BR112019014644A2

BR112019014644A2 - soluções de perfusão e/ou preservação de órgãos

Info

Publication number: BR112019014644A2
Application number: BR112019014644A
Authority: BR
Inventors: Sigvardsson Anne-Li; Sjöqvist Elin
Original assignee: Xvivo Perfusion Ab
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2020-05-26
Also published as: ES2751767T3; SI3448149T1; US20220202006A1; MX2019008501A; PT3448149T; JP2022145712A; KR102700330B1; PL3448149T3; DK3448149T3; EP3448149A1; US20240081322A1; AU2017393861B2; AU2017393861A1; CA3047360A1; EP3448149B1; CA3047360C; HUE046233T2; KR20190104213A; US20180199566A1; RU2737147C1

Abstract

uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado é fornecida. a solução compreende dextrano, glicose, íons de cálcio, um tampão e água, tem um ph de 6,6 a 7,8 e é estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor. um método de preparar a solução também é fornecido. o método compreende combinar dextrano, glicose, íons de cálcio, tampão e água para obter uma solução inicial, ajustando o ph da solução inicial para 7,0 a 7,8, se necessário, e submetendo a solução inicial à esterilização por calor, obtendo assim a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos. um método de perfusão e/ou preservação de um tecido ou órgão isolado também é fornecido. um método para lavagem, armazenamento e/ou transporte de um pulmão isolado após a remoção de um doador, em preparação para eventual transplante em um receptor, também é fornecido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: SOLUÇÕES DE PERFUSÃO E/OU PRESERVAÇÃO DE ÓRGÃOS Campo da Invenção [0001] A presente invenção se refere a soluções de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado, as soluções compreendendo dextrano, glicose, ions de cálcio, um tampão e água, com um pH de 6,6 a 7,8 e sendo estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor, bem como métodos de produção e utilização de tais soluções.

Antecedentes da Invenção [0002] Soluções de dextrano foram usadas para diferentes fins médicos por mais de 50 anos. A solução Perfadex® é uma solução de dextrano esterilizada por calor que foi desenvolvida para a perfusão de órgãos no inicio dos anos 70. Nos últimos quinze a vinte anos, tornou-se o produto predominante para a preservação dos pulmões antes do transplante. A solução Macrodex® e a solução Rheomacrodex® têm sido usadas por mais tempo como expansores de plasma durante a cirurgia e em pacientes com trauma. A solução PrimECC® (PCT/EP2011/069524) é outra solução de dextrano indicada como solução de primer para máquinas de circulação extracorpórea. Todas estas soluções são fornecidas comercialmente com um pH sub-fisiológico de cerca de 4 a 6. As soluções podem ser ligeiramente

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2/33 tamponadas com fosfato e/ou bicarbonate, mas como o pH diminui durante a esterilização por calor devido à hidrólise do dextrano, o pH no produto comercialmente fornecido é inferior a 6,6 e, frequentemente, inferior a 6 à temperatura da sua utilização. Este pH sub-fisiológico não tem sido uma preocupação principal para os produtos infundidos, como a solução Macrodex® ou solução PrimECC®, pois a acidez é fraca e os conteúdos plasmáticos, principalmente albumina sérica, tamponam instantaneamente para manter o pH fisiológico no plasma.

[0003] Quando uma solução de dextrano é usada para lavar ou perfundir um órgão isolado, não há tantos componentes do plasma como a albumina do soro disponível e a capacidade de tamponamento é, portanto, reduzida no órgão ou tecido isolado. Assim, na prática, os usuários geralmente tamponam a solução Perfadex® com tris(hidroximetil)aminometano (doravante TRIS, também denominado THAM) ou tampões semelhantes para atingir o pH fisiológico imediatamente antes da utilização. O tamponamento da solução Perfadex® pelos usuários (também denominado tampão pré-uso) foi aceito, mas há sempre o risco de cometer erros quando um produto não é fornecido pronto para uso. O usuário pode esquecer completamente de armazenar em tampão a solução ou o usuário pode usar o tampão errado ou a concentração incorreta. Qualquer uma

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3/33 dessas circunstâncias pode afetar negativamente a qualidade do órgão isolado, por exemplo, pulmão ou pulmões. Portanto, uma solução de perfusão de órgão pré-tamponada pronta para uso melhoraria a segurança de preservação de órgãos, bem como a conveniência do usuário.

[0004] O documento WO 2012/142487 descreve uma solução de perfusão pulmonar chamada OCS Solution, compreendendo Dextran 40, magnésio, potássio, sódio, nutrientes como glicose, hormônios, tampão etc. A referência ensina que o pH da solução OCS é monitorado durante a produção, que a solução OCS é termicamente esterilizado, que a Solução OCS é suplementada com um meio celular antes do uso, e que o pH do meio resultante é ajustado antes do uso com, por exemplo, bicarbonato (parágrafos [0010], [0035], [0045] e [0066]), indicando que a Solução OCS é fornecida a um pH sub-fisiológico, o qual requer mais tamponamento antes da utilização.

[0005] Soluções de dextrano filtradas estéreis não autoclavadas, tais como Solução STEEN (PCT/SE01/02419), têm sido usadas em pH fisiológico por cerca de 15 anos, mas para o conhecimento dos presentes inventores não há soluções de dextrano esterilizadas por calor com um pH entre 6,6 e 7,8 para uso médico disponíveis. A filtração estéril é aceitável para produtos de baixo volume,

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4/33 geralmente com baixo teor de dextrano. Caso contrário, o dextrano entupiría o filtro.

[0006] Outro problema com a esterilização por calor de soluções que compreendem especialmente a glicose, especialmente soluções para diálise peritoneal, é a degradação da glicose para produtos de degradação tóxicos. Têm sido feitas tentativas para reduzir os subprodutos tóxicos, diminuindo ainda mais o pH da solução para cerca de 3, durante a esterilização por calor ou através da separação de eletrólitos e glicose durante a esterilização (Ledebo et al., 2000 e Wieslander et al. , 1995).

