BR112019019255A2 - composições e métodos envolvendo moléculas probióticas - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a peptídeos que são derivados de bactérias probióticas que podem ser úteis para a prevenção e/ou tratamento de infecções entéricas ou infecções não entéricas de um sujeito. os peptídeos também podem ser utilizados para reduzir a virulência de infecções entéricas ou infecções não entéricas de um sujeito. a invenção também se relaciona com composições de peptídeos e composições que compreendem fracções de cultura de bactérias probióticas.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS QUE ENVOLVEM MOLÉCULAS PROBIÓTICAS

Campo [001] A presente invenção se refere a moléculas probióticas. Mais especificamente, a presente invenção se refere, em aspectos, a moléculas probióticas, composições que compreendem as moléculas probióticas e vários métodos e usos das moléculas probióticas. Antecedente [002] Um pequeno biopeptideo produzido por espécies de Lactobacillus demonstrou ser eficaz contra a infecção enterohemorrágica de Escherichia coli [Medellin-Pefia et al., 2009]. Foi demonstrado que influencia e regula negativamente a transcrição dos genes de E. coli envolvidos na colonização e na detecção de quorum e foi capaz de impedir a adesão da E. coli ao hospedeiro de células epiteliais [Medellin-Pefia et al., 2009] . Foi demonstrado que o biopeptideo influenciou o sistema de secreção de E. coli tipo III (T3SS) e foi capaz de interferir no sistema de sinalização de detecção de quorum (QS), resultando em uma regulação negativa dos genes de virulência [MedellinPefia et al., 2007, Medellin-Pefia e Griffiths, 2009].

[003] A Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2009/155711 descreve moléculas isoladas e caracterizadas derivadas de bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ou Bifidobacterium para uso em composições e métodos para o tratamento e/ou prevenção de infecção por bactérias patogênicas nocivas, tais como Salmonella ou E. coli. As moléculas isoladas também podem ser utilizadas em produtos alimentares nutricionais ou médicos que fornecem

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2/65 probióticos ao trato gastrointestinal de um mamífero.

[004] A Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2015/021530 descreve moléculas derivadas de bactérias probióticas que são fornecidas para uso em composições e métodos para o tratamento e/ou prevenção de infecção por vírus patogênicos. As moléculas isoladas também podem ser utilizadas em produtos alimentares nutricionais ou médicos que fornecem probióticos ao trato gastrointestinal de um mamífero.

[005] Há necessidade de terapias alternativas para superar ou mitigar pelo menos algumas das deficiências da técnica anterior e/ou fornecer uma alternativa útil. Descrição dos Desenhos [006] A presente invenção será ainda compreendida a partir da descrição a seguir, com referência às Figuras.

[007] A Figura 1 mostra um ensaio de toxicidade em células de lactato desidrogenase. Curva de resposta à dose da inibição da toxicidade celular com sobrenadante livre de células. Barras de erro representam desvio padrão.

[008] A Figura 2 mostra um ensaio de toxicidade em células de lactato desidrogenase. Curva de resposta à dose da inibição da toxicidade celular com sobrenadante livre de células. Barras de erro representam desvio padrão. Sumário [009] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos MALPPK, em que o peptídeo possui menos de 19 resíduos de aminoácidos.

[010] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos MALPPK.

[011] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptídeo

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3/65 compreendendo a sequência de aminoácidos CVLPPK, em que o peptideo compreende menos de 68 residues de aminoácidos.

[012] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo que consiste na sequência de aminoácidos CVLPPK.

[013] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo compreendendo a sequência de aminoácidos HLLPLP, em que o peptideo compreende menos de 9 residues de aminoácidos.

[014] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo que consiste na sequência de aminoácidos HLLPLP.

[015] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo compreendendo a sequência XX [L ou I]PPK, em que cada X designa independentemente um aminoácido hidrofóbico, em que o peptideo possui menos de 19 residues de aminoácidos.

[016] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo que consiste na sequência XX [L ou I]PPK, em que cada X designa independentemente um aminoácido hidrofóbico.

[017] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo que consiste na sequência XiX2[L ou I]PPK, em que Xi é selecionado dentre N, C, Q, M, S e T e em que X2 é selecionado entre A, I, L e V.

[018] De acordo com um aspecto, é fornecido um peptideo que compreende ou consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste em LPVPK, ALPK, EVLNCLALPK, LPLP, HLLPLPL, YVPEPF, KYVPEPF e EMPFKPYPVEPF, em que o peptideo compreende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 residues de aminoácidos [019] Em um aspecto, o peptideo é derivado de uma bactéria probiótica selecionada dentre Lactobacillus,

Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus e combinações das mesmas.

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4/65 [020] Em um aspecto, Lactobacillus é selecionada dentre Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus e Lactobacillus plantarum.

[021] Em um aspecto, Lactococcus é Lactococcus lactis.

[022] Em um aspecto, Bifidobacterium é selecionada dentre Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium crudilactis e misturas das mesmas.

[023] Em um aspecto, Streptococcus é Streptococcus thermophilus .

[024] Em um aspecto, o peptídeo é combinado com um ou mais antivirais, fontes de açúcar, produtos alimentares comestíveis, suplementos nutricionais e líquidos ingeríveis.

[025] Em um aspecto, o peptídeo é concentrado a partir de um sobrenadante livre de células ou fração do mesmo.

[02 6] Em um aspecto, o peptídeo é fornecido como uma fração de cultura seca, tal como liofilizada ou seca por pulverização.

[027] Em um aspecto, a fração de cultura seca é um sobrenadante livre de células.

[028] De acordo com um aspecto, é fornecida uma composição compreendendo o peptídeo aqui descrito.

[02 9] Em um aspecto, a composição é um produto alimentício, bebida, produto de saúde, medicamento ou suplemento nutricional.

[030] Em um aspecto, a composição compreende as bactérias probióticas vivas das quais os peptídeos são derivados.

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5/65 [031] Em um aspecto, a composição compreende as bactérias probióticas vivas que não sejam as bactérias das quais os peptideos são derivados.

[032] Em um aspecto, os peptideos na composição são purificados.

[033] De acordo com um aspecto, é fornecido um método de tratamento e/ou prevenção de uma infecção em um individuo e/ou para reduzir a virulência de uma infecção em um individuo, o método compreendendo administrar o peptideo ou a composição aqui descrita a um individuo com necessidade do mesmo.

[034] Em um aspecto, a infecção é uma infecção entérica.

[035] Em um aspecto, a infecção é uma infecção não entérica.

[036] Em um aspecto, a infecção é selecionada do grupo que consiste em uma infecção do trato urinário, uma infecção vaginal, uma infecção do trato respiratório, uma infecção no estômago, uma infecção produtora de biofilme, mastite, uma infecção na pele e uma infecção oral.

[037] De acordo com um aspecto, é fornecido um método para reduzir a resistência a antibióticos, compreendendo administrar os peptideos aqui descritos a um individuo com necessidade do mesmo.

[038] Em um aspecto, o método é para reduzir a resistência aos antibióticos da MRS.

[039] De acordo com um aspecto, é fornecido um método de tratamento de MRS, compreendendo administrar os peptideos aqui descritos a um individuo com necessidade do mesmo.

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6/65 [040] De acordo com um aspecto, é fornecido um método para prevenir ou interromper e/ou penetrar biofilmes, compreendendo administrar os peptídeos aqui descritos.

[041] De acordo com um aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma ferida, compreendendo administrar os peptídeos aqui descritos.

[042] De acordo com um aspecto, é fornecido um método para reduzir a ligação de um patógeno não entérico ao tecido de um indivíduo, compreendendo administrar os peptídeos aqui descritos.

[043] De acordo com um aspecto, é fornecido um objeto inerte compreendendo os peptídeos aqui descritos.

[044] Em um aspecto, o objeto inerte é um stent, cateter ou curativo que compreende as moléculas probióticas, que são liberadas a partir do objeto durante um período de tempo.

[045] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve-se entender, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicam modalidades da invenção, são dados apenas a título ilustrativo, uma vez que várias mudanças e modificações dentro da essência e do escopo da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica a partir da descrição detalhada. Descrição detalhada [046] Moléculas probióticas foram descritas para uso no tratamento de infecções gastrointestinais. Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que as moléculas descritas nas Publicações Internacionais de Pedido de

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Patente Nos. WO 2009/155711 e WO 2015/021530 interfiram com o sistema de detecção de quorum (QS) dos patógenos do sistema de secreção de tipo III (T3SS) e trabalhos anteriores mostraram que as moléculas probióticas podem causar uma regulação negativa dos genes de virulência para uma variedade de patógenos entéricos. O extrato livre de células de uma cepa de L acidophilus foi capaz de interferir com a detecção de quorum no Clostridium difficile e foi capaz de sub-regular os genes de virulência por C. difficile [Yun et al., 2014] . Extratos livres de células de cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium inibiram o crescimento de Campylobacter jejuni e o promotor flaA sigma 28 com regulação negativa e foram capazes de regular negativamente a expressão dos genes ciaB e flaA em Campylobactor jejuni [Ding et al., 2005, Mundi et al. 2013] . Verificou-se também que as moléculas probióticas produzidas por Lactobacillus afetam a virulência de Salmonella e demonstram principalmente genes de virulência envolvidos no T3SS [Sharma 2014] . Um ensaio de campo realizado em 2015 testou as moléculas probióticas in vivo com leitões desmamados e mostrou ter um efeito significativo na diminuição da gravidade e dos casos de diarréia [University of Guelph/MicroSintesis, 2015] .

[047] Verificou-se agora que esse modo de ação também é eficaz na regulação negativa dos efeitos dos genes de virulência que são regulados pela detecção de quorum em outros tipos de patógenos e infecções, e não apenas patógenos entéricos. Além disso, foram identificados novos peptideos que também são eficazes no tratamento e/ou prevenção de infecções entéricas ou não entéricas e/ou na

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8/65 redução da virulência de tais infecções. Além disso, esses peptideos em aspectos são capazes de superar a resistência aos medicamentos pelo menos em parte; em outros aspectos, são capazes de reduzir a resistência aos medicamentos; em outros aspectos, são capazes de tratar e/ou prevenir e/ou reduzir a virulência de infecções causadas por bactérias resistentes a medicamentos e em outros aspectos, são capazes de potencializar os efeitos de antibióticos em bactérias e/ou bactérias resistentes a medicamentos. Definições [048] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa versada na técnica a qual esta invenção pertence. Ver, por exemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2^a ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, Nova Iorque, 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989), cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

[049] Por derivado, entende-se que as moléculas probióticas são produzidas direta ou indiretamente pelas bactérias probióticas. Por exemplo, as bactérias probióticas podem secretar as moléculas probióticas diretamente no meio de cultura. Em outros aspectos, as moléculas podem ser formadas indiretamente dentro do meio de cultura, por exemplo, sendo clivadas a partir de peptideos mais longos.

[050] Variantes das sequências descritas neste

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9/65 documento são sequências biologicamente ativas que possuem uma sequência peptidica que difere da sequência de uma sequência nativa ou do tipo selvagem, em virtude de uma inserção, deleção, modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos dentro da sequência nativa. Tais variantes geralmente têm menos de 100% de identidade de sequência com uma sequência nativa. Normalmente, no entanto, uma variante biologicamente ativa terá uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com a sequência de uma sequência de ocorrência natural correspondente, tipicamente pelo menos cerca de 75%, mais tipicamente pelo menos cerca de 80%, ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 85%, ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 90% e ainda mais tipicamente de pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Os fragmentos de nucleotideos variantes de qualquer comprimento que retêm uma atividade biológica da sequência nativa correspondente. As variantes também incluem sequências em que um ou mais aminoácidos são adicionados em uma das extremidades ou dentro de uma sequência nativa. As variantes também incluem sequências em que um número de aminoácidos é excluido e opcionalmente substituído por um ou mais aminoácidos diferentes.

