo; e uma segunda célula tendo um genoma que inclui o sítio alvo.

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[00864] A primeira toolbox pode incluir pelo menos uma entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia que pode ser ativado no sítio alvo; o genoma da segunda célula pode não incluir um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia que pode ser ativado usando sítio alvo. Além disso, uma sequência de ITR ainda pode ser incluída nas extremidades 5’ e 3’ da primeira toolbox.

[00865] Em particular, a sequência do polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e a sequência do polinucleotídeo que codifica a segunda endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra; e a sequência do polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e a sequência do polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia pode ser a mesma ou diferente uma da outra.

[00866] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo.

[00867] Especificamente, o sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos de 18 pb a 25 pb presente no genoma do embrião transgênico.

[00868] O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo.

[00869] Por exemplo, o sítio alvo pode ser uma sequência adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM; e o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR.

[00870] No entanto, nesse caso, e também pelo mesmo motivo descrito acima, o número e a localização da toolbox (100) inserida no genoma do embrião do estágio de 2m de células pode ser diferente do número e da localização da toolbox (100) inserida no genoma do embrião de estágio 2m+1 de células. Adicionalmente, a localização e o número da toolbox 100, que é inserida nos genomas de 2m+1 células que constituem o embrião de estágio 2m+1 de células, podem ser diferentes um do outro.

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[00871] No caso em que o estágio em que a toolbox (100) começou a ser inserida no genoma é um embrião de estágio de 2m células, a toolbox (100) pode ser inserida em um local diferente para cada genoma de células que constituem o embrião após o estágio de 2m células (m é um número natural 1 ou maior). 2-2. Método para produzir células e/ou zigotos, incluindo genoma, no qual a toolbox é inserida

[00872] A seguir, são descritos vários métodos para a produção de células tendo um genoma no qual a toolbox (100) é inserida. Para maior conveniência das explicações, presume-se que exista um tipo de toolbox que possa ser inserida no genoma.

[00873] Um método para preparar uma célula na qual a toolbox (100) é inserida pode incluir a dispensação da toolbox (100) em uma célula. Em particular, a toolbox (100) pode incluir um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica o componente da nuclease manipulada.

[00874] Pode haver vários métodos para dispensar a toolbox (100) em uma célula.

[00875] Por exemplo, a toolbox pode ser dispensada na célula pela introdução do polinucleotídeo que codifica a toolbox na célula. A introdução do polinucleotídeo que codifica a toolbox na célula pode incluir um método no qual o polinucleotídeo que codifica a toolbox é incorporado em um vetor plasmídico e depois introduzido na célula. Adicionalmente, a introdução do polinucleotídeo que codifica a toolbox na célula pode incluir um método no qual o polinucleotídeo que codifica a toolbox é incorporado em um vetor viral e depois transduzido na célula.

[00876] Um método para preparar uma célula na qual a toolbox (100) é inserida pode incluir a dispensação de uma transposase na célula.

[00877] Pode haver vários métodos para dispensar a transposase na célula.

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[00878] Por exemplo, a transposase pode ser dispensada na célula pela introdução da transposase na forma de uma proteína ou um polipeptídeo.

[00879] Em um outro exemplo, a transposase pode ser dispensada na célula pela introdução do polinucleotídeo que codifica a transposase na célula.

[00880] A introdução do polinucleotídeo que codifica a transposase na célula pode incluir a incorporação do polinucleotídeo que codifica a transposase em um vetor plasmídico seguido pela introdução do resultante na célula. Adicionalmente, a introdução do polinucleotídeo que codifica a transposase na célula pode incluir a incorporação do polinucleotídeo que codifica uma transposase em um vetor viral seguido pela transdução do resultante na célula.

[00881] O polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em conjunto em um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica a toolbox e depois entregue à célula. Adicionalmente, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em um vetor, que é diferente do vetor em que o polinucleotídeo que codifica a toolbox é incluído e depois dispensado à célula. Em particular, o vetor pode ser um vetor não viral ou vetor viral.

[00882] No caso em que o polinucleotídeo que codifica a transposase é incorporado em um vetor plasmídico e depois introduzido na célula, o plasmídeo pode ser transportado para o interior do núcleo e, em seguida, um mRNA que codifica a transposase pode ser produzido no núcleo através da transcrição. O mRNA produzido pode ser transportado para o citoplasma e interagir com um ribossomo e um tRNA no citoplasma, e a transposase pode ser expressada no citoplasma através da interação. A transposase expressada pelo mecanismo acima pode ser introduzida no interior do núcleo.

[00883] A seguir, será descrito o mecanismo pelo qual a toolbox é inserida no genoma de uma célula pela toolbox e uma transposase dispensada na célula. A toolbox (100) e a tansposase dispensadas na célula pelo método

155 / 353 acima descrito podem ser introduzidas no citoplasma da célula. A toolbox (100) e a transposase introduzida no citoplasma podem ser transportadas para o interior do núcleo através de poros nucleares.

[00884] No interior do núcleo, a transposase pode interagir com uma primeira sequência de ITR (101) e uma segunda sequência de ITR (107), que são componentes da toolbox (100), a toolbox (100) pode ser inserida no genoma pela interação. A constituição da toolbox (100) pode ser referida na FIG. 1.

[00885] No caso em que a toolbox (100) é incorporada a um vetor plasmídico e depois dispensada à célula, a toolbox (100) pode ser excluída do vetor plasmídico e a toolbox excluída (100) pode ser inserida no genoma da célula.

[00886] A célula pode ser uma célula isolada ou uma célula não isolada incluída no órgão ou tecido de um animal.

[00887] Um método para preparar uma célula não isolada tendo um genoma, no qual a toolbox (100) é inserida, pode incluir a dispensação da toolbox (100) e da transposase por um método de injeção direta em um tecido ou órgão de um indivíduo.

[00888] Mesmo neste caso, a toolbox (100) pode ser inserida no genoma da célula não isolada, de maneira semelhante ao mecanismo pelo qual a toolbox (100) é inserida no genoma da célula isolada.

[00889] No caso em que o tecido ou órgão é um tecido ou órgão reprodutivo, há uma vantagem em que os gametas transformados podem ser obtidos continuamente.

[00890] A seguir, serão descritos vários métodos para produzir um zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox (100) é inserida. Como descrito acima, para conveniência das explicações, presume-se que exista um tipo de toolbox que possa ser inserida no genoma de um zigoto.

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[00891] Um método para produzir um zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox (100) é inserida pode incluir a microinjeção da toolbox (100) no zigoto e/ou embrião.

[00892] Um método para produzir um zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox (100) é inserida pode incluir a microinjeção de uma transposase no zigoto e/ou embrião.

[00893] O método para a dispensação da toolbox e da transposase na célula é descrito acima e, portanto, os detalhes específicos são omitidos na presente invenção.

[00894] Um método de exemplo para preparar um embrião transgênico provido pelo presente relatório descritivo pode incluir a microinjeção de um vetor, que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica o componente de uma nuclease manipulada, em um zigoto ou embrião. Adicionalmente, o método pode incluir a microinjeção de uma transposase, que pode interagir com o gene de transposon, em um zigoto ou embrião.

[00895] A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que é incorporado em um vetor plasmídico ou vetor viral. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e depois microinjetado no zigoto ou embrião.

[00896] Em uma forma de realização de exemplo de um embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, o embrião transgênico pode incluir uma primeira célula, na qual um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro local e uma segunda célula, em que um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma segunda nuclease manipulada tem um genoma incluído em um segundo local que é diferente do primeiro local. Em particular,

157 / 353 a sequência do polinucleotídeo que codifica os componentes da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica os componentes da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra.

[00897] Em outra forma de realização de exemplo de um embrião transgênico que pode ser preparado pelo método acima, o embrião transgênico pode incluir uma primeira célula, na qual um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma primeira nuclease manipulada tem um genoma incluído em um primeiro local e uma segunda célula, na qual um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma segunda nuclease manipulada tem um genoma incluído no primeiro sítio. Em particular, a sequência do polinucleotídeo que codifica os componentes da primeira nuclease manipulada e a sequência do polinucleotídeo que codifica os componentes da segunda nuclease manipulada pode ser igual ou diferente uma da outra.

[00898] Um método para preparar um zigoto e/ou embrião, que tem um genoma no qual a toolbox (100) é inserida, pode incluir a realização de uma transferência nuclear de célula somática (SCNT) usando um genoma no qual a toolbox (100) é inserida.

[00899] Um método de exemplo para preparar um embrião transgênico provido pelo presente relatório descritivo pode incluir um método para preparar uma célula doadora transgênica, na qual o componente de uma nuclease manipulada é expressada e um método para transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[00900] A preparação da célula doadora transgênica pode incluir a transformação de uma célula com um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica um gene de transposon e o componente da nuclease manipulada. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente a transformação de uma célula com uma transposase que pode interagir com o gene de transposon.

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[00901] A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que é incorporado em um vetor plasmídico ou vetor viral. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser incorporado em um único vetor juntamente com o polinucleotídeo que codifica o gene de transposon e o componente da nuclease manipulada e depois microinjetado em um zigoto ou embrião.

[00902] O mecanismo pelo qual a toolbox (100) é inserida no genoma de uma célula que constitui o zigoto é semelhante ao mecanismo pelo qual a toolbox (100) é inserida no genoma de uma célula isolada.

3. Animal transgênico que inclui genoma no qual a toolbox é inserida 3-1. Animal transgênico que inclui genoma no qual a toolbox é inserida

[00903] De acordo com algumas formas de realização providas pelo presente relatório descritivo, um animal transgênico incluindo um genoma no qual uma toolbox é inserida pode ser provido.

[00904] De acordo com uma forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um animal transgênico tendo um genoma, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA que é incluída entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Especificamente, o animal pode ser um artiodáctilo.

[00905] Adicionalmente, um animal transgênico, no qual o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo presente no animal é adicionalmente incluído entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR. Em particular, um elemento de controle de expressão pode ser incluído em um ou mais entre a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

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[00906] Na presente divulgação, um animal transgênico tendo um genoma no qual uma toolbox é inserida refere-se a um animal tendo pelo menos uma célula tendo um genoma no qual a toolbox é inserida. A transformação pode incluir uma transformação temporária e uma transformação permanente.

[00907] Adicionalmente, daqui em diante, entre as células possuídas pelo animal transgênico, a célula na qual a toolbox é inserida é chamada de “célula manipulada com toolbox” e a célula na qual a toolbox não está inserida é chamada “célula manipulada que não é para toolbox”.

[00908] No entanto, na presente divulgação, o termo “célula manipulada sem toolbox” refere-se apenas a uma célula que tem um genoma em um estado em que a toolbox não está inserida na mesma, e o termo não deve ser entendido como um termo para uma célula em que o genoma é geneticamente modificado para outros fins. Ou seja, uma célula que tem outro genoma manipulado geneticamente, embora na qual a toolbox não esteja inserida, também pode ser a chamada “célula projetada sem toolbox” da presente divulgação.

[00909] Um animal transgênico no qual a toolbox é inserida pode ser um animal quimérico ou homólogo.

[00910] Por exemplo, o animal quimérico pode se referir a um animal que tem uma “célula manipulada sem toolbox”, além da “célula manipulada com toolbox”.

[00911] Ou seja, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pelo presente relatório descritivo, pode ser provido um animal transgênico quimérico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma toolbox e uma segunda célula tendo um genoma que não inclui uma toolbox.

[00912] Especificamente, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo; e uma segunda célula tendo um genoma que inclui o sítio alvo, pode ser provida.

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[00913] A primeira toolbox pode incluir pelo menos um polinucleotídeo entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo; e o genoma da segunda célula pode não incluir um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo. Adicionalmente, uma sequência de ITR pode ser adicionalmente incluída nas extremidades 5’ e 3’ da primeira toolbox.

[00914] Em particular, a sequência do polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e a sequência do polinucleotídeo que codifica a segunda endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra; e a sequência do polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e a sequência do polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia pode ser a mesma ou diferente uma da outra.

[00915] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo.

[00916] Especificamente, o sítio alvo pode ser uma sequência de nucleotídeos de 18 pb a 25 pb presente no genoma animal transgênico.

[00917] O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo.

[00918] Por exemplo, o sítio alvo pode ser uma sequência adjacente à extremidade 5’ ou extremidade 3’ de uma sequência PAM, e o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR.

[00919] Em um outro exemplo, o animal quimérico pode se referir a um animal que tem apenas uma “célula manipulada com toolbox”, mas no qual o local no qual uma toolbox é inserida no genoma de cada “célula manipulada com toolbox” que constitui o animal é diferente.

[00920] Ou seja, de acordo com uma forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma

161 / 353 segunda célula que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente em um segundo local, e o primeiro local e o segundo local são diferentes. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos um entre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo, que é localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, incluída em um genoma animal. Em particular, a sequência da primeira toolbox e a sequência da segunda toolbox podem ser iguais ou diferentes.

[00921] De acordo com outra forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, um animal transgênico, que inclui uma primeira célula que tem um genoma incluindo uma primeira toolbox e uma segunda célula que tem um genoma incluindo uma segunda toolbox, na qual a primeira toolbox é presente em um primeiro local, a segunda toolbox é presente em um segundo local, e o primeiro local e o segundo sítio são os mesmos, podem ser providos. A primeira toolbox e a segunda toolbox podem incluir pelo menos um entre um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo. O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do animal ou um exopolinucleotídeo, que é localizado entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, incluída em um genoma animal. Em particular, a sequência da primeira toolbox e a sequência da segunda toolbox são diferentes.

[00922] Por exemplo, o genoma da primeira célula pode incluir adicionalmente uma terceira toolbox, cuja sequência é a mesma que a da primeira toolbox.

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[00923] Em um outro exemplo, o genoma da segunda célula pode incluir adicionalmente uma quarta toolbox, cuja sequência é a mesma que a da segunda toolbox.

[00924] O animal transgênico pode incluir adicionalmente uma terceira célula, que tem um genoma que não inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[00925] O animal homólogo pode se referir a animais nos quais o local no qual a toolbox é inserida no genoma de cada “célula manipulada com toolbox” que constitui o animal é o mesmo.

[00926] De acordo com algumas formas de realização de exemplo divulgadas pelo presente relatório descritivo, um gameta ou zigoto (e/ou embrião) que tem um genoma no qual a toolbox é inserida pode ser obtido de um animal, incluindo uma célula que tem um genoma no qual a toolbox é inserido, e o gameta pode ser um espermatozoide ou um óvulo.

[00927] De acordo com algumas formas de realização de exemplo divulgadas pelo presente relatório descritivo, um descendente incluindo uma célula que tem um genoma no qual a toolbox é inserida pode ser produzida a partir de um animal, incluindo uma célula que tem um genoma no qual a toolbox é inserida.

[00928] De acordo com algumas formas de realização de exemplo divulgadas pelo presente relatório descritivo, uma edição gênica adicional pode ocorrer em um genoma animal, incluindo uma célula que tem um genoma no qual a toolbox é inserida. 3-2. Método para preparar animal transgênico, incluindo genoma, no qual a toolbox é inserida

[00929] Um método para produzir um animal, incluindo uma “célula manipulada com toolbox”, por algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir o transplante de um zigoto ou

163 / 353 embrião, que tem um genoma no qual uma toolbox é inserida, no útero de uma mãe de substituição. Após o transplante do zigoto ou embrião no útero da mãe de substituição, seguido de um período de gestação, pode ser produzido um animal tendo um genoma no qual a toolbox é inserida.

[00930] Um método para produzir um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox é inserida pode incluir uma microinjeção (MI) da toolbox e/ou transposase.

[00931] O zigoto e/ou embrião produzido pela microinjeção (MI) pode ser quimérico ou homólogo. Adicionalmente, o animal obtido pelo transplante do zigoto e/ou embrião no útero de uma mãe de substituição pode ser quimérico ou homólogo.

[00932] Outro método para produzir um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox é inserida pode incluir a realização de uma transferência nuclear de célula somática (SCNT).

[00933] A transferência nuclear de célula somática pode incluir o transplante do núcleo da célula somática (301) tendo um genoma no qual a toolbox (100) da FIG. 5 é inserida em um oócito enucleado. Um animal, incluindo uma “célula manipulada com toolbox”, pode ser produzido pelo transplante do zigoto ou embrião produzido pela transferência nuclear de célula somática (SCNT) no útero de uma mãe de substituição.

[00934] O zigoto e/ou embrião obtido pela transferência nuclear de células somáticas (SCNT) pode ser homólogo. Adicionalmente, o animal produzido usando o zigoto e/ou embrião também pode ser homólogo. Nesse caso, o genoma do zigoto, embrião e/ou animal produzido pela transferência nuclear de célula somática (SCNT), que é homóloga, pode ter uma sequência que é igual ao genoma da célula somática (301).

[00935] Um outro método para produzir o zigoto ou embrião tendo um genoma no qual uma toolbox é inserida pode incluir um método para fertilização in vitro entre um óvulo (303) e um espermatozoide (305) tendo um

164 / 353 genoma no qual a toolbox (100) é inserida; ou um método para fertilização in vitro entre o óvulo (303) ou o espermatozoide (305) com um espermatozoide ou óvulo de tipo selvagem (WT).

[00936] O zigoto e/ou embrião produzido por fertilização in vitro pode ser quimérico ou homólogo. Além disso, o animal obtido por implantação do zigoto e/ou embrião no útero de uma mãe de substituição pode ser quimérico ou homólogo.

[00937] Mais especificamente, um método de exemplo para a preparação de um animal transgênico provido pelo presente relatório descritivo pode incluir uma preparação de um embrião transgênico no qual os componentes de uma nuclease manipulada são expressados e um transplante do embrião transgênico no útero de uma mãe de substituição.

[00938] Um método de exemplo para preparar um embrião transgênico pode incluir uma microinjeção de um vetor, que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica os componentes da nuclease manipulada, em um zigoto ou embrião. Adicionalmente, a preparação do embrião transgênico pode incluir adicionalmente uma microinjeção de uma transposase, que pode interagir com o gene de transposon, no zigoto ou embrião.

[00939] Um outro método de exemplo para a preparação de um embrião transgênico pode incluir uma preparação de uma célula doadora transgênica na qual os componentes de uma nuclease manipulada são expressados, e um transplante do núcleo da célula doadora transgênica em um óvulo enucleado do animal.

[00940] A preparação da célula doadora transgênica pode incluir uma transformação de uma célula com um vetor que inclui um gene de transposon e um polinucleotídeo que codifica os componentes da nuclease manipulada. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente a transformação da célula com uma transposase que pode interagir com o gene de transposon.

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[00941] A transposase pode estar na forma de uma proteína, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica a transposase. O polinucleotídeo pode ser um que está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral. Além disso, o polinucleotídeo que codifica a transposase pode estar na forma na qual o polinucleotídeo é incluído em um vetor juntamente com o gene de transposon e o polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada.

[00942] Um método para produzir um animal incluindo uma “célula manipulada com toolbox” por algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir uma injeção da toolbox e da transposase em um tecido de um animal. Nesse caso, apenas parte do tecido injetado pode se tornar uma “célula manipulada com toolbox”. O animal produzido através do método acima mencionado para injetar em um tecido pode ser um animal quimérico.

[00943] Um método para produzir um animal incluindo uma “célula manipulada com toolbox” por algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir uma reprodução natural entre um macho que tem um testículo incluindo uma “célula manipulada com toolbox” ou uma fêmea que tem um ovário incluindo uma “célula manipulada com toolbox”.

[00944] Por exemplo, o método pode incluir uma reprodução natural entre um macho que tem um testículo incluindo uma “célula manipulada com toolbox” e uma fêmea que tem um ovário incluindo uma “célula manipulada com toolbox”.

[00945] Em um outro exemplo, o método pode incluir uma reprodução natural entre um macho que tem um testículo incluindo um “manipulado com toolbox” e uma fêmea do tipo selvagem (WT); ou reprodução natural entre uma fêmea que tem um ovário, incluindo um “manipulado com toolbox” e um macho do tipo selvagem (WT).

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[00946] O animal produzido através da reprodução natural descrita acima pode ser um animal quimérico ou homólogo. [Segunda edição gênica usando toolbox]

[00947] Na presente divulgação, quando uma toolbox é inserida em um genoma e transformada como descrito acima, é chamada de primeira edição gênica.

[00948] Uma segunda edição gênica adicional pode ocorrer usando uma toolbox que é inserida em um genoma pela primeira edição gênica. Adicionalmente, uma (n+1)ésima edição gênica pode ocorrer usando um genoma no qual a nésima edição gênica ocorreu (n é um número natural de 2 ou mais). A nésima edição gênica e a (n+1)ésima edição gênica podem ocorrer no genoma de uma célula ou no genoma de outra célula.

[00949] A “nésima edição gênica” pode ser uma edição gênica usando um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) incluído como componente de uma toolbox.

[00950] Adicionalmente, a “nésima edição gênica” pode ser uma edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada expressada a partir da toolbox.

[00951] Além disso, a “nésima edição gênica” pode ser uma edição gênica usando um polinucleotídeo que tem uma sequência PAM incluída como um componente da toolbox.

[00952] Para conveniência da explicação, a seguir, será descrita a segunda edição gênica usando um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), que é incluído como um componente de uma toolbox e/ou um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada.

1. Segunda edição gênica usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), incluído na toolbox

[00953] A seguir, é descrita a segunda edição gênica usando um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) presente em uma toolbox.

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[00954] A segunda edição gênica usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) pode ocorrer dentro da toolbox. 1-1. Edição secundária de troca de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) 1-1-1. Toolbox para edição de troca de genes secundária usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

[00955] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox para edição de trocas pode ser provida.

[00956] A toolbox para edição de trocas pode incluir uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2), e uma segunda sequência de ITR.

[00957] Um primeiro polinucleotídeo pode ser incluído entre o polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2). O primeiro polinucleotídeo pode ser um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo não traduzido, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido, e um polinucleotídeo não funcional, mas não está limitado ao mesmo.

[00958] A seguir, algumas formas de realização de exemplo da toolbox para edição de trocas serão descritas.

[00959] Por exemplo, a toolbox para edição de trocas pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e uma segunda sequência de ITR.

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[00960] Em um outro exemplo, a toolbox para edição de trocas pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e uma segunda sequência de ITR.

[00961] Em ainda um outro exemplo, a toolbox para edição de trocas pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um gene da proteína fluorescente, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e uma segunda sequência de ITR.

[00962] Em ainda um outro exemplo, a toolbox para edição de trocas pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína alvo, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e uma segunda sequência de ITR.

[00963] A seguir, será descrito um método secundário de edição de trocas de genes usando a toolbox para edição de trocas descrita acima. Ou seja, será descrito um método para a troca de polinucleotídeo específico. 1-1-2. Método secundário de edição de trocas de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

[00964] Em um genoma no qual a toolbox para edição de trocas é inserida, um primeiro polinucleotídeo que é presente entre o polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) pode ser trocado por um segundo polinucleotídeo.

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[00965] Um método para trocar o primeiro polinucleotídeo com o segundo polinucleotídeo pode incluir uma dispensação do segundo polinucleotídeo em uma célula na qual a toolbox para edição de trocas é inserida.

[00966] Pode haver vários métodos para dispensar o segundo polinucleotídeo na célula.

[00967] Por exemplo, o segundo polinucleotídeo pode ser dispensado na célula através da introdução do segundo polinucleotídeo na célula. A introdução de um polinucleotídeo que codifica o segundo polinucleotídeo na célula pode incluir um método para incorporar o segundo polinucleotídeo em um vetor plasmídico e depois introduzir o resultante na célula. Adicionalmente, a introdução do segundo polinucleotídeo na célula pode incluir a incorporação do segundo polinucleotídeo em um vetor viral e depois a transdução do resultante na célula.

[00968] O segundo polinucleotídeo é localizado entre o polinucleotídeo que codifica o terceiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS3) e o polinucleotídeo que codifica o quarto sítio de reconhecimento de recombinase (RRS4). Neste caso, o terceiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS3) pode ser um que forma um par com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1); e o quarto sítio de reconhecimento de recombinase (RRS4) pode ser um que forma um par com o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[00969] Adicionalmente, um método para trocar um primeiro polinucleotídeo com um segundo polinucleotídeo pode incluir a dispensação de uma primeira recombinase e uma segunda recombinase na célula.

[00970] Nesse caso, a primeira recombinase pode interagir com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e/ou o terceiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS3); e a segunda recombinase pode

170 / 353 interagir com o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e/ou o quarto sítio de reconhecimento de recombinase (RRS4).

[00971] Pode haver vários métodos para dispensar a recombinase na célula.

[00972] Por exemplo, a recombinase pode ser dispensada na célula introduzindo a recombinase como uma proteína na célula.

[00973] Em um outro exemplo, a recombinase pode ser dispensada na célula pela introdução do polinucleotídeo que codifica a recombinase na célula. A introdução do polinucleotídeo que codifica a recombinase na célula pode incluir um método para incorporar o polinucleotídeo que codifica a recombinase em um vetor plasmídico e depois introduzir o resultante na célula. Adicionalmente, a introdução do polinucleotídeo que codifica a recombinase na célula pode incluir a incorporação do polinucleotídeo que codifica a recombinase em um vetor viral e, em seguida, a transdução do resultante na célula.

[00974] A primeira recombinase dispensada na célula pelo método descrito acima pode interagir com o polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o polinucleotídeo que codifica o terceiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS3).

[00975] Adicionalmente, a segunda recombinase entregue na célula pode interagir com o polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e o polinucleotídeo que codifica o quarto sítio de reconhecimento de recombinase (RRS4).

[00976] Pela interação, o primeiro polinucleotídeo pode ser excluído da toolbox, e o segundo polinucleotídeo pode ser inserido na toolbox.

[00977] A seguir, são descritas várias formas de realização de exemplo para edição de trocas pelo método acima e os efeitos da edição de trocas. Estes podem variar de acordo com os tipos do primeiro polinucleotídeo e/ou do segundo polinucleotídeo.

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[00978] O polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, que é incluída nas toolboxes para edição de trocas de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode sofrer edição de trocas para um polinucleotídeo que codifica uma segunda endonuclease guiada por RNA e um segundo ácido nucleico guia.

[00979] Nesse caso, mesmo adicionalmente sem tratamento adicional na célula tendo um genoma no qual uma toolbox com edição de trocas é inserida, a segunda endonuclease guiada por RNA e o segundo ácido nucleico guia são expressados e, assim, um complexo de nuclease manipulada pode ser formado, e terceiro edição gênica pode ocorrer no genoma.

[00980] O polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia, que é incluído nas toolboxes para a edição de trocas de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode sofrer edição de trocas por um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia. A sequência do primeiro ácido nucleico guia e a sequência do segundo ácido nucleico guia podem ser diferentes uma da outra.

[00981] Neste caso, o sítio alvo da edição gênica usando uma nuclease manipulada pode ser alterado por edição de trocas.

[00982] O gene da proteína fluorescente, que é incluído nas toolboxes para edição de trocas de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode sofrer edição de trocas para um gene que codifica a proteína alvo (gene da proteína alvo).

[00983] Nesse caso, a proteína fluorescente não é expressada na célula por edição de trocas. Usando essa característica, é possível selecionar se o gene da proteína alvo é inserido no genoma da célula.

[00984] O primeiro gene da proteína alvo, que está incluído nas toolboxes para edição de trocas de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode sofrer edição de trocas para um segundo gene da proteína alvo.

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[00985] Por essa segunda edição gênica, a proteína alvo pode ser expressada na célula no tempo desejado.

[00986] O primeiro gene da proteína alvo, que está incluído nas toolboxes para edição de trocas de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode sofrer edição de trocas para um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[00987] Por essa segunda edição gênica, a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia podem ser expressados na célula. A endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia podem formar um complexo de nuclease manipulada, e uma terceira edição gênica adicional pode ocorrer no genoma da célula pelo complexo de nuclease manipulada formado. 1-2. Edição secundária da inserção de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) 1-2-1. Toolbox para edição de inserção usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

[00988] Uma toolbox para edição de inserção pode ser provida de acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação.

[00989] A toolbox para edição de inserção pode incluir uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e uma segunda sequência de ITR.

[00990] A seguir, algumas formas de realização de exemplo da toolbox para edição de inserção serão descritas.

[00991] Por exemplo, a toolbox para edição de inserção pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e uma segunda sequência de ITR.

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[00992] Em um outro exemplo, a toolbox para edição de inserção pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia, e uma segunda sequência de ITR.

[00993] Em ainda um outro exemplo, a toolbox para edição de inserção pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia, e uma segunda sequência de ITR.

[00994] Em ainda um outro exemplo, a toolbox para edição de inserção pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e uma segunda sequência de ITR.

[00995] Em ainda um outro exemplo, a toolbox para edição de inserção pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia e uma segunda sequência de ITR.

[00996] A seguir, será descrito um método para edição de inserção secundária de genes usando uma toolbox para edição de inserção descrita acima. Isto é, um método para inserir um polinucleotídeo específico será descrito. 1-2-2. Método para edição secundária de inserção de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

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[00997] Em um genoma no qual uma toolbox para edição de inserção é inserida, um primeiro polinucleotídeo pode ser inserido no sítio onde o polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) é localizado.

[00998] Um método para inserir o primeiro polinucleotídeo pode incluir uma dispensação do primeiro polinucleotídeo em uma célula na qual a toolbox para edição de inserção é inserida.

[00999] Pode haver vários métodos para dispensar o primeiro polinucleotídeo na célula.

[001000] Por exemplo, o primeiro polinucleotídeo pode ser dispensado na célula através da introdução do primeiro polinucleotídeo na célula. A introdução de um polinucleotídeo que codifica o primeiro polinucleotídeo na célula pode incluir um método para incorporar o primeiro polinucleotídeo em um vetor plasmídico e depois introduzir o resultante na célula. Adicionalmente, a introdução do primeiro polinucleotídeo na célula pode incluir a incorporação do primeiro polinucleotídeo em um vetor viral e, em seguida, a transdução do resultante na célula.

[001001] O polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) é ainda incluído no vetor que inclui o primeiro polinucleotídeo. Nesse caso, o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) pode formar um par com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1).

[001002] Além disso, um método para inserir o primeiro polinucleotídeo pode incluir a dispensação de uma primeira recombinase na célula.

[001003] Nesse caso, a primeira recombinase pode interagir com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e/ou o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[001004] O método para dispensar a recombinase na célula foi descrito acima e, portanto, a descrição detalhada é omitida na presente invenção.

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[001005] A recombinase, que é dispensada na célula pelo método descrito acima, pode interagir com o polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[001006] Pela interação, o primeiro polinucleotídeo pode ser inserido na toolbox.

[001007] A seguir, são descritas várias formas de realização de exemplo para edição de inserção pelo método acima e os efeitos da edição de inserção do mesmo. Estes podem variar de acordo com os tipos da toolbox para edição de inserção e/ou um primeiro polinucleotídeo.

[001008] No caso em que um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA são incluídos em uma toolbox para inserir edição de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um polinucleotídeo que codifica um núcleo guia ácido pode ser inserido na toolbox.

[001009] Neste caso, um complexo de nuclease manipulada pode ser formado dentro da célula pela transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a primeira endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia inserido. Uma terceira edição gênica adicional pode ocorrer após a segunda edição gênica (edição de inserção), mesmo sem tratamento adicional, pelo complexo de nuclease manipulada formado dentro da célula.

[001010] No caso em que um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia são incluídos nas toolboxes para edição de inserção de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um polinucleotídeo que codifica um promotor

176 / 353 para a transcrição do polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia pode ser inserido na toolbox.

[001011] Neste caso, o primeiro ácido nucleico guia pode ser expressado no momento em que o polinucleotídeo que codifica o promotor é inserido e, através da expressão, um complexo de nuclease manipulada pode ser formado dentro da célula. Isto é, um primeiro ácido nucleico guia pode ser expressado em um momento desejado controlando o momento de inserção do polinucleotídeo que codifica um promotor. Eventualmente, o tempo para a edição do terceiro gene pode ser controlado através da segunda edição gênica (edição por inserção).

[001012] No caso em que um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia são incluídos nas toolboxes para edição de inserção de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um polinucleotídeo que codifica um promotor para a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA pode ser inserido na toolbox.

[001013] Neste caso, a endonuclease guiada por RNA pode ser expressada no momento em que o polinucleotídeo que codifica o promotor é inserido e, através da expressão, um complexo de nuclease manipulada pode ser formado dentro da célula. Ou seja, uma primeira endonuclease guiada por RNA pode ser expressada em um momento desejado controlando o momento de inserção do polinucleotídeo que codifica o promotor. Eventualmente, o momento para a edição do terceiro gene pode ser controlado através da segunda edição gênica (edição por inserção).

[001014] No caso em que um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) são incluídos em toolboxes

177 / 353 para edição de inserção de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um gene da proteína fluorescente pode ser inserido na toolbox.

[001015] Nesse caso, é possível selecionar se um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA, que é um componente da toolbox, é inserido no genoma pela inserção do gene da proteína fluorescente.

[001016] No caso em que um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia são incluídos nas toolboxes para edição de inserção de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia pode ser inserido na toolbox. Em particular, a sequência do segundo ácido nucleico guia pode ser igual ou diferente da sequência do primeiro ácido nucleico guia.

[001017] Quando a sequência do segundo ácido nucleico guia é a mesma que a do primeiro ácido nucleico guia, uma quantidade maior de ácidos nucleicos guia pode ser expressada na célula e a eficiência de edição gênica usando a toolbox pode ser aumentada.

[001018] Quando a sequência do segundo ácido nucleico guia é diferente da do primeiro ácido nucleico guia, os sítios alvo para edição gênica usando a toolbox podem ser versáteis. 1-3. Edição secundária da exclusão de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) 1-3-1. Toolbox para edição de exclusão usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

[001019] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox para edição de exclusão pode ser provida.

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[001020] A toolbox para edição de exclusão pode incluir uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um primeiro polinucleotídeo, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e uma segunda sequência de ITR.

[001021] O primeiro polinucleotídeo pode incluir um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo não traduzido, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido e um polinucleotídeo não funcional, mas não está limitado ao mesmo.

[001022] O primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) podem formar um par. Para conveniência da explicação, a seguir, assume-se que a sequência do primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) é a mesma que a do segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[001023] A seguir, algumas formas de realização de exemplo da toolbox para edição de exclusão são descritas.

[001024] Por exemplo, a toolbox para edição de exclusão pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um códon de parada, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2), um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA e uma segunda sequência de ITR.

[001025] Em um outro exemplo, uma toolbox para edição de exclusão pode ser uma toolbox, que inclui uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um códon de parada da transcrição, um polinucleotídeo que codifica um segundo

179 / 353 sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2), um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia e uma segunda sequência de ITR.

[001026] A seguir, será descrito um método para edição de exclusão secundária de gene usando a toolbox para edição de exclusão descrita acima. Ou seja, um método para excluir polinucleotídeo específico será descrito. 1-3-2. Método para editar a exclusão secundária de genes usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)

[001027] No genoma no qual uma toolbox para edição de exclusão é inserida, um primeiro polinucleotídeo presente entre o polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) pode ser excluído.

[001028] Um método para excluir o primeiro polinucleotídeo pode incluir a dispensação de uma primeira recombinase em uma célula na qual a toolbox para edição de exclusão é inserida.

[001029] A primeira recombinase pode interagir com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[001030] O método para dispensar uma recombinase na célula é descrito acima e, portanto, os detalhes do método são omitidos na presente invenção.

[001031] A primeira recombinase, que é dispensada na célula pelo método descrito acima, pode interagir com um polinucleotídeo que codifica o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2).

[001032] O primeiro polinucleotídeo pode ser excluído da toolbox pela interação.

[001033] A seguir, são descritas várias formas de realização de exemplo de edição por exclusão pelo método acima e os efeitos da edição por exclusão.

180 / 353 Estes podem variar de acordo com o tipo do primeiro polinucleotídeo e/ou a toolbox para edição de exclusão.

[001034] No caso em que um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um códon de parada, um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2) e um polinucleotídeo que codifica uma primeira endonuclease guiada por RNA são incluídos nas toolboxes para edição por exclusão de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, é possível excluir o códon de parada das toolboxes.

[001035] Neste caso, a primeira endonuclease guiada por RNA pode ser expressada pela exclusão do códon de parada. Ou seja, o momento da transcrição e/ou tradução de um polinucleotídeo específico incluído na toolbox pode ser controlado pela exclusão de um componente parcial da toolbox.

[001036] No caso em que um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1), um códon de parada da transcrição (poli T), um polinucleotídeo que codifica um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS2), e um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia está incluído nas toolboxes para edição de exclusão, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, é possível excluir o códon de parada da transcrição (poli T) das toolboxes.

[001037] Neste caso, o primeiro ácido nucleico guia pode ser expressado pela exclusão do códon de parada da transcrição (poli T). Ou seja, o momento da transcrição e/ou tradução de um polinucleotídeo específico incluído na toolbox pode ser controlado pela exclusão de um componente parcial da toolbox.

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2. Segunda edição gênica usando o componente da nuclease manipulada que é expressada da toolbox

[001038] A seguir, será descrita a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada que é expressada a partir de um polinucleotídeo que é incluído em uma toolbox inserida em um genoma.

[001039] A segunda edição gênica usando os componentes de uma nuclease manipulada pode ocorrer fora da toolbox ou dentro da toolbox. 2-1. Segunda edição gênica usando componentes de nuclease manipulada, expressada a partir de uma toolbox que não inclui o elemento de controle de expressão 2-1-1. Toolbox que não inclui o elemento de controle de expressão

[001040] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox que não inclui um elemento de controle de expressão pode ser provida.

[001041] A toolbox que não inclui o elemento de controle de expressão pode incluir uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada e uma segunda sequência de ITR.

[001042] A seguir, são descritas algumas formas de realização de exemplo da toolbox que não incluem o elemento de controle de expressão.

[001043] Por exemplo, a toolbox pode ser uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA.

[001044] Em um outro exemplo, a toolbox pode ser uma toolbox que inclui dois ou mais polinucleotídeos que codificam uma endonuclease guiada por RNA. Neste caso, as sequências dos dois ou mais polinucleotídeos que codificam uma endonuclease guiada por RNA podem ser iguais ou diferentes uma da outra.

[001045] Quando as sequências dos dois ou mais polinucleotídeos que codificam uma endonuclease guiada por RNA incluída na toolbox são as mesmas, o nível de expressão da mesma endonuclease guiada por RNA é

182 / 353 aumentado em uma célula e, assim, a eficiência da segunda edição gênica pode ser aumentada.

[001046] Ainda em outro exemplo, a toolbox pode ser uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[001047] Ainda em outro exemplo, a toolbox pode ser uma toolbox que inclui dois ou mais polinucleotídeos que codificam um ácido nucleico guia. Neste caso, as sequências dos dois ou mais polinucleotídeos que codificam um ácido nucleico guia, podem ser iguais ou diferentes.

[001048] Quando pelo menos uma sequência entre os dois ou mais polinucleotídeos que codificam um ácido nucleico guia incluído na toolbox é a mesma, o nível de expressão do ácido nucleico guia que tem a mesma sequência pode ser aumentado em uma célula e, assim, a eficiência da segunda edição gênica pode ser aumentada.

[001049] Quando pelo menos uma sequência entre os dois ou mais polinucleotídeos que codificam um ácido nucleico guia incluído na toolbox é diferente, vários tipos de ácidos nucleicos guia podem ser expressados em uma célula. Nesse caso, a segunda edição gênica pode ocorrer em um número maior de sítios alvo.

[001050] Em ainda um outro exemplo, a toolbox pode ser uma toolbox que inclui um ou mais tipo(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um ou mais tipo(s) de um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[001051] Nesse caso, a segunda edição gênica pode ocorrer em um sítio alvo presente no genoma da célula após a inserção da toolbox no genoma da célula, sem tratamento adicional, pela primeira edição gênica. Um ou mais do(s) ácido(s) nucleico(s) guia expressado(s) da toolbox pode(m) ser ligado(s) complementarmente ao sítio alvo.