[0007] O mesmo problema de degradação da glicose é conhecido a partir da produção de soluções de dextrano para vários fins médicos, como a preservação de órgãos. A principal resposta para este problema tem sido aumentar a quantidade de glicose na solução antes da esterilização para assegurar glicose suficiente no produto final para uso no suporte do metabolismo do órgão. Esta resposta não considera qualquer potencial efeito tóxico dos produtos de degradação da glicose. Se a sobrecarga de glicose durante a produção piora o problema através da geração de quantidades aumentadas de produtos de degradação de glicose potencialmente tóxicos. Sumário da invenção

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5/33 [0008] A presente invenção fornece uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado que resolve estes problemas e proporciona vantagens adicionais. A solução compreende dextrano, glicose, ions de cálcio, um tampão e água. A solução tem um pH de 6,6 a 7,8 e é estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor. O tecido ou órgão isolado pode ser selecionado, por exemplo, entre pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas e/ou intestino. A solução é tamponada a um pH fisiologicamente aceitável para a temperatura de seu uso antes da esterilização por calor (também denominada prétamponamento) , e é complementada com ions de cálcio para imitar o fluido extracelular também antes da esterilização por calor (também denominada pré-suplementação de cálcio) e, em seguida, é submetida à esterilização por calor. Assim, a solução resultante está pronta para ser utilizada, uma vez que não requer qualquer outro tamponamento, ou qualquer suplementação adicional, com cálcio ou quaisquer outros compostos, antes da utilização. Além disso, a combinação de pré-tamponamento e pré-suplementação de cálcio antes da esterilização por calor fornece proteção para a glicose durante a esterilização por calor, mantendo uma maior concentração de glicose na solução e reduzindo assim a produção de produtos de degradação potencialmente tóxicos.

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6/33 [0009] A presente invenção também fornece um método para preparar a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado. O método compreende uma etapa de (1) combinar o dextrano, a glicose, os ions de cálcio, o tampão e a água para obter uma solução inicial. O método também compreende uma etapa de (2) ajustar o pH da solução inicial para 7,0 a 7,8, se necessário. O método também compreende uma etapa de (3) submeter a solução inicial à esterilização por calor, obtendo assim a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos.

[00010] A presente invenção também fornece um método para perfundir e/ou preservar um tecido ou órgão isolado. O método compreende uma etapa de (1) obter um volume da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado a partir de um recipiente estéril no qual a solução foi armazenada. O método também compreende uma etapa de (2) administrar o volume obtido da solução ao tecido ou órgão isolado, perfundindo e/ou preservando o tecido ou órgão isolado.

[00011] A presente invenção também fornece um método para lavagem, armazenamento e/ou transporte de um pulmão isolado após a remoção de um doador, em preparação para eventual transplante em um receptor. O método compreende uma etapa de (1) lavagem do pulmão isolado do doador com um volume de lavagem de uma solução de perfusão e/ou

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7/33 preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado. 0 método também compreende uma etapa de (2) encher um recipiente de armazenamento de órgãos estéreis, pelo menos parcialmente, com um volume de enchimento da solução e imergir o pulmão isolado no volume de enchimento da solução.

Descrição

Soluções de perfusão e/ou preservação de órgãos [00012] Como referido acima, a presente invenção fornece uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado. A solução compreende dextrano, glicose, ions de cálcio, um tampão e água. A solução tem um pH de 6,6 a 7,8 e é estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor.

[00013] Soluções contendo dextrano, por exemplo, Dextrano 40, e baixos níveis de potássio, por exemplo, níveis extracelulares, têm sido utilizadas para preservação de órgãos desde a década de 1960, sendo as soluções denominadas, por exemplo, soluções de dextrano, soluções Dextran 40 e/ou soluções de LPD.

[00014] No final da década de 1990, uma solução LPD chamada solução Perfadex® se tornou a solução de preservação predominante para uso em órgãos ricos em endotélio, como os pulmões. A composição da solução Perfadex® (fornecida como massa/L) é a seguinte:

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Dextran-4 0	50	g
Cloreto de Sódio	8 g
D-Glicose monohidratada	1 g
Cloreto de Potássio	400	mg
Sulfato de Magnésio 7 H2O	200	mg
Fosfato dissódico 12 H2O	117	mg
Dihidrogenofosfato de potássio	63 :	mg

[00015] Podem ser utilizadas composições eletroliticas alternativas, desde que sejam fisiologicamente aceitáveis e possuam uma composição de eletrólito relativamente próxima da do plasma. Dextranos [00016] Como notado, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada compreende dextrano. Os dextranos são polissacarídeos com pesos moleculares maiores ou iguais a 1000 daltons (Da) , que possuem uma estrutura linear de unidades de repetição de Dglucopiranosil α-ligadas, e que podem ser agrupadas em três classes, Classe 1, Classe 2 e Classe 3, com base em suas estruturas. Os dextranos que estão comercialmente disponíveis podem ser classificados de acordo com a fonte e/ou peso molecular médio ponderai. Dextranos comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, dextranos obtidos de Leuconostoc spp. ou Leuconostoc mesenteroides. Os dextranos comercialmente disponíveis também incluem, por

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9/33 exemplo, dextranos com pesos moleculares médios ponderais

de aproximadamente 20000 Da	, também	denominados	Dextran	20,
aproximadamente 40000 Da,	também	denominado	Dextran	40,
aproximadamente 60000 Da,	também denominado Dextran 60	, θ
aproximadamente 70000 Da,	também	denominado	Dextran	70,

entre outros, bem como misturas desses dextranos e de outros.

