BR112019011692A2 - salto de exon por derivados de ácido nucleico de peptídeo - Google Patents

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Abstract

derivado de ácido nucleico de peptídeo de fórmula (i) é fornecido para se ligar fortemente a um sítio de junção dentro de um pré-mrna de uma maneira específica de sequência. dado com excelente permeabilidade da membrana celular e forte afinidade para rna, o referido derivado de ácido nucleico de peptídeo induz salto de éxon em células tratadas com o ácido nucleico de peptídeo em concentração subfentomolar como oligonucleotídeo "nu". o referido composto mostra atividade terapêutica em indivíduos na administração sistêmica, mesmo em 1 µg/kg ou menos, e, portanto, é útil tratar uma doença ou sintoma a custo de tratamento acessível.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SALTO
DE EXON POR DERÍVADOS DE ÁCIDO NUCLEICO DE PEPTÍDEO.
Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se ao salto de éxon induzido por derivados de ácido nucleico de peptídeo com boa penetração celular e forte afinidade por ácido nucleico, e reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório U.S. No. 62/440.929, depositado em 30 de Dezembro de 2016, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade.
Antecedente da Invenção [002] Os oligonucleotídeos têm sido usados para diversas finalidades biológicas incluindo inibição antissenso da expressão de gene, PCR (reação em cadeia da polimerase), análise diagnostica por chip de gene, etc. Como os oligonucleotídeos interagem com ácido nucleico incluindo DNA e RNA em uma forma específica de sequência, são úteis para previsivelmente modular os processos biológicos envolvendo DNA ou RNA dentro da célula. Os oligonucleotídeos com boa permeabilidade celular são capazes de modular tais processos biológicos dentro da célula de uma maneira previsível em sequência.
[003] Proteínas como Alvos de Fármaco: Proteínas mediam diversas funções celulares. Não seria surpreendente descobrir que a maioria dos fármacos atualmente comercializados apresenta atividade terapêutica através da modulação de funções de proteína(s). Por exemplo, o fármaco anti-inflamatório não esteróide, aspirina, inibe enzimas chamadas ciclo-oxigenases quanto a sua atividade antiinflamatória. Losartana liga-se a um receptor de transmembrana chamado receptor da angiotensina II devido à sua atividade antihipertensiva. A rosiglitazona ativa seletivamente um receptor intracelular chamado receptor ativado por proliferador de peroxissoma y (PPARy) para eliciar sua atividade antidiabética. Etanercepte é uma
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2/189 proteína de fusão que se liga a uma citocina chamada fator de necrose de tumor-α (TNF-a) e neutraliza a atividade biológica do TNF-α quanto a sua atividade anti-reumática. Herceptina é um anticorpo monoclonal para o tratamento do câncer de mama, ligando-se seletivamente ao erbB2 superexpresso em certos tipos de células de câncer de mama. [004] Pré-mRNA: A informação genética é transportada no DNA (ácido 2-desoxirribose nucleico), que é transcrito para produzir o prémRNA (ácido ribonucleico pré-mensageiro) no núcleo. Pré-mRNA de mamífero geralmente consiste em éxons e introns, e éxon e intron estão interligados entre si. Éxons e introns são numerados conforme ilustrado na Figura 1A.
[005] Junção de Pré-mRNA em mRNA: No núcleo, o pré-mRNA é processado em mRNA após a deleção de introns e ligação de éxons por uma série de reações complexas coletivamente chamadas de junção como ilustrado esquematicamente na Figura 1B. [Ann. Rev. Biochem. 72 (1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014)] [006] A junção é iniciada pela formação do complexo E de splicesome” (isto é, complexo de splicesome inicial) entre pré-mRNA e fatores adaptadores de junção. No complexo E de splicesome”, U1 liga-se à junção do éxon N e do intron N e U2AF35 liga-se à junção do intron N e éxon (N+1). Assim, a junção de exon/íntron ou íntron/éxon é crítica para a formação do complexo de splicesome inicial. Complexo E de splicesome” evolui para complexo A de splicesome” na complexação adicional com U2. Complexo A de splicesome”, em seguida, sofre uma série de reações complexas para excluir ou dividir o íntron para se juntar aos éxons vizinhos.
[007] Junção Alternativa e Variante de Junção: Todos os éxons de pré-mRNA nem sempre são retidos para formar o mRNA de tamanho natural durante a junção. Certos éxons são deletados ou retirados
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3/189 para formar mRNAs variantes, isto é, variantes de junção. Assim, o pré-mRNA pode ser alternativamente juntado para produzir múltiplas variantes de junção.
[008] A junção alternativa em células de mamíferos foi relatada pela primeira vez em 1981 com o gene que codifica a calcitonina. [Nature vol. 290(5801), 63-65 (1981); Proc. Natl. Acad. Sei. USA vol 79(6), 1717-1721 (1982)]. O gene consiste em 6 éxons, e o mRNA da calcitonina é produzido pelo salto do éxon 5 e éxon 6. Enquanto isso, o salto do éxon 4 produz uma variante de mRNA que codifica o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP).
[009] A junção alternativa parece estar completamente à altura das células e condições às quais as células são expostas. Devido à junção alternativa, várias proteínas são produzidas a partir de um único gene. A junção alternativa permite que os animais gerem mais di~ versidades de proteínas para o tamanho do genoma. Em humanos, estima-se que 95% dos genes multiexônicos tenham junção alternativa. [Nature Genetics vol 40 (12), 1413-1415 (2008)] [0010] Variantes de junção e Funções biológicas: As variantes de junção são encontradas como°Correndo espontaneamente de uma forma dependente do tipo de célula ou tecido, e codificam proteínas que possuem perfis biológicos frequentemente diferentes dos perfis da proteína de tamanho natural.
[0011] O receptor de andrógeno (AR) seria um bom exemplo de genes que produzem múltiplas variantes de junção. [Int. J. Biol. Sci. vol 7 (6), 815-822 (2011)] O pré-mRNA de AR consiste em 8 éxons mais 4 éxons crípticos (os éxons crípticos são fornecidos como sombreados no diagrama abaixo). Existem pelo menos sete variantes de junção do mRNA de AR.
[0012] A variante de mRNA de AR 1 é composta do éxon 1 ao éxon 8 ligado em série, e codifica a proteína de AR de tamanho natu
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4/189 rah como ilustrado na Figura 2A. No caso da variante de mRNA de AR
3, o éxon 4 ao éxon 8 são retirados (isto é, deletados). Consequentemente, a variante de mRNA de AR 3 codifica uma proteína de AR truncada (AR3) sem o domínio de ligação ao ligante (LBD) presente na proteína de tamanho natural.
[0013] A proteína de AR de tamanho natural torna-se funcionalmente ativa após a formação do complexo com um andrógeno, tal como testosterona ou di-hidrotestosterona (DHT). Enquanto isso, a proteína de AR3 truncada é funcionalmente ativa mesmo na ausência de andrógeno. Nos tumores de próstata resistentes à terapia de ablação de andrógeno, a proteína de AR3 têm sido frequentemente constatada ser super-regulada. Assim, a formação endógena da proteína variante de AR3 pode ser empregada juntamente como um processo de seleção natural para que as células de câncer de próstata escapem da terapia de ablação de andrógeno.
[0014] O fator indutível por hipoxia 1a (HIF-1a) é uma subunidade de um fator de transcrição chamado fator indutível por hipoxia 1 (HIF1) e é codificado pelo gene HIF1A. O HIF-1a é super-regulado em resposta à hipoxia (isto é, baixo nível de oxigênio) e, portanto, pode ser considerado como o sensor de oxigênio celular. [Proc. Natí. Acad. Sei. USA, vol 92, 5510-5514 (1995)]. O HIF-1a induz a transcrição de mais de 60 genes incluindo VEGF e EPO. O HIF-1a promove a formação de novos vasos sanguíneos via VEGF. [Exp. Mol. Med. vol 36, 1-12 (2004)]. Os tumores sólidos experimentam hipoxia devido ao limitado fornecimento de sangue e super-regula o HIF-1a para sobreviver sob hipoxia.
[0015] A proteína de HIF-1a consiste em vários domínios para a sua atividade funcional como ativador da transcrição. Contém uma hélice-alça-hélice (bHLH) e dois domínios de PAS. [para domínio de PAS, cf. Curr. Biol. vol 7 (11), R674-677 (1997); EUR. J. Biochem. vol
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271 (6), 1198-1208 (2004)]. HIF~1a possui um domínio de degradação dependente de oxigênio (ODD) que serve como sensor de oxigênio e é bem conhecido por ser crítico para a estabilidade da proteína de HIF1a.
[0016] Existem pelo menos seis variantes da proteína de HIF-1a codificada por seis variantes de junção de mRNA de HIF~1a como ilustrado na Figura 2B. [Exp. Mol. Med. vol 36, 1-12 (2004)]. O mRNA de HIF-1a de tamanho natural (HIF-1aFL) é similar ao mRNA de HIF-Ια tipo selvagem (HIF-1aWT), exceto para três bases adicionais (UAG) entre o éxon 1 e éxon 2 devido à junção alternativa. O éxon 14 é deletado ou ignorado no HIF-1a736. O HIF-1a736 não possui domínio de ativação do C-terminal (CAD). Sabe-se que tanto o HIF-1aFL como o HIF1a736 ativam o promotor de VEGF na hipoxia. Entretanto, o HIF-1aS57 (HIF-1aZ) e HIF~1a516 funcionam como uma isoforma negativa dominante de HIF-1a. No câncer de mama, a variante de junção de mRNA de HIF-1aFL reflete um estágio da progressão do câncer e está associada a um mau prognóstico. [BMC Medicine vol 8 (44), 1-12 (2010)] [0017] Como exemplificado pelo receptor de androgênio e pela proteína de HIF-1a, as variantes de junção desempenham papéis importantes na geração de diversidades fisiológicas para um dado gene mamífero. A natureza gera espontaneamente variantes de junção para manter a homeostasia, bem como para responder à dinâmica fisiológica.
[0018] Síntese de Proteína Ribossõmica: Os introns de pré-mRNA são retirados enzimaticamente para produzir mRNA (ácido ribonucleico mensageiro), que é, então, localizado no compartimento citosólico. No citosol, um complexo de maquinaria translacional chamado ribossoma liga-se ao mRNA e realiza a síntese de proteína à medida que varre a informação genética codificada ao longo do mRNA. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668
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6/189 (1988)] [0019] Códon: Durante a síntese de proteína ribossômica, cada aminoácido é codificado por uma tríade da sequência de mRNA. Por exemplo, AUG, UUA, CCC e AGA codificam metionina, leucina, prolina e arginina, respectivamente. Essas tríades são chamadas de códon. Dados com 4 monômeros de mRNA de A, G, U e C, existem 64 (4 x 4 x 4 = 64) códons possíveis. Certos códons correspondem ao sinal de interrupção para a síntese de proteína ribossômica. UGA”, UAA” e UAG” são os códons para o sinal de interrupção. A síntese de proteína ribossôrnica termina quando a maquinaria ribossômica reconhece um códon de interrupção ao varrer ao longo do mRNA.
[0020] Oligonucleotídeo Antissenso (ASO): Uma ligação de oligonucleotídeo a mRNA ou pré-mRNA de uma forma específica de sequência (isto é, complementarmente) é chamada oligonucleotídeo antissenso (ASO). ASO firmemente ligando-se ao mRNA pode bloquear a síntese de proteína ribossômica. Do mesmo modo, o ASo firmemente ligando-se ao pré-mRNA pode interferir com o processo de junção e produzir variantes de junção do mRNA.
[0021] Inibição Antissenso de Junção: A junção de pré-mRNA começa após o complexo E de splicesome” (isto é, complexo E) ser formado. Como esquematicamente descrito na Figura 3, proteínas de SR (isto é, proteínas ricas em serina arginina) ligam-se a regiões de realçador de junção exônico (ESE) e auxiliam o recrutamento de U1 e U2AF35 para ligação ao sítio de junção 5 e sítio de junção 3, respectivamente. [Biochem. Cell Biol, vol 77 (4), 277-291 (1999); Curr. Opin. Cell Biol, vol 13 (3), 302-309 (2001)] [0022] Em princípio, o ASO pode inibir a formação do complexo E de splicesome” por ligação a uma determinada região do pré-mRNA, ο que é crítico para a formação do complexo Ε. A formação do complexo
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E é inibida ou bloqueada se o ASO se ligar firmemente a um sítio de junção 5, sítio de junção 3, ou região ESE.
[0023] Uma vez que o mRNA codifica a proteína de acordo com a sua sequência, uma variante de junção de mRNA codifica uma proteína diferente da proteína codificada pelo mRNA original ou de tamanho natural. Assim, a inibição antissenso do processamento é uma opção terapêutica eficaz por codificação da(s) proteína(s) variante(s) que apresenta(m) propriedades biológicas diferentes das da proteína codificada pelo mRNA original ou de tamanho natural”.
[0024] Fase de Leitura Induzida por Inibição Antissenso de Junção: Uma parte da codificação da sequência de DNA (CDS) para o mRNA de HIF-1a humano [Código de mRNA de NCBI: NM___001530] é fornecida na Figura 4A como um exemplo para ilustrar a fase de leitura de quadro) induzida por inibição antissenso de junção. A CDS (isto é, barra amarela) é exibida pelo códon e éxon (isto é, seta verde). Deve notar-se que T (isto é, timina) na CDS deve ser substituído por U (isto é, uracila) em mRNA ou pré-mRNA.
[0025] Se o éxon 3 é deletado por inibição antissenso da junção, a extremidade 3' do éxon 2 é ligada diretamente à extremidade 5' do éxon 4. Então, a junção entre o éxon 2 e éxon 4 lê ...-GAT-GCT- (GTTD-GAA-CTA-..· como fornecido na Figura 4B (conforme diagrama à esquerda). Existem quatro nucleotídeos entre os dois códons vizinhos do mRNA de tamanho natural. A deleção do éxon 3 coloca os códons começando do éxon 4 fora da estrutura. Assim, a deleção do éxon 3 induz a fase de leitura dos códons.
[0026] Se o éxon 3 e o éxon 4 forem deletados simultaneamente por inibição antissenso da junção, a extremidade 3’ do éxon 2 une-se à extremidade 5' do éxon 5. Então, a junção entre o éxon 2 e o éxon 5 lê -GAT-GCT-(G~GC)-CTT-GTC-...!! como mostrado na Figura 4B (conforme diagrama à direita). Existem três nucleotídeos entre os dois cóPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 97/291
8/189 dons vizinhos do mRNA de tamanho natural. A deleção dupla do éxon e éxon 4 coloca os códons começando do éxon 5 na estrutura, isto é, sem fase de leitura.
[0027] A fase de leitura produz códons diferentes dos códons diferentes dos códons originais e geralmente gera um códon de terminação prematura (PTC), como ilustrado na Figura 4G para o caso da deleção do éxon 3 no mRNA de HIF-1a. A fase de leitura de indução do salto de éxon está destinada a produzir um fragmento de proteína truncada no C-terminal devido à terminação prematura da síntese de proteína ribossômica. Um tal fragmento de proteína pode apresentar propriedades fisiológicas diferentes da proteína ’Original ou de tamanho natural. Assim, a inibição antissenso da junção pode ser uma opção terapêutica eficaz para um gene alvo da doença.
[0028] Detecção de Salto de Exon por RT-PCR Aninhada: Um mRNA de variante de junção induzido com um ASO é frequentemente detectado por PCR (reação em cadeia da polimerase). Se um ASO induzir o salto do éxon 4 de 150 pb de comprimento como ilustrado na Figura 5A, existem dois mRNAs possíveis produzidos a partir do prémRNA alvo de ASO, isto é, o mRNA de tamanho natural e a variante de junção de mRNA sem o éxon 4. No caso do ASO induzir o salto do éxon 4 completamente (isto é, 100%), as células tratadas com o ASO produzem apenas o produto de PCR menor do que o produto de PCR do mRNA de tamanho natural por 150 pb. A banda do produto de PCR para o salto de éxon é amostrada e submetida a sequenciamento de modo a confirmar que a banda do produto de PCR veio eficazmente da variante de junção de mRNA.
[0029] Estimativa do Rendimento de Salto de Exon por Método de PCR: Nas literaturas, o rendimento do ou a eficácia do salto do éxon foi estimada usualmente comparando a intensidade da banda do gel do produto de PCR para o mRNA da variante de junção com a intensiPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 98/291
9/189 dade para o mRNA de tamanho natural· Tal estimativa é teoricamente válida em grande parte se apenas o mRNA de tamanho natural e o mRNA de variante de junção possuírem estabilidade comparável nas células, bem como durante os procedimentos de ensaio adotados para a detecção de POR. Considerando que a estabilidade do mRNA é o resultado bruto da evolução ao longo de um bilhão de anos, no entanto, é improvável que as variantes de junção de mRNA devam apresentar a mesma estabilidade que o mRNA de tamanho natural.
[0030] Do mesmo modo, é justo supor que o enriquecimento relativo do mRNA de variante de junção e do mRNA de tamanho natural pode variar muito dependendo dos iniciadores de PCR, condições de PCR e método de detecção por PCR. Recentemente, a qPCR digital foi aplicada para estimar o rendimento de saltos de éxon do mRNA da distrofina em camundongos mdx tratados com um ASO de distrofina de morfolino ou 2'-OMe PTO (fosforotioato). O rendimento do salto de éxon por qPCR digital foi consideravelmente diferente dos rendimentos por métodos tradicionais, como qPCR aninhada. [Lab. Investigation, vol 90, 1396-1402 (2010)]. Um estudo de qPCR digital para o salto do éxon em mioblastos e fibroblastos de pacientes com DMD humanos sugere que a qPCR digital seja a escolha para detectar com segurança os produtos de salto de éxon com alta sensibilidade. [PLoS One 0162467, September 09 (2016)] [0031] Dado que o rendimento aparente do salto do éxon tende a variar dependendo do método e condição de ensaio de PCR, o rendimento do salto do éxon pelo ensaio de PCR pode necessitar de ser adicionalmente validado pela expressão de proteína ou ensaios funcionais para o gene alvo.
[0032] Super-requlação da Realimentação de Transcrição por ElciRNA: O laço de íntron é formado como um subproduto durante a junção do pré-mRNA. O salto de éxon rende não apenas mRNA de variPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 99/291
10/189 ante de junção, porém, também RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) como ilustrado na Figura 5B, no qual o éxon 3 e éxon 4 são retirados para produzir o laço composto de introns, éxon 3 e éxon 4. O laço inicialmente formado, isto é, ElciRNA Φ, pode sofrer junção adicional para render um laço secundário definido como ElciRNA ©.
[0033] Esses laços de ElciRNA retêm a sequência do sítio de junção 5’ do éxon 4 e são capazes de recrutar proteína ribonuclear nuclear de U1 (snRNP de U1). snRNP de U1 em seguida recruta a RNA polimerase II, que pode super-regular a transcrição do pré-mRNA. A transcrição de um pré-mRNA pode aumentar se os ElciRNAs se acumularem além de um nível limiar no núcleo. Assim, ElciRNAs podem funcionar frequentemente como um regulador de retroalimentação da transcrição quando o salto do éxon°Corre excessivamente. [Nature Struct. Mol. Biol, vol 22 (3), 256-264 (2015)] [0034] Oliqonucleotídeos Não Naturais: O oligonucleotídeo de DNA ou RNA está sujeito à degradação por nucleases endógenas, limitando a sua utilidade terapêutica. Até à data, vários oligonucleotídecs não naturais (isto é, que não°Correm naturalmente) foram desenvolvidos e investigados intensivamente. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Muitos deles mostram estabilidade metabólica prolongada em comparação com DNA e RNA. Fornecidas na Figura 6A, estão as estruturas químicas para alguns dos oligonucleotídeos não naturais representativos. Esses oligonucteotídeos ligam-se previsivelmente a um ácido nucleico complementar como o DNA ou o RNA.
[0035] Oligonucleotídeo de Fosforotioato (PTO): PTO é um análogo de DNA com um dos átomos de oxigênio de fosfato de cadeias principal substituído com um átomo de enxofre por monômero. Uma tal mudança estrutural pequena tornou o PTO comparativamente resistente à degradação por nucleases. [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 100/291
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402 (1985)] [0036] Refletindo a similaridade estrutural da cadeia principal entre PTO e DNA, ambos penetram mal na membrana celular na maioria dos tipos de células de mamíferos. Para alguns tipos de células que expressam abundantemente o(s) transportador(es) para o DNA, no entanto, DNA e PTO mostram uma permeabilidade celular comparativamente boa. Os PTOs administrados sistemicamente são conhecidos por distribuir facilmente para o fígado e rim devido a uma expressão abundante de transportadores para o DNA. [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)] [0037] A fim de melhorar a permeabilidade da célula de PTO in vitro, a lipofecção tem sido popularmente adotada. No entanto, a lipofecção altera fisicamente a membrana celular, causa citotoxicidade e, portanto, não seria ideal para uso terapêutico a longo prazo.
