BR112019021668A2 - Composto acilado de insulina - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a compostos que se relacionam ao tratamento de diabetes e/ou da hiperglicemia. mais especificamente, os compostos descritos se referem a compostos de insulina acilada que diminuem a glicose no sangue, composições farmacêuticas que contém esses compostos, usos terapêuticos de tais compostos e um composto intermediário usado para a fabricação de compostos de insulina acilada.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
COMPOSTO ACILADO DE INSULINA.
[001] A presente invenção refere-se ao tratamento de diabetes e/ou hiperglicemia. A invenção refere-se a compostos que abaixam a glicose no sangue, composições farmacêuticas que contenham tais compostos e usos terapêuticos de tais compostos.
[002] De forma ideal a terapia de reposição de insulina para pacientes diabéticos seria o mais próximo possível do padrão de secreção endógena de insulina em indivíduos saudáveis. A demanda fisiológica de insulina pode ser separada em duas fases: (a) uma fase de absorção de nutrientes que requer um pulso de insulina para descartar o aumento de glicose no sangue relacionado à refeição, também conhecido como insulina prandial e (b) uma fase de pós absorção que requer suprimento sustentado de insulina para regular a produção hepática de glicose para manter a glicose no sangue em jejum ideal, também conhecida como insulina basal.
[003] A terapia com insulina eficaz para pessoas com diabetes pode envolver em geral o uso combinado de dois tipos de formulações de insulina exógenas: uma insulina prandial de ação rápida nas refeições e uma insulina basal de ação mais longa administrada uma ou duas vezes ao dia para o controle dos níveis de glicose no sangue entre as refeições. Uma ou mais características da insulina endógena que podem ser desejáveis para emular incluem uma afinidade de ligação aos receptores de insulina humana, ligação preferencial aos receptores de insulina humana sobre o receptor de IGF-1 humano, fosforilação dos receptores de insulina humana e redução de glicose no sangue.
[004] Uma insulina basal exógena desejável também deve fornecer uma ação de tempo prolongado - isto é, podería controlar os níveis de glicose no sangue durante pelo menos 12 horas, e de
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2/29 preferência durante 24 horas ou mais, sem risco significativo de hipoglicemia. Algumas insulinas basais têm uma duração de ação de 24 horas ou mais. Um composto com um perfil de ação no tempo prolongado, sem variações significativas na eficácia durante esse tempo, pode diminuir o risco de hipoglicemia noturna e permitir maior variabilidade nos tempos de dosagem diários sem aumentar o risco de hipoglicemia do paciente. As características de uma insulina basal exógena que pode ser desejável incluem taxa de depuração reduzida da corrente sanguínea e estabilidade química em múltiplas concentrações, o que podería contribuir para a estabilidade prolongada do prazo de validade.
[005] Existe a necessidade de tratamentos alternativos para diabetes e/ou hiperglicemia em pacientes com necessidade do mesmo. Alguns compostos de insulina acilados são conhecidos, ver, por exemplo, a Patente U.S. NQ. 6.444.641 e Patente U.S. NQ. 7.615.532, mas há uma necessidade com relação a tratamentos alternativos adicionais. A presente invenção fornece um composto que é útil no tratamento de diabetes, reduzindo a hemoglobina A1c e reduzindo os níveis de glicose no sangue em pacientes que estejam necessitando da mesma. Os presentes compostos também são feitos com a utilização um novo composto, descrito abaixo.
[006] A presente invenção inclui um composto da fórmula (Fórmula I):
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I I
GiVEQCCTSICSLYQLENYCXaa
I /
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT P < )r-T H o' na qual Xaa é o aminoácido glicina ou aspargina.
[007] O composto de Fórmula I é um composto de insulina que consiste em uma cadeia A com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ: 1 e uma cadeia B com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ: 4, em que existe uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 6 da SEQ ID N-: 1 e a cisteína na posição 11 da SEQ ID NQ: 1, existe uma ligação dissulfeto entre a cisteína na posição 7 da SEQ ID N-: 1 ea cisteína na posição 7 da SEQ ID NQ: 4, existe uma ligação de dissulfeto entre a cisteína na posição 20 da SEQ ID N-: 1 e a cisteína na posição 19 da SEQ ID N-:4ea lisina na posição 29 da cadeia B (SEQ ID NQ: 4) é quimicamente modificada através da formação de uma ligação de amida entre o grupo épsilon-amino da cadeia lateral da lisina e o carboxilato livre de AEEA com OH-C18-YGIu-YGIu-Lys(AEEA) onde OH-C18 é o ácido octadecanodióico, yGlu é o ácido Lglutâmico conectado através de seu grupo gama-carboxila de cadeia lateral e o AEEA é o ácido 2- [2- (2-aminoetóxi)etóxi] acético. A estrutura acima, a Fórmula I, contém os códigos padrão de aminoácidos de letra única para os resíduos de aminoácidos da cadeia de insulina A e cadeia B, com exceção do resíduo 29 da cadeia B, que é a lisina, onde a estrutura desse resíduo de aminoácido foi expandida.
[008] Os presentes compostos incluem ainda o Composto 12,
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4/29 que tem a estrutura da Fórmula I e em que Xaa é o aminoácido glicina. Os presentes compostos incluem ainda o Composto 19, que tem a estrutura da Fórmula I e em que Xaa é o aminoácido asparagina.
[009] O presente pedido de patente também proporciona uma composição farmacêutica que compreende o composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. O presente pedido de patente ainda fornece um método para o tratamento de diabetes em um paciente, que compreende a administração a um paciente em que esteja necessitando da mesma de uma quantidade eficaz do composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19 ou uma composição farmacêutica que compreenda o composto de Fórmula I, o Composto 12 ou o Composto 19.
[0010] O presente pedido de patente proporciona um método para o tratamento de hiperglicemia em um paciente que compreende a administração a um paciente que esteja necessitando da mesma de uma quantidade eficaz do composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19 ou uma composição farmacêutica que compreenda o composto de Fórmula I, Composto 12, ou Composto 19. O presente pedido de patente também proporciona um composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19 para ser usado em terapia. O presente pedido de patente fornece ainda um composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19 para ser usado para o tratamento de diabetes ou no tratamento de hiperglicemia.
[0011] O presente pedido de patente proporciona um composto, Composto A, que tem a fórmula:
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[0012] O presente pedido também fornece o uso do Composto A na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes e/ou hiperglicemia. O presente pedido fornece ainda o uso do Composto A na preparação ou fabricação de um composto de Fórmula I, Composto 12 ou Composto 19.
