BR112019015721A2 - Inibidores de tiol isomerases e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

é aqui divulgado um método para administrar a um doente necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto inibidor da tiol isomerase extracelular para tratar ou prevenir uma doença ou condição influenciada pela atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares (por exemplo, dissulfureto isomerase de proteína, erp5, erp57, erp72 e tioredoxina). a doença ou condição inclui trombose arterial, trombose venosa, uma doença trombica, um câncer, uma doença infecciosa, uma doença viral, uma desordem imunológica, inflamação, uma doença neurológica e uma desordem neurodegenerativa.

Description

INIBIDORES DE TIOL ISOMERASES E USO DOS MESMOS

ANTECEDENTES:

[0001] As tiol isomerases são membros de uma grande família de dissulfeto oxidoredutases, que catalisa a troca de dissulfeto pós-traducional para a dobragem adequada de proteínas recentemente sintetizadas. Aproximadamente vinte membros de uma grande família de tiol isomerase/dissulfeto oxidoredutases existem em seres humanos com uma composição de domínio de tiol isomerases é a-b-b'-a'. Essas tiol isomerases são geralmente capazes de reações de oxidação e redução e isomerização e são frequentemente encontradas no retículo endoplásmico em que as mesmas catalisam o dobramento adequado de proteínas recentemente traduzidas.

[0002] Adicionalmente, algumas tiol isomerases como proteína dissulfeto isomerase (PDI), ERp5, ERp57, ERp72 e tiorredoxina (TRX) foram recentemente descobertas para realizar funções extracelulares. Essas cinco tiol isomerases, daqui em diante referidas como tiol isomerases extracelulares, são secretadas pelas células como plaquetas e refixadas à membrana plasmática, em que as mesmas funcionam como oxidoredutases extracelulares. As tiol isomerases extracelulares também foram identificadas na superfície de células endoteliais e para desempenhar um papel na ativação de formação de trombo e formação de fibrina, assim como na agregação de plaqueta, secreção de grânulo, aglutinação de fibrinogênio e mobilização de cálcio. Dessas enzimas, o papel da PDI na formação de trombo é muito bem estudado e entendido, enquanto ERp5, ERp57 e ERp72 também são conhecidos como necessários.

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2/37 [0003] As ferramentas para investigar tiol isomerases são principalmente compreendidas de anticorpos que têm limitações. Permanece uma necessidade na técnica por produtos farmacêuticos, incluindo pequenas moléculas, direcionados contra essas tiol isomerases que ofereceríam uma abordagem inovadora para a teoria antitrombótica.

[0004] Al ém disso, os membros da família PDI são aumentados em produção em muitos tipos de câncer distintos, incluindo ovariano, de próstata, pulmão, melanoma, linfoma e glioma, embora a inibição de PDI é citotóxica em linhagens de células de câncer ovariano. Considera-se que essas enzimas tenham envolvimento polifuncional na oncogênese do câncer, em que as mesmas desempenham papéis na ativação do oncogene, evitação de apoptose, secreção de proteína A relacionada a classe I complexa de maior histocompatibilidade (MICA), e na resistência a agentes quimioterápicos.

[0005] Permanece adicionalmente uma necessidade na técnica por produtos farmacêuticos, incluindo pequenas moléculas, direcionadas contra esses tiol isomerases para tratar câncer e outros processos associados a doença em que as tiol isomerases extracelulares são implicadas.

[0006] Também há uma necessidade na técnica pelo desenvolvimento de produtos farmacêuticos para alvejar tiol isomerases extracelulares, tanto seletiva quanto amplamente, para prevenir e tratar o desenvolvimento ou progressão de doenças e afecções que envolvem tiol isomerases extracelulares.

SUMÁRIO:

[0007] É revelado no presente documento um método que

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3/37 compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto inibidor de tiol isomerase extracelular para tratar ou prevenir uma doença ou afecção influenciada pela atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é zafirlucaste, montelucaste, CGP-13501, CGP-7930, alossetrona, balsalazida, benserazida, butaclamol, levadopa, mesalazina, oxcarbazepina, um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, e/ou uma forma de estado sólido dos mesmos.

[0008] Em uma outra modalidade, um método para prevenir ou tratar trombose, uma doença trombótica, aqreqação de plaqueta, geração de fibrina, ou uma combinação dos mesmos em um paciente compreende administrar ao paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de zafirlucaste.

[0009] Em ainda outra modalidade, um método para inibir uma tiol isomerase das tiol isomerases extracelulares em uma célula compreende colocar a célula em contato com uma quantidade eficaz de zafirlucaste, montelucaste, CGP-13501, CGP-7930, alossetrona, balsalazida, benserazida, butaclamol, leva-dopa, mesalazina, oxcarbazepina, um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, e/ou uma forma de estado sólido dos mesmos.

[0010] Os recursos descritos acima e outros recursos são exemplificados pelas Fiquras a sequir e descrição detalhada.

[0011] Em qeral, a revelação pode compreender alternativamente, consistir ou consistir essencialmente em,

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4/37 quaisquer componentes adequados revelados no presente documento. A revelação pode ser adicional ou alternativamente formulada de modo a ser desprovida, ou substancialmente livre, de quaisquer componentes, materiais, ingredientes, adjuvantes ou espécies usados nas composições da técnica anterior ou que são, de outro modo, desnecessárias para a obtenção da função e/ou dos objetivos da presente revelação.

DESENHOS:

[0012] Com referência agora às Figuras, que são modalidades exemplificativas e não devem ser consideradas limitantes:

[0013] A Figura 1 ilustra dados na inibição de várias tiol isomerases por zafirlucaste em um ensaio enzimático ín vi tro;

[0014] A Figura 2 ilustra dados na inibição de várias tiol isomerases por montelucaste em um ensaio enzimático ín vi tro;

[0015] A Figura 3 ilustra dados na inibição de ERp57 por outros inibidores em várias concentrações em um ensaio enzimático in vitro;

[0016] A Figura 4 ilustra dados na inibição de agregação de plaqueta estimulada por colágeno por zafirlucaste;

[0017] A Figura 5 ilustra a intensidade de fluorescência máxima de trombos formada em camundongos na presença de zafirlucaste (quadrados) ou veículo (círculos); e [0018] A Figura 6 mostra os efeitos de zafirlucaste no momento do sangramento que foram avaliados pelo ensaio de sangramento de cauda.

DESCRIÇÃO DETALHADA:

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5/37 [0019] São reveladas no presente documento tiol isomerase inibidores e seu uso terapêutico na prevenção ou tratamento do desenvolvimento ou progressão de uma doença ou afecção que envolve uma ou mais das tiol isomerases extracelulares.

[0020] Em uma modalidade, um método de inibição de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares em um paciente em necessidade do mesmo para o tratamento ou prevenção de uma doença ou afecção influenciada pela atividade de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares, ou para inibir um processo influenciado pela atividade de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares, o método compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição inibidora de tiol isomerases extracelulares que compreende um composto inibidor de tiol isomerase extracelular conforme revelado no presente documento. Em determinadas modalidades, a doença ou afecção é trombose, uma doença trombótica, uma doença infecciosa que inclui virus da imunodeficiência humana (HIV), um câncer, inflamação, ou uma combinação dos mesmos, conforme revelado no presente documento.

Tiol isomerases extracelulares [0021] Conforme usado no presente documento, a tiol isomerase extracelular inclui pelo menos proteína dissulfeto isomerase (PDI), tiorredoxina (TRX), e as seguintes proteínas residentes em retículo endoplásmico: ERp5, ERp57, e ERp72.

