BR112019021638A2 - Vetor de herpesvírus galináceo 3, vacina, cromossomo artificial bacteriano, método para produção de um vetor de herpesvírus galináceo 3 recombinante - Google Patents

Vetor de herpesvírus galináceo 3, vacina, cromossomo artificial bacteriano, método para produção de um vetor de herpesvírus galináceo 3 recombinante Download PDF

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Abstract

a invenção refere-se a um vetor de herpesvírus galináceo 3 recombinante que codifica antígenos heterólogos patogênicos aviários compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos inseridos nos loci intergênicos ul3/ul4 e/ou ul21/ul22. a invenção refere-se ainda a vacinas compreendendo o referido vetor de herpesvírus galináceo 3 recombinante e, opcionalmente, mais um vetor do vírus da doença de marek e ao uso da vacina para proteger uma espécie aviária contra um ou mais patógenos aviários. são providos métodos adicionais para o tratamento de uma espécie aviária que visam proteção contra uma ou mais doenças causadas por patógenos aviários e um método para produção do vetor de herpesvírus galináceo 3 recombinante que codifica antígenos heterólogos patogênicos aviários.

Description

VETOR DE HERPESVIRUS GALINÁCEO 3, VACINA, CROMOSSOMO ARTIFICIAL
BAC TE RI ANO, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM VETOR DE HERPESVIRUS
GALINÁCEO 3 RECOMBINANTE
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se a um vetor de herpesvirus galináceo 3 (Gallíd herpervírus 3) recombinante que codifica antigenos heterólogos patogênicos aviários compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22. A invenção refere-se ainda a vacinas compreendendo o referido vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante e, opcionalmente, mais um vetor do vírus da doença de Marek e a um uso da vacina para proteger uma espécie aviária contra um ou mais patógenos aviários. São providos métodos adicionais de tratamento de uma espécie aviária para proteção contra uma ou mais doenças causada por patógenos aviários e um método para produção do vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante que codifica antigenos heterólogos patogênicos aviários.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A doença de Marek (DM) é uma doença altamente contagiosa das aves domésticas, caracterizada pelo aparecimento rápido de linfomas de células T. É uma doença de distribuição mundial que provoca imensos prejuízos econômicos à avicultura. O agente causador da doença, o vírus 1 da doença de Marek (MDV1, Gallíd herpesvirus 2, GaHV-2), é um herpesvirus alfa do gênero Mardivirus (ICTV, 2006), o qual também inclui o herpesvirus de perus, antigenicamente relacionado (HVT, Meleagrid herpesvirus
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1), uma cepa amplamente utilizada como vacina contra a DM desde o final da década de sessenta (Kawamura et al., 1969; Witter et al. , 1970) . O terceiro membro do gênero Mardívírus é o MDV-2 (Gallid herpesvirus 3, GaHV-3), que inclui cepas não patogênicas, sendo algumas destas utilizadas como vacinas vivas contra a DM (von Bülow et al., 1975).
[003] O virus 1 da doença de Marek (MDV-1) ou herpesvirus galináceo 2 (GaHV2), o agente causador da doença de Marek (DM), é um dos principais patógenos nas aves. MDV-1 faz parte do gênero Mardivirus na família Herpesvírídae. Nas aves infectadas, MDV-1 replica-se nas células epiteliais do folículo das penas e se dissemina através da via respiratória pela inalação de poeira em ambientes de criação de aves, contaminada com o vírus infeccioso eliminado junto com as células descarnadas da pele e penas. A DM é caracterizada por linfomas generalizados de células T e sintomas de paralisia que se devem à infiltração dos linfócitos nos nervos. A taxa de mortalidade provocada pela DM varia entre 10-30%, pode ir até 60-80%. Vacinas vivas compreendendo cepas diferentes têm sido utilizadas em combinações diferentes para o controle da DM nos últimos 40 anos (Witter RL. Curr Top Microbiol Immunol. 2001; 255: 57-90; Calnek BW et al. , Avian diseases. 1983;27:844-9) . Essas incluem a cepa Rispens naturalmente atenuada de MDV-1 (CVI-988), a cepa SB-1 de MDV-2 (GaHV3) e a cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT).
[004] Além de sua utilização como vacinas bem sucedidas na indução de proteção prolongada contra a DM, cepas vacinais de herpesvirus de aves foram também reconhecidas como vetores virais recombinantes para induzir proteção contra outras doenças
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3/90 infecciosas importantes das aves. O vetor mais bem sucedido e amplamente utilizado para vacina recombinante é HVT, que demonstrou muita eficácia na proteção contra vários patógenos virais aviários (Morgan RW, et al. , Avian diseases 1993; 37: 1032-40; Li Y, et al., Vaccine. 2011; 29: 8257-66; Darteil R et al. , Virology 1995;211:481-90; Kapczynski DR et al., Vaccine. 2015; 33: 1197-205). Embora vacinas individuais de HVT recombinante tenham comprovado ser extremamente eficazes, quando se utiliza mais de uma vacina do vetor HVT, tem sido problemático obter as respostas imunes desejadas contra cada componente da vacina combinada. Existem recomendações claras para não se utilizar outro HVT com os vetores recombinantes, pois haverá interferência, resultando em pouca eficácia contra o material exógeno inserido (American Association of Avian Pathologists A. Frequently asked questions on viral tumor diseases http ://www.aaap.info/frequently-asked-questions-on-viraltumor-diseases, 2012) . Com essa restrição sobre o vetor HVT para o seu uso como vacinas multivalentes, há necessidade de outras plataformas como vetores que complementarão, em vez de interferirem com a proteção contra múltiplos componentes na vacina.
[005] O primeiro GaHV3 (MDV-2) licenciado para uso como vacina foi da cepa SB-1 (Schat KA et al. , J Natl Cancer Inst. 1978; 60: 1075-82) . Foi introduzido originalmente como vacina contra a DM na metade da década de oitenta e usado em combinação com uma vacina de HVT (Calnek BW et al., Avian diseases. 1983; 27: 844-9). Vacinas bivalentes contendo as cepas SB-1 e Fcl26 de HVT têm sido usadas com êxito em muitos países, incluindo os Estados Unidos, na América do Sul e na Ásia (Witter RL. Curr Top
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Microbiol Immunol. 2001; 255: 57-90; Bublot M, Sharma J. Vaccination against Marek's disease. In: Davison F, Nair V, editors. Marek's Disease-An Evolving Problem. London: Elsevier Academic Press; 2004. p. 168-85). Acredita-se que vacinas bivalentes com SB-l/HVT confiram proteção superior pelo efeito sinérgico, embora o mecanismo molecular não tenha sido identificado (Calnek BW et al. , Avian diseases. 1983;27:844-9; Witter RL et al. , Avian pathology: journal of the WVPA. 1984;13:75-92). Foi também relatado que SB-1 induz uma proteção muito boa em pintos positivos para anticorpo materno (Witter RL et al. , Avian pathology: journal of the WVPA. 1984; 13: 75-92) . 0 genoma de 166-Kb da cepa SB-1 de GaHV3 possui uma organização genômica semelhante à do MDV-1, compartilhando vários genes homólogos (Spatz SJ et al. , Virus Genes. 2011; 42:331-8) bem como um conjunto exclusivo de genes e microRNAs (Yao Y et al. , J Virol. 2007;81:7164-70).
[006] Diferentemente de MDV-1, onde estudos extensos foram conduzidos para examinar os determinantes moleculares de várias características biológicas, somente poucos estudos foram realizados sobre o genoma de GaHV3 (MDV-2) para revelar algumas das propriedades exclusivas associadas com esse vírus. A determinação da sequência genômica completa da cepa HPRS-24 protótipo do MDV-2 possibilitou as comparações da estrutura do genoma e da sequência com outras espécies do MDV (Izumiya et al., 2001) . Avanços recentes na clonagem de genomas de herpesvirus como cromossomas artificias bacterianos (BAC) ajudaram a identificar características moleculares de diversos herpesvirus (Adler et al., 2003; Zelnik, 2003) incluindo MDV-1 (Petherbridge et al., 2004, 2003; Schumacher et al., 2000), HVT
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5/90 (Baigent et al.,
2006) e a cepa vacinai SB-1 do MDV-2 (Petherbridge et al., 2009).
[007] Vacinas contra MDV baseadas em uma cepa recombinante do herpesvirus MDV oferecem a vantagem de conseguir simultaneamente a imunidade contra MDV e pelo menos contra um patógeno viral adicional. Diferentes métodos foram empregados para produzir tais vacinas bivalentes. Uma das abordagens amplamente utilizada e bem-sucedida foi entregar o antígeno VP2 do IBDV em várias plataformas de vetor vacinai contra MDV, incluindo o HVT (Tsukamoto K et al., J Virol. 2002; 76: 563745; Perozo F et al. , Avian diseases. 2009; 53: 624-8), MDV-1 (Tsukamoto K et al., Virology. 1999; 257: 352-62; Zhou X et al. , Vaccine. 2010;28:3990-6) e vetores virais da varíola aviária (Tsukamoto K et al. , Virology. 2000; 269: 257-67) . Considerando a necessidade de proteger as aves contra múltiplos patógenos, há necessidade de plataformas de vetores adicionais que não interferirão uma com a outra na geração de respostas imunes protetoras a todos os componentes na vacina.
[008] MDV e IBDV são vírus altamente infecciosos cujas taxas de mortalidade os tornaram uma ameaça constante à avicultura mundial durante décadas. A presença de anticorpos maternos, a emergência de novas variantes, o custo de produção e, em alguns casos, a falta de adesão à estratégia DIVA (revisado em Muller H, et al., Avian pathology: journal of the WVPA. 2012; 41: 1339) constituem desafios que limitam o controle eficiente do IBDV. IBDV é um dos vírus contra os quais é mais difícil de proteger utilizando vacinas vivas recombinantes para aves e, consequentemente, a eficácia adequada relativa à proteção
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6/90 precisa ser demonstrada. Vacinas bivalentes contra MDV/IBDV permitem a vacinação contra as duas doenças simultaneamente, diminuindo os custos de produção e inoculação. Elas também são mais seguras e podem ser fornecidas ín ovo, diferentemente de vacinas com IBDV atenuado que causam IBD (bursite infecciosa aviária) em pintos e são fatais para embriões. VAXXITEKhve+ibd é uma vacina existente contra MDV/IBDV baseada em HVT. No entanto, há ainda necessidade de vacinas bivalentes adicionais contra o MDV.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção provê um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante (GaHV3; MDV-2) compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3. De preferência, o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante. Em uma modalidade, o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais polinucleotideos heterólogos inseridos no locus intergênico UL3/UL4 do vetor do herpesvirus galináceo 3. De preferência, pelo menos um antígeno confere proteção contra o vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV). Pelo menos um antígeno pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em (a) VP2, VP3, VP4 e VPX do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV);
(b) glicoproteína B, glicoproteína I, glicoproteína D,
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7/90 glicoproteina E e glicoproteina C de ILTV; (c) proteína de fusão do virus da doença de Newcastle (NDV-F) e hemaglutinina e neuraminidase viral (NDV-NH) do NDV (d) hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) do virus da gripe aviária; e (e) proteína SI ou S2 de IBV. De preferência, pelo menos um antígeno confere proteção contra IBDV. Mais preferivelmente, pelo menos um antígeno é VP2 de IBDV. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos da proteína VP2 exibe pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NOs: 12. Em outra modalidade, a proteína VP2 possui a sequência apresentada em SEQ ID NOs : 12 .
[0010] O vetor do herpesvirus galináceo 3, de preferência, contém cassete(s) de expressão incluindo um ou mais polinucleotídeos heterólogos, em que, opcionalmente, o cassete de expressão compreende ainda um promotor. Em uma modalidade, o promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV), promotor do CMV de cobaias, promotor do CMV de murinos, promotor do SV40, promotores do vírus da pseudoraiva do promotor da glicoproteina X, promotor alfa 4 do vírus do herpes simples 1, promotor da beta-actina de galinha, promotor da beta-actina de coelho, promotor da timidina quinase do vírus do herpes simples, promotores dos genes de glicoproteínas gC, gB, gE ou gl do vírus da doença de Marek e promotores das glicoproteínas gB, gE, gl, gD do vírus da laringotraqueíte infecciosa.
[0011] Em outro aspecto, é provida uma vacina que compreende o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção. A vacina pode compreender ainda um excipiente, veículo ou
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8/90 adjuvante farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a vacina também compreende mais um vetor do vírus da doença de Marek (MDV) selecionado a partir do grupo que consiste em Vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT), em que o vetor adicional de MDV pode ser um vetor de MDV recombinante. Em uma modalidade específica, o vetor adicional do vírus da doença de Marek (MDV) é um vetor do vírus da doença de Marek (MDV) recombinante incluindo o vetor do vírus da doença de Marek (MDV) recombinante que compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário. De acordo com a invenção, o vetor adicional do vírus da doença de Marek recombinante pode ser um segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante além do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de acordo com a invenção, sendo o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante.
[0012] Em uma modalidade, o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante também compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do dito segundo vetor do herpesvirus galináceo 3, de preferência no locus intergênico UL3/UL4 do segundo herpesvirus galináceo 3, em que o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um antígeno diferente de um patógeno aviário como o um ou mais polinucleotídeos heterólogos do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante. O vetor adicional do vírus da doença
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9/90 de Marek e o (primeiro) vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de acordo com a invenção podem ser administrados juntos ou separados um do outro.
[0013] Em outro aspecto, a presente invenção provê um DNA isolado que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de acordo com a invenção.
[0014] Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê um cromossomo artificial bacteriano (BAC) compreendendo um polinucleotideo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de acordo com a invenção.
[0015] Em ainda outro aspecto, a vacina da invenção é provida para uso na vacinação de uma espécie aviária contra uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários, de preferência contra a doença de Marek, e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários. Em uma modalidade, uma ou mais doenças são causadas por um ou mais dentre o vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), o vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), o vírus da doença de Newcastle (NDV), o vírus da gripe aviária (AIV) ou o vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV) . A vacina é provida ainda para uso na proteção de uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários, de preferência contra sintomas clínicos causados pelo vírus da doença de Marek e sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários. Em uma modalidade, um ou mais patógenos aviários causadores das doenças ou dos sintomas clínicos são selecionados a partir do grupo que consiste em patógenos doe vírus da doença de Newcastle, vírus da doença infecciosa da bursa e vírus da laringotraqueíte infecciosa
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10/90 aviária, virus da gripe aviária e virus da bronquite infecciosa aviária .
[0016] A espécie aviária pode ser de aves domésticas, de preferência, a espécie aviária é de galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombo-malhado ou pombo comum, mais preferivelmente a espécie aviária é de peru ou galinha, ainda mais preferivelmente galinha. A vacina de acordo com a invenção pode ser administrada por spray, ín ovo, por via subcutânea, intramuscular, oral ou nasal. Em uma modalidade em particular, a vacina é administrada ín ovo, de preferência ín ovo em ovos embrionados de 18 dias. Em uma modalidade alternativa, a vacina é administrada por via subcutânea ou intramuscular a pintos, de preferência a pintos de 1 dia de idade.
[0017] É ainda provido um método para tratar uma espécie aviária visando proteção contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários, o qual compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz da vacina de acordo com a invenção, em que de preferência uma ou mais doenças são causadas por um ou mais dentre vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
[0018] Em ainda outro aspecto, é provido um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) que compreende um ou mais marcadores inseridos nos locí intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, de preferência no locus intergênico UL3/UL4 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o marcador é de preferência um gene marcador de seleção,
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11/90 um gene repórter ou um código de barra de DNA. De preferência, o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante. Além disso, é provido também um cromossomo artificial bacteriano (BAC) compreendendo um polinucleotídeo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante incluindo um ou mais marcadores inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante.
[0019] Além disso, é provido também um método para produzir um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, o qual compreende (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) inserir um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3 e, opcionalmente, (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b). Em uma modalidade, o método compreende (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais marcadores nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) substituir um ou mais marcadores por um cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário e (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b). De preferência, o
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12/90 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante.