[0038] Nos últimos 30 anos, PTO e as variantes de PTO foram avaliadas clinicamente para tratar cânceres, distúrbios imunológicos, doenças metabólicas e assim por diante. [Biochemistry vol 41, 45034510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Muitos de tais candidatos a fármaco antissenso não foram desenvolvidos com sucesso, em parte devido à fraca permeabilidade celular de PTO. Para superar a fraca permeabilidade celular, PTO precisa ser administrado em altas doses para atividade terapêutica. No entanto, os PTOs são conhecidos por provocar toxicidade Hmitante da dose, incluindo aumento do tempo de coagulação, ativação do complemento, nefropatia tubular, ativação de célula de Kupffer e estimulação imune, incluindo esplenomegalia, hiperplasia linfoide e infiltração de células mononucleares. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)] [0039] Verificou-se que muitos PTO antissenso mostram atividade clínica para doenças com uma contribuição significativa do fígado ou
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12/189 rins. O Mipomersen é um análogo da PTO que inibe a síntese da apoB-100, uma proteína envolvida no transporte do colesterol LDL. Mipomersen manifestou atividade clínica em uma determinada população de pacientes com aterosclerose devido à sua distribuição preferencial para o fígado. [Circulation vol 118 (7), 743-753 (2008)] O ISIS113715 é um análogo de PTO que inibe a síntese da proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B), e mostrou atividade terapêutica em pacientes com diabetes tipo II. [Curr. Opin. Moí. Then vol 6, 331-336 (2004)] [0040] 2'-O-Alquil RNA: 2!-O-alquil-RNA é um análogo de RNA tendo o grupo 2!-hidróxi no anel de ribose substituído por um grupo alquilóxi. O 2’-O-alquil RNA mostra afinidade de RNA mais forte que PTO ou DNA. Além disso, 2’-O-alquil RNA mostra uma estabilidade metabólica melhorada para fins terapêuticos. No entanto, o 2'-O-alquilRNA apresenta uma baixa permeabilidade da membrana, o que limita o escopo terapêutico.
[0041] Ácido Nucleico Bloqueado (LNA): No LNA, o anel de ribose da cadeia principal do RNA é restrito estruturalmente para aumentar a afinidade de ligação para RNA ou DNA. Assim, o LNA pode ser considerado como um análogo de DNA ou RNA de alta afinidade. [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)]. No entanto, o LNA também mostra uma baixa permeabilidade celular como DNA ou RNA.
[0042] Oligonucleotídeo Híbrido de Cadeia Principal de DNA ou RNA: PTO e 2!-O~alquil RNA são frequentemente fundidos em um único oligonucleotídeo. Devido à parte de 2’-O-alquil RNA, um tal oligonucleotídeo híbrido possui uma afinidade de ligação ao RNA mais forte que o oligonucleotídeo de PTO da mesma sequência. Similarmente, LNA e PTO são frequentemente fundidos em um único oligonucleotídeo, e o oligonucleotídeo híbrido possui uma afinidade de ligação ao RNA mais forte do que o oligonucleotídeo PTO da mesma sequência. No entanto, esses oligonucleotídeos híbridos também apresentam fraPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 102/291
13/189 ca permeabilidade celular.
[0043] Qliqonucleotídeo de Morfolino de Fosforodiamidato (PMO): No PMO, os módulos de cadeia principal de DNA de fosfato e 2desoximbose são substituídos por fosforodiamidato e morfolina, respectivamente. [Appl. Microbiol. Biotechno!, vol 71, 575-586 (2006)]. Embora a cadeia principal do DNA esteja carregada negativamente, a cadeia principal do PMO não é carregada. Assim, a ligação entre PMO e mRNA é livre da repulsão eletrostática entre as cadeias principais, e tende a ser mais forte do que a ligação entre DNA e mRNA. Como o PMO é marcadamente diferente do DNA na estrutura da cadeia principal, o PMO não seria reconhecido pelo(s) transportador(es) hepático(s) que reconhece(m) DNA ou RNA. No entanto, o PMO não penetra facilmente na membrana celular.
[0044] Ácido Nucleico de Peptídeo (PNA): O PNA é um polipeptídeo com a cadeia principal unitária de N-(2-aminoetil)glicina, e foi descoberto pelo Dr. Nielsen e colaboradores. [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. A Figura 6B ilustra a estrutura química e nomenclatura para o protótipo (isto é, não modificado) PNA.
[0045] Tal como o DNA e o RNA, o PNA também se liga seletivamente a um ácido nucleico complementar [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. Na ligação ao ácido nucleico complementar, o Nterminal do PNA é equivalente à extremidade 5’ de DNA ou RNA, e o C~terminal do PNA é equivalente à extremidade 3! do DNA ou RNA.
[0046] Como o PMO, a cadeia principal do PNA não é carregado. Assim, a ligação entre o PNA e o RNA tende a ser mais forte que a ligação entre o DNA e o RNA. Como o PNA é marcadamente diferente do DNA na estrutura química, o PNA não seria reconhecido pelo(s) transportador(es) hepático(s) que reconhece(m) o DNA, e mostraria um perfil de distribuição de tecido diferente do DNA ou do PTO. No entanto, o PNA também penetra mal na membrana celular dos mamíPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 103/291
14/189 feros. [Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280 (2003)] [0047] Distrofia Muscular de Duchenne (DMD): DMD é uma doença da emaciação muscular que afeta um por aproximadamente 3.500 crianças recém-nascidas do sexo masculino. [Lancet Neurol, vol 9, 7793 (2010)]. Os pacientes com DMD perdem gradualmente sua função muscular e morrem de insuficiência cardíaca ou respiratória antes de atingirem os 30 anos. Em muitos pacientes com DMD, o gene da distrofina é mutado para produzir o mRNA da distrofina com um códon de terminação prematura (PTC), e expressa uma distrofina não funcional truncada sem a parte do C-terminal. [Human Mol. Genetics vol 12 (8), 907-914 (2003); e referências nele].
[0048] Uma abordagem popular para tratar DMD tem sido pular o éxon possuindo um PTC no mRNA da distrofina usando um ASO, e codificar uma proteína variante de junção com o C-terminal que é frequentemente denominado como a distrofina de tamanho natural.
[0049] Salto de Exon 23 de mRNA de Distrofina em Camundongos MDX: Camundongo Mdx é um mutante com um PTC no éxon 23 do pré-mRNA da distrofina, e tem sido amplamente adotado como um modelo animal para DMD humana. [FEBS J. vol. 280 (17), 4177-4186 (2013)]. Os ASOs complementarmente alvejando o pré-mRNA da distrofina de camundongo foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 23. [Artificial DNA: PNA & XNA vol 2(1), 6-15 (2011)]. A este respeito, o camundongo mdx serviu como um bom sistema modelo para avaliar uma classe de oligonucleotídeo quanto à sua capacidade de induzir o salto do exon.
[0050] Um ASO de 2'-OMe PTO (2’--O-metilfosforotioato) de 20mer totalmente complementar à junção do éxon 23 e do ínfron 23 (isto é, o sítio de junção 5’ do éxon 23) foi injetado localmente em um músculo de camundongo mdx em aproximadamente 10 pg/Kg como formulado com um agente de transfecção anfifílico F127, e aumentou a ex
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15/189 pressão da distrofina de tamanho natural no tecido muscular da injeção por imuno-histoquímica (IHC) e western blot para a distrofina de tamanho natural. Esses resultados por IHC e western blot indicam que o éxon 23 foi ignorado pela injeção local do ASO. O ASO possui uma sobreposição complementar de 18 mer com a extremidade 5' do íntron 23 e uma sobreposição complementar de 2~mer com a extremidade 3' do éxon 23. [Nature Med. vol 9 (8), 1009-1014 (2003)] [0051] Outro ASO de 2!-OMe PTO de 20-mer totalmente complementar à junção do éxon 23 e do íntron 23 (isto é, o sítio de junção 5’ do éxon 23) foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 23. O ASO de 20-mer complementarmente direciona à junção do éxon 23 e do íntron 23, e possui uma sobreposição complementar de 18-mer com a extremidade 5' do íntron 23 e uma sobreposição complementar de 2-mer com a extremidade 3' do éxon 23. Uma incubação de 96 horas de mioblastos de camundongo com 2 ou 4 μΜ de ASO induziu o salto do éxon 23, como confirmado por RT-PCR aninhada. O salto do éxon 23 também foi identificado por RT-PCR em camundongos mdx que receberam duas injeções intramusculares de 2,9 nmol do ASO. O salto de éxon 23 foi detectado em tecidos musculares de camundongos mdx administrados subcutaneamente com o ASO de 2'OMe PTO em 50 mg/Kg. Um ASO de 2'-FPS de 20-mer (2’-fluorofosforotioato) possuindo a mesma sequência que o ASO de 2'-OMe PTO acima mencionada também induziu o salto do éxon 23 em mioblastos de camundongo como o ASO de 2’-OMe PTO. No entanto, o ASO de 2!-FPS não induziu o salto do éxon 23 em camundongos mdx após injeções intramusculares ou subcutâneas. [Moí. Ther. Nucl. Acids vol 4, e265 (2015)] [0052] Um ácido nucleico de peptídeo de 20-mer (PNA) complementarmente alvejando a junção do éxon 23 e do íntron 23 foi avaliado quanto a sua capacidade de induzir o salto do éxon 23 em camundon
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16/189 gos mdx. O ASO de PNA de 20-mer possui uma sobreposição complementar de 18 mer com a extremidade 5' do intron 23 e uma sobreposição complementar de 2 mer com a extremidade 3' do éxon 23. O PNA de 20-mer em 250 nM induziu a deleção do éxon 23 em células de mdx H2K como analisado por RT-PCR aninhada. Após uma injeção intramuscular em 5 a 20 pg (aproximadamente 0,25 a 2 mg/Kg) em camundongos mdx, o PNA de 20-mer induziu o salto do éxon 23 no tecido muscular do sítio de injeção. Concluiu-se que a eficiência de salto do éxon do PNA de 20-mer foi superior ao do ASO de 2’-OMe PTO acima mencionado em camundongos mdx. O PNA de 20-mer foi conjugado covalentemente a vários peptídeos de penetração celular (GPPs) para melhorar a permeabilidade celular. Esses conjugados de PNA-CPP e o PNA não modificado induziram comparativamente o salto do éxon 23 nas células, bem como no tecido muscular do sítio de injeção. [Mol. Ther. vol 16 (1), 38-45 (2008)] [0053] Um ASO de PMO de 25 mer, totalmente complementar à junção do éxon 23 e do íntron 23 (isto é, o sítio de injeção 5’ do éxon 23) foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 23 em camundongos mdx. O ASO de 25-mer possui uma sobreposição complementar de 18~mer com o íntron 23 e uma sobreposição complementar de 7-mer com o éxon 23. O PMO de 25-mer induziu o salto de éxon 23 em camundongos mdx após injeções intravenosas múltiplas a 2 mg por animal (aproximadamente 100 mg/Kg) [Nat. Med. vol 12 (2), 175177 (2006)]. O PMO de 25-mer foi conjugado covalentemente a vários peptídeos de penetração celular (CPPs) de modo a melhorar a permeabilidade celular. Esses conjugados de PMO-CPP induziram o salto do éxon 23 nos músculos em uma injeção intravenosa única em 3 mg/Kg. [Human Mol. Genetvol 18 (22), 4405-4414 (2009)] [0054] Salto de Exon 46 de mRNA da Distrofina em Mioblastos de Paciente com DMD Humano: ASOs de 2’-OMe PTO foram projetados
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17/189 para complementarmente direcionar uma região de realçador de junção exônica (ESE) no éxon 46 em pré-mRNA da distrofina humano, e foram avaliados quanto à eficiência de salto do éxon 46 em células de mioblasto derivadas de um paciente com DMD humano sem o éxon 45 no mRNA da distrofina. As células foram transfectadas com o ASO em 1 μΜ por lipofecção e incubadas por 24 horas até a extração do RNA para RT-PCR aninhada para detecção do salto do éxon 46. Vários dos ASOs testados induziram o salto do éxon 46. [Human Mol. Genet, vol 10 (15), 1547-1554 (2001)] [0055] Salto do Exon 51 do mRNA da Distrofina em Pacientes com DMD: Drisapersen (PRO051 ou GSK24022968) é um 2’-OMe PTO de 20-mer projetado para complementarmente direcionar uma região de ESE dentro do éxon 51 no pré-mRNA da distrofina humana, e foi avaliado para atividade terapêutica em pacientes com DMD humana. Após avaliação da biópsia de tecidos musculares por POR aninhada, o drisapersen induziu o salto do éxon 51 em pacientes com DMD por via subcutânea recebendo 2 a 6 mg/Kg por semana, embora a eficácia do salto do éxon não fosse alta. [N. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522 (2011)] [0056] Eteplirsen (AVI-4658) é um PMO de 30-mer projetado para complementarmente direcionar um ESE dentro do éxon 51 no prémRNA da distrofina humana, e foi avaliado quanto a sua atividade terapêutica em pacientes com DMD. Em uma avaliação de biópsia de tecidos musculares por IHC ( imuno-histoquímica) para a distrofina de tamanho natural, o eteplirsen induziu o salto de éxon 51 em pacientes com DMD recebendo 2 a 20 mg/Kg por semana por infusão intravenosa. [Lancet vol 378 (9791), 595-605 (2011)] [0057] Salto de Exon 27 de mRNA de APQB em Células HepG2: A apolipoproteína B (APOB) constitui uma parte integral das partículas de lipoproteína. O mRNA de APOB consiste em 29 exons. ASOs de APOB de 2’-OMe RNA foram projetados para direcionar o sítio de jun
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18/189 ção 3' do éxon 27, o sítio de junção 5' do éxon 27, ou ambos o sítio de junção 3' e o sítio de junção 5'. O ASO do sítio de junção 3! (ASO de 3'-SS) tem uma sobreposição de 15 mer com o íntron 26 e uma sobreposição de 5-mer com o éxon 27. [BMC Mol. Biol. 2007, 8:3. publicado em 17 de Janeiro de 2007]. O ASO do sítio de junção 5! (ASO de 5'SS) possui uma sobreposição de 5-mer com o éxon 27 e uma sobreposição de 15-mer com o íntron 27. Um ASO de 2’-OMe RNA de 40mer foi projetado fundindo covalentemente o ASO de 3’-SS com ASO de 5’-SS. Assim, o ASO de 40-mer é capaz de interagir simultaneamente com o sítio de junção 3', bem como o sítio de junção 5!.
[0058] Os ASOs foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon 27 em células HepG2 por Hpofecção. É interessante notar que tanto o ASO de 3’-SS quanto o ASO de 5'-SS não conseguiram induzir o salto do éxon 27 em células HepG2 em 25 a 250. nM. Entretanto, o ASO de 40-mer mostrou um nível marcado do salto do éxon 27 de uma forma dependente da dose entre 25 e 250 nM. É provável que a sobreposição complementar de 15-mer do 2 OME RNA com a parte do íntron de um sítio de junção isoladamente não seja suficiente para eficazmente inibir a formação do complexo de splicesome inicial. Seria desejável uma ligação mais apertada a um sítio de junção abrangendo o éxon 27 do pré-mRNA de APOB, para induzir o salto do exon, inibindo eficazmente a formação do complexo de splicesome inicial em células HepG2.
[0059] Salto Alternativo de Pré-mRNA de Bcl-x: BCL2L1 (Bcl-x) é um gene humano que codifica Bcl-xL ou Bcl-xS através da junção alternativa. Um ASO de 2’-OMe PTO de 18-merfoi projetado para direcionar o sítio de junção 5’ do éxon 2, e possui uma sobreposição complementar de 16-mer com o éxon 2 e uma sobreposição de 2-mer com o íntron 2. Por Hpofecção em 80 a 400 nM, o ASO promoveu a produção celular de Bcl-xS através da junção alternativa em um painel de
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19/189 células de câncer incluindo MCF7, PC3, Du145, HeLa e MDA MB231.
[J. Bioi. Chem. vol 277 (51), 49374-49382 (2002)] [ΟΟθθ] Correção de Junção In Vitro Livre de Células no Pré-mRNA de β-Globina: A talassemia é um distúrbio sanguíneo hereditário causada pela formação anormal de hemoglobina. Uma mutação rara do IVS2705 encontrada em pacientes com talassemia do Mediterrâneo carrega uma mutação pontual [T -» G] na posição de nucleotídeo 705 no intron 2 do gene da β-globina humana. A mutação de IVS2705 cria um sítio de junção 5' adicional e ativa um sítio de junção 3' críptico na posição 579 do intron. A mutação de IVS2705 induz uma junção alternativa para inserir 127 nucleotídeos, isto é, o nucleotídeo 579-705 do intron entre o éxon 2 e éxon 3. [J. Biol. Chem. vol. 260, 16332-16337 (1985)] [0061] Um ASO de 2’-OMe RNA de 17-mer totalmente complementar ao sítio de junção 5’ críptico do mutante de IVS2705 foi avaliado quanto à sua capacidade de corrigir a junção anormal em um sistema de junção in vitro sem células. O ASO possui uma sobreposição de 8mer com o íntron e sobreposição de 9-mer com o éxon críptico. O ASO eficazmente corrigiu a junção aberrante em 0,12 a 2 μΜ para produzir o mRNA sem o éxon críptico originário do íntron 2. [Proc. Natí. Acad. Sci. USA vol 90, 8673-8677 (1993)]. O sistema de junção in vitro é livre de células e, portanto, não requer qualquer agente de liberação para induzir o salto do exon. O ASO induziu o salto do éxon em 120 nM no sistema de junção livre de células. Se o ASO possuísse uma afinidade mais forte pelo sítio de junção 5!, a atividade do salto do éxon seria mais potente. De modo a melhorar a potência do salto do exon, é necessário usar um ASO que possua uma forte afinidade para o sítio de junção 5'.
[0062] Correção de Junção do Pré-mRNA da Luciferase em Células HeLa pLuc/705 por 2'-OMe RNA: pLuc/705 é um gene da luciferase mo
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20/189 dificado para ter o intron 2 do mutante de IVS2705 da β-globina humana inserida entre os nucleotídeos 1368 e 1369. Célular HeLa pLuc/705 expressam estavelmente o gene da luciferase pLuc/705 modificado. As células HeLa modificadas expressam urn mRNA de luciferase com o éxon críptico entre os nucleotídeos 1368 e 1369 e, portanto, codificam uma proteína variante da luciferase não funcional.
[0063] Um oligonucleotídeo de 2’-OMe RNA de 17-mer complementarmente direcionando o sítio de junção 5' críptico do mutante de IVS2705 (possuindo uma sobreposição de 8-mer com intron e sobreposição de 9-mer com o éxon críptico) foi avaliado quanto à sua capacidade de corrigir a junção aberrante do pré-mRNA de luciferase modificado em células HeLa pLuc/705. Após a lipofecção em 20 a 500 nM, o ASO de 17-mer restaurou a atividade da luciferase celular de uma forma dependente de dose. O éxon críptico foi constatado ser retirado pelo tratamento com o ASO por análise de RT-PCR. A atividade de salto do éxon foi observada em 20 nM ou maior concentração. [Biochemistry vol 37, 6235-6239 (1998)] [0064] Correção de Junção do Pré-mRNA da Luciferase em Células HeLa pLuc/705 por PNA: Derivados de PNA de 17-mer complementarmente direcionando o sítio de junção 5' críptico do mutante de IVS2705 (possuindo uma sobreposição de 8-mer com íntron e sobreposição de 9-mer com o éxon críptico) foram avaliados quanto à sua capacidade de corrigir a junção aberrante do pré-mRNA da luciferase modificado em células HeLa pLuc/705. Esses derivados de PNA foram projetados para possuírem um número variável de grupos fosfonato covalentemente conjugados com o N-terminal da sequência de PNA. [Nud. Acids Res. vol 30 (13), 4424-4432 (2008)]. A conjugação covalente de porções de fosfonato ao PNA foi introduzida para facilitar a transfecção na célula por lipofecção.
[0065] Após a lipofecção em 2,5 a 60 nM, os ASOs de PNA res
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21/189 tauraram a atividade da luciferase celular de uma forma dependente de dose. O éxon críptico foi constatado ser retirado pelo tratamento com o ASO por RT-PCR. ASOs de PNA com mais grupos fosfonato ligados a ele mostraram maior potência e eficácia na junção do éxon críptico. Um ASO de PNA com 12 grupos fosfonato mostrou uma eficácia do salto do éxon de 81 % em 2,5 nM.
[0066] A potência subnanomolar observada do salto do éxon pelo ASO de PNA é muito mais forte do que a potência do ASO de 2’-OMe RNA de 17-mer. [Biochemistry vol 37, 6235-6239 (1998)]. PNA seria muito útil para potencialmente induzir o salto do exon, se devidamente modificado para liberação na célula.
[0067] Salto de Exon de Pré-mRNA de FOLH1 com 2'-OMe PTO: O antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) é um produto do gene da folato hidrolase (FOL.H1), e é altamente expresso em tecidos de próstata malignos. ASOs de 2'-OMe PTO direcionando o prémRNA de FOLH1 foram avaliadas quanto à sua capacidade de induzir o salto de éxon em células de câncer de próstata LNCap após uma transfecção por Hpofecção. [Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)] [0068] SSO1 é uma ASO de 18-mer direcionando o sítio de junção 5’ do éxon 1 e possui uma sobreposição complementar de 16 mer com o éxon 1 e uma sobreposição de 2 mer com o íntron 1. SSO6 e SSO18 são ASOs de 18-mer direcionando complementarmente o éxon 6 e éxon 18, respectivamente.
[0069] O SSO1 induziu a junção alternativa com uma IC50 de aproximadamente 400 nM. O SSO6 induziu o salto do éxon 6 com uma ICso de aproximadamente 4 nM. O SSO18 induziu o salto do éxon 18 com uma ICso de aproximadamente 4 nM.