[0013] Os compostos da presente invenção têm uma taxa de depuração mais lenta que as insulinas aciladas conhecidas, como a insulina degludec, que podería melhorar a biodisponibilidade, alcançar um perfil farmacocinético mais estável em seres humanos ao longo do tempo e/ou aumentar a duração da ação do composto in vivo. Além disso, os compostos da presente invenção exibem uma baixa taxa de degradação química, o que indica que eles aumentaram a estabilidade química e podem alcançar uma vida útil mais longa do que as insulinas aciladas conhecidas, como a insulina degludec.
[0014] O termo tratamento ou tratando, na forma usada aqui, neste pedido de patente, se refere ao gerenciamento e atendimento de um paciente com diabetes ou hiperglicemia, ou outra condição para a qual a administração de insulina é indicada com o objetivo de combater ou aliviar os sintomas e complicações dessas condições. O paciente a ser tratado é um animal e, de preferência, um ser humano.
[0015] Na forma como utilizada aqui, neste pedido de patente, a expressão quantidade eficaz se refere à quantidade ou dose de um composto da presente invenção ou de uma composição farmacêutica que contenha um composto da presente invenção, que mediante administração de dose única ou múltipla ao paciente ou sujeito,
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6/29 provocará a resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que está sendo procurado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. Uma dose pode incluir uma dose inicial de carga mais alta, seguida por uma dose mais baixa.
[0016] Os termos paciente, sujeito e indivíduo, na forma como usados aqui, neste pedido de patente são intercambiáveis, se referem a um animal, de preferência os termos se referem a seres humanos. Em determinadas modalidades, o paciente, de preferência um ser humano, é ainda caracterizado com uma doença ou distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução dos níveis de glicose no sangue.
[0017] As composições farmacêuticas que compreendem o composto da presente invenção podem ser administradas por via parenteral a pacientes que estejam necessitando de um tal tratamento. A administração parentérica pode ser realizada através de injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta ou injetor acionado mecanicamente. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão.
[0018] Modalidades da presente invenção fornecem composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente que compreende a administração a um paciente que esteja necessitando de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições farmacêuticas podem ser preparadas através de qualquer uma de uma variedade de técnicas com a utilização de excipientes convencionais para produtos farmacêuticos que são bem conhecidos na técnica. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 21- edição, University of the Sciences Filadélfia, Filadélfia, PA, EUA (2006)).
[0019] Os compostos reivindicados podem ser utilizados em
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7/29 combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis para o tratamento de diabetes e/ou condições relacionadas ao diabetes. Os exemplos não limitativos dos agentes terapêuticos adicionais que podem ser combinados com os compostos reivindicados incluem: insulina ou análogos de insulina; biguanidas; sulfonilureias; tiazolidinedionas; inibidores de dipeptidil peptidase-4 (DPP-4); inibidores do transportador de glicose dependente de sódio (SGLT2); compostos de incretina, tais como análogos do glucagon-tipo-peptideo-1 (GLP-1) ou GLP-1, polipeptídeo inibitório gástrico (GIP) ou análogos GIP, análogos da oxintomodulina ou oxinomomulina; ou combinações de qualquer um dos agentes anteriores. Os compostos reivindicados e o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) podem ser administrados juntos através da mesma via e dispositivo de suprimento, como uma única pílula, cápsula, comprimido ou formulação injetável; ou administrados separadamente, ao mesmo tempo, em dispositivos ou vias de suprimento separados; ou administrado sequencialmente.
[0020] Um dos compostos de insulina acilada reivindicados, o Composto 12, foi gerado através de acilação seletiva do grupo amino LysB29 épsilon da insulina A21G (insulina humana em que o 212 aminoácido da cadeia da insulina A é substituído por Glicina, insulina A21G) com a intermediário de ácido graxo ligante: C18-OtBu-yGlu (OtBu) -yGlu (OtBu) -Lys (Boc) -AEEA-OH, em que C18-OtBu é ácido 18-terc-butoxi-18-oxo- octadecanodióico, yGlu é L ácido glutâmico conectado através de seu grupo gama carboxila de cadeia lateral, e AEEA é ácido 2- [2- (2-aminoetoxi) etóxi] acético.
[0021] A geração da molécula ocorreu em três estágios principais: 1) geração de insulina A21G, 2) síntese do intermediário ligante-ácido graxo e 3) acilação, desproteção, purificação e troca de sal para isolar o composto 12.
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[0022] A parte de insulina dos presentes compostos pode ser preparada através de uma variedade de técnicas conhecidas por um versado na técnica, como por meio da produção de uma molécula de proteína precursora, com a utilização de técnicas de DNA recombinante. O DNA, incluindo cDNA e DNA sintético, pode ser de filamento duplo ou de filamento simples. As sequências de codificação que codificam a molécula de proteína precursora descrita aqui, neste pedido de patente, podem variar como resultado da redundância ou degeneração do código genético. O DNA pode ser introduzido em uma célula hospedeira para produzir a proteína precursora da presente invenção. Uma célula hospedeira apropriada é transfectada de forma transitória ou de maneira estável ou transformada com um sistema de expressão para a produção da proteína precursora. As células hospedeiras podem ser células bacterianas, como as cepas K12 ou B de Escherichia coli, células de fungos, como células de leveduras ou células de mamíferos, como células de ovário de hamster chinês (CHO).
[0023] Os vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integrante do DNA do cromossoma do hospedeiro. Em geral os vetores de expressão irão conter marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina, neomicina e di-hidrofolato redutase, para permitir a seleção daquelas células transformadas com as sequências de DNA desejadas.
[0024] Os presentes compostos podem ser preparados através de uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, bem como naqueles métodos descritos abaixo. As etapas sintéticas específicas com relação a cada uma das rotas descritas podem ser combinadas de maneiras diferentes para a preparação dos compostos descritos aqui, neste pedido de patente. O composto 19 foi preparado de uma maneira similar aquela do composto 12.
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[0025] A parte da molécula de ácido graxo ligante dos Compostos 12 e 19, com a fórmula mostrada abaixo, Composto A, é gerada usando síntese em fase sólida, como mostrado na Figura 2.
