BR112019013193A2

BR112019013193A2 - mutantes algáceos de alta produtividade que têm antena fotossintética reduzida

Info

Publication number: BR112019013193A2
Application number: BR112019013193A
Authority: BR
Inventors: Schultz Andrew; R Moellering Eric; Kuzminov Fedor; Ajjawi Imad; Nominati Jennifer; Verruto John; Kwok Kathleen; Aqui Moena; Bauman Nicholas; R Radakovits Randor; Spreafico Roberto; Imam Saheed; Bailey Shaun
Original assignee: Synthetic Genomics Inc
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-12-10
Also published as: SA519401668B1; CA3047811A1; US11787843B2; US20210188924A1; EP3562833A1; MX2019007765A; JP2020503051A; EP3562833A4; US10968259B2; JP7057786B2; WO2018126201A1; AU2017388870B2; AU2017388870A1; US20180186842A1; US20240052001A1

Abstract

a presente invenção refere-se a micro-organismos fotossintéticos mutantes que têm um gene sgi1 atenuado. os mutantes têm teor de clorofila reduzido e produtividade aumentada em relação a células do tipo selvagem. são também revelados métodos para usar tais mutantes para produzir biomassa ou bioprodutos e métodos para triar tais mutantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’MUTANTES ALGÂCEOS DE ALTA PRODUTIVIDADE QUE TÊM ANTENA FOTOSSINTÉTICA REDUZIDA”.

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade conforme disposto no Título 35 do USC § 119(e) do número de série U.S. 62/441.002, depositado em 30 de dezembro de 2016, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade.

Incorporação da Listagem de Sequências [002] O material na listagem de sequências anexa está incorporado ao presente documento a título de referência neste pedido. O arquivo de texto da listagem de sequências anexo, que tem o nome SGI2080_1WOJSequenceJJsting.txt, foi criado em 28 de dezembro de 2017 e tem 265 quilopares de bases. O arquivo pode ser acessado com o uso de Microsoft Word em um computador que use Windows OS.

Campo da invenção [003] A presente invenção refere-se a mutantes de organismos fotossintéticos que têm teor de clorofila reduzido e produtividade de lipídio e biomassa aumentada. A presente invenção também se refere a métodos para gerar, selecionar e triar tais mutantes.

Antecedentes [004] Modificar geneticamente organismos fotossintéticos para aumentar a eficiência fotossintética para uma produtividade mais alta é um objetivo de longa data de biólogos de plantas e algas. Os documentos n US 2014/0220638 e US 2016/030489, ambos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência, descrevem triagens de mutantes para obter mutantes algáceos denominados mutantes LIHLA que têm teor de clorofila reduzido que

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2/137 são prejudicados em sua capacidade para aclimatar com pouca luz, isto é, os mesmos retêm o estado de baixo teor de clorofila de células adaptadas à muita luz mesmo em pouca luz. O documento n² US 2014/0220638 descreve mutantes algáceos que têm mutações nos genes LAR1, LAR2 e LAR3 Reguladores de Aclimatação à Luz, e o documento n² US 2016/0304896 revela mutantes algáceos que têm mutações no gene SRP54 cloroplástico.

Sumário [005] São fornecidos no presente documento organismos fotossintéticos mutantes que têm um gene atenuado que codifica um polipeptídeo de Melhora Significativa do Crescimento 1 (SGI1). Os organismos fotossintéticos mutantes têm produtividade mais alta do que os organismos fotossintéticos de controle que são substancialmente Idênticos aos micro-organismos fotossintétlco mutantes exceto que os mesmos não têm um gene SGI1 atenuado. Uma produtividade mais alta pode ser medida como a taxa de acúmulo de biomassa ou a taxa de produção de um bioproduto, tal como, por exemplo, lipídio, proteína, um ou mais carboidratos (por exemplo, um ou mais açúcares ou álcoois), pigmentos, antioxidantes, terpenoides, vitaminas ou polímeros. Os mutantes de SGI1 revelados no presente documento podem exibir produtividade aumentada sob condições fotoautotróficas.

[006] Conforme descrito no presente documento, um polipeptídeo SGI1 é um polipeptídeo que tem um domínio de receptor do Regulador de Resposta (domínio de RR) e um domínio de ligação a DNA do tipo myb (myb), em que o domínio de RR é N-terminal ao domínio myb, e os dois domínios são separados por uma sequência de aminoácidos, denominada no presente documento como um ligante, que não pertence a nenhum dos domínios. O domínio de RR e domínio myb em várias modalidades podem estar na metade N-terminal da

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3/137 proteína.

[007] Um gene SGI1 atenuado é um gene SGI1 cuja função ou expressão é interrompida de modo que o produto de gene (o polipeptídeo SGI1) seja reduzido em quantidade ou atividade em relação a sua abundância ou atividade em um organismo do tipo selvagem, isto é, a função do polipeptídeo SGI1 é diminuída devido à mutação do gene SGI1 ou devido a manipulações genéticas fora do próprio gene SGI1 que afetam a expressão do gene SGI1.

[008] Um organismo fotossintético mutante conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado exibe uma produtividade mais alta em relação a um organismo fotossintético de controle e tem teor de clorofila reduzido em relação ao organismo fotossintético de controle. Em alguns exemplos, um organismo fotossintético mutante que tem um gene SGI1 atenuado tem uma quantidade reduzida de clorofila b, e, em alguns exemplos, um organismo fotossintético mutante que tem um gene SGI1 atenuado tem uma razão aumentada de clorofila a:clorofila b. Um organismo fotossintético mutante conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado pode ter tamanho de antena fotossintética diminuído, por exemplo, tamanho de antena do fotossistema II (PSII) reduzido e/ou fotossistema I (PSI) reduzido.

[009] Os mutantes de SGI1 de alta produtividade podem produzir mais blomassa do que um organismo fotossintético de controle, por exemplo, mais biomassa por dia do que o organismo fotossintético de controle ou do tipo selvagem a partir do qual os organismos fotossintéticos mutantes foram derivados. A produtividade de biomassa pode ser produtividade em peso seco sem cinzas (AFDW), peso seco, peso úmido ou carbono orgânico total (TOC). Alternativa ou adicionalmente, um mutante de SGI1 pode produzir mais de um bioproduto, tal como, porém sem limitação, lipídio, proteína,

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4/137 carboidrato, um ou mais policetídeos, um terpenoide, um pigmento, um antioxidante, uma vitamina, um ou mais nucleotídeos, um ou mais ácidos nucleicos, um ou mais aminoácidos, um ou mais carboidratos, um áicool, um hormônio, uma citocina, um peptídeo ou um polímero que é produzido por um organismo de controle cultivado sob condições substancialmente iguais ao longo do mesmo período de tempo.

[0010] Em algumas modalidades, um organismo fotossintético mutante conforme fornecido no presente documento produz pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% mais biomassa do que um organismo fotossintético de controle reproduzido ou cultivado sob condições substancialmente iguais, que, para algas, podem ser condições de cultura em batelada, semicontínua ou contínua e podem ser conduções de cultura repletas de nutrientes ou podem ser condições depletadas de nitrogênio e podem ser condições fotoautotróficas.

[0011] Os mutantes de SGI1 de alta produtividade podem ter um corte transversal de absorção funcional reduzida do PSII (opsii) ou tamanho de antena do PSII reduzido. Por exemplo, o tamanho de unidade em corte transversal da antena do PSII pode ser reduzido em pelo menos cerca de 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% em relação ao tamanho de antena do PSII do micro-organismo de controle. Um mutante de STI1 pode ter adicionalmente um corte transversal de absorção funcional reduzida do PSI (opsi). Por exemplo, o tamanho de unidade em corte

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5/137 transversal da antena do PSI pode ser reduzido em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em relação ao tamanho de antena do PSI de um organismo fotossintético de controle.

[0012] Em várias modalidades, um organismo fotossintético mutante conforme fornecido no presente documento tem Fv/Fm aumentado em relação a um organismo fotossintético de controle. Por exemplo, o organismo fotossintético mutante pode ter Fv/Fm aumentado em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50% em relação a um organismo fotossintético de controle, por exemplo, aumentado em entre cerca de 5% e cerca de 50%, ou entre cerca de 5% e 30%, em relação a um organismo fotossintético de controle.

[0013] Ademais, um organismo fotossintético mutante conforme fornecido no presente documento pode ter uma taxa aumentada de transporte de elétrons no lado aceitante do fotossistema II (Ι/τ’οθ) em relação a uma célula de controle ou do tipo selvagem. Um mutante conforme fornecido no presente documento pode ter um valor de 1/TQa que é aumentado em pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 80% ou 100% em relação a um organismo do tipo selvagem ou de controle.

[0014] Adicionalmente, a taxa de fixação de carbono (Pmax (C)) em um mutante de SGI1 conforme fornecido no presente documento pode ser elevada em relação a um organismo de controle. Por exemplo, Pmax (¹⁴C) pode ser aumentada em pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 80% ou 100% em relação a um organismo de do tipo selvagem ou de controle.

[0015] Em algumas modalidades, mutantes de SGI1 diminuíram o

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6/137 tamanho de antena do PSI e/ou PSH e podem ter adicionalmente uma quantidade mais alta de uma ribulose bisfosfato carboxilase ativase (Rubisco ativase ou RA) do que um organismo de controle ou do tipo selvagem, por exemplo, pelo menos 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2 ou 2,5 vezes a quantidade de RA como um organismo de controle. Em algumas modalidades, os mutantes demonstram expressão reduzida de 6, 8, 10, 12 ou 14 genes LHCP e expressão aumentada de um gene RA, tal como um gene RA-α ou RA-β. São revelados no presente documento organismos fotossintéticos mutantes que têm teor de clorofila reduzido e tamanho de antena do PSIi reduzido em que os mutantes têm uma quantidade mais alta de Rubisco ativase do que os organismos fotossintéticos de controle. Os mutantes podem ter um gene SGI1 atenuado e podem ter uma produtividade mais alta do que os organismos fotossintéticos de controle.

[0016] Um gene SGI1 codifica um polipeptídeo que tem um domínio receptor de resposta (RR) e um domínio myb, em que o domínio myb é C-terminal ao domínio de RR. Em algumas modalidades, o gene codifica um polipeptídeo que tem a arquitetura de domínio (começando a partir da extremidade N-termlnal) RR-ligantemyb, em que o ligante é uma sequência de aminoácidos que não é parte do domínio de RR ou do domínio myb. O ligante pode incluir opcionalmente uma sequência de localização nuclear (NLS). Um polipeptídeo SGI1 pode ser um polipeptídeo que tem um domínio de RR N-terminal a um domínio myb e separado do domínio myb por um ligante que não pertence a nenhum dos domínios, em que o polipeptídeo tem uma pontuação de pelo menos 350 quando submetido à varredura com um Modelo Oculto de Markov (HMM) que reconhece a arquitetura de domínio SGI1 de polipeptídeos SGI1 algáceos, conforme apresentados no Exemplo 6. Os exemplos de tais polipeptídeos SGI são fornecidos nas Tabelas 3 e 4. Em vários

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7/137 exemplos, o gene que é atenuado em um mutante conforme fornecido no presente documento pode (em um organismo do tipo selvagem) codificar um polipeptídeo SGI1 que tem um domínio myb que tem pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio myb, tal como SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID

NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID

NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID

NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 ou SEQ ID NO:75, e/ou que inclui um domínio de RR que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio de RR, tal como SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID

NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQID

NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQID

NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQID

NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 ou SEQ ID NO:57. Alternativa ou adicionalmente, o gene que é atenuado em um mutante conforme fornecido no presente documento pode (em um organismo do tipo selvagem) codificar um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo SGI1, tal como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID

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NO:19, SEQ	ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID
NO:23, SEQ	ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID
NO:27, SEQ	ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID
NO:31, SEQ	ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID
NO:35, SEQ NO:39.	ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 ou SEQ ID

[0017] São fornecidos no presente documento, em algumas modalidades, micro-organismos algáceos mutantes que têm um gene SGI1 atenuado, em que os mutantes têm produtividade de biomassa mais alta ou produzem mais de um bioproduto do que um microorganismo algáceo de controle. Os mutantes algáceos podem ter teor de clorofila reduzido e podem ter tamanho de antena do PSII reduzido. Em alguns exemplos, o gene SGI1 que é atenuado pode codificar um polipeptídeo SGI1 que tem um domínio myb que tem pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio myb, tal como SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, e/ou inclui um domínio de RR que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um domínio de RR, tal como SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49. Alternativa ou adicionalmente, o gene que é atenuado em uma alga mutante conforme fornecido no presente documento pode (em uma alga do tipo selvagem) codificar um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos que tem pelo

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9/137 menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo SGI1, tal como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:19.

[0018] São adicionalmente fornecidos no presente documento mutantes algáceos que têm um gene SGI1 atenuado que tem um teor de proteína por unidade de biomassa mais alto do que as algas progenitoras das quais os mesmos são derivados. As algas com alto teor de proteína podem ter, por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% mais proteína em uma base por biomassa do que uma alga de controle ou do tipo selvagem. Em algumas modalidades, os mutantes SGI1 algáceos que têm teor de proteína aumentado demonstram uma taxa de crescimento mais alta e/ou uma produtividade de biomassa mais alta do que as cepas algáceas de controle ou do tipo selvagem das quais os mesmos são derivados. É também incluída uma biomassa algácea com alto teor de proteína, em que a biomassa algácea compreende células algáceas mutantes que têm um gene SGI1 atenuado, em que as células algáceas mutantes têm um teor de proteína mais alto do que as algas de controle ou do tipo selvagem das quais as mesmas são derivadas. É fornecido adicionalmente um lisado de células mutantes de SGI1 algáceas. O lisado pode ter opcionalmente um teor de proteína mais alto do que um lisado algáceo de células algáceas do tipo selvagem.

[0019] Um micro-organismo algáceo mutante que tem um gene SGI1 atenuado pode produzir mais biomassa ou mais de um bioproduto do que é produzido por um organismo de controle cultivado sob condições substancialmente iguais. O bioproduto pode ser, por

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10/137 exemplo, biomassa, iipídio, proteína ou um carboidrato. Em várias modalidades, um mutante de SGI1 pode produzir mais de um ou mais lipídios, uma ou mais proteínas, um ou mais policetídeos, terpenoide, um pigmento, um antioxidante, uma vitamina, um ou mais nucleotídeos, um ou mais ácidos nucleicos, um ou mais aminoácidos, um ou mais carboidratos, um álcool, um hormônio, uma citocina, um peptídeo ou um polímero que é produzido por uma alga de controle que não tem um gene SGI1 atenuado. Em algumas modalidades, a alga mutante que tem um gene SGI1 atenuado produz pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% mais de um bioproduto do que uma alga de controle cultivada sob condições substancialmente iguais, que podem ser condições de cultura em batelada, semicontínua ou contínua e podem ser conduções de cultura repletas de nutrientes ou podem ser condições depletadas de nitrogênio e podem ser condições fotoautotróficas. A biomassa pode ser medida como, por exemplo, peso seco sem cinzas (AFDW) ou carbono orgânico total (TOC).

[0020] Ademais, um mutante algáceo que tem um gene SGI1 atenuado e que tem produtividade mais alta em relação a uma alga de controle ou do tipo selvagem pode ter teor de clorofila reduzido em relação a uma alga de controle ou do tipo selvagem. Por exemplo, o teor de clorofila total pode ser reduzido em cerca de 20% a cerca de 80% em relação a níveis do tipo selvagem, por exemplo, em cerca de 30% a cerca de 70% dos níveis do tipo selvagem.

[0021] Um micro-organismo algáceo mutante que tem um gene SGI1 atenuado conforme fornecido no presente documento pode ter um tamanho de antena do fotossistema II (PSII) reduzido. Por

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11/137 exemplo, o tamanho de unidade em corte transversal da antena do PSII pode ser reduzido em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em relação ao tamanho de antena do PSII do micro-organismo de controle.

[0022] Um mutante algáceo conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado e que demonstra produtividade mais alta do que um micro-organismo de controle pode ter, opcional e adicionalmente, uma antena do fotossistema I (PSI) reduzida. Por exemplo, o tamanho de unidade em corte transversal da antena do PSII pode ser reduzido em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em relação ao tamanho de antena do PSII do microorganismo de controle.

[0023] Adicionalmente, uma alga mutante conforme fornecida no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado pode ter absorção de carbono aumentada, indicativa da taxa de fotossíntese, em reiação a uma alga de controle, por exemplo, Pmax (C) aumentada em relação a uma alga de controle. A Pmax (C) pode ser aumentada em cerca de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% em relação à Pmax (C) de um micro-organismo de controle.

[0024] Um mutante algáceo conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado pode ter adicionalmente expressão reduzida dos genes LHC. Por exemplo, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 ou pelo menos 12 genes LHC podem ser decrescentemente regulados em relação a seu nível de expressão em uma célula de controle. A redução na expressão dos genes LHC pode

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12/137 ser, por exemplo, uma redução de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% no nível dos transcritos de LHC.

[0025] Ademais, um mutante aigáceo conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado pode ter abundância aumentada de um polipeptídeo de Rubisco Ativase (RA). O nível de proteína RA pode ser, por exemplo, 1,5 vez, 2 vezes, 2,5 vezes ou mais do que 2,5 vezes o nível de uma célula de controle ou do tipo selvagem. Uma ou ambas dentre uma isozima RA alfa ou uma isozima RA beta podem ser aumentadas em um mutante de alta produtividade conforme fornecido no presente documento. O nível de um transcrito de RA pode também ser elevado em um mutante aigáceo conforme fornecido no presente documento, por exemplo, de cerca de 1,2 vez a 10 vezes os níveis do tipo selvagem ou mais. É fornecido no presente documento em algumas modalidades um mutante aigáceo com baixo teor de clorofila que tem tamanho de antena do PSII reduzido e expressão aumentada de RA. A redução no tamanho de antena do PSII pode ser, por exemplo, pelo menos 20% ou pelo menos 30% em relação ao tamanho de antena do PSII do tipo selvagem, e o aumento no nível de proteína RA pode ser pelo menos duas vezes o tipo selvagem.

[0026] Em várias modalidades, um mutante aigáceo de alta produtividade conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado tem pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 17% ou pelo menos 20% mais proteína em uma base por TOC do que uma alga de controle. Por exemplo, o mutante aigáceo de alta produtividade pode produzir pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% mais proteína do que uma célula de controle em uma base diária em um sistema de cultura em batelada, contínuo ou

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13/137 semicontínuo.

[0027] Um micro-organismo algáceo mutante conforme fornecido no presente documento pode ser qualquer microalga eucariótica, tal como, porém sem limitação, uma alga Chlorophyta ou Charyophyta. Por exemplo, a microalga mutante pode ser uma alga Chlorophyta alga da classe Chiorophyceace, Chlorodendrophyceae, Prasinophyceace ou Trebouxiophyceae. Em algumas modalidades, a microalga mutante pode ser um membro da Chlorophyceace, tal como uma espécie de Asteromonas, Ankistrodesmus, Carteria, Chiamydomonas, Chlorococcum, Chiorogonium, Chrysosphaera, Dunaiieila, Haematococcus, Monoraphidium, Neochiohs, Oedogonium, Peiagomonas, Pieurococcus, Pyrobotrys, Scenedesmus ou Voivox. Em modalidades alternativas, a microalga mutante pode ser um membro da Chlorodendrophyceae, tal como uma espécie de Prasinodadus, Scherffeiia ou Tetraseimis. Em modalidades alternativas adicionais, a alga mutante pode ser um membro da Prasinophyceace, opcionalmente uma espécie de Ostreococcus ou Micromonas. Ainda altemativamente, a microalga mutante pode ser um membro da Chlorodendrophyceae, tal como uma espécie de Prasinodadus, ScherffeHa ou Tetraselmis, ou pode ser um membro da Trebouxiophyceae, opcionalmente uma espécie de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Botryococcus, Chlouelia, Auxenochlouelia, Heveochiouella, Marinichlouella, Parachiouelia, Pseudochioueiia, Tetrachloueila, Eremosphaera, Franceia, Micractiniurn, Nannochiouis, Oocystis, Picochiouum, Prototheca, Stichococcus ou Viridieiia.

[0028] Um aspecto adicional da invenção é um método para fabricar um bioproduto, em que o método inclui cultivar um mutante fotossintético conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado para produzir o bioproduto. O método pode incluir

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14/137 ainda recuperar o bioproduto da cultura ou organismo. Por exemplo, o produto pode ser recuperado do meio de cultura, células algáceas coletadas ou cultura total ou pode ser isolado de plantas coletando-se ou homogeneizando-se o tecido vegetal, por exemplo. O bioproduto pode ser, por exemplo, biomassa, proteína, lipídio ou carboidrato. Ademais, o produto pode ser um ou mais lipídios, proteínas, policetídeos, terpenoides, pigmentos, antioxidantes, vitaminas, nucleotídeos, ácidos nucleicos, aminoácidos, carboidratos, álcoois, hormônios, citocinas, peptídeos ou polímeros. Em algumas modalidades, o produto é uma biomassa com alto teor de proteína, em que a proteína constituí pelo menos 50% do TOC do organismo fotossintético ou tecido do mesmo. Em modalidades alternativas, o produto é lipídio e pode ser, por exemplo, triglicerídeo.

[0029] O método pode incluir cultivar um mutante de SGI1 algáceo em cultura em batelada, semicontínua ou contínua em que o meio de cultura pode ser repleto de nutrientes ou pode ser, por exemplo, depletado de nitrogênio. O cultivo pode ser sob condições fotoautotróficas, em que carbono inorgânico, por exemplo, carbonato ou dióxido de carbono, é substancialmente a única fonte de carbono no meio de cultura para a produção de moléculas orgânicas pelo mutante algáceo.

[0030] Ainda outro aspecto da invenção é um método para isolar uma alga mutante que tem produtividade mais alta em relação à alga progenitora da qual a mesma é derivada. O método inclui: cultivar uma cepa algácea sob condições fotoautotróficas semicontínuas ou contínuas por pelo menos vente gerações e Isolar pelo menos uma linhagem mutante da cultura, em que a linhagem isolada tem uma taxa de crescimento mais alta do que a cepa algácea progenitora. O método pode incluir uma etapa de mutagênese antes do cultivo. A mutagênese pode ser por UV, irradiação gama, mutágenos químicos,

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15/137 mutagênese de inserção aleatória ou mutagênese alvejada, por exemplo. Em várias modalidades, as algas são expostas à luz constante durante o cultivo. Em várias modalidades, a intensidade de luz à qual as algas são expostas durante o cultivo é pelo menos 500 uE, pelo menos 600 uE, pelo menos 700 uE, pelo menos 800 uD, pelo menos 900 uE, pelo menos 1.000 uE, pelo menos 1.100 uE, pelo menos 1.200 uD, pelo menos 1.400 uE, pelo menos 1.600 uE, pelo menos 1.800 uE, pelo menos 2.000 uE, pelo menos 2.200 uE, pelo menos 2.500 uE ou pelo menos 3.000 uE.

[0031] A linhagem isolada que tem uma taxa de crescimento mais alta pode ser avaliada quanto à produtividade mais alta em relação à linhagem progenitora, por exemplo, em cultura em batelada, semicontínua ou contínua. Isolar um mutante de alta produtividade pode incluir opcional e adicionalmente: medir um ou mais dentre Fv/Fm, sigma, PSI I, PSI ou Pmax (C) (Pmax para fixação de carbono). [0032] O método pode incluir adicionalmente o sequenciamento do genoma do mutante de alta produtividade isolado para identificar a mutação.

[0033] É ainda outro aspecto da invenção um método para selecionar mutantes algáceos de alta produtividade, em que o método inclui: mutagenizar uma população de algas, selecionar células com baixo teor de clorofila com o uso de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), distribuir linhagens isoladas das células de baixa fluorescência de clorofila em placas com múltiplos poços, triar as células de baixa fluorescência de clorofila em placas de múltiplos poços para o tamanho de antena do fotossistema II (PSII), Fv/Fm, e selecionar pelo menos uma linhagem de células que tem tamanho de antena do PSII reduzido, Fv/Fm aumentado, e aumentou em relação a células do tipo selvagem, para selecionar um mutante de alta produtividade. O método pode incluir opcional e adicionalmente medir

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16/137 a Pmax. A linhagem isolada que tem uma taxa de crescimento mais alta pode ser avaliada quanto à produtividade mais alta em relação à linhagem progenitora, por exemplo, em cultura em batelada, semicontínua ou contínua. O método pode incluir adicionalmente realizar PCR e/ou sequenciar pelo menos uma porção do genoma do mutante de alta produtividade isolado para identitificar a mutação. Breve descrição dos desenhos [0034] As Figuras 1A e 1B fornecem gráficos que mostram melhora da produtividade de TOC de mutantes clássicos de ParachíQuelta A) NE-7843 e B) NE-13380 em relação a WT-1185 sob condições de cultura semicontínua de luz contínua (65% de diluição diária, 2.000 uE, 1% de CO2). Os dados representados são de culturas duplicadas biológicas.

[0035] A Figura 2 é um diagrama da estrutura de gene de Parachlouella T-2261 (SGI1) que representam as localizações de SNPs detectados pelo sequenciamento de genoma de NE-7843 e NE13380. A localização alvejada por um RNA-guia para mutagênese de inserção mediada por Cas9 é também mostrada.

[0036] A Figura 3 é um gráfico que mostra produtividades de TOC de mutantes com knockout de Parachloueka T-2261 (SGI1) gerados por Cas9. Os dados representam a média e 0 desvio padrão das três réplicas biológicas avaliadas sob condições de cultura semicontínua de luz contínua (2.000 μΕ).

[0037] A Figura 4 é um alinhamento do domínio de receptor do Regulador de Resposta (RR) dos polipeptídeos SGI1 algáceos. As sequências mostradas são Parachioreka sp. WT-1185 (SEQ ID NO:58), Coccomyxa subelHpsoidea (SEQ ID NO:59), Ostreococcus lucimarinus (SEQ ID NO:60), Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO:61), Chromochlorís zofíngiensis (SEQ ID NO:62), Volvox carteri (SEQ ID NO:63), Tetraselmis sp. 105 (SEQ ID NO:64), Oocystis sp.

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17/137 (SEQ ID NO:65) e Micromonas sp. RCC299 (SEQ ID NO:66).

[0038] A Figura 5 é um alinhamento do domínio myb dos polipeptídeos SGI1 algáceos. As sequências mostradas são Parachlorella sp. WT-1185 (SEQ ID NO:40), Coccomyxa subellípsoidea (SEQ ID NO:41)_; Ostreococcus lucimarínus (SEQ ID NO:42), Chlamydomonas reinhardtíi (SEQ ID NO:43), Chromochloris zofingiensis (SEQ ID NO:44), Volvox carters (SEQ ID NO:45), Tetraselmis sp. 105 (SEQ ID NO:46), Oocystis sp. (SEQ ID NO:47) e Micromonas sp. RCC299 (SEQ ID NO:48).

[0039] A Figura 6 é um diagrama esquemático do método de triagem por FACS-FIRe. Não é mostrada a mutagênese, que pode ser realizada antes da FACS. O método pode incluir adicionalmente o teste de produtividade.

[0040] A Figura 7 é um diagrama da estrutura de gene SGI1 de Parachlouella que representa localizações de SNPs detectados pelo sequenciamento de genoma de NE-07843 e NE-13380 e das mutações alvejadas sGE-13371, GE13380, GE-16345, GE-16346, GE16347, GE-16399, GE-13232, GE-13428 e GE-16980 resultantes da mutagênese mediada por Cas9. As localizações dos RNAs-guias são mostradas por setas.

[0041] A Figura 8 é um gráfico que mostra os resultados da análise microaproximada da biomassa da cepa do tipo selvagem de Parachlouella WT-1185 e do mutante clássico NE-13380 para determinar o teor de lipídio, proteína e carboidrato. As amostras foram adquiridas a partir de culturas adaptadas à diluição diária de 40% de estado estacionário em um sistema semicontínuo. FAMEs, carboidratos e aminoácidos são representados como a % de TOC alocada a cada fração calculada pelo teor de carbono de cada classe de analito. Os números de inserção na % de C na proteína indicam o valor percentual real.

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18/137 [0042] A Figura 9 é um mapa de calor com base nos dados transcriptômicos para 15 genes LHC de Parachloueüa que (com a exceção de CP26) são decrescentemente regulados no mutante de SGI1 NE-7843 em relação à cepa do tipo selvagem original WT-1185.

[0043] As Figura 10A a 10D fornecem gráficos que mostram os resultados da análise por MRM do PSII, PSI e teor de Rubisco de Parachlouella tipo selvagem (WT-1185) e mutantes clássicos de SGH (NE-7843 e NE-13380). Â) o número de complexos de PSI, PSII e proteína Rubisco por TOC no tipo selvagem WT-1185 e mutante NE7843, B) o número de complexos de PSI, PSII e proteína Rubisco por TOC no tipo selvagem WT-1185 e mutante NE-13380,C) o número de complexos de PSI, PSII e proteína Rubisco no tipo selvagem WT-1185 e mutante NE-13380 em uma base por grama de proteína. D) o teor de proteína mais baixo por TOC na análise por MRM em comparação à análise microaproximada (Figura 8) está relacionado à eficiência de extração não ideal.

[0044] A Figura 11A é um gráfico que mostra a diferença no PSII, PSI e teor de Rubisco Ativase (RA) de Parachlouella tipo selvagem (WT-1185) e do mutante clássico de SGI1 NE-7843 por microanálise.

[0045] A Figura 11B fornece Western blots usados para quantificar PSII, PSI e Rubisco Ativase (RA) em Parachlouella tipo selvagem (WT-1185) e no mutante clássico de SGI1 NE-7843.

[0046] A Figura 12 é um gráfico que mostra que o mutante de SGI1 NE-7843 exibe produtividade de biomassa aumentada sob SOPA (semicontínuo) cultivando em luz diel modelada de acordo com um Imperial Valley típico, CA no dia 4 de maio. Os dados representam triplicatas biológicas.

[0047] A Figura 13 é um gráfico que mostra o acúmulo de TOC volumétrico sob condições de irradiância de diel EPICs em batelada repletas de N. Os dados duplicados biológicos são mostrados

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19/137 individualmente para WT-1185 e NE-13380.

[0048] A Figura 14A é um gráfico que mostra a produtividade de TOC volumétrica sob modo AFS em batelada sem N observada na cepa NE-07843 em comparação à cepa do tipo selvagem WT-1185.

[0049] A Figura 14B é um gráfico que mostra a produtividade de FAME volumétrica sob modo AFS em batelada sem N observada na cepa NE-07843 em comparação à cepa do tipo selvagem WT-1185.

[0050] A Figura 15 fornece diagramas dos alelos de SGM de Tetraseímis e as posições das sequências-alvo de guia MA1 (Guia 1) e JC2 (Guia 2).