[0022] PDI é uma proteína de 508 aminoácidos que tem um papel importante na ativação de plaqueta. A liberação de PDI das plaquetas ativadas foi demonstrada quase duas

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6/37 décadas atrás e confirmada em muitos estudos subsequentes e também liberadas pelas células endoteliais. Os anticorpos direcionados em PDI e concentrações micromolares da agregação, adesão e secreção de plaqueta de inibição de bacitracina antibiótica. A inibição de PDI foi mostrada para inibir o crescimento de célula do câncer e induzir a necrose tumoral em um modelo de câncer ovariano.

[0023] ERp5 é uma proteína de 440 aminoácidos que contém dois domínios de tiorredoxina (motivos que contêm CGHC) e compartilha uma identidade de sequência de 47 % com PDI. ERp5 de superfície celular de bloqueio resulta na agregação de plaqueta, aglutinação de fibrinogênio e secreção de grânulo alfa diminuídas. Além de seu papel na hemostase, altos níveis de expressão de ERp5 foram mostrados para se correlacionar com a prevenção de uma resposta antitumoral eficaz em linfomas de Hodgkin e foram propostos como um biomarcador para a progressão do câncer de próstata e de mama.

[0024] ERp57 é uma tiol isomerase que consiste em 505 aminoácidos e desempenha papéis importantes na regulação de ativação de plaqueta inicial e também suporta a formação de trombo arterial, afetando a agregação de plaqueta, secreção de grânulo densa, aglutinação de fibrinogênio, mobilização de cálcio e formação de trombo sob condições de fluxo sanguíneo arterial. Além de seu papel na formação de trombo, ERp57 também foi mostrado como necessário para o dobramento adequado de hemaglutinina da influenza e implicado na progressão de doença da doença de Alzheimer e metástase de câncer.

[0025] ERp72 é uma proteína ER solúvel em 645

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7/37 aminoácidos que compartilha 37 % de homologia de sequência com PDI. ERp72 tem três domínios de CGHC catalítico em comparação com os dois encontrados em PDI, ERp5 e ERp57. 0 aumento percentual de ERp72 recrutado para a superfície de plaquetas após a ativação é maior que aquele de PDI, ERp5 e ERp57, sugerindo que o mesmo realiza um papel atualmente desconhecido embora importante na ativação de plaqueta. 0 efeito de inibição de ERp72 na formação de trombo é semelhantemente desconhecido. Além de sua relocalização para a superfície da plaqueta ativada, ERp72 foi implicado no processo infecioso de poliomavírus e também na sinalização de redox de NADPH oxidase (Nox) 1.

[0026] Em uma modalidade, o alvo para inibição é uma ou mais tiol isomerases das tiol isomerases extracelulares, incluindo proteína dissulfeto isomerase (PDI), tiorredoxina (TRX), ERp5, ERp57, e ERp72. Em uma modalidade, o alvo para inibição é PDI. Em uma modalidade, o alvo para inibição é tiorredoxina (TRX). Em uma modalidade, o alvo para inibição é ERp5. Em uma modalidade, o alvo para inibição é ERp57. Em uma modalidade, o alvo para inibição é ERp72.

[0027] 0 termo paciente, conforme usado no presente documento, é um animal humano ou não humano que precisa de tratamento médico. 0 tratamento médico pode incluir o tratamento de uma afecção existente, como uma doença ou um distúrbio, tratamento profilático ou preventivo, ou tratamento diagnóstico. Em algumas modalidades o paciente é um paciente humano.

[0028] 0 termo fornecer, conforme usado no presente documento, significa dar, administrar, vender, distribuir, transferir (com lucros ou não), fabricar, compor ou

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8/37 dispensar .

[0029] O termo fornecer um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo com pelo menos um agente terapêutico adicional, conforme usado no presente documento, significa um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e o agente ativo (ou agentes ativos) adicional são fornecidos simultaneamente em uma forma farmacêutica única, fornecida concomitantemente em formas farmacêuticas separadas, ou fornecidas formas farmacêuticas separadas para administração separada por alguma quantidade de tempo que está dentro do tempo em que tanto o composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo quanto o pelo menos um agente ativo adicional estão dentro da corrente sanguínea de um paciente. 0 composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e o agente ativo adicional não precisam ser prescritos para um paciente pelo mesmo trabalhador de cuidados médicos. 0 agente ou agentes ativos adicionais não precisam de uma prescrição. A administração do composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou o pelo menos um agente ativo adicional pode ocorrer por meio de qualquer rota adequada, por exemplo, comprimidos orais, cápsulas orais, líquidos orais, inalação, injeção, supositórios ou contato tópico.

[0030] 0 termo tratamento, conforme usado no presente documento, inclui fornecer um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável

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9/37 do mesmo, seja como o único agente ativo ou juntamente com pelo menos um agente ativo adicional suficiente para: (a) prevenir que ocorra uma doença ou afecção ou um sintoma de uma doença ou afecção em um paciente que pode ser predisposto à doença ou afecção, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibir a doença ou afecção, isto é, atrasar seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença ou afecção, isto é, causar a regressão da doença ou afecção. Tratar e tratamento também significam fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como o único agente ativo ou juntamente com pelo menos um agente ativo adicional para um paciente que sofre de uma doença ou afecção influenciada pela atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares. Uma doença ou afecção influenciada pela atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares significa que a uma ou mais tiol isomerase extracelular está implicada na doença ou afecção.

[0031] 0 composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou composições farmacêuticas/combinações reveladas no presente documento são úteis para tratar pacientes. 0 composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou composições farmacêuticas/combinações são úteis para tratar ou prevenir doenças e distúrbios em que a atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares estão envolvidas. Em determinadas modalidades o paciente é afligido com trombose ou tem risco de desenvolver uma trombose. Em determinadas modalidades o paciente é afligindo com câncer. Em determinadas modalidades, a doença

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10/37 é câncer hematológico, câncer associado a HPV, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer gástrico, câncer de mama ou câncer colorretal. Em outras modalidades, o paciente a ser tratado é afligido com um distúrbio inflamatório, uma doença infecciosa, um transtorno imune, ou uma doença neurológica.

Compostos inibidores de tiol isomerase extracelulares [0032] Conforme usado no presente documento, composto inibidor de tiol isomerase extracelular é um inibidor de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares. Os compostos inibidores de tiol isomerase extracelular incluem zafirlucaste, montelucaste, CGP-13501 (CAS Reg. n° 5618968-5), CGP-7930 (Reg. CAS n° 57717-80-3), alossetrona, balsalazida, benserazida, butaclamol, leva-dopa, mesalazina, oxcarbazepina, um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, e/ou forma de estado sólido dos mesmos. Como inibidores de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares, um ou mais desses compostos podem ser usados como um agente antitrombótico, e agente anticoagulante, um agente anti-inflamatório, um agente antiviral, um quimioterápico ou um agente anticâncer, etc., ou uma combinação dos mesmos.

[0033] Zafirlucaste é um antagonista de receptor de leucotrieno de peptídeo seletivo sintético (LTRA), com o nome químico 4-(5-ciclopentiloxicarbonilamino-l-metilindol3-ilmetil)-3-metoxi-N-o-tolilsulfonilbenzamida. Constatouse que Zafirlucaste é um inibidor de tiol isomerase de espectro amplo que inibe a função de plaqueta, formação de trombo e crescimento de célula do câncer.

