TW201904988A - 醯化之胰島素化合物 - Google Patents

醯化之胰島素化合物

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Abstract

本發明所描述之化合物係關於糖尿病及/或高血糖症之治療。更具體地說，所描述之化合物係關於降低血糖的醯化之胰島素化合物、含有此等化合物之醫藥組合物、此等化合物之治療用途及用於製備該等醯化之胰島素化合物的中間化合物。

Description

醯化之胰島素化合物
本發明屬於糖尿病及/或高血糖症治療之領域。本發明係關於降低血糖之化合物、含有此等化合物之醫藥組合物及此等化合物之治療用途。
用於糖尿病患者之胰島素替代療法的理想情況是，儘可能接近地對應健康個體中內源性胰島素分泌之模式。對於胰島素之生理需求可以分成兩個階段：(a)養分吸收階段，該階段需要胰島素脈衝來處理與進食有關的血糖激增，又稱為「餐時」胰島素；及(b)吸收後階段，該階段需要持續遞送胰島素來調節肝臟葡萄糖輸出以維持最佳的禁食血糖，又稱為「基礎」胰島素。
有效用於糖尿病人的胰島素療法一般可能涉及組合使用兩種類型之外源胰島素調配物：速效、進餐時間餐時胰島素以及長效基礎胰島素，每天投與一次或兩次以控制每餐之間的血糖含量。可能希望模擬的內源性胰島素之一或多個特徵包括對人類胰島素受體之結合親和力，即相對於人類IGF-1受體，優先結合至人類胰島素受體；人類胰島素受體之磷酸化；及血液中之葡萄糖降低作用。
希望的外源性基礎胰島素亦應當提供較長之作用時間，亦即，其應控制血糖含量至少12小時，且較佳地控制24小時或更長時間，而沒有引起低血糖之較大風險。一些基礎胰島素具有24小時或更長的持續作用時間。具有較長作用時間型態且在該時間期間有效性不會顯著變化的化合物可以降低夜間低血糖之風險且允許每天給藥次數之較大變化，而不會增加患者發生低血糖之風險。可能希望的外源性基礎胰島素之特徵包括在血流中之清除率較低以及在多種濃度下之化學穩定性，該化學穩定性可以引起延長的儲存期限穩定性。
需要有用於有需要患者之糖尿病及/或高血糖症的替代治療方法。已知一些醯化之胰島素化合物，參見例如美國專利第6,444,641號及美國專利第7,615,532號，但仍需要另外的替代治療方法。本發明提供一種可用於治療有需要患者之糖尿病、降低其血紅蛋白A1c及降低其血糖含量的化合物。本發明化合物亦使用以下描述之新穎化合物製備。
本發明包括一種下式(式I)之化合物：其中Xaa係胺基酸甘胺酸或天冬醯胺。
式I之化合物係由具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1之A鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4之B鏈組成的胰島素化合物，其中二硫鍵存在於在SEQ ID NO: 1之6位處的半胱胺酸與在SEQ ID NO: 1之11位處的半胱胺酸之間，二硫鍵存在於在SEQ ID NO: 1之7位處的半胱胺酸與在SEQ ID NO: 4之7位處之半胱胺酸之間，二硫鍵存在於在SEQ ID NO: 1之20位處的半胱胺酸與在SEQ ID NO: 4之19位處的半胱胺酸之間，且在B鏈(SEQ ID NO: 4)之29位處的離胺酸藉由在該離胺酸側鏈之ε-胺基與具有OH-C18-γGlu-γGlu-Lys-(AEEA)-之AEEA的游離羧酸酯之間形成醯胺鍵進行化學修飾，其中OH-C18係十八烷二酸，γGlu係經由側鏈γ羧基連接之L-麩胺酸，且AEEA係2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙酸。以上結構，即式I，含有胰島素A鏈及B鏈之胺基酸殘基的標準單字母胺基酸代碼，不過B鏈之殘基29，即離胺酸除外，其中該胺基酸殘基之結構已展開。
本發明化合物進一步包括化合物12，其具有式I之結構且其中Xaa係胺基酸甘胺酸。本發明化合物進一步包括化合物19，其具有式I之結構且其中Xaa係胺基酸天冬醯胺。
本申請案亦提供一種醫藥組合物，其包含式I之化合物、化合物12或化合物19及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。本申請案進一步提供一種治療患者之糖尿病的方法，其包含向有需要患者投與有效量的式I之化合物、化合物12或化合物19，或包含式I之化合物、化合物12或化合物19的醫藥組合物。
