BR112019016657A2 - métodos baseados em hla e composições e usos destes - Google Patents

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Abstract

a presente revelação fornece composições e métodos para o isolamento de hla-peptídeos de células. a presente revelação fornece uma plataforma universal e métodos para definição do perfil do peptidoma de hla, que permitem a identificação de hla-peptídeos apresentados endogenamente por linhagens de células que expressam qualquer construção possível de classe i ou ii.

Description

MÉTODOS BASEADOS EM HLA E COMPOSIÇÕES E USOS DESTES REFERÊNCIA CRUZADA [001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. Provisório N° 62/457.978, depositado em 12 de fevereiro de 2017, e Pedido U.S. Provisório N° 62/461,162, depositado em 20 de fevereiro de 2017, cada um deles incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS [002] O complexo de histocompatibilidade principal (MHC) é um complexo gênico que codifica genes do antigeno leucocitário humano (HLA). Os genes HLA são expressos como heterodimeros de proteina que são exibidos na superficie de células humanas às células T circulantes. Os genes HLA são altamente polimórficos, o que permite que eles façam um ajuste fino do sistema imune adaptive. As respostas imunes adaptivas se baseiam, em parte, na habilidade de células T para identificar e eliminar células que exibem antigenos peptidicos associados a doenças ligados a heterodimeros de antigeno leucocitário humano (HLA).
[003] Em humanos, proteínas endógenas e exógenas podem ser processadas em peptídeos pelo proteassoma e por proteases e peptidases citosólicas e endossômicas/lisossômicas e apresentadas por duas classes de proteínas da superfície celular codificadas por MHC. Essas proteínas da superfície celular são denominadas antigenos leucocitários humanos (HLA classe I e classe II), e o grupo de peptídeos que se ligam a elas e provocam respostas imunes são denominados epitopos de HLA. Os epitopos de HLA são um componente crucial que permite que o sistema imune detecte sinais de perigo, por exemplo, infecção por patógeno e transformação de self.
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Células T CD8+ circulantes reconhecem epitopos de MHC classe I (HLA-A, HLA-B e HLA-C) derivados de vias de processamento endógenas e exibidos em quase todas as células nucleadas. Células T CD4+ reconhecem epitopos de MHC classe II (HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP) exibidos em células apresentadoras de antigeno (APCs), por exemplo, células dendriticas e macrófagos. A apresentação de peptideo-HLA classe II ativa células T auxiliares, promovendo subsequentemente diferenciação de célula B e produção de anticorpo, bem como respostas de CTL. Células T auxiliares ativadas também secretam citocinas e quimiocinas que ativam e induzem diferenciação de outras células T.
[004] Os genes que codificam heterodimeros de HLA são altamente polimórficos, com mais de 12.000 variantes de alelo classe I e 4.000 variantes de alelo classe II identificadas através da população humana. A partir de haplótipos de HLA maternos e paternos, um individuo pode herdar diferentes alelos para cada um dos loci de HLA classe I e classe II. Moléculas HLA Classe I são heterodimeros constituidos por uma cadeia pesada a, codificada por genes HLA classe I, e uma β-2-microglobulina (B2M). Moléculas HLA Classe II são heterodimeros de cadeia α e β, ambas codificadas pelos genes HLA classe II. Por causa das combinações de pareamento de cadeias α e β, a população de heterodimeros de HLA é altamente complexa. Além disso, estima-se que cada heterodimero de HLA se ligue a milhares de peptideos com preferências de ligação alelo-especificas. Na verdade, estima-se que cada alelo HLA se ligue e apresente aproximadamente 1.000 - 10.000 peptideos únicos às células T; <0,1% de aproximadamente 10 milhões de peptideos de 9-mer
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3/345 potenciais de genes que codificam proteína humana. Considerando essa grande diversidade na ligação ao HLA, uma previsão precisa de se um peptídeo tem probabilidade de se ligar a um alelo HLA específico é altamente desafiadora. Sabe-se menos sobre as características de ligação ao peptídeo alelo-específica de moléculas HLA classe II por causa da heterogeneidade do pareamento de cadeias α e β, complexidade de dados que limita a habilidade para atribuir confiavelmente epitopos de ligação centrais, e a ausência de grau de imunoprecipitação, anticorpos alelo-específicos necessários para análises bioquímicas de alta resolução. Além disso, a análise de epitopos peptídicos derivados de certo alelo HLA desperta ambiguidade quando múltiplos alelos HLA são apresentados na superfície de uma célula.
[005] A compreensão das preferências de ligação de cada heterodímero de HLA é fundamental para prever com sucesso quais neoantígenos têm probabilidade de provocar respostas de células T tumor-específicas. Claramente, há uma necessidade por métodos de identificação e isolamento de peptídeos associados ao HLA classe I e classe II específicos (por exemplo, peptídeos de neoantígeno). Essa metodologia e moléculas isoladas são úteis, por exemplo, para a pesquisa de peptídeos associados ao HLA, bem como para o desenvolvimento de produtos terapêuticos incluindo, sem limitação, produtos terapêuticos de base imune.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [006] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes mencionados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse
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4/345 especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
SUMÁRIO [007] Os métodos e composições descritos nesse relatório descritivo encontram utilidade em uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, os métodos e composições descritos nesse relatório descritivo podem ser usados para identificar peptideos antigênicos imunogênicos e podem ser usados para desenvolver fármacos, por exemplo, fármacos medicamentosos personalizados.
[008] É fornecido nesse relatório descritivo um método de caracterização de complexos HLA-peptideo que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade; expressão do HLA marcado com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização dos complexos HLA-peptideo. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade codificado é um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade
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5/345 solúvel.
[009] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a caracterização de um peptídeo ligado ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para dois ou mais alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, os dois ou mais alelos HLA classe I e/ou classe II compreendem pelo
menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17,
18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 alelos HLA classe I
e/ou classe II . Em algumas modalidades, os complexos de
peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio intracelular. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são secretados. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptídeos-HLA solúveis marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptídeos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLA-específicos. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe
I ou classe II recombinante é um alelo HLA classe I ou classe
II recombinante único.
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6/345 [0010] Em algumas modalidades, o método compreende: o fornecimento de uma população de células, cada uma compreendendo uma ou mais células que compreendem um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um polipeptideo recombinante diferente codificado por um alelo HLA diferente ligado operacionalmente a um peptideo com aceptor por afinidade; enriquecimento para complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização de um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptideosHLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento.
[0011] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptideos à população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptideos ou a expressão dos (um ou mais) peptideos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA. Em algumas modalidades, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico.
[0012] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação da sequência de um peptideo ou uma porção desta ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento, opcionalmente determinação de se um peptideo ou uma porção deste está
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7/345 modificado. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquimica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LCMS/MS, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de associações de peptideos com moléculas HLA nos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[0013] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos derivados de um fármaco polipeptidico como, por exemplo, um biológico (por exemplo, um fármaco de anticorpo).
[0014] Em algumas modalidades, a doença ou condição é
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8/345 câncer, uma infecção com um agente infeccioso ou uma reação autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um fármaco polipeptidico como, por exemplo, um biológico (por exemplo, um fármaco de anticorpo) ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptideos dos complexos HLA-peptideo, opcionalmente em que os peptideos são de uma ou mais proteinas-alvo do agente infeccioso ou do fármaco polipeptidico. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptideos das (uma ou mais) proteinas-alvo do agente infeccioso ou do fármaco polipeptidico.
[0015] Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptideos dos complexos HLA-peptideo derivados de um agente infeccioso. Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um individuo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II recombinante é compativel com um individuo com uma doença ou condição.
[0016] Em algumas modalidades, o peptideo do complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um individuo quando apresentado por uma célula apresentadora de antigeno. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a comparação de
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9/345 complexos HLA-peptídeo de células de câncer com complexos HLA-peptídeo de células não-câncer. Em algumas modalidades, a população de células compreende diversas populações de células, cada população de células expressando um alelo HLA classe I ou classe II recombinante diferente. Em algumas modalidades, cada população de células das diversas populações está em um mesmo recipiente ou em um recipiente separado.
[0017] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptídeos dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da caracterização. Em algumas modalidades, um complexo HLA-peptídeo é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um complexo HLA-peptídeo com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado de meios de uma cultura de células. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Por exemplo, um HLA, por exemplo, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade, pode ser isolado usando uma partícula ou coluna que contém um anticorpo anti-HLA. Em algumas modalidades, os peptídeos são isolados usando anticorpos anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando uma coluna que contém um anticorpo anti-HLA. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a remoção de um ou mais aminoácidos de um terminal de um peptídeo ligado a um complexo de peptídeos-HLA marcados com
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10/345 aceptor por afinidade.
[0018] Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe I. Em
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11/345 algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, cada sequência codifica pelo menos dois alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes.
[0019] Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, um ou mais dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um primeiro peptideo com aceptor por afinidade e um ou mais dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um
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12/345 peptídeo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um marcador por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de pelo menos um segundo ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente ligado operacionalmente ao mesmo peptídeo com aceptor por afinidade ou a um peptídeo com aceptor por afinidade diferente.
[0020] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado está localizado em um local extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado é expresso
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13/345 intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência interna da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante, por exemplo, uma sequência da alça flexível. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante por um vinculador. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade com os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente ao peptídeo com aceptor por afinidade.
[0021] Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de etiqueta (tag) que compreende um peptídeo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta
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14/345 de glicoproteína D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, etiqueta de sortase, uma etiqueta que forma uma
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15/345 ligação peptidica covalente a uma partícula, ou uma combinação destas; opcionalmente, em que o peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[0022] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com os complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade.
[0023] Em algumas modalidades, a molécula de afinidade compreende uma molécula que se liga à biotina. Por exemplo, a molécula de afinidade pode compreender estreptavidina, NeutrAvidin, incluindo homólogos de proteína de outros organismos e derivados destes.
[0024] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida é uma partícula. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao peptídeo com aceptor por afinidade.
[0025] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao
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16/345 peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade especifica para uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade especifica para uma porção do terminalN do alelo HLA classe I ou classe II recombinante.
[0026] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
[0027] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica [32-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica [32-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que
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17/345 codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[0028] Em algumas modalidades, o segundo peptideo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptideo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta
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18/345 de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR) , etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE) , etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[0029] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas
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19/345 modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[0030] Em algumas modalidades, a determinação compreende a realização de análise bioquímica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas modalidades, a determinação compreende a obtenção de uma sequência de peptídeos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptídeos isolados dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptídeos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptídeos. Em algumas modalidades, o banco de dados de peptídeos é um banco de dados de peptídeos de especificidade sem enzima, por exemplo, um banco de dados sem modificação ou um banco de dados com modificação. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a pesquisa do banco de dados de peptídeos usando uma estratégia de pesquisa reversa de banco de dados. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula humana. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula de camundongo. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula CHO. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS,
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ExpiCHO, CHO e THP1.
[0031] Em algumas modalidades, a população de células é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, agentes que alteram o processamento de antígeno (por exemplo, inibidores de peptidase, inibidores de proteassoma e inibidores de TAP), ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam uma via metabólica ou um estado metabólico das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam o proteoma celular das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular (por exemplo, AIRE ou uma proteína de ligação ao CREB ou moduladores desta) das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam um fator de transcrição das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular de um HLA das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular do proteoma das células.
[0032] Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células
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21/345 tumorais. Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento dos referidos complexos HLA-peptideo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o referido agente é uma citocina inflamatória, um agente quimico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[0033] Em algumas modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA mutado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da proteina do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a análise para expressão pode compreender um ensaio Western blot, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), espectrometria de massa (MS), um ensaio de hibridização de microarranjo, um ensaio RNA-seq, um ensaio de reação em cadeia de polimerase, um ensaio LAMP, um ensaio de reação em cadeia de ligase, um ensaio Southern blot, um ensaio Northern blot ou um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
[0034] Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para diferentes alelos HLA. Em algumas modalidades, cada alelo HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única. Em algumas modalidades, cada ácido polinucléico que codifica um alelo
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HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única.
[0035] É fornecido nesse relatório descritivo um banco de dados de sequências de peptideo de ligação especifica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma combinação de dois ou mais bancos de dados de sequências de peptideo de ligação especifica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo repetidamente, cada vez usando um alelo HLA diferente. É fornecido nesse relatório descritivo um método para a geração de um algoritmo de previsão para identificação de peptideos de ligação alelo HLA-especificos, que compreende o treinamento de uma máquina com um banco de dados de sequências de peptideos descrito nesse relatório descritivo ou uma combinação descrita nesse relatório descritivo.
[0036] Em algumas modalidades, a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e redes neurais. Em algumas modalidades, uma variável usada para treinar a máquina compreende uma ou mais variáveis selecionadas do grupo que consiste em sequência de peptideos, propriedades fisicas do aminoácido, propriedades fisicas do peptideo, nivel de expressão da proteina-fonte de um peptideo dentro de uma célula, estabilidade da proteina, taxa de tradução de proteina, sitios de ubiquitinação, taxa de degradação de proteina, eficiências de tradução a partir do perfil ribossomal, capacidade de divagem de proteina, localização da proteina, motivos da proteina hospedeira que facilitam o transporte de TAP, proteina hospedeira ser submetida à autofagia, motivos que favorecem estagnação
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23/345 ribossômica, e características da proteína que favorecem NMD .
[0037] Em algumas modalidades, os motivos que favorecem estagnação ribossômica compreendem trechos de poliprolina ou polilisina. Em algumas modalidades, as características da proteína que favorecem NMD são selecionadas do grupo que consiste em uma UTR-3' longa, um códon de parada maior do que 50 ácidos nucleicos a montante da última junção éxon:éxon e capacidade de divagem de peptídeo.
[0038] É fornecido nesse relatório descritivo um método para identificação de peptídeos de ligação alelo HLAespecíficos, que compreende a análise da sequência de um peptídeo com uma máquina que foi treinada com um banco de dados de sequências de peptídeos obtido por realização de um método descrito nesse relatório descritivo para o alelo HLA. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação do nível de expressão da proteína-fonte do peptídeo dentro de uma célula; e em que a expressão da proteína-fonte é uma variável preditiva usada pela máquina. Em algumas modalidades, o nível de expressão é determinado por medição da quantidade de proteína-fonte ou da quantidade de RNA que codifica a referida proteína-fonte.
[0039] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma codificando um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência que codifica uma cadeiaα do alelo HLA classe I recombinante diferente, uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade e,
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24/345 opcionalmente, uma sequência que codifica [32-microglobulina; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c) , estão ligadas operacionalmente.
[0040] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma compreendendo uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe II recombinante, uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c) , estão ligadas operacionalmente. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico recombinante é isolado. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-
A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas
modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que
consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP.
[0041] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a molécula de aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA
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25/345 recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA recombinante por um vinculador.
[0042] Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas pelo mesmo polinucleotideo. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas por polinucleotídeos diferentes. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado se liga especificamente a uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem dois ou mais peptídeos com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que pelo menos duas das três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem o mesmo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, os dois ou mais peptídeos com aceptor por afinidade são únicos para cada uma das (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade.
[0043] Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é selecionado do grupo que consiste em
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26/345 peptídeo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteína D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP) , etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD) , etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-iike (SUMO), etiqueta de purificação por
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27/345 afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[0044] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente a uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com uma sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, para dois ou mais dos ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica o HLA marcado com aceptor por afinidade está integrada estavelmente no genoma de uma célula. Em algumas modalidades, a sequência que codifica [32-microglobulina ou a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende uma etiqueta de HA. Em algumas modalidades, a sequência que codifica β2microglobulina ou a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica o HLA recombinante e o peptídeo com aceptor por afinidade por um
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28/345 vinculador.
[0045] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sitio de salto ribossomal ou um elemento de sitio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[0046] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende duas ou mais moléculas de polipeptídeo isoladas codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreendem duas ou mais moléculas de polipeptídeo codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreendem uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreende uma ou mais células que compreendem uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[0047] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA classe I ou classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é
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29/345 modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos e um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a composição é formulada usando peptídeos ou ácidos polinucleicos que codificam peptídeos específicos para um tipo de HLA de um paciente. É fornecido nesse relatório descritivo um método de produção de uma célula, que compreende a transdução ou transfecção de duas ou mais células com os dois ou mais ácidos polinucleicos de uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[0048] É fornecido nesse relatório descritivo um peptídeo identificado de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a
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30/345 administração ao mamifero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamifero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a célula apresenta o peptideo como um complexo HLA-peptideo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo
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31/345 um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo.
[0049] Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune de célula T. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de célula T CD8. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de células T CD4. Em algumas modalidades, a resposta imune é resposta imune humoral.
[0050] É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade
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32/345 eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a doença é câncer. Em algumas modalidades, a doença é infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, opcionalmente um virus ou bactéria, ou um parasita.
[0051] Em algumas modalidades, o virus é selecionado do grupo que consiste em: virus BK (BKV), virus da Dengue (DENV1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus da Hepatite B (HBV), virus da Hepatite C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, virus da imunodeficiência humana (HIV), virus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um virus influenza, RSV, HPV, raiva, virus da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, virus da varicela, papilomavirus humano (HPV), variola, zoster, e qualquer combinação destes.
[0052] Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e qualquer combinação destas .
[0053] Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp.,
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33/345 e qualquer combinação destes.
[0054] É fornecido nesse relatório descritivo um método de enriquecimento para peptideos imunogênicos, que compreende: o fornecimento de uma população de células que compreende uma ou mais células que expressam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um peptideo com aceptor por afinidade ligado operacionalmente a um HLA recombinante codificado por um alelo HLA recombinante; e enriquecimento para complexos HLA-peptideo que compreendem o HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a determinação da sequência de peptideos imunogênicos isolados dos complexos HLA-peptideo. Em algumas modalidades, a determinação compreende a utilização de LCMS/MS.
[0055] É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptídeo que compreende a sequência de um
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34/345 peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um individuo, o método compreendendo a administração ao individuo de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo.
[0056] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um individuo com uma doença ou condição, que compreende o fornecimento de uma população de células derivadas de um individuo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento e caracterização dos complexos de peptideosHLA marcados com aceptor por afinidade; e, opcionalmente, desenvolvimento de uma terapêutica com base na caracterização.
[0057] É fornecido nesse relatório descritivo um método de identificação de pelo menos um antigeno imunogênico especifico do individuo e preparação de uma composição imunogênica especifica para o individuo que inclui o (pelo menos um) antigeno imunogênico especifico do individuo, em
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35/345 que o indivíduo possui uma doença e o (pelo menos um) antígeno imunogênico específico do indivíduo é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo, o referido método compreendendo: o fornecimento de uma população de células derivadas de um indivíduo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células do indivíduo, de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento para complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade das (uma ou mais) células; identificação de um peptideo imunogênico dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos que é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo; e formulação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo com base em um ou mais dos peptideos imunogênicos específicos para o indivíduo identificados.
[0058] Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica específica para o indivíduo compreende um peptideo dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica
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36/345 específica para o indivíduo compreende uma célula T que expressa um receptor de célula T (TCR) que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, a composição imunogênica específica para o indivíduo compreende uma célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR) que expressa um receptor que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos.
[0059] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de outro agente terapêutico, opcionalmente, um inibidor do ponto de verificação imune ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de um adjuvante, opcionalmente, poli-ICLC, ao indivíduo.
[0060] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é câncer. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é uma infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, um vírus, bactéria ou um parasita.
[0061] Em algumas modalidades, o vírus é selecionado do grupo que consiste em: vírus BK (BKV), vírus da Dengue (DENV1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovírus (CMV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um vírus influenza, RSV, HPV, raiva, vírus
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37/345 da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, vírus da varicela, papilomavírus humano (HPV), varíola, zoster, e qualquer combinação destes.
[0062] Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e combinações destas.
[0063] Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp., e qualquer combinação destes.
[0064] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição, que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica pelo menos dois alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica os (pelo menos dois) HLAs classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreende a primeira sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um primeiro alelo HLA classe I ou classe II ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um primeiro peptídeo com aceptor por afinidade; e uma segunda sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um segundo alelo HLA classe I ou
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38/345 classe II ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade; expressão dos (pelo menos dois) HLAs marcados com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e identificação de um peptideo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos; e formulação de uma composição imunogênica com base em um ou mais dos peptídeos identificados, em que o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II recombinantes são compatíveis com um haplótipo de HLA de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma doença ou condição.
[0065] Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é diferente do segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o primeiro peptideo com aceptor por afinidade é o mesmo que o segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um peptideo ligado ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de
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39/345 peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um dominio transmembrana. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio intracelular. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são excretados. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptideos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade.
[0066] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLAespecíficos. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptídeos exógenos à população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptídeos exógenos ou a expressão dos (um ou mais) peptídeos exógenos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos exógenos.
[0067] Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA.
[0068] Em algumas modalidades, o enriquecimento não
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40/345 compreende o uso de um reagente tetramérico. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação da sequência de um peptídeo ou uma porção desta ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LC-MS/MS, ou uma combinação destas.
[0069] Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptídeo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação de se um peptídeo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de associações de peptídeos com moléculas HLA no primeiro e/ou no segundo complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[0070] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptídeos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptídeos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptídeos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades,
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41/345 a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição.
[0071] Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer ou uma infecção com um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo, opcionalmente em que os peptídeos são de uma ou mais proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptídeos das (uma ou mais) proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo derivados de um agente infeccioso.
[0072] Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias. Em algumas modalidades, o peptídeo do primeiro e/ou do segundo complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um indivíduo quando apresentado por uma célula apresentadora de antígeno. Em algumas modalidades, o método compreende a comparação de complexos HLA-peptídeo de células doentes com complexos HLA-peptídeo de células não doentes. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor
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42/345 por afinidade antes da identificação. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superficie celular de HLA classe I ou classe II.
[0073] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células expressa os alelos HLA endógenos normalmente expressos pela população de células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knockout de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos
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43/345 os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um segundo alelo HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLADR, HLA-DQ e HLA-DP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe II e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um segundo alelo HLA classe II.
[0074] Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão, cada uma, ligadas operacionalmente. Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão compreendidas em moléculas de polinucleotideos diferentes. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo peptideo com aceptor
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44/345 por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II por um vinculador.
[0075] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam o primeiro e/ou segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos
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45/345 de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[0076] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de marcação que compreende um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB) , Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag), etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteina de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag,
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Calmodulina-tag, E-tagr S-tagr SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S~tagr etiqueta de proteína carreadora de biotinacarbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP) , HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[0077] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[0078] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a
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47/345 superfície sólida é uma partícula.
[0079] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminal-N do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II.
[0080] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
[0081] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe
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II recombinante é uma primeira cadeia-α de HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é uma segunda cadeia-α de HLA classe I.
[0082] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptideo com aceptor por afinidade.
[0083] Em algumas modalidades, o terceiro peptideo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II e/ou uma cadeia-β de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA classe II HLA está conectada à sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II. Em
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49/345 algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II.
[0084] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II ou a cadeia-α de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[0085] Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptídeo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptídeo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteína D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase
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50/345 alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-iike (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[0086] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador
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51/345 clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[0087] Em algumas modalidades, o método compreende a realização de análise bioquímica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas modalidades, o método compreende a obtenção de uma sequência de peptideos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptideos isolados dos complexos de peptideosHLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptideos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptideos.
[0088] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO e THP1. Em algumas modalidades, a linhagem de célula é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células tumorais.
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52/345 [0089] Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento do primeiro e/ou segundo complexos HLA-peptídeo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o agente é uma citocina inflamatória, um agente quimico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[0090] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo alelo HLA é um alelo HLA mutado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade.
[0091] Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA que codifica o primeiro e/ou segundo RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da primeira e/ou segunda proteina do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência de código de barras única. Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência compreendem uma sequência de código de barras única.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0092] As características da presente revelação são
apresentadas com particularidade nas reivindicações em
anexo. Uma melhor compreensão das características e
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53/345 vantagens da presente revelação será obtida por referência à descrição detalhada seguinte que apresenta modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da revelação são utilizados, e aos desenhos que a acompanham, nos quais:
[0093] A FIGURA 1A é uma representação esquemática representativa de um fluxo de imunopurificação universal e de geração de dados. Moléculas HLA classe I e/ou classe II são introduzidas em qualquer célula, incluindo uma célula que não expressa HLA classe I ou classe II, de modo que um alelo (ou alelos) HLA classe I ou classe II específico seja expresso na célula. Populações de células que expressam HLA modificadas geneticamente são coletadas, lisadas, e seus complexos HLA-peptídeo são etiquetados (por exemplo, biotinilados) e imunopurifiçados (por exemplo, usando a interação biotina-estreptavidina). Peptídeos associados ao HLA específicos para um único HLA podem ser eluídos de seus complexos etiquetados (por exemplo, biotinilados) e avaliados (por exemplo, sequenciados usando LC-MS/MS de alta resolução).
[0094] A FIGURA 1B é uma representação esquemática de estruturas de moléculas HLA classe II -DP, -DQ, e -DR. HLADR moléculas são heterodímeros que contêm uma cadeia-a constante e uma cadeia-β variável. Moléculas HLA-DQ e HLADP são heterodímeros que contêm cadeias-α variáveis e cadeias-β variáveis.
[0095] A FIGURA 2 é uma representação esquemática representativa de construções projetadas para expressão de HLA classe I e II em linhagens de células cultivadas. Construções HLA-A*02:01 representam designs de HLA classe I que implementam peptídeos aceptores de biotina (BAP) para
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54/345 biotinilação e imunopurificação. Construções HLA-DAS1*11:01 representam designs de HLA classe II que implementam peptídeos aceptores de biotina (BAP) para biotinilação e imunopurificação.
[0096] A FIGURA 3 é uma representação esquemática de um vetor lentiviral exemplar que pode ser usado para gerar linhagens de células estáveis que expressam construções de HLA classe I e classe II.
[0097] A FIGURA 4A é uma representação esquemática representativa de uma introdução à base de transfecção de construções de HLA classe I ou classe II para IP universal e sequenciamento de peptídeo associado ao HLA por LC-MS/MS.
[0098] A FIGURA 4B é uma representação esquemática representativa de uma introdução à base de transfecção de construções de HLA classe I ou classe II, seguida por um processo de seleção, por exemplo, inclusão de um gene de resistência antibiótica. As células selecionadas podem então ser submetidas à IP universal e sequenciamento de peptídeo associado ao HLA por LC-MS/MS.
[0099] A FIGURA 5 é uma representação esquemática de imunopurificação universal para HLA classe I e classe II. As células, por exemplo, HEK293T (rim embrionário humano), são transfectadas ou transduzidas para expressar um alelo HLA classe I ou classe II único com um marcador por afinidade para imunopurificação. Células que expressam HLA-etiquetado são coletadas, lisadas, e seus complexos HLA-peptídeo são biotinilados e imunopurifiçados usando a interação biotinaestreptavidina. Peptídeos associados ao HLA específicos para um único HLA são eluídos de seus complexos biotinilados e analisados (por exemplo, sequenciados usando LC-MS/MS de
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55/345 alta resolução).
[00100] A FIGURA 6A é um Western blot (anti-biotinilação) que compara transfecções simuladas, de GFP e plasmideo vazio com construções HLA-A*02:01 para imunoprecipitação à base de biotinilação, que demonstra a expressão de alelos HLA classe I em células HEK293T.
[00101] A FIGURA 6B é um gel corado com Ponceau usado como a controle de carregamento para a análise Western blot.
[00102] A FIGURA 6C é uma representação esquemática de construções de HLA classe I usadas para gerar células HEK293T modificadas geneticamente das imagens na FIGURA 6A e FIGURA 6B.
[00103] A FIGURA 7A consiste em imagens de um Western blot (superior) e de controle de carregamento (inferior) de um experimento de evolução temporal da biotinilação, que demonstra que a biotinilação de HLA-BAP marcado no terminalC e -N está completa em 10 minutos para células que expressam HLA classe I e classe II-BAP. Os resultados mostram otimização de transfecção e biotinilação de alelos HLA classe I e classe II-BAP expressos por células HEK293T.
[00104] A FIGURA 7B é um Western blot contra o anti-BAP (superior) e controle de carregamento (inferior) de células que expressam construções de HLA classe I e classe II marcadas com BAP no terminal-N e -C.
[00105] A FIGURA 7C é uma representação esquemática de construções de classe I (HLA-A*02:01) e classe II (HLADR[3*ll:01) marcadas com BAP no terminal-N e -C usadas para otimização de transfecção e biotinilação.
[00106] A FIGURA 8A é uma imagem de Western blot (antiestreptavidina para marcador de BAP e anti-HA para marcador
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56/345 de HA) e controles de carregamento (Ponceau S) que mostra a expressão de construções biotiniladas de HLA classe I e classe II usadas para imunoprecipitação de HLA em células HEK293T. Os lisados foram analisados antes da adição de biotina (-Biotina), depois da adição de biotina (+Entrada de Biotina), e após biotinilação e pulldown subsequente com particulas de estreptavidina (+Biotina FT) . A redução no sinal na raia +Biotina FT demonstra que MHC biotinilado está sendo removido do lisado e se ligando às particulas de estreptavidina.
[00107] A FIGURA 8B é uma imagem de Western blot (antiestreptavidina para marcador de BAP e anti-HA para marcador de HA) e controles de carregamento (Ponceau S) que mostra a expressão de construções biotiniladas de HLA classe I e classe II usadas para imunoprecipitação de HLA em células HeLa (câncer cervical humano). Os lisados foram analisados antes da adição de biotina (-Biotina), depois da adição de biotina (+Entrada de Biotina), e após biotinilação e pulldown subsequente com partículas de estreptavidina (+Biotina FT) . A redução no sinal na raia +Biotina FT demonstra que MHC biotinilado está sendo removido do lisado e se ligando às partículas de estreptavidina.
[00108] A FIGURA 8C é uma imagem de Western blot (antiestreptavidina para marcador de BAP e anti-HA para marcador de HA) e controles de carregamento (Ponceau S) que mostra a expressão de construções biotiniladas de HLA classe I e classe II usadas para imunoprecipitação de HLA em células A375 (melanoma maligno humano). Os lisados foram analisados antes da adição de biotina (-Biotina), depois da adição de biotina (+Entrada de Biotina), e após biotinilação e pulldown
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57/345 subsequente com partículas de estreptavidina (+Biotina FT). A redução no sinal na raia +Biotina FT demonstra que MHC biotinilado está sendo removido do lisado e se ligando às partículas de estreptavidina.
[00109] A FIGURA 8D é uma imagem de Western blot (antiestreptavidina para marcador de BAP e anti-HA para marcador de HA) e controles de carregamento (Ponceau S) que mostra a expressão de construções biotiniladas de HLA classe I e classe II usadas para imunoprecipitação de HLA em células Expi293 (rim embrionário humano modificado geneticamente para cultura e expressão de proteína em alta densidade). Os lisados foram analisados antes da adição de biotina (Biotina), depois da adição de biotina (+Entrada de Biotina), e após biotinilação e pulldown subsequente com partículas de estreptavidina (+Biotina FT) . A redução no sinal na raia +Biotina FT demonstra que MHC biotinilado está sendo removido do lisado e se ligando às partículas de estreptavidina.
[00110] A FIGURA 9A é um gráfico de barras de uma análise por LC-MS/MS exemplar de peptídeos associados ao HLA isolados usando o fluxo de imunoprecipitação universal de HLA (IP Universal). É mostrada uma representação em gráfico de barras dos peptídeos associados ao HLA únicos totais identificados de vários tipos de células (A375; cinza, HEK293T; laranja, HeLa; azul) que expressam construções marcadas por afinidade de HLA classe I e classe II usadas no fluxo de IP Universal.
[00111] A FIGURA 9B é um gráfico de barras que mostra dados representativos de criação de perfil de peptídeo HLA classe I monoalélico por LC-MS/MS. Cada barra representa o número total de peptídeos associados ao HLA únicos identificados por experimentos de classe I monoalélico que
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58/345 implementaram as construções de HLA marcado por afinidade.
[00112] A FIGURA 9C é um gráfico de barras que mostra dados representativos de criação de perfil de peptídeo HLA classe II monoalélico por LC-MS/MS. Cada barra representa o número total de peptídeos associados ao HLA únicos identificados por experimentos de classe II monoalélico que implementaram as construções de HLA marcado por afinidade.
[00113] A FIGURA 10A é uma representação esquemática das características de peptídeos associados ao HLA classe I e classe II descobertos usando o fluxo de IP Universal. É mostrada uma representação por Sequence Logo exemplar de peptídeos associados ao HLA-A*02:01 classe I e peptídeos associados ao HLA-DRp*ll:01 classe II isolados e sequenciados usando a plataforma de IP Universal.
[00114] A FIGURA 10B é um gráfico de barras que mostra distribuições de comprimento de peptídeo associado ao HLA, que compara peptídeos associados ao HLA da classe I (vermelho; HLA-A*02 : 01) e da classe II (azul; HLA-DR[3*11: 01) identificados usando o fluxo de IP Universal. As distribuições de comprimento de peptídeos associados ao HLA tanto da classe I quanto da classe II identificados usando o IP Universal seguem as tendências esperadas.
[00115] A FIGURA 11A é uma representação esquemática de construções de HLA classe II que foram modificadas geneticamente para expressão por diferentes tipos de células para o fluxo de IP Universal.
[00116] A FIGURA 11B é uma representação esquemática dos complexos de HLA classe II que podem se formar mediante expressão da construção mostrada na FIGURA 11A em linhagens de células que expressam subunidades da cadeia-α e cadeia-β
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59/345 endógenas de HLA da classe II. Complexos de HLA da classe II são formados por pareamento da cadeia-α e cadeia-β, que são, cada uma, etiquetadas com um identificador de afinidade diferente.
[00117] A FIGURA 12A é uma representação esquemática de uma estratégia de IP Universal serial que pode ser usada para deconvolução do pareamento da cadeia-α e cadeia-β de HLA da classe II retratado na FIGURA 11B e alocações não ambiguas de ligação ao peptideo aos complexos de HLA da classe II específicos e demonstra validação da IP Universal serial de complexos de HLA da classe II que contêm múltiplos marcadores por afinidade. Células que expressam construções de HLA da classe II marcado com afinidade dupla são lisadas, biotiniladas e incubadas com partículas acopladas a anticorpos anti-HA. Complexos de HLA Classe II com subunidades marcadas com HA são isolados, lavados e eluidos usando um peptideo de HA (por exemplo, YPYDVPDYA). A eluição é então incubada com partículas acopladas a NeutrAvidin ou estreptavidina para isolar os complexos de HLA da classe II marcados com HA e marcados com biotina. Peptideos ligados aos complexos de HLA da classe II com marcação dupla são então eluidos e sequenciados por LC-MS/MS.
[00118] A FIGURA 12B é uma validação por Western blot da estratégia de IP Universal serial em células HEK293T que expressam construções HLA-DRB*11:01 com marcação dupla. Um anticorpo anti-HA foi usado para acompanhar o processo de enriquecimento serial. Um controle de carregamento (gel corado com Ponceau S) é mostrado.
[00119] A FIGURA 12C representa os resultados de um experimento de controle negativo exemplar no qual células
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60/345 que expressam construção de HLA da classe II marcado com afinidade dupla HLA-DRB*11:01 foram lisadas e incubadas com particulas acopladas a anticorpos anti-HA sem biotinilação. Um Western blot e controle de carregamento (gel corado com Ponceau S) são mostrados para demonstrar a especificidade do fluxo de IP Universal serial. Nenhum enriquecimento foi observado quando a etapa de biotinilação foi removida do protocolo de IP Universal serial.
[00120] A FIGURA 13 é uma representação esquemática de experimentos de uma limpeza panorâmica de HLA classe II que permitem a identificação de epitopos de ligação centrais. Moléculas HLA classe II se ligam a conjuntos aninhados de peptideos, normalmente com 12-18 aminoácidos de comprimento, gerados a partir da mesma proteina-fonte. Peptideos mais longos ressaltam dos lados do terminal-N e -C de moléculas HLA classe II, enquanto o epitopo central interage mais fortemente com o sulco de ligação ao peptídeo. Peptideos ligados às moléculas HLA classe II são limpos usando peptidases específicas para extremidades do terminal-N e C. Após limpeza, os epitopos peptídicos centrais são sequenciados usando LC-MS/MS.
[00121] A FIGURA 14A é uma representação esquemática de uma abordagem de criação de perfil de peptidoma de HLA monoalélico que implementa um marcador por afinidade de biotina. Uma modalidade exemplar da presente revelação se utiliza do peptídeo aceptor de biotina (BAP) que é biotinilado em um resíduo de lisina (K) por uma enzima BirA. A sequência de peptideos de BAP contém um resíduo de lisina que é biotinilado mediante a adição de enzima BirA, biotina e ATP. O produto biotinilado exibe alta afinidade por
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61/345 estreptavidina/NeutrAvidin. Partículas de estreptavidina/NeutrAvidin podem ser usadas para enriquecer para a sequência de peptideos de BAP biotinilada.
[00122] A FIGURA 14B é uma representação esquemática de imunopurificação à base de biotina de moléculas HLA modificadas geneticamente. Um alelo HLA específico com uma sequência de BAP no terminal-N ou -C da proteína HLA é introduzido em uma célula, por exemplo, por transfecção ou transdução de um plasmídeo. Observe que o plasmídeo contém um código de barras de DNA que permite que um método à base de PCR monitore a linhagem de célula para cada alelo. Comprimentos de código de barras podem ser de pelo menos 5 pares de bases, pelo menos 10 pares de bases, pelo menos 15 pares de bases, pelo menos 20 pares de bases ou mais. Células que expressam as proteínas HLA-BAP são lisadas e biotiniladas. Complexos HLA-BAP-peptídeo são imunopurifiçados da mistura complexa de lisados, que podem ser submetidos à análise por LC-MS/MS para identificação de peptideo.
[00123] A FIGURA 15 é uma representação esquemática de uma aplicação exemplar da plataforma de IP Universal para validação e descoberta de epitopo direcionado. Uma linhagem de célula de interesse é modificada geneticamente para expressar uma construção de HLA-etiquetado alelo-específico (por exemplo, BAP). Células que expressam moléculas de HLAetiquetado (por exemplo, BAP) são modificadas geneticamente para expressar um único epitopo ou múltiplos epitopos. Células que expressam epitopo são lisadas e complexos HLABAP-peptídeo são imunopurifiçados. Antígenos peptídicos isolados podem ser examinados por qualquer meio adequado,
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62/345 por exemplo, sequenciados por LC-MS/MS, e fragmentos de peptideo gerados pelos epitopos introduzidos podem ser usados como uma leitura de alto rendimento para processamento e apresentação de antigeno com alelo HLA compatível.
[00124] A FIGURA 16 é uma representação esquemática da multiplexação de alelos HLA dentro do fluxo de IP Universal. Múltiplos alelos classe I e classe II podem ser expressos a partir de uma única construção de HLA. Por exemplo, múltiplas cadeias pesadas podem ser incluídas em uma construção da classe I e múltiplas cadeias-β e/ou -a podem ser incluídas em uma construção da classe II. Por multiplexação de alelos HLA em uma única construção, múltiplas moléculas HLA podem ser liberadas e expressas em uma linhagem de célula de interesse. A multiplexação de alelos permite a combinação com tipos de HLA do paciente e leituras personalizadas de antigeno peptidico com a aplicação do fluxo de IP Universal e análise subsequente do complexo e/ou peptideo, por exemplo, leitura por LC-MS/MS.
[00125] A FIGURA 17 é uma representação esquemática de abordagens multialélicas e monoalélicas na criação de perfil do ligante de HLA. Em uma abordagem multialélica, os ligantes de HLA são co-imunoprecipitados com heterodimeros de HLA diretamente do material ou de linhagens de células do paciente (superior). Como essas células expressavam naturalmente múltiplos alelos HLA, peptideos identificados por essas abordagens multialélicas devem ser deconvolucionados para atribuir ligação a um heterodimero de HLA especifico se os tipos de HLA são conhecidos. Em uma abordagem monoalélica, os ligantes de HLA são coimunoprecipitados com heterodimeros de HLA de linhagens de
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63/345 células modificadas geneticamente para expressão somente de um único alelo HLA (inferior). Dessa forma, peptideos identificados por abordagens monoalélicas não necessitam de deconvolução para alocações de ligação ao heterodimero de HLA.
[00126] A FIGURA 18A é um diagrama que mostra peptídeo neoantigênico mutado apresentado em MHC.
[00127] A FIGURA 18B é um método esquemático de desenvolvimento de uma terapia personalizada de direcionamento a neoantígeno como descrita nesse relatório descritivo.
[00128] A FIGURA 19 mostra uma representação esquemática que mostra diferentes abordagens experimentais de criação de perfil de diferentes ligantes de HLA. O ensaio bioquímico de ligação de peptídeo:MHC (p:MHC) é lento e de baixo rendimento e não possui informações sobre o processamento. A espectrometria de massa multialélica é de alto rendimento e possui habilidade para aprender as regras de processamento; no entanto, ela exige imputação in silico para atribuir peptideos aos alelos. A espectrometria de massa monoalélica fornece uma abordagem rápida, imparcial e limpa para definição de motivos de ligação ao peptídeo através de alelos de MHC diversos. A espectrometria de massa monoalélica pode preencher rapidamente e sistematicamente lacunas de cobertura de alelos e torna possível alavancar preferências de comprimento de peptídeo alelo-específicas.
[00129] A FIGURA 20A mostra uma tabela de peptideos de ligação ao HLA exemplares para alelos A*01:01, B*51:01, A*29:02 e B*54:01 descobertos com o uso de abordagem monoalélica. A abordagem monoalélica descobre peptideos de
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64/345 ligação ao HLA que têm pontuação baixa por NetMHCpan, mas validam bioquimicamente como aglutinantes fortes.
[00130] A FIGURA 20B é um gráfico de barras que mostra taxas de alocação incorretas em 100 deconvoluções simuladas. Um genótipo aleatório de seis alelos HLA do paciente (2 alelos cada de HLA-A, HLA-B e HLA-C, amostragem em frequências de alelos nos EUA) foi gerado. Para cada alelo, 500 peptideos do experimento monoalélico relevantes foram amostrados e combinados com um conjunto de dados multialélicos simulado de 3.000 peptideos. Cada peptideo foi atribuído ao alelo que gera a melhor pontuação na classificação de NetMHCpan% para determinar a percentagem de peptideos incorretamente atribuídos por NetMHCpan. Esse processo foi repetido 100 vezes.
[00131] A FIGURA 21 é uma ilustração esquemática de previsor de apresentação em MHC para diversos alelos de MHC Classe I individuais usando dados de MS. O treinamento e avaliação de modelo são realizados em proteínas-fontes não sobrepostas. Peptideos observados por MS são designados para treinar/testar, dependendo da proteína-fonte. A abordagem de avaliação emprega um excesso de 5.000:1 de iscas para aglutinantes verdadeiros.
[00132] A FIGURA 22 é um gráfico de barras que mostra previsões significativamente aprimoradas tanto em termos de processamento quanto de ligação alelo-específica.
DESCRIÇÃO DETALHADA [00133] A descrição e exemplos seguintes ilustram modalidades da revelação em detalhe. Deve ser subentendido que essa revelação não está limitada às modalidades particulares descritas nesse relatório descritivo e, dessa
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65/345 forma, elas podem variar. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão que há numerosas variações e modificações dessa revelação, que estão englobadas dentro de seu escopo.
[00134] Todos os termos visam ser subentendidos como seriam subentendidos por aqueles técnicos no assunto. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem o mesmo significado que comumente subentendido por aqueles técnicos no assunto à qual a revelação pertence.