LEGENDAS DAS FIGURAS
[0020] Figura 1. A) Processo de recombinação (recombineering) para gerar (em cima, A-i) SB-1-UL3/4VP2, (no meio, A-ii) SB-1UL10/11VP2 e (embaixo, A-iii) SB-1-UL21/22VP2. O cassete de expressão de VP2 foi inserido nos loci intergênicos UL3/UL4, UL10/UL11 e UL21/UL22. O cassete de expressão de VP2 é mostrado como uma seta contínua. A localização e a orientação dos genes de SB-1 são mostradas. B) Imunocoloração de VP2 (azul escuro) em placas de células infectadas. Células CEE foram infectadas com (B-i) SB-1-UL3/4VP2, (B-ii) SB-1-UL21/22VP2 e (B-iii) SB-1UL10/11VP2. As células foram fixadas cinco dias após a infecção e coradas como descrito na seção de materiais e métodos (barra de escala = 2000 pm).
[0021] Figura 2. Curva de crescimento de vírus SB-1 recombinantes in vitro. O número de cópias do genoma por um milhão de células CEE é traçado contra horas após a infecção; vírus vacinais SB-1-UL3/4VP2 (), SB-1-UL21/22VP2 (·) , SB-1UL10/11VP2 (O) e SB-1 (A) . Não foi observada diferença significativa entre SB-1 e SB-1 UL3/4VP2 depois de 24 horas após a infecção. O nível de replicação de SB-1-UL10/11VP2 e de SB-1UL21/22VP2 foram menores do que aquele dos vírus SB-1 e SB-1UL3/4VP2. Cada momento foi calculado tendo por base três réplicas. Cada réplica foi medida em triplicata. As barras de erro representam o desvio padrão.
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[0022] Figura 3. Titulações de anticorpos neutralizantes contra VP2 no soro de galinhas imunizadas com as vacinas dos vírus VAXXITEKhvt+ibd (♦), SB-1-UL3/4VP2 (), SB-1-UL21/22VP2 (·) , SB-1-UL10/11VP2 (O) e SB-1 (A). Amostras de soro foram coletadas em 2, 3 e 4 semanas após a vacinação. A titulação média em cada grupo é mostrada como uma barra horizontal.
[0023] Figura 4. As galinhas foram vacinadas com VAXXITEKhvt+ibd (♦), SB-1-UL3/4VP2 (), SB-1-UL21/22VP2 (·) e SB-1 (A) seguida por infecção com IBDV UK661 no momento 0. A) Pontuação clínica média em aves vacinadas desafiadas com IBDV UK661. As barras mostram o desvio padrão, n=8. B) Porcentagem de sobrevida para as aves vacinadas desafiadas com IBDV UK661. Aves inoculadas com pSB-1 foram sacrificadas por motivos humanitários ou morreram 55 horas após a infecção pelo IBDV.
[0024] Figura 5. As galinhas foram vacinadas com SB-1UL3/4VP2 (), SB-1-UL3/4VP2 e HVT-9HA (A) e não vacinadas (controle negativo) (·). Titulações de anticorpos neutralizantes contra VP2 de IBDV em 0, 1, 3, 4, 5 e 6 semanas são mostradas (n=10). Barras de erro representam o desvio padrão.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0025] As modalidades gerais compreendendo ou compreende abrangem a modalidade mais específica consistindo em. Além disso, formas no singular e plural não são usadas de maneira limitativa. Neste relatório descritivo, as formas no singular um, uma, o e a designam o singular e o plural, a menos que expressamente indicado para designar o singular somente.
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[0026] O termo animal, neste relatório descritivo, inclui todos os mamíferos, aves e peixes. Nesse contexto em particular, animal refere-se a uma espécie aviária, como galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombo-malhado, pombo comum, cisne, faisão, papagaio, tentilhão, falcão, corvo, avestruz, ema e cassuar. Os termos animal e ave também incluem um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo estágio embrionário e fetal. De preferência, o animal é uma ave. Neste relatório descritivo, o termo ave refere-se a uma ave doméstica ou comercial mantida para produção de ovos, por sua carne ou penas. As aves podem ser aves da ordem Gallíformes, como galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombo-malhado e pombo comum.
[0027] O termo espécie aviária, neste relatório descritivo, refere-se a aves, de preferência aves como galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombo-malhado ou pombo comum. No contexto da presente invenção, é especialmente preferido peru ou galinha, sendo mais preferido galinha.
[0028] Os termos ácido nucleico, nucleotídeo e polinucleotídeo, neste relatório descritivo, são usados alternadamente e referem-se a um polímero de fita simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou bases ribonucleotídicas lidas da extremidade 5' para a 3' e incluem RNA, DNA, cDNA ou cRNA e derivados dos mesmos, como aqueles contendo cadeias principais (backbones) modificadas. No contexto do vetor do herpesvirus galináceo 3, o técnico no assunto entendería que este se refere ao ácido desoxirribonucleico, ou seja, DNA ou cDNA. Os polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados de diferentes maneiras (p. ex., por síntese
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15/90 química, por clonagem de genes etc.) e podem assumir várias formas (p. ex., linear ou ramifica, fita simples ou dupla, ou um híbrido do mesmo, primers (iniciador), sondas etc.). O termo sequência nucleotídica ou sequência de ácido nucleico refere-se às fitas sense e antisense de um ácido nucleico quer como fitas únicas individuais ou no duplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) inclui RNAi (RNA de inibição), dsRNA (RNA de fita dupla) , siRNA (pequeno RNA de interferência) , mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA de transferência, seja carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar).
[0029] O termo DNA genômico ou genoma é usado alternadamente e refere-se às informações genéticas hereditárias de um organismo hospedeiro. O DNA genômico compreende o DNA do núcleo (também referido como DNA cromossômico), mas também de outras organelas celulares (p. ex., mitocôndria).
[0030] O termo RNA genômico ou genoma refere-se às informações genéticas hereditárias de um vírus RNA. O RNA genômico pode ser um RNA de fita positiva ou de fita negativa.
[0031] O termo gene, neste relatório descritivo, refere-se a um locus do DNA ou RNA da sequência genômica hereditária que afeta os traços de um organismo ao ser expresso como um produto funcional ou por regulação da expressão do gene. Genes e polinucleotideos podem incluir introns e exons como na sequência genômica, ou apenas as sequências de codificação como nos cDNAs, tal como uma fase de leitura aberta (ORF) , compreendendo um códon de partida (códon de metionina) e um códon de parada da tradução. Genes e polinucleotideos podem também incluir regiões que
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16/90 regulam as suas expressões, como inicio da transcrição, tradução e terminação da transcrição. Assim, estão incluídos também elementos reguladores como os promotores.
[0032] O termo polinucleotídeo heterólogo, neste relatório descritivo, refere-se a um polinucleotídeo derivado de um organismo diferente ou de uma espécie diferente do receptor que codifica uma proteína heteróloga. No contexto do vetor do herpesvirus galináceo 3, o técnico no assunto entendería que este se refere a um DNA ou cDNA. Um polinucleotídeo heterólogo pode também ser chamado de transgene. Assim, pode ser um gene ou uma fase de leitura aberta (ORF) que codifica uma proteína heteróloga. No contexto do herpesvirus galináceo 3, polinucleotídeo heterólogo refere-se a um polinucleotídeo derivado de um patógeno aviário ou vírus diferente (espécie e/ou cepa diferentes), especialmente um vírus aviário diferente, incluindo um vírus diferente da família Herpesvírídae que causa infecção aviária e uma cepa diferente do herpesvirus galináceo
3. O termo heterólogo, quando usado com referência a partes de um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais sequências que não são encontradas com a mesma relação entre si na natureza. Heterólogo pode também se referir a uma sequência polinucleotídica viral, como um gene ou transgene, ou uma porção da mesma, inserida em um genoma viral no qual não é tipicamente encontrada, ou em um gene introduzido em um organismo no qual não é tipicamente encontrada.
[0033] Um vetor viral recombinante ou vetor viral, neste relatório descritivo, refere-se a um vírus recombinante que compreende um genoma do vírus e um polinucleotídeo heterólogo
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17/90 para transdução de uma célula hospedeira. Tal vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode ser derivado de uma cepa SB-1 ou HPRS24 do herpesvirus galináceo 3. Quando adequado, sequências de genes ou que codificam proteínas virais podem ser incorporadas em tal vetor viral recombinante, conforme aqui descrito, para vacinar uma galinha ou outra ave contra uma ou mais doenças virais. Um vetor viral recombinante pode também compreender um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um marcador. Tipicamente, um vetor viral recombinante contém um polinucleotídeo heterólogo ou transgene que está operativamente ligado a um promotor para dar efeito à transcrição do transgene. 0 termo recombinante inclui ainda qualquer modificação, alteração ou construção de um polinucleotídeo ou proteína em sua forma ou estrutura nativa, ou qualquer modificação, alteração ou construção de um polinucleotídeo ou proteína em seu ambiente ou entorno nativo. A modificação, alteração ou construção de um polinucleotídeo ou proteína pode incluir, entre outros, deleção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, deleção de um gene inteiro, otimização de códons de um gene, substituição conservadora de aminoácidos e inserção de um ou mais polinucleotídeos heterólogos.
[0034] O termo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante (GaHV3, MDV-2), neste relatório descritivo, refere-se a um vírus recombinante compreendendo todos os genes essenciais de GaHV3, tais como da cepa SB-1 ou HPRS24. As cepas do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2), usadas para o vetor viral recombinante, podem ser quaisquer cepas SB-1, incluindo, entre outras, a Vacina contra a Doença de Marek comercial (vacina SB-1) (Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, EUA), tendo uma sequência do genoma
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18/90 como definida pelo Número de Acesso do GenBank HQ840738.1. O vetor do herpesvirus galináceo 3 recombinante (GaHV3, MDV-2) pode conter ainda genes não essenciais excluídos ou modificados por mutação. O herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) pode ser qualquer herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) que compreenda uma sequência do genoma tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) conforme definida no Número de Acesso do GenBank HQ840738.1 (sem considerar sequências inseridas de polinucleotídeos heterólogos). Além disso, a deleção de genes não essenciais não é considerada para alinhamento de sequências.
[0035] Uma cepa do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2), além da SB-1, é a cepa HPRS24 cuja sequência genômica é definida pelo Número de Acesso do GenBank NC_002577.1 (INSDC: AB049735.1). Os genomas de HPRS24 e SB-1 compartilham 98,4% de identidade de sequência (Spatz and Schat, 201 1; Vírus Gene 42, 331-338). As cepas do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) usadas para o vetor viral recombinante podem ser os isolados HN-1, 287C/1, 401/1, 437A/1, 301B/1, 471B/1, 281MI/1 e 298B/1 descritos nas publicações (Witter (1987) Avian Dis 31, 752-765; Witter et al.
(1987) Avian Dis 31, 829-840; Witter (1995) Avian Pathology (1995) 24, 665-678). Embora não tenha sido utilizada como cepa vacinai até o momento, pode-se considerar a cepa HPRS24, ou qualquer um dos isolados mencionados acima de MDV-2, uma cepa vacinai adequada por causa do grau de parentesco e similaridade antigênica dos mesmos.
[0036] O termo proteína é usado alternadamente com sequências de resíduos de aminoácidos ou polipeptídeo e
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19/90 refere-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Esses termos também incluem proteínas que são modificadas após a tradução através de reações que incluem, entre outras, de glicosilação, acetilação, fosforilação ou processamento proteico. Modificações e mudanças, por exemplo, fusões com outras proteínas, substituições, deleções ou inserções na sequência de aminoácidos, podem ser feitas na estrutura de um polipeptídeo enquanto a molécula mantém a sua atividade biológica funcional. Por exemplo, podem ser feitas certas substituições na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou na sequência de ácido nucleico de codificação subjacente e uma proteína com as mesmas propriedades pode ser obtida.
[0037] O termo antígeno, neste relatório descritivo, é uma substância que provoca uma resposta imune adaptativa em um animal hospedeiro e pode também ser referido como imunógeno. Os antígenos são tipicamente de alto peso molecular e proteínas ou polissacarídeos. Peptídeos, lipídios, ácidos nucleicos e muitos outros materiais podem também atuar como antígenos. Um antígeno pode ser um organismo inteiro, morto, atenuado ou vivo, ou uma subunidade ou parte de um organismo; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune quando da apresentação a um animal hospedeiro; um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo, um epítopo, um haptenos ou qualquer combinação dos mesmos. Um imunógeno ou antígeno pode também ser uma toxina ou antitoxina. O antígeno codificado e expresso pelos polinucleotídeos heterólogos de acordo com a invenção é tipicamente uma proteína imunogênica ou antigênica. Neste relatório descritivo, um antígeno pode também se referir à parte ou fragmento imunogênico de um antígeno compreendendo o epítopo, p. ex., peptídeo(s).
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[0038] Neste relatório descritivo, o termo antígeno de um patógeno aviário refere-se a uma proteína codificada por um patógeno, de preferência um vírus aqui descrito, incluindo proteínas estruturais e não estruturais. Tais antígenos podem incluir proteínas virais naturais ou não naturais de IBDV, NDV, AIV, ILTV e/ou IBV, incluindo as proteínas VP2, F e/ou HN. Neste relatório descritivo, um antígeno refere-se uma proteína ou polipeptídeo viral, como um polipeptídeo viral, bem como partículas virais. Em algumas modalidades, um antígeno de acordo com a invenção pode também ser um ácido nucleico viral.
[0039] O termo proteína ou peptídeo imunogênico, neste relatório descritivo, inclui polipeptídeos que são imunologicamente ativos no sentido de que, uma vez administrado ao hospedeiro, o polipeptídeo é capaz de suscitar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular direcionada contra a proteína. De preferência, o fragmento da proteína é tal que este possui substancialmente a mesma atividade biológica que a proteína completa. Assim, um fragmento proteico de acordo com a invenção compreende ou consiste essencialmente em ou consiste em pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. Uma proteína ou polipeptídeo imunogênico, neste relatório descritivo, inclui a sequência completa da proteína, análogos da mesma ou fragmentos imunogênicos da mesma. Por fragmento imunogênico, entende-se um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epítopos e, assim, suscita a resposta imunológica descrita acima.
[0040] O termo proteína ou peptídeo imunogênico contempla ainda deleções, adições e substituições à sequência, desde que o polipeptídeo atue produzindo uma resposta imunológica como
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21/90 definida acima. O termo variação conservadora indica a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico de tal modo que o resíduo de aminoácido codificado não mude ou constitua outro resíduo biologicamente semelhante. A este respeito, substituições especialmente preferidas serão em geral conservadoras por natureza, ou seja, aquelas substituições que acontecem dentro de uma família de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos: aspartato e glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) não polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares sem carga: glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são às vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Os exemplos de variações conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico, ou glutamina por asparagina, e as semelhantes; ou uma substituição conservadora semelhante de um aminoácido por um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito importante sobre a atividade biológica. Proteínas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que a molécula de referência, mas possuindo substituições mínimas de aminoácidos que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, portanto, dentro da definição do polipeptídeo de referência. Todos os
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22/90 polipeptideos produzidos por essas modificações estão aqui incluídos. O termo variação conservadora também inclui o uso de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido original não substituído, desde que os anticorpos desenvolvidos contra o polipeptídeo substituído também reajam imunologicamente com o polipeptídeo não substituído.
[0041] O termo epítopo refere-se ao sítio em um antígeno ou haptenos ao qual respondam células B e/ou células T específicas. O termo é também usado alternadamente com determinante antigênico ou sítio determinante antigênico. Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples, que mostre a capacidade de um anticorpo para bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo. Um epítopo pode ser linear ou conformacional. Um epítopo conformacional é composto por seções descontínuas da sequência de aminoácidos do antígeno.