[00017] O Dextran 40 é ideal para preservação de órgãos, devido ao tamanho molecular ótimo, que fornece pressão oncótica suficiente em soluções de dextrano sem aumentar a viscosidade desnecessariamente, particularmente quando fornecido em 40 a 60 g/L, de um modo preferido 50 g/L, em soluções de dextrano. No entanto, Dextran 60, Dextran 70, ou qualquer outro dextrano com uma distribuição de tamanho molecular oncótica entre os de Dextran 20 e Dextran 70 pode substituir o Dextran 40 para fornecer resultados aceitáveis.

[00018] Consequentemente, em algumas modalidades da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada, o dextrano tem um peso molecular médio ponderai de 20000 a 70000 Da, por exemplo, 30000 a 50000 Da, ou 33000 a 42000 Da. Também em algumas modalidades, o dextrano compreende Dextrano 40. Também em algumas modalidades, o dextrano está presente na solução a uma concentração de 40 a 60 g/L, por exemplo 45 a 55 g/L, 48 a 52 g/L, ou 50 g/1.

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Também em alguns exemplos, o dextrano compreende um dextrano obtido de Leuconostoc spp. ou Leuconostoc mesent eroides.

Glicose, ions de cálcio e tampão [00019] Como notado, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada também compreende glicose e ions de cálcio.

[00020] Nos últimos 15 anos aproximadamente, a solução Perfadex® foi usada em cerca de 90% de todos os enxertos de pulmão antes do transplante. A solução Perfadex®, como todas as outras soluções comerciais de Dextran 40, foi fornecida comercialmente em um pH baixo de cerca de 4 a 6 e, portanto, exigiu tamponamento, para obter um pH mais alto, imediatamente antes do uso. Esse tamponamento foi feito predominantemente com TRIS. A razão pela qual a solução Perfadex® foi fornecida a um pH baixo é aumentar a estabilidade do produto, particularmente glicose, e não menos durante a esterilização por calor. Como discutido em detalhe abaixo, os presentes inventores mostraram que, ao contrário da técnica anterior, na solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como divulgada aqui um pH aumentado de 7,0 a 7,8, preferencialmente 7,4 ± 0,2, antes da esterilização por calor estabiliza a glicose durante o processo de esterilização por calor.

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11/33 [00021] Muitos usuários também suplementaram a solução Perfadex® com uma solução estéril de ions de cálcio imediatamente antes do uso, pois isso mostrou ser benéfico para o endotélio (Ingemansson et al., 1996). Uma razão pela qual os ions de cálcio não foram incluídos na solução Perfadex® até pouco antes do uso foi que havia uma expectativa de que se os íons de cálcio fossem adicionados antes da esterilização por calor da solução Perfadex®, então o fosfato de cálcio se precipitaria durante a esterilização por calor e armazenamento subsequente. Surpreendentemente, os presentes inventores mostraram que a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada não exibe a formação de precipitado durante a esterilização por calor ou armazenamento subsequente durante 24 meses após a esterilização por calor. Além disso, ao contrário do estado da técnica, os inventores mostraram que a suplementação de íons de cálcio, juntamente com um pH de 7,0 a 7,8, de um modo preferido 7,4 ± 0,2, estabiliza sinergicamente a glicose durante a esterilização por calor.

[00022] Por essas razões, tanto o tamponamento TRIS quanto a suplementação de íons de cálcio da solução Perfadex® foram entendidos como benéficos ou mesmo necessários para o uso final, mas nem os íons de cálcio, nem o TRIS foram fornecidos anteriormente na solução

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Perfadex® até pouco antes do uso devido aos problemas esperados durante a esterilização por calor e armazenamento. Uma vantagem da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada, baseada em prétamponamento e pré-suplementação de cálcio antes da esterilização por calor, é que a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos pode ser fornecida como um produto pronto para uso. Um produto pronto para uso proporciona conveniência para o usuário e melhora a segurança, pois há menos risco envolvido, em termos de tamponamento defeituoso e/ou outra suplementação, quando nenhum tamponamento adicional ou outra suplementação é necessária.

[00023] Consequentemente, em algumas modalidades da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada, a glicose estava presente na solução a 0,5 a 5 g/L antes da esterilização por calor, por exemplo, 0,6 a 3 g/1, 0,8 a 2 g/1, 0,9 a 1,5 g/1 ou 1 g/1. Com isto entendese que a glicose estava presente em uma solução inicial a 0,5 a 5 g/1, antes de submeter a solução inicial a esterilização por calor para obter a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos e, portanto, antes da degradação parcial de glicose que ocorre durante a esterilização por calor. Assim, em alguns exemplos, a glicose pode ser adicionada a uma solução inicial em 0,5 a 5 g/L e, então, a solução inicial pode ser submetida à esterilização por

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13/33 calor, proporcionando assim a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos em que a glicose estava presente na solução em 0,5 a 5 g/L.

[00024] Também em algumas modalidades, a degradação da glicose durante a esterilização por calor foi inferior a 10%, por exemplo, inferior a 9,5% ou inferior a 9,0%. Com isto entende-se que a esterilização por calor de uma solução inicial, para obter a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos, resulta na solução de perfusão e/ou preservação de órgãos com uma concentração de glicose menor que a concentração de glicose presente na solução inicial, a diminuição é devida novamente à degradação parcial da glicose que ocorre durante a esterilização por calor, e a diminuição é menor que 10% da concentração de glicose que estava presente na solução inicial.

[00025] Além disso, em algumas modalidades da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada, os ions de cálcio estão presentes na solução a uma concentração de 0,3 a 1,5 mM, por exemplo, 0,4 a 1 mM ou 0,5 mM. Também em algumas modalidades, a solução não resulta em precipitado durante 24 meses de armazenamento a 5 a 25 °C. Também em algumas modalidades, a solução compreende ainda ions fosfato. Também em algumas modalidades, os ions fosfato estão presentes na solução a

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14/33 uma concentração de 0,2 a 0,8 mM, por exemplo, 0,7 a 0,8 mM.