[00135] Os cabeçalhos de seção usados nesse relatório descritivo são apenas para fins organizacionais e não devem ser considerados como limitantes do tema descrito.
[00136] Embora várias características da presente revelação possam ser descritas no contexto de uma modalidade única, as características também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer combinação adequada. Inversamente, embora a presente revelação possa ser descrita nesse relatório descritivo no contexto de modalidades separadas para maior clareza, a revelação também pode ser implementada em uma modalidade única.
[00137] As definições seguintes suplementam aquelas na técnica e são dirigidas ao pedido atual e não devem ser imputadas a nenhum caso relacionado ou não relacionado, por exemplo, a nenhuma patente ou pedido comumente concedido. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados na prática para testagem da presente revelação, são descritos nesse relatório descritivo materiais e métodos exemplares. Consequentemente, a terminologia usada nesse relatório descritivo tem apenas o
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66/345 objetivo de descrever modalidades particulares, e não visa ser limitante.
Definições [00138] Nesse pedido, o uso do singular inclui o plural, salvo indicação especifica em contrário. Deve ser observado que, como usadas no relatório descritivo, as formas no singular um, uma, o e a incluem referentes no plural, salvo o contexto determine claramente o contrário. Nesse pedido, o uso de ou significa e/ou, a menos que seja afirmado o contrário. Além disso, uso do termo que inclui, bem como outras formas, por exemplo, incluem, inclui e incluido, não é limitante.
[00139] O termo um ou mais ou pelo menos um, por exemplo, um ou mais ou pelo menos um membro (ou membros) de um grupo de membros, é claro per se, por meio de exemplificação adicional, que o termo engloba inter alia uma referência a qualquer um dos referidos membros, ou a quaisquer dois ou mais dos referidos membros como, por exemplo, quaisquer >3, >4, >5, >6 ou >7 etc. dos referidos membros, e até todos os referidos membros.
[00140] Referência no relatório descritivo a algumas modalidades, uma modalidade, uma modalidade ou outras modalidades significa que um recurso, estrutura ou caracteristica descrita em conexão com as modalidades está incluida em pelo menos algumas modalidades, mas não necessariamente em todas as modalidades, da presente revelação.
[00141] Como usadas nesse relatório descritivo e reivindicação (ou reivindicações), as palavras que compreende (e qualquer forma de que compreende, por
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67/345 exemplo, compreendem e compreende), que possui (e qualquer forma de que possui, por exemplo, possuem e possui), que inclui (e qualquer forma de que inclui, por exemplo, inclui e incluem) ou que contém (e qualquer forma de que contém, por exemplo, contém e contêm) são inclusivas ou em aberto e não excluem etapas do método ou elementos não citados adicionais. Está contemplado que qualquer modalidade discutida nesse relatório descritivo pode ser implementada com relação a qualquer método ou composição da revelação, e vice-versa. Além disso, as composições da revelação podem ser usadas para obter métodos da revelação.
[00142] O termo cerca de ou aproximadamente, como usado nesse relatório descritivo quando se refere a um valor mensurável como, por exemplo, um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, visa englobar variações de +/-20% ou menos, +/-10% ou menos, +/-5% ou menos, ou +/1% ou menos de e a partir de um valor especificado, na medida em que essas variações sejam apropriadas para realização na presente revelação. Deve ser subentendido que o valor ao qual o modificador cerca de ou aproximadamente se refere é, ele próprio, também especificamente revelado.
[00143] O termo resposta imune inclui respostas imunes mediadas por células T e/ou mediadas por células B que são influenciadas por modulação da coestimulação de células T. Respostas imunes exemplares incluem respostas de células T, por exemplo, produção de citocina, e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imune inclui respostas imunes que são afetadas indiretamente por ativação de célula T, por exemplo, produção de anticorpo (respostas humorais) e
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68/345 ativação de células responsivas à citocina, por exemplo, macrófagos.
[00144] Um receptor deve ser subentendido como significando uma molécula ou um agrupamento de moléculas biológicas capaz de ligação a um ligante. Um receptor pode servir para transmitir informação em uma célula, uma formação de células ou um organismo. O receptor compreende pelo menos uma unidade receptora e pode conter duas ou mais unidades receptoras, em que cada unidade receptora pode consistir em uma molécula de proteína, por exemplo, uma molécula de glicoproteína. O receptor possui uma estrutura que complementa a estrutura de um ligante e pode complexar o ligante como um parceiro de ligação. Informação de sinalização pode ser transmitida por alterações conformacionais do receptor após ligação com o ligante na superfície de uma célula. De acordo com a presente revelação, um receptor pode se referir às proteínas de MHC classes I e II capazes de formar um complexo receptor/ligante com um ligante, por exemplo, um peptideo ou fragmento de peptideo de comprimento adequado.
[00145] Uma sequência de código de barras pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que pode codificar um item de informação sobre uma sequência, por exemplo, a identidade de uma sequência à qual o código de barras está anexado ou a identidade de uma amostra da qual uma sequência é derivada.
[00146] O termo ligante significa uma molécula que é capaz de formar um complexo com um receptor. De acordo com a presente revelação, um ligante deve ser subentendido como significando, por exemplo, um peptideo ou fragmento de peptideo que possui um comprimento adequado e motivos de
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69/345 ligação adequados em sua sequência de aminoácidos, de modo que o peptídeo ou fragmento de peptídeo seja capaz de formar um complexo com proteínas de MHC classe I ou MHC classe II.
[00147] Um antígeno é uma molécula capaz de estimular uma resposta imune, e pode ser produzido por células de câncer ou agentes infecciosos ou por uma doença autoimune. Antígenos reconhecidos por células T, sejam linfócitos T auxiliares (células T auxiliares (Th) ) ou linfócitos T citotóxicos (CTLs), não são reconhecidos como proteínas intactas, mas sim como pequenos peptídeos que se associam com proteínas MHC classe I ou classe II na superfície de células. Durante a evolução de uma resposta imune de ocorrência natural, antígenos que são reconhecidos em associação com moléculas MHC classe II em células apresentadoras de antígeno (APCs) são adquiridos do exterior da célula, internalizados, e processados em pequenos peptídeos que se associam com as moléculas MHC classe II. APCs também podem apresentar de forma cruzada antígenos peptídicos por processamento de antígenos exógenos e apresentação dos antígenos processados em moléculas MHC classe I. Antígenos que dão origem a proteínas que são reconhecidas em associação com moléculas MHC classe I são geralmente proteínas que são produzidas dentro das células, e esses antígenos são processados e associados com moléculas MHC classe I. Sabe-se agora que os peptídeos que se associam com certas moléculas MHC classe I ou classe II são caracterizados como tendo um motivo de ligação comum, e os motivos de ligação para um grande número de moléculas MHC classe I e II diferentes foram determinados. Peptídeos sintéticos, que correspondem à sequência de aminoácidos de
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70/345 certo antigeno e que contêm um motivo de ligação para certa molécula MHC classe I ou II, também podem ser sintetizados. Esses peptídeos podem então ser adicionados às APCs apropriadas, e as APCs podem ser usadas para estimular uma resposta de célula T auxiliar ou de CTL in vitro ou in vivo. Os motivos de ligação, métodos para a síntese dos peptídeos, e métodos para estimulação de uma célula T auxiliar ou resposta de CTL são todos conhecidos e facilmente disponíveis àqueles técnicos no assunto.
[00148] O termo peptídeo é usado de forma intercambiável com peptídeo mutante e peptídeo neoantigênico no presente relatório descritivo. Similarmente, o termo polipeptídeo é usado de forma intercambiável com polipeptídeo mutante e polipeptídeo neoantigênico no presente relatório descritivo. O termo neoantígeno ou neoepitopo significa uma classe de antigenos tumorais ou epitopos tumorais que surge de mutações tumor-específicas na proteína expressa. A presente revelação ainda inclui peptídeos que compreendem mutações tumorespecíficas, peptídeos que compreendem mutações tumorespecíficas conhecidas, e polipeptídeos mutantes ou fragmentos destes identificados pelo método da presente revelação. Esses peptídeos e polipeptídeos são referidos nesse relatório descritivo como peptídeos neoantigênicos ou polipeptídeos neoantigênicos. Os polipeptídeos ou peptídeos podem ter diversos comprimentos, em suas formas neutras (sem carga) ou em formas que são sais, e livres de modificações como, por exemplo, glicosilação, oxidação da cadeia lateral, fosforilação, ou qualquer modificação póstradução, ou que contêm essas modificações, desde que a
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71/345 modificação não destrua a atividade biológica dos polipeptideos como descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, os peptideos neoantigênicos da presente revelação podem incluir: para MHC Classe I, 22 resíduos ou menos de comprimento, por exemplo, de cerca de 8 até cerca de 22 resíduos, de cerca de 8 até cerca de 15 resíduos, ou
9 ou 10 resíduos; para MHC Classe II, 40 resíduos ou menos
de compr imento, por exemplo, de cerca de 8 até cerca de 40
resíduos de comprimento, de cerca de 8 até cerca de 24
resíduos de comprimento, de cerca de 12 até cerca de 19
resíduos , ou de cerca de 14 até cerca de 18 resíduos. Em
algumas modalidades, um peptideo neoantigênico ou
polipeptídeo neoantigênico compreende um neoepitopo.
[00149] O termo epitopo inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo, peptideo de anticorpo e/ou molécula anticorpo-like (incluindo, sem limitação, um receptor de célula T) como definido nesse relatório descritivo. Determinantes epitópicos tipicamente consiste em grupos de moléculas quimicamente ativas na superfície como, por exemplo, aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e geralmente possuem características estruturais tridimensional específicas, bem como características de carga específicas.
[00150] O termo epitopo de célula T significa uma sequência de peptideos que pode ser ligada pelas moléculas MHC de classe I ou II na forma de uma molécula MHC de apresentação de peptideo ou complexo de MHC e depois, nessa forma, ser reconhecido e ligado por linfócitos T citotóxicos ou células T auxiliares, respectivamente.
[00151] O termo anticorpo, como usado nesse relatório
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72/345 descritivo, inclui IgG (incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo IgAl e IgA2), IgD, IgE, ou IgM e IgY, e visa incluir anticorpos inteiros, incluindo anticorpos inteiros de cadeia única e fragmentos de ligação ao antigeno (Fab) destes. Fragmentos de anticorpo de ligação ao antigeno incluem, sem limitação, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd (que consiste em VH e CHI), fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmento variável ligado por dissulfeto (dsFv) e fragmentos que compreendem um dominio VL ou VH. Os anticorpos podem se originar de qualquer animal. Fragmentos de anticorpo de ligação ao antigeno, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a região (ou regiões) variável isoladamente ou em combinação com tudo ou parcialmente um dos seguintes: região de dobradiça, domínios CHI, CH2 e CH3. Também são incluídas quaisquer combinações de região (ou regiões) variável e região de dobradiça, domínios CHI, CH2 e CH3. Anticorpos podem ser monoclonais, policlonais, quiméricos, humanizados e anticorpos monoclonais e policlonais humanos que, por exemplo, se ligam especificamente a um polipeptídeo HLA-associado ou um complexo HLA-peptideo. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão que diversas técnicas de imunoafinidade são adequadas para enriquecer proteínas solúveis, por exemplo, complexos HLA-peptideo solúveis ou polipeptídeos HLAassociados ligados à membrana, por exemplo, que foram clivados proteoliticamente da membrana. Essas incluem técnicas nas quais (1) um ou mais anticorpos capazes de se ligar especificamente à proteína solúvel são imobilizados a um substrato fixo ou móvel (por exemplo, poços plásticos ou partículas de resina, látex ou paramagnéticas) , e (2) uma
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73/345 solução que contém a proteína solúvel de uma amostra biológica é passada sobre o substrato revestido com anticorpo, permitindo que a proteína solúvel se ligue aos anticorpos. 0 substrato com o anticorpo e proteína solúvel ligada é separado da solução e, opcionalmente, o anticorpo e a proteína solúvel são dissociados, por exemplo, por variação do pH e/ou da força iônica e/ou da composição iônica da solução que banha os anticorpos. Alternativamente, técnicas de imunoprecipitação nas quais o anticorpo e a proteína solúvel são combinados e permitidos a formar agregados macromoleculares podem ser usadas. Os agregados macromoleculares podem ser separados da solução por técnicas de exclusão de tamanho ou por centrifugação.
[00152] O termo imunopurificação (IP) (ou imunopurificação por afinidade ou imunoprecipitação) é um processo bem conhecido na técnica e é amplamente usado para o isolamento de um antígeno desejado de uma amostra. Em geral, o processo envolve o contato de uma amostra que contém um antígeno desejado com uma matriz de afinidade que compreende um anticorpo com o antígeno anexado covalentemente a uma fase sólida. O antígeno na amostra fica ligado à matriz de afinidade por meio de uma ligação imunoquímica. A matriz de afinidade é então lavada para remover quaisquer espécies não ligadas. O antígeno é removido da matriz de afinidade por alteração da composição química de uma solução em contato com a matriz de afinidade. A imunopurificação pode ser efetuada em uma coluna que contém a matriz de afinidade, quando então a solução é um eluente. Alternativamente a imunopurificação pode ser em um processo de batelada, quando então a matriz de afinidade é mantida
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74/345 como uma suspensão na solução. Uma etapa importante no processo é a remoção de antígeno da matriz. Isso é comumente obtido por aumento da força iônica da solução em contato com a matriz de afinidade, por exemplo, pela adição de um sal inorgânico. Uma alteração de pH também pode ser eficaz para dissociar a ligação imunoquimica entre o antígeno e a matriz de afinidade.
[00153] O termo agente significa qualquer composto químico de pequena molécula, anticorpo, molécula de ácido nucleico, ou polipeptídeo, ou fragmentos destes.
[00154] O termo alteração ou mudança significa um aumento ou uma diminuição. Uma alteração pode ser de apenas 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% ou por 40%, 50%, 60%, ou de até 70%, 75%, 80%, 90% ou 100%.
[00155] O termo amostra biológica significa qualquer tecido, célula, fluido ou outro material derivado de um organismo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo amostra inclui uma amostra biológica como, por exemplo, qualquer tecido, célula, fluido, ou outro material derivado de um organismo. O termo se liga especificamente significa um composto (por exemplo, peptideo) que reconhece e se liga a uma molécula (por exemplo, polipeptídeo) , mas que não reconhece e se liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica.
[00156] O termo reagente de captura significa um reagente que se liga especificamente a uma molécula (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo) para selecionar ou isolar a molécula (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo).
[00157] Como usados nesse relatório descritivo, os termos
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75/345 determinação, avaliação, análise, medição, detecção e seus equivalentes gramaticais se referem às determinações tanto quantitativas quanto qualitativas e, dessa forma, o termo determinação é usado de forma intercambiável nesse relatório descritivo com análise, medição e semelhantes. Quando se deseja uma determinação quantitativa, é usada a frase determinação de uma quantidade de um analito e semelhantes. Quando se deseja uma determinação qualitativa e/ou quantitativa, é usada a frase determinação de um nível de um analito ou detecção de um analito.
[00158] O termo fragmento significa uma porção de uma proteína ou ácido nucleico que é substancialmente idêntica a uma proteína ou ácido nucleico de referência. Em algumas modalidades, a porção retém pelo menos 50%, 75% ou 80%, ou 90%, 95%, ou até mesmo 99% da atividade biológica da proteína ou ácido nucleico de referência descrito nesse relatório descritivo.
[00159] Os termos isolado, purificado, biologicamente puro e seus equivalentes gramaticais se referem ao material que é livre em graus variáveis de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. Isolado significa um grau de separação da fonte original ou vizinhanças. Pureza significa um grau de separação que é maior do que isolamento. Uma proteína purificada ou biologicamente pura é suficientemente livre de outros materiais, de modo que quaisquer impurezas não afetem materialmente as propriedades biológicas da proteína ou causem outras consequências adversas. Ou seja, um ácido nucleico ou peptideo da presente revelação é purificado se
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76/345 ele é substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura, quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou de precursores químicos ou outros produtos químicos, quando sintetizado quimicamente. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. 0 termo purificado pode significar que um ácido nucleico ou proteína dá origem a basicamente uma banda em um gel eletroforético. Para uma proteína que pode ser submetida a modificações, por exemplo, fosforilação ou glicosilação, diferentes modificações podem dar origem a diferentes proteínas isoladas, que podem ser purificadas separadamente.
[00160] O termo polipeptídeo isolado (por exemplo, um peptideo de um complexo HLA-peptideo) ou complexo de polipeptídeo (por exemplo, um complexo HLA-peptideo) significa um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeo da presente revelação que foi separado de componentes que o acompanham naturalmente. Tipicamente, o polipeptídeo ou complexo de polipeptídeo é isolado quando ele é pelo menos 60%, por peso, livre das proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais ele está naturalmente associado. A preparação pode ser pelo menos 75%, pelo menos 90%, ou pelo menos 99%, por peso, de um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeo da presente revelação. Um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeo isolado da presente revelação pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural, por expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica esse polipeptídeo ou um ou mais componentes de um complexo de polipeptídeo, ou por síntese
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77/345 química do polipeptídeo ou um ou mais componentes do complexo de polipeptídeo. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida, ou por análise por HPLC.
[00161] O termo vetores se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar ou mediar a expressão de um ácido nucleico heterólogo. Um plasmídeo é uma espécie do gênero englobado pelo termo vetor. Um vetor tipicamente se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que contém uma origem de replicação e outras entidades necessárias para replicação e/ou manutenção em uma célula hospedeira. Vetores capazes de dirigir a expressão de genes e/ou sequência de ácidos nucleicos à qual estão ligados operacionalmente são referidos nesse relatório descritivo como vetores de expressão. Em geral, vetores de expressão de utilidade estão frequentemente na forma de plasmídeos, que se referem às moléculas de DNA circulares de fita dupla que, em sua forma de vetor, não estão ligadas ao cromossomo, e tipicamente compreendem entidades para expressão estável ou transitória do DNA codificado. Outros vetores de expressão que podem ser usados nos métodos como revelados nesse relatório descritivo incluem, sem imitação, plasmídeos, epissomos, cromossomos artificiais bacterianos, cromossomos artificiais de levedura, bacteriófagos ou vetores virais, e esses vetores podem se integrar no genoma do hospedeiro ou replicam autonomamente na célula. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Outras formas de vetores de expressão conhecidas por aqueles técnicos no assunto que servem a funções equivalentes também podem ser usadas, por exemplo, vetores
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78/345 extracromossômicos auto-replicantes ou vetores capazes de integração no genoma de um hospedeiro. Vetores exemplares são aqueles capazes de replicação e/ou expressão autônoma de ácidos nucleicos aos quais estão ligados.
[00162] O termo perfil molecular significa a caracterização da expressão ou do nível de expressão de dois ou mais marcadores (por exemplo, polipeptídeos ou polinucleotídeos).
[00163] Os termos espaçador ou vinculador, como usados em referência a uma proteína de fusão, se referem a um peptídeo que une as proteínas, compreendendo uma proteína de fusão. Geralmente, um espaçador não possui outra atividade biológica específica além de unir ou preservar alguma distância mínima ou outro relacionamento espacial entre as proteínas ou sequências de RNA. No entanto, em algumas modalidades, os aminoácidos constituintes de um espaçador podem ser selecionados para influenciar alguma propriedade da molécula como, por exemplo, o enovelamento, carga líquida ou hidrofobicidade da molécula. Vinculadores adequados para uso em uma modalidade da presente revelação são bem conhecidos por aqueles técnicos no assunto e incluem, sem limitação, vinculadores de carbono de cadeia linear ou ramificada, vinculadores de carbono heterocíclicos, ou vinculadores peptídicos. O vinculador é usado para separar dois peptídeos antigênicos por uma distância suficiente para assegurar que, em algumas modalidades, cada peptídeo antigênico se enovele adequadamente. Sequências peptídicas vinculadoras exemplares adotam uma conformação estendida flexível e não exibem uma propensão para o desenvolvimento de uma estrutura secundária ordenada. Aminoácidos típicos em
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79/345 regiões de proteína flexíveis incluem Gly, Asn e Ser. Esperase que praticamente qualquer permutação de sequências de aminoácidos que contêm Gly, Asn e Ser atenda aos critérios acima para uma sequência vinculadora. Outros aminoácidos quase neutros, por exemplo, Thr e Ala, também podem ser usados na sequência vinculadora. Ainda outras sequências de aminoácidos que podem ser usadas como vinculadores são reveladas em Maratea e cols. (1985), Gene 40: 39-46; Murphy e cols. (1986) Proc. Nat '1. Acad. Sei. USA 83: 8258-62; Patente U.S. N° 4.935.233; e Patente U.S. N° 4.751.180.
[00164] O termo neoplasia se refere a qualquer doença que seja causada ou resulte em níveis inadequadamente altos de divisão celular, níveis inadequadamente baixos de apoptose, ou ambos. Glioblastoma é um exemplo não limitante de uma neoplasia ou câncer. Os termos câncer ou tumor ou distúrbio hiperproliferativo se referem à presença de células que possuem características típicas de células que causam câncer, por exemplo, proliferação não controlada, imortalidade, potencial metastático, crescimento e taxa de proliferação rápidos, e certas características morfológicas típicas. As células de câncer estão frequentemente na forma de um tumor, mas essas células podem existir isoladamente dentro de um animal, ou podem ser uma célula de câncer não tumorigênica, por exemplo, uma célula de leucemia. Cânceres incluem, sem limitação, câncer de célula B, por exemplo, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, as doenças da cadeia pesada como, por exemplo, doença da cadeia alfa, doença da cadeia gama e doença da cadeia mu, gamopatia monoclonal benigna, e amiloidose imunocítica, melanomas, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer brônquico, câncer
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80/345 colón-retal, câncer de próstata (por exemplo, câncer de próstata metastático, hormônio-refratário), câncer pancreático, câncer do estômago, câncer ovariano, câncer da bexiga urinária, câncer do cérebro ou do sistema nervoso central, câncer do sistema nervoso periférico, câncer esofágico, câncer cervical, câncer uterino ou endometrial, câncer da cavidade oral ou faringe, câncer do fígado, câncer renal, câncer testicular, câncer do trato biliar, câncer do intestino delgado ou apêndice, câncer da glândula salivar, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula adrenal, osteossarcoma, condrossarcoma, câncer de tecidos hematológicos e semelhantes. Outros exemplos não limitantes de tipos de cânceres aplicáveis aos métodos englobados pela presente revelação incluem sarcomas e carcinomas humanos, por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, 1infangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, câncer colón-retal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma da
glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea,
carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares,
cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma
broncogêni co, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma
do dueto biliar, câncer do fígado, coriocarcinoma, seminoma,
carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical,
câncer óss eo, tumor cerebral, câncer testicular, carcinoma
do pulmão, carcinoma do pulmão de pequena célula, carcinoma
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81/345 da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma do acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemias, por exemplo, leucemia linfocitica aguda e leucemia mielocitica aguda (mieloblástica, pró-mielocitica, mielomonocitica, monocitica e eritroleucemia); leucemia crônica (leucemia mielocitica crônica (granulocitica) e leucemia linfocitica crônica); e policitemia vera, linfoma (doença de Hodgkin e doença não-Hodgkin), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, e doença da cadeia pesada. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer epitelial como, por exemplo, sem limitação, câncer da bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer do cólon, cânceres ginecológicos, câncer renal, câncer laringeo, câncer de pulmão, câncer oral, câncer da cabeça e pescoço, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata ou câncer de pele. Em outras modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer do cólon. Ainda em outras modalidades, o câncer epitelial é câncer de pulmão de célula não pequena, carcinoma de célula renal não papilar, carcinoma cervical, carcinoma ovariano (por exemplo, carcinoma ovariano seroso) ou carcinoma da mama. Os cânceres epiteliais podem ser caracterizados de várias outras formas incluindo, sem limitação, seroso, endometrióide, mucinoso, de célula clara, de Brenner ou indiferenciado. Em algumas modalidades, a presente revelação é usada no tratamento, diagnóstico e/ou prognóstico de linfoma ou seus subtipos incluindo, sem limitação, linfoma de célula do manto. Distúrbios linfoproliferativos também são considerados como sendo
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82/345 doenças proliferativas.
[00165] O termo vacina deve ser subentendido como significando uma composição para a geração de imunidade para a profilaxia e/ou tratamento de doenças (por exemplo, neoplasia/tumor/agentes infecciosos/doenças autoimunes). Consequentemente, vacinas são medicamentos que compreendem antigenos e visam ser usados em humanos ou animais para a geração de defesa especifica e substância protetiva por vacinação. Uma composição de vacina pode incluir um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Aspectos da presente revelação estão relacionados ao uso da tecnologia na preparação de uma vacina baseada em antigeno. Nessas modalidades, vacina visa se referir a um ou mais peptideos antigênicos doença-especificos (ou ácidos nucleicos que os codificam correspondentes). Em algumas modalidades, a vacina baseada em antigeno contém pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos
nove, pelo menos 10 , pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos
13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos
17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos
21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos
25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos
29, pelo menos 30, ou mais peptideos antigênicos. Em algumas modalidades, a vacina baseada em antigeno contém de 2 a 100, a 75, 2 a 50, 2a 25, 2 a 20, 2 a 19, 2a 18, 2 a 17,2a
16, 2 a 15, 2 a 14, 2a 13, 2 a 12, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 3 a 100, 3 a 75, 3 a 50, 3 a25, a 20, 3 a 19, 3a 18, 3 a 17, 3 a 16, 3a 15, 3 a 14,3a
13, 3 a 12, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 4 a
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100, 4 a 75, 4 a 50, 4a 25, 4 a 20, 4 a 19, 4a 18, 4 a 17, 4 a 16, 4 a 15, 4 a 14, 4 a 13, 4 a 12, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 5a 100, 5 a 75, 5 a 50, 5a 25, 5 a 20, 5 a 19, 5 a 18, 5 a 17, 5 a 16, 5 a 15, 5 a 14, 5 a 13, 5 a 12, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, ou 5 a 7 peptideos antigênicos. Em algumas modalidades, a vacina baseada em antigeno contém 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 peptideos antigênicos. Em alguns casos, os peptideos antigênicos são peptideos neoantigênicos. Em alguns casos, os peptideos antigênicos compreendem um ou mais neoepitopos.
[00166] O termo farmaceuticamente aceitável se refere a aprovado ou aprovável por um órgão regulador do governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou em outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, incluindo humanos. Um excipiente, carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável se refere a um excipiente, carreador ou diluente que pode ser administrado a um indivíduo, junto com um agente, e que não destrói a atividade farmacológica deste e é atóxico quando administrado em doses suficientes para liberar uma quantidade terapêutica do agente. Um sal farmaceuticamente aceitável de antígenos doença-específicos reunidos em pool como citado nesse relatório descritivo pode ser um sal de ácido ou base que é geralmente considerado na técnica como sendo adequado para uso em contato com os tecidos de seres humanos ou animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação. Esses sais incluem sais de ácido mineral e orgânico de resíduos básicos como, por exemplo, aminas, bem como sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos como, por exemplo, ácidos
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84/345 carboxílicos. Sais farmacêuticos específicos incluem, sem limitação, sais de ácidos como, por exemplo, ácido clorídrico, fosfórico, bromídrico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfâmico, sulfanílico, fórmico, tolueno sulfônico, metano sulfônico, benzeno sulfônico, etano dissulfônico, 2-hidroxietilsulfônico, nítrico, benzóico, 2-acetoxibenzóico, cítrico, tartárico, lático, esteárico, salicílico, glutâmico, ascórbico, pamóico, succínico, fumárico, maléico, propiônico, hidroximaléico, hidroiódico, fenilacético, alcanóico como, por exemplo, ácido acético, HOOC- (CH2) n-COOH, em que n é 0-4 e semelhantes. Similarmente, cátions farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem imitação, sódio, potássio, cálcio, alumínio, lítio e amônio. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão a partir dessa revelação e dos conhecimentos na técnica que sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais para os antígenos doença-específicos reunidos em pool fornecidos nesse relatório descritivo, incluindo aqueles listados por Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, página 1.418 (1985) . Em geral, um sal de ácido ou base farmaceuticamente aceitável pode ser sintetizado a partir de um composto parental que contém uma porção básica ou ácida por qualquer método químico convencional. Resumidamente, esses sais podem ser preparados por reação das formas livres de ácido ou base desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou ácido apropriada em um solvente apropriado.
[00167] Moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da revelação incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da revelação ou um fragmento deste.
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Essas moléculas de ácido nucleico não precisam ser 100% idênticas a uma sequência de ácidos nucleicos endógena, mas tipicamente exibirão identidade substancial. Polinucleotideos que possuem identidade substancial para uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridizar com pelo menos uma fita de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. O termo hibridizar significa parear para formar uma molécula de fita dupla entre sequências de polinucleotideos complementares, ou porções destas, sob várias condições de rigor (veja, por exemplo, Wahl, G.M. e S.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507). Por exemplo, concentração de sal rigorosa pode normalmente ser menos do que cerca de 750 mM de NaCl e 75 mM de citrato trissódico, menos do que cerca de 500 mM de NaCl e 50 mM de citrato trissódico, ou menos do que cerca de 250 mM de NaCl e 25 mM de citrato trissódico. Hibridização de baixo rigor pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo, formamida, enquanto hibridização de rigor alto pode ser obtida na presença de pelo menos cerca de 35% de formamida, ou pelo menos cerca de 50% de formamida. Condições rigorosas de temperatura podem normalmente incluir temperaturas de pelo menos cerca de 30°C, pelo menos cerca de 37°C, ou pelo menos cerca de 42°C. A variação de parâmetros adicionais, por exemplo, tempo de hibridização, a concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), e a inclusão ou exclusão de DNA carreador, são bem conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Vários niveis de rigor são obtidos por combinação dessas várias condições, como necessário. Em uma modalidade exemplar, a hibridização pode
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86/345 ocorrer a 30°C em 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trissódico e SDS 1%. Em outra modalidade exemplar, a hibridização pode ocorrer a 37°C em 500 mM de NaCl, 50 mM de citrato trissódico, SDS 1%, formamida 35%, 100 pg/ml de DNA de esperma desnaturado de salmão (ssDNA). Em outra modalidade exemplar, a hibridização pode ocorrer a 42°C em 250 mM de NaCl, 25 mM de citrato trissódico, SDS 1%, formamida 50% e 200 pg/ml de ssDNA. Variações úteis nessas condições serão prontamente evidentes para aqueles técnicos no assunto. Para a maioria das aplicações, as etapas de lavagem que vêm após a hibridização também podem variar em termos de rigor. As condições do rigor da lavagem podem ser definidas por concentração de sal e por temperatura. Como acima, o rigor da lavagem pode ser aumentado por diminuição da concentração de sal ou por aumento da temperatura. Por exemplo, concentração de sal rigorosa para as etapas de lavagem pode ser menos do que cerca de 30 mM de NaCl e 3 mM de citrato trissódico, ou menos do que cerca de 15 mM de NaCl e 1,5 mM de citrato trissódico. Condições rigorosas de temperatura para as etapas de lavagem podem incluir uma temperatura de pelo menos cerca de 25°C, de pelo menos cerca de 42°C, ou pelo menos cerca de 68°C. Em modalidades exemplares, as etapas de lavagem podem ocorrer a 25°C em 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato trissódico e SDS 0,1%. Em outras modalidades exemplares, as etapas de lavagem podem ocorrer a 42 °C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e SDS 0,1%. Em outra modalidade exemplar, as etapas de lavagem podem ocorrer a 68°C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e SDS 0,1%. Variações adicionais nessas condições serão prontamente evidentes para aqueles técnicos no assunto. As
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87/345 técnicas de hibridização são bem conhecidas por aqueles técnicos no assunto e são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei., USA 72: 3961, 1975); Ausubel e cols. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nova York, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nova York); e Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York.
[00168] O termo substancialmente idêntico significa um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico que exibe pelo menos 50% de identidade para uma sequência de aminoácidos (por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas nesse relatório descritivo) ou sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos descritas nesse relatório descritivo) de referência. Uma sequência desse tipo pode ser pelo menos 60%, 80% ou 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou até mesmo 99% ou mais idêntica no nível de aminoácido ou de ácido nucleico para a sequência usada para comparação. A identidade de sequência é tipicamente medida usando um software de análise de sequências (por exemplo, Sequence Analysis Software Package do Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP ou PILEUP/PRETTYBOX). Esse software combina sequências idênticas ou similares por atribuição de graus de homologia a várias substituições, deleções, e/ou outras modificações. Substituições conservativas tipicamente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina,
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88/345 leucina; aspártico ácido, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. E uma abordagem exemplar para determinação do grau de identidade, um programa BLAST pode ser usado, com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e em° indicando uma sequência intimamente relacionada. 0 termo referência significa um padrão de comparação.
[00169] O termo indivíduo ou paciente se refere a um animal que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. Apenas como exemplo, um indivíduo inclui, sem limitação, um mamífero, incluindo, sem limitação, um humano ou um mamífero não humano, por exemplo, um primata não humano, murídeo, bovino, equino, canino, ovino ou felino.
[00170] Os termos tratar, tratado, que trata, tratamento e semelhantes visam se referir à redução, prevenção ou melhora de um distúrbio e/ou sintomas associados com ele (por exemplo, uma neoplasia ou tumor ou agente infeccioso ou uma doença autoimune). O termo tratamento pode se referir à administração da terapia a um indivíduo após o surgimento, ou surgimento suspeito, de uma doença (por exemplo, câncer ou infecção por um agente infeccioso ou uma doença autoimune). O termo tratamento inclui os conceitos de alívio, que se referem à redução da frequência de ocorrência ou recorrência, ou da gravidade, de quaisquer sintomas ou outros efeitos danosos relacionados à doença e/ou dos efeitos colaterais associados à terapia. O termo tratamento também engloba os conceitos de gerenciamento, que se referem à redução da gravidade de uma doença ou distúrbio em um paciente, por exemplo, extensão da vida ou prolongamento da capacidade de sobrevivência de um paciente
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89/345 com a doença, ou o retardo de sua recorrência, por exemplo, prolongamento do periodo de remissão em um paciente que já sofreu da doença. Observa-se que, embora não eliminado, o tratamento de um distúrbio ou condição não exige que o distúrbio, condição ou sintomas associados com ela sejam completamente eliminados.
[00171] Os termos evitar, prevenir, prevenção e seus equivalentes gramaticais, como usados nesse relatório descritivo, significam evitar ou retardar o surgimento de sintomas associados com uma doença ou condição em um indivíduo que não desenvolveu esses sintomas no momento em que a administração de um agente ou composto começa.
[00172] O termo efeito terapêutico se refere a algum grau de alívio de um ou mais dos sintomas de um distúrbio (por exemplo, uma neoplasia, tumor ou infecção por um agente infeccioso ou uma doença autoimune) ou sua patologia associada. O termo quantidade terapeuticamente eficaz, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma quantidade de um agente que é eficaz, após administração de dose única ou de doses múltiplas, para a célula ou indivíduo, no prolongamento da capacidade de sobrevivência do paciente com esse distúrbio, na redução de um ou mais sinais ou sintomas do distúrbio, na prevenção ou retardo e semelhantes além do esperado na ausência desse tratamento. O termo quantidade terapeuticamente eficaz visa qualificar a quantidade necessária para obter um efeito terapêutico. Um médico ou veterinário com habilidades na técnica pode facilmente determinar e prescrever a quantidade terapeuticamente eficaz (por exemplo, ED50) da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou
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90/345 veterinário pode iniciar doses dos compostos da presente revelação empregadas em uma composição farmacêutica em níveis menores do que aquele necessário a fim de obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. Os termos doença, condição e distúrbio são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo.
[00173] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o alelo HLA ainda compreende uma etiqueta de peptideo, um marcador por afinidade, uma etiqueta de epitopo, ou uma etiqueta de aceptor por afinidade que pode ser usada para imunopurifrear a proteína HLA. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão que os termos etiqueta de peptideo, etiqueta de afinidade, etiqueta de epitopo ou etiqueta de aceptor por afinidade são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo etiqueta de aceptor por afinidade se refere a uma sequência de aminoácidos que permite que a proteína etiquetada seja prontamente detectada ou purificada, por exemplo, por purificação por afinidade. Uma etiqueta de aceptor por afinidade é geralmente (mas não necessariamente) colocada no terminal-N- ou -C ou perto dele de um alelo HLA. Várias etiquetas de peptideo são bem conhecidas na técnica. Exemplos não limitantes incluem etiqueta de poli-histidina (por exemplo, 4 a 15 resíduos His consecutivos, por exemplo, 8 resíduos His consecutivos); etiqueta de poli-histidina-glicina; etiqueta de HA (por exemplo, Field e cols., Mol. Cell. Biol., 8: 2159, 1988); etiqueta de c-myc (por exemplo, Evans e cols., Mol. Cell. Biol., 5: 3610, 1985); etiqueta de glicoproteína D do vírus
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91/345 do Herpes simples (gD) (por exemplo, Paborsky e cols., Protein Engineering, 3: 547, 1990); etiqueta de FLAG (por exemplo, Hopp e cols., BioTechnology, 6: 1204, 1988; Patentes U.S. Nos 4.703.004 e 4.851.341); etiqueta de epitopo KT3 (por exemplo, Martine e cols., Science, 255: 192, 1992); etiqueta de epitopo de tubulina (por exemplo, Skinner, Biol. Chem., 266: 15173, 1991); etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7 (por exemplo, Lutz-Freyemuth e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393, 1990); etiqueta de estreptavidina (StrepTag.TM. ou StrepTagll.TM.; veja, por exemplo, Schmidt e cols., J. Mol. Biol., 255 (5): 753-766, 1996 ou Patente U.S. N° 5.506.121; também disponivel comercialmente por Sigma-Genosys) ; ou uma etiqueta de epitopo de VSV-G derivado da glicoproteina do virus da estomatite vesicular; ou uma etiqueta V5 derivado de um epitopo pequeno (Pk) encontrado nas proteinas P e V do paramixovirus do virus simio 5 (SV5). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade é uma etiqueta de epitopo, que é um tipo de etiqueta de peptideo que adiciona um epitopo reconhecivel (sitio de ligação ao anticorpo) à proteina HLA para fornecer ligação do anticorpo correspondente permitindo, dessa forma, a identificação ou purificação por afinidade da proteina etiquetada. Exemplo não limitante de uma etiqueta de epitopo é proteina A ou proteina G, que se liga à IgG. Em algumas modalidades, a matriz de resina de cromatografia de Sefarose 6 Fast Flow de IgG é acoplada covalentemente à IgG humana. Essa resina permite taxas de fluxo elevadas, para a purificação rápida e conveniente de uma proteina etiquetada com proteina A. Várias outras porções de etiqueta são conhecidas, e podem ser previstas, por aqueles técnicos no
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92/345 assunto, e são contempladas nesse relatório descritivo. Qualquer etiqueta de peptideo pode ser usada, desde que seja capaz de ser expressa como um elemento de um complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00174] Como usado nesse relatório descritivo, o termo molécula de afinidade se refere a uma molécula ou um ligante que se liga com especificidade química a um peptideo com aceptor por afinidade. Especificidade química é a habilidade de um sítio de ligação à proteína para se ligar a ligantes específicos. A quanto menos ligantes uma proteína pode se ligar, maior sua especificidade. A especificidade descreve a força de ligação entre certa proteína e ligante. Esse relacionamento pode ser descrito por uma constante de dissociação (Kd) , que caracteriza o equilíbrio entre os estados ligados e não ligados para o sistema proteínaligante.
[00175] O termo complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade se refere a um complexo que compreende um peptideo associado ao HLA classe I ou classe II ou uma porção deste especificamente ligado a um único peptideo recombinante alélico HLA classe I ou classe II que compreende um peptideo com aceptor por afinidade.
[00176] Os termos ligação específica ou que se liga especificamente, quando usados em referência à interação de uma molécula de afinidade e uma etiqueta de aceptor por afinidade ou um epitopo e um peptideo HLA, significam que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (ou seja, o determinante ou epitopo antigênico) na proteína; em outras palavras, a molécula de afinidade é de reconhecimento e ligação a uma estrutura específica de um
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93/345 peptideo com aceptor por afinidade, e não às proteínas em geral.
[00177] Como usado nesse relatório descritivo, o termo afinidade se refere à uma medida da força de ligação entre dois membros de um par de ligação, por exemplo, uma etiqueta de aceptor por afinidade e uma molécula de afinidade e um peptideo de ligação ao HLA e um HLA classe I ou II. Kd é a constante de dissociação e possui unidades de molaridade. A constante de afinidade é o inverso da constante de dissociação. Constante de afinidade é algumas vezes usada como um termo genérico para descrever a entidade química. Ela é uma medida direta da energia de ligação. A afinidade pode ser determinada experimentalmente, por exemplo, por ressonância de plásmon de superfície (SPR), usando unidades de SPR Biacore disponíveis comercialmente. A afinidade também pode ser expressa como a concentração inibidora 50 (IC50), que é a concentração na qual 50% do peptideo são deslocados. Da mesma forma, In(ICso) se refere ao log natural da IC50. Koff se refere à constante off-rate, por exemplo, para dissociação de uma molécula de afinidade do complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00178] Em algumas modalidades, um complexo de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade compreende peptideo aceptor de biotina (BAP) e é imunopurifiçado de misturas celulares complexas usando partículas de estreptavidina/NeutrAvidin. A ligação à biotinaavidina/estreptavidina é a interação não covalente mais forte conhecida na natureza. Essa propriedade é explorada como uma ferramenta biológica para uma ampla gama de aplicações, por exemplo, imunopurificação de uma proteína à
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94/345 qual biotina está anexada covalentemente. Em uma modalidade exemplar, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o alelo HLA implementa peptídeo aceptor de biotina (BAP) como uma etiqueta de aceptor por afinidade para imunopurificação. BAP pode ser especificamente biotinilada in vivo ou in vitro em um único resíduo de lisina dentro da etiqueta (por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.723.584, 5.874.239 e 5.932.433; e Patente U.K N° GB2370039). BAP tem tipicamente 15 aminoácidos de comprimento e contém uma única lisina como um resíduo aceptor de biotina. Em algumas modalidades, BAP é colocada no terminal-N- ou -C ou perto dele de um único peptídeo de alelo HLA. Em algumas modalidades, BAP é colocada entre um domínio de cadeia pesada e domínio de β2microglobulina de um peptídeo HLA classe I. Em algumas modalidades, BAP é colocada entre um domínio de cadeia-β e um domínio de cadeia-α de um peptídeo HLA classe II. Em algumas modalidades, BAP é colocada em regiões da alça entre os domínios al, «2 e «3 da cadeia pesada de HLA da classe I, ou entre domínios al e a2 e βΐ e β2 da cadeia-α e cadeia-β, respectivamente de HLA da classe II. Construções exemplares projetadas para expressão de HLA classe I e II que implementam BAP para biotinilação e imunopurificação são descritas na FIGURA 2.
[00179] Como usado nesse relatório descritivo, o termo biotina se refere ao composto biotina propriamente dito e análogos, derivados e variantes desta. Dessa forma, o termo biotina inclui biotina (ácido cis-hexahidro-2-oxo-lH-tieno [3,4]imidazol-4-pentanóico) e quaisquer derivados e análogos deste, incluindo compostos biotina-like. Esses compostos incluem, por exemplo, biotina-e-N-lisina, biocitina
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95/345 hidrazida, derivados amino ou sulfidril de 2-iminobiotina e éster N-hidroxisuccinimidico do ácido biotinil-Eaminocapróico, sulfosuccinimidaiminobiotina, biotinabromoacetilidrazida, p-diazobenzoil biocitina, 3-(Nmaleimidopropionil)biocitina, destiobiotina e semelhantes. 0 termo biotina também compreende variantes de biotina que podem se ligar especificamente a um ou mais de uma porção de Rizavidina, avidina, estreptavidina, tamavidina, ou outros peptideos avidina-like.