[0042] Uma resposta imunológica a uma composição ou vacina é a resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos, suscitada por e a uma composição ou vacina de interesse. Normalmente, uma resposta imunológica inclui, entre outros, um ou mais dos efeitos seguintes: a produção de anticorpos, células B, células T helper, e/ou células T citotóxicas, direcionadas especificamente contra um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protetora, de modo que a resistência à nova infecção será intensificada e/ou será reduzida a gravidade clínica da doença. Tal proteção será demonstrada quer por uma redução ou falta de sintomas normalmente
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23/90 exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo mais rápido até a recuperação e/ou uma titulação viral diminuída no hospedeiro infectado.
[0043] 0 termo patógeno aviário, neste relatório descritivo, refere-se a um agente infeccioso que é patogênico em aves, incluindo bactérias, vírus, leveduras, nematódeos, fungos etc. No presente contexto, são especialmente preferidos vírus de aves e bactérias de aves, sendo mais preferidos os vírus aviários. Os vírus aviários de interesse particular são o vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), o vírus da doença de Newcastle (NDV), o vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), o vírus da gripe aviária (AIV) e o vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
[0044] Neste relatório descritivo, um sítio de inserção refere-se a uma região em um genoma viral na qual um polinucleotídeo heterólogo é inserido e que é uma região não essencial. Os sítios de inserção da presente invenção podem ser uma região intergênica ou locus intergênico, especialmente o locus intergênico entre UL3 e UL4 e/ou o locus intergênico entre UL21 e UL22 na região longa única (UL) do genoma, de preferência o locus intergênico entre UL3 e UL4. A inserção de um ou mais polinucleotideos heterólogos em uma dessas regiões possibilita a produção de um vetor viral recombinante que pode, então, ser introduzido em uma galinha ou outra ave para proteção contra uma ou mais doenças. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um antígeno de um patógeno aviário, como aqui descrito, pode ser inserido em um sítio de inserção, como aqui revelado, além de em um ou mais sítios de
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24/90 inserção conhecidos na técnica. Um sitio de inserção adequado deve permitir a inserção de um polinucleotideo sem afetar a replicação e crescimento do vírus. 0 técnico no assunto entenderá que, no contexto of uma vacina, um sítio de inserção adequado deve também permitir que o polinucleotideo inserido induza uma resposta imune adequada e proteção contra o respectivo patógeno aviário.
[0045] O termo região não essencial refere-se a uma região do genoma de um vírus que não é essencial para replicação e propagação do vírus em cultura de tecido do hospedeiro. Teoricamente, qualquer região não essencial ou porção da mesma pode ser deletada do genoma da cepa SB-1 ou HPRS24 do herpesvirus galináceo 3, ou uma sequência exógena pode ser inserida nela, e a viabilidade e estabilidade do vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante resultante da delação ou inserção pode ser utilizada para averiguar se uma região deletada ou porção da mesma é, de fato, não essencial.
[0046] O termo locus intergênico, neste relatório descritivo, refere à região entre dois genes e, no contexto da presente invenção, ao locus entre dois genes da região longa única (UL) de um vetor do herpesvirus galináceo 3 (GaHV3, MDV2) . A inserção no locus intergênico em uma localização específica significa que o transgene ou polinucleotideo heterólogo está inserido entre dois genes, mais especificamente entre dois genes da região UL, sem substituir ou deletar um gene. Por exemplo, o locus intergênico de UL3/UL4 e UL21/UL22 possui uma sequência como fornecida em SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente.
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[0047] Neste relatório descritivo, o termo cassete de expressão refere-se à parte de um vetor que compreende todos os elementos necessários para a expressão de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Contém um ou mais genes que codificam uma proteína e sequências que controlam a expressão, ou seja, elementos reguladores. Assim, compreende um promotor operacionalmente ligado a uma fase de leitura aberta (ORF) e uma região 3' não traduzida contendo uma região de terminação da transcrição. Elementos adicionais constituem, por exemplo, um intensificador (enhancer) . O cassete de expressão pode ser parte de um vetor, tipicamente um vetor de expressão, incluindo um plasmídeo ou um vetor viral. O cassete de expressão pode também ser integrado em um cromossomo por integração aleatória ou direcionada, tal como por recombinação homóloga ou por integração viral. Um cassete de expressão é preparado por meio
de técnicas de clonagem natural. e não se refere, portanto, a uma
estrutura gênica
[0048] Neste relatório descritivo, o termo promotor refere-
se a uma região de DNA que inicia a transcri ção de um gene ou
fase de leitura aberta em particular. Os promotores estão
localizados na região 5' , próximos ao sítio de início da transcrição de genes na mesma fita. Tipicamente, um promotor tem cerca de 100 a 1000 pares de bases de comprimento. Os promotores adequados para o uso em vetores são bem conhecidos na técnica, como um promotor bacteriano, um promotor viral ou semelhantes. Por exemplo, os promotores úteis de acordo com a presente invenção podem incluir, entre outros, um promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV), promotor do CMV de cobaias, promotor do CMV de murinos, promotor do SV40, promotores do vírus
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26/90 da pseudoraiva do promotor da glicoproteina X, promotor alfa 4 do virus do herpes simples 1, promotor da beta-actina de galinha, promotor da beta-actina de coelho, promotor da timidina quinase do virus do herpes simples, promotores de glicoproteinas do virus da doença de Marek, incluindo qualquer isolado ou cepa do MDV, como MDV-1, MDV-2 e HVT, por exemplo, um promotor que controle a expressão de glicoproteinas como gC, gB, gE ou gl, promotores do vírus da laringotraqueíte infecciosa como aqueles de genes das glicoproteinas gB, gE, gl, gD ou quaisquer outros promotores adequados.
[0049] A região da terminação da transcrição permite a terminação eficiente da transcrição. A região da terminação pode ser do mesmo gene que a sequência do promotor, ou pode ser de um gene diferente. Pode ser ainda do mesmo gene que a ORE, ou pode ser de um gene diferente.
[0050] Os termos idêntico ou percentual de identidade, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polinucleotídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou com uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (ou seja, cerca de 60% de identidade, de preferência 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade ao longo de uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada), conforme medida por meio de algoritmos de comparação de sequência, como BLAST ou BLAST 2.0, com os parâmetros padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, p. ex., o site da
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NCBI encontrado no endereço https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou semelhantes). É então feita referência a tais sequências como substancialmente idênticas. Essa definição também se refere, ou se aplica ao comprimento de uma determinada sequência. A definição pode também incluir sequências com deleções, adições e/ou substituições.
[0051] Para comparação entre sequências, uma sequência serve tipicamente como uma sequência de referência, à qual outras sequências são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de referência e comparação podem ser inseridas em um computador, e parâmetros do algoritmo do programa para as sequências são selecionados como desejado. O percentual de identidade das sequências é então gerado para as sequências de comparação em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros selecionados. Um exemplo de algoritmo que pode ser adequado para determinar o percentual de identidade de sequência e de similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul et al., (Nuc Acids Res 25:3389-3402, 1977) e Altschul et al., (J Mol Biol 215:403-410, 1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para determinar o percentual de identidade de sequências para quaisquer ácidos nucleicos ou proteínas, tais como aqueles aqui descritos. Quando se diz que as sequências de RNA são semelhantes, ou que têm um grau de identidade ou homologia de sequência com sequências de DNA, timidina (T) na sequência do DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Assim, sequências de RNA são abrangidas pela invenção e podem ser derivadas de sequências de
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DNA, pelo fato de timidina (T) na sequência de DNA ser considerada igual à uracila (U) em sequências de RNA.
[0052] Neste relatório descritivo, uma vacina ou uma composição imunogênica deve abranger uma composição adequada para administração a um indivíduo, tal como uma ave. Em geral, uma vacina é estéril e, de preferência, livre de contaminantes que sejam capazes de provocar uma resposta indesejável no indivíduo (p. ex., o(s) composto(s) na vacina é/são de grau farmacêutico) e contém um antígeno. No presente contexto, a vacina contém pelo menos o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção como antígeno e possivelmente um vetor adicional do vírus da doença de Marek, conforme aqui descrito. As vacinas podem projetadas para administração a indivíduo com necessidade da mesma através de diversas vias de administração diferentes, incluindo ín ovo, oral, intravenosa, bucal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, intraqueal, intramuscular, subcutânea, por inalação e as semelhantes. De preferência, a vacina é administrada ín ovo, por via intramuscular ou subcutânea. O termo vacinar, neste relatório descritivo, significa conferir uma resposta imune protetora e, consequentemente, proteger contra uma doença causada por um patógeno aviário.
[0053] Os termos vacina polivalente, vacina combinada ou combo e vacina multivalente são usados alternadamente para se referir a uma vacina contendo mais de um antígeno. A vacina polivalente pode conter dois, três, quatro ou mais antígenos. A vacina polivalente pode compreender vetores virais recombinantes, vírus ativos ou atenuados ou mortos do tipo
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29/90 selvagem ou uma mistura de vetores virais recombinantes e vírus do tipo selvagem em forma ativa ou atenuada ou morta.
[0054] O termo vírus da doença de Marek ou MDV, neste relatório descritivo, refere-se a qualquer alfa herpesvirus do gênero Mardívírus, incluindo o herpesvirus de perus (HVT) , o sorotipo 1 do vírus da doença de Marek (MDV-1) e herpesvirus galináceo 3. Tipicamente, um MDV usado como vacina é a cepa SB1 do herpesvirus galináceo 3, a cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e a cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT). Neste relatório descritivo, tal vírus pode incluir os componentes genéticos do vírus, ou seja, o genoma e transcritos do mesmo, proteínas codificadas pelo genoma (incluindo proteínas estruturais e não estruturais) e partículas virais funcionais ou não funcionais. O polinucleotídeo e as sequências polinucleotídicas que codificam tais vírus são bem conhecidos na técnica e seriam facilmente encontrados pelo técnico no assunto. MDV inclui vírus do tipo selvagem, vírus do tipo selvagem atenuado naturalmente e MDV recombinante. Um MDV recombinante pode compreender um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário.
[0055] O termo DNA isolado, neste relatório descritivo, significa um DNA que foi separado substancialmente de, ou enriquecido em relação a, outras substâncias com as quais ocorre na natureza. O DNA isolado é normalmente pelo menos 80%, pelo menos 90% puro, pelo menos 98% puro ou pelo menos aproximadamente 99% puro, em peso, e somente contém quantidades mínimas de DNA ou proteína contaminante.
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[0056] O termo cromossomo artificial bacteriano, abreviado como BAC neste relatório descritivo, refere-se a uma construção de DNA com base no plasmídeo F que compreende uma inserção de cerca de 150 a 350 kbp e usada para transformação e clonagem em bactérias como Escherichia coli. Os vetores BAC podem abrigar sequências grandes de DNA, como genomas de vírus DNA ou sequências que codificam genomas de vírus RNA. Isso permite a modificação eficiente de genomas virais utilizando técnicas bem estabelecidas de mutagênese em E. coli, tais como CRISPR/Cas9, nucleases efetoras semelhantes aos ativadores da transcrição (TALENs) ou nucleases dedo de zinco (ZFNs) . É abrangido também um vetor de clonagem baseado no plasmídeo bacteriano Pl e referido freguentemente como cromossomo artificial derivado de Pl (PAC) .
[0057] Neste relatório descritivo, um veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante farmaceuticamente aceitável ou adjuvante refere-se a um agente que modifica o efeito de outros agentes e que é útil na preparação de uma vacina, em geral seguro, não tóxico nem biologicamente ou de outro modo indesejável. Tal agente pode ser adicionado a uma vacina para modificar a resposta imune de um indivíduo ao reforçar a resposta de modo que seja fornecida uma quantidade maior de anticorpos e proteção mais duradoura. Tal agente pode incluir um excipiente, diluente, veículo ou adjuvante que seja aceitável para uso veterinário ou farmacêutico. Tal agente pode ser não natural ou pode ser natural, mas não encontrado naturalmente em combinação com outros agentes na composição imunogênica.
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[0058] Neste relatório descritivo, um anticorpo refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região framework (arcabouço) de um gene de imunoglobulinas, ou fragmentos do mesmo que se liga especificamente e reconhece um antígeno. Os genes reconhecidos de imunoglobulinas podem incluir os genes das regiões constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como os genes de regiões variáveis de uma miriade de imunoglobulinas. As cadeias leves podem ser classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas podem ser classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, as quais, por sua vez, definem as classes das imunoglobulinas, IgY, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2)
[0059] A presente invenção provê um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2), de preferência um vetor da cepa SB1 de herpesvirus galináceo 3 recombinante (GaHV3; MDV-2), compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3. De preferência, o vetor compreende um ou mais polinucleotideos heterólogos inseridos no locus intergênico UL3/UL4 do vetor do herpesvirus galináceo 3. O polinucleotideo heterólogo pode ser incorporado em qualquer lugar dentro dos locl intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22. O locus intergênico UL3/UL4 da cepa SB-1 (HQ840738.1) possui a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 e o locus intergênico de UL21/UL22 da cepa SB-1 possui a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 2. As sequências nucleotídicas dos locl intergênicos UL3/UL4
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32/90 e UL21/UL22 são iguais para a cepa HPRS24 (NC_002577.1). 0 polinucleotídeo heterólogo pode ser incorporado em qualquer lugar dentro das sequências de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, de preferência entre os nucleotídeos 10 a 90 da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, mais preferivelmente entre os nucleotídeos 20 a 80 da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente entre os nucleotídeos 30 a 70 da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.
[0060] Os patógenos aviários podem ser do vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da doença infecciosa da bursa (ou seja, IBDV ou vírus da doença de Gumboro) , vírus da doença de Marek (MDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV), vírus da encefalomielite aviária e de outros picornavírus, do reovírus aviário, paramixovírus aviário, metapneumovírus aviário, vírus da gripe aviária, adenovirus aviário, vírus da varíola aviária, coronavirus aviário, rotavirus aviário, parvovirus aviário, astrovírus aviário e vírus da anemia das galinhas, Eimeria sp. (coccidiose), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avlbacterlum sp., E. coll ou Clostridium sp. De preferência, o antígeno de um patógeno aviário é um antígeno de um vírus aviário. Mais preferivelmente, o vetor recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam genes de vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou semelhantes.
[0061] Um antígeno especialmente adequado de um patógeno aviário de acordo com a invenção é um antígeno de um vírus
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33/90 aviário como vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV). Antígenos exemplares são VP2, VP3, VP4 e VPX de IBDV; glicoproteína B, glicoproteína I, glicoproteína D, glicoproteína E e glicoproteína C de IBDV, de preferência glicoproteína B, glicoproteína I ou glicoproteína E; proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle (NDV-F) e hemaglutinina e neuraminidase viral (NDV-NH) de NDV; as proteínas hemaglutinina (HA) ou neuraminidase (NA) do vírus da gripe aviária, de preferência do vírus da gripe aviária tipo A, mais preferivelmente hemaglutinina do sorotipo H5 (H5 HA) do vírus Influenza A aviário, hemaglutinina do sorotipo H7 (H7 HA) do vírus Influenza A aviário, hemaglutinina do sorotipo H9 (H9 HA) do vírus Influenza A aviário ou neuraminidase do sorotipo H5N1 (H5N1 NA) do vírus Influenza A aviário; e a proteína SI ou S2 de IBV. A proteína SI e S2 são glicoproteínas que são produtos da divagem da glicoproteína Spike (glicoproteína S) . São especialmente preferidos os antígenos de IBDV, sendo mais preferido o antígeno VP2 de IBDV. Pelo menos um antígeno de um patógeno aviário pode também ser combinações de dois ou mais dos antígenos listados acima.