Temperatura da solução, escolha do tampão e pH [00026] Como notado, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada também compreende um tampão. Além disso, a solução tem um pH de 6,6 a 7,8 e é estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor.

[00027] A perfusão e preservação da lavagem de órgãos é feita em temperaturas sub-fisiológicas. Normalmente, uma descarga à temperatura ambiente é feita no início da lavagem dos órgãos, depois da lavagem a frio e preservação a frio são realizadas entre 2 e 15 °C. O pH da solução de dextrano correspondente depende da temperatura. Isso é especialmente verdadeiro quando um tampão como o TRIS é usado na solução de dextrano. O pH de uma solução tamponada TRIS aumenta cerca de 0,01 unidades de pH por decréscimo de grau Celsius. Convencionalmente, o pH é medido à temperatura ambiente, o que significa 18 a 25 °C, ou mais particularmente 25 °C. A diferença de temperatura entre 25 °C e 5 °C resulta em um aumento de pH de aproximadamente 0,2 unidades de pH para uma solução tamponada TRIS.

[00028] Os tecidos, especialmente os pulmões, são mais sensíveis ao pH acima de 7,4, e particularmente acima

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15/33 de 7,8, do que ao pH abaixo de 7,4. Por isso, é benéfico se o pH na solução de dextrano não for superior a 7,8 a qualquer temperatura da sua utilização e, de um modo preferido, não for superior a 7,6. Na faixa inferior, um pH tão baixo quanto 6,6, medido a 25 °C, seria aceitável para armazenamento a 2 a 15 °C, uma vez que o pH da solução de dextrano seria um pouco maior na temperatura mais baixa. 0 tecido pulmonar também sustentaria o curto período de lavagem à temperatura ambiente com uma solução com pH tão baixo quanto 6, 6, especialmente porque há mais albumina sérica presente na vasculatura durante a lavagem do que durante a preservação, e como a albumina sérica tamponará a fraca acidez da solução de dextrano.

[00029] Como notado, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada pode ser prétamponada com TRIS. O pré-tamponamento com TRIS utiliza a dependência de temperatura do tamponamento com TRIS e, portanto, mantém um pH aceitável pós esterilização por calor para sua temperatura de uso pretendida, e nenhum tamponamento é requerido pelo usuário. O pH da solução antes da esterilização por calor, isto é, o pH de uma solução inicial que será esterilizada por calor para produzir a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos, deve preferencialmente ser de 7,0 a 7,8, à temperatura ambiente ou 25 °C antes da esterilização por calor, mais

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16/33 preferivelmente 7,2 a 7,6. 0 pH da solução terá geralmente diminuído até 0,4 unidades de pH, e mais particularmente 0,1 a 0,3 unidades de pH, após esterilização por calor devido a degradação de glicose e dextrano. Por conseguinte, preparando uma solução inicial com um pH de 7,0 a 7,8, à temperatura ambiente, ou 25 °C, de um modo mais preferido

7,2 a 7,6, antes da esterilização por calor, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos terá um pH adequado para perfusão e/ou preservação de órgãos após esterilização por calor, por exemplo, um pH de 6,6 a 7,8, um pH de 6,7 a 7,7, ou um pH de 6,9 a 7,6, também à temperatura ambiente, ou 25 °C.

[00030] Como será reconhecido, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada também pode ser pré-tamponada com tampões diferentes de, ou em adição a, TRIS, por exemplo, um tampão orgânico ou biológico diferente de, ou além do, TRIS, baseado em princípios similares como discutido para TRIS. Um exemplo de tal tampão alternativo é o BIS-TRIS.

[00031] Como também será reconhecido, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada pode ser esterilizada por calor com base na esterilização por vapor em um autoclave a uma temperatura adequada durante um período de tempo adequado, por exemplo, a 121 °C

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por 20 minutos	ou mais ou	com	tempo	e temperatura
alternativos	para	atingir F0 de	12 a	15.
[00032]	Consequentemente,	em	algumas	modalidades da

solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada, o tampão compreende um tampão orgânico ou biológico que está presente na solução a uma concentração de 1 a 15 mM, por exemplo, 1,5 a 10 mM, 2 a 5 mM ou 3 mM. Também em alguns exemplos, o tampão orgânico ou biológico compreende TRIS em uma concentração de 1 a 5 mM, por exemplo, 1,5 a 4 mM ou 3 mM.

[00033] Além disso, em algumas modalidades, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos tem um pH de

6,6 a 7,8 à temperatura ambiente, por exemplo, a 18 a 25 °C ou a 25 °C. Também em algumas modalidades a solução tem um pH de 6,7 a 7,7, ou um pH de 6,9 a 7,6, também à temperatura ambiente, por exemplo, a 18 a 25 °C ou a 25 °C.

[00034] Além disso, em algumas modalidades, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos é estéril tendo sido submetida à esterilização por calor com base na esterilização por vapor em um autoclave, por exemplo, a 115 a 130 °C, ou a 118 a 123 °C, ou a 121 °C, durante pelo menos 5 minutos, ou pelo menos 10 minutos, ou durante 20 minutos ou mais, para obter uma F0 de pelo menos 10, ou pelo menos 12, ou pelo menos 15, ou de 12 a 15.