[051] Percentual de identidade de sequência é aqui definida como a porcentagem de residues de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos residues na sequência de interesse após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhuma substituição conservadora como parte

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10/65 da identidade da sequência. Nenhuma das extensões 5', 3' ou extensões internas, deleções ou inserções na sequência candidata deve ser interpretada como afetando a identidade ou homologia da sequência. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica, tais como BLAST.

[052] Ativo ou atividade para os fins deste documento se refere a uma atividade biológica de uma molécula probiótica nativa ou de ocorrência natural, em que a atividade biológica se refere a uma função biológica (inibitória ou estimulatória) causada por uma molécula probiótica nativa ou de ocorrência natural.

[053] Assim, biologicamente ativo ou atividade biológica quando usado em conjunto com as moléculas probióticas aqui descritas se refere à molécula probiótica ou sequência de aminoácidos que exibe ou compartilha uma função efetora da molécula ou sequência probiótica nativa. Por exemplo, as moléculas probióticas descritas neste documento têm a atividade biológica de prevenir, inibir ou tratar uma infecção em um animal.

[054] Biologicamente ativo ou atividade biológica quando usado em conjunto com sequências variantes significa que as sequências variantes exibem ou compartilham uma função efetora da sequência de origem. A atividade biológica da sequência variante pode ser aumentada, diminuída ou no mesmo nível em comparação com a sequência de origem.

[055] Isolado se refere a uma molécula que foi purificada a partir de sua fonte ou foi preparada por métodos recombinantes ou sintéticos e purificada. As

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11/65 moléculas probióticas purificadas estão substancialmente livres de outros aminoácidos.

[056] Substancialmente livre neste documento significa menos que cerca de 5%, tipicamente menos que cerca de 2%, mais tipicamente menos que cerca de 1%, ainda mais tipicamente menos que cerca de 0,5%, mais tipicamente menos que cerca de 0,1% de contaminação com outros aminoácidos de origem. Uma composição de molécula probiótica essencialmente pura significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% em peso da molécula probiótica, com base no peso total da composição, tipicamente pelo menos cerca de 95% em peso, mais tipicamente pelo menos cerca de 90% em peso, ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 95% em peso e ainda mais tipicamente pelo menos cerca de 99% em peso de nucleotídeo, com base no peso total da composição.

[057] Como aqui utilizado, tratamento ou terapia é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os fins aqui descritos, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (ou seja, não piorando) da doença, atraso ou lentidão na progressão, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. Tratamento e terapia também podem significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não estiver recebendo tratamento ou terapia. Assim, tratamento ou terapia é uma intervenção realizada com a intenção de alterar a patologia de um distúrbio. Especificamente, o tratamento ou terapia pode

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12/65 impedir diretamente, desacelerar ou diminuir a patologia de uma doença ou distúrbio, tais como uma infecção, ou pode tornar a infecção mais suscetível ao tratamento ou terapia por outros agentes terapêuticos.

[058] Os termos quantidade terapeuticamente eficaz, quantidade eficaz ou quantidade suficiente significam uma quantidade suficiente, quando administrada a um indivíduo, incluindo um mamífero, por exemplo, um humano, para alcançar um resultado desejado, por exemplo, uma quantidade eficaz para tratar uma infecção. Quantidades eficazes das moléculas probióticas descritas aqui podem variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo. Os regimes de dosagem ou

tratamento podem ser	ajustados para	fornecer a	resposta
terapêutica ideal,	tais como é	entendido	por um
especialista.
[059] Além disso,	um regime de	tratamento	de um

indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz pode consistir em uma única administração ou, alternativamente, compreender uma série de aplicações. A duração do período de tratamento depende de vários fatores, tais como a gravidade e/ou o local da doença, a idade do indivíduo, a concentração do agente, a capacidade de resposta do paciente ao agente ou uma combinação dos mesmos. Também será reconhecido que a dosagem eficaz do agente utilizado para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um determinado regime de tratamento. Alterações na dosagem podem resultar e se tornar aparentes por ensaios de diagnóstico padrão conhecidos na técnica. As moléculas probióticas descritas neste documento podem, em aspectos,

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13/65 ser administradas antes, durante ou após o tratamento com terapias convencionais para a doença ou distúrbio em questão, tais como uma infecção.

[060] O termo indivíduo, conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer membro do reino animal, incluindo pássaros, peixes, invertebrados, anfíbios, mamíferos e répteis. Normalmente, o indivíduo é um vertebrado humano ou não humano. Os vertebrados não humanos incluem animais de criação, animais de companhia e animais de laboratório. Indivíduos não humanos também incluem especificamente primatas não humanos, bem como roedores. Os indivíduos não humanos também incluem especificamente, sem limitação, aves domésticas, galinhas, cavalos, vacas, porcos, cabras, cães, gatos, porquinhos-da-índia, hamsters, martas, visões, coelhos, crustáceos e moluscos. Tipicamente, o indivíduo é aves domésticas ou mamíferos. O termo mamífero se refere a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, outros primatas superiores, animais domésticos e de fazenda e zoológico, esportes ou animais de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. Normalmente, o mamífero é humano.

[061] A administração em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem.

[062] O termo farmaceuticamente aceitável significa que o composto ou combinação de compostos é compatível com os demais ingredientes de uma formulação para uso farmacêutico e que geralmente é seguro para administrar a seres humanos de acordo com os padrões governamentais

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14/65 estabelecidos, incluindo os promulgados pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos.

[063] Veículos, tais como aqui utilizado, incluem veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou indivíduo a ele exposto nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o veículo farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa tamponada com pH. Exemplos de veículos farmacologicamente aceitáveis incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose e dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol e sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS™.

[064] Um lipossoma é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para a entrega de um agente, tais como as moléculas probióticas aqui descritas, a um indivíduo, tais como um mamífero. Os componentes do lipossoma são geralmente dispostos em uma formação de bicamada, semelhante ao arranjo lipídico das membranas biológicas.

[065] No entendimento do escopo da presente invenção, os artigos um, uma, o/a e referido(a) pretendem

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15/65 significar que há um ou mais dos elementos. Além disso, o termo compreendendo e seus derivados, conforme usado aqui, pretende ser termo aberto que especifica a presença dos recursos, elementos, componentes, grupos, números inteiros e/ou etapas declarados, mas não excluem a presença de outros recursos, elementos, componentes, grupos, números inteiros e/ou etapas não declarados. 0 precedente também se aplica a palavras com significados semelhantes, tais como os termos incluindo, tendo e seus derivados.

[066] Será entendido que quaisquer aspectos descritos como compreendendo certos componentes também podem consistir em ou consistir essencialmente em, em que consistindo em tem um significado restrito ou fechado e consistindo essencialmente em significa incluir os componentes especificados, mas excluindo outros componentes, exceto materiais presentes como impurezas, materiais inevitáveis presentes como resultado de processos usados para fornecer os componentes e componentes adicionados para uma finalidade diferente da obtenção do efeito técnico da invenção. Por exemplo, uma composição definida usando a frase consistindo essencialmente em abrange qualquer aditivo, excipiente, diluente, transportador e veículo farmaceuticamente aceitável conhecido. Tipicamente, uma composição consistindo essencialmente em um conjunto de componentes compreenderá menos de 5% em peso, tipicamente menos de 3% em peso, mais tipicamente menos de 1% em peso de componentes não especificados.

[067] Será entendido que qualquer componente aqui definido como sendo incluído pode ser explicitamente

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16/65 excluído da invenção reivindicada por meio de ressalva ou limitação negativa. Por exemplo, em aspectos, infecções entéricas, tais como infecções bacterianas entéricas e/ou virais entéricas, são explicitamente excluídas das composições e métodos aqui descritos. Em outros aspectos, as moléculas aqui descritas não são bacteriocinas.

[068] Além disso, todos os intervalos dados neste documento incluem o fim dos intervalos e também quaisquer pontos intermediários, explicitamente declarados ou não.

[069] Finalmente, termos de grau como substancialmente, cerca de e aproximadamente, conforme aqui utilizados, significam uma quantidade razoável de desvio do termo modificado, de modo que o resultado final não seja significativamente alterado. Esses termos de grau devem ser interpretados como incluindo um desvio de pelo menos ± 5% do termo modificado se esse desvio não negar o significado da palavra que ele modifica. Moléculas Probióticas e Composições que compreendem Moléculas Probióticas [070] A presente invenção fornece moléculas probióticas isoladas de bactérias probióticas e frações de cultura adicionais, tais como um sobrenadante livre de células, das bactérias que podem minimizar, inibir, tratar e/ou prevenir a infecção em um indivíduo, geralmente infecções não entéricas. Em particular, a(s) molécula(s) pode(m) ser derivada(s) de uma ou mais espécies bacterianas selecionadas do grupo constituído pelos gêneros Aerococcus, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Fusobactehum, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Melissococcus, Micrococcus, Pedioc,

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Peptostrepococcus, Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus e Weissella. As espécies bacterianas de ácido láctico probioticamente ativo específicas incluem Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei subsp. paracasei, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Lactocoocus lactis subsp. cremoris, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus salivarius e Streptococcus thermophilus. Outros exemplos compreendem espécies de Bifidobacterium probioticamente ativas, incluindo Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e Bifidobacterium breve.

[071] Outras espécies bacterianas podem ser selecionadas do grupo que consiste em Paenibacillus lautus probioticamente ativo, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Micrococcus varians, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Pediococococcus carnophylus, tais como o microrganismo Lactobacillus casei ssp. cepa

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18/65 rhamnosus LC-705, DSM 7061 descrita na publicação No. EP 0576780, e descrita como Lactobacillus rhamnosus LC-705, DSM 7061 em US 5908646, isoladamente ou em combinação com uma bactéria do gênero Propionibacterium ou outra cepa de Lactobacillus casei.

[072] As cepas bacterianas probióticas específicas que podem produzir as moléculas aqui descritas são, em aspectos, selecionadas do grupo de cepas constituído por: Bifidobacterium animalis cepa DSM 15954, Bifidobacterium longum subsp. infantis cepa DSM 15953, Bifidobacterium longum subsp. longum cepa DSM 15955, Enterococcus faecium cepa DSM 15958, Lactobacillus acidophilus cepa DSM 13241 (La-5), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cepa DSM 15956, Lactobacillus helveticus cepa DSM 14998, Lactobacillus helveticus cepa DSM 14997, Lactococcus lactis cepa DSM 14797, Streptococcus thermophilus cepa DSM15957, Lactobacillus fermentum cepa ATCC55845 e Lactobacillus rhamnosus cepa ATCC55826.

[073] Em aspectos típicos, as moléculas são derivadas de Lactobacillus acidophilus (La-5), bem como de cepas de Pediococcus, cepas de Bifidobacterium, tais como mas não limitadas a Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium crudilactis e também de Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis e Streptococcus thermophilus.

[074] As moléculas probióticas são agora mostradas como eficazes contra patógenos não entéricos e foram identificadas novas moléculas que são eficazes contra

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19/65 patógenos entéricos e não entéricos. As moléculas de probiótico aqui descritas incluem as moléculas descritas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 2009/155711 e WO 2015/021530, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[075] Em aspectos, as moléculas probióticas são pequenas moléculas, tipicamente proteicas, resistentes à temperatura (podem ser aquecidas, congeladas e descongeladas e ainda exibem atividade), são estáveis por longos periodos de tempo congelados (mais de dois anos), podem ser produzidas prontamente em grandes volumes (por exemplo, cerca de 2 mg/L) e podem ser secos por métodos como liofilização e/ou secagem por pulverização. Tipicamente, as moléculas são peptideos.

[076] As moléculas podem ser incorporadas em uma variedade de substâncias para administração a um indivíduo, tais como qualquer tipo de animal e humano. Por exemplo, as moléculas podem ser incorporadas em qualquer tipo de produto alimentício, suplemento nutricional ou bebida para consumo animal ou humano.