本申請案提供一種治療患者之高血糖症的方法，其包含向有需要患者投與有效量的式I之化合物、化合物12或化合物19，或包含式I之化合物、化合物12或化合物19的醫藥組合物。本申請案亦提供式I之化合物、化合物12或化合物19，其係用於療法中。本申請案進一步提供式I之化合物、化合物12或化合物19，其係用於治療糖尿病或治療高血糖症。
本申請案提供一種具有下式之化合物，即化合物A：。
本申請案亦提供化合物A於製造用於治療糖尿病及/或高血糖症之藥物中的用途。本申請案進一步提供化合物A於製備或製造式I之化合物、化合物12或化合物19中的用途。
本發明化合物之清除率比已知之醯化胰島素諸如德谷胰島素(degludec)要慢，由此可以改善生物利用率，在人體內隨時間而實現更穩定之藥物動力學概況及/或增加該化合物在活體內之持續作用時間。另外，本發明化合物展現較低之化學降解速率，由此指示其具有增加之化學穩定性，且可以實現比已知之醯化胰島素諸如德谷胰島素長的儲存期限。
如本文所使用，術語「治療(treatment/treating)」係指對患有糖尿病或高血糖症，或適於投與胰島素之其他病狀之患者的管理及護理，旨在對抗或緩解該等病狀之症狀及併發症。待治療之患者係動物，且較佳地為人類。
如本文所使用，術語「有效量」係指當以單次或多次劑量投與患者或受試者時，將對組織、系統、動物、哺乳動物或人類引起研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學響應或發揮所需治療作用的本發明化合物或含有本發明化合物之醫藥組合物的量或劑量。劑量可以包括較高的初始負載劑量，繼之以較低劑量。
術語「患者」、「受試者」及「個體」在本文中可互換使用，意思指動物，較佳地，該術語係指人類。在某些實施例中，患者，較佳為人類，進一步用將得益於血液葡萄糖含量降低之疾病或病症或病狀表徵。
包含本發明化合物之醫藥組合物可以非經腸投與需要此類治療之患者。非經腸投藥可以藉助於注射器，視情況藉助於筆樣注射器或機械驅動之注射器經皮下、肌肉內或靜脈內注射進行。或者，非經腸投藥可以藉助於輸注泵進行。
本發明之實施例提供適於向患者投與之醫藥組合物，其包含向有需要患者投與治療有效量的本發明之化合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。此類醫藥組合物可藉由多種技術中之任一種，使用此項技術熟知的用於醫藥產品之習知賦形劑製備。(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第21版, University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia, PA, USA (2006))。
所主張之化合物可以與一或多種可用於治療糖尿病及/或糖尿病相關病狀之額外治療劑同時、分開或依序組合使用。可以與所主張之化合物組合的額外治療劑之非限制性實例包括：胰島素或胰島素類似物；雙胍；磺醯脲；噻唑啶二酮；二肽基肽酶-4(「DPP-4」)抑制劑；鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白(SGLT2)抑制劑；腸促胰島素化合物，諸如類升糖素肽-1(GLP-1)或GLP-1類似物、抑胃多肽(GIP)或GIP類似物、調酸素或調酸素類似物；或前述藥劑中任一種之組合。所主張之化合物及該一或多種額外治療劑可以經由相同遞送路徑及裝置，諸如單一丸劑、膠囊、錠劑或可注射調配物一起投與；或以單獨遞送裝置或途徑在相同時間分開投與；或依序投與。
所主張之醯化胰島素化合物之一，即化合物12係藉由用連接子-脂肪酸中間物使A21G-胰島素(胰島素A鏈之第21個胺基酸經甘胺酸取代之人類胰島素，即A21G-胰島素)之LysB29 ε胺基選擇性醯化而產生，該連接子-脂肪酸中間物為：C18-OtBu-γGlu(OtBu)-γGlu(OtBu)-Lys(Boc)-AEEA-OH，其中C18-OtBu係18-第三丁氧基-18-側氧基-十八烷二酸，γGlu係經由側鏈γ羧基連接之L-麩胺酸，且AEEA係2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙酸。