Composto A
FmooNFF'
Fmoc-AEEA
1. FrTKJC-LvsfBocVOH
HAW, ÓiEA. DMF
2. Pipericiina/DMt-
1. Emoc-Glu-OfBu. HATH DIEA, DMF
2. PiperáSnaOslF
3. s-moc-Giu-OtBu HAW lííEA. DMF
PipsfiSina/DMF
5. CIS-OíBu. HATU. lííEA, DMF
MHRor·
1. HFÍP/DCM
2. RF-HPLC
TFAM2O/ffeCN
SiiaC hrotn XDB t -C N
C»mposto A
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Composto A
Representação esquemática da síntese do Composto A (PS indica suporte de polímero)
[0026] Existe potencial para gerar o Composto A com a utilização de apenas métodos de fase de solução ou em combinação com métodos de fase sólida que podem ser mais escaláveis. A conjugação da molécula de ácido graxo ligante à insulina A21G é realizada em um solvente orgânico (N-metil-2-pirrolidona (NMP)/sulfóxido de dimetil (DMSO)) devido à solubilidade do terc-butiloxicarbonil Boc/tercésteres butílicos tBu de ácidos graxos de ligação à base de aminoácidos protegidos. No entanto, esquemas alternativos de proteção/ desproteção podem ser planejados para tornar o ácido graxo do ligante solúvel em solução aquosa para minimizar o uso de solventes orgânicos.
[0027] Da mesma forma, a última transformação química remove os grupos de proteção Boc/tBu com a utilização de ácido trifluoroacético (TFA). Uma estratégia alternativa de proteção/ desproteção pode ser elaborada para condições mais suaves de divagem.
[0028] O composto A é gerado através de síntese de peptídeo em fase sólida.
[0029] Fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) -Lys (Boc) -OH (1430 mg, 3 mmols, 2 eq em relação à resina; catálogo Novabiochem # 852012) é misturado com 1-[Bis (dimetilamino) metileno] -1H-1,2,3-triazolo[ Hexafluorofosfato de 4,5-b] peridíneo 3-oxidado (HATU) (1150 mg, 3 mmols, 2 eq em relação à resina; catálogo Oakwood Chemical # 023926) e N, N-diisopropil etilamina (DIEA) (1333 ul, 7,6 mmols, 5 eq.) em 10 ml de DMF durante 2 minutos e depois transferido para o recipiente que contém resina de cloreto de H-AEEA-2-clorotritil (2,11 g, 0,72 mmol/g, 1,52 mmol; catálogo internacional de peptídeos # RHX
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11074-PI), que é pré inchado em diclorometano (DCM) e pré lavado com dimetilformamida (DMF).
[0030] A suspensão espessa é misturada durante 1,5 h, filtrada e a resina é bem lavada com DMF (teste de Kaiser é negativo). O grupo de proteção Fmoc é removido através de tratamento da resina com 20% de piperidina/DMF (10 ml, 30 min). Depois de uma lavagem da resina com DMF (40 ml), o teste de Kaiser é positivo para fornecer a resina H2N-Lys (Boc) -AEEA-2-clorotritil-cloreto (1,52 mmol em teoria).
[0031] O Fmoc-Glu-OtBu (1297 mg, 3,0 mmols, 2,0 eq, catálogo Ark Pharma # AK-48532) é pré ativado (2min) com HATU (1153 mg, 3 mmols, 2 eq) usando DIEA como base (1333 μΙ, 7,7 mmols), 5,0 eq) em 10 ml de DMF, depois transferidos para a resina. A suspensão espessa é misturada durante 3 horas, filtrada e a resina é bem lavada com DMF (teste de Kaiser é negativo).
[0032] O grupo protetor Fmoc é removido através do tratamento da resina com 20% de piperidina/DMF (10 ml, 30 min) seguido de uma lavagem da resina com DMF (40 ml, o teste de Kaiser é positivo). Um segundo Fmoc-Glu-OtBu é acoplado à resina repetindo as condições acima com a utilização de um tempo de acoplamento de 1,5 horas.
[0033] Depois da remoção do último grupo protetor Fmoc, o ácido 18-terc-butóxi-18-oxo- octadecanodióico (1,13 g, 3,0 mmols, 2,0 eq) é pré ativado (2 min) com HATU (1,15 g, 3,0 mmols, 2,0 eq) com a utilização de DIEA como base (1333 μΙ, 7,7 mmols, 5,0 eq) em 10 ml de DMF e em seguida transferido para a resina. A suspensão espessa é misturada durante 3 horas, filtrada e a resina é lavada bem primeiro com DMF e em seguida com DCM (teste de Kaiser é negativo). O ácido graxo do ligante protegido é clivado da resina através da mistura com 30% de HFIP/DCM (20 m) durante uma hora. A resina é filtrada e enxaguada bem com DCM. Os filtrados combinados são evaporados
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12/29 para dar um óleo in vácuo. O óleo residual é diluído com acetonitrila (15-20 ml) e evaporado in vácuo novamente para dar um óleo.
[0034] A amostra é novamente dissolvida com acetonitrila (15-20 ml) e é evaporada in vácuo para formar um óleo. Uma corrente suave de nitrogênio evapora a acetonitrila residual para dar 2,6 gramas de sólido amorfo bruto (teoria = 1,7 gramas).
[0035] A purificação começa com a amostra bruta sendo dissolvida em 5 ml de DMF e 20 ml de acetonitrila (incluindo lavagens do balão). Em seguida, é adicionada água para dar 40 ml de uma solução nebulosa. 5 ml de acetonitrila adicional fornecem uma solução transparente (volume total igual a 45 ml (33% aquoso). A purificação é realizada carregando a amostra em uma coluna de HPLC de fase reversa ciano de semi preparação (SilaChrom XDB1-CN; 10pm, 100Á; 2,1 x 25cm).
[0036] A amostra é em seguida eluída com a utilização de um gradiente de 40 a 60% de B ao longo de 72 min, 15 ml/min, 60°C (tampão A = TFA a 0,1% em água e tampão B = TFA a 0,1% em acetonitrila). As frações determinadas para conter o produto desejado por RP-HPLC analítico são reunidas e liofilizadas para dar 1,22 gramas de produto (Composto A) como um sólido amorfo branco (72% da teoria; 91% de pureza por RP-HPLC; obs MW = 1114,6 Daltons (Da);teo MW = 1114,45 Da).
[0037] A acilação começa com 404,9 mg; 0,363 mmol; 1,32 equivalentes do Composto A, síntese descrita acima, e TSTU (O- (NSuccinimidil) -Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilurônio tetrafluoroborato) (91,5 mg 0,3039 mmol; 1,1 equiv), que são dissolvidos em 2,5 ml de N-metil-2pirrolidona (NMP). A esta solução é adicionada diisopropil etilamina (DIEA, 192 μΙ; 1,102 mmol; 4 equiv), e a mistura resultante é incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos para gerar o éster Composto A-OSu em NMP e usada diretamente.