Abordagens de criação de perfil de HLA [00180] O ensaio bioquímico de ligação ao peptídeo-MHC para descoberta de epitopo de HLA foi a base para NetMHC, o previsor alelo-específico usando redes neurais artificiais; no entanto, o ensaio bioquímico de ligação p:MHC lento é um método de baixo rendimento (FIGURA 19) . Ligantes de HLA processados e apresentados endogenamente com perfil definido a partir de linhagens de células e materiais derivados do paciente são comumente multialélicos, o que significa que dados de LC-MS/MS gerados a partir dessas amostras contêm uma população mista de ligantes que podem se ligar a um dos múltiplos alelos HLA expressos simultaneamente, como mostrado na FIGURA 17 e na FIGURA 19. Conjuntos de dados multialélico exigem deconvolução para verificar quais peptideos se ligam aos diferentes heterodímeros de HLA apresentados por um indivíduo. Dessa forma, ligantes de conjuntos de dados multialélicos devem ser designados para os seus heterodímeros de HLA correspondentes usando (1) previsores de ligação treinados com dados preexistentes ou (2) algoritmos de deconvolução que alavancam a sobreposição através de alelos HLA representados em grandes conjuntos de
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96/345 dados de ligantes. É importante observar que somente conjuntos de dados de LC-MS/MS com informação digitada HLA disponivel podem ser confiavelmente deconvolucionados. Na verdade, quase 40% dos ligantes processados naturalmente ligados aos complexos de HLA classe I relatados de estudos multialélicos na Immune Epitope Database (IEDB) não possuem alocações de alelo HLA-especificas em consequência da ausência de informação digitada de HLA ou da incapacidade de deconvolução, tornando desafiador o uso desse subconjunto de dados para previsão de epitopo alelo-especifica. Além disso, é difícil identificar peptideos ligados a heterodímeros de HLA classe I raros e a muitos heterodímeros de HLA classe II, pois não há dados anotados suficientes para deconvolução. A abordagem de geração de dados multialélicos também limita a descoberta de novos motivos de ligação, ne medida em que a deconvolução se baseia em conhecimento preexistente. Embora haja interrupções na utilização de conjuntos de dados multialélicos para previsões de epitopo alelo-especificas, eles são imensamente valiosos para determinação de padrões de apresentação de ligante que exigem a co-expressão de múltiplos alelos e para validação dos algoritmos de previsão de epitopo.
[00181] Uma abordagem ortogonal à geração de dados multialélicos e subsequente deconvolução é a criação de conjuntos de dados monoalélicos dos quais populações de peptideos apresentadas por um único alelo HLA são identificadas (FIGURA 17 e FIGURA 19) . Um método para a geração de dados monoalélicos utiliza linhagens de células que são deficientes na expressão de HLA. Essas células podem ser transfectadas ou transduzidas com alelos HLA únicos e,
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97/345 dessa forma, ligantes podem ter seu perfil definido por LCMS/MS para gerar bibliotecas de ligantes alelo-especificas. Peptídeos ligados às moléculas de HLA solúvel (sHLA) também podem ser isolados de meios de células e ter seu perfil traçado por LC-MS/MS para produzir dados monoalélicos. Uma vantagem importante de conjuntos de dados monoalélicos é que eles não necessitam de deconvolução e permitem alocações peptideo-alelo HLA confiáveis sem dados preexistentes. Abordagens monoalélicas também fornecem rapidamente dados para alelos HLA que não foram caracterizados previamente uma tarefa que os dados multialélicos só podem fazer caso haja uma sobreposição suficiente entre grandes conjuntos de dados. Adicionalmente, novos motivos de ligação ao peptideo podem facilmente ser descobertos usando sistemas monoalélicos, na medida em que não é necessário conhecimento prévio para alocações de ligação ao HLA confiáveis. Dados monoalélicos podem até ser alavancados para atribuir ligantes de conjuntos de dados multialélicos quando os métodos de deconvolução não conseguem fazê-lo.
[00182] O fator limitante da abordagem monoalélica atualmente disponível é que ela exige uma linhagem de célula deficiente em HLA. Uma característica inovadora crucial da presente revelação é que uma linhagem de célula deficiente em HLA não é necessária para a geração de dados monoalélicos. As construções marcadas por afinidade como fornecidas nesse relatório descritivo podem ser colocadas em qualquer linhagem de célula que apresenta complexos HLA-peptídeo endógenos para isolar o alelo de interesse usando o marcador por afinidade. Outra vantagem da presente revelação é que os mesmos reagentes podem ser usados para qualquer alelo HLA
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98/345 classe I ou classe II na biblioteca, desde que ele possua o mesmo marcador por afinidade, o que torna o método atualmente revelado escalonável (automatizado). Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer. Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição.
[00183] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento dos peptideos dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da caracterização. Em algumas modalidades, os peptideos são isolados usando anticorpos anti-HLA. Em alguns casos, HLA solúvel (sHLA) com marcadores por afinidade é isolado com o uso de anticorpos anti-HLA. Em alguns casos, HLA solúvel (sHLA) com marcadores por afinidade é isolado com o uso de uma coluna que contém um anticorpo anti-HLA.
Métodos e composições [00184] É fornecido nesse relatório descritivo um método de caracterização de complexos HLA-peptídeo que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou
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99/345 mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade; expressão do HLA marcado com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização dos complexos HLA-peptídeo.
[00185] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a caracterização de um peptídeo do complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes. Em algumas modalidades, o método compreende a utilização de mais de um alelo HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, a população de células é derivada de um indivíduo (por exemplo, um paciente que possui uma doença) . Em algumas modalidades, a população de células consiste em linhagens de células classe I e/ou classe II-negativas. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLA-específicos.
[00186] É fornecido nesse relatório descritivo um método de geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLAespecíficos que compreende: o fornecimento de uma primeira
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100/345 e uma segunda população de células, cada uma compreendendo uma ou mais células que compreendem um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade da sequência compreende um polipeptideo recombinante diferente codificado por um alelo HLA diferente ligado operacionalmente a um peptideo com aceptor por afinidade; enriquecimento para complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; caracterização de um peptideo ou uma porção deste ligado a um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento; e geração de um banco de dados de peptideos alelo HLA-especificos.
[00187] Em algumas modalidades, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico.
[00188] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação da sequência de um peptideo ou uma porção desta ligada a um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se o peptideo ou uma porção deste está modificado (por exemplo, modificação pós-tradução). Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise por espectrometria de massa. Em algumas modalidades, a espectrometria de massa é análise por MS, análise por MS/MS, análise por LC-MS/MS, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, análise por MS é usada para determinar uma massa de um peptideo intacto. Por exemplo, a determinação pode compreender a determinação de uma massa de um peptideo intacto (por exemplo, análise por MS). Em algumas
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101/345 modalidades, análise por MS/MS é usada para determinar uma massa de fragmentos de peptideo. Por exemplo, a determinação pode compreender a determinação de uma massa de fragmentos de peptideo, que pode ser usada para determinar uma sequência de aminoácidos de um peptídeo ou porção desta (por exemplo, análise por MS/MS). Em algumas modalidades, a massa de fragmentos de peptídeo é usada para determinar uma sequência de aminoácidos dentro do peptídeo. Em algumas modalidades, análise por LC-MS/MS é usada para separar misturas de peptídeos complexas. Por exemplo, a determinação pode compreender a separação de misturas de peptídeos complexas, por exemplo, por cromatografia líquida, e determinação de uma massa de um peptídeo intacto, uma massa de fragmentos de peptídeo, ou uma combinação destes (por exemplo, análise por LC-MS/MS). Esses dados podem ser usados, por exemplo, para sequenciamento de peptídeo.
[00189] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptídeo ou uma porção deste ligado a um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se um peptídeo ou uma porção deste ligado a um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se o peptídeo ou uma porção deste está modificado (por exemplo, modificação póstradução). Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de associações de peptídeos de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por
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102/345 afinidade com alelos HLA.
[00190] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptídeos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptídeos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptídeos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptídeos associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer. Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição.
[00191] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias.
[00192] Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II recombinante é compatível com um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, uma célula apresentadora de antígeno que compreende o peptídeo ou um mutante deste ligado a um complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade possui reatividade para uma célula T que expressa um receptor de célula T de um indivíduo. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a comparação de complexos HLA-peptídeo de células de câncer com complexos HLA-peptídeo de células não-câncer.
[00193] Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas
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103/345 modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, o knock-out de um alelo HLA classe I ou classe II compreende a eliminação da função do alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o knock-out do alelo HLA classe I ou classe II é obtido por meio de edição gênica. Em algumas modalidades, a edição gênica é realizada por administração a um individuo necessitado de uma nuclease, em que a nuclease visa o alelo HLA classe I ou alelo classe II a ser knocked-out. Em algumas modalidades, a nuclease é uma proteina associada ao CRISPR (por exemplo, proteínas Cas, por exemplo, Cas9), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), a Nuclease Efetora Semelhantes a Ativadores da Transcrição (TALEN) , ou uma meganuclease. Em algumas modalidades, edição gênica é obtida por administração a um indivíduo necessitado de um sistema CRISPR-Cas9. Em algumas modalidades, qualquer nuclease adequada que induza um entalhe ou quebra de fita dupla em um sítio de reconhecimento desejado é usada. Em algumas modalidades, uma nuclease de ocorrência natural ou nativa é usada. Em algumas modalidades, uma nuclease modificada ou criada por engenharia genética é usada.
[00194] Em algumas modalidades, a população de células é um knock-down de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-down de um ou
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104/345 mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-down de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-down de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-down de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, o knock-down de um alelo HLA classe I ou classe II compreende a redução na expressão do alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o knock-down do alelo HLA classe I ou alelo classe II é obtido por administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um pequeno RNA interferente de fita dupla (siRNA), um microRNA (miRNA), um RNA hairpin curto (shRNA), em que o siRNA, miRNA, shRNA visa o alelo HLA classe I ou alelo classe II a ser nocauteado (knocked-down). Em algumas modalidades, a expressão do alelo HLA classe I ou classe II é reduzida por cerca de 99%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, ou cerca de 20%, comparada com quando o alelo HLA classe I ou alelo classe II não foi nocauteado (knocked-down) .
[00195] Em algumas modalidades, a população de células compreende células que foram enriquecidas ou separadas quanto à expressão na superfície da célula de um alelo HLA classe I, um alelo HLA classe II, ou uma combinação destes, por exemplo, por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Em algumas modalidades, a separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é usada para
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105/345 separar a população de células. Em algumas modalidades, a separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é usada para separar a população de células quanto à expressão na superfície da célula de um alelo HLA classe I, um alelo HLA classe II, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, FACS é usada para enriquecer ou separar células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II.
[00196] Em algumas modalidades, a população de células compreende diversas populações de células, cada uma expressando um alelo HLA classe I ou classe II recombinante diferente. Em algumas modalidades, cada população de células das diversas populações está em um recipiente separado.
[00197] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptideos dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da caracterização. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a limpeza de um terminal do peptideo ligado aos complexos HLA-peptideo (FIGURA 13).
[00198] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de
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106/345 células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLAB, HLA-C. Em algumas modalidades, o HLA classe I é um grupo classe-I-b não clássico. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-E, HLA-F e HLAG. Em algumas modalidades, o HLA classe I é um grupo classeI-b não clássico selecionado do grupo que consiste em HLAE, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas.
[00199] Em algumas modalidades, cada sequência que codifica um alelo HLA classe I e/ou classe II diferente está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante que codifica uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada
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107/345 operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante que codifica uma porção intracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante.
[00200] Em algumas modalidades, a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante por um vinculador.
[00201] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00202] Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento.
[00203] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao peptideo com aceptor por afinidade. Em
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108/345 algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade pode compreender um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidinaglicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB) , Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteina de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteina C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteina carreadora de biotinacarbóxi (BCCP), etiqueta de proteina fluorescente verde
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109/345 (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP) , HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade.
[00204] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida é uma partícula.
[00205] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao peptídeo com aceptor por afinidade. Em
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110/345 algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular dos complexos HLA-peptídeo. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminal-N dos complexos HLA-peptídeo.
[00206] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com a vetor ou plasmídeo que compreende o ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral.
[00207] Qualquer ensaio bioquímico adequado pode ser usado para determinar um HLA expresso em uma célula (por exemplo, uma linhagem de célula modificada geneticamente) . Métodos exemplares para determinar a identidade de um alelo HLA expresso em uma célula (por exemplo, uma linhagem de célula modificada geneticamente) incluem análise Western blot, por exemplo, para determinar a classe de um alelo HLA (classe I ou classe II), análise de sequência, por exemplo, sequenciamento de alelos individuais (por exemplo, usando diferentes iniciadores para identificação de diferentes
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111/345 alelos de sequência similar). Em algumas modalidades, um ácido polinucléico que codifica um alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. A sequência de código de barras pode ser usada para identificar um alelo HLA expresso em uma célula. Em algumas modalidades, a sequência de código de barras é única para um único HLA. Em algumas modalidades, a sequência de código de barras é única para um único alelo HLA classe I ou classe II.
[00208] Em algumas modalidades, o ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade está integrada estavelmente no genoma da população de células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica β2microglobulina está conectada à sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[00209] Em algumas modalidades, a sequência que codifica um HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II
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112/345 nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[00210] Em algumas modalidades, o segundo peptideo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptideo com aceptor por afinidade e pode compreender um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST),
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113/345 etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitIna-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes.
[00211] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00212] Em algumas modalidades, a determinação compreende a realização de espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas
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114/345 modalidades, a determinação compreende a obtenção de uma sequência de peptideos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptideos isolados dos complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptideos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptideos.
[00213] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO e THP1. Em algumas modalidades, a linhagem de célula é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, um agente que altera o processamento de antigeno (por exemplo, inibidores de peptidase, inibidor de proteassoma, inibidor de TAP etc.), ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o banco de dados de peptideos é um banco de dados de peptideos de especificidade sem enzima, por exemplo, um banco de dados sem modificação ou um banco de dados com modificação (por exemplo, fosforilação ou cisteinilação). Em algumas modalidades, o banco de dados de peptideos é um banco de dados de polipeptideos. Em algumas modalidades, o banco de dados de polipeptideos é um banco de dados de proteínas. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a pesquisa do banco de dados de peptideos usando uma estratégia de pesquisa reversa de banco de dados. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a pesquisa de um banco de dados de proteínas usando uma estratégia de pesquisa reversa de banco de dados. Em algumas modalidades, é realizada uma pesquisa de novo, por exemplo, para descobrir novos peptideos que não estão
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115/345 incluídos em um banco de dados de peptídeos ou de proteínas normal.
[00214] Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células tumorais ou células infectadas por um agente infeccioso ou uma porção deste.
[00215] Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento dos referidos complexos HLA-peptídeo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o referido agente é uma citocina inflamatória, um agente químico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[00216] Em algumas modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA mutado.
[00217] Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para diferentes alelos HLA.
[00218] É fornecido nesse relatório descritivo um banco de dados de sequências de peptídeo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização dos métodos descritos nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma combinação de dois ou mais bancos de dados de sequências de peptídeo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização dos métodos descritos nesse relatório descritivo repetidamente, cada vez usando um alelo HLA diferente. É fornecido nesse relatório descritivo um método para a geração de um algoritmo de previsão para identificação de peptídeos
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116/345 de ligação alelo HLA-especificos, que compreende o treinamento de uma máquina com um banco de dados de sequências de peptideos descritas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e redes neurais.
[00219] A geração de um algoritmo de previsão por treinamento de uma máquina é uma técnica bem conhecida. O mais importante no treinamento da máquina é a qualidade do banco de dados usado para o treinamento. Tipicamente, a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e/ou uma rede neural.
[00220] Em algumas modalidades, uma variável usada para treinar a máquina ou algoritmo compreende uma ou mais variáveis selecionadas do grupo que consiste em sequência de peptideos, propriedades físicas do aminoácido, propriedades físicas do peptideo, nível de expressão da proteína-fonte de um peptideo dentro de uma célula, estabilidade da proteína, taxa de tradução de proteína, sítios de ubiquitinação, taxa de degradação de proteína, eficiências de tradução a partir do perfil ribossomal, capacidade de divagem de proteína, localização da proteína, motivos da proteína hospedeira que facilitam o transporte de TAP, proteína hospedeira ser submetida à autofagia, motivos que favorecem estagnação ribossômica (por exemplo, trechos de poliprolina ou polilisina), características da proteína que favorecem NMD (por exemplo, UTR-3' longa, códon de parada >50nt a montante da última junção éxon:éxon e capacidade de divagem de peptideo).
[00221] É fornecido nesse relatório descritivo um método
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117/345 para identificação de peptideos de ligação alelo HLAespecíficos, que compreende a análise da sequência de um peptideo com uma máquina que foi treinada com um banco de dados de sequências de peptideos obtido por realização de um método descrito nesse relatório descritivo para o alelo HLA. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação do nível de expressão da proteína-fonte do peptideo dentro de uma célula; e em que a expressão da proteína-fonte é uma variável preditiva usada pela máquina. Em algumas modalidades, o nível de expressão é determinado por medição da quantidade de proteína-fonte ou da quantidade de RNA que codifica a referida proteína-fonte.
[00222] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um primeiro e um segundo ácido polinucléico recombinante, cada um compreendendo uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende (a) uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe I recombinante diferente, (b) uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, (c) uma sequência que codifica [32-microglobulina; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c), estão ligadas operacionalmente.
[00223] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um primeiro e um segundo ácido polinucléico recombinante, cada um compreendendo uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende (a) uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe II recombinante,
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118/345 (b) uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, (c) uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c), estão ligadas operacionalmente.
[00224] Em algumas modalidades, o primeiro e segundo ácidos polinucleicos recombinantes estão isolados.
[00225] Em algumas modalidades, a sequência codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C. Em algumas modalidades, o HLA classe I é um grupo classe-I-b não clássico. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o HLA classe I é um grupo classe-I-b não clássico selecionado do grupo que consiste em HLA-E, HLA-F e HLA-G.
[00226] Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência da sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente que codifica uma porção extracelular do alelo HLA recombinante diferente. Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica uma molécula de aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente. Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência da sequência que codifica
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119/345 um alelo HLA recombinante diferente que codifica uma porção intracelular do alelo HLA recombinante diferente. Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente. Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente por um vinculador. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado se liga especificamente a uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade do primeiro e o segundo ácidos polinucleicos recombinantes é diferente.
[00227] Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado pode compreender um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) ,
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120/345 etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente a uma molécula de afinidade. Em algumas
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121/345 modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade não interage especificamente com uma sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante codificado. Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade está integrado estavelmente no genoma de uma célula. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina ou a sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[00228] Em algumas modalidades, o segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende uma etiqueta de HA. Em algumas modalidades, o segundo peptideo com aceptor por afinidade pode compreender um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB) , Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag), etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio
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122/345 de ligação à colina (CBD) , etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR) , etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tagr etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S~tagr etiqueta de proteína carreadora de biotinacarbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP) , HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00229] Em algumas modalidades, tanto para o primeiro quanto para o segundo ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica [32-microglobulina ou a sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica um HLA recombinante diferente e o peptídeo com aceptor por afinidade por um vinculador. Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência
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123/345 de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00230] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma primeira e uma segunda molécula de polipeptídeo isolada codificada pelo primeiro e pelo segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma primeira e uma segunda célula que compreende uma primeira e uma segunda molécula de polipeptídeo codificada pelo primeiro e pelo segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma primeira e uma segunda célula que compreende o primeiro e o segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma primeira e uma segunda população de células que compreendem uma ou mais células que compreendem o primeiro e o segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[00231] Em algumas modalidades, a primeira e a segunda
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124/345 população de células expressam um ou mais alelos HLA classe I ou classe II endógenos. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda população de células são modificadas geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda população de células são modificadas geneticamente para não possuir alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda população de células são modificadas geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda população de células são modificadas geneticamente para não possuir alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda população de células são modificadas geneticamente para não possuir alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos.
[00232] É fornecido nesse relatório descritivo um método de produção de uma célula, que compreende a transdução ou transfecção de uma primeira e uma segunda célula com o primeiro e o segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[00233] É fornecido nesse relatório descritivo um peptídeo identificado de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo.
[00234] É fornecido nesse relatório descritivo um método de enriquecimento para peptideos imunogênicos, que compreende: o fornecimento de uma população de células que compreende uma ou mais células que expressam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um peptídeo com aceptor por
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125/345 afinidade ligado operacionalmente a um HLA recombinante codificado por um alelo HLA recombinante; e enriquecimento para complexos HLA-peptideo que compreendem o HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a determinação da sequência de peptídeos imunogênicos isolados dos complexos HLA-peptideo. Em algumas modalidades, a determinação compreende a utilização de LCMS/MS .
Sistema Antígeno Leucocitário Humano (HLA) [00235] O sistema imune pode ser classificado em dois subsistemas funcionais: o sistema imune inato e o adaptive. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra infecções, e a maioria dos patógenos potenciais é rapidamente neutralizada por esse sistema antes que possa causar, por exemplo, uma infecção perceptível. O sistema imune adaptive reage às estruturas moleculares, referidas como antígenos, do organismo invasor. Diferentemente do sistema imune inato, o sistema imune adaptive é altamente específico para um patógeno. A imunidade adaptativa também pode fornecer proteção duradoura; por exemplo, alguém que se recuperou de sarampo está agora protegido por toda a vida. Há dois tipos de reações imune adaptiva, que incluem a reação imune humoral e a reação imune mediada por células. Na reação imune humoral, anticorpos secretados por células B em líquidos corpóreos se ligam a antígenos derivados de patógenos, levando à eliminação do patógeno por meio de diversos mecanismos, por exemplo, lise mediada por complemento. Na reação imune mediada por células, células T capazes de destruir outras células são ativadas. Por exemplo, se proteínas associadas com uma doença estão presentes em uma
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126/345 célula, elas são fragmentadas proteoliticamente em peptideos dentro da célula. Proteínas celulares especificas então se aderem aos antigenos ou peptideos formados dessa forma e os transportam até a superfície da célula, onde são apresentados aos mecanismos de defesa moleculares, em células T, do corpo. Células T citotóxicas reconhecem esses antigenos e matam as células que abrigam os antigenos.
[00236] O termo complexo de histocompatibilidade principal (MHC), moléculas MHC ou proteínas MHC se refere às proteínas capazes de ligação a peptideos resultantes da divagem proteolítica de antigenos de proteína e que representem epitopos de célula T potenciais, transportando-os até a superfície da célula e apresentandoos a células específicas, por exemplo, em linfócitos T citotóxicos ou células T auxiliares. O MHC humano também é denominado o complexo HLA. Dessa forma, o termo sistema de antígeno leucocitário humano (HLA), moléculas HLA ou proteínas HLA se refere a um complexo gênico que codifica as proteínas MHC em humanos. O termo MHC é referido como o complexo H-2 em espécies murídeas. Aqueles técnicos no assunto reconhecerão que os termos complexo de histocompatibilidade principal (MHC), moléculas MHC, proteínas MHC e sistema de antígeno leucocitário humano (HLA), moléculas HLA, proteínas HLA são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo.
[00237] As proteínas HLA são classificadas em dois tipos, referidas como HLA classe I e HLA classe II. As estruturas das proteínas das duas classes de HLA são muito similares; no entanto, elas possuem funções muito diferentes. Proteínas HLA Classe I estão presentes na superfície de quase todas as
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127/345 células do corpo, incluindo na maioria das células tumorais. Proteínas HLA Classe I são carregadas com antígenos que normalmente se originam de proteínas endógenas ou de patógenos presentes dentro das células, e são então apresentadas a linfócitos T naive ou citotóxicos (CTLs). Proteínas HLA classe II estão presentes em células apresentadoras de antígeno (APCs) incluindo, sem limitação, células dendríticas, células B e macrófagos. Elas apresentam principalmente peptídeos, que são processados de fontes externas de antígenos, ou seja, fora das células, às células T auxiliares. A maioria dos peptídeos ligados pelas proteínas HLA classe I se origina de proteínas citoplasmáticas produzidas nas células hospedeiras saudáveis de um organismo, e normalmente não estimula uma reação imune.
[00238] Moléculas HLA Classe I consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve e são capazes de se ligar a um peptídeo de cerca de 7 a 13 aminoácidos (por exemplo, cerca de 8 a 11 aminoácidos, ou 9 ou 10 aminoácidos), se esse peptídeo possui motivos de ligação adequados, e apresentálo aos linfócitos T citotóxicos. Os peptídeos ligados por moléculas HLA classe I se originam de um antígeno de proteína endógeno. A cadeia pesada das moléculas HLA da classe I pode ser um monômero de HLA-A, HLA-B ou HLA-C, e a cadeia leve é β-2-microglobulina. HLA Classe I ocorre como uma cadeia-a composta por três domínios - al, a2 e a3. Essa cadeia é frequentemente referida como cadeia pesada da classe I, e é referida nesse relatório descritivo como a cadeia-alfa da classe I. A al se situa sobre uma unidade da molécula nãoHLA β2-ιηίοηου1οόη1ίη3 (codificada no cromossomo humano 15) . O domínio a3 é transmembrana, que ancora a molécula HLA
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128/345 classe I à membrana celular. 0 peptideo que está sendo apresentado é mantido pelo piso do sulco de ligação ao peptideo, na região central do heterodimero al/ &2 (uma molécula composta por duas subunidades não idênticas). HLAA, HLA-B ou HLA-C Classe I são altamente polimórficos. HLA Classe Ib exibe polimorfismo limitado, padrões de expressão e antigenos apresentados. Esse grupo é subdividido em um grupo codificado dentro de loci de HLA, por exemplo, HLA-E, HLA-F, HLA-G, bem como aqueles ligantes não estresse, por exemplo, ULBPs, Rael e H60 . Os antigenos/ligantes para muitas dessas moléculas permanecem desconhecidos, mas eles podem interagir com cada uma de células T CD8 + , células NKT e células NK.
[00239] Em algumas modalidades, a presente revelação utiliza um alelo HLA-E classe I não clássico. HLA-E é uma das moléculas classe I não clássicas reconhecidas por células exterminadoras naturais (natural killer) (NK) e células T CD8+. HLA-E é expresso em quase todos os todos os tecidos, incluindo pulmão, fígado, pele e células placentárias. A expressão de HLA-E também é detectada em tumores sólidos (por exemplo, osteossarcoma e melanoma) . HLA-E se liga ao TCR expresso em células T CD8+, resultando na ativação de célula T. HLA-E também sabidamente se liga ao receptor CD94/NKG2 expresso em células NK e células T CD8+. CD94 pode parear com várias isoformas diferentes de NKG2 para formar receptores com potencial para inibir (NKG2A, NKG2B) ou promover (NKG2C) ativação celular. HLA-E pode se ligar a um peptideo derivado de resíduos de aminoácidos 3-11 das sequências-líderes da maioria das moléculas HLA-A, -B, -C e -G, mas não pode se ligar ao seu próprio peptídeo-líder.
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Também foi demonstrado que HLA-E apresenta peptideos derivados de proteínas endógenas similares aos alelos HLAA, -B e -C. Sob condições fisiológicas, o engajamento de CD94/NKG2A com HLA-E, carregado com peptideos das sequências-líderes de HLA classe I, normalmente induz sinais inibitórios. 0 citomegalovírus (CMV) utiliza o mecanismo para escape da vigilância imune de células NK por meio da expressão da glicoproteína UL40, que mimetiza o líder de HLA-A. No entanto, também é relatado que células T CD8+ podem reconhecer HLA-E carregado com o peptideo UL40 derivado da cepa de CMV Toledo e participa da defesa contra CMV. Vários estudos revelaram diversas funções importantes de HLA-E em doenças infecciosas e câncer.
[00240] Os antígenos peptídicos se aderem às moléculas de HLA classe I por ligação por afinidade competitiva dentro do retículo endoplasmático, antes de serem apresentados na superfície da célula. Aqui, a afinidade de um antigeno peptídico individual está diretamente ligada à sua sequência de aminoácidos e à presença de motivos de ligação específicos em posições definidas dentro da sequência de aminoácidos. Se a sequência de um peptideo desse tipo é conhecida, é possível manipular o sistema imune contra células doentes usando, por exemplo, vacinas de peptideo.
[00241] Moléculas HLA Classe II possuem duas cadeias, α e β, cada uma tendo dois domínios - al e a2 e βΐ e β2 - cada cadeia tendo um domínio transmembrana, a2 e β2, respectivamente, que ancora a molécula HLA classe II à membrana celular. O sulco de ligação ao peptideo é formado pelo heterodímero de al e βΐ. O peptideo ligado pelas moléculas HLA da classe II normalmente se origina de forma
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130/345 extracelular de um antígeno de proteína exógeno. A cadeia-α e a cadeia-β estão em monômeros de HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP (FIGURA IB). Moléculas HLA Classe II possuem seis isótipos. Moléculas clássicas apresentam peptídeos aos linfócitos CD4+. Moléculas não clássicas, acessórias, com funções intracelulares, não são expostas em membranas celulares, mas em membranas internas em lisossomos, normalmente carregando os peptídeos antigênicos em moléculas HLA classe II clássicas.
[00242] No HLA classe II, fagócitos como, por exemplo, macrófagos e células dendríticas imaturas, recolhem entidades por fagocitose em fagossomos - embora células B exibam a endocitose mais geral em endossomos - que se fundem com lisossomos, cujas enzimas ácidas clivam a proteína recolhida em muitos peptídeos diferentes. A autofagia é outra fonte de peptídeos HLA classe II. Por meio da dinâmica físico-química na interação molecular com as variantes de HLA classe II oriundas do hospedeiro, codificadas no genoma do hospedeiro, um peptideo particular exibe imunodominância e é carregado sobre moléculas HLA classe II. Essas são transportadas e exteriorizadas na superfície da célula. Os subgenes mais estudados do HLA classe II são: HLA-DPA1, HLADPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA e HLA-DRB1.
[00243] A apresentação de peptídeos por moléculas HLA classe II a células T auxiliares CD4+ é necessária para respostas imunes a antígenos estranhos (Roche e Furuta, 2015) . Uma vez ativadas, células T CD4+ promovem a diferenciação de célula B e produção de anticorpo, bem como respostas de células T CD8+ (CTL) . Células T CD4+ também secretam citocinas e quimiocinas que ativam e induzem
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131/345 diferenciação de outras células imunes. Moléculas HLA classe II são heterodimeros de cadeias α e β que interagem para formar um sulco de ligação ao peptideo que é mais aberto do que sulcos de ligação ao peptideo da classe I (Unanue e cols., 2016). Acredita-se que peptídeos ligados às moléculas HLA classe II tenham um núcleo de ligação de 9 aminoácidos com resíduos flanqueadores no lado do terminal-N ou -C que se ressaltam ao sulco (Jardetzky e cols., 1996; Stern e cols., 1994) . Esses peptídeos têm normalmente 12-16 aminoácidos de comprimento e frequentemente contêm 3-4 resíduos de ancoragem nas posições Pl, P4, P6/7 e P9 do registro de ligação (Rossjohn e cols., 2015) .
[00244] Alelos HLA são expressos de forma co-dominante, o que significa que os alelos (variantes) herdados de ambos os progenitores são expressos igualmente. Por exemplo, cada pessoa carrega 2 alelos de cada um dos 3 genes da classe I, (HLA-A, HLA-B e HLA-C) e, portanto, pode expressar seis tipos diferentes de HLA da classe II. No lócus de HLA classe II, cada pessoa herda um par de genes HLA-DP (DPA1 e DPB1, que codificam cadeias α e β), um par de genes HLA-DQ (DQA1 e DQB1, para cadeias α e β), um gene HLA-DRa (DRA1), e um ou mais genes ΗΕΑ-ϋΗβ (DRB1 e DRB3, -4 ou -5). Isso significa que um indivíduo heterozigoto pode herdar seis ou oito alelos HLA classe II funcionantes, três ou mais de cada progenitor. Dessa forma, os genes HLA são altamente polimórficos; existem muitos alelos diferentes nos diferentes indivíduos dentro de uma população. Genes que codificam proteínas HLA possuem muitas variações possíveis, permitindo que o sistema imune de cada pessoa reaja a uma ampla gama de invasores estranhos. Alguns genes HLA possuem centenas de versões identificadas
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132/345 (alelos), cada uma delas recebendo um número particular. Em algumas modalidades, os alelos HLA classe I são HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01 (não clássico). Em algumas modalidades, alelos HLA classe II são HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, e HLADRB*07:01.
[00245] Os alelos HLA específicos do indivíduo ou o genótipo de HLA de um indivíduo podem ser determinados por qualquer método conhecido na técnica. Em modalidades exemplares, genótipos de HLA são determinados por qualquer método descrito no Pedido de Patente Internacional número PCT/US2014/068746, publicado em 11 de junho de 2015 como WO 2015085147. Resumidamente, os métodos incluem a determinação de tipos de genes polimórficos que podem compreender a geração de um alinhamento de leituras extraídas de um conjunto de dados de sequenciamento com um conjunto de genes de referência que compreende variantes de alelo do gene polimórfico, determinação de uma primeira probabilidade posterior ou uma pontuação derivada da probabilidade posterior para cada variante de alelo no alinhamento, identificação da variante de alelo com uma primeira probabilidade posterior máxima ou pontuação derivada da probabilidade posterior como uma primeira variante de alelo, identificação de uma ou mais leituras sobrepostas que se alinhavam com a primeira variante de alelo e uma ou mais outras variantes de alelo, determinação de uma segunda probabilidade posterior ou pontuação derivada da probabilidade posterior para as (uma ou mais) outras variantes de alelo usando um fator de ponderação, identificação de uma segunda variante de alelo por seleção
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133/345 da variante de alelo com uma segunda probabilidade posterior máxima ou pontuação derivada da probabilidade posterior, as primeira e segunda variantes de alelo definindo o tipo de gene para o gene polimórfico, e fornecimento de uma leitura de saída da primeira e segunda variantes de alelo.
[00246] Como descrito nesse relatório descritivo, há um grande corpo de evidência tanto em animais quanto em humanos de que epitopos mutados são eficazes na indução de uma resposta imune e que casos de regressão espontânea de tumor ou sobrevida de longo prazo se correlacionam com respostas de células T CD8+ a epitopos mutados (Buckwaiter e Srivastava PK. 'It is the antigen (s), Stupid' and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in Immunology 20: 296-300 (2008); Karanikas e cols., High Frequence of Cytolytic T Lymphocytes Directed Against a Tumor-Specific Mutated Antigen Detectable with HLA Tetramers in the Blood of a Lung Carcinoma Patient With Long Survival, Cancer Res. 61: 3718-3724 (2001); Lennerz e cols. The Response of Autologous T Cells to a Human Melanoma is Dominated by Mutated Neoantigens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102: 16013 (2005)) e que imunoedição pode ser rastreada às alterações na expressão de antígenos mutados dominantes em camundongos e homem (Matsushita e cols., Cancer Exome Analysis Reveals a T-Cell-Dependent Mechanism of Cancer Immunoediting, Nature 482: 400 (2012); DuPage e cols., Expression of Tumor-Specific Antigens Underlies Cancer Immunoediting, Nature 482: 405 (2012); e Sampson e cols., Immunologic Escape After Prolonged Progression-Free Survival with Epidermal Growth Factor Receptor Variant III Peptide Vaccination in Patients with Newly Diagnosed
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Glioblastoma, J. Clin. Oncol. 28: 4722-4729 (2010)).
[00247] A tecnologia de sequenciamento revelou que cada tumor contém múltiplas mutações específicas do paciente que alteram o teor de codificação de proteína de um gene. Essas mutações criam proteínas alteradas, que variam de alterações de aminoácido único (causadas por mutações missense) até a adição de regiões longas de novas sequência de aminoácidos em função de frame shifts, leitura através de códons de terminação ou tradução de regiões de intron (novas mutações de quadro de leitura aberta; neoORFs). Essas proteínas mutadas são alvos valiosos para a resposta imune do hospedeiro ao tumor, diferentemente de proteínas nativas, na medida em que não estão sujeitas aos efeitos de amortecimento imune da autotolerância. Portanto, proteínas mutadas têm maior probabilidade de serem imunogênicas e também são mais específicas para as células tumorais, comparadas com células normais do paciente.
[00248] O termo célula T inclui células T CD4+ e células T CD8+. O termo célula T também inclui tanto células T tipo T auxiliar 1 quanto células T tipo T auxiliar 2. Células T, como usadas nesse relatório descritivo são geralmente classificadas por função e antígenos da superfície celular (antígenos de diferenciação de agrupamento, ou CDs), que também facilitam a ligação do receptor de célula T ao antígeno, em duas classes principais: células T auxiliares (helper) (Th) e linfócitos T citotóxicos (CTLs).
[00249] Células T auxiliares (Th) maduras expressam a proteína de superfície CD4 e são referidas como células T CD4+. Após desenvolvimento da célula T, células T naive
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135/345 maduras deixam o time e começam a se espalhar por todo o corpo, incluindo os linfonodos. Células T naive são aquelas células T que nunca foram expostas ao antigeno para o qual foram programadas para responder. Como todas as células T, elas expressam o complexo receptor de célula T-CD3. 0 receptor de célula T (TCR) consiste em regiões tanto constantes quanto variáveis. A região variável determina para qual antigeno a célula T pode responder. Células T CD4+ possuem TCRs com uma afinidade por MHC Classe II, e CD4 está envolvido na determinação da afinidade por MHC durante maturação no timo. Proteínas MHC Classe II geralmente só são encontradas na superfície de células apresentadoras de antigeno especializadas (APCs). Células apresentadoras de antigeno (APCs) especializadas são primariamente células dendríticas, macrófagos e células B, embora células dendríticas sejam o único grupo de células que expressa MHC Classe II constitutivamente (em todos os momentos). Algumas APCs também ligam antígenos nativos (ou não processados) à sua superfície, por exemplo, células dendríticas foliculares, mas antígenos não processados não interagem com células T e não estão envolvidos em sua ativação. Os antígenos peptídicos que se ligam às proteínas MHC classe I são tipicamente mais curtos do que antígenos peptídicos que se ligam às proteínas MHC classe II.
[00250] Linfócitos T citotóxicos (CTLs), também conhecidos como células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ ou células T killer, se referem aos linfócitos que induzem apoptose nas células visadas. CTLs formam conjugados antígeno-específicos com células-alvo por meio de interação de TCRs com antigeno processado (Ag)
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136/345 nas superfícies das células-alvo, resultando em apoptose da célula visada. Corpos apoptóticos são eliminados por macrófagos. 0 termo resposta de CTL é usado para se referir à resposta imune primária mediada por células CTL. Linfócitos T citotóxicos possuem tanto receptores de célula T (TCR) quanto moléculas CD8 em sua superfície. Os receptores de célula T são capazes de reconhecer e se ligar a peptideos complexados com as moléculas de HLA classe I. Cada linfócito T citotóxico expressa um receptor de célula T único que é capaz de se ligar a complexos MHC/peptídeo específicos. A maioria das células T citotóxicas expressa receptores de célula T (TCRs) que podem reconhecer um antígeno específico. A fim de que TCR se ligue à molécula MHC classe I, o primeiro deve ser acompanhado por uma glicoproteína denominada CD8, que se liga à porção constante da molécula MHC classe I. Portanto, essas células T são denominadas células T CD8+. A afinidade entre CD8 e a molécula MHC mantém a célula Tea célula-alvo ligadas intimamente juntas durante ativação antígeno-específica. Células T CD8+ são reconhecidas como células T após se tornarem ativadas e são geralmente classificadas como tendo um papel citotóxico pré-definido dentro do sistema imune. No entanto, células T CD8+ também possuem a habilidade para produzir algumas citocinas.
[00251] Receptores de célula T (TCR) são receptores da superfície celular que participam na ativação de células T em resposta à apresentação de antígeno. O TCR é geralmente feito de duas cadeias, alfa e beta, que se montam para formar um heterodímero e se associa com as subunidades de transdução de CD3 para formar o complexo receptor de célula T presente na superfície celular. Cada cadeia alfa e beta do TCR
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137/345 consiste em uma região variável (V) e constante (C) do terminal-N imunoglobulina-like, um domínio transmembrana hidrofóbico, e uma região citoplasmática curta. Como para as moléculas de imunoglobulina, as regiões variáveis das cadeias alfa e beta são geradas por recombinação V(D)J, criando uma diversidade grande de especificidades de antígeno dentro da população de células T. No entanto, em contraste com imunoglobulinas, que reconhecem antígeno intacto, células T são ativadas por fragmentos processados de peptideo em associação com uma molécula MHC, introduzindo uma dimensão extra ao reconhecimento de antígeno por células T, conhecida como restrição de MHC. 0 reconhecimento de disparidades de MHC entre o doador e o receptor por meio do receptor de célula T leva à proliferação de células T e ao desenvolvimento potencial de GVHD. Foi demonstrado que a expressão de superfície normal no TCR depende da síntese e montagem coordenadas de todos os sete componentes do complexo (Ashwell e Klusner 1990). A inativação de TCRa ou TCRp pode resultar na eliminação do TCR da superfície de células T, evitando o reconhecimento de aloantígeno e, dessa forma, GVHD. No entanto, a ruptura de TCR geralmente resulta na eliminação do componente de sinalização de CD3 e altera o meio de expansão adicional de células T.
[00252] O termo peptidoma de HLA se refere a um pool de peptídeos que interagem especificamente com uma classe de HLA particular e pode englobar milhares de sequências diferentes. Os peptidomas de HLA incluem uma diversidade de peptídeos, derivados de proteínas tanto normais quanto anormais expressas nas células. Dessa forma, os peptidomas de HLA podem ser estudados para identificar peptídeos
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138/345 específicos de câncer, para o desenvolvimento de produtos imunoterapêuticos antitumorais e como uma fonte de informação sobre esquemas de sintese e degradação de proteinas dentro das células de câncer. Em algumas modalidades, peptidoma de HLA é um pool de moléculas HLA solúveis (sHLA). Em algumas modalidades, peptidoma de HLA é um pool de HLA da membrana (mHLA).
[00253] O termo célula apresentadora de antigeno ou APC inclui células apresentadoras de antigeno professionals (por exemplo, linfócitos B, macrófagos, monócitos, células dendríticas, células de Langerhans), bem como outras células apresentadoras de antigeno (por exemplo, queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos, células epiteliais tímicas, células epiteliais da tireóide, células gliais (cérebro), células beta pancreáticas e células endoteliais vasculares) . Uma célula apresentadora de antigeno ou APC é uma célula que expressa as moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) e pode exibir antigeno estranho complexado com MHC em sua superfície.
[00254] Fluxo de IP Universal: Plataforma de identificação de complexo HLA-peptideo monoalélico universal [00255] As respostas imunes adaptivas se baseiam, em parte, na habilidade de células T citotóxicas CD8+ para identificar e eliminar células que exibem antígenos associados a doenças ligados às moléculas de antigeno leucocitário humano (HLA) classe I. Proteinas HLA classe I (HLA-A, B e C) são expressas na superfície de quase todas as células nucleadas no corpo humano e são necessárias para apresentação de peptídeos curtos para detecção por
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139/345 receptores de célula T CD8+. Os peptideos ligados ao HLA surgem de proteínas endógenas ou estranhas que são clivadas pelo proteassoma e peptidases do ER antes do carregamento e exibidos por proteínas HLA classe I. Os genes HLA são os genes mais polimórficos através da população humana, com mais de 10.000 variantes de alelo HLA classe I identificadas até hoje (Robinson e cols., 2015). Estima-se que cada alelo HLA se ligue e apresente aproximadamente 1.000-10.000 peptideos únicos às células T; <0,1% de aproximadamente 10 milhões de peptideos de 9-mer potenciais de genes que codificam proteína humana (Bassani-Sternberg e cols., 2015; Hunt e cols., 1992; Rammensee e cols., 1995, 1999; Rock e cols.; Vita e cols., 2015; Walz e cols., 2015) .