該分子之產生分三個主要階段發生：1)產生A21G-胰島素；2)合成連接子-脂肪酸中間物；及3)醯化、脫保護、純化及鹽交換以分離出化合物12。
本發明化合物之胰島素部分可藉由熟習此項技術者已知之多種技術製備，諸如經由使用重組DNA技術製造前驅蛋白分子製備。DNA，包括cDNA及合成DNA，可以為雙股或單股的。編碼本文所描述之前驅蛋白分子的編碼序列可能因遺傳密碼之冗餘或簡併而變化。可以將DNA引入宿主細胞中以便產生本發明之前驅蛋白。適當宿主細胞用表現系統短暫或穩定轉染或轉型以產生該前驅蛋白。該等宿主細胞可以為細菌細胞，諸如K12或大腸桿菌B株；真菌細胞，諸如酵母細胞；或哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(「CHO」)細胞。
表現載體通常可在宿主生物體中以游離基因體形式或作為宿主染色體DNA之整體部分複製。通常，表現載體將含有選擇標記物，例如四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶，以允許選擇經所需DNA序列轉型之細胞。
本發明化合物可藉由此項技術中已知之多種程序以及以下描述之方法製備。所描述之途徑各自的具體合成步驟可以不同方式組合以製備本文所描述之化合物。化合物19係以與化合物12類似之方式製備。
具有以下顯示之化學式的化合物12及19之連接子脂肪酸分子部分，即化合物A，係如下文所示，使用固相合成方法產生。 化合物 A 合成化合物 A 之示意性表示 (「PS」指示聚合物載體)
有可能僅使用溶液相方法或使用溶液相方法與更易於縮放之固相方法的組合產生化合物A。歸因於基於第三丁氧基羰基「Boc」/第三丁基酯「tBu」保護之胺基酸的連接子脂肪酸之溶解性，在有機溶劑(N -甲基-2-吡咯啶酮(NMP)/二甲亞碸(DMSO))中進行連接子脂肪酸分子與A21G-胰島素之偶聯。然而，亦可設計替代保護/脫保護方案以使連接子脂肪酸可溶於水溶液中，由此使有機溶劑之使用減到最少。
同樣，最後一步化學轉化使用三氟乙酸(TFA)移除Boc/tBu保護基。對於較溫和之裂解條件，可以設計替代保護/脫保護策略。
化合物A係藉由固相肽合成方法產生。將茀基甲氧基羰基(Fmoc)-Lys(Boc)-OH(1430 mg，3 mmol，相對於樹脂為2當量；Novabiochem目錄號852012)與1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HATU)(1150 mg，3 mmol，相對於樹脂為2當量；Oakwood Chemical目錄號023926)及N,N-二異丙基乙胺(DIEA)(1333 μl，7.6 mmol，5當量)一起在10 mL DMF中混合2分鐘且接著轉移至含有H-AEEA-2-氯三苯甲基氯樹脂(2.11 g，0.72 mmol/g，1.52 mmol；Peptides International目錄號RHX-11074-PI)之容器中，該樹脂在二氯甲烷(DCM)中預先膨脹且用二甲基甲醯胺(DMF)預先洗滌。
漿液混合1.5小時，過濾並用DMF充分洗滌樹脂(凱撒測試(Kaiser test)呈陰性)。藉由用20%哌啶/DMF(10 mL，30分鐘)處理樹脂來移除Fmoc保護基。在用DMF洗滌樹脂(40 mL)之後，凱撒測試呈陽性，由此提供H2 N-Lys(Boc)-AEEA-2-氯三苯甲基氯樹脂(理論上1.52 mmol)。
在10 mL DMF中，使用DIEA作為鹼(1333 µL，7.7 mmol，5.0當量)，用HATU(1153 mg，3 mmol，2當量)預活化Fmoc-Glu-OtBu(1297 mg，3.0 mmol，2.0當量；Ark Pharma目錄號AK-48532)(2分鐘)，接著將其轉移至該樹脂。漿液混合3小時，過濾並用DMF充分洗滌樹脂(凱撒測試呈陰性)。
藉由用20%哌啶/DMF (10 mL，30分鐘)處理樹脂來移除Fmoc保護基，隨後用DMF洗滌樹脂(40 mL，凱撒測試呈陽性)。藉由重複以上條件，使用1.5小時偶合時間使另一Fmoc-Glu-OtBu與該樹脂偶合。