[001052] Ou seja, quando a toolbox, que inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica ácido

183 / 353 nucleico guia, sem incluir o elemento de controle da expressão, é inserida no genoma, uma nésimo (n é um número natural de 2 ou maior) edição gênica pode ocorrer no genoma sem tratamento adicional.

[001053] Acima descrita, a toolbox que não inclui o elemento de controle de expressão pode ser inserida no genoma e/ou cromossomo de uma célula.

[001054] Cada toolbox com várias constituições descritas acima pode ser inserida no genoma e/ou cromossomo de uma célula através de várias combinações.

[001055] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, uma primeira toolbox e uma segunda toolbox podem ser inseridas no genoma de uma única célula.

[001056] Por exemplo, a primeira toolbox pode incluir uma primeira sequência de ITR, um ou mais tipo(s) de polinucleotídeo(s) que codifica(m) uma endonuclease guiada por RNA, e uma segunda sequência de ITR. A segunda toolbox pode incluir uma terceira sequência de ITR, um ou mais tipo(s) de polinucleotídeo(s) que codifica(m) um ácido nucleico guia e uma quarta sequência de ITR.

[001057] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, cada uma da primeira toolbox e da segunda toolbox pode ser inserida independentemente no genoma (e/ou cromossomo) de uma célula diferente.

[001058] Por exemplo, uma primeira toolbox pode ser inserida no genoma de uma primeira célula presente em um único indivíduo e uma segunda toolbox pode ser inserida no genoma de uma segunda célula presente no indivíduo. A primeira toolbox pode incluir um ou mais tipo(s) de polinucleotídeo(s) que codifica(m) uma endonuclease guiada por RNA. A segunda toolbox pode incluir um ou mais tipo(s) de polinucleotídeo(s) que codifica(m) um ácido nucleico guia.

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[001059] Cada célula diferente pode ser uma célula não isolada que é incluída em um único indivíduo.

[001060] Cada célula diferente pode ser uma célula não isolada que é incluída em um zigoto e/ou embrião.

[001061] A seguir, será descrito um método para a segunda edição gênica usando os componentes de codificação da toolbox descritos acima de uma nuclease manipulada sem incluir o elemento de controle de expressão. 2-1-2. Método de segunda edição gênica

[001062] Na presente divulgação, é provido um método para a segunda edição gênica em uma célula, na qual uma toolbox que inclui componentes de codificação de polinucleotídeos de uma nuclease manipulada é inserida sem incluir um elemento de controle de expressão. De acordo com a construção da toolbox inserida no genoma da célula, vários métodos para segunda edição gênica podem ser providos.

[001063] Por exemplo, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserido, pode incluir a dispensação de um ácido nucleico guia em uma célula.

[001064] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserida, pode incluir a dispensação de um polinucleotídeo doador na célula.

[001065] A dispensação do ácido nucleico guia em uma célula inclui a introdução de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia na célula. Especificamente, um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia pode ser introduzido na célula na forma de um RNA, ou um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia pode ser incorporado em um vetor e, em seguida, o resultante pode ser introduzido na célula.

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[001066] Adicionalmente, a dispensação do polinucleotídeo doador na célula inclui a introdução de um vetor incluindo o polinucleotídeo doador na célula.

[001067] No caso em que o ácido nucleico guia é dispensado em uma célula, o ácido nucleico guia pode se ligar a um sítio alvo.

[001068] Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA pode ser expressada na célula a partir do polinucleotídeo que foi inserido na toolbox pelo sistema de expressão da célula, e a endonuclease guiada por RNA pode clivar o sítio alvo presente no genoma, em um estado onde a endonuclease guiada por RNA forma um complexo com o ácido nucleico guia.

[001069] Uma vez que o sítio alvo é clivado, um indel pode ocorrer no sítio alvo pelas interações repetidas do sistema de reparação pela união de extremidade não homóloga (NHEJ) e pela endonuclease guiada por RNA e, consequentemente, uma sequência particular perto do sítio alvo ser rompida. Como resultado, um gene que inclui a sequência particular pode atingir um estado em que o gene não pode mais desempenhar uma função normal, ou seja, um estado de inativação.

[001070] Adicionalmente, quando o polinucleotídeo doador é provido em uma célula junto com o ácido nucleico guia, o polinucleotídeo doador pode ser modificado para dentro do sítio alvo que foi clivado pela endonuclease guiada por RNA.

[001071] Em um outro exemplo, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é inserida, pode incluir a dispensação de uma endonuclease guiada por RNA na célula.

[001072] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual uma toolbox que inclui um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é inserida, pode incluir a dispensação de um polinucleotídeo doador na célula.

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[001073] A dispensação da endonuclease guiada por RNA em uma célula inclui a dispensação da endonuclease guiada por RNA em uma célula na forma de uma proteína e/ou um polipeptídeo. Adicionalmente, a dispensação da endonuclease guiada por RNA em uma célula pode incluir a introdução do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA na célula. O polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA pode ser introduzido na célula em um estado em que o polinucleotídeo é incorporado em um vetor.

[001074] Em um outro exemplo, em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox (ver FIG. 8 (a)) que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (103) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (105) é inserida, mesmo sem tratamento adicional, a um gene alvo ao qual o ácido nucleico guia pode se ligar pode ser inativado.

[001075] A FIG. 8 (a) ilustra uma toolbox, na qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (103) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (105) são incluídos entre uma primeira sequência de ITR (101) e uma segunda sequência de ITR (107).

[001076] Especificamente, quando a toolbox é inserida no genoma de uma célula, a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia podem ser expressados pelo mecanismo de expressão em uma célula. O ácido nucleico guia pode se ligar ao sítio alvo (231), que é presente no genoma da célula, e a endonuclease guiada por RNA, em um estado que forma um complexo de nuclease manipulada com o ácido nucleico guia, pode clivar o sítio alvo (231).

[001077] A FIG. 8 (b) ilustra uma forma, na qual o sítio alvo (231) é clivado, no genoma no qual a toolbox (ver FIG. 8 (a)) que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (103) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (105), é inserida. O sítio alvo (231) pode ser dividido em uma primeira região (231 (a)) e uma segunda região (231 (b)) pelo complexo do polinucleotídeo que codifica uma

187 / 353 endonuclease guiada por RNA (103) e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (105).

[001078] Ou seja, na célula que tem um genoma no qual a toolbox é inserida, mesmo adicionalmente sem tratamento adicional, um gene alvo incluindo um sítio alvo tendo uma sequência igual ou complementar à parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser inativado (ver a FIG. 8 (b)).

[001079] No entanto, quando um polinucleotídeo doador é provido à célula, também é possível que o polinucleotídeo doador seja introduzido antes que o gene incluindo a sequência específica seja eliminado pelo mecanismo descrito acima.

[001080] Adicionalmente, em outro exemplo, em uma célula que tem um genoma no qual uma primeira toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e uma segunda toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia são inseridas, mesmo sem tratamento adicional, um gene alvo incluindo um sítio alvo que tem a mesma ou uma sequência complementar à parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser inativado.

[001081] Especificamente, quando a primeira toolbox e a segunda toolbox são inseridas em um genoma de uma célula, a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia que é expressado pelo mecanismo de expressão na célula podem formar um complexo de nuclease manipulada, e o complexo de nuclease manipulada pode clivar o sítio alvo, ao qual um ácido nucleico guia pode ter uma ligação complementar.

[001082] Ou seja, na célula tendo um genoma no qual a primeira toolbox e a segunda toolbox são inseridas, um gene alvo, que inclui um sítio alvo no qual o ácido nucleico guia pode ter uma ligação complementar mesmo sem tratamento adicional, pode ser inativado.

[001083] No entanto, quando a célula é provida com um polinucleotídeo doador, também é possível que o polinucleotídeo doador seja introduzido antes

188 / 353 que o gene alvo, incluindo o sítio alvo, seja eliminado pelo mecanismo descrito acima.

[001084] Ao contrário da descrição acima, a primeira toolbox pode ser inserida no genoma de uma primeira célula de um indivíduo e a segunda toolbox pode ser inserida no genoma de uma segunda célula do indivíduo.

[001085] Neste caso, uma endonuclease guiada por RNA pode ser expressada na primeira célula pelo mecanismo de expressão na célula, e um ácido nucleico guia pode ser expressado na segunda célula.

[001086] A endonuclease guiada por RNA expressada na primeira célula pode ser transportada da primeira célula por um sistema de dispensação intercelular. Adicionalmente, o ácido nucleico guia expressado na segunda célula pode ser transportado da segunda célula por um sistema de dispensação intracelular. Ou seja, a endonuclease guiada por RNA expressada na primeira célula e o ácido nucleico guia expressado na segunda célula de um indivíduo, podem estar presentes na mesma célula, através do transporte pelo sistema de dispensação intercelular. Em particular, a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia podem formar um complexo e a edição gênica pode ocorrer no genoma da célula.

[001087] Por exemplo, a endonuclease guiada por RNA expressada na primeira célula pode migrar para a segunda célula, formando assim um complexo com o ácido nucleico guia expressado na segunda célula e, nesse caso, a segunda edição gênica pode ocorrer na segunda célula.

[001088] Em um outro exemplo, o ácido nucleico guia expressado na segunda célula pode migrar para a primeira célula, formando assim um complexo com a endonuclease guiada por RNA expressada na primeira célula e, neste caso, uma segunda edição gênica pode ocorrer na primeira célula.

[001089] Adicionalmente, ainda em outro exemplo, a endonuclease guiada por RNA expressada na primeira célula e o ácido nucleico guia expressado na segunda célula podem migrar para uma terceira célula, que é

189 / 353 presente no indivíduo. Nesse caso, a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia podem formar um complexo na terceira célula e a segunda edição gênica pode ocorrer na terceira célula.

[001090] O mecanismo para a segunda edição gênica foi descrito acima e, portanto, a descrição detalhada é omitida na presente invenção.

[001091] O método descrito acima para a segunda edição gênica pode ser um método para edição gênica em uma célula isolada.

[001092] Um método para a segunda edição gênica em uma célula não isolada pode incluir um método para injetar o RNA descrito acima, vetor plasmídico, polipeptídeo e/ou proteína no tecido ou órgão de um indivíduo.

[001093] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em um zigoto e/ou embrião pode incluir um método para microinjectar o RNA descrito acima, vetor plasmídico, polipeptídeo e/ou proteína em um zigoto.

[001094] A seguir, será descrito um sítio alvo em que a segunda edição gênica descrita acima pode ser descrita.

[001095] O sítio alvo onde a edição gênica pode ocorrer depende do tipo de ácido nucleico guia provido à célula.

[001096] A provisão do ácido nucleico guia pode se referir a uma dispensação do ácido nucleico guia a partir do exterior de uma célula para dentro da célula.

[001097] Adicionalmente, a provisão do ácido nucleico guia pode se referir a uma provisão do ácido nucleico guia pela expressão do polinucleotídeo que é inserido no genoma de uma célula. Neste caso, o polinucleotídeo inserido no genoma de uma célula pode ser aquele que é incluído como um componente de uma toolbox.

[001098] Por exemplo, quando um tipo de ácido nucleico guia é provido para uma célula, a edição gênica pode ocorrer em um sítio alvo ao qual um ácido nucleico guia pode se ligar.

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[001099] Em um outro exemplo, quando dois tipos diferentes de um primeiro ácido nucleico guia e um segundo ácido nucleico guia são providos para uma célula, a edição gênica pode ocorrer em um primeiro sítio alvo ao qual um primeiro ácido nucleico guia pode se ligar e em um segundo sítio alvo ao qual um segundo ácido nucleico guia pode se ligar. 2-2. Segunda edição gênica usando componente de nuclease manipulada que é expressada a partir da toolbox que inclui o elemento de controle de expressão 2-2-1. Toolbox que inclui o elemento de controle de expressão

[001100] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox incluindo um elemento de controle de expressão pode ser provida.

[001101] O elemento de controle de expressão pode se referir a um elemento para controlar o tempo e/ou o sítio da expressão de um polinucleotídeo específico.

[001102] No caso de uma toolbox na qual o elemento de controle de expressão está incluído, a transcrição e/ou tradução de parte do polinucleotídeo incluído no interior da toolbox pode ser inibida, a menos que o material e/ou as condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão seja(m) tratado(as).

[001103] Como usado na presente invenção, o termo “material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão” pode se referir a um material e/ou condições que pode(m) induzir ou causar o aumento da transcrição e/ou tradução de um polinucleotídeo, no qual a transcrição e/ou a tradução do polinucleotídeo é inibida pelo elemento de controle de expressão.

[001104] A toolbox incluindo o elemento de controle de expressão pode incluir uma primeira sequência de ITR, um elemento de controle de expressão, um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada e uma segunda sequência de ITR.

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[001105] O elemento de controle de expressão pode ser um elemento que controla a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica os componentes da nuclease manipulada.

[001106] Em particular, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada pode ser inibida, a menos que o material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão seja(m) tratado(as).

[001107] No caso de uma célula que tem um genoma no qual a toolbox incluindo o elemento de controle de expressão é inserida, os componentes de uma nuclease manipulada não podem ser expressados sem o tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão. Nesse caso, a segunda edição gênica não pode ocorrer, a menos que a nuclease manipulada seja adicionalmente dispensada no interior da célula a partir do exterior.

[001108] A seguir, algumas formas de realização de exemplo da toolbox, incluindo o elemento de controle de expressão, serão descritas. A FIG. 9 ilustra algumas formas de realização de exemplo da toolbox, incluindo o elemento de controle de expressão (130).

[001109] Por exemplo, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (132) e o elemento de controle de expressão (130) (ver FIG. 9 (a)).

[001110] Em um outro exemplo, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (134) e o elemento de controle de expressão (130) (ver FIG. 9 (b)).

[001111] Em ainda um outro exemplo, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, e pode incluir um elemento de controle de expressão em uma ou mais das extremidades 5’ do

192 / 353 polinucleotídeo que codifica um RNA guiado por RNA endonuclease e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

[001112] Especificamente, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (132) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (134), e pode incluir o elemento de controle de expressão (130) na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o RNA endonuclease guiada. Adicionalmente, um polinucleotídeo que codifica um promotor (131) pode ser incluído na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia (134) (ver FIG. 9 (c)).

[001113] Especificamente, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (132) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (134), e pode incluir o elemento de controle de expressão (130) na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia (134). Adicionalmente, um polinucleotídeo que codifica um promotor (131) pode ser incluído na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA (132) (ver FIG. 9 (d)).

[001114] Especificamente, a toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (132) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (134), e pode incluir o elemento de controle de expressão (130 (a)) na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (132) e pode incluir o elemento de controle de expressão (130 (b)) na extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia (ver FIG. 9 (e)).

[001115] Mesmo no caso em que um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia são incluídos em um genoma, quando o elemento de controle da expressão é adicionalmente incluído em pelo menos uma da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA e da extremidade

193 / 353 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, não é possível concluir que a segunda edição gênica possa ocorrer sem tratamento específico.

[001116] A seguir, algumas formas de realização específicas do elemento de controle de expressão (130) são divulgadas. A FIG. 10 ilustra algumas formas de realização de um elemento de controle de expressão.

[001117] Por exemplo, o elemento de controle de expressão (130) pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (151) (ver FIG. 10 (a)).

[001118] No caso em que o polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (151) é inserido no genoma de uma célula, o promotor induzível não pode ser operado sem o tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle da expressão. Neste caso, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do promotor induzível pode não ocorrer. Especificamente, quando o promotor induzível é um promotor Tet-on, se um material que afeta o promotor Tet-on (por exemplo, tetraciclina) não for tratado, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do promotor Tet-on pode não ocorrer.

[001119] Em um outro exemplo, o elemento de controle de expressão (130) pode incluir um polinucleotídeo que codifica [sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) - códon de parada da transcrição (154) - sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (155)] (daqui em diante, RTR). Um exopolinucleotídeo pode ser adicionalmente incluído entre o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) e o códon de parada da transcrição (154).

[001120] Ou seja, na presente divulgação, o RTR pode significar que um exopolinucleotídeo é ainda incluído entre o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) e o códon de parada da transcrição (154).

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[001121] O RTR pode ser incluído entre um polinucleotídeo que codifica um promotor (152) e um polinucleotídeo a ser transcrito e/ou traduzido (ver FIG. 10 (b)).

[001122] No caso em que o RTR é inserido no genoma de uma célula, o códon de parada da transcrição não pode ser excluído sem o tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle da expressão e, nesse caso, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do RTR pode não ocorrer. Especificamente, quando a célula não é tratada com uma recombinase (por exemplo, Cre recombinase, Dre recombinase, etc.), que é um material que afeta o RTR, a transcrição do polinucleotídeo presente na direção 3’ do RTR pode não ocorrer.

[001123] Em ainda um outro exemplo, o elemento de controle de expressão (130) pode incluir um polinucleotídeo que codifica [sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) – códon de parada (156) - sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (155)] (daqui em diante, RSR). Um exopolinucleotídeo pode adicionalmente ser incluído entre o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) e o códon de parada (156).

[001124] Ou seja, na presente divulgação, o RSR pode significar que um exopolinucleotídeo pode ainda ser incluído entre o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (153) e o códon de parada (156).

[001125] O RSR pode ser incluído entre um polinucleotídeo que codifica um promotor (152) e um polinucleotídeo a ser transcrito e/ou traduzido (ver FIG. 10 (c)).

[001126] No caso em que o RSR é inserido no genoma de uma célula, o códon de parada não pode ser excluído sem o tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle da expressão e, nesse caso, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do RSR pode não ocorrer. Especificamente, quando a célula não é tratada com uma recombinase (por exemplo, Cre recombinase, Dre recombinase, etc.), que é um

195 / 353 material que afeta o RSR, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do RSR pode não ocorrer.

[001127] Em ainda um outro exemplo, pode ser um caso em que o elemento de controle de expressão (130) não inclui um polinucleotídeo que codifica um promotor, mas inclui um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (157) (ver FIG. 10 (d)).

[001128] Nesse caso, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo presente na direção 3’ do RRS pode não ocorrer, a menos que i) o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) ou um mutante do mesmo e um polinucleotídeo que codifique um promotor, e ii) uma recombinase que pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) é tratada na célula.

[001129] Cada toolbox incluindo o elemento de controle de expressão (130) provido na presente divulgação pode formar uma combinação e, assim, ser inserida no genoma (e/ou cromossomo) de uma célula.

[001130] Ou seja, uma primeira toolbox e uma segunda toolbox podem ser inseridas no genoma de uma única célula e, neste caso, qualquer uma ou mais da primeira toolbox e da segunda toolbox podem incluir o elemento de controle de expressão (130).

[001131] Por exemplo, a primeira toolbox pode incluir o elemento de controle de expressão (130) e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. A segunda toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[001132] Em um outro exemplo, a primeira toolbox pode incluir o elemento de controle de expressão (130) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. A segunda toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA.

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[001133] Ainda em outro exemplo, a primeira toolbox pode incluir o elemento de controle de expressão (130) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. A segunda toolbox pode incluir o elemento de controle de expressão (130) e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA.

[001134] Mesmo neste caso, a expressão dos componentes da nuclease manipulada pode ser inibida pelo elemento de controle de expressão (130) e, portanto, não é possível concluir que a segunda edição gênica possa ocorrer sem tratamento adicional do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle da expressão, mesmo que a toolbox seja inserida em um genoma pela primeira edição gênica. 2-2-2. Método para segunda edição gênica

[001135] A presente divulgação provê um método para a segunda edição gênica, expressando os componentes de uma nuclease manipulada a partir de uma toolbox que inclui o elemento de controle de expressão e um polinucleotídeo que codifica os componentes da nuclease manipulada.

[001136] Vários métodos para a segunda edição gênica podem ser providos de acordo com a construção da toolbox inserida em um genoma.

[001137] Para maior conveniência das explicações, a seguir, um caso em que um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é incluído na extremidade 3’ do elemento de controle de expressão à medida que a construção da toolbox é assumida e será descrita no mesmo.

[001138] Por exemplo, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserida, pode incluir o tratamento de um material e/ou condições que pode(m) operar o promotor induzível; e a dispensação de um ácido nucleico guia. Adicionalmente, um método para a

197 / 353 segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001139] O tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão, a provisão de um ácido nucleico guia, e a provisão do polinucleotídeo doador na célula podem ser tratados e providos simultaneamente, e também podem ser aplicáveis a outras formas de realização de exemplo abaixo.

[001140] O material ou as condições que pode(m) operar o promotor induzível foi(ram) descrito(as) acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida. Adicionalmente, o método para prover o ácido nucleico guia e/ou polinucleotídeo doador para a célula também foi descrito acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001141] Quando o material e/ou condições que pode(m) operar o promotor induzível são tratados na célula, o promotor induzível pode ser ativado e, nesse caso, o polinucleotídeo presente na extremidade 3’ do promotor induzível é transcrito e/ou traduzido e assim, a endonuclease guiada por RNA pode ser expressada.

[001142] O ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar ao sítio alvo presente no genoma da célula. Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA expressada pelo mecanismo descrito acima pode clivar o sítio alvo enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia e, nesse caso, o gene alvo incluindo o sítio alvo pode ser inativado.

[001143] Adicionalmente, quando um polinucleotídeo doador é provido na célula, o polinucleotídeo doador pode ser modificado em um sítio onde o sítio alvo é clivado.

[001144] Ou seja, pelo tratamento do(as) material e/ou condições que pode(m) operar o promotor induzível na célula, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA localizada na extremidade 3’ do promotor induzível pode ser controlada em tempo hábil e,

198 / 353 através do mesmo, a edição gênica também pode ser controlada em tempo hábil.

[001145] Em um outro exemplo, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um RSR inserido entre um polinucleotídeo que codifica um promotor e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserida, pode incluir a provisão de uma recombinase sítio-específica (SSR) e um ácido nucleico guia para a célula. Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001146] A provisão da recombinase sítio-específica (SSR) em uma célula pode incluir a provisão da proteína recombinase sítio-específica (SSR) ou do polinucleotídeo que codifica a recombinase sítio-específica (SSR) na célula. O polinucleotídeo que codifica a recombinase sítio-específica (SSR) pode ser introduzido na célula incorporando em um vetor plasmídico ou vetor viral.

[001147] O método para prover o ácido nucleico guia e/ou polinucleotídeo doador para uma célula foi descrito acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001148] Quando a recombinase sítio-específica (SSR) é dispensada na célula, a recombinase sítio-específica (SSR) e o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) podem interagir entre si e o códon de parada pode ser excluído pela interação. Neste caso, a endonuclease guiada por RNA presente na extremidade 3’ do RSR pode ser expressada.

[001149] O ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar ao sítio alvo presente no genoma da célula. Além disso, a endonuclease guiada por RNA expressada pode clivar o sítio alvo enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia e, nesse caso, o gene alvo incluindo o sítio alvo pode ser inativado.

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[001150] Adicionalmente, quando um polinucleotídeo doador é provido na célula, o polinucleotídeo doador pode ser modificado no sítio onde o sítio alvo é clivado.

[001151] Ou seja, a transcrição e/ou tradução de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA localizada na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o RSR pode ser controlada em tempo hábil pela dispensação da recombinase (SSR) e através da mesma assim, a edição gênica também pode ser controlada em tempo hábil.

[001152] Em ainda um outro exemplo, um método para segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um RTR inserido entre um polinucleotídeo que codifica um promotor e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é inserida, pode incluir a provisão de uma recombinase sítio-específica (SSR) e uma endonuclease guiada por RNA para a célula. Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001153] O método para prover a recombinase sítio-específica (SSR), endonuclease guiada por RNA e/ou polinucleotídeo doador na célula foi descrito acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001154] Quando a recombinase sítio-específica (SSR) é provida na célula, o códon de parada da transcrição pode ser excluído através da interação entre a recombinase sítio-específica (SSR) e o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS). Neste caso, o ácido nucleico guia presente na extremidade 3’ do RSR pode ser expressado. O ácido nucleico guia pode se ligar ao sítio alvo que é presente no genoma da célula.

[001155] A endonuclease guiada por RNA provida na célula pode clivar o sítio alvo enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia e, nesse caso, o gene alvo, incluindo o sítio alvo, pode ser inativado.

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[001156] Adicionalmente, quando um polinucleotídeo doador é provido na célula, o polinucleotídeo doador pode ser modificado no sítio onde o sítio alvo é clivado.

[001157] Ou seja, pela provisão da recombinase (SSR), a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia localizado na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o RTR pode ser controlada em tempo hábil, e através do mesmo, assim, a edição gênica também pode ser controlada em tempo hábil.

[001158] Em ainda um outro exemplo, um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, sem incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor é inserido, pode incluir a provisão de uma primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e um polinucleotídeo que codifica um promotor para a célula. A primeira recombinase sítio-específica (SSR1) pode interagir com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1). Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001159] O método para prover a primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e o polinucleotídeo doador na célula foi descrito acima e, portanto, a descrição detalhada é omitida.

[001160] O polinucleotídeo que codifica o promotor pode ser incorporado em um vetor plasmídico juntamente com um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), que forma um par com o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e depois provido na célula.

[001161] Quando a primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e o polinucleotídeo que codifica um promotor são providos para a célula, a primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e o primeiro sítio de

201 / 353 reconhecimento de recombinase (RRS1) podem interagir entre si e, assim, o polinucleotídeo que codifica um promotor pode ser inserida em uma toolbox que é presente no genoma da célula. Neste caso, a endonuclease guiada por RNA que é presente na extremidade 3’ do primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) pode ser transcrita e/ou traduzida.

[001162] O ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar ao sítio alvo presente no genoma da célula. Além disso, a endonuclease guiada por RNA expressada pode clivar o sítio alvo enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia e, nesse caso, o gene alvo incluindo o sítio alvo pode ser inativado.

[001163] Além disso, quando um polinucleotídeo doador é provido na célula, o polinucleotídeo doador pode ser modificado no sítio onde o sítio alvo é clivado.

[001164] Isto é, pela provisão da primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e um polinucleotídeo que codifica um promotor, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA localizada na extremidade 3’ do polinucleotídeo que codifica o primeiro o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) pode ser controlado em tempo hábil e, através do mesmo, a edição gênica também pode ser controlada em tempo hábil.

[001165] A seguir, um método para segunda edição gênica usando uma toolbox na qual um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é incluído na extremidade 3’ do elemento de controle de expressão. No entanto, o método para a segunda edição gênica usando uma toolbox na qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é incluído na extremidade 3’ do elemento de controle de expressão e foi descrito um mecanismo no mesmo em detalhes acima e, portanto, os detalhes específicos do mecanismo de edição gênica serão omitidos.

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[001166] Por exemplo, um método para a segunda edição gênica, em uma célula tendo tem um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é inserida, pode incluir um tratamento de um material e/ou condições que pode operar um promotor induzível e uma provisão de uma endonuclease guiada por RNA para a célula. Além disso, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir adicionalmente a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001167] O tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão na célula, a provisão de uma endonuclease guiada por RNA, e a provisão do polinucleotídeo doador podem ser tratados e providos simultaneamente, e esses métodos também podem ser aplicados a outras formas de realização de exemplo abaixo.

[001168] Em um outro exemplo, um método para a segunda edição gênica, em uma célula tendo um genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo um RTR entre um polinucleotídeo que codifica um promotor e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, pode incluir a provisão de uma recombinase sítio-específico (SSR) e uma endonuclease guiada por RNA para a célula. Além disso, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

[001169] Em ainda um outro exemplo, um método para a segunda edição gênica, em uma célula tendo um genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica um primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (RRS1) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia sem um polinucleotídeo que codifica um promotor, pode incluir a provisão de uma primeira recombinase sítio-específica (SSR1) e um polinucleotídeo que codifica um promotor para a célula. Além disso, um método para a segunda edição gênica na célula pode incluir a provisão adicional de um polinucleotídeo doador à célula.

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[001170] Como descrito acima, um método para a segunda edição gênica em uma célula isolada pode incluir a dispensação direta à célula de vários tipos de materiais (por exemplo, materiais que afetam o elemento de controle da expressão), RNA, um vetor de plasmídeo, um vetor viral, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrito(a) acima.

[001171] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em uma célula não isolada pode incluir a injeção, nos tecidos ou órgãos de um indivíduo, de vários tipos de materiais (por exemplo, materiais que afetam o elemento de controle da expressão), RNA, um vetor de plasmídeo, um vetor viral, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrita(a) acima.

[001172] Além disso, um método para segunda edição gênica em um zigoto e/ou embrião pode incluir microinjeção (MI), a um zigoto no estado de um pronúcleo de estágio de 1 célula de um animal, vários tipos de materiais (por exemplo, materiais que afetam o elemento de controle da expressão), RNA, um vetor plasmídico, um vetor viral, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrita(a) acima.

[001173] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em um zigoto e/ou embrião pode incluir a microinjeção, em um zigoto em um estado após um estágio de 2 células de um animal, vários tipos de materiais (por exemplo, materiais que afetam o elemento de controle de expressão), RNA, um vetor plasmídico, um vetor viral, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrita(a) acima.

[001174] Como descrito acima, no caso de uma célula, um zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserida, não é necessário prover uma endonuclease guiada por RNA por edição gênica. Neste caso, é possível resolver os problemas devido ao grande tamanho de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, baixa eficiência de dispensação).

204 / 353 2-3. Embrião transgênico e animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componente de nuclease manipulada expressada na toolbox 2-3-1. Embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de nuclease manipulada 2-3-1-1. Construção de embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de nuclease manipulada

[001175] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, é provido um embrião transgênico no qual o embrião inclui uma ou mais célula(s) (daqui em diante, “uma célula com segunda edição gênica") tendo um genoma no qual a segunda edição gênica ocorreu usando componentes de um nuclease expressada em uma toolbox.

[001176] De acordo com uma forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, um embrião transgênico pode ser provido, no qual o embrião tem um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR; e no qual um endopolinucleotídeo é inativado. Em particular, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao endopolinucleotídeo.

[001177] A forma na qual o endopolinucleotídeo é inativado pode estar em qualquer uma das formas selecionadas a partir de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência do endopolinucleotídeo não está incluído na mesma, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente adicionado à sequência do endopolinucleotídeo, e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência do endopolinucleotídeo é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente adicionado à mesma.

[001178] Como usado na presente invenção, o termo “célula com segunda edição gênica” refere-se a uma célula tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica, e o termo “segunda edição gênica” pode incluir a edição

205 / 353 gênica usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) acima descrito; edição gênica usando uma toolbox que não inclui um elemento de controle de expressão; e edição gênica usando uma toolbox que inclui um elemento de controle de expressão.

[001179] No entanto, na presente divulgação, o termo “célula com segunda edição gênica” simplesmente se refere a uma célula tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica, mas não importa se uma toolbox está ou não incluída no genoma da célula. Ou seja, a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica no genoma pode ser a “célula com segunda edição gênica” descrita na presente divulgação, mesmo quando uma toolbox é inserida no genoma; ou pode ser a “célula com segunda edição gênica” descrita na presente divulgação, mesmo quando uma toolbox não é inserida no genoma.

[001180] Adicionalmente, como usado na presente invenção, o termo “célula de edição sem segundo gene” refere-se a uma célula que tem um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu. No entanto, na presente divulgação, o termo “célula sem segunda edição gênica” simplesmente se refere a uma célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu, a célula que tem um genoma no qual a toolbox (100) é inserida e onde a segunda edição gênica acima descrita não ocorreu também pode pertencer à célula. Ou seja, desde que a segunda edição gênica não tenha ocorrido, qualquer célula que tenha um genoma no qual ocorreu outra manipulação genética pode ser a “célula com segunda edição gênica não descrita” descrita na presente divulgação.

[001181] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, o embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada que é expressada a partir de uma toolbox pode ser quimérico ou homólogo.

[001182] O embrião homólogo pode se referir a um embrião transgênico que tem apenas a “célula com segunda edição gênica”.

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[001183] O embrião quimérico pode se referir a um embrião transgênico que tem adicionalmente a “célula sem segunda edição gênica”, além da “célula com segunda edição gênica”.

[001184] Um exemplo do embrião transgênico quimérico que pode ser provido na presente divulgação pode ser um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula tendo um genoma que inclui uma segunda toolbox e um sítio modificado. A sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[001185] Em particular, a primeira toolbox e/ou a segunda toolbox pode(m) incluir um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Adicionalmente, a primeira toolbox e/ou a segunda toolbox pode(m) incluir adicionalmente um elemento de controle de expressão para qualquer um ou mais selecionado(s) da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o núcleo guia ácido. Nesse caso, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao sítio alvo.

[001186] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo.

[001187] O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo. O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica.

[001188] Especificamente, o sítio alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, e o sítio modificado pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Em particular, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região, e a sequência da segunda região é diferente da quinta região.

[001189] A segunda região e a quinta região podem incluir uma sequência PAM. A terceira região e a sexta região podem incluir uma sequência PAM.

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[001190] A sequência da quinta região pode estar em qualquer uma das formas selecionadas de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região não está incluído nela. ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à mesma. Nos casos de ii) e iii), o pelo menos um nucleotídeo que é adicionado adicionalmente a ele pode incluir um ou mais selecionado(s) de um componente de ativação de edição, um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido, um polinucleotídeo não traduzido, um íntron artificial e um elemento de controle de expressão.

[001191] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do zigoto e/ou embrião.

[001192] Cada um do sítio alvo e do sítio modificado pode ser uma sequência adjacente a uma sequência PAM.

[001193] Cada um do sítio alvo e do sítio modificado pode incluir uma primeira sequência de ITR na direção 5’ e cada um pode incluir uma segunda sequência de ITR na direção 3’.

[001194] Outro exemplo do embrião transgênico quimérico que pode ser provido na presente divulgação pode ser um embrião transgênico, que inclui uma primeira célula que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula que não inclui uma toolbox, mas tem um genoma que inclui um gene modificado.

[001195] Em particular, a primeira toolbox pode incluir um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Adicionalmente, a primeira toolbox pode incluir adicionalmente um elemento

208 / 353 de controle de expressão para qualquer um selecionado da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Nesse caso, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao sítio alvo.

[001196] O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica.

[001197] Especificamente, o sítio alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região; e o sítio modificado pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Em particular, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região e a sequência da segunda região é diferente da quinta região.

[001198] A sequência da quinta região pode estar em qualquer uma das formas selecionadas de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região não está incluído nela. ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à mesma.

[001199] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do zigoto e/ou embrião.

[001200] O sítio alvo e o sítio modificado podem ser uma sequência adjacente à sequência PAM.

[001201] Cada um do sítio alvo e do sítio modificado pode incluir uma primeira sequência de ITR na direção 5’ e cada um pode incluir uma segunda sequência de ITR na direção 3’.

[001202] Especificamente, o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR, e o

209 / 353 sítio modificado e a sequência PAM podem ser incluídos entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR.

[001203] A seguir, será descrito um método para preparar um embrião transgênico que inclui uma ou mais das células nas quais ocorreu a segunda edição gênica por uma nuclease manipulada que é expressada a partir de uma toolbox inserida no genoma. 2-3-1-2. Método para preparar embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de nuclease manipulada

[001204] Um método para produzir um zigoto e/ou embrião, que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada que é expressada em uma toolbox, pode incluir uma microinjeção (MI) do “elemento para a segunda edição gênica” para um zigoto.

[001205] Em particular, o zigoto e/ou embrião pode ser obtido por reprodução natural ou fertilização in vitro. A reprodução natural e/ou fertilização in vitro pode(m) ser realizada(s) entre um gameta, que é produzido a partir de um animal que tem um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada é inserida, e um gameta, que é produzido de um animal com um sexo diferente do animal acima.

[001206] Como usado na presente invenção, o termo “elemento para segunda edição gênica” refere-se a um elemento que é provido a uma célula, um embrião ou um animal, de modo a permitir a segunda edição gênica no genoma.

[001207] Por exemplo, o “elemento para segunda edição gênica” pode ser qualquer um ou mais selecionado(s) do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão, um polinucleotídeo incluindo um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), uma recombinase sítio- específica (SSR), uma endonuclease guiada por RNA, um ácido nucleico guia, e um polinucleotídeo doador, mas não está limitado aos mesmos.

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[001208] Mais especificamente, um método de exemplo para preparar um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica provida pelo presente relatório descritivo, pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo a um zigoto ou embrião tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Adicionalmente, um método de exemplo para preparar um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica, pode ser para adicionalmente prover um polinucleotídeo doador ao zigoto ou embrião. Em particular, o polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente com o ácido nucleico guia. Por exemplo, o polinucleotídeo doador e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia podem ser incorporados em um único vetor e providos como tais.

[001209] O zigoto ou embrião pode ser aquele obtido por fertilização in vitro entre um gameta, que é produzido a partir de um animal que tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um gameta, que é produzido a partir de um animal com um sexo diferente do animal acima.

[001210] Mais especificamente, outro método de exemplo para preparar um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica provida pelo presente relatório descritivo, pode incluir uma provisão de qualquer um dentre os materiais e condições que afetam o elemento de controle da expressão, para um zigoto ou embrião que tenha um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo e que inclui o elemento de controle de expressão em qualquer um ou mais selecionado(s) da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia.

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[001211] Adicionalmente, um método de exemplo para a preparação de um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica, pode ainda prover uma provisão de um polinucleotídeo doador para o zigoto ou embrião.

[001212] O polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente com qualquer um ou mais dos materiais ou condições que afetam o elemento de controle de expressão.

[001213] Outro método para preparar um zigoto e/ou embrião tendo um genoma, no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada expressada a partir de uma toolbox, pode incluir a realização de uma transferência nuclear de célula somática (SCNT).

[001214] Em particular, a célula somática usada na transferência nuclear de célula somática pode ter um genoma no qual uma toolbox incluindo um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada é inserida.

[001215] A transferência nuclear de célula somática (SCNT) pode incluir o transplante do núcleo da “célula com segunda edição gênica” produzida pelo método descrito acima em um óvulo enucleado. Em particular, a “célula com segunda edição gênica” pode ser considerada como uma célula doadora transgênica.

[001216] Mais especificamente, um método de exemplo para preparar um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica provida pelo presente relatório descritivo, pode incluir i) um método para preparar uma célula doadora transgênica tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e em que a edição gênica ocorreu no sítio alvo e ii) um método para transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[001217] O método para preparar a célula doadora transgênica pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo a uma célula tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma

212 / 353 endonuclease guiada por RNA. O método para preparar a célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente uma provisão de um polinucleotídeo doador para uma célula tendo um genoma que inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA.

[001218] Em particular, o polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente com o ácido nucleico guia. Por exemplo, o polinucleotídeo doador e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia podem ser incorporados em um único vetor, e providos como tais.

[001219] Mais especificamente, outro método de exemplo para preparar um embrião transgênico, no qual ocorreu a edição gênica, provida pelo presente relatório descritivo, pode incluir i) um método para preparar uma célula doadora transgênica tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, que inclui um elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) a partir da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, e no qual ocorreu a edição gênica no sítio alvo, e ii) um método para transplantar o núcleo da célula doadora transgênica para um óvulo enucleado.

[001220] O método para preparar uma célula doadora transgênica pode incluir uma provisão de um ou mais selecionado(s) dentre materiais e condições que afetam o elemento de controle de expressão, a uma célula tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo e que inclui o elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) a partir da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia. Adicionalmente, o método

213 / 353 para preparar a célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente uma provisão de um polinucleotídeo doador para a célula.

[001221] O polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente, juntamente com pelo menos um dos materiais ou condições que afetam o elemento de controle de expressão. 2-3-2. Animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando nuclease manipulada 2-3-2-1. Construção de animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando nuclease manipulada

[001222] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, um animal transgênico pode ser provido, na qual o animal transgênico inclui uma ou mais célula(s) tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada expressada a partir de uma toolbox (doravante, “célula com segunda edição gênica”).

[001223] De acordo com uma forma de realização de exemplo provida pelo presente relatório descritivo, um animal transgênico pode ser provido, no qual o animal transgênico tem um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR e na qual um endopolinucleotídeo é inativado. Em particular, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao endopolinucleotídeo.