[0051] As Figuras 16A a 16C fornecem gráficos que mostram o teor de clorofila de mutantes de SGI1 alvejados por Cas9 em A) uma base por TOC e B) uma base por célula; C) fornece razões de clorofila a:b dos clones mutantes.

[0052] As Figuras 17A a 17D fornecem gráficos que mostram medições fotofisiológicas dos mutantes de SGM de Tetraslmis alvejados por Cas9 A) o corte transversal de PSII medido a 450 nm, B) o corte transversal de PSII medido a 520 nm, C) Fv/Fm e D) a taxa de renovação de PSII.

[0053] As Figuras 18A a 18C fornecem gráficos que mostram medições fotofisiológicas dos mutantes de SGI1 de Tetraslmis alvejados por Cas9 A) ¹⁴C Pmax por célula, B) ¹⁴C Pmax por TOC e C) taxa de crescimento.

[0054] A Figura 19 é um gráfico que fornece a produtividade de TOC areai de duas cepas mutantes de SGI1 de Tetraslmis alvejadas por Cas9, STR24096 e STR24098, em um sistema de cultura de vinte e quatro horas de luz semicontínuo.

[0055] A Figura 20A é um gráfico que fornece a produtividade de TOC areai das duas cepas mutantes de SGI1 de Tetras! mis alvejadas por Cas9, STR24096 e STR24098, em um sistema de cultura diel

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20/137 semicontínuo.

[0056] A Figura 20B é um gráfico que fornece a produtividade de TOC areai de uma cepa mutante de SGI1 de Parachíoueíia classicamente mutagenizada, NE-7843, em um sistema de cultura diel semicontínuo.

[0057] A Figura 21A é uma fotografia de plantas Arabídopsis do tipo selvagem (4 setores na esquerda) e plantas Arabídopsis mutantes ARR2 (4 setores na direita) cultivadas pelo mesmo número de dias.

[0058] A Figura 21B é um gráfico que mostra o teor de clorofila a e clorofila b das plantas Arabídopsis do tipo selvagem e mutantes ARR2 como uma porcentagem em peso úmido.

[0059] A Figura 22A é um gráfico do peso seco de plantas Arabídopsis do tipo selvagem e mutantes ARR2 em 23 dias.

[0060] A Figura 22B é um gráfico do peso úmido de plantas Arabídopsis do tipo selvagem e mutantes ARR2 em 23 dias.

[0061] A Figura 22C é um gráfico do peso seco de plantas Arabídopsis do tipo selvagem e mutantes ARR2 em 18 dias.

[0062] A Figura 22D é um gráfico do peso úmido de plantas Arabídopsis do tipo selvagem e mutantes ARR2 em 18 dias.

Descrição detalhada da invenção [0063] São fornecidos no presente documento mutantes algáceos que têm teor de clorofila reduzida e eficiência fotossintética mais alta em relação a algas de controle, em que os mutantes algáceos têm expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que tem um Domínio Receptor de Resposta e um homeodomínio. A proteína CheY bacteriana é um membro conhecido de um sistema de dois componentes que efetua uma alteração transcricional em resposta a sinais ambientais.

Definições [0064] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos

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21/137 técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. No caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A não ser que exigido de outro modo pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades, e os termos no plural devem incluir o singular. Todas as faixas fornecidas dentro do pedido são inclusivas dos valores nas extremidades superior e inferior da faixa a não ser que especificamente indicado de outro modo.

[0065] Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas no presente documento estão incorporadas a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência.

[0066] O termo e/ou, conforme usado em um sintagma, tal como A e/ou B, no presente documento, é destinado a incluir A e B, A ou B, A e B.

[0067] Cerca de” significa ou dentro de 10% do valor determinado, ou dentro de 5% do valor determinado ou, em alguns casos, dentro de 2,5% do valor determinado, ou cerca de pode significar arredondado ao dígito significativo mais próximo.

[0068] O termo gene é usado amplamente para se referir a qualquer segmento de uma molécula de ácido nucleico (tipicamente DNA, mas opcionalmente RNA) que codifica um polipeptídeo ou RNA expresso. Assim, os genes incluem sequências que codificam o RNA expresso (que podem incluir sequências de codificação de polipeptídeo ou, por exemplo, RNAs funcionais, tais como RNAs ribossômicos, tRNAs, RNAs antissenso, microRNAs, RNAs em formato de grampo curtos, ribozimas, etc.). Os genes podem compreender

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22/137 adicionalmente sequências reguladoras exigidas para ou que afetam sua expressão, assim como sequências associadas a sequências de codificação de RNA ou proteína em seu estado natural, tal como, por exemplo, sequências de introns, sequências não traduzidas 5’ ou 3’, etc. Em alguns exemplos, gene pode se referir apenas a uma porção de codificação de proteína de uma molécula de DNA ou RNA, que pode incluir introns ou não. Um gene tem, de preferência, mais do que 50 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente, mais do que 100 nucleotídeos de comprimento e, pode ter, por exemplo, entre 50 nucleotídeos e 500.000 nucleotídeos de comprimento, tal como entre 100 nucleotídeos e 100.000 nucleotídeos de comprimento ou entre cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 50.000 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 20.000 nucleotídeos de comprimento. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo clonagem de uma fonte de interesse ou sintetização de informações de sequência conhecidas ou previstas.

[0069] O termo ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico refere-se a um segmento de DNA ou RNA (por exemplo, mRNA) e também inclui ácidos nucleicos que têm cadeias principais modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloqueados) ou nucleobases modificadas ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ter fita dupla ou fita simples; uma molécula de ácido nucleico de fita simples que compreende um gene ou uma porção do mesmo pode ser uma fita codiflcadora (senso) ou uma fita não codificadora (antissenso).

[0070] Um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico pode ser derivada de uma fonte indicada, que inclui o isolamento (total ou em parte) de um polipeptídeo ou segmento de ácido nucleico ou de uma fonte indicada. Uma molécula de ácido nucleico pode também ser

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23/137 derivada de uma fonte indicada, por exemplo, clonagem direta, amplificação por PCR ou síntese artificial da fonte de polinucleotídeo indicada ou com base em uma sequência associada à fonte de polinucleotídeo indicada, que pode ser, por exemplo, uma espécie de organismo.

[0071] Os genes ou moléculas de ácido nucleico derivadas de uma fonte ou espécie particular também incluem genes ou moléculas de ácido nucleico que têm modificações de sequência em relação às moléculas de ácido nucleico de fonte, isto é, a sequência do gene ou molécula de ácido nucleico é derivada da sequência de um gene ou molécula de ácido nucleico da fonte ou espécie referida, mas pode ter modificações. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nucleico derivada de uma fonte (por exemplo, um gene referido particular) pode incluir uma ou mais mutações em relação ao gene ou molécula de ácido nucleico de fonte que não são pretendidas ou que são deliberadamente introduzidas, e se uma ou mais mutações, incluindo substituições, deleções ou inserções, forem deliberadamente introduzidas, as alterações de sequência podem ser introduzidas pela mutação aleatória ou alvejada de células ou ácidos nucleicos, por amplificação ou outras técnicas de biologia molecular ou síntese de genes, ou por síntese química, ou qualquer combinação das mesmas. Um gene ou molécula de ácido nucleico que é derivada de um gene ou molécula de ácido nucleico referida que codifica um RNA ou polipeptídeo funcional pode codificar um RNA ou polipeptídeo funcional que tem pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o RNA ou polipeptídeo funcional referido ou de origem, ou com um fragmento funcional do mesmo. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nucleico que é derivada de um gene ou molécula de ácido nucleico referida que

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24/137 codifica um RNA ou polipeptídeo funcionai pode codificar um RNA ou polipeptídeo funcional que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o RNA ou polipeptídeo funcional referido ou de origem, ou com um fragmento funcional do mesmo.

[0072] Similarmente, um polipeptídeo ou proteína derivada de uma origem ou espécie particular inclui polipeptídeos ou proteínas que têm modificações de sequência em relação ao polipeptídeo de origem, isto é, o polipeptídeo é derivado da sequência de um polipeptídeo da origem ou espécie referida, mas tem modificações. Por exemplo, um polipeptídeo ou proteína derivada de uma origem (por exemplo, uma proteína referida particular) pode incluir uma ou mais mutações (diferenças de aminoácido) em relação ao polipeptídeo de origem que não são pretendidas ou que são deliberadamente introduzidas (por exemplo, pela mutação da molécula de ácido nucleico de codificação). Um polipeptídeo que é derivado de um polipeptídeo referido pode ter pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo referido ou de origem, ou com um fragmento funcional do mesmo. Por exemplo, um polipeptídeo que é derivado de um polipeptídeo referido pode ter pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo referido ou de origem, ou com um fragmento funcional do mesmo.

[0073] Conforme usado no presente documento, uma proteína ou ácido nucleico isolado é removido de seu meio natural ou do contexto no qual a proteína ou ácido nucleico existe em natureza. Por exemplo, uma proteína ou molécula de ácido nucleico isolada é removida da

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25/137 célula ou organismo ao qual a mesma está associada em sem ambiente nativo ou natural. Um ácido nucleico ou proteína isolada pode ser, em alguns casos, parcial ou substancialmente purificada, mas nenhum nível de purificação particular é exigido para isolamento. Assim, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser uma sequência de ácido nucleico que foi removida do cromossomo, genoma ou epissomo que é integrado na natureza.

[0074] Uma molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos ou proteína ou sequência de polipeptídeos purificada é substancialmente isenta de material celular e componentes celulares. A molécula de ácido nucleico ou proteína purificada pode ser substancialmente isenta de produtos químicos além de tampão ou solvente, por exemplo. Substancialmente isento não se destina a significar que outros componentes além das moléculas de ácido nucleico inovadoras são indetectáveis.

[0075] Os termos ocorrência natural e tipo selvagem referem-se a uma forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeos ou proteína de ocorrência natural ou do tipo selvagem pode estar presente em e ser isolada de uma fonte natural e não é intencionalmente modificada por manipulação humana.

[0076] Conforme usado no presente documento atenuado significa reduzido em quantidade, grau, intensidade ou força. Um gene atenuado é um gene que produz menos de seu produto codificado e/ou produz um produto codificado menos funcional, em relação a um gene não atenuado ou do tipo selvagem. Um gene atenuado pode, em alguns exemplos, não produzir nenhum de seus produtos codificados ou pode produzir um produto de gene (polipeptídeo) que é completamente inativo. Expressão de gene atenuada pode se referir a uma quantidade e/ou taxa de transcrição significativamente reduzida

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26/137 do gene em questão, ou de tradução, enovelamento, ou montagem da proteína codificada. Como exemplos não limitantes, um gene atenuado pode ser um gene com mutação ou interrompido (por exemplo, um gene interrompido por deleção, truncamento, deslocação do quadro de leitura ou mutação por inserção parcial ou total) que não codifica um quadro de leitura aberto funcional completo ou que tem expressão diminuída devido à alteração ou interrupção das sequências reguladoras de gene. Um gene atenuado pode também ser um gene que tem uma ou mais mutações que afetam a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, em que o polipeptídeo codificado é reduzido em quantidade e/ou atividade pela mutação (ou mutações). Um gene atenuado pode também ser um gene alvejado por um construto que reduz a expressão do gene, tal como, por exemplo, um RNA antissenso, microRNA, molécula de RNAI ou ribozima. A expressão de gene atenuada pode ser uma expressão de gene que é eliminada, por exemplo, reduzida a uma quantidade que é insignificante ou indetectável. A expressão de gene atenuada pode também ser uma expressão de gene que resulta em um RNA ou proteína que não é completamente funcional ou não é funcional, por exemplo, a expressão de gene atenuada pode ser uma expressão de gene que resulta em um RNA e/ou polipeptídeo truncado.

[0077] Molécula de ácido nucleico exógena ou gene exógeno refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou gene que foi introduzido (transformado) em uma célula. Uma célula transformada pode ser referida quanto a uma célula recombinante, na qual um gene (genes) exógeno adicional pode ser introduzida. Um descendente de uma célula transformada com uma molécula de ácido nucleico é também denominado transformado se o mesmo tiver herdado a molécula de ácido nucleico exógena. O gene ou molécula de ácido nucleico exógena pode ser derivada de uma espécie diferente (e

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27/137 assim heteróloga), ou da mesma espécie (e assim homóloga), em relação à célula sendo transformada. Uma molécula de ácido nucleico, gene ou proteína endógena é uma molécula de ácido nucleico, gene ou proteína nativa como a mesma ocorre no, ou é naturalmente produzida pelo, hospedeiro.

[0078] O termo nativo é usado no presente documento para se referir a sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos como as mesmas ocorrem naturalmente no hospedeiro. O termo não nativo é usado no presente documento para se referir a sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos que não ocorrem naturalmente no hospedeiro. Assim, uma molécula de ácido nucleico não nativa é uma molécula de ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula hospedeira, por exemplo, a molécula de ácido nucleico não nativa é exógena à célula hospedeira ou micro-organismo no qual a mesma é introduzida e pode ser heteróloga em relação a célula hospedeira ou micro-organismo. Adicionalmente, uma sequência de ácidos nucleicos ou sequência de aminoácidos que foi removida de uma célula, submetida à manipulação laboratorial e introduzida ou reintroduzida em uma célula hospedeira de modo que a mesma se diferencie em sequência ou localização no genoma em relação a sua posição em um organismo não manipulado (isto é, é justaposta ou ligado de maneira funcional a sequências com as quais a mesma não é justaposta ou ligada de maneira funcional em um organismo não transformado) é considerada não nativa. Os genes não nativos também incluem genes endógenos ao micro-organismo hospedeiro ligada de maneira funcional a uma ou mais sequências reguladoras heterólogas que foram recombinadas no genoma hospedeiro.

[0079] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou geneticamente modificada é uma molécula de ácido nucleico que foi

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28/137 alterada através de manipulação humana. Como exemplos não limitantes, uma molécula de ácido nucleico recombinante inclui qualquer molécula de ácido nucleico que: 1) foi parcial ou completamente sintetizada ou modificada in vitro, por exemplo, com o uso de técnicas químicas ou enzimáticas (por exemplo, pelo uso de síntese de ácido nucleico química, ou pelo uso de enzimas para replicação, polimerização, digestão (exonucleolítica ou endonucleolítlca), ligação, transcrição reversa, transcrição, modificação de base (incluindo, por exemplo, metilação), integração ou recombinação (incluindo recombinação homóloga e sítio-específica) das moléculas de ácido nucleico); 2) Inclui sequências de nucleotídeos unidas que não são unidades em natureza; 3) foi geneticamente modificada com o uso de técnicas de clonagem molecular de modo que a mesma não tenha um ou mais nucleotídeos em relação à sequência de moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural; e/ou 4) foi manipulada com o uso de técnicas de clonagem molecular de modo que a mesma tenha uma ou mais alterações ou reorganizações de sequência em relação à sequência de ácidos nucleicos de ocorrência natural. Como exemplos não limitantes, um cDNA é uma molécula de DNA recombinante, como é qualquer molécula de ácido nucleico que foi gerada por reação (ou reações) de polimerase in vitro), ou à qual ligantes foram ligados, ou que foi integrada em um vetor, tal como um vetor de clonagem ou vetor de expressão.

[0080] O termo proteína recombinante conforme usado no presente documento refere-se a uma proteína produzida por engenharia genética independentemente de se o amlnoácido varia deste de uma proteína do tipo selvagem.

[0081] Quando aplicado a organismos, o termo recombinante, modificado ou geneticamente modificado refere-se a organismos que foram manipulados pela introdução de uma sequência de ácidos

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29/137 nudeicos recombinante heteróloga ou exógena no organismo (por exemplo, uma sequênda de áddos nudeicos não nativa) e inclui knockouts de gene, mutações alvejadas, substituição de gene e substituição de promotor, deleção, interrupção ou inserção, assim como a introdução de transgenes ou genes sintéticos ou sequêndas de ácidos nudeicos no organismo. Isto é, recombinante, modificado ou geneticamente modificado refere-se a organismos que foram alterados por intervenção humana. Organismos recombinantes ou geneticamente modificados podem também ser organismos nos quais construtos para knockdown” de gene foram introduzidos. Tais construtos incluem, porém sem limitação, construtos de RNAi, de microRNA, de shRNA, de siRNA, antissenso e de ribozima. São também induídos organismos cujos genomas foram alterados pela atividade de meganucleases, nucleases dedo de zinco, TALENs ou sistemas de cas/CRISPR. Uma molécula de ácido nudeico exógena ou recombinante pode ser integrada no genoma do organismo recombinante/geneticamente modificado ou, em outros casos, pode não ser integrado no genoma hospedeiro. Conforme usado no presente documento, rnicro-organismo recombinante ou célula hospedeira recombinante inclui a progênie ou derivados dos microorganismos recombinantes da invenção. Devido ao fato de que determinadas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido à mutação ou influêndas ambientais, tal progênie ou derivados podem não ser, de fato, idênticos à célula progenitora, mas estão ainda induídos dentro do escopo do termo conforme usado no presente documento.

[0082] O termo promotor refere-se a uma sequência de ácidos nudeicos com a capacidade para se ligar à RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3’). Um promotor inclui o número mínimo de bases ou

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30/137 elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do fundo. Um promotor pode incluir um sítio de iniciação de transcrição assim como domínio de ligação de proteína (sequências consenso) responsável pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos contêm frequentemente, mas nem sempre, TATA boxes e CAT boxes. Promotores procarióticos podem conter sequências promotoras procarióticas -10 e -35. Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzívels e repressíveis, de uma variedade de diferentes fontes é bem conhecido na técnica. Fontes representativas incluem, por exemplo, tipos de célula algácea, viral, de mamífero, de inseto, vegetal, de levedura e bacteriana, e os promotores adequados dessas fontes estão prontamente disponíveis ou podem ser sinteticamente produzidos, com base nas sequências publicamente disponíveis na linhagem ou, por exemplo, a partir de depósitos, tais como ATCC, assim como outras fontes comerciais ou individuais. Os promotores podem ser unidirecionais (iniciar transcrição em uma direção) ou bidirecionais (iniciar transcrição em ambas as direções). Um promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor reprimível ou um promotor regulável. Uma região promotora pode incluir, adicionalmente ao promotor proximal a gene em que a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição, sequências adicionais a montante do gene que podem estar dentro de 1 quilopar de bases, 2 quilopares de bases, 3 quilopares de bases, 4 quilopares de bases, 5 quilopares de bases ou mais do sítio de início transcricional de um gene, em que as sequências adicionais podem influenciar a taxa de transcrição do gene a jusante e opcionalmente a responsividade do promotor às condições de desenvolvimento, ambientais ou bioquímicas (por exemplo, metabólicas).

[0083] O termo heterólogo quando usado em referência a um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima refere-se

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31/137 a um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é de uma fonte ou derivada de uma fonte diferente da espécie do organismo hospedeiro. Em contraste, um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima homóloga é usada no presente documento para denotar um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é derivada da espécie do organismo hospedeiro. Ao se referir a uma sequência reguladora de gene ou a uma sequência de ácidos nucleicos auxiliar usada para manter ou manipular uma sequência de genes (por exemplo, um promotor, uma região não traduzida 5’, região não traduzida 3’, sequência de adição de poli A, sequência de introns, sítio de splicing, sítio de ligação a ribossoma, sequência de entrada de ribossoma interna, região de homologia de genoma, sítio de recombinação, etc.), heterólogo significa que a sequência reguladora ou sequência auxiliar não está naturalmente associada ao gene com o qual a sequência de ácidos nucleicos reguladora ou auxiliar está justaposta em um construto, genoma, cromossomo ou epissomo. Assim, um promotor ligado de maneira funcional a um gene ao qual o mesmo não é ligado de maneira funcional em seu estado natural (isto é, no genoma de um organismo não geneticamente modificado) é denominado no presente documento um promotor heterólogo, embora o promotor possa ser derivado da mesma espécie (ou, em alguns casos, do mesmo organismo) que o gene ao qual o mesmo está ligado.

[0084] Conforme usado no presente documento, o termo proteína ou polipeptídeo se destina a abranger um polipeptídeo singular assim como polipeptídeos no plural e se refere a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo polipeptídeo refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um

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32/137 comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteína, cadeia de aminoácidos ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos são incluídos dentro da definição de polipeptídeo, e o termo polipeptídeo pode ser usado em vez de ou de modo intercambiável com qualquer um desses termos.

[0085] Os números de acesso de proteína e gene, comumente fornecidos em parênteses após um nome de gene ou espécie, são identificadores exclusivos para um registro de sequência publicamente disponível no site da web do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov) mantido pelos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos. O número de identificação de sequência de Identificador Genlnfo (Gl) é específico para uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. Se uma sequência mudar de qualquer modo um novo número de Gl é atribuído. Uma ferramenta de Histórico de Revisão de Sequência está disponível para rastrear os vários números de Gl, números de versão e datas de atualização para sequências que aparecem em um registro do GenBank específico. A pesquisa e a obtenção de sequências de ácidos nucleicos ou genes ou sequências de proteínas com base nos números de acesso e números de Gl são bem conhecidas nas técnicas de, por exemplo, biologia celular, bioquímica, biologia molecular e genética molecular.

[0086] Conforme usado no presente documento, os termos por cento de identidade ou homologia em relação a sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são definidos como a porcentagem de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos polipeptídeos conhecidos, após o alinhamento das sequências para identidade percentual máxima e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a homologia percentual máxima. Inserções ou deleções N-terminais ou C-terminais não devem ser

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33/137 interpretadas como afetando a homologia, e deleções e/ou inserções internas na sequência de polipeptídeos menores do que cerca de 30, menores do que cerca de 20 ou menores do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos não devem ser interpretadas como afetando a homologia. A homologia ou identidade no nível de sequência de nucleotídeos ou aminoácidos pode ser determinada por análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) com o uso do algoritmo empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3.389 a 3.402, e Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2.264 a 2.268), que são adaptados para pesquisa de similaridade entre sequências. A abordagem usada pelo programa BLAST é primeiramente considerar segmentos similares, com e sem lacunas, entre uma sequência de consulta e uma sequência de banco de dados, então, avaliar a significância estatística de todas as correspondências que são identificadas e, finalmente, resumir apenas aquelas correspondências que satisfazem um limite de significância pré-selecionado. Para uma discussão sobre os problemas básicos na pesquisa de similaridade de banco de dados de sequências, consultar Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119 a 129. Os parâmetros de pesquisa para histograma, descrições, alinhamentos, expectativa (isto é, o limite de significância estatística para relatar correspondências contra sequências de banco de dados), corte, matriz e filtro (baixa complexidade) podem estar nas definições padrão. A matriz de pontuação padrão usada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10.915 a 10.919), recomendada para sequências de consulta com mais de 85 de comprimento (bases de nucleotídeo ou aminoácidos).

[0087] Para blastn, projetado para comparar sequências de nucleotídeo, a matriz de pontuação é definida pelas razões entre M

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34/137 (isto é, a pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes) e N (isto é, a pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes), em que os valores padrão para M e N podem ser +5 e -4, respectivamente. Quatro parâmetros de blastn podem ser ajustados da seguinte forma: Q=10 (penalidade por criação de lacuna); R™10 (penalidade por extensão da lacuna); wink-1 (gera acertos de palavras a cada wink-ésima posição ao longo da consulta); e gapw-16 (define a largura de janela dentro da qual alinhamentos com lacuna são gerados). As definições de parâmetro de Blastp equivalentes para comparação de sequências de aminoácidos podem ser: Q=9; R=2; wink=1; e gapw-32. Uma comparação Bestfit entre sequências, disponíveis no pacote GCG versão 10.0, pode usar os parâmetros de DNA GAP=50 (penalidade por criação de lacuna) e LEN=3 (penalidade por extensão da lacuna), e as definições equivalentes nas comparações de proteína podem ser GAP—8 e LEN-2.

[0088] Conforme usado no presente documento, o sintagma substituição de aminoácido conservative ou mutação conservative refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido com uma propriedade comum. Um modo funcional para definir as propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácido entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais análises, grupos de aminoácidos podem ser definidos em que aminoácidos dentro de um grupo realizam troca, de preferência, um com o outro, e portanto, se assemelham um ao outro na maior parte em seu impacto da estrutura de proteína geral (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Os exemplos de grupos de aminoácidos definidos dessa maneira podem incluir: um grupo carregado/polar”

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35/137 incluindo Glu, Asp, Asn, Gin, Lys, Arg e His; um grupo aromático ou cíclico incluindo Pro, Phe, Tyr e Trp; e um grupo alifático incluindo Gly, Ala, Vai, Leu, He, Met, Ser, Thr e Cys. Dentro de cada grupo, subgrupos podem também ser identificados. Por exemplo, o grupo de aminoácidos carregados/polares pode ser subdividido em subgrupos incluindo: o subgrupo positivamente carregado que compreende Lys, Arg e His; o subgrupo negativamente carregado que compreende Glu e Asp; e o subgrupo polar que compreende Asn e Gin. Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdividido em subgrupos incluindo: o subgrupo de anel de nitrogênio que compreende Pro, His e Trp; e o subgrupo fenlla que compreende Phe e Tyr. Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdividido em subgrupos incluindo: o grande subgrupo não polar alifático que compreende Vai, Leu e He; o subgrupo ligeiramente polar alifático que compreende Met, Ser, Thr e Cys; e o subgrupo de resíduo pequeno que compreende Gly e Ala. Os exemplos de mutações conservatives incluem substituições de aminoácidos dos aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, porém sem limitação: Lys por Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida; Glu por Asp ou vice-versa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida; Ser por Thr ou vice-versa, de modo que um -OH livre possa ser mantido; e Gin por Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido. Uma variante conservative é um polipeptídeo que inclui um ou mais aminoácidos que foram substituídos para substituir um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência (por exemplo, um polipeptídeo cuja sequência é revelada em uma publicação ou banco de dados de sequências, ou cuja sequência foi determinada por sequenciamento de ácido nucleico) com um aminoácido que tem propriedades comuns, por exemplo, pertencente ao mesmo grupo ou subgrupo aminoácido

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36/137 conforme delineado acima.

[0089] Conforme usado no presente documento, expressão inclui a expressão de um gene pelo menos no nível de produção de RNA, e um produto de expressão inclui o produto resultante, por exemplo, um polipeptídeo ou RNA funcional (por exemplo, um RNA ribossômico, um tRNA, um RNA antissenso, um micro RNA, um shRNA, uma ribozima, etc.), de um gene expresso. O termo expressão aumentada inclui uma alteração na expressão de gene para facilitar a produção de mRNA aumentada e/ou expressão de polipeptídeo aumentada. Produção aumentada [de um produto de gene] inclui um aumento na quantidade de expressão de polipeptídeo, no nível da atividade enzimática de um polipeptídeo, ou uma combinação de ambos, em comparação à produção ou atividade enzimática nativa do polipeptídeo.

[0090] Alguns aspectos da presente invenção incluem a deleção, o silenciamento, a inativação ou a regulação decrescente parcial, substancial ou completa da expressão de sequências de polinucleotídeos particulares. Os genes podem ser parcial, substancial ou completamente deletados, silenciados, inativados, ou sua expressão pode ser regulada decrescentemente a fim de afetar a atividade realizada pelo polipeptídeo que os mesmos codificam, tal como a atividade de uma enzima. Os genes podem ser parcial, substancial ou completamente deletados, silenciados, inativados ou regulados decrescentemente pela inserção de sequências de ácidos nucleicos que interrompem a função e/ou expressão do gene (por exemplo, inserção viral, mutagênese de transposon, engenharia de meganuclease, recombinação homóloga ou outros métodos conhecidos na técnica). Os termos eliminar, eliminação e ’’knockout’ podem ser usados de maneira intercambiável com os termos deleção, deleção parcial, deleção substancial ou deleção

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37/137 completa. Em determinadas modalidades, um micro-organismo de interesse pode ser geneticamente modificado por recombinação homóloga sítio-dirigida ou integração alvejada ou mutação com o uso de um sistema de cas/CRISPR para realizar knockout de um gene particular de interesse. Em ainda outras modalidades, a inserção alvejada ou mutação de uma região reguladora de gene com o uso de um sistema de cas/CRISPR, RNAi ou construtos de DNA antissenso (asDNA) pode ser usada para silenciar, inativar regular decrescentemente, parcial, substancial ou completamente, um gene particular de interesse.

[0091] Essas inserções, deleções ou outras modificações de determinadas moléculas de ácido nucleico ou sequências de polinucleotídeos particulares podem ser entendidas como abrangendo modificação (ou modificações) genética ou transformação (ou transformações) de modo que as cepas resultantes dos microorganismos ou células hospedeiras possam ser entendidas como sendo geneticamente modificadas, geneticamente manipuladas ou transformadas.

[0092] Conforme usado no presente documento, crescentemente regulado ou regulação crescente inclui um aumento na expressão de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na atividade de uma enzima, por exemplo, um aumento na expressão de gene ou atividade enzimática em comparação à expressão ou atividade em um gene ou enzima idêntica de outro modo que não foi crescentemente regulada.

[0093] Conforme usado no presente documento, decrescentemente regulado” ou regulação decrescente inclui uma diminuição na expressão de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na atividade de uma enzima, por exemplo, uma diminuição na expressão de gene ou atividade enzimática em

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38/137 comparação à expressão ou atividade em um gene ou enzima idêntica de outro modo que não foi decrescentemente regulada.

[0094] Conforme usado no presente documento, mutante referese a um organismo que tem uma mutação em um gene que é o resultado da mutagênese clássica, por exemplo, com o uso de irradiação gama, UV ou mutágenos químicos, ou é um organismo recombinante que tem estrutura ou expressão alterada de um gene como um resultado da engenharia genética que pode incluir, como exemplos não limitantes, superexpressão, incluindo expressão de um gene sob diferentes regulações temporais, biológicas ou ambientais e/ou a um grau diferente do que ocorre naturalmente e/ou expressão de um gene que não é naturalmente expresso na célula recombinante; recombinação homóloga, incluindo knockouts e knockins (por exemplo, substituição de gene por genes que codificam polipeptídeos que têm atividade maior ou menor do que o polipeptídeo do tipo selvagem e/ou polipeptídeos negativos dominantes); atenuação de gene por meio de RNAi, RNA antissenso ou ribozimas ou similares; e engenharia de genoma com o uso de tecnologias de meganucleases, TALENs e/ou CRISPR e similares. Um mutante não é, portanto, um organismo de ocorrência natural e é o resultado de intervenção humana. Um organismo mutante de interesse terá tipicamente um fenótipo diferente do que este da cepa do tipo selvagem ou progenitora correspondente que não tem a mutação, em que o fenótipo pode ser avaliado por ensaios de crescimento, análise de produto, propriedades fotossintéticas, ensaios bioquímicos, etc. Ao se referir a um gene, mutante significa que o gene tem pelo menos uma alteração, deleção ou inserção de base (nucleotídeo) em relação a um gene nativo ou do tipo selvagem. A mutação (alteração, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos) pode estar na região de codificação do gene ou pode estar em um íntron, 3’ UTR, 5’ UTR ou

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39/137 região promotora, por exemplo, dentro de cerca de 2 quilopares de bases do sítio de início transcricional ou dentro de 3 quilopares de bases do sítio de início transcricional. Por exemplo, um mutante que tem expressão atenuada de um gene conforme revelado no presente documento pode ter uma mutação, que pode ser uma ou mais alterações de nucleobase e/ou uma ou mais deleções de nucleobase e/ou uma ou mais inserções de nucleobase, na região de um gene 5’ do sítio de início transcricional, tal como, em exemplos não limitantes, dentro de cerca de 2 quilopares de bases, dentro de 1,5 quilopar de bases, dentro de 1 quilopar de bases ou dentro de 0,5 quilopar de bases do sítio de início transcricional conhecido ou putativo ou dentro de 3 quilopares de bases, dentro de 2,5 quilopares de bases, dentro de 2 quilopares de bases, dentro de 1,5 quilopar de bases, dentro de 1 quilopar de bases ou dentro de 0,5 quilopares de bases do sítio de início traducional. Como exemplos não limitantes, um gene mutante pode ser um gene que tem uma mutação, inserção ou deleção dentro da região promotora que pode ou aumentar ou diminuir a expressão do gene; pode ser um gene que tem uma deleção que resulta na produção de uma proteína não funcional, proteína truncada, proteína negativa dominante ou nenhuma proteína; pode ser um gene que tem uma ou mais mutações pontuais que levam a uma alteração no aminoácido da proteína codificada ou resulta no splicing aberrante do transcrito de gene, etc.