Degradação de glicose durante a esterilização por calor

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18/33 [00035] Considerando a degradação da glicose em mais detalhes, a degradação da glicose durante a esterilização por calor tem sido investigada principalmente em relação a soluções de nutrição peritoneal e em soluções para diálise peritoneal. Estas soluções contêm concentrações relativamente altas de glicose, tipicamente cerca de 1,5%, e são frequentemente usadas repetidamente no mesmo paciente. O tema da degradação da glicose em soluções de diálise peritoneal, seus efeitos tóxicos e medidas preventivas tomadas para evitar os efeitos tóxicos, foram exaustivamente investigados por pesquisadores do Hospital Universitário de Lund, juntamente com os pesquisadores da Gambro AB, em Lund, Suécia. Seus resultados foram publicados em várias publicações, algumas das quais são referenciadas aqui como (Nilsson Thorell et al. , 1993,

Ledebo et al., 2000, e Wieslander et al., 1995) . Em (Nilsson Thorell et al. , 1993), vários produtos de degradação da glicose foram identificados como acetaldeido, 5-HMF, glioxal, metilglioxal, formaldeido e 2-furaldeido. Concluiu-se também que havia mais produtos de degradação não identificados presentes que poderíam ser responsáveis pelos efeitos citotóxicos observados após a esterilização por calor das soluções de diálise peritoneal.

[00036] As respostas para evitar a degradação da glicose, como proposto por (Ledebo et al., 2000, e

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Wieslander et al., 1995), baseiam-se principalmente em evitar a esterilização por calor. Se uma solução deve ser esterilizada por calor, isso deve ser feito em um pH baixo, preferencialmente em torno de 3 a 3,5, ou a glicose não deve ser esterilizada junto com os eletrólitos.

[00037] Em soluções de dextrano para perfusão de órgãos, a concentração de glicose geralmente é de cerca de 0,05 a 0,5%. Foi bem reconhecido que a glicose é degradada durante a esterilização por calor e isto foi neutralizado através da suplementação de glicose durante a produção em cerca de 5 a 10%, para pelo menos estar mais perto do alvo estimado no produto final após esterilização por calor. Tipicamente, 10 a 15% da glicose seriam degradados durante a esterilização por calor com base na esterilização a vapor como descrito acima, por exemplo, para atingir uma F0 de 12 a 15. Os efeitos potencialmente tóxicos dos produtos de degradação não foram considerados, provavelmente porque a exposição subsequente é curta e única. Embora não tenha sido observada toxicidade direta com a utilização de soluções de dextrano para a perfusão de órgãos, uma redução de produtos de degradação de glicose potencialmente tóxicos, conforme alcançada para a solução de perfusão e preservação de órgãos como aqui divulgada, deve ser benéfica, pois deve melhorar ainda mais a segurança do produto. Outra vantagem com a glicose estabilizada durante

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20/33 a produção das soluções de perfusão e/ou preservação de órgãos é que garante melhor o importante teor de glicose no produto final em níveis que suportarão o metabolismo durante o armazenamento de um tecido ou órgão isolado. Estabilização da glicose [00038] Considerando a estabilização da glicose em maior detalhe, como é mostrado na técnica anterior referenciada (Ledebo et al., 2000, e Wieslander et al., 1995), um pH baixo é considerado essencial para reduzir a degradação da glicose e formação de produtos de degradação da glicose. Além disso (Wieslander et al., 1995) afirma que o Ca2⁺ é uma substância catalítica para a degradação da glicose e sugere que Ca2⁺, juntamente com os ions Mg2⁺, Cl~ e Na⁺, devem ser mantidos separados da glicose durante a esterilização por calor.

[00039] Como referido acima, os presentes inventores mostraram que, ao contrário do estado da técnica, um pH aumentado de 7,0 a 7,8, preferivelmente 7,4 ± 0,2, antes da esterilização por calor estabiliza a glicose durante o processo de esterilização por calor, novamente com base na esterilização a vapor como descrito acima, por exemplo, para alcançar uma F0 de 12 a 15. Também como notado, ao contrário do estado da técnica, os presentes inventores mostraram que a suplementação de ions de cálcio, juntamente com um pH de 7,0 a 7,8, de preferência 7,4 ± 0,2,

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21/33 estabiliza sinergicamente a glicose durante a esterilização por calor. Nenhum efeito estabilizante é observado quando a solução é suplementada com ions de cálcio, mas sem o aumento do pH. Como é mostrado na Tabela 2 do Exemplo 1, as duas soluções sem ajuste de pH e sem um tampão orgânico ou biológico estável à esterilização por calor, tal como TRIS (isto é, LPD e LPD + CaCU) perdem quase 13% da glicose devido à degradação da glicose durante a esterilização por calor, enquanto que na solução tamponada TRIS ajustada para um pH de 7,4 ± 0,2 (LPD + TRIS) a degradação é inferior a 10%, e também com suplementação de ions de cálcio (LPD + TRIS + CaCÍ2) a degradação é inferior a 9%.

[00040] Como descrito acima, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada é prétamponada a um pH fisiologicamente aceitável e suplementada com uma concentração baixa de ions de cálcio, que proporciona uma matriz eletrolitica mais parecida com plasma para a solução. O tamponamento com TRIS para um pH fisiologicamente aceitável tem um efeito protetor da glicose durante a esterilização por calor. Além disso, a combinação de ions de cálcio e um pH f isiologicamente aceitável da solução estabiliza sinergicamente a glicose durante a esterilização por calor.

Seleção do tampão

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22/33 [00041] Considerando os tampões com maior detalhe, os tampões para a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos aqui descritos, destinados à esterilização por calor, devem ser cuidadosamente selecionados, uma vez que muitos tampões, tais como MOPS e HEPES, podem degradar durante a esterilização por calor. Outro fator importante, ao selecionar um tampão para uma solução eletrolitica quase fisiológica, é o risco de precipitação entre o tampão e os cátions divalentes durante a produção e durante a vida útil do produto. O bicarbonate e o fosfato são conhecidos por precipitarem com ions de cálcio e magnésio quando presentes em concentrações acima dos limites de solubilidade. O TRIS é um tampão ideal para soluções esterilizadas por calor, embora possam ser utilizados outros tampões proporcionando as mesmas duas propriedades de serem esterilizáveis pelo calor e não formarem precipitado com cátions divalentes. Outro fator benéfico para um tampão usado em uma solução de perfusão e/ou preservação para uso em hipotermia menor ou igual a 25 °C, ou de um modo preferido menor ou igual a 15 °C, é a dependência do pH da temperatura. Como observado acima, o TRIS fornece um aumento de pH de cerca de 0,01 por decréscimo de grau Celsius. Isto significa que a solução pode ser armazenada a um pH ligeiramente mais baixo à temperatura ambiente, proporcionando estabilidade ao

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23/33 produto, sem comprometer o pH fisiológico aceitável na temperatura mais baixa de uso.