[001224] A forma na qual o endopolinucleotídeo é inativado pode estar em qualquer uma das formas selecionadas de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência do endopolinucleotídeo não está incluído na mesma, ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à sequência do endopolinucleotídeo e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência do endopolinucleotídeo é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente adicionado à mesma.

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[001225] O animal transgênico, no qual ocorreu a segunda edição gênica usando componentes de uma nuclease manipulada que é expressada a partir de uma toolbox, pode ser um animal quimérico ou animal homólogo.

[001226] O animal homólogo pode se referir a um animal transgênico que tem apenas a “célula com segunda edição gênica”.

[001227] O animal quimérico pode se referir a um animal transgênico que tem adicionalmente uma “célula com segunda edição gênica”, além da “célula com segunda edição gênica”.

[001228] Um exemplo do animal transgênico quimérico que pode ser provido na presente divulgação pode ser um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um sítio alvo e uma segunda célula tendo um genoma que inclui um segundo toolbox e um sítio modificado. A sequência da primeira toolbox pode ser igual ou diferente da segunda toolbox.

[001229] Em particular, a primeira toolbox e/ou a segunda toolbox pode(m) incluir um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Adicionalmente, a primeira toolbox e/ou a segunda toolbox pode(m) incluir adicionalmente um elemento de controle de expressão, em qualquer uma ou mais selecionada(s) da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e a extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a ácido nucleico guia. Nesse caso, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao sítio alvo.

[001230] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo.

[001231] O sítio alvo pode ser um exopolinucleotídeo.

[001232] O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica.

[001233] Especificamente, a sequência alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, e a sequência modificada

215 / 353 pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Nesse caso, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região e a sequência da segunda região é diferente da quinta região.

[001234] A segunda região e a quinta região podem cada uma incluir uma sequência PAM. A terceira região e a sexta região podem cada uma incluir uma sequência PAM.

[001235] A sequência da quinta região pode estar em qualquer uma das formas selecionadas de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região não está incluído na mesma. ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à mesma. Nos casos de ii) e iii), o pelo menos um nucleotídeo que é adicionado adicionalmente à mesma pode incluir um ou mais selecionado(s) de um componente de habilitação de edição, um polinucleotídeo que codifica um(a) proteína ou RNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não funcional, um polinucleotídeo que codifica um RNA não traduzido, um polinucleotídeo não traduzido, um íntron artificial, e um elemento de controle de expressão.

[001236] O sítio alvo e o sítio modificado podem ser uma sequência adjacente a uma sequência PAM.

[001237] Cada um do sítio alvo e do sítio modificado pode incluir uma primeira sequência de ITR na direção 5’ e cada um pode incluir uma segunda sequência de ITR na direção 3’.

[001238] Um outro exemplo do embrião transgênico quimérico que pode ser provido na presente divulgação pode ser um animal transgênico, que inclui uma primeira célula tendo um genoma que inclui uma primeira toolbox e um

216 / 353 sítio alvo e uma segunda célula, que não inclui uma toolbox, mas tem um genoma incluindo um gene modificado.

[001239] Em particular, a primeira toolbox pode incluir um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia. Adicionalmente, a primeira toolbox pode incluir adicionalmente um elemento de controle de expressão em qualquer um ou mais selecionado(s) da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia. Nesse caso, o ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao sítio alvo.

[001240] O sítio modificado pode ser aquele em que a sequência do sítio alvo foi alterada por edição gênica.

[001241] Especificamente, a sequência alvo pode incluir uma primeira região, uma segunda região e uma terceira região, e a sequência modificada pode incluir uma quarta região, uma quinta região e uma sexta região. Nesse caso, a sequência da primeira região é a mesma da quarta região, a sequência da terceira região é a mesma da sexta região e a sequência da segunda região é diferente da quinta região.

[001242] A sequência da quinta região pode estar em qualquer uma das formas selecionadas de i) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região não está incluído nela. ii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à sequência da segunda região e iii) uma forma na qual pelo menos um nucleotídeo na sequência da segunda região é excluído e pelo menos um nucleotídeo é adicionado adicionalmente à mesma.

[001243] O sítio alvo pode ser um endopolinucleotídeo do animal.

[001244] O sítio alvo e o sítio modificado podem ser uma sequência adjacente a uma sequência PAM.

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[001245] O sítio alvo e o sítio modificado podem cada um incluir uma primeira sequência de ITR na direção 5’ e cada um pode incluir uma segunda sequência de ITR na direção 3’.

[001246] Especificamente, o sítio alvo e a sequência PAM podem ser incluídos entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR, o sítio modificado e a sequência PAM podem ser incluídos entre a primeira sequência de ITR e a segunda sequência de ITR.

[001247] A seguir, será descrito um método para preparar um animal transgênico, no qual o animal transgênico inclui uma ou mais célula(s) tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica por uma nuclease manipulada que é expressada a partir de uma toolbox inserida no genoma. 2-3-2-2. Método para preparar animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica usando nuclease manipulada

[001248] Um método para produzir um animal que inclui uma “célula com segunda edição gênica” de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir transplante, no útero de uma mãe de substituição, um zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a segunda a edição gênica ocorreu por componentes de uma nuclease manipulada.

[001249] Por exemplo, como descrito acima, um animal incluindo a “célula com segunda edição gênica” pode ser produzido através da implantação do zigoto e/ou embrião produzido por microinjeção (MI) do “elemento para segunda edição gênica” no útero de uma mãe de substituição. Neste caso, o animal produzido pode ser quimérico ou homólogo.

[001250] Em um outro exemplo, um animal incluindo a “célula com segunda edição gênica” pode ser produzido implantando, no útero de uma mãe de substituição, o zigoto e/ou embrião produzido por transferência nuclear de célula somática (SCNT) usando uma célula que tem um genoma no qual

218 / 353 ocorreu a segunda edição gênica como descrito acima. Nesse caso, o animal produzido pode ser homólogo.

[001251] Mais especificamente, um método de exemplo para preparar um animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica provida pelo presente relatório descritivo pode incluir i) um método para preparar um embrião tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e no qual o segundo a edição gênica ocorreu no sítio alvo e ii) um método para implantar o embrião em uma mãe de substituição.

[001252] O método para preparar o embrião pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo a um zigoto ou embrião, que tem um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Adicionalmente, o método para preparar o embrião pode incluir adicionalmente uma provisão de um polinucleotídeo doador para o zigoto ou embrião.

[001253] Em particular, o polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente, juntamente com o ácido nucleico guia. Por exemplo, o polinucleotídeo doador e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia podem ser incorporados em um único vetor e providos como tais.

[001254] A preparação do embrião pode incluir i) preparar uma célula doadora transgênica tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e na qual ocorreu uma segunda edição gênica no sítio alvo e ii) transplantar do núcleo da célula doadora transgênica em um óvulo enucleado.

[001255] A preparação da célula doadora transgênica pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia que pode se ligar ao sítio alvo, a uma célula tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente uma provisão de um

219 / 353 polinucleotídeo doador para uma célula tendo um genoma que inclui o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA.

[001256] Em particular, o polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente, juntamente com o ácido nucleico guia. Por exemplo, o polinucleotídeo doador e o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, podem ser incorporados em um único vetor e providos como tais.

[001257] Mais especificamente, outro método para preparar um animal transgênico, no qual ocorreu a edição gênica, provido na presente divulgação pode incluir i) preparação de um embrião tendo um genoma que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e o polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente a um sítio alvo, que inclui um elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) a partir da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, e em que a edição gênica ocorreu no sítio alvo e ii) implantação do embrião em uma mãe de substituição.

[001258] Um método de exemplo para preparar o embrião pode incluir uma provisão de um ou mais selecionado(s) dentre os materiais e condições que afetam o elemento de controle da expressão, para um zigoto ou embrião tendo um genoma, que inclui um sítio alvo, um polinucleotídeo que codifica um endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, que podem se ligar especificamente ao sítio alvo e que inclui um elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) a partir da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia. Adicionalmente, a preparação do embrião pode incluir adicionalmente a provisão de um polinucleotídeo doador para a célula.

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[001259] O polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente com um ou mais selecionado(s) dentre materiais e condições que afetam o elemento de controle de expressão.

[001260] Outro método de exemplo para preparar o embrião pode incluir i) preparação de uma célula doadora transgênica tendo um genoma que inclui um sítio alvo, um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao sítio alvo, e que inclui um elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) a partir da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia; e ii) implantação do núcleo da célula doadora transgênica em um oócito enucleado.

[001261] A preparação da célula doadora transgênica pode incluir uma provisão de um ou mais selecionado(s) dentre materiais e condições que afetam o elemento de controle de expressão, para uma célula tendo um genoma, que inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que podem se ligar especificamente ao sítio alvo, e que inclui o elemento de controle de expressão em um ou mais selecionado(s) da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e da extremidade 5’ do polinucleotídeo que codifica o núcleo guia ácido. Adicionalmente, a preparação da célula doadora transgênica pode incluir adicionalmente uma provisão de um polinucleotídeo doador para a célula.

[001262] O polinucleotídeo doador pode ser provido simultaneamente com um ou mais selecionado(s) dentre materiais e condições que afetam o elemento de controle de expressão.

[001263] Um método para produzir um animal que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir uma

221 / 353 injeção do “elemento para segunda edição gênica” descrito acima a um tecido de um animal. O animal produzido através do método de injeção no tecido descrito acima pode ser um animal quimérico.

[001264] Um método para produzir um animal que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir a reprodução natural de um macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica” ou uma fêmea que tem um ovário, incluindo a “célula com segunda edição gênica”.

[001265] Por exemplo, a reprodução natural pode ser realizada entre o macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica” e a fêmea que tem um ovário incluindo a “célula com segunda edição gênica”.

[001266] Em um outro exemplo, a reprodução pode ser realizada entre um macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica” e uma fêmea do tipo selvagem (WT), ou entre um macho do tipo selvagem (WT) e uma fêmea que tem um ovário incluindo a “célula com segunda edição gênica”.

3. Segunda edição gênica usando toolbox que inclui polinucleotídeo com sequência PAM

[001267] A seguir, será descrita a segunda edição gênica em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM incluída em uma toolbox inserida em um genoma. A segunda edição gênica pode ser uma modificação de um polinucleotídeo doador.

[001268] Ou seja, uma toolbox incluindo um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM inserida artificialmente no genoma pode funcionar como um sítio alvo que permite a edição gênica.

[001269] Como descrito acima, a toolbox pode estar localizada dentro do porto seguro e, portanto, a ocorrência de edição gênica na toolbox pode não afetar a expressão da proteína ou do RNA no genoma de uma célula.

222 / 353 3-1. Toolbox incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001270] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox incluindo uma primeira sequência de ITR, um polinucleotídeo com uma sequência PAM, e uma segunda sequência de ITR podem ser providas.

[001271] A toolbox pode incluir adicionalmente um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada. Por exemplo, a toolbox pode incluir adicionalmente um ou mais selecionado(s) de um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[001272] A seguir, algumas formas de realização de exemplo do polinucleotídeo tendo uma sequência PAM serão descritas.

[001273] Por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM pode incluir um gene marcador, os detalhes do gene marcador foram descritos acima e, portanto, são omitidos.

[001274] Em um outro exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e/ou um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia.

[001275] Ainda em um outro exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM pode incluir um polinucleotídeo que não inclui um códon de partida (AUG). Quando o polinucleotídeo que tem a sequência PAM não inclui o códon de partida (AUG), o RNA ou a proteína que é transcrito(a) e/ou traduzido(a) pelo polinucleotídeo inserido artificialmente no genoma pode não ocorrer.

[001276] Ou seja, quando o polinucleotídeo inserido do lado de fora não inclui o códon de partida (AUG), o RNA ou a proteína não é expressado(a) e, portanto, há uma vantagem em que o polinucleotídeo inserido do lado de fora

223 / 353 pode ser utilizado como um sítio a ser clivado por uma nuclease manipulada, mantendo a estabilidade intracelular.

[001277] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma pluralidade de polinucleotídeos tendo uma sequência PAM (doravante, sítio de edição artificial) pode ser incluída dentro de uma única toolbox.

[001278] Como usado na presente invenção, o termo “sítio de edição artificial” refere-se a um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM presente em uma toolbox, e o sítio de edição artificial pode ser incluído em um genoma e funcionar como um sítio alvo no qual a edição gênica pode ocorrer.

[001279] Por exemplo, dois sítios de edição artificial podem ser incluídos em uma única toolbox. Ou seja, um primeiro sítio de edição artificial e um segundo sítio de edição artificial podem ser incluídos em uma única toolbox.

[001280] A sequência do primeiro sítio de edição artificial pode ser a mesma do segundo sítio de edição artificial.

[001281] A sequência do primeiro sítio de edição artificial pode ser diferente da do segundo sítio de edição artificial.

[001282] Em um outro exemplo, três ou mais sítios de edição artificial podem ser incluídos em uma única toolbox. No entanto, para facilitar a explicação, a explicação será provida no caso em que dois sítios de edição artificial possam ser incluídos em uma única toolbox.

[001283] As explicações abaixo na presente invenção (explicações no caso em que o número de sítios de edição artificial é dois) podem ser aplicáveis ao relacionamento entre dois sítios de edição artificial selecionados aleatoriamente entre n sítios de edição artificial, mesmo quando o número do sítio de edição artificial é n (n é um número natural igual ou maior que 3).

[001284] A FIG. 11 ilustra algumas formas de realização de uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

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[001285] A FIG. 11 (a) ilustra a toolbox (140 (a)) na qual um único polinucleotídeo tendo uma sequência PAM (203) é incluído entre uma primeira sequência de ITR (201) e uma segunda sequência de ITR (207).

[001286] A FIG. 11 (b) ilustra a toolbox (140 (b)) na qual um primeiro sítio de edição artificial (205) e um segundo sítio de edição artificial (206) são incluídos entre uma primeira sequência de ITR (201) e uma segunda sequência de ITR (207). Em particular, a sequência do primeiro sítio de edição artificial (205) pode ser a mesma que a do segundo sítio de edição artificial (206).

[001287] A FIG. 11 (c) ilustra a toolbox (140 (c)) na qual um primeiro sítio de edição artificial (202) e um segundo sítio de edição artificial (204) são incluídos entre uma primeira sequência de ITR (201) e uma segunda sequência de ITR (207). Em particular, a sequência do primeiro sítio de edição artificial (202) é diferente da do segundo sítio de edição artificial (204).

[001288] A toolbox pode ser inserida em um genoma ou cromossomo, e a forma e o método de como a toolbox é inserida em um genoma ou cromossomo foram descritos acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001289] A seguir, um método de segunda edição gênica em uma célula, zigoto, embrião ou animal tendo um genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM, como descrito acima, e uma forma do genoma no qual a segunda edição gênica é inserida ocorrido será descrita. 3-2. Método de segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001290] A seguir, será descrito o método de segunda edição gênica em uma célula na qual uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM será descrita. O método para inserir uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo a sequência PAM em uma célula pode ser suficientemente explicado pelo método de inserção da toolbox descrito

225 / 353 anteriormente e, portanto, os detalhes específicos sobre ela são omitidos na presente invenção.

[001291] Vários métodos para segunda edição gênica podem ser providos de acordo com a construção da toolbox inserida no genoma de uma célula.

[001292] Para conveniência da explicação, a seguir, supõe-se que um polinucleotídeo codifique uma endonuclease guiada por RNA em um genoma e descrito no mesmo.

[001293] Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA pode ser incluído em uma toolbox que é a mesma da toolbox que inclui o polinucleotídeo tendo a sequência PAM ou incluída em uma toolbox que é diferente da toolbox que inclui o polinucleotídeo tendo a sequência PAM e, em seguida, inserida em um genoma. Em um outro exemplo, o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA pode ser inserido no genoma sem ser incluído no componente da toolbox.

[001294] A seguir, o método para a segunda edição gênica será explicado usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (a).

[001295] A FIG. 12 ilustra um processo de segunda edição gênica usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (a).

[001296] Um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox (140 (a)) incluindo um único polinucleotídeo (203) tendo uma sequência PAM é inserida pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia e polinucleotídeo doador (232) em uma célula.

[001297] Parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à parte da sequência do polinucleotídeo que tem a sequência PAM (203).

[001298] Pode haver vários métodos para prover o ácido nucleico guia para a célula.

[001299] Por exemplo, o ácido nucleico guia pode ser provido na célula através da introdução de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia

226 / 353 na célula. O polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia pode ser introduzido na forma de um RNA ou pode ser incorporado em um vetor plasmídico ou vetor viral e depois introduzido na célula.

[001300] Em um outro exemplo, o ácido nucleico guia pode ser provido para a célula pela expressão do ácido nucleico guia a partir de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia incluído na toolbox (140 (a)) ou em uma toolbox diferente da toolbox (140 (a)). Adicionalmente, o ácido nucleico guia pode ser provido na célula pela expressão do ácido nucleico guia de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia que é inserido em um genoma.

[001301] Ainda em um outro exemplo, no caso em que o ácido nucleico guia está incluído na toolbox (140 (a)) ou em uma toolbox diferente da toolbox (140 (a)), mas não é normalmente expressado pelo elemento de controle de expressão descrito acima, o ácido nucleico guia pode ser provido para a célula pelo tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão. O(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão foi(ram) descrito(as) acima e, portanto, os detalhes específicos são omitidos na presente invenção.

[001302] Pode haver vários métodos para dispensar o polinucleotídeo doador na célula.

[001303] Por exemplo, o polinucleotídeo doador pode ser dispensado na célula através da introdução de um vetor plasmídico ou vetor viral, que inclui o polinucleotídeo doador, na célula.

[001304] Quando o ácido nucleico guia é provido para a célula pelo método descrito acima, o ácido nucleico guia pode interagir com a endonuclease guiada por RNA, e o ácido nucleico guia e a endonuclease guiada por RNA podem formar um complexo na célula.

[001305] Adicionalmente, o ácido nucleico guia dispensado na célula pode se ligar especificamente ao polinucleotídeo (203). A endonuclease guiada

227 / 353 por RNA pode clivar o polinucleotídeo (203) em um estado de formação de um complexo com o ácido nucleico guia. Nesse caso, o polinucleotídeo doador (232) dispensado na célula pode ser modificado para o polinucleotídeo (203) e, como resultado, o polinucleotídeo (203) pode ser dividido em duas partes (203 (a) e 203 (b)) (ver a FIG. 12).

[001306] Então, um método para a segunda edição gênica será explicado usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (b).

[001307] A FIG. 13 ilustra um processo de segunda edição gênica usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (b).

[001308] Um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual a toolbox (140 (b)), incluindo um primeiro sítio de edição artificial (205) e um segundo sítio de edição artificial (206), é inserida, pode incluir uma provisão de um ácido nucleico guia e o polinucleotídeo doador para a célula.

[001309] Como descrito acima, o primeiro sítio de edição artificial (205) e o segundo sítio de edição artificial (206) podem incluir a mesma sequência.

[001310] A parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à sequência do primeiro sítio de edição artificial (205) e/ou do segundo sítio de edição artificial (206).

[001311] Pode haver vários métodos para prover o ácido nucleico guia na célula.

[001312] Por exemplo, o ácido nucleico guia pode ser provido na célula pela introdução de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia na célula.

[001313] Em um outro exemplo, o ácido nucleico guia pode ser provido para a célula pela expressão do ácido nucleico guia de um polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia que está incluído na toolbox (140 (b)) ou em uma toolbox diferente da toolbox (140 (b)).

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[001314] Ainda em um outro exemplo, no caso em que o ácido nucleico guia está incluído na toolbox (140 (b)) ou em uma toolbox diferente da toolbox (140 (b)), mas não é normalmente expressado pelo elemento de controle de expressão descrito acima, o ácido nucleico guia pode ser provido para a célula pelo tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão.

[001315] Pode haver vários métodos para dispensar o polinucleotídeo doador para a célula, e esses métodos foram descritos acima e, portanto, as explicações específicas serão omitidas na presente invenção.

[001316] Quando o ácido nucleico guia é provido para a célula pelo método descrito acima, o ácido nucleico guia pode interagir com a endonuclease guiada por RNA e o ácido nucleico guia e a endonuclease guiada por RNA podem formar um complexo dentro da célula.

[001317] Adicionalmente, o ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar especificamente ao primeiro sítio de edição artificial (205) e/ou ao segundo sítio de edição artificial (206). A endonuclease guiada por RNA pode clivar o primeiro sítio de edição artificial (205) e/ou o segundo sítio de edição artificial (206) em um estado que forma um complexo com o ácido nucleico guia.

[001318] Neste caso, o polinucleotídeo doador (232) introduzido na célula pode ser modificado para o primeiro sítio de edição artificial (205) e/ou para o segundo sítio de edição artificial (206).

[001319] Como resultado, o primeiro sítio de edição artificial (205) pode ser dividido em uma primeira região (205 (a)) e uma segunda região (205 (b)). Adicionalmente, o segundo sítio de edição artificial (206) pode ser dividido em uma primeira região (206 (a)) e uma segunda região (206 (b)) (ver a FIG. 13 (b) para ver a FIG. 13 (d)).

[001320] No caso em que o polinucleotídeo doador (232) é modificado no primeiro sítio de edição artificial (205) e no segundo sítio de edição artificial

229 / 353 (206), um nível mais alto do polipeptídeo pode ser expressado em uma célula onde o polinucleotídeo doador (232) é modificado. O polipeptídeo pode ser aquele que é codificado pelo polinucleotídeo doador (232) (ver FIG. 13).

[001321] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica será explicado usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (c).

[001322] A FIG. 14 ilustra um processo de segunda edição gênica usando a toolbox ilustrada na FIG. 11 (c).

[001323] Um método para a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma, no qual a toolbox (140 (c)), incluindo um primeiro sítio de edição artificial (202) e um segundo sítio de edição artificial (204), é inserida, pode incluir uma provisão de um primeiro ácido nucleico guia, um segundo ácido nucleico guia, um primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) e um segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) na célula. Como descrito acima, a sequência do primeiro sítio de edição artificial (202) é diferente da do segundo sítio de edição artificial (204).

[001324] Nesse caso, parte da sequência do primeiro ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à parte da sequência do primeiro sítio de edição artificial (202). Parte da sequência do segundo ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à parte da sequência do segundo sítio de edição artificial (204).

[001325] Adicionalmente, a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) podem incluir uma sequência que é igual à parte da sequência do primeiro sítio de edição artificial (202). Adicionalmente, a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) podem incluir uma sequência que é igual à parte da sequência do segundo sítio de edição artificial (204). Ou seja, a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) e do segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) podem incluir uma sequência para recombinação homóloga.

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[001326] Pode haver vários métodos para prover o primeiro ácido nucleico guia e o segundo ácido nucleico guia na célula.

[001327] Por exemplo, o primeiro ácido nucleico guia e o segundo ácido nucleico guia podem ser providos para a célula pela introdução do polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia na célula.

[001328] Em um outro exemplo, o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia pode(m) ser provido(s) para a célula pela expressão do primeiro ácido nucleico guia e do segundo ácido nucleico guia do polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia, que está incluído na toolbox 140 (c) ou em uma toolbox diferente da toolbox 140 (c). Neste caso, o polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e o polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia, podem ser incluídos na mesma ou em diferentes toolboxes e depois providos na célula.

[001329] Em ainda um outro exemplo, no caso em que o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia está(ão) incluído(s) na toolbox 140(c) ou em uma toolbox diferente da toolbox 140(c), mas normalmente não é(são) expressado(s) pelo elemento de controle de expressão descrito acima, o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia pode(m) ser provido(s) para a célula pelo tratamento do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento controle de expressão. Também neste caso, o polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia e o polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia podem ser incluídos na mesma ou em diferentes toolboxes e depois providos na célula.

[001330] Pode haver vários métodos para dispensar o primeiro polinucleotídeo doador e o segundo polinucleotídeo doador na célula.

[001331] Por exemplo, o primeiro polinucleotídeo doador e o segundo polinucleotídeo doador podem ser dispensados na célula pela introdução de um

231 / 353 vetor incluindo o primeiro polinucleotídeo doador e o segundo polinucleotídeo doador na célula. Neste caso, o primeiro e o segundo polinucleotídeos doadores podem ser incluídos no mesmo vetor e depois dispensados na célula. Alternativamente, o primeiro e o segundo polinucleotídeos doadores podem ser incluídos em um vetor diferente e depois dispensados na célula. O vetor pode ser um vetor plasmídico ou vetor viral.

[001332] Quando o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia são providos para a célula pelo método descrito acima, o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia pode(m) interagir com a endonuclease guiada por RNA, e o primeiro ácido nucleico guia e/ou o segundo ácido nucleico guia pode(m) formar um complexo com a endonuclease guiada por RNA na célula.

[001333] O primeiro ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar especificamente ao primeiro sítio de edição artificial (202). A endonuclease guiada por RNA pode clivar o primeiro sítio de edição artificial (202) em um estado que forma um complexo com o primeiro ácido nucleico guia. Nesse caso, o primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) provido na célula pode ser modificado no primeiro sítio de edição artificial (202).

[001334] Adicionalmente, o segundo ácido nucleico guia provido na célula pode se ligar especificamente ao segundo sítio de edição artificial (204). A endonuclease guiada por RNA pode clivar o segundo sítio de edição artificial (204) em um estado que forma um complexo com o segundo ácido nucleico guia. Neste caso, o segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) provido na célula pode ser modificado no segundo sítio de edição artificial (204).

[001335] Como resultado, o primeiro sítio de edição artificial (202) pode ser dividido em uma primeira região (202 (a)) e uma segunda região (202 (b)). Adicionalmente, o segundo sítio de edição artificial (204) pode ser dividido em uma primeira região (204 (a)) e uma segunda região (204 (b)) (ver FIG. 14 (b) a FIG. 14 (d)).

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[001336] A forma da toolbox (140 (c)) na qual ocorreu a segunda edição gênica pode estar em uma forma na qual o primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) é modificado no primeiro sítio de edição artificial (202) (ver FIG. 14 (b)).

[001337] Adicionalmente, outra forma da toolbox (140 (c)) na qual ocorreu a segunda edição gênica pode estar em uma forma na qual o segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) é modificado no segundo sítio de edição artificial (204) (ver FIG. 14 (c)).

[001338] Adicionalmente, a forma da toolbox (140 (c)) na qual ocorreu a segunda edição gênica pode estar em uma forma na qual o primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) é modificado no primeiro sítio de edição artificial (202), e o segundo polinucleotídeo doador (232 (b)) é modificado no segundo sítio de edição artificial (204) (ver FIG. 14 (d)).

[001339] Ou seja, quando a segunda edição gênica ocorre na toolbox (140 (c)), o primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)) e o segundo polinucleotídeo doador (232 (b)), que possuem uma sequência diferente entre si, podem ser modificados no primeiro sítio de edição artificial (202) e no segundo sítio de edição artificial (204), respectivamente. Nesse caso, um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo podem ser expressados na célula em que o primeiro e o segundo polinucleotídeos doadores (232) são modificados. O primeiro polipeptídeo pode ser aquele que é codificado pelo primeiro polinucleotídeo doador (232 (a)), e o segundo polipeptídeo pode ser um que é codificado pelo segundo polinucleotídeo doador (232 (b)).

[001340] Ao contrário dos exemplos descritos acima, quando um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA não é inserido no genoma da célula, a segunda edição gênica pode ser realizada provendo adicionalmente uma endonuclease guiada por RNA à célula.

[001341] Pode haver vários métodos para administrar a endonuclease guiada por RNA na célula.

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[001342] Por exemplo, a endonuclease guiada por RNA pode ser dispensada na célula através da introdução da endonuclease guiada por RNA como uma proteína na célula. Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA pode ser dispensada na célula através da introdução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA na célula. A introdução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA na célula pode incluir a incorporação do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA em um vetor plasmídico ou um vetor viral e depois introduzido na célula.

[001343] Como descrito acima, um método para a segunda edição gênica em uma célula isolada pode incluir um método para dispensar diretamente um RNA, um vetor plasmídico, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrita(a) acima para a célula isolada.

[001344] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em uma célula não isolada pode incluir um método para injetar um RNA, um vetor plasmídico, um polipeptídeo e/ou uma proteína descrito(a) acima no tecido ou órgão de um indivíduo.

[001345] Adicionalmente, um método para a segunda edição gênica em um zigoto e/ou embrião pode incluir um método para microinjectar um RNA, um vetor plasmídico, um polipeptídeo e/ou uma proteína para um zigoto de um animal em um estado de estágio de 1 célula pronuclear.

[001346] A seguir, serão descritos os efeitos da ocorrência da segunda edição gênica em uma toolbox, que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[001347] Os efeitos devido à segunda edição gênica podem variar de acordo com os tipos do polinucleotídeo, incluindo uma sequência PAM incluída em uma toolbox provida por algumas formas de realização de exemplo divulgadas na presente divulgação.

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[001348] Por exemplo, quando o polinucleotídeo incluindo a sequência PAM é um gene marcador, se um polinucleotídeo doador for modificado no polinucleotídeo que inclui a sequência PAM como sítio alvo, o polinucleotídeo codificado pelo gene marcador não pode ser expressado na célula. Através dessa característica, a célula na qual o polinucleotídeo doador é modificado no genoma pode ser selecionada. Os detalhes relativos à seleção de células nas quais a edição gênica ocorreu usando um gene marcador serão descritos mais adiante.

[001349] Em um outro exemplo, quando o polinucleotídeo incluindo a sequência PAM é um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, se um polinucleotídeo doador for modificado no polinucleotídeo que inclui a sequência PAM como um sítio alvo, o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA não pode ser expressado na célula.

[001350] Nesse caso, o sítio alvo pode ser aquele que é clivado usando uma endonuclease guiada por RNA, que é expressada pela transcrição e tradução do polinucleotídeo que inclui a sequência PAM, e aquele em que o polinucleotídeo doador é modificado. Há uma vantagem na edição gênica adicionais indesejados não ocorrer após a modificação no polinucleotídeo doador porque a endonuclease guiada por RNA não é mais expressada em uma célula.

[001351] A seguir, a construção de um embrião ou animal em que ocorreu a segunda edição gênica e que é produzida usando uma célula, zigoto, embrião ou animal em que a toolbox descrita acima, incluindo o polinucleotídeo com a sequência PAM, é inserida no genoma, e um método de preparação do mesmo será descrito. 3-3. Embrião transgênico e animal em que ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM 3-3-1. Embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

235 / 353 3-3-1-1. Construção de embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001352] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, um embrião transgênico pode ser provido, em que o embrião transgênico inclui uma ou mais das células com segunda edição gênica (doravante, “célula com segunda edição gênica com PAM") tendo um genoma no qual a segunda edição gênica ocorreu em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM incluída em uma toolbox.

[001353] Adicionalmente, como usado na presente invenção, o termo “célula sem segunda edição gênica com PAM” refere-se a uma célula que inclui um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM.

[001354] No entanto, na presente divulgação, o termo “célula sem segunda edição gênica com PAM” simplesmente refere-se a uma célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu e a qualquer célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica descrita acima não ocorreu e na qual a toolbox (100) está inserida também pode corresponder à mesma. Ou seja, a menos que seja o caso em que a segunda edição gênica não tenha ocorrido no polinucleotídeo tendo a sequência PAM, qualquer célula tendo um genoma com uma manipulação genética diferente também poderá se tornar uma “célula sem segunda edição gênica com PAM” de acordo com a presente divulgação.

[001355] Um embrião transgênico incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” pode ser quimérico ou homólogo.

[001356] O embrião homólogo pode se referir a um embrião transgênico que tem apenas a “célula com segunda edição gênica com PAM”.

[001357] O embrião quimérico pode se referir a um embrião transgênico que tem a “célula sem segunda edição gênica com PAM”, além da “célula com segunda edição gênica com PAM”.

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[001358] A seguir, será descrito um método para preparar um embrião transgênico que inclui uma ou mais célula(s) que possuem um genoma no qual ocorreu uma segunda edição gênica em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM que é inserida no genoma. 3-3-1-2. Método para preparar embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001359] Um método para produzir um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM incluída em uma toolbox, pode incluir microinjeção (MI) do “elemento para segunda edição gênica” em um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM é inserido.

[001360] Como usado na presente invenção, o termo “elemento para segunda edição gênica” refere-se a um elemento provido a uma célula, um embrião ou um animal, de modo a permitir a segunda edição gênica no genoma. Por exemplo, o “elemento para segunda edição gênica” pode ser qualquer um selecionado a partir do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão, um polinucleotídeo incluindo um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), uma recombinase sítio-específica (SSR), uma endonuclease guiada por RNA, um ácido nucleico guia e um polinucleotídeo doador, mas não está limitado aos mesmos.

[001361] Um método para produzir um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM incluída em uma toolbox pode incluir transferência nuclear de célula somática (SCNT). A transferência nuclear de célula somática (SCNT) pode incluir o transplante do núcleo de uma célula em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM produzida pelo método descrito acima, no qual ocorreu a segunda edição gênica, para um óvulo enucleado.

237 / 353 3-3-2. Embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM 3-3-2-1. Construção de embrião transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001362] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, um animal transgênico pode ser provido, na qual o animal transgênico inclui uma ou mais da célula com segunda edição gênica com PAM que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica em um polinucleotídeo que tem uma sequência PAM incluída em uma toolbox.

[001363] Um animal transgênico incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” pode ser um animal quimérico ou animal homólogo.

[001364] O animal homólogo pode se referir a um animal transgênico que tem apenas a “célula com segunda edição gênica com PAM”.

[001365] O animal quimérico pode se referir a um animal transgênico que tem a “célula com segunda edição gênica com PAM” além da “célula com segunda edição gênica com PAM”.

[001366] A seguir, será descrito um método para a preparação de um animal transgênico que inclui uma ou mais célula(s) tendo um genoma, no qual a segunda edição gênica ocorreu em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM incluída em uma toolbox que é inserida no genoma. 3-3-2-2. Método para preparar animal transgênico no qual ocorreu a segunda edição gênica na toolbox, incluindo polinucleotídeo tendo sequência PAM

[001367] Um método para produzir um animal incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir o transplante de um zigoto ou embrião tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica em um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM produzido pelo método acima descrito, no útero de uma mãe de substituição.

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[001368] Por exemplo, como descrito acima, um animal que inclui a “célula com segunda edição gênica com PAM” pode ser produzido implantando o zigoto e/ou embrião produzido pela microinjeção (MI) do “elemento para segunda edição gênica” no útero de uma mãe de substituição. Neste caso, o animal produzido pode ser quimérico ou homólogo.

[001369] Em um outro exemplo, como descrito acima, um animal incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” pode ser produzido implantando o zigoto e/ou embrião produzido por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) usando a “célula com segunda edição gênica com PAM” no útero de uma mãe de substituição. Nesse caso, o animal produzido pode ser homólogo.

[001370] Um método para produzir um animal, incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM”, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode incluir a injeção do “elemento para segunda edição gênica” descrito acima para um tecido de um animal tendo um genoma no qual é inserido um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM. O animal produzido através do método de injeção no tecido pode ser um animal quimérico.

[001371] Um método para produzir um animal incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir reprodução natural entre um macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” e/ou uma fêmea que tem um ovário, incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM”.

[001372] Por exemplo, a reprodução natural pode ser realizada entre um macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” e uma fêmea que tem um ovário incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM”.

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[001373] Em um outro exemplo, a reprodução natural pode ser realizada entre um macho que tem um testículo incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM” e uma fêmea do tipo selvagem; ou entre um macho do tipo selvagem e uma fêmea que tem um ovário incluindo a “célula com segunda edição gênica com PAM”.

4. Usar aspectos de animais transgênicos, incluindo células tendo genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica

[001374] A seguir, são descritos aspectos para a utilização do animal transgênico, incluindo uma ou mais das “células com segunda edição gênica” acima descritas e/ou “célula com segunda edição gênica com PAM”.

[001375] A “segunda edição gênica” pode ser qualquer um ou mais selecionado(s) a partir da edição gênica usando sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), edição gênica usando uma nuclease projetada que é expressada a partir de uma toolbox que não inclui um elemento de controle de expressão, edição gênica usando um nuclease manipulada que é expressada a partir de uma toolbox que inclui um elemento de controle de expressão, e edição gênica em uma toolbox que inclui um polinucleotídeo tendo uma sequência PAM, que é descrita acima, mas não está limitada à mesma.

[001376] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um aspecto da utilização do animal transgênico pode incluir biorreatores, animais com variedades melhoradas, animais resistentes a doenças, e modelos animais para doença.

[001377] Por exemplo, no caso em que a “célula com segunda edição gênica” e/ou “célula com segunda edição gênica com PAM” é uma célula em que um polinucleotídeo doador é modificado em um genoma, o animal transgênico pode ser utilizado como um biorreator.

[001378] No caso em que o animal transgênico é um animal grande, um polipeptídeo que pode ser expressado pelo polinucleotídeo doador inativado pode ser obtido em larga escala.

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[001379] O polinucleotídeo doador pode ser um polinucleotídeo que codifica albumina humana, um polinucleotídeo que codifica interleucina-2 humana, um polinucleotídeo que codifica eritropoietina humana, um polinucleotídeo que codifica insulina humana, e um polinucleotídeo que codifica ômega-3, mas não está limitado ao mesmo.

[001380] O polinucleotídeo doador pode estar em uma forma na qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo e um polinucleotídeo que codifica um ligante estão incluídos. Nesse caso, uma proteína de fusão na qual a proteína alvo e o ligante estão incluídos pode ser expressada em uma célula tendo genoma no qual o polinucleotídeo doador é modificado. O ligante na proteína de fusão expressada pode ser clivado e, assim, a proteína alvo pode ser obtida. O ligante foi descrito acima e, portanto, os detalhes específicos do mesmo serão omitidos na presente invenção.

[001381] A seguir, é descrito um processo para produzir uma proteína alvo a partir de um animal transgênico, incluindo uma célula que tem um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo e um polinucleotídeo que codifica um ligante são modificados para um polinucleotídeo doador.

[001382] A FIG. 15 ilustra um processo, no qual um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo e um polinucleotídeo que codifica um ligante são modificados em um polinucleotídeo doador, e uma proteína alvo é produzida a partir de um animal transgênico, incluindo a célula, na qual o polinucleotídeo doador é modificado.

[001383] A FIG. 15 (a) ilustra o vetor incluindo um polinucleotídeo doador (150) e um promotor (145) e um sítio alvo (142) que estão presentes no genoma de um animal.

[001384] A FIG. 15 (b) ilustra uma forma na qual o polinucleotídeo doador (150) é modificado no sítio alvo (142).

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[001385] A FIG. 15 (c) ilustra uma proteína de fusão (160), que é expressada em uma célula, um embrião ou um animal na(o) qual o polinucleotídeo doador (150) é modificado.

[001386] A FIG. 15 (d) ilustra uma forma na qual a insulina (148) é obtida a partir da proteína de fusão (160).

[001387] A seguir, assume-se que o polinucleotídeo doador (150) inclui um polinucleotídeo (143) que codifica insulina humana e um polinucleotídeo que codifica um ligante (141).

[001388] Quando um ácido nucleico guia e uma endonuclease guiada por RNA são providos para uma célula, o ácido nucleico guia e a endonuclease guiada por RNA interagem, formando assim um complexo dentro da célula, e o complexo de nuclease manipulada pode clivar o polinucleotídeo (142), que tem uma sequência igual ou complementar à de parte do ácido nucleico guia. Quando o polinucleotídeo doador (150) é provido na célula, o polinucleotídeo doador (150) pode ser modificado no polinucleotídeo (142) (ver FIG. 15 (a)). A forma na qual o polinucleotídeo doador (150) é modificado é uma forma na qual o polinucleotídeo doador (150) é incluído entre a primeira região (142 (a)) e uma segunda região (142 (b)), que são produzidas por clivagem do polinucleotídeo (142).