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[0038] Na criação do Composto 12, a uma solução de insulina A21G (ou a uma solução de insulina humana no caso do Composto 19) (sal TFA; 1,558 g; 0,276 mmol) dissolvido em 15 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) 1, 8-Diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (DBU; 495 μΙ, 3,31 mmols, 12 eq., Número de catálogo Sigma-Aldrich: 33482). Em seguida, imediatamente, é adicionado o éster do composto A-OSu acima em NMP.
[0039] Depois da mistura de reação ser agitada em temperatura ambiente durante 12 minutos, ela é adicionada a uma mistura de éter de dietil/DCM/TFA (30: 10: 0,2 v/v; volume de 200 ml). O precipitado branco resultante é isolado por centrifugação e depois triturado com éter de dietil uma vez.
[0040] A desproteção (remoção dos grupos Boc e OtBu) começa com o precipitado branco úmido com éter acima sendo tratado com uma mistura de TFA/triisopropilsilano (TIS; Aldrich)/água (92,5: 5,0: 2,5 v/v; 50 ml) durante 20 minutos. À mistura é adicionado éter de dietil (200 ml) e o precipitado resultante é recolhido por centrifugação. A análise por RP-HPLC mostra que a etapa de desproteção está completa (12,4% de insulina A21G não reagida e 56,7% de produto acilado com B29; 13% de produto bis-acilado).
[0041] A purificação começa com o produto bruto acima sendo dissolvido em água/acetonitrila (1: 1 v/v; 20 ml). O éter residual é removido aplicando uma corrente suave de nitrogênio sobre a superfície da mistura até o volume ser de aproximadamente 20 ml. A solução resultante é diluída com água Milli-Q (200 ml) e carregada em uma coluna de HPLC de preparação Zeosphere 120DRP, A10, C8 (5 x 25 cm).
[0042] A amostra é eluída da coluna através de um gradiente de acetonitrila (20 a 35%) em água (contendo 0,1% v/v TFA) durante 144 minutos a 28 ml/min enquanto monitorada por UV a 225 nm e 280 nm.
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As frações que contém o produto desejado são identificadas por RPHPLC (coluna: Waters XSelect CSH C18, 4,6x50mm) e reunidas (100 ml; 99,8% por RP-HPLC). ESMS: espectro desconvoluído: observado: 6.577,1 Da; calc: 6.578,5 Da.
[0043] Na conversão para troca de sal de HCI (método da coluna), as frações reunidas acima são diluídas com água para 200 ml e recarregadas na coluna de HPLC de preparação Zeosphere. Os tampões de eluição são então alterados. O tampão A continha HCI a 0,01% em água e o tampão B é acetonitrila.
[0044] A coluna é em seguida lavada com três volumes de coluna de 5% de tampão B e, em seguida, a amostra é eluída com a utilização de 70% de tampão B, enquanto monitorando 225 nm e 280 nm. A amostra é recolhida em um frasco de liofilização limpo, congelada e liofilizada para produzir o Composto 12 como um pó branco (620,5 mg, 0,094 mmol; rendimento total de 34%). A pureza é confirmada por RP-HPLC analítico e encontrada em 99,9%. ESMS: espectro desconvoluído: observado: 6.577,3 Da; calc: 6.578,5 Da.
[0045] Na conversão em troca de sal de HCI (método de resina), o composto 12 (sal de TFA; 102,9 mg) é dissolvido em água/acetonitrila (1: 1 v/v; 20 ml) e adicionado à resina de cloreto de troca iônica (4,05 g; 248 mmols de resina/mmol de insulina; Bio-Rad 1-x8 (cat # 1401431); malha 50-100; forma de cloreto; 2,08 meq/grama seca; 46% de umidade; amônio quaternário; número de controle 2100011742) que é pré lavado com 20 ml cada de metanol, acetonitrila e água/acetonitrila (1:1 v/v).
[0046] A resina e a insulina são misturadas em temperatura ambiente durante uma hora, ocasião em que a resina é filtrada e lavada com água/acetonitrila (1: 1 v/v, 20 ml). O filtrado e as lavagens são combinados, congelados e liofilizados para produzir o Composto 12 como um pó branco (89,9 mg; recuperação de etapa a 87%). A
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15/29 pureza é confirmada através de RP-HPLC analítico e é de 99,9%. ESMS: espectro desconvoluído: observado: 6576,7 Da; calc: 6578,5 Da. Métodos adicionais de troca de sal também podem ser utilizados, como diálise.
[0047] A acilação de LisB29 para os presentes compostos é confirmada através de digestão com a endoprotease Glu-C. Aproximadamente 300 pg do Composto 12 ou 19 são dissolvidos em tampão Tris 50 mM, pH 8 (1 mg/ml) e m seguida tratados com 20 pg de endoprotease Glu-C (Worthington Biochemical Catalog # LS003605). Depois da incubação em temperatura ambiente durante
17,5 horas, uma alíquota (200 pl) da mistura de reação é extinta com HCI 0,1 N (300 pl).
[0048] A mistura resultante (80 pl) é analisada através de LC/MS (coluna Waters XBridge C8, 4,6 x 150 mm, 5 pm, 130 Â). Foi verificado que o fragmento de diagnóstico, B22-30 + Composto A, era 1944,4 Da (vs. calc = 1944,3 Da). Todos os outros fragmentos de digestão Glu-C resultantes dos Compostos 12 ou 19 estavam isentos de acilação.
Afinidade do Receptor In Vitro
[0049] Os compostos 12 e 19 e compostos de controle (insulina humana biossintética e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1)) são testados no ensaio de proximidade de cintilação do receptor de insulina humana (hIR) e do receptor de IGF-1 humano (hlGF-1R) (SPA ) ensaios competitivos de ligação a radio ligantes com a utilização de membranas preparadas utilizando etapas de centrifugação diferencial a partir de células HEK 293 transfectadas de maneira estável sobre a expressão do hIR-A, hIR-B ou hlGF-1R recombinante.
[0050] As condições do tampão de ensaio são utilizadas consistindo em Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, NP-40 a 0,003% (p/v) e contendo insulina recombinante humana (3- [1251]
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16/29 iodotirosil-A14) humana ou [1251] -IGF-1 recombinante. Os dados de contagens por minuto (CPM) são normalizados para controles de insulina humana não marcada ou IGF-1 e plotados como porcentagem de inibição no eixo y versus concentração do composto logarítmico no eixo x. Os valores de IC50 são determinados a partir da análise de regressão logística não linear de 4 parâmetros (GeneData, Versão 12) e representam a concentração na qual a ligação específica foi inibida em 50%. Se necessário, os parâmetros superior e inferior da curva são fixados em 100 ou 0%, respectivamente, para gerar uma curva completa.