[077] Como terapêutica, as moléculas probióticas aqui descritas podem ser administradas de maneira a um animal ou humano para o tratamento eficaz da infecção. Como terapêutico ou profilático, o tratamento pode ser em conjunto com outras terapias, conforme desejado. Em outra modalidade, as moléculas probióticas descritas neste documento podem ser usadas em composições e em métodos além do uso de bactérias probióticas inteiras. Alternativamente, bactérias probióticas inteiras podem ser usadas sozinhas, desde que as bactérias sejam cultivadas e/ou usadas de modo

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20/65 que as moléculas sejam produzidas no meio de cultura em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[078] Em aspectos, as moléculas probióticas são derivadas de bactérias probióticas, tais como Lactobacillus acidophilus (La-5), em que a molécula compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: MALPPK, CVLPPK, HLLPLP e LKPTPEGD. Normalmente, a molécula compreende uma ou mais das seguintes sequências de aminoácidos: MALPPK, CVLPPK, HLLPLP e LKPTPEGD. É entendido por uma pessoa versada na técnica que essas sequências podem ser alteradas por deleção, substituição ou inserção, desde que a atividade das moléculas não seja substancialmente reduzida. Por exemplo, a sequência pode compreender XX [L ou I]PPK, em que X designa um aminoácido hidrofóbico. Alternativamente, a sequência pode compreender X1X2 [L ou I]PPK, em que Xi é selecionado dentre N, C, Q, M, S e T e em que X2 é selecionado entre A, I, L e V.

[079] As sequências podem ainda ter inserções, substituições ou deleções de um ou mais dos residues de aminoácidos. Além disso, as moléculas aqui descritas podem ainda ser alteradas com glicosilação, desglicosilação, sais orgânicos e inorgânicos e modificadas covalentemente. Também estão incluídas moléculas modificadas para aumentar a meia-vida in vivo, por exemplo, PEGuilada. Modificações possíveis, mas não limitativas, das moléculas aqui descritas incluem modificações compreendendo combinações de substituições de aminoácidos juntamente com uma deleção de um ou mais aminoácidos ou adição de um ou mais aminoácidos.

[080] Em um aspecto generalizado, as moléculas aqui descritas podem ser fornecidas em uma quantidade

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21/65 terapeuticamente eficaz sozinha ou dentro de uma composição e em quantidades que podem variar de acordo com fatores como o estado de inf ecção/saúde, idade, sexo e peso do receptor. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal e podem ficar a critério do médico assistente ou veterinário. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou em intervalos periódicos e/ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. A quantidade da molécula para administração dependerá da via de administração, do tempo de administração e pode variar de acordo com as respostas individuais do indivíduo. As vias de administração adequadas são, por exemplo, através da via tópica, oral, retal ou parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular). Além disso, as moléculas podem ser incorporadas nos polímeros permitindo a liberação sustentada, os polímeros sendo implantados nas

proximidades de	onde a entrega	é desejada, por	exemplo,	no
local de uma	infecção, ou	os	polímeros	podem	ser
implantados, por exemplo, por	via	subcutânea	ou por	via
intramuscular	ou entregues	por	via intravenosa	ou
intraperitoneal	para resultar	na	entrega sistêmica	das
moléculas aqui	descritas.
[081] As	moléculas aqui		descritas	podem	ser

administradas na forma de, por exemplo, um comprimido, uma cápsula, uma pastilha, um selo, uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um pó, um aerossol, um supositório, um spray, uma pastilha, pomada, creme, pasta, espuma, gel, tampão, pessário, grânulo, bolus, enxaguatório bucal ou adesivo

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22/65 transdérmico. As moléculas podem ser administradas como um sobrenadante livre de células, que, em alguns aspectos, é um concentrado de sobrenadante livre de células. 0 concentrado pode estar na forma liquida ou em pó.

[082] As formulações incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, inalação, tópica (incluindo dérmica, transdérmica, bucal e sublingual), vaginal, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraocular, intratraqueal e epidural), intramamária ou por inalação. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de associar o ingrediente ativo a um veiculo ou excipientes farmacêuticos. Em geral, as formulações são preparadas associando uniformemente e intimamente o ingrediente ativo a veiculos liquidos ou veiculos sólidos finamente divididos ou ambos e, em seguida, se necessário, moldando o produto.

[083] As formulações adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, hóstias ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um liquido aquoso ou em um liquido não aquoso; ou como uma emulsão liquida de óleo em água ou emulsão de água em óleo, etc.

[084] Um comprimido pode ser fabricado por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos comprimidos podem ser preparados comprimindo em uma máquina adequada, as moléculas aqui

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23/65 descritas em uma forma de fluxo livre, tais como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, ativo na superfície e/ou agente dispersante. Os comprimidos moldados podem ser feitos moldando, em uma máquina adequada, uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem opcionalmente ser revestidos ou ranhurados e podem ser formulados de modo a proporcionar uma liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nos mesmos.

[085] As formulações adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas que compreendem os ingredientes em uma base aromatizada, tipicamente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tais como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e colutórios compreendendo o ingrediente a ser administrado em um veiculo liquido adequado.

[086] As formulações adequadas para administração tópica na pele podem ser apresentadas como pomadas, cremes, géis ou pastas compreendendo o ingrediente a ser administrado em um veiculo farmacêutico aceitável. Em uma modalidade, o sistema de administração tópica é um adesivo transdérmico contendo o ingrediente a ser administrado.

[087] As formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato.

[088] As formulações adequadas para administração nasal, em que o veiculo é um sólido, incluem um pó grosso

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24/65 com um tamanho de partícula, por exemplo, na faixa de 20 a 500 microns, o qual é administrado por inalação rápida através da passagem nasal de um recipiente do pó mantido fechado até o nariz. Formulações adequadas, em que o veículo é um líquido, para administração, tais como, por exemplo, um spray nasal ou gotas nasais, incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo.

[089] As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo, além do ingrediente ativo, ingredientes como veículos, tais como são conhecidos na técnica como apropriados.

[090] As formulações adequadas para inalação podem ser apresentadas na forma de vapores, poeiras, pós ou formulações de pulverização contendo, além do ingrediente ativo, ingredientes, tais como veículos que são conhecidos na técnica como apropriados.

[091] As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações adequadas para administração parenteral incluem preparações em partículas dos agentes antiangiogênicos, incluindo, entre outros, partículas dimensionadas de baixo micron ou nanômetro (por exemplo, menos de 2000 nanômetros, tipicamente menos de 1000 nanômetros, mais tipicamente

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25/65 menos de 500 nanometres, em média de seção transversal), partículas que são compostas pelas moléculas descritas aqui isoladamente ou em combinação com ingredientes acessórios ou em um polimero para liberação sustentada. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em condições liofilizadas, exigindo apenas a adição de um veiculo liquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis dos tipos descritos anteriormente.

[092] As composições compreendendo as moléculas aqui descritas podem compreender cerca de 0,00001% a cerca de 99% em peso do ativo e qualquer intervalo entre eles. Por exemplo, doses tipicas podem compreender de cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg das moléculas descritas aqui por dose de

300 mg, tais	como cerca de	0,	5	μg, cerca	de	1	μg, cerca	de
2 μg, cerca	de 3 μg, cerca	de	4	μg, cerca	de	5	μg, cerca	de
6 μg, cerca	de 7 μg, cerca	de	8	μg, cerca	de	9	μg, cerca	de
10 μg, cerca	de 25 μg, cerca	de	50 μg ou cerca	de 75 μυ	por
dose de 300	mg, tais como	de	cerca de 0,1	μυ	a	cerca de	10

μg, ou de cerca de 1 μg a cerca de 5 μg ou de cerca de 1 μg a cerca de 2 μg por dose de 300 mg (e todos os incrementos e porcentagens relacionados em peso).

[093] As moléculas probióticas podem ser administradas por um periodo de horas, dias, semanas ou meses, dependendo de vários fatores, incluindo a gravidade da infecção a ser tratada, se uma recorrência da infecção é considerada provável ou para prevenir a infecção, etc. A administração

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26/65 pode ser constante, por exemplo, infusão constante durante um período de horas, dias, semanas, meses, etc. Alternativamente, a administração pode ser intermitente, por exemplo, as moléculas podem ser administradas uma vez ao dia durante um período de dias, uma vez que hora por um período de horas ou qualquer outro cronograma que considere adequado.

[094] As composições aqui descritas podem ser preparadas por métodos conhecidos per se para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que podem ser administradas a indivíduos, de modo que uma quantidade eficaz da substância ativa seja combinada em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados são descritos, por exemplo, no Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aidershot, Inglaterra (1995)). Nesta base, as composições incluem, embora não exclusivamente, soluções das substâncias em associação com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e podem estar contidas em soluções tamponadas com um pH adequado e/ou ser iso-osmóticas com fluidos fisiológicos. A este respeito, pode ser feita referência à Patente No. US 5.843.456 (a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

[095] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos das pessoas versadas na técnica e incluem, por exemplo, solução salina estéril, lactose, sacarose, fosfato de cálcio, gelatina, dextrina, ágar, pectina, óleo de amendoim, azeite, óleo de gergelim e água. Além disso, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais

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27/65 estabilizadores, tais como, por exemplo, carboidratos, incluindo sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrina e glicose, proteínas, tais como albumina ou caseína e tampões, tais como fosfatos alcalinos.

[096] Em outro aspecto não limitativo, a administração das moléculas probióticas pode ser realizada por qualquer método que possa introduzir as moléculas no trato digestivo, tais como oral ou retal, após o qual as moléculas probióticas entram na corrente sanguínea. As bactérias que produzem as moléculas probióticas e/ou as moléculas probióticas isoladas podem ser misturadas com um veículo e aplicadas a alimentos líquidos ou sólidos ou a água potável. O material transportador não deve ser tóxico para o animal. As bactérias que produzem as moléculas probióticas e/ou as moléculas probióticas isoladas também podem ser formuladas em uma composição fornecida como uma pasta inoculante para ser diretamente injetada na boca de um animal. A formulação pode incluir ingredientes adicionados para melhorar a palatabilidade, melhorar o prazo de validade, conferir benefícios nutricionais e similares. Se uma dose reproduzível e medida for desejada, as moléculas podem ser administradas por uma cânula do rúmen, tais como aqui descrito. A quantidade de moléculas isoladas de bactérias probióticas a serem administradas é governada por fatores que afetam a eficácia. Ao monitorar a infecção antes, durante e após a administração das moléculas probióticas a partir de bactérias probióticas, as pessoas versadas na técnica podem determinar prontamente o nível de dosagem necessário para reduzir a quantidade de infecção transportada pelos animais. As moléculas de uma ou

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28/65 mais cepas de bactérias probióticas podem ser administradas juntas. Uma combinação de cepas pode ser vantajosa porque animais individuais podem diferir quanto à cepa que é mais persistente em um determinado indivíduo.

[097] Os métodos para administrar as moléculas probióticas são essencialmente os mesmos, seja para prevenção ou tratamento. Portanto, a necessidade de primeiro determinar se uma infecção patogênica está sendo realizada pelos animais é removida. Ao administrar rotineiramente uma dose eficaz a todos os animais de um rebanho, o risco de contaminação por uma infecção patogênica pode ser substancialmente reduzido ou eliminado por uma combinação de prevenção e tratamento.

[098] É entendido por uma pessoa versada na técnica que as moléculas isoladas e frações de cultura que as contêm, podem ser usadas em conjunto com terapias conhecidas para prevenção e/ou tratamento de infecções em um indivíduo. Entende-se também que composições das moléculas probióticas aqui descritas, isoladas ou em uma fração de cultura ou em conjunto com bactérias probióticas, também podem ser usadas em conjunto (formuladas com) com uma fonte de açúcar, tais como, por exemplo, glicose em quantidades de até a cerca de 0,01% a cerca de 0,1% ou mais em peso da composição.