[001389] O método para prover um ácido nucleico guia e uma endonuclease guiada por RNA em uma célula foi descrito acima e, portanto, os detalhes específicos sobre o mesmo serão omitidos na presente invenção.

[001390] Com base na descrição acima, uma proteína de fusão (160) pode ser expressada a partir de um animal que inclui uma ou mais célula(s) tendo um genoma no qual o polinucleotídeo doador (150) é modificado. A proteína de fusão (160) pode estar em uma forma onde o polipeptídeo (144) codificado por uma primeira região (142 (a)) do polinucleotídeo, o ligante (146) e a insulina humana (148) estão incluídos. A proteína de fusão (160) pode ser obtida do animal e purificada (ver FIG. 15 (c)), e a insulina humana (148) pode ser obtida

242 / 353 pela clivagem do ligante (146) presente na proteína de fusão obtida e/ou purificada (160) (ver FIG. 15 (d)).

[001391] Como descrito acima, uma proteína de fusão incluindo insulina humana pode ser expressada no corpo do animal usando um polinucleotídeo doador tendo uma construção na qual o polinucleotídeo que codifica insulina humana e o polinucleotídeo que codifica um ligante são incluídos e, portanto, o choque hipoglicêmico pode não ocorrer no corpo do animal devido ao pequeno tamanho da insulina humana.

[001392] Em um outro exemplo, quando “célula com segunda edição gênica” e/ou “célula com segunda edição gênica com PAM” é uma célula tendo um genoma no qual um exopolinucleotídeo e/ou um endopolinucleotídeo é(são) inativado(s), o animal transgênico pode ser utilizado como animais com variedades melhoradas, animais resistentes a doenças, ou modelos animais para doenças, mas não se limitam aos mesmos.

[001393] Os animais com variedades melhoradas podem se referir a um animal em que um polinucleotídeo que codifica uma proteína de soro de leite é inativado, ou a um animal em que um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo é inserido ou modificado.

[001394] Especificamente, os animais com variedades melhoradas podem se referir a um animal onde um polinucleotídeo que codifica uma proteína de soro de leite é inativado. A proteína de soro de leite pode ser beta- lactoglobulina, alfa-lactoglobulina e albumina sérica bovina, mas não está limitada às mesmas. Quando a proteína do soro de leite é beta-lactoglobulina, a beta-lactoglobulina, que é conhecida como um importante fator indutor de alergia para os habilitados na técnica, pode não estar contida no leite do animal.

[001395] Especificamente, os animais com variedades melhoradas podem se referir a um animal em que um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo é inserido ou modificado. A proteína alvo pode ser um polinucleotídeo que codifica a albumina humana, um polinucleotídeo que codifica a interleucina-2

243 / 353 humana, um polinucleotídeo que codifica a eritropoietina humana, um polinucleotídeo que codifica insulina humana, e um polinucleotídeo que codifica ômega-3, mas não está limitado aos mesmos.

[001396] Especificamente, o animal resistente à doença pode se referir a um animal resistente à doença infecciosa ou a uma vaca que reprime a doença da vaca louca (encefalopatia espongiforme bovina). A doença infecciosa pode ser tripanossomíase, mas não está limitada à mesma. A vaca que reprime a doença da vaca louca (encefalopatia espongiforme bovina) pode ser uma vaca que inclui uma célula tendo um genoma no qual é inativado o polinucleotídeo que codifica uma proteína de príon.

[001397] Especificamente, o modelo animal para a doença pode ser um modelo animal de tumor. O modelo animal de tumor pode ser um animal que inclui uma célula tendo um genoma no qual o gene supressor de tumor é eliminado. Por exemplo, o gene supressor de tumor pode ser o gene RB1, gene p53, gene pVHL, gene APC, gene ST5, gene YPEL3, gene ST7 e gene ST14, mas não está limitado ao mesmo.

[001398] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um aspecto da utilização de um animal transgênico que inclui uma ou mais da “célula com segunda edição gênica” e/ou “célula com segunda edição gênica com PAM” pode incluir a obtenção de um gameta ou zigoto ( e/ou embrião) tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica a partir do animal transgênico. Nesse caso, o gameta pode ser um espermatozoide ou óvulo.

[001399] Um descendente, incluindo a “célula com segunda edição gênica” e/ou “célula com segunda edição gênica com PAM”, pode ser produzido fertilizando um gameta, que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica, com outro gameta, que é do tipo selvagem (WT) ou tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica.

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[001400] No caso em que o zigoto (e/ou embrião), que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica, é implantado no útero de uma mãe de substituição, um indivíduo e/ou descendente incluindo a “célula com segunda edição gênica” pode ser produzido. [Seleção da célula transformada usando a toolbox]

1. Seleção de células transformadas usando toolbox incluindo gene da proteína fluorescente 1-1. Estrutura do genoma no qual a toolbox incluindo o gene da proteína fluorescente é inserida

[001401] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente (daqui em diante, toolbox fluorescente) pode ser provida.

[001402] A toolbox fluorescente pode ter uma estrutura na qual o gene da proteína fluorescente é incluído entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira sequência de ITR e um polinucleotídeo que codifica uma segunda sequência de ITR.

[001403] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a toolbox fluorescente é inserida pode ser provida. Em particular, a localização e o número da toolbox fluorescente inserida na célula podem variar. A célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

[001404] Adicionalmente, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, um zigoto e/ou embrião incluindo um genoma no qual a toolbox fluorescente é inserida pode ser provida. Em particular, pelo menos uma das células que constituem o zigoto e/ou embrião deve incluir a toolbox fluorescente e, entre as células acima, o número de células que incluem a toolbox fluorescente não é limitado.

[001405] O método para preparar um(a) célula, zigoto e/ou embrião no(s) qual(is) a toolbox fluorescente é inserida é semelhante ao método descrito

245 / 353 acima para preparar a célula na qual a toolbox é inserida e, portanto, explicações específicas sobre o mesmo serão omitidas na presente invenção.

[001406] A proteína fluorescente pode ser expressada na(o) célula, zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox fluorescente é inserida, de acordo com o mecanismo de expressão. A fluorescência pode ser desenvolvida a partir da célula pela expressão da proteína fluorescente, e um sinal de fluorescência pode ser provido do lado de fora da célula de acordo com o desenvolvimento da fluorescência.

[001407] Usando o sinal de fluorescência provido para o exterior da célula, uma célula, um zigoto e/ou um embrião tendo um genoma no qual a toolbox fluorescente está inserida pode ser distinguida(o) de um embrião e/ou zigoto no qual a toolbox fluorescente não está inserida.

[001408] Se, uma célula na qual uma toolbox provida pela presente divulgação é inserida é preparada, e a toolbox fluorescente descrita acima é usada quando a célula, o embrião e/ou o zigoto na(o)(s) qual(is) a toolbox é inserida, é selecionada com precisão, a célula, o embrião e/ou o zigoto na(o)(s) qual(is) a toolbox é inserida, pode(m) ser facilmente distinguida(o)(s).

[001409] Adicionalmente, em uma célula tendo um genoma no qual ‘n + 1’ (n é um número natural de 1 ou mais) toolboxes fluorescentes são inseridas, um nível maior da proteína fluorescente pode ser expressado em comparação com a célula que tem um genoma no qual ‘n’ toolboxes fluorescentes são inseridas. Ou seja, o sinal de fluorescência provido em uma célula tendo um genoma, no qual são inseridas ‘n + 1’ toolboxes fluorescentes (n é um número natural de 1 ou mais), pode ser maior que o sinal de fluorescência provido em uma célula que tem um genoma, no qual são inseridas toolboxes fluorescentes.

[001410] Nesse caso, a célula na qual a toolbox fluorescente está inserida pode ser selecionada com mais precisão, selecionando a célula que provê um sinal de fluorescência maior.

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[001411] Além disso, no caso de um primeiro embrião em que o número de toolboxes fluorescentes incluídas no genoma de toda a célula que constitui o embrião é ‘n + 1’, uma quantidade maior da proteína fluorescente pode ser expressada em comparação com a expressada em um segundo embrião, em que o número de toolboxes fluorescentes incluídas no genoma de toda a célula que constitui o embrião é ‘n’. Ou seja, o sinal visual provido no primeiro embrião pode ser maior que o sinal visual provido no segundo embrião.

[001412] Nesse caso, o embrião no qual a toolbox fluorescente está inserida pode ser selecionado com mais precisão, selecionando o primeiro embrião que provê um sinal de fluorescência maior.

[001413] A seguir, será descrito um método para selecionar uma célula, embrião e/ou zigoto, em que a segunda edição gênica normalmente ocorreu, após a segunda edição gênica usando uma toolbox fluorescente. 1-2. Seleção de célula transformada usando toolbox, incluindo gene da proteína fluorescente

[001414] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, pode ser provido um método para selecionar um(a) célula, embrião e/ou zigoto na(o) qual a segunda edição gênica ocorreu após a segunda edição gênica usando uma toolbox fluorescente. A segunda edição gênica usando a toolbox fluorescente pode incluir modificar em um polinucleotídeo doador tendo uma região do gene da proteína fluorescente incluída na toolbox fluorescente como sítio alvo.

[001415] Por exemplo, a segunda edição gênica, que tem uma região do gene da proteína fluorescente como sítio alvo, pode ocorrer em uma célula tendo um genoma no qual uma única toolbox fluorescente é inserida. Nesse caso, a proteína fluorescente não pode ser expressada na célula. Ou seja, a fluorescência não pode ser desenvolvida em uma célula onde ocorreu a segunda edição gênica e, como resultado, nenhum sinal visual pode ser provido para o exterior da célula.

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[001416] Portanto, de acordo com a presença/ausência do sinal visual a ser provido para o exterior da célula, a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula que tem um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu.

[001417] Em um outro exemplo, a segunda edição gênica pode ocorrer apenas na primeira toolbox fluorescente em uma célula tendo um genoma no qual uma primeira toolbox fluorescente e uma segunda toolbox fluorescente são inseridas. Nesse caso, o nível da proteína fluorescente expressada na célula na qual a segunda edição gênica ocorreu apenas na primeira toolbox fluorescente (doravante, uma primeira célula) pode ser menor em comparação ao da célula, na qual a segunda edição gênica não ocorreu e na qual uma primeira toolbox fluorescente e uma segunda toolbox fluorescente estão inseridas. Ou seja, uma quantidade menor de fluorescência pode ser desenvolvida na primeira célula em comparação com a célula na qual a segunda edição gênica não ocorreu e, como resultado, o sinal visual provido para o exterior da primeira célula pode ser mais fraco.

[001418] Portanto, de acordo com a intensidade do sinal visual provido para o exterior da célula, a primeira célula na qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula que tem um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu.

[001419] O método e o mecanismo para segunda edição gênica usando a toolbox fluorescente podem ser explicados pelo método e mecanismo descritos acima para segunda edição gênica usando uma toolbox e, portanto, os detalhes específicos sobre o mesmo serão omitidos na presente invenção.

[001420] O método descrito acima para selecionar a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser usado não apenas em uma célula isolada, mas também em um(a) célula não isolada, zigoto e/ou embrião.

[001421] Por exemplo, no caso de um embrião em que o número de toolboxes fluorescentes inseridas no genoma de toda a célula que constitui o

248 / 353 embrião é ‘n + 2’ (n é um número natural de 1 ou mais), a segunda edição gênica pode ocorrem apenas nas toolboxes fluorescentes ‘n’ (doravante, o embrião no qual a segunda edição gênica ocorreu apenas nas toolboxes fluorescentes ‘n’ é expressado como “primeiro embrião”).

[001422] O nível da proteína fluorescente expressa no primeiro embrião pode ser menor em comparação com o embrião, que está em um estado em que a segunda edição gênica não ocorreu e no qual ‘n + 2’ toolboxes fluorescentes são inseridas. Ou seja, uma quantidade menor de fluorescência pode ser desenvolvida no primeiro embrião em comparação com o embrião no qual a segunda edição gênica não ocorreu e, como resultado, o sinal visual provido para a parte externa do primeiro embrião pode ser fraco.

[001423] Portanto, de acordo com a intensidade do sinal visual provido para o exterior do embrião, o primeiro embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguido de um embrião que tem um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu.

[001424] Em ainda um outro exemplo, a segunda edição gênica pode ocorrer apenas nas ‘n + 1’ toolboxes fluorescentes em um embrião que tem um genoma no qual as ‘n + 2’ toolboxes fluorescentes são inseridas. A seguir, o embrião no qual a segunda edição gênica ocorreu apenas nas ‘n + 1’ toolboxes fluorescentes é expressado como “segundo embrião”.

[001425] Em comparação com o primeiro embrião descrito acima, a quantidade de proteína fluorescente expressa no segundo embrião pode ser menor. Ou seja, em comparação com o primeiro embrião, uma quantidade menor de fluorescência pode ser desenvolvida no segundo embrião, onde a segunda edição gênica ocorreu em um número maior de sítios alvo e, como resultado, o sinal visual provido para o exterior do segundo embrião o embrião pode ser mais fraco.

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[001426] Nesse caso, o embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser selecionado com mais precisão, selecionando o segundo embrião, que provê um sinal de fluorescência mais fraco.

2. Seleção da célula transformada usando toolbox incluindo o gene da proteína de superfície 2-1. Estrutura do genoma no qual a toolbox incluindo o gene da proteína de superfície é inserida

[001427] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma toolbox incluindo um gene de proteína de superfície (daqui em diante, toolbox de superfície) pode ser provida.

[001428] A toolbox de superfície pode ter uma estrutura na qual um gene de proteína de superfície é incluído entre um polinucleotídeo que codifica uma primeira sequência de ITR e um polinucleotídeo que codifica uma segunda sequência de ITR. Para conveniência das explicações, a seguir, supõe-se que uma toolbox de superfície única inclua um único gene de proteína de superfície.

[001429] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a toolbox de superfície é inserida pode ser provida. Em particular, a célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

[001430] Adicionalmente, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, um zigoto e/ou embrião incluindo um genoma no qual a toolbox de superfície é inserida pode ser provida.

[001431] A proteína de superfície pode ser expressada em um(a) célula, zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox de superfície é inserida, de acordo com o mecanismo de expressão intracelular. Nesse caso, a proteína da superfície pode aparecer na superfície da(o) célula, zigoto e/ou embrião.

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[001432] O uso dos anticorpos que podem interagir com a proteína de superfície, um(a) célula, zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox de superfície está inserida pode ser distinguido(a) de um(a) célula, zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox de superfície não está inserida. Nesse caso, os anticorpos podem interagir com partículas magnéticas ou fluoróforos.

[001433] Por conseguinte, usando um(a) propriedade magnética ou sinal de fluorescência, um(a) célula, embrião e/ou zigoto tendo um genoma no qual a toolbox de superfície está inserida podem ser distinguidos de um(a) célula, embrião e/ou zigoto tendo um genoma no qual a superfície toolbox não está inserida.

[001434] Se, após a preparação de uma célula na qual uma toolbox provida pela presente divulgação é inserida, uma toolbox de superfície descrita acima é usada quando é necessário selecionar com precisão um(a) célula, embrião e/ou zigoto no(a) qual uma toolbox é inserida, será possível selecionar facilmente a(o) célula, embrião e/ou zigoto no(a) qual usando anticorpos que possam interagir com a proteína da superfície.

[001435] A FIG. 16 ilustra uma forma de realização de exemplo para selecionar uma célula tendo um genoma no qual a toolbox de superfície (320) é inserida. Para conveniência da explicação, presume-se que a célula seja uma célula isolada.

[001436] FIG. 16 (a) ilustra um genoma (310) no qual uma toolbox de superfície não é inserida. Uma proteína de superfície não é expressada na superfície de uma célula (311) que tem esse genoma (310).

[001437] A FIG. 16 (b) ilustra parte do genoma no qual a toolbox de superfície (320) é inserida. A toolbox de superfície (320) pode ter uma estrutura na qual o gene da proteína de superfície (325) é incluído entre a primeira sequência de ITR (322) e a segunda sequência de ITR (329). A proteína de

251 / 353 superfície (323) pode ser expressada na superfície da célula (321) tendo esse genoma.

[001438] A FIG. 16 (c) ilustra um processo de utilização de cromatografia para selecionar uma célula na qual a proteína de superfície é expressada entre as células nas quais uma proteína de superfície é expressada e as células nas quais uma proteína de superfície não é expressada.

[001439] Quando as células (311 e 321) são escoadas para uma cromatografia incluindo o anticorpo (324), de modo a selecionar uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox de superfície é inserida, a célula (321) tendo um genoma no qual a toolbox de superfície (320 ) é inserido pode ser ligado à coluna de cromatografia pela interação entre um anticorpo (324) e uma proteína de superfície (323). Ou seja, a célula (321) que está ligada à coluna de cromatografia pela interação entre a proteína de superfície (323) e o anticorpo (324) (ver FIG. 16 (c)).

[001440] A seguir, será descrito um método para selecionar uma célula, embrião e/ou zigoto no qual a segunda edição gênica normalmente ocorreu após a segunda edição gênica usando uma toolbox de superfície. 2-2. Seleção de células transformadas usando toolbox, incluindo o gene da proteína de superfície

[001441] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, pode ser provido um método para selecionar um(a) célula, embrião e/ou zigoto no(a) qual a segunda edição gênica ocorreu após a segunda edição gênica usando uma toolbox de superfície. A segunda edição gênica usando a toolbox de superfície pode incluir modificar em um polinucleotídeo doador para um gene de proteína de superfície que é incluído na toolbox de superfície. Como descrito acima, a descrição será dada na suposição de que um único gene de proteína de superfície esteja incluído em uma única toolbox de superfície.

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[001442] Por exemplo, a segunda edição gênica que tem um gene de proteína de superfície como alvo pode ocorrer em uma célula tendo um genoma no qual uma única toolbox de superfície é inserida.

[001443] Nesse caso, a proteína da superfície não pode ser expressada na célula. Ou seja, a proteína de superfície não pode aparecer na superfície da célula na qual ocorreu a segunda edição gênica e, como resultado, a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica não pode interagir com um anticorpo que pode interagir com a proteína de superfície.

[001444] Por conseguinte, de acordo com a presença/ausência de uma interação entre o anticorpo e a célula, a célula que tem um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula na qual a segunda edição gênica não ocorreu.

[001445] Mesmo no caso de uma célula tendo um genoma no qual são inseridas duas ou mais toolboxes de superfície, como descrito acima, a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula na qual a segunda edição gênica não ocorreu, de acordo com a presença/ausência de uma interação entre o anticorpo e a célula.

[001446] Nesse caso, a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser selecionada em todas as toolboxes de superfície inseridas no genoma.

[001447] O método e o mecanismo para segunda edição gênica usando a toolbox de superfície podem ser explicados pelo método e pelo mecanismo descritos acima para segunda edição gênica usando uma toolbox e, portanto, a explicação específica será omitida sobre os mesmos na presente invenção.

[001448] O método descrito acima para selecionar a célula na qual ocorreu a edição gênica pode ser utilizado não apenas em uma célula isolada, mas também em um(a) célula não isolada, zigoto e/ou embrião.

[001449] Por exemplo, no caso em que o número da toolbox de superfície inserida no genoma de toda a célula que constitui o embrião é ‘n’ ou mais (n é um número natural de 2 ou mais), a segunda edição gênica pode ocorrer em

253 / 353 todos as toolboxes de superfície ‘n’. Nesse caso, a proteína de superfície não pode ser expressada em um embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica. Ou seja, a proteína de superfície não pode aparecer na superfície do embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica e, como resultado, o embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica não pode interagir com um anticorpo que pode interagir com a proteína de superfície.

[001450] Ou seja, o embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguido do embrião no qual a segunda edição gênica não ocorreu, de acordo com a presença/ausência de uma interação entre o anticorpo e a célula. Nesse caso, o embrião selecionado pode ser uma célula na qual ocorreu a segunda edição gênica em todas as toolboxes de superfície inseridas no genoma de toda a célula que constitui o embrião.

[001451] A FIG. 17 ilustra uma forma de realização de exemplo para selecionar a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox de superfície (320) é inserida. Para conveniência da explicação, a descrição é provida com base no pressuposto de que a célula é uma célula isolada.

[001452] A FIG. 17 (a) ilustra um genoma e uma célula (321) no caso em que a segunda edição gênica não ocorreu em uma célula que tem um genoma no qual a toolbox de superfície (320) é inserida.

[001453] A FIG. 17 (b) ilustra um genoma e uma célula no caso em que ocorreu uma segunda edição gênica em uma célula que tem um genoma no qual a toolbox de superfície (320) é inserida.

[001454] No caso em que um polinucleotídeo doador (232) é modificado em uma toolbox de superfície, que é inserida em um genoma de uma célula tendo um genoma no qual a toolbox de superfície (320) é inserida, e o gene da proteína de superfície (325) é dividido em uma primeira região (325 (a)) e uma segunda região (325 (b)), a proteína de superfície (323) não é expressada na superfície da célula (331).

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[001455] A FIG. 17 (c) ilustra um processo usando cromatografia para selecionar a célula na qual um polinucleotídeo doador (232) é modificado em uma toolbox de superfície.

[001456] Quando a célula (331) onde o polinucleotídeo doador (232) é modificado, e a célula (321) onde o polinucleotídeo doador (232) não é modificado, fluem para a cromatografia na qual o anticorpo (324) é incluído, a célula (331) onde o polinucleotídeo doador (232) é introduzido não pode ser ligada à coluna de cromatografia. Utilizando essa propriedade, é possível selecionar a célula na qual ocorreu a segunda edição gênica, obtendo a célula (331) que não está ligada à coluna de cromatografia (ver FIG. 17 (c)).

3. Seleção de célula transformada usando toolbox incluindo gene autodestrutivo 3-1. Estrutura do genoma no qual a toolbox incluindo gene autodestrutivo é inserida

[001457] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma toolbox incluindo um gene autodestrutivo (daqui em diante, uma toolbox autodestrutiva) pode ser provida.

[001458] A FIG. 18 (a) ilustra uma forma de realização de exemplo de uma toolbox autodestrutiva.

[001459] Com referência à FIG. 18 (a), a toolbox autodestrutiva (340) pode ter uma estrutura na qual um gene autodestrutivo (347) e um elemento de controle de expressão (345) capaz de controlar a expressão do gene autodestrutivo são incluídos entre uma primeira sequência de ITR (343) e uma segunda sequência de ITR (349).

[001460] Para conveniência das explicações, a seguir, a descrição é provida com base no pressuposto de que um único gene autodestrutivo é incluído em uma única toolbox autodestrutiva. Além disso, a descrição é provida com base no pressuposto de que o elemento de controle da expressão

255 / 353 (345) é um promotor Tet-on e o gene autodestrutivo (347) é um gene da timidina quinase.

[001461] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a toolbox autodestrutiva é inserida pode ser provida. Em particular, a célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

[001462] Adicionalmente, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, um zigoto e/ou embrião incluindo um genoma no qual a toolbox autodestrutiva é inserida pode ser provido.

[001463] Quando a tetraciclina é tratada na(o) célula (341), zigoto e/ou embrião tendo um genoma no qual a toolbox autodestrutiva (340) é inserida, a timidina quinase pode ser expressada na(o) célula, zigoto e/ou embrião, de acordo com o mecanismo de expressão intracelular.

[001464] Quando um pró-fármaco (por exemplo, ganciclovir) é provido à(ao) célula, zigoto e/ou embrião na(o) qual a timidina quinase é expressada, parte da(o) célula, zigoto e/ou embrião pode ser apoptizada. O pró-fármaco pode interagir com timidina quinase e, como resultado, a célula na qual a timidina quinase é expressada pode ser apoptizada.

[001465] Ou seja, a célula tendo um genoma, no qual a toolbox autodestrutiva é inserida, pode ser apoptizada pelo tratamento de um material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle da expressão e um pró- fármaco.

[001466] A seguir, será descrito um método para selecionar uma célula, embrião e/ou zigoto, na(o) qual a segunda edição gênica normalmente ocorreu após a segunda edição usando uma toolbox autodestrutiva. 3-2. Seleção de células transformadas usando toolbox, incluindo gene autodestrutivo

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[001467] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, pode ser provido um método para selecionar a(o) célula transformada, zigoto e/ou embrião na(o) qual a segunda edição gênica ocorreu após a segunda edição gênica usando uma toolbox autodestrutiva. A segunda edição gênica usando a toolbox autodestrutiva pode incluir modificar um polinucleotídeo doador para um gene autodestrutivo que está incluído na toolbox autodestrutiva. Como descrito acima, a descrição será provida com base no pressuposto de que um único gene autodestrutivo está incluído em uma única toolbox autodestrutiva.

[001468] A segunda edição gênica pode ocorrer em uma única célula tendo um genoma no qual uma toolbox autodestrutiva é inserida, tendo parte do gene autodestrutivo como um sítio alvo. Em particular, mesmo quando um pró-fármaco é provido à célula na qual a edição gênica ocorreu por ter parte do gene autodestrutivo como sítio alvo, a célula não é apoptizada.

[001469] Portanto, de acordo com a presença/ausência de apoptose após o tratamento da célula com tetraciclina e um pró-fármaco, a célula tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu.

[001470] Ou seja, a célula que pode sobreviver mesmo após o tratamento com tetraciclina e um pró-fármaco pode ser a célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica ocorreu.

[001471] Mesmo no caso de uma célula tendo um genoma no qual duas ou mais toolboxes autodestrutivas são inseridas, como descrito acima, a célula tendo um genoma no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguida da célula tendo um genoma no qual a segunda edição gênica não ocorreu, de acordo com a presença/ausência de apoptose. Nesse caso, a célula selecionada pode ser uma célula na qual ocorreu a segunda edição gênica em todas as toolboxes autodestrutivas inseridas em um genoma.

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[001472] A seguir, fazendo referência à FIG. 18, a descrição será provida mais especificamente em relação à presença/ausência de apoptose quando um polinucleotídeo doador é modificado ou não é modificado em um gene autodestrutivo incluído em uma toolbox autodestrutiva.

[001473] A FIG. 18 ilustra uma forma de realização de exemplo no que se refere à seleção de uma célula na qual ocorreu a segunda edição gênica em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox autodestrutiva (340) é inserida. Para conveniência da explicação, presume-se que a célula seja uma célula isolada.

[001474] No caso em que o polinucleotídeo doador (232) é modificado em uma toolbox autodestrutivas (340) que é inserida no genoma da célula, o gene autodestrutivo (347) pode ser dividido em uma primeira região (347 (a)) e uma segunda região (347 (b)). Em particular, mesmo quando o promotor Tet- on (345) opera tratando a tetraciclina na célula (351), na qual é empurrado o polinucleotídeo doador (232), a timidina quinase não pode ser expressada na célula. Neste caso, mesmo quando a célula é provida com um pró-fármaco, a célula (351) não é apoptizada (ver FIG. 18 (b)).

[001475] Enquanto isso, no caso em que o polinucleotídeo doador não é modificado em uma toolbox autodestrutiva (340) que é inserida no genoma da célula, o promotor Tet-on (345) pode ser operado tratando a célula com tetraciclina. A transcrição e/ou tradução do gene autodestrutivo (347) pode ser iniciada pela operação do promotor Tet-on (345) e, assim, a timidina quinase pode ser expressada. Uma vez que a célula, na qual a timidina quinase é expressada, é provida com um pró-fármaco, a célula pode ser apoptizada.

[001476] Nesse caso, pode ser obtida uma célula (351) que não é apoptizada e, nesse caso, uma célula na qual ocorreu a segunda edição gênica (ver FIG. 18 (a)).

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[001477] O método descrito acima para selecionar a célula na qual ocorreu a edição gênica pode ser aplicado não apenas a uma célula isolada, mas também a um(a) célula não isolada, zigoto e/ou embrião.

[001478] Por exemplo, quando o número de toolboxes autodestrutivas inseridas no genoma de toda a célula que constitui o embrião é ‘n’ ou maior (n é um número natural de 2 ou maior), a segunda edição gênica pode ocorrer em todos as ‘n’ toolboxes autodestrutivas. Neste caso, mesmo quando o embrião é provido com tetraciclina, a timidina quinase não pode ser expressada no embrião acima descrito, no qual ocorreu a segunda edição gênica. Em particular, mesmo quando o embrião é provido com uma pró-droga, a célula que constitui o embrião não é apoptizada.

[001479] Ou seja, de acordo com a presença/ausência de apoptose da célula que constitui o embrião, um embrião no qual ocorreu a segunda edição gênica pode ser distinguido de um embrião no qual a segunda edição gênica não ocorreu. Nesse caso, os embriões nos quais ocorreu a segunda edição gênica em todas as toolboxes de superfície inseridas no genoma podem ser selecionados. [Seleção de sexo usando a toolbox]

1. Seleção do sexo por inserção do gene SRY e/ou inativação do gene SRY

[001480] Um método para selecionar o sexo de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação pode incluir inserção do gene SRY no genoma ou inativação do gene SRY a partir do genoma.

[001481] A seguir, um indivíduo do sexo masculino no qual o gene SRY é inserido no genoma e um método para produzir o indivíduo do sexo masculino é descrito. Adicionalmente, é descrito um indivíduo do sexo feminino no qual o gene SRY é eliminado de um genoma e um método para a produção do indivíduo do sexo feminino.

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[001482] 1-1. Produção de indivíduo do sexo masculino por inserção do gene SRY

[001483] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um animal macho tendo um cromossomo XX no qual um gene SRY é inserido pode ser provido.

[001484] Por exemplo, um animal macho tendo um genoma no qual o gene SRY é inserido em um endopolinucleotídeo pode ser provido.

[001485] Em um outro exemplo, um animal macho tendo um genoma no qual o gene SRY é inserido em um exopolinucleotídeo pode ser provido. O exopolinucleotídeo pode estar presente dentro de uma toolbox ou pode estar presente fora de uma toolbox.

[001486] O gene SRY pode ser inserido no genoma através de vários mecanismos.

[001487] Por exemplo, o gene SRY pode ser inserido no genoma como um componente de uma toolbox. Um método para o gene SRY, como componente de uma toolbox, ser inserido no genoma de um(a) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido pode ser suficientemente explicado pelo método descrito acima para inserir uma toolbox e, portanto, a explicação específica sobre o mesmo será omitida na presente invenção.

[001488] Em um outro exemplo, o gene SRY pode ser modificado em um genoma por um complexo de nuclease manipulada que é expressado a partir de um polinucleotídeo que codifica uma nuclease manipulada inserida no genoma.

[001489] Um método para o gene SRY ser inserido no genoma de um(a) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido pelo complexo de nuclease manipulada inclui a provisão de um polinucleotídeo doador, incluindo o gene SRY na(o) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido.

[001490] Ainda em outro exemplo, o gene SRY pode ser inserido no genoma usando um sítio de reconhecimento de recombinase (RRS).

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[001491] Um método para o gene SRY ser inserido no genoma de um(a) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido pelo sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) inclui uma provisão do gene SRY, o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), e uma recombinase sítio-específica (SSR) para a(o) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido. Nesse caso, a recombinase sítio-específica (SSR) pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS).

[001492] O método para prover a toolbox, transposase, polinucleotídeo doador, sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), recombinase sítio- específica (SSR), etc. para a(o) célula, zigoto (e/ou embrião) e/ou tecido foi descrita(o) acima e assim, explicações específicas sobre o mesmo serão omitidas na presente invenção.

[001493] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, pode ser provido um método para produzir um animal macho tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY está inserido.

[001494] Por exemplo, um método para produzir um animal macho tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY é inserido pode incluir a fertilização de um espermatozoide tendo um cromossomo X no qual o gene SRY é inserido e um óvulo do tipo selvagem.

[001495] O espermatozoide tendo um cromossomo X no qual o gene SRY é inserido pode ser produzido a partir de um animal que tem um órgão reprodutor (ou um tecido reprodutor) tendo um genoma no qual o gene SRY é inserido.

[001496] Em um outro exemplo, um método para produzir um animal macho tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY é inserido pode incluir a fertilização de um óvulo tendo um cromossomo X no qual o gene SRY é inserido e um espermatozoide do tipo selvagem.

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[001497] O óvulo tendo um cromossomo X no qual o gene SRY está inserido pode ser produzido a partir de um animal tendo um órgão reprodutor (ou um tecido reprodutor) tendo um genoma no qual o gene SRY está inserido.

[001498] Adicionalmente, em outro exemplo, um método para a produção de um animal macho tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY está inserido pode incluir a implantação de um zigoto e/ou embrião tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY está inserido, no útero de uma mãe de substituição.

[001499] O zigoto e/ou embrião tendo um cromossomo XX no qual o gene SRY está inserido pode ser produzido pela transferência nuclear de célula somática descrita acima (SCNT) ou microinjeção (MI).

[001500] Adicionalmente, em outro exemplo, um método para produzir um animal macho com um cromossomo XX no qual o gene SRY está inserido pode incluir a injeção da toolbox SRY acima descrita, transposase, polinucleotídeo doador, sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) e/ou sítio recombinase específica (SSR), etc. a um órgão ou tecido reprodutor de um animal.

[001501] Os espermatozoides podem ser obtidos a partir de um animal macho tendo um cromossomo XX produzido pelo método acima descrito. 1-2. Produção de indivíduos do sexo feminino por inativação do gene SRY 1-2-1. Produção de indivíduos do sexo feminino por inativação do gene

SRY

[001502] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, um animal de sexo feminino tendo um cromossomo XY no qual um gene SRY é inativado pode ser provido.

[001503] A seguir, será descrita uma toolbox para inativação do gene SRY e um método para produzir um animal tendo um genoma no qual um gene SRY é inativado. 1-2-1-1. Toolbox para inativação do gene SRY

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[001504] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, uma toolbox para inativação de um gene SRY presente no cromossomo Y (a seguir, toolbox de inativação de SRY) pode ser provida.

[001505] A toolbox de inativação de SRY pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um componente de nuclease manipulada é incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. A toolbox de inativação de SRY pode incluir adicionalmente um elemento de controle de expressão.

[001506] Por exemplo, a toolbox de inativação de SRY pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é incluído entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Nesse caso, parte da sequência do ácido nucleico guia é igual a, ou complementar à, parte da sequência do gene SRY.

[001507] Em um outro exemplo, a toolbox de inativação de SRY pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Adicionalmente, a toolbox de inativação de SRY pode ter uma constituição na qual um elemento de controle de expressão, que controla a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e/ou o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, é adicionalmente incluído. Nesse caso, parte da sequência do ácido nucleico guia é igual a, ou complementar à, parte da sequência do gene SRY.

[001508] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a toolbox de inativação de SRY é inserida pode ser provida. A célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

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[001509] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, um zigoto e/ou embrião incluindo um genoma no qual a toolbox de inativação de SRY é inserida pode ser provida.

[001510] A FIG. 19 (a) ilustra uma forma de realização de exemplo de um genoma no qual uma toolbox de inativação de SRY (360) é inserida.

[001511] A toolbox de inativação de SRY (360) pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (363) e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia (365) são incluídos entre uma primeira sequência de ITR (361) e uma segunda sequência de ITR 367. Parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à parte da sequência de um gene SRY.

[001512] A toolbox de inativação de SRY (360) pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (362), de modo a controlar a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA (363). Para conveniência da explicação, presume-se que o promotor induzível seja um promotor Tet-on.

[001513] Adicionalmente, a toolbox de inativação de SRY (360) pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor (364) para a transcrição do polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia (365).

[001514] A seguir, um método para inativação do gene SRY em um genoma no qual é inserida uma toolbox para inativação SRY, e um método para produzir uma fêmea tendo um genoma no qual um gene SRY é inativado, são descritos. 1-2-1-2. Inativação do gene SRY usando toolbox e método para produzir indivíduo do sexo feminino tendo genoma no qual o gene SRY é inativado

[001515] A seguir, são providos vários métodos para inativar um gene SRY no genoma de uma célula. Para conveniência da explicação, presume-se que a célula seja uma célula isolada. Vários métodos para a inativação do gene

264 / 353 SRY podem ser providos de acordo com a construção de uma toolbox de SRY inserida no genoma da célula.

[001516] Por exemplo, um método para a inativação de um gene SRY em uma célula tendo um genoma, no qual uma toolbox de inativação de SRY, incluindo um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que pode se ligar especificamente ao gene SRY é inserida, pode incluir uma provisão de uma endonuclease guiada por RNA em uma célula.

[001517] Em um outro exemplo, um método para a inativação de um gene SRY em uma célula tendo um genoma, no qual uma toolbox de inativação de SRY incluindo um elemento de controle de expressão que codifica polinucleotídeo, um polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA, e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia que podem se ligar especificamente ao gene SRY é inserida, pode incluir uma provisão de condições e/ou um material que afeta o elemento de controle da expressão na célula.

[001518] O método para prover a endonuclease guiada por RNA e/ou o material que afeta o elemento de controle de expressão em uma célula foi descrito acima e, portanto, a explicação específica sobre o mesmo será omitida na presente invenção.

[001519] Com referência à FIG. 19, o mecanismo no qual um gene SRY é eliminado será descrito especificamente.

[001520] A FIG. 19 (b) ilustra uma forma de um genoma no qual um gene SRY (400) é inativado em um genoma no qual uma toolbox de inativação de SRY (360) é inserida.

[001521] Em uma célula que tem um genoma no qual a toolbox de inativação de SRY (360) é incluída, o ácido nucleico guia pode ser expressado dentro de uma célula por um polinucleotídeo que codifica um promotor (364), e o ácido nucleico guia expressado pode se ligar complementarmente a um gene SRY (400), que é um gene endógeno presente no genoma da célula.

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[001522] No caso em que a célula tendo um genoma no qual a toolbox de inativação de SRY (360) é inserida, é provida com tetraciclina, o promotor Tet- on (362) pode operar e, nesse caso, a endonuclease guiada por RNA pode ser expressada na célula. A endonuclease guiada por RNA pode clivar o gene SRY (400) enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia.

[001523] Ou seja, o gene SRY (400) pode ser inativado em um genoma masculino. Nesse caso, o gene SRY (400) pode ser dividido em uma primeira região (400 (a)) e uma segunda região (400 (b)).

[001524] Na presente divulgação, é provido um método para produzir um animal de sexo feminino que tem um genoma no qual um gene SRY é eliminado.

[001525] Por exemplo, um método para produzir um animal de sexo feminino tendo um genoma no qual um gene SRY é eliminado pode incluir a fertilização de um espermatozoide tendo um cromossomo Y no qual o gene SRY é eliminado e um óvulo.

[001526] O espermatozoide tendo um cromossomo Y no qual o gene SRY é inativado pode ser produzido a partir de um animal tendo um órgão reprodutor (ou um tecido reprodutor) tendo um genoma no qual o gene SRY está inserido. Além disso, o óvulo pode ser do tipo selvagem.

[001527] Em um outro exemplo, um método para produzir um animal de sexo feminino tendo um genoma no qual um gene SRY é inativado pode incluir a implantação de um zigoto e/ou embrião tendo um cromossomo XY no qual o gene SRY é inativado, no útero de uma mãe de substituição.

[001528] O zigoto e/ou embrião tendo um cromossomo XY no qual o gene SRY é inativado pode ser produzido pela transferência nuclear de célula somática (SCNT) ou microinjeção (MI) acima descrita.

[001529] Em ainda um outro exemplo, um método para produzir um animal de sexo feminino tendo um genoma no qual um gene SRY é inativado pode incluir a injeção do elemento de controle de expressão descrito acima e a

266 / 353 endonuclease guiada por RNA a um órgão reprodutor ou a um tecido reprodutor de um animal.

[001530] O leite ou óvulos pode(m) ser obtido(s) a partir de um animal de sexo feminino tendo um cromossomo XY produzido pelo método acima descrito. 1-2-2. Produção de indivíduos do sexo feminino por modificação genética prejudicial à motilidade

[001531] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, a motilidade dos espermatozoides tendo um cromossomo Y pode ser danificada via modificação do gene que causa dano à motilidade e, neste caso, um animal de sexo feminino tendo um cromossomo XX pode ser provido com uma probabilidade relativamente alta.