[00042] A concentração do tampão deve ser suficiente para manter um pH de 6,6 a 7,8 ao longo da vida útil do produto, mas não deve exceder qualquer nível de toxicidade para o tecido. Para o TRIS, uma concentração na solução final de 1 a 15 mM, ou de um modo preferido de 1 a 5 mM, é considerada suficiente e segura. Fonte de ions de cálcio [00043] A fonte de ions de cálcio para a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada pode ser qualquer sal de ions de cálcio solúvel fisiologicamente aceitável, tal como lactato de cálcio, gluconato de cálcio ou, de um modo preferido cloreto de cálcio. A concentração de ions de cálcio na solução de perfusão e/ou preservação de órgãos deve ser semelhante à concentração no plasma humano, que é de cerca de 1,5 mM. Uma concentração ligeiramente menor pode ser benéfica, pois reduz o risco de precipitação com ions de fosfato presentes na solução. A concentração ótima de ions de cálcio na solução é, portanto, de 0,3 a 1,5 mM. Água [00044] Como notado, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos como aqui divulgada também compreende

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24/33 água. A água adequada inclui água de gualidade extremamente alta, como água para injeção.

Métodos de preparação das soluções de perfusão e/ou preservação de órgãos [00045] Como notado acima, a presente invenção também proporciona um método para preparar solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado.

[00046] O método compreende uma etapa de (1) combinar o dextrano, a glicose, os ions de cálcio, o tampão e a água para obter uma solução inicial. O método também compreende uma etapa de (2) ajustar o pH da solução inicial para 7,0 a 7,8, ou para 7,2 a 7,6, se necessário. O método também compreende uma etapa de (3) submeter a solução inicial à esterilização por calor, obtendo assim a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos.

Métodos de perfusão e/ou preservação de um tecido ou órgão isolado [00047] Como notado acima, a presente invenção também fornece um método de perfusão e/ou preservação de um tecido ou órgão isolado.

[00048] O método compreende uma etapa de (1) obter um volume da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado a partir de um recipiente estéril no qual a solução foi armazenada. O método também

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25/33 compreende uma etapa de (2) administrar o volume obtido da solução ao tecido ou órgão isolado, perfundindo e/ou preservando o tecido ou órgão isolado. 0 recipiente estéril pode ser, por exemplo, um saco de fluido estéril, tal como um saco de fluido estéril de 1000 mL, ou um saco de fluido estéril de 3000 mL, entre outros recipientes.

[00049] Em algumas modalidades do método, a obtenção da etapa (1) compreende a inserção de tubo esterilizado no recipiente esterilizado e permite que o volume da solução flua do recipiente esterilizado através do tubo esterilizado e a administração da etapa (2) compreende administrar o volume obtido da solução do tubo estéril para o tecido ou órgão isolado.

[00050] Também em algumas modalidades, a administração da etapa (2) é realizada em hipotermia inferior ou igual a 25 °C. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração da etapa (2) é realizada em hipotermia de 2 a 15 °C.

[00051] Também em algumas modalidades, o volume obtido da solução não é suplementado com ingredientes adicionais durante ou entre as etapas (1) e (2) . De acordo com estas modalidades, o volume obtido da solução não é suplementado com tampão adicional, nem ácido ou base, nem meio de cultura, nem quaisquer outros ingredientes adicionais, durante ou entre as etapas (1) e (2). Como será

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26/33 reconhecido, de acordo com estas modalidades, a solução foi fornecida pronta para usar. Como também será reconhecido, no entanto, em outras modalidades, o volume obtido da solução pode ser submetido à suplementação adicional com ingredientes adicionais, dependendo das circunstâncias da perfusão e/ou preservação.

[00052] Também em algumas modalidades, o tecido ou órgão isolado compreende um ou mais de pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas e/ou intestino. O tecido ou órgão isolado pode ser circulatório isolado dentro da cavidade do doador, ou após a recuperação do corpo doador, ou ambos em sequência.

Métodos para lavagem, armazenamento e/ou transporte de um pulmão isolado após a remoção de um doador, em preparação para eventual transplante em um receptor [00053] Como notado acima, a presente invenção também fornece um método para lavagem, armazenamento e/ou transporte de um pulmão isolado após remoção de um doador em preparação para eventual transplante em um receptor.

[00054] O método compreende uma etapa de (1) lavar o pulmão isolado do doador com um volume de lavagem de uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado. O método também compreende uma etapa de (2) encher um recipiente de armazenamento de órgãos estéreis pelo menos parcialmente com um volume de

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27/33 enchimento da solução, e imergir o pulmão isolado no volume de enchimento da solução.

[00055] De acordo com este método, a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos pode servir como uma solução extracelular pré-tamponada contendo Dextran 40 e cálcio que pode ser usada para resfriamento rápido, perfusão e armazenamento de pulmões em conexão com transplante. A administração da solução nas temperaturas recomendadas resfria efetivamente o órgão para reduzir suas necessidades metabólicas. Técnica asséptica deve ser usada.

[00056] Também de acordo com este método, as etapas (1) e (2) podem ser realizadas em várias ordens. Por exemplo, a lavagem da etapa (1) pode ser realizada primeiro, seguido pelo enchimento da etapa (2), depois a imersão da etapa (2) . Também por exemplo, o enchimento da etapa (2) pode ser realizado primeiro, seguido pela lavagem da etapa (1), depois a imersão da etapa (2) . Também, por exemplo, a lavagem da etapa (1) e o enchimento da etapa (2) podem ser realizados ao mesmo tempo, seguidos pela imersão da etapa (2).