[099] Entende-se também que, embora as composições descritas aqui possam ser diretamente ingeridas ou usadas como aditivo em conjunto com alimentos, será reconhecido que elas podem ser incorporadas a uma variedade de alimentos e bebidas, incluindo, entre outros, iogurtes, sorvetes, queijos, produtos de panificação, tais como pão, biscoitos e bolos, laticínios e substitutos de produtos

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29/65 lácteos, produtos de confeitaria, composições de óleos comestíveis, pastas para barra, cereais matinais, sucos, carnes, produtos e similares. Dentro do escopo do termo alimentos devem ser incluídos, em particular, alimentos que provavelmente serão classificados como alimentos funcionais, ou seja, alimentos com aparência semelhante aos alimentos convencionais e destinados a serem consumidos como parte de uma dieta normal, mas tenham sido modificados para papéis fisiológicos além do fornecimento de nutrientes simples. Da mesma forma, as composições aqui descritas podem ser apresentadas em formas de dosagem, tais como em uma cápsula ou em um comprimido seco e comprimido ou em supositório retal ou vaginal, ou como aerossol ou inalador. Novamente, as quantidades das moléculas probióticas ativas variarão dependendo do alimento ou bebida em particular e podem conter qualquer quantidade até cerca de 100% do produto, especialmente quando formuladas como cápsulas/ comprimidos ingeríveis.

[100] Também é entendido por uma pessoa versada na técnica que as moléculas aqui descritas, isoladas ou fornecidas como dentro de uma fração de cultura, podem ser combinadas com o uso de bactérias probióticas em métodos de tratamento ou para suplementação nutricional. Em alguns aspectos particulares, as moléculas aqui descritas podem ser combinadas com bactérias probióticas vivas das espécies das quais as moléculas são derivadas. Em outros aspectos, estas espécies bacterianas podem ser excluídas das composições. Em outros aspectos, as moléculas aqui descritas podem ser combinadas com bactérias probióticas vivas de uma espécie que não produz as moléculas.

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Métodos de Uso [101] Inesperadamente, verificou-se que as moléculas probióticas descritas neste documento, sejam administradas na forma isolada ou na forma de bactérias das quais as moléculas probióticas são derivadas, são úteis no tratamento de infecções, em alguns aspectos de infecções entéricas ou não entéricas, uma série de que são especificamente descritas abaixo.

[102] Em alguns aspectos particulares, as moléculas aqui descritas interagem sinergicamente entre si e/ou com antibióticos ou outros agentes anti-infecciosos para tratar e/ou prevenir uma infecção entérica ou não entérica e/ou reduzir a virulência de uma infecção entérica ou não entérica, incluindo redução da resistência a antibióticos e/ou aumento da sensibilidade de um microrganismo patogênico especifico a um tratamento convencional, tais como um antibiótico.

Infecções entéricas [103] Entre as bactérias comumente envolvidas em infecções entéricas estão Escherichia coli, tais como EHEC, Vibrio cholerae, e várias espécies de Salmonella, Shigella e Streptococcuss anaeróbicos. As infecções entéricas são caracterizadas por diarréia, desconforto abdominal, náusea e vômito e anorexia. Uma perda significativa de liquidos e eletrólitos pode resultar de vômitos e diarréia graves.

[104] O uso de certas moléculas probióticas para o tratamento de infecções entéricas, tais como as descritas acima, tanto bacterianas quanto virais, são descritas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 2009/155711 e WO 2015/021530, ambas aqui incorporadas

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31/65 por referência. Agora são identificados peptideos adicionais, tais como MALPPK, CVLPPK e HLLPLP, que também são úteis no tratamento e/ou prevenção de tais infecções. Infecções do trato urinário [105] As infecções do trato urinário (ITU) são uma das infecções bacterianas mais frequentemente adquiridas em seres humanos, sendo a E. coli responsável por 90% de todas as ITUs e afetando cerca de 1,3 milhão de mulheres todos os anos [Marrs et al., 2005] . As cepas de Lactobacillus, que dominam a flora encontrada nas vaginas de mulheres saudáveis, se espalham pelo reto e perineo e formam uma barreira na vagina para bloquear a entrada de uropatógenos. O conceito de aumentar artificialmente o número de lactobacilos por meio de probióticos há muito é teorizado, mas apenas recentemente demonstrou ser eficaz [Reid e Bruce, 2005] . Uma variedade de estudos demonstrou um efeito positivo de cepas probióticas de Lactobacillus usadas no tratamento de ITUs, especificamente na prevenção de ITUs reincidentes [Bruce et al., 1992; Chrisholm, 2015; Delley et al., 2015; Stapleton et al., 2011] . Existe uma forte necessidade de encontrar um tratamento eficaz e não antimicrobiano seguro para infecções recorrentes do trato urinário [Stapleton et al., 2011] .

[10 6] O patógeno de ITU mais comum é E. coli, que possui virulência regulada por QS e E. coli entérica mostrou anteriormente ser menos virulenta quando tratada com as moléculas probióticas aqui descritas [Medellin-Pefia et al., 2007, Medellin-Pefia and Griffiths, 2009, aqui incorporado por referência na sua totalidade]. E. coli uropatogênica (UPEC) tem muitos dos mesmos genes de

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32/65 virulência ativados como E. coli entérica e possui T3SS. Assim, as moléculas probióticas aqui descritas devem ser eficazes na redução da virulência da cepa UPEC [Snyder et al. 2004] . Reid [2000] mostrou que uma cepa de Lactobacillus acidophilus produziu um composto que inibiu significativamente os Enterococcuss uropatogênicos para aderir às células uroepiteliais. Um gene principal observado in vivo para ITU são os genes fim, que são genes de proteínas fimbriais necessários para a ligação à superfície das células uroepiteliais, necessários para a infecção [Snyder et al., 2004] . A regulação desses genes foi testada em uma cepa UPEC para regulação negativa quando expostos às moléculas probióticas aqui descritas para garantir que o biopeptídeo seja eficaz na redução da virulência em uma cepa uropatogênica de E. coli.

[107] Em outros aspectos, as moléculas probióticas aqui descritas podem ser úteis no tratamento de cistite aguda, tais como a causada por E. coli ou S. saprophytics; no tratamento de pielonef rite, tais como a causada por E. coli, Klebsiella, Enterobacter ou Proteus mirabillis; no tratamento de ITU complicada, tais como a causada por E. coli, Enterococci, Klebsiella, Proteus ou P. aeruginosa; ou prostatite, tais como a causada por E. coli, bacilos gramnegativos, Staphylococcus ou Enterococcus.

Vaginose bacteriana [108] Outra infecção comum é a vaginose bacteriana (BV), caracterizada por uma mudança na flora vaginal de uma predominância de lactobacilos protetores para bactérias patogênicas e responsável por até 25% das visitas às clínicas ginecológicas [Barrons e Tassone, 2008] . A BV

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33/65 aumenta o risco de infecção pelo HIV e aumenta o risco de bebês com baixo peso ao nascer e parto prematuro [Reid e Burton, 2002] . As taxas de cura da BV com antibióticos tradicionais são baixas e as infecções recorrem em até 50% das mulheres aos 6 meses [Barrons e Tassone, 2008] . A ingestão diária de cepas de Lactobacillus resultou em uma restauração da flora vaginal normal em pacientes com BV assintomática [Reid e Burton, 2002] . Verificou-se no estudo que o uso de cepas de Lactobacillus isoladamente estava associado a taxas de cura da BV comparáveis àquelas com terapias antibióticas padrão [Barrons e Tassone, 2008] .

[109] Estudos têm demonstrado que o uso de supositórios liofilizados de bactérias probióticas permite uma colonização mais rápida do trato urogenital pelas células probióticas [Barrons e Tassone, 2008; Reid e Bruce, 2006]. Como as moléculas probióticas aqui descritas são resistentes a métodos de secagem, tais como a liofilização, os supositórios liofilizados são um modo viável de administração. Isso tornaria as moléculas probióticas mais prontamente disponíveis no local da infecção.

Infecções respiratórias [110] As infecções respiratórias abrangem uma ampla variedade de infecções (otite, pneumonia, faringite) e patógenos, incluindo cepas comuns como Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus [Nagalingam et al., 2013] . As infecções respiratórias são muito graves, especialmente para bebês e idosos, contribuindo significativamente para a morbimortalidade em todo o mundo. Tratamentos e prevenção alternativos seriam

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34/65 benéficos [Veras de Araujo et al., 2015] .

[111] As infecções do trato respiratório inferior e superior são especificamente contempladas aqui como sendo úteis para o tratamento com as moléculas aqui descritas. Por exemplo, Streptococcus pyogenes, um Streptococcus do grupo A na faringite estreptocócica (garganta inflamada) e/ou outras infecções na garganta podem ser tratadas com as moléculas aqui descritas.

[112] Nagalingam et al. sugerem que a composição do microbioma sinusal está correlacionada com a doença. O microbioma sinusal de pacientes com rinossinusite crônica mostrou uma redução significativa nas populações de bactérias do ácido lático (LAB) em comparação com a de indivíduos saudáveis [Nagalingam et al., 2013]. Eles sugerem ainda que a suplementação de LAB poderia ser usada para proteger as superficies mucosas do trato respiratório contra infecções, semelhante ao caso do trato GI e urogenital [Nagalingam et al., 2013] . Há um grande número de estudos sobre os efeitos de infecções probióticas e respiratórias superiores. Dois exemplos mostraram que, em duas populações muito suscetíveis (bebês e idosos), verificou-se que aquelas suplementadas por via oral com bactérias probióticas apresentavam menos infecções respiratórias superiores (URI) em comparação aos grupos de controle [Maldonado et al., 2012; Guillmard et al., 2010] .

[113] A maioria dos estudos utilizou a ingestão oral de bactérias probióticas, no entanto, os sprays nasais também foram eficazes [Skovberg et al., 2009]. Isso sugere sprays nasais como outro modo de entrega. Isso melhoraria a entrega das bactérias probióticas no local da infecção.

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Infecção por Helicobacter pylori [114] Helicobacter pylori causa gastrite crônica e é responsável pelo desenvolvimento de úlcera péptica, e é considerado um fator de risco no desenvolvimento de neoplasias gástricas, tais como linfomas de tecido linfóide associado a mucosa gástrica e adenocarcinoma gástrico [Wang et al., 2004]. Embora os tratamentos antibióticos existentes sejam eficazes, há preocupações com a resistência antibacteriana. Além disso, esses medicamentos podem ter efeitos colaterais negativos, que muitas vezes levam à interrupção do tratamento. Por essas razões, é desejável investigar tratamentos alternativos [Wang et al., 2004]. Em seu estudo, Wang et al., [2004] constataram que a ingestão de iogurte probiótico contendo cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium foi capaz de suprimir a infecção por H. pylori em humanos [Wang et al., 2004] . Em um estudo mais antigo, verificou-se que o sobrenadante de Lactobacillus acidophilus Lal inibiu o crescimento de Η. pylori in vitro e demonstrou ter um efeito supressor de H. pylori em humanos [Michetti et al., 1999] . Outro estudo de Canducci et al., também mostrou que o L. acidophilus usado sobrenadante da cultura foi capaz de reduzir drasticamente a viabilidade do H. pylori in vitro e in vivo [2000]. Isso sugere fortemente que os bioativos probióticos produzidos por cepas de Lactobacillus no meio gasto livre de células podem ter um efeito benéfico no tratamento de uma infecção por H. pylori.

Infecção por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) [115] O Staphylococcus aureus resistente à meticilina

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36/65 (MRSA) é responsável por muitas infecções fatais, incluindo pneumonia, sepse, oseomielite e endocardite. Os pacientes são tipicamente colonizados por longos periodos de tempo, com 50% dos pacientes ainda colonizados após um ano [Karska-Wysocki et al., 2010]. O MRSA é um patógeno produtor de biofilme capaz de aderir a muitas superficies. Este estudo demonstrou que Lactobacillus acidophilus foi capaz de eliminar 99% das células MRSA após uma incubação de 24 horas. O estudo vincula o efeito às bactérias do ácido lático produzindo peptideos bioativos que inibem a produção de biofilme [Karska-Wysocki et al., 2010]. As moléculas probióticas aqui descritas demonstraram interferir com os sistemas QS que regulam a produção de biofilme. Isso pode inibir biofilmes e, portanto, as moléculas probióticas podem ser eficazes não apenas no tratamento de MRSA, mas em outros patógenos resistentes a antibióticos. Saúde Bucal [116] Estudos científicos sugerem que os probióticos são eficazes na manutenção da saúde bucal e na prevenção de doenças bucais. Por exemplo, foi demonstrado que os probióticos podem melhorar a flora comensal e impedir a colonização de patógenos, prevenindo a inflamação gengival [Iniesta et al., 2012]. Existem vários estudos que avaliam o uso de probióticos Lactobacilli na saúde bucal. Os resultados indicam que o uso de comprimidos contendo L. reuteri foi associado a uma redução significativa na Prevotella intermedia na saliva, bem como na contagem de patógenos periodontais, tais como P. gingivalis [Iniesta et al., 2012]. Os resultados indicam que a administração oral

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37/65 de pastilhas de L. reuteri pode ser útil em conjunto com descamação e aplainamento radicular na periodontite crônica [Teughels et al., 2013] .