在移除最後一個Fmoc保護基之後，在10 mL DMF中，使用DIEA作為鹼(1333 µL，7.7 mmol，5.0當量)，用HATU (1.15 g，3.0 mmol，2.0當量)預活化18-第三丁氧基-18-側氧基-十八烷二酸(1.13 g，3.0 mmol，2.0當量)(2分鐘)，接著轉移至該樹脂。漿液混合3小時，過濾，先用DMF充分洗滌樹脂後，接著用DCM洗滌(凱撒測試呈陰性)。經保護之連接子-脂肪酸藉由與30% HFIP/DCM (20 mL)混合1小時而自樹脂裂解。過濾出樹脂並用DCM充分沖洗。在真空中蒸發合併之濾液，得到油狀物。用乙腈(15-20 mL)稀釋殘餘油狀物，並再次在真空中蒸發，得到油狀物。
再用乙腈(15-20 mL)溶解樣本，並在真空中蒸發，形成油狀物。輕柔氮氣流使殘留乙腈蒸發，得到2.6公克粗製非晶型固體(理論值=1.7公克)。
藉由將粗製樣本溶解於5 mL DMF及20 mL乙腈(包括燒瓶洗滌液)中開始純化。接著，添加水，得到40 mL混濁溶液。再添加5 mL乙腈，得到澄清溶液(總體積等於45 mL(33%水溶液))。藉由將樣本裝載至半製備型氰基逆相HPLC管柱(SilaChrom XDB1-CN；10 µm，100Å；2.1×25 cm)上來進行純化。
接著，使用40-60% B梯度，在15 mL/min、60℃下經72分鐘溶離樣本(緩衝液A=含0.1% TFA之水且緩衝液B=含0.1% TFA之乙腈)。彙集經分析RP-HPLC測定含有所需產物之溶離份並凍乾，得到1.22公克呈白色非晶型固體狀之產物(化合物A)(理論上72%；RP-HPLC測定為91%純度；MW觀測值=1114.6道爾頓(Da)；MW理論值=1114.45 Da)。
藉由將404.9 mg；0.363 mmol；1.32當量化合物A(如以上所描述合成)及TSTU(O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N,N',N'-四甲四氟硼酸鹽)(91.5 mg；0.3039 mmol；1.1當量)溶解於2.5 mLN - 甲基-2-吡咯啶酮(NMP)中，開始醯化。向此溶液中添加二異丙基乙胺(DIEA，192 µL；1.102 mmol；4當量)，並在室溫下培育所得混合物30分鐘，得到於NMP中之化合物A-OSu酯並直接使用。
在產生化合物12時，向A21G-胰島素(或在化合物19之情況下為人類胰島素)(TFA鹽；1.584 g；0.276 mmol)溶解於15 mL二甲亞碸(DMSO)中之溶液中添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU；495 µL，3.31 mmol，12當量，Sigma-Aldrich目錄號：33482)。接著，立即添加於NMP中之上述化合物A-OSu酯。
在環境溫度下攪拌反應混合物12分鐘之後，將其添加至乙醚/DCM/TFA混合物(30:10:0.2 v/v；200 mL體積)中。藉由離心分離所得白色沈澱且接著用乙醚濕磨一次。
藉由用TFA/三異丙基矽烷(TIS；Aldrich)/水混合物(92.5:5.0:2.5 v/v；50 mL)處理以上乙醚潤濕之白色沈澱20分鐘，開始脫保護(移除Boc及OtBu基團)。向該混合物中添加乙醚(200 mL)且藉由離心收集所得沈澱。RP-HPLC分析顯示脫保護步驟完成(12.4%未反應之A21G-胰島素；56.7% B29-醯化產物；13%雙醯化產物)。
藉由將以上粗產物溶解於水/乙腈(1:1 v/v；20mL)中，開始純化。藉由將輕柔氮氣流施加於該混合物之表面上直至體積達到約20 mL來移除殘留乙醚。用Milli-Q水(200 mL)稀釋所得溶液並將其裝載至C8製備型HPLC管柱(5×25 cm；Zeosphere 120DRP，A10)上。
用乙腈(20-35%)/水(含有0.1%v/v TFA)梯度，在28 mL/min下經144分鐘自管柱溶離出樣本，同時在225 nm及280 nm下進行UV監測。藉由RP-HPLC(管柱：Waters XSelect CSH C18，4.6×50mm)鑑別含有所需產物之溶離份且彙集起來(100 mL；藉由RP-HPLC測定為99.8%)。ESMS：解卷積譜圖：觀測值：6,577.1 Da；計算值：6,578.5 Da。