[0062] Em certas modalidades, um vetor viral recombinante da invenção pode conter um polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do IBDV, como uma proteína VP2 ou produto gênico do IBDV. Em outra modalidade, tal vetor viral recombinante pode conter um polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), como gB ou gC ou gD ou gE ou gl, proteína UL
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34/90 ou produto gênico do ILTV. Em outra modalidade, tal vetor viral recombinante pode conter um polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do NDV, como uma proteína F ou HN ou produto gênico do NDV. Em outra modalidade, tal vetor viral recombinante pode conter polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do vírus da gripe aviária (AIV), como uma proteína HA ou NA ou produto gênico do AIV. Em outra modalidade, tal vetor viral recombinante pode conter polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do vírus da bronquite infecciosa (IBV), como proteína SI ou S2 ou produto gênico do IBV. Um polinucleotídeo pode ter mais de um gene, incluindo uma proteína de fusão-gene ou produto gênico, como uma proteína de fusão F-HN do NDV, quimera ou produto gênico. Em algumas modalidades, a sequência de codificação completa de tal gene pode ser utilizada de modo que seja produzida uma proteína ou polipeptídeo completo ou totalmente funcional. Alternativamente, uma porção ou fragmento de uma proteína ou polipeptídeo viral pode ser suficiente para fornecer proteção contra um ou mais vírus em particular.
[0063] Em uma modalidade preferida, o vetor viral recombinante da invenção contém um polinucleotídeo que codifica uma proteína viral ou produto gênico do IBDV, como uma proteína VP2 ou produto gênico do IBDV. Em uma modalidade, o polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa VP2 de IBDV exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% similaridade de sequência com um polinucleotídeo tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 10, de preferência, tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polinucleotídeo tendo a sequência
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35/90 apresentada em SEQ ID NO: 6 e mais preferivelmente exibe uma sequência de SEQ ID NO: 10. Em outra modalidade, o antígeno de um patógeno aviário é VP2, exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12, de preferência, tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12, mais preferivelmente, tem uma sequência proteica de SEQ ID NO: 12. O antígeno pode também ser um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 12. Além do mais, o fragmento imunogênico ou a proteína completa de VP2 do IBDV pode ser fundido a um fragmento imunogênico ou outra proteína completa de outro antígeno de um patógeno aviário.
[0064] Em outra modalidade, o antígeno de um patógeno aviário é glicoproteína E (gE), glicoproteína I (gl) ou glicoproteína B (gB) do vírus da laringotraqueíte infecciosa (herpesvirus galináceo 1), exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 (gE), SEQ ID NO: 32 (gl) ou SEQ ID NO: 33 (gB), respectivamente, de preferência, exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 (gE), SEQ ID NO: 32 (gl) ou SEQ ID NO: 33 (gB), respectivamente, mais preferivelmente possui uma sequência proteica de SEQ ID NO: 31 (gE), SEQ ID NO: 32 (gl) ou SEQ ID NO: 33 (gB), respectivamente. O antígeno pode também ser
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36/90 um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 31 (gE), SEQ ID NO: 32 (gl) ou SEQ ID NO: 33 (gB) , respectivamente. Além do mais, o fragmento imunogênico ou a proteína completa de gE, gl ou gB do ILTV pode ser fundido a um fragmento imunogênico ou à proteína completa de outro antígeno de um patógeno aviário.
[0065] Em outra modalidade, o antígeno de um patógeno aviário é uma proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle (NDV-F) ou hemaglutinina e neuraminidase do vírus da doença de Newcastle (NDV-NH), exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (NDV-F) ou SEQ ID NO: 35 (NDV-NH), respectivamente, de preferência, exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (NDV-F) ou SEQ ID NO: 35 (NDV-NH), respectivamente, mais preferivelmente possui uma sequência proteica de SEQ ID NO: 34 (NDV-F) ou SEQ ID NO: 35 (NDV-NH), respectivamente. O antígeno pode também ser um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 34 (NDV-F) ou SEQ ID NO: 35 (NDV-NH), respectivamente. Além do mais, o fragmento imunogênico ou a proteína completa de NDVF ou NDV-NH pode ser fundido a um fragmento imunogênico ou à proteína completa de outro antígeno de um patógeno aviário.
[0066] Em outra modalidade, o antígeno de um patógeno aviário é hemaglutinina do sorotipo H5 (H5 HA) do virus Influenza A aviário, hemaglutinina do sorotipo H7 (H7 HA) do virus Influenza
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A aviário, hemaglutinina do sorotipo H9 (H9 HA) do virus Influenza A aviário ou neuraminidase do sorotipo H5N1 (H5N1 NA) do virus Influenza A aviário, exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36 (H5 HA), SEQ ID NO: 37 (H7 HA), SEQ ID NO: 38 (H9 HA) ou SEQ ID NO: 39 (H5N1 NA), respectivamente, de preferência exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36 (H5 HA), SEQ ID NO: 37 (H7 HA), SEQ ID NO: 38 (H9 HA) ou SEQ ID NO: 39 (H5N1 NA) , respectivamente, mais preferivelmente possui uma sequência proteica de SEQ ID NO: 36 (H5 HA), SEQ ID NO: 37 (H7 HA), SEQ ID NO: 38 (H9 HA) ou SEQ ID NO: 39 (H5N1 NA), respectivamente. O antígeno pode também ser um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 36 (H5 HA), SEQ ID NO: 37 (H7 HA), SEQ ID NO: 38 (H9 HA) ou SEQ ID NO: 39 (H5N1 NA), respectivamente. Além do mais, o fragmento imunogênico ou a proteína completa H5 HA, H7 HA, H9 HA ou H5N1 NA pode ser fundido a um fragmento imunogênico ou à proteína completa de outro antígeno de um patógeno aviário.
[0067] Em ainda outra modalidade, o antígeno de um patógeno aviário é a glicoproteína SI ou S2 do IBV, exibindo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada nos aminoácidos 25 a 530 de SEQ ID NO: 40 (Sl) ou nos aminoácidos 553 a 1146 de SEQ ID NO: 40 (S2) , respectivamente, de preferência exibindo pelo menos 70%, 75%,
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80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada nos aminoácidos 25 a 530 de SEQ ID NO: 40 (Sl) ou nos aminoácidos 553 a 1146 de SEQ ID NO: 40 (S2) , respectivamente, mais preferivelmente possui uma sequência proteica dos aminoácidos 25 a 530 de SEQ ID NO: 40 (Sl) ou dos aminoácidos 553 a 1146 de SEQ ID NO: 40 (S2), respectivamente. O antígeno pode também ser um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos dos aminoácidos 25 a 530 de SEQ ID NO: 40 (Sl) ou dos aminoácidos 553 a 1146 de SEQ ID NO: 40 (S2), respectivamente. Além do mais, o fragmento imunogênico ou a proteína completa da proteína Sl ou S2 pode ser fundido a um fragmento imunogênico ou à proteína completa de outro antígeno de um patógeno aviário.
[0068] Os antígenos adequados na presente invenção podem também ser uma variante alélica de qualquer um dos antígenos de um patógeno aviário aqui revelado. O termo variante alélica refere-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo contendo polimorfismos que levam a mudanças nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (p. ex., uma espécie ou variedade de vírus) . Tais variações alélicas naturais podem resultar tipicamente em 1-5% de variância em um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. As variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em várias espécies diferentes, o que pode ser realizado rapidamente utilizando sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético do gene naquelas espécies. Toda e qualquer uma de tais variações do ácido
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39/90 nucleico e os resultantes polimorfismos ou variações de aminoácidos que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse destinam-se a ser abrangidos pelo âmbito da invenção.
[0069] Os polinucleotídeos utilizados na presente invenção podem ter os códons otimizados para um hospedeiro específico. Otimização de códons, neste relatório descritivo, refere-se a um polinucleotídeo que é produzido por engenharia genética para aumentar sua expressão em uma dada espécie. Para obter polinucleotídeos otimizados que codificam polipeptídeos VP2 de IBDV, a sequência de DNA do gene da proteína VP2 pode ser modificada para (1) compreender códons preferidos por genes altamente expressos em uma espécie em particular; (2) compreender um conteúdo de A+T ou G+C em uma composição de bases de nucleotídeos que é substancialmente encontrado na dita espécie; (3) formar uma sequência de início da dita espécie; ou (4) eliminar sequências que causam desestabilização, poliadenilação inadequada, degradação e terminação do RNA ou que formam estruturas hairpins (grampos de cabelo) secundárias ou sítios de splicing no RNA. A expressão aumentada da proteína VP2 na dita espécie pode ser alcançada utilizando a frequência de distribuição dos códons utilizados em eucariotos e procariotos, ou em uma determina espécie.
[0070] Os antígenos virais codificados e expressos pelo vetor viral recombinante da presente invenção podem ser codificados por um gene viral. No entanto, o técnico no assunto reconhecerá que, a este respeito, pode não ser necessário incorporar a totalidade de um determinado gene viral para que seja obtida uma
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40/90 resposta imune desejada. Em vez disso, uma parte de tal gene pode ser suficiente. A otimização de uma proteína viral desejada ou de um polinucleotídeo que codifica tal proteína, independentemente da extensão da proteína, pode ser rapidamente realizada utilizando métodos conhecidos na técnica. 0 técnico no assunto reconhecerá ainda que podem ser feitas modificações a um gene ou genes virais, ou às proteínas codificadas pelos mesmos, para aumentar a imunogenicidade da proteína viral quando introduzida no indivíduo.
[0071] Além disso, o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante pode compreender mais de um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa pelo menos um antígeno de um patógeno aviário. Em uma modalidade, o vetor da invenção compreende dois ou três polinucleotídeos heterólogos, preferivelmente dois. De preferência, pelo menos um dos polinucleotídeos heterólogos codifica e expressa VP2 de IBDV como descrito acima.
[0072] Assim, em algumas modalidades, o vetor viral recombinante pode expressar uma proteína heteróloga de uma única espécie viral ou pode expressar mais de uma proteína heteróloga de uma única espécie viral diferente do herpesvirus galináceo 3 a fim de ser obtida proteção contra MDV e uma doença adicional causada por um vírus aviário. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê um vetor viral recombinante compreendendo o genoma de GalHV3 e um polinucleotídeo que codifica e expressa um antígeno de um patógeno diferente, conferindo, assim, proteção em uma espécie aviária, tal como aves, contra a doença de Marek e pelo menos outra doença causada por um patógeno aviário
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41/90 diferente. Especificamente, a invenção provê um vetor viral recombinante compreendendo o genoma de GalHV3 e um polinucleotídeo que codifica e expressa um antígeno de um vírus diferente, proporcionando, assim, proteção em uma espécie aviária, tal como aves, contra a doença de Marek e pelo menos uma doença causada por um patógeno viral aviário diferente. Por exemplo, o vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode proporcionar proteção em espécies aviárias, tal como aves, contra MDV e IBDV, ou pode proporcionar proteção contra MDV e ILTV, ou pode proporcionar proteção contra MDV e NDV, ou pode proporcionar proteção contra MDV e AIV, ou pode proporcionar proteção contra MDV e IBV. De preferência, o vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode proporcionar proteção em espécies aviárias, tal como aves, contra MDV e IBDV.
[0073] Em outras modalidades, o vetor viral recombinante pode expressar proteínas heterólogas de mais de uma espécie viral para que seja obtida proteção contra múltiplos vírus além do MDV. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê um vetor viral recombinante compreendendo o genoma de GalHV3 e pelo menos dois polinucleotídeos que codificam e que expressam um antígeno de dois patógenos diferentes, proporcionando, assim, proteção em uma espécie aviária, tal como aves, contra a doença de Marek e pelo menos duas outras doenças causadas por patógenos aviários. Especificamente, a invenção provê um vetor viral recombinante compreendendo o genoma de GaHV3 e pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam antígenos de dois vírus diferentes, proporcionando, assim, proteção em espécies aviárias, tal como aves, contra a doença de Marek e pelo menos duas outras doenças causadas por patógeno
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42/90 viral aviário. Por exemplo, o vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode proporcionar proteção em espécies aviárias, tal como aves, conta MDV, IBDV e uma das doenças selecionadas causadas por NDV, AIV e IBV; ou contra MDV, NDV e uma das doenças selecionadas causadas por IBDV, AIV e IBV; ou contra MDV, AIV e uma das doenças selecionadas causadas por IBDV, NDV e IBV; ou contra MDV, IBV e uma das doenças selecionadas causadas por IBDV, NDV e AIV. De preferência, o vetor viral recombinante de acordo com a invenção pode proporcionar proteção em espécies aviárias, tal como aves, contra MDV, IBDV e uma das doenças selecionadas causadas por NDV, AIV e IBV.
[0074] Caso o vetor viral recombinante compreenda mais de um polinucleotideo heterólogo, os polinucleotídeos podem ser inseridos no mesmo sítio de inserção ou em diferentes sítios de inserção. De preferência, pelo menos um dos polinucleotídeos heterólogos é inserido no locus intergênico de UL3/UL4. Além disso, mais de um polinucleotideo heterólogo pode codificar e ser expresso pelo mesmo cassete de expressão utilizando um promotor ou por cassetes de expressão separados.
[0075] Assim, de acordo com a invenção, o vetor viral recombinante pode compreender um ou mais transgenes operativamente ligados a um ou mais promotores para expressão de uma ou mais proteínas ou peptídeos virais ou fragmentos ou porções dos mesmos. Em algumas modalidades, um único transgene pode estar operacionalmente ligado a um único promotor, ou mais de um transgene pode estar operativamente ligado a um único promotor. Em outras modalidades, mais de um transgene pode estar presente em um vetor recombinante, em que um primeiro transgene
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43/90 está operativamente ligado a um primeiro promotor e um segundo transgene está operativamente ligado a um segundo promotor.
[0076] A expressão bem-sucedida da sequência genética inserida de cDNA pelo vírus infeccioso modificado requer duas condições. Primeiramente, a inserção deve ser em uma região não essencial do genoma do vírus para que o vírus modificado permaneça viável (replicação e amplificação intactas), p. ex., pela inserção nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22. A segunda condição para expressão do cDNA inserido é a presença de sequências reguladoras que permitem a expressão do gene no background viral (por exemplo: promotor, intensificador, doador e aceitador de sítios de splicing e introns, sequência consenso de Kozak para tradução, sinais de poliadenilação, elementos não traduzidos da sequência).
[0077] Em geral, é vantajoso empregar um promotor funcional forte em células eucarióticas. Os promotores incluem, entre outros, promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV), promotor do CMV de cobaias, promotor do CMV de murinos, promotor do SV40, promotores do vírus da pseudoraiva tais como o promotor da glicoproteína X, do vírus do herpes simples 1 como o promotor alfa 4, promotor da beta-actina de galinha, promotor da betaactina de coelho, promotor da timidina quinase do vírus do herpes simples, promotores dos vírus da doença de Marek (incluindo MDV-
1, MDV-2 e HVT) i como aqueles que direcionam a expressão de
glicoproteínas gC, gB, gE ou gl , promotores do vírus da
laringotraque!te infecciosa como aqueles dos genes das
glicoproteínas gB, gE, gl, gD ou outros promotores de
herpesvírus. Quando o locus de inserção consiste em um gene de
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SB-1 (por exemplo, genes gC, gD, US2 ou US 10), o gene exógeno pode ser inserido no vetor sem qualquer sequência adicional de promotor, pois o promotor do gene deletado do vetor direcionará a transcrição do gene exógeno inserido.
Vetor intermediário de herpesvirus galináceo 3 (GaHVS; MDV-2) compreendendo um ou mais marcadores
[0078] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um produto intermediário usado para a produção do herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção. Esse vetor intermediário do herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais marcadores inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3. De preferência, um ou mais marcadores são inseridos no locus intergênico de UL3/UL4.
[0079] O marcador pode ser um gene marcador de seleção, um gene repórter ou um código de barra de DNA. Os marcadores de seleção podem codificar, por exemplo, resistência a biocidas ou resistência a antibióticos (p. ex., canamicina, G418, bleomicina, higromicina, etc.) . Um marcador selecionável preferido é o gene K de galactoquinase do E.coli (galK) , que confere sensibilidade a 2-desoxi-galactose (2-DOG), mas permite a sobrevida e crescimento em meio com galactose como a única fonte de carbono. Outro marcador selecionável preferido é kan/sacB, um cassete de expressão contendo o gene de neomicina (canamicina) de Tn5 e o gene sacB de Bacillus subtilis.