[00057] Em algumas modalidades do método, a lavagem da etapa (1) pode inicialmente ser feita à temperatura ambiente para remover mais completamente o sangue da circulação seguido por lavagem a frio realizada a 2 a 8 °C. A lavagem deve preferencialmente ser feita tanto

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28/33 anterógrado quanto retrógrado. A lavagem de acordo com a etapa (2) é de preferência realizada entre 2 e 8 °C. Isto pode ser feito, por exemplo, com base no volume de descarga da solução a ser fornecido primeiro à temperatura ambiente, depois a 2 a 8 °C, e pelo volume de enchimento da solução a ser fornecido entre 2 e 8 °C.

[00058] Também em algumas modalidades, a lavagem da etapa (1) resulta em um efluente do pulmão isolado e é realizada até o efluente ficar claro. Por exemplo, a lavagem pode ser realizada pela administração do volume de lavagem da solução por fluxo continuo, resultando em um efluente do pulmão isolado. Também, por exemplo, a lavagem pode ser realizada até que o efluente tenha uma nitidez que seja a mesma que a de um volume de referência da solução de perfusão e/ou preservação de órgãos que não tenha sido usada para lavagem.

[00059] Também em algumas modalidades, o volume de lavagem da solução corresponde a 50 a 75 mL da solução por kg de peso corporal do doador e/ou de 3 a 8 L da solução, embora em outras modalidades o volume de lavagem possa ser superior ou inferior a esses volumes.

[00060	] Também em	algumas	modalidades, o	método
compreende	ainda	etapas	de (3)	vedar	o recipiente de
armazenamento de	órgãos	estéreis,	com	o pulmão	isolado
contido no	mesmo,	com um	fecho esté	r 11; e	depois (4)	manter

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29/33 o recipiente de armazenamento de órgãos esterilizado a 2 a °C durante até 12 horas, dependendo da qualidade inicial

do pulmão,	antes	do transplante	do pulmão isolado	para	o
receptor, em que etapas (1) e (2).	as etapas (3) e	(4) são realizadas	após	as
[00061	] De	acordo com	estas modalidades,	a

manutenção da etapa (4) pode ser realizada, por exemplo, colocando o recipiente de armazenamento de órgãos esterilizado, selado de tal modo, dentro de uma caixa de papelão bem isolada ou caixa de transporte a 2 a 8 °C. Nestes exemplos, o gelo pode ser usado para cercar o recipiente estéril de armazenamento de órgãos, mas o gelo não deve entrar em contato direto com o pulmão isolado.

[00062] Também de acordo com estas modalidades, o pulmão isolado pode ser armazenado, com base na sua qualidade inicial durante 1 a 12 horas, 3 a 12 horas, 6 a 12 horas, 9 a 12 horas, 10 a 12 horas, ou 11 a 12 horas antes do transplante do pulmão isolado para o receptor. Também de acordo com estas modalidades, enquanto o pulmão isolado está sendo assim armazenado, o pulmão isolado pode ser transportado para o receptor, por exemplo, transportado dentro de uma instalação de assistência médica, como um hospital e/ou um centro de transplante de órgãos, ou entre instalações de atendimento médico.

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30/33 [00063] Também em algumas modalidades, o volume de lavagem da solução é obtido a partir de um ou mais recipientes estéreis nos quais a solução foi armazenada. O um ou mais recipientes estéreis podem ser recipientes estéreis como discutido acima, por exemplo, um ou mais sacos estéreis de 1000 ml e/ou um ou mais sacos estéreis de 3000 ml, entre outros. De acordo com estas modalidades, o volume de lavagem da solução não é suplementado com ingredientes adicionais antes ou durante a etapa (1).

[00064] Também em algumas modalidades, o volume de enchimento da solução é obtido a partir de um ou mais recipientes estéreis nos quais a solução foi armazenada. O um ou mais recipientes estéreis podem ser recipientes estéreis como discutido acima, por exemplo, um ou mais sacos estéreis de 1000 ml e/ou um ou mais sacos estéreis de 3000 ml, entre outros. De acordo com estas modalidades, o volume de enchimento da solução não é suplementado com ingredientes adicionais antes ou durante a etapa (2).

[00065] Também em algumas modalidades a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos não é suplementada com ingredientes adicionais antes ou durante quaisquer etapas do método. Como será reconhecido, de acordo com estas modalidades, a solução foi fornecida pronta para usar. Como também será reconhecido, no entanto, em outras modalidades, alguns volumes da solução podem ser suplementados com

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31/33 ingredientes adicionais, dependendo das circunstâncias da lavagem, armazenamento e/ou transporte.

Exemplo 1 [00066] Quatro soluções de teste foram preparadas de acordo com a Tabela 1.

Tabela 1

Componente	LPD	LPD + TRIS	LPD + CaCl₂	LPD + TRIS + CaCl₂
Dextran-4 0	50 g	50 g	50 g	50 g
Cloreto de sódio	8 g	8 g	8 g	8 g
D-Glicose monohidratada	1 g	1 g	1 g	1 g
Cloreto de potássio	400 mg	400 mg	400 mg	400 mg
Sulfato de magnésio 7H₂O	200 mg	200 mg	200 mg	200 mg
Fosfato dissódico 12H₂O	117 mg	117 mg	117 mg	117 mg
Dihidrogenofosfato de potássio	63 mg	63 mg	63 mg	63 mg
TRIS	Não aplicável	7 4 mg	Não aplicável	7 4 mg
Cloreto de cálcio 2H₂O	Não aplicável	Não aplicável	242 mg	242 mg
Água (água para injeção)	Adicionar a 1 L	Adicionar a 1 L	Adicionar a 1 L	Adicionar a 1 L
pH ajustado para	Não aplicável	7,4 +/0,2	Não aplicável	7,4 +/0,2

[00067] Todas as quatro soluções foram autoclavadas simultaneamente a 121 °C por 20 min, correspondendo a uma F0 de 15.