[0070] É interessante notar que SSO6 e SSO18 direcionando uma região intraexônica (isto é, sítio realçador de junção exônico) induziu o salto do éxon muito mais potencialmente que o SSO1 direcionando um
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22/189 sítio de junção 5'. O direcionamento de uma região ESE com ASOs de
2!“0Me PTO foi considerado mais eficaz do que o direcionamento de um sítio de junção neste exemplo específico.
[0071 ] Junção Alternativa de Pré-mRNA de IL-5Ra com 2'-O-MOE RNA: 2!-O-MOE RNA (2'-O-metoxietil RNA) ASOs direcionando complementarmente o pré-mRNA de IL-5Ra de murino foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir a junção alternativa (isto é, salto do exon) em células BCL1 após uma transfecção por eletroporação. [Mol. Pharmacol, vol 58, 380-387 (2000)] [0072] ASOs foram projetados examinando complementarmente várias regiões do éxon 9 e os sítios de junção flanqueando o éxon 9. Um ASO de 20-mer totalmente complementar com o sítio de junção 3' (3' SS) do éxon 9 com uma sobreposição de 4-mer com íntron 8 induziu a junção alternativa marcadamente em 10 μΜ. ASOs direcionando regiões intraexônicas do éxon 9 induziu a junção alternativa em 10 μΜ com uma eficácia comparável ao ASO de 3' SS. Todos os ASOs testados induziram a junção alternativa, indicando que o éxon 9 e seus sítios de junção são altamente suscetíveis ao salto do exon. O sítio de junção 3’ foi mais suscetível que o sítio de junção 5'.
[0073] ASOs de 20-mer também foram projetados para complementarmente direcionar os sítios de junção que flanqueiam o éxon 8 com uma sobreposição de 4-mer com o íntron. Os ASOs induziram o salto do éxon 8 em 10 μΜ, embora o ASO de 3' SS fosse mais eficaz que o ASO de 5' SS.
[0074] A potência do salto do éxon micromolar dos ASOs de 2’-OMOE RNA por eletroporação é considerada muito pobre em comparação com a potência do salto do éxon nanomolar de ASOs de 2’-OMe PTO direcionando o pré-mRNA de FOLH1 por lipofecção. [Oligonucleotides, vol 16, 186-175 (2006)]. A lipofecção seria mais eficaz do que a eletroporação para transfecção de oligonucleotídeos com a cadeia
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23/189 principal carregada negativamente na célula.
[0075] Salto do Exon 10 do Pré-mRNA de Tau com 2!-O-MOE PTO: O sítio de junção 5’ do éxon 10 no pré-mRNA da tau possui uma sequência de 18 mer capaz de formar uma alça de haste, e não seria adequada para a formação do complexo de splicesome E. Assim, o éxon 10 do pré-mRNA da tau é altamente propenso a saltar.
[0076] ASOs de 2'-O-MOE PTO direcionando ao sítio de junção 3' ou ao sítio de junção 5! do éxon de tau 10 foram avaliados quanto à sua capacidade de realçar o salto do éxon 10. [J. Bioí Chem. vol 276 (46), 42986-42993 (2001)]. Ε10α é um ASO de 18 mer complementarmente direcionado ao sítio de junção 3'. E10a possui uma sobreposição de 10-mer com o íntron 9 e uma sobreposição de 8-mer com o éxon 10. Ε10β é um ASO de 21-mer complementarmente alvejando o sítio de junção 5'. Ε10β possui uma sobreposição de 8-mer com o éxon 10 e uma sobreposição de 13-mer com o íntron 10.
[0077] Após uma transfecção em células COS-1 por lipofecção, E10a e Ε10β induziram o salto do éxon 10 com uma IC50 de 2-5 nM. Em células PC12 transfectadas por electroporação, os ASOs induziram o salto do éxon 10 com uma ICso micromolar.
[0078] Salto do Exon 2 do Pré-mRNA de MyD88 com ASO de 2'O-MOE RNA: MyD88 é uma proteína adaptadora envolvida na ativação induzida por IL-1R e TLR de NF-kB. ASOs de 2!-O-metoxietil (2'-OMOE) RNA de 20-mer foram designados para complementarmente direcionar o sítio de junção 3' ou o sítio de junção 5' do eoxn 2 no prémRNA de MyD88 humano. Os ASOs de 20-mer foram projetados para ter uma sobreposição de 0, 5, 10, 15 ou 20-mer com a extremidade 5' do íntron 1 (isto é, o sítio de junção 3' do éxon 2) ou a extremidade 3' do íntron 2 ( isto é, o sítio de junção 5’ do éxon 2). Os ASOs foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 2 em células A549 após uma transfecção por lipofecção. [J. Immunol, vol
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176, 3652-3661 (2006)].
[0079] Dos ASOs, o ASO que possui uma sobreposição de 20-mer com o intron 1 no sítio de junção 3’ do éxon 2 induziu o salto do éxon 2 mais potente e eficazmente. A ICso observada para o salto do éxon 2 foi entre 50 e 100 nM. Os ASOs direcionado o sítio de junção 5! não eram tão eficazes quanto os ASOs direcionando o sítio de junção de 3'. Entre os ASOs direcionando o sítio de junção 5', o ASO mais potente foi o ASO que possui uma sobreposição de 20-mer com a extremidade 3' do éxon 2.
[0080] Entre os ASO de 2’-O-MOE RNA designados provavelmente para direcionar o sítio de junção 3' ou o sítio de junção 5' de éxon 2 no pré-mRNA de MouseMyD88, o ASO possuindo uma sobreposição de 20-mer com a extremidade 5' do éxon 2 induziu mais potencialmente o salto do éxon 2 em células RAW 264.7 transfectadas por lipofecção.
[0081] O ASO mais potente nas células de murino foi administrado duas vezes por semana durante 2 semanas em 50 mg/Kg. Houve decréscimos significativos no mRNA de MyD88 por 60 a 85% no intestino, tecido adiposo e fígado. 50 mg/Kg é uma dose elevada que pode causar efeitos adversos típicos dos terapêuticos de oligonucleotídeo com a cadeia principal de fosfato ribose. Existe uma forte necessidade de melhorar acentuadamente a potência do salto do éxon se os ASOs de 2’-O-MOE RNA devam mostrar atividade terapêutica sem incorrer em efeitos adversos típicos.
[0082] Restauração do Exon 7 em SMN2 por Nusinersen: A atrofia muscular espinhal (SMA) é uma doença rara, com risco de vida, causada por deleção ou perda de função no gene SMN1 (sobrevivência do neurônio motor 1). Os seres humanos têm um gene SMN2 parálogo que tem uma sequência de codificação idêntica, com exceção de 11 nucleotídeos. Um SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) de C para
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T no éxon 7 de SMN2 induz o salto do éxon 7, e o mRNA variante de junção resultante codifica uma proteína variante de SMN2 metabolizada rapidamente. Assim, o mutante SMN2 é incapaz de compensar a escassez funcional da proteína SMN1, o que leva a uma erupção de
SMA. [Neurology vol 86, 890-897 (2016)] [0083] Nusinersen (Spiranza™) é um ASO de 2S-O-MOE RNA de 18 mer complementarmente direcionando uma região de silenciador de junção no íntron SMN2 7. Como o nusinersen bloqueia estericamente a ligação de uma proteína de silenciamento de junção, o éxon 7 é retido ou restaurado para produzir a proteína SMN2 de tamanho natural. Nusinersen restaura o processo de junção regular, ligando-se à região do silenciador de junção localizada no íntron SMN2 7.
[0084] Nusinersen foi aprovado pelo US FDA em 2016 para tratar SMA. O nusinersen é administrado por via intratecal em 12 mg uma vez por trimestre ou dois trimestres. Nusinersen permanece na medula espinhal com uma meia-vida de 135 a 177 dias no líquido cefalorraquidiano (CSF). [Nusinersen US Label, FDA, December 2016] [0085] Potência Terapêutica de Terapêuticos de Qliqonucleotídeo do Salto do Exon: Tal como nos casos exemplares citados anteriormente neste documento, os oligonucleotídeos com cadeia principal de fosfato induzem o salto do éxon com uma potência nanomolar em células transfectadas por lipofecção, porém, com uma potência micromolar em células tratadas como oligonucleotídeos !!nus.
[0086] A potência do salto do éxon micromolar do pré-mRNA de MyD88 foi transladada em uma dose terapêutica de 10 mg/Kg ou superior após administração sistêmica como oligonucleotídeo nu em camundongos. [J. Immunol, vol 176, 3652-3661 (2006)]. Em uma tal dose terapêutica elevada, os oligonucleotídeos com cadeia principal de fosfato são susceptíveis a eventos adversos imunológicos. Assim, seria muito desejável desenvolver um método ou formulação para mePetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 115/291
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Ihorar marcadamente a dose terapêutica.
[0087] Drisapersen, um PTO de 2!-OMe de 20-mer projetado para induzir o salto do éxon 51 no pré-mRNA da distrofina humana, induziu o salto do éxon 51 em pacientes com DMD subcutaneamente recebendo o ASO em 2 a 6 mg/Kg por semana como oligonucleotídeo nu, embora a eficácia de salto do éxon não fosse alta. [Λ/. Engl. J. Med. vol 364, 1513-1522 (2011)]. Havia uma preocupação em aumentar a dose terapêutica de drisapersen devido à toxicidade de limitação de dose.
[0088] PNA e PMO possuem uma cadeia principal neutra, não são reconhecidos pelos sistemas imunes (especialmente receptores tipo dobre de sino), e estariam livres das respostas imunológicas comumente observadas com oligonucleotídeos com cadeia principal de fosfato.
[0089] Eteplirsen (AVI-4658), um PMO de 30~mer desenvolvido para induzir o salto do éxon 51 no pré-mRNA da distrofina humana, foi bem tolerado em pacientes com DMD recebendo o ASO por infusão intravenosa de 2 a 20 mg/Kg por semana. [Lancet vol 378 (9791), 595605 (2011)] Recentemente, eteplirsen recebeu uma aprovação acelerada do US FDA para uso em pacientes com DMD.
[0090] Embora o nusinersen seja um ASO de capacidade de restauração do éxon em vez do salto do exon, a dose terapêutica aprovada de 12 mg por trimestre é bastante atrativa. A eficiente captação neuronal após uma injeção intratecal é considerada em grande parte responsável pela potência do nusinersen.
[0091] O desenvolvimento clínico de terapias de oligonucleotídeo com cadeias principal de fosfato foi criticamente dificultado por toxicidades de limitação de dose, incluindo toxicidade imunológica através da ativação dos receptores tipo dobre de sino ou ativação do complemento, toxicidade específica de tecido no fígado ou rim. Ao melhorar a potência terapêutica in vivo, tais toxicidades de limitação de dose poPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 116/291
27/189 dem ser superadas.
[0092] Os oligonucleotídeos são muito caros de fabricar. O nível atual da dose terapêutica humana de 100 mg a 2 g por semana é transladado em um custo de API de 100 a 2.000 USD (dólares americanos) por semana, se o custo de fabricação de API for generosamente considerado como 1.000 USD por grama. Na realidade, o custo de fabricação de API de terapêuticos com oligonucleotídeo está bem acima de 1.000 USD por grama. Assim, haverá uma forte demanda por parte dos profissionais de saúde para melhorar significativamente a potência terapêutica, a fim de fornecer terapêuticos de oligonucleotídeo a um custo anual de tratamento acessível para uso crônico.
[0093] Boa Permeabilidade Celular do Oligonucleotídeo: A membrana celular é uma barreira de bicamada de lipídeo desenvolvida ao longo de um bilhão de anos. A membrana celular funciona, de fato, como uma grande barreira para oligonucleotídeos antissenso de filamento único de tamanho de 4 a 10K Da. A liberação celular de tais ASOs por penetração direta da membrana celular é praticamente impossível. Existem outras trilhas de captação celular de oligonucleotídeos de filamento único. Para citar alguns, endocitose mediada por transportador em hepatócitos como visto com mipomersen direcionando ApoB100, captação neuronal (provável de ser endocitose), como observado com nusinersen, captação celular mediada por GaINac (Nacetilgaiactosamina), e assim por diante. No entanto, tais trilhas captação celular são altamente dependentes de tecidos e dificilmente são aplicáveis geralmente à maioria dos tipos de tecidos. [Nature Biotechnol. vol 35 (3), 222-229 (2017)] [0094] Seria possível formular adequadamente um oligonucleotídeo com cadeia principal de fosfato para possuir uma boa permeabilidade celular, e prever-se-ia que tal oligonucleotídeo formulado mostrasse melhor potência terapêutica in vivo do que o oligonucleotídeo
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28/189 nu (isto é, sem formulação). Dado que os oligonucleotídeos com cadeia principal de fosfato mostraram potência do salto do éxon nanomolar no máximo em células se transfectadas por lipofecção, a potência terapêutica in vivo para um oligonucleotídeo formulado para possuir boa permeabilidade celular seria marcadamente melhorada como ditaria a potência do salto do éxon in vitro nanomolar. Assim, a boa permeabilidade celular seria crítica para a potência terapêutica in vivo de oligonucleotídeos que induzem o salto do exon. No entanto, o desenvolvimento de uma formulação eliciando boa liberação nos tecidos permaneceu um enorme desafio técnico no campo dos terapêuticos de oligonucleotídeos.
[0095] Nucleobases Modificadas de PNA para Boa Permeabilidade Celular e Alta Afinidade: Como citado anteriormente, os derivados de PNA foram projetados para possuir um número variável de grupos fosfonato covalentemente conjugados para facilitar a liberação na célula por lipofecção. Descobriu-se que tais ASOs de PNA exibiam potência de salto de subnanomolar nas células HeLa após a lipofecção. [NucL Acids Res. vol 30 (13), 4424-4432 (2008)]. A potência subnanomolar é consideravelmente mais potente do que a potência do salto do éxon observada com ASOs com a cadeia principal de fosfato. Desse modo, o PNA seria útil para induzir de forma potente o salto do éxon se for adequadamente liberado na célula.
[0096] O PNA foi tornado altamente permeável à membrana de célula de mamífero introduzindo nucleobases modificadas com um lipídeo catiônico ou o seu equivalente ligado covalentemente a este. As estruturas químicas de tais nucleobases modificadas são exemplificadas na Figura 6C. Verificou-se que tais nucleobases modificadas de citosina, adenina e guanina hibridizam previsível mente com guanina, timina e citosina, respectivamente. [Pedido PCT No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253],
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29/189 [0097] A incorporação de tais nucleobases modificadas no PNA simula situações de Hpofecção. Por lipofecção, as moléculas de oligonucleotídeo são complexadas com as moléculas de lipídeo catiônicas tal como a lipofectamina, e tais complexos de Hpofectamina/oligonucleotídeo tendem a penetrar na membrana celular com bastante facilidade quando comparados com moléculas de oligonucleotídeo nuas.
[0098] Além da boa permeabilidade da membrana, verificou-se que esses derivados de PNA possuem uma afinidade ultra-forte para o ácido nucleico complementar. Por exemplo, a incorporação de 4 a 5 nucleobases modificadas em derivados de PNA de 11- a 13-mer produziu facilmente um ganho de Tm de 20°C ou superior na formação de duplex com DNA complementar.
[0099] Descobriu-se que esses derivados de PNA foram altamente sensíveis a um não pareamento de base única. Um não pareamento de base única resultou em uma perda de Tm de 11 a 22°C, dependendo do tipo de base modificada, bem como da sequência de PNA.
[00100] Dados com boa permeabilidade da membrana e uma afinidade ultra-elevada para o ácido nucleico, os derivados de PNA com tais nucleobases modificadas seriam úteis para induzir potencialmente o salto do exon.
Breve Descrição das Figuras [00101] Figura 1A. Ilustração da numeração para introns e éxons no pré-mRNA.
[00102] Figura 1B. Breve ilustração esquemática do processo de junção.
[00103] Figura 2A. Variantes de junção de mRNA de AR codificando as proteínas AR de variantes.
[00104] Figura 2B. Variantes de junção de mRNA de HIF-1a codificando as proteínas de HIF~1a de variantes.
[00105] Figura 3. Ilustração esquemática para os processos biolóPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 119/291
30/189 gicos envolvidos na formação do complexo inicial de splice some.
[00106] Figura 4A. Uma parte de CDS lido a partir do mRNA de
HIF-lo humano.
[00107] Figura 4B. Sequências de junção de exon-éxon das variantes de junção de HIF-1a sem éxon 3 (esquerda) e éxons 3-4 (direita) illustrating fase de leitura (fora da estrutura) e na estrutura, respectivamente.
[00108] Figura 4C. Fase de leitura exemplar produzindo um PTC. [00109] Figura 5A. Ilustração esquemática para RT-PCR aninhada para detectar o salto de exon.
[00110] Figura 5B. Ilustração esquemática da formação de ElciRNAs durante o salto de exon.
[00111] Figura 6A. Estruturas químicas para oligonucleotídeos não naturais representativos.
[00112] Figura 6HB. A estrutura química e nomenclatura abreviada do protótipo PNA.
[00113] Figura 6C. Nucleobases modificadas desenvolvidas para melhorar a permeabilidade de membrana de PNA.
[00114] Figura 7. Exemplos de nucleobases naturais ou não naturais (modificadas) selecionáveis para o derivado de ácido nucleico de peptídeo de Fórmula i.
[00115] Figura 8A. Exemplos para radical alquila substituída ou não substituída selecionáveis para o composto de Fórmula I.
[00116] Figura 8B. Exemplos para alquilacila substituída ou não substituída, e radicais arilacila substituída ou não substituída selecionáveis para o composto de Fórmula I.
[00117] Figura 8C. Exemplos para alquilamino substituído, arilamino substituído, arila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, e radicais arilfospfonila
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31/189 substituída ou não substituída selecionáveis para o composto de Fórmula I.
[00118] Figura 8D. Exemplos para alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, e radicais arilaminocarbonila substituída ou não substituída selecionáveis para o composto de Fórmula I.
[00119] Figura 8E. Exemplos para alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, e radicais ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída selecionáveis para o composto de Fórmula I.
[00120] Figura 9. Estruturas químicas de monômeros de PNA com nucleobase natural ou modificada.
[00121] Figura 10. Estruturas químicas para abreviações de substituintes N~terminal ou C-terminal.
[00122] Figura 11. Estrutura química para o derivado de 14-mer de PNA de (N—>C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)TNH2.
[00123] Figura 12. Estrutura química para o derivado de 15-mer de PNA de (N C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TTAA(2O2)CNH2.
[00124] Figura 13. Estruturas químicas para monômeros de FmocPNA usados para sintetizar os derivados de PNA desta invenção.
[00125] Figura 14. Ciclo de alongamento de monômero típico adotado na síntese de peptídeo em fase sólida.
[00126] Figura 15A. Cromatograma de HPLC de fase reversa de Cis para HIF-ASO 1 antes da purificação.
[00127] Figura 15B. Cromatograma de HPLC de fase reversa de
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Cis para HIF-ASO 1 após purificação por HPLC.
[00128] Figura 16. Espectro de massa de ESI-TOF de HIF-ASO 1 purificado por HPLC preparativa de Cis-RP.
[00129] Figura 17A. Posições alvo dos iniciadores específicos de éxon empregados na PCR aninhada com HIF-1a para detectar o salto de éxon induzido por HIF-ASO 2 em células HeLa.
[00130] Figura 17B. Dados de eletroforese de produtos de PCR aninhados com HIF~1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
[00131] Figura 17C. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída para o salto de HIF-1a éxon 2.
[00132] Figura 18A. Dados de western blot de HIF-1o em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2 em 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou 10 aM durante 24 horas.
[00133] Figura 18E3. Níveis de expressão de proreína HIF-1a relativos normalizados contra β-actina em células HeLa tratadas com HIFASO 2 em 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou 10 aM durante 24 horas, (barra de erro por erro padrão) [00134] Figura 18C. qPCR aninhada com HIF-1o por SYBR Green em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00135] Figura 18D. qPCR aninhada com HIF-1o por sonda de TaqMan em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00136] Figura 19A. Dados de eletroforese de produtos de PCR aninhados com HIF~1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 6 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
[00137] Figura 19B. Dados de western blot de HIF-1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 6 em 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, ou 1 aM durante 24 horas.
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33/189 [00138] Figura 19C. Níveis de expressão de HIF-1a normalizados contra β-actina em células HeLa tratadas com HIF-ASO 6 em 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, ou 1 aM durante 24 horas, (barra de erro por erro padrão) [00139] Figura 20A. Dados de qPCR aninhada por SYBR Green em células HeLa tratadas com SSHIF-ASO 6!! em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00140] Figura 20B. Dados de qPCR aninhada por sonda de TaqMan em células HeLa tratadas com HIF-ASO 6 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00141] Figura 21Â. Dados de eletroforese de produtos de PCR aninhados com HIF-1o em células HeLa tratadas com HIF-ASO 1 em 0 (controle negativo), 1, 3, 10, 30 ou 100 aM (esquerda); e dados do sequenciamento de Sanger para o produto de PCR atribuível ao salto de éxons 2-3 (direita).
[00142] Figura 21B. Dados de western blot de HIF-1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 1 durante 72 horas em 0 zM (controle negativo), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM ou 300 aM.