[0095] Domínios conservados dos polipeptídeos incluem aqueles identificados no banco de dados cd (domínio conservado), no banco de dados COG, no banco de dados SMART, no banco de dados PRK, no banco de dados TIGRFAM, no banco de dados InterPro (ebi.ac.uk/interpro/) ou outros conhecidos na técnica. O site da web do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) patrocinado pelos Institutos

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Nacionais de Saúde dos EUA inclui um banco de dados de domínio conservado (CDD) que o mesmo descreve como um recurso de anotação de proteína que consiste em uma coleção de múltiplos modelos de alinhamento de sequências bem anotados para domínios antigos e proteínas de comprimento completo. Os mesmos estão disponíveis como matrizes de pontuação específica para posição (PSSMs) para rápida identificação de domínios conservados em sequências de proteínas por meio de RPS-BLAST. O teor de CDD inclui domínios curados por NCBI, que usam informações de estrutura 3D para definir explicitamente limites de domínio e fornecer compreensões sobre relações de sequência/estrutura/função, assim como modelos de domínio importados de vários bancos de dados de fonte externa (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM). [0096] O termo Pfam refere-se a uma grande coleção de domínios de proteína e famílias de proteína pelo Consórcio Pfam e disponível em diversos sites da web patrocinados em todo o mundo, incluindo: pfam.sanger.ac.uk/ (Welcome Trust, Sanger Institute); pfam.sbc.su.se (Stockholm Bioinformatics Center); pfam.janelia.org/ (Janelia Farm, Howard Hughes Medical Institute); pfam.jouy.inra.fr/ (Institut national de la Recherche Agronomique); e pfam.ccbb.re.kr. A última versão de Pfam é Pfam 30.0 (maio de 2016). Domínios e famílias Pfam são identificados com o uso de múltiplos alinhamentos de sequência e modelos ocultos de Markov (HMMs). Atribuições de domínio ou família Pfam~A são atribuições de alta qualidade geradas por um alinhamento de semente curada com o uso de membros representativos de uma família de proteína e modelos ocultos de Markov de perfil com base no alinhamento de semente. (A não ser que especificado de outro modo, correspondências de uma proteína consultada a um domínio ou família Pfam são correspondências PfamA). Todas as sequências identificadas pertencentes à família são,

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41/137 então, usadas para gerar automaticamente um alinhamento completo para a família (Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320 a 322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263 a 266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138 a D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Issue 34, D247 a 251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Issue 38, D211 a 222). Acessando-se o banco de dados Pfam, por exemplo, com o uso de qualquer um dos sites da web referidos acima, sequências de proteínas podem ser consultadas contra os HMMs com o uso de software de pesquisa de homologia HMMER (por exemplo, HMMER2, HMMER3 ou uma versão superior, hmmer.janelia.org/). Correspondências significativas que identificam uma proteína consultada como estando em uma família pfam (ou como tendo um domínio Pfam particular) são aquelas em que a pontuação de bits é maior ou igual ao limite de reunião para o domínio Pfam. Os valores de expectativa (valores e) podem também ser usados como um critério para inclusão de uma proteína consultada em um Pfam ou para determinar se uma proteína consultada tem um domínio Pfam particular, em que valores e baixos (muito menores do que 1,0, por exemplo, menores do que 0,1 ou menores ou iguais a 0,01) representam baixas probabilidades de que uma correspondência é devido ao acaso.

[0097] Um cDNA é uma molécula de DNA que compreende pelo menos uma porção da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA, com a exceção de que a molécula de DNA substitui a nucleobase timina, ou T, no lugar da uridina, ou U, que ocorre na sequência de mRNA. Um cDNA pode ser de fita dupla ou de fita simples e pode ser, por exemplo, o complemento da sequência de mRNA. Em exemplos preferenciais, um cDNA não inclui uma ou mais sequências de introns que ocorrem no gene de ocorrência natural ao

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42/137 qual o cDNA corresponde (isto é, o gene conforme o mesmo ocorre no genoma de um organismo). Por exemplo, um cDNA pode ter sequências a montante de um íntron de um gene de ocorrência natural justapostas a sequências a jusante do íntron do gene de ocorrência natural, em que as sequências a montante e a jusante não são justapostas em uma molécula de DNA em natureza (isto é, as sequências não são justapostas no gene de ocorrência natural). Um cDNA pode ser produzido por transcrição reversa de moléculas de mRNA ou pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese química e/ou com o uso de uma ou mais enzimas de restrição, uma ou mais ligases, uma ou mais polimerases (incluindo, porém sem limitação, polimerases tolerantes a altas temperaturas que podem ser usadas em reação em cadeia de polimerase (PCRs)), uma ou mais recombinases, etc., com base no conhecimento da sequência de cDNA, em que o conhecimento da sequência de cDNA pode ser opcionalmente baseado na identificação das regiões de codificação das sequências de genoma ou compilado a partir dos múltiplos cDNAs parciais das sequências.

[0098] A referência a propriedades que são substancialmente iguais ou substancialmente idênticas sem mais explicações do significado pretendido destina-se a significar que as propriedades estão dentro de 10% e, de preferência, dentro de 5% e podem estar dentro de 2,5% do valor de referência. Quando o significado pretendido de substancialmente em um contexto particular não é apresentado, o termo é usado para incluir desvios pequenos e irrelevantes que não são material para as características consideradas importantes no contexto da invenção.

[0099] Uma célula de controle, organismo de controle ou micro-organismo de controle é uma célula, organismo ou microorganismo do tipo selvagem a partir do qual uma célula, organismo ou

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43/137 micro-organismo mutante (célula, organismo ou micro-organismo geneticamente modificado ou mutagenizado) é direta ou indiretamente derivado ou é uma célula, organismo ou micro-organismo que é substancialmente idêntico à célula, organismo ou micro-organismo mutante referido, com a exceção de que a célula, organismo ou microorganismo de controle não tem a mutação resultando na produtividade aumentada, por exemplo, a célula, organismo ou micro-organismo de controle não foi geneticamente modificado ou mutagenizado para atenuar um gene SGI1. Por exemplo, quando a alga recombinante compreende mutação em um gene SGI1, uma alga de controle pode ser substancialmente idêntica à alga recombinante com a exceção de que a alga de controle não compreende uma mutação no gene SGI1. [00100] As mesmas condições ou as mesmas condições de cultura, conforme usado no presente documento, significa substancialmente as mesmas condições, isto é, quaisquer diferenças entre as condições referidas que podem estar presentes são pequenas e não relevantes à função ou propriedades do micro-organismo que são material para a invenção, incluindo produção de lipídio ou produção de biomassa.

[00101] Conforme usado no presente documento lipídio ou lipídios refere-se a gorduras, ceras, ácidos graxos, derivados de ácido graxo, tais como álcoois graxos, ésteres de cera, alcanos e alcenos, esteróis, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídios, esfingolipídios, sacarolipídios e glicerolipídios. Lipídios FAME ou FAME refere-se a lipídios que têm porções químicas acila que podem ser derivadas para ésteres metílicos de ácido graxo, tais como, por exemplo, monoacilglicerídeos, diacilglicerídeos, triacilglicerídeos, ésteres de cera e lipídios de membrana, tais como fosfolipídios, galactolipídios, etc. A produtividade de lipídio pode ser avaliada como a produtividade de FAME em miligramas por litro (mg/l)

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44/137 e, para algas, pode ser relatada como gramas por metro² por dia (g/m²/dia). Nos ensaios semicontínuos fornecidos no presente documento, valores em mg/l são convertidos em g/m2/dia levando em consideração a área de irradiância incidente (a abertura de prateleira de frasco SCPA de 1% x 33/8 ou 0,003145m²) e o volume da cultura (550 ml). Para obter valores de produtividade em g/m²/dia, os valores em mg/l são multiplicados pela taxa de diluição diária (30%) e um fator de conversão de 0,175. Quando o lipídio ou subcategorias do mesmo (por exemplo, TAG ou FAME) são denominadas como uma porcentagem, a porcentagem é um percentual em peso a não ser que indicado de outro modo.

[00102] Conforme usado no presente documento, o termo produto de ácido graxo inclui ácidos graxos livres, mono-di- ou triglicerídeos, aldeídos graxos, álcools graxos, ésteres de ácido graxo (Incluindo, porém sem limitação, ésteres de cera); e hidrocarbonetos, incluindo, porém sem limitação, alcanos e alcenos).

[00103] Biomassa refere-se à massa celular, de células vivas ou mortas, e pode ser avaliada, por exemplo, como peso úmido ou peso de pélete aspirado, ou como peso seco (por exemplo, liofilizado de uma amostra de cultura ou células peletizadas), peso seco sem cinzas (AFDW) ou carbono orgânico total (TOC), com o uso dos métodos conhecidos na técnica. A biomassa aumenta durante o crescimento de uma cultura sob condições permissivas a crescimento e pode ser denominada acúmulo de biomassa em culturas em batelada, por exemplo. Em culturas contínuas ou semicontínuas que passam por diluição estável ou regular, a biomassa que é produzida que acumularia de outro modo na cultura é removida durante a diluição da cultura. Assim, a produtividade de biomassa diária (aumentos na biomassa) por essas culturas pode também ser denominada acúmulo de biomassa”. A produtividade de biomassa pode ser avaliada como a

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45/137 produtividade de TOC em miligramas por litro (mg/l) e, para algas, pode ser relatada como gramas por metro² por dia (g/m²/dia). Nos ensaios semicontínuos fornecidos no presente documento, valores em mg/l são convertidos em g/m2/dia levando em consideração a área de irradiância incidente (a abertura de prateleira de frasco SCPA de ΓΛ x 33/8 ou 0,003145m²) e o volume da cultura (550 ml). Para obter valores de produtividade em g/m²/dia, os valores em mg/l são multiplicados pela taxa de diluição diária (30%) e um fator de conversão de 0,175. Quando a biomassa é expressa como uma porcentagem, a porcentagem é um percentual em peso não ser que indicado de outro modo.

[00104] No contexto da invenção, uma fonte de nitrogênio é uma fonte de nitrogênio que pode ser recolhida e metabolizada pelo microorganismo em questão e incorporada em biomoléculas para crescimento e propagação. Por exemplo, compostos incluindo nitrogênio que não podem ser recolhidos e/ou metabolizados pelo micro-organismo para crescimento (por exemplo, tampões biológicos contendo nitrogênio, tais como Hepes, Tris, etc.) não são considerados fontes de nitrogênio no contexto da invenção.

[00105] Nitrogênio reduzido, conforme usado no presente documento, é nitrogênio na forma química de amônio, amônia, ureia ou um aminoácido que pode ser recolhido e metabolizado pelo microorganismo sendo cultivado para fornecer uma fonte de nitrogênio para incorporação em biomoléculas, suportando, assim, o crescimento. Por exemplo, adicionalmente à amônio/amônia e ureia, o nitrogênio reduzido pode incluir vários aminoácidos em que o aminoácido (ou aminoácidos) pode servir como uma fonte de nitrogênio ao microorganismo em questão. Os exemplos de aminoácidos podem incluir, sem limitação, glutamato, glutamina, histidina, lisina, arginina, asparagina, alanina e glicina. Nitrogênio não reduzido no contexto de

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46/137 uma fonte de nitrogênio que pode estar presente em um meio de cultura para micro-organismos refere-se a nitrato ou nitrito que deve ser reduzido antes da assimilação em compostos orgânicos pelo micro-organismo.

[00106] A única fonte de nitrogênio [no meio de cultura] é usado de forma intercambiável com substancialmente a única fonte de nitrogênio e indica que nenhuma outra fonte de nitrogênio é intencionalmente adicionada ao meio de cultura, ou que nenhuma outra fonte de nitrogênio está presente em uma quantidade suficiente para aumentar significativamente o crescimento dos micro-organismos ou células cultivadas no meio referido. Por todo este pedido, por razão de brevidade, o termo nitrato apenas é usado para caracterizar meios de cultura nos quais nitrato é a única fonte de nitrogênio que está disponível aos micro-organismos para suportar o crescimento.

[00107] Similarmente, a única fonte de carbono [no meio de cultura]” é usado de forma intercambiável com substancialmente a única fonte de carbono e indica que nenhuma outra fonte de carbono está presente em uma quantidade suficiente para aumentar a produtividade, crescimento ou propagação dos micro-organismos ou células cultivadas no meio referido ou que se tornam incorporadas a biomoléculas, tais como lipídios produzidos pelos micro-organismos ou células.

[00108] Condições repletas de nitrogênio referem-se a condições de meios em que nenhum benefício de crescimento ou propagação adicional é conferido adicionando-se mais nitrogênio (em uma forma que pode ser usada pelo micro-organismo) ao meio. Similarmente, condições repletas de nutrientes referem-se a condições de meios em que nenhum nutriente está limitando o crescimento ou propagação, isto é, quando um meio está repleto de nutrientes, adicionar mais nutriente (nutrientes) ao meio não resulta em uma taxa de crescimento

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47/137 ou propagação aprimorada. No contexto de repleto de nutrientes, ο termo nutrientes inclui, como exemplos não limitantes, fosfato, enxofre, ferro e, opcionalmente, silica, mas exclui fontes de carbono, tais como açúcares ou ácidos orgânicos que podem ser usados pelo organismo como uma fonte de energia.

Polipeptídeos SGI1 [00109] Conforme descrito no presente documento, polipeptídeos SGI1 ou Melhora Significativa do Crescimento 1 são polipeptídeos que incluem um domínio de receptor do Regulador de Resposta ou RR” (pfam PF00072) e um domínio de ligação do tipo Myb, denominado no presente documento simplesmente um domínio myb (pfam PF00249), em que o domínio de RR é posicionado N-terminal ao domínio myb. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo SGI1 que abrange o domínio de RR e o domínio myb inclui uma extensão de aminoácidos que ocorre entre os domínios RR e myb que revela ser insatisfatoriamente conservada ou não conservada dentre os polipeptídeos SGI1. A sequência de aminoácidos que ocorre entre o domínio de RR e o domínio myb pode ser denominada no presente documento como um ligante entre os dois domínios. O ligante pode ter qualquer comprimento e, em vários exempios, pode estar na faixa de comprimento de um a cerca de 300 aminoácidos, de dez a cerca de 200 aminoácidos ou de vinte a cerca de 150 aminoácidos de comprimento. A região ligante pode incluir opcionalmente uma sequência de localização nuclear (NLS).

[00110] Um domínio de RR dentro de uma proteína SGI1 pode ser caracterizado como pfam PF00072 ou como um domínio de receptor de sinal ou simplesmente domínio de receptor e/ou pode ser classificado como cd00156 no banco de dados de domínio conservado (CDD), como COG0784 nos Clusters of Orthologous Groups of proteins database, ou como um domínio de superfamilia do tipo

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CheY Interpro, IPR011006. O domínio de RR é encontrado em sistemas reguladores com dois componentes bacterianos (como o sistema com dois componentes de quimiotaxia bacteriana que inclui um polipeptídeo conhecido como CheY), em que o mesmo recebe um sinal de um parceiro sensor. O domínio de RR de tais sistemas é frequentemente encontrado N-terminal a um domínio de ligação a DNA e por incluir um sítio fosfoaceitante. A Figura 4 fornece um alinhamento dos domínios RR de Parachlorella sp. WT-1185 (SEQ ID NO:58), Coccomyxa subelHpsoidea (SEQ ID NO:59), Ostreococcus luámarinus (SEQ ID NO:60), Chlamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO:61), Chromochlorís zofingiensís (SEQ ID NO:62), VqIvox carters (SEQ ID NO:63), Tetraselmis sp. 105 (SEQ ID NO:64), Oocystis sp. WT-4183 (SEQ ID NO:65) e Micromonas sp. RCC299 (SEQ ID NO:66).

[00111] Um domínio myb dentro de uma proteína SGI1 pode ser caracterizado, por exemplo, como pfamPF00249: Domínio de ligação a DNA do tipo Myb, e/ou pode ser identificado como o domínio conservado TIGR01557 domínio de ligação a DNA do tipo myb, classe SHAQKYF, ou como um domínio de superfamília do tipo Interpro Homeobox (IPR009057) e/ou um domínio myb Interpro (IPR017930).

[00112] Adicionalmente a ter um domínio de RR N-terminal a um domínio myb, uma proteína SGI1 conforme fornecido no presente documento pode ter uma pontuação de 300 ou mais, 320 ou mais, 340 ou mais, 350 ou mais, 360 ou mais, ou 370 ou mais com um valor e menor do que cerca de 1e-10, 1e50, 1e-70 ou 1e-100, quando submetida à varredura com um Modelo Oculto de Markov (HMM) projetado para pontuar proteínas com base em quão bem a sequência de aminoácidos de uma proteína corresponde aos aminoácidos conservados de uma região de homólogos de SGI1 em algas

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49/137 (consultar o Exemplo 6). A região de polipeptídeos SGI1 usados para desenvolver o HMM é a sequência de aminoácidos que inclui (proceder na direção N-terminal para C-terminal) o domínio de RR, o ligante e o domínio myb. Em um HMM, posições de aminoácidos altamente conservadas têm maior peso do que posições de aminoácidos insatisfatoriamente conservadas dentro de uma região comparada dos polipeptídeos para chegar na pontuação. Os polipeptídeos que têm pontuações de pelo menos cerca de 300 ou de 350 ou mais, tal como, por exemplo, 370 ou mais, quando submetidos à varredura com um modelo HMM com base em sequências de proteínas dos polipeptídeos SGI1 algáceos que incluem uma única sequência contínua que inclui o domínio de RR, ligante e domínio myb desenvolvidos incluem, sem limitação, polipeptídeos das espécies algáceas e vegetais Parachlorella sp. 1185 (SEQ ID NO:3), Coccomyxa subellipsoídea (SEQ ID NO:9), Ostreococcus lucimarinus (SEQ ID NO: 10), Chíamydomonas reinhardtii (SEQ ID NO: 11), Volvox carter! (SEQ ID NO: 13), Tetraselmis sp. 105 (SEQ ID NOs:14, 15 e 16), Oocystís sp. (SEQ ID NO: 17), Micromonas sp. RCC299 (SEQ ID NO: 18), Micromonas pusilia (SEQ ID NO: 19), Sphagnum fallax (SEQ ID NO:20), Physcomítrella patens (SEQ ID NO:21), Arabídopsis thaíiana (SEQ ID NO:22), Arabídopsis haílerí (SEQ ID NO:23), Arabídopsis lyrata (SEQ ID NO:24), Melianthus annuus (SEQ ID NO:25), Vitis vinifera (SEQ ID NO:26), Amborelia trichopoda (SEQ ID NO:27), Ricinus communis (SEQ ID NO:28), Solanum íycopersicum (SEQ ID NO:29), Soianum tuberosum (SEQ ID NO:30), Gossypium hirsutum (SEQ ID NO:31), Theobroma cacao (SEQ ID NO:32), Phaeolis vulgaris (SEQ ID NO:33), Glycine max (SEQ ID NO:34), Chenopodium quinoa (SEQ ID NO:35), Malus domesticus (SEQ ID NO:36), Zea mays (SEQ ID NO:37), Brassica rapa (SEQ ID NO:38) e Oryza sativa (SEQ ID NO:39). São também incluídos como

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50/137 polipeptídeos SGI1 polipeptídeos que têm pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos anteriores, em que o polipeptídeo tem um domínio de RR e um domínio myb, e o domínio de RR é N-terminal ao domínio myb, em que o polipeptídeo SGI1 é um polipeptídeo de ocorrência natural ou uma variante do mesmo. Em várias modalidades, o polipeptídeo SGI1 é de uma espécie vegetal ou algácea, isto é, é um polipeptídeo de ocorrência natural de uma espécie vegetal ou algácea. Um gene que codifica um polipeptídeo SGI1 conforme fornecido no presente documento, por exemplo, um gene que é interrompido ou cuja expressão é atenuada em um mutante conforme fornecido no presente documento pode ser, em várias modalidades, um gene de ocorrência natural de uma espécie vegetal ou algácea que codifica um polipeptídeo conforme revelado no presente documento.

[00113] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI1 conforme fornecido no presente documento é um polipeptídeo SGI1 algáceo, por exemplo, que tem uma sequência de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural, em que o polipeptídeo algáceo inclui um domínio de RR e um domínio myb, e o domínio de RR é N-terminal ao domínio myb. O polipeptídeo algáceo pode ter opcionalmente pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos polipeptídeos SGI1 algáceos revelados no presente documento. Em algumas modalidades, um gene SGI1 pode ser um gene que codifica um polipeptídeo SGI1 algáceo, tal como, por exemplo, um

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51/137 polipeptídeo que tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural. Um gene SGI1 que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de um polipeptídeo SGI algáceo de ocorrência natural pode ser um gene que tem uma sequência de genes de ocorrência natural da sequência de codificação de gene ou pode ter uma sequência que varia da sequência de um gene de ocorrência natural. Em várias modalidades, um gene SGI1 que é atenuado, sofre mutação ou é interrompido em um organismo fotosslntético mutante conforme revelado no presente documento pode ser um gene que é identificado através de BLAST, por exemplo, com o uso de uma ou mais sequências reveladas no presente documento como consultas e/ou por varredura de HMM, em que o HMM é construído a partir das sequências de aminoácidos, por exemplo, mediante alinhamento múltiplo de pelo menos seis pollpeptídeos SGI1, em que as sequências de aminoácidos incluem um domínio de RR e um domínio myb, em que o domínio de RR é N-terminal ao domínio myb, e em que há uma sequência ligante entre os domínios de RR e myb que não pertence a nenhum dos domínios.

[00114] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI1 tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 algáceo ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um domínio de RR de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49. Em

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52/137 algumas modalidades, um polipeptídeo SGI1 tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 algáceo ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um domínio myb de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67.

[00115] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI1 tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 algáceo ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptídeo SGI1 algáceo de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:19.

[00116] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 vegetal ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 vegetal de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptídeo SGI algáceo de ocorrência natural e/ou tem pelo menos

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50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com um domínio de RR da SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 ou SEQ ID NO:57. Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 vegetal ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 vegetal de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptídeo SGI aigáceo de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com um domínio myb da SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 ou SEQ ID NO:75.

[00117] Em algumas modalidades, um polipeptídeo SGI tem a sequência de um polipeptídeo SGI1 vegetal ou é uma variante de um polipeptídeo SGI1 vegetal de ocorrência natural que tem pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com um polipeptídeo SGI de ocorrência natural e/ou tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23_;SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID

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NO:32, SEQ ID ΝΟ:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 ou SEQ ID NO:39.

Cepas Mutantes [00118] Os mutantes fornecidos no presente documento que têm um gene SGI1 atenuado incluem organismos fotossintéticos, tais como organismos fotossintéticos eucarióticos, incluindo plantas e algas, tais como algas (microalgas) eucarióticas unicelulares.

[00119] Uma cepa algácea que tem um gene SGI1 com mutação que pode ser, em vários exemplos, uma cepa geneticamente modificada para ter expressão atenuada de um gene SGI1, pode ser qualquer cepa algácea eucariótica, tal como, por exemplo, uma espécie de qualquer um dos gêneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankístrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Cartería, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cydotella, Desmodesmus, Dunaiíeka, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragílaropsís, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosígma, Hyrnenomonas, Isochrysís, Lepodndis, Mícractinium, Monodus, Monoraphídium, Nannochloris, Nannochíoropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmís, Nitzschia, Ochromonas, Oedogoníum, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysís, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochlorís, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria e Volvox.

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55/137 [00120] Por exemplo, uma alga que tem uma mutação em um gene SGI1 conforme revelado no presente documento pode ser uma espécie que pertence a qualquer um dos filos ochrophyta (incluindo membros da bacillariophyceae, coscinodiscophyceae, fragilariophyceae, eustigmatophyceae, xanthophyceae, pelagophyceae, chrysophyceae, raphidophyceae e synurophyceae), haptophyta (incluindo membros da coccolithophyceae e pavlophyceae) e chlorophyta (incluindo membros da trebouxiophyceae, chlorophyceae, nephrophyceae, pyramimonadophyceae, uivophyceae, mamiellophyceae e chlorodendrophyceae), assim como charyophyta, euglenoides e dinoflagelados.

[00121] Em algumas modalidades do presente pedido, microorganismos preferenciais que podem sofrer mutação ou ser geneticamente modificados incluem, porém sem limitação, espécies de chlorophyta, tais como Chioreíia, Parachlorella, Pseudochlorella, Tetrach/orella, Auxenochlorella, Prototheca, Oocystis, Franceia, Micratiníum, Pícochlorum, Nannochloris, SchízochlamydeHa, Eremosphaera, Stichococcus, Botryococcus, Virídieka, Parietoch/orís Borodmeka, Bracteacoccus, Neochloris, Monoraphidium, Desmodesmus, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Cartería, Chiamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Volvox, Platymonas, Dunaíieiía, Haematococcus, Asteromonas, Pyrobotrys, Oedogoníum, Nephroselmis, Pleurococcus, Pyramímonas, Pseudoneochlorís, Ostreococcus, Tetraselmis e Staurastrum.

[00122] Em outros exemplos, os mutantes podem ser geneticamente modificados ou isolados com o uso de uma espécie algácea heterokonta, tal como uma espécie de diatomácea, tal como, por exemplo, uma espécie de qualquer um dos gêneros Amphora, Chaetoceros, Cydotella, Fragi/aría, Fragilaropsis, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Phaeodactylum ou Thalassiosira. Em exemplos

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56/137 adicionais, um mutante conforme revelado no presente documento é uma espécie da classe Eustigmatophyceae, tal como, por exemplo, uma espécie de Ellipsoidion, Eustigmatos, Vischeria, Monodus, Nannochloropsis, ou Pseudostaurastrum. Outros gêneros da Ochrophyta que podem ser considerados incluem, sem limitação, Boldimonas, Botrydium, Bauchería, Tnbonema, Monodus, Aureococcus, Bigeloweilla, Pelagomomas, Chrysosphaera, Ochromonas, Heterosigma, Nephrochloris, Boekelovia, Crícosphaera, Hymenomonas, Isochrysis, Pleurochrysis e Pavlova.

[00123] Em modalidades adicionais, os organismos que podem sofrer mutação ou ser geneticamente modificados para incluírem um gene SGI1 com mutação ou atenuado incluem espécies de planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de células de planta pode sofrer mutação ou ser geneticamente modificada para atenuar a expressão de um gene SGI, por exemplo, com o uso de construtos de ácido nucleico e vários métodos de transformação conhecidos na técnica (Consultar Guerineau F., Methods Mol Biol. (1995) 49:1 a 32). Nas modalidades preferenciais, as plantas e as células vegetais alvo incluem, porém sem limitação, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas, incluindo culturas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, milheto, cevada), culturas frutíferas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas forrageiras (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas sacarinas, inhame), culturas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas floridas (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinheiro, abato, beto vermelho), plantas usadas em fitorremediação (por exemplo, plantas que acumulam metal pesado); culturas oleosas (por exemplo, girassol, semente de colza) e plantas usadas para propósitos experimentais (por exemplo, Arabidopsis).

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Assim, mutantes de SGM podem ser gerados em uma ampla gama de plantas, tal como, por exemplo, com plantas dicotiledôneas que pertencem às ordens Magniolales, Mlciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myrlcales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violates, Salicates, Capparales, Ericates, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiates, Rhamnales, Sapindales, Juglandates, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemonlales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales e Asterales. Os mutantes de SGI1 podem ser também gerados em plantas monocotiledôneas, tais como aquelas pertencentes às ordens Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchidales, ou com plantas pertencentes a Gymnospermae, por exemplo, aquelas que pertencem às ordens Pinales, Ginkgoales, Cycadales, Araucarlales, Cupressales e Gnetales ou com plantas classificadas como musgos (Bryophyta), por exemplo, Sphagnales e Funariales.

[00124] As espécies de planta exemplificativas e não limitantes que podem ter um gene SGI1 atenuado incluem Sphagnum fallax , Physcomitrella patens, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis halted, Arabidopsis lyrata, Hellanthus annuus, Vitis vinifera, Amborella trichopoda, Ricinus communis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Gossypium hirsutum, Theobroma cacao, Phaeolis vulgaris, Glycine max, Chenopodium quinoa, Mai us domesticus, Zea mays,

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Brassica rapa e Oryza sativa.

Atenuação de Gene [00125] Um micro-organismo mutante conforme fornecido no presente documento que tem um gene SGI1 atenuado é um mutante gerado por intervenção humana, por exemplo, por mutagênese clássica ou engenharia genética. Por exemplo, um micro-organismo mutante conforme fornecido no presente documento pode ser um mutante gerado por qualquer método de mutagênese viável, incluindo, porém sem limitação, irradiação UV, irradiação gama ou mutagênese química e a triagem de mutantes que têm clorofila e produtividade aumentada, por exemplo, com o uso dos métodos revelados no presente documento. Por exemplo, a triagem de mutantes com teor de clorofila reduzido pode usar seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), inspeção visual e/ou extração e medição da absorção de clorofila. A produtividade aumentada pode ser avaliada pelo crescimento de mutantes e medição do peso seco, peso úmido, peso seco sem cinzas ou carbono orgânico total (TOC). Métodos para gerar mutantes de organismos fotossintéticos com o uso de mutagênese clássica e engenharia genética são bem conhecidos.