[0051] A constante de afinidade (Ki) é calculada a partir do valor de IC50 com base na equação Ki = IC50/ (1 + L7 Kd) em que L* é igual à concentração de rádio ligante usado no experimento e Kd é igual à constante de afinidade de ligação do equilíbrio do rádio ligante com relação ao respectivo receptor, determinado a partir da análise de ligação de saturação.
[0052] Os valores calculados de Ki do Composto 12 são Ki = 7,11 nM para hIR-A e Ki = 7,56 nM para hIR-B (Tabela 1). O composto 12 e a insulina humana têm uma afinidade de ligação com relação à hIR-A e hIR-B inferior a 10 nM e o composto 12 é altamente seletivo com relação à hIR-A e hIR-B em comparação com hlGF-1R (> 500 vezes seletivo para ambos), que é semelhante à taxa de seletividade da insulina humana nos mesmos ensaios.
[0053] Os valores calculados de Ki do Composto 19 são Ki = 3,40 nM para hIR-A e Ki = 3,45 nM para hIR-B (Tabela 1). O composto 19 e a insulina humana têm uma afinidade de ligação com relação ao hIR-A e hIR-B inferior a 4 nM e o composto 19 é altamente seletivo om relação ao hIR-A e hIR-B em comparação com hlGF-1R (> 700 vezes seletivo para ambos), que é mais seletivo que a taxa de seletividade da insulina humana nos mesmos ensaios.
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Tabela 1: Os subtipos A e B do receptor de insulina humana (hIR-A e hIR-B) e o fator de crescimento 1 do tipo insulina humana (hlGF-1R) Afinidade de ligação, valores de Ki e SEM são médias geométricas expressas em 3 dígitos significativos.
| Ki, nM (geoSEM, n) | |||
| Nome | IR-A | IR-B | IGF-1R |
| Composto 12 | 7,11 (0,48, n=3) | 7,56 (0,72, n=3) | 4060 (582, n=3) |
| Composto 19 | 3,40 (1,44, n=6) | 3,45 (0,479, n=3) | 2540 (462, n=3) |
| Insulina humana | 0,197 (0,012, n=3) | 0,257 (0,030, n=3) | 97,8(10,3, n=3) |
| IGF-1 | 5,40 (0,59, n=3) | 65,9 (8,8, n=3) | 0,157 (0,010, n=3) |
Ativação do Receptor Funcional
[0054] O receptor de insulina contém um domínio de tirosinaquinase intracelular que depois da ligação ao ligante auto fosforila seus próprios resíduos de tirosina para permitir o recrutamento de proteínas adaptadoras que atuam para induzir as vias de sinalização de insulina. A atividade celular funcional para a estimulação da auto fosforilação do receptor nos resíduos de tirosina é determinada depois do tratamento com ligante das células 293HEK que super expressam hIR-A, hIR-B ou hlGF-1R, cada um com um epítopo C9 terminal C (TETSQVAPA, SEQ ID NQ: 5).
[0055] Depois do estímulo de células com várias concentrações de ligante, em um meio desprovido de albumina, a 37°C durante 60 minutos (ensaios hIR-A e hIR-B) ou durante 30 minutos (ensaio hlGF1R), o nível de auto fosforilação da tirosina através do domínio cinase de cada receptor é determinado através de ELISA; em que, o receptor ativado é capturado por um anticorpo (RHO 1D4) para a etiqueta do epítopo C9, seguido pela detecção do nível de fosforilação da tirosina
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18/29 com o conjugado peroxidase de rábano silvestre anti-fosfotirosina, anticorpo 4G10 ™ -HRP.
[0056] A potência funcional é relatada como a concentração que provoca uma resposta semimáxima (EC50) com relação a uma concentração máxima eficaz (100 nM) do controle positivo, insulina humana (ensaios de fosforilação de hIR-A e hIR-B) ou 10 nM do controle positivo de hlGF-1 (ensaio de fosforilação de hlGF-1R). Os valores de EC50 são determinados a partir da análise de regressão logística não linear de 4 parâmetros (NGR Screener 13). Se necessário, os parâmetros superior e inferior da curva são definidos como 100 ou 0, respectivamente.
[0057] Os valores relatados para EC50 são mostrados como média geométrica e o erro padrão geométrico da média (geo SEM), com o número de determinações independentes indicadas por n (Tabela 2).
[0058] O composto 12 demonstra a ativação das isoformas humanas IR-A e IR-B. A potência do Composto 12 e da insulina humana com relação ás isoformas IR-A e IR-B é inferior a 40 nM. O composto 12 é cerca de 1300 vezes mais potente em hIR-A e hIR-B do que o IGF-1R, que é maior que a taxa de seletividade da insulina humana nos mesmos ensaios.
[0059] O composto 19 demonstra a ativação das isoformas humanas IR-A e IR-B. A potência do Composto 19 e da insulina humana para as isoformas IR-A e IR-B é inferior a 25 nM. O composto 19 é cerca de 400 vezes mais potente em hIR-A e hIR-B que o IGF1R, que é maior que a taxa de seletividade da insulina humana nos mesmos ensaios. Por comparação, a seletividade da insulina humana para IR-A e IR-B em comparação com IGF-1R é de aproximadamente 200 vezes.
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Tabela 2: Ativação do Receptor de Insulina Humana Subtipos A e B (hIR-A e hIR-B) e Receptor do Fator de Crescimento 1 semelhante à insulina humana (hlGF-1 R).
| EC5o, nM (geoSEM, n) | |||
| Nome | IR-A | IR-B | IGF-1R |
| Composto 12 | 34,1 (25, n=7) | 37,9 (3,2, n=3) | 49900 (17300, n=4) |
| Composto19 | 23,4 (6,34, n=7) | 13,7 (1,47, n=3) | 7170 (1940, n=7) |
| Insulina Humana | 1,53 (0,11, n=7) | 1,83 (0,07, n=3) | 351 (110, n=4) |
| IGF-1 | 116 (11, n=3) | 427 (29, n=3) | 0,939 (0,146, n=4) |
[0060] Avaliação da Potência In Vivo em um Modelo de Rato do Diabetes Tipo 1
[0061] Os efeitos dos compostos 12 e 19 são investigados no modelo de diabetes de ratos tratado com estreptozotocina (STZ). Ratos machos Sprague-Dawley, 400 - 425 gramas de peso corporal, são obtidos a partir de Envigo, Indianapolis, Indiana. Depois da aclimatação durante aproximadamente uma semana, os ratos são anestesiados com isoflurano e recebem uma injeção única de Zanosar® (item # 89256, Teva Parenteral Medicines, 40mg/kg, IV). Os ratos são utilizados em estudos 3 dias depois da injeção de Zanosar; apenas animais com glicose no sangue em jejum entre 400 e 550mg/ dl são usados nesses estudos.