[117] Porphyrmonas gingivalis é o patógeno comum responsável pela periodontite. Uma cepa probiótica de Lactobacillus diminuiu significativamente o número de P. gingivalis [Matsuoka e Koga, 2014] . Os exemplos mostram que o uso de bactérias probióticas Lactobacillus pode interferir na adesão do patógeno e que a colonização pode levar a um benefício significativo à saúde.

[118] Pelo exposto, é evidente que as moléculas probióticas descritas aqui podem ser úteis no tratamento de uma ampla variedade de patógenos, incluindo bactérias, vírus, leveduras, fungos e parasitas. Em alguns aspectos, o patógeno é entérico ou não entérico e/ou a infecção ocorre em um local entérico ou não entérico.

[119] Por exemplo, as moléculas probióticas descritas aqui podem ser úteis no tratamento de uma infecção bacteriana de um gênero selecionado do grupo que consiste em Abiotrophia, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinobaculum, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agrobacterium, Alcaligenes, Alloiococcus, Alteromonas, Amycolata, Amycolatopsis, Anaerobospirillum, Anaerorhabdus, Anguillina, Arachnia, Arcanobacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Atopobium, Aureobacterium, Bacillus, Bacteroides, Balneatrocefalia, Balneatrocefalia, Bacteroides, Balneatrocefalia, Bacteroides, Balneatrobacteria Bordetella, Brachyspira, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia,

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Buttiauxella, Butyrivibrio, Calymmatobacterium Campylobacter, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Catonella Cedecea, Cellulomonas, Centipeda, Chlamydia Chromobacterium, Chyseobacterium, Chryseomonas Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Comamonas Corynebacterium, Coxiella, Cryptobacterium, Delfiia Dermabacter, Dermatophilus, Desulfomonas, Desulfovibrio Dialister, Dichelobacter, Dolosicoccus, Dolosigranulum Edwardsiella, Eggerthella, Ehrlichia, Eikenella Empedobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia Erysipelothrix, Escherichia, Eubacterium, Ewingella Exiguobacterium, Facklamia, Ator Filif, Flavimonas Flavobacterium, Flexispira, Francisella, Fusobacterium Gardnerella, Gemella Globicatella, Gordona, Haemophilus Helicobacter, Helococo, Holdemania, Ignavigranum Johnsonella, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koserella Kurthia, Kytococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lautropia Leclercia, Legionella, Leminorella, Leptospira Leptotrichia, Leuconostella, Listuconostomia, Megasphaera Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Mitsuokella Mobiluncus, Moellerella, Moraxella, Morganella Mycobacterium, Mycoplasma, Myroides, Neisseria, Nocardia Nocardiopsis, Ochrobactrum, Oeskovia, Oligella, Orientia Paantoibacilluscus, Paenibacilluscus Peptostreptococcus Photobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas Porphyrimonas Prevotella, Propionibacterium, Proteus, Providencia Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rhodococcus Rickettsia, Rochalimaea, Roseomonas, Rothia, Ruminococos Salmonella, Selenomonas, Serpulina, Serratia, Shewenella

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Shigella, Simkania, Slackia, Sphingobacterium, Sphingomonas , Spirillum, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Stomatococcus, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Succinivibrio, Sutterella, Suttonella, Tatumella, Tissierella, Trabulsiella, Treponema, Tropheryma, TsOkamurella, Turicella, Ureaplasma, Vagococo, Veillonella, Vibrio, Weeksella, Wolinella, Xanthomonas, Xenorhabdus, Yersinia e Yokenella.

[120] Por exemplo, a infecção bacteriana pode ser causada por uma bactéria selecionada do grupo constituído por Actimomyces europeus, Actimomyces georgiae, Actimomyces gerencseriae, Actimomyces graevenitzii, Actimomyces israelii, Actimomyces meyeri, Actimomyces naeslundll, Actimomyces neuii neuii, Actimomyces neuii anitratus, Actimomyces odontolyticus, Actimomyces radingae, Actimomyces turicensis, Actimomyces viscosus, Arthrobacter creatinolyticus, Arthrobacter cumminsii, Arthrobacter woluwensis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus spillus, Bacillus lusillus, Bacillus lichillus, Bacillus Bacagus, Bacillus Bacagus, Bacillus Bacagus Bacillus thuringiensis, Borrelia afzelii, Borrelia andersonii, Borrelia bissettii, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia japonica, Borrelia lusitaniae, Borrelia tanukii, Borrelia turdi, Borrelia valaisiana Borrelia caucasica, Borrelia crocidurae, Borrelia recurrentis, Borrelia duttoni, Borrelia graingeri, Borrelia hermsii, Borrelia hispanica, Borrelia latyschewii, Borrelia mazzottii, Borrelia parkeri, Borrelia pérsica, Borrelia recurrentis, Borrelia turicatae, Borrelia venezuelensi, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella

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40/65 holmseii, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bordetella pertussis, Bordetella pertussis ematum, Clostridium absonum, Clostridium argentinense, Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris , Clostridium carnis, Clostridium celatum, Clostridium clostridio forme, Clostridium cochlearium, Clostridium cocleatum, Clostridium fallax, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulars, Clostridium leptum, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputr, Clostridium pili forme, Clostridium putrefasciens, Clostridium ramosum, Clostridium septicum, Clostridium sordelii, Clostridium sphenoides, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vulneris, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus raffinosus, Enterococcus solitarius, Haemophilus aegyptius, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus par aphrophilus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus segnis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Klebsiella ornitholytica, Klebsiella oxytoca,

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Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae

Klebsiella ozaenae

Klebsiella terrigena

Lysteria ivanoviovi

Lysteria monocytogenes

Mycobacterium abscessus

Mycobacterium africanum, Mycobacterium alvei

Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium aurum, Mycobacterium avium

Mycobacterium bohemicum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium branderi, Mycobacterium brumae, Mycobacterium celatum

Mycobacteri um chelonae

Mycobacterium chubense

Mycobacteri um con fluent is

Mycobacterium conspicuum

Mycobacteri um cookii

Mycobacterium flavescens

Mycobacterium fortuitum

Mycobacterium gadium

Mycobacteri um gastri

Mycobacterium genavense

Mycobacteri um gordonae, Mycobacterium goodii

Mycobacterium haemophilum

Mycobacterium hassicum

Mycobacterium intracelular

Mycobacterium interjectum

Mycobacterium heidelberense

Mycobacterium kansasii

Mycobacterium lentiflavum, Mycobacterium leprae, Mycobacterium malmoense

Mycobacteri um marinum

Mycobacterium microgenicum

Mycobacteri um microti

Mycobacterium mucogemcum

Mycobacteri um neoaurum

Mycobacterium nonchromogenicum

Mycobacteri um peregrinum

Mycobacterium phlei

Mycobacteri um scrofulaceum

Mycobacterium shimoidei

Mycobacteri um simiae

Mycobacterium smegmatis

Mycobacteri um szulgai, Mycobacterium terrae

Mycobacterium thermoresistabile, Mycobacterium triplex*

Mycobacteri um

Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tusciae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium vaccae

Mycobacterium wolinskyi

Mycobacterium xenopi

Mycoplasma buccale, Mycoplasoplasma faucium, Mycoplasma fermentans

Mycoplasma genitalium

Mycoplasma hominis

Mycoplasma

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42/65 lipophilum, Mycoplasma orale, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma pirum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma primatum, Mycoplasma salivarium, Mycoplasma spermatophilum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas luteola. Pseudomonas mendocina, Pseudomonas monteilii, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas pertocinogena, Pseudomonas pseudalcaligenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Rickettsia africae, Rickettsia akari, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia felis, Rickettsia honei, Rickettsia japonica, Rickettsia mongolotimonae, Rickettsia prowazeldi, Rickettsia rickettsiae, Rickettsia sibirica, Rickettsia slovaca, Rickettsia typhi, Salmonella choleraesuis choleraesuis, Salmonella choleraesuis arizonae, Salmonella choleraesuis bongori, Salmonella choleraesuis diarizonae, Salmonella choleraesuis houtenae, Salmonella choleraesuis indica, Salmonella choleraesuis salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Shigella dysentaeriae, Shigella flexococele, Staigella sonnei ureolyticus, Staphylococcus caprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii cohnii, Staphylococcus c. ureolyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis hominis, Staphylococcus h. novobiosepticius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedins, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophytics, Staphylococcus schleiferi

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43/65 schleiferi, Staphylococcus s. coagulans, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae, Streptococtre disqualactia, Streptococcus disgalactia, Streptococcus disgalactia, Streptococcus porcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus constellatus, Streptococcus constellatus pharyngidis, Streptococcus intermedins, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Streptococcus vestibularis, Streptococcus criceti, Streptococcus mutans, Streptococcus ratti, Streptococcus sobrinus, Streptococcus acidominimus, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus suis, Vibrio alginolyticus, V, carcaças, Vibrio cholerae, C. cincinnatiensis, Vibrio damsela, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio hollisae, Vibrio metschnikovii, Vibrio mimicus, Vibrio parehaemolyticus, Vivrio vulnificus, Yersinia pestis, Yersinia aldovae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia mollaretii, Yersinia pseudotuberculosis e Yersinia rohdei.

[121] Alternativamente, as moléculas probióticas aqui descritas podem ser úteis no tratamento de um virus de uma família selecionada do grupo que consiste em Astroviridae,

Caliciviridae, Picornaviridae, Togaviridae, Flaviviridae,

Caronaviridae, Paramyxviridae, Orthomyxoviridae,

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Bunyaviridae, Arenaviridae, Rhabdoviridae,, Filoviridae, Reoviridae, Bornaviridae, Retroviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Hepadnaviridae, (por exemplo, um vírus selecionado do grupo que consiste no virus Coxsackie A-24, virus Adeno 11, virus Adeno 21, virus Coxsackie B, vírus de doença de Borna, Vírus sincicial respiratório, virus Parainfluenza, virus da encefalite da Califórnia, virus do papiloma humano, virus varicela zoster, vírus da febre do carrapato do Colorado, virus Herpes Simplex, virus vaccinia, virus parainfluenza 1, virus parainfluenza 2, virus parainfluenza 3, virus da dengue, virus Ebola, Parvovirus B19, Virus Coxsackie A-16, HSV-1, virus da hepatite A, virus da hepatite B, virus da hepatite C, virus da hepatite D, virus da hepatite E, virus da imunodeficiência humana, Coxsackie B1-B5, virus da gripe A, B ou C, virus LaCross, lassavirus, virus da rubeola virus Coxsackie A ou B, ecovirus, virus da coriomeningite linfocitica, HSV-2, vírus da caxumba, Vírus respiratório sinicial, Virus Epstein-Barr, Enterovirus do Poliovirus, vírus da raiva, rubivirus, virus da variola, virus WEE, vírus da febre amarela e vírus da varicela zoster).

[122] Alternativamente, as moléculas probióticas aqui descritas podem ser úteis no tratamento de uma levedura ou fungo. Por exemplo, um fungo ou levedura que infecta um hospedeiro é selecionado do grupo que consiste em Aspergillus sp., Dermatophytes, Blastomyces dermatltldls, Candida sp., Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Histoplasma capsulatum e Dematiaceous Fungi.