[00126] Os exemplos de genes atenuados incluem, sem limitação, genes que têm uma ou mais substituições de nucleotídeo que alteram a sequência de um ou mais aminoácidos resultando na atividade reduzida ou abolida da proteína codificada; inserções ou deleções (indels) no gene que alteram a sequência de aminoácidos da proteína por deslocação do quadro de leitura e/ou introdução de códons de parada; grandes inserções no gene que resultam na deslocação do quadro de leitura ou truncamento do polipeptídeo codificado ou instabilidade do RNA transcrito pelo gene, grandes deleções que resultam em nenhuma proteína funcional sendo produzida; inserções, deleções ou mutações pontuais em regiões do gene 5’ ou 3’ da região

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59/137 de codificação que afetam a transcrição; e inserções, deleções ou mutações pontuais em introns ou em junções de íntron/éxon que afetam a transcrição, splicing ou estabilidade do RNA. Um gene atenuado pode também ser um gene cujo transcrito é alvejado, por exemplo, por RNAi, RNA antissenso, ribozimas ou similares. Um organismo fotossintético que tem um gene SGI1 atenuado é denominado no presente documento como um mutante de SGI1 independentemente do mecanismo de atenuação do gene SGI1. Os mutantes de SGI1 podem ser isolados por métodos revelados no presente documento, incluindo mutagênese e procedimentos de triagem revelados no presente documento assim como por engenharia genética.

[00127] Assim, um mutante pode ser um mutante geneticamente modificado, por exemplo, um mutante em que um gene SGI1 foi alvejado por recombinação homóloga para knockout, knockdown e/ou substituição de gene (por exemplo, com a forma com mutação do gene que pode codificar um polipeptídeo que tem atividade reduzida em relação ao polipeptídeo do tipo selvagem). Por exemplo, um organismo fotossintético de interesse pode ser geneticamente modificado por recombinação homóloga sítio-dirigida para inserir uma sequência em um locus genômico e alterar, assim, um gene e/ou sua expressão e/ou inserir um promotor em um locus genético do microorganismo hospedeiro para afetar a expressão de um gene no locus. [00128] Por exemplo, knockout de gene, knockdown de gene ou substituição de gene por recombinação homóloga pode ser pela transformação de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, DNA) que inclui uma sequência homólogo à região do genoma a ser alterada, em que a sequência homóloga é interrompida por uma sequência estranha, tipicamente um gene marcador selecionável que permite a seleção do construto integrado. As sequências de

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60/137 flanqueamento homólogas a genoma em cada lado da sequência estranha ou sequência de genes com mutação podem ter, por exemplo, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1.000, pelo menos cerca de 1.200, pelo menos cerca de 1.500, pelo menos cerca de 1.750 ou pelo menos cerca de 2.000 (por exemplo, pelo menos qualquer um dentre 50, 100, 200, 500, 1.000, 1.500 ou 2.000) nucleotídeos de comprimento. Um construto de knockout de gene ou knocfc/n de gene em que uma sequência estranha é flanqueada por sequências de genes alvo pode ser fornecido em um vetor que pode ser opcionalmente linearizado, por exemplo, fora da região que deve passar por recombinação homóloga ou pode ser fornecido como um fragmento linear que não está no contexto de um vetor, por exemplo, o construto de knockout ou knockín pode ser um fragmento isolado ou sintetizado, incluindo, porém sem limitação, um produto de PCR. Em alguns casos, um sistema de marcador divido pode ser usado para gerar knockouts de genes por recombinação homóloga, em que dois fragmentos de DNA podem ser introduzidos que podem regenerar um marcador selecionável e interromper o locus de gene de interesse por meio de três eventos cruzados (Jeong et ai. (2007) FEMS Microbiol Lett 273: 157 a 163).

[00129] Em um aspecto, esta revelação fornece organismos geneticamente modificados, por exemplo, micro-organismos que têm uma ou mais modificações genéticas ou mutações para atenuar a expressão de um gene SGI1. Conforme usado no presente documento, atenuar ou alterar a expressão e/ou função de um gene (por exemplo, um gene SGI1) significa reduzir ou eliminar a

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61/137 expressão do gene em qualquer maneira que reduza a produção, expressão e/ou função da proteína completamente funcional normalmente expressa. Os meios para atenuar um gene, tal como um gene SGI1, incluem, por exemplo, construtos de recombinação homóloga; sistemas de CRISPR, incluindo RNAs-guia, Cas9 ou outras enzimas cas, por exemplo, Cpf1, Cms1, Csm1 ou outros, e opcionalmente, fragmentos doadores para inserção no sítio alvejado; construtos de RNAi, incluindo shRNAs, construtos de RNA antissenso; construtos de rlbozima; TALENS, nucleases Dedo de Zinco; e meganucleases. Por exemplo, em algumas modalidades, o gene pode ser interrompido, por exemplo, por uma inserção ou substituição de gene mediada por recombinação homóloga e/ou pela atividade de um agente de indução de quebra de fita dupla, tal como meganuclease (consultar, por exemplo, o documento n² WO2012017329 (US20130164850 e US20160272980), nuclease dedo de zinco (PerezPinera et aL (2012) Curr. Opin. Chem. BioL 16:268 a 277; WO2012017329 (US20130164850 e US20120324603), TALEN (WO2014/207043, US20160130599); WO 2014/076571 (US20160272980)) ou uma proteína cas (por exemplo, uma proteína Cas9, proteína efetora Cpf1 ou proteína efetora Csm1) de um sistema CRISPR (consultar, por exemplo, os documentos ² US 8.697.359; US 8.795.965; US 8.889.356; US 2016/0304893; US 2016/0090603; US2014/0068797; US 2016/0208243; US 2017/0233756). Outros métodos de interrupção são conhecidos na técnica e seriam adequados aqui conforme seria entendido por aqueles com habilidade comum na técnica.

[00130] Em algumas modalidades, o micro-organismo mutante tem uma ou mais mutações que estão presentes em, ou uma ou mais mutações que afetam a expressão de, um gene SGI1. Um microorganismo recombinante geneticamente modificado para ter expressão

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62/137 atenuada de um gene SGI1 pode ter um gene SGI1 interrompido que inclui pelo menos uma inserção, mutação ou deleção que reduz ou abole a expressão do gene de modo que um gene SGI1 completamente funcional não seja produzido em menores quantidades do que é produzido por um micro-organismo de controle que não inclui um gene SGI1 interrompido. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais mutações (alteração, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos) pode estar na região de codificação do gene ou pode estar em um íntron, 3’ UTR, 5’ UTR ou região promotora, por exemplo, dentro de cerca de 1 quilopar de bases do sítio de início transcricional, dentro de cerca de 2 quilopares de bases do sítio de início transcricional ou dentro de cerca de 3 quilopares de bases do sítio de início transcricional. Em algumas modalidades, por exemplo, um micro-organlsmo mutante que tem expressão atenuada de um gene conforme revelado no presente documento pode ter uma ou mais mutações, que podem ser uma ou mais alterações de nucleobase e/ou uma ou mais deleções de nucleobase e/ou uma ou mais inserções de nucleobase, na região de um gene 5’ do sítio de início transcricional, tal como, em exemplos não limitantes, dentro de cerca de 2 quilopares de bases, dentro de cerca de 1,5 quilopar de bases, dentro de cerca de 1 quilopar de bases ou dentro de cerca de 0,5 quilopar de bases do sítio de início transcricional conhecido ou putativo ou dentro de cerca de 3 quilopares de bases, dentro de cerca de 2,5 quilopares de bases, dentro de cerca de 2 quilopares de bases, dentro de cerca de 1,5 quilopar de bases, dentro de cerca de 1 quilopar de bases ou dentro de cerca de 0,5 quilopares de bases do sítio de início traducional. Como exemplos não limitantes, um gene mutante pode ser um gene que tem uma mutação, inserção ou deleção dentro da região promotora que pode ou aumentar ou diminuir a expressão do gene; pode ser um gene que tem uma deleção que resulta na produção de

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63/137 uma proteína não funcional, proteína truncada, proteína negativa dominante ou nenhuma proteína; pode ser um gene que tem uma ou mais mutações pontuais que levam a uma alteração no aminoácido da proteína codificada ou resulta no splicing aberrante do transcrito de gene, etc.

[00131] Os sistemas de CRISPR referidos no presente documento e revisados por Hsu et a/. (Ce// 157:1.262 a 1.278, 2014) incluem, adicionalmente ao polipeptídeo ou complexo de cas nuclease, um RNA de alvejamento, frequentemente denotado crRNA, que interage com o sítio-alvo de genoma pela complementaridade com uma sequência de sítio-alvo, um RNA transativador (tracr) que forma complexo com o polipeptídeo cas e também inclui uma região que se liga (por complementaridade) ao crRNA de alvejamento. Esta revelação contempla o uso de duas moléculas de RNA (um crRNA e um tracrRNA) que podem ser cotransformadas em uma cepa hospedeira (ou expressas em uma cepa hospedeira) que expressa ou é transfectada com uma proteína cas para edição de genoma ou o uso de um único RNA-guia que inclui uma sequência complementar a uma sequência-alvo assim como uma sequência que interage com uma proteína cas. Isto é, em algumas estratégias, um sistema de CRISPR conforme usado no presente documento pode compreender duas moléculas de RNA separadas (polinucleotídeos de RNA: um tracrRNA e a RNA-alvo ou crRNA, consultar abaixo) e pode ser denominado no presente documento RNA de alvejamento de DNA de molécula dupla ou RNA de alvejamento de DNA de duas moléculas. Alternativamente, conforme Ilustrado nos exemplos, o RNA de alvejamento de DNA pode também incluir a sequência transativadora para interação com a proteína cas (adicionalmente às sequências-alvo homólogas (cr)), isto é, o RNA de alvejamento de DNA pode ser uma única molécula de RNA (único polinucleotídeo de RNA) e é

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64/137 denominado no presente documento RNA-guia quimérico, RNA-guia único ou sgRNA. Os termos RNA de alvejamento de DNA e gRNA são incluslvos, referindo-se, ambos, a RNAs de alvejamento de DNA de molécula dupla e a RNAs de alvejamento de DNA de molécula única (isto é, sgRNAs). Tanto RNAs-guia de molécula única quanto sistemas de dois RNAs foram descritos em detalhes na literatura e, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente n·- U.S. 2014/0068797, Incorporada a título de referência ao presente documento em sua totalidade. Algumas modalidades dos métodos e composições apresentados no presente documento incluem um RNAguia que tem uma sequência que corresponde a uma sequência-alvo em um gene SGI1. Em algumas modalidades, o RNA-guia é um guia quimérico. Em outras modalidades, o RNA-guia nâo inclui uma sequência tracr. Em alguns exemplos, tanto um crRNA para alvejamento do locus de gene quanto um tracrRNA são empregados na mutagênese mediada por cas. Em algumas modalidades, a proteína cas é expressa na célula ou organismo-aivo e, em algumas modalidades alternativas, uma proteína cas pode ser introduzida na célula, por exemplo, como um complexo de ribonucleoproteína que inclui um RNA-guia, que pode ser um RNA-guia quimérico ou um crRNA e, em algumas modalidades, um tracrRNA. Qualquer proteína cas pode ser usada nos métodos no presente documento, por exemplo, Cas1, CasllB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecida como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csd, Csc2, Csa5, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Cms1, Cpf 1, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, C2c1, C2c2, C2c3 e homólogos das mesmas ou versões modificadas das mesmas. A proteína cas pode ser uma proteína Cas9, tal como uma proteína Cas9 de

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Staphylococcus pyogenes, S. thermophilus, S. pneumonia, S. aureus ou Neisseria meningitidis, como exemplos não limitantes. São também consideradas as proteínas Cas9 fornecidas como SEQ ID Nos:1 a 256 e 795 a 1346 na Publicação de Pedido de Patente n^fi U.S. 2014/0068797, incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade, e proteínas Cas9 quiméricas que podem combinar domínios de mais do que uma proteína Cas9, assim como variantes e mutantes de proteínas Cas9 identificadas. A nuclease guiada por RNA pode ser, por exemplo, uma proteína Cpf1 (consultar, por exemplo, o documento n^fi US 2016/0208243) ou uma proteína Csm1 (consultar, por exemplo, o documento n² US 2017/0233756). [00132] A atividade de Cas nuclease cliva o DNA-alvo para produzir quebras de fita dupla. Essas quebras são, então, reparadas pela célula em um de dois modos: junção de extremidades não homólogas ou reparo direcionado à homologia. Na junção de extremidades não homólogas (NHEJ), as quebras de fita dupla são reparadas pela ligação direta das extremidades quebradas uma à outra. Nesse caso, nenhum material de ácido nucleico novo é inserido no sítio, embora algum material de ácido nucleico possa ser perdido, resultado em uma deleção, ou alteração, frequentemente resultando em mutação. No reparo direcionado à homologia, um polinucleotídeo doador (algumas vezes denominado DNA doador ou DNA de edição) que pode ter homologia à sequência-alvo de DNA clivada é usado como um modelo para o reparo da sequência-alvo de DNA clivada, resultando na transferência de informações genéticas do polinucleotídeo doador ao DNA-alvo. Como tal, material de ácido nucieico novo pode ser inserido/copiado no sítio. As modificações do DNA-alvo devido à NHEJ e/ou reparo direcionado à homologia (por exemplo, com o uso de uma molécula de DNA doadora) pode levar à, por exemplo, correção de gene, substituição de gene, etiquetagem de gene, inserção de

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66/137 transgene, deleção de nucleotídeo, interrupção de gene, mutação de gene, etc.

[00133] Em alguns casos, a divagem do DNA por um polipeptídeo de modificação sítio-dirigida (por exemplo, uma cas nuclease, nuclease dedo de zinco, meganuclease ou TALEN) pode ser usada para deleter material de ácido nucleico de uma sequência-alvo de DNA clivando-se a sequência-alvo de DNA e permitindo que a célula repare a sequência na ausência de um polinucleotídeo doador exogenamente fornecido. Tais eventos de NHEJ podem resultar em mutações (reparo errôneo”) no sítio de reunião das extremidades clivadas que podem resultar na interrupção de gene.

[00134] Alternativamente, se um RNA de alvejamento de DNA for coadministrado a células que expressam uma cas nuclease juntamente com um DNA doador, os presentes métodos podem ser usados para adicionar, isto é, inserir ou substituir, material de ácido nucleico a uma sequência-alvo de DNA (por exemplo, knockouf por mutagênese de inserção ou knockin' de um ácido nucleico que codifica uma proteína (por exemplo, um marcador selecionável e/ou qualquer proteína de interesse), um siRNA, um miRNA, etc., para modificar uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, introduzir uma mutação) e similares.

[00135] Um DNA doador pode, em modalidades particulares, incluir uma sequência reguladora de genes (por exemplo, um promotor) que pode, com o uso de alvejamento CRISPR, ser inserida a montante das regiões de codificação do gene e a montante da região promotora proximal presumida do gene, por exemplo, pelo menos cerca de 50 pares de base, pelo menos cerca de 100 pares de base, pelo menos cerca de 120 pares de base, pelo menos cerca de 150 pares de base, pelo menos cerca de 200 pares de base, pelo menos cerca de 250 pares de base, pelo menos cerca de 300 pares de base, pelo menos

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67/137 cerca de 350 pares de base, peto menos cerca de 400 pares de base, peto menos cerca de 450 pares de base ou peto menos cerca de 500 pares de base (por exemplo, pelo menos 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 pares de base) a montante do ATG de iniciação da região de codificação do gene SGI1. O DNA doador pode incluir uma sequência, tal como, por exemplo, um marcador selecionável ou qualquer sequência conveniente, que pode interferir com o promotor nativo. A sequência adicional inserida a montante do ATG de iniciação do quadro de leitura aberto de SGI1 (por exemplo, na 5’UTR ou a montante do sítio de início transcricional do gene SGI1) pode diminuir ou até mesmo eliminar a expressão do gene SGI1 endógeno. Alternativa ou adicionalmente, o gene SGI1 nativo pode ter seu promotor endógeno completa ou parcialmente substituído por um promotor mais fraco ou diferentemente regulado ou uma sequência não promotora.

[00136] Em alguns exemplos, uma molécula de ácido nucleico introduzida em uma célula hospedeira para gerar uma linhagem de células de edição de genoma de alta eficiência codifica uma enzima Cas9 que sofre mutação em relação à enzima do tipo selvagem correspondente de modo que a enzima Cas9 com mutação não tenha a capacidade para clivar uma ou ambas as fitas de um polinucleotídeoalvo contendo uma sequência-alvo. Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que diva ambas as fitas a uma nickase (uma enzima que oliva uma fita simples). Outros exemplos de mutações que tornam Cas9 uma nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A e N863A. Em algumas modalidades, uma Cas9 nickase pode ser usada em combinação com uma sequênciaguia (ou sequências-guia), por exemplo, duas sequências-guia, que têm como alvo, respectivamente, fitas senso e antissenso do alvo de

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DNA. Essa combinação permite que ambas as fitas sejam cortadas e usadas para induzir NHEJ. Dois alvos de nickase (dentro de proximidade estreita, mas alvejando diferentes fitas do DNA) podem ser usados para induzir NHEJ mutagênico. Tal alvejamento de um locus com o uso de enzimas que clivam cepas opostas nas posições desalinhadas pode também reduzir a divagem não alvo, na medida que ambas as fitas devem ser precisa e especificamente clivadas para alcançar mutação de genoma. Em exemplos adicionais, uma enzima Cas9 mutante que é prejudicada em sua capacidade para clivar DNA pode ser expressa na célula, em que um ou mais RNAs-guia que têm como alvo uma sequência a montante do sítio de início transcricionai ou traducional do gene alvejado são também introduzidos. Nesse caso, a enzima cas pode se ligar à sequência-alvo e bloquear a transcrição do gene alvejado (Qi et aL (2013) Celt 152:1.173 a 1.183). Essa interferência de CRISPR da expressão de gene pode ser denominada RNAi e é também descrita em detalhes em Larson et al. (2013) Nat. Protoc. 8: 2.180 a 2.196. Em alguns casos, um polipeptídeo cas tal como um polipeptídeo Cas9 é um polipeptídeo de fusão que compreende, por exemplo: i) um polipeptídeo Cas9 (que pode ser opcionalmente um polipeptídeo Cas9 variante conforme descrito acima); e b) um polipeptídeo heterólogo covalentemente ligado (também denominado parceiro de fusão). Uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga pode ser ligada a outra sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos quimérica que codifica um polipeptídeo quimérico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão Cas9 é gerado fundindo-se um polipeptídeo Cas9 a uma sequência heteróloga que fornece localização subcelular (isto é, a sequência heteróloga é uma sequência de localização subcelular, por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para alvejamento de

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69/137 núcleo; um sinal de localização mitocondrial para alvejamento de mitocôndria; um sinal de localização de cloroplasto para alvejamento de um cloroplasto; um sinal de retenção de ER; e similares). Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode fornecer uma etiqueta (isto é, a sequência heteróloga é uma identificação detectável) para facilitar o rastreamento e/ou a purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato e similares; uma etiqueta de hemaglutinina (HA); uma etiqueta FLAG; uma etiqueta Myc; e similares).

[00137] As células hospedeiras podem ser geneticamente modificadas (por exemplo, transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com, por exemplo, um construto de vetor que pode ser, por exemplo, um vetor para recombinação homóloga que inclui sequências de ácidos nucleicos homólogas a uma porção de um locus de gene SGI1 da célula hospedeira ou a regiões adjacentes à mesma ou pode ser um vetor de expressão para a expressão de qualquer um ou uma combinação dentre: uma proteína cas (por exemplo, uma proteína Cas9), um RNA-guia quimérico de CRISPR, um crRNA e/ou um tracrRNA, um construto de RNAi (por exemplo, um shRNA), um RNA antissenso ou uma ribozima. O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc. Um vetor para expressão de um polipeptídeo ou RNA para edição de genoma pode também ser projetado para integração no hospedeiro, por exemplo, por recombinação homóloga. Um vetor contendo uma sequência de polinucleotídeos conforme descrito no presente documento, por exemplo, sequências que têm homologia a sequências de gene SGI1 hospedeiras (incluindo sequências que estão a montante e a jusante dos sequências de codificação de polipeptídeo SGI1), assim como, opcionalmente, um gene-repórter ou marcador

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70/137 selecionável pode ser empregado para transformar um hospedeiro apropriado para causar a atenuação de um gene SGI1.

[00138] O micro-organismo recombinante, em alguns exemplos, pode ter expressão reduzida, mas não abolida do gene SGI1, e o micro-organismo recombinante pode ter um aumento na produção de lipídio de cerca de 25% a cerca de 200% ou mais, por exemplo. Por exemplo, o aumento na produção d lipídio pode ser entre cerca de 25% mais a cerca de 200% mais, cerca de 25% mais a cerca de 175% mais, cerca de 25% mais a cerca de 150% mais, cerca de 25% mais a cerca de 125% mais, cerca de 50% mais a cerca de 200% mais, cerca de 50% mais a cerca de 175% mais, cerca de 50% mais a cerca de 150% mais, cerca de 50% mais a cerca de 125% mais, cerca de 75% mais a cerca de 200% mais ou cerca de 75% mais a cerca de 175% mais, cerca de 75% mais a cerca de 150% ou cerca de 75% mais a cerca de 125% mais (por exemplo, 25 a 200% mais) em relação a um micro-organismo de controle. Um organismo fotossintético geneticamente modificado conforme fornecido no presente documento pode, em alguns exemplos, incluir um construto de ácido nucleico para atenuar a expressão de um gene SGI1. Em algumas modalidades, micro-organismo geneticamente modificado conforme fornecido no presente documento pode incluir um construto de ácido nucleico para atenuar a expressão de um polipeptídeo SGI1. Por exemplo, um micro-organismo hospedeiro pode incluir um construto para expressar uma molécula de RNAi, ribozima ou molécula antissenso que reduz a expressão de um gene SGI1. Em alguns exemplos, um microorganismo recombinante conforme fornecido no presente documento pode incluir pelo menos um construto introduzido (exógeno ou não nativo) para reduzir a expressão de um gene SGI1.

[00139] Em alguns exemplos, cepas geneticamente modificadas podem ser tríadas quanto à expressão de um gene SGI1 que é

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71/137 diminuída em relação a uma célula de controle que não inclui uma modificação genética para atenuar a expressão de gene SGI1, mas não é eliminada, com o uso de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, RNA-Seq ou PCR de transcrição reversa (RTPCR). Uma cepa geneticamente modificada conforme fornecido no presente documento pode ser modificada para incluir um construto para atenuar a expressão de gene reduzindo-se a quantidade, estabilidade ou traduzibilidade do mRNA de um gene que codifica um polipeptídeo SGI1. Por exemplo, um micro-organismo, tal como uma cepa algácea ou heterokonta, pode ser transformado com um construto de RNA, RNAi ou ribozima antissenso que tem como alvo um mRNA de um gene SGI1 com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um construto de RNA antissenso que inclui toda ou uma porção da região transcrita de um gene pode ser introduzido em um micro-organismo para diminuir a expressão de gene (Shroda et a/. (1999) The Plant Cell 11:1.165 a 1.178; Ngiam et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 775 a 782; Ohnuma et al. (2009) Protoplasma 236: 107 a 112; Lavaud et al. (2012) PLoS One 7:e36806). Alternativa ou adicionalmente, urn construto de RNAi (por exemplo, urn construto que codifica um RNA em formato de grampo curto) que tem como alvo um gene que tem um domínio de TPR pode ser introduzido em um organismo fotossintético, tal como uma alga ou planta para reduzir a expressão do gene SGI1 (consultar, por exemplo, Cerruti et ai. (2011) Eukaryotic Ce// (2011) 10: 1.164 a 1.172; Shroda et al. (2006) Curr Genet. 49:69 a 84).

[00140] As ribozimas são complexos de RNA-proteína que clivam ácidos nucleicos de uma forma específica para sítio. As ribozimas têm domínios catalíticos específicos que processam a atividade de endonuclease. Por exemplo, a Patente n-· U.S. 5.354.855 (incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade) relata

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72/137 que certas ribozimas podem atuar como endonucleases com uma especificidade de sequência maior que aquela de ribonucleases conhecidas e que se aproxima daquela das enzimas de restrição de DNA. Os construtos de RNA catalítico (ribozimas) podem ser projetados para pareamento de bases com um mRNA que codifica um gene conforme fornecido no presente documento para clivar o alvo de mRNA. Em alguns exemplos, as sequências de ribozima podem ser integradas dentro de um construto de RNA antissenso para mediar a divagem do alvo. Vários tipos de ribozimas podem ser considerados, seu projeto e uso são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Haseloff et a!. (1988) Nature 334:585 a 591. As ribozimas são alvejadas a uma dada sequência em virtude de anelamento a um sítio por interações de pares de bases complementares. Dois prolongamentos de homologia são necessários para esse alvejamento. Esses prolongamentos de sequências homólogas flanqueiam a estrutura de ribozima catalítica definida acima. Cada prolongamento de sequência homóloga pode variar em comprimento de 7 a 15 nucleotídeos. A única exigência para definir as sequências homólogas é que, no RNA alvo, as mesmas sejam separadas por uma sequência específica que é o sítio de divagem. Para ribozima do tipo cabeça de martelo, o sítio de divagem é uma sequência de dinucleotídeos, no RNA alvo é uma uracila (U) seguida por uma adenina, citosina ou uracila (A, C ou U) (Thompson et al., (1995) Nud Acids Res 23:2.250 a 2.268). A frequência deste dinucleotídeo que ocorre em qualquer dado RNA é estatisticamente 3 de 16. Portanto, para um dado RNA mensageiro alvo de 1.000 bases, 187 sítios de divagem de dinucleotídeo são estatisticamente possíveis.

[00141] O projeto geral e a otimização de atividade de divagem de RNA direcionado a ribozima foi discutido em detalhes (Haseloff e Gerlach (1988) Nature 334:585 a 591; Symons (1992) Ann Rev

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Biochem 61: 641 a 671; Chowrira et al. (1994) J Biol Chem 269:25.856 a 25.864; Thompson et al. (1995) supra), todos incorporados a título de referência em sua totalidade. Projetar e testar ribozimas quanto à divagem eficaz de um RNA alvo é um processo bem conhecido pelos versados na técnica. Os exemplos de métodos científicos para projetar e testar ribozimas são descritos por Chowrira et al., (1994) supra e Lieber e Strauss (1995) Mol Cell Biol. 15: 540 a 551, cada um incorporado a título de referência. A identificação de sequências operacionais e preferenciais para uso em regulação decrescente de um dado gene é uma matéria para preparar e testar uma dada sequência e é um método de triagem rotineiramente praticado conhecido por aqueles versados na técnica. O uso de construtos de RNAi é descrito na literatura mencionada acima assim como nos documentos n— US2005/0166289 e WO 2013/016267 (ambos os quais estão incorporados ao presente documento em sua referência), por exemplo. Um RNA de fita dupla com homologia ao gene alvo é entregue à célula ou produzido na célula por expressão de um construto de RNAi, por exemplo, um construto em forma de grampo curto de RNAi (sh). O construto pode incluir uma sequência que é idêntica ao gene alvo ou pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência do gene alvo. O construto pode ter pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos

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74/137 cerca de 800, pelo menos cerca de 900 ou pelo menos cerca de 1 kb de sequência (por exemplo, pelo menos 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800 ou 1 kb de sequência) homóloga ao gene alvo. Os vetores de expressão podem ser geneticamente modificados com o uso de promotores selecionados para expressão contínua e induzível de um construto de RNAi, tal como um construto que produz um shRNA.

[00142] Os promotores usados em construtos antissenso, de RNAi ou de ribozima podem ser qualquer um que seja funcional no organismo hospedeiro e que seja adequado para os níveis de expressão exigidos para reduzir a expressão de gene alvo a uma quantidade desejada. Os promotores funcionais em algas e plantas são conhecidos na técnica e revelados no presente documento. O construto pode ser transformado em algas ou plantas com o uso de qualquer método viável, incluindo qualquer um revelado no presente documento. Um organismo ou micro-organismo recombinante transformado com uma molécula de ácido nucleico para atenuar a expressão de gene SGI1, tal como, porém sem limitação, um construto antissenso, de RNAi ou de ribozima, pode ter as propriedades de um mutante de SGI1 descrito no presente documento, incluindo, por exemplo, teor de clorofila reduzido, eficiência fotossintética aumentada e produtividade aumentada em cultura, em relação a um organismo hospedeiro ou molécula de ácido nucleico que resulta em expressão de gene atenuada.

[00143] Um versado na técnica perceberá que diversos métodos de transformação podem ser usados para transformação genética de micro-organismos e, portanto, podem ser empregados para os métodos da presente invenção. Transformação estável se destina a significar que o construto de ácido nucleico introduzido em um organismo se integra ao genoma do organismo ou é parte de um construto epissomal estável e pode ser herdado pela progênie do

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75/137 mesmo. Transformação temporária” se destina a significar que um polinucleotídeo é introduzido no organismo e não se integrar ao genoma ou se tornar de outro modo estabilizado e estavelmente herdado por gerações sucessivas.

[00144] A transformação genética pode resultar em inserção e/ou expressão estáveis de transgenes, construtos do núcleo ou do plastídeo e, em alguns casos, pode resultar em expressão temporária de transgenes. Os métodos de transformação podem ser também usados para a introdução de RNAs guia ou DNAs de edição. A transformação genética de microalgas foi relatada como bem-sucedida para mais de 30 cepas diferentes de microalgas, que pertencem a pelo menos aproximadamente 22 espécies de algas verdes, vermelhas e marrons, diatomáceas, euglenidas e dinoflagelados (consultar, por exemplo, Radakovits et al., Eukaryotic Cell, 2010; e Gong et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2011). Os exemplos não limitantes de tais métodos de transformação úteis incluem agitação de células na presença de microesferas de vidro ou lâminas de carboneto de silício, conforme relatado, por exemplo, por Dunahay, Biotechniques, 15(3):452 a 460, 1993; Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990; Michael e Miller, Plant J., 13, 427 a 435, 1998. Técnicas de eletroporação têm sido usadas com sucesso para transformação genética de diversas espécies microalgáceas, incluindo Nannochloropsis sp. (consultar, por exemplo, Chen et al., J. Phycol., 44:768 a 76, 2008), Chlorella sp. (consultar, por exemplo, Chen et al., Curr. Genet., 39:365 a 370, 2001; Chow e Tung, Plant Cell Rep. Volume 18, η² 9, 778 a 780, 1999), Chlamydomonas (Shimogawara et al., Genetics, 148: 1.821 a 1.828, 1998) e Dunaliella (Sun et al., Mol. Biotechnol. 30(3): 185 a 192, 2005), por exemplo. Bombardeio de microprojéteis, também denominado bombardeio de micropartículas, transformação por pistola de genes ou bombardeio biolístico, tem sido

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76/137 usado com sucesso para diversas espécies algáceas, incluindo, por exemplo, espécies de diatomáceas, tal como Phaeodactyium (Apt et aL, MoL Gen. Genet., 252:572 a 579, 1996), Cydoteila e Navicula (Dunahay et aL, J. PhycoL, 31:1.004 a 1.012, 1995), Cylindrotheca (Fischer et aL, J. PhycoL, 35:113 a 120, 1999) e Chaetoceros sp. (Miyagawa-Yamaguchi et aL, PhycoL Res. 59: 113 a 119, 2011), assim como espécies de algas verdes, tal como Chlorella (EI~Sheekh, Biologia Plantarum, Volume 42, n² 2: 209 a 216, 1999) e espécies de Volvox (Jakoblak et ai., Protist, 155:381 a 393, 2004). Adicionalmente, técnicas de transferência de gene mediada por Agrobacterium podem também ser úteis para transformação genética de microalgas, conforme foi relatado, por exemplo, por Kumar, Plant ScL, 166(3):731 a 738, 2004 e Cheney et aL, J. PhycoL, Volume 37, Suplemento 11, 2001. A conjugação com espécies bacterianas também tem sido empregada para transferência de genes e construtos a algas, conforme revelado, por exemplo, no documento n² US 2016/0244770, incorporado ao presente documento a título de referência.