在轉化成HCl鹽交換(管柱法)時，用水將以上彙集之溶離份稀釋至200 mL並將其再裝載至Zeosphere製備型HPLC管柱上。接著，更換溶離緩衝液。A緩衝液包括含0.01% HCl之水且B緩衝液係乙腈。
接著，用三管柱體積之5%緩衝液B洗滌管柱，且接著使用70%緩衝液B溶離樣本，同時在225 nm及280 nm下監測。將樣本收集於清潔的凍乾瓶中，冷凍並凍乾，得到呈白色粉末狀之化合物12(620.5 mg，0.094 mmol；34%總產率)。藉由分析RP-HPLC確定純度並發現純度為99.9%。ESMS：解卷積譜圖：觀測值：6,577.3 Da；計算值：6,578.5 Da。
在轉化成HCl鹽交換(樹脂法)時，將化合物12(TFA鹽；102.9 mg)溶解於水/乙腈(1:1 v/v；20 mL)中並將其添加至氯離子交換樹脂(4.05 g；248 mmol樹脂/mmol胰島素；Bio-Rad 1-x8(目錄號140-1431)；50-100目；氯離子形式；2.08毫當量/公克乾重；46%水分；四級銨；控制號碼2100011742)中，該樹脂用甲醇、乙腈及水/乙腈(1:1 v/v)各20 mL預先洗滌。
在室溫下，將樹脂與胰島素混合1小時，此時，過濾出樹脂並用水/乙腈(1:1 v/v，20 mL)洗滌。合併濾液及洗滌液，冷凍並凍乾，得到呈白色粉末狀之化合物12(89.9 mg；87%步驟回收率)。藉由分析RP-HPLC確定純度並發現純度為99.9%。ESMS：解卷積譜圖：觀測值：6576.7 Da；計算值：6578.5 Da。亦可使用其他鹽交換方法，諸如透析。
藉由用內切蛋白酶Glu-C消化來確定本發明化合物之LysB29醯化。將約300 µg化合物12或19溶解於50 mM Tris緩衝液(pH 8，1 mg/ml)中，且接著用20 µg內切蛋白酶Glu-C(Worthington Biochemical目錄號LS003605)處理。在室溫下培育17.5小時之後，用0.1N HCl(300 µL)淬滅反應混合物之等分試樣(200 µL)。
藉由LC/MS(Waters XBridge C8管柱，4.6×150 mm，5 µm，130Å)分析所得混合物(80 µL)。發現診斷片段B22-30+化合物A係1944.4 Da(對比計算值=1944.3 Da)。由此得到的化合物12或19之所有其他Glu-C消化片段均未醯化。
活體外受體親和力 在人類胰島素受體(hIR)及人類IGF-1受體(hIGF-1R)閃爍近接分析(scintillation proximity assay，SPA)競爭性放射性配位體結合分析中，使用自過度表現重組hIR-A、hIR-B或hIGF-1R的穩定轉染之293 HEK細胞以差速離心步驟製備之膜測試化合物12及19以及對照化合物(生物合成人類胰島素及類胰島素生長因子1(IGF-1))。
使用的分析緩衝液條件由50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.003%(w/v)NP-40組成且含有人類重組(3-[125 I]-碘代酪胺醯基-A14 )-胰島素或人類重組[125 I]-IGF-1。針對未標記人類胰島素或IGF-1對照將每分鐘計數(CPM)數據校正並以在y軸上之抑制百分比相對於在x軸上之化合物濃度對數作圖。IC50值係由4參數邏輯斯蒂非線性回歸分析(4-parameter logistic non-linear regression analysis；GeneData，第12版)測定且表示抑制50%之特異性結合的濃度。必要時，將曲線頂部或底部參數分別設定為100%或0%，以得到完整曲線。
基於等式Ki=IC50/(1+L*/Kd)，由IC50值計算親和力常數(Ki)，其中L*等於實驗中使用之放射性配位體的濃度且Kd等於針對各別受體之放射性配位體的平衡結合親和力常數，均由飽和結合分析測定。
化合物12之Ki計算值對於hIR-A係Ki=7.11 nM且對於hIR-B係Ki=7.56 nM(表1)。化合物12及人類胰島素均對於hIR-A及hIR-B具有低於10 nM之結合親和力且相較於hIGF-1R，化合物12對hIR-A及hIR-B之選擇性較高(對於二者的選擇性＞500倍)，類似於相同分析中人類胰島素之選擇性比率。