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Zafirlucaste

A síntese e formas farmacêuticas de zafirlucaste são adicionalmente descritas nas Patentes n° US 4.859.692;

5.294.636; 5.319.097; 5.482.963; 5.583.152; 5.612.367; 6.143.775; 6.333.361; e 6.399.104, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em suas totalidades.

[0034] Montelucaste é um antagonista de receptor de leucotrieno de peptídeo sintético (LTRA), com o nome químico ácido [R-(E)]-1-[[[1-[3-[2-(7-cloro-2quinolinil)etenil]fenil]-3-[2-(7-cloro-2quinolinil)etenil]fenil]-3-[2-(1-hidroxi-lmetiletil}fenil]propil]tio]metil ciclopropano acético. A síntese e formas farmacêuticas de montelucaste e sódio de montelucaste são adicionalmente descritas na Patente US n° 5.565.473, que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0035] 0 termo agente ativo, conforme usado no presente documento, significa um composto (que inclui o composto inibidor de tiol isomerase extracelular), elemento ou mistura que, quando administrada a um paciente, sozinha ou em combinação com um outro composto, elemento ou mistura, confere, direta ou indiretamente, um efeito fisiológico no paciente. 0 efeito fisiológico indireto pode ocorrer por meio de um metabólito ou outro mecanismo indireto. Quando o agente ativo for um composto, então, os

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12/37 sais, solvatos (incluindo hidratos) do composto livre, formas cristalinas, formas não cristalinas (isto é, amorfas), e quaisquer polimorfos do composto estão incluídos. Todas as formas são contempladas no presente documento independentemente dos métodos usados para obter as mesmas.

[0036] 0 termo sal farmaceuticamente aceitável, conforme usado no presente documento, inclui derivados dos compostos revelados em que o composto parental é modificado ao produzir sais de adição de ácido ou base inorqânicos ou orqânicos dos mesmos. Os sais dos presentes compostos podem ser sintetizados a partir de um composto parental que contém uma fração química básica ou ácida por meio de métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem pode ser preparados ao reaqir formas de ácido livre desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base adequada (como hidróxido de Na, Ca, Mq, ou K, carbonato, bicarbonato, ou semelhante), ou ao reaqir formas de base livre desses compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido adequado. Tais reações são tipicamente realizadas em áqua ou em um solvente orqânico, ou em uma mistura dos dois. Geralmente, os meios não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila são usados, onde se aplica. Os sais dos presentes compostos incluem adicionalmente solvatos dos compostos e dos sais de composto.

[0037] Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitação, sais minerais ou de ácido orqânico de resíduos básicos como aminas; sais alcalinos ou orqânicos de resíduos ácidos como ácidos carboxílicos; e

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13/37 semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais e os sais de amônio quaternário do composto parental formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, os sais ácidos não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfármico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, lático, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, mesílico, esílico, besílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetiônico, HOOC-(CH2) _n-COOH em que n é 0-4, e semelhante. As listas de sais adequados adicionais podem ser encontradas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p. 1418 (1985).

Antitrombótico [0038] As tiol isomerases extracelulares estão envolvidas na regulação de hemostase e trombose, como a inibição de uma ou mais tiol isomerases extracelulares irá bloquear a agregação de plaqueta, secreção de grânulo, adesão, formação de trombo e geração de fibrina. Os antitrombóticos podem ser usados terapeuticamente para prevenção (prevenção primária, prevenção secundária) ou tratamento de um coágulo sanguíneo perigoso (trombose aguda).

[0039] A inibição da atividade de PDI, ERp5 ou ERp57

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14/37 bloqueia a formação de trombo que segue a lesão induzida por laser de vasos sanguíneos em um modelo murino de trombose.

[0040] Ademais, uma vez que a inibição da atividade de tiol isomerases afeta tanto o acúmulo de plaqueta quanto a formação de fibrina, esses agentes terapêuticos seriam um aprimoramento nas terapias atualmente disponíveis que apenas alvejam os coágulos arteriais (ataque cardíaco e derrames amplamente desencadeados pela ativação inadequada de plaquetas) ou coágulos venosos (trombose venosa profunda e embolismo pulmonar amplamente causado por ativação inadequada do sistema de coágulo). Os dados sugerem que cada tiol isomerase tem especificidades de substrato únicas e mecanismos de ação que sugerem que cada um podería ser um alvo independente.

[0041] A doença ou afeção trombótica a ser prevenida ou tratada pelo composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser o infarto do miocárdio agudo, angina estável, angina instável, oclusão aguda que segue angioplastia coronária e/ou colocação de stent, um ataque isquêmico transiente, doença cerebrovascular, derrame, doença vascular periférica, insuficiência placentária, fibrilação atrial, trombose venosa profunda, embolismo pulmonar, ou uma combinação dos mesmos.

[0042] As respostas de plaqueta na presença de zafirlucaste, (0,1 μΜ -10 μΜ) foram testadas em uma faixa de ensaios funcionais de plaqueta incluindo estudos de agregação, secreção de grânulo e dispersão. Zafirlucaste foi considerado para inibir a agregação de plaqueta, secreção de a-grânulo e densa, dispersão de plaqueta

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mediante formação	de colágeno	e trombo sob	fluxo. Esses
dados sugerem que	zafirlucaste	e outros inibidores	de amplo
espectro de tiol	isomerases	da subfamília	de	proteína
dissulfeto isomerase podem ser usados como	um	fármaco
antitrombótico. [0043] Em uma	modalidade	, a doença	ou	afecção

influenciada pela atividade de uma ou mais tiol isomerases extracelulares é trombose arterial, trombose venosa, uma doença trombótica como infarto do miocárdio agudo, angina estável, angina instável, oclusão aguda que segue a angioplastia coronária e/ou colocação de stent, um ataque isquêmico transiente, doença cerebrovascular, derrame, doença vascular periférica, insuficiência placentária, fibrilação atrial, trombose venosa profunda, e embolismo pulmonar, ou uma combinação dos mesmos; e em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é zafirlucaste. Anticâncer [0044] A inibição de PDI é um alvo viável para a terapia de câncer. Vide, Xu et al. Protein disulfide isomerase: a promising target for cancer therapy Drug Discovery Today, Vol. 19, n° 3, março de 2014.

[0045] Há evidência adicional para o papel de metástase tumoral para ERp5. Vide Gumireddy et al. In vivo selection for metastasis promoting genes in the mouse PNAS (2007) 104, 6696-6701.

[0046] ERp57 é expresso a partir do gene PDIA3 em seres humanos. O mesmo consiste em 505 aminoácidos e é aumentado em produção em câncer de mama, pulmão, útero, estômago e hepático, assim como melanoma em comparação com os tecidos normais. Os níveis de expressão de ERp57 foram

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16/37 positivamente correlacionados com as habilidades de transformação do virus sarcoma oncogênico em células NIH3T3, sugerindo que ERp57 está envolvido na transformação oncogênica. Ao contrário dos membros da familia PDI, ERp57 tem a habilidade de interagir com o DNA nuclear e ativar a expressão genética à medida que ERp57 interage com as moléculas de DNA através de seu domínio a' cataliticamente ativo. ERp57 também é um componente do complexo transcricional de STAT3 e o ERp57- STAT3 modula a sinalização de célula e proliferação regulada por STAT3. ERp57 também regula a expressão genética através da via mTOR, que é um outro regulador importante de proliferação celular e sobrevivência. ERp57 também foi implicada na aglutinação de pelo menos três proteínas envolvidas com o reparo de DNA, incluindo Ref-l/APE, que, a própria tem a habilidade de ativar fatores de transcrição adicionais. Além das funções de regulação de gene, a expressão de ERp57 aumentada está correlacionada a uma resistência ao tratamento com paclitaxel em câncer ovariano e radioresistência em câncer de laringe, promove a metástase de câncer de mama no osso, e está envolvida na desregulação de sinalização de EGFR em uma linhagem celular de câncer de mama, impedindo sua ativação a jusante de moléculas-alvo como STAT3, Akt e PLCy. À medida que ERp57 desempenha um papel na formação de trombo, seu alvo potencial na prevenção de trombose associada a câncer, uma causa mais importante para a morbidade e mortalidade em pacientes com câncer.