[00145] Um vetor ou construto de transformação, conforme descrito no presente documento, compreenderá tipicamente um gene marcador que confere um fenótipo seleclonável ou pontuável em células hospedeiras alvo, por exemplo, células algáceas ou pode ser cotransformado com um construto que inclui um marcador. Diversos marcadores selecionáveis foram desenvolvidos com sucesso para isolamento eficaz de transformantes genéticos de algas. Os marcadores selecionáveis comuns incluem resistência a antibióticos, marcadores fluorescentes e marcadores bioquímicos. Diversos gene para resistência a antibióticos diferentes foram usados com sucesso para seleção de transformante microalgáceos, incluindo blastocidina, bleomicina (consultar, por exemplo, Apt et aL, 1996, supra; Fischer et aL, 1999, supra; Fuhrmann et al., Plant J., 19, 353 a 361, 1999,

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Lumbreras et al., Plant J., 14(4):441 a 447, 1998; Zaslavskaia et al., J. Phycol., 36:379 a 386, 2000), espectinomicina (Cerutti et al., Genetics, 145: 97 a 110, 1997; Doetsch et al., Curr. Genet., 39, 49 a 60, 2001; Fargo, Mol. Cell. Biol., 19:6.980 a 6.990, 1999), estreptomicina (Berthold et al., Protist, 153:401 a 412, 2002), paromomicina (Jakobiak et al., Protist, supra.', Sizova et al., Gene, 277:221 a 229, 2001), nourseotricina (Zaslavskaia et al., 2000, supra), G418 (Dunahay et al., 1995, supra; Poulsen e Kroger, FEBS Lett., 272:3.413 a 3.423, 2005, Zaslavskaia et al., 2000, supra), higromicina(Berthold et al., 2002, supra), cloranfenicol (Poulsen e Kroger, 2005, supra) e muitos outros. Os marcadores selecionáveis adicionais para uso em microalgas, tal como Chlamydomonas, podem ser marcadores que fornecem resistência a canamicina e resistência a amicacina (Bateman, Mol. Gen. Genet. 263:404 a 410, 2000), resistência a zeomicina e fleomicina (por exemplo, feomicina ZEOCIN™ D1) (Stevens, Mol. Gen. Genet. 251:23 a 30, 1996) e resistência a paromomicina e neomicina (Sizova et al., 2001, supra). Outros marcadores fluorescentes ou cromogênicos que têm sido usados incluem luciferase (Falciatore et al., J. Mar. Biotechnol., 1: 239 a 251, 1999; Fuhrmann et a!., Plant Mol. Biol., 2004; Jarvis e Brown, Curr. Genet., 19: 317 a 322, 1991), β~ glucuronidase (Chen et al., 2001, supra' Cheney et al., 2001, supra; Chow e Tung, 1999, supra; Ei-Sheekh, 1999, supra; Falciatore et al., 1999, supra; Kubler et al., J. Mar. Biotechnol., 1:165 a 169, 1994), β~ galactosidase (Gan et al., J. Appl. Phycol., 15:345 a 349, 2003; Jiang eta!., Plant Cell Rep., 21:1.211 a 1.216, 2003; Qin etal., High Technol. Lett., 13:87 a 89, 2003) e proteína verde fluorescente (GFP) (Cheney et al., 2001, supra; Ender et al., Plant Cell, 2002, Franklin et al., Plant J., 2002; 56, 148, 210).

[00146] Um versado na técnica perceberá prontamente que uma variedade de sequências promotoras pode ser empregada de modo

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78/137 útil para sistemas de transformação de espécies microalgáceas em conformidade com a presente invenção. Por exemplo, os promotores comumente usados para acionar a expressão de transgene em microalgas incluem várias versões do promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (CalW35S), que têm sido usados tanto em dlnoflagelados quanto em clorófltas (Chow et a/, Plant Cell Rep., 18:778 a 780, 1999; Jarvis e Brown, Curr. Genet., 317 a 321, 1991; Lohuis e Miller, Plant J., 13:427 a 435, 1998). Também foi relatado que o promotor SV40 de vírus símio é ativo em diversas algas (Gan et al., J. Appl. Phycol., 151 345 a 349, 2003; Qin et al., Hydroblologia 398 a 399, 469 a 472, 1999). Os promotores de RBCS2 (ribulose bisfosfato carboxilase, unidade pequena) (Fuhrmann et al., Plant J., 19:353 a 361, 1999) e PsaD (proteína abundante do complexo de fotossistema I; Fischer e Rochaix, FEBS Lett. 581:5,555 a 5,560, 2001) de Chlamydomonas podem ser também úteis. Os promotores de fusão de HSP70A/RBCS2 e HSP70A/p2TUB (tubulina) (Schroda et al., Plant J., 21:121 a 131, 2000) podem ser também úteis para uma expressão melhorada de transgenes, em que o promotor HSP70A pode servir como um ativador transcricional quando colocado a montante de outros promotores. A expressão em alto nível de um gene de interesse pode ser também atingida, por exemplo, em espécies de diatomáceas, sob o controle de um promotor de um gene fcp que codifica uma proteína de ligação de fucoxantina-clorofila a/b de diatomácea (Falciatore et al., Mar. Biotechnol., 1:239 a 251, 1999; Zaslavskaia et al., J. Phycol. 36:379 a 386, 2000) ou o gene vcp que codifica uma proteína de ligação de vlolaxantina-clorofila a/b de eustigmatófita (consultar a Patente n··· U.S. 8.318.482, incorporada a título de referência ao presente documento). Se for desejado, promotores induzíveis podem fornecer expressão rápida e firmemente controlada de genes em microalgas transgênicas. Por exemplo, as regiões

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79/137 promotoras dos genes NR que codificam nitrato redutase podem ser usadas como tais promotores induzíveis. A atividade de promotor NR é tipicamente suprimida por amônia e induzida quando amônio é substituído por nitrato (Poulsen e Kroger, FEBS Lett 272:3.413 a 3.423, 2005), assim, a expressão de genes pode ser ativada ou desativada quando células microalgáceas são proliferadas na presença de amônio/nitrato. Um promotor de Nannochloropsis reprimível por amônio, denominado o promotor de Nitrlto/Sulfito Redutase reprimível por Amônia, é revelado no documento n²2017/0073695, incorporado ao presente documento a título de referência. Os promotores algáceos adicionais que podem encontrar uso nos construtos e sistemas de transformação fornecidos no presente documento incluem aqueles revelados na Patente n² U.S. 8.835.419; Patente n² U.S. 8.883.993; Publicação de Pedido de Patente n² US 2013/0023035; Publicação de Pedido de Patente n² US 2013/0323780; Publicação de Pedido de Patente n² US 2014/0363892, Publicação de Pedido de Patente n² US 2017/0152520 e Publicação de Pedido de Patente n² U.S. 2017/0114107, todas incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00147] As células e organismos hospedeiros podem ser células ou organismos não transformados ou podem ser células ou organismos que já são transfectados com pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena. Por exemplo, uma célula hospedeira algácea ou vegetal que é geneticamente modificada para ter expressão atenuada de um gene SGI1 pode incluir ainda um ou mais transgenes que podem conferir ou contribuir para qualquer traço desejável, tal como, porém sem limitação, produção aumentada de biomoléculas de interesse, tal como uma ou mais proteínas, pigmentos, álcools ou lipídios.

[00148] A transformação de células algáceas por microbombardeio

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80/137 é descrita, por exempio, na Patente n² US 8.883.993 e Publicação de Pedido de Patente n^s US 2017/0130238, ambas as quais estão incorporadas a título de referência em sua totalidade. O bombardeio de células com o uso da Pistola de Genes BioRad Helios® é também descrito no Helios Gene Gun System Instruction Manual, M1652411 disponível em bio-rad.com/en-us/product/helios-gene~gunsystem?tab™Documents).

[00149] Em vários aspectos, mutações de atenuação de gene são geradas em uma planta. Os métodos incluem, por exemplo, introduzir o sistema CRISPR, conforme descrito no presente documento, para ter como alvo um ou mais genes SGI1 de planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula vegetal pode ser geneticamente modificada para as características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas no presente documento com o uso dos construtos de ácido nucléico da presente revelação e os vários métodos de transformação conhecidos na técnica (Consultar Guerineau F., Methods Mol Biol. (1995) 49:1 a 32). Nas modalidades preferenciais, as plantas e as células vegetais alvo para modificação genética incluem, porém sem limitação, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas, incluindo culturas de grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, milheto, cevada), culturas frutíferas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas forrageiras (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterrabas sacarinas, inhame), culturas de vegetais folhosos (por exempio, alface, espinafre); plantas floridas (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pinheiros (por exemplo, pinheiro, abato, beto vermelho), plantas usadas em fitorremediação (por exempio, plantas que acumulam metal pesado); culturas oleosas (por exemplo, girassol, semente de colza) e plantas usadas para propósitos experimentais (por exemplo, Arabidopsis).

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Assim, mutantes de SGI1 podem ser gerados em uma ampla gama de plantas, tal como, por exemplo, com plantas dicotiledôneas que pertencem às ordens Magniolales, Miciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violates, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales e Asterales.

[00150] Os mutantes de SGI1 podem ser também gerados em plantas monocotiledôneas, tais como aquelas pertencentes às ordens Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales e Orchidates, ou com plantas pertencentes a Gymnospermae, por exemplo, aquelas que pertencem às ordens Pinales, Ginkgoales, Cycadales, Araucariales, Cupressales e Gnetales.

[00151] Alternativa ou adicionalmente a qualquer uma das modalidades apresentadas acima, estão incluídas no presente documento as seguintes modalidades:

[00152] A modalidade 1 é um organismo fotossintético mutante que tem um gene atenuado que codifica um polipeptídeo SGI1, em que o organismo fotossintético produz mais biomassa ou mais do que pelo menos um bioproduto do que um organismo fotossintético de controle proliferado ou cultivado substancialmente sob as mesmas condições,

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82/137 opcionalmente, em que um ou mais dos seguintes são satisfeitos:

a) o organismo fotossintético mutante tem teor de clorofila reduzido em relação ao micro-organismo fotossintético de controle;

b) o organismo fotossintético mutante tem uma razão a:b de clorofila aumentada em relação ao organismo fotossintético de controle;

c) o organismo fotossintético mutante tem um tamanho de antena do fotossistema II (PSII) reduzido em relação ao organismo fotossintético de controle;

d) o organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante tem um Pmáx de ^UC mais alto em relação ao organismo fotossintético de controle;

e) o organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante tem um Fv/Fm mais alto do que o organismo de controle;

f) o organismo fotossintético mutante tem um teor de proteína mais alto do que o organismo de controle; e

g) o organismo fotossintético mutante tem um teor de rubisco ativase mais alto do que o organismo de controle.

[00153] A modalidade 2 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com a modalidade 1, em que o organismo fotossintético mutante produz pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% mais biomassa ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos

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100% mais de menos um bioproduto do que um organismo fotossintético de controle proliferado ou cultivado substancialmente sob as mesmas condições, opcionalmente, em que o bioproduto é um ou mais lipídios, um ou mais carboidratos, uma ou mais proteínas ou peptídeos, um ou mais ácidos nucleicos, um ou mais açúcares, um ou mais álcoois, um ou mais aminoácidos, um ou mais nucleotídeos, um ou mais antioxidantes, um ou mais pigmentos ou corantes, uma ou mais vitaminas, um ou mais terpenoides ou um ou mais polímeros. [00154] A Modalidade 3 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com a modalidade 1 ou a modalidade 2, em que o gene SGI1 codifica um polipeptídeo SGI que tem um domínio de myb C-terminal a um domínio de receptor do Regulador de Resposta, opcionalmente, em que o polipeptídeo SGI1:

a) compreende uma sequência de aminoácidos que codifica um domínio de receptor do Regulador de Resposta (RR) que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 ou SEQ ID NO:57; e/ou

b) compreende uma sequência de aminoácidos que codifica um domínio myb que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade com qualquer uma dentre SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID

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NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID N0:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74 ou SEQ ID NO:75.

[00155] A modalidade 4 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o gene SGI1 tem mutação, opcionalmente, em que:

a) o gene SGI1 compreende um indel que inativa o gene;

b) o gene SGI1 compreende uma mutação que altera pelo menos um aminoácido do polipeptídeo SGI1 codificado pelo gene;

c) o gene SGI1 compreende uma inserção de um fragmento de DNA introduzido que inativa o gene;

d) o gene SGI1 compreende uma inserção de um fragmento de DNA introduzido na região não traduzida 5’ ou 3’ do gene que reduz a expressão do gene; e/ou

e) o gene SGI1 compreende um indel na região não traduzida 5’ ou 3’ do gene que reduz a expressão do gene.

[00156] A modalidade 5 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o organismo fotossintético mutante compreende um construto de RNAi, um construto antissenso ou um construto de rlbozima que tem como alvo o transcrito de gene SG11.

[00157] A modalidade 6 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o organismo fotossintético mutante é uma planta, opcionalmente, uma monocotlledônea, uma dicotiledônea ou musgo.

[00158] A modalidade 7 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o organismo fotossintético mutante é uma alga, opcionalmente uma microalga, opcionalmente uma alga Chlorophyta ou Charyophyta.A modalidade 7 é um organismo fotossintético mutante, de acordo com

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85/137 modalidade 7, em que o micro-organismo fotossintético mutante é uma alga Chlorophyta da classe Chlorophyceace, Chlorodendrophyceae, Prasinophyceace ou Trebouxiophyceae.

[00159] A modalidade 8 é uma biomassa que compreende um organismo fotossintético mutante de qualquer uma das modalidades acima.

[00160] A modalidade 9 é um método para produzir biomassa ou um bioproduto que compreende cultivar qualquer um dos organismos fotossintéticos mutantes das modalidades 1 a 7 e isolar biomassa. Exemplos

Meios [00161] PM119 é um meio repleto de nutrientes que inclui: Sais 35 ppt Instant Ocean (Aquatic Eco Systems; Apopka, FL), solução de enriquecimento com água marinha 5X Guillard’s F/2 (50X estoque da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, número de catálogo G0154; concentrações finais de componentes nos meios: nitrato de sódio 4,413 mM; fosfato de sódio monobásico 0,16 mM; Biotina 0,103 μΜ; cloreto de cobalto 0,240 pM · 6H2O; sulfato cúprico 0,200 μΜ · 5H2O; EDTA dissódico 0,0585 mM * 2H2O; cloreto de manganês 4,54 pM * 4HzO; molibdato de sódio 0,124 μΜ · 2HzO; tiamina 1,48 μΜ * HCI; Vitamina B12 0,0185 pM; sulfato de zinco 0,382 μΜ · 7H2O).

[00162] PM074 é um meio repleto de nutrientes que é produzido pela adição de 1,3 ml de PROLINE® F/2 Algae Feed Part A (Aquatic Eco-Systems) e 1,3 ml PROLINE® F/2 Algae Feed Part B (Aquatic Eco-Systems) até um volume final de 1 litro de uma solução de sais Instant Ocean (35 g/l) (Aquatic Eco Systems, Apopka, FL). Prolina A e Prolina B juntas incluem NaNOs 8,8 mM, NaHsPO+hW 0,361 mM, metais vestigiais 10X F/2 e Vitaminas 10X F/2 (Guillard (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, in Culture of Marine Invertebrate Animals. (eds: Smith W.L. e Chanley M.H.) Plenum

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Press, New York, EUA. páginas 26 a 60).

[00163] PM 147 é um meio repleto de nutrientes que é baseado em PM074, mas tem 50% do sal. O mesmo é produzido pela adição de 1,3 ml de PROLINE® F/2 Algae Feed Part A (Aquatic Eco-Systems) e 1,3 ml PROLINE® F/2 Algae Feed Part B (Aquatic Eco-Systems) até um volume final de 1 litro de uma solução de sais Instant Ocean (17,5 g/l) (Aquatic Eco Systems, Apopka, FL).

[00164] PM 153 é um meio repleto de nutrientes que é baseado em PM074, mas inclui ureia em vez de nitrato como a fonte de nitrogênio. O mesmo é produzido adicionando-se 1,3 ml de PROLINE® F/2 Algae Feed Part A (Aquatic Eco-Systems) e 1,3 ml de Solução C até um volume final de 1 litro de uma solução de sais Instant Ocean (17,5 g/l) (Aquatic Eco Systems, Apopka, FL) e, então, adicionando-se 4 ml se ureia esterilizada por filtração 1,1 M. A Solução C é 38,75 g/l de NaH2PO4 H2O, 758 mg/l de Tiamina HCI, 3,88 mg/l de vitamina B12 e 3,84 mg/l de biotina.

Exemplo 1. Mutagênese UV de uma cepa de Parachlorella [00165] Para isolar mutantes de uma clorófita, ou espécies de alga verde, células de Parachlorella cepa WT-1185 foram mutagenizadas com UV e selecionadas com base em baixa fluorescência de clorofila após aclimatação em baixa luz. A cepa de Parachlorella usadas para mutagênese, WT-1185, foi isoiada de um ambiente marinho. As células de Parachlorella WT-1185 foram proliferadas até fase logarítmica média e, então, diluídas a 1 x 10® células/ml com meio de proliferação PM 119. As suspensões de células foram transferidas por pipeta a uma placa de Petri de 100 mm e colocadas dentro de um reticulador STRATALINKER® 2400 UV (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) com a tampa da placa removida, irradiação UV foi executada com 10.000, 25.000 e 50.000 pJ/cm². Após irradiação, as suspensões de células foram pipetadas em um frasco em agitação

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87/137 envolvido em folha metálica para impedir a exposição à luz por vinte e quatro horas durante a recuperação.

Exemplo 2. Triagem por mutantes de cepa WT-1185 de Parachioreiia sp. com baixo teor de clorofila [00166] Após mutagênese e recuperação, conforme descrito no Exemplo 1, as células de colônias com cor pálida foram selecionadas e deixadas proliferar entre um e cinco dias em baixa (100 pmol de fótons nr² s'¹) luz, após os quais as mesmas foram selecionadas por citometria de fluxo com o uso de um citômetro de fluxo BD FACSAria II (BD Biosciences, San Jose, CA) para selecionar células que têm baixa fluorescência de clorofila. Em geral, a porção de células com no mínimo aproximadamente 0,5 a 2% de fluorescência de clorofila em comparação com a população total de células foi selecionada. Ademais, a triagem primária de linhagens com antena reduzida isoladas através de citometria de fluxo foi conduzida através da seleção de colônias verdes ou amarelas visualmente após as células selecionadas terem sido colocadas em placas. A fim de triar linhagens com antena reduzida putativa de outros mutantes de pigmento reduzidos e falsos positivos, colônias selecionadas foram submetidas a uma triagem de cultivo secundária de produtividade média para aclimatar os isolados a condições de baixa luz antes de medições fotofisiológicas. A fluorescência de clorofila foi monitorada durante aclimatação a baixa luz para selecionar colônias que mantiveram a característica de fluorescência de clorofila reduzida do estado aclimatado a alta luz. Os clones que foram selecionados demonstraram apenas aumentos pequenos em clorofila (em relação a células do tipo selvagem) quando transferidos de luz alta para baixa.

[00167] Os ensaios de cultura semicontínuos em luz alta constante (aproximadamente 1.700 pmol de fótons nr² s¹) com o uso de 165 ml de culturas em frascos de cultura de tecido de 75 cm² foram realizados

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88/137 para identificar cepas que têm produtividade aumentada (taxa aumentada de produção de biomassa, medida como acúmulo de TOC) em relação à cepa progenitora do tipo selvagem WT-1185. Dois frascos de 75 cm² foram inoculados com cultura de semente de uma dada cepa mutante. Os frascos tinham tampões que têm tubulação conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com a largura (dimensão mais estreita) contra um banco de luz LED. A profundidade das culturas (a distância da parede do frasco mais próximo à fonte de luz até a parede na parte posterior do frasco) foi aproximadamente 8,0 cm. As culturas foram diluídas diariamente no começo do período de luz removendo-se 65% do volume de cultura e substituindo-se as mesmas por meios PM119 frescos diluídos para ajustar ao aumento em salinidade devido à evaporação que ocorre nas culturas (212 ml de di H2O a 1 I de meio PM119). As amostras para análise de TOC foram tomadas da cultura removida para a diluição. Dois isolados, NE-7843 e NE-13380, que foram identificados nesse ensaio como tendo produtividade aumentada foram analisados adicionalmente.

Exemplo 3. Ensaios de Produtividade Semicontínuos de Mutantes Algáceos NE-7843 e NE-13380.

[00168] Entre as cepas de Parachioresia que mostraram ter teor de clorofila reduzido sob condições de baixa luz estavam dois isolados que foram analisados para produtividade aumentada: mutantes NE7843 e NE-13380. No ensaio de produtividade, culturas fotoautotróficas dos mutantes foram proliferadas durante diversos dias em modo semicontínuo de luz constante (CL-SCPA) com amostras de cultura removidas diariamente para determinação de biomassa. A luz foi mantida a uma constante de 1.900 a 2.000 pmol de fótons nr² s’¹por 24 horas por dia. Nesse ensaio, meios de cultura PM119 em um

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89/137 frasco de 225 cm² foram inoculados com cultura de semente de uma dada cepa mutante. Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíram barras de agitação e tinham tampões que têm tubulação conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com a largura (dimensão mais estreita) contra um banco de luz LED. A dimensão de profundidade dos frascos, que se estendem para trás a partir da fonte de luz, foi 13,7 cm. Considerandose 0 posicionamento dos frascos, a maior distância das células nos frascos a partir da salinidade da fonte de luz foi aproximadamente 15,5 cm. As culturas foram diluídas diariamente removendo-se 65% do volume de cultura e substituindo-se as mesmas por meio de cultura PM119 fresco diluído para ajustar ao aumento em salinidade devido à evaporação que ocorre nas culturas. As amostras para análise de TOC foram tomadas da cultura removida para a diluição. O ensaio de produtividade semicontínuo foi executado por 12 dias uma vez que as culturas tenham atingido estado de equilíbrio.

[00169] A produtividade para 0 ensaio foi avaliada medindo-se carbono orgânico total (TOC) das amostras que foram removidas diariamente. O carbono orgânico total (TOC) foi determinado diluindose 2 ml de cultura celular até um volume total de 20 ml com água Dl. Três injeções por medição foram injetadas em um Analisador Shimadzu TOC-Vcsj para determinação de Carbono Total (TC) e Carbono Inorgânico Total (TIC). O forno de combustão foi ajustado a 720Ό, e TOC foi determinado subtraindo-se TIC de T C. A faixa de calíbraçâo de 4 pontos foi de 2 ppm a 200 ppm correspondendo a 20 a 2.000 ppm para culturas não diluídas com uma correlação de r² > 0,999.

[00170] Os resultados exemplificativos dos ensaios de produtividade em pequena escala são fornecidos na Figura 1A para

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90/137 mutante NE-7843 e na Figura 1B para mutante NE-13380, em que a produtividade diária média de culturas duplicadas durante 12 dias do cultivo é mostrada. As Figuras 1A e 1B demonstram que os mutantes NE-7843 e NE-13380, respectivamente, tiveram produtividade mais alta nesse ensaio CLSCPA, em que cada um demonstram um aumento médio de 34% em relação ao tipo selvagem em TOC durante o curso do ensaio de 12 dias.

Exemplo 4. Genotipagem de Mutantes de LIHLA de Parachiorelia [00171] Os genomas de NE-13380 e NE-7843 foram sequenciados para identificar mutações, tais como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou mutações por inserção/deleção (indels), qualquer um dos quais podería formar a base genética para os fenótipos observados nessas duas cepas. SNPs forma identificados no genoma de NE-13380 que causaram mutações nas regiões de codificação de quatro genes diferentes (primeiras quatro linhas da Tabela 1).

Tabela 1. SNPs em Genoma NE-13380

Gene (ou Genes) com Mutação	Descrição	Tipo de SNP	Modificação de Sequência de Codificação
T-0699	Domínio de ligação a DNA de hélice com abas domínio 1 de cadeia C	Variante com troca de sentido	Trp13Arg
T-4339	proteína prevista conservada	Com ganho de parada	Arg575Stop
T-0841, T-1004	ATPase transportadora de cálcio de proteína associada a flagelar	Variante com troca de sentido	Ser1019Leu
T-2261	proteína do tipo CheY	Variante aceitante de splicing e variante de íntron	retenção de íntron potencial

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T-0898, T-0899, T-0900	Proteína prevista conservada Dynein cadeia leve 4 axonemal	região introgênica	nenhum
T-2627	isoforma 1 de proteína SK12/DOB1 dependente de RNA helicase ATP	variante de íntron	nenhum
T-9629	isoforma 1 de proteína AGD5 que ativa GTPase de fator de ribosilação por ADP e proteína prevista conservada	Variante de gene a montante, variante de íntron	nenhum
[00172] Em	bora essa análise de mutações NE-13380 estivesse em

curso, a análise do genoma de NE-7843 revelou que essa cepa também abrigava SNPs distintos (Tabela 2), incluindo um SNP no gene T-2261 (sequência de genes fornecida como SEQ ID NO:1; sequência de codificação fornecida como SEQ ID NO:2 que codifica a sequência de proteínas da SEQ ID NO:3), um gene também com mutação em NE-13380 (linha 4 da Tabela 1)—que fornece evidência forte de que mutações no gene T-2261 foram a causa do fenótipo de alta produtividade altamente desejável dessas cepas.

Tabela 2. SNPs em Genoma NE-7843

Gene (ou Genes) com Mutação	Descrição	Tipo de SNP	Modificação de Sequência de Codificação
T-0936	proteína da família de ligação a Ran de dedo de Zn	Com ganho de parada	*329Lys
T-4448	Citocromo P450 CYP 711 clan	Variante com troca de sentido	Leu508Cys

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T-2261	Sensor de regulador de resposta tipo b histidina quinase/CheY	Variante com troca de sentido	Leu250Pro
T-3935	Piruvato-flavodoxina oxidorredutase	Variante com troca de sentido	Lys577Glu
T-8682	Dynein cadeia leve LC8 tipo 2	Variante com troca de sentido	Tyr77His
T-4805	ribonucleoproteínas do tipo Sm	Variante com troca de sentido	Asp32Asn
T-5398	Aldolase classe I	Variante com troca de sentido	Gly26Cys
[00173] A	Figura 2 mostra a local das mutações no gene T-2661 de

Parachloreila que tem um domínio do tipo CheY regulador de resposta. Exemplo 5. Geração de mutações alvejadas no gene de proteína do tipo CheY reguladora de resposta T-2661 de Parachloreila [00174] Para demonstrar definitivamente que a mutação do gene T2261 resultou no fenótipo de alta produtividade, três cepas foram geradas em que o gene T-2261 sofreu knock out por mutagênese por inserção medida por Cas9 com um RNA guia que alveja a extremidade 3’ do segundo éxon do gene T-2261 (Figura 2). O RNA guia único (sg RNA) (SEQ ID NO:5) incluiu a sequência-alvo da SEQ ID NO:4 (isto é, a sequência CRISPR ou sequência correspondente à sequência-alvo do gene T-2261) e foi produzido por anelamento de dois oligômeros de DNA complementares que incorporaram a sequência do promotor T7 para gerar um modelo de fita dupla para transcrição in vitro. Reações de transcrição in vitro foram realizadas com o uso do Kit MEGAshortscript™ T7 (Life Technologies número de catálogo AM1354M; Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA resultante foi purificado com o uso de colunas Zymo-Spin™ V-E (Zymo Research; Irvine, CA; número de catálogo C1024-25) de acordo com o protocolo do fabricante.

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93/137 [00175] O RNA guia purificado foi transformado em células da linhagem de células editora que expressam Cas9 de Parachlorella GE15699. A linhagem editora que expressa Cas9 foi produzida transformando-se a cepa WT-1185 de Parachlorella do tipo selvagem com um construto que incluiu: 1) um cassete de expressão de Cas9 que continha um códon de gene de Cas9 geneticamente modificado otimizado para Parachlorella e contendo introns de Parachlorella, que também incluíram uma etiqueta FLAG N-terminal, sinal de localização nuclear e ligante peptídico (SEQ ID NO:76) ligada de maneira funcional ao promotor RPS17 de Parachlorella (SEQ ID NO:77) e o terminador RPS17 de Parachlorella (SEQ ID NO:78); 2) um cassete de expressão de marcador selecionável, que continha um gene de resistência a blasticidina de códon de Aspergillus terreus otimizado para Parachlorella e contendo introns de Parachlorella (SEQ ID NO:79), ligada de maneira funcional ao promotor RPS4 de Parachlorella (SEQ ID NO:80) e o terminador RPS4 de Parachlorella (SEQ ID NO:81); e 3) um cassete de expressão de repórter GFP, que continha o gene TurboGFP (Evrogen, Moscou, Rússia) (SEQ ID NO:82), ativado pelo promotor ACP1 de Parachlorella (SEQ ID NO:83) e terminado pelo terminador ACP1 de Parachlorella (SEQ ID:84). (Consultar, por exemplo, publicação de pedido de Patente de propriedade comum copendente n² US 2016/0304896 assim como a publicação de pedido de Patente n² US 2017/0073695 e publicação de pedido de Patente n² US 2017/0152520, todas as quais estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.) [00176] O RNA guia (SEQ ID NO:5) foi transformado na linhagem editora GE-15699 juntamente com um fragmento doador de DNA que incluiu um gene BleR de resistência a bleomicina com códon otimizado para Parachlorella e contendo introns de Parachlorella (SEQ

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ID N0:6) ligados de maneira funcional ao promotor RPS4 de Parachlorella (SEQ ID NO:7) e o terminador RPS4 de Parachlorella (SEQ ID NO:8). A transformação foi por eletroporação, essencialmente conforme descrito no documento n² US 2016/0304896. Após a eletroporação, as células foram colocadas em placas em meio de ágar contendo 250 pg/ml de zeocina para selecionar transformantes que incorporaram o cassete BleR. Os transformantes foram triados por PCR de colônia com o uso de iniciadores projetados para amplificar através do locus alvejado nativo e foram selecionadas três cepas que demonstraram a inserção do cassete BleR no locus de gene T-2661: GE-16391, GE-16392 e GE-16393.