[001532] A seguir, a toolbox para modificação de um gene que causa dano à motilidade e um método para a produção de espermatozoides tendo um genoma no qual o gene que causa dano à motilidade é modificado, será descrita. 1-2-2-1. Toolbox para modificar o gene que causa dano à motilidade

[001533] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, uma toolbox que pode ser usada para a modificação de um gene que causa dano à motilidade (doravante, “toolbox alvo do cromossomo Y”) pode ser provida a um polinucleotídeo que pode estar presente apenas no cromossomo Y.

[001534] Por exemplo, a toolbox pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é incluída entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Neste caso, o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia tem uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte do polinucleotídeo que pode estar presente apenas no cromossomo Y.

[001535] Em um outro exemplo, a toolbox pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um

267 / 353 polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. Adicionalmente, a toolbox pode ter uma constituição na qual um elemento de controle de expressão, que controla a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA e/ou o polinucleotídeo que codifica o ácido nucleico guia, é adicionalmente incluído. Neste caso, parte da sequência do ácido nucleico guia pode ser igual ou complementar à parte da sequência do polinucleotídeo que pode estar presente apenas no cromossomo Y.

[001536] O polinucleotídeo que pode estar presente apenas no cromossomo Y divulgado nas formas de realização de exemplo descritas acima pode ser um gene SRY.

[001537] A toolbox que pode ser usada para a modificação do gene que causa dano à motilidade pode ser a toolbox de inativação de SRY acima descrita.

[001538] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a “toolbox alvo do cromossomo Y” é inserida pode ser provida. A célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

[001539] Adicionalmente, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, um zigoto e/ou embrião incluindo um genoma no qual a “toolbox alvo do cromossomo Y” é inserida pode ser provida. 1-2-2-2. Modificação do gene que causa dano à motilidade usando a toolbox e o método de produção de espermatozoides nos quais o gene que causa dano à motilidade é modificado

[001540] A seguir, são providos vários métodos de modificação de um gene que causa dano à motilidade ao genoma de uma célula. Para conveniência da explicação, presume-se que a célula seja uma célula isolada. Vários métodos para a modificação do gene que causa dano à motilidade podem ser providos

268 / 353 de acordo com a construção da “toolbox alvo do cromossomo Y” inserida no genoma da célula.

[001541] Por exemplo, um método para modificar o gene que causa dano à motilidade no genoma de uma célula tendo um genoma, no qual a “toolbox alvo do cromossomo Y”, incluindo um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia, pode incluir uma provisão de um endonuclease guiada por RNA e gene que causa dano à motilidade na célula.

[001542] Em um outro exemplo, um método para a modificação do gene que causa dano à motilidade no genoma de uma célula tendo um genoma, no qual a “toolbox alvo do cromossomo Y” incluindo um elemento de controle de expressão que codifica polinucleotídeo, um polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA, e um polinucleotídeo que codifica um ácido nucleico guia é inserido, pode incluir uma provisão de condições e/ou um material que afeta o elemento de controle da expressão e o gene que causa dano à motilidade na célula.

[001543] A provisão do gene que causa dano à motilidade na célula pode incluir a introdução de um vetor plasmídico incluindo o gene que causa dano à motilidade na célula.

[001544] No caso em que o material que afeta o elemento de controle da expressão, a endonuclease guiada por RNA e/ou o gene que causa dano à motilidade é(são) provida(o)(s) para a célula, o ácido nucleico guia expressado na célula pode se ligar complementarmente ao polinucleotídeo, que pode ser presente apenas no cromossomo Y que é presente no genoma da célula. Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA que é injetada ou expressada pelo sistema de expressão da célula pode clivar o polinucleotídeo que pode estar presente apenas no cromossomo Y enquanto forma um complexo com o ácido nucleico guia. Neste caso, o gene que causa dano à motilidade pode ser modificado no polinucleotídeo, que pode estar presente apenas no cromossomo Y.

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[001545] Na presente divulgação, é provido um método para a produção de espermatozoides tendo um cromossomo Y no qual um gene que causa dano à motilidade é modificado em um gene SRY.

[001546] Por exemplo, um método para a produção de espermatozoides tendo um cromossomo Y no qual é modificado o gene que causa dano à motilidade pode incluir a injeção do material que afeta o elemento de controle da expressão, uma endonuclease guiada por RNA e/ou gene que causa dano à motilidade a um órgão reprodutor ou tecido reprodutor de um animal.

[001547] No órgão reprodutor ou tecido reprodutor de um animal macho tendo um cromossomo Y no qual o gene que causa dano à motilidade é modificado, espermatozoides tendo um cromossomo Y no qual o gene que causa dano à motilidade é modificado, podem ser produzidos.

[001548] Em um outro exemplo, um método para a produção de espermatozoides tendo um cromossomo Y no qual o gene que causa dano à motilidade é modificado pode incluir uma provisão direta, para um espermatozoide, do material que afeta o elemento de controle da expressão, uma endonuclease guiada por RNA e/ou gene que causa dano à motilidade descrita(o) acima.

[001549] Os espermatozoides tendo um cromossomo Y no qual o gene que causa dano à motilidade é modificado, obtidos pelos métodos descritos acima, podem ter motilidade reduzida e, como um resultado, esses espermatozoides podem ter uma dificuldade relativa na fertilização com óvulos, em comparação com o espermatozoide. tendo um cromossomo X.

[001550] Nesse caso, a probabilidade de produzir um zigoto e/ou embrião com um cromossomo XX é maior que a probabilidade de produzir um zigoto e/ou embrião com um cromossomo XY e, como um resultado, o indivíduo do sexo feminino tendo um cromossomo XX pode ser produzido.

2. Seleção do sexo por modificação do gene da proteína fluorescente no cromossomo X e no cromossomo Y

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[001551] Um método para a seleção de um sexo de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação pode incluir a realização de modificação de cada tipo diferente de um gene da proteína fluorescente, para um sítio adjacente ao gene que é presente especificamente no cromossomo X e no cromossomo Y de um indivíduo, respectivamente.

[001552] A seguir, a construção da toolbox, que é usada para a modificação de um gene da proteína fluorescente em um sítio adjacente a um gene que é presente especificamente no cromossomo X e no cromossomo Y, respectivamente, e o mecanismo de operação da toolbox em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox é inserida é descrito. 2-1. Toolbox para modificação do gene da proteína fluorescente no cromossomo X e no cromossomo Y

[001553] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas na presente divulgação, é provida uma toolbox (doravante, toolbox de classificação do cromossomo XY) para a modificação de cada gene da proteína fluorescente diferente em um primeiro sítio alvo, que é adjacente a um gene presente especificamente no cromossomo X de um animal, e em um segundo sítio alvo, que é adjacente a um gene presente especificamente no cromossomo Y.

[001554] Para maior conveniência das explicações, a seguir, assume-se que um gene presente especificamente no cromossomo X é um gene DAX, e assume-se que um gene que é presente especificamente no cromossomo Y seja um gene SRY.

[001555] Por exemplo, na toolbox de classificação do cromossomo XY, um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR. O primeiro ácido nucleico guia inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do primeiro sítio alvo e o segundo ácido

271 / 353 nucleico guia inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do segundo sítio alvo.

[001556] O primeiro sítio alvo é um polinucleotídeo adjacente a um gene DAX e o segundo sítio alvo é um polinucleotídeo adjacente a um gene SRY.

[001557] Em um outro exemplo, na toolbox de classificação do cromossomo XY, um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia, um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia e um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA podem ser incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda ITR sequência. Nesse caso, a toolbox pode incluir um elemento de controle de expressão que controla a expressão de uma endonuclease guiada por RNA.

[001558] O primeiro ácido nucleico guia inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do primeiro sítio alvo e o segundo ácido nucleico guia inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do segundo sítio alvo.

[001559] De acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, uma célula incluindo um genoma no qual a toolbox de classificação do cromossomo XY é inserida pode ser provida. A célula pode ser um(a) célula somática, gameta ou célula-tronco.

[001560] Adicionalmente, de acordo com algumas formas de realização de exemplo providas pela presente divulgação, pode ser provido um zigoto e/ou embrião que inclui um genoma no qual a toolbox de classificação do cromossomo XY é inserida.

[001561] A FIG. 20 (a) ilustra uma forma na qual a toolbox de classificação do cromossomo XY é inserida no genoma de um animal.

[001562] A FIG. 20 (b) ilustra um gene DAX (421) e um gene SRY (431), que são genes endógenos presentes no genoma no qual a toolbox de classificação do cromossomo XY é inserida e um sítio alvo (420) adjacente ao gene DAX o sítio alvo (430) que é adjacente ao gene SRY.

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[001563] A toolbox de classificação do cromossomo XY (370) pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA (373), um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia (375), e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia (377) entre um primeiro Sequência de ITR (371) e uma segunda sequência de ITR (379).

[001564] A toolbox (370) inclui um polinucleotídeo (372) que codifica um promotor induzível que controla a expressão de uma endonuclease guiada por RNA. Para conveniência da explicação, presume-se que o promotor induzível seja um promotor Tet-on. Adicionalmente, a toolbox (370) pode incluir adicionalmente um promotor (374) que controla a expressão do primeiro ácido nucleico guia e um promotor (376) que controla a expressão do segundo ácido nucleico guia.

[001565] O polinucleotídeo que codifica o primeiro ácido nucleico guia (375) inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do primeiro sítio alvo (420), que é adjacente a um gene DAX (421), e o polinucleotídeo que codifica o segundo ácido nucleico guia (377) inclui uma sequência que é igual a, ou complementar à, parte da sequência do segundo sítio alvo (430), que é adjacente a um gene SRY (431).

[001566] A seguir, um método para a modificação de um primeiro gene da proteína fluorescente para um primeiro sítio alvo adjacente a um gene DAX e a modificação de um segundo gene da proteína fluorescente para um segundo sítio alvo adjacente a um gene SRY no genoma no qual a toolbox de classificação do cromossomo XY é inserida, e um método para selecionar o sexo de cada indivíduo, são descritos. 2-2. Método para modificação do gene da proteína fluorescente no cromossomo X e no cromossomo Y e método para seleção de sexo

[001567] Um método para a modificação de um gene da proteína fluorescente em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox, que inclui um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia e um

273 / 353 polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia, é inserida pode incluir uma provisão de um RNA endonuclease guiada, um primeiro gene da proteína fluorescente, e um segundo gene da proteína fluorescente na célula.

[001568] Um método para a modificação de um gene da proteína fluorescente em uma célula tendo um genoma no qual uma toolbox, que inclui um polinucleotídeo que codifica um elemento de controle de expressão, um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, um polinucleotídeo que codifica um primeiro ácido nucleico guia, e um polinucleotídeo que codifica um segundo ácido nucleico guia, é inserida pode incluir uma provisão de um material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão, um primeiro gene da proteína fluorescente, e um segundo gene da proteína fluorescente na célula.

[001569] Nesse caso, a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do primeiro gene da proteína fluorescente podem incluir uma sequência igual à parte da sequência do primeiro sítio alvo, e as extremidades 5’ e 3’ do segundo gene da proteína fluorescente podem incluir uma sequência igual à parte da sequência do segundo sítio alvo.

[001570] A introdução do primeiro gene da proteína fluorescente e um segundo gene da proteína fluorescente na célula pode incluir a introdução de um vetor não viral (por exemplo, vetor plasmídico) ou vetor viral, que inclui o primeiro gene da proteína fluorescente e um segundo gene da proteína fluorescente, na célula.

[001571] A seguir, um mecanismo para a modificação do primeiro gene da proteína fluorescente em um primeiro sítio alvo presente no genoma de uma célula e um mecanismo para a modificação do segundo gene da proteína fluorescente no segundo sítio alvo presente no genoma da célula serão ser descrito mais especificamente, com referência à FIG. 20.

[001572] A FIG. 20 (c) ilustra a forma de um genoma no qual o primeiro gene da proteína fluorescente (423) é modificado no primeiro sítio alvo (420)

274 / 353 e o segundo gene da proteína fluorescente (433) é modificado no segundo sítio alvo (430), e um processo de expressão da fluorescência por modificação.

[001573] O primeiro ácido nucleico guia pode ser expressado em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox de classificação do cromossomo XY (370) é inserida, por um polinucleotídeo (374) que codifica um promotor que está incluído na toolbox de classificação do cromossomo XY (370). Nesse caso, o primeiro ácido nucleico guia pode se ligar especificamente ao primeiro sítio alvo (420). Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA, que é expressada pela operação do promotor Tet-on devido ao tratamento da tetraciclina, pode clivar o primeiro sítio alvo (420), e o primeiro gene da proteína fluorescente (423) pode ser inativado para o primeiro sítio alvo (420). Em particular, o primeiro sítio alvo (420) pode ser dividido em uma primeira região (420 (a)) e uma segunda região (420 (b)).

[001574] Adicionalmente, o segundo ácido nucleico guia pode ser expressado na célula por um polinucleotídeo que codifica um promotor (376) incluído na toolbox de classificação do cromossomo XY (370), e o segundo ácido nucleico guia pode se ligar complementarmente ao segundo sítio alvo (430). Adicionalmente, a endonuclease guiada por RNA, que é expressada pela operação do promotor Tet-on devido ao tratamento da tetraciclina, pode clivar o segundo sítio alvo (430), e o segundo gene da proteína fluorescente (433) pode ser inativado para o segundo sítio alvo (430). Em particular, o segundo sítio alvo (430) pode ser dividido em uma primeira região (430 (a)) e uma segunda região (430 (b)).

[001575] A seguir, como descrito acima, um método para selecionar o sexo de um embrião e/ou indivíduo via modificação de um primeiro gene da proteína fluorescente e um segundo gene da proteína fluorescente, é descrito.

[001576] Por exemplo, um método para selecionar o sexo por modificação de um primeiro gene da proteína fluorescente e um segundo gene da proteína fluorescente pode incluir a injeção de um material e/ou condições

275 / 353 que afeta(m) o elemento de controle de expressão, uma endonuclease guiada por RNA, um primeiro gene da proteína fluorescente e/ou um segundo gene proteico fluorescente para um tecido reprodutor e/ou órgão reprodutor de um indivíduo de sexo masculino tendo um genoma no qual a toolbox acima descrita é modificada (ver FIG. 20).

[001577] No caso em que o primeiro gene da proteína fluorescente (423) e/ou o segundo gene da proteína fluorescente (433) são modificados no tecido reprodutor e/ou órgão reprodutor do indivíduo de sexo masculino, um primeiro espermatozoide (520) tendo um cromossomo X, no qual o primeiro gene da proteína fluorescente (423) é inativado e um segundo espermatozoide (530) tendo um cromossomo Y no qual o segundo gene da proteína fluorescente (433) é inativado pode ser produzido a partir do indivíduo do sexo masculino.

[001578] No caso em que o primeiro espermatozoide (520) e o óvulo do tipo selvagem (500) são fertilizados, um primeiro embrião (521) tendo um genoma no qual um primeiro gene da proteína fluorescente é modificado pode ser produzido. No primeiro embrião (521), uma primeira proteína fluorescente pode ser expressada. Nesse caso, uma primeira fluorescência (523) pode ser desenvolvida a partir do primeiro embrião pela expressão da primeira proteína fluorescente, e um sinal de fluorescência pode ser provido para o exterior da célula de acordo com o desenvolvimento da fluorescência.

[001579] No caso em que o segundo espermatozoide (530) e o óvulo do tipo selvagem (500) são fertilizados, um segundo embrião (531) tendo um genoma no qual um segundo gene da proteína fluorescente é modificado pode ser produzido. No segundo embrião (531), uma segunda proteína fluorescente pode ser expressada. Nesse caso, uma segunda fluorescência (533) pode ser desenvolvida a partir do segundo embrião pela expressão da segunda proteína fluorescente, e um sinal de fluorescência pode ser provido para o exterior da célula de acordo com o desenvolvimento da fluorescência.

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[001580] Ou seja, sinais de fluorescência diferentes um do outro podem ser providos a partir do primeiro embrião tendo um genoma no qual o primeiro gene da proteína fluorescente é modificado, e do segundo embrião tendo um genoma no qual o segundo gene da proteína fluorescente é modificado, e como resultado, o embrião (521) tendo cromossomo XX e o embrião (531) tendo cromossomo XY podem ser distinguidos um do outro.

[001581] Em um outro exemplo, um método para selecionar o sexo por modificação de um primeiro gene da proteína fluorescente e um segundo gene da proteína fluorescente pode incluir uma microinjeção (MI) do(as) material e/ou condições que afeta(m) o elemento de controle de expressão, uma endonuclease guiada por RNA, um primeiro gene da proteína fluorescente e/ou um segundo gene da proteína fluorescente em um zigoto no momento da fertilização de um gameta tendo um genoma no qual a toolbox descrita acima é modificada.

[001582] Nesse caso, um embrião no qual o primeiro gene da proteína fluorescente (423) ou o segundo gene da proteína fluorescente (433) é modificado, pode ser produzido.

[001583] Como descrito acima, proteínas fluorescentes mutuamente diferentes podem ser expressadas em um embrião tendo um genoma no qual o primeiro gene da proteína fluorescente é modificado, e em um embrião tendo um genoma no qual o segundo gene da proteína fluorescente é modificado. Nesse caso, um embrião tendo um cromossomo XX pode ser distinguido de um embrião tendo o cromossomo XY usando um sinal de fluorescência.

[001584] Quando os embriões selecionados pelos métodos acima são implantados no útero de uma mãe de substituição, indivíduos com o sexo desejado, podem ser produzidos.

[001585] O uso do método acima descrito tem vantagens em que as proteínas fluorescentes podem ser expressadas em um embrião em uma fase relativamente precoce, permitindo assim uma seleção mais rápida e

277 / 353 implantação mais segura do embrião rapidamente selecionado no útero de uma mãe de substituição. [Sistema de excisão de toolbox]

1. Construção do sistema de excisão de toolbox

[001586] Uma toolbox de excisão pode ser provida de acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação. A toolbox de excisão inclui um “componente para excisão de toolbox”. O “componente para excisão de toolbox” refere-se a uma construção incluindo um polinucleotídeo que permite expressar um elemento, que é capaz de excisar a toolbox de um genoma no qual a toolbox é inserida.

[001587] A toolbox de excisão pode incluir um polinucleotídeo que codifica os componentes de uma nuclease manipulada. Para conveniência da explicação, supõe-se que um polinucleotídeo que codifique uma endonuclease guiada por RNA seja incluído na toolbox de excisão.

[001588] A seguir, vários tipos de construção de uma toolbox de excisão, métodos para preparar as toolboxes de excisão, e mecanismos pelos quais vários tipos de toolboxes de excisão são excisadas de um genoma sob condições particulares, são mais especificamente divulgados. 1-1. Estrutura de genoma no qual a toolbox, tendo construção habilitando a expressão de polinucleotídeo que codifica a transposase em condições particulares, é inserida

[001589] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox de excisão, na qual a expressão de uma transposase é controlada por um promotor induzível e/ou promotor tecido- específico, pode ser provida. A toolbox de excisão pode ser preparada por inserção ou excisão via recombinação sítio-específica.

[001590] A seguir, quando a toolbox de excisão for produzida pela inserção por recombinação sítio-específica, será descrito o método de construção e produção da toolbox de excisão.

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[001591] Por exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível e um polinucleotídeo que codifica uma transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção 5’ para 3’.

[001592] Em um outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido- específico e um polinucleotídeo que codifica uma transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção 5’ para 3’.

[001593] Em ainda um outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível, um polinucleotídeo que codifica uma primeira transposase, um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico e um polinucleotídeo que codifica uma segunda transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção de 5’ a 3’.

[001594] A FIG. 21 ilustra uma forma de realização de uma toolbox de excisão na qual a expressão de uma transposase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[001595] A toolbox de excisão (700 (b)) pode ter uma constituição na qual um componente (700 (c)) para a excisão de toolbox é incluído entre uma primeira sequência de ITR (701) e uma segunda sequência de ITR (705). Adicionalmente, a toolbox de excisão (700 (b)) pode incluir adicionalmente um ou mais sítios de reconhecimento de recombinase.

[001596] O componente (700 (c)) para a excisão de toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (707), um polinucleotídeo que codifica uma primeira transposase (704), um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico (709) e um polinucleotídeo que codifica uma segunda transposase (706). Neste caso, o polinucleotídeo que codifica a primeira transposase (704) e o polinucleotídeo

279 / 353 que codifica a segunda transposase (706) podem ter a mesma sequência. A primeira transposase e a segunda transposase podem interagir com a primeira sequência de ITR (701) e com a segunda sequência de ITR (705).

[001597] A seguir, é descrito um método para preparar a toolbox de excisão (700 (b)).

[001598] Um método para preparar a toolbox de excisão (700 (b)) pode incluir uma provisão de uma recombinase e o componente (700 (c)) para a excisão de toolbox em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox (700 (a)) é inserida.

[001599] A recombinase pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (703), que é incluído na toolbox (700 (a)), e o sítio de reconhecimento de recombinase (702), que é incluído no componente (700 (c)) para a excisão de toolbox.

[001600] O método para prover a recombinase foi descrito acima e, portanto, os detalhes específicos sobre o mesmo serão omitidos na presente invenção.

[001601] Pode haver vários métodos para prover o componente (700 (c)) para a excisão de toolbox em uma célula. Por exemplo, o componente para a excisão de toolbox pode ser provido em uma célula, introduzindo um vetor plasmídico, que inclui o componente para a excisão de toolbox, na célula.

[001602] Como descrito acima, a recombinase provida na célula pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (703), que é incluído na toolbox (700 (a)), e o sítio de reconhecimento de recombinase (702), que é incluído no componente para a excisão de toolbox; e o componente para a excisão de toolbox pode ser inserido em uma localização do sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (703) da toolbox (700 (a)). Com base no acima exposto, a toolbox de excisão (700 (b)) que habilita a expressão de uma transposase sob condições particulares pode ser preparada.

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[001603] A seguir, será descrita uma construção de uma toolbox de excisão, que é produzida pela excisão de um códon de parada por meio de recombinação sítio-específica, e um método para produzir a mesma será descrito.

[001604] Por exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível, um sítio de reconhecimento de recombinase, e um polinucleotídeo que codifica uma transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção 5’ para 3’.

[001605] Em um outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido- específico, um sítio de reconhecimento de recombinase, e um polinucleotídeo que codifica uma transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR em uma direção 5’ para 3’ .

[001606] Em ainda um outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível, um sítio de reconhecimento de recombinase, um polinucleotídeo que codifica uma primeira transposase, um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico, um sítio de reconhecimento de recombinase, e um polinucleotídeo que codifica uma segunda transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção 5’ a 3’.

[001607] A FIG. 22 ilustra outra forma de realização de uma toolbox de excisão, na qual a expressão de uma transposase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[001608] A toolbox da toolbox de excisão (800 (b)) pode ter uma constituição na qual o componente para a excisão de toolbox é incluído entre uma primeira sequência de ITR (801) e uma segunda sequência de ITR (808).

[001609] O componente para a excisão de toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (802), um primeiro sítio

281 / 353 de reconhecimento de recombinase (803 (b)), um polinucleotídeo que codifica uma primeira transposase (804), um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico (805 ), um segundo sítio de reconhecimento de recombinase (806 (b)), e um polinucleotídeo que codifica uma segunda transposase (807). O polinucleotídeo que codifica a primeira transposase (804) e o polinucleotídeo que codifica a segunda transposase (807) podem ser da mesma sequência. A primeira transposase e a segunda transposase podem interagir com a primeira sequência de ITR (801) e a segunda sequência de ITR (808).

[001610] Adicionalmente, o primeiro sítio de reconhecimento de recombinase (803 (b)) e o segundo sítio de reconhecimento de recombinase (806 (b)) podem ser da mesma sequência.

[001611] A seguir, é descrito um método para preparar a toolbox de excisão (800 (b)).

[001612] Um método para preparar a toolbox de excisão (800 (b)) pode incluir uma provisão de uma recombinase para uma célula tendo um genoma no qual a toolbox (800 (a)) é inserida.

[001613] A recombinase provida na célula pode interagir com os sítios de reconhecimento de recombinase (RRSs) que constituem um primeiro RSR (803 (a)) e um segundo RSR (806 (a)) que estão incluídos na toolbox (800 (a)). O primeiro RSR (803 (a)) e o segundo RSR (806 (a)) podem ser da mesma sequência.

[001614] Como descrito acima, o códon de parada pode ser excluído quando a recombinase provida na célula interage com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) que constitui o primeiro RSR (803 (a)) e o segundo RSR (806 (a)).

[001615] Com base no exposto, pode ser produzida a toolbox de excisão 800 (b), na qual uma transposase pode ser expressada em condições particulares.

282 / 353 1-2. Estrutura do genoma no qual a toolbox, tendo construção habilitando a expressão do polinucleotídeo que codifica a recombinase em condições particulares, é inserida

[001616] De acordo com algumas formas de realização de exemplo da presente divulgação, uma toolbox de excisão, na qual a expressão de uma recombinase é controlada por um promotor induzível e/ou promotor tecido- específico, pode ser provida.

[001617] Por exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível, um polinucleotídeo que codifica uma recombinase, um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo e um polinucleotídeo que codifica um RSR, e um polinucleotídeo que codifica um RSR e um polinucleotídeo que codifica uma transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção de 5’ a 3’.

[001618] Em um outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido- específico, um polinucleotídeo que codifica uma recombinase, um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um RSR, e um polinucleotídeo que codifica uma RSR são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção de 5’ a 3’.

[001619] Ainda em outro exemplo, a toolbox de excisão pode ter uma constituição na qual um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível; um polinucleotídeo que codifica uma recombinase, um polinucleotídeo que codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um RSR, e um polinucleotídeo que codifica uma primeira transposase, um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico, um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico, um polinucleotídeo que codifica um promotor específico, um polinucleotídeo que

283 / 353 codifica um promotor constitutivo, um polinucleotídeo que codifica um promotor o polinucleotídeo que codifica um RSR, e um polinucleotídeo que codifica uma segunda transposase são incluídos entre uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR na direção 5’ a 3’.

[001620] A FIG. 23 ilustra uma forma de realização de uma toolbox de excisão na qual a expressão de uma recombinase pode ser controlada por um promotor induzível e um promotor tecido-específico.

[001621] A toolbox de excisão (900 (b)) pode ter uma constituição na qual um componente para a excisão de toolbox é incluído entre uma primeira sequência de ITR (901) e uma segunda sequência de ITR (906).

[001622] O componente para a excisão de toolbox pode incluir um polinucleotídeo que codifica um promotor induzível (908), um polinucleotídeo que codifica uma primeira recombinase (909), um polinucleotídeo que codifica um promotor tecido-específico (910), um polinucleotídeo que codifica uma segunda recombinase (911), um polinucleotídeo que codifica um promotor (903), um polinucleotídeo que codifica um RSR (904) e um polinucleotídeo que codifica uma transposase (905). Adicionalmente, o componente para a excisão de toolbox pode incluir adicionalmente um ou mais sítios de reconhecimento de recombinase (RRSs).

[001623] O polinucleotídeo que codifica a primeira recombinase (909) e o polinucleotídeo que codifica a segunda recombinase (911) têm a mesma sequência. A primeira recombinase e a segunda recombinase podem interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), que constitui o polinucleotídeo que codifica o RSR (904).

[001624] A seguir, é descrito um método para preparar a toolbox de excisão 900 (b).

[001625] Um método para preparar a toolbox de excisão (900 (b)) pode incluir uma provisão de uma terceira recombinase e o componente (900 (c))

284 / 353 para a excisão de toolbox em uma célula tendo um genoma no qual a toolbox (900 (a)) é inserida.

[001626] O método para prover a terceira recombinase e o componente (900 (c)) para a excisão de toolbox em uma célula foi descrito acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001627] A terceira recombinase provida na célula pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (902), que é incluído na toolbox (900 (a)), e o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS)(907), que é incluído no componente (900 (c)) para a excisão de toolbox, que é provida na célula.

[001628] Pelas interações acima, o componente (900 (c)) para a excisão de toolbox pode ser inserido na localização do sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) (902) da toolbox (900 (a)). Com base no exposto, a toolbox de excisão (900 (b)), na qual uma transposase pode ser expressada sob condições particulares, pode ser preparada.

2. Mecanismo de excisão usando a toolbox de excisão

[001629] A seguir, um mecanismo pelo qual a toolbox de excisão provida pela presente divulgação é excisada sob condições particulares é descrito.

[001630] Adicionalmente, o mecanismo pelo qual um polinucleotídeo doador que é modificado em um genoma é excisado do genoma por um material que é expressado da toolbox de excisão provida pela presente divulgação. 2-1. Mecanismo de excisão de toolbox de excisão 2-1-1. Mecanismo de excisão de toolbox de excisão tendo constituição na qual o polinucleotídeo que codifica a transposase pode ser expressado sob condições particulares

[001631] A presente divulgação provê uma explicação sobre o mecanismo de excisão de uma toolbox de excisão, na qual a expressão de uma transposase é controlada pelo promotor induzível e pelo promotor tecido- específico descritos acimas.

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[001632] Para conveniência da explicação, presume-se que o promotor induzível seja um promotor que possa ser operado em uma condição de baixa temperatura que pode ocorrer durante a etapa de replicação celular, e que o promotor tecido-específico seja considerado um promotor que pode ser ativado em um tecido reprodutor. O tecido reprodutor pode ser um testículo ou ovário.

[001633] A seguir, o mecanismo pelo qual a toolbox de excisão (700 (b)) é excisada do genoma de uma célula durante a etapa de replicação celular é descrito com referência à FIG. 21. Para conveniência das explicações, presume- se que a célula seja uma célula isolada.

[001634] Durante a etapa de replicação celular, uma condição de baixa temperatura pode ser aplicada à célula tendo um genoma no qual a toolbox de excisão descrita acima (700 (b)) é inserida. Em uma condição de baixa temperatura, o promotor induzível (707) pode ser operado, e uma primeira transposase pode ser expressada na célula pela operação do promotor induzível (707).

[001635] Quando a primeira transposase é expressada na célula, a primeira transposase pode interagir com a primeira sequência de ITR (701) e a segunda sequência de ITR (705) presentes no genoma da célula. Neste caso, a toolbox de excisão (700 (b)) pode ser excisada do genoma da célula.

[001636] Por conseguinte, durante a etapa na qual a célula tendo o genoma no qual a toolbox de excisão (700 (b)) é inserida, é replicada, a toolbox de excisão (700 (b)) pode ser excisada do genoma da célula. Nesse caso, uma célula replicada tendo o genoma no qual a toolbox de excisão (700 (b)) é inserida, não pode ser produzida.

[001637] Em seguida, um mecanismo pelo qual a toolbox de excisão (700 (b)) é excisada de um genoma em um tecido reprodutor, é descrito.

[001638] No tecido reprodutor acima descrito tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (700 (b)) é inserida, o promotor específico do tecido (709)

286 / 353 pode operar, e uma segunda transposase pode ser expressada no tecido reprodutor pela operação do promotor tecido-específico (709).

[001639] Quando a segunda transposase é expressada no tecido reprodutor, a segunda transposase pode interagir com a primeira sequência de ITR (701) e a segunda sequência de ITR (705), que estão presentes no genoma do tecido. Nesse caso, a toolbox de excisão (700 (b)) pode ser excisada do genoma do tecido reprodutor.

[001640] Ou seja, a toolbox de excisão (700 (b)) pode ser excisada do genoma de um tecido reprodutor. Por conseguinte, um gameta tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (700 (b)) está inserida não pode ser produzido a partir de um(a) célula e/ou animal tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (700 (b)) está inserida.

[001641] O mecanismo de excisão de toolbox de excisão (800 (b)) provido na presente divulgação é substancialmente o mesmo que a toolbox acima descrita (700 (b)) e, portanto, a explicação detalhada é omitida. 2-1-2. Mecanismo de excisão de toolbox de excisão tendo construção na qual o polinucleotídeo que codifica a recombinase pode ser expressado sob condições particulares

[001642] A presente divulgação provê uma explicação sobre o mecanismo de excisão de toolbox de excisão na qual a expressão de uma recombinase é controlada pelo promotor induzível e pelo promotor tecido- específico descrito acima. Para conveniência da explicação, a seguir, supõe-se que o promotor induzível seja um promotor que possa ser operado em uma condição de baixa temperatura que pode ocorrer durante a etapa de replicação celular, e que o promotor tecido-específico seja considerado um promotor que pode ser operado em um tecido reprodutor.

[001643] A seguir, o mecanismo pelo qual a toolbox de excisão (900 (b)) é excisada do genoma em uma etapa de replicação celular, é descrito.

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[001644] Durante a etapa de replicação celular, uma condição de baixa temperatura pode ser aplicada à célula tendo um genoma no qual a toolbox de excisão acima (900 (b)) é inserida. Em uma condição de baixa temperatura, o promotor induzível (908) pode ser operado, e uma primeira recombinase pode ser expressada na célula pela operação do promotor induzível (908).

[001645] A primeira recombinase expressada dentro da célula pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS), que constitui um polinucleotídeo que codifica um RSR (904) presente na toolbox de excisão (900 (b)). Neste caso, o códon de parada pode ser excisado do polinucleotídeo que codifica o RSR (904), e a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo que codifica a transposase (905) pode(m) ocorrer. Ou seja, a transposase pode ser expressada dentro da célula pela excisão do códon de parada.

[001646] A transposase expressada pode interagir com uma primeira sequência de ITR (901) e uma segunda sequência de ITR (906), que estão presentes no genoma da célula. Nesse caso, a toolbox de excisão (900 (b)) pode ser excisada do genoma da célula.

[001647] Por conseguinte, quando se tenta replicar células usando uma célula tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (900 (b)) é inserida, a toolbox de excisão (900 (b)) pode ser excisada do genoma da célula. Nesse caso, uma célula replicada tendo o genoma no qual a toolbox de excisão (900 (b)) é inserida não pode ser produzida.

[001648] Em seguida, o mecanismo pelo qual a toolbox de excisão (900 (b)) é excisada do genoma em um tecido reprodutor, é descrito.

[001649] No tecido reprodutor descrito acima tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (900 (b)) é inserida, o promotor específico do tecido (910) pode ser operado, e uma segunda recombinase pode ser expressada no tecido pela operação do promotor tecido-específico (910).

[001650] A segunda recombinase expressada no tecido reprodutor pode interagir com o sítio de reconhecimento de recombinase que constitui o

288 / 353 polinucleotídeo que codifica um RSR (904) presente na toolbox de excisão (900 (b)). Nesse caso, o códon de parada pode ser excisado do polinucleotídeo que codifica o RSR (904). A transposase pode ser expressada dentro da célula pela excisão do códon de parada.

[001651] A transposase expressada pode interagir com a primeira sequência de ITR (901) e a segunda sequência de ITR (906) que estão presentes no genoma da célula. Nesse caso, a toolbox de excisão (900 (b)) pode ser excisada do genoma do tecido reprodutor.

[001652] Ou seja, a toolbox de excisão (900 (b)) pode ser excisada no genoma de um tecido reprodutor. Por conseguinte, um gameta tendo o genoma no qual a toolbox de excisão 900 (b) é inserida não pode ser produzido a partir de um(a) célula e/ou animal tendo um genoma no qual a toolbox de excisão (900 (b)) é inserida. 2-2. Mecanismo de excisão da parte em que ocorreu a edição gênica

[001653] A seguir, um mecanismo pelo qual um polinucleotídeo doador, que é modificado em um genoma, é excisado do genoma pela transposase expressada a partir de uma toolbox de excisão, é descrito.

[001654] De acordo com a divulgação anterior, assumiu-se que a toolbox de excisão inclui um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA, e a modificação do polinucleotídeo doador pode ser devido à edição gênica usando a endonuclease guiada por RNA expressada a partir da toolbox de excisão.

[001655] O mecanismo pelo qual uma transposase é expressada a partir da toolbox de excisão sob condições particulares foi descrito acima e, portanto, a explicação específica sobre o mecanismo da expressão de uma transposase é omitida na presente invenção.

[001656] O polinucleotídeo doador que é modificado no genoma por edição gênica pode ser excisado do genoma pela transposase expressada na toolbox de excisão.

289 / 353

[001657] Por exemplo, quando o polinucleotídeo doador é modificado para dentro da toolbox de excisão, o polinucleotídeo doador pode ser excisado do genoma, excisando a toolbox de excisão pela transposase expressada na toolbox de excisão.

[001658] Em um outro exemplo, quando o polinucleotídeo doador é modificado para dentro de uma toolbox que não seja a toolbox de excisão, o polinucleotídeo doador pode ser excisado do genoma no caso em que o polinucleotídeo doador tem uma sequência de ITR, que pode interagir com a transposase expressada a partir da toolbox de excisão, nas extremidades 5’ e 3’ do polinucleotídeo doador.

[001659] Em ainda um outro exemplo, mesmo quando o polinucleotídeo doador é modificado em um endopolinucleotídeo, que não é uma toolbox, o polinucleotídeo doador pode ser excisado do genoma no caso em que o polinucleotídeo doador tem uma sequência de ITR, que pode interagir com a transposase expressada a partir da toolbox de excisão, nas extremidades 5’ e 3’ do polinucleotídeo doador.

3. Utilização da toolbox de excisão

[001660] A seguir, casos em que a construção da toolbox precisa ser alterada para uma toolbox de excisão, são descritos. Ou seja, o aspecto da utilização da toolbox de excisão, é descrito.

[001661] Para conveniência das explicações, a seguir, assume-se que um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA seja incluído em uma toolbox.

[001662] No caso em que uma pessoa habilitada na técnica, que produziu células tendo um genoma no qual a toolbox é inserida, vende células e/ou animais tendo um genoma no qual a toolbox é inserida a terceiros, é descrito que adquiriram a(o)s células e/ou animais da pessoa habilitada pode obter a endonuclease guiada por RNA expressada a partir da(o)s células e/ou animais. Nesse caso, a aquisição da endonuclease guiada por RNA expressada a partir

290 / 353 de células e/ou animais por terceiros pode ser considerada um benefício legítimo.

[001663] Adicionalmente, quando a pessoa habilitada na técnica vende a(o)s células e/ou animais tendo um genoma, no qual um polinucleotídeo doador é modificado no genoma da célula usando a toolbox, terceiros que compraram a(o)s células e/ou animais podem obter o RNA e/ou a proteína doador(a) a partir da(o)s células e/ou animais. O RNA e/ou a proteína doador(a) é um que é expressado pela transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo doador. Nesse caso, a aquisição do(a) RNA e/ou proteína doador(a) a partir de células e/ou animais adquiridos por terceiros pode ser considerada um benefício legítimo.

[001664] Além da aquisição da endonuclease guiada por RNA, o RNA doador e/ou a proteína doadora expressado(a) a partir da(o)s células e/ou animais, qualquer terceiro que tenha adquirido a(o)s células e/ou animais pode ter um benefício ilegítimo usando as células adquiridas e/ou animais.

[001665] Por exemplo, um exemplo de que qualquer terceiro que adquiriu as células tendo um genoma no qual a toolbox é inserida pode ter um benefício adicional ilegítimo pode incluir casos em que o terceiro está envolvido em uma produção ou venda em larga escala das células tendo um genoma no qual a toolbox e/ou o polinucleotídeo doador(a) é inserida(o), por replicação das células.

[001666] Em um outro exemplo, um exemplo de que qualquer terceiro que tenha adquirido gametas tendo um genoma no qual a toolbox é inserida pode ter um benefício adicional ilegítimo pode incluir casos em que terceiros estão envolvidos na produção de indivíduos tendo um genoma no qual a(o) toolbox e/ou polinucleotídeo doador(a) é inserida(o) por fertilização in vitro usando os gametas.

[001667] Em ainda um outro exemplo, um exemplo em que qualquer terceiro que adquiriu animais tendo um genoma no qual a toolbox é inserida

291 / 353 pode ter um benefício ilegítimo adicional pode incluir casos em que o terceiro está envolvido na produção ou venda de gametas tendo um genoma no qual a qual a(o) toolbox e/ou polinucleotídeo doador(a) é inserida(o), usando o animal.