[00256] Diferentemente das proteínas HLA classe I, proteínas HLA classe II (HLA-DR, DQ e DP) só são expressas na superfície de células apresentadoras de antigeno (APCs) e células epiteliais, vasculares e de tecidos conjuntivos em resposta a sinais inflamatórios. A apresentação de peptideos, mais frequentemente derivados de proteínas exógenas, por moléculas HLA classe II às células T CD4+ é necessária para respostas imunes a antígenos estranhos (Roche e Furuta, 2015) . Uma vez ativadas, células T CD4 + promovem diferenciação de célula B e produção de anticorpo, bem como respostas de células T CD8+. Células T CD4+ também secretam citocinas e quimiocinas que ativam e induzem diferenciação de outras células imunes. Moléculas HLA classe II são heterodímeros de cadeias α e β que interagem para formar um sulco de ligação ao peptideo que é mais aberto do que os sulcos de ligação ao peptideo da classe I (Unanue e cols., 2016). Acredita-se que peptideos ligados às moléculas
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HLA classe II tenham um núcleo de ligação de 9 aminoácidos com resíduos flanqueadores no lado do terminal-N ou -C que se ressaltam ao sulco (Jardetzky e cols., 1996; Stern e cols., 1994) . Esses peptídeos têm normalmente 12-16 aminoácidos de comprimento e frequentemente contêm 3-4 resíduos de ancoragem nas posições Pl, P4, P6/7 e P9 do registro de ligação (Rossjohn e cols., 2015) . Sabe-se menos sobre as características de ligação ao peptideo aleloespecífica de moléculas HLA classe II, por causa da heterogeneidade do pareamento de cadeias α e β, complexidade de dados que limita a habilidade para atribuir confiavelmente epitopos de ligação centrais, e da ausência de grau de imunoprecipitação, anticorpos alelo-específicos necessários para análises bioquímicas de alta resolução.
[00257] As regras de ligação ao peptideo foram intensamente estudadas para um subconjunto de alelos HLA (Vita e cols., 2015) e codificadas em algoritmos avançados baseados em rede neural que prevêem a ligação (Hoof e cols., 2009; Lundegaard e cols., 2008) . No entanto, vários fatores limitam a potência para prever peptídeos apresentados em alelos HLA. Primeiro, a procedência de dados de peptídeos sobre os quais esses algoritmos são treinados é diversa,
variando de avaliações de bibliotecas de peptídeos até
degradação de Edman e sequenciamento baseado em
espectrometria de massa de peptídeos processados e
apresentados endogenamente (Boen e cols., 2000; Rammensee e cols., 1995, 1999; Vita e cols., 2015). As identificações de peptídeos baseadas em espectrometria de massa constituem cerca de 30% da identificação total em IEDB. A espectrometria de massa se tornou um método desejado de sequenciamento de
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141/345 peptideo associado ao HLA por causa do trabalho pioneiro por Donald F. Hunt e colleagues (Cobbold e cols., 2013; Hunt e cols., 1992; Meadows e cols., 1997; Mohammed e cols., 2008; Zarling e cols., 2000, 2006), bem como dos aprimoramentos à instrumentação demonstrados por muitos grupos ao longo das últimas duas décadas (Bassani-Sternberg e cols., 2015; Caron e cols., 2015; Mommen e cols., 2014) . Segundo, muitos algoritmos de previsão existentes se concentraram na previsão de ligação, mas podem não levar em conta completamente processos endógenos que geram e transportam peptideos antes da ligação (Larsen e cols., 2007) . Terceiro, o número de peptideos de ligação para muitos alelos HLA é muito pequeno para desenvolver um previsor confiável. Até agora, no entanto, a geração de conjuntos de dados de alta qualidade tem sido impedida pelos protocolos ineficientes que necessitam de quantidades proibitivamente grandes de material celular inserido e uma ausência de ferramentas de pesquisa de banco de dados para sequenciamento de peptideoHLA (Caron e cols., 2015; Hoof e cols., 2009; Lundegaard e cols., 2008; Vita e cols., 2015).
[00258] É revelada nesse relatório descritivo uma estratégia bioquímica de enriquecimento única para complexos de peptideo-HLA classe I e II de células vivas e lisado celular. Moléculas HLA que contêm uma sequência de marcação no terminal-N ou no terminal-C (por exemplo, BAP ou HA) podem ser marcadas na superfície da célula ou em lisado célular. Por exemplo, moléculas HLA que contêm uma sequência de peptideo aceptor de biotina (BAP) no terminal-N ou no terminal-C pode ser marcada enzimaticamente com biotina na superfície da célula ou no lisado célular. Por exemplo,
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142/345 moléculas HLA que contêm uma sequência de HA no terminal-N ou no terminal-C podem ser enriquecidas das misturas celulares complexas usando um anticorpo específico para HA. Em uma modalidade exemplar, complexos HLA-peptídeo marcados com biotina são enriquecidos de misturas celulares complexas usando partículas de estreptavidina/NeutrAvidin e os complexos HLA-peptídeo enriquecidos são analisados ou caracterizados. Em uma modalidade exemplar, complexos HLApeptídeo marcados com HA são enriquecidos de misturas celulares complexas usando um anticorpo específico para HA e os complexos HLA-peptídeo enriquecidos são analisados ou caracterizados. Por exemplo, peptídeos associados podem ser eluídos e sequenciados por LC-MS/MS. Notavelmente, os métodos atualmente revelados fornecem uma plataforma universal para análise e caracterização dos complexos HLApeptídeo. Por exemplo, os métodos atualmente revelados fornecem uma plataforma universal para a identificação de peptídeos apresentados endogenamente de linhagem de célula que expressa todas as construções de classe I ou II possíveis.
[00259] São reveladas nesse relatório descritivo linhagens de células que expressam alelo HLA classe I e classe II único que permitem alocações de peptídeo:alelo não ambíguas (Shimizu e DeMars, 1989; Shimizu e cols., 1986) . Isso é um aprimoramento em relação aos métodos atuais de detecção de peptídeos ligados ao HLA, na medida em que a maioria dos estudos baseados em MS envolve eluição e sequenciamento de uma mistura confusa de ligantes ligados a múltiplas moléculas HLA-A, B e C, o que exige previsões de afinidade e algumas vezes deconvolução para alocações de
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143/345 alelo (Bassani-Sternberg e Gfeller, 2016). Estudos com linhagens de células transfectadas com HLA solúvel foram capazes de derivar epitopos de ligação a peptideos para um único alelo HLA, mas os experimentos mais abrangentes até hoje identificaram apenas <200 peptideos únicos e exigiam várias ordens de magnitude mais de material celular de partida (Hawkins e cols., 2008) . Por remoção da incerteza de alocações peptideo:HLA, os métodos atualmente revelados facilitam avaliações mais profundas e mais precisas de ligantomas HLA-peptideo e regras relacionadas ao processamento e apresentação de antigeno peptidico usando menos material celular do que esforços prévios.
[00260] Os métodos e composições descritos nesse relatório descritivo incluem, por exemplo, cadeia-β variável marcada quimicamente (biotinilação) para diferenciar entre heterodimeros de HLA classe II apresentados por células, o que permite um mapeamento de epitopo aprimorado. Construções de HLA classe I e classe II que contêm uma etiqueta, por exemplo, uma sequência de peptideo aceptor de biotina (BAP), no terminal-N ou -C, podem ser usadas nos métodos descritos nesse relatório descritivo. A etiquetagem de afinidade do terminal-N e -C permite imunopurificação alelo HLA-seletiva de células que expressam HLA endógeno. A etiquetagem de afinidade do terminal-N permite a imunopurificação alelo HLA-seletiva de complexos apresentados na superfície celular. Por exemplo, após transfecção ou transdução, a biotinilação do terminal-N permite a diferenciação entre complexos HLA apresentados na superfície da célula vs. todos os complexos HLA-peptideo em lisados celulares. Por exemplo, a biotinilação de complexos HLA-peptideo nas superfícies de
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144/345 células intactas (sem lise) permite métodos imparciais de sequenciamento por espectrometria de massa (MS) de peptídeos processados e apresentados endogenamente. Os métodos de enriquecimento revelados nesse relatório descritivo, por exemplo, métodos de enriquecimento por imunoprecipitação, permitem análise de alto rendimento de amostras de células.
[00261] É fornecido nesse relatório descritivo um método de caracterização de complexos HLA-peptídeo que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade; expressão do HLA marcado com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização dos complexos HLA-peptídeo.
[00262] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a caracterização de um peptídeo ligado ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento.
[00263] Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para dois ou mais alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, os dois ou
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145/345 mais alelos HLA classe I e/ou classe II compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 alelos HLA classe I e/ou classe II.
[00264] Em algumas modalidades, os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio intracelular. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são excretados. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptídeos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade.
[00265] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptideos alelo HLAespecíficos.
[00266] Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um alelo HLA classe I ou classe II recombinante único.
[00267] Em algumas modalidades, o método compreende: o fornecimento de uma população de células, cada uma compreendendo uma ou mais células que compreendem um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um polipeptídeo recombinante diferente codificado por um alelo HLA diferente ligado operacionalmente a um peptideo com aceptor por
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146/345 afinidade; enriquecimento para complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização de um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptideosHLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento.
[00268] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptídeos à população de células.
[00269] Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptídeos ou a expressão dos (um ou mais) peptídeos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA.
[00270] Em algumas modalidades, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico.
[00271] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação da sequência de um peptídeo ou uma porção desta ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento, opcionalmente determinação de se um peptídeo ou uma porção deste está modificado. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LCMS/MS, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptídeo ou uma porção deste
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147/345 ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de associações de peptideos com moléculas HLA nos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00272] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer, uma infecção com um agente infeccioso ou uma reação autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptideos dos complexos HLA-peptideo, opcionalmente em que os peptideos são de uma ou mais proteinas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptideos das (uma ou mais) proteinas-alvo do agente
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148/345 infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptideos dos complexos HLA-peptideo derivados de um agente infeccioso.
[00273] Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II recombinante é compatível com um indivíduo com uma doença ou condição.
[00274] Em algumas modalidades, o método compreende a pesquisa de hipersensibilidade farmacológica (por exemplo, biológicos). Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de se um biológico administrado (por exemplo, um fármaco de proteína, peptídeo ou anticorpo), um fragmento de biológicos administrados, ou um fragmento biológico processado são apresentados às células T. Esses epitopos podem causar efeito adverso no indivíduo e, dessa forma, como os biológicos administrados são processados no indivíduo deve ser monitorado. Por exemplo, um fármaco para HIV (por exemplo, Abacavir) pode se ligar às moléculas HLA e alterar motivos de ligação ao peptídeo para certos alelos HLA (por exemplo, HLA-B5701).
[00275] Em algumas modalidades, o peptídeo do complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um indivíduo quando apresentado por uma célula apresentadora de antigeno. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a comparação de complexos HLA-peptideo de células de câncer com complexos HLA-peptideo de células não-câncer.
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149/345 [00276] Em algumas modalidades, a população de células compreende diversas populações de células, cada população de células expressando um alelo HLA classe I ou classe II recombinante diferente. Em algumas modalidades, cada população de células das diversas populações está em um mesmo recipiente ou em um recipiente separado.
[00277] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptídeos dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da caracterização. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a remoção de um ou mais aminoácidos de um terminal de um peptídeo ligado a um complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00278] Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA
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150/345 classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I.
[00279] Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knockout de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLAB, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas.
[00280] Em algumas modalidades, cada sequência codifica pelo menos dois alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica o peptideo com aceptor por
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151/345 afinidade .
[00281] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de pelo menos um segundo ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente ligado operacionalmente ao mesmo peptídeo com aceptor por afinidade ou a um peptídeo com aceptor por afinidade diferente.
[00282] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante.
[00283] Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante por um vinculador.
[00284] Em algumas modalidades, o enriquecimento
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152/345 compreende o enriquecimento para células intactas que expressam os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao peptideo com aceptor por afinidade.
[00285] Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de marcação que compreende um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR),
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153/345 etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende
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154/345 a imunoprecipitação de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida é uma partícula. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminal-N do alelo HLA classe I ou classe II recombinante.
[00286] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
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155/345 [00287] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador.
[00288] Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptídeo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptídeo
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156/345 aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por
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157/345 afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00289] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00290] Em algumas modalidades, a determinação compreende a realização de análise bioquímica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas modalidades, a determinação compreende a obtenção de uma sequência de peptídeos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptídeos isolados dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptídeos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptídeos.
[00291] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa,
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A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO e THP1. Em algumas modalidades, a linhagem de célula é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, agentes que alteram o processamento de antigeno (por exemplo, inibidores de peptidase, inibidores de proteassoma e inibidores de TAP), ou uma combinação destes.
[00292] Em algumas modalidades, o banco de dados de peptídeos é um banco de dados de peptídeos de especificidade sem enzima, por exemplo, um banco de dados sem modificação ou um banco de dados com modificação. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a pesquisa do banco de dados de peptídeos usando uma estratégia de pesquisa reversa de banco de dados.
[00293] Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células tumorais. Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento dos referidos complexos HLA-peptídeo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o referido agente é uma citocina inflamatória, um agente químico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[00294] Em algumas modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA mutado.
[00295] Em algumas modalidades, a sequência que codifica
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159/345 o alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da proteína do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes.
[00296] Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para diferentes alelos HLA. Em algumas modalidades, cada alelo HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única. Em algumas modalidades, cada ácido polinucléico que codifica um alelo HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única.
[00297] É fornecido nesse relatório descritivo um banco de dados de sequências de peptideo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma combinação de dois ou mais bancos de dados de sequências de peptideo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo repetidamente, cada vez usando um alelo HLA diferente. É fornecido nesse relatório descritivo um método para a geração de um algoritmo de previsão para identificação de peptideos de ligação alelo HLA-específicos, que compreende o treinamento de uma máquina com um banco de dados de sequências de peptideos descrito nesse relatório descritivo
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160/345 ou uma combinação descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e redes neurais. Em algumas modalidades, uma variável usada para treinar a máquina compreende uma ou mais variáveis selecionadas do grupo que consiste em sequência de peptideos, propriedades físicas do aminoácido, propriedades físicas do peptideo, nível de expressão da proteína-fonte de um peptideo dentro de uma célula, estabilidade da proteína, taxa de tradução de proteína, sítios de ubiquitinação, taxa de degradação de proteína, eficiências de tradução a partir do perfil ribossomal, capacidade de divagem de proteína, localização da proteína, motivos da proteína hospedeira que facilitam o transporte de TAP, proteína hospedeira ser submetida à autofagia, motivos que favorecem estagnação ribossômica, e características da proteína que favorecem NMD. Em algumas modalidades, os motivos que favorecem estagnação ribossômica compreendem trechos de poliprolina ou polilisina. Em algumas modalidades, as características da proteína que favorecem NMD são selecionadas do grupo que consiste em uma UTR-3' longa, um códon de parada maior do que 50nt a montante da última junção éxon:éxon e capacidade de divagem de peptideo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para identificação de peptideos de ligação alelo HLA-específicos, que compreende a análise da sequência de um peptideo com uma máquina que foi treinada com um banco de dados de sequências de peptideos obtido por realização de um método descrito nesse relatório descritivo para o alelo HLA. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação do nível de expressão da proteína-fonte do
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161/345 peptideo dentro de uma célula; e em que a expressão da proteína-fonte é uma variável preditiva usada pela máquina. Em algumas modalidades, o nível de expressão é determinado por medição da quantidade de proteína-fonte ou da quantidade de RNA que codifica a referida proteína-fonte.
[00298] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma codificando um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem (a) uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe I recombinante diferente, (b) uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, (c) uma sequência que codifica [32-microglobulina; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c), estão ligadas operacionalmente.
[00299] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma compreendendo uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem (a) uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe II recombinante, (b) uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, (c) uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c), estão ligadas operacionalmente. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico recombinante é isolado. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLAPetição 870190134748, de 16/12/2019, pág. 168/376
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A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas
modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que
consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP.
[00300] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a molécula de aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA recombinante.
[00301] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA recombinante por um vinculador.
[00302] Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas pelo mesmo polinucleotideo. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas por polinucleotídeos diferentes.
[00303] Em algumas modalidades, o peptídeo com aceptor por afinidade codificado se liga especificamente a uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade.
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163/345 [00304] Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem dois ou mais peptideos com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que pelo menos duas das três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem o mesmo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, os dois ou mais peptideos com aceptor por afinidade são únicos para cada uma das (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é selecionado do grupo que consiste em peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidinaglicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose
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164/345 (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST) , etiqueta de Glu-Glu (EE) , etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tagr etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S~tagr etiqueta de proteína carreadora de biotinacarbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP) , HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente a uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com uma sequência de aminoácidos do
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HLA classe I ou classe II recombinante.
[00305] Em algumas modalidades, para dois ou mais dos ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica o HLA marcado com aceptor por afinidade está integrada estavelmente no genoma de uma célula.
[00306] Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina ou a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende uma etiqueta de HA. Em algumas modalidades, a sequência que codifica β2-microglobulina ou a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica o HLA recombinante e o peptídeo com aceptor por afinidade por um vinculador. Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00307] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende duas ou mais moléculas de polipeptídeo isoladas codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que
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166/345 compreende uma população de células que compreende duas ou mais moléculas de polipeptideo codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreende uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreende uma ou mais células que compreendem uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[00308] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA classe I ou classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos e um ou mais alelos HLA classe II endógenos.
[00309] Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a composição é formulada usando peptideos ou ácidos polinucleicos que codificam peptideos específicos para um tipo de HLA de um paciente.
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167/345 [00310] É fornecido nesse relatório descritivo um método de produção de uma célula, que compreende a transdução ou transfecção de duas ou mais células com os dois ou mais ácidos polinucleicos de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um peptídeo identificado de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo.
[00311] É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a célula apresenta o peptídeo como um complexo HLA-peptideo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de
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168/345 uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo.
[00312] Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune de célula T. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de célula T CD8. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de células T CD4. Em algumas modalidades, a resposta imune é resposta imune humoral.
[00313] É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência
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169/345 que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamifero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamifero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamifero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamifero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamifero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamifero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo.
[00314] Em algumas modalidades, a doença é câncer. Em algumas modalidades, a doença é infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, opcionalmente um virus ou bactéria, ou um parasita. Em algumas modalidades, o virus é selecionado do grupo que consiste em: virus BK (BKV), virus da Dengue (DENV-1, DENV2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus da Hepatite B (HBV), virus da Hepatite C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, virus da imunodeficiência humana (HIV), virus linfotrópico de célula T humana (HTLV1), um virus influenza, RSV, HPV, raiva, virus da caxumba rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B,
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Rotavirus, virus da varicela, papilomavirus humano (HPV), variola, zoster, e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp., e qualquer combinação destes.
[00315] É fornecido nesse relatório descritivo um método de enriquecimento para peptideos imunogênicos, que compreende: o fornecimento de uma população de células que compreende uma ou mais células que expressam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um peptideo com aceptor por afinidade ligado operacionalmente a um HLA recombinante codificado por um alelo HLA recombinante; e enriquecimento para complexos HLA-peptideo que compreendem o HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a determinação da sequência de peptideos imunogênicos isolados dos complexos HLA-peptideo. Em algumas modalidades, a determinação compreende a utilização de LCMS/MS.
[00316] É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma
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171/345 quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende
uma sequência que codifica um peptideo que compreende a
sequência de um descritivo. Enriquecimento peptideo de complexos descrita nesse HLA-pept ideo relatório
[00317] Os genes que codificam glicoproteínas de HLA classe I e classe II estão entre as sequências codificadoras mais polimórficas no genoma humano. No entanto, há regiões relativamente constantes ou invariáveis para cada uma das cadeias pesadas de HLA classe I e cadeias α e β de HLA classe II que podem ser visadas por anticorpos para capturar seletivamente qualquer cadeia pesada de HLA classe I ou cadeia α ou β de HLA classe II. No entanto, como as cadeias α e β normalmente estão associadas entre elas in vivo, a
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172/345 imunopurificação da cadeia-α de um HLA solúvel intacto pode coprecipitar a cadeia-β e vice-versa. Anticorpos anti-HLA classe II para o objetivo de enriquecimento para polipeptideos HLA-associados podem reconhecer epitopos conservados apresentados na cadeia α ou β.
[00318] O método de enriquecimento que emprega anticorpos específicos para alelo HLA ou que utiliza reagentes não HLAespecíficos é bem conhecido na técnica. Por exemplo, polipeptideos HLA-C são tipicamente expressos por indivíduos em níveis menores do que HLA-A e HLA-B. Consequentemente, a fim de aumentar a detecção de HLA-C com o uso de anticorpos, pode ser vantajoso fornecer uma imunopurificação específica de HLA-C usando um anticorpo específico para HLA-C, em adição a outros métodos de purificação. Vários exemplos de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente a cadeias de HLA individuais estão disponíveis comercialmente.
[00319] É fornecido nesse relatório descritivo um fluxo de imunopurificação universal (IP) para o enriquecimento de um ou mais complexos de polipeptídeo de HLA de alelo único. Ilustrativo de um método desse tipo para enriquecimento para um polipeptídeo HLA-associado é um método que compreende uma etapa de imunopurificação. O fluxo de IP Universal compreende construções de IP Universal que consistem em uma construção de DNA que codifica alelos HLA classe I ou classe II marcados por afinidade que são expressos por um vetor de expressão por meio de transfecção ou transdução celular. Exemplo não limitante de um vetor de expressão é um vetor lentiviral.
[00320] Células transfectadas ou transduzidas com construções de IP Universal foram expandidas ou selecionadas
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173/345 e depois expandidas antes de análises de sequência por LCMS/MS. Populações de células adequadas para transfecção ou transdução incluem, por exemplo, linhagens de células deficientes em classe I nas quais um único alelo HLA classe I é expresso, linhagens de células deficientes em classe II nas quais um único par de alelos HLA classe II é expresso, ou linhagens de células deficientes em classe I e classe II nas quais um único HLA classe I e/ou único par de alelos classe II são expressos. Como uma modalidade exemplar, a linhagem de célula B deficiente em classe I é B721.221. Em algumas modalidades, as células são A375 ou HEK293T, HeLa ou expi293. No entanto, é evidente para aqueles técnicos no assunto que podem ser geradas outras populações de células que são deficientes em classe I e/ou classe II. Métodos para a geração de células deficientes em classe I e/ou classe II, bem como linhagens de células deficientes em classe I e/ou classe II são conhecidos na técnica, e um método exemplar para deleção/inativação de genes classe I ou classe II endógenos inclui edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9, por exemplo, em células THP-1. Em algumas modalidades, as populações de células são células apresentadoras de antigeno profissionais, por exemplo, macrófagos, células B e células dendriticas. As células podem ser células B ou células dendriticas. Em algumas modalidades, as células são células tumorais ou células de uma linhagem de célula tumoral. Em algumas modalidades, as células são células isoladas de um paciente. Em algumas modalidades, as células contêm um agente infeccioso ou uma porção deste.
[00321] Em algumas modalidades, as construções de IP Universal compreendem construções de HLA classe I ou classe
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II que compreendem uma etiqueta de aceptor por afinidade e molécula de afinidade. Em algumas modalidades, as construções de IP Universal compreendem pelo menos uma etiqueta de aceptor por afinidade e molécula de afinidade que se ligam especificamente. Em algumas modalidades, uma etiqueta de aceptor por afinidade é etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress,
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Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, uma etiqueta de epitopo de VSV-G derivado da glicoproteína do vírus da estomatite viral ou uma etiqueta V5 derivado de um epitopo pequeno (Pk) encontrado nas proteínas P e V do paramixovirus do vírus símio 5 (SV5). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade pode incluir múltiplas repetições da sequência de marcação (por exemplo, 3x etiqueta de poli-histidina, 3x etiqueta de FLAG). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade pode incluir múltiplas repetições da sequência de marcação (por exemplo, 3x etiqueta de polihistidina, 3x etiqueta de FLAG). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade é uma etiqueta de epitopo, que é um tipo de etiqueta de peptídeo que adiciona um epitopo reconhecível (sítio de ligação ao anticorpo) à proteína HLA para fornecer ligação do anticorpo correspondente permitindo, dessa forma, a identificação ou purificação por afinidade da proteína etiquetada. Exemplo não limitante de uma etiqueta de epitopo é proteína A ou proteína G, que se liga à IgG. Em algumas modalidades, etiquetas de aceptor por afinidade incluem o peptídeo aceptor de biotina (BAP) ou sequência de peptídeos de hemaglutinina da influenza humana (HA) . Várias outras porções de etiquetagem são conhecidas e podem ser previstas por aqueles
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176/345 técnicos no assunto, e são contempladas nesse relatório descritivo. Qualquer etiqueta de peptideo pode ser usada, desde que ela seja capaz de ser expressa como um elemento de um complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00322] Os marcadores por afinidade podem ser colocados no terminal-N ou terminal-C do alelo HLA. Uma sequência de divagem, por exemplo, F2A ou um sitio interno de entrada de ribossomos (IRES), pode ser colocada entre a cadeia-α e β2microglobulina (classe I) ou entre a cadeia-α e cadeia-β (classe II) . Em algumas modalidades, um único alelo HLA classe I é HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 e HLA-B*14:02, ou HLAE*01:01, e alelo HLA classe II é HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 e HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 ou HLA-DRB*07:01. Em algumas modalidades, a sequência de divagem é uma sequência T2A, P2A, E2A ou F2A. Por exemplo, a sequência de divagem pode ser EGRGSLLTCGDVEENPGP (T2A), A T N F S L LKQAGDVEENPGP (P2A) , QCTNYALLKLAGD V E S N P G P (E2A) ouVKQTLNFDLLKLAGDVES N P G P (F2A) .
[00323] Em algumas modalidades, a imunopurificação de complexo HLA-peptideo é baseada em biotina. Em algumas modalidades, a imunopurificação de complexo HLA-peptideo é baseada em estreptavidina ou NeutrAvidin. Em algumas modalidades, complexos HLA-peptideo também podem ser enriquecidos de uma amostra biológica por técnicas de cromatografia, por exemplo, HPLC. Em algumas modalidades, a depleção de proteínas séricas em alta abundância pode ser usada para enriquecer para complexos HLA-peptídeo. Em algumas modalidades, métodos para a remoção de proteínas
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177/345 séricas abundantes incluem ligantes de corante (para albumina), proteína A e G (para γ-globulinas) ou anticorpos específicos que se ligam com alta afinidade e depletam seletivamente essas espécies da amostra (Govorukhina, Reijmers e cols. 2006). Essas estratégias aumentariam o número de sequências de peptideos derivadas de HLA identificadas em uma única análise por espectrometria de massa.
[00324] O grau de enriquecimento desejável para otimizar a resolução de sequências de HLA particulares de uma amostra biológica dependerá da concentração inicial da sequência de HLA na amostra biológica, e da concentração e natureza de outras proteínas não HLA na amostra.
[00325] Para enriquecer complexos HLA-peptídeo dentro de uma amostra biológica, técnicas clássicas de purificação de proteínas podem ser usadas isoladamente ou em combinação com os métodos de fluxo de IP Universal fornecidos nesse relatório descritivo. As técnicas clássicas de separação de proteínas (purificação) se baseiam em: diferenças de tamanho (ultrafiltração, filtração em gel ou cromatografia por exclusão de tamanho); diferenças de carga (pi) (cromatografia por troca de ânions/cátions, ou cromatografia por interação hidrofóbica); e combinações de diferenças de tamanho e carga (eletroforese ID ou 2D) . As opções de imunopurificação incluem o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente às proteínas HLA. Outras opções de purificação de proteínas por afinidade envolvem o uso de proteínas que sabidamente se ligam ao HLA, e essas incluem: CD8, que se liga ao domínio «3 de todas as proteínas HLA classe I; CD4 que se liga a todas as proteínas
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HLA classe II; receptores de célula T autólogos; e peptídeos antigênicos que se ligam ao HLA com alta afinidade (algoritmos de modelagem por computador podem ser usados para prever características de ligação ao peptídeo/HLA). Qualquer uma dessas opções de proteína HLA de alta afinidade pode ser imobilizada sobre um suporte sólido insolúvel para preparar uma matriz de afinidade que pode ser usada para capturar o HLA de uma amostra biológica líquida. Condições de eluição apropriadas resultarão na concentração e purificação (isolamento) do teor de HLA da amostra.
[00326] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade com os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente ao peptídeo com aceptor por afinidade. Em alguns casos, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico.
Antígenos específicos de doenças [00327] Em algumas modalidades, o tamanho de pelo menos uma molécula de peptídeo antigênico pode compreender, sem limitação, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca
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179/345 de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120 ou mais resíduos de molécula amino, e qualquer faixa derivável entre esses valores.
[00328] Em algumas modalidades, as moléculas de peptídeo antigênico são iguais ou menores do que 50 aminoácidos. Em algumas modalidades, as moléculas de peptídeo antigênico são iguais até cerca de 20 até cerca de 30 aminoácidos. Um peptídeo pode mais longo ser projetado de várias formas. Por exemplo, quando as regiões de ligação ao HLA são previstas ou conhecidas, um peptídeo mais longo pode consistir em: peptídeos de ligação individuais com uma extensão de 0-10 aminoácidos em direção ao terminal-N e -C de cada produto gênico correspondente. Um peptídeo mais longo também pode consistir em uma concatenação de alguns ou todos os peptídeos de ligação com sequências estendidas para cada um. Em outro caso, quando o sequenciamento revela uma sequência de epitopo longa (>10 resíduos) presente no tecido doente (por exemplo, em função de uma frameshift, leitura ou inclusão de intron que leva a uma nova sequência de peptídeos), um peptídeo mais longo pode consistir em todo o trecho de novos aminoácidos doença-específicos. Em ambos os casos, o uso de um peptídeo mais longo exige processamento endógeno por células apresentadoras de antígeno profissionais como, por
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180/345 exemplo, células dendríticas, e pode levar à apresentação de antígeno mais eficaz e à indução de respostas de células T. Em algumas modalidades, a sequência estendida é alterada para aprimorar as propriedades bioquímicas do polipeptídeo (propriedades como, por exemplo, solubilidade ou estabilidade) ou para aumentar a probabilidade para processamento proteossômico eficiente do peptídeo.
[00329] Os peptídeos e polipeptídeos antigênicos podem se ligar a uma proteína HLA. Em algumas modalidades, os peptídeos antigênicos podem se ligar a uma proteína HLA com afinidade maior do que um peptídeo nativo / do tipo selvagem correspondente. O peptídeo antigênico pode ter uma IC50 de cerca de menos do que 1.000 nM, cerca de menos do que 500 nM, cerca de menos do que 250 nM, cerca de menos do que 200 nM, cerca de menos do que 150 nM, cerca de menos do que 100 nM, ou cerca de menos do que 50 nM. Em algumas modalidades, os peptídeos antigênicos não induzem uma resposta autoimune e/ou provocam tolerância imunológica quando administrados a um indivíduo.
[00330] A presente revelação também fornece composições que compreendem diversos peptídeos antigênicos. Referência a peptídeos antigênicos inclui qualquer modalidade de liberação adequada que possa resultar na introdução do peptídeo na célula de um indivíduo (por exemplo, ácido nucleico). Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 3 ou mais peptídeos antigênicos. Em algumas modalidades, a composição contém pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 ou 50 peptídeos distintos. Em algumas modalidades, a composição
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181/345 contém pelo menos 20 peptídeos distintos. Em algumas modalidades, a composição contém no máximo 20 peptídeos distintos. De acordo com a presente revelação, 2 ou mais dos peptídeos distintos podem ser derivados do mesmo polipeptídeo. Por exemplo, se uma mutação antigênica codifica um polipeptídeo, dois ou mais dos peptídeos antigênicos podem ser derivados do polipeptídeo. Em uma modalidade, os dois ou mais peptídeos antigênicos derivados do polipeptídeo podem compreender um arranjo lado a lado que transpõe o polipeptídeo (por exemplo, os peptídeos antigênicos podem compreender uma série de peptídeos antigênicos sobrepostos que transpõe uma porção, ou todo, do polipeptídeo). Peptídeos antigênicos podem ser derivados de qualquer gene codificador de proteína. Os peptídeos antigênicos podem ser derivados de mutações em câncer humano ou de um agente infeccioso ou uma doença autoimune.
[00331] Os peptídeos, polipeptídeos e análogos antigênicos podem ainda ser modificados para conter porções químicas adicionais que normalmente não são parte da proteína. Aquelas porções derivatizadas podem aumentar a solubilidade, a meia-vida biológica, a absorção da proteína ou a afinidade de ligação. As porções também podem reduzir ou eliminar quaisquer efeitos colaterais desejáveis das proteínas e semelhantes. Uma visão geral para aquelas porções pode ser encontrada em Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20a Edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000). Por exemplo, peptídeos e polipeptídeos antigênicos que possuem a atividade desejada podem ser modificados como necessário para fornecer certos atributos desejados, por exemplo, características farmacológicas aprimoradas,
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182/345 enquanto aumentam ou pelo menos retêm substancialmente toda a atividade biológica do peptideo não modificado para se ligar à molécula MHC desejada e ativar a célula T apropriada. Por exemplo, os peptideos e polipeptideos antigênicos podem ser submetidos a várias alterações, por exemplo, substituições, conservativas ou não conservativas, em que essas alterações podem fornecer certas vantagens em seu uso, por exemplo, ligação à MHC aumentada. Essas substituições conservativas podem englobar a substituição de um resíduo de aminoácido com outro resíduo de aminoácido que é biologicamente e/ou quimicamente similar, por exemplo, um resíduo hidrofóbico por outro, ou um resíduo polar por outro. 0 efeito de substituições de aminoácidos únicas também pode ser sondado usando D-aminoácidos. Essas modificações podem ser feitas usando procedimentos de síntese peptídica bem conhecidos, como descrito, por exemplo, em Merrifield, Science 232: 341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), páginas 1-284 (1979); e Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III, Pierce), 2a Edição (1984).
[00332] O peptideo antigênico também pode ser modificado por extensão ou diminuição da sequência de aminoácidos do composto, por exemplo, pela adição ou deleção de aminoácidos. Os peptideos, polipeptideos ou análogos antigênicos também podem ser modificados por alteração da ordem ou composição de certos resíduos. Será observado por aqueles técnicos no assunto que certos resíduos de aminoácidos essenciais para atividade biológica, por exemplo, aqueles em sítios de contato críticos ou resíduos conservados, geralmente não podem ser alterados sem um efeito adverso sobre a atividade
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183/345 biológica. Os aminoácidos não críticos não precisam ser limitados àqueles de ocorrência natural em proteínas, por exemplo, L-a-aminoácidos, ou seus isômeros-D, mas também podem incluir aminoácidos não naturais, por exemplo, β-γ-δaminoácidos, bem como quaisquer derivados de L-aaminoácidos .
[00333] Um peptideo antigênico pode ser otimizado por utilização de uma série de peptideos com substituições de aminoácidos únicas para determinar o efeito da carga eletrostática, hidrofobicidade etc. sobre a ligação à MHC. Por exemplo, uma série de substituições de aminoácidos carregados positivamente (por exemplo, Lys ou Arg) ou carregados negativamente (por exemplo, Glu) pode ser feita ao longo do comprimento do peptideo, revelando diferentes padrões de sensibilidade em direção a várias moléculas MHC e receptores de célula T. Além disso, múltiplas substituições usando pequenas porções, relativamente neutras, por exemplo, Ala, Gly, Pro ou resíduos similares, podem ser empregadas. As substituições podem ser homo-oligômeros ou heterooligômeros. O número e tipos de resíduos que são substituídos ou adicionados dependem do espaçamento necessário entre pontos de contato essenciais e certos atributos funcionais que se buscam (por exemplo, hidrofobicidade versus hidrofilicidade). Afinidade de ligação aumentada para uma molécula MHC ou receptor de célula T também pode ser obtida por essas substituições, comparada com a afinidade do peptideo parental. Em qualquer caso, essas substituições devem empregar resíduos de aminoácidos ou outros fragmentos moleculares escolhidos para evitar, por exemplo, interferência estérica e de carga que possa romper a ligação.
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Substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos. Substituições, deleções, inserções ou qualquer combinação destas também podem ser combinadas para se chegar em um peptídeo final.
[00334] Um peptídeo antigênico pode ser modificado para fornecer atributos desejados. Por exemplo, a habilidade dos peptideos para induzir atividade de CTL pode ser aumentada por ligação a uma sequência que contém pelo menos um epitopo que é capaz de indução de uma resposta de célula T auxiliar. Em algumas modalidades, conjugados peptideos imunogênicos/célula T auxiliar estão ligados por uma molécula espaçadora. Em algumas modalidades, um espaçador compreende moléculas neutras, relativamente pequenas, por exemplo, aminoácidos ou miméticos de aminoácido, que são substancialmente sem carga sob condições fisiológicas. Espaçadores podem ser selecionados, por exemplo, de Ala, Gly, ou outros espaçadores neutros de aminoácidos não polares ou aminoácidos polares neutros. Será subentendido que o espaçador opcionalmente presente não precisa ser composto pelos mesmos resíduos e, dessa forma, pode ser um hetero- ou homo-oligômero. O peptídeo antigênico pode estar ligado ao peptídeo T auxiliar diretamente ou por meio de um espaçador no terminal amino ou carbóxi do peptídeo. O terminal amino do peptídeo antigênico ou do peptídeo T auxiliar pode ser acilado. Peptideos T auxiliares exemplares incluem toxóide tetânico 830-843, influenza 307-319, circunsporozoíto de malária 382-398 e 378- 389.
Linhagens de células de HLA monoalélicas [00335] Uma linhagem de célula monoalélica que expressa um único alelo HLA classe I, um único par de alelos HLA
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185/345 classe II, ou um único alelo HLA classe I e um único par de alelos HLA classe II pode ser gerada por transdução ou transfecção de uma população de células adequada com um ácido polinucléico, por exemplo, um vetor, que codifica um único alelo HLA. Populações de células adequadas incluem, por exemplo, linhagens de células deficientes em classe I nas quais um único alelo HLA classe I é expresso, linhagens de células deficientes em classe II nas quais um único par de alelos HLA classe II é expresso, ou linhagens de células deficientes em classe I e classe II nas quais um único HLA classe I e/ou único par de alelos classe II são expressos. Como uma modalidade exemplar, a linhagem de célula B deficiente em classe I é B721.221. No entanto, é evidente para aqueles técnicos no assunto que podem ser geradas outras populações de células que são deficientes em classe I e/ou classe II. Um método exemplar para deleção/inativação de genes classe I ou classe II endógenos inclui edição do genoma mediada por CRISPR-Cas9, por exemplo, em células THP-1. Em algumas modalidades, as populações de células são células apresentadoras de antígeno profissionais, por exemplo, macrófagos, células B e células dendríticas. As células podem ser células B ou células dendríticas. Em algumas modalidades, as células são células tumorais ou células de uma linhagem de célula tumoral. Em algumas modalidades, as células são células isoladas de um paciente. Em algumas modalidades, as células contêm um agente infeccioso ou uma porção deste. Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é adicionalmente modificada, por exemplo, por aumento ou diminuição da expressão e/ou atividade de pelo
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186/345 menos um gene. Em algumas modalidades, o gene codifica um membro do imunoproteassoma. Sabe-se que o imunoproteassoma está envolvido no processamento de peptídeos de ligação ao HLA classe I e inclui as subunidades LMP2 (βΐί), MECL-1 (β2ί) , e LMP7 (β5ί) . 0 imunoproteassoma também pode ser induzido por interferon-gama. Consequentemente, em algumas modalidades, a população de células pode ser colocada em contato com uma ou mais citocinas, fatores de crescimento, ou outras proteínas. As células podem ser estimuladas com citocinas inflamatórias como, por exemplo, interferon-gama, IL-10, IL-6 e/ou TNF-α. A população de células também pode ser submetida a várias condições ambientais, tais como estresse (estresse térmico, privação de oxigênio, privação de glicose, agentes indutores de danos ao DNA, etc.) . Em algumas modalidades, as células são colocadas em contato com um ou mais de um quimioterápico, radiação, terapias direcionadas, imunoterapia. Os métodos revelados nesse relatório descritivo podem, portanto, serem usados para estudar o efeito de vários genes ou condições sobre o processamento e apresentação do peptídeo HLA. Em algumas modalidades, as condições usadas são selecionadas de modo a combinarem com a condição do paciente do qual a população de HLA-peptídeos deve ser identificada.
[00336] Um alelo HLA único da presente revelação pode ser codificado e expresso usando um sistema de base viral (por exemplo, um sistema de adenovirus, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um poxvirus ou um lentivírus) . Plasmídeos que podem ser usados para liberação por vírus adenoassociado, adenovirus e lentivírus foram descritos previamente (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos
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6.955.808 e 6.943.019, e Pedido de Patente U.S. N° 20080254008, incorporados nesse relatório descritivo por referência). Entre os vetores que podem ser usados na prática da presente revelação, integração no genoma do hospedeiro de uma célula é possível com métodos de transferência de gene de retrovirus, frequentemente resultando em expressão de longo prazo do transgene inserido. Em uma modalidade exemplar, o retrovirus é um lentivírus. Adicionalmente, eficiências de transdução elevadas têm sido observadas em muitos tipos diferentes de células e tecidos-alvo. O tropismo de um retrovirus pode ser alterado por incorporação de proteínas do envelope estranhas, expansão da população-alvo de células-alvo potencial. Um retrovirus também pode ser modificado geneticamente para permitir expressão condicional do transgene inserido, de modo que somente certos tipos de células sejam infectados pelo lentivírus. Promotores específicos para o tipo de células podem ser usados para direcionar a expressão em tipos específicos de células. Vetores lentivirais são vetores retrovirais (e, dessa forma, tanto vetores lentivirais quanto vetores retrovirais podem ser usados na prática da presente revelação). Além disso, vetores lentivirais são capazes de transduzir ou infectar células que não estão em divisão e tipicamente produzem altas titulações virais. Um vetor lentiviral exemplar que pode ser usado para gerar linhagens de células estáveis transduzidas para expressar HLA classe I e classe II é mostrado na FIGURA
3.
[00337] A seleção de um sistema de transferência de gene retroviral pode depender do tecido-alvo. Vetores retrovirais são compreendidos por repetições terminais longas cis
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188/345 atuantes com capacidade de empacotamento para até 6-10 kb de sequência estranha. As LTRs cis-atuantes mínimas são suficientes para replicação e empacotamento dos vetores, que são então usados para integrar o ácido nucleico desejado na célula-alvo para fornecer expressão permanente. Vetores retrovirais amplamente usados que podem ser utilizados na prática da presente revelação incluem aqueles baseados no vírus da leucemia murídea (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), e combinações destes (veja, por exemplo, Buchscher e cols., (1992) J. Virol. 66: 2.731-2.739; Johann e cols., (1992) J. Virol. 66: 1.6351.640; Sommnerfelt e cols., (1990) Virol. 176: 58-59; Wilson e cols., (1998) J. Virol. 63: 2.374-2.378; Miller e cols., (1991) J. Virol. 65: 2.220-2.224; PCT/US94/05700). Além disso, útil na prática da presente revelação é um vetor lentiviral mínimo não primata, por exemplo, um vetor lentiviral baseado no vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) (veja, por exemplo, Balagaan, (2006) J. Gene Med.; 8: 275 — 285, publicado online em 21 de novembro 2005 em Wiley InterScience DOI: 10.1002/jgm.845). Os vetores podem ter promotor de citomegalovírus (CMV) dirigindo a expressão do gene-alvo. Consequentemente, a presente revelação contempla entre os vetores úteis na prática da presente revelação: vetores virais, incluindo vetores retrovirais e vetores lentivirais.