[0062] Os ratos são distribuídos em grupos para fornecer variação comparável na glicemia e peso corporal; os ratos são randomizados. A glicemia é medida com a utilização do glicômetro Accu-Chek Aviva (Roche).
[0063] Os ratos tratados com STZ são administrados com uma dose única subcutânea (SC) do artigo ou veículo de teste (solução salina normal estéril, solução de cloreto de sódio a 0,9% p/v). As
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20/29 amostras de sangue para medições de glicose são coletadas através de sangramento na cauda. Os animais têm livre acesso a comida e água durante todo o experimento. Amostras de plasma desses estudos são enviadas para análise dos níveis de compostos. Como mostrado na Tabela 3, o Composto 12 teve redução eficaz da glicose durante pelo menos 24 horas em uma dose de 100 nmol/kg. A Tabela 3 mostra os valores para o Composto 19 em vários momentos durante a avaliação. O composto 19 também teve redução eficaz da glicose por pelo menos 24 horas em uma dose de 100 nmol/ kg.
Tabela 3: Potência do Composto 12 In Vivo.
| Grupo Glicose média mg/dl ± SEM (n = 5) | |||||
| Tempo (horas) | Veículo | Composto 12 (12,5 nmol/kg) | Composto 12 (25 nmol/kg) | Composto 12 (50 nmol/kg) | Composto 12 (100 nmol/kg) |
| 0 | 490 ±2,78 | 508 ±19,8 | 486 ± 16,4 | 501 ±13,3 | 489 ±6,10 |
| 1 | 504 ± 26,0 | 535 ± 25,9 | 499 ±31,1 | 501 ±21,8 | 414 ±7,15 |
| 2 | 480 ±16,3 | 496 ±25,7 | 360 ±48,1 | 384 ±66,3 | 123 ±9,29 |
| 4 | 512 ±35,1 | 450 ±21,0 | 249 ±91,3 | 122 ±33,8 | 84,9 ±10,4 |
| 6 | 500 ±34,3 | 393 ±67,9 | 209 ±82,6 | 74,5 ±8,92 | 70,5 ±6,36 |
| 8 | 498 ±16.6 | 473 ±45,5 | 308 ±62,5 | 95,9 ±20,7 | 73,0 ±6,13 |
| 10 | 561 ± 18,5 | 527 ±36,4 | 412 ±55,3 | 121 ±12,9 | 73,9 ±11,3 |
| 12 | 584 ±7,53 | 586 ±12,0 | 513 ±39,6 | 261 ±36,3 | 84,9 ±12,5 |
| 18 | 553 ±18,3 | 532 ±34,4 | 499 ±25,9 | 420 ±42,6 | 114 ±15,8 |
| 24 | 488 ±13,0 | 539 ±18,2 | 481 ±38,4 | 344 ±66,2 | 162 ±37,3 |
| 36 | 601* ±0 | 591 ±10 | 589 ±8,41 | 598 ±3,0 | 591 ±8,80 |
| 48 | 508 ±11,3 | 551 ±18,4 | 517 ±29,1 | 510 ±25,7 | 504 ±22,9 |
| 72 | 553 ±8,79 | 564 ±15,5 | 557 ±23,6 | 555 ±20,5 | 550 ±23,4 |
| 36 horas | 19300 | 19100 | 16500 | 12400 | 7480 |
| AUC | ±197 | ±358 | ± 1096 | ±831 | ±488 |
[0064] Os valores acima de 601 não são medidos devido a que essa a leitura mais alta do glicômetro.
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Tabela 4: Potência do Composto 19 In Vivo
| Grupo Glicose média mg/dl ± SEM (n=5) | |||||
| Tempo (Horas) | Veículo | Composto 19 (12,5 nmol/kg) | Composto 19 (25 nmol/kg) | Composto 19 (50 nmol/kg) | Composto 19 (100 nmol/kg) |
| 0 | 510 ±28,6 | 513 ± 10,0 | 520 ±20,8 | 530 ± 15,1 | 546 ± 16,8 |
| 1 | 500 ±24,5 | 545 ± 17,8 | 517 ±25,5 | 544 ±11,8 | 541 ±23,1 |
| 2 | 522 ±21,9 | 518 ± 21,2 | 367 ±38,0 | 302 ±58,4 | 242 ±30,7 |
| 4 | 442 ±26,4 | 292 ± 77,9 | 109 ±25,7 | 100 ±21,0 | 74,2 ±4,00 |
| 6 | 404 ± 18,6 | 204 ±67,6 | 81,8 ±4,79 | 63,8 ±7,15 | 59,7 ±6,06 |
| 8 | 418 ±36,9 | 230 ±73,3 | 113 ± 14,5 | 73,0 ± 10,7 | 69,1 ±5,59 |
| 10 | 443 ±39,2 | 324 ± 77,9 | 224 ± 13,2 | 150 ±46,5 | 63,8 ±5,32 |
| 12 | 548 ±27,6 | 595 ±6,40 | 386 ±30,1 | 157 ±80,5 | 93,5 ±20,3 |
| 18 | 546 ±36,3 | 573 ±9,04 | 513 ±23,3 | 356 ± 102 | 97,7 ±5,38 |
| 24 | 519 ±24,8 | 553 ± 21,1 | 536 ±24,4 | 503 ±26,9 | 190 ±59,8 |
| 36 | 600 ± 1 | 601* ±0 | 590 ±9,63 | 566 ±30,9 | 576 ±11,6 |
| 48 | 498 ±20,4 | 550 ± 20,2 | 510 ± 19,3 | 537 ± 17,4 | 499 ±27,5 |
| 72 | 549 ±22,2 | 566 ± 18,0 | 566 ± 18,5 | 579 ± 16,2 | 591 ± 10,1 |
| 36 horas AUC | 18700 ±471 | 18100 ±718 | 154000 ±240 | 12700 ± 1240 | 7840 ±557 |
| [0065] Os valores acima d | e 601 não são medidos devido a que |
essa a leitura mais alta do glicômetro.
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Avaliação da Liberação do Fármaco em um Modelo de Porco de Diabetes do Tipo 1.