[123] Como aqui utilizado, o termo parasita ou infecção parasitológica deve ser entendido como um

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45/65 organismo, unicelular ou multicelular, que não seja um virus, bactéria, fungo ou levedura capaz de infectar outro organismo, por exemplo, um ser humano. Exemplos de tais parasitas incluem, por exemplo, um parasita selecionado do grupo que consiste em Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides, Balantidium coll, Blastocystis hominis, Clonorchis sinensis, Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Diphyllobothium, Diphyllobiumium, Entamoeba histolytica, Enterobius vermicularis , Fasciola hepatica, Enterobius vermicularis , Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Giardia intestinalis (syn. Giardia lamblia), Heterophyes heterophyes, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Isospora belli, Metagonimus yokogawai, Necator americanus, Opistorchis felineus, Paragonimus westermani, Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Taenia saginata, Trichuris trichiura, Babesia diver gens, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium oval, Plasmodium vivax, Leishmania braziliensis e Leishmania donovani.

[124] Em alguns aspectos, as moléculas probióticas podem ser usadas geralmente para reduzir a formação de biofilme ou interromper os biofilmes já formados. As moléculas probióticas também podem ser utilizadas em genes de virulência com regulação negativa, geralmente aqueles associados ao T3SS, e na redução da ligação de patógenos ao tecido e/ou superficies. 0 tratamento de feridas e o tratamento e/ou prevenção de infecções em feridas utilizando as moléculas probióticas aqui descritas também são contemplados.

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46/65 [125] Em certos aspectos, o tratamento de infecções entéricas especificas é contemplado. Por exemplo, a paratuberculose da subespécie de Mycobacterium avium é responsável pela doença de Johne em bovinos. A indústria de laticínios dos EUA registrou perdas anuais de US$ 1,5 bilhão devido à doença e que 22% dos rebanhos leiteiros nos EUA estão infectados. Possui um T3SS e, portanto, espera-se que seja tratado e/ou impedido através do uso das moléculas probióticas aqui descritas.

[126] Em alguns aspectos mais gerais, as moléculas probióticas podem ser usadas como alternativa ou adjuvante às terapias antibióticas convencionais para reduzir assim o uso de antibióticos e mitigar o desenvolvimento da resistência aos antibióticos.

[127] As moléculas probióticas descritas aqui podem, em alguns aspectos, ser administradas, por exemplo, por via parentérica, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intracraniana, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinhal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, intrarretal, intravaginal, aerossol ou administração oral. Tipicamente, as composições da invenção são administradas oralmente ou diretamente no local da infecção.

[128] As moléculas probióticas descritas neste documento podem, em alguns aspectos, ser administradas em combinação, concorrente ou sequencialmente, com tratamentos convencionais para infecção, incluindo antibióticos, por exemplo. As moléculas probióticas descritas aqui podem ser formuladas em conjunto com esses tratamentos convencionais quando apropriado.

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47/65 [129] As moléculas probióticas descritas aqui podem ser usadas em qualquer quantidade adequada, mas são tipicamente fornecidas em doses compreendendo de cerca de 1 a cerca de 10000 ng/kg, tais como de cerca de 1 a cerca de 1000, cerca de 1 a cerca de 500, cerca de 10 a cerca de 250, ou cerca de 50 a cerca de 100 ng/kg, tais como cerca de 1, cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300 ou cerca de 500 ng/kg.

[130] A divulgação acima descreve de forma geral a presente invenção. Um entendimento mais completo pode ser obtido por referência aos seguintes Exemplos específicos. Estes exemplos são descritos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Alterações na forma e substituição de equivalentes são contempladas, pois as circunstâncias podem sugerir ou facilitar. Embora termos específicos tenham sido empregados neste documento, tais termos são pretendidos em um sentido descritivo e não para fins de limitação.

Exemplos Exemplo 1: Resumo da identificação de E. coli e biopeptídeo uropatogênico Objetivo:

[131] O objetivo desses experimentos foi determinar se o sobrenadante livre de células de La-5 podería regular a expressão de genes de virulência em E. coli uropatogênica (UPEC).

Materiais e métodos:

[132] O sobrenadante livre de células La-5 utilizado para estes experimentos foi o lote D4. As duas cepas de

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UPEC foram isoladas de uma infecção do trato urinário de cães. Eles foram fornecidos pelo laboratório de patologia e biologia da Universidade de Guelph. A cepa 1, alias UPEC99, e a cepa 2, alias UPEC804. As cepas foram cultivadas em ágar LB. Dois meios diferentes foram testados LB e meio de urina artificial.

Conjuntos de primers testados:

Gene Alias	Nome do gene	FWD ou REV	Sequência 5'-3'
FimA	Proteína fimbrial tipo 1	FWD	CATCGTTTCCAACGCATCCT
FimA	Proteína fimbrial tipo 1	REV	GGTTGCGGCACCAATGGCATAATA
FliC	Flagellin	FWD	ACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAA
FliC	Flagellin	REV	GCGCTGTTAATACGCAAGCCAGAA
GapA	Gliceraldeído- 3-fosfabode sidrogenase	FWD	CATCGTTTCCAACGCATCCT
GapA	Gliceraldeído- 3-fosfabode sidrogenase	REV	ACCTTCGATGATGCCGAAGTT
P apA_2	Pilus P fimbrial principal	FWD	GTGCCTGCAGAAAATGCAGAT
P apA_2	Pilus P fimbrial principal	REV	CCCGTTTTCCACTCGAATCA
HylA	Hemolisina A	FWD	ACCTTGTCAGGACGGCAGAT
HylA	Hemolisina A	REV	CCGTGCCATTCTTTTCATCA
TufA	Fator de alongamento Tu	FWD	ACTTCCCGGGCGACGACACTC
TufA	Fator de alongamento Tu	REV	CGCCCGGCATTACCATCTCTAC

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49/65 [133] Os ensaios foram realizados de forma semelhante aos ensaios de Salmonella, conforme descrito em Sharma 2014. Os UPEC foram cultivados por 4 horas na presença de sobrenadante livre de células. As células foram coletadas e o RNA foi extraído. O RNA foi tratado com DNAse I para remover o DNA genômico. O RNA foi usado como modelo para produzir cDNA. O cDNA foi analisado por qPCR e a expressão gênica foi normalizada para um gene de referência e comparada a um meio de controle livre células. Resultados:

Tabela 1.1: Comparação da expressão gênica com LB e meio de urina artificial.

Alvo genético	Cepa	Meio	Gene de referência	Infrarregulação
FüC	Cepa 1 (E99)	LB	GapA	0,024
FüC	Cepa 1 (E99)	Meio de urina artificial	GapA	0,014
FüC	Cepa 2 (E804)	LB	GapA	0,56
FüC	Cepa 2 (E804)	Meio de urina artificial	GapA	0,045
HylA	Cepa 1 (E99)	LB	GapA	16, 47
HylA	Cepa 1 (E99)	Meio de urina artificial	GapA	1,35
HylA	Cepa 2 (E804)	LB	GapA	Não expresso
HylA	Cepa 2 (E804)	Meio de urina artificial	GapA	Não expresso
FimA	Cepa 1 (E99)	LB	GapA	Não expresso

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FimA	Cepa 1 (E99)	Meio de urina artificial	GapA	Não	expresso
FimA	Cepa 2 (E804)	LB	GapA	Não	expresso
FimA	Cepa 2 (E804)	Meio de urina artificial	GapA	Não	expresso

[134] Os dados da Tabela 1.1 sugeriram que ο sobrenadante livre de células é eficaz na infrarregulação do HylA, mas não do FliC. Há também mais infrarregulação no meio LB do HylA em comparação com o meio de urina artificial. A expressão desses genes foi investigada com apenas meios LB, uma vez que possui uma maior infrarregulação dos genes. Este experimento foi testado novamente para confirmar que a resposta era específica da cepa.

Tabela 1.2: Regulação genética específica da cepa de comparação.

Alvo genético	Cepa	Meio	Gene de referência	Infrarregulação
FliC	Cepa 1 (E99)	LB	GapA	1, 90
FliC	Cepa 2 (E804)	LB	GapA	0,705
HylA	Cepa 1 (E99)	LB	GapA	12,72
HylA	Cepa 2 (E804)	LB	GapA	Não expresso

[135] Os dados na Tabela 1.2 sugerem que o sobrenadante livre de células pode infrarregular o HylA, mas apenas é a cepa 1, pois o HylA não parece ser expresso na cepa 2. O sobrenadante livre de células não parece afetar a infrarregulação de FliC.

Tabela 1.3: Curva de resposta à dose do lote D4 e da cepa 1 (E99) de UPEC

Alvo

Dose

Gene de referência

Infrarregulação

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genético
HylA	4x	GapA	40,46
HylA	2x	GapA	19, 86
HylA	lx	GapA	24, 69
HylA	0,5x	GapA	4, 90
HylA	0,25x	GapA	2,79

[136] A dose lx é equivalente a 10 mL de sobrenadante livre de células (lx). A infrarregulação do HylA se correlaciona com a quantidade de material testado. Isso sugere que o sobrenadante livre de células possui uma interação especifica com a regulação do HylA e com possíveis mecanismos de derivação (downstream).

Tabela 1.4: Tabela resumida da expressão do gene HylA na cepa 1 (E99) com lote de estabilidade (Sl).

Gene alvo	Tratamento	Gene de referência	Quantidade de infrarregulação de HylA
Hyla	E 9 9 0,2 5x	GapA	0, 98
Hyla	E99 0,5X	GapA	3,16
Hyla	E99 IX	GapA	6,96
Hyla	E99 2X	GapA	10,85

[137] A dose lx é equivalente a 10 mL de sobrenadante livre de células (lx) . Um segundo lote de material foi testado para determinar no sobrenadante livre de células secas para um lote de produção independente adicional também podería infrarregulação a expressão de HylA. Houve uma resposta à dose com a quantidade de sobrenadante livre de células secas testada e a infrarregulação de HylA. Exemplo 2: Identificação de moléculas bioativas a partir de sobrenadante livre de células

Objetivo:

[138] O objetivo desses experimentos foi identificar os

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52/65 peptídeos bioativos do sobrenadante livre de células. Materiais e métodos:

[139] 0 sobrenadante livre de células foi separado usando resina Sephadex G75. As amostras foram separadas e coletadas em frações: Fração 1 (> 163000 Da), Fração 2 (163000 a 14500 Da), Fração 3 (14500 a 1300 Da), Fração 4 (1300 a 110 Da), Fração 5 (110 a 10 Da). As amostras foram coletadas e analisadas por qPCR usando a cepa Salmonella enteric typhimurium DT104. A infrarregulação de HilA foi comparada com o gene de referência 16S.

Primers :

HilA FWD 5'-3'-TGTCGGAAGATAAAGAGCAT

HilA REV 5'-3'-AAGGAAGTATCGCCAATGTA 16S FWD 5'-3'-CAAGTCATCATGGCCCTTAC 16S REV 5'-3'-CGGACTACGACGCACTTTAT [140] A fração ativa da cromatografia de deleção de tamanho G75 foi ainda separada usando cromatografia de fase

reversa. As frações	da	fase	reversa:	Fração	1	(0	a 2
minutos),	Fração 2	(2	a 4	minutos),	Fração	3	(4	a 16
minutos),	Fração 4	(16	a 32	minutos),	Fração	5	(32	a 40
minutos),	Fração 6	(40	a 58	minutos)	As frações	foram

secas e neutralizadas para remover acetonitrila e ácido trifluoroacético do solvente. As frações secas foram testadas usando as mesmas condições de qPCR do teste acima. As frações foram analisadas por sequenciamento de novo no centro analítico avançado da Universidade de Guelph. Os peptídeos das frações ativas de 6 lotes foram comparados e os peptídeos comuns dos lotes foram deduzidos.