[00143] Figura 21C. Níveis de expressão de HIF-1o normalizados contra β-actina em células HeLa tratadas com HIF-ASO 1 durante 72 horas em 0 zM (controle negativo), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM ou 300 aM.
[00144] Figura 22A. Dados de PCR aninhada com HIF-1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 12 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM (esquerda) juntamente com os dados do sequenciamento de Sanger da banda do salto de éxon (direita).
[00145] Figura 22B. Dados de western blot de HIF-1o em células HeLa tratadas com HIF-ASO 12 em 0 (controle negativo), 0,01,0,1, 1 ou 10 aM.
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34/189 [00146] Figura 22C. Dados de qPCR aninhada com HIF-1a obtidos em células HeLa tratadas com HIF-ASO 12 em 0 (controle negativo),
10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00147] Figura 23A. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhada com AR em células MCF tratadas com AR-ASO 1 durante 3 horas em 0 (controle negativo), 3, 30, 300 ou 3.000 aM.
[00148] Figura 23B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída ao salto de éxons 4-5.
[00149] Figura 23C. Dados de western blot de AR em células MCF tratadas com AR-ASO 1 durante 48 horas em 0 zM (controle negativo, isto é, N/C), 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM ou 30 aM.
[00150] Figura 24A. Dados de qPCR por SYBR Green para níveis de éxon 4-6 de AR em células MCF tratadas com AR-ASO 1 durante 5 horas em 0 (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00151] Figura 24B. Dados de qPCR por SYBR Green para níveis de éxon 4-6 de AR em células MCF tratadas com AR-ASO 5” durante 5 horas em 0 (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00152] Figura 24C. Dados de qPCR por ensaio de TaqMan para mRNA de AR em células MCF tratadas com AR-ASO 5 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 1, 10, 100, ou 1,000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00153] Figura 25A. Dados de western blot obtidos com o pêlo do sítio de injeção. NC, 1p, 10p, 100p e 1.000p referem-se ao grupo negativo de controle, grupo de tratamento de ASO de 1, 10, 100 e 1.000 pmol/Kg, respectivamente.
[00154] Figura 25B. Dados de western blot obtidos com o pêlo do sítio sem injeção. NC, 1 p, 10p, 100p e 1.000p referem-se ao grupo nePetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 124/291
35/189 gativo de controle, grupo de tratamento de ASO de 1, 10, 100 e 1.000 pmol/Kg, respectivamente.
[00155] Figura 26A. Nível de expressão de proteína de AR por grupo bem como por indivíduo no sítio de injeção (esquerda) e no sítio sem injeção (direita). (** para p < 0,01, e * para p < 0,05) [00156] Figura 26B. Nível de expressão de proteína de AR médio por grupo no sítio de injeção (esquerda) e no sítio sem injeção (direita). (** para p < 0,01, e * para p < 0,05) [00157] Figura 27A. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhada com AR em células MCF tratadas com AR-ASO 1 durante 3 horas em 0 (controle negativo), 30, 100 ou 1.000 aM.
[00158] Figura 27B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída ao salto de éxons 5.
[00159] Figura 28A. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com SCN-ASO 7 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
[00160] Figura 28B. Dados do sequenciamento de Sanger para os produtos de PCR aninhada atribuídos para o salto do éxon 4 (topo) e éxons 4-5 (base), respectivamente.
[00161] Figura 29A. Dados de qPCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com SCN-ASO 7 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00162] Figura 29B. Dados de qPCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com SCN-ASO 3 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00163] Figura 29C. Dados de qPCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com SCN-ASO 8 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10 ou 100 zM. (barra de erro por erro padrão) [00164] Figura 30A. Resultados do ensaio de CoroNa em células PC3 tratadas com SCN-ASO 7 durante 30 horas em 0 (controle ne
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36/189 gativo), 100 ou 1.000 zM.
[00165] Figura 30B. Resultados do ensaio de CoroNa em células
PC3 tratadas com SCN-ASO 3SS durante 30 horas em 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
[00166] Figura 30C. Resultados do ensaio de CoroNa em células PC3 tratadas com SCN-ASO 8 durante 30 horas em 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
[00167] Figura 31 A. Dados de eletroforese de produtos de RT-PCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com ASO 27 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, ou 100 zM.
[00168] Figura 31B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída ao salto de éxons 4-5.
[00169] Figura 31C. Dados de eletroforese de produtos de RT-PCR aninhada com SCN9A em células PC3 tratadas com ASO 27 em 0 (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 aM.
[00170] Figura 32A. Dados de qPCR de SCN9A por síntese de cDNA de uma etapa em células PC3 tratadas com SCN-ASO 27 em 0 (controle negativo), 0,1, 1 ou 10 aM durante 24 horas, (barra de erro por erro padrão) [00171] Figura 32B. Dados de qPCR de SCN9A por síntese de cDNA com hexâmero randomizado em células PC3 tratadas com SCN-ASO 27 em 0 (controle negativo), 0,1, 1 ou 10 aM durante 24 horas, (barra de erro por erro padrão) [00172] Figura 33A. Traços médios da intensidade de fluorescência celular em células L5 DRG de rato (estimuladas com ligação de L5/L6) tratadas com SCN-ASO 27 em 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
[00173] Figura 33B. Traços médios da intensidade de fluorescência celular em células L5 DRG de rato (sem ligação de L5/L6 tratadas com SCN-ASO 27 em 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
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37/189 [00174] Figura 34A. Dados de western blot para expressão de proteína Nav1.7 em células neuronais DRG (estimuladas com ligação de
L5/L6) tratadas com SCN-ASO 30 durante 24 horas em 0 (isto é, controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
[00175] Figura 34B. Corrente de sódio por ensaio de grampo de emplastro manual em células neuronais DRG (estimuladas com ligação de L5/L6) tratadas com SCN-ASO 30 durante 4 horas em 0 (controle negativo) e 100 zM. (barra de erro por erro padrão) [00176] Figura 35A. Dados de qPCR de SCN9A por síntese de cDNA de uma etapa em células neuronais L5 DRG de rato tratadas com SCN-ASO 30 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, 30, 100 ou 300 zM. (barra de erro por erro padrão) [00177] Figura 35B. Dados de qPCR de SCN9A por síntese de cDNA com hexâmero randomizado em células neuronais L5 DRG de rato tratadas com SCN-ASO 30 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 10, 30, 100 ou 300 zM. (barra de erro por erro padrão) [00178] Figura 36. Reversão da alodinía induzida por DPNP em ratos subcutaneamente administrados com veículo (PBS, controle negativo), SCN-ASO 7 100 pmol/Kg, SCN-ASO 8 100 pmol/Kg, SCNASO 21 100 pmol/Kg, SCN-ASO 35 100 pmol/Kg, SCN-ASO 36 100 pmol/Kg, ou SCN-ASO 37 100 pmol/Kg. (barra de erro por erro padrão) [00179] Figura 37A. Dados de eletrofeorese para os produtos de PCR aninhada (Método A) obtidos com tecidos musculares de camundongos mdx subcutaneamente administrados apenas com veículo (controle negativo), 1.000 pmol/Kg de DMD-ASO 1, ou 1.000 pmol/Kg de DMD-ASO 4, BID durante 3 dias.
[00180] Figura 37B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída para o salto de éxon 23.
[00181] Figura 38A. Dados de eletrofeorese para os produtos de
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POR aninhada (Método B) obtidos com tecidos musculares de camundongos mdx subcutaneamente administrados apenas com veículo (controle negativo), 1.000 pmol/Kg de DMD-ASO 1, ou 1.000 pmol/Kg de DMD-ASO 4, BID durante 3 dias.
[00182] Figura 38B. Dados do sequenciamento de Sanger para a banda do produto de PCR atribuída para o salto de éxons 21-23.
[00183] Figura 38C. Dados de eletrofeorese para os produtos de PCR aninhada (Método A) obtidos com as amostras de triceps em camundongos mdx subcutaneamente administrados com DMD-ASO 1 em 0 (controle negativo) ou 10 pmol/Kg, BID durante 5 dias.
[00184] Figura 39A. Escores de Rotarod em camundongos mdx tratados com veículo (controle negativo), 100 pmol/Kg de DMD-ASO 1 or 1.000 pmol/Kg de DMD-ASO 1. (barra de erro por erro padrão e * para p < 0,05) [00185] Figura 39B. Escores da força de aderência em camundongos mdx cronicamente administrados com DMD-ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 50 ou 200 pmol/Kg. (barra de erro por erro padrão e * para p < 0,05) [00186] Figura 40. Imagens de IHC de distrofina de tamanho natural imersas com manchamento de DAPI em tecidos musculares de camundongos mdx administrados com DMD-ASO 1 em 0 (controle negativo) ou 200 pmol/Kg, 2X por semana durante 30 semanas.
[00187] Figura 41. Níveis de expressão relativos da proteína distrofina de tamanho natural em músculos esqueléticos de camundongos mdx cronicamente administrados com DMD-ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 50 ou 200 pmol/Kg. O nível de expressão é como normalizado contra o nível de expressão em camundongos WT. (barra de erro por erro padrão, * para p < 0,05 e ** p < 0,01) [00188] Figura 42. Dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada obtidos com os músculos esqueléticos amostrados dos ca
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39/189 mundongos mdx na Semana 7.
[00189] Figura 43. Mudanças histopatológicas por Manchamento de H&E dos triceps de camundongos C57BL/6 (controle negativo dos
WT) e camundongos mdx cronicamente administrados com DMDASO 1 em 0 (controle negativo dos mdx), 10, 50 ou 200 pmol/Kg.
[00190] Figura 44A. Distâncias percorridas em esteira em camundongos C57BL/6 (controle negativo dos WT) e camundongos mdx cronicamente expostos a DMD ASO2 em 0 (controle negativo dos mdx), 10 pmol/Kg ou 30 pmol/Kg. (barra de erro por erro padrão, * para p < 0,05, “ para p < 0,01 e para p < 0,001) [00191] Figura 44B. Níveis de creatina cinase de soro em camundongos C57BL/6 (controle negativo dos WT) e camundongos mdx cronicamente expostos a DMD ASO2 em 0 (controle negativo dos mdx), 10 pmol/Kg ou 30 pmol/Kg. (barra de erro por erro padrão, para p < 0,01, e **** para p < 0,0001) [00192] Figura 44C. Níveis de mioglobina de soro em camundongos C57BL/6 (controle negativo dos WT) e camundongos mdx cronicamente expostos a DMD ASO2 em 0 (controle negativo dos mdx), 10 pmol/Kg ou 30 pmol/Kg. (barra de erro por erro padrão, *** para p < 0,001, e **** para p < 0,0001) [00193] Figura 45A. Dados de western blot sondados para distrofinas de tamanho natural em amostras de músculo esquelético de camundongos selvagens (controle negativo dos WT) or camundongos mdx cronicamente expostos a DMD-ASO 2 em 0 (controle negativo dos mdx), 10, ou 30 pmol/Kg.
[00194] Figura 45B. Níveis de creatina cinase de soro em camundongos WT (controle negativo dos WT), camundongos mdx sem tratamento com ASO, e camundongos mdx subcutaneamente administrados com 50 pmol/Kg de DMD-ASO 1, 10 pmol/Kg de DMD-ASO 2, ou 10 pmol/Kg de DMD-ASO 6, 2X por semana durante 66 semaPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 129/291
40/189 nas. (barra de erro por erro padrão e ** para p < 0,01) [00195] Figura 45C. Níveis de mioglobina de soro em camundongos WT (controle negativo dos WT), camundongos mdx sem tratamento com ASO, e camundongos mdx subcutaneamente administrados com 50 pmol/Kg de DMD-ASO 1, 10 pmol/Kg de DMD-ASO 2, ou 10 pmol/Kg de DMD-ASO 6, 2X por semana durante 66 semanas, (barra de erro por erro padrão, * para p < 0,05, e para p < 0,001) [00196] Figura 46A. Dados de eletrofeorese para os produtos de PCR aninhada de IDO-1 em células SKOV3 tratadas com IDO-ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM (diagrama esquerdo), e os dados do sequenciamento de Sanger para a banda de PCR de salto de éxon (diagrama direito).
[00197] Figura 46B. Resultados do ensaio de secreção de cinurrenina em células SKOV3 tratadas com IDO-ASO 1 em 0 zM (controle negativo) ou 10 zM a 1 fM. (barra de erro por erro padrão, e * para p < 0,05) [00198] Figura 47A. Dados de eletrofeorese para os produtos de PCR aninhada de IDO-1 em células SKOV3 tratadas com IDO-ASO 5 em 0 (controle negativo), 1,3, 10, 30 ou 100 aM.
[00199] Figura 47B. Dados do sequenciamento de Sangerpara as bandas de PCR atribuídas ao salto de éxons 2-4 e éxons 2-6.
[00200] Figura 47C. Dados de eletrofeorese para os produtos de PCR aninhada de IDO-1 em células SKOV3 tratadas com IDO-ASO 6 em 0 (controle negativo), 1,3, 10, 30 ou 100 aM (diagrama esquerdo), e dados do sequenciamento de Sanger para a banda de PCR atribuída ao salto de éxons 2-5 (diagrama direito).
[00201] Figura 48A. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhada com SNAP25 em células PC12 tratadas com 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM SNAP-ASO 3 (diagrama esquerdo), e dados do sequenciamento de Sanger para a banda de PCR para o salPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 130/291
41/189 to de éxons 5-7.
[00202] Figura 48B. Mudanças no nível de mRNA de SNAP25 de rato de tamanho natural em células PC12 tratadas com SNAP-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00203] Figura 48C. Mudanças no nível de mRNA de SNAP25 de rato de tamanho natural em células PC12 tratadas com SNAP-ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (barra de erro por erro padrão) [00204] Figura 49A. Dados de western blot de SNAP25 (diagrama de topo) e níveis de expressão de SNAP25 relativos normalizados contra β-actina (diagrama de base) em células PC12 tratadas com SNAP-ASO 3 durante 48 horas em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM ou 10 aM.
[00205] Figura 49B. Dados de western blot de SNAP25 em células PC12 tratadas com SNAP-ASO 1 em 0 (controle negativo), 0,1 ou 1 aM durante 48 horas ou durante 72 horas.
[00206] Figura 50A. Dados de western blot de SNAP25 (diagrama de topo) e níveis de expressão de SNAP25 relativos normalizados contra β-actina (diagrama de base) em células SiMa tratadas com SNAP-ASO 3 durante 48 horas em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, ou 100 aM.
[00207] Figura 50B. Mudanças no nível de mRNA de SNAP25 humano de tamanho natural em células SiMa tratadas com SNAP-ASO 3 em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, ou 100 aM. (barra de erro por erro padrão) [00208] Figura 51. Imagens de IHC de SNAP25 para as amostras de pêlo de camundongos topicamente administrados com SNAP-ASO 1 em 0 (controle negativo), 1, 10 ou 100 fM, BID durante urn periodo de 4 dias.
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42/189 [00209] Figura 52A. Análise eletroforética dos produtos de POR aninhada em células de melanoma de camundongo B16F10 tratadas com TYR-ASO 4 em 0 (controle negativo), 1, 10 ou 1.000 aM.
[00210] Figura 52B. Sequenciamento de Sanger para o produto de
POR atribuído ao salto de éxons 2-3.
[00211] Figura 52C. Mudanças no nível de mRNA de TYR de tamanho natural por qPCR em células de melanoma de camundongo de B16F10 tratadas com TYR-ASO 4 em 0 (controle negativo), 1, 10, 100 ou 1.000 aM. (barra de erro por erro padrão) [00212] Figura 53A. Dados de western blo de TYR em células B16F10 tratadas com TYR-ASO 4 durante 24 horas em 0 (controle negativo), 0,01,0,1, 1, ou 10 aM.
[00213] Figura 53B. Mudanças no teor de melanina em células de melanoma de camundongo de B16F10 tratadas com TYR-ASO 4 em 0 (controle negativo) 1, 10, 100 ou 1.000 aM, ou com 10 pg/mL ou 100 pg/mL de arbutina. (barra de erro por erro padrão, * para p < 0,05, para p < 0,01, e *** para p < 0,001) [00214] Figura 53C. Mudanças no nível de mRNA de TYR de tamanho natural por qPCR em melanócitos epiteliais primários humanos tratados com TYR-ASO 1 em 0 zM (controle negativo), 1 zM, 100 zM ou 10 aM. (barra de erro por erro padrão) [00215] Figura 54A. Análise eletroforética dos produtos de PCR aninhada em células Jurkat tratadas com PD-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100or 1,000 aM.
[00216] Figura 54B. Sequenciamento de Sanger para os produtos de PCR atribuídos ao salto do éxon 2 (esquerda) e éxon 3 (direita), respectivamente.
[00217] Figura 55A. Mudanças no nível de mRNA de PD-1 humano por qPCR aninhada em células Jurkat tratadas com PD-ASO 3” em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM. (barra de erro por erro pa
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43/189 drâo, ** para p < 0,01, e * para p < 0,05) [00218] Figura 55B. Mudanças no nível de mRNA de IL-2 humano por qPCR em células Jurkat tratadas com PD-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM. (barra de erro por erro padrão, ** para p < 0,01, e * para p < 0,05) [00219] Figura 56A. Mudanças no nível de mRNA de PD-1 humano por qPCR aninhada em células Jurkat tratadas com PD-ASO 1 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM. (barra de erro por erro padrão, e * para p < 0,05) [00220] Figura 56B. Inibição do crescimento do melanoma B16F10 em camundongos C57BL/6 subcutaneamente administrados com PDASO 2” em 2, 10, ou 50 pmol/Kg, 2X por semana, (barra de erro por erro padrão, e * para p < 0,05)
Sumário da Invenção [00221] A presente invenção fornece um derivado de ácido nucleico de peptídeo representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Figure BR112019011692A2_D0001
em que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
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Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Τι, Ϊ2, ..., Τη-ι,θΤη independentemente representam deuteride [D], híbrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
X e Y independentemente representam hídrido, formila [HC(=O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila [NíGCí-S)-·], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa hídrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino não substituído [-NH2], alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais; e pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à porção de nucleobase.
[00222] Em algumas modalidades, 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sePetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 134/291
45/189 quência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não é [(5' 3’) UUGCCUGGUAAGGA] dentro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5' 3')
UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5' 3’) UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano, [(5! -> 3’) AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano, ou [(5' > 3') UGUACAGAUUGUCU] dentro do prémRNA de tirossinase humano.
[00223] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com um sítio de junção alvo dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não compreende [(5' —> 3') UUGCCUGGUAAGGA] dentro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5' » 3’) UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5' 3') UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano, [(5' > 3') AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5' -> 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, ou [(5’ -> 3') UGUACAGAUUGUCU] dentro do prémRNA de tirossinase humano.
[00224] O composto de Fórmula I potencialmente induz o salto de éxon alvo do pré-mRNA alvo, produz variante(s) de ligação de mRNA sem o éxon alvo e, portanto, é útil para modular a atividade funcional do gene transcrevendo o pré-mRNA alvo.
Descrição da Invenção [00225] A presente invenção fornece um derivado de ácido nucleico de peptídeo representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
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B2 Brs
V 0 V 0 V o V o χ·ν'Ί···-ν>·Αν'Ί;-ν>Α η·Ι'.......Fórmula I v s, t, H i t, - << rt sn i« em que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10~mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7-mer de íntron e 7~mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, Sn-i, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn independentemente representam deuterido [D], híbrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
X e Y independentemente representam hídrido, formila [HC(-O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila (NHs-Cí-S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa hídrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não
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47/189 substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino não substituído [-Nhh], alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
Bi, 82, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais; e pelo menos quatro dentre Bi, B2, ..., Bn-1, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à porção de nucleobase.
[00226] Em algumas modalidades, 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não é [(5' -> 3') UUGCCUGGUAAGGA] dentro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5! 3')
UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5'
3’) UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano, [(5s -> 3!) AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5' > 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, ou [(5' 3') UGUACAGAUUGUCU] dentro do prémRNA de tirossinase humano.
[00227] Em algumas modalidades, 0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com um sítio de junção alvo dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não compreende [(5! -» 3!) UUGCCUGGUAAGGA] dentro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5' -» 3') UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5' 3’) UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano,
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48/189 [(5' > 3’) AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5’ 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano, ou [(5' 3’) UGUACAGAUUGUCU] dentro do prémRNA de tirossinase humano.
[00228] O composto de Fórmula I potencialmente induz o salto de éxon alvo do pré-mRNA alvo, produz variante(s) de ligação de mRNA sem o éxon alvo, e, portanto, é útil para modular a atividade funcional do gene transcrevendo o pré-mRNA alvo.
[00229] A condição adotada para descrever o composto de Fórmula I em que n é um número inteiro entre 10 e 25 literalmente afirma que n é um número inteiro selecionado dentre 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, e 24.
[00230] Foi estimado que havería 26.564 genes em todo o genoma humano. [In Silico Biol, vol 4, 387-393 (2004)] Dado que existem aproximadamente 8,8 éxons e 7,8 introns por gene, em média, existem 368.122 sítios de ligação [{(8,2 x 2) - 2} x 25.564 = 368.122] possíveis no genoma humano. Uma vez que existem 1.048.576 (isto é, 410) sequências possíveis para o pré-mRNA de 10 mer, mesmo os derivados de PNA de 10-mer mostrariam um nível de especificidade suficiente para um sítio de junção alvo. No entanto, a extremidade 5' e a extremidade 3' de cada íntron são altamente conservadas para possuir a sequência começando com [(5 > 3') | GU-] e a sequência terminando com [(5 3’) - AG| ], respectivamente, onde | significa a junção de íntron-éxon ou exon-íntron. Desse modo, o composto de Fórmula I com um comprimento de oligômero de 11-mer ou mais longo (isto é, n é um número inteiro maior que 10) está previsto para mostrar um nível suficiente de especificidade para o sítio de junção alvo.