[00068] A degradação da glicose em cada solução após esterilização por calor foi medida utilizando análise de glicose por HPLC DRI de acordo com a farmacopeia norte

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32/33 americana para o Dextran 40 na injeção de glicose. Os resultados estão resumidos na Tabela 2.

Tabela 2

Solução	% de degradação de glicose
LPD	12,84
LPD + CaCl₂	12,64
LPD + TRIS	9, 8
LPD + TRIS + CaC12	8,75

[00069] Os ions de cálcio por si só não forneceram um efeito estabilizador da glicose como o pré-tamponamento fez. No entanto, a combinação de ions de cálcio e prétamponamento proporcionou um efeito sinérgico de estabilização da glicose.

[00070] A formação do precipitado também foi medida em duas soluções. A Tabela 3 resume os dados turbidimétricos, após 24 meses de armazenamento a duas temperaturas diferentes, de LPD e LPD + cálcio + TRIS. A medição da turbidez foi realizada utilizando um método da farmacopeia europeia, 2.2.1 Nitidez e Grau de Opalescência de Líquidos, com turbidez expressa como unidades de turbidez nefelométrica (doravante NTU) . Tabela 3.

24 meses	Turbidez PhEur 2.2.1 (armazenamento a 5 °C)	Turbidez PhEur 2.2.1 (armazenamento a 25 °C)
LPD	1,84 NTU	1,76 NTU
LPD + 3 mM TRIS + 0,5 mM Ca²⁺	1,61 NTU	1,60 NTU

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Referências

1. Heat sterilization of fluids for peritoneal dialysis gives rise to aldehydes. Nilsson-Thorell CB1, Muscalu N, Andrén AH, Kjellstrand PT, Wieslander AP. Perit Dial Int. 1993,-13(3):208 a 213.

2. Heat sterilization of glicose-containing fluids for peritoneal dialysis: biological consequences of chemical alterations. Wieslander AP, Kjellstrand PT, Rippel B. Perit Dial Int. 1995,-15(7 Suppl) : S52-9; discussion S59-60

3. Can we prevent the degradation of glicose in peritoneal dialysis solutions? Ledebo I, Wieslander A, Kjellstrand P. Perit Dial Int. 2000,-20 Suppl 2:S48-51.

4. Importance of calcium in long-term preservation of the vasculature. Ingemansson R, Sjõberg T, Steen S. Ann Thorac Surg. 1996 Apr;61(4):1158 a 1162.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado, a solução caracterizada pelo fato de compreender dextrano, glicose, ions de cálcio, um tampão e água, em que a solução tem um pH de 6,6 a 7,8 e é estéril com base em ter sido submetida à esterilização por calor, em que todos os componentes estavam presentes antes da esterilização por calor, e em que o tampão compreende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) que está presente na solução a uma concentração de 1 a 15 mM.
2. Solução, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dextrano tem um peso molecular médio ponderado (Mw) de 20000 a 70000 daltons.
3. Solução, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dextrano compreende o Dextrano 40.
4. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o dextrano está presente na solução a uma concentração de 40 a 60 g/1.

5. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a glicose estava presente na solução a 0,5 a 5 g/1 antes da esterilização por calor.

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6. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os ions de cálcio estão presentes na solução a uma concentração de 0,3 a 1,5 mM. 7. Solução, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tampão orgânico ou biológico compreendí s tris(hidroximetil) aminometano (TRIS ) a uma concentração de 1 a 5 mM. 8. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a solução compreende adicionalmente ions fosfato a uma concentração de 0,2 a 0,8 mM.

9. Método de preparação de uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de compreender etapas de: (1) combinar o dextrano, a glicose, os ions de cálcio, o tampão, e a água para obter uma solução inicial; (2) ajustar o pH da solução inicial para 7,2 a 7,6, se necessário; e (3) submeter a solução inicial à esterilização por calor, obtendo assim a solução de perfusão e/ou preservação de órgãos.
10. Método para perfundir e/ou preservar um tecido ou órgão isolado caracterizado pelo fato de compreender as etapas de (1) obter um volume de uma solução de perfusão

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3/4 e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 a partir de um recipiente estéril no qual a solução foi armazenada; e (2) administrar o volume obtido da solução ao tecido ou órgão isolado, perfundindo e/ou preservando o tecido ou órgão isolado.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a obtenção da etapa (1) compreende inserir um tubo estéril no recipiente estéril e permitir que o volume da solução flua do recipiente estéril através do tubo estéril e a administração da etapa (2) compreende administrar o volume obtido da solução a partir do tubo estéril para o tecido ou órgão isolado.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a administração da etapa (2) é realizada em hipotermia inferior ou igual a 25 °C, de um modo preferido em que a administração da etapa (2) é realizada em hipotermia de 2 a 15 °C.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o volume obtido da solução não é suplementado com ingredientes adicionais durante ou entre as etapas (1) e (2) .

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14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o tecido ou órgão isolado compreende um ou mais de pulmão, coração, fígado, rim, pâncreas e/ou intestino.
15. Método para lavagem, armazenamento e/ou transporte de um pulmão isolado após a remoção de um doador em preparação para eventual transplante em um receptor, o método caracterizado pelo fato de compreender etapas de: (1) lavar o pulmão isolado do doador com um volume de lavagem de uma solução de perfusão e/ou preservação de órgãos para um tecido ou órgão isolado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e (2) encher um recipiente de armazenamento de órgãos esterilizado pelo menos parcialmente com um volume de enchimento da solução, e imergir o pulmão no volume de enchimento da solução.