[00338] Qualquer alelo HLA pode ser expresso na população de células. Em uma modalidade exemplar, o alelo HLA é um alelo HLA classe I. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I é um alelo HLA-A ou um alelo HLA-B. Em algumas
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189/345 modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA classe II. Sequências de alelos HLA classe I e classe II podem ser encontradas Base de Dados IPD-IMGT/HLA. Alelos HLA exemplares incluem, sem limitação, HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLAE*01:01, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLADRB*15:01 e HLA-DRB*07:01.
[00339] Em algumas modalidades, o alelo HLA é selecionado de modo a corresponder a um genótipo de interesse. Em algumas modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA mutado, que pode ser um alelo de ocorrência não natural ou um alelo de ocorrência natural em um paciente doente. Os métodos revelados nesse relatório descritivo possuem a vantagem adicional de identificação de peptideos de ligação ao HLA para alelos HLA associados com vários distúrbios, bem como alelos que estão presentes em frequência baixa. Consequentemente, em algumas modalidades do método, o alelo HLA está presente em uma frequência de menos do que 1% dentro de uma população, por exemplo, dentro da população caucasiana.
[00340] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o alelo HLA ainda compreende uma etiqueta de aceptor por afinidade que pode ser usada para imunopurifrear a proteína HLA. Etiquetas adequadas são bem conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, uma etiqueta de aceptor por afinidade é etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteína D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7,
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190/345 etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD) , etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR) , etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, uma etiqueta de epitopo de VSV-G derivado da glicoproteína do vírus da estomatite viral ou uma etiqueta V5 derivado de um epitopo pequeno (Pk) encontrado nas proteínas P e V do paramixovirus do vírus símio 5 (SV5). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor
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191/345 por afinidade é uma etiqueta de epitopo, que é um tipo de etiqueta de peptideo que adiciona um epitopo reconhecível (sítio de ligação ao anticorpo) à proteína HLA para fornecer ligação do anticorpo correspondente permitindo, dessa forma, a identificação ou purificação por afinidade da proteína etiquetada. Exemplo não limitante de uma etiqueta de epitopo é proteína A ou proteína G, que se liga à IgG. Em algumas modalidades, etiquetas de aceptor por afinidade incluem o peptideo aceptor de biotina (BAP) ou sequência de peptídeos de hemaglutinina da influenza humana (HA) . Várias outras porções de etiquetagem são conhecidas e podem ser previstas por aqueles técnicos no assunto, e são contempladas nesse relatório descritivo. Qualquer etiqueta de peptideo pode ser usada, desde que ela seja capaz de ser expressa como um elemento de um complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00341] Os métodos fornecidos nesse relatório descritivo compreendem o isolamento de complexos HLA-peptídeo das células transfectadas ou transduzidas com construções de HLA de IP Universal. Em algumas modalidades, os complexos podem ser isolados usando metodologias de imunoprecipitação padronizadas conhecidas na técnica com anticorpos disponíveis comercialmente. As células podem ser lisadas primeiro. Complexos HLA classe I-peptídeo podem ser isolados usando anticorpos específicos para HLA classe I, por exemplo, o anticorpo W6/32, enquanto complexos HLA-peptídeo classe II podem ser isolados usando anticorpos específicos para HLA classe II, por exemplo, o anticorpo monoclonal M5/114.15.2. Em algumas modalidades, os alelos (ou par de) HLA únicos são expressos como uma proteína de fusão com uma etiqueta de
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192/345 peptideo e os complexos HLA-peptídeo são isolados usando moléculas de ligação que reconhecem as etiquetas de peptideo.
[00342] Os métodos ainda compreendem o isolamento de peptideos dos referidos complexos HLA-peptídeo e sequenciamento dos peptideos. Os peptideos são isolados do complexo por qualquer método conhecido por aqueles técnicos no assunto, por exemplo, eluição ácida. Embora qualquer método de sequenciamento possa ser usado, métodos que empregam espectrometria de massa como, por exemplo, cromatografia líquida—espectrometria de massa (LC-MS ou LCMS/MS ou, alternativamente, HPLC-MS ou HPLC-MS/MS) são utilizados em algumas modalidades. Esses métodos de sequenciamento são bem conhecidos por aqueles técnicos no assunto e são revisados em Medzihradszky KF e Chalkley RJ. Mass Spectrom Rev. 2015 Jan-Fev; 34 (1): 43-63.
[00343] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos ou uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a
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193/345 população de células compreende células que foram enriquecidas ou separadas, por exemplo, por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Em algumas modalidades, a separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é usada para separar a população de células. Em algumas modalidades, a população de células é previamente classificada por FACS quanto à expressão na superfície da célula de HLA classe I ou classe II ou HLA tanto classe I quanto classe II. Por exemplo, FACS pode ser usada para separar a população de células quanto à expressão na superfície da célula de um alelo HLA classe I, um alelo HLA classe II, ou uma combinação destes.
Bibliotecas de construções de HLA marcado com aceptor de afinidade [00344] O termo biblioteca, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma coleção de moléculas de ácido nucleico (circulares ou lineares). Em uma modalidade, uma biblioteca pode compreender diversas (ou seja, duas ou mais) moléculas de ácido nucleico, que podem ser de um organismo, órgão, tecido ou célula-fonte comum. Em algumas modalidades, uma biblioteca é representativa de todo ou de uma porção ou de uma porção significante do teor de ácido nucleico de um organismo (uma biblioteca genômica), ou um conjunto de moléculas de ácido nucleico representativo de todas ou de uma porção ou de uma porção significante das moléculas de ácido nucleico expressas (uma biblioteca de cDNA ou segmentos dela derivados) em uma célula, tecido, órgão ou organismo. Uma biblioteca também pode compreender sequências aleatórias feitas por síntese de novo, mutagênese de uma ou mais sequências e semelhantes. Essas bibliotecas podem estar
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194/345 contidas em um ou mais vetores. Uma biblioteca de construções de HLA marcado com aceptor por afinidade como fornecidas nesse relatório descritivo compreende uma sequência de DNA que codifica elementos de um alelo HLA, um peptideo com aceptor por afinidade ou um vinculador. Técnicas biológicas moleculares apropriadas podem ser encontradas em Sambrook e cols. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Vários métodos para facilitação da clonagem de segmentos de ácido nucleico foram descritos, por exemplo, como nas seguintes referências: Ferguson, J., e cols., Gene 16: 191 (1981) e Hashimoto-Gotoh, T., e cols., Gene 41: 125 (1986) . Outros termos usados nos campos de tecnologia de ácido nucleico recombinante e biologia molecular e celular, como usados nesse relatório descritivo, serão geralmente subentendidos por aqueles habilitados nas técnicas aplicáveis.
[00345] Os vários elementos ou domínios de um alelo HLA recombinante podem ser dispostos em qualquer ordem entre as extremidades do terminal-N e terminal-C do alelo HLA recombinante. Um elemento ou domínio que é mais próximo do terminal-N de um polipeptídeo recombinante codificado por um alelo HLA recombinante do que outro elemento ou domínio é dito como estando ao terminal-N do outro elemento ou domínio. Similarmente, um elemento ou domínio que é mais próximo do terminal-C de um polipeptídeo recombinante codificado por um alelo HLA recombinante do que outro elemento ou domínio é dito como estando ao terminal-C do outro elemento ou domínio. Salvo indicação expressa em contrário, elementos ou domínios diferentes de um polipeptídeo recombinante codificado por um alelo HLA
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195/345 recombinante não precisam estar adjacentes (ou seja, sem um ou mais elementos ou domínios intervenientes). Em algumas modalidades, elementos ou domínios diferentes de um polipeptídeo recombinante codificado por um alelo HLA recombinante podem estar adjacentes.
[00346] Um polipeptídeo recombinante codificado por um alelo HLA recombinante pode incluir um ou mais elementos opcionais, por exemplo, um ou mais vinculadores, etiquetas de peptídeo (por exemplo, etiquetas de epitopo), ou sítio(s) de reconhecimento de protease. Em algumas modalidades, uma etiqueta de peptídeo é um peptídeo com aceptor por afinidade. Um vinculador é uma série relativamente curta de aminoácidos que separa outros elementos ou domínios da proteína recombinante. Em algumas modalidades, um vinculador tem de 1 a 100 aminoácidos de comprimento; por exemplo, de 5 a 75, de 10 a 60, de 15 a 50, de 15 a 40 ou de 1 a 50 aminoácidos de comprimento.
[00347] Métodos de expressão de proteínas em sistemas de expressão heterólogos são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, uma molécula de ácido nucleico que codifica toda ou parte de uma proteína de interesse (por exemplo, um HLA classe I ou classe II recombinante marcado com aceptor por peptídeo de afinidade) é obtida usando métodos tais como aqueles descritos nesse relatório descritivo. A sequência de ácidos nucleicos codificadora de proteína é clonada em um vetor de expressão que é adequado para a célula hospedeira de interesse particular usando procedimentos padronizados de DNA recombinante. Vetores de expressão incluem (entre outros elementos) sequências regulatórias (por exemplo, promotores) que podem estar ligadas operacionalmente à molécula de ácido
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196/345 nucleico codificadora de proteína desejada para causar a expressão dessa molécula de ácido nucleico na célula hospedeira. Juntas, as sequências regulatórias e a sequência de ácidos nucleicos codificadora de proteína são um cassete de expressão. Vetores de expressão também podem incluir uma origem de replicação, genes de marcador que fornecem seleção fenotípica em células transformadas, um ou mais outros promotores, e uma região polivinculadora que contém vários sítios de restrição para a inserção de sequências de ácidos nucleicos heterólogas.
[00348] Vetores de expressão úteis para expressão de proteína(s) heteróloga(s) em uma variedade de células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, e alguns exemplos específicos são fornecidos nesse relatório descritivo. A célula hospedeira é transfectada com (ou infectada com um vírus que contém) o vetor de expressão usando qualquer método adequado para a célula hospedeira particular. Esses métodos de transfecção também são bem conhecidos na técnica e métodos exemplares não limitantes são descritos nesse relatório descritivo. A célula hospedeira transfectada ou transduzida é capaz de expressar a proteína codificada pela sequência de ácidos nucleicos correspondente no cassete de expressão.
[00349] Em algumas modalidades, construções de HLA classe I ou classe II que compreendem uma etiqueta de aceptor por afinidade e molécula de afinidade no terminal-N ou no terminal-C. Em algumas modalidades, construções de HLA classe I ou classe II compreendem pelo menos uma etiqueta de aceptor por afinidade e molécula de afinidade que se ligam especificamente. Em algumas modalidades, uma etiqueta de aceptor por afinidade é etiqueta de poli-histidina, etiqueta
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197/345 de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP) , etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina
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198/345 tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, uma etiqueta de epitopo de VSV-G derivado da glicoproteina do virus da estomatite viral ou uma etiqueta V5 derivado de um epitopo pequeno (Pk) encontrado nas proteínas P e V do paramixovirus do virus símio 5 (SV5). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade pode incluir múltiplas repetições da sequência de marcação (por exemplo, 3x etiqueta de poli-histidina, 3x etiqueta de FLAG). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade pode incluir múltiplas repetições da sequência de marcação (por exemplo, 3x etiqueta de polihistidina, 3x etiqueta de FLAG). Em algumas modalidades, a etiqueta de aceptor por afinidade é uma etiqueta de epitopo, que é um tipo de etiqueta de peptideo que adiciona um epitopo reconhecível (sítio de ligação ao anticorpo) à proteína HLA para fornecer ligação do anticorpo correspondente permitindo, dessa forma, a identificação ou purificação por afinidade da proteína etiquetada. Exemplo não limitante de uma etiqueta de epitopo é proteína A ou proteína G, que se liga à IgG.
[00350] Em algumas modalidades, etiquetas de aceptor por afinidade incluem o peptideo aceptor de biotina (BAP) ou sequência de peptideos de hemaglutinina da influenza humana (HA). Várias outras porções de etiquetagem são conhecidas e podem ser previstas por aqueles técnicos no assunto, e são contempladas nesse relatório descritivo. Qualquer etiqueta de peptideo pode ser usada, desde que ela seja capaz de ser expressa como um elemento de um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00351] Os marcadores por afinidade podem ser colocados
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199/345 no terminal-N ou no terminal-C do alelo HLA. Em algumas modalidades, o marcador por afinidade é colocado no terminalC do alelo HLA para permitir localização do HLA-peptideo na superfície da célula vs. ER. Em algumas modalidades, o marcador por afinidade é colocado no terminal-N do alelo HLA para permitir isolamentos de HLA único de linhagens de células que expressam múltiplos alelos HLA endógenos. Ainda em outra modalidade, o marcador por afinidade é adicionado às cadeias-β variáveis para imunopurifrear heterodímeros específicos de HLA classe II.
[00352] Em algumas modalidades, uma sequência de divagem, por exemplo, F2A ou um sítio interno de entrada de ribossomos (IRES), pode ser colocada entre a cadeia-α e β2microglobulina (classe I) ou entre a cadeia-α e cadeia-β (classe II) . Em algumas modalidades, um único alelo HLA classe I é HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 e HLA-B*14:02, ou HLAE*01:01, e alelo HLA classe II é HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 e HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 ou HLA-DRB*07:01.
[00353] Construções exemplares não limitantes de HLA marcado com aceptor por afinidade são retratadas na FIGURA 2, FIGURA 6C e FIGURA 7C.
Métodos terapêuticos [00354] A imunoterapia personalizada com o uso de peptideos específicos do tumor foi descrita (Ott e cols., Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 28 (2014) 559-569). A escolha eficiente de quais peptideos particulares utilizar como um imunógeno exige a habilidade para prever quais peptideos específicos do tumor se ligariam eficientemente aos alelos HLA presentes em um paciente. Uma das barreiras críticas ao desenvolvimento de imunoterapia curativa e tumor-específica
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200/345 é a identificação e seleção de antígenos tumorais altamente específicos e restritos para evitar autoimunidade. Neoantígenos tumorais, que surgem como um resultado de alteração genética (por exemplo, inversões, translocações, deleções, mutações missense, mutações de sítio de splice etc.) dentro de células malignas, representam a classe de antígenos mais tumor-específica. Neoantígenos foram raramente usados em vacinas ou composições imunogênicas contra câncer em função de dificuldades técnicas na sua identificação, seleção de antígenos otimizados, e produção de neoantígenos para uso em uma vacina ou composição imunogênica. Essas problemas podem ser abordados por: identificação de mutações em neoplasias/tumores que estão presentes no nível de DNA no tumor, mas não em amostras de linhagem germinativa compatível de uma proporção elevada de indivíduos que possuem câncer; análise das mutações identificadas com um ou mais algoritmos de previsão da ligação ao peptídeo-MHC para gerar diversos epitopos de célula T de neoantígeno que são expressos dentro da neoplasia/tumor e que se ligam a uma proporção elevada de alelos HLA do paciente; e síntese dos diversos peptídeos neoantigênicos selecionados dos conjuntos de todos os peptídeos de neoantígeno e peptídeos de ligação previstos para uso em uma vacina ou composição imunogênica contra câncer adequada ao tratamento de uma proporção elevada de indivíduos que possuem câncer (FIGURA 18A e FIGURA 18B).
[00355] Por exemplo, a tradução de informação de sequenciamento de peptídeo em uma vacina terapêutica pode incluir a previsão de peptídeos mutados que podem se ligar às moléculas HLA de uma proporção elevada de indivíduos. A
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201/345 escolha eficiente de quais mutações particulares utilizar como imunógeno exige a habilidade para prever quais peptídeos mutados se ligariam eficientemente a uma proporção elevada de alelos HLA do paciente. Recentemente, abordagens de aprendizado baseadas em rede neural com peptídeos de ligação e não ligação validados avançaram a precisão de algoritmos de previsão para os alelos HLA-A e -B principais. No entanto, até mesmo com o uso de algoritmos baseados em rede neural avançados para codificar regras de ligação ao HLA-peptídeo, vários fatores limitam a força para prever peptídeos apresentados em alelos HLA.
[00356] Por exemplo, a tradução de informação de sequenciamento de peptideo em uma vacina terapêutica pode incluir a formulação do fármaco como uma vacina multiepitopos de peptídeos longos. Visar o máximo de epitopos mutados quanto praticamente possível se beneficia da enorme capacidade do sistema imune, evita a oportunidade para escape imunológico por infra-modulação de um produto gênico imune direcionado, e compensa a imprecisão conhecida das abordagens de previsão de epitopo. Peptídeos sintéticos fornecem um meio útil para preparar múltiplos imunógenos eficientemente e rapidamente traduzir a identificação de epitopos mutantes em uma vacina eficaz. Peptídeos podem ser prontamente sintetizados quimicamente e facilmente purificados utilizando reagentes livres de bactérias contaminantes ou substâncias animais. O pequeno tamanho permite um foco mais claro sobre a região mutada da proteína e também reduz competição antigênica irrelevante de outros componentes (proteína não mutada ou antígenos do vetor viral).
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202/345 [00357] Por exemplo, a tradução de informação de sequenciamento de peptideo em uma vacina terapêutica pode incluir uma combinação com um adjuvante de vacina forte. Vacinas eficazes podem exigir um adjuvante forte para iniciar uma resposta imune. Por exemplo, poli-ICLC, um agonista de TLR3, e os domínios de RNA helicase de MDA5 e RIG3 demonstraram várias propriedades desejáveis para um adjuvante de vacina. Essas propriedades incluem a indução de ativação local e sistêmica de células imunes in vivo, produção de quimiocinas e citocinas estimulatórias, e a estimulação de apresentação de antigeno por DCs. Além disso, poli-ICLC pode induzir respostas CD4+ e CD8+ duráveis em humanos. Notavelmente, similaridades impressionantes na supra-regulação de vias transcricionais e de transdução de sinal foram observadas em indivíduos vacinados com poli-ICLC e em voluntários que receberam a vacina contra febre amarela replicação-competente, altamente eficaz. Além disso, >90% dos pacientes com carcinoma ovariano imunizados com poliICLC em combinação com uma vacina de peptideo NYESO-1 (em adição a Montanida) mostraram indução de célula T CD4+ e CD8 + , bem como respostas de anticorpo ao peptideo em um estudo de fase 1 recente. Ao mesmo tempo, poli-ICLC foi intensamente testado em mais de 25 experimentos clínicos até hoje e exibiu um perfil de toxicidade relativamente benigno.
[00358] Em algumas modalidades, peptideos imunogênicos podem ser identificados de células de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, peptideos imunogênicos podem ser específicos para um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, peptideos imunogênicos podem se ligar a um HLA que é compatível com um
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203/345 haplótipo de HLA de um indivíduo com uma doença ou condição.
[00359] Em algumas modalidades, uma biblioteca de peptideos pode ser expressa nas células. Em algumas modalidades, as células compreendem os peptideos a serem identificados ou caracterizados. Em algumas modalidades, os peptideos a serem identificados ou caracterizados são peptideos endógenos. Em algumas modalidades, os peptideos são peptideos exógenos. Por exemplo, os peptideos a serem identificados ou caracterizados podem ser expressos por diversas sequências que codificam uma biblioteca de peptideos.
[00360] Antes da revelação do presente relatório descritivo, a maioria dos estudos de LC-MS/MS do peptidoma de HLA usava células que expressam múltiplas moléculas HLA, o que exige que peptideos sejam designados para 1 de até 6 alelos da classe I usando previsores de bioinformática preexistentes ou deconvolução (Bassani-Sternberg e Gfeller, 2016). Dessa forma, peptideos que não combinam intimamente com motivos conhecidos não podiam ser confiavelmente relatados como aglutinantes para certo alelo HLA.
[00361] São fornecidos nesse relatório descritivo métodos de previsão de peptideos, por exemplo, peptideos mutados, que podem se ligar às moléculas HLA de indivíduos. Em algumas modalidades, o pedido fornece métodos de identificação de certo conjunto de antígeno que compreende peptideos entre os peptideos mais adequados para a preparação de uma composição imunogênica para um indivíduo, o referido método compreendendo a seleção do certo conjunto de peptideos dos diversos peptideos capazes de ligação a uma proteína HLA
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204/345 do indivíduo, em que a referida habilidade para se ligar a uma proteína HLA é determinada por análise da sequência de peptídeos com uma máquina que foi treinada com um bancos de dados de sequências de peptídeos que correspondem aos peptídeos de ligação ao HLA específicos para cada um dos alelos HLA do referido indivíduo. São fornecidos nesse relatório descritivo métodos de identificação de certo conjunto de antígeno que compreende peptídeos entre os peptídeos mais adequados para a preparação de uma composição imunogênica para um indivíduo, o referido método compreendendo a seleção do certo conjunto de peptídeos dos diversos peptídeos determinados como capazes de se ligar a uma proteína HLA do indivíduo, a habilidade para se ligar a uma proteína HLA sendo determinada por análise da sequência de peptídeos com uma máquina que foi treinada com um banco de dados de sequências de peptídeos obtido por realização dos métodos descritos nesse relatório descritivo acima. Dessa forma, em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos de identificação de diversos peptídeos específicos do indivíduo para a preparação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo, em que o indivíduo possui um tumor e os peptídeos específicos do indivíduo são específicos para o indivíduo e para o tumor do indivíduo, o referido método compreendendo: sequenciamento de uma amostra do tumor do indivíduo e uma amostra não tumoral do indivíduo; determinação, com base no sequenciamento de ácido nucleico: mutações não silenciosas presentes no genoma de células de câncer do indivíduo, mas não em tecido normal do indivíduo, e no genótipo de HLA do indivíduo; e seleção das mutações não silenciosas identificadas dos diversos peptídeos
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205/345 específicos do indivíduo, cada um tendo um epitopo tumoral diferente que é um epitopo específico para o tumor do indivíduo e cada um sendo identificado como capaz de ligação a uma proteína HLA do indivíduo, como determinado por análise da sequência de peptídeos derivada das mutações não silenciosas nos métodos para previsão da ligação ao HLA descritos nesse relatório descritivo.
[00362] Em algumas modalidades, é revelado nesse relatório descritivo um método de caracterização de complexos HLA-peptídeo específicos para um indivíduo.
[00363] Em algumas modalidades, um método de caracterização de complexos HLA-peptídeo específicos para um indivíduo é usado para desenvolver um imunoterapêutico em um indivíduo necessitado, por exemplo, um indivíduo com uma condição ou doença.
[00364] É fornecido nesse relatório descritivo um método de fornecimento de uma imunidade antitumoral em um mamífero que compreende a administração ao mamífero de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo identificado de acordo com um método descrito. É fornecido nesse relatório descritivo um método de fornecimento de uma imunidade antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptídeo com uma sequência de um peptídeo identificada de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de fornecimento de uma imunidade antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo identificada de acordo com um método descrito nesse
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206/345 relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de fornecimento de uma imunidade antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de peptideo identificada de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a célula apresenta o peptideo como um complexo HLA-peptideo.
[00365] É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo identificado de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo identificada de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo identificada de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo identificada de acordo
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207/345 com um método descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, em que a doença ou distúrbio é câncer. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de um inibidor do ponto de verificação imune ao indivíduo.
[00366] São revelados nesse relatório descritivo, em algumas modalidades, métodos de desenvolvimento de um imunoterapêutico para um indivíduo necessitado por caracterização dos complexos HLA-peptideo que compreendem: a) o fornecimento de uma população de células derivadas do indivíduo necessitado, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende: i) uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a ii) uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade; b) expressão do HLA marcado com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; c) enriquecimento para os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; caracterização dos complexos HLA-peptideo específicos para o indivíduo necessitado; e d) desenvolvimento do imunoterapêutico com base em um complexo HLA-peptideo específico para o indivíduo necessitado; em que o indivíduo possui uma doença ou condição.
[00367] Em algumas modalidades, o imunoterapêutico é um
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208/345 ácido nucleico ou um terapêutico peptídico.
[00368] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptideos à população de células. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptideos ou a expressão dos (um ou mais) peptideos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos.
[00369] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais HLAs específicos para o paciente. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de
todos os HLAs específicos para o paciente. Em algumas
modalidades, HLAs específicos do paciente podem ser
introduzidos como alelo único. Em algumas modalidades,
múltiplos HLAs específicos do paciente podem ser introduzidos. Em algumas modalidades, o método compreende o desenvolvimento de um imunoterapêutico com base nos peptideos identificados em conexão com os HLAs específicos do paciente. Em algumas modalidades, a população de células é derivada do indivíduo necessitado.
[00370] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades,
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209/345 a biblioteca compreende uma biblioteca de peptídeos associados com a doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer ou uma infecção com um agente infeccioso ou uma doença autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptídeos dos complexos HLA-peptídeo específicos para o indivíduo necessitado, opcionalmente em que os peptídeos são de uma ou mais proteínas-alvo do agente infeccioso ou da doença autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptídeos das (uma ou mais) proteínas-alvo do agente infeccioso ou doença autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptídeos dos complexos HLA-peptídeo derivados de um agente infeccioso ou uma doença autoimune.
[00371] Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno. Em algumas modalidades, o patógeno é um vírus, bactéria ou um parasita.
[00372] Em algumas modalidades, o vírus é selecionado do grupo que consiste em: vírus BK (BKV), vírus da Dengue (DENV1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovírus (CMV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um vírus influenza, RSV, HPV, raiva, vírus da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, vírus da varicela, papilomavírus humano (HPV), varíola, zoster, e combinações destes.
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210/345 [00373] Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis e Mycobacterium tuberculosis. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e combinações destas.
[00374] Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp. (por exemplo, L. major, L. infantum, L. braziliensis, L. donovani, L. chagasi, L. mexicana), Plasmodium spp. (por exemplo, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae), Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus e Schistosoma spp. (S. mansoni, S. haematobium,
S. japonicum).
[00375] Em algumas modalidades, o imunoterapêutico é um receptor modificado geneticamente. Em algumas modalidades, o receptor modificado geneticamente é um receptor de antigeno quimérico (CAR) , um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de célula B (BCR), uma terapia célula T adotiva (ACT), ou um derivado destes. Em outros aspectos, o receptor modificado geneticamente é um receptor de antigeno quimérico (CAR). Em alguns aspectos, o CAR é um CAR de primeira geração. Em outros aspectos, o CAR é um CAR de segunda geração. Ainda em outros aspectos, o CAR é um CAR de terceira geração.
[00376] Em alguns aspectos, o CAR compreende uma porção extracelular, uma porção transmembrana e uma porção intracelular. Em alguns aspectos, a porção intracelular
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211/345 compreende pelo menos um domínio coestimulatório de célula
T. Em alguns aspectos, o domínio coestimulatório de célula T é selecionado do grupo que consiste em CD27, CD28, TNFRS9 (4-1BB), TNFRSF4 (0X40), TNFRSF8 (CD30), CD40LG (CD40L), ICOS, ITGB2 (LFA-1), CD2, CD7, KLRC2 (NKG2C), TNFRS18 (GITR), TNFRSF14 (HVEM), ou qualquer combinação destes.
[00377] Em alguns aspectos, o receptor modificado geneticamente se liga a um alvo. Em alguns aspectos, a ligação é específica para um peptídeo identificado pelo método de caracterização de complexos HLA-peptídeo específicos para um indivíduo que sofre de uma doença ou condição.
[00378] Em alguns aspectos, o imunoterapêutico é uma célula como descrita em detalhe nesse relatório descritivo. Em alguns aspectos, o imunoterapêutico é uma célula que compreende um receptor que se liga especificamente a um peptídeo identificado pelo método de caracterização dos complexos HLA-peptídeo específicos para um indivíduo que sofre de uma doença ou condição. Em alguns aspectos, o imunoterapêutico é uma célula usada em combinação com os peptídeos/ácidos nucleicos dessa invenção. Em algumas modalidades, a célula é uma célula do paciente. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula é linfócito infiltrante de tumor.
[00379] Em alguns aspectos, um indivíduo com uma condição ou doença é tratado com base em um repertório de receptores de célula T do indivíduo. Em algumas modalidades, uma vacina de antigeno é selecionada com base em um repertório de receptores de célula T do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com células T que expressam TCRs
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212/345 específicos para um antigeno ou peptideo identificado usando os métodos descritos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um antigeno ou peptídeo identificado usando os métodos descritos nesse relatório descritivo específico para TCRs, por exemplo, TCRs específicos do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um antigeno ou peptídeo identificado usando os métodos descritos nesse relatório descritivo específico para células T que expressam TCRs, por exemplo, TCRs específicos do indivíduo. Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com um antigeno ou peptídeo identificado usando os métodos descritos nesse relatório descritivo específico para TCRs específicos do indivíduo.
[00380] Em algumas modalidades, uma composição ou vacina imunogênica de antigeno é selecionada com base em TCRs identificados em um indivíduo. Em uma modalidade, a identificação de um repertório de células T e testagem em ensaios funcionais são usadas para determinar uma composição imunogênica ou vacina para ser administrada a um indivíduo com uma condição ou doença. Em algumas modalidades, a composição imunogênica é uma vacina de antigeno. Em algumas modalidades, a vacina de antigeno compreende peptideos antigênicos específicos do indivíduo. Em algumas modalidades, os peptideos antigênicos a serem incluídos em uma vacina de antigeno são selecionados com base em uma quantificação de TCRs específicos do indivíduo que se ligam aos antígenos. Em algumas modalidades, peptideos antigênicos são selecionados com base em uma afinidade de ligação do peptídeo a um TCR. Em algumas modalidades, a seleção se baseia em uma combinação tanto da quantidade quanto da
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213/345 afinidade de ligação. Por exemplo, um TCR que se liga fortemente a um antigeno em um ensaio funcional, mas que não está altamente representado em um repertório de TCRs, pode ser um bom candidato para uma vacina de antigeno, pois células T que expressam o TCR seriam vantajosamente amplificadas .
[00381] Em algumas modalidades, antigenos são selecionados para administração a um individuo com base na ligação aos TCRs. Em algumas modalidades, células T, por exemplo, células T de um individuo com uma doença ou condição, podem ser expandidas. Células T expandidas que expressam TCRs especificos para um peptideo antigênico imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo, podem ser administradas de volta a um individuo. Em algumas modalidades, células adequadas, por exemplo, PBMCs, são transduzidas ou transfectadas com polinucleotideos para expressão de TCRs especificos para um peptideo antigênico imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo e administradas a um individuo. Células T que expressam TCRs especificos para um peptideo antigênico imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo podem ser expandidas e administradas de volta a um individuo. Em algumas modalidades, células T que expressam TCRs especificos para um peptideo antigênico imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo que resultam em atividade citolitica quando incubadas com tecido doente autólogo podem ser expandidas e administradas a um individuo. Em algumas modalidades, células T usadas em ensaios funcionais resultam em ligação a um peptideo antigênico
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214/345 imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo podem ser expandidas e administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, TCRs que foram determinadas como se ligando aos peptídeos antigênicos imunogênicos específicos do indivíduo identificados usando o método descrito nesse relatório descritivo podem ser expressos em células T e administrados a um indivíduo.
[00382] Os métodos descritos nesse relatório descritivo podem envolver transferência adotiva de células do sistema imune, por exemplo, células T, específicas para antígenos selecionados, por exemplo, antígenos associados a um tumor ou patógeno. Várias estratégias podem ser empregadas para modificar geneticamente células T por alteração da especificidade do receptor de célula T (TCR), por exemplo, por introdução de novas cadeias α e β de TCR com especificidade para um peptídeo antigênico imunogênico identificado usando o método descrito nesse relatório descritivo (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 8.697.854; Publicações de Patente PCT: WO 2003020763, WO 2004033685, WO 2004044004, WO 2005114215, WO 2006000830, WO 2008038002, WO 2008039818, WO 2004074322, WO 2005113595, WO 2006125962, WO 2013166321, WO 2013039889, WO 2014018863, WO 2014083173; Patente U.S. N° 8.088.379).
[00383] Receptores de antígenos quiméricos (CARs) podem ser usados para gerar células imunorresponsivas, por exemplo, células T, específicas para alvos selecionados, por exemplo, peptídeos antigênicos imunogênicos identificados usando o método descrito nesse relatório descritivo, com uma ampla variedade de construções de quimera de receptor (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.843.728, 5.851.828,
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5.912.170, 6.004.811, 6.284.240, 6.392.013, 6.410.014, 6.753.162, 8.211.422; e, Publicação PCT WO 9215322). Construções de CAR alternativas podem ser caracterizadas como pertencentes a gerações sucessivas. CARs de primeirageração tipicamente consistem em um fragmento variável de cadeia única de um anticorpo específico para um antígeno, por exemplo, que compreende uma VL ligada a uma VH de um anticorpo específico, ligada por um vinculador flexível, por exemplo, por um domínio de dobradiça CD8a e um domínio transmembrana CD8a, aos domínios de sinalização transmembrana e intracelulares de CD3/ ou FcRy ou scFv-FcRy (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.741.465; Patente
U.S. N° 5.912.172; Patente U.S. N° 5.906.936). CARs de segunda-geração incorporam os domínios intracelulares de uma ou mais moléculas coestimulatórias, por exemplo, CD28, 0X40 (CD134) ou 4-1BB (CD137), dentro do endodomínio, por exemplo, scFv-CD28/0X40/4-1BB-CD3 (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 8.911.993, 8.916.381, 8.975.071, 9.101.584, 9. 102.760, 9.102.761) . CARs de terceira-geração incluem uma combinação de endodomínios coestimulatórios, por exemplo, cadeia-CD3C, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, 0X40, 4-1BB, ou domínios de sinalização de CD28, por exemplo, scFv-CD28-4-IBB-CD3C ou scFv-CD28-0X40-CD3Q (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 8.906.682, Patente U.S. N° 8.399.645, Patente U.S. N° 5.686.281; Publicação PCT N° WO 2014134165; Publicação PCT N° WO 2012079000). Em algumas modalidades, a coestimulação pode ser coordenada por expressão de CARs em células T antígeno-específicas, escolhidas de modo a serem ativadas e expandidas após, por exemplo, interação com antígeno em células apresentadoras de
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216/345 antígeno profissionais, com coestimulação. Receptores modificados geneticamente adicionais podem ser fornecidos nas células imunorresponsivas, por exemplo, para aumentar o direcionamento de um ataque de células T e/ou minimizar efeitos colaterais.
[00384] Técnicas alternativas podem ser usadas para transformar células imunorresponsivas-alvo, por exemplo, fusão de protoplasto, lipofecção, transfecção ou eletroporação. Uma ampla variedade de vetores pode ser usada, por exemplo, vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, plasmídeos ou transposons, por exemplo, um transposon Sleeping Beauty (veja as Patentes U.S. Nos 6.489.458, 7.148.203, 7.160.682, 7.985.739, 8.227.432), pode ser usado para introduzir CARs, por exemplo, usando sinalização de CARs de 2a geração antígeno-específicos por meio de CD3/ e CD28 ou CD137. Vetores virais podem incluir, por exemplo, vetores baseados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV.
[00385] Células que são visadas para transformação podem incluir, por exemplo, células T, células exterminadoras naturais (natural killer) (NK), linfócitos T citotóxicos (CTL), células T regulatórias, células-tronco embrionárias humanas, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) ou uma célula-tronco pluripotente a partir da qual células linfóides podem ser diferenciadas. Células T que expressam um CAR desejado, por exemplo, podem ser selecionadas por meio de cocultura com células de ativação e propagação (APC) γ-irradiadas, que co-expressam o antígeno de câncer e moléculas coestimulatórias. As células T CAR modificadas geneticamente podem ser expandidas, por exemplo, por
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217/345 cocultura em APC na presença de fatores solúveis, por exemplo, IL-2 e IL-21. Essa expansão pode ser realizada, por exemplo, de modo a fornecer células T CAR de memória (que podem ser testadas, por exemplo, por arranjo digital não enzimático e/ou citometria de fluxo multipainel). Dessa forma, podem ser fornecidas células T CAR que possuem atividade citotóxica específica contra tumores que abrigam antígenos (opcionalmente em conjunto com a produção de quimiocinas desejadas como, por exemplo, interferon-γ). Células T CAR desse tipo podem ser usadas, por exemplo, em modelos animais, por exemplo, para tratar xenoenxertos tumorais.
[00386] Abordagens como as citadas anteriormente podem ser adaptadas para fornecer métodos de tratamento e/ou de aumento da sobrevida de um indivíduo que possui uma doença, por exemplo, uma neoplasia ou infecção patogênica, por exemplo, por administração de uma quantidade eficaz de uma célula imunorresponsiva que compreende um receptor de reconhecimento de antígeno que se liga a um antígeno selecionado, em que a ligação ativa a célula imunorresponsiva tratando ou evitando, dessa forma, a doença (por exemplo, uma neoplasia, uma infecção por patógeno, um distúrbio autoimune ou uma reação a um transplante alogênico). A dosagem em terapias com célula T CAR pode envolver, por exemplo, a administração de 106 a 109 células/kg, com ou sem um esquema de linfodepleção, por exemplo, com ciclofosfamida.
[00387] Para se proteger contra possíveis reações adversas, células imunorresponsivas modificadas geneticamente podem ser equipadas com um interruptor de
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218/345 segurança transgênico, na forma de um transgene que torna as células vulneráveis à exposição a um sinal especifico. Por exemplo, o gene de timidina quinase (TK) do virus do herpes simples pode ser usado dessa forma, por exemplo, por introdução em linfócitos T alogênicos usados como infusões doadoras de linfócitos após transplante de célula-tronco. Nessas células, a administração de um pró-fármaco de nucleosideo como, por exemplo, ganciclovir ou aciclovir, causa a morte da célula. Construções alternativas de interruptor de segurança incluem caspase 9-induzivel, por exemplo, desencadeada por administração de um dimerizador de pequena molécula que junta moléculas icasp9 não funcionais para formar a enzima ativa. Uma ampla variedade de abordagens alternativas à implementação de controles da proliferação celular foi descrita (veja, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N° 20130071414; Publicação de Patente PCT WO 2011146862; Publicação de Patente PCT WO 201401 1987; Publicação de Patente PCT WO 2013040371). Em um refinamento adicional de terapias adotivas, pode ser usada edição do genoma para customizar células imunorresponsivas às implementações alternativas, por exemplo, fornecimento de células T CAR editadas.
[00388] Os métodos de terapia celular também podem envolver a ativação e expansão ex vivo de células T. Em algumas modalidades, células T podem ser ativadas antes de sua administração a um individuo necessitado. Exemplos desses tipos de tratamentos incluem o uso de células de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) (veja a Patente U.S. N° 5.126.132), células T citotóxicas (veja a Patente U.S. N° 6.255.073; e a Patente U.S. N° 5,846,827), células expandidas
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219/345 de linfonodo de drenagem do tumor (veja a Patente U.S. N° 6.251.385), e várias outras preparações de linfócitos (veja a Patente U.S. N° 6.194.207; Patente U.S. N° 5.443.983; Patente U.S. N° 6.040.177; e Patente U.S. N° 5.766.920).
[00389] Uma população de células T ativadas ex vivo pode estar em um estado que orquestra maximamente uma resposta imune ao câncer, doenças infecciosas ou outros estados de doença, por exemplo, um estado de doença autoimune. Para ativação, pelo menos dois sinais podem ser liberados às células T. O primeiro sinal é normalmente liberado por meio do receptor de célula T (TCR) na superfície da célula T. O primeiro sinal de TCR é normalmente desencadeado após interação do TCR com antígenos peptídicos expressos em conjunto com um complexo MHC na superfície de uma célula apresentadora de antígeno (APC). O segundo sinal normalmente é liberado por meio de receptores coestimulatórios na superfície de células T. Receptores coestimulatórios são geralmente desencadeados por ligantes correspondentes ou citocinas expressas na superfície de APCs.
[00390] Está contemplado que as células T específicas para peptideos antigênicos imunogênicos identificados usando o método descrito nesse relatório descritivo podem ser obtidas e usadas em métodos de tratamento ou prevenção de doença. A esse respeito, a revelação fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma população de células que compreende células específicas para peptideos antigênicos imunogênicos identificados usando o método descrito nesse relatório descritivo em uma quantidade eficaz para tratar ou evitar a doença no
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220/345 indivíduo. Em algumas modalidades, um método de tratamento ou prevenção de uma doença em um indivíduo compreende a administração de uma população de células enriquecida para células T reativas à doença a um indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou evitar câncer no mamífero. As células podem ser células que são alogênicas ou autólogas ao indivíduo.
[00391] A revelação ainda fornece um método de indução de uma resposta imune doença-específica em um indivíduo, a vacinação contra uma doença, o tratamento e/ou alívio de um sintoma de uma doença em um indivíduo por administração ao indivíduo de um peptideo antigênico ou vacina.
[00392] O peptideo ou composição da revelação pode ser administrado em uma quantidade suficiente para induzir uma resposta de CTL. Um peptideo antigênico ou composição de vacina pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Agentes terapêuticos exemplares incluem, sem limitação, um agente quimioterápico ou bioterapêutico, radiação ou imunoterapia. Qualquer tratamento terapêutico adequado para uma doença particular pode ser administrado. Exemplos de agentes quimioterápicos
e agentes bioterapêuticos incluem, sem limitação,
aldesleucina , altretamina, amifostina, asparaginase,
bleomicina, capecitabina, carboplatina, carmustina,
cladribina, cisaprida, cisplatina, ciclofosfamida,
citarabina, dacarbazina (DTIC) , dactinomicina , docetaxel,
doxorrubicina, dronabinol, epoetina alfa, etoposida,
filgrastim, fludarabina, fluoruracil, gencitabina,
granisetron, hidroxiuréia, idarrubicina, ifosfamida,
interferon alfa, irinotecan , lansoprazol, levamisol,
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221/345 leucovorin, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazol, ondansetron, paclitaxel (Taxol®) , pilocarpina, proclorperazina, rituximab, tamoxifeno, taxol, topotecan cloridrato, trastuzumab, vinblastina, vincristina e vinorelbina tartrato. Além disso, o indivíduo pode ainda receber a administração de um agente anti-imunossupressivo ou imunoestimulante. Por exemplo, o indivíduo pode ainda receber a administração de um anticorpo anti-CTLA ou antiPD-1 ou anti-PD-Ll.
[00393] A quantidade de cada peptideo a ser incluída em uma composição de vacina e o regime de dosagem podem ser determinados por aqueles técnicos no assunto. Por exemplo, um peptideo ou sua variante pode ser preparado para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Métodos exemplares de injeção de peptideos incluem s.c, i.d., i.p., i.m. e i.v. Métodos exemplares de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c, i.p. e i.v. Outros métodos de administração da composição de vacina são conhecidos por aqueles técnicos no assunto.
[00394] Uma composição farmacêutica pode ser compilada, de tal modo que a seleção, número e/ou quantidade de peptideos presentes na composição sejam específicos para a doença e/ou paciente. Por exemplo, a seleção exata de peptideos pode ser guiada por padrões de expressão das proteínas parentais em certo tecido para evitar efeitos colaterais. A seleção pode ser dependente do tipo específico de doença, do estado da doença, de regimes de tratamento anteriores, do estado imune do paciente e do haplótipo de
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HLA do paciente. Além disso, a vacina de acordo com a presente revelação pode conter componentes individualizados, de acordo com as necessidades pessoais do paciente particular. Exemplos incluem a variação das quantidades de peptídeos de acordo com a expressão do antígeno relacionado no paciente particular, efeitos colaterais indesejados em consequência de alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários após uma primeira rodada ou esquema de tratamento.