[0047] 0 câncer a ser tratado com o composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser ovariano, de próstata,

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17/37 pulmão, melanoma, linfoma, glioma, de mama ou neuroblastoma .

[0048] 0 composto inibidor de tiol isomerase

extracelular	pode	ser usado sozinho ou	opcionalmente	em
combinação	com	um outro agente	anticâncer	ou
quimioterápico.
[0049] Em	uma	modalidade, o câncer é	tratado com	uma
combinação	do	composto inibidor de	tiol isomerase

extracelular e um agente quimioterápico como carboplatina ou cisplatina. Em uma tal modalidade, o composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode fornecer uma vantagem ao superar ou prevenir a resistência à carboplatina e/ou cisplatina.

Anti-infeccioso/antiviral [0050] As tiol isomerases, em particular PDI, também foram implicadas na entrada de HIV-1. 0 uso de um inibidor de tiol isomerase de espectro amplo (por exemplo, zafirlucaste) pode oferecer efeitos protetores para impedir a entrada de vírus conforme demonstrado por Khan et al. Discovery of a Small Molecule PDI Inhibitor That Inhibits Reduction of HIV-1 Envelope Glycoprotein gpl20. ACS Chemical Biology, Vol. 6, n° 3, março de 2011.

[0051] A doença viral a ser tratada ou prevenida com o composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser HIV, virus da dengue, ou rotavirus. 0 um ou mais compostos inibidores de tiol isomerase extracelular podem ser adicionalmente usados para tratar ou prevenir doenças infecciosas como cólera conforme demonstrado por Orlandi. Protein Disulfide Isomerase- mediated Reduction of the A Subunit of Cholera Toxin in a Human Intestinal Cell Line.

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The Journal of Biochemistry, Vol. 272, n° 7, 14 de fevereiro de 2007.

Anti-inflamatório [0052] A inflamação a ser tratada com o composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser inflamação dos pulmões, articulações, tecido conjuntivo, olhos, nariz, intestinos, rins, fígado, pele, sistema nervoso central, sistema vascular ou coração. PDI foi demonstrado para desempenhar um papel crítico no recrutamento de neutrófilos e na ativação da resposta imune inata durante a inflamação vascular e lesão do tecido.

Transtornos neurológicos e neurodegenerativos [0053] As tiol isomerases estão presentes no cérebro e aumentam em produção em pacientes com transtornos de dobramento neurológico como doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Alzheimer, doença de Huntington, e doença de Parkinson. 0 uso de um inibidor de tiol isomerase de espectro amplo (por exemplo, zafirlucaste) pode oferecer efeitos protetores para prevenir ou reduzir a degeneração neurológica, para tratar transtornos neurodegenerativos, e tratar doença e transtornos neurológicos, devido ao dano às espécies reativas de oxigênio e à apoptose associada a membros da subfamília de PDI em doenças neurodegenerativas. Estudos anteriores demonstraram que inibidores de PDI podem suprimir a toxicidade associada a proteínas Huntingtina e b-amiloide desdobradas.

Composições Farmacêuticas. Dosagem [0054] 0 um ou mais compostos inibidores de tiol isomerase extracelular podem ser administrados como o produto químico puro, ou administrados como uma composição

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19/37 farmacêutica. Consequentemente, uma modalidade fornece composições farmacêuticas que compreendem um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode conter um composto inibidor de tiol isomerase extracelular ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como o único agente ativo, ou pode conter um ou mais agentes ativos adicionais.

[0055] 0 composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser administrado via oral, tópica, parenteral, por inalação ou aspersão, subligual, transdérmica, via administração bucal, retal, como uma solução oftálmica, ou por outros meios, em forma farmacêutica que contém carreadores farmaceuticamente aceitáveis convencionais. A composição farmacêutica pode ser formulada como qualquer forma farmaceuticamente útil, por exemplo, como um aerossol, um creme, um gel, uma pílula, uma cápsula, um comprimido, um xarope, um emplastro transdérmico, ou uma solução oftálmica. Algumas formas farmacêuticas, como comprimidos e cápsulas, podem ser subdivididas em doses unitárias adequadamente dimensionadas que contêm quantidades adequadas dos componentes ativos, por exemplo, uma quantidade eficaz para obter a finalidade desej ada.

[0056] 0 termo forma farmacêutica, conforme usado no presente documento, significa uma unidade de administração de um agente ativo. Exemplos de formas farmacêuticas incluem comprimidos, cápsulas, injeções, suspensões, líquidos, emulsões, cremes, pomadas, supositórios, formas

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20/37 inaláveis, formas transdérmicas, e semelhantes. Uma forma farmacêutica exemplificativa é uma forma farmacêutica oral sólida.

[0057] 0 termo composições farmacêuticas, conforme usado no presente documento, são composições que compreendem pelo menos um agente ativo, como um composto ou sal da Fórmula I, e pelo menos uma outra substância, como

um carreador. As	composições	farmacêuticas satisfazem os
padrões GMP (boas	normas de fabricação)	da FDA	dos EUA para
fármacos humanos	ou não	humanos.	As	composições
farmacêuticas podem ser	formuladas	em	uma forma
farmacêutica.
[0058] 0 termo	carreador	, conforme	usado	no presente

documento, aplicado às composições farmacêuticas se refere a um diluente, excipiente, ou veiculo com o qual um composto ativo é fornecido.

[0059] Os carreadores incluem excipientes e diluentes e podem ter pureza suficientemente alta e toxicidade suficientemente baixa para tornar os mesmos adequados para administração ao paciente que é tratado. 0 carreador pode ser inerte ou pode possuir benefícios farmacêuticos por si próprio. A quantidade de carreador empregado em combinação com o composto é suficiente para fornecer uma quantidade prática de material para administração por dose unitária do composto inibidor de tiol isomerase extracelular.

[0060] As classes de carreadores incluem, por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de coloração, diluentes, disintegrantes, emulsificantes, flavorizantes, agentes antiaderentes, lubrificantes, preservativos, estabilizadores, tensoativos, agentes de formação de

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21/37 comprimido, e agentes umectantes. Alguns carreadores podem ser listados em mais de uma classe, por exemplo, o óleo vegetal pode ser usado como um lubrificante em algumas formulações e um diluente em outras. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos incluem açúcares, amidos, celuloses, tragacanto em pó, malte, gelatina, talco e óleos vegetais. Os agentes ativos opcionais podem estar incluídos em uma composição farmacêutica, que não interfere substancialmente com a atividade do composto inibidor de tiol isomerase extracelular.

[0061] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração oral. Essas composições contêm entre 0,1 e 99 por centro em peso (% em peso) do composto inibidor de tiol isomerase extracelular, especificamente pelo menos cerca de 5 % em peso. Em algumas modalidades, a composição contém de cerca de 25 % em peso a cerca de 50 % em peso ou de cerca de 5 % em peso a cerca de 75 % em peso do composto inibidor de tiol isomerase extracelular.