化合物19之Ki計算值對於hIR-A係Ki=3.40 nM且對於hIR-B係Ki=3.45 nM(表1)。化合物19及人類胰島素均對於hIR-A及hIR-B具有低於4 nM之結合親和力且相較於hIGF-1R，化合物19對hIR-A及hIR-B之選擇性較高(對於二者的選擇性＞700倍)，其選擇性高於在相同分析中人類胰島素之選擇性比率。表 1 ：人類胰島素受體亞型A及B(hIR-A及hIR-B)以及人類似胰島素生長因子-1受體(hIGF-1R)結合親和力，Ki及SEM值係以精確至3個有效數位表示之幾何平均值
受體功能活化 胰島素受體含有細胞內酪胺酸激酶結構域，其在配位體結合時使其自身酪胺酸殘基自體磷酸化以允許募集接頭蛋白，由此用來誘導胰島素信號傳導路徑。在配位體處理過度表現hIR-A、hIR-B或hIGF-1R之293HEK細胞之後，測定用於刺激受體在酪胺酸殘基上自體磷酸化的功能細胞活性，該hIR-A、hIR-B或hIGF-1R各自具有C末端C9抗原決定基(TETSQVAPA，SEQ ID NO: 5)。
在不含白蛋白之培養基中，在37℃下用各種濃度之配位體刺激細胞60分鐘(hIR-A及hIR-B分析)或30分鐘(hIGF-1R分析)之後，藉由ELISA測定各受體之激酶結構域之酪胺酸自體磷酸化水準；其中藉由針對C9抗原決定基標籤之抗體(RHO 1D4)捕捉活化受體，隨後用泛抗磷酸酪胺酸辣根過氧化酶偶聯物4G10™-HRP抗體偵測酪胺酸磷酸化程度。
功能效力報導為相對於最大有效濃度(100 nM)之陽性對照人類胰島素(hIR-A及hIR-B磷酸化分析)或10 nM陽性對照hIGF-1(hIGF-1R磷酸化分析)，引起半數最大響應(EC50)之濃度。EC50值係由4參數邏輯斯蒂非線性回歸分析(NGR Screener 13)測定。必要時，將曲線頂部或底部參數分別設定為100或0。
報導的EC50值係以幾何平均值及平均值之幾何標準誤差(geoSEM)顯示，其中獨立測定之次數以「n」指示(表2)。
化合物12展示人類IR-A及IR-B同功異型物之活化。化合物12及人類胰島素針對IR-A及IR-B同功異型物之效力低於40 nM。化合物12對於hIR-A及hIR-B之效力係對於IGF-1R之效力的約1300倍，大於在相同分析中人類胰島素之選擇性比率。
化合物19展示人類IR-A及IR-B同功異型物之活化。化合物19及人類胰島素針對IR-A及IR-B同功異型物之效力低於25 nM。化合物19對於hIR-A及hIR-B之效力係對於IGF-1R之效力的約400倍，大於在相同分析中人類胰島素之選擇性比率。比較起來，人類胰島素對IR-A及IR-B之選擇性係對IGF-1R之選擇性的約200倍。表 2 ：人類胰島素受體亞型A及B(hIR-A及hIR-B)以及人類似胰島素生長因子-1受體(hIGF-1R)活化
在大鼠 1 型糖尿病 模型中之活體內效力之評估 在鏈佐黴素(STZ)處理之大鼠糖尿病模型中研究化合物12及19之作用。自Envigo (Indianapolis, Indiana)獲得體重為400-425公克的雄性史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)。使大鼠適應環境約一週之後，用異氟烷使其麻醉並給與Zanosar®(件號89256，Teva Parenteral Medicines，40 mg/kg，IV)之單次注射液。研究中使用注射Zanosar之後3天的大鼠；在該等研究中僅使用非空腹血糖在400-550 mg/dl之間的動物。
將大鼠分成提供相當之血糖和體重變化的數組；將大鼠隨機分組。使用Accu-Chek Aviva血糖儀(Roche)量測血糖。
對STZ處理之大鼠給與單次皮下(SC)劑量之測試物或媒劑(無菌標準生理食鹽水，0.9% w/v氯化鈉溶液)。藉由尾部抽血收集血液樣本進行血糖量測。在整個實驗中，使動物自由接取食物及水。送交來自該等研究之血漿樣本用於化合物含量分析。如表3中所示，化合物12在100 nmol/kg劑量下有效使血糖降低至少24小時。表3顯示在評估期間各個時間點時化合物19的值。化合物19在100 nmol/kg劑量下亦有效使血糖降低至少24小時。表 3 ：化合物12之活體內效力 *超過601的值未量測，因為該值係血糖儀上之高讀數表 4 ：化合物19之活體內效力 *超過601的值未量測，因為該值係血糖儀上之高讀數