[00177] Os mutantes geneticamente modificados por Cas9 GE16391, GE·· 16392 e GE-16393 e o mutante classicamente derivado NE-7843 foram testados sob luz contínua em um ensaio de produtividade de diluição semicontínua (SCPA) sob condições descritas no Exemplo 3 (o ensaio CL2000: a luz foi mantida a uma constante de 1.900 a 2.000 pmol de fótons ητ² s^_1 por 24 horas por dia e a cultura foi diluída de volta por 65% diariamente). Os mutantes geneticamente modificados por Cas9 mostraram exibir aumentos de produtividade de TOC em relação a cepas do tipo selvagem a uma magnitude essencialmente idêntica àquela observada nas cepas originais isoladas de mutagênese clássica (Figura 3), com o GE16392 demostrando um aumento de cerca de 26% em produtividade de biomassa e os mutantes GE-16391 e GE-16393 demonstrando aumentos de produtividade de biomassa de 33% e 34%. A partir disso, foi concluído que knockout ou redução extrema de expressão ou função de T-2661 em Parachlordla WT1185 pode levar a aumentos de 25 a 35% em produtividade de biomassa sob condições de alta luz contínua. Devido a essa influência em produtividade, o gene T-2661 foi nomeado SGI1, ou Melhora Significativa do Crescimento 1.

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Exemplo 6. Gene SGI1 de Parachlorella (T-2661) e Ortólogos em outros organismos fotossintéticos [00178] O gene SGI1 de Parachlorella (SEQ ID NO:1, sequência de codificação fornecida como SEQ ID NO:2) mostrou codificar urn polipeptídeo (SEQ ID NO:3) que inclui dois domínios funcionais principais, ambos ocorrendo na metade N-terminal da proteína com 619 aminoácidos. A presença de um receptor de Regulador de Resposta ou domínio de RR (Pfam PF00072), que se estende aproximadamente do aminoácido 36 até o aminoácido 148 do polipeptídeo SGI1 de Parachlorella (SEQ ID NO:3), é responsável pela anotação biolnformática de SGI1 como um polipeptídeo do tipo CheY (consultar as Tabelas 1 e 2). Esse domínio de RR é também caracterizado como um domínio de receptor de sinal, cd00156, no banco de dados de domínio conservado (CDD), que se estende aproximadamente do aminoácido 37 ao aminoácido 154. Esse domínio é também caracterizado como um domínio de receptor do tipo CheY (REC), COG0784, nas Aglomerações de Grupos Ortólogos do banco de dados de proteínas e como um domínio de superfamília do tipo CheY Interpro, IPR011006, com ambos esses domínios caracterizados se estendendo aproximadamente do aminoácido 33 até o aminoácido 161 do polipeptídeo SGI1 de Parachlorella da SEQ ID NO:3. O domínio de RR (algumas vezes denominado um receptor ou, frequentemente, um domínio REC) é encontrado em sistemas reguladores com dois componentes bacterianos (como o sistema com dois componentes de quimiotaxia bacteriana que inclui um polipeptídeo conhecido como CheY), em que o mesmo recebe um sinal de um parceiro sensor. O domínio de RR de tais sistemas é frequentemente encontrado N-terminal a um domínio de ligação a DNA e tipicamente inclui um sítio fosfoaceitante que pode ser fosforilado, em que a fosforilação pode ser responsável por sua ativação ou

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96/137 desativação.

[00179] O gene SGI1 de Parachlorella (gene T-2661) também tern um domínio myb, posicionado C-terminal ao domínio de RR. O domínio myb é identificado como pfam PF00249: Domínio de ligação a DNA do tipo Myb, que se estende aproximadamente da posição de aminoácido 204 até aproximadamente a posição de aminoácido 254 da SEQ ID NO:3, e é também identificado como o domínio conservado TIGR01557 domínio de ligação a DNA do tipo myb, classe SHAQKYF, que se estende aproximadamente da posição de aminoácido 202 até a posição de aminoácido 255 da SEQ ID NO:3 (polipeptídeo SGI1 de Parachlorellá). Quando a SEQ ID NO:3 é consultada contra a análise de sequências protelcas Interpro e o banco de dados de classificação, um domínio de superfamília de domínio do tipo Homeobox Interpro (IPR009057), que se estende da posição de aminoácido 201 até a posição de aminoácido 259 da SEQ ID NO:3, e um domínio de Myb Interpro (IPR017930), que se estende da posição de aminoácido 199 até a posição de aminoácido 258 da SEQ ID NO:3, são identificados.

[00180] Adicionalmente, um sinal de localização nuclear podería ser identificado no polipeptídeo SGI1 de Parachlorella posicionado entre o domínio de RR e o domínio de Myb, dentro de uma região de baixa conservação de aminoácido denominada no presente documento como o ligante entre os domínios conservados.

[00181] Nenhum domínio de proteína conservada podería ser encontrado na região do polipeptídeo SGI1 de Parachlorella C-termínal ao domínio de myb. Em contraste, a arquitetura de SGI1 de domínios de RR e myb, em que o domínio de myb é posicionado C-terminal ao domínio de RR, pode ser encontrada em muitas proteínas codificadas em genomas de Viridiplantae. Análise bioinformática foi usada para identificar ortólogos prováveis de SGI1 de Parachlorella em espécies

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97/137 de planta e alga adicionais com base nessa arquitetura conservada. [00182] Para identificar uma classe de proteínas SGI1 em organismos fotossintéticos adicionais, um modelo Oculto de Markov (HMM) foi construído para a arquitetura de domínio de RR-domínio de myb encontrada no polipeptídeo SGI1 de Parachíoreíia. A sequência de aminoácidos usada para desenvolver o HMM incluiu o prolongamento contíguo de sequência de aminoácidos que incluiu tanto domínio de RR quanto ao domínio de myb, assim como a região de ligante entre os dois domínios.

[00183] Como uma primeira etapa, a sequência de polipeptídeos SGI1 de Parachlorella (SEQ ID NO:3) foi usada para pesquisar por BLAST o banco de dados JGI Phytozome v.12 que incluiu os genomas de plantas e algas. Três genomas algáceos patenteados (de espécies de Parachlorella, Tetraselmis e Oocystis) foram também adicionados ao banco de dados que foi pesquisado. A pesquisa foi interrompida quando atingiu aproximadamente 2.000 acertos. Esses resultados foram, então, analisados por InterProScan (disponível junto à EMBLEBI [European Molecular Biolgy Laboratories-European Bioinformatics Institute, por exemplo, em ebi.ac.uk]) para garantir que os resultados selecionados tivessem tanto o domínio de superfamília do tipo CheY Interpro (IPR011006) quanto o domínio de Myb ou do tipo Homeobox Interpro (IPR009057 ou IPR017930). Os candidatos que não tiveram ambos os domínios foram eliminados. Essa etapa reduziu o número de acertos selecionados a entre 900 e 1.000, com os polipeptídeos tendo a arquitetura de dois domínios (domínio de RR N-terminal ao domínio de myb) claramente identificados em polipeptídeos tanto de algas quanto de plantas superiores. As sequências resultantes foram usadas para montar uma árvore filogenética baseada em homologia de sequência. A árvore filogenética mostrou um agrupamento claro de polipeptídeos homólogos a SGI1 de espécies algáceas.

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98/137 [00184] Em uma dada espécie de algas, o número de genes do tipo SGI é baixo. Tipicamente, um gene único foi identificado em uma dada espécie algácea, embora, em Tetraselmis, três genes altamente homólogos tenham sido identificados, que eram, em todos os alelos prováveis do mesmo gene, a cepa que foi avaliada como sendo triploide. O baixo número de genes SGI1 em uma dada espécie algácea indica que o gene ou genes SGI1 identificados nessa espécie algácea são, de fato, o gene SGI1 funcional dessa espécie, visto que a função do polipeptídeo SGI1 único encontrado em Parachlorella, que é haploide, e os três polipeptídeos SGI1 aitamente similares identificados em Tetraselmís, que se acredita ser triploide, foram funcionalmente validados (consultar os Exemplos 5 e 7 e 16 a 18). (Os genomas de Parachlorella e Tetraselmís foram sequenciados internamente.) [00185] Para estabelecer um critério para ortólogos de SGI1 prováveis em outros organismos fotossintéticos, então, um Modelo Oculto de Markov (HMM) foi desenvolvido com base na aglomeração algácea de sequência de polipeptídeos SGI1. O HMM foi desenvolvido com base na porção N-terminal do polipeptídeo SGI1 que abrange ambos os domínios de RR e myb, incluindo a região de ligante entre os dois domínios conservados. A sequência dos polipeptídeos Cterminais ao domínio de myb que não incluíram qualquer estrutura conservada reconhecível foi excluída da construção de modelo. HMMER 3.1b2 foi usado para construir o HMM com o uso de Alinhamentos Múltiplos de Sequências (MSAs) de sequências patenteadas de polipeptídeos de Parachlorella, Oocystis e Tetraselmís assim como sequências de bancos de dados públicos de polipeptídeos de Chlamydomonas reinhardtií, Volvox carters, Chromochloris zofíngíensis, Coccomyxa subelíípsoídea, Micromonas sp. RCC299 e Ostreococcus luminarinus. Os alinhamentos múltiplos de sequências

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99/137 (MSAs) das porções N-terminais das proteínas, conforme descrito acima, foram gerados com o uso do kit de ferramentas ETE3 e do fluxo de trabalho eggnog41. Esse programa usa internamente os programas Muscle, MAFFT, Clustal Omega e M-coffee para alinhamento, trimAI para aparamento de alinhamento e PhyML para interferência de filogenia. Todos esses programas estão publicamente disponíveis. Um HMM, diferente de uma sequência de proteínas única usada para comparação de homologia, por exemplo, captura informações de múltiplas sequências de proteínas e, portanto, pode distinguir resíduos altamente conservados de altamente divergentes dentro de uma sequências de polipeptídeos e considerar o mesmo ao determinar a relação entre as sequências. Quando um HMM é usado para pontuar uma sequência, os resíduos altamente conservados recebem mais peso que resíduos altamente divergentes, fornecendo, assim, sensibilidade e precisão superiores em relação a PSAs mais simples.

[00186] O HMM de SGI1 foi usado para atribuir uma pontuação aos polipeptídeos identificados na pesquisa BLAST que também foram verificados como tendo os dois domínios conservados (RR e myb). As pontuações mais altas (com exceção do homólogo de Arabídopsis halleri de pontuação muito alta, SEQ ID NO:23) foram encontradas em espécies algáceas, com pontuações de HMM para ortólogos putativos na faixa de cerca de 475 a menos que 200 no banco de dados de organismos fotossintéticos. As pontuações de HMM de homólogos algáceos nessa amostra, de modo geral, estavam na faixa de cerca de 400 a cerca de 450. Conforme mostrado na Tabela 3, os homólogos de SGI1 em Oocystis, Tetraselmis, Parachlorella e quase todos os homólogos algáceos adicionais consultados tiveram pontuações de cerca de 400 ou maiores. A pontuação incomumente baixa do polipeptídeo de Chromochlorís zofingiensis provavelmente é o

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100/137 resultado de anotação de genoma com falha: um alinhamento de domínios de RR de polipeptídeos SGI1 algáceos (Figura 4) mostra a presença do domínio de RR de C. zofingiensls (SEQ ID NO:44) que parece estar carecendo de um alongamento contínuo de aminoácidos na região N-terminal desse domínio. As homologias de sequência dos domínios de RR dos homólogos de SGI1 algáceos mostradas na Figura 4 com o domínio de RR de SGI1 de Parachlorella (SEQ ID NO:40) estavam na faixa de cerca de 55% a cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos. A Figura 5 fornece um alinhamento de sequências de domínio de myb de polipeptídeos de SGI1 algáceos, com homologias de sequência com o domínio de myb de Parachlorella (SEQ ID NO: 58) na faixa de cerca de 85% a cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos entre esse conjunto de homologias algáceas.

Tabela 3. Ortólogos de SGI1 em espécies algáceas

Organismo	Sequência de Polipeptídeos	Domínio de RR	Domínio de Myb	Pontuação de HMM	valor E
Parachlorella sp. 1185	SEQ ID NO:3	SEQ ID NO:40	SEQ ID NO:58	400,20	8,5e-118
Coccomyxa subellipsoidea	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:41	SEQ ID NO:59	403,0	1,2e-118
Ostreococcus lucimarinus	SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:60	425,8	1,4e-125
Chlamydomonas reinhardtii	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:43	SEQ ID NO:61	413,3	8,4e-122
Chromochlorís zofingiensís	SEQ ID NO:12	SEQ ID NO:44	SEQ ID NO:62	292,6	6,1e-85
Voivox carteri	SEQ ID NO:13	SEQ ID NO:45	SEQ ID NO:63	441,4	2,3e-130
Tetraselmis sp. 105 (T-5172)	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:46	SEQ ID NO:64	403,6	7,9e-119

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101/137

Tetraselmis sp. 105 (T-5185)	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:46	SEQ ID NO:64	403,0	1,2e-118
Tetraselmis sp. 105 (T-5230)	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:46	SEQ ID NO:64	402,9	1,3e-118
Oocystis sp.	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:47	SEQ ID NO:65	426,9	6e-126
Micromonas sp. RC299	SEQ ID NO:18	SEQ ID NO:48	SEQ ID NO:66	418,4	2,4e-123
Micromonas pusilla	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:49	SEQ ID NO:67	405,9	1,6e-119

[00187] As espécies de planta tiveram homólogos cujas pontuações de HMM estavam na faixa de 475,9 (Arabidopsis hallerí) até abaixo de 200. Os exemplos de homólogos vegetais que têm pontuações de HMM de 370 ou maior são fornecidos na Tabela 4. Os efeitos de proliferação sobre plantas que têm uma mutação em um gene que codifica um desses homólogos, o gene ARR2 de Arabidopsis gaditana que tem uma pontuação de HMM de 371, são demonstrados no Exemplo 19.

Tabela 4. Homólogos de SG11 em espécies de planta

Organismo	Sequência de Polipeptídeos	Domínio de RR	Domínio de Myb	Pontuação de HMM	valor E
Sphagnum fallax	SEQ ID NO:20	SEQ ID NO:50	SEQ ID NO:68	397,3	6,8e-117
Physcomitrella patens	SEQ ID NO:21	SEQ ID NO:51	SEQ ID NO:69	372,3	2,8e-109
ArabidopsiS-Jhaii ana	SEQ ID NO:22	SEQ ID NO:52	SEQ ID NO:70	371,1	6,4e-109
Arabidopsis halleri	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:53	SEQ ID NO:71	475,9	6,9e-141
Arabidopsis lyrata	SEQ ID NO:24		SEQ ID NO:71	395,5	2,4e-116

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102/137

Helianthus annus	SEQ ID NO:25			391,2	4,9e-115
Vitis vinifera	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO:54	SEQ ID NO:72	390,6	7,3e-115
Arriboreila tríchopoda	SEQ ID NO:27			390,1	1e-114
Ricinus communis	SEQ ID NO:28			390,1	1,1e-114
Solanum lycopersicum	SEQ ID NO:29			388,4	3,4e-114
Solanum tuberosum	SEQ ID NO:30			387,2	7,9e-114
Gossypium hirsutum	SEQ ID NO:31			385,8	2,1e-113
Theobroma cacao	SEQ ID NO:32			383,0	1,6e-112
Phaseolus vulgaris	SEQ ID NO:33			381,6	4,2e-112
Glycine max	SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:73	381,4	4,6e-112
Chenopodium quinoa	SEQ ID NO:35			373,7	1,1e-109
Malus domestica	SEQ ID NO:36			372,6	2,4e-109
Zea mays	SEQ ID NO:37	SEQ ID NO:56	SEQ ID NO:74	371,5	4,96-109
Brassica rape	SEQ ID NO:38			370,5	1e-108
Oryza sativa	SEQ ID NO:39	SEQ ID NO:57	SEQ ID NO:75	369,6	1,96-108

[00188] Em todos os homólogos algáceos e vegetais listados nas

Tabelas 2 e 3, os domínios de RR e myb ocorrem dentro dos primeiros

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103/137 aminoácidos (mais N-terminais) das sequências de polipeptídeos conforme anotado nos genomas de JGI, e em um domínio conservado é identificado carbóxi-terminal ao domínio de myb nesses homólogos de SGI1.

Exemplo 7. Teor de clorofila, Tamanho de Antena e Fotofisiologia de Mutantes de SGI1 NE-7843 e NE-13380.

[00189] O teor de clorofila dos mutantes de alta produtividade foi determinado extraindo-se células com metanol e analisando-se o sobrenadante por espectrofotometria. Em resumo, alíquotas de 500 μ! de cultura foram pipetadas em tubos de tampa de torção de 2,0 ml e peletizadas com o uso de uma microcentrífuga de mesa a 15.000 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram aspirados a partir dos péletes, e cada pélete foi ressuspenso em 1,5 ml de metanol 99,8% (neutralizado anteriormente com carbonato de magnésio). 0,2 ml de microesferas de vidro (0,1 mm de diâmetro) foi adicionado a cada frasco e submetido a bead beat por 3 min. 1,0 ml de sobrenadante foi transferido para novos tubos de tampa abre e fecha de 1,7 ml e foi centrifugado em uma microcentrífuga de mesa a 15.000 rpm por 10 minutos. Os péletes resultantes eram brancos, indicando que uma extração completa foi realizada. 0,8 ml de cada sobrenadante foi pipetado em um cadinho de vidro óptico, e os comprimentos de onda de absorção foram lidos imediatamente em comprimentos de onda de 720 nm, 665 nm e 652 nm. Medições espectrofotométricas foram executadas em modo de feixe duplo com o uso de um branco de metanol a 99,8%. As seguintes equações foram usadas para calcular a concentração de clorofila: Clorofila a [g nr³] = 16,72(A665-A720) + 9,16 (A652-A720) e Clorofila b [g m-3] = 34,09(A652-A720) 15,28(A665-A720). A quantidade de clorofilas a e b foi padronizada em uma base por célula e por TOC. A Tabela 5 mostra que, embora a quantidade de clorofila total por célula tenha variado um pouco entre

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104/137 os mutantes de SGI1, a mesma foi universalmente diminuída em relação a células do tipo selvagem por uma quantidade que está na faixa de cerca de 30% a cerca de 65%, consistente com a redução observada em tamanho de antena. Em uma base por TOC, a redução em clorofila total em mutantes de SGI1 em relação a células do tipo foi na faixa de cerca de 30% a cerca de 50%.

Tabela 5. Teor de clorofila de Mutantes de SGI1 e Algas do Tipo

Selvagem

Cepa	Clorofila a / célula, pg	Clorofila a, % de alteração	Clorofila b / célula, pg	Clorofila b, % de alteração	Clorofila Total /TOC(%)	Clorofila Total / TOC % de alteração
WT-1185	0,284	0%	0,097	0%	6,9%	0%
NE-7843	0,306	8%	0,058	-40%	4,7%	-32%
NE-13380	0,287	1%	0,063	-35%	4,4%	-36%
GE-16491	0,250	-12%	0,045	-54%	3,7%	-46%
GE-16492	0,211	-26%	0,035	-64%	3,4%	-50%
GE-16493	0,246	-14%	0,043	-55%	3,6%	-47%

[00190] Adiciona mente ao teor de clorofila, cepas com knockout de SGI1 NE-7843, NE-13380, GE-16391, GE-16392 e GE-16393 foram analisadas quanto ao tamanho de antena do PSII, tamanho de antena do PSI, 1/T^!Qa (a taxa saturada de luz do transporte de elétrons no lado aceitante do fotossistema II em saturação de luz, uma medida da eficiência de transporte de elétrons fotossintético linear) assim como um Pmáx para fixação de carbono. As células das cepas do tipo selvagem e mutante de SGI1 foram cultivadas no ensaio de cultura semicontínuo de luz constante (CL-SCPA) descrito no Exemplo 3. Os dados sobre tipo selvagem e mutantes clássicos de SGI1 de Parachioreiia (NE-7843 e NE-13380) foram obtidos em experimentos separados daquele que incluiu os três knockouts de SGI1 alvejados

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105/137 (GE-16491, GE-16492, GE-16493). A análise de vários parâmetros fotossintéticos foi realizada com o uso da técnica de Indução e Relaxamento de Fluorescência (FIRe) desenvolvida para medir uma série exaustiva de características fotossintéticas e fisiológicas de organismos fotossintéticos (Gorbunov e Falkowski (2005) Fluorescence Induction and Relaxation (FIRe) Technique and Instrumentation for Monitoring Photosynthetic Processes and Primary Production in Aquatic Ecosystems em: Photosynthesis: Fundamental Aspects to Global Perspectives, Proc. 13° Congresso Internacional de Fotossintese, Montreal, 29 de agosto a 3 de setembro de 2004. (Eds: A. van der Est and D. Bruce), Allen Press, Volume 2, páginas 1.029 a 1.031). A técnica de FIRe se baseia em medição e análise de perfis de fluorescência variável de clorofila (analisado por Falkowski et. al., 2004 Development and Application of Variable clorofila Fluorescence Techniques in Marine Ecosystems em: Chiorophyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis (C. Papageorgiou e Govingjee, eds), Springer, páginas 757 a 778) que dependem da relação entre fluorescência de clorofila e a eficiência de processos fotossintéticos. Essa técnica fornece um conjunto de parâmetros que caracterizam processos de coleta de luz fotossintética, a fotoquímica no Fotossistema li (PSII) e transporte de elétrons fotossintético até fixação de carbono. As medições realizadas no presente documento usaram um dispositivo de mini-FIRe produzido por Maxim Gorbunov da Rutgers University, East Brunswick, NJ. Um dispositivo de FIRe comercialmente disponível da Sea-Bird Scientific (Halifax, Canadá, satlantic.com e planet-ocean.co.uk). Outras informações referentes ao uso do dispositivo de FIRe estão disponíveis em manuais da empresa. Todas as medições foram tomadas com o uso de culturas semicontínuas de luz constante (2.000 pmol de fótons nr² s^_1) (CLSCPA) (consultar o Exemplo 3). Para obter Fv/Fm e Opsii, medições de

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106/137 cinética de Indução e Relaxamento de Fluorescência (FIRe) foram realizadas no escuro. Os valores para Fv/Fm e opsii apresentados na Tabela 7 foram calculados como uma média de 6 medições (3 medições de cada uma das 2 réplicas biológicas), os erros para esses parâmetros não excederam 5%.

[00191] As medições de corte transversal de PSI foram realizadas com o uso de um espectrômetro JTS-10 modificado com um filtro ajustado para medir o deslocamento eletrocrômico (ECS) a 520 nm equipado com um vaporizador instantâneo de renovação única customizado (STF). A densidade de potência de pico na câmara de amostra foi alta o suficiente para garantir fechamento completo dos centros de reação dentro de aproximadamente 10 ps. A taxa de excitação resultante foi ~ 1 a 3 acertos por centro de reação por 10 ps (dependendo do corte transversal de absorção funcional do fotossistema). O STF gerou pulsos ultrabrilantes curtos de luz azul (455 nm, com 30 nm de meia largura de banda), e a temporização de pulso foi controlada pelo acionamento do Espectrômetro JTS-10. A duração de pulso foi controlada pela Caixa de Controle de Pulso de STF e foi ajustável na faixa de 1 ps a 50 ps com o uso do potenciômetro no painel frontal. Para medir o corte transversal de PSI, diluiu-se as culturas a um OD de cerca de 0,2 no máximo de clorofila (-440 nm) com base na medição de espectros de absorção de suspensão de células com o uso de um espectrofotômetro Perkin Elmer Lambda 650 equipado com uma esfera integradora. O ECS foi medido com o uso de lampejos de 10 ps com intensidades na faixa de 4.000 a 120.000 pmol de fótons nr² s'¹ na presença de DCMU e hidroxilamina. A curva experimental foi ajustada com uma função exponencial simples ecs = ecs_m x (1 Petição 870190058779, de 25/06/2019, pág. 338/383

107/137 em que é o sinal de ECS máximo; /£ é a densidade de fóton em fótons/m²; e é corte transversal funcional do PSI. Os valores obtidos para corte transversal funcional do PSI para o tipo selvagem de Parachlorella (WT-1185) foi (4.0 ± ü.5) x ιο^-ίδ m². Esses valores são próximos aqueles obtidos para 0 corte transversal funcional do PSII proliferado sob as mesmas condições (¾^ = (4>3±ü>l) x 1G^Wm²). Foi estimado que os erros para esses parâmetros não excedem 20%.

[00192] As taxas de fixação de carbono (P_máx de C¹⁴) foram medidas com 0 uso de culturas normalizadas a 5 pg de clorofila ml·¹em meio contendo 0,5 g l·¹ (5,95 mM) de bicarbonate de sódio. 20,4 pCi ml·¹ de bicarbonate de sódio marcado com C¹⁴ foram adicionados a cada cultura e expostos a 2500 μΕ por uma duração de 10 minutos. As amostras foram acidificadas imediatamente com HCI 2 N e deixadas em exalação de gases de um dia para 0 outro. No dia seguinte, as amostras foram medidas com 0 uso de um contador de cintilação Beckman LS6500 e quantificadas.

[00193] T Qa (0 tempo de transporte de elétrons no lado aceitante de PSII medido sob condições de luz de saturação - efetivamente determinado pela etapa mais baixa de transporte de elétrons fotossintético linear) foi medido a partir de curvas de luz FIRe e perfis de cinética de relaxamento induzido por escuro (DIRK). A concentração de PSII volumétrica em relação ao tipo foi estimada como (Fv/a⁵³⁰psn). Foi estimado que os erros para esses parâmetros não excedem 15%. O corte transversal de absorção óptica (média calculada sobre espectro de emissão de uma fonte de luz) foi estimado com 0 uso da seguinte equação:

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108/137 ¹ Γ”·1« ®»Μ<>ΓΓίΓ =7~~T~----7 I m(lG) X---;—X dx ^^TOC [Ghl/TQC]]^âl em que [Chl/TOC] é a clorofila/TOC da amostra, αθ(λ) é a densidade óptica medida da amostra em comprimento de onda λ, Δ1 é o comprimento de trajetória de feixe de medição no cadinho (1 cm), i(l) é a intensidade da fonte de luz usada para proliferar algas em comprimento de onda λ.

Tabela 6. Parâmetros Fluorescentes e Fotossintéticos Medidos com a

Técnica FIRe

Parâmetros recuperados de FIRe, JTS-10	Descrição
Fv/Fm	O rendimento quântico máximo de fotoquímica em PSII, medido em um estado adaptado ao escuro (sem dimensões). Esse parâmetro caracteriza a eficiência de reações fotossintéticas primárias.
Opsil	Corte transversal de absorção funcional do PSII (Â²) em um estado adaptado ao escuro. O parâmetro é o produto do corte transversal de absorção óptica do PSII (isto é, o tamanho físico da unidade de PSII) e o rendimento quântico de fotoquímica no PSII. Podería ser medido com o uso de diferentes comprimentos de onda de excitação
Opsi	Corte transversal de absorção funcional do PSI (A²) em um estado adaptado ao escuro. O parâmetro é o produto do corte transversal de absorção óptica do PSII (isto é, o tamanho físico da unidade de PSI) e o rendimento quântico de fotoquímica no PSI.
1/TQa	Taxa de saturação de luz de transporte de elétrons no lado aceitante do fotossistema II. Esse parâmetro indica a eficiência de transporte de elétrons fotossintético linear.

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109/137 [00194] A Tabela 7 mostra que todos os mutantes de SGI1 demonstraram Fv/Fm aumentado (em cerca de 10 a 14%) enquanto exibem tamanho de corte transversal de antena reduzido em comparação com a cepa do tipo selvagem da qual os mesmos foram derivados. Os mutantes de SGI1 também tiveram tamanho de antena reduzido de PSI! e PSI (até 40 a 50% em relação ao tipo selvagem), altas taxas de transporte de elétrons no lado aceitante do PSII (1/foa) sob luz de saturação (aumentada entre cerca de 35% e cerca de 130% e em pelo menos aproximadamente 100% em relação ao tipo selvagem nos mutantes geneticamente modificados) e altas taxas de absorção de carbono (P_máx) (até pelo menos 30 a 40% em relação ao tipo selvagem), enquanto, conforme determinado por determinação de proteína de Monitoramento de Múltiplas Reações, o número de fotossistemas em uma base por TOC foi mantido (consultar o Exemplo 7). As cepas foram também caracterizadas por razão amis alta entre clorofila a e clorofila b em comparação com o tipo selvagem (aumentado em aproximadamente 70%), que é indicativo de perda de complexos de coleta de luz periférica e é consistente com o tamanho reduzido observado do corte transversal funcional do PSII. (Tabela 7). Os mutantes KO de SGI1 recapitulados (GE-16491, GE-16492 e GE16493, geneticamente modificados com o uso de CRISPR/Cas9) mostraram um fenótipo fotoflslológico muito similar aos mutantes originais, mas com reduções ainda maiores na antena do PSII (até 55%), taxas mais rápidas de transporte de elétrons no lado aceitante do PSII sob luz de saturação (aumentado em até 130%), e taxas mais altas de absorção de carbono (até 80% mais altas em GE-16491) (Tabela 7).