[00231] O composto de Fórmula I liga-se firmemente ao ácido nucleico complementar como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR 2009/001256]. Por exemplo, a incorporação de 4 a 5 nucleobases moPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 138/291
49/189 dificadas (isto é, não natural de°Corrência natural) para derivados de PNA de 11 a 13 mer de Fórmula I facilmente produz um ganho de Tm de 20°C ou maior na formação de duplex com DNA complementar. O composto da presente invenção possui forte afinidade para RNA complementar como para o DNA complementar. Assim, é preferido ter o composto desta invenção seja o mais curto possível, a fim de evitar efeitos off-target indesejados, originados da ligação do referido composto a outras sequências de pré-mRNA com um número pequeno de imcompatibilidades. Assim, o comprimento de oligômero do referido composto é limitado a ser menor que 25 m.
[00232] O composto de Fórmula I é altamente sensível a um não pareamento de base única como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. Por exemplo, um não pareamento de base única resultou emu ma perda de Tm de 11 a 22°C dependendo do tipo de base modificada bem como a sequência de PNA. Devido a forte afinidade para RNA, entretanto, o composto desta invenção liga-se ainda firmemente a uma sequência de sítio de junção alvo possuindo um ou dois não pareamentos, e potencialmente induz o salto do éxon alvo.
[00233] O composto de Fórmula I liga-se firmemente a um sítio de junção 3! ou a um sítio de junção 5’ dentro de um pré-mRNA alvo, dependendo de sua sequência.
[00234] No caso do composto ligar-se a um sítio de junção 3’, o referido composto possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de 14-mer em um sítio de junção 3’ alvo consistindo em 7-mer do íntron alvo e 7-mer do éxon alvo. Desse modo, o sítio de junção 3’ é inequivocamente definido como a junção entre a extremidade 3’ do íntron alvo e a extremidade 5’ do éxon alvo.
[00235] No caso do composto ligar-se a um sítio de junção 5’, o referido composto possui pelo menos uma sobreposição complementar
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50/189 de 10-mer com uma sequência de 14-mer em um sítio de junção 5’ alvo consistindo em 7-mer do éxon alvo e 7-mer do intron alvo. Desse modo, o sítio de junção 5’ é inequivocamente definido como a junção entre a extremidade 3’ do éxon alvo e a extremidade 5’ do íntron alvo. [00236] A sequência de 14-mer descrevendo o composto de Fórmula I alvejando um sítio de junção 3’ é ilustrada com o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF1a(fator 1 indutível por hipóxia alfa) humano lido a partir do gene HIF1A humano [Sequência de Referência de NCBI: NG__029606.1]. Uma sequência de 40-mer do sítio de junção 3’ consistindo no 20-mer de íntron 1 e no 20-mer de éxon 2 lê [(5'-»3') uucuuguuguuguuaaguag | GAUAAGUUCUGAACGUCGAA], em que as sequências de íntron e éxon são denotadas por letras minúsculas e maiúsculas, respectivamente, e a junção entre íntron 1 e éxon 2 é marcada com |. Desse modo, a sequência de 14-mer do sítio de junção 3’ consistindo no 7mer do íntron de HIF-1o 1 e no 7-mer do éxon de HIF-1o 2 lê [(5'—>3') uaaguag| GAUAAGU]. Neste sítio de junção 3’, o íntron e éxon alvos são íntron 1 e éxon 2 de de HIF~1a, respectivamente.
[00237] A sequência de pré-mRNA de 40-mer acima foi fornecida inequivocamente para identificar o sítio de junção 3’ do éxon 2 no prémRNA de HIF~1a humano, visto que os números de éxon geralmente variam dependendo das transcrições de mRNA. Ao longo desta invenção, o sítio de junção alvo do referido composto de PNA é inequivocamente identificado onde aplicável, especificando simultaneamente o número de éxon alvo e uma sequência de pré-mRNA compreendendo o sítio de junção alvo.
[00238] A sequência de 14-mer descrevendo o composto de Fórmula I alvejando um sítio de junção 5’ é ilustrada com o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 2 e íntron 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano. Uma sequência de 40-mer do sítio de junção 5’ consistindo
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51/189 no 20-mer de éxon 2 e no 20-mer de intron 2 lê [(5'-->3') GAGGAAACUUCUGGAUGCUGl gugaguuauuuuacaagggu], em que as sequências de éxon e intron são denotadas por letras maiúsculas e minúsculas, respectivamente, e a junção entre éxon 2 e intron 2 és marcada com Desse modo, a sequência de 14-mer do sítio de junção 5’ consistindo no 7-mer do éxon de HIF-1a 2 e no 7-mer do ntron de HIF1a 2 lê [(5'—>3') GAUGCUG | gugaguu]. Neste sítio de junção 5’, o éxon e intron alvos são éxon 2 e íntron 2 de HIF-1a, respectivamente.
[00239] O composto de Fórmula I liga-se firmemente ao sítio de junção alvo dentro do pré-mRNA alvo, e interfere com a formação do complexo inicial de splicesome11 envolvendo o sítio de junção alvo do composto. O referido composto liga-se firmemente a um sítio de junção 3’ ou a um sítio de junção 5’ dentro do pré-mRNA alvo dependendo da sequência de nucleotídeo do referido composto. Visto que o composto desta invenção estericamente inibe a formação de complexo inicial de splicesome”, o éxon alvo é retirado para produzir a(s) variante(s) de ligação de mRNA sem o éxon alvo. Consequentemente, o composto da presente invenção potencialmente induz o salto do éxon alvo.
[00240] As estruturas químicas das nucleobases naturais (isto é, de°Corrência natural) ou não naturais (isto é, de°Corrência não natural) nucleobases adotadas para descrever o derivado de PNA de Fórmula I são exemplificadas na Figura 7. Nucleobases natural ou não naturais desta invenção compreendem, porém, não estão limitadas às nucleobases fornecidas na Figura 7. O fornecimento de tais nucleobases natural ou não naturais é para ilustrar a diversidade de nucleobases permissíveis, e, portanto, não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção às nucleobases fornecidas na Figura 7. Uma pessoa versada no campo de oligonucleotídeo pode facilmente descobrir uma nucleobase natural complementar a cada das nucleoPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 141/291
52/189 bases não naturais exemplificadas nas Figuras 7. Portanto, a pessoa versada pode inequivocamente identificar a complementaridade entre o composto de Fórmula I e uma sequência de pré-mRNA alvo.
[00241] Os substituintes adotados para descrever o derivado de PNA de Fórmula I são exemplificados na Figura 8A à Figura 8E. Figura 8A fornece exemplos para radicais alquila substituída ou não substituída. Alquilacila substituída ou não substituída, e radicais arilacila substituída ou não substituída são exemplificados na Figura 8B. Figura 8C ilustra os exemplos para alquilamino substituído, arilamino substituído, arila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, alquilfosfonila substituída ou não substituída, e radicais arilfosfonila substituída ou não substituída. Figura 8D fornece exemplos para alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, e radicais arilaminocarbonila substituída ou não substituída. Na Figura 8E, são fornecidos exemplos para alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, e radicais ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída. O fornecimento de tais substituintes exemplares é para ilustrar a diversidade de substituintes permissíveis, e, portanto, não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos substituintes exemplificados na Figura 8A à Figura 8E. Visto que uma pessoa versada no campo pode facilmente descobrir que a sequência de oligonucleotídeo é o fator primordial para ligação específica de sequência de oligonucleotídeo a uma sequência de pré-mRNA alvo sobre os substituintes no N-terminal ou C-terminal, existem substituintes mais diversos permissíveis para o referido composto desta invenção do que os substituintes exemplificados na Figura 8A à Figura 8E.
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53/189 [00242] O composto de Fórmula I possui boa permeabilidade celular e pode ser facilmente liberado na célula como oligonucleotídeo nu (isto é, sem ser formulado com adjuvante(s) para aumentar a liberação na célula) como exemplificado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. Desse modo, o composto desta invenção potencialmente induz o salto de éxon alvo no pré-mRNA alvo para produzir variante(s) de ligação de mRNA sem o éxon alvo em células tratadas com o composto de Fórmula I como oligonucleotídeo nu.
[00243] O composto de Fórmula I não requer quaisquer meios ou formulações para liberação em células para potencialmente induzir o salto de éxon alvo nas células. A este respeito, o composto da presente invenção distingue-se distintamente de outras classes de oligonucleotídeos incluindo DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'OMOE RNA, LNA, PMO, PNA, e assim por diante.
[00244] Dada a forte afinidade para o RNA e boa permeabilidade celular, o composto de Fórmula I facilmente induz o salto de éxon alvo em células com uma potência antissenso subfentomolar. Até o momento, a potência de salto antissenso subfentomolar nunca foi relatada ou realizada com outras classes de oligonucleotídeos incluindo DNA, RNA, PTO, 2’-OMe PTO, 2’-OMe RNA, 2’-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA, e assim por diante. Mesmo a potência do salto de éxon antissenso subnanomolar foi raramente documentada com outras classes de oligonucleotídeos. A potência do salto de éxon antissenso subnanomolar foi relatada com ASOs de PNA projetados para possuir um número variável de grupos fosfonato covalentemente conjugados ao N-terminal da sequência de PNA para facilitar a lipofecção para transfecção na célula. [Nucl. Acids Res. vol 30(13), 4424-4432 (2008)]. Como citado anteriormente neste documento, a potência in vitro do salto de éxon antissenso tem sido relatada como sendo nanomolar a micromolar mesmo sob condições de liberação forçada em células,
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54/189 tais como lipofecção, eletroporação, e assim por diante. A este respeito, o composto de Fórmula I é distintamente diferenciado de outras classes de oligonucleotídeo incluindo DNA, RNA, PTO, 2’-0Me PTO, 2'-0Me RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA, e assim por diante. [00245] Para que uma molécula oligonucleotídica se ligue à sua sequência complementar dentro de um pré-mRNA, a molécula necessita de ser esticada ou desdobrada para ligação complementar à sequência pré-mRNA alvo. As moléculas de oligonucleotídeo tendem a agregar ou a permanecer dobradas (por exemplo, como alfinete de cabelo) devido à sua alta propensão de formar ligações de hidrogênio intermoleculares ou intramoleculares entre as nucleobases. Assim, havería barreira de energia adicional de desdobramento contra o salto de éxon antissenso com oligonucleotídeos investigados popularmente incluindo DNA, RNA, PTO, 2’-OMe PTO, RNA 2'~OMe, RNA 2'~OMOE, LNA, PMO, PNA e assim por diante. Os oligonucleotídeos foram convencionalmente quantificados por aborção UV após uma incubação a > 90°C em tampão aquoso para desdobrar as moléculas de oligonucleotídeo tanto quanto possível.
[00246] O derivado de PNA de Fórmula I possuí cargas positivas múltiplas distribuídas ao longo de todo filamento de oligonucleotídeo em pH fisiológico devido a vários grupos amino básicos ligados covalentemente às nucleobases modificadas nos mesmos. As cargas positivas múltiplas permitem que o composto de Fórmula I permaneça desdobrado ou esticado devido à repulsão eletrostática entre cargas positivas vizinhas no mesmo filamento de oligonucleotídeo. O derivado de Fórmula I tem uma baixa propensão para agregar com outra(s) molécula(s) de Fórmula I. Assim, o composto de Fórmula I tende a permanecer estruturalmente pronto (isto é, esticado) para ligação complementar à sequência alvo dentro do pré-mRNA alvo. A prontidão estrutural é também importante para o oligonucleotídeo de fórmula I
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55/189 alinhar rapidamente com a sequência de pré-mRNA alvo, uma vez que o pré-mRNA alvo está sendo transcrito a partir do DNA. Desse modo, a prontidão estrutural combinada com a forte afinidade é considerada adicionar-se à forte afinidade de ligação para produzir a potência do salto de éxon antissenso subfentomolar do composto de Fórmula L Nestes aspectos, o composto de Fórmula I é altamente diferenciado de outras classes de oligonucleotídeo incluindo DNA, RNA, PTO, 2'OMe PTO, 2'-0Me RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA, e assim por diante.
[00247] Devido à boa permeabilidade celular, o derivado de PNA de Fórmula I pode ser administrado sistemicamente como oligonucleotídeo nu para potencialmente induzir o salto do éxon no(s) tecido(s) alvo(s). O composto de Fórmula I não requer uma formulação ou um adjuvante para aumentar a liberação no tecido alvo para eliciar a atividade terapêutica desejada. O composto de Fórmula I é dissolvido simplesmente em PBS (solução salina tamponada com fosfato) ou solução salina, e administrado sistemicamente para eliciar sem esforço a atividade terapêutica no(s) tecido(s) alvo(s).
[00248] Dada com a potência subfentomolar do salto de éxon em células tratadas como oligonucleotídeo nu, o derivado de PNA da presente invenção apresenta atividade terapêutica in vivo frequentemente a uma dose sistêmica de 1 pg/kg ou inferior. Uma tal potência terapêutica forte nunca foi realizada com outras classes de oligonucleotídeo incluindo DNA, RNA, PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'OMOERNA, LNA, PMO, PNA, e assim por diante. Como o custo de fabricação do oligonucleotídeo é geralmente muito alto, a potência ultra-forte é uma grande vantagem para a obtenção de um custo de tratamento permissível, especialmente para pacientes com uma doença crônica. A este respeito, o composto de Fórmula I é altamente diferenciado de outras classes de oligonucleotídeo incluindo DNA, RNA,
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PTO, 2'-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA e assim por diante.
[00249] Devido à boa permeabilidade celular, o derivado de PNA da presente invenção é facilmente administrado topicamente ou transdermicamente para induzir a atividade terapêutica no sítio de administração. O composto desta invenção não necessita de ser formulado de forma intensiva ou invasiva para eliciar a atividade terapêutica tópica pretendida. O derivado de PNA de Fórmula I é facilmente liberado transdermicamente como oligonucleotídeo nu. Devido à potência de salto de éxon ultra-forte, o referido composto mostra atividade terapêutica após administração tópica ou transdérmica de uma solução de oligonucleotídeo subpicomolar. A liberação tópica ou transdérmica como oligonucleotídeo nu tem sido extremamente desafiante com outras classes de oligonucleotídeos incluindo DNA, RNA, PTO, 2’-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA e assim em. A este respeito, o composto de Fórmula I é distintamente diferenciado de outras classes de oligonucleotídeos incluindo DNA, RNA, PTO, 2s-OMe PTO, 2'-OMe RNA, 2'-OMOE RNA, LNA, PMO, PNA e assim por diante.
[00250] O composto de Fórmula I pode ser usado como combinado com um ácido ou base farmaceuticamente aceitável incluindo, porém, não limitado a hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ácido clorídrico, ácido metanossulfônico, ácido cítrico, ácido trifluoroacético e assim por diante.
[00251] O derivado de PNA de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser administrado a um indivíduo em combinação com um adjuvante farmaceuticamente aceitável incluindo, porém, não limitado a ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido tartárico, ácido esteárico, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etanol, isopropanol, bicarbonate de sódio, água destilada, conservante(s), e assim por
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57/189 diante.
[00252] O composto da presente invenção pode ser administrado sistemicamente a um indivíduo com uma dose terapeutícamente eficaz na faixa de 1 fmol/kg a superior a 1 nmol/kg, que pode variar dependendo do horário de dosagem, condições ou situações do indivíduo, e assim por diante. O composto da presente invenção pode ser administrado topicamente a um indivíduo em uma concentração terapeuticamente eficaz variando de 1 aM a superior a 1 nM, que pode variar dependendo do horário de dosagem, condições ou situações do indivíduo, e assim por diante.
[00253] Preferido é um derivado de PNA de Fórmula ί, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
©2 A Brs
-ί-AλV-À ('......% A AL Fónnula I < | 4 h i ί h í 4 h ! 4
L §2 ’2 At Sn In em que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10~mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7-mer de íntron e 7~mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, Sn-ί, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn independentemente representam deuterido, hídrido, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
X e Y independentemente representam hídrido, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substitu
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58/189 ida, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiioxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, radical alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa hídrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino não substituído, alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
Bi, 82, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula IH, ou Fórmula IV:
Rí
Si H;: rf
Figure BR112019011692A2_D0002
Figure BR112019011692A2_D0003
Figure BR112019011692A2_D0004
Fórmula II
Fórmula III
Fórmula IV em que,
R1, R2, Rs, R4, Rs e Rs são independentemente selecionaPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 148/291
59/189 dos dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Li, L.2 e Ls são um ligador covalente representado por Fórmula V covalentemente ligando o grupo amino básico à porção de nucleobase:
Figure BR112019011692A2_D0005
Fórmula v em que,
Qi e Qm são metileno substituído ou não substituído (-CH2-) radical, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, .... e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-O-), enxofre (-S-), e radical amino substituído ou não substituído [-N(H)-, ou N(substituinte)-]; e m é um número inteiro entre 1 e 15.
[00254] As nucleobases não naturais de Fórmula II, Fórmula III e Fórmula IV são equivalentes à citosina, adenina, e guanina, respect!vamente, para emparelhamento de base complementar com 0 prémRNA como ilustrado na técnica anterior [PCT/KR2009/001256]. [00255] A condição adotada para descrever a FórmulaV em que m é um número inteiro entre 1 e 15 literalmente afirma que n é um número inteiro selecionado dentre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, e 14.
[00256] De interesse é um oligomero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Bz Ba-i Bn (X J Os J cu ,J J
Ύ ρ Y ο Ύ o Y o
S'Ύ W·/» l- '[μ* ΥΝ·-'Ι->Ύ-ζ Fórmula I U, t, Ύ 4 H h S. í em que, n é um número inteiro entre 11 e 23;
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60/189 o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, Sn-1, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam hídrido, aminocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula HI, ou Fórmula IV;
Ri, R2, Rs, R4, Rs e Re são independentemente selecionados dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são radical metileno substituído ou não substituído, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno substituído ou não substituído, oxigênio, e radical amino; e m é um número inteiro entre 1 e 11.
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61/189 [00257] De interesse particular é um derivado de PNA de Fórmula
I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Si £>2
J J O.. .-s cx ,J •’γ O '/ O Ο Ύ O
X..,..--4 --------ll ^xÃ<,-N -'fr'· Z-.v Fórmula I
- r 1- f Mt lr γ n r -T Z. rornw
Y s, ‘h s2 Ϊ2 s)v1 TB.t d sn % em que, n é um número inteiro entre 11 e 21;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, .... Sn-ι, Sn, Ti, T2, Tn-ι, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam hídrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, ..., Bn-1, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula HI, ou Fórmula IV;
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62/189
Ri, R2, Rs. R4. Rs e Re são independentemente selecionados dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Ch, .... e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno, oxigênio, e radical amino; e m é um número inteiro entre 1 e 11.
[00258] De maior interesse é um oligomero de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Sa.5 Bn
J Os J J Os J toqA-VVV'n (' A2 fórmula , em que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo;
S1, S2, .... Sn-i, Sn, Ti, T2, ..... Tn-ι, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam hídrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
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63/189 mesmo:
Bi, B2. ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
R1, R3i e Rssão radical híbrido, e R2, R4, e Re independentemente representam hídrído, ou radical alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre radical metileno e oxigênio; e m é um número inteiro entre 1 e 9.
[00259] De maior interesse é um derivado de PNA de Fórmula I, ou um x, em n é um número inteiro entre 12 e 19;
composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo;
Si, S2, ..., Sn-i, Sn, Τι, T2, Tn-ι, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam alquilacila substituíÒ, γ Fórmula I λ
Tj que,
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64/189 da ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou radical alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, 82, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco dentre B1, Bs, ..., Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula HI, ou Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são radical híbrido;
Q1 e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Qs, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre radical metileno e oxigênio; e m é um número inteiro entre 1 e 9.
[00260] De maior interesse é um derivado de PNA de Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
B5? Bn
O.v J zx 0« 4 ...
-y o i-AAi-...... u 'T V
ViÂAr 4: A A.., í l·' r Fórmula i
+ +< H 1, 1, M 1 ; H i +.
em que, n é um número inteiro entre 12 e 18;
composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com a sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro do pré-mRNA alvo;
composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo;
Si, S2, Sn-1, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn são radical híbrido;
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X é radical híbrido;
Y representa alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou radical alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2. ..., Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
Ri, R2, R3, R4, Rs, e Re são radical híbrido;
Li representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, -CH2~O-(CH2)5~, -CH2-O-(CH2)6-, ou -ch2-o~ (CH2)7- com a extremidade direita é diretamente ligado ao grupo amino básico; e
L2 e L.3 são independentemente selecionados dentre (CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2O-(CH2)2-, -(CH2)3~O-(CH2)2~, e ~(CH2)2-O~(CH2)3- com a extremidade direita é diretamente ligado ao grupo amino básico.