[001668] Em ainda um outro exemplo, um exemplo em que qualquer terceiro que adquiriu animais tendo um genoma no qual a toolbox é inserida pode ter um benefício adicional ilegítimo pode incluir casos em que o terceiro está envolvido na produção ou venda de descendentes tendo um genoma no qual a(o) toolbox e/ou polinucleotídeo doador(a) é inserida(o), usando o animal.

[001669] Como descrito acima, como medida de salvaguarda para impedir que terceiros que adquiriram a(o)s células e/ou animais tenham um benefício adicional ilegítimo, é possível que uma pessoa habilitada na técnica possa vender, a terceiros, a(o)s células e/ou animais tendo um genoma no qual o polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserido, após alterar a construção da toolbox para a construção da toolbox de excisão.

[001670] A seguir, o mecanismo e os efeitos do mesmo nos casos em que a construção da toolbox foi alterada para a construção da toolbox de excisão, são descritos.

[001671] Para conveniência da explicação, a seguir, apenas o mecanismo de excisão e os efeitos da toolbox de excisão são descritos, mas isso também pode ser aplicado ao polinucleotídeo doador da mesma maneira.

[001672] No caso de uma pessoa habilitada na técnica vender a(o)s células e/ou animais tendo um genoma no qual a toolbox de excisão é inserida, se qualquer terceiro que adquiriu a(o)s células e/ou animais tentar obter um benefício adicional ilegítimo, como descrito acima, a toolbox de excisão pode ser excisada do genoma da(o)s células e/ou animais.

[001673] Por exemplo, se qualquer terceiro que adquiriu as células tendo um genoma no qual a toolbox de excisão é inserida tenta replicar as células, o

292 / 353 promotor induzível incluído na toolbox de excisão pode ser operado e então uma transposase pode ser expressada, e como um resultado, a toolbox de excisão pode ser excisada do genoma da célula.

[001674] Em um outro exemplo, no caso em que qualquer terceiro, que adquiriu animais tendo um genoma no qual a toolbox de excisão é inserida, tenta produzir gametas usando os animais, uma transposase pode ser expressada no tecido pela atividade do promotor tecido-específico no mesmo, e como um resultado, gametas nos quais a toolbox de excisão é excisada podem ser produzidos.

[001675] Ainda em um outro exemplo, no caso em que qualquer terceiro, que adquiriu animais tendo um genoma no qual a toolbox de excisão é inserida, tenta produzir descendentes usando os animais, uma transposase pode ser expressada em um tecido reprodutor pela atividade do promotor tecido- específico no mesmo, e, como um resultado, um descendente no qual a toolbox de excisão é excisada, pode ser produzido.

[001676] Ou seja, para impedir que terceiros que adquiriram a(o)s células e/ou animais tendo um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA é inserido, tenham um benefício adicional ilegítimo, uma pessoa habilitada na técnica pode alterar o construção da toolbox para a construção da toolbox de excisão. [Exemplo Experimental 1] Preparação de embrião transgênico tendo genoma no qual o gene da proteína alvo é inserido usando transferência nuclear de células somáticas

[001677] Os presentes inventores conduziram o seguinte experimento de modo a inserir o gene da proteína alvo no genoma bovino.

[001678] Para confirmar visualmente a inserção do gene da proteína alvo, os presentes inventores selecionaram um gene da proteína fluorescente como proteína alvo e conduziram o experimento, e prepararam uma toolbox incluindo

293 / 353 o gene da proteína fluorescente e prepararam um zigoto bovino incluindo a toolbox preparada pelo método de SCNT.

1. Preparação do vetor da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo

[001679] Para preparar um vetor de expressão final, incluindo uma toolbox na qual um gene da proteína fluorescente verde e um gene da proteína fluorescente vermelha são incluídos, a proteína fluorescente verde e o gene da proteína fluorescente vermelha foram amplificados usando a clonagem por PCR no Gateway (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100 Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

[001680] Os iniciadores de PCR usados para a amplificação do gene da proteína fluorescente verde e do gene da proteína fluorescente vermelha são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[001681] No presente relatório descritivo, o número de sequência é expressado como SEQ ID NO. [Tabela 2] Tipo de Iniciador Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência GgggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcAC GFP-Direta pr_GFP_F_1 SEQ ID NO:1 CATGGCCAGCAAAGGAGAAGA

ACTT GgggaccactttgtacaagaaagctgggtcTTA GFP-Inversa pr_GFP_R_1 SEQ ID NO:2

TTTGTAGAGCTCATCCATGCC GgggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcAC RFP-Direta pr_RFP_F_1 SEQ ID NO:3 CATGGATAGCACTGAGAACGTC

AT ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCTA RFP-Inversa pr_RFP_R_1 SEQ ID NO:4

CTGGAACAGGTGGTGGC

[001682] Os presentes inventores prepararam um vetor de expressão final usando o gene da proteína fluorescente verde e/ou gene da proteína fluorescente vermelha amplificado.

[001683] A FIG. 24 (a) ilustra parte do vetor de expressão final para a expressão da proteína fluorescente verde e a FIG. 24 (b) ilustra parte do vetor de expressão final para a expressão da proteína fluorescente vermelha.

294 / 353

[001684] Para a preparação do vetor de expressão final, o pDonor (Invitrogen) foi usado como vetor de entrada, e o vetor PB-CA (com um promotor p-CCAGG) e o vetor PB-TET (com um promotor Tet-on) foram usados como o vetor de destino.

[001685] As sequências de piggyBac (PB) usadas neste exemplo experimental são mostradas na tabela 3 abaixo. [Tabela 3] Tipo de Nome da SEQ ID NO Sequência Transposon SEQ

TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCA TGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCG CGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGGACATCTCAGTCGC

CGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGG PB 5’ tp_PB_1 SEQ ID NO:5 TAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGA

GTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTA AGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCATGTT CTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTT ATAGATATC TTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTT TTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGA

ATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTT PB 3’ tp_PB_2 SEQ ID NO:6 AATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAG

ACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTAT CTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTT AA

2. Preparação de embrião clonado (SCNT) 2-1. Isolamento de células bovinas

[001686] Os presentes inventores isolaram fibroblastos de um feto bovino, de modo a inserir uma toolbox incluindo um gene de proteína alvo no genoma.

[001687] O tecido fetal bovino no 45º dia de gestação foi picado usando uma lâmina cirúrgica e dissociado a 37C por 1 hora usando o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), ao qual 25% (p/v) de tripsina e EDTA 1 mM (Invitrogen) foram adicionados.

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[001688] As células tratadas com tripsina foram centrifugadas a 1.500 rpm por 2 min, lavadas uma vez com DPBS sem Ca2+ e Mg2+ e semeadas em uma placa de cultura plástica de 100 mm.

[001689] As células semeadas foram cultivadas em meio DMEM, ao qual foram adicionados 10% (v/v) de FBS, glutamina 1 mM, NaHCO3 25 mM, 1% (v/v) de meio essencial mínimo (MEM) a 39C sob condições de atmosfera umidificada de CO2 a 5% e ar a 95% por 6 a 8 dias.

[001690] Após a remoção das células soltas e um pedaço de cortes das células semeadas, as células presas foram cultivadas para ter uma confluência entre si na placa de cultura, e adicionalmente cultivadas mais em intervalos de 4 a 6 dias por tripsinização por 5 min usando tripsina a 0,1% e EDTA a 0,02%. As células cultivadas foram dispensadas em 3 novas placas de cultura para posterior subcultura e depois armazenadas em meio de congelamento em nitrogênio líquido a -196C. 2-2. Transfecção com vetor de toolbox

[001691] Os presentes inventores descongelaram as células que foram armazenadas pelo método acima, cultivadas por 3 a 4 dias, e recuperaram fibroblastos da camada única usando tripsina, e prepararam células doadoras para SCNT usando os fibroblastos recuperados.

[001692] Antes de cerca de 18 a 24 horas para transfecção, os fibroblastos recuperados foram dispensados em placas de 6 poços. Quando as células atingiram cerca de 50-60% de confluência, a transfecção prosseguiu para os fibroblastos de acordo com o método do fabricante conhecido.

[001693] O vetor plasmídico (PB-CA-GFP) contendo um gene da proteína fluorescente verde, e o vetor pCy43 (vetor de expressão da transposase, Sanger Institute, Hinxton, Reino Unido) foram transfectados para os fibroblastos recuperados e, em seguida, uma célula doadora na qual uma proteína fluorescente verde é expressada (doravante, célula doadora de GFP), foi preparada.

296 / 353

[001694] Adicionalmente, o vetor plasmídico (PB-TET-RFP) contendo um gene da proteína fluorescente vermelho e o vetor pCy43 (vetor de expressão transposase, Sanger Institute, Hinxton, Reino Unido) foram transfectados para os fibroblastos recuperados e, em seguida, uma célula doadora na qual um vermelho proteína fluorescente é expressada (doravante, célula doadora de RFP) foi preparada.

[001695] O vetor pCy43 foi usado para a transposição de PB-CA-GFP ou PB-TET-RFP.

[001696] A expressão de uma proteína fluorescente verde foi confirmada na célula doadora de GFP preparada pelo método acima.

[001697] A FIG. 25 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente verde na célula doadora de GFP (ver FIG. 25 (a), esquerda: condição de luz visível, direita: condição de luz fluorescente).

[001698] Adicionalmente, quando as células doadoras de RFP preparadas pelo método acima foram tratadas com doxiciclina (2 mg/mL) e neomicina (1 mg/mL), a expressão da proteína fluorescente vermelha foi confirmada, e o desaparecimento da expressão de RFP foi confirmado em 8º dia após a remoção de doxiciclina.

[001699] A FIG. 25 (b) mostra a expressão de uma proteína fluorescente vermelha quando as células doadoras de RFP foram tratadas com doxiciclina e neomicina (ver FIG. 25 (b) (b-1), topo: condição de luz visível, fundo: condição de luz fluorescente), e mostra o desaparecimento da expressão de RFP no 8º dia após a remoção da doxiciclina (ver FIG. 25 (b) (b-2), topo: condição de luz visível, fundo: condição de luz fluorescente).

[001700] A partir dos resultados acima, foi confirmado que o tempo de expressão da proteína fluorescente vermelha pode ser controlado por tratamento com doxiciclina quando o promotor Tet-on é usado.

[001701] Em outras palavras, foi confirmado que, quando um promotor induzível (por exemplo, promotor Tet-on) é usado como um elemento de

297 / 353 controle de expressão, o promotor induzível pode ser operado através do tratamento com as condições ou o material que pode ativar o promotor induzível (por exemplo, doxiciclina) e que a transcrição e/ou tradução da proteína alvo possa ser controlada pela operação do promotor induzível em tempo hábil.

[001702] Através da confirmação da presença da expressão de uma proteína fluorescente, foram selecionadas células doadoras tendo um genoma no qual o gene da proteína alvo foi inserido, e embriões transgênicos foram produzidos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) usando as células doadoras selecionadas 2-3. Preparação de embrião clonado usando célula doadora (SCNT)

[001703] O núcleo de cada uma das células doadoras de GFP ou células doadoras de RFP preparadas pelo método acima foi transferido para cada oócito enucleado (óvulo enucleado), fundido eletricamente, ativado por ionomicina por 4 min, e depois cultivado em 6-DMAP por 4 horas.

[001704] O embrião clonado que pode expressar uma proteína fluorescente verde (doravante, embrião clonado com GFP) ou embrião clonado que pode expressar uma proteína fluorescente vermelha (doravante, embrião clonado com RFP) obtido pela fusão elétrica, como descrito acima, foi cultivado em uma incubadora (39C, CO2 5%) em uma microgota de 25 μL de meio quimicamente definido, recoberto com óleo mineral por 7 a 8 dias. O meio quimicamente definido foi preparado pelo método convencionalmente conhecido. 2-4. Confirmação da inserção da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo 2-4-1. Resultados de PCR, RT-PCR

[001705] Para confirmar se o gene da proteína fluorescente verde e o gene da proteína fluorescente vermelha foram inseridos no genoma dos embriões transgênicos bovinos produzidos pelo método acima (embrião clonado com GFP e embrião clonado com RFP) e detectar a presença/ausência de expressão

298 / 353 de mRNA no mesmo, PCR e RT-PCR de DNA (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha), foram realizados.

[001706] Para a PCR de DNA, o DNA do genoma foi extraído do sangue ou células de uma vaca transgênica usando o kit de extração de DNA (kit DNeasy Sangue & Tecido 69506, Qiagen, Limburg, Holanda).

[001707] Para RT-PCR, o RNA total foi extraído usando o kit de extração de RNA (kit de extração de RNA total Easy spin, Cat. 17221, iNtRON, Sungnam, Coréia) e o cDNA foi sintetizado usando o kit de síntese de cDNA (RNA para Kit de Pré-mistura de cDNA EcoDry®, PT5153-2, Clontech, Califórnia, EUA) para síntese de cDNA. Para a síntese de cDNA, 1 µg de RNA total foi usado.

[001708] Os iniciadores usados para PCR são mostrados na Tabela 4 abaixo. [Tabela 4] Tipo de Iniciador Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência GFP-Direta pr_GFP_F_2 SEQ ID NO:7 CACATGAAGCAGCACGACTT GFP-Inversa pr_GFP_R_2 SEQ ID NO:8 AGTTCACCTTGATGCCGTTC RFP-Direta pr_RFP_F_2 SEQ ID NO:9 CCCCGTAATGCAGAAGAAGA RFP-Inversa pr_RFP_R_2 SEQ ID NO:10 GGTGATGTCCAGCTTGGAGT GAPDH-Direta pr_GAPDH_F_1 SEQ ID NO:11 GGCGTGAACCACGAGAAGTA GAPDH-Inversa pr_GAPDH_R_1 SEQ ID NO:12 CCCTCCACGATGCCAAAGT

[001709] A FIG. 26 mostra os resultados de RT-PCR e PCR de DNA dos embriões transgênicos (embrião clonado com GFP e embrião clonado com RFP) (A: resultado da PCR usando o DNA do genoma como modelo, B: resultado da PCR usando cDNA do genomo como um molde, C: expressão de mRNA de GAPDH via RT-PCR, M: marcador molecular, controle: embrião sem transformação). 2-4-2. Confirmação da expressão da proteína fluorescente no embrião

[001710] A expressão de GFP ou RFP sem mosaicismo foi visualmente confirmada no embrião transgênico (embrião clonado com GFP e embrião clonado com RFP).

299 / 353

[001711] A FIG. 27 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente verde em um embrião clonado com GFP (esquerda: condição de luz visível, direita: condição de luz fluorescente).

[001712] A FIG. 27 (b) mostra os resultados quando o embrião clonado com RFP com 7 dias de idade foi tratado com doxiciclina e depois cultivado por mais dois dias. Quando um embrião transformado foi tratado com doxiciclina, a expressão de uma proteína fluorescente vermelha foi confirmada (ver FIG. 27 (b); direita da linha tracejada), enquanto que quando um embrião não transformado foi tratado com doxiciclina, a expressão de um a proteína fluorescente vermelha não foi confirmada (ver FIG. 27 (b); esquerda da linha tracejada).

[001713] A partir deste experimento, foi confirmado que células e/ou embriões tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene de proteína alvo para transformação é inserida, podem sobreviver sem nenhum perigo específico. [Exemplo Experimental 2] Preparação de vaca transgênica tendo genoma no qual o gene da proteína alvo é inserido via microinjeção

[001714] Os presentes inventores conduziram o seguinte experimento de modo a inserir um gene de proteína alvo no genoma bovino.

[001715] Como descrito acima, para confirmação visual da inserção do gene da proteína alvo, os presentes inventores conduziram o experimento selecionando um gene da proteína fluorescente como a proteína alvo e prepararam uma toolbox incluindo o gene da proteína fluorescente e, assim, prepararam um zigoto bovino que inclui uma toolbox preparada por um método de microinjeção (MI), e transplantou o zigoto para o útero de uma mãe de substituição, preparando assim uma vaca transgênica tendo um genoma no qual o gene da proteína fluorescente é inserido.

1. Preparação de vetor da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo

300 / 353

[001716] Para preparar um vetor de expressão final, incluindo uma toolbox na qual um gene da proteína fluorescente amarela, um gene da proteína fluorescente verde, e um gene da proteína fluorescente vermelho são incluídos, o gene da proteína fluorescente amarela, o gene da proteína fluorescente verde, e o gene da proteína fluorescente vermelho foram amplificados usando a clonagem por PCR no Gateway (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).

[001717] Os iniciadores usados para a amplificação do gene da proteína fluorescente amarela, do gene da proteína fluorescente verde e do gene da proteína fluorescente vermelha foram adquiridos na Addgene (http://www.addgene.org, Plasmid # 34879).

[001718] Um vetor de expressão final incluindo uma toolbox na qual um gene da proteína fluorescente amarela é incluído (daqui em diante, vetor YFP) foi preparado usando o gene amplificado. A FIG. 28 (a) ilustra parte do vetor YFP.

[001719] Adicionalmente, os cDNAs do promotor de β-caseína e da Interleucina 2 humana (hIL2) foram amplificados usando a clonagem por PCR no Gateway (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Esses cDNAs foram inseridos no PB-GFP por clonagem por infusão (In fusion HD cloning kit, lontech, 639644, California, USA) e, assim, o vetor de expressão final incluindo a toolbox (construção

[001720] promotor-hIL2-pA-pCAG-GFP-Pa-3’PB de 5’PB-β-caseína) que inclui gene de GFP e hIL2 (daqui em diante, vetor GFP-hIL2). A FIG. 28 (b) ilustra parte do vetor GFP-hIL2.

[001721] Adicionalmente, o Rox-GFP-poliA-rox e o gene da proteína fluorescente vermelha foram amplificados pela clonagem por PCR no Gateway (MultiSite Gateway ProPlus, Invitrogen, 12537100, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e um vetor de expressão final (daqui em diante, Vetor

301 / 353 GFP-RFP) incluindo a toolbox (construção 5’PB-pCAG-rox-GFP-pA-rox- RFP-pA-3’PB) que inclui a Rox-GFP-poliA-rox e o gene da proteína fluorescente verde foi preparado usando a Rox-GFP-poliA-rox amplificada e o gene da proteína fluorescente vermelha. A FIG. 28 (c) ilustra parte do vetor GFP-RFP.

[001722] As sequências Bela Adormecida (SB) usadas neste experimento são mostradas na Tabela 5 abaixo. [Tabela 5] Tipo de Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência Transposon atacagttgaagtcggaagtttacatacacttaagttggagtcattaaa actcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttg gcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttcc 5’ SB tp_SB_1 SEQ ID NO:13 aacaattgtttacagacagattatttcacttataattcactgtatcacaat tccagtgggtcagaagtttacatacactaagttgactgtgcctttaaac agcttggaaaattccagaaaatgatgtcatggctttagaagct gtggaaggctactcgaaatgtttgacccaagttaaacaatttaaagg caatgctaccaaatactaattgagtgtatgtaaacttctgacccactgg gaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctctctactat 3’ SB tp_SB_2 SEQ ID NO:14 tattctgatatttcacattcttaaaataaagtggtgatcctaactgaccta agacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaattgtgaaaaagt gagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactg tatagggatcctctagctaga

2. Preparação de embrião (MI) 2-1. Coleta de óvulos e maturação in vitro (IVM)

[001723] Ovários bovinos coletados em soro fisiológico (35C) foram transferidos do matadouro para o laboratório em 2 horas. Os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram sugados usando uma agulha de calibre 18 acoplada a uma seringa descartável (10 mL) de folículos capilares de 2-8 mm.

[001724] Os COCs que têm um citoplasma uniformemente granulado e são cercados com células do cumulus de 3 ou mais camadas foram selecionados dos COCs sugados.

[001725] Os COCs selecionados foram lavados 3 vezes com meio de cultura de tecidos tamponado com HEPES-199 (TCM-199; Invitrogen,

302 / 353 Carlsbad, CA, EUA) suplementado com FBS a 10%, NaHCO3 2 mM (Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO, EUA) e penicilina-estreptomicina a 1% (v/v).

[001726] Os COCs selecionados foram cultivados em placas de 4 poços (30-40 oócitos por poço; Falcon, Becton-Dickinson Ltd., Plymouth, Reino Unido) a 39C e CO2 a 5% por 22 horas, e o meio usado foi o TCM-199 (450 μL) suplementado com FBS a 10%, 0,005 AU/ml de FSH (Antrin, Teikoku, Japão), cisteamina 100 µM (Sigma-Aldrich) e 1 μg/mL de 17β-estradiol (Sigma-Aldrich). 2-2. Coleta de espermatozoides, fertilização in vitro (FIV) e cultura in vitro de embriões (CIV)

[001727] Os espermatozoides foram isolados do sêmen bovino descongelado por centrifugação e a centrifugação foi realizada em um gradiente descontínuo de Percoll (45-90%) a 1.500 rpm por 15 min.

[001728] A solução de Percoll a 45% foi preparada com Percoll a 90% (Nutricell, Campinas, SP, Brasil) (1 mL) e TALP de capacitação (Nutricell) (1 mL).

[001729] O sedimento de espermatozoide obtido por centrifugação foi lavado duas vezes com TALP de capacitação (Nutricell) a 1.500 rpm por 5 min.

[001730] Os espermatozoides com motilidade ativa obtidos do sedimento de espermatozoides foram usados para a fertilização com óvulos maduros (IVM de 24 horas).

[001731] Os óvulos e 1-2 × 106 espermatozoides/mL foram fertilizados por 18 horas sob as condições de 39C e umidade de CO2 a 5% em microgramas de 30 mL de microgotas de meio IVF-TALP (Nutricell) recoberto com óleo mineral.

[001732] Os zigotos presumíveis foram cultivados em meio de cultura recoberto com óleo mineral (Sigma-Aldrich), e as condições de cultura foram O2 a 5%, CO2 a 5% e atmosfera de N2 a 90% a 39C.

303 / 353

[001733] No segundo dia após a incubação, a taxa de clivagem do zigoto foi registrada e o desenvolvimento do embrião foi monitorado de acordo com as etapas da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS). 2-3. Microinjeção (MI)

[001734] O vetor YFP descrito acima, o vetor GFP-hIL2 e o vetor GFP- RFP (doravante, vetor de toolbox) e o vetor de transposase foram microinjetados no citoplasma de um zigoto, no qual as células do cumulus foram removidas usando a máquina de microinjetor (Femtojet, Eppendorf, Alemanha).

[001735] A quantidade respectiva do vetor microinjetado no citoplasma do zigoto foi de 100 ng/mL (a proporção entre o vetor da toolbox e o vetor de transposase foi de 1:1).

[001736] O vetor de transposase (pCMV (CAT) T7-SB100X) para o vetor a beleza adormecida (SB) e o de transposase (pCy43) para piggyBac (PB) foram adquiridos na Addgene (http://www.addgene.org, Plasmid # 34879) e provido pelo Sanger Institute (Hinxton, Reino Unido).

[001737] Sete dias após a microinjeção do vetor, os embriões que expressam uma proteína fluorescente foram selecionados.

[001738] Ou seja, usando o método acima, um embrião tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente amarela é inserido (doravante, embrião YFP), um embrião tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente verde e o gene hIL2 é inserido (doravante, embrião GFP-hIL2), e um embrião tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo rox-GFP-poliA-rox e um gene da proteína fluorescente vermelho é inserido (doravante, embrião GFP-RFP) foram produzidos.

3. Preparação de vaca transgênica tendo genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo o gene da proteína alvo 3-1. Preparação de vaca transgênica

304 / 353

[001739] Os presentes inventores prepararam uma vaca transgênica transplantando o embrião bovino preparado pela microinjeção descrita acima no útero de uma mãe de substituição.

[001740] O embrião que expressa uma proteína fluorescente foi transferido para o corno uterino de uma mãe de substituição pelo método transcervical em PBS suplementado com FBS a 20%.

[001741] No 45º dia de pós-estro, a sobrevivência do embrião e a gestação foram confirmadas por palpação retal e ultrassonografia. 3-2. Produção de indivíduo SNU-SB1 (do sexo feminino) e confirmação da presença/ausência de inserção da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo

[001742] Um SNU-SB1 (do sexo feminino) nasceu de uma mãe de substituição na qual um embrião de YFP foi transplantado pelo método acima. A FIG. 29 (a) mostra o SNU-SB1.

[001743] A expressão de uma proteína fluorescente amarela foi confirmada no nariz do SNU-SB1, e a expressão de uma proteína fluorescente amarela foi confirmada na célula primária da pele.

[001744] A FIG. 29 (b) mostra a expressão de uma proteína fluorescente amarela no nariz do SNU-SB1, e a FIG. 29 (c) mostra a expressão de uma proteína fluorescente amarela na célula da pele primária do SNU-SB1 (ver FIG. 29 (c), linha esquerda: célula da pele de vaca tipo selvagem, linha direita: célula da pele de vaca transgênica, topo: condição de luz visível, fundo: condição fluorescente).

[001745] Adicionalmente, a inserção do gene da proteína fluorescente amarela foi confirmada por PCR de DNA. A FIG. 29 (d) mostra os resultados que confirmam a inserção do gene da proteína fluorescente amarela via PCR de DNA (ver FIG. 29 (d), 1: marcador molecular, 2: vaca do tipo selvagem, 3: grupo de controle positivo, 4: sangue de vaca transgênica, 5: tecido da orelha

305 / 353 da vaca transgênica, 6: placenta da vaca transgênica, 7: grupo de controle negativo).

[001746] O método de extração de DNA para PCR de DNA foi descrito acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida. 3-3. Produção de indivíduo SNU-PB2 (do sexo feminino) e confirmação da presença/ausência de inserção da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo

[001747] Um SNU-PB2 (fêmea) nasceu de uma mãe de substituição na qual um embrião de GFP-hIL2 foi transplantado pelo método acima.

[001748] A expressão de uma proteína fluorescente verde foi confirmada nos olhos, nariz, etc. do SNU-PB2, e a expressão de uma proteína fluorescente verde também foi confirmada nas células da pele primárias do SNU-PB2.

[001749] A FIG. 30 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente verde nos olhos e nariz do SNU-PB2, e a FIG. 30 (b) mostra a expressão de uma proteína fluorescente verde nas células da pele primárias do SNU-PB2 (ver FIG. 30 (b), esquerda: condição de luz visível, direita: condição fluorescente).

[001750] Adicionalmente, a inserção do gene da proteína fluorescente verde, que é um gene incluído no vetor GFP-hIL2, em um genoma foi confirmada por meio da PCR do DNA (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha).

[001751] A FIG. 30 (c) mostra os resultados que confirmam a inserção de um gene da proteína fluorescente verde via PCR de DNA (ver FIG. 30 (c), 1: marcador molecular, 2: vaca de tipo selvagem, 3: sangue de vaca transgênica, 4: grupo de controle positivo, 5: grupo de controle negativo).

[001752] Adicionalmente, a inserção de um gene da proteína fluorescente verde no genoma e a expressão do mRNA foram confirmadas por RT-PCR (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha) usando células primárias bovinas.

306 / 353

[001753] A FIG. 30 (d) mostra os resultados que confirmam a inserção de um gene da proteína fluorescente verde via RT-PCR (ver FIG. 30 (d), 1: cDNA de vaca do tipo selvagem, 2: cDNA de vaca transgênica, 3: grupo de controle negativo).

[001754] O método de extração de DNA e RNA para PCR e RT-PCR de DNA foram descritos acima e, portanto, as explicações específicas são omitidas na presente invenção.

[001755] A partir dos resultados acima, foi confirmado que o gene incluído no vetor GFP-hIL2 foi inserido no genoma do SNU-PB2. 3-4. Produção de indivíduo SNU-PB1 (do sexo masculino) e confirmação da presença/ausência de inserção da toolbox, incluindo o gene da proteína alvo

[001756] Um SNU-PB1 (do sexo masculino) nasceu de uma mãe de substituição na qual um embrião de GFP-RFP foi transplantado pelo método acima. A FIG. 31 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente verde no SNU-PB1.

[001757] A expressão de uma proteína fluorescente verde foi observada antes da Dre recombinase ser transfectada para as células da pele primárias, que foram isoladas do SNU-PB1 e cultivadas.

[001758] Após a transfecção de Dre recombinase na forma de um mRNA para as células da pele primárias, que foram isoladas do SNU-PB1 e cultivadas, a expressão de uma proteína fluorescente vermelha foi observada na célula.

[001759] A FIG. 31 (b) mostra os resultados que confirmam a expressão de uma proteína fluorescente verde e a expressão de uma proteína fluorescente vermelha nas células da pele primárias, que foram isoladas do SNU-PB1 e cultivadas (ver FIG. 31 (b), topo: condição de luz visível, fundo: condição fluorescente, esquerda: antes da transfecção com Dre recombinase, direita: após transfecção com Dre recombinase).

307 / 353

[001760] Adicionalmente, antes da transfecção com Dre recombinase, a inserção de um gene da proteína fluorescente verde no genoma e a expressão do mRNA foram confirmadas por PCR e RT-PCR de DNA (ver FIG. 32 (a) e FIG. 32 (b)). FIG. 32 (a) mostra os resultados da PCR de DNA antes da transfecção com Dre recombinase (ver FIG. 32 (a), 1: marcador molecular, 2: vaca de tipo selvagem, 3: sangue de vaca transgênica, 4: grupo de controle positivo (gene da proteína fluorescente verde), 5: grupo negativo). A FIG. 32 (b) mostra os resultados de RT-PCR antes da transfecção com Dre recombinase (ver FIG. 32 (b), 1: marcador molecular, 2: vaca do tipo selvagem, 3: vaca transgênica, 4: grupo negativo).

[001761] Adicionalmente, confirmou-se que o gene da proteína fluorescente verde foi excisado do genoma após a transfecção com Dre recombinase. A FIG. 32 (c) mostra os resultados da PCR do DNA após a transfecção com Dre recombinase (ver FIG. 32 (c), 1: marcador molecular, 2: antes da transfecção com Dre, 3: após a transfecção com Dre, 4: grupo negativo).

[001762] O método de extração de DNA e RNA para PCR e RT-PCR de DNA foram descritos acima e, portanto, as explicações específicas sobre o mesmo são omitidas na presente invenção.

[001763] A partir dos resultados acima, os presentes inventores confirmaram que um tipo desejado de uma proteína alvo pode ser expressado controlando em tempo hábil, provendo uma recombinase a um(a) célula ou animal tendo um genoma no qual o sítio de reconhecimento de recombinase (RRS) é inserido.

4. Produção de vaca descendente transgênica tendo genoma no qual é inserida uma toolbox incluindo o gene da proteína alvo 4-1. Vaca descendente transgênica 4-1-1. Vaca SNU-F1-1

308 / 353

[001764] Uma vaca descendente (SNU-F1-1) nasceu por reprodução natural entre uma vaca feminino (SNU-SB1) e uma vaca masculino (SNU- PB1).

[001765] A FIG. 33 (a) mostra SNU-F1-1, que é uma vaca descendente, e SNU-SB1, que é uma vaca mãe (ver a FIG. 33 (a), seta esquerda: SNU-F1-1, seta direita: SNU- SB1).

[001766] Os presentes inventores confirmaram visualmente que uma proteína fluorescente verde é expressada nas células da pele primárias de SNU- F1-1, que é uma vaca descendente, e confirmaram visualmente que uma proteína fluorescente vermelha é expressada após o tratamento com Dre recombinase.

[001767] A FIG. 33 (b) mostra que uma proteína fluorescente verde é expressada nas células da pele primárias do SNU-F1-1 antes do tratamento com Dre recombinase, e que uma proteína fluorescente vermelha é expressada após o tratamento com Dre recombinase (topo: antes do tratamento com Dre, fundo: após tratamento com Dre).

[001768] Adicionalmente, foi confirmado por análise da PCR do DNA que o PB-promotor CAG-Rox-GFP-Rox-RFP-PB, que é uma construção do vetor GFP-RFP, é inserido no genoma do SNU-F1-1.

[001769] A FIG. 34 mostra os resultados da análise da PCR do DNA de SNU-F1-1 (ver FIG. 34, 1: marcador molecular, 2: grupo de controle positivo (vetor GFP-RFP), 3: DNA obtido de uma vaca de tipo selvagem, 4: DNA obtido do sangue de SNU-PB1, 5: DNA obtido do sangue de SNU-F1-1, 6: DNA obtido por tratamento de Dre recombinase em células de SNU-F1-1, 7: grupo de controle negativo (água sem nuclease)). O método de extração de DNA para PCR de DNA foi descrito acima e, portanto, a explicação específica é omitida na presente invenção.

[001770] Adicionalmente, os presentes inventores analisaram a sequência de DNA de uma vaca descendente (SNU-F1-1) e, a partir dos resultados da

309 / 353 análise, confirmaram que a toolbox incluindo o PB-promotor CAG-Rox-GFP- Rox-RFP-PB, que é inserida no genoma da vaca do sexo masculino (SNU- PB1), é inserida no genoma da vaca descendente (SNU-F1-1). O local de inserção da toolbox será descrito mais adiante. 4-1-2. Vaca SNU-F1-2

[001771] A vaca fêmea (SNU-PB2) ficou grávida com SNU-F1-2 por reprodução natural entre uma vaca do sexo feminino (SNU-PB2) e uma vaca do sexo masculino (SNU-PB1). A vaca do sexo feminino (SNU-PB2), durante a gravidez, foi atacada por uma vaca diferente e ferida, e, portanto, a vaca do sexo feminino (SNU-PB2) foi sacrificada.

[001772] Os presentes inventores confirmaram visualmente que uma proteína fluorescente verde é expressada em fibroblastos fetais obtidos a partir do feto SNU-F1-2.

[001773] A FIG. 35 mostra que uma proteína fluorescente verde é expressada nos fibroblastos do feto de SNU-F1-2 (ver figura 35 abaixo, esquerda: condição de luz visível, direita: condição fluorescente).

[001774] Adicionalmente, através da análise da sequência de DNA do feto SNU-F1-2, os presentes inventores confirmaram que a toolbox incluindo o PB-promotor beta-caseína-hIL2-pA-promotor CAG-GFP-pA-PB, que é inserida no genoma da vaca do sexo feminino (SNU-PB2) também foi dispensada no genoma do feto SNU-F1-2. O local de inserção da toolbox será descrito mais adiante.

[001775] Através deste experimento, foi confirmado que os animais tendo um genoma no qual o gene da proteína alvo para a transfecção é inserido podem sobreviver sem problemas de saúde e produzir descendentes saudáveis.

[001776] Adicionalmente, através desses resultados, foi confirmado que a toolbox incluída no genoma bovino transgênico da geração F0 pode ser transmitida para a geração F1. 4-2. Leite de vaca do sexo feminino

310 / 353

[001777] Para demonstrar que a proteína expressada no gene inserido em um genoma pode ser incluída no leite de vaca, os presentes inventores analisaram o leite de uma vaca do sexo feminino na qual uma toolbox com a mesma construção que a toolbox inserida no genoma do SNU-PB2 (uma toolbox com a construção do 5’PB-promotor β-caseína-hIL2-pA-pCAG-GFP- Pa-3’PB) é inserida.

[001778] Como resultado da análise do leite da vaca fêmea tendo um genoma no qual uma toolbox incluindo um gene da proteína fluorescente é inserida usando um microscópio confocal, foi confirmado visualmente que uma proteína fluorescente verde é expressada no leite da vaca do sexo feminino.

[001779] A FIG. 36 (a) mostra os resultados que confirmam a presença/ausência de expressão de uma proteína fluorescente no leite de vaca usando um microscópio confocal (ver FIG. 36 (a), à esquerda: leite de vaca do tipo selvagem, direita: leite de vaca transgênica inserido com Toolbox).

[001780] Adicionalmente, foi confirmado pelo ELISA que a interleucina humana (hIL) expressada pelo componente da toolbox está incluída no leite de vaca do sexo feminino.

[001781] A FIG. 36 (b) mostra os resultados confirmando via ELISA que a interleucina humana está incluída no leite (ver FIG. 36 (b), topo: controle ELISA, fundo: 1 a 3; leite de vaca tipo selvagem, 4 a 8; leite de vaca transgênica inserida com toolbox).

[001782] Foi confirmado que, mesmo quando uma vaca descendente ingere leite, na qual estão incluídas uma proteína fluorescente verde e a interleucina humana (LIL), a vaca descendente pode sobreviver sem problemas de saúde.

[001783] A partir desta experiência, foi confirmado que proteínas expressadas através da transcrição e tradução de um exopolinucleotídeo podem ser incluídas no leite de uma vaca fêmea transgênica. Ou seja, foi confirmado que uma vaca transgênica pode ser utilizada como um biorreator.

311 / 353

5. Local de inserção no genoma no qual o gene da proteína alvo pode ser inserido

[001784] Os presentes inventores confirmaram, através de análise de sequência, os locais de inserção nos quais a toolbox incluindo um gene de proteína alvo (por exemplo, gene da proteína fluorescente) pode ser inserida no genoma da vaca transgênica F0 e da vaca descendente.

[001785] As amostras de DNA foram preparadas para análise de sequência e as amostras de DNA foram extraídas do sangue ou das células primárias de acordo com o protocolo do fabricante usando um kit de extração de DNA. A qualidade do DNA genômico (razão OD 260/280 é de 1,8-2,0 e razão OD 260/230 maior que 1,6) e a quantidade (1 µg) para a preparação de uma biblioteca foi confirmada usando o kit de análise de dsDNA por fluorímetro Qubit (Invitrogen, CA) e Infinite F200 Pro NanoQuant (TECAN, Männedorf).

[001786] Para preparar uma biblioteca para análise de massa da sequência, o DNA do genoma purificado a partir de amostras de vaca transgênica F0 (SNU-SB1, SNU-PB1 e SNU-PB2) e vacas descendentes (SNU-F1-1 e SNU-F1-2) foi clivado aleatoriamente usando o Ultrasonicator Covaris S2 e, assim, foram obtidos fragmentos de DNA com tamanho médio de 350 pb. Uma biblioteca de sequenciamento de DNA foi preparada usando o kit de preparação de amostras sem PCR de DNA TruSeq (da Illumina (San Diego, CA, EUA)), e a biblioteca foi preparada de acordo com o protocolo do fabricante.

[001787] O tamanho e a qualidade da biblioteca final foram avaliados pelo kit de DNA de Alta sensibilidade Agilent (AgilentTechnologies, Santa Clara).

[001788] O sequenciamento foi realizado no Illumina HiSeq 2500 usando o Kit de Agrupamento de Extremidade pareada TruSeq v3 e o Kit SBS TruSeq

312 / 353 v3-HS (FC-401-3001), e a análise da imagem foi realizada usando o software de controle HiSeq (ver. 2.2.58).

[001789] As leituras restantes foram realizadas usando a versão BWA.

0.7.5a., e o genoma de Bos taurus (UMD 3.1, http://asia.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Annotation) e as sequências gênicas de proteína alvo foram mapeadas simultaneamente.

[001790] O local de inserção do gene da proteína alvo foi analisado usando os dados de mapeamento BAM (formato alinhado) formados por BWA.

[001791] BWA significa que, como determinado pelo esquema de pontuação do tipo Smith-Waterman, parte dos nucleotídeos pode ser omitida (daqui em diante, soft-clipped) no extremo da leitura.

[001792] O local da inserção foi deduzido confirmando o padrão mapeado da sequência Soft-Clipped.

[001793] Adicionalmente, os softwarers Delly foram aplicados em paralelo para avaliar as alterações na estrutura do genoma como um índice de inserção do gene da proteína alvo.

[001794] Finalmente, o local de inserção do candidato foi verificado manualmente usando o software IGV.

[001795] As variações no número de cópias (CNVs) foram confirmadas pelo software Control-FREEC. Este software é usado para calcular um múltiplo da região de interesse. 5-1. Local de inserção no genoma da vaca transgênica de geração parental no qual o gene da proteína alvo pode ser inserido

[001796] Em seguida, os sítios de inserção no genoma da vaca transgênica da geração parental, confirmados por análise de sequência, na qual uma toolbox incluindo um gene da proteína alvo é inserida, são descritos.