Marcadores selecionáveis são bem conhecidos pelo técnico no assunto e podem incluir quaisquer marcadores adequados para uso
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45/90 de acordo com a invenção. Genes repórteres podem ser utilizados para monitorar a expressão, mas normalmente não resultam na de uma célula. Os genes repórteres adequados incluem, por exemplo, um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS), genes de uma ou mais das várias proteínas fluorescentes, como proteína verde fluorescente (GFP), proteína vermelha fluorescente (RFP), ou qualquer uma de uma grande família de proteínas com fluorescência em comprimentos de onda característicos, um gene de β-lactamase, um gene que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos, um gene de luciferase, um gene xylE, o qual codifica uma catecol dioxigenase que converte catecóis cromogênicos, um gene de oc-amilase, um gene de tirosinase, o qual codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, as quais, por sua vez, condensam formando melanina, ou uma a-galactosidase, que catalisa um substrato a-galactose cromogênico. Um código de barra de DNA não possui uma função específica além de ter uma sequência detectável e única. De preferência, o marcador é um gene marcador de seleção ou um gene repórter. Mais preferivelmente, o vetor intermediário do herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais cassetes de expressão compreendendo um gene marcador de seleção e/ou um gene repórter. Em uma modalidade preferida, o gene marcador de seleção ou gene repórter é galK ou uma combinação de kan/sacB. O marcador pode servir como um guardador de lugar nos loci intergênicos de UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 para pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, uma vez que é facilmente substituído por pelo menos um antígeno de um patógeno aviário como descrito abaixo.
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Métodos para produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2)
[0080] A presente invenção provê ainda um método par produzir um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, o qual compreende a introdução de um, dois ou mais polinucleotídeos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 é de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3.
[0081] Em uma modalidade, o método de produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) inserir um ou mais polinucleotídeos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3 e, opcionalmente, (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) .
[0082] Em outra modalidade, o método de produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais marcadores nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) substituir um ou mais marcadores por um cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário e (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um
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47/90 antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) . O herpesvirus galináceo 3 recombinante pode ser codificado e expresso por um cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou um cromossomo artificial derivado de Pl (PAC), de preferência um BAC. Assim, a etapa (a) pode compreender prover um cromossomo artificial bacteriano ou um cromossomo artificial derivado de PI compreendendo um polinucleotideo que codifica o vetor do herpesvirus galináceo 3 (recombinante). O técnico no assunto entendería que a vantagem de se usar BAC ou PAC como vetor para o herpesvirus galináceo 3 é que a inserção de um ou mais polinucleotideos heterólogos e a amplificação podem ser realizadas em E.colí. Isso também inclui uma etapa de rastreamento pelo vetor viral desejado. O método pode, portanto, compreender ainda as etapas de (d) isolar o BAC ou PAC compreendendo um polinucleotideo codificador do vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) e (e) transfectar fibroblastos de embriões de galinhas com o BAC ou PAC da etapa (d) .
[0083] Como indicado acima, o termo amplificar o vetor de herpesvirus galináceo 3 está relacionado à amplificação em E.colí ou em células hospedeiro de aves, como fibroblastos de embriões de galinhas, dependendo do vetor de herpesvirus galináceo 3 usado. Em E.colí, isso envolve cultivar E.colí transfectado com o plasmídeo (BAC ou PAC) que codifica o vetor viral desejado, sob condições adequadas, e isolar o DNA plasmidial. Nas células aviárias, as células contendo o vetor viral desejado são cultivadas e o sobrenadante ou as células
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48/90 inteiras contendo o vetor viral desejado são coletados. Para propagação do vírus, o vetor viral desejado colhido pode ser utilizado diretamente para transduzir células hospedeiras de aves ou pode ser congelado e armazenado antes do uso futuro.
[0084] O termo substituir um ou mais marcadores, neste relatório descritivo, significa inserir um cassete de expressão no lugar de um ou mais marcadores por quaisquer métodos conhecidos pelo técnico no assunto para integração direcionada. Por exemplo, o cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos, que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, podem ser inseridos por recombinação homóloga. Alternativamente um ou mais marcadores, de preferência um cassete de expressão que codifica um ou mais marcadores, pode ser flanqueado por sítios de reconhecimento (p. ex., sítios loxP ou FRT) por uma recombinase específica do sítio (p. ex., recombinase Cre ou Flp) e um ou mais marcadores são então substituídos por um cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, em que o cassete de expressão é também flanqueado por sítios de reconhecimento pela mesma recombinase sítio-específica utilizando a tecnologia de recombinação mediada por Cre-loxP ou recombinação mediada por Flp-FRT.
[0085] Um vetor viral de herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) recombinante pode ser construído como descrito em WO 2013/057235 e WO 2017/027324 em duas etapas. Primeiramente, as regiões genômicas do herpesvirus galináceo-3 (MDV-2) flanqueando o locus de inserção são clonadas em uma construção do plasmídeo de
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E.coli; sitio (s) de restrição único (s) é (são) posicionado (s) entre as duas regiões flanqueadoras (plasmídeo de inserção) a fim de permitir a inserção do DNA doador do cassete de expressão. Separadamente, a sequência gênica de cDNA ou DNA a ser inserida é precedida por uma região promotora (região de início do gene) e uma sequência terminadora (ou de poliadenilação, poli-A) que é específica para o vetor do herpesvirus galináceo-3 (MDV-2) e/ou células eucarióticas, como células de mamíferos. O cassete de expressão inteiro (promotor-transgene-poli-A) é então clonado no(s) sítio(s) de restrição único(s) do plasmídeo de inserção para construir o plasmídeo doador que contém o cassete de expressão flanqueado pelos braços do herpesvirus galináceo-3 (MDV-2) nos dois lados do locus de inserção. A construção resultante do plasmídeo doador é, a seguir, amplificada em E.coli e o DNA do plasmídeo é extraído. O plasmídeo é então linearizado utilizando uma enzima de restrição que corta a cadeia principal (backbone) do plasmídeo (fora dos braços do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) e do cassete de expressão). Depois, fibroblastos de embriões de galinhas são cotransfectados com o DNA original do herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) e o DNA linearizado do plasmídeo doador. A população dos vírus resultantes é então clonada por múltiplas etapas de diluição limitante, em que o vetor viral recombinante expressando o transgene é isolado da população viral não expressando. Do mesmo modo, outro cassete exógeno pode ser inserido em outro locus de inserção para criar um vetor duplo de herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) expressando dois genes recombinantes (polinucleotídeos). O segundo cassete pode também ser inserido no mesmo locus. O herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) recombinante é produzido em
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50/90 fibroblastos primários de embriões de galinhas do mesmo modo que para a vacina da cepa SB-1 MD do herpesvirus galináceo 3 (MDV2) original. Após incubação, as células infectadas são colhidas, misturadas com um meio de congelamento, o qual permite a sobrevida de células infectadas, e congeladas normalmente em frascos criogênicos ou ampolas de vidro e armazenados em nitrogênio líquido.
[0086] Alternativamente, um vetor de herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) recombinante pode ser construído como cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou como cromossomo artificial derivado de Pl (PAC). Especificamente, um clone pSB-1 BAC (Petherbridge L et al. , J Virol Methods 2009; 158: 11-7), compreendendo o genoma inteiro da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (Número de acesso no Genebank HQ840738.1) pode ser utilizado para gerar vírus recombinantes com um cassete de expressão de galK (SEQ ID NO: 8) inserido no locus indicado. Os primers (iniciadores) (como os primers listados na Tabela 2) possuem sequências homólogas às dos nucleotídeos exatos da região onde o fragmento irá ser inserido. A recombinação homóloga entre as sequências homólogas dos primers e a sequência nucleotídica do locus no vetor resulta na inserção do fragmento. Colônias positivas são selecionadas tendo por base a sua capacidade para utilizar galactose como a única fonte de carbono em um meio mínimo. O cassete de expressão de galK (SEQ ID NO: 8) pode então ser substituído pelo cassete de expressão de VP2 (SEQ ID NO: 9) ou qualquer outro cassete de expressão de polinucleotideo heterólogo. Colônias positivas são selecionadas tendo por base a sua capacidade para crescer na presença de 2desoxi-galactose, e a integração do cassete de expressão de VP2
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51/90 é confirmada por PCR específica e sequenciamento. O vetor de herpesvirus galináceo recombinante de acordo com a invenção é isolado do E.colí, CEF são transfectados com o DNA do BAC que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção e vírus reconstituídos são submetidos a passagens para gerar estoques de vírus de trabalho.
Vacinas
[0087] Em alguns aspectos, o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos de acordo com a invenção pode ser utilizado como uma vacina, ou seja, uma composição imunogênica, para administração a um indivíduo, como uma galinha ou outra ave, com objetivo de conferir proteção contra um ou mais vírus aviários. Assim, a vacina compreende um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante.
[0088] A vacina da presente invenção pode compreender um vetor de herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) recombinante da presente invenção e um veículo, excipiente ou adjuvante aceitável para uso farmacêutico ou veterinário.
[0089] Em outra modalidade, a vacina compreende: (i) um vetor de herpesvirus galináceo 3 (MDV-2) recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que
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52/90 expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante; e (ii) pelo menos um vetor adicional do vírus da doença de Marek (MDV). O vetor adicional de MDV é selecionado preferivelmente a partir do grupo que consiste em vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT ou MDV-3), mais preferivelmente entre vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus. O vetor adicional de MDV pode ser um vetor do tipo selvagem, preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT ou MDV-3) ou um vetor de MDV recombinante derivado preferivelmente de um vetor de MDV selecionado a partir do grupo que consiste em vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT ou MDV-3).
[0090] O vetor do vírus da doença de Marek (MDV) recombinante pode compreender um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário. O vetor de MDV recombinante pode ser derivado do vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 ou do vetor da cepa Fcl2 6 do herpesvirus de perus (HVT ou MDV-3) . O
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53/90 vetor de MDV recombinante pode também ser um segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, preferivelmente um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante, além do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção. O técnico no assunto entendería que o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante é diferente do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante pelo fato de expressarem polinucleotídeos heterólogos diferentes. Assim, o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um antígeno de um patógeno aviário diferente daquele de um ou mais polinucleotídeos heterólogos do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante. O técnico no assunto entendería ainda que os dois vetores de herpesvirus galináceo 3 recombinante podem expressar diferentes polinucleotídeos heterólogos e, consequentemente, podem conferir proteção contra doenças diferentes causadas por um patógeno aviário além da doença de Marek. Esse segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante pode igualmente compreender um ou mais polinucleotídeos heterólogos inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do dito segundo vetor do herpesvirus galináceo 3, de preferência no locus intergênico UL3/UL4. Embora o primeiro e o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante sejam preferivelmente vetores da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante, eles podem também ser derivados de cepas diferentes de tal modo que primeiro vector seja derivado de uma cepa SB-1 e o segundo vetor de uma cepa HPRS24, ou o primeiro vetor seja derivado de uma cepa HPRS24 e o segundo de uma cepa HPRS24. De preferência, o (primeiro) vetor
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54/90 de herpesvirus galináceo 3 recombinante e o vírus adicional da doença de Marek, como descritos acima, são administrados juntos em uma forma farmacêutica. Alternativamente, o (primeiro) vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante e o vírus adicional da doença de Marek, como descritos acima, podem ser administrados em forma farmacêutica separada ao mesmo tempo ou em momentos diferentes.
[0091] A vacina de acordo com a invenção é projetada para gerar imunidade mediada por anticorpos e/ou imunidade celular em um indivíduo. A vacina pode compreender ainda um excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Um excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável pode ser uma substância que intensifica uma resposta imune em um indivíduo a um antígeno exógeno, incluindo, entre outros, adjuvantes, lipossomas, microesferas biodegradáveis. Um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável pode conter uma substância destinada a proteger o antígeno de catabolismo rápido, como hidróxido de alumínio ou óleo mineral, ou um estimulador de respostas imunes, como proteínas derivadas de Bordetella pertussis ou Mycobacterium tuberculosis. As vacinas de acordo com a invenção podem compreender ou consistir essencialmente em um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes adequados para uso na prática da presente invenção são (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, anidrido maleico e polímeros derivados de alquenila, (2) sequências imunoestimulantes (ISS), tais como sequências oligodesosirribonucleotídicas tendo uma ou mais unidade CpG não metiladas (Klinman et al, 1996; W098/16247), (3) uma emulsão óleo em água, como a emulsão SPT descrita na página 147 de Vaccine Design, The Subunit and Adj uvant Approach,
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55/90 publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 da mesma obra, (4) lipidios catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, p. ex., DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, (7) saponina ou (8) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência no presente pedido de patente, ou (9) quaisquer combinações ou misturas dos mesmos. Os adjuvantes disponíveis comercialmente podem incluir, por exemplo, Adjuvante Incompleto e Adjuvante Completo de Freund, Adjuvante 65 da Merck, os sais de alumínio como hidróxido de alumínio gel (alum) ou fosfato de alumínio; oligonucleotídeos CpG, os sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacarídeos com derivações catiônicas ou aniônicas; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; e lipídio A monofosforilado.
[0092] O técnico no assunto será capaz de identificar veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso com a presente invenção. Um veículo farmaceuticamente aceitável adequado pode ser determinado em parte pela composição em particular sendo administrada, bem como pelo método especificamente utilizado para administrar a composição. Desse modo, há disponível uma grande variedade de formulações adequadas de vacinas que podem ser de utilidade na presente invenção. Um veículo farmaceuticamente aceitável adequado inclui soluções isotônicas, estéreis aquosas e não aquosas para injeções, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornem a formulação isotônica com o sangue do indivíduo pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes
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56/90 espessantes, estabilizantes e conservantes. O veiculo ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser qualquer composto ou combinação de compostos que facilite a administração do vetor (ou proteína expressa por um vetor da invenção ín vitro), ou que facilite a transfecção ou infecção e/ou melhore a conservação do vetor (ou proteína). O veículo ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados para os métodos desta invenção incluem, entre outros, solução de NaCl 0,9% (p. ex., solução salina) ou um tampão fosfato, poli-(Lglutamato) ou polivinilpirrolidona. Tais vacinas podem também compreender tampões (p. ex., solução salina com tampão neutro ou solução salina com tampão fosfato), carboidratos (p. ex., glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes como EDTA ou glutationa, adjuvantes (p. ex., hidróxido de alumínio), solutos que tornam a formulação isotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o sangue de um indivíduo, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Soluções e suspensões para injeções podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.
[0093] A administração pode ser de qualquer maneira conveniente, por exemplo, por injeção, administração oral, inalação, aplicação transdérmica ou administração retal. A administração pode também ser por injeção in ovo. A injeção de um vetor viral recombinante ou de uma vacina, como aqui descritos, pode ser fornecida a um indivíduo, tal como aves, em
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57/90 uma administração ou dose única ou pode ser administrada mais de uma vez, como em doses repetidas.
[0094] Uma vacina pode geralmente ser utilizada para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Por exemplo, de acordo com a invenção, a vacina pode ser fornecida a um indivíduo, como uma espécie aviária, para imunização contra uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários. Tipicamente, a vacina é administrada antes da infecção ou exposição a um patógeno aviário a fim de proporcionar proteção contra infecção por um ou mais patógenos aviários ou o desenvolvimento de sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários. De preferência, o patógeno aviário é um vírus aviário, mais preferivelmente o patógeno aviário é o vírus da doença de Marek e um ou mais vírus aviários adicionais. Um ou mais aviários adicionais são preferivelmente vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV). A fim de conferir proteção ou imunizar contra um patógeno aviário, a vacina é administrada em idade precoce, de preferência ín ovo, como a ovos embrionados de 18 dias, como a ovos de galinhas, ou a pintos, de preferência a pintos de 1 dia de idade. Em outra modalidade, a vacina pode também ser fornecida a um indivíduo, como uma ave, depois da infecção ou exposição a um ou mais patógenos aviários a fim de
fornecer tratamento para o patógeno no indivíduo, tal como
reduzindo ou eliminando a infecção no indivíduo.