[00261] O composto de Fórmula I pode ser abreviado como descrito na técnica anterior [PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253]. Fornecidos são exemplos de tais abreviações usadas para descrever os derivados de PNA de Fórmula I direcionando 0 sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1o humano lido a partir do gene HIF1A humano (Sequência de Referência de NCBI: NG 029606.1):
(N C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)~TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N > C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N -4 C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O3)-TA(5)-NH2;
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66/189 (N -> C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TOC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N -> C) PiV“CA(5)G“AA(5)C-TTA(5)“TCC(1O2)TA(5)-NH2;
(N -+ C) Benzoil-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N -> C) n-Propil-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2;
(N -> C) Benz!l-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N C) p-Toluenossulfonil~CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)~TCC(1O2)TA(5)-NH2;
(N C) [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)TCC(1O2)~TA(5)-NH2;
(N -> C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TALys-NH2;
(N > C) ΝΤοηίμΝ4ν1β~ΟΑ(5)6-ΑΑ(5)Ο-ΤΤΑ(5)~ΤΟΟ(1Ο2)-·ΤΑ(5)-·Ιν'5NH2;
(N -> C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C~TTA(5)-TCC(1O2)~TA(5)~Lys~NH2;
(N > C) FAM-HEX-OA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCO(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N -> C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N C) FethoCArg~GA(5)A”C(1O2)TT~A(5)TG~CTA(5)~C(1O2)TGly~ NH2;
(N -> C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-LysNH2;
(N > C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)CNH2; e (N -> C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T-A(6)CTTA(6)NH2:
em que,
A, G, T, e C são monômeros de PNA com uma nucleobase natural de adenlna, guanina, timina, e citosina, respectivamente;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq) são monômeros de PNA com uma nucleobase não natural representada por Fórmula VI,
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Fórmula VII, Fórmula VIII, Fórmula IX, e Fórmula X, respectivamente:
O— (4¾
F~NH
Figure BR112019011692A2_D0006
Figure BR112019011692A2_D0007
Figure BR112019011692A2_D0008
NH;;
Fórmula VI
Fórmula VII
Fórmula VII o
Figure BR112019011692A2_D0009
Figure BR112019011692A2_D0010
nh2
Q “'(CHjP
Fórmula IX
Fórmula X em que, p e q são números inteiros; e as abreviaturas para os substituintes de N- e C-terminais são especificamente definidas como segue: Fmoc- é a abreviatura para ”[(9-fluorenil)metilóxi]carbonil·; Fethoc- para ”[2-(9~fluorenil)etil~ 1-óxi]carbonila; Ac- para acetil-; Benzoil- para benzenocabonii-; Piv- para pivalil-; n~Propil· para ss 1 -(n-propil)-; Ή- para grupo hídrido-; p-Toluenossulfonila para (4~metilbenzeno)“1-sulfonil·; -Lys para resíduo de aminoácido lisina; -Vai- para resíduo de aminoácido valina; -Leu- para resíduo de aminoácido leucina; ”-Arg~ para resíduo de aminoácido arginina”; -Gly- para resíduo de aminoácido glicina; [N-(2-Feniletil)amino]carbonil· para [N-1 -(2-feniletil) amino] carbonil-; Benzil· para 1-(feni!)metil-; Fenil· para fenil·; Me~ para metil-; -HEX- para 6-amino-1-hexanoil·; FAM- para 5, ou 6fluorescein-carbonil- (mistura isomérica); e -NH2 para grupo -amino não substituído.
[00262] Figura 9 coletivamente fornece as estruturas químicas para os monômeros de PNA abreviados como A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), e G(pOq). Como discutido na técnica anterior [PCT/KR
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2009/001256], C(pOq) é considerado como um monômero de PNA modificado equivalente à citosina devido à sua hibridização preferida para guanina. A(p) e A(pOq) são empregados como monômeros de PNA modificados agindo como adenina por sua estreita afinidade com timina. Da mesma forma, G(p) e G(pOq) são considerados monômeros de PNA modificados equivalentes à guanina devido ao seu emparelhamento de base produtiva com citosina.
[00263] Figura 10 inequivocamente fornece as estruturas químicas para uma variedade de abreviaturas para substituintes usados para diversificar o N-terminal ou C-terminal do derivado de PNA de Fórmula I nesta invenção. O fornecimento dos grupos N-terminal ou Cterminal na Figura 10 como exemplos é para ilustrar a diversidade de substituintes permissíveis para o N-terminal ou C-terminal do derivado de PNA de Fórmula I, e, portanto, não deve ser interpretado para limitar o escopo dos grupos N-terminal ou C-terminal para o composto desta invenção. Uma pessoa versada na técnica pode facilmente descobrir que a sequência de oligonucleotídeo é o principal contribuinte para a interação específica de sequência com a sequência de prémRNA alvo.
[00264] Para ilustrar as abreviaturas adotadas para tais derivados de PNA, a estrutura química para um derivado de PNA de 14-mer abreviado como (N-»C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)C(1O2)T-NH2ss é fornecida na Figura 11.
[00265] Como outra ilustração, a estrutura química para um derivado de PNA de 15-mer abreviado como (N -* C)Fmoc-Val-CTC(1O2)A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2 é fornecida na Figura 12.
[00266] O composto de Fórmula I deve cumprir a exigência de possuir pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer consistindo em 7~ mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo. Se o
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69/189 composto de Fórmula I direciona, por exemplo, o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano, o sítio de junção 3’ é inequivocamente definido pela sequência de pré-mRNA de HIF-1o humana de 30-mer de [(5'—>3') guuguuguuaaguag| GAUAAGUUCUGAACG]. Em seguida, a sequência de 14-mer do sítio de junção 3’ de HIF-1a alvo lê [(5’-->3’) uaaguag | GAUAAGU].
[00267] Um HIF-1a ASO de 15-mer com uma sequência de (N -» C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)C-NH2 é equivalente à sequência de DNA de (5'—> 3') CAG-AAC-TTA-TCC-TAC para ligação complementar ao pré-mRNA de HIF-1o humano. O ASO de 15-mer tem uma sobreposição complementar de 15-mer (isto é, completamente complementar) com o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 30-mer de [(5’~—>3) quuguuquuaaquaq | GAUAAGUUCUGAACG]· O ASO de PNA possui uma sobreposição complementar de 11-mer (isto é, 4-mer de íntron 1 e 7-mer de éxon 2) com a sequência de pré-nRNA de HIF-1a de 14mer de [(5'-»3') uaaguag | GAUAAGU]. Desse modo, o ASO de PNA de HIF-1a de 15-mer encontra as condições da sobreposição complementar requerida para o composto de Fórmula I.
[00268] Outro ASO de HIF~1a de 15-mer com uma sequência de (N C) Fethoc-CTO(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 !! é equivalente à sequência de DNA de (5'—> 3’) CTC-ATC-CTA-CTTAAC para ligação complementar ao pré-mRNA de HIF-1a. O ASO de PNA de 15-mer possui um único não pareamento com o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 1 e éxon 2 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de HIF-1a de 30-mer de [(5'—->3’) quuquuquuaaquaq | GAU!!AAGUUCUGAACG1, em que o único não pareamento é marcado com um sinal de aspas (). O PNA de 15-mer possui uma sobreposição complementar de 12-mer com a
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70/189 sequência de sítio de junção 3’ de 14~mer adotada para descrever ο composto de Fórmula I marcado como negrito e sublinhado em [(5'—>3') uaaguag | GAUAAGU1, em que o único não pareamento é marcado com um sinal de aspas ( ). Apesar do único não pareamento, o ASO de HIF-1a de 15-mer encontra as condições da sobreposição complementar requerida para o composto de Fórmula I.
[00269] No caso do composto de Fórmula I alvejar, por exemplo, o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 4 e intron 4 no prémRNA de SCN9A humano, o sítio de junção 5’ é inequivocamente definido pela sequência de pré-mRNA de SCN9A humano de 30-mer de [(5’ —> 3’) CGUCAUUGUUUUUGC| guaaguacuuucagc] lido a partir do gene SCN94 humano (acessado de Sequência de Referência de NCBI: NC 000002.12). Em seguida, a sequência de 14-mer do sítio de junção 5’ de SCN9A alvo lê [(5'-*3!) UUUUUGC| guaagua].
[00270] Um ASO de SCN9A de 16-mer com uma sequência de (N -> C) Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)NH2 é equivalente à sequência de DNA de (5'-* 3') ACT-TAC-GCAAAA-ACA-A para ligação complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano. O PNA de 16-mer possui uma sobreposição complementar de 16-mer (isto é, completamente complementar) com 0 sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 4 e intron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de prémRNA de SCN9A de 30-mer de [(5’ -> 3') CGUCAUUGUUUUUGC | guaaguacuuucagc]. O ASO de SCN9A de 16-mer possui uma sobreposição complementar de 13-mer com a sequência de sítio de junção 5’ de 14-mer marcado como negrito e sublinhado em [(5' > 3') UUUUUGC | guaaqual. O ASO de SCN9A de 16-mer encontra as condições da sobreposição complementar requerida para 0 composto de Fórmula I.
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Descrição Detalhada da Invenção
Procedimentos Gerais para Preparação de Oligômeros de PNA [00271] Oligômeros de PNA foram sintetizados por síntese de peptídeo em fase sólida (SPPS) com base na química de Fmoc de acordo com o método descrito na técnica anterior [US 6.133.444; WO96/40685] ou com pequenas modificações. O suporte sólido usado nesta invenção foi Η-Rink Amlde-ChemMatrlx adquirido de PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada). Os monômeros de Fmoc~PNA com uma nucleobase modificada foram sintetizados como descrito na técnica anterior [PCT/KR 2009/001256] ou com pequenas modificações.
[00272] As estruturas químicas dos monômeros de Fmoc~PNA com uma nucleobase modificada usada nesta invenção são apresentadas na Figura 13. Os monômeros de Fmoc-PNA fornecidos na Figura 13 devem ser empregados como exemplos e, por conseguinte, não devem ser empregados para limitar o escopo da presente invenção. Uma pessoa versada no campo pode facilmente descobrir que um grande número de variações nos grupos protetores, por exemplo, são possíveis para tais monômeros de Fmoc-PNA usados para sintetizar o derivado de PNA de Fórmula I.
[00273] Os oligômeros de PNA foram purificados por HPLC de fase reversa em Cie (água/acetonitrila ou água/metanol com 0,1% de TFA) e caracterizados por espectrometria de massa incluindo MALDITOF/MS e ESI-TOF/MS.
[00274] A Figura 14 fornece um ciclo de alongamento de monômero típico adotado na SPPS desta invenção, e os detalhes sintéticos são fornecidos como abaixo. Para uma pessoa versada no campo, no entanto, deve haver muitas pequenas variações obviamente possíveis para executar tais reações de SPPS em um sintetizador de peptídeo automático ou sintetizador de peptídeo manual. As etapas de reação envolvidas da SPPS são fornecidas abaixo como procedimentos de
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72/189 reação exemplares.
Ativação da Resina de H-Rink-ChemMatrix [00275] 0,01 mmol (aproximadamente 20 mg de resina) da resina
ChemMatrix em 1,5 mL de 20% de piperidina/dimetilformamida (DMF) foi vortexado em um tubo de libras durante 20 min e a solução de reação foi filtrada. A resina foi lavada durante 30 segundos cada em série com 1,5 mL de cloreto de metileno (MC), 1,5 mL de DMF, 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC. As aminas livres resultantes no suporte sólido foram submetidas ao acoplamento com um monômero de Fmoc-PNA ou com um derivado de aminoácido protegido com Fmoc.
DeFmoc [00276] A resina foi vortexada em 1,5 mL de 20% de piperidina/DMF durante 7 min, e a solução de DeFmoc foi filtrada. A resina foi lavada durante 30 segundos cada em série com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF, 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC. As aminas livres resultantes no suporte sólido foram imediatamente submetidas a acoplamento com um monômero de Fmoc-PNA.
Acoplamento com Monômero de Fmoc-PNA [00277] As aminas livres no suporte sólido foram acopladas com um monômero de Fmoc-PNA como segue. 0,04 mmol de um monômero de Fmoc-PNA, 0,05 mmol de HBTU [hexafluoro-fosfato de 2-(1/7benzotriazol-1-11)-1,1,3,3-tetrametilurio] e 10 mmol de DIEA (N,Ndiisopropiletilamina) foram incubados por 2 min em 1 mL de DMF anidrosa, e adicionados à resina com aminas livres. A solução de resina foi vortexada durante 1 hora e o meio de reação foi filtrado. Em seguida, a resina foi lavada durante 30 segundos cada em série com 1,5 mL de MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC.
Tamponamento [00278] Após a reação de acoplamento, as aminas livres não reagiPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 162/291
73/189 das foram tamponadas por agitação durante 5 min em 1,5 mL de solução de tamponamento (5% de anidrido acético e 6% de 2,6-leutidina em DMF). Em seguida, a solução de tamponamento foi filtrada e a resina foi lavada durante 30 segundos cada em série com 1,5 mL de
MC, 1,5 mL de DMF e 1,5 mL de MC.
Introdução de Radical Fethoc-” em N-Terminal [00279] O radical Fethoc- foi introduzido no N-terminal reagindo as aminas livres na resina com Fethoc-OSu sob condições de acoplamento básicas usuais. A estrutura química de Fethoc-OSu [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351,36] é fornecida como segue.
Figure BR112019011692A2_D0011
Clivaqem da Resina [00280] Os oligômeros de PNA ligados à resina foram clivados da resina por agitação da resina durante 3 horas em 1,5 mL de solução de divagem (2,5% de tri-isopropilsilano e 2,5% de água em ácido trifluoroacético). A resina foi filtrada e 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida ou por sopragem de gás nitrogênio sobre a solução. O resíduo resultante foi triturado com éter dietílico e 0 precipitado resultante foi recolhido por filtração para purificação por HPLC de fase reversa.
Análise e Purificação por HPLC [00281] Após a divagem da resina, 0 produto bruto de PNA foi purificado por HPLC de fase reversa em Cw eluindo água/acetonitrila ou água/metanol (método de gradiente) contendo 0,1% de TFA. A Figura 15A e a Figura 15B são cromatogramas de HPLC exemplares para HIF-ASO 1 antes e após a purificação por HPLC, respectivamente. A sequência de oligômero de HIF-ASO 1 é fornecida na Tabela 1.
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Exemplos Sintéticos para Derivados de PNA de Fórmula I [00282] Os derivados de PNA foram preparados de acordo com os procedimentos sintéticos acima com ou sem pequenas modificações. Os derivados de PNA desta invenção foram projetados para alvejar um sítio de junção dentro de um pré-mRNA incluindo, porém, não limitado ao pré-mRNA de HIF-1a humano ou de camundongo, o pré-mRNA do receptor de andrógeno (AR) humano ou de camundongo, o pré-mRNA de SCN9A humano ou rato, o pré-mRNA de distrofina de camundongo, o pré-mRNA de tirossinase humano ou de camundongo, o pré-mRNA de SNAP25 humano ou de camundongo, o pré-mRNA de IDO1 humano, o pré-mRNA de PD-1 humano ou de camundongo, e assim por diante. O fornecimento de tais derivados de PNA direcionando um sítio de junção para vários pré-mRNAs é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção àqueles sítios de junção alvo citados como exemplos.
[00283] A Tabela 1 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano, juntamente com dados de caracterização estruturais por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de HIF-1a na Tabela 1 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos derivados de PNA especificados na Tabela 1.
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Tabela 1. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3! abrangendo a junção do íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
PNA Sequência de PNA (N -> C) Massa Exata, m/z
T eóricaa Observada11
HIF-ASO 1 Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4486,05 4486,04
HIF-ASO 2 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4473,99 4474,02
HIF-ASO 3 Fethoc-G(5)AA(5)-CTT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2 4462,03 4462,07
HIF-ASO 4 Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-CT-NH2 4376,94 4376,99
HIF-ASO 5 Fethoc-G(5)AA(6)-CTT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)T-NH2 4504,07 4504,09
HIF-ASO 6 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-TA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2 5393,47 5393,44
HIF-ASO 7 Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(102)TT-AA(6)C-NH2 4784,18 4784,14
HIF-ASO 8 Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2 4727,13 4727,79
HIF-ASO 9 Piv-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-A(5)AC-NH2 3695,73 3695,74
HIF-ASO 10 Piv-Lys-AA(6)C-TTA(6)-TCC(1O2)-TA(6)C-TTA(5)-Val-NH2 4844,33 4844,33
HIF-ASO 11 Fethoc-A(6)GA-A(6)CT-CA(6)T-CC(1O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2 5448,54 5448,50
HIF-ASO 12 H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-T CC(1O3)-TA(5)-NH2 4263,98 4263,99
HIF-ASO 13 Benzoil-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4441.06 4441,06
HIF-ASO 14 n-Propil-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2 4306,03 4306,05
HIF-ASO 15 p-Toluenossulfonil-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4405,95 4405,90
HIF-ASO 16 [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2 4426,06 4426,08
HIF-ASO 17 Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2 4984,44 4984,46
HIF-ASO 18 N-Fen!l-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2 4468,11 4468,14
75/189 a)massa exata teórica;b) massa exata observada
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76/189 [00284] A Figura 15A é um cromatograma de HPLC obtido com um produto bruto de HIF-ASO 1. O produto bruto foi purificado por HPLC preparatória de Cis-RP. A Figura 15B é um cromatograma de HPLC para um produto purificado de HIF-ASO 1. A pureza de HIF-ASO 1 melhorou marcadamente após a purificação por HPLC preparatória. A Figura 16 fornece um espectro de ESI-TOF/MS obtido com o produto purificado de HIF-ASO 1. O fornecimento dos dados de análise para HIF-ASO 1 é para ilustrar como os derivados de PNA de Fórmula I foram purificados e identificados na presente invenção, e não devem ser interpretados para limitar o escopo desta invenção.
[00285] A Tabela 2 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de HIF-1a humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de HIF-1o na Tabela 2 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de HIF-1o especificados na Tabela 2. Tabela 2. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de HIF~1a humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N -> C) Massa Exata, m/z
teórica3 observada0
HIF-ASO 19 Fethoc-TA(5)G-TTC(1O2)~A(5)AA(5)- CTG(6)-TA(5)A-NH2 4915,27 4915,26
HIF-ASO 20 Fethoc-TA(5)G-TTC(1O2)~A(5)AA(5)- CTG(6)-CA(5)A-NH2 4900,27 4900,29
a) massa exata teórica;b) massa exata observada [00286] A Tabela 3 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 5 e do íntron 5 no pré-mRNA do receptor de andrógeno humano (AR) lido a
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77/189 partir do gene AR humano (acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC__000023.11), juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de AR na Tabela 3 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de AR especificados na Tabela 3.
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Tabela 3. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon e do intron 5 no pré-mRNA de AR humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teórica8 observada11
AR-ASO 1 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4257,90 4257,92
AR-ASO 2 Fethoc-TC(1O2)C-TTA(6)-CCA(6)-GGC(1O2)-AA(6)G-G(6)-NH2 5207,37 5207,42
AR-ASO 3 Fethoc-TC(1O2)C-TTA(5)-CCA(5)-GGC(1O2)-AA(5)G-G(6)-NH2 5165,32 5165,31
AR-ASO 4 Fethoc-TA(5)C-CAG(6)-GC(1O2)A-A(5)GG(6)-C-NH2 4283,97 4283,96
AR-ASO 5 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2 3968,85 3968,86
AR-ASO 6 Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(6)GG(6)-CA(5)A-NH2 3982,86 3982,88
AR-ASO 7 Ac-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG(6)-CA(5)A-NH2 3774,77 3774,83
AR-ASO 8 Fethoc-C(1O2)TT-A(6)CC-A(6)GG(6)-CA(6)A-NH2 4010,89 4010,93
AR-ASO 9 H-CTT-A(5)C(1O3)C-A(5)G(3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4092,89 4092,90
AR-ASO 10 Benzoil-CTT-A(5)C(1O5)C-A(5)G(2O2)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4254,96 4254,99
AR-ASO 11 n-Propil-CTT-A(5)C(2O2)C-A(3)G(2O3)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4150,93 4150,93
AR-ASO 12 p-Toluenossulfonil-CTT-A(5)C(1O2)C-A(8)G(5)G-C(1O2)AA(5)-G-NH2 4302,96 4302,90
AR-ASO 13 Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)C(1O2)C-A(2O2)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys- nh2 4629,16 4629,16
AR-ASO 14 Fethoc-CTT-A(5)C(1O2)C-A(5)GT-C(1O2)TA(5)-G-NH2 4223,88 4223,93
AR-ASO 15 N-Fenil-N-Me-CTT-A(5)C(102)C-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-Lys-NH2 4239,96 4240,00
78/189 a) massa exata teórica;b) massa exata observada [00287] A Tabela 4 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 4 e intron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano (subtipo de canal de sódio 9A) lido a partir
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 168/291 do gene SCN9A humano (acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC 000002.12) juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de SCN9A na Tabela 4 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs especificados na Tabela 4.