[0066] Os suínos miniatura machos Yucatan diabéticos (induzidos por aloxanos), castrados e com acesso vascular previamente ajustado são colocados em estropos para contenção e têm suas portas de acesso vascular acessadas (equipadas para amostragem de sangue) e verificadas quanto à patência. Os animais são aleatoriamente colocados em grupos de tratamento e devolvidos às suas gaiolas. Depois da coleta de duas amostras de sangue da linha de base (-30 e 0 min), os animais são injetados com artigo de teste a 1,8 nmol/kg, por via subcutânea no flanco (0 min) com uma seringa de insulina (agulha de 0,3 ml 5/16). Todos os animais do estudo têm acesso ad libitum a água limpa e fresca durante todo o período restante da coleta de sangue.
[0067] Amostras de sangue em série (2,0 ml cada) são coletadas de cada animal nos seguintes pontos de tempo: -30, 0 (imediatamente antes da dose), 1,5, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 42, 48, 54, 60 e 72 horas depois da administração subcutânea. Todos os animais do estudo são submetidos a jejum alimentar durante a noite e não são alimentados novamente até após a coleta da amostra de 24 horas. Naquele momento, os animais são alimentados com 300 gramas de dieta S-9 e administrados 0,2 U/kg de Humalog. Eles são novamente jejuados até que a amostra de 60 horas seja coletada e recebem 300 gramas de dieta S-9 e 0,2 U/kg de Humalog. Eles retornam ao seu regime normal de alimentação e manutenção de insulina depois da coleta de 72 horas. [0068] As amostras de sangue (anticoagulante: nenhum [soro]) são mantidas em temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos, mas não mais de duas horas para permitir a coagulação. As concentrações séricas de glicose são determinadas com a utilização de um analisador automático de química clínica AU480. Uma alíquota para PK é enviada para análise.
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[0069] Os dados são representados como média +/- erro padrão da média (SEM), a menos que especificado de outra forma. A alteração da glicose da linha de base é calculada subtraindo o valor da glicose em cada ponto do tempo do valor de glicose da linha de base. O valor da linha de base é calculado a partir da média dos valores de 0,5 e 0 min de glicose. As amostras para PK / PD são coletadas até 72 horas após a dose.
[0070] As concentrações de plasma de porco (K3EDTA) para o Composto 12 são medidas por LC/MS em Q2 Solutions (Ithaca, NY). Ο composto 12 é imuno precipitado (IP) a partir de alíquotas de plasma/soro de 100 μΙ com a utilização de um anticorpo monoclonal anti-insulina-biotina (Fitzgerald # 10R-I134E) e esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Invitrogen M-280). Depois das etapas de lavagem, as variantes de insulina são eluídas dos complexos IP com acetonitrila ácido (5:20:80 ácido fórmico/acetonitrila/água).
[0071] Em seguida a eluição, 10 μΙ do eluente são injetados no espectrômetro de massa para análise por LC/MS. O sistema LC/MS é composto por um cromatógrafo líquido Dionex 2D-nanoUPLC (NCS3500RS) e um espectrômetro de massa Thermo Q/Exactive Plus. A resolução é alcançada através de cromatografia bidimensional com a utilização de colunas coletoras em série que consistem em uma micro coluna Thermo (160454) e uma coluna Acclaim PepMap-100 C18 (0,3 x 5 mm, 5 μιτι dp) e uma coluna analítica Thermo Easy Spray PepMap C18 (75 μιτι x 15 cm, 5 μιτι dp), ambas operadas a 60QC.
[0072] O espectrômetro de massa é operado no modo de íon positivo, nanoESI (Easy Spray) e as seguintes transições de íon precursor/produto são monitoradas para o Composto 12: 1316,600 χ 586,854. Os ensaios são verificados para a medição das concentrações de variantes de insulina no intervalo de 0,25 a 50 ng/ml. [0073] A farmacocinética (PK) do Composto 12 é avaliada em
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24/29 suínos Yucatan machos induzidos para diabéticos, depois da administração subcutânea única (SC) de 1,8 nmol/kg de Composto 12. Uma amostra de insulina degludec é preparada de maneira semelhante ao Composto 12 e é usada como um comparador neste estudo.
[0074] Alguns parâmetros PK do Composto 12 e insulina degludec são mostrados na Tabela 5. A taxa de liberação do Composto 12 é de 2 a 3 vezes mais lenta do que a taxa de depuração da insulina degludec, o que podería levar a um perfil de farmacocinética mais plano e maior duração da ação do Composto 12 in vivo em humanos.
Tabela 5: Parâmetros médios de fármaco cinética do composto 12 e insulina degludec em suínos Yucatan machos induzidos para diabéticos depois de doses subcutâneas únicas
| Compostos | Dose | Estado | T1/2 | Tmax | Cmax | AUCo-inf | CL/F |
| (nmol/kg) | (hr) | (hr) | (pmol/L) | (hr*nmol/L) | (mL/h r/kg) | ||
| Composto | 1,8 | Média | 15 | 10 | 2510 | 78,3 | 23,8 |
| 12 | SOM | 3 | 8 | 692 | 17,4 | 4,64 | |
| Insulina | 1,8 | Média | 13 | 12 | 881 | 23,5 | 87,8 |
| degludec | SD | 3 | 10 | 314 | 8,30 | 39,8 |
Abreviações: T1/2 = meia vida, Tmax = Tempo até a concentração máxima, Cmax = concentração máxima no plasma, AUCo-int = área sob a curva a partir de 0 até 0 infinito, CL/F = liberação/biodisponibilidade (N=5 para 0 Composto 12 12, N=6 para insulina degludec.
Avaliação da Estabilidade Química
[0075] As amostras são preparadas através da dissolução do pó liofilizado dos Compostos 12 e 19 em NaOH 20 mM em uma concentração alvo de aproximadamente 6 mM. Esta solução é então dialisada contra 10 mM de Tris, resultando em uma concentração de
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25/29 estoque de 5,6 mM. Esta solução padrão é em seguida usada para a preparação de soluções nas concentrações alvo que contenham 10 mM de Tris, 19 mg/ml de glicerol, 3,15 mg/ml de m-cresol e 4 de zinco por insulina hexâmetro (base molar), em pH 7,5. As concentrações alvo foram U200 (200 unidades/ml, o que equivale a 1,2 mM), U400 (2,4 mM), U600 (3,6 mM) e U800 (4,8 mM). As concentrações reais das soluções estavam dentro de 0,1 mM dos níveis de concentração alvo. As amostras de comparação, insulina degludec são preparadas da mesma maneira que as amostras dos compostos 12 e 19 para os estudos de estabilidade.