Tabela 2.1: Infraregulação de qPCR das frações de deleção de tamanho

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Tratamento	Gene alvo	Gene de referência	Quantidade de infrarregulação
Entrada	HilA	16S	14,36
Fração 1	HilA	16S	1,38
Fração 2	HilA	16S	2, 98
Fração 3	HilA	16S	10, 97
Fração 4	HilA	16S	1,84
Fração 5	HilA	16S	3, 30

[141] A fração de deleção por tamanho 3 foi ainda mais caracterizada, pois possuía atividade semelhante à entrada, sugerindo que a atividade dessa fração é o principal componente das moléculas bioativas.

Tabela 2.2: Inf rarregulação de qPCR da fração de fase reversa (PR) purificada a partir da deleção por tamanho

Tratamento	Gene alvo	Gene de referência	Quantidade de infrarregulação
Fração de RP 1	HilA	16S	1,15
Fração de RP 2	HilA	16S	0, 68
Fração de RP 3	HilA	16S	3, 78
Fração de RP 4	HilA	16S	0,56
Fração de RP 5	HilA	16S	169
Fração de RP 6	HilA	16S	0,0096

[142] As frações RP 3 e 5 foram selecionadas para o sequenciamento de novo. Os resultados são da fração 5, pois teve a maior atividade observando que o MALPPK também encontrou na Fração de RP 3, mas os outros peptídeos foram encontrados apenas na fração 5.

Tabela 2.3: Sequenciamento de novo de fração de RP 5 de biopeptídeos analisados de 6 lotes de produção

	Número da batelada
Sequência de peptídeos	D4	D8	D10	D14	D15	P64

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54/65

MALPPK	Presente	Presente	Presente	Presente	Presente	Presente
CVLPPK	Presente	Presente	Presente	Presente	Presente	Presente
HLLPPLP	Presente	Presente	Presente	Presente	ND	ND
LKPTPEGD	Presente	Presente	Presente	Presente	Presente	ND

[143] 0 sequenciamento de novo foi utilizado para identificar sequências de aminoácidos responsáveis pela infrarregulação de genes de virulência, tais como HilA, na Salmonella enterica typhimurium DT104. Foram analisados seis lotes de produção independentes. 0 sobrenadante livre de células foi separado utilizando cromatografia de deleção por tamanho (Sephadex G75). As amostras foram isoladas em 5 frações com base em sua massa molecular. A terceira fração com uma faixa de peso molecular prevista de 14,5 a 1,3 kDa foi posteriormente analisada por cromatografia de fase reversa e a fração de RP 5 foi analisada por sequenciamento de novo. Uma comparação de todos os biopeptideos analisados identificou dois peptideos que eram comuns entre todos os seis lotes e dois peptideos adicionais que eram comuns a pelo menos 4 lotes. Uma vez que o sequenciamento de novo é apenas uma análise qualitativa, todos os quatro peptideos foram sintetizados para identificar quais peptideos são responsáveis pela infrarregulação de HilA em Salmonella typhimurium DT104 entérico.

Tabela 2.4: Semiquantificação de biopeptideos da fração de deleção por tamanho 3 do lote de estabilidade 1 (Sl)

Sequência de peptideos	Concentração de peptideos (ng/mL)
MALPPK	2500
CVLPPK	Abaixo do limite de detecção
HLLPLP	2,5 a 5

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55/65

LKPTPEGD	25 a 50
YPVEPF	10 a 25
YPPGGP	100

[144] Os bio-peptideos selecionados do sequenciamento de novo e dois peptideos adicionais que foram identificados na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2009/155711 foram analisados por espectroscopia de massa usando o modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) para semiquantifrear a quantidade de biopeptideo presente no lote de estabilidade SI. A altura do pico de cada peptideo foi comparada com a altura do pico de uma série de diluições de uma quantidade conhecida de cada biopeptideo. Este método semi-quantitativo identificou que o MALPPK era o peptideo mais abundante presente dos 6 peptideos analisados.

Tabela 2.5: Análise de qPCR da alteração na expressão de

HylA e HilA na presença de biopeptideos sintéticos individuais

Sequência de peptideo	Gene alvo	Gene de referência	Quantidade de infrarregulação
MALPPK	HylA	GapA	9, 06
CVLPPK	HylA	GapA	3, 20
HLLPLP	HylA	GapA	2, 64
LKPTPEGD	HylA	GapA	4, 69
YPVEPF	HylA	GapA	1,03
YPPGGP	HylA	GapA	3,56
MALPPK	HilA	16S	19,56
CVLPPK	HilA	16S	3, 75
HLLPLP	HilA	16S	2, 93
LKPTPEGD	HilA	16S	11,08
YPVEPF	HilA	16S	0, 68

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56/65

YPPGGP

HilA

16S

2, 93

[145] Os biopeptídeos sintéticos foram analisados a 50 gg por ensaio. A análise de qPCR sugere que todos os peptídeos afetam a infrarregulação de HylA, exceto YPVEPF. O peptídeo MALPPK parece ter o efeito mais alto na infrarregulação de HylA, seguido por LKPTPEGD, YPPGGP, CVLPPK e HLLPLP.

Resumo:

[146] Os dados apresentados nas tabelas 2.1 a 2.5 demonstram que os peptídeos encontrados no sobrenadante livre de células do meio de fermentação La-5 podem diminuir a expressão de HilA em Salmonella enterica typhimurium DT104 e Hemolisina A (HylA). O HylA é uma toxina formadora de poros produzida pela UPEC e é um dos fatores de virulência envolvidos na infecção. A interação parece ser específica, uma vez que a expressão de flagelina (FliC) não é infrarregulada na presença do sobrenadante livre de células. Dois lotes de produção independentes demonstraram uma infrarregulação específica de HylA de uma maneira dependente da dose. Foram identificados quatro peptídeos a partir do sequenciamento de novo da fração de deleção de tamanho 3. Esses quatro peptídeos e dois peptídeos adicionais de uma patente anterior foram sintetizados e seu efeito na expressão do gene HylA foi quantificado por qPCR. Todos os biopeptídeos, exceto YPVEPF, estavam ativos e MALPPK foi o peptídeo mais ativo dos 6 peptídeos analisados.

Exemplo 3: Ensaio de toxicidade em células E, coli Objetivo:

[147] O objetivo deste experimento foi determinar se

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57/65 houve uma redução na produção de toxinas em E. coll uropatogênica no presente meio livre de células de Lactobacillus acidophilus usando um ensaio fisiológico de toxicidade celular. Materiais e métodos:

[148] 0 sobrenadante livre de células secas foi dissolvido em caldo LB (14 mg/mL) e foi ajustado usando pH 7,2 usando NaOH 0,1 N. A solução foi diluida com caldo LB até a concentração final. O caldo (5 mL) foi inoculado com 50 μΣ de uma cultura de cepa UPEC099 de 18 horas. A amostra foi cultivada durante 4 horas a 37 °C com agitação de 200 rpm. Uma aliquota de 1 mL da cultura foi centrifugada a 10.000 x g para remover as células de E. coli. O sobrenadante (100 μΣ) foi adicionado a 1 ιηΣ de células de mamifero HT29 (1E6 células/ιηΣ) e incubado por 1 hora a 37 °C suplementado com CO2 a 5%. Após a incubação, a mistura foi transferida para um tubo de 1,5 mh e centrifugada a 250 x g para remover as células de mamíferos. O sobrenadante (50 μΣ) foi usado para testar a toxicidade celular usando o ensaio de citotoxicidade Pierce Lactate Dehydrogenase DDH (Thermo Fisher Scientific). As soluções para o ensaio foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Os 50 μΣ do sobrenadante foram incubados com 50 μΣ da mistura de reação do ensaio em uma placa de 96 poços. O ensaio foi coberto com papel aluminio para protegê-lo da luz e incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de parada da reação (50 μΣ) foi adicionada e a placa de 96 poços foi lida a 4 90 nm e 680 nm. Os valores de absorbância foram usados para calcular a citotoxicidade, os dados são expressos como

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58/65 porcentagem de inibição.

Re suitados/Diseussão :

[149] Os dados apresentados nas Figuras 1 e 2 representam a inibição da produção de toxinas UPEC com o sobrenadante livre de células. Esses dados fornecem suporte fisiológico de que o sobrenadante livre de células é capaz de reduzir o efeito da toxina nas células de mamíferos HT29 de maneira dependente da dose. A lactato desidrogenase é um marcador fisiológico para a lise celular e a inibição da lactato desidrogenase em um ensaio de ponto final sugere que menos células de mamíferos foram lisadas, inferindo que o sobrenadante livre de células pode reduzir a quantidade de toxina produzida por UPEC099.

Exemplo 4: Teste do sobrenadante livre de células de bactérias probióticas adicionais

Objetivo:

[150] O objetivo deste experimento foi determinar se outras bactérias probióticas produzem peptídeos bioativos similares no sobrenadante livre de células.

Materiais e métodos:

[151] Todas as bactérias probióticas foram cultivadas por 48 horas usando o mesmo meio de fermentação. As células foram separadas do meio de fermentação por centrifugação e o sobrenadante livre de células foi neutralizado para pH 7 com NaOH 0,1 N. O sobrenadante foi dividido em alíquotas em amostras de 10 mL e seco por congelamento. Uma alíquota foi usada para ensaios biológicos ou para cromatografia de deleção por tamanho. Para a cromatografia de deleção por tamanho, a amostra foi separada usando uma resina Sephadex G75. As amostras foram separadas e coletadas em frações:

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59/65

Fração 1 (> 163000 Da), Fração 2 (163000 a 14500 Da), Fração 3 (14500 a 1300 Da) , Fração 4 (1300 a 110 Da) ,

Fração 5 (110 a 10 Da) . A fração 3 de cada cultura probiótica foi coletada e seca, as amostras secas foram analisadas por sequenciamento de novo no centro analítico avançado da Universidade de Guelph (Tabela 3).

[152] Além disso, a amostra lx de cada cultura probiótica foi testada usando o Ensaio de qPCR de Salmonella descrito no exemplo 1 ou um ensaio de Lactato Desidrogenase (LDH) usando UPEC 099 ou Staphylococcus aureus 81 M. Para o ensaio de LDH, o sobrenadante livre de células secas foi ressuspenso em 5 mL de caldo de lisogenia e inoculado com UPEC 0 99 ou Staphylococcus aureus 81 M e incubado por 4 horas. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi analisado. Uma aliquota de 100 pL de sobrenadante foi adicionada a 1 mL de células HT2 9 de mamifero a 1 χ 10⁶ células por mL em uma placa de 12 poços. As amostras foram incubadas por 45 minutos a 37 °C e CO2 a 5%. O sobrenadante foi então testado usando o protocolo do fabricante (kit de teste de citotoxicidade Pierce LDH, Thermo Scientific, Rockford, II, EUA). A inibição percentual foi calculada usando o controle sem

tratamento e um	controle com	detergente lisado	usando	a
fórmula fornecida Tabela 3: Resumo	no protocolo da atividade	(Tabela 3). de sobrenadantes	livres	de
células probióticas e peptideos	identificados da	fração	de

SEC 3

Espécie de bacteria

Nomes de cepa

Código col. Cult.

LDH (%) inibição

LDH (%) inibição com MRS A

Quantidade de infrarregula-

Sequênci a de pepti-

Sequên -cia de pepti-

Sequên -cia de pepti-

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60/65

			com UPE C 099	81M	ção de HilA	deos MALPPK	deos HLLPLP	deos YPVEPF
L. acidop hilus	La-5	DSM- 13241	83	80	-77	MALPPK	HLLPLP	YPVEPF
L. rhamno sus	GG[Go rbach Goldi n]	ATCC 53103	48	43	-36	LPVPK	TTLPLP TT	N.D .
L. reuter i		DSM- 17938	90	0	-43	EVLNCL ALPK	HLLPLP	EMPFKP YPVEPF
L. lactis	Berridge x 13 [BUCS A V 453, NCDO 496, NCIB 8586]	ATCC 11454	95	17	-202	MALPPK	HLLPLP L	KYVPEP F

Exemplo 5: Superando a resistência ao medicamento

Objetivo:

[153] Para determinar se o sobrenadante livre de células de bactérias probióticas, tais como Lactobacillus acidophilus La-5, poderia aumentar a sensibilidade de bactérias resistentes a medicamentos a antibióticos, especificamente Staphylococci resistentes a meticilina a cefoxitina.