Tabela 4. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 4 e do intron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teórica8 observada0
SCN-ASO 1 Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4640,19 4640,88
SCN-ASO 2 FAM-HEX-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4887,24 4887,40
SCN-ASO 3 Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4652,20 4652,24
SCN-ASO 4 Fethoc-TG(6)T-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 5574,61 5574,57
SCN-ASO 5 Fethoc-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(5)-ACA(5)-A-NH2 4261,98 4262,00
SCN-ASO 6 Fethoc-TA(6)C-GC(1O2)A-A(6)AA(6)-ACA(6)-A-NH2 4318,05 4318,17
SCN-ASO 7 Fethoc-AC(102)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH2 5250,53 5250,46
SCN-ASO 8 Fmoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)AC-A(5)A-NH2 5539,61 5539,57
SCN-ASO 9 Pív-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 4500,17 4499,80
SCN-ASO 10 FAM-HEX-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2 3970,82 3974,17
SCN-ASO 11 Fmoc-TA(6)A-A(5)TA(6)-CGC(1O2)-AA(6)A-AA(6)C-A(6)-NH2 5334,57 5335,59
SCN-ASO 12 Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH2 4975,34 4975,34
79/189
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 169/291
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teóricaa observada”
SCN-ASO 13 H-CTT-A(5)CG(3)~ C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O3)AA(5)-NH2 4711,22 4711,25
SCN-ASO 14 Benzoil-CTT-A(5)CG(2O2)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O5)AA(5)-NH2 4873,30 4873,32
SCN-ASO 15 n-Propil-CTT-A(5)CG(2O3)-C(1O2)AA(3)-AA(5)A-C(2O2)AA(5)-NH2 4769,27 4769,30
SCN-ASO 16 p-Toluenossulfonil-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(8)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-NH2 4935,32 4935,29
SCN-ASO 17 [N-(2-Feniletil)amino]carbonil-CTT-A(5)CG(6)-C(102)AA(2O2)-AA(5)A-C(102)A A(5)-NH2 4888,31 4888,32
SCN-ASO 18 Fethoc-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)TA(5)-AA(5)T-C(1O2)AA(5)-NH2 4957,32 4957,32
SCN-ASO 19 Fethoc-Lys-Leu-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(4)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH2 5330,60 5330,60
SCN-ASO 20 N-Fen!l-N-Me-CTT-A(5)CG(6)-C(1O2)AA(5)-AA(5)A-C(1O2)AA(5)-Lys-NH2 4957,40 4957,42
al massa exata teórica;b) massa exata observada
80/189 [00288] A Tabela 5 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de SCN9A na Tabela 5 é para exemplificar os derivados de PNA da Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de SCN9A fornecidos na Tabela 5.
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 170/291
Tabela 5. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N -> C) Massa Exata, m/z
teóricaa observada0
SCN-ASO 21 Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2 5398,60 5398,58
SCN-ASO 22 Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2 4282,97 4283,00
SCN-ASO 23 Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2 4182,87 4182,89
SCN-ASO 24 Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2 4282,97 4283,00
SCN-ASO 25 Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2 4281,98 4282,05
SCN-ASO 26 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2 4369,06 4369,08
SCN-ASO 27 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2 4620,16 4620,14
SCN-ASO 28 Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2 4345,56 4345,08
SCN-ASO 29 Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2 4676,22 4676,25
SCN-ASO 30 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2 4660,16 4660,15
SCN-ASO 31 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2 4895,27 4895,20
SCN-ASO 32 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2 4951,27 4951,26
SCN-ASO 33 Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2 5146,37 5146,35
81/189 a) massa exata teórica;massa exata observada [00289] A Tabela 6 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando um sítio de junção específico no pré-mRNA de SCN9A humano ou de rato, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectroPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 171/291 metria de massa. O fornecimento dos ASOs SCN9A na Tabela 6 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula E, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de SCN9A especificados na Tabela 6.
Tabela 6. Derivados de PNA complementarmente direcionando um sítio de junção específico (SS) no pré-mRNA de SCN9A humano ou de rato, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Espécies Sítio Alvo3 Sequência de PNA (N —> C) Massa Exata, m/z
teórica3 observada3
SCN-ASO 34 Humana 5' SS de Exon 2 Fethoc-GA(5)T-A(5)TG-A(5)GT-G(6)TA(5)-C(1O2)TA(5)-A-NH2 5346,49 5346,46
SCN-ASO 35 Rato 5' SS de Exon 2 Fethoc-GA(5)T-A(5)TG-A(5)GT-G(6)CA(5)-C(1O2)TA(5)-A-NH2 5331,49 5331,52
SCN-ASO 36 Humana & Rato 5' SS de Exon 7 Fethoc-A(5)TA(5)-CC(1O2)C-TG(6)A-A(5)TC-TG(6)T-NH2 4866,26 4866,29
SCN-ASO 37 Humana & Rato 3' SS de Exon 15 Fethoc-AA(5)G-A(5)C(12)T-CG(6)G-A(5)GC(1O2)-TA(5)-NH2 4772,23 4772,21
82/189 a)SS denota o sítio de junção; b)massa exata teórica; ec) massa exata observada.
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83/189 [00290] SCN-ASO 34 é um ASO de 16-mer completamente complementar ao sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 2 e intron 2 no pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 34 possui uma sobreposição complementar de 11-mer com éxon 2 e uma sobreposição complementar de 5-mer com íntron 2 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de SCN9A humana de 25mer de [(5' > 3’) GAUUUUAGUACACUC | auauccuuuul.
[00291] SCN-ASO 35 é um ASO de 16-mer complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 2 e íntron 2 no pré-mRNA de SCN9A de rato. SCN-ASO 35 possui uma sobreposição complementar de 11-mer com éxon 2 e uma sobreposição complementar de 5-mer com íntron 2 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de SCN9A de rato de 25-mer [(5! -> 3’) GAUCUUAGUGCACUCI auauccuuucl lido a partir do DNA genômico de rato [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC 005102.3]. SCN-ASO 35 possui um único não pareamento com o pré-mRNA de SCN9A humano visto que marcado com um sinal de aspas ( ) na sequência de pré-mRNA de 25-mer de [(5' > 3') GAUUUUAGUACACUC| auauccuuuul [00292] SCN-ASO 36 é um ASO de 15-mer complementarmente direcionando o sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 7 e íntron 7 no pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 36 possui uma sobreposição complementar de 11-mer com éxon 7 e uma sobreposição complementar de 4-mer com íntron 7 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de SCN9A humana de 25mer de [(5’ 3') CAGCACAGAUUCAGG | guauquaaual. A sequência alvo de SCN-ASO 43 é conservada no pré-mRNA de SCN9A de rato. [00293] SCN-ASO 37 é um ASO de 14-mer complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de íntron 14 e éxon 15 no pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 37 possui uma
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84/189 sobreposição complementar de 3-mer com íntron 14 e uma sobreposição complementar de 11-mer com éxon 15 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de SCN9A humana de 25mer de [(5' > 3’) uugcuuuuag I CUCCGAGUCUUCAAG1. A sequência alvo de ASO é conservada no pré-mRNA de SCN9A de rato, e marcada como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 25mer de rato [(5’ > 3’) uuauuucuag j CUCCGAGUCULJCAAGl.
[00294] Tabela 7 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ ou 5’ de éxon 23 no pré-mRNA de distrofina de camundongo lido a partir do DNA genômico de camundongo [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC 000086.7] juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento da ASOs da distrofina na Tabela 7 é para exemplificar os derivados de PNA da Fórmula ί, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção dos ASOs de distrofina especificados na Tabela 7.
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Tabela 7. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ ou 5’ de éxon 23 no pré mRNA de distrofina de camundongo, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sítio Alvoa Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teóricab observada0
DMD-ASO 1 3’ SS Fethoc-A(5)GA-G(6)CC(1O2)-TCA-A(5)AA(5)-T-NH2 4267,97 4267,97
DMD-ASO 2 3’ SS Fethoc-TTG(6)-CA(5)G-AG(6)C-C(1O2)TC-AA(5)A-A(5)T-NH2 5441,49 5441,54
DMD-ASO 3 3’ SS Fethoc-TTG(6)-CA(6)G-AG(6)C-C(12)TC-AA(6)A-A(6)T-NH2 5483,54 5483,55
DMD-ASO 4 3’ SS Fethoc-A(6)CT-TTG(6)-CA(6)G-A(6)GC(1O2)-CTC(1O2)-AA(6)-NH2 5571,59 5571,59
DMD-ASO 5 3' SS Fethoc-TG(6)C-A(5)GA-G(6)CC(1O2)-TCA(5)-A-NH2 4258,96 4258,98
DMD-ASO 6 5’ SS Fethoc-C(12)TC-GG(6)C-TTA(6)-CC(1O2)T-GA(6)A-A(6)TT-NH2 5672,52 5672,51
DMD-ASO 7 5' SS Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC(102)-TG(6)A-AA(5)T-TT-NH2 4488,00 4488,00
a) SS denota o sítio de junção;b) massa exata teórica; ec) massa exata observada.
[00295] A Tabela 8 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando um sítio de junção no prémRNA de indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO1) humano ou de camundongo, juntamente com dados de caracteri
85/189 zação estrutural por espectrometria de massa. As sequências de pré-mRNA de IDO 1 humanas e de camundongo foram lidas a partir do DNA genômico humano [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NCJ300008.11] e do DNA genômico de camundongo [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC 000074], respectivamente. O fornecimento dos ASOs de IDO1 na Tabela 8 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de IDO1 especificados na Tabela 8.
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Tabela 8. Derivados de PNA complementarmente direcionando um sítio de junção específico (SS) no pré-mRNA de IDO1 humano ou de camundongo, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Espécies Sítio Alvoa Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teóricab observada0
IDO-ASO 1 Humana 3' SS de Exon 7 Fethoc-GG(6)A-A(5)TT-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2 4282,97 4283,00
IDO-ASO 2 Humana 3’ SS de Exon 7 Fethoc-AA(5)T-TA(5)C-CTA(5)-AA(5)A-C(1O2)A-NH2 4503,08 4503,09
IDO-ASO 3 Camundongo 3’ SS de Exon 7 Fethoc-GG(5)G~A(5)TT~G(5)CC(1O2)~TTT-A(5)AA(5)-NH2 4918,24 4918,26
IDO-ASO 4 Camundongo 3’ SS de Exon 7 Fethoc-GG(5)G-A(5)TT-G(5)CC(1O2)-TTT-A(5)-NH2 4267,91 4267,93
IDO-ASO 5 Humana 5’ SS de Exon 3 Fethoc-CA(5)A-A(5)CC(1O2)-TTA(5)-CGG(6)-A-NH2 4243,96 4243,98
IDO-ASO 6 Humana 3’ SS de Exon 4 Fethoc-GG(6)C-AA(5)G-A(5)CC(1O2)-TGA(5)-T-NH2 4299,96 4299,97
a) SS denota o sítio de junção; b)massa exata teórica; ec) massa exata observada.
[00296] Tabela 9 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ de éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 humano lido a partir do gene SNAP25 humano [Sequência de Referência de NCBI: NG 029626.1], juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa. O fornecimento dos ASOs de SNAP25 na Tabela 9 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de SNAP25 especificados na Tabela 9.
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Tabela 9. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 6 e éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 humano, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N —► C) Massa Exata, m/z
teórica9 observadab
SNAP-ASO 1 Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2 5188,36 5188,38
SNAP-ASO 2 Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 4266,93 4266,95
SNAP-ASO 3 Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)T-NH2 4533,03 4533,04
SNAP-ASO 4 Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2 4519,01 4518,95
SNAP-ASO 5 Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2 4533,03 4533,04
SNAP-ASO 6 Fethoc-G(5)TT~A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(102)~NH2 4601,07 4601,08
SNAP-ASO 7 Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)~TTA(5)-CCC(102)-TG(6)-NH2 4478,98 4478,99
SNAP-ASO 8 Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2 4468,02 4468,04
SNAP-ASO 9 Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2 4216,91 4216,93
SNAP-ASO 10 Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2 5374,45 5374,44
SNAP-ASO 11 Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 5188,36 5188,35
SNAP-ASO 12 FethoCA(6)TT“TG(5)T-TA(6)C“C(1O2)CTG(5)GNH2 4522,04 4522,05
87/189 a) massa exata teórica; e b) massa exata observada [00297] Tabela 10 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangenPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 177/291 do a junção de intron 1 e éxon 2 no pré-mRNA da tirossinase humana (TYR) lido a partir do gene TYR humano [Sequência de Referência de NCBI: NG 0008748], ou o pré-mRNA de TYR de camundongo lido a partir do DNA genômico de camundongo [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC__000073]. O fornecimento dos ASOs de TYR na Tabela 10 é para exemplificar os derivados de PNA de Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção aos ASOs de TYR especificados na Tabela 10.
Tabela 10. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ abrangendo a junção de intron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de TYR humano ou de camundongo, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Espécies Sequência de PNA (N C) Massa Exata, m/z
teórica3 observada0
TYR-ASO 1 Humana Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2 4258,96 4260,99
TYR-ASO 2 Humana Fethoc-AC(12)A-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-TA(5)C(1O2)-AA(5)-NH2 5532,55 5532,54
TYR-ASO 3 Humana Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1O2)C-NH2 4592,11 4592,11
TYR-ASO 4 Camundongo Fethoc-CA(5)A-A(5)TG-A(5)TC(1O2)-TG(6)T-G-NH2 4289,95 4289,96
a) massa exata teórica; eb) massa exata observada
88/189 [00298] Tabela 11 fornece derivados de PNA complementarmente direcionando sítio de junção 3’ ou 5’ do éxon 2 no pré-mRNA de PD-1 humano lido a partir do gene PDCD1 humano [Sequência de Referência de NCBI: NG 012110], ou o pré-mRNA de PD-1 de camundongo lido a partir do DNA genômico do camundongo [acessado a partir da Sequência de Referência de NCBI: NC__000067], O fornecimento dos ASOs de PD-1 na Tabela 11 é para exemplificar os derivados de PNA da Fórmula I, e não deve ser interpretado para limitar o escopo da prePetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 178/291 sente invenção aos ASOs de PD-1 especificados na Tabela 11.
Tabela 11. Derivados de PNA complementarmente direcionando o sítio de junção 3’ ou o sítio de junção 5’ do éxon 2 no pré-mRNA de PD-1 humano ou de camundongo, juntamente com dados de caracterização estrutural por espectrometria de massa.
Exemplo de PNA Espécies Sequência de PNA (N —> C) Massa Exata, m/z
teórica3 observada0
PD-ASO 1 Humana Fethoc-C(1O2)TG(6)-GG(6)G-AG(6)T-CTG-A(5)G-NH2 4636,07 4636,08
PD-ASO 2 Camundongo Fethoc-CC(1O2)T-CA(5)C-CTG(5)-TTA(5)-C(1O2)CA(5)-C-NH2 5022,27 5022,27
PD-ASO 3 Humana Fethoc-CG(6)C-A(5)CC-TG(6)T-CA(5)C-C(1O2)C-NH2 4422,03 4422,05
a) SS denota o sítio de junção; b)massa exata teórica; ec) massa exata observada.
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Afinidade de Ligação de Derivados de PNA Modelo para RNA ou PNA Complementar [00299] Derivados de PNA de 10-mer possuindo nucleobases modificadas foram preparados como compostos modelo para exemplificar a forte afinidade dos compostos de PNA de Fórmula I tanto para RNA como para DNA. Estes compostos de PNA modelo foram preparados de acordo com os procedimentos sintéticos fornecidos na presente invenção ou com pequenas modificações. Os derivados de PNA de 10mer são fornecidos na Tabela 12 juntamente com dados de identificação estrutural por espectrometria de massa.
Tabela 12. Derivados de PNA de 10-mer como compostos modelo para exemplificar a forte afinidade de RNA ou DNA dos compostos de PNA de Fórmula I.
Exemplo de PNA Sequência de PNA (N -> C) Massa Exata, m/z.
teórica3 observadab
PNA 10-1 Fmoc-GTA-GAT-CAC-T-NH2 2948,14 2949,05
PNA 10-2 Fmoc-GTA-GA(5)T-CAC-T-NH2 3048,24 3050,41
PNA 10-3 Fmoc-GTA(5)-GAT-CA(5)C-T-NH2 3148,34 3150,65
PNA 10-4 Fmoc-GTA(5)-GA(5)T-CA(5)C-T-NH2 3248,44 3250,81
PNA 10-5 Fmoc-GTA-G(5)AT-CAC-T-NH2 3032,25 3035,01
PNA 10-6 Fmoc-GTA-GAT-C(1O2)AC-T-NH2 3044,21 3047,02
PNA 10-7 Fmoc-GTA(5)-GA(5)T-C(1O2)AC-T-NH2 3245,39 3248,10
a) massa exata teórica; e b) massa exata observada [00300] Os oligômeros de PNA de 10-mers na Tabela 12 foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação para o RNA ou DNA de 10mer complementar medindo os valores de Tm como descrito abaixo.
[00301] Uma solução mista de 4 μΜ de oligômero de PNA de 10mer e 4 μΜ de DNA ou RNA de 10-mer complementar em 4 mL de tampão aquoso (pH 7,16, fosfato sódico a 10 mM, NaCI a 100 mM) em 15 mL de tubo falcon de polipropileno foi incubada a 90°C durante um minuto e lentamente resfriada até a temperatura ambiente. Em segui
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91/189 da, a solução foi transferida para uma cubeta UV de quartzo de 4 mL e submetida à medição de Tm em 260 nm em um espectrofotômetro UV/Visível como descrito na técnica anterior [PCT/KR2009/001256] ou com pequenas modificações. Os DNA e RNA para medições de Tm foram adquiridos da Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Republic of Korea) e usados sem outra purificação.
[00302] A Tabela 13 fornece valores de Tm (quando não corrigidos) medidos entre os oligômeros de PNA modelo e o DNA ou RNA complementar. PNA 10-1, o oligômero de PNA de referência sem núcleobase modificada, produziu valores de Tm de 51 e 55°C contra o DNA e RNA complementares, respectivamente. Os oligômeros de PNA modelo possuindo nucleobase(s) modificada(s) tenderam a apresentar maior valor de Tm com maior incorporação de nucleobases modificadas. O PNA 10-7 apresentou um Tm de 69°C contra o DNA e RNA complementares, sugerindo que os oligômeros de PNA modelo ligam-se ao seu DNA e RNA complementares com afinidade de ligação comparável.
Tabela 13. Valores de Tm entre o PNA de 10-mer e o DNA ou RNA complementar.
PNA DNA ou RNA Complementar Tm,°C ATma,°C
PNA 10-1 51
PNA 10-2 55 +4
PNA 10-3 61 + 10
PNA 10-4 DNA (5' -» 3!) AGT-GAT-CTA-C 66 + 15
PNA 10-5 53 + 2
PNA 10-6 59 + 8
PNA 10-7 69 + 18
PNA 10-1 55 -
PNA 10-4 RNA (5' > 3') AGU-GAU-CUA-C 66 + 11
PNA 10-7 69 + 18
a> valor de Tm - valor de Tm de PNA 10-1
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Afinidade de Ligação de Derivados de PNA para DNA Complementar de 10-mer [00303] Os derivados de PNA de Fórmula I foram avaliados quanto à sua afinidade de ligação para DNAs de 10-mer complementarmente direcionando o N-terminal ou C-terminal. A afinidade de ligação foi avaliada pelo valor de Tm para o duplex entre o PNA e o DNA complementar 10-mer. O duplex entre os derivados de PNA e DNAs de complementaridade total geralmente mostra valores de Tm muito altos para serem determinados com confiança em solução tampão aquosa. A solução tampão aquosa tende a ferver durante a medição de Tm.
[00304] Os valores observados de Tm (quando não corrigidos) dos derivados de PNA de Fórmula I foram muito elevados para uma ligação complementar ao DNA de 10-mer, e são fornecidos na Tabela 14. Por exemplo, AR-ASO 1 mostrou um valor de Tm de 86,1 °C para o duplex com o DNA complementar de 10-mer direcionado o N-terminal de 10-mer dentro do PNA marcado como negrito e sublinhado em [(N C) Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2]. Enquanto isso, AR-ASO 1 mostrou um valor de Tm de 81,3°C para o duplex com o DNA de 10-mer complementar direcionando o C-terminal 10-mer dentro do PNA marcado como negrito e sublinhado em [(N > C) Fethoc-C (102) TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH21.
Tabela 14. Valores de Tm entre os PNAs e o DNA complementar de
10-mer direcionando o N-terminal ou o C-terminal do PNA.
PNA Valor de Tm,°C
DNA de 10-mer contra N-Terminal DNA de 10-mer contra C-Terminal
AR-ASO 1 86,1 81,3
AR-ASO 4 84,3 84,5
AR-ASO 5 84,4 78,4
HIF-ASO 1 66,0 60,0
HIF-ASO 4 66,0 53,4
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PNA Valor de Tm,°C
DNA de 10-mer contra N-Termlnal DNA de 10-mer contra C-Terminal
HIF-ASO 5 62,0 58,0
HIF-ASO 7 69,0 61,0
HIF-ASO 8 73,0 61,0
HIF-ASO 9 60,9 59,0
HIF-ASO 10 61,0 60,0
HIF-ASO 11 73,4 61,0
SCN-ASO 4 63,5 71,6
SCN-ASO 7 65,0 64,6
SCN-ASO 8 74,0 68,6
SCN-ASO 12 76,0 77,0
SCN-ASO 22 74,0 65,0
SCN-ASO 24 77,0 66,0
SCN-ASO 25 78,0 66,0
SCN-ASO 26 75,0 72,0
SCN-ASO 27 77,0 69,0
SCN-ASO 28 78,1 70,0
SCN-ASO 30 79,0 74,0
SNAP-ASO 2 76,0 87,6
SNAP-ASO 3 77,3 88,7
SNAP-ASO 8 58,0 68,0
SNAP-ASO 9 62,0 76,0
SNAP-ASO 10 61,0 68,0
SNAP-ASO 12 62,0 74,0
TYR-ASO 1 78,0 73,0
TYR-ASO 4 72,0 72,0
Exemplos para a Atividade In Vitro de ASOs de HIF-1a [00305] Derivados de PNA de Fórmula I direcionando suplementarmente o sítio de junção 3 do éxon 2 ou éxon 4 no pré-mRNA do HIF-1a humano (fator induzido por hipoxia 1a) foram avaliados quanto à atividade antissenso de saltos de éxon de HIF-1a em células HeLa. Exemplos biológicos para estes ASOs de HIF-1a são fornecidos como
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94/189 exemplos para ilustrar que o salto do éxon é potentemente induzido pelo composto de Fórmula I direcionando um sítio de junção em um pré-mRNA alvo e, portanto, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a ASOs de HIF-1cl
HIF-1a Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por HIF-ASO 2.