豬 1 型糖尿病 模型中藥物清除率之評估 將預先建立血管通路的去勢雄性糖尿病(阿尿素(alloxan)誘發)Yucatan微型豬放入吊網中進行限制並使其血管通路端口可接取(配備用於血液取樣)且檢查通暢性。將動物隨機地分入治療組並放回其圍欄。收集兩個基線血液樣本(-30分鐘及0分鐘)之後，用胰島素注射器(0.3 ml，5/16”針)在動物側腹中皮下注射1.8 nmol/kg測試物(0分鐘)。所有研究動物在其餘血液收集期內均任意接取清潔的淡水。
在以下時間點自各動物收集連續血液樣本(各2.0 mL)：-30、0(在即將給藥前)、在皮下給藥之後1.5、3、6、12、18、24、36、42、48、54、60及72小時。接著，所有研究動物禁食過夜且不再餵食直至24小時之後收集樣本。在此時，對動物餵食300公克S-9飼料並投與0.2 U/kg優泌樂(Humalog)。再次使其禁食直至60小時之後收集樣本，且接著，其接受300公克S-9飼料及0.2 U/kg優泌樂。使其恢復正常進食且維持胰島素方案，72小時之後，收集樣本。
血液樣本(抗凝血劑：無[血清])在環境溫度下維持至少30分鐘但不超過2小時以使其凝固。使用自動化AU480臨床化學分析儀(Clinical Chemistry Analyzer)測定血清葡萄糖濃度。運送用於PK之等分試樣進行分析。
除非另外說明，否則數據係以平均值+/-平均值之標準誤差(SEM)表示。藉由自基線血糖值減去每個時間點之血糖值來計算血糖自基線之變化。基線值係由-0.5分鐘及0分鐘血糖值之平均值計算。收集PK/PD樣本直至給藥後72小時。
在Q2 Solutions(Ithaca, NY)，藉由LC/MS量測化合物12之豬血漿(K3EDTA)濃度。使用抗胰島素-生物素單株抗體(Fitzgerald #10R-I134E)及塗佈抗生蛋白鏈菌素之磁珠(Invitrogen M-280)，使化合物12自100 µL血漿/血清等分試樣中進行免疫沈澱(IP)。洗滌步驟之後，用酸性乙腈(5:20:80甲酸/乙腈/水)自IP複合物溶離胰島素變異體。
溶離之後，將10 µL溶離劑注射至質譜儀上進行LC/MS分析。LC/MS系統由Dionex 2D-nanoUPLC液相層析儀(NCS-3500RS)及Thermo Q/Exactive Plus質譜儀組成。使用由Thermo微型前置管柱(160454)以及均在60℃下操作的Acclaim PepMap 100 C18管柱(0.3×5 mm，5 µm dp)及Thermo Easy Spray PepMap C18分析管柱(75 µm×15 cm，5 µm dp)組成的連續截留管柱，藉由二維層析法完成解析。
質譜儀係以陽離子、nanoESI(Easy Spray)模式操作，且監測化合物12之以下前驅體/產物離子轉變：1316.600→586.854。該等分析經驗證以量測在0.25至50 ng/mL範圍內之胰島素變異體濃度。
在單次皮下(SC)投與1.8 nmol/kg化合物12之後，評估誘發糖尿病之雄性Yucatan豬中化合物12之藥物動力學(PK)。以與化合物12類似之方式製備德谷胰島素樣本並在此研究中用作比較劑。
化合物12及德谷胰島素的一些PK參數顯示於表5中。化合物12之清除率比德谷胰島素之清除率要慢2-3倍，由此可以使化合物12在人體中活體內產生較平之PK型態及延長之持續作用時間。表 5 ：在單次皮下給藥之後誘發糖尿病之雄性Yucatan豬中化合物12及德谷胰島素的平均PK參數 縮寫：T1 / 2 =半衰期；Tmax =達到最大濃度之時間；Cmax =最大血漿濃度；AUC0 - inf =自0至無窮大的曲線下面積；CL/F=清除率/生物利用率(對於化合物12，N=5；對於德谷胰島素，N=6)
化學穩定性之評估 藉由將冷凍乾燥的化合物12及19粉末溶解於20 mM NaOH中達到約6 mM之目標濃度來製備樣本。接著，針對10 mM Tris對此溶液透析，得到5.6 mM之儲備液濃度。接著，使用此儲備溶液製備含有10 mM Tris、19 mg/mL甘油、3.15 mg/mL間甲酚及每份胰島素六聚體4份鋅(以莫耳計)的目標濃度之溶液，pH值為7.5。目標濃度係U200(200個單位/毫升，相當於1.2 mM)、U400(2.4 mM)、U600(3.6 mM)及U800(4.8 mM)。溶液之實際濃度在目標濃度水準之0.1 mM內。比較劑德谷胰島素樣本係以與化合物12及19樣本相同之方式製備以用於穩定性研究。