Materiais e métodos:

[154] O sobrenadante livre de células La-5 usado para esses experimentos foi obtido dos lotes N9 a N10 e N13. Três cepas de Staphylococci resistentes à meticilina (MRS)

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61/65 foram usadas nesses experimentos: 1) Staphylococcus pseudintermedius (também conhecida como cepa C260 22-2011 dtqa), um isolado clínico de uma infecção de pele de cachorro; 2) Staphylococcus aureus (cepa LA - 414M SPA t034), uma cepa associada a gado isolada de carne bovina comprada em uma mercearia em Charlottetown, PEI, Canadá; e 3) Staphylococcus aureus (cepa também conhecida como 81 M SPA t008), isolado de carne de aves comprada em uma mercearia em Charlottetown, PEI, Canadá. Todas as três linhagens de MRS foram fornecidas pelo Atlantic Veterinary College (AVC) na Universidade da Ilha do Príncipe Edward. A resistência à meticilina dessas cepas foi confirmada pela equipe da AVC usando um método de difusão em disco de oxacilina. As cepas foram originalmente cultivadas em inclinações de ágar de sangue de ovelha e depois transferidas para placas de ágar de caldo lisogênico. A cefoxitina ressuspensa em metanol foi usada para teste de resistência a antibióticos e o crescimento foi testado em dois tipos diferentes de meios, o caldo lisogênico padrão e o meio Mueller-Hinton BBL™ ajustado por cátion BBL™ padrão (Becton, Dickinson and Company). As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) da cefoxitina foram determinadas para cada cepa em cada meio respectivo, na presença e na ausência do sobrenadante livre de células. Os ensaios foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) para testes de CIM de espécies estafilocócicas [CLSI, 2015], bem como o Comitê Europeu para Testes de Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST) da Sociedade Européia de Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas [EUCAST, 2003] .

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62/65 [155] 0 protocolo para teste de MIC foi o seguinte. Os sobrenadantes isentos de células foram ressuspensos no meio respectivo e o filtro esterilizado através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 μΜ. A concentração requerida de sobrenadante livre de células secas foi pesada e adicionada em concentrações variando de 0 a 60 mg/mL. Adicionou-se cefoxitina para obter as concentrações variando de 0 a 250 μg/mL. Culturas de cada cepa respectiva foram cultivadas durante a noite em caldo lisogênico ou de Mueller-Hinton por 16 a 20 horas a 37 °C e agitação de 200 rpm em condições aeróbicas para atingir densidades ópticas a 600 nm (OD600) de 1,2 a 1,6. As culturas durante a noite foram diluidas 1000 vezes e inoculadas nas respectivas amostras; esta diluição da cultura durante a noite resultou em um inóculo contendo cerca de 5 x 10⁶ UFC/mL. As culturas (150 μΕ) foram cultivadas em uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 poços. A placa de microtitulação foi então coberta em parafilme e incubada a 35 °C ± 2 °C por 24 horas. Após a incubação, as microplacas foram lidas a 600 nm usando um leitor de microplacas. O valor da CIM foi a concentração do antibiótico que resultou em uma leitura de OD600 < 0,1. Os dados são a média de duas réplicas técnicas de duas réplicas biológicas.

[156] Os beta-lactâmicos, tais como a meticilina e a cefoxitina, inibem a biossintese da parede celular bacteriana. As bactérias desenvolveram mecanismos para evitar esses inibidores, levando à resistência a antibióticos. MecA é um gene que pode se ligar a betalactamas, reduzindo assim sua atividade. Os Staphylococci que adquiriram o gene MecA são resistentes à meticilina. A

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63/65 expressão de MecA é regulada pela detecção de quorum, portanto, foi investigado se o sobrenadante livre de células podería aumentar a suscetibilidade de Staphylococci resistentes à meticilina, inibindo a detecção de quorum.

[157] Os dados mostram que o sobrenadante livre de células pode aumentar a suscetibilidade de espécies de Staphylococci resistentes à meticilina ao antibiótico

cefoxitina;	por	sua vez, isso reduz a concentração	de
cefoxitina	necessária para interromper ou impedir	a
proliferação	de	espécies de Staphylococci resistentes	à

meticilina. Para as concentrações testadas de sobrenadante livre de células (5 mg/mL, 30 mg/mL e 60 mg/mL), os dados indicam uma resposta à dose: à medida que a concentração de sobrenadante livre de células aumenta, há uma redução maior na Cefoxitina MIC comparada para o controle de 0 mg/mL. A combinação de cefoxitina e sobrenadante livre de células pode aumentar a suscetibilidade de Staphylococci resistente à meticilina em 2,5 a 6,25 vezes em comparação à cefoxitina apenas (Tabela 4).

Tabela 4: Faixa dos valores de CIM de Cefoxitina para

Staphylococci resistentes à meticilina

	Faixa de concentração de cefoxitina (pg/mL) para inibição do crescimento para O.D. <0,1
Concentração livre de células seca por ensaio (mg/mL)	MSRP C260 caldo lisogênico	MRSA LA 414M caldo lisogênico	MRSA LA 414M caldo de Mueller- Hinton	MRSA 81M caldo lisogênico	MRSA 81M caldo de MuellerHinton
0	125 a 175	30 a 40	50 a 60	75 a 125	75 a 100
5	50 a 75	15 a 20	40 a 50	40 a 50	40 a 50
30	20 a 30	15 a 20	20 a 30	30 a 40	30 a 40
60	20 a 30	10 a 15	20 a 30	30 a 40	20 a 30

[158] Para a cromatografia de deleção por tamanho, a

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64/65 amostra foi separada usando uma resina Sephadex G75. As amostras foram separadas e coletadas em frações: Fração 1 (> 163000 Da), Fração 2 (163000 a 14500 Da), Fração 3 (14500 a 1300 Da), Fração 4 (1300 a 110 Da), Fração 5 (110 a 10 Da) . O Staphylococcus aureus 81 M resistente à meticilina foi mais suscetível à cefoxitina quando coincubado com a fração de deleção de tamanho 3. Esses dados indicam que o componente ativo está na fração de deleção de tamanho 3 (Tabela 5), sugerindo fortemente que as moléculas bioativas responsáveis por esse efeito são os mesmos que os descritos e caracterizados aqui.

Tabela 5: Faixa dos valores de Cefoxitina MIC para Staphylococcus aureus 81 M resistente à meticilina com frações de deleção de tamanho do sobrenadante livre de células

Controles	Faixa de concentração de cefoxitina (gg/mL) para inibição do crescimento para O.D. < 0,1
Não tratado (0 mg/mL)	60 a 75
Sobrenadante livre de células (30 mg/mL)	20 a 30
Número de fração de exclusão de tamanho
Fração 1	60 a 75
Fração 2	75 a 100
Fração 3	30 a 40
Fração 4	60 a 75
Fração 5	40 a 50

[159] A divulgação acima descreve de forma geral a

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65/65 presente invenção. Embora termos específicos tenham sido empregados neste documento, tais termos são pretendidos em um sentido descritivo e não para fins de limitação.

[160] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados acima são aqui incorporados por referência em sua totalidade na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência em sua totalidade.

[161] Embora modalidades preferidas da invenção tenham sido descritas aqui em detalhes, será entendido pelas pessoas versadas na técnica que variações podem ser feitas a elas sem se afastar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações anexas.

Claims (31)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Peptídeo caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos MALPPK, em que o peptídeo tem menos de 19 resíduos de aminoácidos.
2. 2. Peptídeo caracterizado pelo fato de consistir na sequência de aminoácidos MALPPK.
3. 3. Peptídeo caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos CVLPPK, em que o peptídeo compreende menos de 68 resíduos de aminoácidos.
4. 4. Peptídeo caracterizado pelo fato de consistir na sequência de aminoácidos CVLPPK.
5. 5. Peptídeo caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos HLLPLP, em que o peptídeo compreende menos de 9 resíduos de aminoácidos.
6. 6. Peptídeo caracterizado pelo fato de consistir na sequência de aminoácidos HLLPLP.
7. 7. Peptídeo caracterizado pelo fato de compreender a sequência XX [L ou I]PPK, em que cada X designa independentemente um aminoácido hidrofóbico, em que o peptídeo possui menos de 19 resíduos de aminoácidos.
8. 8. Peptídeo caracterizado pelo fato de consistir na sequência XX [L ou I]PPK, em que cada X designa independentemente um aminoácido hidrofóbico.
9. 9. Peptídeo caracterizado pelo fato de consistir na sequência X1X2 [L ou I]PPK, em que Xi é selecionado dentre N, C, Q, M, S e T e em que X2 é selecionado dentre A, I, L e V.
10. 10. Peptídeo caracterizado pelo fato de compreender ou consistir em uma sequência selecionada do grupo que consiste em LPVPK, ALPK, EVLNCLALPK, LPLP, HLLPLPL, YVPEPF,

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    2/5

    KYVPEPF e EMPFKPYPVEPF, em que o peptídeo compreende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 resíduos de aminoácidos.
11. 11. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser derivado de uma bactéria probiótica selecionada de Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus e combinações das mesmas.
12. 12. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Lactobacillus é selecionada dentre Lactobacillus acidophilus (La-5), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus e Lactobacillus plantarum.
13. 13. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Lactococcus é Lactococcus lactis.
14. 14. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Bifidobacterium é selecionada dentre Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium crudilactis e misturas das mesmas.
15. 15. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que Streptococcus é Streptococcus thermophilus.
16. 16. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é combinado com um ou mais antivirais, fontes de açúcar, produtos alimentares comestíveis, suplementos nutricionais e líquidos ingeríveis.
17. 17. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das

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    3/5 reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o peptideo é concentrado a partir de um sobrenadante livre de células ou fração do mesmo.
18. 18. Peptideo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o peptideo é fornecido como uma fração de cultura seca, tal como liofilizada ou seca por pulverização.
19. 19. Peptideo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fração de cultura seca é um sobrenadante livre de células.
20. 20. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o peptideo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
21. 21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a composição é um produto

    alimentício, bebida, produto para saúde, medicamento ou suplemento nutricional 22. Composição, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que a composição compreende bactérias probióticas vivas das quais os peptideos são derivados. 23. Composição, de acordo com qualquer uma das

    reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição compreende bactérias probióticas vivas que não sejam as bactérias das quais os peptideos são derivados.
22. 24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que os peptideos na composição são purificados.
23. 25. Método para tratar e/ou prevenir uma infecção em um indivíduo e/ou para reduzir a virulência de uma infecção em

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    4/5 um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar o peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo.

    26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção entérica. 27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção não entérica. 28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a infecção é selecionada do grupo que consiste em uma infecção do trato urinário, uma infecção vaginal, uma infecção do trato respiratório, uma

    infecção no estômago, uma infecção produtora de biofilme, mastite, uma infecção na pele e uma infecção oral.
24. 29. Método para reduzir a resistência a antibióticos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo.
25. 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o método é para reduzir a resistência aos antibióticos da MRS.
26. 31. Método de tratamento de MRS caracterizado pelo fato de que compreende administrar os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definida em qualquer uma das

    Petição 870190118554, de 14/11/2019, pág. 11/13

    5/5 reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo .
27. 32. Método para prevenir ou interromper e/ou penetrar biofilmes caracterizado pelo fato de que compreende administrar os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 23 a um indivíduo com necessidade do mesmo.
28. 33. Método de tratamento de uma ferida caracterizado pelo fato de que compreende administrar os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo.
29. 34. Método para reduzir a ligação de um patógeno não entérico ao tecido de um indivíduo caracterizado pelo fato que de compreende administrar os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo.
30. 35. Objeto inerte caracterizado pelo fato de que compreende os peptídeos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 a um indivíduo com necessidade do mesmo.
31. 36. Objeto inerte, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de ser um stent, cateter ou curativo com as moléculas probióticas, que são liberadas a partir do objeto por um período de tempo.