Produção de antígenos específicos de doenças [00395] A presente revelação se baseia, pelo menos em parte, na habilidade para apresentar ao sistema imune do paciente um ou mais antígenos doença-específicos. Aqueles técnicos no assunto, a partir dessa revelação e do conhecimento na técnica, observarão que há várias formas para produzir esses antígenos doença-específicos. Em geral, esses antígenos doença-específicos podem ser produzidos in vitro ou in vivo. Antígenos específicos de doenças podem ser produzidos in vitro como peptídeos ou polipeptídeos, que podem então ser formulados em uma vacina ou composição imunogênica e administrados a um indivíduo. Como descrito em mais detalhes nesse relatório descritivo, essa produção in vitro pode ocorrer por diversos métodos conhecidos por aqueles técnicos no assunto como, por exemplo, síntese peptídica ou expressão de um peptídeo/polipeptídeo a partir de uma molécula de DNA ou RNA em qualquer um entre diversos sistemas de expressão recombinante bacterianos, eucarióticos ou virais, seguido por purificação do peptídeo/polipeptídeo expresso. Alternativamente, antígenos doença-específicos podem ser produzidos in vivo por introdução de moléculas
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223/345 (por exemplo, DNA, RNA, sistemas de expressão virais e semelhantes) que codificam antígenos doença-específicos em um indivíduo, onde os antígenos doença-específicos codificados são expressos. Os métodos de produção de antígenos in vitro e in vivo também são adicionalmente descritos nesse relatório descritivo, na medida em que se relaciona às composições farmacêuticas e métodos de liberação da terapia.
[00396] Em algumas modalidades, a presente revelação inclui peptideos antigênicos modificados. Uma modificação pode incluir uma modificação química covalente que não altera a sequência de aminoácidos primária do peptideo antigênico propriamente dito. Modificações podem produzir peptideos com propriedades desejadas, por exemplo, prolongamento da meia in vivo -vida, aumento da estabilidade, redução da depuração, alteração da imunogenicidade ou alergenicidade, capacitação da evocação de anticorpos particulares, direcionamento celular, captação de antigeno, processamento de antigeno, afinidade de MHC, estabilidade de MHC ou apresentação de antigeno. Alterações a um peptideo antigênico que podem ser realizadas incluem, sem limitação, conjugação a uma proteína carreadora, conjugação a um ligante, conjugação a um anticorpo, PEGuilação, polisialilação, HESilação, miméticos de PEG recombinantes, fusão de Fc, fusão de albumina, adesão de nanopartícuia, encapsulação nanoparticulada, fusão de colesterol, fusão de ferro, acilação, amidação, glicosilação, oxidação da cadeia lateral, fosforilação, biotinilação, a adição de um material tensoativo, a adição de miméticos de aminoácido, ou a adição de aminoácidos não naturais.
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224/345 [00397] Questões associadas com meia-vida plasmática curta ou suscetibilidade à degradação por protease podem ser superadas por várias modificações, incluindo conjugação ou ligação da sequência polipeptídica a qualquer um entre diversos polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos (veja, por exemplo, tipicamente por meio de uma porção de ligação ligada covalentemente tanto à proteína quanto ao polímero não proteináceo, por exemplo, um PEG) . Essas biomoléculas conjugadas ao PEG demonstraram que possuem propriedades clinicamente úteis, incluindo melhor estabilidade física e térmica, proteção contra suscetibilidade à degradação enzimática, solubilidade aumentada, meia-vida circulante in vivo mais longa e depuração diminuída, imunogenicidade e antigenicidade reduzidas e toxicidade reduzida.
[00398] PEGs adequados para conjugação a uma sequência polipeptídica são geralmente hidrossolúveis em temperatura ambiente, e possuem a fórmula geral R(O-CH2-CH2) nO-R, em que R é hidrogênio ou um grupo de proteção como, por exemplo, um grupo alquil ou um grupo alcanol, e em que n é um número inteiro de 1 a 1.000. Quando R é um grupo de proteção, ele geralmente possui de 1 a 8 carbonos. O PEG conjugado à sequência polipeptídica pode ser linear ou ramificado. Derivados de PEG ramificados, star-PEGs e PEGs multibraços são contemplados pela presente revelação.
[00399] A presente revelação também contempla composições de conjugados nas quais os PEGs possuem valores de n diferentes e, dessa forma, os vários PEGs diferentes estão presentes em proporções específicas. Por exemplo,
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225/345 algumas composições compreendem uma mistura de conjugados
nos quais n = 1, 2, 3 e 4 . Em algumas composições, a
percentagem de conjugados nos quais n = 1 é 18-25%, a
percentagem de conjugados nos quais n = 2 é 50-66%, a
percentagem de conjugados nos quais n = 3 é 12-16% e a
percentagem de conjugados nos quais n = 4 é de até 5%. Essas composições podem ser produzidas por condições de reação e métodos de purificação conhecidos na técnica. Por exemplo, cromatografia por troca de cátions pode ser usada para separar conjugados, e é então identificada uma fração que contém o conjugado que possui, por exemplo, o número desejado de PEGs anexados, purificados livres de sequências de proteína não modificadas e de conjugados que possuem outros números de PEGs anexados.
[00400] PEG pode ser ligado a um polipeptídeo da presente revelação por meio de um grupo reativo terminal (um espaçador). O espaçador é, por exemplo, um grupo reativo terminal que medeia uma ligação entre os grupos amino ou carboxil livres de uma ou mais das sequências polipeptídicas e polietileno glicol. O PEG que possui o espaçador que pode ser ligado ao grupo amino livre inclui Nhidroxissuccinilimida polietileno glicol, que pode ser preparado por ativação de éster de ácido succínico de polietileno glicol com N-hidróxi succinilimida. Outro polietileno glicol ativado que pode ser ligado a um grupo amino livre é 2,4-bis(O-metoxipolietilenoglicol)-6-cloro-striazina, que pode ser preparada por reação de éter monometílico de polietileno glicol com cloreto cianúrico. O polietileno glicol ativado que está ligado ao grupo carboxil livre inclui polioxietilenodiamina.
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226/345 [00401] A conjugação de uma ou mais das sequências polipeptídicas da presente revelação ao PEG que possui um espaçador pode ser realizada por vários métodos convencionais. Por exemplo, a reação de conjugação pode ser realizada em solução em um pH de 5 a 10, em temperatura de 4°C até a temperatura ambiente, por 30 minutos até 20 horas, utilizando uma proporção molar de reagente para proteína de 4:1 até 30:1. As condições de reação podem ser selecionadas para dirigir a reação em direção à produção predominantemente de um grau de substituição desejado. Em geral, temperatura baixa, pH baixo (por exemplo, pH = 5) e tempo de reação curto tendem a diminuir o número de PEGs anexados, enquanto temperatura alta, pH de neutro a alto (por exemplo, pH>7) e tempo de reação mais longo tendem a aumentar o número de PEGs anexados. Vários meios conhecidos na técnica podem ser usados para terminar a reação. Em algumas modalidades, a reação é terminada por acidificação da mistura de reação e congelamento, por exemplo, a -20°C.
[00402] A presente revelação também contempla o uso de miméticos de PEG. Foram desenvolvidos miméticos de PEG recombinantes que retêm os atributos de PEG (por exemplo, meia-vida sérica aumentada) conferindo, ao mesmo tempo, várias propriedades vantajosas adicionais. Como exemplo, cadeias polipeptídicas simples (que compreendem, por exemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser e Thr) capazes de formar uma conformação estendida similar ao PEG, podem ser produzidas recombinantemente já fundidas ao fármaco de peptídeo ou proteína de interesse (por exemplo, tecnologia de XTEN de Amunix; Mountain View, CA) . Isso remove a necessidade de uma etapa de conjugação adicional durante o
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227/345 processo de fabricação. Além disso, técnicas estabelecidas de biologia molecular permitem o controle da composição da cadeia lateral das cadeias polipeptidicas, permitindo
otimização da imunogenicidade e das propriedades de
fabricação. [00403] A glicosilação pode afetar as propriedades
físicas de proteínas e também pode ser importante na
estabilidade, secreção e localização subcelular da proteina. A glicosilação adequada pode ser importante para a atividade biológica. Na verdade, alguns genes de organismos eucarióticos, quando expressos em bactérias (por exemplo, E. coli) que não possuem processos celulares para a glicosilação de proteínas, geram proteínas que são recuperadas com pouca ou nenhuma atividade em virtude de sua ausência de glicosilação. A adição de sítios de glicosilação pode ser obtida por alteração da sequência de aminoácidos. A alteração ao polipeptídeo pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina (para sítios de glicosilação ligada ao 0) ou resíduos de asparagina (para sítios de glicosilação ligada ao N) . As estruturas de oligossacarídeos ligados ao N e ligados ao 0 e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo podem ser diferentes. Um tipo de açúcar que é comumente encontrado em ambos é ácido N-acetilneuramínico (daqui por diante denominado ácido siálico). 0 ácido siálico é normalmente o resíduo terminal de oligossacarídeos tanto ligados ao N quanto ligados ao 0 e, em função de sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas à glicoproteína. Modalidades da presente revelação compreendem a geração e o uso de variantes de N-glicosilação.
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228/345 [00404] As sequências polipeptidicas da presente revelação podem opcionalmente ser alterada por meio de alterações no nivel de DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica o polipeptídeo em bases pré-selecionadas, de modo que sejam gerados códons que se traduzirão nos aminoácidos desejados. Outro meio para aumentar o número de carboidrato porções no polipeptídeo é por acoplamento químico ou enzimático dos glicosídeos ao polipeptídeo. A remoção de carboidratos pode ser obtida quimicamente ou enzimaticamente, ou por substituição de códons que codificam resíduos de aminoácidos que são glicosilados. São conhecidas técnicas de glicosilação química, e a divagem enzimática de porções carboidrato em polipeptídeos pode ser obtida pelo uso de diversas endo- e exo-glicosidases.
[00405] Componentes e moléculas adequadas adicionais para conjugação incluem, por exemplo, moléculas para direcionamento ao sistema linfático, tiroglobulina; albuminas como, por exemplo, albumina sérica humana (HAS); toxóide tetânico; toxóide diftérico; poliaminoácidos como, por exemplo, poli(D-lisina:ácido D-glutâmico); polipeptídeos VP6 de rotavirus; hemaglutinina do vírus influenza, nucleoproteína do vírus influenza; hemocianina Keyhole Limpet (KLH); e proteína central e antigeno de superfície do vírus da hepatite B; ou qualquer combinação dos citados anteriormente.
[00406] A fusão de albumina a um ou mais polipeptídeos da presente revelação pode ser obtida, por exemplo, por manipulação genética, de modo que o DNA que codifica HSA, ou um fragmento deste, é unido ao DNA que codifica as (uma ou mais) sequências polipeptídicas. A seguir, um hospedeiro
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229/345 adequado pode ser transformado ou transfectado com as sequências de nucleotídeos fundidas na forma de, por exemplo, um plasmideo adequado, de modo a expressar um polipeptídeo de fusão. A expressão pode ser efetuada in vitro, por exemplo, por células procarióticas ou eucarióticas, ou in vivo, por exemplo, por um organismo transgênico. Em algumas modalidades da presente revelação, a expressão da proteína de fusão é realizada em linhagens de células de mamíferos, por exemplo, linhagens de células CHO. A transformação é usada amplamente nesse relatório descritivo para se referir à alteração genética de uma célula resultante da captação direta, incorporação e expressão de material genético exógeno (DNA exógeno) de suas vizinhanças e recolhido através da(s) membrana(s) celular(es). A transformação ocorre naturalmente em algumas espécies de bactérias, mas ela também pode ser efetuada por meios artificiais em outras células. Além disso, a própria albumina pode ser modificada para estender sua meia-vida circulante. A fusão da albumina modificada a um ou mais polipeptídeos pode ser obtida pelas técnicas de manipulação genética descritas acima ou por conjugação química; a molécula de fusão resultante possui uma meia-vida que excede aquela de fusões com albumina não modificada (veja WO 2011/051489). Várias estratégias de ligação à albumina foram desenvolvidas como alternativas à fusão direta, incluindo ligação à albumina por meio de uma cadeia de ácido graxo conjugada (acilação). Como a albumina sérica é uma proteína de transporte para ácidos graxos, esses ligantes naturais com atividade de ligação à albumina têm sido usados para extensão da meia-vida de produtos terapêuticos de pequena proteína. Por exemplo, insulina
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Detemir (LEVEMIR), um produto aprovado para diabetes, compreende uma cadeia miristil conjugada a uma insulina modificada geneticamente, resultando em uma análogo de insulina de longa ação.
[00407] Outro tipo de modificação é a conjugação (por exemplo, ligar) de um ou mais componentes ou moléculas adicionais ao terminal-N e/ou -C de uma sequência polipeptidica, por exemplo, outra proteína (por exemplo, uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos heteróloga à proteína do indivíduo), ou uma molécula carreadora. Dessa forma, uma sequência polipeptídica exemplar pode ser fornecida como um conjugado com outro componente ou molécula.
[00408] A modificação de um conjugado pode resultar em uma sequência polipeptídica que retém atividade com uma função ou atividade adicional ou complementar da segunda molécula. Por exemplo, uma sequência polipeptídica pode ser conjugada a uma molécula, por exemplo, para facilitar a solubilidade, armazenamento, meia-vida ou estabilidade in vivo ou ao armazenamento, redução na imunogenicidade, liberação retardada ou controlada in vivo etc. Outras funções ou atividades incluem um conjugado que reduz a toxicidade em relação a uma sequência polipeptídica não conjugada, um conjugado que visa um tipo de célula ou órgão mais eficientemente do que uma sequência polipeptídica não conjugada, ou um fármaco para se opor ainda mais às causas
ou efeitos associados com um distúrbio ou doença, como
apresentado nesse relatório descritivo (por exemplo,
diabetes).
[00409] Um polipeptídeo também pode ser conjugado a
macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, por
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231/345 exemplo, proteínas; polissacarídeos, por exemplo, sefarose, agarose, celulose, partículas de celulose; aminoácidos poliméricos como, por exemplo, ácido poliglutâmico, polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas virais inativadas; toxinas bacterianas inativadas como, por exemplo, toxóide da difteria, tétano, cólera, moléculas de leucotoxina; bactérias inativadas; e células dendríticas.
[00410] Componentes e moléculas candidatas adicionais para conjugação incluem aquelas adequadas para isolamento ou purificação. Exemplos não limitantes particulares incluem moléculas de ligação, por exemplo, biotina (par de ligação específica de biotina-avidina), um anticorpo, um receptor, um ligante, uma lectina, ou moléculas que compreendem um suporte sólido, incluindo, por exemplo, partículas, placas ou partículas plásticas ou de poliestireno, partículas magnéticas, fitas de teste, e membranas. Métodos de purificação como, por exemplo, cromatografia por troca de cátions, podem ser usados para separar conjugados por diferença de carga, que separa eficazmente conjugados em seus vários pesos moleculares. O teor das frações obtidas por cromatografia por troca de cátions pode ser identificado por peso molecular com o uso de métodos convencionais, por exemplo, espectroscopia de massa, SDS-PAGE, ou outros métodos conhecidos para a separação de entidades moleculares por peso molecular.
[00411] Em algumas modalidades, o terminal amino ou carboxil de uma sequência polipeptídica da presente revelação pode ser fundido com uma região Fc de imunoglobulina (por exemplo, Fc humano) para formar um conjugado de fusão (ou molécula de fusão). Foi demonstrado
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232/345 que conjugados de fusão Fc aumentam a meia-vida sistêmica de biofarmacêuticos e, dessa forma, o produto biofarmacêutico pode necessitar de administração menos frequente.
[00412] Fc se liga ao receptor Fc neonatal (FcRn) em células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e, mediante ligação, a molécula de fusão Fc é protegida de degradação e liberada novamente na circulação, mantendo a molécula em circulação por mais tempo. Acredita-se que essa ligação ao Fc seja o mecanismo pelo qual IgG endógena retém sua meia-vida plasmática longa. Tecnologia mais recente de fusão de Fc liga uma única cópia de um biofarmacêutico à região Fc de um anticorpo para otimizar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do biofarmacêutico, comparados com conjugados de fusão de Fc tradicionais.
[00413] A presente revelação contempla o uso de outras modificações, atualmente conhecidas ou desenvolvidas no futuro, dos polipeptídeos para aprimorar uma ou mais propriedades. Esse método para o prolongamento da meia-vida na circulação, aumento da estabilidade, redução da depuração ou alteração da imunogenicidade ou alergenicidade de um polipeptídeo da presente revelação envolve a modificação das sequências polipeptídicas por hesilação, que utiliza derivados hidroxietil amido ligados a outras moléculas a fim de modificar as características da molécula. Vários aspectos de hesilação são descritos, por exemplo, nos Pedidos de Patente U.S. Nos 2007/0134197 e 2006/0258607.
Síntese de peptídeo/polipeptídeo in vitro [00414] Proteínas ou peptideos podem ser feitas por qualquer metodologia conhecida por aqueles técnicos no assunto, incluindo a expressão de proteínas, polipeptídeos
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233/345 ou peptídeos por meio de técnicas biológicas moleculares padronizadas, o isolamento de proteínas ou peptídeos de fontes naturais, tradução in vitro, ou a síntese química de proteínas ou peptídeos.
[00415] Peptídeos podem ser prontamente sintetizados quimicamente utilizando reagentes que são livres de contaminantes bacterianos ou substâncias animais (Merrifield RB: Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85: 2.14954, 1963). Em algumas modalidades, peptídeos antigênicos são preparados por (1) síntese de fase sólida paralela em instrumentos multicanais usando síntese uniforme e condições de divagem; (2) purificação sobre uma coluna de RP-HPLC com desnudamento de coluna; e nova lavagem, mas não troca, entre peptídeos; seguida por (3) análise com um conjunto limitado dos ensaios mais informativos. A impressão digital de Boas Práticas de Fabricação (GMP) pode ser definida em torno do conjunto de peptídeos para um paciente individual exigindo, dessa forma, procedimentos de transição adequados somente entre sínteses de peptídeos para diferentes pacientes.
[00416] Alternativamente, um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica um peptideo antigênico da presente revelação pode ser usado para produzir o peptideo antigênico in vitro. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, de fita simples e/ou dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com um arcabouço de fosforotiotato, ou combinações destes, e ele pode conter introns, desde que ele codifique o peptideo. Em uma modalidade, tradução in vitro é usada para produzir o
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234/345 peptídeo. Existem muitos sistemas exemplares que aqueles técnicos no assunto poderíam utilizar (por exemplo, o Kit Retie Lysate IVT, Life Technologies, Waltham, MA). Um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo também pode ser preparado. Vetores de expressão para tipos diferentes de células são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados sem experimentação desnecessária. Geralmente, o DNA é inserido em um vetor de expressão, por exemplo, um plasmídeo, em orientação adequada e quadro de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode estar ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulatórias da transcrição e da tradução apropriadas reconhecidas pelo hospedeiro desejado (por exemplo, bactérias), embora esses controles geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. 0 vetor é então introduzido nas bactérias hospedeira para clonagem usando técnicas-padrão (veja, por exemplo, Sambrook e cols. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
[00417] Vetores de expressão que compreendem os polinucleotídeos isolados, bem como células hospedeiras que contêm os vetores de expressão, também são contemplados. Os peptideos antigênicos podem ser fornecidos na forma de moléculas de RNA ou cDNA que codificam os peptideos antigênicos desejados. Um ou mais peptideos antigênicos da revelação podem ser codificados por um único vetor de expressão.
[00418] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem compreender a sequência codificadora para o peptídeo antigênico doença-específico fundida no mesmo quadro de
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235/345 leitura a um polinucleotideo que auxilia, por exemplo, na expressão e/ou secreção de um polipeptídeo por uma célula hospedeira (por exemplo, uma sequência-líder que funciona como uma sequência secretora para o controle do transporte de um polipeptídeo da célula). 0 polipeptídeo que possui uma sequência-líder é uma pré-proteína e pode ter a sequêncialíder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo.
[00419] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem compreender a sequência codificadora para o peptídeo antigênico doença-específico fundida no mesmo quadro de leitura a uma sequência marcadora que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado, que pode então ser incorporado em uma vacina ou composição imunogênica contra a doença personalizada. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser uma etiqueta de hexa-histidina fornecida por um vetor pQE-9 para fornecer a purificação do polipeptídeo maduro fundido ao marcador, no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a sequência marcadora pode ser uma etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada da proteína hemaglutinina de influenza quando um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7) é usado. Etiquetas adicionais incluem, sem limitação, etiquetas de calmodulina, etiquetas de FLAG, etiquetas de Myc, etiquetas de S, etiquetas de SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta V5, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, etiquetas de Proteína Carreadora de Carboxil Biotina (BCCP), etiquetas de GST, etiquetas de proteína fluorescente (por exemplo, etiquetas de proteína fluorescente verde), etiquetas de proteína de ligação à maltose, etiquetas Nus, Strep-tag, etiqueta de tioredoxina, etiqueta de TC, etiqueta
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236/345 de Ty e semelhantes.
[00420] Em algumas modalidades, os polinucleotideos podem compreender a sequência codificadora para um ou mais dos peptídeos antigênicos doença-específicos fundida no mesmo quadro de leitura para uma única construção concatenada de peptideo antigênico capaz de produção de múltiplos peptídeos antigênicos.
[00421] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico isolado que possuem uma sequência de nucleotídeos pelo menos 60% idêntica, pelo menos 65% idêntica, pelo menos 70% idêntica, pelo menos 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, ou pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um polinucleotídeo que codifica um peptideo antigênico doença-específico da presente revelação, podem ser fornecidas.
[00422] Os peptídeos antigênicos doença-específicos isolados descritos nesse relatório descritivo podem ser produzidos in vitro (por exemplo, no laboratório) por qualquer método adequado conhecido na técnica. Esses métodos variam de métodos sintéticos de proteína diretos para a construção de uma sequência de DNA que codifica sequências polipeptídicas isoladas e expressão daquelas sequências em um hospedeiro transformado adequado. Em algumas modalidades, é construída uma sequência de DNA usando tecnologia recombinante por isolamento ou síntese de uma sequência de DNA que codifica uma proteína do tipo selvagem de interesse. Opcionalmente, a sequência pode ser mutagenizada por mutagênese sítio-específica para fornecer análogos funcionais desta. Veja, por exemplo, Zoeller e cols., Proa.
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Nat'l. Acad. Sci. USA 81: 5.662-5.066 (1984) e Patente U.S. N° 4.588.585.
[00423] Em algumas modalidades, uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse seria construída por síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser projetados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo desejado e seleção daqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídeo recombinante de interesse é produzido. Métodos padronizados podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos completa pode ser usada para a construção um gene traduzido de forma retrógrada. Além disso, um oligômero de DNA que contém uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo isolado particular pode ser sintetizado. Por exemplo, vários pequenos oligonucleotídeos que codificam porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e depois ligados. Os oligonucleotídeos individuais tipicamente contêm protuberâncias 5' ou 3' para montagem complementar.
[00424] Uma vez montadas (por exemplo, por síntese, mutagênese sítio-dirigida, ou outro método) , as sequências de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo isolado particular de interesse são inseridas em um vetor de expressão e, opcionalmente, ligadas operacionalmente a uma sequência de controle de expressão apropriada para expressão da proteína em um hospedeiro desejado. A montagem adequada pode ser confirmada por sequenciamento de nucleotídeo, mapeamento de restrição e expressão de um polipeptídeo
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238/345 biologicamente ativo em um hospedeiro adequado. Como é bem conhecido na técnica, a fim de obter níveis altos de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene pode ser ligado operacionalmente às sequências de controle de expressão da transcrição e tradução que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.
[00425] Vetores de expressão recombinantes podem ser usados para amplificar e expressar DNA que codifica os peptideos antigênicos doença-específicos. Vetores de expressão recombinantes são construções de DNA replicáveis que possuem fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA que codificam um peptídeo antigênico doença-específico ou um análogo bioequivalente ligado operacionalmente a elementos reguladores da transcrição ou da tradução adequados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos. Uma unidade transcricional geralmente compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos que possuem um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, promotores ou intensificadores transcricionais, (2) uma sequência estrutural ou codificadora que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína, e (3) sequências de iniciação e terminação da transcrição e tradução apropriadas, como descritas em detalhe nesse relatório descritivo. Esses elementos reguladores podem incluir uma sequência operadora para controlar a transcrição. A habilidade para replicar em um hospedeiro, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes, pode adicionalmente ser incorporada. Regiões de DNA estão ligadas operacionalmente quando elas são funcionalmente relacionadas
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239/345 entre elas. Por exemplo, DNA para um peptideo sinalizador (líder secretor) está ligado operacionalmente a um DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora se ele controla a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora se ele está posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, ligado operacionalmente significa contíguo e, no caso de líderes secretores, significa contíguo e em quadro de leitura. Elementos estruturais destinados a serem usados em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência-líder que habilita a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, quando a proteína recombinante é expressa sem uma sequência- líder ou de transporte, ela pode incluir um resíduo de metionina no terminal-N. Esse resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para fornecer um produto final.
[00426] Vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos, especialmente mamíferos ou humanos, incluem, por exemplo, vetores que compreendem sequências de controle de expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovirus e citomegalovírus. Vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, por exemplo, plasmídeos de Escherichia coli, incluindo pCR 1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de gama de hospedeiros mais ampla, por exemplo, M13 e fagos de DNA filamentosos de fita simples.
[00427] Células hospedeiras adequadas para expressão de
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240/345 um polipeptideo incluem procariotas, células de leveduras, insetos ou células eucarióticas superiores sob o controle dos promotores apropriados. Procariotas incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. Células eucarióticas superiores incluem linhagens de células estabelecidas de origem mamifera. Sistemas de tradução livres de células também poderiam ser empregadas. Vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e mamíferos são bem conhecidos na técnica (veja Pouwels e cols., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).
[00428] Vários sistemas de cultura de células de mamíferos ou insetos também são vantajosamente empregados para expressar proteína recombinante. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada porque essas proteínas são geralmente enoveladas corretamente, adequadamente modificadas e completamente funcionais. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem as linhagens de células de rim de macaco COS-7, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor apropriado incluindo, por exemplo, células L, linhagens de células C127, 3T3, de ovário de hamster chinês (CHO), 293, HeLa e BHK. Vetores de expressão de mamíferos podem compreender elementos não transcritos como, por exemplo, uma origem de replicação, um promotor e intensificador adequados ligados ao gene a ser expresso, e outras sequências de flanqueamento 5' ou 3' não transcritas, e sequências 5' ou 3' não traduzidas, por exemplo, sítios de ligação ao
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241/345 ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceptores de splice, e sequências de terminação da transcrição. Sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de inseto são revisados por Luckow e Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988).
[00429] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Esses métodos padronizados incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca de ions, de coluna de afinidade e de tamanho e semelhantes), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica-padrão para purificação de proteínas. Etiquetas de afinidade como, por exemplo, hexahistidina, domínio de ligação à maltose, sequência do capsídeo de influenza, glutationa-S-transferase e semelhantes, podem ser anexadas à proteína para permitir a fácil purificação por passagem sobre uma coluna de afinidade apropriada. Proteínas isoladas também podem ser fisicamente caracterizadas usando técnicas como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios-x. Por exemplo, sobrenadantes de sistemas que secretam proteína recombinante em meios de cultura podem primeiro ser concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Alternativamente, uma resina de troca de ânions pode ser empregada, por exemplo, uma matriz ou substrato que possui grupos dietilaminoetil (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrana, celulose ou outros tipos
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242/345 comumente empregados em purificação de proteina. Alternativamente, uma etapa de troca de cátions pode ser empregada. Trocadores de cátions incluem várias matrizes insolúveis adequadas que compreendem grupos sulfopropil ou carboximetil. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia liquida de alto rendimento de fase reversa (RP-HPLC) que empregam meios de RP-HPLC hidrofóbicos, por exemplo, silica gel que possui grupos metil ou outros grupos alifáticos pendentes, podem ser empregadas para purificar ainda mais a composição de proteina de célula-tronco de câncer-Fc. Algumas ou todas as etapas de purificação mencionadas anteriormente, em várias combinações, também podem ser empregadas para fornecer uma proteina recombinante homogênea.
[00430] A proteina recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, por extração inicial de péletes de células, seguida por uma ou mais etapas de cromatografia de concentração, dessalinização, troca de ions aquosos ou exclusão de tamanho. Cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) pode ser empregada para etapas finais de purificação. As células microbianas empregadas na expressão de uma proteina recombinante podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclagem de congelamento-descongelamento, sonificação, ruptura mecânica, ou uso de agentes de lise de células.
Síntese de peptídeo/polipeptídeo in vivo [00431] A presente invenção também contempla o uso de moléculas de ácido nucléico como veiculos para liberação de peptideos/polipeptideos antigênicos ao indivíduo necessitado, in vivo, na forma de, por exemplo, vacinas de
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DNA/RNA (veja, por exemplo, WO 2012/159643 e WO 2012/159754, incorporados nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade).
[00432] Em algumas modalidades, antígenos podem ser administrados a um paciente necessitado por uso de um plasmídeo. Esses são plasmídeos que normalmente consistem em um promotor viral forte para dirigir a transcrição e tradução in vivo do gene (ou DNA complementar) de interesse (Mor, e cols. (1995), The Journal of Immunology 155 (4) : 2.0392.046) . íntron A pode algumas vezes ser incluído para aumentar a estabilidade de mRNA e, dessa forma, aumentar a expressão de proteína (Leitner e cols. (1997), The Journal of Immunology 159 (12): 6.112-6.119). Plasmídeos também incluem um forte sinal de poliadenilação/terminação da transcrição, por exemplo, sequências de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino ou de beta-globulina de coelho (Alarcon e cols. (1999), Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Robinson e cols., (2000), Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74; Bohm e cols. (1996), Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40). Vetores multicistrônicos são algumas vezes construídos para expressar mais de um imunógeno, ou para expressar um imunógeno e uma proteína imunoestimuladora (Lewis e cols. (1999), Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
[00433] Plasmídeos podem ser introduzidos em tecidos animais por diversos métodos diferentes. As duas abordagens mais populares são injeção de DNA em solução salina, usando uma agulha hipodérmica padronizada, e liberação por pistola gênica. Uma representação esquemática da construção de um
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244/345 plasmideo de vacina de DNA e sua liberação subsequente por esses dois métodos em um hospedeiro é ilustrada em Scientific American (Weiner e cols. (1999) Scientific American 281 (1) : 34-41) . A injeção em solução salina é normalmente realizada por via intramuscular (IM) em músculo esquelético, ou por via intradérmica (ID), com o DNA sendo liberado aos espaços extracelulares. Isso pode ser auxiliado por eletroporação danificando-se temporariamente fibras musculares com miotoxinas como, por exemplo, bupivacaína; ou por utilização de soluções hipertônicas de solução salina ou sacarose (Alarcon e cols. (1999), Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). As respostas imunes a esse método de liberação podem ser afetadas por muitos fatores, incluindo tipo da agulha, alinhamento da agulha, velocidade de injeção, volume de injeção, tipo de músculo, e idade, sexo e condição fisiológica do animal que está sendo injetado (Alarcon e cols. (1999) Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).
[00434] A liberação por pistola gênica, o outro método de liberação comumente usado, acelera balisticamente DNA de plasmideo (pDNA) que foi adsorvido sobre microparticulas de ouro ou tungstênio na células-alvo, usando hélio comprimido como acelerante (Alarcon e cols. (1999) Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis e cols. (1999), Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).
[00435] Métodos de liberação alternativos podem incluir instilação de aerossol de DNA nu (naked) em superficies mucosas, por exemplo, às mucosas nasal e pulmonar (Lewis e cols. (1999), Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) e administração tópica de pDNA ao olho e mucosa
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245/345 vaginal (Lewis e cols. (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) . A liberação à superfície mucosa também foi obtida usando preparações de lipossomo catiônicoDNA, microesferas biodegradáveis, vetores de Shigella ou Listeria atenuados para administração oral à mucosa intestinal e vetores de adenovirus recombinantes. DNA ou RNA também podem ser liberados às células após ruptura mecânica suave da membrana celular, permeabilizando temporariamente as células. Essa ruptura mecânica suave da membrana pode ser obtida forçando gentilmente as células através de uma pequena abertura (Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Sharei e cols., PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone .0118803, 13 de abril de 2015) .
[00436] Em algumas modalidades, uma vacina ou composição imunogênica doença-específica pode incluir plasmídeos de DNA separados que codificam, por exemplo, um ou mais peptídeos/polipeptídeos antigênicos, como identificados de acordo com a revelação. Como discutido nesse relatório descritivo, a escolha exata de vetores de expressão pode depender dos peptídeos/polipeptídeos a serem expressos, e faz parte dos conhecimentos daqueles técnicos no assunto. Espera-se que a persistência esperada das construções de DNA (por exemplo, em uma forma epissômica, não replicante, não integrada nas células musculares) forneça uma duração de proteção aumentada.
[00437] Um ou mais peptídeos antigênicos da presente revelação podem ser codificados e expressos in vivo usando um sistema de base viral (por exemplo, um sistema de adenovirus, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um poxvirus ou um lentivírus). Em uma modalidade, a vacina ou
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246/345 composição imunogênica contra a doença pode incluir um vetor de base viral para uso em um paciente humano necessitado como, por exemplo, um adenovirus (veja, por exemplo, Baden e cols. First-in-Human Evaluation of the Safety and Immunogenicity of a Recombinant Adenovirus Serotype 26 HIV1 Env Vaccine (IPCAVD 001). J. Infect Dis., 15 de janeiro de 2013; 207 (2): 240-7, incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade). Plasmídeos que podem ser usados para liberação de vírus adenoassociado, adenovirus e lentivírus foram descritos previamente (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.955.808 e 6.943.019, e Pedido de Patente U.S. N° 20080254008, incorporados nesse relatório descritivo por referência).
[00438] Os peptideos e polipeptídeos da revelação também podem ser expressos por um vetor, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico, como discutido nesse relatório descritivo, por exemplo, RNA ou um plasmídeo de DNA, um vetor viral como, por exemplo, um poxvirus, por exemplo, ortopoxvírus, vírus avipox ou adenovirus, AAV ou lentivírus. Essa abordagem envolve o uso de um vetor para expressar sequências de nucleotídeos que codificam o peptideo da revelação. Após introdução em um hospedeiro agudamente ou cronicamente infectado ou em um hospedeiro não infectado, o vetor expressa o peptideo imunogênico e, dessa forma, provoca uma resposta de CTL do hospedeiro.
[00439] Entre os vetores que podem ser usados na prática da revelação, a integração no genoma do hospedeiro de uma célula é possível com métodos de transferência de gene de retrovirus, frequentemente resultando em expressão de longo prazo do transgene inserido. Em algumas modalidades, o
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247/345 retrovirus é um lentivirus. Adicionalmente, eficiências de transdução elevadas têm sido observadas em muitos tipos diferentes de células e tecidos-alvo. 0 tropismo de um retrovirus pode ser alterado por incorporação de proteínas do envelope estranhas, expansão da população-alvo de células-alvo potencial. Um retrovirus também pode ser modificado geneticamente para permitir expressão condicional do transgene inserido, de modo que somente certos tipos de células sejam infectados pelo lentivirus. Promotores específicos para o tipo de células podem ser usados para direcionar a expressão em tipos específicos de células. Vetores lentivirais são vetores retrovirais (e, dessa forma, tanto vetores lentivirais quanto vetores retrovirais podem ser usados na prática da revelação). Além disso, vetores lentivirais são capazes de transduzir ou infectar células que não estão em divisão e tipicamente produzem altas titulações virais. A seleção de um sistema de transferência de gene retroviral pode, portanto, depender do tecido-alvo. Vetores retrovirais são compostos por repetições terminais longas cis-atuantes com capacidade de empacotamento para até 6-10 kb de sequência estranha. As LTRs cis-atuantes mínimas são suficientes para replicação e empacotamento dos vetores, que são então usados para integrar o ácido nucleico desejado na célula-alvo para fornecer expressão permanente. Vetores retrovirais amplamente usados que podem ser utilizados na prática da revelação incluem aqueles baseados no vírus da leucemia murídea (MuLV), vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), e combinações destes (veja, por exemplo, Buchscher e cols., (1992) J. Virol. 66: 2.731
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2.739; Johann e cols., (1992) J. Virol. 66: 1.635-1.640; Sommnerfelt e cols., (1990) Virol. 176: 58-59; Wilson e cols., (1998) J. Virol. 63: 2.374-2.378; Miller e cols., (1991) J. Virol. 65: 2.220-2.224; PCT/US94/05700) .
[00440] Também é útil na prática da revelação um vetor lentiviral mínimo não primata, por exemplo, um vetor lentiviral com base no vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). (veja, por exemplo, Balagaan, (2006) J. Gene Med.; 8: 275- 285, publicado online em 21 de novembro 2005 em Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Os vetores podem ter um promotor de citomegalovírus (CMV) que dirige a expressão do gene-alvo. Consequentemente, a revelação contempla entre o(s) vetor (es) úteis na prática da revelação: vetores virais, incluindo vetores retrovirais e vetores lentivirais.
[00441] Vetores lentivirais foram revelados como um tratamento para doença de Parkinson; veja, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N° 20120295960 e as Patentes U.S. Nos 7303910 e 7351585. Vetores lentivirais também foram revelados para liberação ao cérebro; veja, por exemplo, as Publicações de Patentes U.S. Nos US20110293571; US20040013648, US20070025970, US20090111106 e Patente U.S. N° US7259015. Em outra modalidade vetores lentivirais são usados para liberar vetores ao cérebro daqueles que estão sendo tratados para uma doença. Quanto aos sistemas de vetor de lentivírus úteis na prática da revelação, é feita menção às Patentes U.S. Nos 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682 e 7,198,784, e documentos nelas citados. Em uma modalidade desse relatório descritivo, a liberação é por meio de um lentivírus. Zou e cols. administraram cerca de 10
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249/345 μΐ de um lentivírus recombinante que possui uma titulação de 1 x 109 unidades de transdução (TU)/ml por um cateter intratecal. Esses tipos de dosagens podem ser adaptadas ou extrapoladas para uso de um vetor retroviral ou lentiviral na presente revelação. Para transdução em tecidos como, por exemplo, o cérebro, é necessário usar volumes muito pequenos e, portanto, a preparação viral é concentrada por ultracentrifugação. Outros métodos de concentração como, por exemplo, ultrafiltração ou ligação e eluição de uma matriz, podem ser usados. Em outras modalidades, a quantidade de lentivirus administrada pode ser 1 x 105 ou cerca de 1 x 105 unidades formadoras de placa (PFU), 5 x 105 ou cerca de 5 x 105 PFU, 1 x 106 ou cerca de 1 x 106 PFU, 5 x 106 ou cerca de 5 x 106 PFU, 1 x 107 ou cerca de 1 x 107 PFU, 5 x 107 ou cerca de 5 x 107 PFU, 1 x 108 ou cerca de 1 x 108 PFU, 5 x 108 ou cerca de 5 x 108 PFU, 1 x 109 ou cerca de 1 x 109 PFU, 5 x 109 ou cerca de 5 x 109 PFU, 1 x 1010 ou cerca de 1 x 1010 PFU ou 5 x 1010 ou cerca de 5 x 1010 PFU como dosagem única total para um humano médio de 7 5 kg ou ajustada para o peso e tamanho e espécie do indivíduo. Aqueles técnicos no assunto podem determinar a dosagem adequada. Dosagens adequadas para um vírus podem ser determinadas empiricamente.
[00442] Também é útil na prática da revelação um vetor de adenovirus. Uma vantagem é a habilidade de adenovirus recombinantes para transferir e expressar eficientemente genes recombinantes em diversas células e tecidos de mamíferos in vitro e in vivo, resultando na expressão elevada dos ácidos nucleicos transferidos. Além disso, a habilidade para infectar produtivamente células quiescentes expande a utilidade de vetores adenovirais recombinantes. Além disso,
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250/345 níveis de expressão elevados asseguram que os produtos dos ácidos nucleicos serão expressos até níveis suficientes para gerar uma resposta imune (veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.029.848, incorporada nesse relatório descritivo por referência). Quanto aos vetores de adenovirus úteis na prática da revelação, menciona-se a Patente U.S. N° 6.955.808. O vetor de adenovirus usado pode ser selecionado do grupo que consiste nos vetores Ad5, Ad35, Adil, C6 e C7. A sequência do genoma do Adenovirus 5 (Ad5) foi publicada (Chroboczek, J., Bieber, F., e Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285; cujo conteúdo é incorporado nesse relatório descritivo por referência). Vetores Ad35 são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.974.695, 6.913.922 e 6.869.794. Vetores Adll são descritos na Patente U.S. N° 6.913.922. Vetores C6 de adenovirus são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.780.407; 6.537.594; 6.309.647; 6.265.189; 6.156.567; 6.090.393; 5.942.235 e 5.833.975. Vetores C7 são descritos na Patente U.S. N° 6.277.558. Vetores de adenovirus que são Eldefeituosos ou deletados, E3-defeituosos ou deletados e/ou E4-defeituosos ou deletados também podem ser usados. Certos adenovirus que possuem mutações na região El possuem margem de segurança aumentada, porque mutantes de adenovirus Eldefeituosos são replicação-defeituosos em células não permissivas ou, no mínimo, são altamente atenuados. Adenovirus que possuem mutações na região E3 podem ter a imunogenicidade aumentada por rompimento do mecanismo pelo qual o adenovirus infra-regula moléculas de MHC classe I. Adenovirus que possuem mutações E4 podem ter imunogenicidade
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251/345 reduzida do vetor de adenovirus por causa da supressão da expressão gênica tardia. Esses vetores podem ser particularmente úteis quando se deseja revacinação repetida utilizando o mesmo vetor. Vetores de adenovirus que são deletados ou mutados em El, E3, E4, El e E3, e El e E4 podem ser usados de acordo com a presente revelação. Além disso, vetores de adenovirus gutless, nos quais todos os genes virais estão deletados, também podem ser usados de acordo com a presente revelação. Esses vetores necessitam de um virus auxiliar para sua replicação e exigem uma linhagem de célula humana 293 especial que expressa tanto Ela quanto Cre, uma condição que não existe no ambiente natural. Esses vetores gutless não são imunogênicos e, dessa forma, os vetores podem ser inoculados várias vezes para revacinação. Os vetores de adenovirus gutless podem ser usados para a inserção de insertos/genes heterólogos como, por exemplo, os transgenes da presente revelação, e podem até mesmo ser usados para co-liberação de um grande número de insertos/genes heterólogos. Em algumas modalidades, a liberação é por meio de um adenovirus, que pode ser em uma única dose de reforço. Em algumas modalidades, o adenovirus é liberado por meio de múltiplas doses. Em termos de liberação in vivo, AAV é vantajoso em relação a outros vetores virais em função da baixa toxicidade e baixa probabilidade de causar mutagênese de inserção, pois não se integra no genoma do hospedeiro. AAV possui um limite de empacotamento de 4,5 ou 4,75 Kb. Construções maiores do que 4,5 ou 4,75 Kb resultam em produção de virus significantemente reduzida. Há muitos promotores que podem ser usados para dirigir a expressão da molécula de ácido
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252/345 nucléico. ITR de AAV pode servir como um promotor e é vantajosa para eliminação da necessidade de um elemento promotor adicional. Para expressão ubiqua, os seguintes promotores podem ser usados: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadeias pesadas ou leves de Ferritina etc. Para expressão no cérebro, os seguintes promotores podem ser usados: Sinapsina I para todos os neurônios, CaMK II-alfa para neurônios excitatórios, GAD67 ou GAD65 ou VGAT para neurônios GABAérgicos etc. Os promotores usados para dirigir a sintese de RNA podem incluir: promotores Pol III como, por exemplo, U6 ou H1. 0 uso de um promotor Pol II e cassetes intrônicos pode ser feito para expressar RNA-guia (gRNA). Com relação aos vetores de AAV úteis na prática da revelação, mencionamse as Patente U.S. N°s 5.658.785, 7.115.391, 7.172.893, 6.953.690, 6.936.466, 6.924.128, 6.893.865, 6.793.926, 6.537.540, 6.475.769 e 6.258.595, e documentos nelas citados. Quanto ao AAV, o AAV pode ser AAV1, AAV2, AAV5 ou qualquer combinação destes. Pode-se selecionar o AAV com relação às células a serem visadas; por exemplo, podem ser selecionados sorotipos de AAV 1, 2, 5 ou um AAV1, AAV2, AAV5 de capsideo hibrido ou qualquer combinação destes para visar o cérebro ou células neuronais; e pode ser selecionado AAV4 para visar tecido cardiaco. AAV8 é útil para liberação ao figado. Em algumas modalidades, a liberação é por meio de um AAV. A dosagem pode ser ajustada para equilibrar o beneficio terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais.