Tabela 7. Fotofisiologia de Mutantes de SGI de Parachioreíla

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Cepa	FIRe/JTS-10	u_c	Taman ho da célula
	F_v/F_m	Gpsii (Â², a 450nm)	Opsil (Â², a 530nm)	ÜPSI (Â², a 440nm)	1/tqô (S’¹)	P máx (nmol de ¹⁴C/ pg de TOC/ hora)	Taman ho da célula, pm³
WT-1185	0,598	428	153	380	94	10,1	40
NE-7843	0,667	277	89	-	194	14,8	63
NE-13380	0,677	261	84	240	197	17,3	57
GE-16491	0,678	253	75	-	211	19,6	83
GE-16492	0,688	235	69		225	15,4	85
GE-16493	0,687	243	71	-	250	16,2	76

Exemplo 8. Triagem Fotofisio óqica para Mutantes Algáceos de Alta

Produtividade [00195] Com base na constatação de mutantes de alta produtividade NE-7843 e NE-13380 com o uso de uma peneira para cepas de antena reduzida e ensaios de produtividade, e a constatação subsequente de que tais mutantes de alta produtividade tiveram características fotofisiológicas distintas conforme apresentado nas Tabelas 5 e 6, incluindo rendimento fotossintético máximo mais alto (Fv/Fm), tamanho de antena do PSII reduzido (opsii) e taxa de renovação do PSII aumentada (1/TQa), uma peneira para mutantes algáceos de alta produtividade foi desenvolvida, denominada no presente documento peneira FACS-FIRE. A peneira incluiu uma seleção para mutantes de baixo teor de clorofila de uma população

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111/137 algácea progenitora com o uso de FACS, e a triagem de linhagens individuais da população selecionada por FACS para baixa fluorescência de clorofila com o uso do dispositivo de FIRe descrito no Exemplo 6 para determinar o tamanho de antena do PSII (opsii) em um ou mais comprimentos de onda, Fv/Fm, e a taxa de transporte de elétrons no lado aceitante do PSII (1/t’q₃). As linhagens que têm tamanho de antena do PSII reduzido, Fv/Fm aumentado e 1/t’q₃aumentado foram expandidas, testadas novamente e avaliadas quanto à taxa de absorção de carbono (Pm (¹⁴C)) e produtividade em cultura. [00196] Em experimentos piloto, células de Parachloreila do tipo selvagem (cepa WT-1185) foram mutagenizadas por UV, conforme descrito no Exemplo 1. A mutagênese pode ser também efetuada por mutágenos químicos, mutagênese por inserção aleatória (consuitar, por exemplo, o documento n² US 2014/0220638, incorporado ao presente documento a título de referência) ou mesmo mutagênese alvejada, tal como por CRISPR/Cas9 (consultar, por exemplo, o documento n² US 2016/0304896, incorporado ao presente documento a título de referência).

[00197] Conforme descrito no Exemplo 2, as células algáceas mutagenizadas foram deixadas se recuperar em baixa luz e, então, submetidas a seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), em que células com baixa fiuorescência de clorofiia que têm a fluorescência de clorofila mais baixa de aproximadamente 0,5 a 2% em comparação com a população total de células foram selecionadas. (Faixas mais restritas, menos restritas, mais amplas ou mais estreitas de fluorescência de clorofila podem ser impostas na seleção por FACS à discrição do usuário.) As células selecionadas por FACS foram colocadas em placas e, após as colônias proliferarem, as mesmas foram individualmente coletadas e inoculadas em meio de cultura (que carece de uma fonte de carbono reduzida) em placas de 96 poços e as

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112/137 culturas foram deixadas proliferar fotoautotroficamente na luz (500 μΕ m~2 s'¹. Culturas em pequena escala (aproximadamente 100 a 200 μΙ) foram iniciadas em dez placas de 96 poços, resultando em aproximadamente 960 culturas individuais de linhagens selecionadas por baixo teor de clorofila.

[00198] A segunda fase da peneira por mutantes de alta produtividade usou o dispositivo de FIRe com um cabo de fibra óptica fixado que transferiu pulsos de luz para sondar a fluorescência celular e a fluorescência coletada transmitida ao detector de instrumento. O cabo de fibra óptica foi retido sobre cada poço individual para sondar e medir a fluorescência de linhagens celulares isoladas, o que foi registrado e usado para calcular Fv/Fm, tamanho de antena do PSII (σpsii) e taxa de renovação do PSII (taxa de transporte de elétrons no lado aceitante do PSII, 1/t’q₃) pelo dispositivo de FIRe. As linhagens que exibem Fv/Fm aumentado em pelo menos 10%, tamanho de antena do PSII reduzido em pelo menos 30% e taxa de renovação do PSII aumentado em pelo menos 50% foram selecionadas para estudo adicional. Os valores de corte para tais parâmetros podem ser definidos em valores diferentes à discrição do usuário, por exemplo, Fv/Fm aumentado em pelo menos 5%, tamanho de antena do PSII reduzido em pelo menos 20% taxa de renovação do PSII aumentada em pelo menos 20% ou critérios mais rescritos podem ser usados para selecionar cepas de interesse.

[00199] Um esquema do processo de triagem é mostrado na Figura 6. A peneira, envolvendo seleção com base em FACS de linhagens com baixo teor de clorofila e triagem com base em FIRe de cultura em pequena escala, pode ser ainda automatizada, por exemplo, pelo dispositivo de FACS que direciona as células com baixo teor de clorofila diretamente nos poços de placas com múltiplos poços e/ou por um braço mecânico automatizado para posicionar com sucesso o

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113/137 cabo de fibra óptica de FIRe ou emitir LED com sistema detector de fluorescência ou outro sistema que pode fornecer lampejos de luz de alta intensidade em microssegundos e coletar sinais de fluorescência sobre poços individuais de placas com múltiplos poços.

[00200] As linhagens algáceas que demonstram baixa fluorescência de clorofila e tamanho de antena reduzido, Fv/Fm aumentado e taxa de renovação do PSII aumentado (1/τ’α₃) podem ser ainda avaliadas conforme fornecido no Exemplo 6, acima, por exemplo, para baixo teor de clorofila b e/ou absorção de carbono aumentada e para produtividade mais alta em cultura, por exemplo, em cultura semicontínua (por exemplo, Exemplo 3).

[00201] Diversas cepas mutantes foram identificadas com o uso dos métodos de triagem por FACS-FIRE, entre o mesmo NE-16980, cujo genoma foi sequenciado. NE-16980 mostrou ter uma mutação da fase de leitura no gene SGI1 (T-2661) (Figura 7).

Exemplo 9. Análise Microaproximada de Mutantes de SGI1 NE-7843 e NE-13380.

[00202] Para determinar a composição de biomassa geral dos mutantes de atenuação de SGI1, análise quantitativa de amostras de culturas proliferadas em modo semicontínuo com 40% de diluição diária foi realizada para determinar o teor de lipídio, proteína e carboidrato das células em cultura semicontínua. Após as culturas atingirem estado de equilíbrio, as alíquotas da cultura removidas para diluição diária foram usadas para análise de lipídio, proteína e carboidrato. O carbono orgânico total (TOC) das amostras de cultura algáceas foi determinado diluindo-se 2 ml de cultura celular até um volume total de 20 ml com água Dl. Três injeções por medição foram injetadas em um Analisador Shimadzu TOC-Vcsj para determinação de Carbono Total (TC) e Carbono Inorgânico Total (TIC). O forno de combustão foi ajustado a 720Ό, e TOC foi determina do subtraindo-se

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TIC de TC. A faixa de calibração de 4 pontos foi de 2 ppm a 200 ppm correspondendo a 20 a 2.000 ppm para culturas nâo diluídas com uma correlação de r² > 0,999.

[00203] Para determinar o teor de lipídios, a análise por FAME foi realizada em amostras de 2 ml que foram secas com o uso de um GeneVac HT-4X. Aos péletes secos, foi adicionado o seguinte: 500 μΙ de KOH 500 mM em metanol, 200 pl de tetra-hidrofurano contendo 0,05% de hidroxll tolueno butilado, 40 μΙ de uma mistura padrão interna de 2 mg/ml de C11:0 ácido graxo/C13:0 triglicerídeo/C23:0 éster metílico de ácido graxo e 500 μΙ de microesferas de vidro (425 a 600 pm de diâmetro). Os frascos foram tampados com tampas forradas com PTFE aberto e colocados em um SPEX GenoGrinder a 1,65 krpm por 7,5 minutos. As amostras foram, então, aquecidas a 80Ό por cinco minutos e deixadas resfriar. Para derivação, 500 μί de trifluoreto de boro 10% em metanol foram adicionados às amostras antes do aquecimento a 80 € por 30 minutos. Os tubos foram deixados resfriar antes de adicionar 2 ml de heptano e 500 μί de NaCI 5 M. As amostras foram, então, submetidas a vórtice por cinco minutos a 2 krpm e, finalmente, centrifugadas por três minutos a 1 krpm. A camada de heptano foi amostrada com o uso de um Autoamostrador Gerstel MPS. A quantificação usou os 80 pg de padrão interno FAME de 023:0.

[00204] Para determinar o teor de proteína, amostras de biomassa isoladas foram hidrolisadas, e os aminoácidos foram derivados em ésteres propoxicarbonil propílicos (AAPE’s), analisados por meio de GC/MS e quantificados contra um padrão interno, conforme detalhado abaixo. Alíquotas (0,5 ml) de Parachlorella do tipo selvagem (WT~ 1185) e cepa com knockout de SGI1 GE-13380 das culturas semicontínuas foram centrifugadas, e os péletes foram lavados duas vezes com solução salina tamponada por fosfato (PBS). As células

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115/137 foram finalmente ressuspensas a um volume final de 0,5 ml (o volume de partida) e transferidas a um frasco de vidro de 4 ml. À amostra de cultura, 800 μΙ de HCI 6 M com TGA foram adicionados (400 pi de ácido tioglicólico (TGA) foram adicionados a 19,6 ml de HCI 6 M pouco antes do uso). Dez μΙ de beta mercaptoetanol foram, então, adicionados ao frasco, seguidos por 200 μ! de norvalina 20 mM, usados como um padrão interno. Cada frasco foi coberto com Ns por 10 segundos, após os quais, os frascos foram submetidos a vórtice por 1 min a 2.500 rpm para homogeneizar as amostras. Os fracos foram, então, colocados em um forno a 110Ό por 22 horas. Ao final da incubação por hidrólise, os frascos foram submetidos a vórtice por 10 min a 2.500 rpm e, então, centrifugados até 1.000 rpm após os quais a centrífuga foi interrompida. Uma alíquota foi removida de cada frasco e seca por colocação em um ácido seguro EZ-2 Genevac que foi executado no método de HCI por pelo menos 3 horas antes da derivação.

[00205] Para derivação, 250 μΙ de miili-Q HaO foram adicionados aos hidrolisados ácidos secos, seguidos por 10 μΙ de mistura antioxidante e, então, 120 μΙ de NaOH 0,5 Μ. A mistura antioxidante foi produzida adicionando-se 0,25 ml de n-propanol, 50 μΙ de tiodiglicol e alguns grânulos de feno! a 2,20 ml de Miili-Q H2O e submetendo-se a vórtice. 80 μΙ do catalisador, uma mistura a 4:1 de piridina e n-propanol foi, então, adicionada, e 0 frasco foi tampado e submetido a vórtice a 2.500 rpm por 1 min. 50 μ! de cloroformato de propila foram, então, adicionado, e 0 frasco foi tampado e submetido a vórtice a 2.500 rpm por 1 min. Após incubação por 1 min, 0 frasco foi novamente submetido a vórtice a 2.500 rpm por 1 min. 500 μΙ de uma mistura a 4:1 de iso-octano e cloroformato foram, então, adicionados ao frasco, que foi novamente tampado e submetido a vórtice a 2.500 rpm por 1 min. A prateleira de frascos de amostra foi, então, coberta com outra

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116/137 prateleira de amostras e agitada 20 vezes para garantir a emulsão das amostras. As amostras foram, então centrifugadas até a centrífuga ter atingido 1.000 rpm e, então, a centrífuga foi interrompida. 200 μΙ da camada orgânica foram removidas em um novo frasco de GC com um insert© de vidro e analisados por GC/MS.

[00206] As amostras foram analisadas por GC/MS com o uso de uma coluna GC de Análise de Aminoácido ZB-AAA 10 x 0,25 mm ID e quantificadas com o uso do padrão interno de norvalina. O solvente de Lavagem 1 da agulha foi acetona e o solvente de Lavagem 2 da agulha foi iso-octano/clorofórmio (80/20) com um programa de 110Ό, mantido por 0 min, 30Ό/ min a 320 Ό, mantido por 0,5 min, com o uso de uma injeção de 4 μΙ a 15:1 de divisão, 250Ό a 1,1 ml/min com uma linha de transferência a 300Ό.

[00207] Os dados de GC-MS foram multiplicados por 0,0005 I para obter valores em pmol e multiplicados pelo peso molecular do aminoácido. O valor foi dividido por 5 para corrigir o volume para obter pg / ml de cada aminoácido. Asparagina é convertida em ácido aspártico durante hidrólise ácida, assim, asparagina mais ácido aspártico são determinados como ácido aspártico nesses métodos. Triptofano não é medido por esses métodos, mas não constitui uma fração significativa dos aminoácidos em proteínas de Parachloreila.

[00208] Para quantificação de carboidrato total, a biomassa foi hidrolisada por uma hora em ácido clorídrico 6 N para converter polissacarídeos em monossacarídeos. Os monossacarídeos resultantes foram convertidos em éteres trimetilsilílicos com o uso de MSTFA N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida com 1% de trimetilclorossilano, e os éteres foram separados e quantificados com o uso de análise por GC-MS.

[00209] Para hidrólise ácida de amostras de cultura, 500 μΙ de HaO Milli-Q foram adicionados a amostras de cultura de 500 μΙ em frascos

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117/137 de 4 ml, ou, quando a amostra de cultura era mais concentrada (TOC mais alta), 800 μΙ de H2O Milli-Q foram adicionados a 200 μΙ de amostra de cultura. 20 μ! de 2,5 mg/ml de ribitol e U-¹³C-glicose como um padrão interno foram adicionados às amostras de cultura diluídas de 1 ml em frascos de 4 ml. 1 ml de HCI concentrado foi, então, adicionado a cada um dos frascos, os frascos foram tampados e colocados em um banho seco a 105Ό por 1 hora. As a mostras foram, então, deixadas resfriar até a temperatura ambiente, e 100 μΙ foram transferidos a um inserto de vidro dentro de um tubo para microcentrífuga de 1,5 ml.

[00210] Para derivação, os tubos para microcentrífuga que incluíram insertos de vidro contendo as amostras foram colocados em um ácido seguro EZ-2 Genevac que foi executado no método HCI por pelo menos 3 horas. Após a secagem, 100 μΙ do reagente de derivação, que consistiu em 800 μΙ de piridina seca adicionada a 1 ml de MFSTA-1% TMCS recém-aberto, foram adicionados a cada amostra. As amostras foram incubadas por 1 hora a 40C durante mistura a 1.000 rpm em um termomisturador Eppendorf. Após incubação, as amostras foram diretamente analisadas por GC/MS.

[00211] As amostras foram analisadas por GC/MS com 0 uso de uma coluna de CG DB5-MS 30 m x 250 pm x 25 pm e quantificadas com 0 uso do padrão interno de U^J3C-glloose. O solvente de lavagem de agulha foi piridina com um programa de equilíbrio por 1 min, 170Ό por 8 min, 10Ό/ min a 210Ό por 0 min, então, 50Ό /min a 325Ό por 2 min (tempo de execução total 16,3 min).

[00212] A Figura 8 mostra os resultados dessa análise na cepa de Parachlorella do tipo selvagem assim como os mutantes com knockout de atenuação de gene SGI1 GE-13380. Inesperadamente, observouse que 0 mutante com knockout de SGI1 NE-13380 teve uma porcentagem aumentada de seu carbono orgânico total como proteína

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118/137 em relação ao tipo selvagem, demonstrando um aumento de aproximadamente 20% em proteína em, uma base por TOC em relação à cepa do tipo selvagem (WT-1185). O mutante de SGI1, que, conforme demonstrado no Exemplo 3, aumentou o acúmulo de carbono orgânico total em comparação com o tipo selvagem no ensaio semlcontínuo, demonstrou de modo correspondente teor de lipídio e carbono reduzido. A composição de aminoácido da proteína de mutantes de SGI1 mostrou ser altamente similar àquela de células do tipo selvagem. As cepas mutantes de SGI1, portanto, fornecem um meio genético de aumentar o teor de proteína de algas e biomassa algácea. Dependendo das condições de cultura, um aumento de aproximadamente 40% a aproximadamente 60% em produtividade de proteína areai pode ser antecipado ao compor a porcentagem aumentada de proteína com a produtividade de biomassa aumentada demonstrada pelos mutantes de SGI1.

Exemplo 10. Transcriptômica e Proteômica de Mutantes de SGI1 NE7843 e NE-13380.

[00213] A análise transcriptômica foi realizada em extratos de mRNA do tipo selvagem e cepas de mutante de SGI1 NE-7843 e NE13380 cultivadas no ensaio de cultura semicontínua em luz constante (ensaio CL-SCPA ou CL2000) descrito no Exemplo 3. A análise transcriptômica de mutantes de SGI1 mostrou um grande número de genes dlferencialmente regulados em relação ao tipo selvagem. Como os mutantes de SGI1 demonstraram teor de clorofila reduzida e antena fotossintética reduzida, foi de interesse observar se os genes de proteína de ligação a clorofila de coleta de luz (LHC) tiveram abundância de transcrito mais baixa nos mutantes em relação à cepa progenitora do tipo selvagem. Quinze genes de LHC foram identificados no genoma de Parachlorella, e surpreendentemente, com exceção do gene que codifica CP26, um polipeptídeo LHC associado

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119/137 ao centro de reação do PSM, todos os genes LHC de Parachloreila identificados mostraram ser regulados de modo decrescente nos mutantes de SGI1 em relação aos níveis de expressão do tipo selvagem (Figura 9). Em média, os mRNAs de LHCs mostraram uma redução de cerca de 1,7 vez em abundância em SGI1 em relação a WT-1185. Outra observação surpreendente desses dados de transcriptômica foi que a Rubisco ativase mostrou ter abundância de transcrito aproximadamente 6 vezes mais alta no mutante de SGI1. [00214] A análise proteômica global foi também realizada para WT1185 e o mutante de SGI1 NE-7843 cultivado em ensaio de cultura semicontínua em luz constante (ensaio CL-SCPA. ou CL2000) descrito no Exemplo 3. Análise de espectrometria de massa (Michigan State University Proteomics Core Facility, East Lansing, Ml) foi realizada para determinar abundância de proteína global. Consistente com o conjunto de dados de transcriptômica, o mutante de SGI1 mostrou abundância de proteína LHC reduzida e abundância de Rubisco ativase elevada em relação às células do tipo selvagem.

[00215] A análise proteômica alvejada foi também realizada para as cepas do tipo selvagem e de mutante de SGI1 (NE-7843 e NE-13380) cultivado em ensaio de cultura semicontínua em luz constante (ensaio CL-SCPA ou CL2000) descrito no Exemplo 3. A análise proteômica foi realizada com o uso de Monitoramento de Múltiplas Reações (MRM), uma abordagem de espectrometria de massa que possibilita a quantificação alvejada de proteínas de interesse com alta especificidade e sensibilidade com o uso de padrões internos para cada proteína de interesse (consultar, por exemplo, Qu et al. (2006) Anal Chem. 78:4543 a 4552; Domon et al. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5:1.921 a 1.926; Wolf-Yadlin et al (2007) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 104:5.860 a 5.865; Stahl-Zeng et al. (2007) Mol. Cell. Proteomics 6:1.809 a 1.817). Peptídeos de alta qualidade de PsaD (uma

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120/137 subunidade de PS I), PsbB (uma subunidade de PS II) e RbcL (a subunidade grande de Rubisco) foram usados para quantificar a abusdância de PSI, PSII e Rubisco em Parachlorella do tipo selvagem (WT-1185) e mutantes de SGI1 (NE-7843 e NE-13380). Os resultados da análise proteômica de MRM (JadeBio, La Jolla, CA) indicaram que os mutantes de SGI1 são caracterizados por um teor de PSII/TOC e razão de PSILPSI ligeiramente elevados (Figuras 10A e 10B). Teor de Rubisco/TOC mais alto foi também observado nos mutantes de SGI1 em comparação com o tipo selvagem (Figuras 10A e 10B), que, consistente com a análise microaproximada (Exemplo 6), teve teor de proteína mais alto por TOC. Entretanto, Westerns quantitativos que comparam os níveis para PsbD (um polipeptídeo do PS II), a subunidade grande de Rubisco e Rubisco ativase mostram que, quando normalizados à proteína total, os níveis de PS II e Rubisco foram comparáveis em tipo selvagem e mutantes de SGI1, visto que o mutante de SGI1 tem um teor de proteína/TOC mais alto em geral (Figuras 10C e 10D).

[00216] Um aumento na abundância da proteína Rubisco ativase (RA) foi observado em ambas as análises de transcriptômica e protômica (Figuras 11A e 11B). Essas observações foram confirmadas através de análise Western quantitativa. As duas isozimas Rubisco ativase (alfa e beta) diferem principalmente em suas terminações N, com RA-a tendo uma terminação N estendida em relação a RA-β. A Figura 11B mostra um Western blot em que a isozima alfa da proteína Rubisco ativase (RA-α) foi aumentada ligeiramente e a isozima beta da proteína Rubisco ativase (RA-β) mostrou ser aumentada significativamente em abundância a aproximadamente 2,5 vezes o nível de proteína do tipo selvagem, consistente com a abundância aumentada do transcrito de RA no mutante conforme determinado por análise transcriptômica.

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Exemplo 11. Produtividade de Mutantes de SGI1 em cultura semicontínua que simula condições de irradiância natural.

[00217] Para avaliar a produtividade de mutantes de SGI1 em um sistema semicontínuo sob um regime de luz que imitou condições naturais de luz do dia em um dia de primavera no Sul da Califórnia, cultura com escala aumentada foram usadas para inocular frascos de cultura de tecido retangular de 225 cm², cada um dos quais continham um volume total final de 550 ml de cultura após inoculação. Um volume de inóculo típico foi aproximadamente 200 ml de cultura com escala aumentada que foi adicionado a aproximadamente 350 ml de meio de cultura PM119. As culturas foram diluídas diariamente ao meio dia, quando a intensidade de luz estava em seu pico, removendo-se 65% do volume e substituindo-se os mesmos pelo mesmo volume do meio de ensaio mais 10 ml adicionais de água deionizada para constituir a evaporação (incluída no meio de constituição). Ensaios semicontínuos foram tipicamente executados por 10 a 14 dias. As produtividades diárias de lipídio e biomassa foram apenas calculadas para culturas que atingiram estado de equilíbrio (em que o aumento em proliferação foi igual ao fator de diluição para o ensaio).

[00218] Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíram barras de agitação e tinham tampões que têm tubulação inserida conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com CO2 (1% de CO2, taxa de fluxo, 300 ml por minuto) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram colocados em um banho de água programado para manter uma temperatura constante de 25 Ό em placas de agitação ajustadas em 575 rpm durante 0 período de ensaio. Os frascos de cultura foram mascarados com um plástico branco opaco para fornecer uma abertura retangular de 31,5 cm² para a irradiância atingir a cultura. Os frascos foram alinhados com a

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122/137 largura (dimensão mais estreita) contra um banco de luz LED que foi programado com um ciclo de luz/escuro e um perfil de luz que aumentou até meio-dia solar e, então, declinou até o final do período de luz. O perfil de luz foi projetado para imitar um dia de primavera no Sul da Califórnia: 14 h de luz: 10 h de escuro, com o pico de luz em aproximadamente 2.000 μΕ. Os frascos incluíram barras de agitação e tinham tampões com tubulação inserida conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com COz (1% de COa, taxa de fluxo, 300 ml por minuto). Os frascos foram colocados em um banho de água programado para manter uma temperatura constante de 25Ό em placas de agitação ajustadas em 575 rpm durante 0 período de ensaio.

[00219] As produtividades de biomassa diárias (TOC) foram calculadas a partir de culturas que atingiram 0 estado de equilíbrio. As produtividades volumétricas de TOC em (mg/l/dia) foram calculadas multiplicando-se as quantidades volumétricas de TOC pela taxa de diluição. As produtividades areais (g/m²/dia) foram calculadas dividindo-se a produtividade total da cultura pelo tamanho da abertura através da qual a irradiância foi permitida:

(produtividade vdumétrica) ^55 / « _w £ sí dia 0,00315 1000 sVg [00220] A Figura 12 mostra a produtividade de TOC diária média para culturas em triplicata do mutante de SGI1 NE-7843 e cepa do tipo selvagem WT-1185 no ensaio diel semicontínuo, mostrando que, sob essas condições, o mutante exibiu um aumento de 20% em produtividade em relação ao tipo selvagem.

Exemplo 12. Produtividade de Culturas a Batelada sob Condições Repletas de Nutrientes [00221] A produtividade de mutante de SGI1 NE-13380 foi também avaliada durante uma semana enquanto cultivada em modo de

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123/137 batelada repleto de nitrogênio. Culturas de NE-13380 e WT-1185 do tipo selvagem foram inoculadas a um OD730 inicial de 0,5 de culturas de semente (aumento em escala) que foram proliferadas em meio de cultura repleto de nitrogênio.

[00222] Após a inoculação, a cepa com knockout de SGI1 NE13380 e a cepa do tipo selvagem WT-1185 foram proliferadas em culturas em triplicata em um ensaio em batelada em frascos para cultura de tecidos retangulares de 75 cm² contendo 175 ml de meio PM119 por diversos dias. Os frascos foram posicionados com sua dimensão de largura mais estreita contra a fonte de luz LED. Os frascos de cultura foram mascarados com um plástico branco opaco para fornecer uma abertura retangular de 21,1 cm² para a irradiância atingir as culturas. A irradiância incidente foi programada em um ciclo de 16 h de luz:8 horas de escuro com um aumento linear de irradiância de 0 a 1.200 uE durante 4 horas, após as quais a irradiância foi mantida por seis horas a 1.200 uE e, então, uma diminuição linear em irradiância de 1.200 para 0 uE durante um período de 4 h (aumentado ou diminuindo em intervalos de 15 min). H2O deionizada foi adicionada às culturas diariamente para substituir perdas evaporativas. A temperatura das culturas foi regulada por um banho de água ajustado a 25Ό. As amostras (5 ml) foram removidas diariame nte para avaliar 0 carbono orgânico total (TOC), conforme descrito no Exemplo 3. A amostragem foi realizada 30 minutos antes do final do ciclo de luz.

[00223] A Figura 13 mostra que sob essas as condições repletas de nitrogênio a batelada, 0 mutante de SGI1 NE-13380 superou 0 tipo selvagem em acúmulo de biomassa.

Exempio 13. TOC e Produtividade de Lipídio de Culturas a Batelada sob Limitação de Nitrogênio [00224] O mutante de SGI1 foi também avaliado quanto ao acúmulo de biomassa e lipídio sob limitação de nitrogênio. A cepa com

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124/137 knockout de SGI1 NE-7843 e a cepa progenitora do tipo selvagem WT-1185 foram cultivadas em um ensaio de produtividade a batelada em meio depletado de nitrogênio, isto é, o meio de cultura não teve fonte de nitrogênio para proliferação celular. As culturas de produção foram inoculadas a um OD730 inicial de 0,5 de culturas de semente (aumento em escala) que foram proliferadas em meio PM074 que incluiu nitrato 8,8 mM.

[00225] Após a inoculação, a cepa com knockout de ZnCys NE7843 e a cepa do tipo selvagem WT-1185 foram proliferadas em culturas em triplicate em um ensaio em batelada em frascos para cultura de tecidos retangulares de 75 cm² por diversos dias.

[00226] A Figura 14A mostra o acúmulo de TOC volumétrico sob condições a batelada repleta de N. Os dados biológicos duplicados são mostrados para WT-1185 e NE-13380, em que o mutante NE13380 superou a cepa do tipo selvagem em acúmulo de biomassa. A Figura 14B mostra que os mutantes de SGI1 também superam a cepa do tipo selvagem em acúmulo de lipídio (FAME), acumulando aproximadamente 50% mais FAME que o tipo selvagem ao longo do curso do ensaio de uma semana.

Exemplo 14. Culturas de Alta Irradiância.

[00227] Melhoras em taxa de proliferação dos mutantes de SGI1 revelados no presente documento foram observadas em múltiplas condições de cultura (Tabela 8). As culturas foram mantidas em alta diluição sob alta luz constante por um sistema de diluição contínuo que introduziu meio de cultura repleto fresco e descarregaram um volume igual de cultura. Os mutantes de SGI1 de Parachioreiía demonstraram uma taxa de proliferação aumentada em 18 a 20% em condições de luz moderada a alta (500 a 1.400 μΕ) e, em luz extremamente alta (5.000 μΕ), observou-se que o mutante de SGI1 proliferou em aproximadamente 5 vezes a taxa da cepa progenitora do tipo

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125/137 selvagem (Tabela 8). A diferença drástica em taxa de proliferação sob condições de luz alta pode ser usada para selecionar mutantes de SGI1.

Tabela 8. Taxas de proliferação de cepas de Parachlorella em baixa densidade, condições de luz alta.

Cepa	Taxa de proliferação diária específica	Taxa de divisão (h)
500 pE^a	1.400 pE^b	5.000 pE^c	500 pE^a	1.400 pE^b	5.000 pE^c
WT-1185^d	1,75	1,92	0,16	9,5	8,7	104,0
NE-13380^e	2,1	2,27	0,85	7,9	7,3	19,6
Melhora*	20,0%	18,2%	431,3%	20,0%	18,2%	431,3%

^a Taxa de proliferação em frasco em agitação com subcultures diárias e 500 μΕ de luz constante.

^b Taxa de proliferação em cultura contínua mantida em baixa densidade (OD72o=0,1) com 1.400 μΕ em fotobiorreator T225 (CLSCPA).

^c Taxa de proliferação em cultura contínua mantida em baixa densidade (OD72o-0,1) com 5.000 μ E em fotobiorreator FMT150.

^d Parachlorella do tipo selvagem.

^e Parachlorella com mutação de SGI1.

^f Aumento em taxa de proliferação em mutante de SGI1 em comparação com a cepa original do tipo selvagem.

[00228] Um número pequeno de células com mutante de SGI1 NE13380 foi inoculado em um fotobiorreator com 400 x 10® células WT1185 de Parachlorella do tipo selvagem que foram proliferadas em cultura contínua em condições de baixa densidade (1 x 10⁶ células por ml) com luz alta (1.400 μΕ). Durante um período de 60 dias, as taxas de proliferação aumentaram lentamente, de modo que, após 60 dias, a cultura tivesse atingido uma taxa de proliferação diária específica de 2,27. A cultura foi, então, colocada em placas para colônias únicas. Os

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126/137 clones individuais foram coletados e analisados quanto à taxa de proliferação e a presença de mutação de SGI1. Notavelmente, todos os clones isolados das placas continham a mutação de SGI1, sugerindo que é possível selecionar mutações do tipo SGI1 através do uso de baixa densidade, luz alta e cultura contínua. Por exemplo, UV, mutagênese química, mutagênese por inserção aleatória ou outros procedimentos de mutagênese podem ser opcionalmente realizados, seguido por baixa densidade, luz alta, cultura contínua por uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas para selecionar mutantes com alta produtividade, tal como mutantes do tipo SGI1. [00229] A Figura 7 mostra um mapa do gene SGI1 com posições de mutações encontradas em vários mutantes marcados. A cepa NE7843 foi isolada nas peneiras reveladas nos Exemplos 1 a 6, e a cepa NE-16980 foi isolada com o uso da peneira revelada no Exemplo 7. Diversos mutantes adicionais cujas mutações são identificadas na Figura 7 foram isolados sob luz alta, seleção por baixa densidade de cultura do presente exemplo.