[0095] As vacinas de acordo com a invenção podem ser
fornecidas em recipientes de dose única ou de doses múltiplas,
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58/90 como ampolas ou frascos lacrados. Tais recipientes podem ser lacrados para conservar a esterilidade da composição até o uso. Em geral, as composições como aqui descritas podem ser armazenadas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. Alternativamente, tal composição pode ser armazenada em condição liofilizada necessitando somente a adição de um veiculo liquido estéril imediatamente antes do uso.
[0096] A dose administrada a um indivíduo, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para uma resposta profilática benéfica no indivíduo ao longo do tempo, como proteger um indivíduo, como uma galinha ou outra ave, contra sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários, ou imunizar contra uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários. Uma dose protetora tipicamente possui cerca de 3000 a 5000 pfu do herpesvirus galináceo 3 recombinante da invenção.
Uso da vacina
[0097] Outro aspecto da invenção diz respeito a um método para induzir uma resposta imunológica em um animal contra um ou mais antígenos, ou uma resposta protetora em um animal contra um ou mais patógenos aviários, em que o método compreende inocular o animal pelo menos uma vez com a vacina da presente invenção. Ainda outro aspecto da invenção diz respeito a um método para induzir uma resposta imunológica em um animal a um ou mais antígenos, ou uma resposta protetora em um animal contra um ou mais patógenos aviários, em um esquema de administração inicialreforço, o qual compreende pelo menos uma administração primária e pelo menos uma administração de reforço utilizando pelo menos
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59/90 um polipeptídeo, antígeno, epítopo ou imunógeno em comum. A vacina usada na administração primária pode ser igual ou pode ser diferente daquelas usadas como reforço.
[0098] Especificamente, a vacina da presente invenção é usada para imunizar uma espécie aviária contra uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários, de preferência contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários. Em algumas modalidades, a vacina da presente invenção é para uso na proteção de uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários, de preferência contra sintomas clínicos causados pelo vírus da doença de Marek e sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários.
[0099] Além disso, é provido também um método de tratamento de uma espécie aviária para proteção contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários, o qual compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz da vacina de acordo com a invenção.
[00100] O animal a ser vacinado é uma espécie aviária e tipicamente aves. Os animais adequados são, por exemplo, perus, galinhas, codornas, patos, gansos ou pombos comuns. De preferência, o animal a ser vacinado é peru ou galinha, mais preferivelmente galinha.
[00101] Um ou mais patógenos aviários causadores da doença ou dos sintomas clínicos são, de preferência, um patógeno aviário selecionado a partir do grupo que consiste em vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV),
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60/90 vírus da laringotraqueíte infecciosa aviária (ILTV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
[00102] Outros patógenos aviários adequados são vírus da encefalomielite aviária e outros picornavírus, reovírus aviários, paramixovirus aviários, metapneumovírus aviários, adenovirus aviários, vírus da varíola aviária, coronavirus aviários, rotavirus aviários, parvovirus aviários, astrovírus aviários e vírus da anemia de galinhas, Eimeria sp. (coccidiose), Campylobacter sp., Salmonella sp., Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Pasteurella sp., Avíbacteríum sp., E. coll ou Clostridium sp. De preferência, o patógeno aviário é um vírus aviário.
[00103] As doenças preferidas causadas por um patógeno aviário contra as quais se vacinar ou proteger são doença de Newcastle (ND) causada pelo vírus da doença de Newcastle (NDV), doença infecciosa da bursa (IBD) causada pelo vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), laringotraqueíte aviária (ILT) causada pelo vírus da laringotraqueíte infecciosa aviária (ILTV), gripe aviária causada pelo vírus da gripe aviária (AIV) ou bronquite infecciosa aviária (IB) causada pelo vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
[00104] Normalmente, uma administração da vacina é realizada in ovo ou a pintos. A administração é feita a pintos de preferência com um ano de idade pela via subcutânea ou intramuscular. A administração in ovo é tipicamente realizada a ovos embrionados de 17-19 dias de idade, preferivelmente ovos embrionados de 18 dias de idade, p. ex., de galinhas. Os animais
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61/90 são preferivelmente embriões de 17 dias ou estão com 1 dia de idade no momento da primeira administração. Uma segunda administração pode ser efetuada nos 10 dias de idade.
[00105] Em uma modalidade, o vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) ou a vacina da invenção é utilizado para proteger uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados pelo vírus da doença infecciosa da bursa. O técnico no assunto entendería que pelo menos um antígeno de um patógeno aviário codificado e expresso por um ou mais polinucleotideos heterólogos seria um antígeno do vírus da doença infecciosa da bursa, preferivelmente VP2 do vírus da doença infecciosa da bursa.
[00106] Uma variedade de vias de administração a pintos de [sic] dias de idade pode ser utilizada, tais como subcutânea ou intramuscular, intradérmica, transdérmica. A vacinação ín ovo pode ser realizada no saco amniótico e/ou no embrião. Dispositivos disponíveis comercialmente para administração ín ovo e s.c. podem ser usados para vacinação.
Exemplos
Clonagem do cassete de expressão de galK no genoma do virus SB1
[00107] O clone pSB-1 BAC (Petherbridge L et al. , J Virol Methods. 2009; 158: 11-7), compreendendo o genoma inteiro da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (Número de Acesso do GenBank: HQ840738.1), foi utilizado para gerar diferentes vírus recombinantes com um cassete de expressão de galK (SEQ ID NO: 8) inserido no locus indicado, empregando uma técnica baseada em recombinação homóloga utilizando proteínas fornecidas por fago
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62/90 lambda. Resumidamente, o cassete de expressão de galK foi amplificado por primers específicos (Tabela 2) marcados com etiqueta (tag) para o locus específico aonde a inserção vai ocorrer. A cepa SW102 de E.coli, abrigando pSB-1 BAC, foi transformada com o fragmento amplificado. Com auxílio da recombinação homóloga, o fragmento foi inserido na localização exata direcionada pelas sequências homólogas (tags) . Por exemplo, o par de primers UL3/4F-GalKF e UL3/4R-GalKR marcam o cassete de galK com a sequência de UL3/4, de modo que o fragmento será inserido na região de UL3/UL4 por recombinação homóloga. Colônias positivas foram selecionadas com base na sua capacidade para utilizar galactose como a única fonte de carbono em um meio mínimo. Protocolos para a abordagem de recombineering (recombinação homóloga) tendo por base a seleção com galK foram descritos (Zhao Y, Nair V. Mutagenesis of the Repeat Regions of Herpesviruses Cloned as Bacterial Artificial Chromossomes. In: Braman J, editor. In Vitro Mutagenesis Protocols. 3a ed: Humana Press; 2010. p. 53-74; Warming S et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33:e36) . A integração do cassete de expressão de galK foi confirmada por PCR específica e sequenciamento.
[00108] Sítios exemplares para inserção de UL3/4, UL10/11 e UL21/22 são mostrados abaixo. A posição do sítio de inserção exato é mostrado em negrito, destacando os dois nucleotídeos 5' e 3' do sítio de inserção. Os números na extremidade 5' e 3' das sequências na Tabela 1, bem como os números indicados para o sítio de inserção referem-se ao genoma da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (Número de Acesso do GenBank HQ840738.1).
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Tabela 1: Loci de inserção
Locus de inserção SEQ ID NO Sequência Sitio de inserção
UL3/4 1 19456- caagaagcatctaaaacgcgcttgattgt cgagtggctgaataaaatctttattgatc gactcgctttcctatttctgatttaataa ccatagatg-19551 19516-inserção- 19517 (entre os nucleotídeos 61 e 62 da SEQ ID NO: 1)
UL21/22 2 49900- gccgggcatatacagaacgtaagccaagc tggagtttgtgtaagtatgtgctctacag cgtgcgggaagggcggttcgcgaataaac acaacagtacagg-4 9999 49949-inserção- 49950 (entre os nucleotídeos 49 e 50 da SEQ ID NO: 1)
ULlO/11 3 32225- agtgaatgggatgaataggaacgcccgaa acataataaaacgctaaatctacaagtga ttgtcgcgcgacttatttatcactataac gtatcgttacatt-32324 32274-inserção- 32275
UL40/41 4 93911- gtatcgaacgatctttaattagcctgtgt gcaactgtactttctacccctacccacaa gaattaataaatgaattcaaattatcgct tttcgcaccgtgt-94010 93960-inserção- 93961
UL50/51 5 109703- aaacggcagcattcgatacggaatcgggc aggagcgagagagagtgtgcgtatgtaat 109750- inserção-109751
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Locus de inserção SEQ ID NO Sequência Sitio de inserção
cgtgcgcaactatacattattgcccgctc gacccgaagccgtc-10 98 02
UL26/27 6 58446- ggatccgctatgtcgacgtataagtttat acattttgcgaccgcaatagcaaataaaa gtaaaataatcgtatgcgcacgtgagaat ttatttatcgaga-58545 58495- inserção-58496
UL45/46 7 101292- gagagaccgagcattagagtagcacttat ttattctatcgcagagaaacagcgcgcgt tcaaaaaaaacacaggcggggtacgataa atttacgcggccg 101393 101292- inserção-101344
Tabela 2: Primers usados para gerar o cassete de expressão de galK
Primer Sequência SEQ ID NO:
UL21/22 gccgggcatatacagaacgtaagccaagctggagtttgtg SEQ ID NO:
F-GalKF taagtatgtgcctgttgacaattaatcatcggca 13
UL21/22 CCTGTACTGTTGTGTTTATTCGCGAACCGCCCTTCCCGCA SEQ ID NO:
R-GalKR CGCTGTAGAGTCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 14
UL26/27 ggatccgctatgtcgacgtataagtttatacattttgcga SEQ ID NO:
F-GalKF ccgcaatagccctgttgacaattaatcatcggca 15
UL26/27 T C T C GAT AAAT AAAT T C T C AC GTGCGCATACGATTATTTT SEQ ID NO:
R-GalKR ACTTTTATTTTCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 16
UL3/4F- taaaacgcgcttgattgtcgagtggctgaataaaatcttt SEQ ID NO:
GalKF attgatcgaccctgttgacaattaatcatcggca 17
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Primer Sequência SEQ ID NO:
UL3/4R- ATAGAT TCCCCGCCCCATCTATGGTTAT TAAATAGAAATA SEQ ID NO:
GalKR GGAAAGCGATCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 18
UL10/11 agtgaatgggatgaataggaacgcccgaaacataataaaa SEQ ID NO:
F-GalKF cgctaaatctcctgttgacaattaatcatcggca 19
UL10/11 AAT G TAAC GATAC G T TATAG T GATAAATAAG T C G C G C GAC SEQ ID NO:
R-GalKR AATCACTTGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 20
UL40/41 gtatcgaacgatctttaattagcctgtgtgcaactgtact SEQ ID NO:
F-GalKF ttctacccctcctgttgacaattaatcatcggca 21
UL40/41 ACAC G G T G C GAAAAG C GATAAT T T GAAT TCATTTATTAAT SEQ ID NO:
R-GalKR TCTTGTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 22
UL50/51 gaaacggcagcattcgatacggaatcgggcaggagcgaga SEQ ID NO:
F-GalKF gagagtgtgccctgttgacaattaatcatcggca 23
UL50/51 GTATGTAATCGTGCGCAACTATACATTATTGCCCGCTCGA SEQ ID NO:
R-GalKR CCCGAAGCCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTTG 24
Clonagem do cassete de expressão de VP2 de IBDV no genoma do virus SB-1
[00109] Os clones pSB-1 BAC, compreendendo um cassete de expressão de galK (SEQ ID NO: 8) no locus intragênico UL3/4 (SEQ ID NO: 1), UL21/22 (SEQ ID NO: 2) ou UL10/11 (SEQ ID NO: 3) do genoma do virus SB-1, foram utilizados para gerar três diferentes recombinantes pSB-l-UL3/4VP2, pSB-l-UL21/22VP2 e pSB-1UL10/11VP2 que contêm o cassete de expressão de VP2 de IBDV VP2 (SEQ ID NO:9). O cassete de expressão de galK (SEQ ID NO: 8) foi substituído pelo cassete de expressão de VP2 (SEQ ID NO: 9) , amplificado do HVT recombinante expressando VP2 de IBDV (Darteil R et al. , Virology 1995; 211: 481-90) e compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica VP2 (SEQ ID NO: 10) e uma
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66/90 sequência promotora do citomegalovírus murino (IE) e intensificadora (SEQ ID NO: 11). Colônias positivas foram selecionadas com base na sua capacidade para crescer na presença de 2-desoxi-galactose (Warming S et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33:e36), e a integração do cassete de expressão de VP2 foi confirmada por PCR específica e sequenciamento.
Cultura celular e propagação do vírus
[00110] Fibroblastos de embriões de galinhas (CEE) foram preparados, a partir de ovos embrionados de 9-11 dias de idade livres de patógenos específicos (SPF) de aves Rhode Island Red (RIR), em meio E199 (Sigma) com soro 5%. Células DF-1 foram propagadas em meio de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) com soro 10%. Células DT40 células foram propagadas em meio RPMI-1640 com soro 10%. Todos os meios da cultura celular eram suplementados com penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 pg/mL e fungizona 0,25 pg/mL.
[00111] Para a preparação de estoques de vírus recombinantes, CEE foram transf ectados com o BAC DNA das construções recombinantes utilizando o reagente de transfecção Lipofectamine® (ThermoFisher) , e os vírus reconstituídos foram submetidos a passagens para gerar estoques de vírus de trabalho. A titulação de vírus vacinais SB-1 foi realizada em CEE e as titulações calculadas pela contagem dos números de placas quatro dias após a infecção. As placas de vírus recombinantes foram confirmadas por imunohistoquímica com anticorpo monoclonal HH7 de camundongo específico contra VP2 de IBDV e o anticorpo monoclonal Y5 de camundongo específico contra SB-1 (Lee LF, Liu X, Witter RL. Monoclonal antibodies with specificity for three
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67/90 different serotypes of Marek’s disease viruses in chickens. J Immunol. 1983; 130: 1003-6) e anticorpo anti-camundongo conjugado a HRP (DAKO) e substrato TrueBlue™ (KPL) de peroxidase.
[00112] Usou-se a cepa UK661 virulenta de IBDV para o desafio, presente em lisados de tecido da Bursa de aves infectadas colhidos 3 dias após a infecção (Eterradossi N et al., Zentralbl Veterinarmed B. 1992; 39: 683-91) . Resumidamente, amostras da bursa infectada por IBDV foram coletadas de aves mostrando sinais agudos da doença, e foram homogeneizadas em clorotrifluorometano (FREON 13). 0 sobrenadante coletado após a centrifugação a 1500g durante 30 minutos a 4 °C foi passado através de um filtro de 0,45 pm e tratado com penicilina e estreptomicina. Os lisados foram titulados, divididos em alíquotas e mantidos a -80 °C até o uso. Foram então inoculados por via intranasal em 20 galinhas White Leghorn spf de quatro semanas de idade (0,05 mL por ave). A cepa D78 foi propaganda em células DF-1 e armazenada a -80 °C até o uso. Titulações das cepas virais UK661 e D78 foram realizadas nas células DT40 e DF-1, respectivamente, calculando a dose infectante mediana em cultura de tecido (TCID50) pelo método de Spearman-Karber (Brownie C et al. , Biologicals. 2011;39:224-30).
Estudos da curva de crescimento dos vírus
[00113] CEFs com confluência em placas de 10 cm2 foram infectados em triplicata com 103 pfu de vírus SB-1. Após a infecção, as células (CEE) infectadas foram colhidas nos momentos 0, 6, 24, 48, 96 e 120 horas após a infecção. As células colhidas foram lavadas com PBS e mantidas a -20 °C até que tivesse sido realizada a extração do DNA. O DNA genômico foi
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68/90 extraído das células infectadas utilizando o kit QIAamp 96 DNA (Qiagen). A guantificação do número de cópias do genoma de SB-1 foi realizada por PCR em tempo real (Singh SM et al. , Res Vet Sei. 2010; 89: 140-5; Islam A et al. , J Virol Methods. 2004; 119: 103-13; Renz KGet al., J Virol Methods. 2006; 135: 186-91) utilizando os primers e as sondas indicados na Tabela 3.