[0076] Para os estudos de estabilidade em uso, as amostras são carregadas em cartuchos siliconados de 3 ml em volumes de preenchimento de aproximadamente 1,5 ml. Os êmbolos do cartucho são posicionados de modo a eliminar o espaço da cabeça no cartucho. Os cartuchos são em seguida colocados a 30°C. As amostras são submetidas a condições de uso, conectando uma agulha e ejetando 5-10 μΙ aproximadamente a cada 2 dias. A análise por cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) e cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) são realizadas nas amostras no momento inicial e depois de vários dias adicionais de armazenamento, conforme detalhado nas tabelas abaixo.
[0077] Para estudos de estabilidade estática de armazenamento, as amostras são carregadas em cartuchos de 3 ml em volumes de preenchimento de 1,5 ml ou frascos de vidro de 0,3 ml em volumes de preenchimento de aproximadamente 0,2 ml. Os cartuchos ou frascos são em seguida colocados a 30°C. A análise por cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) e cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) são realizadas nas amostras no momento inicial e depois de vários dias adicionais de armazenamento, conforme detalhado nas tabelas abaixo.
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[0078] Os parâmetros RP-HPLC são os seguintes: (1) Instrumento: LC com detector de UV e forno de coluna; (2) Coluna: SymmetryShield RP18 3,5 um PN186000179 SN01593532014028; (3) temperatura da coluna: 60°C; (4) 4. Fase móvel: A = 0,085% de TFA em água, B = 0,085% de TFA em acetonitrila; e (5) o gradiente, com um fluxo de 0,9 ml/ min, é como se segue:
| Tempo(min) | %A | %B |
| 0 | 90,0 | 10,0 |
| 3,00 | 90,0 | 10,0 |
| 3,10 | 70,0 | 30,0 |
| 6,10 | 70,0 | 30,0 |
| 36,10 | 40,0 | 60,0 |
| 36,20 | 5,0 | 95,0 |
| 38,20 | 5,0 | 95,0 |
| 38,30 | 90,0 | 10,0 |
| 41,30 | 90,0 | 10,0 |
[0079] A concentração do composto 12 de U200 a U800 não teve efeito apreciável sobre a estabilidade, conforme determinado por RPHPLC ou SEC. A estabilidade química do Composto 12 em um estudo de estabilidade em uso a 30°C (dados através de 110 dias) é mostrada na Tabela 6. A estabilidade química do Composto 12, Composto 19 e insulina comparadora degludec, todas na concentração U200, em um estudo de estabilidade estática, é mostrada na Tabela 7. A estabilidade química da insulina degludec a 30°C em um estudo de estabilidade estática é mostrada na Tabela 8.
[0080] A taxa média de degradação do pico principal do Composto 12 em quatro concentrações diferentes é de 0,064% por semana, mostrada na Tabela 6. Essa taxa é 7 a 8 vezes menor que a taxa de
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27/29 degradação do pico principal da insulina degludec, que é de 0,49%, mostrado na Tabela 8. A Tabela 7 mostra uma comparação direta das formulações U200 do Composto 12, Composto 19 e insulina degludec nos mesmos pontos de tempo. Na comparação direta mostrada na Tabela 7, a taxa de degradação do Composto 12 é mais de quatro vezes menor que a da insulina degludec e a taxa de degradação do Composto 19 é mais de duas vezes menor do que a insulina degludec. A menor taxa de degradação química exibida pelos Compostos 12 e 19 pode levar a um maior prazo de validade dos presentes compostos. Tabela 6: O pico principal percentual do Composto 12 a 30°C como monitorado através de RP-HPLC
| Tempo (dias) | U200 | U400 | U600 | U800 |
| 0 | 98,3 | 98,3 | 98,3 | 98,3 |
| 7 | 97,9 | 98,4 | 98,3 | 98,3 |
| 18 | 97,8 | 98,2 | 98,2 | 98,3 |
| 27 | 97,9 | 98,2 | 98,1 | 98,0 |
| 41 | 97,8 | 98,0 | 98,2 | 98,2 |
| 53 | 97,6 | 97,8 | 98,0 | 98,0 |
| 83 | 97,0 | 97,3 | 97,5 | 97,7 |
| 110 | 97,2 | 97,4 | 97,4 | 97,5 |
| Taxa média de degradação (%/semana) | 0,064 |
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Tabela 7: O pico principal percentual do Composto 12, Composto 19 e da insulina degludec a 30°C como monitorado através de RP-HPLC
| Tempo (dias) | Composto 12 U200 | Composto 19 U200 | Insulina degludec U200 |
| 0 | 98,3 | 98,9 | 97,8 |
| 7 | 97,4 | 97,9 | 96,9 |
| 28 | 97,3 | 98,3 | 95,4 |
| Taxa de degradação (%/semana) | 0,145 | 0,255 | 0,602 |
Tabela 8: O pico principal percentual da Insulina degludec a 30°C como monitorado através de RP-HPLC
| Tempo (dias) | U200 Insulina degludec |
| 0 | 94,4 |
| 7 | 93,2 |
| 14 | 93,5 |
| 21 | 92,6 |
| 28 | 91,8 |
| 42 | 90,1 |
| 56 | 90,9 |
| Taxa média de degradação (%/semana) | 0,49 |
Sequências Estrutura Genérica da cadeia A (SEQ ID N2:1)
GIVEQCCTSICSLYQLENYCXaa
Na qual Xaa na posição 21 da SEQ ID N-: 1 éG ou N.
Cadeia A do Composto 12 (SEQ ID N2: 2)
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG
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29/29
Cadeia A do Composto 19 (SEQ ID N2: 3)
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Cadeia B dos Compostos 12 e 19 (SEQ ID N2: 4)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
Epítopo C9 do terminal C (SEQ ID N2: 5)
TETSQVAPA
Claims (13)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:
nh2
GIVEQCCTSICSLYQLENYCXaa I
I / í
F VNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP.....N >......T
H em que Xaa é o aminoácido glicina ou asparagina.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xaa é o aminoácido glicina.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Xaa é o aminoácido asparagina.
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
5. Método para o tratamento de diabetes em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente necessitando de uma quantidade eficaz dos compostos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou da composição, como definida na reivindicação 4.
6. Método para o tratamento da hiperglicemia em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente que esteja necessitando de uma quantidade eficaz dos compostos, como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 ou da composição, como definida na reivindicação 4.
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2/2
7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de diabetes.
9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento da hiperglicemia.
10. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:
HQ '':'C
11. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes.
12. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia.
13. Uso do composto, como definido na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é para a preparação ou a fabricação de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
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