[001797] A Tabela 6 abaixo descreve os locais de inserção nos quais uma toolbox é inserida no genoma do SNU-SB-1.

313 / 353

[001798] A Tabela 7 abaixo descreve os locais de inserção nos quais uma toolbox é inserida no genoma do SNU-PB-1.

[001799] A Tabela 8 abaixo descreve os locais de inserção nos quais uma toolbox é inserida no genoma do SNU-PB-2.

[001800] Os números de locais descritos nas Tabelas 6 a 10 abaixo indicam locais numerados artificialmente no cromossomo onde as toolboxes são inseridas.

[001801] Como descrito acima, o sítio da toolbox pode ser especificado por um ou mais dos dois seguintes: um gene endógeno localizado mais próximo da extremidade 5’ da toolbox com base na toolbox (doravante, gene 5’); e um gene endógeno localizado mais próximo da extremidade 3’ da toolbox com base na toolbox (doravante, gene 3’).

[001802] Por exemplo, os números de locais 4-1 e 21-1 na Tabela 6 abaixo são locais diferentes presentes no genoma bovino.

[001803] Em um outro exemplo, os números de locais 6-1 e 6-2 na Tabela 7 abaixo são locais diferentes presentes no genoma bovino. [Tabela 6] Cromossoma do Genoma Local N Gene 5’ Gene 3’ Bovino 4 4-1 MIS184 HUNK 21 21-1 TRPM1 APBA2 26 26-1 MKI67 EBF3 [Tabela7] Cromossoma do Local N Gene 5’ Gene 3’ Genoma Bovino 1 1-1 MIS184 HUNK 2 2-1 SLC38A11 COBLL1 3 3-1 GBP5 GBP4 4 4-2 TSGA13 MKLN1 5 5-1 ATXN7L3B CAPS2 6-1 DKK2 GIMD1 6 6-2 PLAC8 COQ2 7 7-1 ERAP2 LNPEP

314 / 353 14 14-1 CSMD3 CSMD3 17 17-1 ORAI1 RNF34 22 22-1 bta-mir-2370 DENND6A 25 25-1 AUTS2 ENSBTAG00000047342 26 26-2 EMX2 RAB11FIP2 X X-1 WWC3 DDX3Y [Tabela 8] Cromossoma do Genoma Local N Gene 5’ Gene 3’ Bovino 3-2 PEX19 PEA15 3 3-3 PDE4B OB-R 5-2 TMEM5 AVPR1A 5 5-3 XRCC6BP1 CTDSP2 5-4 MPST KCTD17 6 6-3 LCORL SLIT2 7 7-2 C7H5orf30 NUDT12 9 9-1 STXBP5 SAMD5 10 10-1 ALDH6A1 VSX2 11-1 PTP LRRTM4 11 11-2 PSMD13 - 15 15-1 SMAP INSC 18 18-1 HSD17B2 CDH13 X-2 ARAF SYN1

X X-3 PBDC1 MAGEE2 5-2. Local de inserção no genoma da vaca descendente no qual o gene da proteína alvo pode ser inserido 5-2-1. Comparação dos locais de inserção do gene da proteína alvo inserido no genoma da vaca transgênica de geração parental e no genoma da vaca descendente

[001804] A seguir, sítios de inserção, onde uma toolbox incluindo um gene da proteína alvo é inserida no genoma da vaca transgênica de geração parental, e sítios de inserção, onde uma toolbox incluindo um gene da proteína alvo é inserida no genoma da vaca descendente, confirmados por análise de sequência, são comparados.

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[001805] A Tabela 9 abaixo descreve os locais de inserção nos quais as toolboxes são inseridas no genoma do SNU-F1-1. [Tabela 9] Cromossoma do Local No. Gene 5’ Gene 3’ Genoma Bovino 4-2 TSGA13 MKLN1 4 4-4 ENSBTAG00000001198.5 ENSBTAG00000046257.1 6 6-1 DKK2 GIMD1

[001806] Como resultado da análise de sequência usando fibroblastos de pele de uma vaca descendente, foi confirmado que o local de inserção no qual uma toolbox é inserida no genoma do SNU-F1-1, uma vaca descendente, se sobrepõe em parte ao local de inserção no qual uma toolbox é inserida no genoma da vaca da geração parental (SNU-PB1, do sexo masculino) (ver as Tabelas 7 e 9).

[001807] A Tabela 10 abaixo descreve os locais de inserção nos quais as toolboxes são inseridas no genoma do SNU-F1-2. [Tabela 10] Cromossoma do Local No. Gene 5’ Gene 3’ Genoma Bovino 1 1-2 ENSBTAG00000025847.3 ENSBTAG00000011051.5 3 3-4 PDE4B LEPR 4 4-3 NPVF C7orf31 10 10-1 ALDH6A1 VSX2 12 12-1 ENSBTAG00000010680.5 U2 X X-3 PBDC1 MAGEE2

[001808] Como resultado da análise de sequência usando fibroblastos fetais de SNU-F1-2, de uma vaca descendente, foi confirmado que o sítio de inserção no qual uma toolbox é inserida no genoma de SNU-F1-2, de uma vaca descendente, se sobrepõe em parte com o local de inserção no qual uma toolbox é inserida no genoma da vaca da geração parental (SNU-PB2, animal do sexo feminino) (ver as Tabelas 8 e 10).

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[001809] Como descrito acima, através da análise de sequência, foi confirmado que pelo menos um local de inserção no qual um gene de proteína alvo é inserido no genoma animal da geração parental pode ser transmitido de maneira intacta ao genoma animal de uma geração descendente e presente. 5-2-2. Correlação entre o número de genes da proteína alvo inseridos no genoma e o nível de expressão da proteína alvo

[001810] Os presentes inventores analisaram SNU-F1-1 e SNU-F1-2 e, assim, examinaram a correlação entre os níveis de expressão de proteínas alvo e o número de genes de proteína alvo inseridos no genoma da célula. Isto foi confirmado medindo as intensidades de fluorescência nos fibroblastos da pele do SNU-F1-1 e nos fibroblastos derivados do feto de SNU-F1-2.

[001811] Medindo a intensidade da fluorescência, confirmou-se que o nível de expressão da proteína fluorescente nos fibroblastos derivados do feto de SNU-F1-2 era cerca de 2,2 vezes superior ao dos fibroblastos de SNU-F1-1 (ver FIG. 35 , topo: SNU-F1-1, fundo: SNU-F1-2, esquerda: condição da luz visível, direita: condição fluorescente).

[001812] Para quantificação da intensidade de fluorescência das amostras de SNU-F1-1 e SNU-F1-2, as imagens de células do mesmo tamanho e mesma densidade foram obtidas usando o ImageJ (v1.50, NIH).

[001813] A partir dos resultados, enquanto o gene da proteína alvo é inserido em 6 sítios de inserção no genoma do SNU-F1-2, o gene da proteína alvo é inserido em 3 sítios de inserção no genoma do SNU-F1-1, confirmou-se que o nível de expressão do gene da proteína alvo (uma proteína transformada expressada por um gene inserido do lado de fora) em uma célula bovina transgênica é correlacionado ao número de cópias dos genes inseridos do lado de fora. [Exemplo Experimental 3] Edição de genes tendo o gene da proteína alvo inserido no genoma como sítio alvo

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[001814] Os presentes inventores realizaram experimentos demonstrando que a edição gênica pode ser realizada tendo, como um alvo, o gene da proteína alvo inserido artificialmente no genoma bovino pelo método acima

[001815] Ou seja, pelos resultados experimentais abaixo, a ativação da edição gênica, mesmo no “sítio de edição artificial” inserido artificialmente no genoma, pode ser suportada.

[001816] Para confirmar com mais eficácia que a edição gênica pode ocorrer em um gene de proteína alvo que é inserido artificialmente no genoma, os presentes inventores realizaram o experimento a seguir usando células tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente verde é inserido como o gene da proteína alvo.

1. Inativação do gene da proteína alvo 1-1. Isolamento de fibroblastos tendo genoma no qual o gene da proteína fluorescente verde é inserido

[001817] Para confirmar que o gene da proteína alvo inserido de fora pode ser inativado, os presentes inventores isolaram fibroblastos tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente verde é inserido (doravante, fibroblasto de GFP) a partir do tecido de um embrião transformado tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente verde é inserido.

[001818] Para o isolamento dos fibroblastos de GFP, um feto foi coletado de uma mãe de substituição para a qual um embrião de GFP foi transplantado, e a coleta do feto foi realizada no 40º dia de gravidez da mãe de substituição.

[001819] A pele do feto coletado foi submetida à digestão enzimática por colagenase e, em seguida, fibroblastos primários foram anexados a placas de cultura.

[001820] Os fibroblastos primários foram expandidos por meio de cultura (DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA), SFB a 15% (Gibco), beta- mercaptoetanol 100 mM (Sigma), NEAA 1% (Sigma) e penicilina/estreptomicina a 1% (Gibco)) nas placas de cultura.

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[001821] A expressão de uma proteína fluorescente verde nos fibroblastos isolados foi confirmada por um microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão). 1-2. Transfecção com vetor CRISPR/Cas9 dirigida ao gene da proteína alvo

[001822] Para inativar o gene da proteína fluorescente verde inserido no genoma do fibroblasto de GFP isolado pelo método descrito acima, um sistema CRISPR/Cas9 modificado usando um RNA guia único (sgRNA), foi usado.

[001823] Para inativar o gene da proteína fluorescente verde, o vetor de expressão de sgRNA tendo o promotor U6 e o vetor de expressão de Cas9 com o promotor CMV foram preparados.

[001824] A FIG. 37 (a) ilustra um sgRNA projetado para se direcionar especificamente a um gene de proteína fluorescente verde.

[001825] A FIG. 37 (b) ilustra um vetor de expressão de sgRNA e um vetor de expressão de Cas9 (esquerda: vetor de expressão de sgRNA, direita: vetor de expressão de Cas9).

[001826] O vetor de expressão de sgRNA e o vetor de expressão da proteína Cas9 (total de 10 g, proporção de 1:3) foram transfectados para fibroblastos isolados pelo método acima. Os fibroblastos transfectados foram cultivados adicionalmente em uma incubadora (38C, CO2 a 5%) por 10 dias. 1-3. Confirmação da expressão de proteína fluorescente e indel para confirmação de inativação

[001827] O vetor de expressão de sgRNA e o vetor de expressão de Cas9 foram transfectados para os fibroblastos isolados pelo método acima e, em seguida, a excisão da expressão de uma proteína fluorescente verde foi confirmada por um microscópio de fluorescência.

[001828] A FIG. 38 (a) mostra os resultados que confirmam que a proteína fluorescente verde não foi expressada após o vetor de expressão de sgRNA e o vetor de expressão de Cas9 serem transfectados para os fibroblastos

319 / 353 tendo um genoma no qual o gene da proteína fluorescente verde foi inserido (ver FIG. 38 (a), a: condição da luz visível, a’: condição fluorescente).

[001829] Ou seja, foi confirmado que o gene da proteína fluorescente verde foi inativado após a transfecção do vetor de expressão de sgRNA e do vetor de expressão de Cas9.

[001830] Adicionalmente, os presentes inventores isolaram o DNA genômico inteiro do fibroblasto, incluindo uma colônia negativa de proteína fluorescente verde e confirmaram o indel de um gene da proteína fluorescente verde como sítio alvo por amplificação por PCR.

[001831] O isolamento de DNA genômico completo foi realizado usando o Mini kit de Extração de DNA Total G-spinTM (iNtRON, Seul, República da Coréia).

[001832] Um fragmento de 575 pb incluindo o sítio alvo foi amplificado por iniciadores de modo a identificar o indel do sítio alvo por amplificação por PCR. Os iniciadores são mostrados na Tabela 11 abaixo. [Tabela 11] Iniciador de Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência

PCR Direto in_pr_GFP_F_1 SEQ ID NO:15 GGACTTCCTTTGTCCCAAATCT Inverso in_pr_GFP_R_1 SEQ ID NO:16 TAGCGGCTGAAGCACTGC

[001833] A FIG. 38 (b) mostra o indel que ocorreu no gene da proteína fluorescente verde.

[001834] Através deste experimento, foi confirmado que o ácido nucleico guia provido de fora pode causar inativação de um gene específico no genoma bovino e que a vaca pode sobreviver mesmo que ocorra uma inativação em um gene específico no genoma bovino.

2. Modificação do polinucleotídeo doador

[001835] Os presentes inventores conduziram um experimento no qual um polinucleotídeo doador foi modificado usando um gene da proteína

320 / 353 fluorescente verde, inserido em um genoma bovino transgênico produzido pelo método acima, como um gene alvo.

[001836] As células primárias foram obtidas de uma vaca transgênica (por exemplo, SNU-PB2) produzida pelo método acima, os vetores plasmídicos foram transfectados para as células primárias através da tecnologia Nucleofactor (Neon, Invitrogen; programa # 16).

[001837] Como vetor plasmídico, i) um vetor de expressão de sgRNA tendo o promotor U6 (Toolgen, Seul, República da Coréia, direcionamento do gene GFP), ii) um vetor de expressão CRISPR/Cas9 com o promotor CMV e iii) um vetor de expressão do DNA doador (gene de resistência à puromicina).

[001838] As células primárias transfectadas foram cultivadas com 4 μg/mL de puromicina (GIBCO) por 3 dias. Após troca com meios de cultura frescos, as células primárias foram cultivadas por mais 10 dias.

[001839] Como resultado, confirmou-se que, no caso de células primárias transfectadas com o vetor de expressão de sgRNA (Toolgen, Seul, República da Coréia), o vetor de expressão CRISPR/Cas9, e o vetor de expressão do DNA doador (gene de resistência à puromicina), as colônias sobreviveram mesmo quando a puromicina foi tratada.

[001840] A FIG. 39 mostra que, quando células primárias tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente verde é inserido, são transfectadas com gRNA, Cas9 e DNA doador (gene de resistência à puromicina), que podem se ligar ao gene da proteína fluorescente verde, as células primárias têm resistência à puromicina.

[001841] Adicionalmente, foi confirmado que, no caso de células primárias transfectadas com o vetor de expressão de sgRNA (Toolgen, Seul, Coréia), o vetor de expressão CRISPR/Cas9, e o vetor de expressão do doador (gene de resistência à puromicina), que têm como alvo uma proteína fluorescente verde, a proteína fluorescente verde não é mais expressada.

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[001842] A FIG. 40 mostra que a proteína fluorescente verde não é expressada nas células primárias transfectadas com o vetor de expressão de sgRNA, vetor de expressão CRISPR/Cas9, e vetor de expressão do DNA doador (gene de resistência à puromicina), que têm como alvo uma proteína fluorescente verde (ver FIG. 40, 1: antes da transfecção, 2: após a transfecção).

[001843] A partir dos resultados acima de i) resultados de sobrevivência de colônias e ii) sem expressão de uma proteína fluorescente verde, foi confirmado que o sistema CRISPR/Cas usando sgRNA e CRISPR/Cas9 é operado nas células primárias do SNU-PB- 2).

[001844] Adicionalmente, os presentes inventores realizaram um experimento para modificar no polinucleotídeo doador (incluindo um gene da proteína fluorescente vermelha) usando o gene da proteína fluorescente verde (gene de GFP), que é inserido no genoma da vaca descendente descrita acima (SNU-F1- 1), como um gene alvo.

[001845] Como no método acima, foram obtidas as células primárias de SNU-F1-1, e i) vetor de expressão de sgRNA tendo o promotor U6 (Toolgen, Seul, República da Coréia, direcionamento do gene de GFP), ii) vetor de expressão CRISPR/Cas9 tendo o promotor do CMV, e iii) o vetor de expressão do DNA doador (incluindo um gene da proteína fluorescente vermelha) foi transfectado para as células primárias via tecnologia Nucleofactor (Neon, Invitrogen; programa # 16).

[001846] A FIG. 41 ilustra um processo no qual o polinucleotídeo doador (414) é modificado no gene da proteína fluorescente verde presente no genoma das células primárias.

[001847] No caso de células primárias transfectadas com o vetor de expressão de sgRNA (Toolgen, Seul, República da Coréia), vetor de expressão de CRISPR/Cas9, e vetor de expressão do DNA doador (incluindo um gene da proteína fluorescente vermelha), confirmou-se que a proteína fluorescente

322 / 353 verde é não é mais expressada e que a proteína fluorescente vermelha é expressada (ver FIG. 42).

[001848] A FIG. 42 mostra que um gene da proteína fluorescente verde é inativado nas células primárias tendo um genoma no qual o gene da proteína fluorescente verde é inserido e, após a modificação de um gene da proteína fluorescente vermelha, o gene da proteína fluorescente vermelha é expressado nas mesmas.

[001849] A partir dos resultados acima de i) sem expressão de uma proteína fluorescente verde e ii) a expressão de uma proteína fluorescente vermelha, foi confirmado que o sistema CRISPR/Cas usando sgRNA e CRISPR/Cas9 pode operar mesmo nas células primárias de a vaca descendente.

[001850] A partir deste experimento, foi confirmado que um polinucleotídeo doador pode ser modificado tendo o sítio de edição artificial inserido do lado de fora como um sítio alvo.

[001851] Adicionalmente, foi confirmado a partir deste experimento que as células podem sobreviver mesmo quando o polinucleotídeo doador é modificado para o sítio alvo presente no genoma da célula.

[001852] Adicionalmente, foi confirmado a partir deste experimento que, no caso em que o polinucleotídeo doador é inativado usando um gene da proteína fluorescente como um gene alvo, as células nas quais a (n+1) ésima edição gênica ocorreu podem ser selecionadas usando uma célula tendo um genoma no qual um gene da proteína fluorescente é inserido (células nas quais ocorreu a nésima edição gênica; n é um número natural de 1 ou maior), aproveitando o fato de que o sinal de fluorescência da célula provida para o exterior se torna mais fraco devido à não expressão de uma proteína fluorescente. [Exemplo experimental 4] Vaca transgênica na qual a endonuclease guiada por RNA é expressada

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1. Preparação de vaca transgênica na qual a endonuclease guiada por RNA é expressada

[001853] Os presentes inventores realizaram o seguinte experimento de modo a preparar uma vaca transgênica na qual uma endonuclease guiada por RNA é expressada (doravante, vaca de spCas9). 1-1. Preparação de vetor

[001854] Um cDNA de spCas9 (apresentado por Toolgen) incluindo um gene de resistência à puromicina e um gene da proteína fluorescente vermelha (gene de RFP) foram clonados por PCR.

[001855] Adicionalmente, o DNA Fat-1 com base em banco de dados NCBI foi sintetizado e o gene Fat-1 foi clonado junto com o promotor EF1alfa.

[001856] Cas9-Puro-RFP, EF1 alfa e DNAs fat-1 foram inseridos no vetor de expressão de transposon piggyBac (vetor de expressão de transposon PB) e, assim, o vetor de expressão final (doravante, vetor de spCas9; PB-CAG- Cas9-RFP- EF1-fat1) foi preparado.

[001857] A FIG. 43 (a) ilustra parte do vetor de spCas9.

[001858] As sequências piggyBac (PB) usadas neste Exemplo Experimental são as mesmas que as mostradas na Tabela 3 acima. 1-2. Preparação do embrião (MI)

[001859] Como o método de integração do gene spCas9 no genoma bovino e as condições experimentais do mesmo são os mesmos para a inserção do gene da proteína alvo e as condições experimentais do mesmo, o método para preparar um embrião tendo um genoma no qual o gene spCas9 é inserido será brevemente descrito.

[001860] Como descrito acima, os óvulos bovinos foram coletados separando os COCs do ovário, seguido de lavagem, e os espermatozoides foram coletados separando-os do sêmen bovino por centrifugação.

[001861] Após remover as células do cumulus do zigoto obtido por fertilização in vitro entre os óvulos e espermatozoides coletados, o vetor de

324 / 353 spCas9 e o vetor de transposase foram microinjetados no citoplasma (cada um na proporção de 50 ng/mL, 1:1) usando a máquina de microinjetor (Femtojet, Eppendorf, Alemanha). O vetor de transposase (pCy43) foi provido pelo Sanger Institute (Hinxton, Reino Unido).

[001862] No embrião microinjetado, uma proteína fluorescente vermelha foi expressada.

[001863] A FIG. 43 (b) mostra que uma proteína fluorescente vermelha foi expressada no embrião no qual o vetor de spCas9 é microinjetado.

[001864] Como o vetor de spCas9 inclui um gene da proteína fluorescente vermelha (ver FIG. 43 (a)), foi confirmado pelo resultado da expressão de uma proteína fluorescente vermelha que o gene spCas9 foi inserido no genoma do embrião no qual o vetor estava microinjetado. 1-3. Preparação de vaca transgênica 1-3-1. Vaca transgênica

[001865] Uma vez que o método de transplantar o embrião transformado no útero de uma mãe de substituição e as condições experimentais do mesmo foram descritas acima, o método de produção da vaca de spCas9 (F0) é brevemente descrito abaixo.

[001866] O embrião produzido pelo método acima foi transplantado para o útero de uma mãe de substituição, no 45º dia pós-estro, um total de 4 mães de substituição estavam grávidas, como confirmado por palpação retal e ultrassonografia.

[001867] Após o período gestacional, nasceram quatro vacas spCas9 (F0). A FIG. 43 (c) mostra SNU-Cas9-2 (F0).

[001868] A Tabela 12 abaixo descreve o sexo e a idade das vacas transgênicas. [Tabela 12] Proporção de Expressão Nome Sexo Idade de RFP SNU-Cas9-1 (F0) 58.3% Feminino 5 Meses

325 / 353 SNU-Cas9-2 (F0) 33.7% Masculino 23 Meses SNU-Cas9-3 (F0) 87.0% Masculino 6 Meses SNU-Cas9-4 (F0) 74.8% Feminino 24 Meses

[001869] Para a análise sanguínea das vacas spCas9, foram coletadas amostras de sangue total (5 mL) da veia jugular. Uma porção das amostras coletadas (1 mL) foi usada para hemograma completo (CBC) (Hemavet 950, Drew Scientific, EUA) e o restante das amostras foram usadas para análise química sérica (BS-400, Mindray, China). Todos os valores de hemograma e análise química sérica confirmados pela análise sanguínea estavam na faixa de referência e foram confirmados que não havia problemas de saúde nas vacas spCas9, mesmo quando Cas9 foi expressada.

[001870] Os presentes inventores obtiveram óvulos de SNU-Cas9-4 (do sexo feminino) e espermatozoides de SNU-Cas9-2 (do sexo masculino).

[001871] Para obter os espermatozoides, o sêmen foi coletado de um gado transgênico de 18 meses de idade, usando uma vagina artificial (Fujihira Industry, Tóquio, Japão) contendo água quente a 50-55C, e os espermatozoides coletados foram imediatamente transferidos para o, e congelado no congelador.

[001872] O sêmen foi diluído na proporção de 50%:50% usando o OPTIXcell (IVM technologies, França) e mantido em temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, o sêmen diluído foi novamente diluído na proporção de 50%:50% e a concentração dos espermatozoides foi mantida em 5,0 ± 107/mL a 4C por 2 horas.

[001873] Os espermatozoides concentrados foram colocados em 500 µL de minitubos de sêmen (IMV technologies, França) e vedados com pó em minitubos (Fujihira Industry, Tóquio, Japão). O minitubo foi congelado a 5,0 cm acima da superfície do nitrogênio líquido por 30 min e depois descongelado em um tanque de nitrogênio líquido.

[001874] Um descendente tendo um genoma no qual o gene spCas9 foi inserido foi produzido por reprodução natural entre um SNU-Cas9-2 (do sexo

326 / 353 masculino) e um SNU-Cas9-4 (do sexo feminino), enquanto protegia gametas dos mesmos. 1-3-2. Confirmação de polinucleotídeo que codifica inserção de endonuclease guiada por RNA no genoma da vaca transgênica 1-3-2-1. Confirmação da expressão da proteína fluorescente

[001875] As células primárias foram isoladas e cultivadas a partir do tecido da pele da orelha da vaca de spCas9, a fim de determinar se a proteína fluorescente foi expressada nas células da vaca de spCas9.

[001876] Para isolamento das células primárias, o tecido da pele da orelha foi separado por punção de biópsia até um diâmetro de 0,5 mm. Os tecidos foram lavados 3 ou mais vezes com PBS contendo penicilina/estreptomicina a 1% e cortados o menor possível com uma lâmina cirúrgica. Os tecidos excisados foram incubados com colagenase tipo IV (Gibco) em HBSS a 37C por 16 horas.

[001877] Após uma semana, o crescimento de fibroblastos da pele foi observado e a placa de cultura foi preenchida com um meio de cultura fresco (DMEM suplementado com FBS a 10%, NEAA a 1%, beta-mercaptoetanol a 100 mM, P/S a 1%).

[001878] Depois que as células primárias se tornaram confluentes, algumas células foram armazenadas em um congelador e outras foram observadas por um microscópio de fluorescência sem criopreservação.

[001879] A FIG. 44 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente vermelha nas células primárias da vaca de spCas9.

[001880] Adicionalmente, a proporção de expressão da proteína fluorescente vermelha foi confirmada em cada vaca de spCas9, e isso foi feito contando 3 vezes no total e calculando a proporção de células nas quais a proteína fluorescente vermelha foi expressada em 100 células. A proporção de expressão de uma proteína fluorescente vermelha de cada vaca de spCas9 é mostrada na Tabela 12 acima.

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[001881] Uma vez que o vetor de spCas9 foi projetado para incluir o gene da proteína fluorescente vermelha, pode-se prever a partir dos resultados acima que o gene spCas9 foi inserido no genoma bovino spCas9.

[001882] No entanto, os presentes inventores realizaram PCR e RT-PCR de DNA para confirmação mais precisa da inserção dos genes spCas9 e Fat1 e expressão de spCas9 e Fat1 em cada genoma bovino spCas9. 1-3-2-2. Resultados de PCR e RT-PCR de DNA

[001883] O DNA do genoma foi extraído das células cultivadas usando o kit de extração de DNA (kit de Sangue&Tecido DNeasy 69506, Qiagen, Limburg, Holanda) e a PCR (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha) foi realizada usando o DNA extraído juntamente com os iniciadores de PCR específicos para spCas9 e Fat1.

[001884] Os iniciadores para PCR e RT-PCR de DNA são mostrados na Tabela 13 abaixo. [Tabela 13] Tipo de Iniciador Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência spCas9-Direto pr_spCas9_F_1 SEQ ID NO:17 GACAAGAAGTACAGCATCGG spCas9-Inverso pr_spCas9_R_1 SEQ ID NO:18 CAACCAGCTGTTCGAGGAGA Fat1-Direto pr_Fat1_F_1 SEQ ID NO:19 AAACACGAAACAGGCGACCA Fat1-Inverso pr_Fat1_R_1 SEQ ID NO:20 TTTGTCGTTGGCCACGATTG GAPDH-Direto pr_GAPDH_F_2 SEQ ID NO:21 GGCGTGAACCACGAGAAGTA GAPDH-Inverso pr_GAPDH_R_2 SEQ ID NO:22 CCCTCCACGATGCCAAAGT

[001885] O produto de PCR foi carregado em um gel de agarose a 1% com um marcador de DNA. Como resultado, foi confirmado por PCR e RT- PCR de DNA que o gene spCas9 foi inserido no genoma bovino spCas9.

[001886] A FIG. 44 (b) mostra os resultados da PCR do DNA usando a vaca de spCas9 (M: marcador molecular, 1: SNU-Cas9-1 (F0), 2: SNU-Cas9-2 (F0), 3: SNU-Cas9-3 (F0), 4: SNU-Cas9-4 (F0), 5: vaca do tipo selvagem, (+): controle positivo (DNAs spCas9), (-): DNAs do grupo de controle negativo).

[001887] A FIG. 44 (c) mostra os resultados de RT-PCR usando a vaca de spCas9 (M: marcador molecular, 1: SNU-Cas9-1 (F0), 2: SNU-Cas9-2 (F0),

328 / 353 3: SNU-Cas9-3 (F0), 4: SNU-Cas9-4 (F0), 5: vaca do tipo selvagem, (-): DNAs do grupo de controle negativo). 1-3-2-3. Análise de sequência (local no qual o polinucleotídeo que codifica a endonuclease guiada por RNA pode ser inserido)

[001888] Adicionalmente, os presentes inventores confirmaram a inserção do gene spCas9 por análise de sequência da vaca de spCas9 (F0).

[001889] Os resultados da análise de sequência são mostrados na Tabela 14 abaixo. [Tabela 14] Cromossoma do Local No. Gene 5’ Gene 3’ Genoma Bovino 1-3 KCNAB1 GMPS 1 1-4 CHAF1B PIGP 2 2-2 HNRNPR LUZP1 7 7-3 MRPL22 HAVCR1 8 8-1 STMN4 CHRNA2 14 14-2 TGS1 LYN 16 16-1 H3F3C TFB2M 18 18-2 CLIP3 OVOL3 X X-4 MGC134232 PHKA2

[001890] Além disso, foi confirmado que o gene spCas9 pode ser inserido na localização da SEQ ID GJ059944.1, além da localização descrita na Tabela acima.

[001891] A partir deste experimento, foi confirmado que a vaca pode sobreviver mesmo se spCas9 for expressado continuamente em uma vaca transgênica e/ou célula transformada tendo um genoma no qual um polinucleotídeo que codifica spCas9 é inserido. 1-3-3. Confirmação de alterações no nível de expressão do gene essencial da vaca transgênica

[001892] A análise de sequenciamento de RNA (seq de RNA) foi realizada para confirmar se spCas9 e Fat1, que são expressados na vaca transgênica de spCas9 (F0), afetam a expressão do gene essencial.

329 / 353

[001893] Para análise de seq de RNA, o RNA foi extraído das células primárias da vaca transgênica de spCas9.

[001894] A qualidade do RNA foi avaliada por análise de integridade da banda de rRNA em um kit Agilent RNA 6000 nano (Agilent Technologies, CA, EUA).

[001895] Antes da construção de uma biblioteca de cDNA, 2 µg de RNA total e esferas magnéticas com um oligo (dT) foram usados para enriquecer o mRNA de poli (A).

[001896] Subsequentemente, o mRNA purificado foi então rompido em fragmentos curtos e o cDNA de fita dupla foi sintetizado imediatamente.

[001897] O cDNA sintetizado foi adicionado ao reparo da extremidade e poli (A) e ligado a um adaptador de sequenciamento usando o kit de preparação de amostras de mRNA TruSeq Stranded (Illumina, CA, EUA).

[001898] Fragmentos adequados, que foram automaticamente purificados pelo cassete de gel de agarose BluePippin a 2% (Sage Science, MA, EUA), foram selecionados como moldes para amplificação por PCR.

[001899] O tamanho e a qualidade da biblioteca final foram avaliados por eletroforese usando o kit de DNA de Alta Sensibilidade Agilent (Agilent Technologies, CA), e os fragmentos foram encontrados na faixa de 350 a 450 pb.

[001900] A biblioteca construída foi sequenciada pelo sequenciador Illumina HiSeq2500 (Illumina, CA, EUA).

[001901] As leituras de baixa qualidade identificadas pelos resultados do sequenciamento foram filtradas pelo relatório do fabricante. As leituras filtradas foram mapeadas para o genoma de referência humano (Ensembl release 72, Flicek P. et al., 2013) usando o alinhador STAR v.2.3.0e (Dobin et al. 2013).

330 / 353

[001902] Os níveis de expressão gênica foram medidos por Cufflinks v2.1.1 (Trapnell C. et al, 2010) usando o banco de dados de anotação gênica da versão Ensembl 72.

[001903] A região do gene não codificante foi removida com a opção de máscara. Para aumentar a precisão das medições, várias opções de correção de leitura e correção do viés de fragmentos foram aplicadas, e todas as outras opções foram definidas como valores padrão.

[001904] Para análise da expressão diferencial, os dados de contagem de nível de gene foram gerados usando a ferramenta HTSeq-count v0.5.4p3 (Anders S. et al. 2014) com a opção “-m intersecção-não vazio” e a opção -r, levando em consideração as duas sequências. Com base nos dados calculados da contagem de leitura, o DEG foi identificado usando um pacote R chamado TCC (Sun J. et al., 2013). Para comparar os dados da contagem de etiquetas, o pacote TCC aplicou uma estratégia robusta de normalização, e o fator de normalização foi calculado usando o método iterativo DEGES/edgeR. Usando a função de ajuste p do pacote R com os parâmetros padrão definidos, o valor Q foi calculado com base no valor p. Verificou-se que os genes expressados diferencialmente têm um limite de valor Q menor que 0,05.

[001905] O banco de dados da Ontologia dos Genes (GO) classifica os genes de acordo com três categorias de processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e funções moleculares (MF), e prevê as funções dos genes selecionados.

[001906] Para caracterizar os genes identificados na análise por DEG, um teste de tendência com base em GO foi realizado usando o teste exato de Fisher (Fisher R. A., 1922). Valores p <0,001 foram considerados estatisticamente significativos.

[001907] A análise de seq de RNA pelo método acima confirmou que o gene essencial não estava incluído na lista de genes com níveis de expressão

331 / 353 alterados. Ou seja, foi confirmado que o gene essencial não é afetado pela expressão de spCas9.

[001908] A Tabela 15 a seguir descreve 10 genes com uma grande alteração no nível de expressão nas células da vaca transgênica de spCas9 (os 5 genes do topo com um nível de expressão aumentado e os 5 genes do topo com um nível de expressão diminuído). [Tabela 15] Número de Acesso do Gene Gene Valor de P Modulação ENSBTAG00000021211 DPT 0,0009 5,42 ↑ ENSBTAG00000000745 AQP1 0,0026 3,63 ↑ ENSBTAG00000007740 BMK 0,0001 3,63 ↑ ENSBTAG00000012623 NDP 0,0008 3,56 ↑ ENSBTAG00000002123 MYO3A 0,0001 3,38 ↑ ENSBTAG00000014132 SNED1 0,0009 -5,16 ↓ ENSBTAG00000015441 ACTB 0,0001 -4,45 ↓ ENSBTAG00000005353 DES 0,0001 -4,41 ↓ ENSBTAG00000025210 COL4A2 0,0001 -4,39 ↓ ENSBTAG00000012849 COL4A1 0,0001 -4,16 ↓ 1-4. Preparação de vaca descendente de vaca transgênica 1-4-1. Vaca descendente de vaca transgênica 1-4-1-1. Produção de vaca descendente por fertilização in vitro (FIV)

[001909] Os óvulos foram obtidos no ovário bovino vivo ou derivado do matadouro, e os óvulos aos quais as células do cumulus estavam bem ligadas foram selecionados por exame microscópico.

[001910] Os óvulos selecionados foram amadurecidos por 22 horas em meio de cultura de tecidos (TCM199) (18-Nakseongdae R & D center). O meio de cultura de tecidos é suplementado com 10% de soro e estrogênio, fator de crescimento epitelial e 1% de antibiótico para uso.

[001911] Os óvulos amadurecidos por 22 horas foram fertilizados com espermatozoides da vaca de spCas9 congelada e descongelada (F0). Cerca de

332 / 353 16 horas após a fertilização, as células do cumulus foram removidas e o embrião fertilizado foi avaliado ao microscópio.

[001912] Entre os embriões avaliados, embriões viáveis foram transferidos para meios de cultura in vitro. O meio de cultura usado foi isento de soro (Islam et al., Theriogenology, 2011).

[001913] Os embriões selecionados foram incubados no meio do estágio 1 por cerca de 4 dias e no meio do estágio 2 por mais 3 dias. Em seguida, foi avaliado o desenvolvimento de blastocistos.

[001914] Entre os embriões desenvolvidos, foram identificados embriões nos quais a proteína fluorescente vermelha foi expressada. Os presentes inventores confirmaram que os embriões nos quais a proteína fluorescente vermelha foi expressada foram os embriões nos quais Cas9 foi expressada, e os embriões nos quais a proteína fluorescente vermelha foi expressada foram selecionados e transplantados para uma mãe de substituição. Isso levou à produção de um bezerro (F1) que expressa spCas9. 1-4-1-2. Produção de vaca descendente via reprodução natural e transferência nuclear de célula somática

[001915] Um bezerro (F1) que expressa spCas9 nasceu por reprodução natural entre a vaca do sexo feminino de spCas9 (F0) e a vaca do sexo masculino de spCas9 (F0).

[001916] Para aumentar o número de bezerros (F1) que expressam spCas9, o método de transferência nuclear de células somáticas pode ser usado além dos métodos de fertilização in vitro. A seguir, o método de transferência nuclear de células somáticas será descrito.

[001917] Após a cultura dos óvulos obtidos no matadouro por cerca de 20 a 24 horas, as células do cumulus foram fisicamente removidas com uma enzima (hialuronidase), e o primeiro corpo e núcleo polares foram removidos com uma micropipeta.

333 / 353

[001918] Adicionalmente, fibroblastos da pele da orelha (F1) que expressam spCas9 foram cultivados até 100% em meio de cultura.

[001919] O óvulo enucleado fundiu-se com o fibroblasto da pele da orelha do bezerro cultivado (F1) através do método de choque elétrico.

[001920] Os embriões fundidos foram ativados através de cálcio e 6- DMAP. Após a ativação, embriões clonados vivos foram cultivados em meio sem soro descrito acima. 1-4-2. Confirmação de alterações no nível de expressão do gene essencial da vaca descendente transgênica

[001921] Como resultado da análise de seq de RNA de uma vaca descendente transgênica produzida pelo método descrito acima, confirmou-se que o gene essencial não estava incluído na lista de genes com níveis de expressão alterados. Ou seja, a expressão de spCas9 não afeta o gene essencial, mesmo no caso de uma vaca descendente transgênica.

2. Segunda edição gênica usando endonuclease guiada por RNA expressada em vaca transgênica – inativação

[001922] Os presentes inventores conduziram um experimento para confirmar se a inativação de um gene alvo pode ser efetivamente induzida em células somáticas e óvulos fertilizados derivados da vaca transgênica acima descrita (vaca de spCas9) que expressa a endonuclease guiada por RNA. A FIG. 45 ilustra um método para inativação de um gene alvo no genoma de uma célula de vaca de spCas9.

[001923] Para confirmar a presença/ausência da atividade de Cas9 nas células da vaca transgênica de spCas9, um vetor plasmídico capaz de expressar sgRNAs para vários genes alvo foi sintetizado usando o protocolo do sítio (www.rGenome.net).

[001924] O método para a preparação de um vetor plasmídico capaz de expressar sgRNAs foi descrito acima e, portanto, uma explicação detalhada é omitida.

334 / 353

[001925] A Tabela 16 abaixo mostra sequências de sgRNA para vários genes alvo (gene de PRNP, gene de Beta-lactoglobulina (BLG), gene de Retinoblastoma 1 (Rb1), gene de Nanog, gene de TP53, gene de IFNT e gene de beta-caseína (BCN)). [Tabela 16] Tipo de sgRNA Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência sgRNA de direcionamento gn_PRNP_1 SEQ ID NO:23 AAAAACCAACATGAAGCATGTGG de gene de PRNP sgRNA de direcionamento gn_BLG_1 SEQ ID NO:24 CCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGG de gene de BLG sgRNA de direcionamento gn_Rb1_1 SEQ ID NO:25 TGACCTCGCCTTGGTGTTCGAGG de gene de Rb1 sgRNA de direcionamento gn_Nanog_1 SEQ ID NO:26 ACCACTGTCCCCGTCTGTGGAGG de gene de Nanog sgRNA de direcionamento gn_TP53_1 SEQ ID NO:27 GCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGG de gene de TP53 sgRNA de direcionamento gn_IFNT_1 SEQ ID NO:28 AGTGGAGAGTCTGTTCATTTGGG de gene de IFNT sgRNA de direcionamento gn_BCN_1 SEQ ID NO:29 TTGCAAGGGCCAGAGCCACCAGG de gene de BCN 2-1. Inativação na célula somática

[001926] Os presentes inventores conduziram o ensaio da endonuclease 1 de T7 (ensaio T7E1) usando PCR de DNA (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha) bem conhecido por uma pessoa habilitada na técnica, de modo a confirmar que spCas9 pode ser expressado na célula somática da vaca de spCas9 (F0) e inativação do gene alvo podem ocorrer.