[0062] 0 termo quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, conforme usado no presente documento, significa uma quantidade eficaz, quando administrada a um paciente, para fornecer um benefício terapêutico como uma prevenção ou uma melhora de sintomas, por exemplo, para tratar um paciente que sofre de uma doença ou afecção influenciada pela atividade de uma ou mais das tiol isomerases extracelulares. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com os fatores como o estado da doença, idade, e peso do paciente, e a habilidade do composto para elicitar a resposta

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22/37 desejada no paciente. Os regimes de dosagem ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais (por exemplo, efeitos colaterais) dos compostos inibidores são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[0063] Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de cerca de 0,001 pg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia, de preferência, 0,01 pg/kg/dia e 100 mg/kg/dia. O versado na técnica irá observar que determinados fatores podem influenciar a dosagem necessária para tratar efetivamente um paciente, incluindo, mas não sem limitação, a gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do paciente, e outras doenças presentes. Além do mais, o tratamento de um paciente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto inibidor pode incluir um único tratamento ou, pode incluir uma série de tratamentos. Será observado também que a dosagem eficaz de um composto inibidor usado para o tratamento pode aumentar ou diminuir no curso de um tratamento específico.

[0064] 0 composto inibidor de tiol isomerase extracelular pode ser administrado uma vez, duas vezes ou três vezes por dia ao paciente em necessidade do mesmo. Dentro dessa modalidade, a administração pode ser feita oralmente.

[0065] Quando administrado por via oral, a dose diária total de zafirlucaste, um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, e/ou uma forma de estado sólido dos mesmos, pode ser cerca de 10 a cerca de 200 mg, especificamente

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cerca	de	:20a	cerca	de	175 mg,	mais	especificamente	cerca
de	40	a	cerca	de	150	mg,	e ainda	mais	especificamente	cerca
de	60	a	cerca	de	125	mg	administrada	uma vez, duas vezes ou

três vezes por dia por via oral.

[0066] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma embalagem que compreende a composição farmacêutica em um recipiente e que compreende adicionalmente instruções para usar a composição na prevenção e tratamento de uma doença ou distúrbio mediada pela uma ou mais tiol isomerases das tiol isomerases extracelulares.

[0067] Est a invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes.

EXEMPLOS:

Exemplo 1. Ensaio Turbidométrico baseado em Insulina ensaio de atividade inibitória de tiol isomerase [0068] As tiol isomerases recombinantes foram adquiridas junto à AbCam (Cambridge MA) , insulina recombinante (bovina), bacitracina, tampões de ditiotreitol (DTT) e todos os outros produtos químicos foram adquiridos junto à Sigma Aldrich (St. Louis, MO; enquanto as placas de fundo claro com 384 poços foram adquiridas junto à Corning (Corning, NY).

[0069] A redução catalítica de insulina por tiol isomerases na presença de DTT resulta na agregação de cadeias de insulina. A turbidez de agregação de insulina pode ser monitorada espectrofotometricamente em uma densidade óptica (OD) a 650 nm. Essa abordagem foi usada por múltiplos grupos para identificar inibidores de tiol isomerase de uma maneira cinética ou de ponto final do

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24/37 teste. Uma concentração final de 10 pg/ml de PDI, 30 pg/ml de ERp5, 10 pg/ml de ERp72 ou 10 pg/ml de tiorredoxina, 125 μΜ de insulina e ácido etilenodiaminatetra acético (EDTA) 2 mM em 30 μΐ de tampão de fosfato de potássio 100 mM foi adicionada a cada placa de poço experimental, enquanto os poços de controle negativo carecem de qualquer tiol isomerase. Os compostos de chumbo foram diluídas em uma curva de dose de 6 pontos e a turbidez de agregação de insulina foi medida cineticamente a cada minuto por 75 minutos com o uso de um leitor de placa Spectramax M3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA.) O ensaio de especificidade utilizou o ensaio de turbidez de insulina também.

[0070] A Figura 1 ilustra os resultados do ensaio de atividade inibitória de tiol isomerase de zafirlucaste. Zafirlucaste foi considerado como um inibidor amplo de enzimas PDI, ERp5, ERp57, ERp72, e tiorredoxina (TRX). Constatou-se que Zafirlucaste tem uma faixa inibitória em ERp5 entre 10-300 μΜ; PDI é inibido entre 30-300 μΜ; TRX é inibido na faixa de 10-300 μΜ; ERp57 é inibido entre 30-300 μΜ; e ERp72 é inibido entre 10-300 μΜ.

[0071] A Figura 2 ilustra os resultados do ensaio de atividade inibitória de tiol isomerase de montelucaste.

[0072] A Figura 3 ilustra dados na inibição de ERp57 por inibidores oxcarbazepina, benserazida, CGP-7930, e alossetrona em várias concentrações em um ensaio enzimático in vitro. Foi adicionalmente constatado que CGP-13501 foi específico para ERp57.

Exemplo 2. Os estudos mostram que zafirlucaste é um inibidor de tiol isomerase que pode inibir a função da

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25/37 plaqueta [0073] Conforme zafirlucaste e montelucaste são inibidor de amplo espectro de tiol isomerases das tiol isomerases extracelulares (vide Exemplo 1), seria esperado ver uma resposta de plaqueta geral diminuída quando as plaquetas fossem tratadas com esse composto.

[0074] Materiais: Zafirlucaste e montelucaste foram adquiridas junto à Sigma Aldrich (Poole, UK). Colágeno foi obtidas junto à Takeda (Linz, Áustria). Cronolume e ATP para experimentos de secreção de grânulo denso foram adquiridos junto à Chronolog (Pennsylvania, EUA) . 0 anticorpo P-Selectina Anti-humano (CD62P) e anticorpo PAC-1 anti-humano foram obtidos junto à BD Biosciences (Nova Jersey, EUA) e o conjugado FITC de fibrinogênio anti-humano foi obtido junto à Dako Cytochemicals (Cambridgeshire, UK). CRP-XL foi adquirido junto à Prof Richard Farndale (University of Cambridge, UK). As lâminas para microscópio e lamelas foram adquiridas junto à VWR (Pennsylvania, EUA). Prolong Anti Fade Gold Medium e Alexa-Fluor Phalloidin 488 foram obtidas junto à Thermo Fisher (California, EUA) . Os chips Cellix foram obtidos junto à Cellix (Dublin, Irlanda). DioC6, Trombina, PGI2, DMSO, Fibrinogênio, Albumina Sérica Bovina livre de Protease (BSA) e todos os outros reagentes tinha grau analítico e foram observados a partir de Sigma Aldrich (Poole, UK).

[0075] Preparação de Plaqueta Humana: 50 ml de sangue foi retirado de indivíduos consensuais livres de fármaco, para uma seringa que contém 5 ml de citrato de sódio (4 % p/v) e 7,5 ml de ACD aquecido (citrato de sódio 85 mM, ácido cítrico 71 mM e glicose 110 mM) . 0 sangue foi

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26/37 centrifugado a 102 g por 20 minutos para obter plasma rico em plaqueta (PRP) , que foi, então, decantado e 10 μΐ de prostaciclina (PGL 125 pg/ml, solubilizado em etanol) foi adicionado. As plaquetas foram peletizadas por meio de centrifugação a 1413 g por 10 minutos, o plasma pobre em plaqueta foi descartado e o pélete foi ressuspenso em 25 ml de tampão HEPES de Tyrode (134 mM de NaCl, 2,9 mM de KC1, 0,34 mM de Na₂HPO₄, 12 mM de NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM de MgCÍ2 e 5 mM de glucose, pH 7,3), 3 ml de ACD e 10 μΐ de PGL foram adicionados e, então, seguindo com a centrifugação a 1413 g por 10 minutos, o pélete de plaqueta foi ressuspenso para a densidade celular adequada com o uso de tampão de Tyrode. As plaquetas ficaram em repouso por 30 minutos a 30 °C para permitir que as respostas de plaqueta se recuperem.