對於使用期間穩定性研究，將樣本裝載至3 mL矽化筒中，填充體積為約1.5 mL。筒柱塞安置成除去筒中之頂部空間。接著，將筒置於30℃下。樣本藉由附接針且約每2天噴出5-10 µL來經歷「使用期間」情形。如下表中所詳述，在初始時間點及在各種額外的儲存天數之後，藉由逆相層析法(RP-HPLC)及尺寸排阻層析法(SEC)對樣本進行分析。
對於靜態儲存穩定性研究，將樣本裝載至3 mL筒中，填充體積為1.5mL，或裝載至0.3 mL玻璃小瓶中，填充體積為約0.2 mL。接著，將該等筒或小瓶置於30℃下。如下表中所詳述，在初始時間點及在各種額外的儲存天數之後，藉由逆相層析法(RP-HPLC)及尺寸排阻層析法(SEC)對樣本進行分析。
RP-HPLC參數如下：(1)儀器：配備UV偵測器及管柱烘箱之LC；(2)管柱：SymmetryShield RP18 3.5 μm PN186000179 SN01593532014028；(3)管柱溫度：60℃；(4)4.移動相：A=含0.085% TFA之水，B=含0.085%TFA之乙腈；以及(5)梯度如下，流量為0.9 mL/min：
如藉由RP-HPLC或SEC所測定，自U200至U800之化合物12濃度對穩定性無明顯影響。化合物12在使用期間穩定性研究中在30℃下之化學穩定性(到110天之數據)顯示於表6中。U200濃度的化合物12、化合物19及比較劑德谷胰島素在靜態穩定性研究中之化學穩定性顯示於表7中。德谷胰島素在靜態穩定性研究中在30℃下之化學穩定性顯示於表8中。
在四種不同濃度下化合物12之主峰的平均降解速率為每週0.064%，如表6中所示。該速率比德谷胰島素之主峰降解速率0.49%低7-8倍，如表8中所示。表7顯示在相同時間點，化合物12、化合物19及德谷胰島素之U200調配物的直接比較。在表7中顯示的直接比較中，化合物12之降解速率比德谷胰島素要低超過四倍且化合物19之降解速率比德谷胰島素要低超過兩倍。化合物12及19所展現的較低化學降解速率可以使本發明化合物之儲存期限增加。表 6：藉由RP-HPLC監測的化合物12在30℃下之主峰百分比 表 7 ：藉由RP-HPLC監測的化合物12、化合物19及德谷胰島素在30℃下之主峰百分比 表 8 ：藉由RP-HPLC監測的德谷胰島素在30℃下之主峰百分比
序列 A 鏈 之一般結構 (SEQ ID NO:1) GIVEQCCTSICSLYQLENYCXaa 其中在SEQ ID NO: 1之21位之Xaa係G或N。化合物 12 之 A 鏈 (SEQ ID NO:2) GIVEQCCTSICSLYQLENYCG化合物 19 之 A 鏈 (SEQ ID NO:3) GIVEQCCTSICSLYQLENYCN化合物 12 及 19 之 B 鏈 (SEQ ID NO:4) FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTC 末端 C9 抗原決定基 (SEQ ID NO: 5) TETSQVAPA

Claims (11)

  1. 一種下式之化合物，其中Xaa係胺基酸甘胺酸或天冬醯胺。
  2. 如請求項1之化合物，其中Xaa係胺基酸甘胺酸。
  3. 如請求項1之化合物，其中Xaa係胺基酸天冬醯胺。
  4. 如請求項1至3之化合物，其係用於療法中。
  5. 如請求項1至3之化合物，其係用於治療糖尿病。
  6. 如請求項1至3之化合物，其係用於治療高血糖症。
  7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3之化合物及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
  8. 一種具有下式之化合物，。
  9. 一種如請求項1至3之化合物或如請求項7之醫藥組合物於製造用於治療糖尿病之藥物中的用途。
  10. 一種如請求項1至3之化合物或如請求項7之醫藥組合物於製造用於治療高血糖症之藥物中的用途。
  11. 如請求項10之化合物用途，其係用於製備或製造如請求項1至3中任一項之化合物。
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