[00443] Em algumas modalidades, a ativação efetiva de uma resposta imune celular para uma vacina ou composição imunogênica contra doença pode ser obtida por expressão dos antigenos relevantes em uma vacina ou composição imunogênica
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253/345 em um microorganismo não patogênico. Exemplos bem conhecidos desses microorganismos são BCG de Mycobacterium bovis, Salmonella e Pseudomonas (veja a Patente U.S. N° 6.991.797, incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade).
[00444] Em algumas modalidades, um poxvirus é usado na vacina ou composição imunogênica contra doença. Esses incluem ortopoxvirus, avipox, vaccinia, MVA, NYVAC, virus da variola dos canários, ALVAC, virus da bouba aviária, TROVAC etc. (veja, por exemplo, Verardie cols., Hum. Vaccin. Immunother. Julho de 2012; 8 (7) : 961-70; e Moss, Vaccine. 2013; 31 (39) : 4.220-4.222) . Vetores de expressão de poxvirus foram descritos em 1982 e rapidamente se tornaram amplamente usados para o desenvolvimento de vacinas, bem como para pesquisa em diversos campos. As vantagens dos vetores incluem construção simples, habilidade para acomodar grandes quantidades de DNA estranho e niveis de expressão elevados. Informação em relação aos poxvirus que podem ser usados na prática da revelação, por exemplo, os poxvirus da subfamilia Chordopoxvirinae (poxvirus de vertebrados), por exemplo, ortopoxvirus e avipoxvirus, por exemplo, virus da vaccinia (por exemplo, Cepa Wyeth, Cepa WR (por exemplo, ATCC® VR1354), Cepa Copenhagen, NYVAC, NYVAC.1, NYVAC.2, MVA, MVABN) , virus da variola dos canários (por exemplo, Cepa Wheatley C93, ALVAC) , virus da bouba aviária (por exemplo, Cepa FP9, Cepa Webster, TROVAC) , dovepox, pigeonpox, quailpox e variola do guaxinim, inter alia, recombinantes sintéticos ou de ocorrência não natural destes, usos destes, e métodos para a produção e utilização desses recombinantes podem ser encontrados na literatura cientifica e de patentes.
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254/345 [00445] Em algumas modalidades, o vírus da vaccinia é usado na vacina ou composição imunogênica contra doença para expressar um antígeno (Rolph e cols., Recombinant Viruses as Vaccines and Immunological Tools. Curr. Opin. Immunol. 9: 517-524, 1997). 0 virus da vaccinia recombinante é capaz de replicar dentro do citoplasma da célula hospedeira infectada e o polipeptídeo de interesse pode, portanto, induzir uma resposta imune. Além disso, poxvirus têm sido amplamente usados como vetores de vacina ou composição imunogênica por causa de sua habilidade para direcionar antígenos codificados para processamento pela via do complexo de histocompatibilidade principal classe I por infecção direta das células imunes, em particular células apresentadoras de antígeno, mas também em função de sua habilidade autoadjuvante.
[00446] Em algumas modalidades, ALVAC é usado como um vetor em uma vacina ou composição imunogênica contra doença. ALVAC é um vírus da varíola dos canários que pode ser modificado para expressar transgenes estranhos e tem sido usado como um método para vacinação contra antígenos tanto procarióticos quanto eucarióticos (Horig H., Lee D.S., Conkright W., e cols. Phase I Clinical Trial of a Recombinant Canarypoxvirus (ALVAC) Vaccine Expressing Human Carcinoembryonic Antigen and the B7.1 Co-Stimulatory Molecule. Cancer Immunol. Immunother. 2000; 49: 504-14; von Mehren M., Arlen P., Tsang K.Y., e cols. Pilot Study of a Dual Gene Recombinant Avipox Vaccine Containing Both Carcinoembryonic Antigen (CEA) and B7.1 Transgenes in Patients with Recurrent CEA-Expressing Adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 2000; 6: 2.219-28; Musey L., Ding Y.,
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Elizaga M., e cols. HIV-1 Vaccination Administered Intramuscularly Can Induce Both Systemic and Mucosal T Cell Immunity in HIV-l-Uninfected Individuals. J. Immunol. 2003; 171: 1.094-101; Paoletti E. Applications of Pox Virus Vectors Vaccination: an Update. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996; 93: 11.349-53; Patente U.S. N° 7.255.862). Em um experimento clinico de fase I, um virus ALVAC que expressa o antigeno tumoral CEA mostrou um perfil de segurança excelente e resultou em respostas de células T CEAespecificas aumentadas em pacientes selecionados; respostas clinicas objetivas, no entanto, não foram observadas (Marshall J.L., Hawkins M.J., Tsang K.Y., e cols. Phase I Study in Patients with Cancer of a Replication-Defective Avipox Recombinant Vaccine that Expresses Human Carcinoembryonic Antigen. J. Clin. Oncol. 1999; 17: 332-7).
[00447] Em algumas modalidades, um virus da Vaccinia Ankara Modificado (MVA) pode ser usado como um vetor viral para uma vacina ou composição imunogênica de antigeno. MVA é um membro da familia ortopoxvirus e foi gerado por cerca de 570 passagens seriais em fibroblastos de embrião de galinha da cepa Ankara do virus da vaccinia (CVA) (para uma revisão, veja Mayr, A., e cols., Infection 3, 6-14, 1975) . Em consequência dessas passagens, o virus MVA resultante contém 31 quilobases menos informação genômica comparado com CVA, e é altamente restrito em termos de célula hospedeira (Meyer, H. e cols., J. Gen. Virol. 72, 1.031-1.038, 1991). MVA é caracterizado por sua atenuação extrema, especificamente, por uma virulência ou habilidade infecciosa diminuída, mas ainda mantém uma imunogenicidade excelente. Quando testado em diversos modelos animais, MVA provou ser
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256/345 avirulento, até mesmo em indivíduos imunossuprimidos. Além disso, MVA-BN®-HER2 é uma imunoterapia candidata projetada para o tratamento de câncer de mama HER-2-positivo e está atualmente em experimentos clínicos (Mandi e cols., Cancer Immunol. Immunother. Janeiro de 2012; 61 (1) : 19-29) . Métodos para a fabricação e uso de MVA recombinante foram descritos (por exemplo, veja as Patentes U.S. Nos 8.309.098 e 5.185.146, incorporadas nesse relatório descritivo em sua totalidade).
[00448] Em algumas modalidades, partículas virais recombinantes da vacina ou composição imunogênica são administradas aos pacientes necessitados.
[00449] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição, que compreende o fornecimento de uma população de células derivadas de um indivíduo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento e caracterização dos complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade; e, opcionalmente desenvolvimento de uma terapêutica com base na caracterização.
[00450] É fornecido nesse relatório descritivo um método
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257/345 de identificação de pelo menos um antigeno imunogênico específico do indivíduo e preparação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo que inclui o (pelo menos um) antigeno imunogênico específico do indivíduo, em que o indivíduo possui uma doença e o (pelo menos um) antigeno imunogênico específico do indivíduo é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo, o referido método compreendendo: o fornecimento de uma população de células derivadas de um indivíduo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células do indivíduo, de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento para complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade das (uma ou mais) células; identificação de um peptídeo imunogênico dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos que é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo; e formulação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo com base em um ou mais dos peptideos imunogênicos específicos para o indivíduo identificados.
[00451] Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica específica para o indivíduo compreende um peptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor
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258/345 por afinidade enriquecidos ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos.
[00452] Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica específica para o indivíduo compreende uma célula T que expressa um receptor de célula T (TCR) que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, a composição imunogênica específica para o indivíduo compreende uma célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR) que expressa um receptor que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de outro agente terapêutico, opcionalmente, um inibidor do ponto de verificação imune ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de um adjuvante, opcionalmente, poli-ICLC, ao indivíduo.
[00453] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é câncer. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é uma infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, um vírus, bactéria ou um parasita. Em algumas modalidades, o vírus é selecionado do grupo que consiste em: vírus BK (BKV), vírus da Dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovírus (CMV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus,
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259/345 vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um vírus influenza, RSV, HPV, raiva, vírus da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, vírus da varicela, papilomavírus humano (HPV), varíola, zoster, e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e combinações destas. Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp., e qualquer combinação destes.
[00454] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição, que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica pelo menos dois alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica os (pelo menos dois) HLAs classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreende a primeira sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um primeiro alelo HLA classe I ou classe II ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um primeiro peptideo com aceptor por afinidade; e
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260/345 uma segunda sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um segundo alelo HLA classe I ou classe II ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade; expressão dos (pelo menos dois) HLAs marcados com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e identificação de um peptideo dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos; e formulação de uma composição imunogênica com base em um ou mais dos peptídeos identificados, em que o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II recombinantes são compatíveis com um haplótipo de HLA de um indivíduo.
[00455] Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma doença ou condição. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é diferente do segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o primeiro peptideo com aceptor por afinidade é o mesmo que o segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um peptideo ligado ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45
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261/345 ou 50 alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um dominio transmembrana. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um dominio intracelular. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são excretados. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptideos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptideos alelo HLA-especificos. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptideos exógenos à população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptideos exógenos ou a expressão dos (um ou mais) peptideos exógenos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos exógenos. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA. Em algumas modalidades, o enriquecimento não
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262/345 compreende o uso de um reagente tetramérico. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação da sequência de um peptideo ou uma porção desta ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LC-MS/MS, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptideo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento.
[00456] Em algumas modalidades, o método compreende a determinação de se um peptideo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de associações de peptideos com moléculas HLA no primeiro e/ou no segundo complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00457] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos
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263/345 associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer ou uma infecção com um agente infeccioso.
[00458] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo, opcionalmente em que os peptídeos são de uma ou mais proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptídeos das (uma ou mais) proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo derivados de um agente infeccioso.
[00459] Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias.
[00460] Em algumas modalidades, o peptideo do primeiro e/ou do segundo complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um indivíduo quando apresentado por uma célula apresentadora de antígeno. Em algumas modalidades, o método compreende a comparação de complexos HLA-peptídeo de células doentes com complexos HLA-peptídeo de células não doentes.
[00461] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptídeos do primeiro e/ou do segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por
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264/345 afinidade antes da identificação.
[00462] Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I.
[00463] Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II.
[00464] Em algumas modalidades, a sequência que codifica
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265/345 os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um segundo alelo HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica os (pelo menos dois) alelos HLA classe
I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLADP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe II e o segundo alelo HLA classe I ou classe
II recombinante é um segundo alelo HLA classe II.
[00465] Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão, cada uma, ligadas operacionalmente. Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão compreendidas em moléculas de polinucleotideos diferentes.
[00466] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, a
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266/345 sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II.
[00467] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II por um vinculador.
[00468] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam o primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento.
[00469] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos
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267/345 de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de marcação que compreende um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1,
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Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[00470] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície
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269/345 sólida é uma partícula.
[00471] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminal-N do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II.
[00472] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
[00473] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe
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II recombinante é uma primeira cadeia-α de HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é uma segunda cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica β2microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[00474] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II e/ou uma cadeia-β de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA da classe II está conectada à sequência que codifica a cadeiaβ de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que
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271/345 codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II ou a cadeia-α de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o terceiro peptideo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[00475] Em algumas modalidades, o terceiro peptideo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptideo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta
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272/345 de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteina de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteina C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteina carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteina fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00476] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sitio de salto ribossomal ou um elemento de sitio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas
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273/345 modalidades, o sitio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sitio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00477] Em algumas modalidades, o método compreende a realização de análise bioquímica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem.
[00478] Em algumas modalidades, o método compreende a obtenção de uma sequência de peptideos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptideos isolados dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptideos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptideos.
[00479] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO e THP1.
[00480] Em algumas modalidades, a linhagem de célula é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, ou uma combinação destes.
[00481] Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células
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274/345 tumorais.
[00482] Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento do primeiro e/ou segundo complexos HLA-peptideo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o agente é uma citocina inflamatória, um agente químico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[00483] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo alelo HLA é um alelo HLA mutado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA que codifica o primeiro e/ou segundo RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da primeira e/ou segunda proteína do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência de código de barras única. Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência compreendem uma sequência de código de barras única.
EXEMPLOS [00484] Os exemplos fornecidos abaixo são apenas para fins ilustrativos e não limitam o escopo das reivindicações fornecidas nesse relatório descritivo.
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EXEMPLO 1. Fluxo de IP Universal: Plataforma de Identificação universal de complexo HLA-peptideo de alelo único [00485] As construções de imunopurificação universal (IP) reveladas nesse relatório descritivo consistem em uma construção de DNA que codifica alelos HLA classe I ou classe II marcados por afinidade que são expressos por um vetor de expressão de mamífero por meio de transfecção ou transdução celular (FIGURA 1A e FIGURA 1B). Construções exemplares não limitantes de HLA classe I e classe II são mostradas na FIGURA 2. Marcadores por afinidade exemplares não limitantes incluem o peptideo aceptor de biotina (BAP) ou sequência de peptideos de hemaglutinina da influenza humana (HA) . Os marcadores por afinidade podem ser colocados no terminal-N ou no terminal-C do alelo HLA. Uma sequência de divagem, por exemplo, F2A, mostrada na FIGURA 2, ou um sítio interno de entrada de ribossomos (IRES) pode ser colocado entre a cadeia-α e p2-microglobulina (classe I) ou entre a cadeia-a e cadeia-β (classe II) . Vetores exemplares não limitantes incluem um vetor lentiviral como mostrado na FIGURA 3. Genes de resistência a anticorpo, por exemplo, resistência à puromicina (Puro), são incorporados nas construções para permitir a seleção após transfecção ou transdução. Células transfectadas ou transduzidas com construções de IP Universal são expandidas (FIGURA 4A) ou selecionada e depois expandidas (FIGURA 4B) antes de análises por LC-MS/MS. Representações esquemáticas da plataforma de imunopurificação universal para HLA classe I e classe II são mostradas na FIGURA 5.
EXEMPLO 2. Cultura de células e imunopurificação e
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276/345 sequenciamento de peptideo HLA [00486] Células HLA monoalélicas foram geradas por transdução de células B721.221, A375, JEG-3, K562, Jurkat ou HEK293T, HeLa ou expi293 com um vetor retroviral que codifica um único alelo HLA classe I (por exemplo, HLA-A*02:01, HLAA*23:01 e HLA-B*14:02 ou HLA-E*01:01) ou alelo HLA classe II (por exemplo, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 e HLA-DRB*11:01 ou HLA-DRB*15:01 ou HLA-DRB*07:01), como descrito previamente (Reche e cols., 2006). Os tipos de linhagens de células HLA classe I ou II foram confirmados por tipagem molecular padronizada. As células foram cultivadas e a imunopurificação de peptideo HLA foi realizada.
[00487] A prova de conceito da transdução de alelos HLA classe I (FIGURA 6C) em células HEK293T é mostrada nas FIGURAS 6A—6C. Transduções simuladas, de GFP e plasmideo vazio com construções HLA-A*02:01 para imunopurificação universal baseada em biotinilação foram realizadas e a biotinilação foi confirmada em um Western blot (FIGURA 6A). Um gel corado com Ponceau foi usado como um controle de carregamento para a análise Western blot (FIGURA 6B) . A transfecção e a otimização da biotinilação de alelos HLA classe I e classe II-BAP (FIGURA 7C) expressos por células HEK293T são mostradas nas FIGURAS 7A—7C. Um experimento de evolução temporal da biotinilação mostrou que a biotinilação de HLA-BAP marcado no terminal-C e -N estava completa em 10 minutos para ambas as células que expressam HLA classe I e classe II-BAP (FIGURA 7A e FIGURA 7B).
[00488] O fluxo de IP Universal atualmente revelado foi testado em vários tipos de células (FIGURAS 8A-8D). As construções de IP Universal para HLA tanto classe I quanto
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277/345 classe II foram transfectadas em células HEK293T (rim embrionário humano) (FIGURA 8A) , HeLa (câncer cervical humano) (FIGURA 8B), A375 (melanoma maligno humano) (FIGURA 8C) e Expi293 (rim embrionário humano modificado geneticamente para cultura e expressão de proteína em alta densidade) (FIGURA 8D). Western blots foram realizados usando anti-estreptavidina para marcador de BAP e anti-HA para marcador de HA, e um gel corado com Ponceau foi usado como um controle de carregamento para os Western blots. Os Western blots confirmaram as expressões de construções tanto de classe I quanto de classe II em todos os tipos de células testadas (FIGURAS 8A-8D).
[00489] A seguir, serão descritos materiais e métodos usados nesse Exemplo.
IP Universal de alelos HLA Classe I e Classe II (Biotina) [00490] As células foram transfectadas ou transduzidas para expressar construções de IP Universal após métodos padronizados. Após transdução, as células são ressuspensas no meio e transferidas para tubos de Falcon e 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 1.500 rpm por 5 minutos e o meio foi removido. As células foram então ressuspensas em 1,5 ml de PBS gelado e transferidas para um tubo de Eppendorf 1,5 ml. Os tubos foram então centrifugados (550 x g a 4°C) por 5 minutos. O PBS foi removido e as células foram então ressuspensas em 1,2 ml de tampão de lise. As células foram ressuspensas no tampão, seguido pela adição de benzonase. Os tubos foram incubados no gelo com misturação ocasional. Após 15 minutos de incubação no gelo, os tubos foram centrifugados (15.000 x g a 4°C) por 20 minutos. Os sobrenadantes (500 μΐ) foram transferidos para outro tubo de 1,5 ml (pré-lavado)
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278/345 para biotinilação. A biotinilação de lisados celulares foi obtida por adição de biotina, ATP e BirA a cada amostra. A amostra foi então incubada em temperatura ambiente por 10 minutos e depois colocada no gelo antes da imunoprecipitação.
[00491] A imunoprecipitação com partículas de NeutrAvidin ou de estreptavidina foi realizada por adição de lama de resina de agarose pré-lavada de estreptavidina ou NeutrAvidin ao lisado biotinilado. A amostra é então colocada em uma prateleira de tubos, e incubada por 30 minutos a 4°C. Após a incubação de 30 minutos, as partículas são peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) e o sobrenadante é removido e descartado. As partículas foram então ressuspensas em 1 ml de tampão de lavagem. As partículas foram então peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) e o tampão de lavagem foi removido e descartado. Essa etapa foi repetida para gerar um total de quatro lavagens em tampão de lavagem. As partículas peletizadas foram ressuspensas em 1 ml de tampão Tris, peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C), e o tampão Tris foi removido. Essa etapa foi repetida para gerar um total de quatro lavagens em tampão Tris. Uma lavagem final foi realizada em água de grau de MS por ressuspensão de partículas em 1 ml de água de grau de Espectrometria de Massa e centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) para peletizar as partículas. O sobrenadante foi removido e as partículas foram armazenadas a -80°C ou imediatamente submetidas à eluição de HLA-peptídeo e dessalinização.
IP Universal serial de alelos HLA classe II (etiquetagem com HA e Biotina) [00492] As células foram transfectadas ou transduzidas
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279/345 para expressar construções de IP Universal após protocolos padronizados. Após transdução, as células são ressuspensas no meio e transferidas para tubos de Falcon de 50 ml. Os tubos foram centrifugados a 1.500 rpm por 5 min e o meio foi removido. As células foram então ressuspensas em 1,5 ml de PBS gelado e transferidas para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos foram então centrifugados (550 x g a 4°C) por 5 minutos. O PBS foi removido e as células foram então ressuspensas em 1,2 ml de tampão de lise. As células foram ressuspensas no tampão, seguido pela adição de benzonase. Os tubos foram incubados no gelo com misturação ocasional. Após 15 minutos de incubação no gelo, os tubos foram centrifugados (15.000 x g a 4°C) por 20 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para outro tubo de 1,5 ml (pré-lavado) para biotinilação. A biotinilação de lisados celulares foi obtida por adição de biotina, ATP e BirA a cada amostra. A amostra foi então incubada em temperatura ambiente por 10 minutos e depois colocada no gelo antes da imunoprecipitação.
[00493] A imunoprecipitação de alelos classe II marcados com HA foi realizada por adição de resina de agarose prélavada de proteina G que foi pré-ligada com anticorpo antiHA. A amostra foi então incubada por 60 minutos a 4 °C em uma prateleira de tubos. Após a incubação de 60 min, as partículas são peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4 °C) e o sobrenadante foi removido e descartado. As partículas foram lavadas duas vezes com tampão de lise e ressuspensas em tampão de lise contendo peptideo de HA livre e incubadas por 15 minutos a 4°C em uma prateleira de tubos. As partículas foram então peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) e o sobrenadante foi transferido
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280/345 para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml contendo 200 μΐ de partículas pré-lavadas de agarose de NeutrAvidin ou estreptavidina. A amostra foi então colocada em uma prateleira de tubos, e incubada por 30 minutos a 4°C. Após a incubação de 30 min, as partículas são peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) e o sobrenadante foi removido e descartado. As partículas foram então ressuspensas em 1 ml de tampão de lavagem. As partículas foram então peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) e o tampão de lavagem foi removido e descartado. Essa etapa foi repetida para gerar um total de quatro lavagens em tampão de lavagem. As partículas peletizadas foram ressuspensas em 1 ml de tampão Tris, peletizadas por centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C), e o tampão de lavagem foi removido. Essa etapa foi repetida para gerar um total de quatro lavagens no tampão Tris. Uma lavagem final foi realizada em água de grau de MS por ressuspensão de partículas em 1 ml de água de grau de Espectrometria de Massa e centrifugação (1.500 x g, 1 min, 4°C) para peletizar as partículas. O sobrenadante foi removido e as partículas foram armazenadas a -80 °C ou imediatamente submetida à eluição de HLA-peptídeo e dessalinização.
Eluição e dessalinização de HLA-Peptideo [00494] Peptídeos foram eluídos de complexos HLA e dessalinizados em Empore C18 StageTips produzidos internamente (3M, 2315) (Rappsilber e cols., 2007) . O carregamento da amostra, lavagens e eluição foram efetuados em uma centrifuga de bancada em uma velocidade máxima de 1.500-3.000 x g. StageTips foram equilibrados com duas lavagens de metanol, duas lavagens de acetonitrila/ácido
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281/345 fórmico e duas lavagens de ácido fórmico. Em um tubo, as partículas secas de peptídeo associado ao IPs HLA foram descongeladas a 4 °C, reconstituídas em mistura de ACN/ácido fórmico, e carregadas em StageTips. As partículas foram lavadas com ácido fórmico, e os peptídeos foram adicionalmente eluídos usando rodadas de incubações de 5 minutos em ácido acético 10%. Os volumes combinados da lavagem e eluição foram combinados e carregados em StageTips. Os tubos contendo as partículas de IP foram lavadas novamente com ácido fórmico, e esse volume também foi carregado em StageTips. Os peptídeos foram lavados duas vezes em StageTips ou cartuchos de dessalinização com ácido fórmico. Os peptídeos foram eluídos usando um gradiente de etapa de misturas de ACN e ácido fórmico. As eluições em etapas foram combinadas e secas até o término.
EXEMPLO 3. Sequenciamento por LC-MS/MS de peptídeos associados à Classe I e Classe II HLA [00495] Todas as análises por LC-ESI-MS/MS nano empregaram as mesmas condições de separação por LC descritas abaixo. As amostras foram separadas cromatograficamente usando um Proxeon Easy Nano LC 1000 (Thermo Scientific, San Jose, CA) adaptado com um capilar PicoFrit de 7 5 pm de diâmetro interno com um emissor de 10 pm compactado sob pressão até aproximadamente 20 cm com partículas de Reprosil C18 (1,9 pm de tamanho de partícula, 200 Â de tamanho de poro, Dr. Maisch GmBH) e aquecidas a 50 °C durante a separação.
[00496] As amostras foram carregadas em mistura de CAN e ácido fórmico e os peptídeos foram eluídos com um gradiente linear de 7-30% de Tampão B (FA 0,1% ou AcOH 0,5% e ACN 80%
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282/345 ou 90%) ao longo de 82 min, Tampão B 30-90% 6 min e depois mantidas a 90% Tampão B por 15 min a 200 nl/min (Tampão A, FA 0,1% e ACN 3%) para gerar aproximadamente 13 (FA) larguras de pico see. Durante aquisição dependente de dados, os peptideos eluidos foram introduzidos em um espectrômetro de massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) equipado com uma fonte de nanoeletrospray a 2,2 kV. Uma MS de varredura completa foi adquirida em uma resolução de 30.000 de 300 a 1.800 m/z. Cada varredura completa foi seguida por varreduras superiores MS2 10 dados-dependente na resolução de 15.000, usando uma largura de isolamento de 0,7 m/ z .
[00497] Os números de peptideos associados ao HLA únicos totais identificados de vários tipos de células que expressam construções de HLA classe I e classe II com etiqueta de afinidade usadas no fluxo de IP Universal são mostrados na FIGURA 9A. O número de peptideos únicos da criação de perfil de peptideo HLA classe I monoalélico é mostrado na FIGURA 9B. O número de peptideos únicos da criação de perfil de peptideo HLA classe II monoalélico é mostrado na FIGURA 9C. A análise por LC-MS/MS de peptideos associados ao HLA revelou caracteristicas de peptideos associados ao HLA classe I e classe II (FIGURAS 10A e 10B) . Representações de logo de sequência de peptideos HLA-A*02:01 classe I-associados peptideos e HLA-DRp*ll:01 classe II-associados isolados e sequenciados são mostradas na FIGURA 10A. As comparações de distribuição de comprimento tanto de peptideos HLA-A*02:01 classe I-associados (vermelho) quanto de peptideos HLADRp*ll:01 classe II-associados (azul) mostraram que ambos os peptideos associados ao HLA classe I e classe II seguiram as
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283/345 tendências esperadas (FIGURA 10B).
[00498] Setenta alelos HLA classe I e 47 alelos HLA classe II foram testados quanto à abordagem monoalélica como descrita nesse relatório descritivo. Setenta alelos HLA classe I únicos com marcadores por afinidade (Tabela 1A) e 47 alelos HLA classe II com marcadores por afinidade únicos (Tabela 2A) foram gerados. A Tabela 1B mostra os detalhes de 96 experimentos únicos usando os 70 alelos HLA classe I únicos (em alguns casos, o mesmo alelo foi colocado em múltiplas linhagens de células). A Tabela 2B mostra os detalhes de 54 experimentos únicos realizados usando os 47 alelos HLA classe II únicos (em alguns casos, o mesmo alelo foi colocado em múltiplas linhagens de células).
Tabela 1A. Setenta alelos HLA Classe I únicos.
# Alelos Classe I únicos # Alelos Classe I únicos
1 A*0201 36 B*3802
2 A*0202 37 B*3901
3 A*0203 38 B*3906
4 A*0206 39 B*4001
5 A*0207 40 B*4002
6 A*1101 41 B*4006
7 A*2301 42 B*4101
8 A*2501 43 B*4201
9 A*2601 44 B*4501
10 A*3001 45 B*4601
11 A*3002 46 B*4801
12 A*3101 47 B*4901
13 A*3201 48 B*5001
14 A*3301 49 B*5201
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15 A*3303 50 B*5301
16 A*3402 51 B*5401
17 A*3601 52 B*5501
18 A*6801 53 B*5703
19 A*7401 54 B*5801
20 B*0702 55 B*5802
21 B*0801 56 B*8101
22 B*1302 57 C*0102
23 B*1401 58 C*0202
24 B*1402 59 C*0303
25 B*1501 60 C*0401
26 B*1502 61 C*0602
27 B*1503 62 C*0701
28 B*1509 63 C*0702
29 B*1510 64 C*0704
30 B*1801 65 C*1203
31 B*270502 66 C*1701
32 B*3502 67 C*1801
33 B*3503 68 F*0101
34 B*3701 69 G*0101
35 B*3801 70 E*0101
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Tabela IB. Bibliotecas e linhagens de células para alelos HLA classe I.
# Experimentos únicos
# Onda de biblioteca Alelo Classe I Linhagem celular # Onda de biblioteca Alelo Classe I Linhagem celular
1 W1 A0201 Hek2 93 49 W2 B4101 expi2 93
2 W1 A0201 HeLa 50 W2 B4201 expi2 93
3 W1 A0201 A375 51 W2 B4501 expi2 93
4 W1 A0201 expi2 93 52 W2 B4601 expi2 93
5 W1 A1101 expi2 93 53 W2 B4801 expi2 93
6 W1 A1101 HeLa 54 W2 B4901 expi2 93
7 W1 A2301 Hek2 93 55 W2 B5001 expi2 93
8 W1 A2301 A375 56 W2 B5201 expi2 93
9 W1 A2301 expi2 93 57 W2 B5301 expi2 93
10 W1 A2601 A375 58 W2 B5501 expi2 93
11 W1 A2601 HeLa 59 W2 B5501 A375
12 W1 A2601 expi2 93 60 W2 B5703 expi2 93
13 W1 A3201 A375 61 W2 B5801 expi2 93
14 W1 A3201 HeLa 62 W2 B5801 A375
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15 W1 A3201 expi2 93 63 W2 B5802 expi2 93
16 W1 A3601 expi2 93 64 W2 B8101 expi2 93
17 W1 B0702 expi2 93 65 W2 C0401 expi2 93
18 W1 B0702 HeLa 66 W2 C0401 A375
19 W1 B0801 expi2 93 67 W2 C0602 expi2 93
20 W1 B0801 HeLa 68 W2 C0602 A375
21 W1 B0801 A375 69 W2 C0701 expi2 93
22 W1 B1402 Hek2 93 70 W2 C0701 A375
23 W1 B1402 A375 71 W2 C0702 expi2 93
24 W1 B1402 expi2 93 72 W2 C0702 A375
25 W1 B1402 HeLa 73 W3 A3301 expi2 93
26 W1 B1501 expi2 93 74 W3 A0206 expi2 93
27 W1 B1509 HeLa 75 W3 A0202 expi2 93
28 W1 B1509 expi2 93 76 W3 A3402 expi2 93
29 W1 B1801 HeLa 77 W3 A0207 expi2 93
30 W1 B1801 expi2 93 78 W3 A0203 expi2 93
31 W1 B270502 HeLa 79 W3 B3502 expi2 93
32 W1 B270502 expi2 93 80 W3 B1401 expi2 93
33 W1 B4001 HeLa 81 W3 B3906 expi2 93
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34 W1 B4001 expi2 93 82 W3 B1510 expi2 93
35 W2 A2501 expi2 93 83 W3 B4006 expi2 93
36 W2 A3001 expi2 93 84 W3 B1502 expi2 93
37 W2 A3002 expi2 93 85 W3 B3802 expi2 93
38 W2 A3101 expi2 93 86 W3 B5401 expi2 93
39 W2 A3303 expi2 93 87 W3 C0303 expi2 93
40 W2 A6801 expi2 93 88 W3 C0202 expi2 93
41 W2 A7401 expi2 93 89 W3 C1203 expi2 93
42 W2 B1302 expi2 93 90 W3 C0102 expi2 93
43 W2 B1503 expi2 93 91 W3 C1701 expi2 93
44 W2 B3503 expi2 93 92 W3 C0704 expi2 93
45 W2 B3701 expi2 93 93 W3 C1801 expi2 93
46 W2 B3801 expi2 93 94 W2 E0101 expi2 93
47 W2 B3901 expi2 93 95 W3 F0101 expi2 93
48 W2 B4002 expi2 93 96 W3 G0101 expi2 93
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Tabela 2A. Quarenta e sete alelos HLA Classe II únicos.
# Alelos Classe II únicos # Alelos Classe II únicos
1 DPBl*0101 25 DRBl*0901
2 DPBl*0101 DPA*01:03 26 DRBl*1001
3 DPBl*0201 DPA*01:03 27 DRBl*1101
4 DPBl*0401 DPA*01:03 28 DRB1*11O2
5 DPBl*0402 DPA*01:03 29 DRB1*11O4
6 DQ2*B0201*A0501 30 DRB1*12O1
7 DQ2*B0202*A0201 31 DRB1*12O2
8 DQ6*B0602*A0102 32 DRB1*13O1
9 DQ6*Bl*0602 33 DRB1*13O2
10 DRBl*0101 34 DRB1*13O3
11 DRBl*0102 35 DRB1*14O1
12 DRBl*0301 36 DRB1*15O1
13 DRBl*0302 37 DRB1*15O2
14 DRBl*0401 38 DRB1*15O3
15 DRBl*0402 39 DRB1*16O1
16 DRBl*0403 40 DRB3*0101
17 DRBl*0404 41 DRB3*0202
18 DRBl*0405 42 DRB3*0301
19 DRBl*0407 43 DRB4*0103
20 DRBl*0701 44 DRB5*0101
21 DRBl*0801 45 HLA DM no marcador por afinidade
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22 DRBl*0802 46 HLA-DM com marcador por afinidade
23 DRBl*0803 47 HLA-DO
DRBl*0804
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Tabela 2B. Bibliotecas e linhagens de células para alelos HLA classe II.
# Experimentos únicos
# Onda de biblioteca Alelo Classe II Linhagem celular # Onda de biblioteca Alelo Classe II Linhagem celular
1 W1 DRBl_0101 Hek2 93 28 W2 DRB1_13O3 expi2 93
2 W1 DRBl_0101 expi2 93 29 W2 DRB1_14O1 expi2 93
3 W1 DRBl_0102 Hek2 93 30 W2 DRB1_15O2 expi2 93
4 W1 DRBl_0102 expi2 93 31 W2 DRB1_15O3 expi2 93
5 W1 DRBl_0701 Hek2 93 32 W2 DRB1_16O1 expi2 93
6 W1 DRBl_0701 expi2 93 33 W2 DRB4_0103 expi2 93
7 W1 DRBl_1101 Hek2 93 34 W2 DPBl_0101 expi2 93
8 W1 DRBl_1101 HeLa 35 W2 DPBl_0201 expi2 93
9 W1 DRBl_1101 A375 36 W2 DPBl_0401 expi2 93
10 W1 DRBl_1101 expi2 93 37 W2 DPBl_0402 expi2 93
11 W1 DRB1_15O1 Hek2 93 38 W2 DQ2_B0201_A0501 expi2 93
12 W1 DRB1_15O1 expi2 93 39 W2 DQ2_B0202_A0201 expi2 93
13 W2 DRBl_0301 expi2 93 40 W2 DQ6_B0602_A0102 expi2 93
14 W2 DRBl_0302 expi2 93 41 W2 HLA DM no etiqueta expi2 93
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15 W2 DRBl_0401 expi2 93 42 W3 DRBl*0402 expi2 93
16 W2 DRBl_0404 expi2 93 43 W3 DRBl*0403 expi2 93
17 W2 DRBl_0405 expi2 93 44 W3 DRB1*11O2 expi2 93
18 W2 DRBl_0407 expi2 93 45 W3 DRB1*12O2 expi2 93
19 W2 DRBl_0801 expi2 93 46 W3 DRBl*0803 expi2 93
20 W2 DRBl_0802 expi2 93 47 W3 DRB3*0101 expi2 93
21 W2 DRBl_0804 expi2 93 48 W3 DRB3*0202 expi2 93
22 W2 DRBl_0901 expi2 93 49 W3 DRB5*0101 expi2 93
23 W2 DRBl_1001 expi2 93 50 W3 DRB3*0301 expi2 93
24 W2 DRB1_11O4 expi2 93 51 W3 HLA-DO expi2 93
25 W2 DRB1_12O1 expi2 93 52 W3 DPB1 0101 expi2 93
26 W2 DRB1_13O1 expi2 93 53 W3 DQ6 BI 0602 expi2 93
27 W2 DRB1_13O2 expi2 93 54 W3 HLA-DM etiquetado expi2 93
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EXEMPLO 4. IP Universal em tandem de complexos de HLA Classe II com múltiplas etiquetas de afinidade [00500] Complexos de HLA Classe II são formados por pareamento da cadeia-α e cadeia-β, cada uma delas podendo ser etiquetada com um marcador por afinidade diferente. Um IP serial usando ambos os marcadores por afinidade permite a deconvolução de pareamento da cadeia-α e cadeia-β e alocações não ambíguas de ligação do peptideo aos complexos de HLA da classe II. A representação esquemática de construções de HLA da classe II modificadas geneticamente para expressão por tipos diferentes de células para fluxo de IP Universal é mostrada na FIGURA 11A. Representações esquemáticas dos possíveis complexos de HLA da classe II que podem se formar mediante expressão de construções da FIGURA 11A em linhagens de células que expressam subunidades endógenas da cadeia-α e cadeia-β de HLA da classe II são mostradas na FIGURA 11B.
[00501] Representações esquemáticas de uma estratégia de IP Universal serial que pode ser usada para deconvolução do pareamento da cadeia-α e cadeia-β e alocações não ambíguas de ligação de peptideo aos complexos de HLA da classe II específicos são retratadas na FIGURA 12A. Células que expressam construções de HLA da classe II marcado com afinidade dupla foram lisadas, biotiniladas e incubadas com partículas acopladas a anticorpos anti-HA. Complexos de HLA Classe II com subunidades marcadas com HA foram isoladas, lavadas e eluídas usando um peptideo de HA (YPYDVPDYA). A eluição foi então incubada com partículas acopladas a NeutrAvidin ou estreptavidina para isolar os complexos de HLA da classe II marcados com HA e marcados com biotina.
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Peptideos ligados aos complexos de HLA da classe II com marcação dupla são então eluidos e sequenciados por LC-MS/MS. Um Western blot e controle de carregamento (gel corado com Ponceau S) demonstrou a especificidade do fluxo de IP Universal serial. Um Western blot validou a estratégia de IP Universal serial em células HEK293T que expressam construções HLA-DRB*11:01 com marcação dupla (FIGURA 12B). Um anticorpo anti-HA foi usado para acompanhar o processo de enriquecimento serial. Um gel corado com Ponceau S foi usado como um controle de carregamento de Western blot. Um Western blot de um experimento de controle negativo no qual células que expressam a construção de HLA da classe II marcado com afinidade dupla HLA-DRB*11:01 foram lisadas e incubadas com partículas acopladas a anticorpos anti-HA sem biotinilação, é mostrado na FIGURA 12C. Como mostrado na FIGURA 12C, nenhum enriquecimento foi observado quando a etapa de biotinilação foi removida do protocolo de IP Universal serial.
EXEMPLO 5. Uma abordagem de criação de um perfil de peptidoma de HLA monoalélico que implementa uma etiqueta de afinidade de biotina.
[00502] Uma representação esquemática de uma abordagem de criação de perfil de peptidoma de HLA monoalélico que implementa um marcador por afinidade de biotina é mostrada na FIGURA 14A e FIGURA 14B. Uma modalidade exemplar da presente revelação se utiliza do peptídeo aceptor de biotina (BAP) que é biotinilado em um resíduo de lisina (K) por uma enzima BirA. A sequência de peptideos de BAP contém um resíduo de lisina que é biotinilado mediante a adição de enzima BirA, biotina e ATP. O produto biotinilado exibe alta afinidade por estreptavidina/NeutrAvidin. Partículas de
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294/345 estreptavidina/NeutrAvidin podem ser usadas para enriquecer para a sequência de peptideos de BAP biotinilada.
EXEMPLO 6. Plataforma de descoberta de epitopo direcionado [00503] Uma linhagem de célula de interesse (por exemplo, 2HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO ou THP1) ou células primárias (por exemplo, células de um individuo com uma doença ou condição) pode ser transfectada/transduzida com uma construção de HLA classe I ou II que contém uma etiqueta (por exemplo, sequência de BAP) no terminal-N ou -C com ou sem seleção para enriquecer para células que expressam HLA (FIGURA 15). As células podem então ser transfectadas ou transduzidas com um segundo plasmideo que contém um fragmento de epitopo ou uma cadeia de epitopos que podem ser expressos e apresentados na molécula HLA marcada com etiqueta. Alternativamente, tanto o plasmideo do alelo HLA quanto o plasmideo de epitopo podem ser liberados simultaneamente nas células, seguido por expansão e/ou seleção. Essas células modificadas geneticamente são então lisadas, biotiniladas, e a molécula HLA é enriquecida pelo lisado (por exemplo, usando particulas de estreptavidina). Os peptideos são eluidos da molécula HLA e analisados, por exemplo, por LC-MS/MS. Esse método permita a análise de como os epitopos são processados e apresentados por diferentes alelos. Esse método também pode ser utilizado para aprimorar a liberação e o design de epitopos.
EXEMPLO 7. Multiplexação de alelos [00504] Uma construção DNA pode ser projetada para expressar múltiplas cadeias pesadas da classe I ou múltiplas
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295/345 cadeias α ou β da classe II que contêm uma ou mais etiquetas (FIGURA 16). Cada construção de HLA pode ser expressa pela mesma construção gênica que inclui uma sequência de salto ribossomal (F2A, T2A, P2A etc.) ou um elemento de IRES. Uma linhagem de célula desejada pode ser transduzida ou transfectada com esse plasmideo para induzir expressão de múltiplos alelos HLA que são etiquetados e subsequentemente enriquecidos. Alternativamente, uma linhagem de célula pode ser transduzida ou transfectada com múltiplos plasmideos, cada um contendo um único alelo HLA. Os peptideos ligados aos alelos HLA podem então ser analisados, por exemplo, por LC-MS/MS. Essa plataforma permite a geração de linhagens de células com múltiplos alelos. Isso pode ser usado, por exemplo, para combinar com um tipo de HLA do paciente. Isso permitirá a geração de padrões de epitopo peptidico para diferentes combinações de alelos.
EXEMPLO 8. Previsão aprimorada de processamento e ligação especifica de alelo [00505] NetMHC é um método alelo-especifico que treina um previsor separado para cada conjunto de dados de ligação do alelo, e NetMHCpan é um método pan-alelos cujas entradas são codificações de vetor tanto de um peptideo quanto de uma subsequência de uma molécula MHC particular. O conhecimento convencional é que NetMHC tem melhor desempenho em alelos com muitos ligantes testados, enquanto NetMHCpan tem melhor desempenho para alelos menos bem caracterizados. No entanto, foi demonstrado que NetMHCpan não é preciso quando nenhum dado relevante era incluido nos conjuntos de treinamento.