Exemplo 15. Identificação e Alvejamento do Gene SGI1 de Tetraselmis [00230] O genoma de um isolado ambiental de uma alga do tipo selvagem de uma espécie de Tetraselmis, denominada no presente documento Tetraselmis WT-105, foi completamente sequenciado internamente (Synthetic Genomics, Inc., La Jolla, CA, EUA). A análise do genoma foi a mais consistente com Tetraselmis sp. WT-105 que é triploide. Com base em BLAST recíproco com o uso da sequência de polipeptideos de SGI de Parachloreila como uma consulta para sequências traduzidas do genoma de Tetraselmis WT-105, três genes foram identificados: T-5172 (SEQ ID NO:85, que tem a sequência de codificação de proteína (ou a sequência de cDNA) da SEQ ID NO:86), T-5185 (SEQ ID NO:87, que tem a sequência de codificação de proteína (ou a sequência de cDNA) da SEQ ID NO:88) e T-5230 (SEQ

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ID NO:89, que tem a sequência de codificação de proteína (ou a sequência de cDNA) da SEQ ID NO:90), considerados como sendo alelos do gene WT-105 SGI1 de Tetraselmis. As proteínas codificadas pelos alelos T-5185 (SEQ ID NO:14) e T-5230 (SEQ ID NO:16) são altamente homólogas, demonstrando 98% de identidade de sequência de aminoácidos por BLAST. A proteína codificada pelo alelo T-5172 (SEQ iD NO: 15) é 90% idêntica à proteína codificada pelo alelo T5230 (SEQ ID NO: 16) e 92% idêntica à proteína codificada pelo alelo T-5185 (SEQ ID NO:14) por análise BLAST. Foi determinado que cada alelo tem um domínio de RR e um domínio de myb (consultar a Tabela 3). Conforme também observado na Tabela 3, os polipeptídeos alélicos de SGI1 de Tetraselmis T-5172, T-5185 e T-5230 mostraram ter pontuações de pelo menos 400, a saber, 403,0 (valor e 2e-118), 403,6 (valor e 9e-119) e 402,9 (valor e 3e-118), respectivamente, contra um HMM desenvolvido para identificar polipeptídeos de SGI1 (Exemplo 6).

[00231] Para gerar uma cepa com knockout de SGI deTetraselmis, um complexo de ribonucleoproteína Cas9 (RNP) que incluiu um RNA guia CRISPR-Cas9 (crRNA) e um RNA tracr CRISPR-Cas9 (trRNA) complexado com uma proteína Cas9 foi introduzido em células algáceas de Tetraselmis por bombardeio de partículas. Um cassete de marcador selecionável para selecionar transformantes foi introduzido juntamente com Cas9 RNP nas micropartículas de ouro. O RNA tracr usado para produzir os RNPs para transformação de Tetraselmis foi um CRISPR-Cas9 tracrRNA Alt-R® com 67 nucleotídeos quimicamente modificado adquirido junto à IDT (Coralville, IA, EUA). Os crRNAs usados em transformações de RNP foram crRNAs CRISPR-Cas9 Alt-R® quimicamente modificados também adquiridos junto à IDT (Coralville, IA, EUA) que incluíram uma sequência-alvo com 20 nucleotídeos (MA1, SEQ ID NO:91 ou JC2, SEQ ID NO:92)

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128/137 presente no quarto éxon de todos os três alelos do gene SGI1 (consultar a Figura 15). Os crRNAs também incluíram uma sequência de 16 nucleotídeos complementar a uma sequência do tracrRNA.

[00232] Antes de formar os complexos de RNP, os crRNAs e tracrRNA foram pré-incubados para permitir que os crRNAs se hibridizem com o tracrRNA. Cada RNA foi ressuspenso a uma concentração de 100 μΜ e quantidades iguais de RNA crRNA e tracrRNA foram combinadas em tubos separados em alíquotas de 20 μΜ, de modo que cada RNA tivesse uma concentração de 50 μΜ em cada mistura de anelamento, exceto pelo fato de que, quando dois crRNAs foram usados em um único experimento, cada crRNA teve uma concentração de 25 μΜ na mistura de anelamento. Os RNAs combinados foram aquecidos a 95Ό por 5 minutos e, então, deixados resfriar na bancada. (RNAs crispr e sinalizador anelados que não foram usados imediatamente foram armazenados a -20°C.) [00233] Uma mistura dos RNAs crispr e tracr anelados (10 μΙ da mistura de anelamento) com proteína Cas9 foi produzida em solução salina tamponada com fosfato (PBS), em que a concentração final de proteína Cas9 foi 100 ug/ml e a concentração final de RNAs foi 10 μΜ. O crRNA (ou crRNAs) anelado e trRNA e proteína Cas9 foram incubados por 15 minutos à temperatura ambiente para formar RNPs. [00234] Para preparar as micropartículas de ouro, protamina (100 μΙ de solução a 1 mg/ml em PBS, produzida por aquecimento a 55Ό a 65Ό e resfriamento à temperatura ambiente antes do uso) foi adicionada a 5 mg de partículas de ouro (0,6 pm, BioRad), e a mistura de partículas de ouro/protamina foi submetida a vórtice e, então, sonicada. Um fragmento de DNA (SEQ ID NO:93) que incluiu um gene marcador selecionável ligado de maneira funcional ao promotor RB40 de Tetraselmís (SEQ ID NO:94) e terminador RB40 de Tetrasehnís (SEQ ID NO:95) foi, então, adicionado à suspensão de

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129/137 protamina/ouro, e a mistura foi submetida a vórtice. O fragmento de DNA marcador selecionável foi um produto de PCR que incluiu um gene de resistência a nourseotricina com códon otimizado para Tetraselmis (SEQ ID NO:96) ligado de maneira funcional ao promotor e ao terminador RB40. Os cinco nucleotídeos mais a 5 de cada iniciador (iniciador MCA1818, SEQ ID NO:97 e iniciador MCA1819, SEQ ID NO:98) usados para produzir o cassete marcador selecionável por PCR com o uso de um modelo de plasmídeo incluíram grupos fosforotioato, de modo que o fragmento de cassete marcador selecionável usado em transformações forre modificado por fosforotioato em cada extremidade.

[00235] A preparação de Cas9 RNP (RNAs anelados/proteína Cas9) foi adicionada às partículas de ouro mais fragmento de DNA marcador selecionável em solução de protamina imediatamente após a adição do fragmento de DNA marcador selecionável às partículas de ouro, e a mistura foi submetida a vórtice e, então, colocada em placas em gelo por 2 a 4 horas. Após a incubação em gelo, as preparações de micropartícula de ouro foram centrifugadas brevemente em uma microcentrífuga, o sobrenadante foi removido, e 400 μί de PVP a 1,5 mg/ml em PBS foram adicionados a cada amostra de micropartícula. As amostras foram submetidas a vórtice, sonicadas por 5 a 10 segundos e submetidas a vórtice novamente, após o qual as partículas suspensas em PVP foram levadas a um segmento pré-seco de tubulação Tefzel™ fixando-se uma seringa a uma tubulação flexível que foi conectada à tubulação Tefzel™ e extraindo-se a mistura de partículas na extremidade oposta da tubulação Tefzel™ por aplicação de sucção por meio da seringa. A tubulação Tefzel™ que incluiu a preparação de partículas de ouro foi ajustada por 5 min para permitir que as partículas de ouro assentem, após o qual a solução de PVP foi gentilmente empurrada de volta para fora da tubulação por meio da

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130/137 seringa. A tubulação foi, então, girada para distribuir as partículas de ouro sobre a circunferência interna da tubulação deixada secar no ar por aproximadamente 5 minutos (durante cujo tempo o tubo foi girado uma ou mais vezes adicionais para distribuir as partículas), após os quais a tubulação Tefzel™ foi fixada a uma fonte de gás e gás nitrogênio foi permitido fluir através da tubulação a 0,1 I por min por um minuto e, então, de cerca de 0,3 a cerca de 0I4 I por minuto por 5 a 10 minutos para completar a secagem. A tubulação Tefzel™ revestida na superfície interna com partículas de ouro a qual o DNA marcador selecionável e RNPs foram aderidos foi, então, cortada em segmentos de 1,27 centímetro (0,5 polegada) que foram usados como cartuchos em uma Pistola de Gene BioRad Helios®.

[00236] Para transformação por mlcrobombardeio, a cepa de Tetraseímis VVT-105 foi cultivada por aproximadamente três dias em um volume de 100 ml de meio de cultura PM074 inoculado a um OD730 de 0,2. A cultura iniciadora foi usada para inocular uma cultura de 1 litro a 3 x 10⁵ células/ml, e a cultura de um litro foi deixada proliferar por mais 3 dias. As células foram ressuspensas a uma concentração de 10⁸ células por ml, com aproximadamente 10⁷ células (100 μΙ) colocadas em placas dentro de um círculo de 4 cm de diâmetro em placas de meio PM074 com 2% de ágar para cada bombardeio. As células colocadas em placas foram deixadas secar na tampa e foram, então, bombardeadas com os cartuchos preparados de uma distância de aproximadamente 5 cm com o uso de hélio ajustado a 4,14 MPa (600 psi). No dia seguinte, as placas foram inundadas com meio PM 147 e colocadas em placas novamente em placas PM 147 que incluíram 200 pg/ml de nourseotricina.

[00237] Após 10 a 14 dias de proliferação em placas seletivas, dezenas de colônias receberam adesivo novamente em placas PM 147 seletivas que incluíram 200 pg/ml de nourseotricina. Os adesivos de

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131/137 sobrevivência foram triados com PCR por mutações no locus de SGI1. Concluiu-se que o cassete de gene marcador seiecionável (SEQ ID NO:93) não inserido no locus rompido com Cas9 de células de Tetraselmis transformadas, portanto, as mutações direcionadas a SGI1 foram inserções ou deleções (indels) em sua maioria pequenas no sítio alvo de SGI1. Os fragmentos de PCR gerados a partir dos clones foram sequenciados por Sanger para detectar esses eventos de mutação. Muitos dos transformantes mostraram ter uma mutação no sítio alvo. Dez dos mesmos foram escolhidos para clonagem de DNA genômico em E. coli para sequenciar cada aielo. Todos os clones na Tabela 8 foram determinados por sequenciamento como tendo knockouts triplos (isto é, homozigoto para a mutação) com a exceção do clone 8, que foi heterozigoto para o alelo mutante.

Tabela 9. Alelos mutantes em Clones de Tetraselmis Isolados após Transformação de RNP com o uso de RNAs guia que têm como alvo SGI

Número do Clone	ID da Cepa	Guia (ou Guias) Usados na transformação	Tipo de Mutação
1		MA1	grande inserção
2	STR24094	MA1+JC2	inserção de 7 pares de bares
3		MA1+JC2	grande inserção
4		MA1+JC2	inserção de 5 pares de bares
5		MA1+JC2	inserção de 13 pares de bares
6	STR24095	MA1	deleção de 5 pares de bases
7	STR24096	MA1	deleção de 9 pares de bases

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8	STR24097	MA1	inserção de 1 pares de bares
9		MA1+JC2	grande inserção
10	STR24098	MA1+JC2	inserção de 15 pares de bares

Exemplo 16. Fotofisiologia de Mutantes de SGI1 de Tetraselmís

Alvejados [00238] Para caracterizar esses clones, cinco dos dez clones listados na Tabela 8 (clones 2, 6, 7, 8 e 10) foram cultivados fotoautotroficamete sob baixa luz 24 horas/dia (140 mol defótons m ²s¹) em meio de cultura PM074 repleto que não incluiu uma fonte de carbono reduzida e incluiu nitrato como a fonte de nitrogênio. As culturas foram diluídas diariamente para manter um número de células fixo. A clorofila foi extraída e medições de FIRe e Pmáx de ¹⁴C foram realizadas conforme descrito no Exemplo 7. Os resultados são mostrados na Figura 16AS B e C; Figura 17A, B, CeDe Figura 18A, B e C. Nessas condições de baixa luz, a razão entre clorofila a:b foi aumentada em relação à cepa do tipo selvagem para todos os mutantes (Figura 16C), com os clones 2, 7 e 10 demonstrando diminuições em clorofila total e particularmente em clorofila b tanto em uma base por TOC (Figura 16A) quanto por célula (Figura 16B). Todos os clones demonstraram uma redução no tamanho de corte transversal de PSII medido em excitação a 450 e 520 nm, com os clones 2, 7 e 10 mostrando a maior redução em tamanho de corte transversal de PSII em relação ao tipo selvagem (Figuras 17A e 17B). Os clones 2, 7 e 10 também demonstraram aos maiores aumentos em Fv/Fm (Figura 17C), enquanto todos os clones demonstraram tempos de renovação fotossintética reduzidos PSII (Figura 17D). Pmáx de ¹⁴C foi aumentado para todos os clones em uma base tanto por célula quanto por TOC (Figuras 18A e 18B), e todos os clones tiveram taxas de proliferação mais altas que o tipo selvagem (Figura 18C).

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133/137 [00239] Os clones 2 e 7, que receberam os nomes de cepa STR24094 e STR24096, respectivamente, foram, então, testados em um ensaio semicontínuo que usou um programa de luz diel com um período de luz de 14 horas que simulou a intensidade de luz de um dia de primavera no Sul da Califórnia, tendo pico de intensidade a aproximadamente 2.000 mol de fótons m’²s’¹ no meio-dia solar. Três réplicas biológicas de cada cepa foram cultivadas simultaneamente e os resultados das três culturas tiveram a média calculada. As garrafas de cultura foram parcialmente envolvidas em folha metálica para refletir a luz não inicialmente absorvida de volta para as culturas. O meio de cultura foi PM153, que incluiu ureia como a fonte de nitrogênio e não compreende uma fonte de carbono reduzida (isto é, as cepas foram cultivadas fotoautotroficamente), e as culturas foram diluídas de volta em 60% diariamente. Conforme resumido na Tabela 10, que, sob essas condições, as cepas de mutante SGI1 STR24094 e STR24096 tiveram Fv/Fm aumentado, tamanho de antena do PSII reduzido (medido com 520 nm de excitação) e PSII aumentado por TOC. Clorofila como uma porcentagem de TOC é reduzida nos mutantes de SGI1 de Tetraselmis, e a razão entre clorofila a e clorofila b é aumentada. A taxa fotossintética, medida como incorporação de ¹⁴C, é aumentada de cerca de 15 a 20% nesses mutantes. A produtividade, relatada como gramas de TOC produzidos por metro por dia, é aumentada aproximadamente 6,5% em STR24094 e aproximadamente 10% em STR24096.

Tabela 10. Fotofisioloqia de Mutantes de SGI1 de Tetraselmis em

Culturas Diel semicontínuas

Cepa	FIRe	Clorofila	Pmax d© ¹⁴c	Produtividade
	Fv/Fm	PSH	fQa (ms)	PSH/ TOC	Clorofila /TOC	Clorofila a:b	nmol de ¹⁴C/ug de TOC/h	g-²dia’¹
WT-105	0,621	148	5,0	17	7,8%	2,0	25,6	15,5

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STR24094	0,683 +10%	108 -27%	3,6 -28%	20 +17,64%	6,4% -17,9%	2,8 +40%	30,8 +20,3%	16,5 +6,45%
STR24096	0,677 +9,0%	117 -21%	4,3 -14%	21 +23,5%	7,6% -2,5%	2,5 +25%	29,7 +16%	17,1 +10,3%

Exemplo 17. Produtividade de mutantes de SGI1 de Tetraselmis em um sistema de cultura semicontínua com luz constante [00240] No CL-SCUBA (Ensaio à Base de Ureia Semicontínuo com Luz Constante), culturas fotoautotróficas dos mutantes de SGI1 de Tetraselmis foram proliferadas durante diversos dias em modo semicontínuo com luz constante com amostras de cultura removidas na mesma hora a cada dia para determinação de biomassa. A luz foi programada em 2.000 pmol de fótons nr² s'¹. Nesse ensaio, 420 ml de meio de cultura PM 153 (que incluiu ureia como fonte de nitrogênio) em um frasco quadrado de 500 ml foram inoculados com cultura de semente de uma dada cepa. Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíram barras de agitação e tinham tampões que têm tubulação conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com CO2 (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com uma abertura de 0,0875m²em direção à luz e dimensão de profundidade dos frascos, estendendo-se de volta a partir da fonte de luz, foi 8 cm. As culturas foram diluídas diretamente removendo-se 40% do volume de cultura e substituindo-se 0 mesmo por meio de cultura PM 153 fresco diluído para ajuste para 0 aumento em salinidade devido à evaporação que ocorre nas culturas. As amostras para análise de TOC foram tomadas da cultura removida para a diluição após as culturas terem atingido estado de equilíbrio.

[00241] A Figura 19 mostra que sob essas condições de cultura semicontínua com luz constante, mutantes de SGI1 de Tetraselmis STR24096 e STR24096 demonstraram biomassa aumentada em 13% e 18%, respectivamente, em relação às células do tipo selvagem (cepa STR00013).

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Exemplo 18. Produtividade de mutantes de SGI1 de Tetraselmis e Parachlorella em um sistema de cultura semicontínua diel [00242] No SCUBA (Ensaio à Base de Ureia Semicontínuo) diel, culturas fotoautotróficas dos mutantes foram proliferadas durante diversos dias em modo semicontínuo com luz diel. A luz foi programada para imitar um dia de primavera médio no Vale Imperial da Califórnia na faixa de escuridão a 2.000 pmol de fótons nr² s¹ ao meio-dia. As amostras foram tomadas no crepúsculo cada dia. Nesse ensaio, 420 ml de meio de cultura PM153 à base de ureia em um frasco quadrado de 500 ml foram inoculados com cultura de semente de uma dada cepa mutante. Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíram barras de agitação e tinham tampões que têm tubulação conectada com filtros para seringa para entregar ar enriquecido com COz (1% de CO2) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram alinhados com uma abertura em direção à luz de 0,0875 m² e dimensão de profundidade dos frascos, estendendo-se de volta a partir da fonte de luz, foi 8 cm. As culturas foram diluídas diretamente removendo-se 40% do volume de cultura e substituindo-se 0 mesmo por meio de cultura PM 153 fresco diluído para ajuste para 0 aumento em salinidade devido à evaporação que ocorre nas culturas. As amostras de cultura removidas diariamente para determinação de biomassa após as culturas atingirem estado de equilíbrio. As amostras para análise de TOC foram tomadas da cultura removida para a diluição.

[00243] A Figura 20A mostra que sob essas condições, mutantes de SGI1 de Tetraselmis demonstraram biomassa aumentada entre 12% e 16% em relação às células do tipo selvagem.

[00244] Em um ensaio diel SCUBA paralelo realizado de acordo com 0 mesmo protocolo, 0 mutante de SGH de Parachlorella classicamente derivado NE-7843 foi testado em culturas em triplicata

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136/137 juntamente com culturas em triplicate da cepa do tipo selvagem de Parachlorella WT-1185. A Figura 20B mostra que, sob esse regime de cultura, o mutante de SGI1 de Parachlorella NE-7843 demonstra um aumento de 18% em produtividade em relação à cepa do tipo selvagem.

Exemplo 19. Análise de mutante de SGI1 de Arabidopsis [00245] Para determinar os efeitos de uma mutação de SGM em plantas superiores, primeiramente identlficou-se os parentes mais próximos do gene de SGI1 de Parachlorella em Arabidopsis thaliana. Com o uso de análise bioinformática revelada no Exemplo 6, o homólogo de A. thaliana mais próximo ao SGI1 de Parachlorella foi determinado como sendo ARR2 (SEQ ID NO:22).

[00246] As sementes de plantas A. thaliana com mutações em ARR1 e ARR2 assim como um controle do tipo selvagem foram obtidas a partir do centro de recursos de Arabidopsis (ABRC). As sementes foram plantadas no solo (50% de mistura de envasamento de partida de semente fertilizada MiracleGro, 25% de perlita, 25% de vermiculita). As sementes plantadas foram vernalizadas a 4Ό por cinco dias antes da transferência a um conviron para crescimento. As plantas foram cultivadas lado a lado em quatro ocasiões diferentes em um conviron ajustado a 25Ό. As plantas receberam ~70 μΕ de luz com um período escuro de 12 horas. O crescimento de mutante ARR1 foi substancialmente mais lenta que plantas tanto do tipo selvagem quanto ARR2 e, portanto, focou-se em comparações entre as plantas do tipo selvagem e com mutante ARR2/SGI1 (doravante denominadas plantas SGI1). Durante os primeiros dois experimentos de crescimento, observou-se uma melhora visual em crescimento das plantas com mutante SGI1 (Figura 21A). Os mutantes de SGI1 de Parachlorella tiveram teor de clorofila reduzido e, portanto, foi determinado o teor de clorofila em folhas do tipo selvagem e SGI1 de

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Arabidopsls. A clorofila foi extraída com o uso tanto de acetona quanto de metanol de três plantas do tipo selvagem e três plantas com mutante ARR2 (duas folhas de cada planta). Observou-se uma redução significativa na quantidade de clorofila nas plantas com mutante SGI1 (Figura 21B). Nos últimos dois experimentos de crescimento, coletou-se as plantas no dia 23 e no dia 18 para determinar pesos úmidos e pesos secos das mudas de planta. Embora tenha sido observada uma alta variação entre plantas individuais e uma alta sobreposição entre plantas do tipo selvagem e SGI1, as plantas SGI1 tiveram consistentemente um peso médio de muda mais alto de cerca de 10% em 23 dias (Figura 22Â e B) e cerca de 40% em 18 dias (Figura 22C e D). Conforme encontrado nas algas verdes (Parachlorella and Tetraselmls) com mutações de SGI1, observou-se teor de clorofila reduzido e um aumento em biomassa média durante crescimento vegetative em um mutante de SGI1 de A. thaliana, indicando que mutações de SGI podem estar associadas à produtividade aumentada em outras plantas superiores também.

[00247] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, será entendido que modificações e variações são abrangidas dentro do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada somente pelas reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Organismo fotossintético mutante que tem um gene atenuado que codifica um polipeptídeo SGI1, em que o organismo fotossintético é caracterizado pelo fato de que produz mais biomassa ou mais do que pelo menos um bioproduto do que um organismo fotossintético de controle proliferado ou cultivado substancialmente sob as mesmas condições, em que o organismo fotossintético de controle não tem um gene SG11 atenuado.
2. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado peio fato de que produz pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% mais biomassa ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, peio menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, peio menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou peio menos 100% mais de pelo menos um bioproduto do que um organismo fotossintético de controle proliferado ou cultivado sob substancialmente as mesmas condições.
3. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem teor de clorofila reduzido em relação ao micro-organismo fotossintético de controle.
4. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 3, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem uma razão a:b de clorofila aumentada em relação ao organismo fotossintético de controle.
5. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a

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2/11 reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem um tamanho de antena do fotossistema II (PSII) reduzido em relação ao organismo fotossintético de controle.
6. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem um Pmáx de ¹⁴C mais alto em relação ao organismo fotossintético de controle.
7. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem um Fv/Fm mais alto do que o organismo de controle.
8. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem um teor de proteína mais alto do que o organismo de controle.
9. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo fotossintético mutante é caracterizado pelo fato de que tem um teor de rubisco ativase mais alto do que o organismo de controle.
10. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o organismo fotossintético é caracterizado pelo fato de que é uma planta.
11. Organismo fotossintético mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o organismo fotossintético é caracterizado pelo fato de que é uma alga.
12. Organismo fotossintético mutante, de acordo com a reivindicação 11, em que o organismo fotossintético é caracterizado pelo fato de que é uma alga Chlorophyta ou Charyophyta.
13. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a

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3/11 reivindicação 12, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado peio fato de que é uma Chlorophyta da classe Chlorophyceace, Chlorodendrophyceae, Prasinophyceace ou Trebouxiophyceae.
14. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 11, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem um tamanho de antena do fotossistema II (PSII) reduzido em relação ao micro-organismo de controle.
15. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o tamanho de unidade em corte transversal do tamanho de antena do PSII é reduzido em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% em relação ao tamanho de unidade em corte transversal da antena do PSII do micro-organismo de controle.
16. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 11, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem Pmáx (¹⁴C) aumentado em relação ao micro-organismo algáceo de controle.
17. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o Pmáx (¹⁴C) é aumentado em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% em relação ao Pmáx (^UC) do micro-organismo de controle.
18. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 11, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem teor de clorofila reduzido em relação ao micro-organismo algáceo de controle.

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19. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 18, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem uma quantidade reduzida de clorofila b em relação ao micro-organismo algáceo de controle.
20. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 18, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem teor de clorofila pelo menos 20% menor em relação ao micro-organismo algáceo de controle.
21. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 19, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem teor de clorofila b pelo menos 20% menor em relação ao micro-organismo algáceo de controle.
22. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem um teor de proteína mais alto do que o micro-organismo algáceo de controle.
23. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 22, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 10% mais proteína como uma porcentagem de carbono orgânico total do que o microorganismo algáceo de controle.
24. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 23, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 20% mais proteína como uma porcentagem de carbono orgânico total do que o microorganismo algáceo de controle.
25. A micro-organismo algáceo mutante de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem expressão reduzida de pelo menos 10 genes LHC em relação ao micro-organismo algáceo de

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5/11 controle.
26. Micro-organismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que tem abundância aumentada de um polipeptídeo ativador de ribulose bisfosfato carboxilase (RA) em relação ao micro-organismo algáceo de controle.
27. Micro-organismo mutante, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ativador de ribulose bisfosfato carboxilase é pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes ou pelo menos 2,5 vezes tão abundante no mutante quanto no micro-organismo algáceo de controle.
28. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que é uma alga Chlorophyta ou Charyophyta.
29. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que é uma Chlorophyta da classe Chlorophyceace, Chlorodendrophyceae, Prasinophyceace ou Trebouxiophyceae.
30. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que é um membro da Chlorophyceace, opcionalmente, uma espécie de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Asteromonas, Ankistrodesmus, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chrysosphaera, Dunaiíeíla, Haematococcus, Monoraphidium, Neochloris, Oedogonium, Peíagomonas, Pleurococcus, Pyrobotrys, Scenedesmus e Voívox.
31. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, em que o micro-organismo algáceo mutante é

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6/11 caracterizado pelo fato de que é um membro da Chlorodendrophyceae, opcionalmente, uma espécie de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Prasinocladus, Scherffelia e Tetraselmis.
32. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que é um membro da Prasinophyceace, opcionalmente, uma espécie de Ostreococcus ou Micromonas.
33. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, em que o micro-organismo algáceo mutante é caracterizado pelo fato de que é um membro da Trebouxiophyceae, opcionalmente, uma espécie de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Botryococcus, Chlorella, Auxenochlorella, Heveochlorella, Marínichlorella, Parachlorella, Pseudochlorella, Tetrachlorella, Eremosphaera, Franceia, Mlcractinium, Nannochloris, Oocystis, Picochlorum, Prototheca, Stichococcus e Viridiella.
34. Micro-organismo algáceo mutante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a alga mutante é de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Chlorella, Auxenochlorella, Heveochlorella, Marinichlorella, Parachlorella, Pseudochlorella e Tetrachlorella.
35. Método para produzir um produto algáceo caracterizado por compreender cultivar o mutante algáceo como definido na reivindicação 1 para produzir o produto.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recuperar o produto da cultura.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o produto é biomassa.
38. Método, de acordo com a reivindicação 35,

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7/11 caracterizado pelo fato de que o produto algáceo é um ou mais lipídios, proteínas, policetídeos, terpenoides, pigmentos, antioxidantes, vitaminas, nucleotídeos, ácidos nucleicos, aminoácidos, carboidratos, álcoois, hormônios, citocinas, peptídeos ou polímeros.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o produto é um ou mais lipídios.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o produto é triacilglIcerídeo.
41. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o produto algáceo é uma ou mais proteínas.
42. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita cultura é em modo batelada, semicontínuo ou contínuo.
43. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita cultura está em condições repletas de nutrientes.

44. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita cultura está em condições depletadas de nitrogênio. 45. Método para isolar uma alga mutante que tem

produtividade mais alta em relação à alga progenitora da qual a mesma é derivada caracterizado por compreender:

cultivar uma cepa algácea sob condições semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas por pelo menos trinta gerações; e

Isolar pelo menos uma cepa da cultura, em que a pelo menos uma cepa isolada tem uma taxa de proliferação mais alta que a alga progenitora;

isolar, assim, uma alga mutante que tem produtividade mais alta em relação à alga progenitora da qual a mesma é derivada.

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46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado peio fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 500 uE.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz constante de uma intensidade de pelo menos 600 uE.
48. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 800 uE.
49. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 1000 uE.
50. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 1200 uE.
51. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 1500 uE.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 2000 uE.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas

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9/11 ou contínuas fotoautotróficas incluem exposição à luz de uma intensidade de pelo menos 2500 uE.
54. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem manter a cultura algácea a uma densidade menor que 5x10® células/ml.
55. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem manter a cultura algácea a uma densidade menor que 2,5 x 10⁶ células/ml.
56. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem manter a cultura algácea a uma densidade menor ou igual a 1,5 x 10® células/ml.
57. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as condições de cultura semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas incluem manter a cultura algácea a uma densidade menor ou igual a 1 x 10® células/ml.
58. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a cepa algácea é mutagenizada antes da cultura sob condições semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas.
59. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a cepa algácea é mutagenizada com o uso de UV, mutagênese química, mutagênese por inserção ou edição de genoma alvejada.
60. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda realizar PCR para amplificar pelo menos uma porção do locus de SGI1 da alga mutante isolada.
61. Método, de acordo com a reivindicação 41,

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10/11 caracterizado pelo fato de que compreende ainda sequenciar pelo menos uma porção do locus de SGI1 da alga mutante isolada.
62. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda sequenciar o genoma da alga mutante isolada.
63. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda avaliar a produtividade da alga mutante isolada.
64. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a cepa algácea é cultivada sob condições semicontínuas ou contínuas fotoautotróficas por pelo menos cem gerações.
65. Método para selecionar mutantes de alta produtividade caracterizado por compreender:

a) mutagenizar uma população de algas;

b) selecionar células de baixa fluorescência de clorofila da população mutagenlzada de algas com o uso de seleção de células ativadas por fluorescência (FACS);

c) distribuir linhagens isoladas das células de baixa fluorescência de clorofila em placas com múltiplos poços;

d) triar as ditas células de baixa fluorescência de clorofila quanto ao tamanho de antena do fotossistema II (PSII), Fv/Fm, e

e) selecionar pelo menos uma linhagem de células que tem tamanho de antena do PSII reduzido, Fv/Fm aumentado, e aumentou em relação a células do tipo selvagem.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que uma linhagem de células selecionada tem um tamanho de antena do PSII reduzido em pelo menos 20%.
67. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que uma linhagem de células selecionada

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11/11 tem Fv/Fm aumentado em pelo menos 10%.
68. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que uma linhagem de células selecionada aumentou em pelo menos 10%.
69. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda triar Pmáx (C) aumentado.
70. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda realizar um ensaio de produtividade.
71. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda sequenciar pelo menos uma porção do genoma da linhagem isolada.