[001927] Um vetor plasmídico capaz de expressar cada um dos sgRNAs descritos acima foi transfectado em fibroblastos isolados da vaca transgênica de spCas9a, e as células primárias transfectadas foram cultivadas por 10 dias em uma incubadora a 38C e CO2 a 5%.

[001928] Após 48 horas, as células cultivadas foram colhidas e o DNA genômico de cada célula foi extraído de cada uma das células transfectadas

335 / 353 usando o kit de extração de DNA (kit DNeasy Sangue & Tecido 69506, Qiagen, Limburg, Holanda).

[001929] Cada DNA extraído foi colocado em um tubo de PCR e 10 µL de tampão foram adicionados usando o kit de lise por PCR Direto e 0,5 µL de proteinase K foram adicionados a ele adicionalmente.

[001930] Os tubos de PCR, incluindo os respectivos DNAs, foram tratados em uma máquina de PCR a 56C por 180 min, tratados a 85C por 15 min e depois submetidos a PCR após adição de um iniciador direto de PRNP e um iniciador reverso de PRNP. Após a PCR, foram obtidos 10-15 μL do produto da PCR.

[001931] O produto de PCR foi misturado com 0,2 μL da endonuclease T7 I (enzima T7E1) e 2 μL do tampão (volume final 20 μL) e reagiu a 37C por cerca de 30 min. Os produtos da reação foram submetidos a eletroforese.

[001932] Como resultado da eletroforese, confirmou-se que ocorreram mutações em todos os genes alvo descritos acima (gene de PRNP, gene de beta- lactoglobulina (BLG), gene de retinoblastoma 1 (Rb1), gene de Nanog, gene de TP53 e gene de beta-caseína (BCN)) presentes na célula primária.

[001933] A FIG. 46 (a) mostra os resultados da eletroforese, após o tratamento do T7E1 no produto de PCR de DNA, no gene de PRNP, gene de beta-lactoglobulina (BLG), gene de retinoblastoma 1 (Rb1), gene de Nanog, gene de TP53 e gene de beta-caseína (BCN) nos fibroblastos bovinos spCas9.

[001934] A Tabela 17 abaixo descreve iniciadores para PCR de DNA para identificar o indel de cada gene alvo. [Tabela 17] Tipo de Gene Alvo Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência Iniciador

GCAAGAAGCGACCAAAAC Direto in_pr_PRNP_F_1 SEQ ID NO:30 PRNP gene CT Inverso in_pr_PRNP_R_1 SEQ ID NO:31 GGTGCATGTTTTCACGATAG

TTAAAGGCCGTGTCTCCAG BLG gene Direto in_pr_BLG_F_1 SEQ ID NO:32

T

336 / 353

GAAAGCCCTGGATAAGCAG Inverso in_pr_BLG_R_1 SEQ ID NO:33

C

CCCCCACCAACTGAGTAGA Direto in_pr_Rb1_F_1 SEQ ID NO:34

A Rb1 gene

GATTCCAGAATGAGGGAGC Inverso in_pr_Rb1_R_1 SEQ ID NO:35

T Direto in_pr_Nanog_F_1 SEQ ID NO:36 ACCTACCATCTCGCTCTGAG Nanog gene ACCAAGAATCGAACCCAGG Inverso in_pr_Nanog_R_1 SEQ ID NO:37

C Direto in_pr_TP53_F_1 SEQ ID NO:38 CTTCAGCCTTTGCCTTTTTG TP53 gene Inverso in_pr_TP53_R_1 SEQ ID NO:39 TTCCGGTCGTCCAAATACTC Direto in_pr_IFNT_F_1 SEQ ID NO:40 TCTTCCCCATGGCTTTTGTG IFNT gene TGGAGATGATAAGAGCCCT Inverso in_pr_IFNT_R_1 SEQ ID NO:41

C

TGGCTGGCAGTGAAACATT Direto in_pr_BCN_F_1 SEQ ID NO:42

A BCN gene

AGGGATTGATGGTACAGAT Inverso in_pr_BCN_R_1 SEQ ID NO:43

GG

[001935] Adicionalmente, foi confirmado que o gene alvo, o gene de PRNP, foi inativado pela análise de sequência. FIG. 46 (b) mostra o indel do gene de PRNP da vaca de spCas9 através da análise de sequência.

[001936] Através deste experimento, foi confirmado que o spCas9 pode ser expressado na célula somática de uma vaca de spCas9, e a inativação de um gene alvo pode ser induzido pela operação do sistema CRISPR/Cas9 na célula somática. 2-2. Inativação em zigoto F1 produzido por fertilização in vitro

[001937] Os presentes inventores conduziram o seguinte experimento de modo a confirmar que o spCas9 pode ser expressado em um zigoto que é produzido por fertilização in vitro usando o gameta de uma vaca de spCas9 e pode ocorrer inativação de um gene alvo pelo spCas9 expressado. 2-2-1. Produção de zigoto que expressa endonuclease guiada por RNA

[001938] Os espermatozoides obtidos do SNU-Cas9-2 e óvulos do tipo selvagem foram fertilizados para produzir óvulos fertilizados (e/ou embriões). O método de obtenção de gametas a partir de uma vaca e os métodos de

337 / 353 fertilização in vitro foram descritos acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001939] Zigoto in vitro (e/ou embrião) foi cultivado em um meio de cultura quimicamente definido por 7 dias. Após 7 dias, alguns blastocistos expressam uma proteína fluorescente vermelha (sem mosaicismo) sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão).

[001940] A FIG. 47 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente vermelha no embrião em mórula e blastocistos, que foram produzidos usando uma vaca de spCas9 (ver FIG. 47 (a), (a-1): embrião de mórula em condições de luz visível, (a- 1 '): embrião mórula em condição fluorescente, blastocistos (a-2) em condição de luz visível, blastocistos (a-2') em condição de fluorescência).

[001941] Ou seja, a inserção do gene spCas9 no genoma do zigoto de spCas9 foi confirmada visualmente. 2-2-2. Resultados da microinjeção do vetor de sgRNA em blastocistos

[001942] O sgRNA na forma de mRNA capaz de se ligar especificamente ao gene de PRNP foi microinjetado nos blastocistos produzidos por fertilização in vitro usando os espermatozoides do SNU-Cas9-2 acima descrito. Como o método de microinjeção foi descrito acima, a explicação detalhada é omitida.

[001943] O indel do gene de PRNP foi confirmado através da PCR do DNA (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha).

[001944] Os iniciadores de PRNP usados para análise da PCR do DNA (iniciador direto - SEQ ID NO: 30, iniciador reverso - SEQ ID NO: 31) são como divulgados na Tabela 17.

[001945] O método de análise da PCR do DNA para confirmar indel específico é como descrito abaixo.

[001946] O sgRNA foi microinjetado em blastocistos obtidos por fertilização in vitro e o DNA extraído de 8 blastocistos finalmente selecionados foi transferido para cada tubo de PCR. Usando um kit de lise por PCR direto,

338 / 353 foram adicionados 10 μL de tampão e adicionalmente foram adicionados 5 μL de proteinase K.

[001947] Os tubos de PCR foram tratados em uma máquina de PCR a 56C por 180 min, tratados a 85C por 15 min e depois submetidos à PCR após adição de um iniciador direto de PRNP e um iniciador reverso de PRNP. Após a PCR, foram obtidos 10-15 μL do produto da PCR.

[001948] O produto de PCR foi misturado com 0,2 μL da endonuclease T7 I (enzima T7E1) e 2 μL do tampão (volume final 20 μL) e reagiu a 37C por cerca de 30 min. Os produtos da reação foram submetidos à eletroforese.

[001949] Como resultado da eletroforese, a ocorrência de indel foi confirmada no gene de PRNP do DNA extraído de cada blastocisto.

[001950] A FIG. 47 (b) confirma a ocorrência de indel no gene de PRNP pelo tratamento T7E1, após a microinjeção do sgRNA (que tem como alvo o gene de PRNP) nos blastocistos produzidos por fertilização in vitro (ver FIG. 47 (b), topo: (-) T7E1, fundo: (+) T7E1, 1: gene marcador, 2-9: blastocistos nos quais o sgRNA foi microinjetado, 10: zigoto do tipo selvagem, 11: gene de PRNP).

[001951] Adicionalmente, o indel do gene de PRNP foi confirmado pela análise da sequência do genoma dos blastocistos.

[001952] A FIG. 47 (c) mostra os resultados indel do gene de PRNP através da análise de sequência dos blastocistos, após microinjeção do sgRNA (que tem como alvo o gene de PRNP) nos blastocistos produzidos por fertilização in vitro.

[001953] Através de alguns experimentos descritos acima, foi confirmado que o spCas9 pode ser expressado no zigoto produzido usando o gameta de uma vaca de spCas9 e que a inativação de um gene alvo pode ser induzida pelo spCas9 expressado. 2-3. Inativação na célula da vaca descendente produzida por reprodução natural

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[001954] Para confirmar que Cas9 também é expressado em células de um bezerro nascido por reprodução natural de vacas de spCas9, os presentes inventores isolaram as células primárias do bezerro e realizaram a experiência a seguir.

[001955] Um bezerro (SNU-Cas9-F1) nasceu por reprodução natural entre um SNU-Cas9-4 (do sexo feminino) e um SNU-Cas9-2 (do sexo masculino), e células primárias foram isoladas do bezerro SNU-Cas9-F1. A FIG. 48 (a) mostra que uma proteína fluorescente vermelha é uniformemente expressada nas células primárias.

[001956] O DNA foi extraído das células primárias pelo kit de extração de DNA (kit de Sangue & Tecido DNeasy 69506, Qiagen, Limburg, Holanda) e a PCR de DNA foi realizada usando o DNA extraído, e os resultados da PCR de DNA em relação aos Cas9 e Fat1 foram mostrados serem positivos.

[001957] A FIG. 48 (b) mostra os resultados da PCR do DNA obtidos usando as células primárias do bezerro SNU-Cas9-F1 (ver FIG. 48 (b), 1: marcador de tamanho, 2: gene spCas9, 3: grupo de controle negativo, 4: gene Fat1, 4: grupo de controle negativo).

[001958] Através destes resultados, foi confirmado que as células primárias do SNU-Cas9-F1 incluem um gene transformador da geração de F0.

[001959] Adicionalmente, os presentes inventores conduziram um experimento no qual um sgRNA foi transfectado nas células primárias do bezerro para confirmar que a inativação de um gene alvo também poderia ocorrer nas células do bezerro (F1) nascidas pela reprodução natural de vacas de spCas9.

[001960] Especificamente, o DNA foi extraído de células primárias transfectadas com um sgRNA que pode se ligar especificamente ao gene de PRNP, e o DNA extraído foi carregado em cada tubo de PCR.

[001961] Usando um kit de lise por PCR direto, foram adicionados 10 μL de tampão e adicionalmente foram adicionados 0,5 μL de proteinase K.

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[001962] Os tubos de PCR foram tratados em uma máquina de PCR a 56C por 180 min, tratados a 85C por 15 min, e depois submetidos à PCR após adição de um iniciador direto de PRNP e um iniciador reverso de PRNP. Após a PCR, foram obtidos 10-15 μL do produto da PCR.

[001963] O produto de PCR foi misturado com 0,5-1 μL da endonuclease T7 I e 2 μL do tampão (volume final 20 μL) e reagiu a 37C por cerca de 30 min. Os produtos da reação foram submetidos à eletroforese.

[001964] Como resultado da eletroforese, a ocorrência de indel no gene de PRNP foi confirmada.

[001965] A FIG. 49 mostra os resultados que confirmam o indel do gene de PRNP via PCR de DNA de células primárias de SNU-Cas9-F1, que foram transfectadas com o sgRNA que tem como alvo o gene de PRNP (ver FIG. 49, 1: marcador de tamanho, 2: vaca de tipo selvagem , 3: vaca SNU-Cas9-2, 4: SNU-Cas9-F1, 5: grupo de controle negativo, 6: grupo de controle positivo (gene de PRNP)).

[001966] Os iniciadores de PRNP usados para análise da PCR do DNA para identificação de mutação no gene de PRNP são como divulgados na Tabela 17.

[001967] Através deste experimento, a transmissão da linha germinativa de um transgene para a descendente e a fertilidade de uma vaca fêmea transgênica foram confirmadas.

[001968] Adicionalmente, através deste experimento, foi confirmado que o spCas9 pode ser expressado em um descendente transgênico e que o spCas9 expressado pode formar um complexo com um ácido nucleico guia provido em células ou animais e, assim, inativar o gene alvo.

[001969] Dependendo do tipo do gene alvo, vários efeitos podem ser vistos. Por exemplo, quando o gene de PRNP é usado como gene alvo, como neste experimento, uma vaca com resistência à doença da vaca louca pode ser produzida.

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[001970] Em um outro exemplo, quando o gene da p-lactoglobulina é usado como gene alvo, como neste experimento, pode ser obtido leite sem alérgenos.

[001971] Ou seja, a vaca transgênica na qual spCas9 pode ser expressada pode ser usada para engenharia de proteínas do leite.

3. Segunda edição gênica usando endonuclease guiada por RNA expressada em vaca transgênica- modificação

[001972] Os presentes inventores obtiveram células primárias de um feto bovino tendo spCas9-2A-GFP, de modo a confirmar que a modificação pode ocorrer efetivamente em células derivadas da vaca transgênica acima descrita (vaca de spCas9) (F0), na qual a endonuclease guiada por RNA é expressada.

[001973] A expressão de GFP foi observada nas células spCas9-2A-GFP obtidas, e foi realizado um experimento para modificar no gene mcherry com a localização de GFP como alvo.

[001974] Especificamente, o experimento de modificação foi realizado usando dois métodos diferentes, ou seja, 1) HITI (3-2. injeção de vetor na célula para HITI) e 2) HDR (3-3. injeção de vetor com na célula para HDR), em células onde Cas9 é expressado. 3-1. Construção de vetor

[001975] Dois tipos de vetores doadores foram preparados para os experimentos de modificação em HDR e modificação em HITI.

[001976] A FIG. 50 (a) ilustra parte de um vetor doador para HITI.

[001977] O vetor doador para HITI pode ter uma constituição na qual um primeiro sítio alvo é incluído na extremidade 5’ de um polinucleotídeo doador para modificar, e um segundo sítio alvo é incluído na extremidade 3’ do polinucleotídeo doador. A sequência do vetor doador para HITI é a mesma que SEQ ID NO: 44 (Nome da SEQ: HITI_ doador de RFP _1). O primeiro sítio alvo e o segundo sítio alvo podem ser ligados a sgRNAs, que podem se ligar

342 / 353 especificamente ao gene de GFP, e podem ser clivados por uma nuclease manipulada.

[001978] A FIG. 50 (b) ilustra parte de um vetor doador para HDR.

[001979] O vetor doador para HDR pode ter uma constituição na qual uma primeira sequência de nucleotídeos de homologia (5’-HR descrita na FIG. 50 (b)) é incluída na extremidade 5’ de um polinucleotídeo doador para modificar, e uma segunda sequência de nucleotídeos de homologia (3’-HR descrito na FIG. 50 (b)) está incluído na extremidade 3’ do polinucleotídeo doador. A primeira sequência de nucleotídeos de homologia e a segunda sequência de nucleotídeos de homologia são as mesmas que parte das sequências incluídas no gene da albumina bovina.

[001980] A sequência do vetor doador para HDR é a mesma que SEQ ID NO: 45 (Nome SEQ: HDR_doador de RFP_1).

[001981] A primeira sequência de nucleotídeos de homologia no vetor doador para HDR usada neste experimento é a mesma que a sequência de nucleotídeos do 1º ao 532º da SEQ ID NO: 45; e a segunda sequência de nucleotídeos de homologia é a mesma que a sequência de nucleotídeos da

2.585a 3.044 a da SEQ ID NO: 45. A FIG. 58 ilustra a sequência do vetor doador para HDR (SEQ ID NO: 45), e a porção destacada de toda a sequência representa a primeira sequência de nucleotídeos de homologia e a segunda sequência de nucleotídeos de homologia. 3-2. Injeção de vetor na célula para HITI

[001982] As células primárias obtidas da vaca de spCas9 (F0) foram isoladas e cultivadas pelo método descrito acima. As células primárias cultivadas da vaca de spCas9 (F0) foram isoladas por tripsina. As células isoladas (1 x 105 a 3 x 105) foram transfectadas com um sgRNA (1 μg), que pode se ligar especificamente à GFP pelo método de eletroporação e um vetor doador (1 μg) para HITI. A transfecção foi induzida usando um instrumento Neon e o programa 16 incluído no instrumento foi aplicado como condição da

343 / 353 transfecção. Doze horas após a transfecção, as células foram trocadas com um meio fresco, e as células nas quais o gene mcherry é digerido foram confirmadas usando antibióticos e marcadores de seleção.

[001983] A FIG. 51 (a) mostra os resultados da PCR de DNA confirmando a modificação do gene mcherry; na qual a linha 1 representa o gene marcador; a linha 2 representa o DNA genômico da vaca de spCas9 (grupo de controle), a linha 3 representa células transfectadas com vetor doador para HITI; e a linha 4 representa o grupo de controle negativo. A sequência de iniciadores diretos para a PCR de DNA é SEQ ID NO: 46 (Nome SEQ: HITI_pr_RFP_F_1) e a sequência de iniciadores reversos para a PCR de DNA é SEQ ID NO: 47 (Nome SEQ: HITI_pr_RFP_R_1).

[001984] A FIG. 51 (b) mostra os resultados confirmando a expressão de mcherry nas células primárias da vaca de spCas9, nas quais as células primárias são transfectadas com o vetor doador para HITI. 3-3. Injeção de vetor na célula para HDR

[001985] As células primárias obtidas da vaca de spCas9 (F0) foram isoladas e cultivadas da mesma maneira que no método descrito acima.

[001986] As células isoladas (1 x 105 a 3 x 105) foram transfectadas com um sgRNA (1 μg), que pode se ligar especificamente ao gene de GFP pelo método de eletroporação e um vetor doador (1 μg) para HDR. A transfecção foi induzida usando um instrumento Neon e, o programa 16 incluído no instrumento foi aplicado como condição da transfecção. Doze horas após a transfecção, as células foram trocadas com um meio fresco, e as células nas quais o gene mcherry é modificado foram confirmadas usando antibióticos e marcadores de seleção.

[001987] A FIG. 52 (a) mostra os resultados da PCR de DNA confirmando a modificação do gene mcherry; na qual a linha 1 representa o gene marcador; a linha 2 representa o DNA genômico da vaca de spCas9 (grupo de controle), a linha 3 representa células transfectadas com vetor doador para

344 / 353 HDR; e a linha 4 representa o grupo de controle negativo. A sequência de iniciadores diretos para a PCR de DNA é a SEQ ID NO: 48 (Nome SEQ: HDR_pr_RFP_F_1) e a sequência de iniciador reversa para a PCR de DNA é a SEQ ID NO: 49 (Nome SEQ: HDR_pr_RFP_R_1).

[001988] A FIG. 52 (b) mostra os resultados que confirmam a expressão de mcherry nas células primárias da vaca de spCas9, nas quais as células primárias são transfectadas com o vetor doador para HDR.

[001989] Através deste experimento, foi confirmado que o spCas9 pode ser expressado nas células de uma vaca transgênica e que o spCas9 expressado pode formar um complexo com o ácido nucleico guia provido nas células e, assim, modificar no polinucleotídeo doador no gene alvo.

[001990] Dependendo do tipo do gene alvo, vários efeitos podem ser observados. Por exemplo, quando o gene da β-caseína é usado como gene alvo, várias proteínas podem ser expressadas no leite de uma vaca transgênica, dependendo do tipo de polinucleotídeo doador. 3-4. Transferência nuclear de células somáticas usando a célula primária spCas9 na qual o doador é modificado

[001991] Os presentes inventores realizaram a transferência nuclear de células somáticas usando as células primárias preparadas pelos métodos de HDR e HITI acima descritos. A descrição do método de transferência nuclear de células somáticas foi descrita acima e, portanto, a explicação detalhada é omitida.

[001992] Foi confirmado que foram obtidos embriões nos quais mcherry foi expressado através da transferência nuclear de células somáticas.

[001993] A FIG. 53 mostra a expressão de mcherry em um embrião que é produzido através da transferência nuclear de células somáticas usando as células primárias da vaca de spCas9 tendo um genoma no qual o gene mcherry é modificado.

345 / 353

[001994] Uma vez que o experimento que é o mesmo do método experimental acima descrito pode ser realizado usando um vetor doador que inclui um gene diferente, vários tipos de células nas quais o gene que codifica a proteína alvo é modificado podem ser preparados com precisão. Isso pode ser usado para uma produção em larga escala de vacas que expressam proteínas alvo. [Exemplo experimental 5] Vaca transgênica que expressa endonuclease guiada por RNA e ácido nucleico guia

1. Preparação do vetor que inclui polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA e ácido nucleico guia que codifica polinucleotídeo

[001995] Um vetor de expressão final (doravante, vetor de spCas9- sgRNA) foi preparado usando o gene spCas9 amplificado, um sgRNA que tem como alvo o gene de beta-lactoglobulina (gene BLG) e um gene de proteína fluorescente vermelha.

[001996] A FIG. 54 ilustra parte do vetor de expressão final para expressar um spCas9 e um sgRNA.

[001997] A sequência de sgRNA incluída no vetor de expressão final é a mesma que a SEQ ID NO: 24 divulgada na Tabela 16.

2. Preparação de embrião (MI)

[001998] Como o método para integrar uma toolbox em um genoma bovino e as condições experimentais do mesmo são as mesmas para a integração do gene da proteína alvo acima descrito e as condições experimentais do mesmo, o método para preparar um embrião tendo um genoma no qual os spCas9 e o sgRNA inseridos serão descritos brevemente.

[001999] Como descrito acima, os óvulos bovinos foram coletados separando os COCs do ovário, seguido de lavagem, e os espermatozoides foram coletados separando-os do sêmen bovino por centrifugação.

346 / 353

[002000] Após a remoção das células do cumulus do zigoto obtido por fertilização in vitro entre os óvulos e espermatozoides coletados, o vetor de spCas9-sgRNA descrito acima e o vetor de transposase foram microinjetados no citoplasma (vetor de spCas9-sgRNA e transposase cada um a 50 ng/mL, proporção de 1:1) usando a máquina de microinjetor (Femtojet, Eppendorf, Alemanha).

[002001] A expressão de uma proteína fluorescente vermelha foi confirmada visualmente no embrião (embrião de spCas9-sgRNA) produzido após a microinjeção, e uma vaca transgênica foi preparada usando o embrião.

3. Preparação de vaca transgênica 3-1. Vaca transgênica

[002002] Uma vez que o método para transplantar um embrião transformado no útero de uma mãe de substituição e as condições experimentais do mesmo estão descritas acima, a seguir, um método para produzir uma vaca transgênica será brevemente descrito.

[002003] O embrião spCas9-sgRNA produzido pelo método acima foi transplantado para o útero de uma mãe de substituição, no 45º dia pós-estro, a sobrevivência do embrião e a gestação da mãe de substituição foram confirmadas por palpação retal e ultrassonografia.

[002004] Uma vaca transgênica (SNU-Cas9-BLG-KO-1 (macho)) tendo um genoma no qual o gene spCas9 e o sgRNA são inseridos nasceu da mãe de substituição e os espermatozoides foram obtidos no SNU-Cas9-BLG-KO -1 (do sexo masculino). 3-2. Confirmação da presença/ausência de inserção de polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por RNA e codificação de polinucleotídeo que codifica ácido nucleico guia no genoma bovino transgênico 3-2-1. Confirmação da expressão da proteína fluorescente

[002005] As células primárias foram isoladas do tecido da pele de SNU- Cas9-BLG-KO-1 (do sexo masculino) pelo método de isolamento de células

347 / 353 primárias acima descrito e a expressão de uma proteína fluorescente vermelha foi confirmada a partir das células primárias.

[002006] A FIG. 55 (a) mostra a expressão de uma proteína fluorescente vermelha nas células primárias de SNU-Cas9-BLG-KO-1 (ver FIG. 55 (a), esquerda: condição de luz visível, direita: condição de fluorescência).

[002007] O vetor de spCas9-sgRNA foi projetado para incluir um gene da proteína fluorescente vermelha e, a partir dos resultados acima, foi confirmado visualmente que os polinucleotídeos que codificam o gene spCas9 e o sgRNA foram inseridos no genoma de SNU-Cas9-BLG-KO-1 (do sexo masculino). 3-2-2. Resultados de PCR e RT-PCR de DNA

[002008] A presença/ausência de inserção de polinucleotídeos que codificam o gene spCas9 e sgRNA no genoma de SNU-Cas9-BLG-KO-1 (do sexo masculino) foi confirmada usando PCR e RT-PCR do DNA (Eppendorf Vapo Protect Mastercycler, Eppendorf, Alemanha). Os iniciadores usados para realizar a PCR e a RT-PCR do DNA e são mostrados na Tabela 18 abaixo. [Tabela 18] Tipo de Iniciador Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência spCas9-Direto pr_spCas9_F_2 SEQ ID NO:50 gacaagaagtacagcatcgg spCas9-Inverso pr_spCas9_R_2 SEQ ID NO:51 caaccagctgttcgaggaga GAPDH- Direto pr_GAPDH_F_3 SEQ ID NO:52 GGCGTGAACCACGAGAAGTA GAPDH- Inverso pr_GAPDH_R_3 SEQ ID NO:53 CCCTCCACGATGCCAAAGT

[002009] Uma vez que os métodos de PCR e RT-PCR de DNA foram descritos acima, a descrição detalhada dos mesmos é omitida. 3-2-3. Confirmação de indel na beta-lactoglobulina

[002010] O DNA genômico inteiro foi isolado a partir de fibroblastos do SNU-Cas9-BLG-KO-1 (do sexo masculino) pelo Mini Kit de Extração de DNA Total G-spinTM (iNtRON, Seul, República da Coréia).

[002011] A mutação no gene da p-lactoglobulina foi confirmada por PCR fluorescente (fPCR) usando o DNA genômico isolado.

348 / 353

[002012] A FIG. 55 (b) mostra os resultados que confirmam a inativação do gene da beta-lactoglobulina nos fibroblastos do SNU-Cas9-BLG-KO-1 usando fPCR (ver FIG. 55 (b), esquerda: fibroblasto bovino do tipo selvagem, direita: fibroblastos nos quais o BLG é inativado).

[002013] Os iniciadores para confirmar a mutação no gene da beta- lactoglobulina são como divulgados na Tabela 19 abaixo. [Tabela 19] Tipo de Iniciador Nome da SEQ SEQ ID NO Sequência Direta iniciador in_pr_BLG_F_1 SEQ ID NO:54 TTAAAGGCCGTGTCTCCAGT Inversa iniciador in_pr_BLG_R_1 SEQ ID NO:55 GAAAGCCCTGGATAAGCAGC

[002014] Através deste experimento, foi confirmado que, no caso de uma vaca transgênica na qual ambos spCas9 e um ácido nucleico guia podem ser expressados, o gene alvo incluindo uma sequência que é igual ou complementar a uma região do ácido nucleico guia pode ser inativado, embora nenhum tratamento adicional seja aplicado.

[002015] Adicionalmente, foi confirmado que uma célula transformada, um embrião transgênico e/ou um animal transgênico podem sobreviver mesmo que o gene alvo seja inativado.

[002016] Vários efeitos podem aparecer de acordo com o tipo do gene alvo. Em particular, no caso em que o gene da beta-lactoglobulina (BLG) é usado como gene alvo, como neste experimento, é possível obter leite sem alérgenos. Ou seja, uma vaca transgênica na qual spCas9 e/ou um ácido nucleico guia podem ser expressados pode ser usada na engenharia de proteínas do leite.

[002017] Adicionalmente, foi confirmado que a célula transformada, o embrião transgênico e/ou o animal transgênico podem sobreviver mesmo quando spCas9 e um ácido nucleico guia são expressados continuamente. [Exemplo experimental 6] Vaca transgênica na qual a expressão da endonuclease guiada por RNA é controlada pelo elemento de controle da expressão

349 / 353

[002018] Os presentes inventores prepararam uma célula primária bovina na qual a expressão do componente de uma nuclease manipulada pode ser controlada, e confirmaram que a edição gênica pode ser controlada na célula primária bovina.

1. Preparação do vetor

[002019] Foi preparado um vetor para produzir as células primárias de uma vaca na qual a expressão do componente de uma nuclease manipulada pode ser controlada.

[002020] O vetor no qual a expressão de uma endonuclease guiada por RNA pode ser controlada é descrito com referência à FIG. 56.

[002021] O vetor inclui [gene da proteína fluorescente verde loxP-poliA- loxP] na direção final 5’ do DNA de spCas9 (apresentado por Toolgen). A expressão de Cas9 não ocorre até que o [loxP- gene da proteína fluorescente verde-poliA-loxP] seja excisado.

[002022] O sgRNA divulgado na FIG. 56 tem o gene de TP53 como gene alvo e a sequência do sgRNA é a mesma da SEQ ID NO: 27 (GCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGG).

2. Preparação de célula bovina na qual a expressão de endonuclease guiada por RNA pode ser controlada

[002023] Os presentes inventores isolaram fibroblastos de uma vaca de tipo selvagem, de modo a produzir uma célula bovina na qual a expressão de uma endonuclease guiada por RNA pode ser controlada.

[002024] Uma vez que o método para isolar o fibroblasto bovino foi descrito acima no Exemplo Experimental 1, a explicação detalhada é omitida.

[002025] Os fibroblastos isolados foram dispensados em placas de 6 poços. Quando as células atingiram cerca de 50-60% de confluência, o vetor acima descrito que pode controlar a expressão da endonuclease guiada por RNA (ver FIG. 56 (a)) (daqui em diante, vetor controlável por expressão) foi transfectado.

350 / 353

[002026] A expressão de uma proteína fluorescente verde foi confirmada na célula bovina transfectada com um vetor controlável pela expressão, e foram selecionadas as células bovinas nas quais a expressão de uma proteína fluorescente verde foi confirmada.

[002027] Uma vez que o gene da proteína fluorescente verde está incluído no vetor controlável da expressão, as células bovinas nas quais a proteína fluorescente verde é expressada são células bovinas onde a expressão de uma endonuclease guiada por RNA pode ser controlada (daqui em diante, célula controlável pela expressão).

3. Resultados do ensaio T7E1 em células transformadas

[002028] No que diz respeito à célula controlável pela expressão preparada pelo método descrito acima, a fim de confirmar que a edição gênica pode ocorrer apenas quando a Cre recombinase (um material que afeta o elemento de controle da expressão) é tratada na célula controlável da expressão, os presentes inventores trataram a expressão de células controláveis com Cre recombinase. Em seguida, o PCR de DNA e o ensaio T7E1 foram realizados em relação às células controláveis por expressão tratadas com Cre recombinase e as células controláveis por expressão não tratadas com Cre recombinase.

[002029] O DNA foi extraído das células controláveis pela expressão não tratadas com a Cre recombinase e, em seguida, o DNA extraído (amostra 1) foi transferido para um tubo de PCR. Além disso, o DNA foi extraído das células controláveis pela expressão tratadas com a recombinase Cre e, em seguida, o DNA extraído (amostra 2) foi transferido para um tubo de PCR.

[002030] Além disso, a água destilada sem DNA como um grupo de controle negativo foi carregada em um tubo de PCR.

[002031] Como grupo de controle positivo, o DNA foi extraído das células primárias de uma vaca tendo um genoma, no qual foram inseridos polinucleotídeos que codificam o DNA de spCas9 e sgRNA, transfectados com um vetor que não inclui [loxP-gene da proteína fluorescente verde-poliA-

351 / 353 loxP2772] (isto é, um elemento de controle de expressão) (ver FIG. 56 (b)) e, em seguida, o DNA extraído (grupo de controle positivo) foi transferido para um tubo de PCR.

[002032] Usando um kit de lise por PCR direto, 10 μL de tampão foram adicionados a cada um dos tubos de PCR contendo amostra 1, amostra 2, amostra do grupo de controle negativo e amostra do grupo de controle positivo e, em seguida, 0,5 μL de proteinase K foram adicionados adicionalmente a cada um dos tubos de PCR.

[002033] Cada um dos tubos de PCR foi tratado em uma máquina de PCR a 56C por 180 min, tratado a 85C por 15 min e, em seguida, submetido à PCR após adição de um iniciador direto de PRNP e um iniciador reverso de PRNP. Após a PCR, foram obtidos 10-15 μL de cada um dos produtos da PCR.

[002034] Cada um dos produtos de PCR foi misturado com 0,5-1 μL da endonuclease T7 I e 2 μL do tampão (volume final 20 μL) e reagiu a 37C por cerca de 30 min. Os produtos da reação foram submetidos a eletroforese.

[002035] Como resultado, foi confirmado que um indel ocorreu em um gene alvo quando a recombinase Cre foi tratada nas células controláveis pela expressão.

[002036] A FIG. 57 mostra os resultados da PCR do DNA confirmando indels de um gene alvo em células controláveis por expressão não tratadas com Cre recombinase e células controláveis por expressão tratadas com Cre recombinase (ver FIG. 57, 1: marcador de tamanho, 2: grupo de controle negativo, 3: célula controlável por expressão não tratada com Cre recombinase, 4: célula controlável por expressão tratada com Cre recombinase, 5: grupo de controle positivo).

[002037] Através deste experimento, os presentes inventores confirmaram que a edição gênica pode ser controlada para ser alcançada no tempo desejado quando uma vaca ou células da vaca tendo um genoma no qual

352 / 353 um elemento de controle de expressão que pode controlar a expressão de componentes de uma nuclease manipulada é inserido é usado. [Número de referência] 100, 320, 340: toolbox 101, 107, 201, 207, 322, 329, 343, 349, 361, 367, 371, 379, 701, 705, 801, 808, 901, 906: sequência de ITR 102, 103, 132, 363, 373: polinucleotídeo que codifica endonuclease guiada por

RNA 104, 105, 134, 365, 375, 377: polinucleotídeo que codifica ácido nucleico guia 110: polinucleotídeo que codifica componentes de nuclease manipulada 130, 130 (a), 130 (b): elemento de controle de expressão 202, 203, 204, 205, 206: polinucleotídeo tendo sequência PAM 210, 220, 230, 240: cromossomo 231, 420, 430: sítio alvo 232, 232 (a), 232 (b), 423, 433: polinucleotídeo doador 401: zigoto 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417: embrião 704, 706, 804, 807, 905: polinucleotídeo que codifica transposase 700 (b), 800 (b): toolbox de excisão 909, 911: polinucleotídeo que codifica recombinase

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[002038] Quando um animal transgênico tendo um genoma no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica é inserido, os animais nos quais os genes são inativados ou modificados podem ser preparados com mais eficiência.

[002039] Por exemplo, um animal transgênico tendo um genoma no qual um gene que codifica uma proteína alvo foi inserido pode ser preparado usando uma ferramenta de edição gênica expressada no animal transgênico. Neste caso, o animal transgênico pode ser utilizado como um biorreator.

353 / 353

[002040] Em um outro exemplo, um animal transgênico tendo um genoma no qual um gene específico é eliminado pode ser preparado usando uma ferramenta de edição gênica expressada no animal transgênico. Nesse caso, o animal transgênico pode ser usado como modelo animal para a doença ou animal de melhoramento da raça, em particular, quando o animal transgênico é um animal grande, o animal transgênico pode ter melhor aplicabilidade industrial quando usado como biorreator para produzir uma proteína alvo ou quando usado como modelo animal para a doença.

[002041] Além disso, uma célula transgênica, um embrião e um animal que tem um genoma, no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica foi inserido, podem ser usados como uma tecnologia de plataforma.

[002042] Por exemplo, uma vez que uma célula transgênica, um embrião e um animal que têm um genoma no qual um gene que codifica uma ferramenta de edição gênica foi inserido, podem ser usados para modificar em vários tipos de genes, a célula transgênica, o embrião e o animal podem ser usados para produzir uma variedade de proteínas alvo.

TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002043] SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 56 mostram sequências iniciadoras.

[002044] SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 mostram a sequência de um gene de transposon.

[002045] As SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 29 mostram a sequência de um ácido nucleico guia.

[002046] As SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 46 mostram a sequência de um vetor doador.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um embrião transgênico não humano tendo um genoma incluindo um gene com um sítio modificado, caracterizado pelo fato de que compreende: preparar um zigoto não humano ou um embrião não humano tendo um genoma incluindo um polinucleotideo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um gene com um sítio alvo, em que o zigoto não humano ou o embrião não humano expressa uma endonuclease guiada por RNA; microinjectar um RNA guia ou um polinucleotídeo que codifica o RNA guia no zigoto não humano ou no embrião não humano, em que o RNA guia pode reconhecer e se ligar ao sítio alvo, em que o polinucleotídeo que codifica o RNA guia está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral; fazendo com que a endonuclease guiada por RNA e o RNA guia forme um complexo; e fazendo com que o complexo modifique o sítio alvo para que o sítio modificado seja produzido, em que o sítio modificado não é reconhecido pelo RNA guia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o zigoto não humano ou o embrião não humano é preparado por um óvulo não humano ou um esperma não humano com um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introduzir um polinucleotídeo doador no zigoto não humano ou embrião não humano.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador é incluído em um vetor plasmídico ou um vetor viral.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador é introduzido simultaneamente como o RNA guia.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador e o RNA guia são introduzidos como uma forma incluída em um vetor.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o sítio modificado é um sítio onde o polinucleotídeo doador é modificado (knocked in).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o embrião não humano transgênico expressa uma proteína codificada pelo polinucleotídeo doador.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o embrião não humano transgênico não expressa uma proteína codificada pelo gene com o sítio modificado.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o embrião não humano transgênico expressa uma proteína codificada em uma forma mutante pelo gene com o sítio modificado.

11. Método para produzir um animal não humano transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o transplante de um embrião não humano transgênico no útero de uma mãe de substituição, em que o embrião não humano transgênico tem um genoma incluindo um gene com um sítio modificado, o embrião não humano transgênico sendo preparado por um método que compreende as etapas de: i) preparar um zigoto não humano ou um embrião não humano tendo um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA e um gene com um sítio alvo, em que o zigoto não humano ou o embrião não humano expressa a endonuclease guiada por RNA;

ii) microinjectar um RNA guia ou um polinucleotídeo que codifica o RNA guia no zigoto não humano ou no embrião não humano, em que o RNA guia pode reconhecer e se ligar ao sítio alvo, em que o polinucleotídeo que codifica o RNA guia está incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral; iii) fazer com que a endonuclease guiada por RNA e o RNA guia formem um complexo; e iv) fazer com que o complexo modifique o sítio alvo para que o sítio modificado seja produzido, em que o sítio modificado não é reconhecido pelo RNA guia.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o zigoto não humano ou o embrião não humano é preparado por um óvulo não humano ou um esperma não humano tendo um genoma incluindo um polinucleotídeo que codifica uma endonuclease guiada por RNA.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as etapas compreendem ainda a introdução de um polinucleotídeo doador no zigoto não humano ou no embrião não humano.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador é incluído em um vetor plasmídico ou vetor viral.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador é introduzido simultaneamente com o RNA guia.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador e o RNA guia são introduzidos como uma forma incluída em um vetor.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o sítio modificado é um sítio em que o polinucleotídeo doador é modificado (knocked in).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o embrião não humano transgênico expressa uma proteína codificada pelo polinucleotídeo doador.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o animal não humano transgênico expressa uma proteína codificada pelo polinucleotídeo doador.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que em que o embrião não humano transgênico não expressa uma proteína codificada pelo gene com o sítio modificado.

21. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o embrião não humano transgênico expressa uma proteína codificada em uma forma mutante pelo gene com o sítio modificado.

22. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um genoma do animal não humano transgênico compreende um gene com um sítio modificado idêntico ao sítio modificado presente no genoma do embrião não humano transgênico.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o animal não humano transgênico expressa uma proteína codificada em uma forma mutante pelo gene com o sítio modificado no genoma ou não expressa uma proteína codificada pelo gene com o sítio modificado no genoma.

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