[0076] Agregação de Plaqueta: 445 μΐ plaquetas lavadas a (4xl0⁸ células/ml) foram incubadas por 5 minutos com veículo (0,1 % (v/v) de DMSO) ou 5 μΐ de zafirlucaste ou montelucaste. 50 μΐ de colágeno 1 pg/ml (final), foi adicionado e a transmissão de luz foi monitorada por 3 minutos a 37 °C com agitação constante (1200 rpm) com o uso de um agregômetro (Chronolog, EUA).

[0077] Secreção de grânulo denso: 395 μΐ de plaquetas lavadas foram adicionados a uma cuveta e incubadas com 5 μΐ de zafirlucaste ou veículo (0,1 % (v/v) de DMSO) por 3 minutos a 37 °C. 50 μΐ de substrato Chronolume foram adicionados e incubados por mais 2 minutos. As plaquetas foram, então, estimuladas com o uso de 50 μΐ de colágeno (1 pg/ml) em um agregômetro Lumi (Modelo 700, Chronolog, EUA) por 3 minutos a 37 °C com agitação constante (1200 rpm) .

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27/37 [0078] Formação de Trombo sob fluxo: 0 sangue humano foi retirado para 3,2 % (p/v) de citrato de sódio e rotulado com DIOC-6 2 μΜ por uma hora. Um biochip cellix foi revestido com 1 μΐ de Colágeno (100 pg/ml) por 1 hora. 0 sangue foi, então, incubado com veículo (0,1 % (v/v) DMSO) ou zafirlucaste (10 μΜ) por 5 minutos antes da perfusão em células microfluídicas Cellix revestidas com colágeno a uma taxa de cisalhamento de 20 dinas/cm². As imagens foram registradas por 10 minutos de perfusão por microscopia confocal (Nikon Al Microscope, Nikon, Japão) e analisadas com o uso de ImageJ.

[0079] Citometria de Fluxo: 5 μΐ de plaquetas (2 x 10⁸ células/ml) foram adicionadas a 42 μΐ de solução salina tamponada com HEPES com Ca2+ 1 mM. Para isso, 0,5 μΐ de zafirlucaste (0,6 μΜ - 10 μΜ) ou montelucaste (0,6 μΜ - 10 μΜ) ou veículo (0,1 % (v/v) DMSO) foi adicionado e incubado por 5 minutos. 1 μΐ de CD62p anti-humano (1:500 de diluição) e 1 μΐ de conjugado de FITC antifibrinogênio (1:500 de diluição) ou 2 μΐ de anticorpo anti-PAC-1 foram adicionados às amostras. As plaquetas foram tratadas com 5 μΐ de CRP- XL (1 ug/ml) ou 5 μΐ de Tyrode por 20 minutos no escuro. As amostras foram, então, fixadas com 450 μΐ de 0,2 % (v/v) de paraformaldeído e analisadas em um citômetro de fluxo accuri C6 (BD Biosciences, UK), com o limite definido para 20000. As populações de plaqueta foram inseridas e 10000 eventos foram registrados.

[0080] Análises estatísticas: Todos os dados brutos foram analisados por ANOVA unidirecional e foram normalizados adequados para o veículo. O Prisma GraphPad foi usado para realizar a análise estatística por ANOVA ou

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28/37 testes t de Student. 0 nível de significância de valores p é conforme segue, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005. Os dados apresentados são meios de +/- erro-padrão da média.

[0081] Zafirlucaste inibe agregação de plaqueta: As plaquetas humanas lavadas (4xl0⁸ células/ml) foram prétratadas com zafirlucaste 0,1 μΜ - 10 μΜ ou veiculo. As plaquetas foram estimuladas com colágeno 1 pg/ml e permitidas para agregar por 3 minutos. Os traços de agregação representativos da resposta foram obtidos e as respostas de dosagem foram comparadas.

[0082] Os dados de 12 doadores foram normalizados para o veiculo e a significância estatística foi calculada com o uso de um controle de veiculo contra ANOVA unidirecional.

Zafirlucaste foi considerado para inibir a agregação de plaqueta estimulada por colágeno de uma maneira dependente de concentração (Figura 4) . Zafirlucaste 10 μΜ reduziu a agregação de plaqueta para 18,1 % (±5,62 %, 81,9 % de inibição) (p<0,0001). Zafirlucaste 5 μΜ e 2,5 μΜ inibiu a agregação de plaqueta para 22,47 % ±6,2 % e 40,00 % ±10,03

% (77,53 %	e 60	% de inibição, respectivamente)	(p<0,0001).
Os níveis	intermediários semelhantes	de agregação foram
detectados	em	concentrações de 1,25	μΜ e	0,6 μΜ. A
agregação	era	54,9 % (±11,38 %) e	54,8 % (	:±ll,07 %),
portanto,	1,25	μΜ e 0,6 μΜ tinham uma	inibição	semelhante

de 45 %. (p<0,01). 0,3 μΜ e 0,1 μΜ não inibiram significativamente a agregação de plaqueta. Montelucaste foi considerado para também inibir a agregação de plaqueta estimulada por colágeno. 10 μΜ inibiu a resposta de agregação para 3,99 ±0, 800 %, 96,1 % de inibição (p<0,0001). 5 μΜ, 3,75 μΜ e 2,5 μΜ que inibiram em 90,63 %

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29/37 ±3,14, 83,56 % ±10,35 e 62,13 % ±10,15, respectivamente, e foram, todos, considerados estatisticamente significativos.

[0083] Zafirlucaste inibe secreção de grânulo denso: A liberação de ATP e outras moléculas dos grânulos densos contribui para o mecanismo de retroinformação positiva e, então, leva a uma modificação da integrina allbp3 e adicional agregação de plaquetas. À medida que a agregação de plaqueta foi perturbada pelo zafirlucaste, a ação de retroinformação positiva de exocitose de grânulo também pode ser perturbada.

[0084] As plaquetas lavadas (4xl0⁸ células/ml) foram pré-tratadas com zafirlucaste (0,1-10 μΜ) ou veículo por 3 minutos. O Chronolume foi adicionado por mais 2 minutos antes de as plaquetas serem estimuladas com 1 pg/ml (final) de colágeno em um agregômetro lumi por 3 minutos. A análise estatística foi calculada com o uso de ANOVA unidirecional (n=3), *P<0,05. Em comparação com a ATP de secreção de veículo (1,25 nM, ±0,34 nM) , zafirlucaste inibiu a secreção de ATP a 10 μΜ com secreção de ATP média sendo 0,327 nM (±0,0727 nM) (P<0,05).

[0085] Zafirlucaste inibiu a aglutinação de fibrinogênio para allbp3: Mediante a ativação de plaquetas, a afinidade do receptor de fibrinogênio allbp3 para seu ligante, fibrinogênio, aumenta. Isso permite a reticulação de plaquetas, permitindo que um trombo se desenvolva. PDI, ERp5 e ERp57 foram, todos, mostrados para modular a aglutinação de fibrinogênio através do uso de anticorpos de bloqueio de função indicando um papel fundamental para essas enzimas na regulação de afinidade nesse receptor. O zafirlucaste inibidor de tiol isomerase de espectro amplo

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30/37 potencial também pode inibir a aglutinação de fibrinogênio devido à inibição de secreção de α grânulo, de uma maneira semelhante aos anticorpos de bloqueio de atividade enzimática.