[00506] A abordagem monoalélica como descrita nesse relatório descritivo (FIGURA 21) descobriu peptideos de
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296/345 ligação ao HLA que eram pobremente pontuados por NetMHCpan, mas bioquimicamente validados como aglutinantes fortes. A FIGURA 20A mostra peptideos de ligação ao HLA exemplares para alelos A*01:01, B*51:01, A*29:02 e B*54:01 descobertos com o uso da abordagem monoalélica atualmente descrita. A FIGURA 20B mostra as taxas de alocação incorretas em 100 deconvoluções simuladas. Um genótipo aleatório de seis alelos HLA do paciente (2 alelos cada de HLA-A, HLA-B e HLAC, amostragem em frequências de alelos nos EUA) foi gerado. Para cada alelo, 500 peptideos do experimento monoalélico relevantes foram amostrados e combinados com um conjunto de dados multialélicos simulado de 3.000 peptideos. Cada peptideo foi atribuído ao alelo que gera a melhor pontuação na classificação de NetMHCpan% para determinar a percentagem de peptideos incorretamente atribuídos por NetMHCpan. Esse processo foi repetido 100 vezes. Como mostrado na FIGURA 22, as previsões tanto de processamento quanto de ligação aleloespecífica foram significativamente aprimoradas.
Parágrafos da revelação [00507] É fornecido nesse relatório descritivo um método de caracterização de complexos HLA-peptídeo que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, em que a sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade compreende uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade; expressão do HLA marcado
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297/345 com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização dos complexos HLA-peptídeo. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade codificado é um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade solúvel.
[00508] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a caracterização de um peptideo ligado ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para dois ou mais alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas modalidades, os dois ou mais alelos HLA classe I e/ou classe II compreendem pelo
menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17,
18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 alelos HLA classe I
e/ou classe II . Em algumas modalidades, os complexos de
peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um domínio intracelular. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são secretados. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são
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298/345 complexos de peptídeos-HLA solúveis marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptídeos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLA-específicos. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe
I ou classe II recombinante é um alelo HLA classe I ou classe
II recombinante único.
[00509] Em algumas modalidades, o método compreende: o fornecimento de uma população de células, cada uma compreendendo uma ou mais células que compreendem um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um polipeptídeo recombinante diferente codificado por um alelo HLA diferente ligado operacionalmente a um peptídeo com aceptor por afinidade; enriquecimento para complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e caracterização de um peptídeo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento.
[00510] Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptídeos à população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptídeos ou a expressão dos (um ou mais) peptídeos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os
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299/345 (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptideos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA. Em algumas modalidades, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico.
[00511] Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação da sequência de um peptideo ou uma porção desta ligada ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento, opcionalmente determinação de se um peptideo ou uma porção deste está modificado. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LCMS/MS, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a determinação de se um peptideo ou uma porção deste ligada ao complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a avaliação de associações de peptideos com moléculas HLA nos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00512] Em algumas modalidades, o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma
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300/345 biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos derivados de um fármaco polipeptidico como, por exemplo, um biológico (por exemplo, um fármaco de anticorpo).
[00513] Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer, uma infecção com um agente infeccioso ou uma reação autoimune. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um fármaco polipeptidico como, por exemplo, um biológico (por exemplo, um fármaco de anticorpo) ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptideos dos complexos HLA-peptideo, opcionalmente em que os peptideos são de uma ou mais proteinas-alvo do agente infeccioso ou do fármaco polipeptidico. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptideos das (uma ou mais) proteinas-alvo do agente infeccioso ou do fármaco polipeptidico.
[00514] Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptideos dos complexos HLA-peptideo derivados de um agente infeccioso. Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas
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301/345 modalidades, a população de células é uma população de células primárias. Em algumas modalidades, o alelo HLA classe I ou classe II recombinante é compatível com um indivíduo com uma doença ou condição.
[00515] Em algumas modalidades, o peptideo do complexo de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um indivíduo quando apresentado por uma célula apresentadora de antígeno. Em algumas modalidades, a caracterização compreende a comparação de complexos HLA-peptídeo de células de câncer com complexos HLA-peptídeo de células não-câncer. Em algumas modalidades, a população de células compreende diversas populações de células, cada população de células expressando um alelo HLA classe I ou classe II recombinante diferente. Em algumas modalidades, cada população de células das diversas populações está em um mesmo recipiente ou em um recipiente separado.
[00516] Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptídeos dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da caracterização. Em algumas modalidades, um complexo HLA-peptídeo é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um complexo HLA-peptídeo com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado de meios de uma cultura de células. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Por exemplo, um HLA, por exemplo, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade, pode ser isolado usando uma partícula ou coluna
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302/345 que contém um anticorpo anti-HLA. Em algumas modalidades, os peptídeos são isolados usando anticorpos anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando um anticorpo anti-HLA. Em alguns casos, um HLA solúvel (sHLA) com ou sem um marcador por afinidade é isolado usando uma coluna que contém um anticorpo anti-HLA. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a remoção de um ou mais aminoácidos de um terminal de um peptídeo ligado a um complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00517] Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades,
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303/345 a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, cada sequência codifica pelo menos dois alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes.
[00518] Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, um ou
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304/345 mais dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um primeiro peptideo com aceptor por afinidade e um ou mais dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade diferente. Em algumas modalidades, cada um dos (pelo menos dois) alelos HLA classe I e/ou classe II diferentes está ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um marcador por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de pelo menos um segundo ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um alelo HLA recombinante diferente ligado operacionalmente ao mesmo peptideo com aceptor por afinidade ou a um peptideo com aceptor por afinidade diferente.
[00519] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado está localizado em um local extracelular do alelo HLA classe
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I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência interna da sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante, por exemplo, uma sequência da alça flexivel. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA classe I ou classe II recombinante por um vinculador. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que expressam os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com os complexos de peptideos-HLA
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306/345 marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao peptideo com aceptor por afinidade.
[00520] Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de marcação que compreende um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress,
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Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteina C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteina carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteina fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, etiqueta de sortase, uma etiqueta que forma uma ligação peptidica covalente a uma partícula, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00521] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com os complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade.
[00522] Em algumas modalidades, a molécula de afinidade compreende uma molécula que se liga à biotina. Por exemplo, a molécula de afinidade pode compreender estreptavidina, NeutrAvidin, incluindo homólogos de proteína de outros organismos e derivados destes.
[00523] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é
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308/345 anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida é uma partícula. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao peptideo com aceptor por afinidade.
[00524] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular do alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminalN do alelo HLA classe I ou classe II recombinante.
[00525] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
[00526] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em
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309/345 algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe I por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o HLA classe I ou classe II recombinante compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[00527] Em algumas modalidades, o segundo peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptídeo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptídeo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de
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310/345 policisteína, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do vírus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD) , etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR) , etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G,
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311/345 etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00528] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sítio de salto ribossomal ou um elemento de sítio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sítio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00529] Em algumas modalidades, a determinação compreende a realização de análise bioquímica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas modalidades, a determinação compreende a obtenção de uma sequência de peptídeos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptídeos isolados dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptídeos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptídeos. Em algumas modalidades, o banco de dados de peptídeos é um banco de dados de peptídeos de especificidade sem enzima, por exemplo, um banco de dados sem modificação ou um banco de dados com modificação. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a pesquisa do banco de dados de peptídeos usando uma estratégia de pesquisa
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312/345 reversa de banco de dados.
[00530] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula humana. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula de camundongo. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula CHO. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat e THP1. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos epigeneticamente ativos, IFN-γ, agentes que alteram o processamento de antígeno (por exemplo, inibidores de peptidase, inibidores de proteassoma e inibidores de TAP), ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam uma via metabólica ou um estado metabólico das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam o proteoma celular das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular (por exemplo, AIRE ou uma proteína de ligação ao CREB ou moduladores desta) das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam um fator de transcrição das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular de um HLA das células. Em algumas modalidades, a população de células é tratada com um ou mais
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313/345 reagentes que modulam ou regulam a expressão ou transcrição celular do proteoma das células.
[00531] Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendriticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células tumorais. Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento dos referidos complexos HLA-peptideo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o referido agente é uma citocina inflamatória, um agente químico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[00532] Em algumas modalidades, o alelo HLA é um alelo HLA mutado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da proteína do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a análise para expressão pode compreender um ensaio Western blot, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), espectrometria de massa (MS), um ensaio de hibridização de microarranjo, um ensaio RNA-seq, um ensaio de reação em cadeia de polimerase,
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314/345 um ensaio LAMP, um ensaio de reação em cadeia de ligase, um ensaio Southern blot, um ensaio Northern blot ou um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
[00533] Em algumas modalidades, o método compreende a realização das etapas do método para diferentes alelos HLA. Em algumas modalidades, cada alelo HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única. Em algumas modalidades, cada ácido polinucléico que codifica um alelo HLA diferente compreende uma sequência de código de barras única.
[00534] É fornecido nesse relatório descritivo um banco de dados de sequências de peptídeo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma combinação de dois ou mais bancos de dados de sequências de peptídeo de ligação específica ao alelo HLA obtidas por realização de um método descrito nesse relatório descritivo repetidamente, cada vez usando um alelo HLA diferente. É fornecido nesse relatório descritivo um método para a geração de um algoritmo de previsão para identificação de peptídeos de ligação alelo HLA-específicos, que compreende o treinamento de uma máquina com um banco de dados de sequências de peptídeos descrito nesse relatório descritivo ou uma combinação descrita nesse relatório descritivo.
[00535] Em algumas modalidades, a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e redes neurais. Em algumas modalidades, uma variável usada para treinar a máquina compreende uma ou mais variáveis selecionadas do grupo que consiste em sequência de peptídeos, propriedades físicas do aminoácido, propriedades
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315/345 físicas do peptídeo, nível de expressão da proteína-fonte de um peptídeo dentro de uma célula, estabilidade da proteína, taxa de tradução de proteína, sítios de ubiquitinação, taxa de degradação de proteína, eficiências de tradução a partir do perfil ribossomal, capacidade de divagem de proteína, localização da proteína, motivos da proteína hospedeira que facilitam o transporte de TAP, proteína hospedeira ser submetida à autofagia, motivos que favorecem estagnação ribossômica, e características da proteína que favorecem NMD .
[00536] Em algumas modalidades, os motivos que favorecem estagnação ribossômica compreendem trechos de poliprolina ou polilisina. Em algumas modalidades, as características da proteína que favorecem NMD são selecionadas do grupo que consiste em uma UTR-3' longa, um códon de parada maior do que 50nt a montante da última junção éxon:éxon e capacidade de divagem de peptídeo.
[00537] É fornecido nesse relatório descritivo um método para identificação de peptideos de ligação alelo HLAespecíficos, que compreende a análise da sequência de um peptídeo com uma máquina que foi treinada com um banco de dados de sequências de peptideos obtido por realização de um método descrito nesse relatório descritivo para o alelo HLA. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação do nível de expressão da proteína-fonte do peptídeo dentro de uma célula; e em que a expressão da proteína-fonte é uma variável preditiva usada pela máquina. Em algumas modalidades, o nível de expressão é determinado por medição da quantidade de proteína-fonte ou da quantidade de RNA que codifica a referida proteína-fonte.
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316/345 [00538] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma codificando um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência que codifica uma cadeiaα do alelo HLA classe I recombinante diferente, uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, uma sequência que codifica p2-microglobulina; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c) , estão ligadas operacionalmente.
[00539] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende um ácido polinucléico recombinante que compreende duas ou mais sequências, cada uma compreendendo uma sequência que codifica um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que as sequências que codificam os HLAs marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência que codifica uma cadeia-α do alelo HLA classe II recombinante, uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade e, opcionalmente, uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II; em que as sequências de (a) e (b) e, opcionalmente, (c) , estão ligadas operacionalmente. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico recombinante é isolado. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLAA, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP.
[00540] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptídeo com aceptor por afinidade está ligada
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317/345 operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a molécula de aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o alelo HLA recombinante. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o alelo HLA recombinante por um vinculador.
[00541] Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas pelo mesmo polinucleotideo. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade são expressas por polinucleotideos diferentes. Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado se liga especificamente a uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem dois ou mais peptideos com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, as (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que pelo menos
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318/345 duas das três ou mais sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade compreendem o mesmo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, os dois ou mais peptideos com aceptor por afinidade são únicos para cada uma das (duas ou mais) sequências que codificam um HLA marcado com aceptor por afinidade.
[00542] Em algumas modalidades, o peptideo com aceptor por afinidade codificado é selecionado do grupo que consiste em peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteina de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta
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319/345 de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00543] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo específico para o peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade se liga especificamente a uma molécula de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptídeo aceptor de afinidade não interage especificamente com uma sequência de aminoácidos do HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, para dois ou mais dos ácidos polinucleicos recombinantes: a sequência que codifica o HLA marcado com aceptor por afinidade está integrada estavelmente no genoma de uma célula. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina ou a sequência
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320/345 que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende uma etiqueta de HA. Em algumas modalidades, a sequência que codifica β2microglobulina ou a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica o HLA recombinante e o peptideo com aceptor por afinidade por um vinculador.
[00544] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sitio de salto ribossomal ou um elemento de sitio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sitio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sitio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00545] É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende duas ou mais moléculas de polipeptideo isoladas codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreende duas ou mais moléculas de polipeptideo codificadas pelo ácido polinucléico de uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que
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321/345 compreende uma composição descrita nesse relatório descritivo. É fornecida nesse relatório descritivo uma composição que compreende uma população de células que compreende uma ou mais células que compreendem uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[00546] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA classe I ou classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é modificada geneticamente para não possuir um ou mais alelos HLA classe I endógenos e um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a composição é formulada usando peptídeos ou ácidos polinucleicos que codificam peptídeos específicos para um tipo de HLA de um paciente. É fornecido nesse relatório descritivo um método de produção de uma célula, que compreende a transdução ou transfecção de duas ou mais células com os dois ou mais ácidos polinucleicos de uma composição descrita nesse relatório descritivo.
[00547] É fornecido nesse relatório descritivo um
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322/345 peptideo identificado de acordo com um método descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta antitumoral em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a célula apresenta o peptideo como um complexo HLA-peptideo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração
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323/345 ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para indução de uma resposta imune em um mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo.
[00548] Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta imune de célula T. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de célula T CD8. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta de células T CD4. Em algumas modalidades, a resposta imune é resposta imune humoral.
[00549] É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um peptídeo que compreende a sequência de um peptídeo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido
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324/345 nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método para o tratamento de um mamífero que possui uma doença, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma célula que compreende um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a doença é câncer. Em algumas modalidades, a doença é infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, opcionalmente um vírus ou bactéria, ou um parasita.
[00550] Em algumas modalidades, o vírus é selecionado do grupo que consiste em: vírus BK (BKV), vírus da Dengue (DENV1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovírus (CMV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um vírus influenza, RSV, HPV, raiva, vírus da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, vírus da varicela, papilomavírus humano (HPV), varíola, zoster, e qualquer combinação destes.
[00551] Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico,
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325/345 meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e qualquer combinação destas.
[00552] Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp., e qualquer combinação destes.
[00553] É fornecido nesse relatório descritivo um método de enriquecimento para peptideos imunogênicos, que compreende: o fornecimento de uma população de células que compreende uma ou mais células que expressam um HLA marcado com aceptor por afinidade, em que o HLA marcado com aceptor por afinidade compreende um peptídeo com aceptor por afinidade ligado operacionalmente a um HLA recombinante codificado por um alelo HLA recombinante; e enriquecimento para complexos HLA-peptideo que compreendem o HLA marcado com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a determinação da sequência de peptideos imunogênicos isolados dos complexos HLA-peptideo. Em algumas modalidades, a determinação compreende a utilização de LCMS/MS.
[00554] É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptídeo descrito nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um
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indivíduo, o método compreendendo a administração ao
indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptideo que
compreende a sequência de um peptideo descrita nesse
relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um
indivíduo, o método compreendendo a administração ao
indivíduo de uma quantidade eficaz de uma célula que
compreende um peptideo que compreende a sequência de um
peptideo descrita nesse relatório descritivo. É fornecido nesse relatório descritivo um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula que compreende uma quantidade eficaz de um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica um peptideo que compreende a sequência de um peptideo descrita nesse relatório descritivo.
[00555] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição, que compreende o fornecimento de uma população de células derivadas de um indivíduo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento e caracterização dos complexos de peptídeos
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HLA marcados com aceptor por afinidade; e, opcionalmente, desenvolvimento de uma terapêutica com base na caracterização.
[00556] É fornecido nesse relatório descritivo um método de identificação de pelo menos um antígeno imunogênico específico do indivíduo e preparação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo que inclui o (pelo menos um) antígeno imunogênico específico do indivíduo, em que o indivíduo possui uma doença e o (pelo menos um) antígeno imunogênico específico do indivíduo é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo, o referido método compreendendo: o fornecimento de uma população de células derivadas de um indivíduo com uma doença ou condição, expressão em uma ou mais células da população de células do indivíduo, de um alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade por introdução nas (uma ou mais) células de um ácido polinucléico que codifica uma sequência que compreende: uma sequência que codifica um alelo HLA classe I ou classe II recombinante ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um peptídeo com aceptor por afinidade formando, dessa forma, complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade nas (uma ou mais) células; enriquecimento para complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade das (uma ou mais) células; identificação de um peptídeo imunogênico dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos que é específico para o indivíduo e para a doença do indivíduo; e formulação de uma composição imunogênica específica para o indivíduo com base em um ou mais dos peptídeos imunogênicos específicos para o indivíduo
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328/345 identificados .
[00557] Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica específica para o indivíduo compreende um peptideo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, a composição terapêutica ou imunogênica específica para o indivíduo compreende uma célula T que expressa um receptor de célula T (TCR) que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeosHLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos. Em algumas modalidades, a composição imunogênica específica para o indivíduo compreende uma célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR) que expressa um receptor que se liga especificamente ao polipeptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos.
[00558] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de outro agente terapêutico, opcionalmente, um inibidor do ponto de verificação imune ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a administração de um adjuvante, opcionalmente, poli-ICLC, ao indivíduo.
[00559] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é câncer. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é uma infecção por um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o agente infeccioso é um patógeno, um vírus,
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329/345 bactéria ou um parasita.
[00560] Em algumas modalidades, o vírus é selecionado do grupo que consiste em: vírus BK (BKV), vírus da Dengue (DENV1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovírus (CMV), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus de Epstein-Barr (EBV), um adenovirus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus linfotrópico de célula T humana (HTLV-1), um vírus influenza, RSV, HPV, raiva, vírus da caxumba - rubéola, poliovirus, febre amarela, hepatite A, hepatite B, Rotavirus, vírus da varicela, papilomavírus humano (HPV), varíola, zoster, e qualquer combinação destes.
[00561] Em algumas modalidades, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em: Klebsiella spp., Tropheryma whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, e Mycobacterium tuberculosis, tifóide, pneumocócico, meningocócico, Haemophilus B, antraz, toxóide tetânico, grupo meningocócico B, BCG, cólera, e combinações destas.
[00562] Em algumas modalidades, o parasita é um helminto ou um protozoário. Em algumas modalidades, o parasita é selecionado do grupo que consiste em: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp., e qualquer combinação destes.
[00563] É fornecido nesse relatório descritivo um método de desenvolvimento de uma terapêutica para um indivíduo com uma doença ou condição, que compreende: o fornecimento de uma população de células, em que uma ou mais células da população de células compreendem um ácido polinucléico que compreende uma sequência que codifica pelo menos dois alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade,
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330/345 em que a sequência que codifica os (pelo menos dois) HLAs classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreende a primeira sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um primeiro alelo HLA classe I ou classe II ligada operacionalmente a uma sequência que codifica um primeiro peptídeo com aceptor por afinidade; e uma segunda sequência recombinante que compreende uma sequência que codifica um segundo alelo HLA classe I ou classe II ligado operacionalmente a uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade; expressão dos (pelo menos dois) HLAs marcados com aceptor por afinidade em pelo menos uma célula das (uma ou mais) células da população de células formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade na (pelo menos uma) célula; enriquecimento para os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e identificação de um peptídeo dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos; e formulação de uma composição imunogênica com base em um ou mais dos peptídeos identificados, em que o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II recombinantes são compatíveis com um haplótipo de HLA de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo possui uma doença ou condição.
[00564] Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é diferente do segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo com aceptor por afinidade é o mesmo que o segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização
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331/345 de um peptideo ligado ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por
afinidade compreendem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45
ou 50 alelos HLA classe I e/ou classe II. Em algumas
modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de
peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um dominio transmembrana. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade compreendem um dominio intracelular. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são excretados. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma membrana celular quando expressos. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos de peptideos-HLA não solúveis marcados com aceptor por afinidade.
[00565] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a geração de um banco de dados de peptideos alelo HLAespecificos. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução de um ou mais peptideos exógenos à população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com os (um ou mais) peptideos exógenos ou a expressão dos (um ou mais) peptideos exógenos na população de células. Em algumas modalidades, a introdução compreende o contato da população de células com um ou mais
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332/345 ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos exógenos.
[00566] Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em DNA. Em algumas modalidades, os (um ou mais) ácidos nucleicos que codificam os (um ou mais) peptídeos consistem em RNA, opcionalmente em que o RNA é mRNA.
[00567] Em algumas modalidades, o enriquecimento não compreende o uso de um reagente tetramérico. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação da sequência de um peptideo ou uma porção desta ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, a determinação compreende análise bioquímica, análise por espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LC-MS/MS, ou uma combinação destas.
[00568] Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou estabilidade de um peptideo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método compreende a determinação de se um peptideo ou uma porção deste ligada ao primeiro e/ou ao segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade do enriquecimento contém uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, o método compreende a avaliação de associações de peptídeos com moléculas HLA no primeiro e/ou no segundo complexo de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00569] Em algumas modalidades, o método compreende a
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333/345 expressão de uma biblioteca de peptideos na população de células formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da população de células com uma biblioteca de peptideos ou uma biblioteca de sequências que codificam peptideos formando, dessa forma, uma biblioteca de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende uma biblioteca de peptideos associados a uma doença ou condição.
[00570] Em algumas modalidades, a doença ou condição é câncer ou uma infecção com um agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a introdução do agente infeccioso ou porções deste em uma ou mais células da população de células. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de um ou mais peptideos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo, opcionalmente em que os peptideos são de uma ou mais proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a caracterização de uma ou mais regiões dos peptideos das (uma ou mais) proteínas-alvo do agente infeccioso. Em algumas modalidades, o método compreende a identificação de peptideos do primeiro e/ou do segundo complexos HLA-peptídeo derivados de um agente infeccioso.
[00571] Em algumas modalidades, a população de células é de uma amostra biológica de um indivíduo com uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células primárias. Em algumas modalidades, o peptideo do primeiro e/ou do segundo complexo
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334/345 de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade é capaz de ativar uma célula T de um individuo quando apresentado por uma célula apresentadora de antigeno. Em algumas modalidades, o método compreende a comparação de complexos HLA-peptideo de células doentes com complexos HLA-peptideo de células não doentes. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento de peptideos do primeiro e/ou do segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade antes da identificação. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células com baixa expressão na superfície celular de HLA classe I ou classe II.
[00572] Em algumas modalidades, a população de células expressa um ou mais alelos HLA endógenos. Em algumas modalidades, a população de células expressa os alelos HLA endógenos normalmente expressos pela população de células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células modificadas geneticamente desprovidas de alelos HLA classe I endógenos e alelos HLA classe II endógenos. Em algumas modalidades, a
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335/345 população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de um ou mais alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe I. Em algumas modalidades, a população de células é um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a população de células é um knockout de todos os alelos HLA classe I e um knock-out de todos os alelos HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe I. Em algumas modalidades, o HLA classe I é selecionado do grupo que consiste em HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um segundo alelo HLA classe I. Em algumas modalidades, a sequência que codifica os (pelo menos dois) alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade codifica um HLA classe II. Em algumas modalidades, o HLA classe II é selecionado do grupo que consiste em HLADR, HLA-DQ e HLA-DP. Em algumas modalidades, o HLA classe II compreende uma cadeia-α de HLA classe II, uma cadeia-β de HLA classe II, ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um primeiro alelo HLA classe II e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é um segundo alelo HLA classe II.
[00573] Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão, cada uma, ligadas operacionalmente.
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Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência estão compreendidas em moléculas de polinucleotideos diferentes. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso extracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-N da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade codificado é expresso intracelularmente. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente ao terminal-C da sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II por um vinculador.
[00574] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o enriquecimento para células intactas que
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337/345 expressam o primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o método não compreende a lise das células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a lise das (uma ou mais) células antes do enriquecimento. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptideo com aceptor por afinidade.
[00575] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende uma sequência de marcação que compreende um peptideo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de poli-histidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptideo de proteina 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptideo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteina de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP), etiqueta de virus da lingua azul (B-tag) , etiqueta de peptideo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de dominio de ligação à colina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de dominio de ligação à celulose
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338/345 (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteina de ligação à galactose (GBP), proteina de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteina C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteina carreadora de biotinacarbóxi (BCCP), etiqueta de proteina fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP) , HaloTag, Nus-tag, Tioredoxina-tag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, ou uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00576] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é biotina ou um anticorpo especifico para o primeiro e/ou segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade com o primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade, em que a molécula de afinidade se liga especificamente à molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de
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339/345 afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
[00577] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a molécula de afinidade é anexada a uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a superfície sólida é uma partícula.
[00578] Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende a imunoprecipitação do primeiro e/ou segundo complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade com uma molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade que se liga especificamente ao primeiro e/ou ao segundo peptideo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao peptideo aceptor de afinidade não interage especificamente com a sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II codificado. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção extracelular do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade específica para uma porção do terminal-N do primeiro e/ou do segundo alelo HLA classe I ou classe II.
[00579] Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células com o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o contato compreende transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o fornecimento compreende o contato da população de células
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340/345 com um vetor que compreende o ácido polinucléico. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o ácido polinucléico está integrado estavelmente no genoma da população de células.
[00580] Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe I. Em algumas modalidades, o primeiro alelo HLA classe I ou classe II recombinante é uma primeira cadeia-α de HLA classe I e o segundo alelo HLA classe I ou classe II recombinante é uma segunda cadeia-α de HLA classe I.
[00581] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica p2-microglobulina nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada à sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica p2-microglobulina está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptídeo com aceptor por afinidade.
[00582] Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II e/ou uma cadeia-β de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende
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341/345 uma sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA classe II. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-β de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-α de HLA classe II e uma segunda cadeia-α de HLA classe II HLA está conectada à sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo HLA classe I ou classe II compreende uma sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II.
[00583] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a expressão de uma sequência que codifica uma cadeia-α de HLA classe II nas (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira cadeia-β de HLA classe II e uma segunda cadeia-β de HLA classe II está conectada à sequência que codifica a cadeia-α de HLA classe II por um vinculador. Em algumas modalidades, a sequência que codifica a cadeia-β de HLA classe II ou a cadeia-α de HLA classe II está conectada a uma sequência que codifica um terceiro peptídeo com aceptor por afinidade. Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro e/ou segundo peptídeo com aceptor por afinidade.
[00584] Em algumas modalidades, o terceiro peptídeo com aceptor por afinidade é diferente do primeiro peptídeo com aceptor por afinidade e é selecionado do grupo que consiste em peptídeo aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de poli-histidina-glicina, etiqueta de
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342/345 poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteina, polifenilalanina, etiqueta de c-myc, etiqueta de glicoproteina D do virus do Herpes simples (gD), etiqueta de FLAG, etiqueta de epitopo KT3, etiqueta de epitopo de tubulina, etiqueta de peptídeo de proteína 10 do gene T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta de peptídeo de ligação à estreptavidina (SPB), Strep-tag, Strep-tag II, etiqueta de proteína de ligação à albumina (ABP), etiqueta de fosfatase alcalina (AP) , etiqueta de vírus da língua azul (B-tag) , etiqueta de peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferase (CAT), etiqueta de domínio de ligação à colina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à quitina (CBD), etiqueta de domínio de ligação à celulose (CBP), etiqueta de diidrofolato redutase (DHFR), etiqueta de proteína de ligação à galactose (GBP), proteína de ligação à maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), etiqueta de Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina de influenza humana (HA), etiqueta de peroxidase de raiz-forte (HRP), NE-tag, etiqueta de HSV, etiqueta de cetosteróide isomerase (KSI), etiqueta de KT3, etiqueta de LacZ, etiqueta de luciferase, etiqueta de NusA, etiqueta de domínio PDZ, Avilag, Calmodulina-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, Softag 1, Softag 3, etiqueta de TC, VSV-tag, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de Proteína C, Sl-tag, S-tag, etiqueta de proteína carreadora de biotina-carbóxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de pequeno modificador ubiquitina-like (SUMO), etiqueta de purificação por afinidade em tandem (TAP), HaloTag, Nus-tag, Tioredoxinatag, Fc-tag, etiqueta de CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de
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TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta de epitopo de VSV-G, etiqueta V5, e uma combinação destes; opcionalmente, em que o primeiro ou segundo peptideo com aceptor por afinidade compreende duas ou mais repetições de uma sequência de marcação.
[00585] Em algumas modalidades, o vinculador compreende uma sequência de ácidos polinucleicos que codifica um vinculador clivável. Em algumas modalidades, o vinculador clivável é um sitio de salto ribossomal ou um elemento de sitio de entrada interno ribossomal (IRES). Em algumas modalidades, o sitio de salto ribossomal ou IRES é clivado quando expresso nas células. Em algumas modalidades, o sitio de salto ribossomal é selecionado do grupo que consiste em F2A, T2A, P2A e E2A. Em algumas modalidades, o elemento de IRES é selecionado de sequências de IRES celular comum ou viral.
[00586] Em algumas modalidades, o método compreende a realização de análise bioquimica ou espectrometria de massa como, por exemplo, espectrometria de massa em tandem. Em algumas modalidades, o método compreende a obtenção de uma sequência de peptideos que corresponde a um espectro de MS/MS de um ou mais peptideos isolados dos complexos de peptideosHLA marcados com aceptor por afinidade enriquecidos de um banco de dados de peptideos; em que uma ou mais sequências obtidas identificam a sequência dos (um ou mais) peptideos.
[00587] Em algumas modalidades, a população de células é uma linhagem de célula selecionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat e THP1. Em algumas modalidades, a linhagem de célula é tratada com uma ou mais citocinas, inibidores do ponto de verificação, fármacos
Petição 870190134748, de 16/12/2019, pág. 350/376
344/345 epigeneticamente ativos, IFN-γ, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a população de células compreende pelo menos 105 células, pelo menos 106 células ou pelo menos 107 células. Em algumas modalidades, a população de células é uma população de células dendríticas, macrófagos, células de câncer ou células B. Em algumas modalidades, a população de células compreende células tumorais.
[00588] Em algumas modalidades, a população de células é colocada em contato com um agente antes do isolamento do primeiro e/ou segundo complexos HLA-peptídeo das (uma ou mais) células. Em algumas modalidades, o agente é uma citocina inflamatória, um agente químico, um adjuvante, um agente terapêutico ou radiação.
[00589] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou segundo alelo HLA é um alelo HLA mutado. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o primeiro e/ou segundo alelo HLA compreende uma sequência de código de barras. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a análise para a expressão do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade.
[00590] Em algumas modalidades, a análise compreende o sequenciamento do primeiro e/ou segundo alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção do RNA que codifica o primeiro e/ou segundo RNA do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, detecção da primeira e/ou segunda proteína do alelo HLA classe I ou classe II marcado com aceptor por afinidade, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo alelos HLA classe I ou classe II marcados com aceptor por afinidade compreendem uma sequência de código de
Petição 870190134748, de 16/12/2019, pág. 351/376
345/345 barras única. Em algumas modalidades, a primeira sequência e a segunda sequência compreendem uma sequência de código de barras única.

Claims (76)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método caracterizado por compreender:
    (a) expressão de uma proteína HLA marcada com aceptor por afinidade em células, em que a proteína HLA marcada com aceptor por afinidade compreende uma sequência codificada por um alelo HLA expresso por um indivíduo, em que a proteína HLA marcada com aceptor por afinidade é codificada por um ácido polinucléico recombinante que compreende:
    (i) uma sequência que codifica o alelo HLA expresso por um indivíduo ligada a (ii) uma sequência que codifica um peptideo com aceptor por afinidade, formando, dessa forma, complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade;
    (b) identificação de um peptideo ou complexo alelo HLAespecífico dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade; e (c) (i) desenvolvimento de um produto terapêutico baseado em uma ou mais sequências de um peptideo ou complexo alelo HLA-específico identificado ou (ii) geração de um banco de dados de peptideos alelo HLA-específicos que compreende uma ou mais sequências de um peptideo ou complexo alelo HLAespecí fico identificado.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende o desenvolvimento de um produto terapêutico baseado em uma ou mais sequências do peptideo ou complexo alelo HLA-específico identificado.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o produto terapêutico é
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 30/45
    2/14 específico para um indivíduo.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o produto terapêutico é específico para uma doença.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o produto terapêutico compreende (a) um ou mais peptideos que compreendem as (uma ou mais) sequências, (b) um polinucleotideo que codifica os (um ou mais) peptideos, (c) uma ou mais APCs que compreendem os (um ou mais) peptideos, (d) um receptor de célula T (TCR) específico para uma HLA em complexo com os (um ou mais) peptideos, (e) uma célula que compreende um TCR ou um receptor de célula T quimérico (CAR) específico para uma HLA em complexo com os (um ou mais) peptideos.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a administração do produto terapêutico a um indivíduo com uma doença.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos (um ou mais) peptideos do produto terapêutico é do mesmo comprimento ou mais longo do que um peptideo alelo HLA-específico correspondente identificado.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a administração de um adjuvante ao indivíduo.
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 31/45
    3/14
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a formulação de um produto terapêutico específico para um indivíduo que expressa o alelo HLA com base em uma ou mais sequências do peptideo ou complexo alelo HLA-específico identificado.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são processados e apresentados endogenamente pelas células.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os peptídeos dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade são peptídeos endógenos.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido polinucléico recombinante compreende uma primeira sequência que codifica uma primeira HLA marcada com aceptor por afinidade e uma segunda sequência que codifica uma segunda HLA marcada com aceptor por afinidade, em que a primeira sequência compreende:
    (a) uma sequência de um primeiro alelo HLA que codifica uma primeira HLA ligada a (b) uma sequência que codifica um primeiro peptideo com aceptor por afinidade;
    em que a segunda sequência compreende:
    (c) uma sequência de um segundo alelo HLA que codifica
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 32/45
    4/14 uma segunda HLA ligada a (d) uma sequência que codifica um segundo peptídeo com aceptor por afinidade;
    em que o primeiro alelo HLA e o segundo alelo HLA são HLAs diferentes
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a identificação de uma sequência de um peptídeo alelo HLAespecífico.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a identificação de um peptídeo alelo HLA-específico que se liga ao alelo HLA expresso por um indivíduo.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a determinação de um nível de expressão de uma proteína-fonte de um peptídeo ou complexo alelo HLA-específico dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão é determinado por medição de uma quantidade da proteína-fonte ou uma quantidade de RNA que codifica a proteína-fonte.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a caracterização de um peptídeo ou complexo alelo HLAespecífico dos complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a realização de uma análise bioquímica, análise por
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 33/45
    5/14 espectrometria de massa, análise por MS, análise por MS/MS, análise por LC-MS/MS, ou uma combinação destas.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a avaliação de uma afinidade de ligação ou uma estabilidade de uma sequência de um peptídeo ligada a um complexo de peptídeos-HLA marcado com aceptor por afinidade.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a determinação de se uma sequência de um peptídeo ligada ao complexo de peptídeos-HLA marcado com aceptor por afinidade contém uma mutação.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a avaliação de associações de peptídeos com moléculas HLA no complexo de peptídeos-HLA marcado com aceptor por afinidade.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a realização de espectrometria de massa.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a realização de espectrometria de massa em tandem.
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a comparação de um espectro de MS/MS de um peptídeo alelo HLAespecífico com um banco de dados de peptídeos que compreende diversos espectros de MS/MS de peptídeos isolados de complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 1,
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 34/45
    6/14 caracterizado pelo fato de que a identificação compreende a identificação de complexos de alelo HLA-específicos capazes de ativação de uma célula T de um indivíduo.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células expressam proteínas HLA endógenas codificadas por alelos HLA normalmente expressos pelas células.
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células primárias.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que as células são de um indivíduo com uma doença.
  30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são uma linhagem de célula.
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que as células são células modificadas geneticamente desprovidas de um ou mais alelos HLA classe I endógenos ou um ou mais alelos HLA classe II endógenos.
  32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são células apresentadoras de antígeno (APCs).
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade não são excretados.
  34. 34. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os complexos de peptídeos-HLA marcados com aceptor por afinidade se incorporam em uma
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 35/45
    7/14 membrana celular quando expressos.
  35. 35. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade são complexos solúveis de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  36. 36. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende o isolamento de peptideos dos complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende o isolamento de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade ou células que expressam complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende o enriquecimento de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento compreende a imunoprecipitação de complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade.
  40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de ligação especifica para o peptideo com aceptor por afinidade com as células.
  41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o peptideo com aceptor por afinidade é BAP (Proteina Aceptora de Biotina).
  42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 41,
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 36/45
    8/14 caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação especifica para o peptideo com aceptor por afinidade é biotina ou um anticorpo especifico para o peptideo com aceptor por afinidade.
  43. 43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento compreende o contato de uma molécula de afinidade especifica para a molécula de ligação especifica para o peptideo com aceptor por afinidade.
  44. 44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a molécula de afinidade é estreptavidina, NeutrAvidin, ou um derivado destas.
  45. 45. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento compreende o enriquecimento de células intactas que expressam complexos de peptideos-HLA marcados com aceptor por afinidade pelas células.
  46. 46. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o método compreende a lise das células antes do enriquecimento.
  47. 47. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a expressão de uma biblioteca de peptideos nas células.
  48. 48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de peptideos compreende uma biblioteca de peptideos associados com uma doença.
  49. 49. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a comparação de complexos HLA-peptideo de células doentes com
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    9/14 complexos HLA-peptídeo de células não doentes.
  50. 50. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende a geração de um banco de dados de peptídeos alelo HLA-específicos que compreende uma ou mais sequências de um peptídeo ou complexo alelo HLA-específico identificado.
  51. 51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende o treinamento de uma máquina com o banco de dados de peptídeos alelo HLA-específicos.
  52. 52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a geração de um algoritmo de previsão para identificação de peptídeos de ligação alelo HLA-específicos.
  53. 53. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a máquina combina um ou mais modelos lineares, máquinas de vetor de suporte, árvores de decisão e redes neurais.
  54. 54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que uma variável usada para treinar a máquina compreende uma ou mais variáveis selecionadas do grupo que consiste em sequência de peptídeos, propriedades físicas do aminoácido, propriedades físicas do peptídeo, nível de expressão da proteína-fonte de um peptídeo dentro de uma célula, estabilidade da proteína, taxa de tradução de proteína, sítios de ubiquitinação, taxa de degradação de proteína, eficiências de tradução a partir do perfil ribossômico, capacidade de divagem de proteína, localização da proteína, motivos da proteína hospedeira que facilitam o transporte de TAP, proteína hospedeira ser
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 38/45
    10/14 submetida à autofagia, motivos que favorecem estagnação ribossômica, e características da proteina que favorecem a degradação mediada por códon não-senso (NMD).
  55. 55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que os motivos que favorecem estagnação ribossômica compreendem trechos de poliprolina ou polilisina.
  56. 56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as características da proteina que favorecem NMD são selecionadas do grupo que consiste em uma UTR-3' longa, um códon de parada maior do que 50 ácidos nucleicos a montante de uma última junção éxon:éxon e capacidade de divagem de peptideo.
  57. 57. Método para identificação de peptideos de ligação alelo HLA-especificos, caracterizado por compreender a análise de uma sequência de um peptideo com uma máquina, em que a máquina foi treinada com um banco de dados de peptideos alelo HLA-especificos gerado de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 50.
  58. 58. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e um ou mais peptideos que compreendem uma ou mais sequências de um peptideo alelo HLA-especifico identificadas de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1.
  59. 59. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e um polinucleotideo que codifica um ou mais peptideos que compreendem uma ou mais sequências de um peptideo alelo HLAespecifico identificadas de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1.
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 39/45
    11/14
  60. 60. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e uma ou mais células apresentadoras de antígeno (APCs) que compreendem um ou mais peptídeos que compreendem uma ou mais sequências de um peptideo alelo HLA-específico identificadas de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1 .
  61. 61. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e um receptor de célula T (TCR) específico para (i) um complexo HLA-peptídeo que compreende ou mais peptídeos que compreendem uma ou mais sequências de um peptideo alelo HLAespecífico identificadas de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1, ou (ii) um complexo alelo HLAespecífico identificado de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1.
  62. 62. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um carreador farmaceuticamente aceitável e uma célula que compreende um TCR específico para (i) um complexo HLA-peptídeo que compreende ou mais peptídeos que compreendem uma ou mais sequências de um peptideo alelo HLAespecífico identificadas de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1, ou (ii) um complexo alelo HLAespecífico identificado de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1.
  63. 63. Banco de dados de sequências de peptideo de ligação específica ao alelo HLA caracterizado por compreender informação de sequências de peptídeos de um peptideo ou complexo alelo HLA-específico identificado de acordo com o método, conforme definido na reivindicação 1.
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 40/45
    12/14
  64. 64. Composição caracterizada por compreender um ácido polinucléico recombinante que compreende uma primeira sequência que codifica uma primeira HLA marcada com aceptor por afinidade e uma segunda sequência que codifica uma segunda HLA marcada com aceptor por afinidade, em que a primeira sequência compreende:
    (a) uma sequência de um primeiro alelo HLA que codifica uma primeira HLA ligada a (b) uma sequência que codifica um primeiro peptideo com aceptor por afinidade;
    em que a segunda sequência compreende:
    (c) uma sequência de um segundo alelo HLA que codifica uma segunda HLA ligada a (d) uma sequência que codifica um segundo peptideo com aceptor por afinidade;
    em que o primeiro alelo HLA e o segundo alelo HLA são alelos HLA diferentes.
  65. 65. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que o peptideo com aceptor por afinidade é BAP (Peptideo Aceptor de Biotina).
  66. 66. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que o primeiro peptideo com aceptor por afinidade é o mesmo que o segundo peptideo com aceptor por afinidade.
  67. 67. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que o primeiro peptideo com aceptor por afinidade é único para a primeira HLA e o segundo peptideo com aceptor por afinidade é único para a segunda HLA.
  68. 68. Composição, de acordo com a reivindicação 64,
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 41/45
    13/14 caracterizada pelo fato de que a primeira sequência e a segunda sequência estão compreendidas em moléculas de ácido polinucleico recombinante diferentes.
  69. 69. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência e a segunda sequência estão compreendidas na mesma molécula de ácido polinucleico.
  70. 70. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção extracelular da primeira sequência.
  71. 71. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a uma sequência que codifica uma porção intracelular da primeira sequência.
  72. 72. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a um terminal-N da primeira sequência.
  73. 73. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a sequência que codifica o primeiro peptideo com aceptor por afinidade está ligada operacionalmente a um terminal-C da primeira sequência.
  74. 74. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência codifica uma primeira sequência de código de barras única e a segunda sequência codifica uma segunda sequência de código de barras única.
    Petição 870190077683, de 12/08/2019, pág. 42/45
    14/14
  75. 75. Composição, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a primeira sequência compreende uma primeira sequência de código de barras única e a segunda sequência compreende uma segunda sequência de código de barras única.
  76. 76. Célula caracterizada por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 64.
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