Tabela 3: Primers para PCR em tempo real
Primers e sondas para detecção de MDV-2 e ovotransferrina de galinha Sequência SEQ ID NO:
Primer forward de MDV-2 AGCATGCGGGAAGAAAAGAG 25
Primer reverse de MDV-2 GAAAGGTTTTCCGCTCCCATA 26
Sonda de MDV-2 CGCCCGTAATGCACCCGTGACT 27
Primer forward de Ovo CACTGCCACTGGGCTCTGT 28
Primer reverse de Ovo GCAATGGCAATAAACCTCCAA 29
Sonda de Ovo AGTCTGGAGAAGTCTGTGCAGCAGCCTCCA 30
Teste de neutralização no soro
[00114] Amostras de soro coletadas por centrifugação foram tratadas com calor a 56 °C durante 30 minutos para inativar fatores do complemento, antes do teste de neutralização. Resumidamente, diluições seriais de amostras de soro foram incubadas com 100 TCID50 da cepa D78 de IBDV por uma hora a 37 °C, e misturas soro-vírus foram incubadas em monocamadas de células DF-1 em placas com 96 cavidades por uma hora, antes de substituição com meio DMEM contendo FCS 2%. As células foram
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69/90 verificadas depois de quatro dias para evidência de efeitos citopáticos (CPE) e determinação dos titulados.
Análise estatística
[00115] Para comparar o nível de replicação dos vírus SB-1
recombinantes, empregou-se um modelo linear. LoglO pfu foi
considerado a variável da reposta e vírus recombinantes além de
horas após a infecção foram considerados as variáveis
exploratórias. Foram identificadas diferenças significativas
entre os momentos e vírus por meio de testes de Tukey post hoc.
As diferenças em níveis de anticorpos neutralizantes no decorrer do estudo e entre os grupos foram analisadas utilizando o teste ANOVA two-way (dois fatores). O nível de anticorpos dentro de cada grupo foi analisado pelo teste ANOVA one-way (um fator). A
taxa de sobrevida entre grupos das aves após o desafio foi
comparada utilizando o teste de Mantel-Cox.
Exemplo 1
Análise de diferentes loci para inserção de um cassete de
expressão
[00116] A construção de um cromossomo artificial bacteriano
(BAC) compreendendo o genoma de SB-1 foi relatada por
Petherbridge L et al. (J Virol Methods. 2009; 158: 11-7; Singh
SM et al. , Res Vet Sei. 2010; 89: 140-5) . Com esse clone pSB-1
BAC, examinou-se o potencial de SB-1 como um novo vetor
recombinante para expressão de antígenos protetores provenientes
de outros patógenos aviários empregando as técnicas bem
estabelecidas de recombinação (recombineering) como descrito
acima. A fim de identificar localizações no genoma de SB-1 para
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70/90 inserir cassetes de expressão que codificam um antígeno de um patógeno aviário, as regiões intergênicas UL10/UL11, UL3/UL4, UL21/UL22, UL40/41, UL26/27 e UL50/UL51 foram testadas para inserção do cassete de expressão de galk bacteriano e produção das construções intermediárias de BAC. Entre as localizações listadas, as regiões intergênicas UL26/27 e UL50/51 produziram muito pouca quantidade de vírus (Tabela 4) . Além disso, rSB-1 UL40/41 galK produziu vírus infeccioso (Tabela 4), mas rSB-1 UL40/41 IBDV VP2 não conseguiu produzir vírus infeccioso (dados não mostrados), provavelmente devido à inserção maior. Como resultado, essas localizações foram excluídas do estudo.
Tabela 4. Comparação entre diferentes recombinantes do vírus rSB-1. Os vírus recombinantes foram produzidos inserindo o cassete de expressão indicado nas localizações especificadas.
Nome do recombinante Título (PFU/mL)
rSB-1 UL40/41 galK 4xl04
rSB-1 UL21/22 galK 9,5xl04
rSB-1 UL3/4 galK 7xl04
rSB-1 UL10/11 galK l,25xl04
rSB-1 UL26/27 galK 50
rSB-1 UL50/51 galK 1,95xl02
[00117] Como os sítios de integração UL40/41, UL26/27 e UK50/51 comprometeram a replicação, continuou-se a investigar mais detalhadamente os sítios de inserção UL3/4, UL10/11 e UL21/22.
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Exemplo 2
Replicação dos vírus rSB-l-UL3/4VP2, rSB-l-UL10/HVP2 e rSB-1UL21/22VP2
[00118] Nesse estudo, usou-se a cepa SB-1 de MDV-2 (GaHV3) como um novo vetor viral para gerar três construções independentes que expressavam VP2 de IBDV nos loci intergênicos e UL3/4, UL10/11 ou os loci UL21/22 do genoma viral.
[00119] Os detalhes sobre a construção de pSB-l-UL3/4VP2, pSB1-UL10/11VP2 e pSB-l-UL21/22VP2 estão resumidos na Figura 1A. Vírus SB-1 recombinantes, produzidos após a transfecção de BAC DNA, foram submetidos a três passagens em CEF para produzir estoques de vírus de baixa passagem. Após o resgate dos vírus, foi realizado o experimento da curva de crescimento para comparar a replicação dos vírus SB-1 recombinantes e originais em células CEF, conforme mostrado na Figura 2. Não foram observadas diferenças significativas na taxa de crescimento dos vírus pSB1 e rSB-l-UL3/4VP2 entre 48 e 120 horas após a infecção. Em contraste, a expressão do cassete de expressão de VP2 no locus UL10/11 e no locus UL21/22 pareceu tornar mais lento o crescimento de SB-1 in vitro. Tal efeito negativo sobre a replicação (tendo por base a titulação do vírus) foi também observado quando se inseriu o cassete de expressão de galK para o vírus rSB-l-UL10/llgalK, mas não para o vírus rSB-1UL21/22galK (vide Tabela 4). Não foi observada diferença significativa em replicação entre a inserção no locus intergênico UL3/4 e clone pSB-1 BAC (Figura 2).
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[00120] Portanto, concluiu-se que a inserção do cassete de expressão de VP2 na junção intragênica entre UL3 e UL4 tem o menor efeito sobre a taxa de crescimento do virus in vitro. A expressão do antígeno VP2 em células infectadas com os vírus rSB-l-UL3/4VP2, rSB-l-UL10/HVP2 e rSB-l-UL21/22VP2 foi avaliada mais detalhadamente por coloração das células infectadas com os anticorpos monoclonais HH7 e anti-HRP de camundongo, conforme mostrado na Figura 1B.
Exemplo 3
[00121] Tendo estreitado os sítios de integração para UL3/4, UL10/11 e UL21/22, examinou-se mais detalhadamente o potencial imunogênico da proteína VP2 (Fahey KJ et al. , J Gen Virol. 1989;70 (Pt 6) :1473-81) do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), o agente causador da doença infecciosa da bursa (IBD, doença de Gumboro) entregue pelo vetor de SB-1 recombinante.
Desenvolvimento de vacina contra IBDV: estudo de imunização
[00122] Pintos RIR SPF com um dia de idade, criados no Biotério Experimental em Pirbright, foram usados para os experimentos de validação. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a lei referentes a animais (Animal Act) (Procedimentos científicos) de 1986 do Reino Unido, sob as licenças do Home Office Personal and Project, após a aprovação do comitê interno de ética em pesquisa.
[00123] Quarenta pintos com 1 dia de idade foram divididos em 4 grupos de 10 aves cada. Cada um dos três grupos recebeu injeções subcutâneas dos vírus vacinais rSB-1-ULl0/11VP2, rSB1-UL21/22VP2 ou rSB-l-UL3/4VP2, respectivamente, cada uma
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73/90 compreendendo 3 x 103 pfu em 100 pL de inóculo. Cada uma das 10 aves no grupo controle recebeu 3 χ 103 pfu da vacina VAXXITEKhvt+ibd® (Merial), conforme recomendado pelo fabricantes. Amostras de sangue foram coletadas semanalmente, da 2a à 5a semana após a vacinação para estudos sorológicos.
[00124] A imunogenicidade das vacinas de SB-1 recombinante foi avaliada medindo-se a produção de anticorpos neutralizantes em galinhas vacinadas. Os resultados da vacinação subcutânea com os vírus vacinais VAXXITEKhvt+ibd, rSB-1-UL10/11VP2, rSB-l-UL21/22VP2 ou rSB-l-UL3/4VP2 são descritos na Figura 3. Anticorpos neutralizantes começaram a aparecer a partir de duas semanas e subiram até uma titulação máximo de 1:640 em quatro semanas após a vacinação. Anticorpos neutralizantes foram detectáveis a partir de duas semanas em diante em todos os grupos, exceto para o grupo de aves vacinadas com rSB-l-UL21/22VP2, nas quais o nível de anticorpos neutralizantes permaneceu indetectável ao longo da segunda semana. Na Terceira semana após a vacinação, todos os quatro grupos mostraram anticorpos neutralizantes no soro de aproximadamente 50% das aves. Na quarta semana após a vacinação, todas as aves mostraram anticorpos neutralizantes (Figura 3) . Embora nenhuma diferença significativa entre os níveis médios de anticorpos tivesse sido observada entre os grupos em cada momento, os valores médios de anticorpos neutralizantes nos grupos inoculados com as vacinas experimentais foram maiores do que aqueles do grupo que recebeu a vacina comercial.
Exemplo 4
[00125] Para o estudo de desafio, a vacinação foi realizada com rSB-l-UL3/4VP2 e rSB-l-UL21/22VP2. rSB-l-UL10/llVP2 foi
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74/90 excluído do estudo por causa de seu baixo nível de crescimento quando comparado a SB-1-UL3/4VP2 e SB-1-UL21/22VP2.
Desenvolvimento de vacina contra IBDV: estudo de desafio
[00126] Pintos RIR SPF com um dia de idade, criados no Biotério Experimental em Pirbright, foram usados para os experimentos de validação. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a lei referentes a animais (Animal Act) (Procedimentos científicos) de 1986 do Reino Unido, sob as licenças do Home Office Personal and Project, após a aprovação do comitê interno de ética em pesquisa.
[00127] Dois grupos (oito aves por grupo) de aves com um dia de idade foram inoculados por via subcutânea com 1000 pfu de estoques dos vírus rSB-l-UL3/4VP2 ou rSB-l-UL21/22VP2. Dois grupos controle foram inoculados com 1000 pfu do vírus derivado de pSB-1 ou com 3000 pfu da vacina comercial VAXXITEKhvt+ibd®, respectivamente. Após a coleta das amostras de sangue quatro semanas depois da vacinação, as aves foram desafiadas por via intranasal com 104,3 TCID50 da cepa virulenta UK661 de IBDV (em volume total de 100 pL, dividido entre as duas narinas). Além do registro do peso corporal, as aves foram monitoradas regularmente e os sinais clínicos pontuados em intervalos de 6 horas. Aves mostrando sinais clínicos avançados (pontuação acima de 9) foram sacrificadas por deslocamento cervical.
[00128] Em três semanas após a vacinação, o nível de anticorpos em aves vacinadas foi testado. Uma ave dos grupos vacinados com VAXXITEKhvt+ibd e rSB-1-UL3/4VP2 e três aves do grupo vacinada com rSB-l-UL21/22VP2 mostraram anticorpos neutralizantes no soro. Em
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75/90 comparação ao Exemplo 3, a quantidade administrada das vacinas de SB-1 foi reduzida de 3000 pfu para 1000 pfu (em comparação à dose de 3000 pfu de VAXXITEKhvt+ibd fornecida em ambos os experimentos). Apenas um número muito pequeno de aves mostrou anticorpos neutralizantes em três semanas após a vacinação, supostamente devido à dose menor fornecida. No entanto, após o desafio experimental com vírus virulento, todos os grupos (exceto pelo grupo controle com SB-1) mostraram 100% de proteção contra IBDV. Assim, esses estudos revelaram que a nova vacina com vetor de herpesvirus galináceo 2 recombinante induziu níveis de proteção semelhantes aos alcançados por aves vacinadas com VAXXITEKhvt+ibd. A pontuação clínica média e sobrevida das aves durante os estudos de desafio são apresentadas na Figura 4. Sinais clínicos foram vistos somente no grupo controle vacinado com SB-1, os quais começaram a aparecer a partir de 36 horas após o desafio e aumentaram abruptamente até 56 horas após o desafio quando a última ave restante foi sacrificada. Todas as aves no grupo controle negativo foram sacrificadas ou morreram 56 horas após a infecção pelo IBDV, enquanto que todas as aves vacinadas com VAXXITEKhvt+ibd, rSB-l-UL3/4VP2 e rSB-l-UL21/22VP2 sobreviveram (p<0,0001).
[00129] Os resultados mostram que GaHV3 pode ser utilizado como um novo vetor para imunização com VP2 de IBDV em pintos com 1 dia de idade, levando à proteção completa em um desafio com uma dose 100% letal de IBDV. Assim, foram identificadas duas localizações no genoma de GaHV3 que permitem a entrega eficaz do cassete de VP2 sem qualquer custo significativo para a replicação do vetor: o locus intergênico UL3/4 e o locus intergênico UL21/22. Prevê-se que esses locl também sustentarão a entrega de
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76/90 genes de outros patógenos. Os resultados indicam que GaHV3, particularmente a cepa SB-1, é adequado para uso como vetor para vacina de galinhas contra IBDV, e que este pode oferecer 100% de proteção em uma dose comercialmente viável, acrescentando, assim, uma nova plataforma de vetor para o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra doenças aviárias.
Exemplo 5
[00130] Para estudar interferência, pintos Ranger Gold com um dia de idade foram inoculados em 3 grupos separados com SB-1UL3/4VP2, HVT-H9HA (HVT expressando a proteína HA do vírus da gripe aviária), uma combinação de HVT-H9HA e SB-1-UL3/4VP2. As aves foram alojadas separadamente para minimizar a possibilidade de excreção e transferência do vírus da vacina entre os grupos. Um grupo adicional de aves não inoculadas foi considerado o controle negativo. A Tabela 5 resume os quatro grupos de aves que foram utilizadas no estudo.
Tabela 5. Resumo do desenho experimental para testar a interação entre os vírus SB-1 e HVT de vacinas
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Nome da SB-1 HVT-H9HA SB-1 Controle
vacina UL3/4VP2 UL3/4VP2+ negativo
HVT-H9HA
Dose alvo Dose alvo: Dose alvo: Dose alvo: N/A
5000 5000 2500 pfu de
pfu/ave pfu/ave cada vacina
Número de 10 aves 10 aves 10 aves 10 aves
aves
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[00131] Amostras de sangue foram coletadas através das veias braquiais da galinha, semanalmente, por 6 semanas (Semanas 0, 1, 3, 4, 5 e 6). Para o ensaio de neutralização do vírus, amostras de soro foram inativadas com calor durante 30 minutos a 56 °C. Após a inativação térmica, foram feitas diluições seriais de 2 vezes do soro em placas com 96 cavidades e incubadas com 100 TCID50 da cepa D78 de IBDV para neutralizar o vírus. O complexo vírus-soro foi transferido para células DF-1 e as células foram incubadas por uma hora. O complexo vírus-soro foi então removido e substituído por DMEM suplementado com soro fetal bovino 2%. O aparecimento de efeito citopático (CPE) foi investigado após 5 dias da inoculação em células DF-1. A última diluição do soro com a ausência de CPE em células DF-1 foi relatado como a titulação para anticorpos neutralizantes no soro.