[0086] A maior concentração de zafirlucaste, 10 μΜ fez com que a aglutinação de fibrinogênio fosse iniciada por 64,45 % (±10,43 %) (3696Au ±1159Au) (p<0,05), em comparação com o veículo (12520Au, ±3264). Uma tendência em relação à inibição foi observada com concentrações mais baixas de zafirlucaste.

[0087] Zafirlucaste inibe a ativação de integrina: Após liberação de cálcio devido a mensageiros secundários, a integrina allbp3 sofre uma alteração conformacional para formar o estado ativo e o anticorpo PAC-1 anti-humano pode se aglutinar.

[0088] As plaquetas lavadas (2xl0⁸ células/ml) foram incubadas com veículo, zafirlucaste (0,6-10 μΜ) ou montelucaste (0,6-10 μΜ) por 5 minutos. Seguindo isso, as plaquetas foram incubadas com anticorpo anti-PAC-1 e estimuladas com CRP-XL antes de os níveis de anticorpo PAC1 ligado a superfície celular foram examinadas por meio de citometria de fluxo. Os dados foram analisados com o uso de ANOVA unidirecional, n=3 .

[0089] Zafirlucaste inibiu a ativação de integrina a 10 μΜ em 54 % (±4,337 %, 748,5Au, ±87,46,) em comparação com o veículo (1623 Au, ±34,67) (p<0,005).

[0090] Zafirlucaste afeta a formação de trombo sob fluxo: Foi anteriormente mostrado que as tiol isomerases, em particular, ERp57 empregam um papel importante na adesão de plaquetas e formação de trombos sob fluxo arterial. Um

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31/37 modelo de formação de trombo in vitro foi usado para identificar se o zafirlucaste tinha quaisquer efeitos fisiológicos no trombo formados sob condições de fluxo.

[0091] 0 sangue humano integral rotulado com corante lipofilico DIOC-6 foi incubado com zafirlucaste (10 μΜ) ou veiculo (0,1 % (v/v) de DMSO) por 5 minutos antes da perfusão em capilares cellix revestidos com colágeno (100 pg/ml) em uma taxa de cisalhamento arterial de 20 dinas/cm². As imagens foram registradas por 10 minutos com o uso de microscopia confocal e analisadas com o uso de ImageJ. A intensidade de fluorescência mediana foi determinada e comparada à resposta de intensidade máxima; quanto mais intensa a fluorescência, maior o volume de trombo formado.

[0092] Tanto para o sangue tratado com veiculo quanto o sangue tratado com zafirlucaste, conforme o tempo aumentou a fluorescência mediana e, portanto, o tamanho do trombo aumento. Após 8 minutos de fluxo, o sangue tratado com 10 μΜ de zafirlucaste mostrou uma ligeira diminuição na intensidade de fluorescência mediana e, portanto, na formação de trombo (p<0,05), MFI para 74,86 (±3,371 Au) em comparação com o veiculo a 89,15 (±1, 679 Au) . O tamanho final do trombo também foi significativamente diminuído em comparação com o veículo (p<0,05; ANOVA bidirecional, 3 doadores). Zafirlucaste inibiu a intensidade de fluorescência mediana em 14,25 % em comparação com o veículo. Concluiu-se, no entanto, que o zafirlucaste diminuiu a formação de trombo no sangue total sob condições de fluxo arterial.

[0093] Os resultados anteriormente mencionados suportam

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a conclusão	de que	o zafirlucaste inibe a	agregação	de
plaqueta,	secreção	de grânulo,	ativação de	integrina	e
formação	de	trombo	sob fluxo	potencialmente	através	da
mediação	de	tiol	isomerases.	Esses dados	suportam	o
potencial	de	zafirlucaste como um inibidor de tiol

isomerase e inibidor de respostas funcionais de plaqueta. Exemplo 3. Zafirlucaste inibe a formação de trombo in vivo, mas não impacta no sangramento dos camundongos [0094] Os efeitos de zafirlucaste na formação de trombo em camundongos foram determinados seguindo a lesão por laser de arteríolas de músculo cremaster, e observados por meio de microscopia intravital. As plaquetas de camundongo C57/BL6 macho foram rotuladas com anticorpo anti-GPIb conjugado a DyLight 649 (0,2 pg/g de peso corporal) e veículo ou zafirlucaste (ZFL) infundido (em um volume necessário para obter uma concentração de circulação de 20 μΜ) . Seguindo a lesão por laser, as imagens foram registradas por 5 minutos. A Figura 5 ilustra a intensidade de fluorescência máxima de cada trombo formado nos camundongos tratados com veículo (n=18 trombos, círculos) ou camundongos tratados com ZFL (n=12 trombos, quadrados) e demonstra que o tratamento com ZFL resulta em uma redução no tamanho do trombo. A Figura 6 ilustra que os efeitos de ZFL no sangramento foram determinados por meio de ensaio de sangramento de cauda. Veículo ou ZFL (em um volume necessário para obter uma concentração de circulação 20 μΜ) foi infundido nas veias femorais de camundongos C57/BL6, 5 minutos antes da biópsia da cauda. 0,5 cm da ponta da cauda foi cortado e o sangue coletado em solução salina tamponada com fosfato (PBS), e o tempo para cessação do sangramento

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33/37 foi registrado. 0 tratamento com ZFL foi associado a nenhuma alteração no tempo de sangramento. Os gráficos representam a média ± SEM, n=10 por tratamento, os dados foram analisados por meio de testes t de Student, ***p<0,005.

Exemplo 4. Efeitos de Inibidores de Tiol Isomerase Extracelular em Crescimento de Célula de Câncer [0095] As células foram colocadas em placas a 6000 células/poço em uma placa de 96 poços e tratadas com a concentração de zafirlucaste indicada 24 horas depois. As células foram permitidas a crescer por mais 24 horas antes das alterações no crescimento serem medidas pelo ensaio de proliferação celular PrestoBlue em triplicata. As leituras de fluorescência com uma excitação a 570 nm e emissão de 600 nm foram coletadas e as amostras tratadas foram convertidas em uma porcentagem dos controles não tratados.

[0096] As linhagens celulares OVCar8 (linhagem celular de câncer ovariano humano), HCT116 (câncer de cólon humano), HeLa (linhagem celular de câncer cervical) e MDAMB-231 (linhagem celular de câncer de mama) foram examinadas por sua habilidade de inibir a proliferação celular. As células OVCar8 e HCT116 exibiram um IC50 na faixa de 5-10 μΜ. As células de câncer cervical HeLa e as linhagens de câncer de mama MDA-MB-231 eram menos sensíveis. A Tabela 1 ilustra os resultados de um ensaio de proliferação celular que testa o zafirlucaste contra as células OVCar8, células HCT116, células HeLa e células MDAMB-231 .

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Tabela 1.