[00132] A Figura 1 resumo os resultados do ensaio de neutralização do vírus do soro de aves que receberam as vacinas de SB-1 e HVT. São mostradas as titulações de anticorpos neutralizantes contra VP2 de IBDV para aves que foram vacinadas com SB-1-UL3/4VP2, SB-1-UL3/4VP2 e HVT-9HA, e do controle negativo. Como mostrado na Figura 1, todas as aves nos 3 grupos (grupo vacinado com SB-1-UL3/4VP2; grupo da vacina combinada SB1-UL3/4VP2 e HVT-9HA; e grupo não vacinado) mostravam título alto de anticorpos maternos antes da vacinação (Semana 0) . Os níveis dos anticorpos começaram a cair para todos os três grupos até a Semana 5. A elevação real em anticorpos neutralizantes é vista após a Semana 5 quando a titulação de anticorpos maternos caiu para 64 e continuaram a cair mais na Semana 6. A titulação de anticorpos neutralizantes aumentou no grupo vacinado com SB1-UL3/4VP2 e no grupo com a vacina combinada SB-1-UL3/4VP2 e
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HVT-9HA para mais de 1:256 na Semana 6. Essa diferença entre o grupo negativo e os grupos vacinados demonstrou ser significativa quando o teste de Tukey foi usado para comparar os dados em cada momento. Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre o grupo vacinado com SB-1UL3/4VP2 e o grupo da vacina combinada SB-1-UL3/4VP2 e HVT-9HA na Semana 6. Assim, os dados mostram que SB-1 e HVT não interferem um com o outro.
[00133] A invenção abrange os itens seguintes:
1. Um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3.
2. O vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 1, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos inseridos no locus intergênico UL3/UL4 do vetor do herpesvirus galináceo 3.
3. O vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 1 ou 2, em que o vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) .
4. O vetor de herpesvirus qualquer um dos itens 1 a 3, em confere proteção contra vírus da (IBDV), vírus da laringotraqueíte galináceo 3 recombinante de que pelo menos um antígeno doença infecciosa da bursa infecciosa (ILTV), vírus da
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79/90 doença de Newcastle (NDV), virus da gripe aviária (AIV) ou virus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
5. O vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens 1 a 4, em que pelo menos um antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em:
(a) VP2, VP3, VP4 e VPX de IBDV;
(b) glicoproteína B, glicoproteína I, glicoproteína D, glicoproteína E e glicoproteína C de ILTV;
(c) proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle (NDV-F) e hemaglutinina e neuraminidase viral (NDV-NH) de NDV;
(d) hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) do vírus da gripe aviária e
(e) proteína SI ou S2 de IBV.
6. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do
item 4, em que pelo menos um antígeno confere proteção contra
IBDV.
7 . 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de
qualquer um . dos itens anteriores, em que pelo menos um antígeno
é VP2 de IBDV.
8 . 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do
item 7, em que:
(a) a sequência de aminoácidos da proteína VP2 exibe pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 12 ou
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80/90 (b) a proteína VP2 possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12.
9. O vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens anteriores, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 contém cassete(s) de expressão contendo um ou mais polinucleotideos heterólogos.
10 . 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do
item 9, em que o cassete de expressão compreende ainda um
promotor.
11. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do
item 10, em que o promotor é selecionado a partir do grupo que consiste em promotor inicial imediato do citomegalovírus (CMV), promotor do CMV de cobaias, promotor do CMV de murinos, promotor do SV40, promotores do vírus da pseudoraiva do promotor da glicoproteína X, promotor alfa 4 do vírus do herpes simples 1, promotor da beta-actina de galinha, promotor da beta-actina de coelho, promotor da timidina quinase do vírus do herpes simples, promotores dos genes de glicoproteínas gC, gB, gE ou gl do vírus da doença de Marek e promotores das glicoproteínas gB, gE, gl, gD do vírus da laringotraqueíte infecciosa.
12. Uma vacina compreendendo o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens anteriores.
13. A vacina do item 12 compreendendo ainda um excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
14. A vacina do item 12 ou 13 compreendendo um vetor adicional do vírus da doença de Marek (MDV) selecionado a partir
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81/90 do grupo que consiste em vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT).
15. A vacina do item 14, em que o vetor adicional de MDV é um vetor de MDV recombinante.
16. A vacina do item 15, em que o vetor do vírus da doença de Marek (MDV) recombinante compreende um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário.
17. A vacina dos itens 14 a 16, em que o vetor do vírus da doença de Marek recombinante é um segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, de preferência um vetor da cepa SB-1 de herpesvirus galináceo 3 recombinante, além do o primeiro vetor
de herpesvirus 1 a 11. galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens
18 . A vacina do item 17, em que o segundo vetor de
herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais
polinucleotideos heterólogos inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do dito segundo vetor do herpesvirus galináceo 3.
19. A vacina do item 18, em que o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais polinucleotideos heterólogos inseridos no locus intergênico UL3/UL4 do segundo herpesvirus galináceo 3.
20. A vacina de qualquer um dos itens 17 a 19, em que o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende
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82/90 pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um antígeno de um patógeno aviário diferente daquele de um ou mais polinucleotídeos heterólogos do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante.
21. A vacina de qualquer um dos itens 14 a 20, em que o vetor adicional do vírus da doença de Marek de qualquer um dos itens 14 a 20 e o (primeiro) vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 12 ou 13 são administrados juntos ou separados um do outro.
22. Um DNA isolado que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens 1 a 11.
23. Um cromossomo artificial bacteriano (BAC) compreendendo um polinucleotídeo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens 1 a 11.
24. A vacina de qualquer um dos itens 12 a 21 para uso na vacinação de uma espécie aviária contra uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários.
25. A vacina de qualquer um dos itens 12 a 21 para uso na proteção de uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários.
26. A vacina de qualquer um dos itens 12 a 21 para uso na vacinação de uma espécie aviária contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários.
27. A vacina de qualquer um dos itens 12 a 21 para uso na proteção de uma espécie aviária contra sintomas clínicos
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83/90 causados pelo vírus da doença de Marek e sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários.
28. A vacina para uso como no item 24 ou 26, em que uma ou mais doenças são causadas por um ou mais dentre vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV) da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
29. A vacina para uso como em qualquer um dos itens 24 a 28, em que a espécie aviária é ave, de preferência, preferivelmente galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombomalhado ou pombo comum.
30. A vacina para uso como no item 29 em que a espécie aviária é peru ou galinha, preferivelmente galinha.
31. A vacina para uso como em qualquer um dos itens 24 a 30, em que um ou mais patógenos aviários causadores das doenças ou sintomas clínicos são selecionados a partir do grupo que consiste em vírus da doença de Newcastle, vírus da doença infecciosa da bursa e vírus da laringotraqueíte infecciosa aviária, vírus da gripe aviária e vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
32. A vacina para uso como em qualquer um dos itens 24 a 31, em que a vacina deve ser administrada por spray, in ovo, via subcutânea intramuscular, oral ou nasal.
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33. A vacina do item 32, em que a vacina deve ser administrada in ovo, de preferência em ovos embrionados de 18 dias.
34. A vacina para uso como no item 32, em que a vacina deve ser administrada por via intramuscular ou subcutânea a pintos, de preferência a pintos de 1 dia de idade.
35. Um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) de qualquer um dos itens 5 a 8 para proteger uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados pelo vírus da doença infecciosa da bursa.
36. Um método de tratamento de uma espécie aviária para proteção contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários, o qual compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz da vacina de qualquer um dos itens 12 a 21.
37. 0 método do item 36, em que uma ou mais doenças são causadas por um ou mais dentre vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV).
38. 0 método do item 36, em que a via de administração é administração por spray, administração in ovo, administração subcutânea, administração intramuscular, administração oral ou administração nasal.
39. 0 método do item 38, em que a via de administração é administração in ovo.
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40. O método selecionada a partir ganso, peru, codorna, do item 3 6, em que a do grupo que consiste pombo-malhado ou pombo espécie aviária é em galinha, pato, comum.
41. 0 método do item 40, em que a espécie aviária é galinha.
42. Um vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) que compreende um ou mais marcadores inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3.
43. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 42, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreende um ou mais marcadores inseridos no locus intergênico UL3/UL4 do vetor do herpesvirus galináceo 3.
44. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 42 ou 43, em que o marcador é um gene marcador de seleção, um gene repórter ou um código de barra de DNA.
45. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 42 ou 43, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreende um ou mais cassetes de expressão incluindo um gene marcador de seleção ou um gene repórter.
46. 0 vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante do item 45, em que o gene marcador de seleção ou gene repórter é galK ou uma combinação de kan/sacB.
47. Um cromossomo artificial bacteriano (BAC) compreendendo um polinucleotídeo que codifica o vetor de
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86/90 herpesvirus galináceo 3 recombinante de qualquer um dos itens 42 a 46.
48. Um método para produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante que compreende:
(a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) inserir um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3 e, opcionalmente, (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) .
49. Um método para produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante que compreende:
(a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais marcadores nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) substituir um ou mais marcadores por um cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário e (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) .
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87/90
50. O método do item 48 ou 49, em que a etapa (a) compreende prover um cromossomo artificial bacteriano compreendendo um polinucleotideo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante.
51. 0 método do item 50, em que as etapas (b) e (c) são realizadas em E.colí.
52. 0 método do item 51 compreendendo ainda as etapas seguintes:
(a) isolar o cromossomo artificial bacteriano compreendendo um polinucleotideo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b);
(b) transfectar fibroblastos de embriões de galinhas com o cromossomo artificial bacteriano da etapa (d).
53. 0 método de qualquer um dos itens 48 a 52, em que o vetor do herpesvirus galináceo 3 é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3.
TABELA DE SEQUÊNCIAS:
SEQ ID NO: l_locus intergênico UL3/4
SEQ ID NO: 2_locus intergênicos UL10/11
SEQ ID NO: 3_locus intergênico UL21/22
SEQ ID NO: 4_locus intergênico UL40/41
SEQ ID NO: 5_locus intergênico UL50/51
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88/90
SEQ ID NO: 6_locus intergênico UL26/27
SEQ ID NO: l_locus intergênico UL45/46
SEQ ID NO: 8_cassete de expressão galK
SEQ ID NO: 9_ sequência nucleotidica de cassete de expressão VP2 de IBDV
SEQ ID NO: 10_sequência nucleotidica de VP2 de IBDV
SEQ ID NO: ll_sequência do promotor e intensificador do citomegalovirus murino (IE)
SEQ ID NO: 12 _sequência da proteína VP2 do IBDV
SEQ ID NO: 13 jorimer UL21/22F-GalKF
SEQ ID NO: 14 jorimer UL21/22R-GalKR
SEQ ID NO: 15 jorimer UL26/27F-GalKF
SEQ ID NO: 16 jorimer UL26/27R-GalKR
SEQ ID NO: 17 jorimer UL3.5/4F-GalKF
SEQ ID NO: 18 jorimer UL3.5/4R-GalKR
SEQ ID NO: 19 jorimer UL10/llF-GalKF
SEQ ID NO: 20 jorimer ULI0/1IR-GalKR
SEQ ID NO: 21 jorimer UL40/41F-GalKF
SEQ ID NO: 22 jorimer UL40/4IR-GalKR
SEQ ID NO: 23 jorimer UL50/51F-GalKF
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89/90
SEQ ID NO: 24_primer UL50/51R-GalKR
SEQ ID NO: 25 jorimer forward de MDV-2
SEQ ID NO: 26 jorimer reverse de MDV-2
SEQ ID NO: 27 _sonda de MDV-2
SEQ ID NO: 28 jorimer forward de ovo
SEQ ID NO: 29 _primer reverse de ovo
SEQ ID NO: 30 sonda de ovo
SEQ ID NO: 31_glicoproteina E (gE) de herpesvirus galináceo1
SEQ ID NO: 32_glicoproteina I (gl) de herpesvirus galináceo1
SEQ ID NO: 33_glicoproteina B (gB) de herpesvirus galináceo1
SEQ ID NO: 34_proteina de fusão do vírus da doença de Newcastle
SEQ ID NO: 35_hemaglutinina-neuraminidase (HN) do virus da doença de Newcastle
SEQ ID NO: 36_hemaglutinina
Influenza A
SEQ ID NO: 37_hemaglutinina
Influenza A
SEQ ID NO: 38_hemaglutinina
Influenza A
SEQ ID NO: 39_neuraminidase
Influenza A
do sorotipo H5 (H5 HA) do virus
do sorotipo H7 (H7 HA) do virus
do sorotipo H9 (H9 HA) do virus (NA) do sorotipo H5N1 do virus
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90/90
SEQ ID NO: 40_glicoproteina spike do vírus da bronquite infecciosa

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos, que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário, inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3.
  2. 2. Vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) é um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2).
  3. 3. Vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um antígeno confere proteção contra vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus da gripe aviária (AIV) ou vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV), e em que pelo menos um antígeno é selecionado preferivelmente a partir do grupo que consiste em:
    (a) VP2, VP3, VP4 e VPX de IBDV;
    (b) glicoproteína B, glicoproteína I, glicoproteína D, glicoproteína E e glicoproteína C de ILTV;
    (c) proteína de fusão do vírus da doença de Newcastle (NDV-F) e hemaglutinina e neuraminidase viral (NDV-NH) de NDV;
    (d) hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) do vírus Influenza aviário e
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    2/5 (e) proteína SI ou S2 de IBV.
  4. 4. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, opcionalmente compreendendo um excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
  5. 5. Vacina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor adicional do vírus da doença de Marek (MDV) selecionado a partir do grupo que consiste em vetor do herpesvirus galináceo 3, vetor da cepa Rispens (CVI-988) naturalmente atenuada do MDV-1 e vetor da cepa Fcl26 do herpesvirus de perus (HVT).
  6. 6. Vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vetor adicional de MDV é um vetor de MDV recombinante e em que o vetor do vírus da doença de Marek (MDV) recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário.
  7. 7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o vetor do vírus da doença de Marek recombinante é um segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante, de preferência um vetor da cepa SB-1 do herpesvirus galináceo 3 recombinante, além do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e em que:
    (a) o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos
    Petição 870190103853, de 15/10/2019, pág. 102/114
    3/5 inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do dito segundo vetor do herpesvirus galináceo 3; e (b) o segundo vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica e expressa um antígeno de um patógeno aviário diferente daquele de um ou mais polinucleotídeos heterólogos do primeiro vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante.
  8. 8. Cromossomo artificial bacteriano (BAC) caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificador do vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  9. 9. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso na vacinação de uma espécie aviária contra a doença de Marek e uma ou mais doenças causadas por um ou mais patógenos aviários.
  10. 10. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de que ser para uso na proteção de uma espécie aviária contra sintomas clínicos causados pelo vírus da doença de Marek e sintomas clínicos causados por um ou mais patógenos aviários.
  11. 11. Vacina para uso definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que:
    (a) uma ou mais doenças ou sintomas clínicos são causadas por um ou mais dentre vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de
    Petição 870190103853, de 15/10/2019, pág. 103/114
    4/5
    Newcastle (NDV), virus da gripe aviária (AIV) ou virus da bronquite infecciosa aviária (IBV) e/ou (b) a espécie aviária é aves, preferivelmente galinha, pato, ganso, peru, codorna, pombo-malhado ou pombo comum, mais preferivelmente peru ou galinha.
  12. 12. Vetor de herpesvirus galináceo 3 (GaHV3; MDV-2) caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais marcadores inseridos nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, em que o marcador é de preferência um gene marcador de seleção, um gene repórter ou um código de barra de DNA.
  13. 13. Método para produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) inserir um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam e que expressam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3 e, opcionalmente, (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotídeos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) .
  14. 14. Método para produção de um vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante caracterizado pelo fato de que compreende:
    Petição 870190103853, de 15/10/2019, pág. 104/114
    5/5 (a) prover um vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais marcadores nos loci intergênicos UL3/UL4 e/ou UL21/UL22 do vetor do herpesvirus galináceo 3, (b) substituir um ou mais marcadores por um cassete de expressão compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário e (c) amplificar o vetor do herpesvirus galináceo 3 compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b) .
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende prover um cromossomo artificial bacteriano compreendendo um polinucleotídeo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante e em que o método compreende opcionalmente ainda as etapas de:
    (a) isolar o cromossomo artificial bacteriano compreendendo um polinucleotídeo que codifica o vetor de herpesvirus galináceo 3 recombinante compreendendo um ou mais polinucleotideos heterólogos que codificam pelo menos um antígeno de um patógeno aviário da etapa (b);
    (b) transfectar fibroblastos de embriões de galinhas com o cromossomo artificial bacteriano da etapa (d).
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