Linhagem Celular	Tipo de Tumor	IC50
HCT116	Câncer de Cólon	5 μΜ (±2 μΜ)
0VCar8	Câncer Ovariano	6 μΜ (±2 μΜ)
HeLa	Câncer Cervical	3 0 μΜ (± 5 μΜ)
MDA-MB-231	Câncer de Mama	100 μΜ (±7 μΜ)

Exemplo 5. Zafirlucaste Inibe Sinalização de EGFR [0097] As células HCT116 (câncer de cólon humano) foram incubadas com fármaco por 24 horas e os extratos celulares totais foram preparados. Os níveis de proteína foram normalizados, a proteína foi carregada em géis de SDSpoliacrilamida e, então, submetidos a eletrosferese antes de transferir para uma membrana de PVDF. As membranas foram sondadas com anticorpos primários de interesse, seguidas por anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte. Western blot das células HCT116 tratadas com zafirlucaste mostraram inibição quase completa de ativação de EGFR e sua sinalização a jusante, monitorada através da medição de fosforilação de STAT3.

[0098] A menos que seja definido de outro modo, os termos técnicos e científicos usados do presente documento têm o mesmo significado como é comumente entendido por um indivíduo versado na técnica a que esta revelação pertence. [0099] As formas singulares um, uma, o e a incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Os pontos finais do teste de todas as faixas direcionadas à mesma característica ou ao mesmo

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35/37 componente são, independentemente combináveis e inclusivos do ponto final do teste citado. 0 sufixo (s) conforme usado no presente documento se destina a incluir tanto o singular quanto o plural do termo que o mesmo modifica incluindo, desse modo, um ou mais desses termos (por exemplo, o carreador (ou carreadores) inclui um ou mais carreadores). 0 termo ou significa e/ou a menos que claramente indicado de outro modo no contexto. 0 termo combinação é inclusive de mesclas, misturas e semelhantes.

[0100] A referência ao longo do relatório descritivo a uma modalidade, uma outra modalidade, algumas modalidades, e assim por diante, significa que um elemento específico (por exemplo, recurso, estrutura, etapa ou característica) descrito em combinação com a modalidade está incluído em pelo menos uma modalidade descrita no presente documento, e pode ou não estar presente em outras modalidades. Além disso, deve-se compreender que os elementos descritos podem ser combinados de qualquer maneira adequada nas várias modalidades.

[0101] Em geral, as composições, métodos e artigos podem compreender alternativamente, consistir ou consistir em, quaisquer ingredientes, etapas ou componentes no presente documento revelados. As composições, métodos e artigos podem ser adicional ou alternativamente formulados, conduzidos ou fabricados de modo a serem desprovidos, ou substancialmente livres, de quaisquer ingredientes, etapas ou componentes desnecessários para a obtenção da função ou objetivos das presentes reivindicações.

[0102] Opcional ou opcionalmente significa que a

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36/37 circunstância ou caso subsequentemente descrito pode ocorrer ou não e que a descrição inclui exemplos em que o caso ocorre e exemplos em que o mesmo não ocorre.

[0103] Cerca de ou aproximadamente conforme usado no presente documento é inclusive do valor definido e significa dentro de uma faixa aceitável de desvio para o valor específico conforme determinado por um dos versados comuns na técnica, considerando a medição em questão e o erro associado à medição da quantidade específica (por exemplo, as limitações do sistema de medição). Por exemplo, cerca de pode significar dentro de um ou mais desvios padrão.

[0104] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes em combinação com apenas um número limitado de modalidades, deve-se compreender prontamente que a invenção não se limita a tais modalidades reveladas. Em vez disso, a invenção pode ser modificada para incorporar qualquer número de variações, alterações, substituições ou disposições equivalentes não descritas no presente documento anteriormente, mas que estão de acordo com o espírito e o escopo da invenção. Adicionalmente, embora várias modalidades da invenção tenham sido descritas, devese compreender que aspectos da invenção podem incluir apenas algumas das modalidades descritas. Consequentemente, a invenção não deve ser vista como limitada pela descrição anterior, mas não se limita apenas pelo escopo das reivindicações anexas.

[0105] Todas as patentes, os pedidos de patente e outras referências citadas são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. No entanto, se um

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37/37 termo no presente pedido contradisser ou conflitar com um termo na referência incorporada, o termo do presente pedido tem prioridade sobre o termo conflitante da referência incorporada.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método que compreende:

   administrar a um doente necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto inibidor da tiol isomerase extracelular para tratar ou prevenir uma doença ou estado influenciado pela atividade de uma ou mais isomerases tiol extracelulares, em que o composto inibidor da tiol isomerase extracelular é zafirlucaste, montelucaste, alosetrona, balsalazida, benserazida, butaclamol, levodopa, mesalazina, oxcarbazepina, um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco e/ou forma de estado sólido do mesmo.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a uma ou mais tiol isomerases das tiol isomerases extracelulares são dissulfureto isomerase de proteína (PDI)), tioredoxina, ERp5, ERp57, ERp72 ou uma combinação da mesma.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é zafirlucaste.
4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a doença ou condição é trombose arterial, trombose venosa, uma doença trombótica, um câncer, uma doença infecciosa, uma doença viral, um distúrbio imune, inflamação, uma doença neurológica, um distúrbio neurodegenerativo, ou uma combinação dos mesmos.
5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a doença ou condição é trombose ou uma doença trombótica.

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6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a doença trombótica é infarto agudo do miocárdio, angina estável, angina instável, oclusão aguda após angioplastia coronariana e/ou colocação de stent, ataque isquêmico transitório, doença cerebrovascular, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, insuficiência placentária. , fibrilação atrial, trombose venosa profunda, embolia pulmonar ou uma combinação dos mesmos.
7. 7. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a doença ou condição é um câncer.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o câncer é mama, cólon, colo-retal, glioma, hematológico, laringeo, pulmão, linfoma, melanoma, neuroblastoma, ovário, próstata ou uma combinação dos mesmos.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é formulado como uma composição farmacêutica opcionalmente compreendendo adicionalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. 10. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é formulado como uma composição farmacêutica em forma de dosagem.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é formulado como um comprimido ou cápsula.
12. 12. Método de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que o composto inibidor de tiol isomerase extracelular é formulado como uma composição farmacêutica adequada para administração por via oral, tópica, parenteral, por

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    3/4 inalação ou pulverização, sublingualmente, transdermicamente, via administração bucal ou retalmente.
13. 13. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1-12, compreendendo ainda fornecer ao paciente pelo menos um agente terapêutico adicional.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o agente terapêutico adicional é um antitrombótico, um anticoagulante, um quimioterápico, um antiviral ou um antiinflamatório.
15. 15. Um método para prevenir ou tratar trombose, uma doença trombótica, agregação de plaquetas, geração de fibrina, ou uma combinação destes em um paciente, compreendendo:

    administrar ao paciente necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de zafirlucaste.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, para a prevenção ou tratamento de trombose arterial e trombose venosa.
17. 17. 0 método da reivindicação 15 ou 16, compreendendo administrar uma dose diária total de zafirlucaste de cerca de 10 a cerca de 200 mg, especificamente cerca de 20 a cerca de 175 mg, mais especificamente cerca de 40 a cerca de 150 mg e ainda mais especificamente cerca de cerca de 125 mg, administrados uma, duas ou três vezes ao dia.
18. 18. Um método para inibir uma tiol isomerase das tiol isomerases extracelulares em uma célula, compreendendo:

    contatar a pilha com uma quantidade eficaz de zafirlucaste, montelucaste, alosetron, balsalazide, benserazide, butaclamol, levodopa, mesalazine, oxcarbazepine, um sal farmaceuticamente aceitável, pró

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    4/4 fármaco e/ou uma forma de estado sólido do mesmo.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a tiol isomerase das tiol isomerases extracelular é a dissulfureto isomerase de proteína (PDI), tioredoxina, ERp5, ERp57, ERp72 ou uma sua combinação.