[00306] HIF-ASO 2 especificado na Tabela 1 é um ASO de 14mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3' do éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano marcado como negrito e sublinhado na Sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ > 3’) uguuaaguag| GAUAAGUUCU], onde o símbolo | representa a junção íntron-éxon. HIF-ASO 2 possui uma sobreposição complementar de 5-mer com íntron 1 e uma sobreposição complementar de 9-mer com o éxon 2.
[00307] O HIF-ASO 2 foi avaliado por PCR aninhada com HIF-1a quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 2 do mRNA de HIF-1a humano em células HeLa. Os procedimentos empregados são fornecidos abaixo.
Cultura de Células e Tratamento com ASO [00308] Células HeLa (Número de Catálogo CCL-2, ATCC) foram cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio EMEM suplementado com 10 % de FBS (soro bovino fetal), 1 % de estreptomicina/penicilina, 1 % de L-glutamina e 1 % de piruvato de sódio sob atmosfera de 5 % de CO2 a 37°C. As células foram tratadas com HIF-ASO 2 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1000 zM. O ASO foi diluído em série em uma concentração adequada em DDW e dividido em alíquotas na placa de cultura.
Extração de RNA [00309] 5 horas mais tarde, 0 RNA total foi extraído utilizando Kit de Extração de RNA Universal (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante.
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Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00310] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de 25 pL de transcrição reversa utilizando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos para éxon [HIF-éxon 1__dianteiro: (5’ 3’) CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; HIF-éxon 8 ..reverso: (5’ -> 3’) AACCCAGACATATCCACC] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, seguido por 15 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 55 e 1 min a 72°C.
Amplificação por PCR aninhada [00311] 1 pL de cDNA foi submetido a uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores de éxon [HIF-éxon 1n__dianteiro: (5’ 3') TGAAGACATCGCGGGGAC; HIF-éxon 5n_reverso: (5’ > 3') TTTTTCACAAGGCCATTTCT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 5 min seguido por 39 ciclos de 30 s a 95CC, 40 s a 50°C e 50 s a 72°C.
[00312] Os conjuntos de iniciadores específicos de éxon para a RTPCR de uma etapa e amplificação por PCR aninhada estão esquematicamente resumidos na Figura 17A.
Identificação do Produto de Salto de Éxon 2 [00313] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em um gel de agarose a 2 % juntamente com um coquetel marcador de tamanho. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger. As bandas de PCR observadas corresponderam ao mRNA de tamanho natural (isto é, sem salto do éxon), e a variante de junção sem o éxon 2 foi atribuída na Figura 17B. As células tratadas com o ASO produziram uma forte banda de PCR de tamanho atribuível ao salto do éxon 2. As células sem o tra
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96/189 tamento com ASO (ou seja, controle negativo) também produziram o produto de PCR correspondente ao salto do éxon 2, sugerindo que o éxon 2 é eliminado espontaneamente até certo ponto. No entanto, a intensidade da banda do salto do éxon foi muito mais forte nas células tratadas com o ASO do que nas células sem tratamento com ASO. Desta maneira, HIF-ASO 2” promoveu o salto do éxon 2 em células HeLa. Os dados de sequenciamento para a banda de salto do éxon são fornecidos na Figura 17C, que manifesta a sequência de mRNA para a junção dos éxons 1 e éxon 3.
Número de Células Influenciadas por uma Única Molécula de ASO [00314] HIF-ASO 2 induziu o salto do éxon 2 mesmo a 10 zM. Existem cerca de 30 moléculas de ASO a 10 zM (isto é, 10~21M) de concentração em 5 ml do meio de cultura em uma placa de cultura de 60 mm. Dado que cerca de 30 moléculas de ASO induziram o salto em aproximadamente 100.000 células HeLa em placa de cultura de 60 mm, estima-se que cada molécula de ASO tenha afetado ou controlado o salto do éxon em cerca de 3.000 células HeLa em média. Desta maneira, cada molécula de ASO é levada rapidamente em torno de um grande número de células para executar seu papel destinado ao salto do éxon.
[00315] HIF-1a Exemplo 2. Inibição da Expressão da Proteína HIF1a em Células HeLa por HIF-ASO 2”.
[00316] HIF-ASO 2 foi avaliado quanto à sua capacidade para inibir a expressão da proteína HIF-1a em células HeLa como descrito abaixo.
Cultura de Células e Tratamento com ASO [00317] Células HeLa cultivadas em placas de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com HIF-ASO 2 a 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou 10 aM.
Tratamento com C0CI2 e Lise Celular [00318] 24 horas após 0 tratamento com ASO, as placas de cultura
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97/189 excepto a sem tratamento com ASO foram tratadas com 200 pM de C0CI2 durante mais 3 horas para super-regular 0 nível de proteína HIF1a suprimindo a atividade das prolil-hidroxilases (PHD). Em seguida, as células foram lavadas 2X com 1 mL de PBS frio e submetidas à lise em gelo com 200 pL de tampão RIPA 1X (Número de Catálogo 9806, Cell Signaling Tech) suplementado com 1 % de SDS e 1X coquetel inibidor de proteinase (complete Mini, Roche). Cada lisado foi coletado em tubo de 1,5 mL, misturado com 100 mL de tampão de amostra 5X e fervido por 5 min a 100°C. Os lisados foram submetidos à separação eletroforética em gel de SDS-PAGE a 8 % e transferidos para uma membrana PVDF de 0,45 pm. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-HIF~1a (Número de Catálogo 610958, BD Biosciences) e um anticorpo anti-p-actina (Número de Catálogo sc4778, Santa Cruz). Inibição da expressão de proteína HIF-1a [00319] A Figura 18A fornece os dados de western blot de HIF-1a obtidos em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2. Enquanto não houve banda de HIF-1 detectada com 0 lisado das células sem tratamento com C0CI2, os Hsados das células tratadas com C0CI2 forneceram uma banda forte para a HIF-Ια. A Figura 18B fornece as intensidades individuais de banda de HIF-1 normalizadas contra cada intensidade de banda de β-actina individual por densitometria. A expressão da HIF-1 o decresceu gradualmente com 0 aumento da concentração de HIF-ASO 2. A diminuição observada foi de cerca de 75 % a 10 aM de HIF-ASO 2”.
[00320] HIF-1 o Exemplo 3. qPCR por SYBR Green para 0 mRNA de HIF-1 o em células HeLa tratadas com HIF-ASO 2.
[00321] O HIF-ASO 2 foi avaliado por qPCR aninhada quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de HIF-1 o de tamanho natural em células HeLa como se segue.
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Cultura de Células & Tratamento com ASO [00322] Células HeLa cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio foram tratadas com ASO 2 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM (2 placas de cultura por cada concentração de ASO).
Extração de RNA [00323] 3 horas após o tratamento com ASO, o RNA total foi extraído com Kit de Extração de RNA MiniBEST Universal (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00324] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de 25 pL de transcrição reversa utilizando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos para éxon [HIF-éxon 1__dianteiro: (5’ > 3') CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT; HIF-éxon 8 ..reverso: (5’ -> 3’) AACCCAGACATATCCACC] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, seguido por 15 ciclos de 30 s a 94°C, 30 sec a 55 e 1 min a 72°C.
qPCR aninhada [00325] 1 pL de cDNA diluído por 100 vezes foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL contra os seguintes conjuntos de iniciadores específicos para éxons: [HIF-éxon 2n__dianteiro (5’ 3')
CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC; HIF-éxon 2n...reverso (5’ -> 3’) AAGTTTCCTCACACGCAAATAG; HIF-éxon 3n_dianteiro (5! -> 3') GAAAGCACAGATGAATTGC; HIF-éxon 3n__reverso (5’ > 3') TCATGTCACCATCATCTGT; HIF-éxon 4n__dianteiro (5’ -> 3') CTAACTGGACACAGTGTGTTTG; HIF-éxon 4n reverso (5’ 3’) TCTGTGTGTAAGCATTTCTCTC; HIF-éxon 5n_dianteiro (5’ > 3’) GCCTTGTGAAAAAGGGTAAAG; HIF-éxon 5n....reverso (5’ -> 3’) CCATGTTG
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CAGACTTTATGT], As reações de PCR foram sondadas com SYBR
Green (Takara, Japan) de acordo com as seguintes condições de ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos durante 5 seg a 95°C e seg a 60°C.
Alterações nos níveis de Éxon de mRNA de HIF-1a [00326] Os níveis de éxons individuais de amostras tratadas com ASO foram normalizados contra cada nível de éxons individual sem tratamento com ASO. Os níveis de éxon individual relativos observados são fornecidos na Figura 18C. Todos os níveis de éxon individuais diminuíram significativamente em 60 a 80 % e 50 a 70 % nas células tratadas com HIF-ASO 2 a 10 zM e 100 zM, respectivamente. No entanto, os níveis de éxon individuais obtidos com as células tratadas com HIFASO 2 a 1.000 zM (isto é, 1 aM) não foram diferentes dos níveis de éxon nas células sem tratamento com ASO. Embora ainda não se saiba por que os níveis de éxon aumentaram de volta aos níveis de controle negativo à medida que a concentração de ASO foi aumentada para 1.000 zM. No entanto, o padrão de resposta a dose invertida na Figura 18C é comparável ao padrão de resposta à dose invertida do salto do éxon no HIF-1a Exemplo 1. (conforme Figura 17A).
[00327] HIF-1a Exemplo 4. qPCR por Sonda TaqMan para mRNA de HIF~1o em Células HeLa Tratadas com HIF-ASO 2.
[00328] O HIF-ASO 2 foi avaliado por qPCR aninhada quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de HIF-1a de tamanho natural em células HeLa, como descrito no HIF-1 Exemplo 3 , salvo indicação em contrário.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00329] 200 ng de padrão de RNA submetido a uma reação de 25 pL de transcrição reversa usando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos
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100/189 para éxon [HIF-éxon 1_dianteiro (2): (5’ > 3') CGCGAACGACAAGAAAAA; HIF-éxon 8__reverso (2): (5! 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 20 ciclos de 30 seg a 94°C, 40 seg a 51 e 50 seg a 72°C.
qPCR aninhada [00330] 1 mL de cDNA diluído por 100 vezes foi submetido a uma reação de PCR 20-L em Tempo Real usando uma sonda TaqMan (Hs00936371„m1, Thermo Fisher) projetado para detectar a junção dos éxons 1 e éxon 2 de HIF-1a humanos de acordo às seguintes condições do ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos 10 seg a 95°C e 30 seg a 60°C.
Alterações no nível de mRNA de HIF-1a [00331] O nível de mRNA de tamanho natural de amostras tratadas com ASO foi normalizado contra o nível de mRNA sem tratamento com ASO. Os níveis de mRNA normalizados observados são fornecidos na Figura 18D. O nível de mRNA de HIF-Ια de tamanho natural significativamente (pelo teste t de Student) diminuiu 65 % e 55 % nas células tratadas com HIF-ASO 2 a 100 zM e 1.000 zM, respectivamente. O nível de mRNA de tamanho natural permaneceu inalterado nas células tratadas com ASO 2 a 10 zM.
[00332] HIF-1a Exemplo 5. Salto de Éxon induzido por HIF-ASO 6. [00333] HIF-ASO 6 especificado na Tabela 1 é um ASO de 17mer totalmente complementar ao sítio de junção 3! abrangendo a junção dos íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF-1a humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20mer de [(5! > 3') uouuaaquaq | GAUAAGUUCU]. HIF-ASO 6 possui uma sobreposição complementar de 7-mer com o íntron 1 e uma sobreposição complementar de 10-mer com o éxon 2.
[00334] O HIF-ASO 6 foi avaliado por PCR aninhada com HIF-1 α
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101/189 quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 2 do mRNA da
HIF-1a humano em células HeLa de acordo com os procedimentos descritos no ssHIF-1a Exemplo 1 salvo indicação em contrário.
[00335] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %, e os resultados da eletroforese são fornecidos na Figura 19A. O salto do éxon 2 foi robusto em todas as concentrações de tratamento de HIF-ASO 6. HIF-ASO 6 induziu o salto do éxon 2 mais efetivamente do que HIF-ASO 2. A banda de PCR para o mRNA de HIF-1a de tamanho natural desapareceu quase completamente em todas as concentrações de HIF-ASO 6. Entretanto, havia um nível significativo do mRNA de HIF~1a de tamanho natural remanescente nas células tratadas com HIF-ASO 2 a 10 a 1000 zM. [cf. Figura 17A] [00336] HIF-ASO 6 possui mais sobreposição complementar com o sítio de junção 3’ do éxon 2 do que com HIF-ASO 2, que seria responsável pela maior eficácia de saltos de éxon observada com HIFASO 6. A ligação mais apertada de ASO ao sítio de junção alvo parece induzir mais efetivamente o salto do éxon alvo.
[00337] HIF~1a Exemplo 6. Inibição da Expressão de Proteína HIF1a em Células HeLa por HIF-ASO 6.
[00338] O HIF-ASO 6 foi avaliado quanto à sua capacidade de sub-regular a expressão de HIF-1a em células HeLa de acordo com os procedimentos descritos no HIF-1a Exemplo 2, salvo indicação em contrário. A Figura 19B é um dado de western blot obtido com células HeLa tratadas com HIF-ASO 6 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM durante 24 horas. A Figura 19C fornece as intensidades individuais de banda de HIF-1 normalizadas contra cada intensidade de banda de β-actina individual por densitometria. A expressão da proteína HIF-1a diminuiu cerca de 45 a 55 % nas células tratadas com HIFASO 6.
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102/189 [00339] HIF»1a Exemplo 7. qPCR por SYBR Green para o mRNA de HF-1 a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 6.
[00340] O HIF-ASO 6 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir uma alteração no mRNA de HIF-1o em células HeLa por qPCR aninhada de acordo com os procedimentos no HIF-1a Exemplo 4 salvo indicação em contrário.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00341] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de 25 pL de transcrição reversa utilizando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxons [HIF-éxon 1_dianteiro (2): (5! > 3') CGCGAACGACAAGAAAAA; HIF-éxon 8 (2): (5! -> 3') CTGTGGTGACTTGTCCTTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, seguido por 15 ciclos de 30 s a 94°C, 40 seg a 51°Ce50 seg a 72°C.
Alterações nos Níveis de Éxon de mRNA de HIF-1a [00342] Os níveis de éxon individuais normalizados contra os níveis de éxon individuais sem tratamento com ASO são fornecidos na Figura 20 (A). Os níveis de éxon significativamente (teste t de Student) diminuíram em 35 %, cerca de 30 % e cerca de 45 % nas células tratadas com HIF-ASO 6 em 10, 100 e 1.000, respectivamente.
[00343] HIF-1a Exemplo 8. qPCR por sonda TaqMan para mRNA de HIF-1a em células HeLa tratadas com ASO 6.
[00344] O HIF ASO 6 foi avaliado por qPCR aninhada quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de HIF-1a de tamanho natural em células HeLa, como descrito em HIF-1a Exemplo 4, salvo indicação em contrário.
Alterações no nível de mRNA de HIF-1a de tamanho natural [00345] O nível de mRNA de tamanho natural de amostras tratadas
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103/189 com ASO foi normalizado contra o nível de mRNA sem tratamento com ASO. Os níveis relativos de mRNA observados são fornecidos na Figura 20 (B). O nível de mRNA de HIF-1a de tamanho natural significativamente (teste t de Student) diminuiu cerca de 60 % e 80 % nas células tratadas com HIF-ASO 6 a 100 zM e 1.000 zM (1 aM), respectivamente. No entanto, o nível de mRNA de tamanho natural permaneceu inalterado nas células tratadas com HIF-ASO 6 a 10 zM. [00346] HIF-1a Exemplo 9. Salto de Éxon Induzido por HIF-ASO 1. [00347] HIF-ASO 1 é um ASO de 14-mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ que abrange a junção dos íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de HIF~1a humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 23-mer de [(5! —> 3') uquuaaquag | GAUAAGUUCUGAAl HIF-ASO 1 possui uma sobreposição de 3-mer com o íntron 1 e uma sobreposição de 11~mer com o éxon 2.
[00348] O HIF-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon no mRNA de HIF-1o, tal como descrito em HIF~1o Exemplo 1, a menos que seja isolado de outro modo. As células HeLa foram tratadas com HIF-ASO 1 a 0 (controle negativo), 1, 3, 10, 30 ou 100 aM. 24 horas depois, o RNA total foi extraído e submetido à PCR aninhada com HIF-1a para detectar o salto do éxon.
Dados do Salto de Éxon [00349] A Figura 21A fornece os dados de eletroforese obtidos com os produtos de PCR aninhadas juntamente com os dados de sequenciamento de Sanger para o produto de PCR atribuível ao salto dos éxons 2-3. O nível de mRNA de tamanho natural tendeu a diminuir à medida que a concentração de ASO foi aumentada de 1 aM para 100 aM. O salto do éxon 2 foi predominante com HIF-ASO 1 às 3 aM e 10 aM. No entanto, o salto dos éxons 2-3 tornou-se excessivo à medida que a concentração de ASO foi aumentada para 100 aM. O produto de
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PCR para o produto de salto dos éxons 2-3 foi inequivocamente confirmado pelo sequenciamento de Sanger, [cf. Figura 21A à direita]
HIF-1 α Exemplo 10. Inibição da Expressão de Proteína HIF-Ια em
Células HeLa por HIF-ASO 1.
[00350] O HIF-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína HIF-1a em células HeLa de acordo com os procedimentos descritos no HIF-1 α Exemplo 2, salvo indicação em contrário. Neste exemplo, as células HeLa foram tratadas com HIF-ASO 1 a 0 zM (controle negativo), 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 10 aM, 30 aM, 100 aM ou 300 aM durante 72 horas antes para suprimir a atividade de PHDs por uma incubação com 200 μΜ de C0CI2 por 3 horas. Havia 4 placas de cultura do controle negativo, isto é, HIFASO 1 a OzM.
[00351] A Figura 21B fornece os dados de western blot de HIF-1o obtidos com os lisados de células HeLa. O nível de proteína HIF-1o foi consideravelmente maior nos lisados do controle negativo do que todos os lisados das células tratadas com HIF-ASO 1. A Figura 21C fornece as intensidades individuais de banda de HIF-1 normalizadas contra a intensidade da banda de actina por densitometria. A expressão de HIF-1a em células HeLa diminuiu de 40 para 80 % ao longo da incubação de 72 horas com HIF-ASO 1” a 0,1 a 300 aM.
[00352] HIF-1 α Exemplo 11. Salto de Éxon Induzido por HIF-ASO
12.
[00353] HIF-ASO 12 especificado na Tabela 2 é um ASO de 15mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ que abrange a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de HIF-1 α humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ 3') uquuuacaq | UUUGAACTAAC1. HIF-ASO 12 possui uma sobreposição de 6-mer com 0 íntron 3 e uma sobreposição de 9-mer com 0 éxon 4.
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105/189 [00354] O HIF-ASO 12 foi avaliado por PCR aninhada com HIF-1 α quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 do mRNA da HIF-1o humano em HeLa. As células HeLa foram incubadas com HIFASO 12 durante 6 horas e depois submetidas à extração de RNA total de acordo com o protocolo descrito em HIF-1 α Exemplo 1, salvo indicação em contrário.
[00355] A Figura 22A fornece os dados de PCR aninhada com HIF1a em células HeLa tratadas com HIF-ASO 12. Uma banda de saltos de éxons atribuível ao salto dos éxons 2-4 foi detectada em todos os produtos de PCR das células tratadas com ASO, enquanto que não nas células não tratadas, (conforme diagrama à esquerda). A intensidade da banda de salto do éxon foi mais intensa em HIF-ASO 12 a 100 zM. A intensidade da banda de mRNA de tamanho natural diminuiu mais em HIF-ASO 12 a 100 zM. O salto dos éxons 2-4 foi confirmado pelo sequenciamento de Sanger como previsto no diagrama à direita.
[00356] HIF-1 α Exemplo 12. A inibição da Expressão da Proteína
HIF-lo em Células HeLa por HIF-ASO 12.
[00357] O HIF-ASO 12 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão de HIF-1 α em células HeLa como descrito em HIFlo Exemplo 2, salvo indicação em contrário.
Tratamento com ASO [00358] As células HeLa foram tratadas com HIF-ASO 12 a 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM ou 1 aM. 3 placas de cultura para o controle negativo. 21 horas mais tarde, as células foram tratadas com 200 μΜ de C0CI2 excepto em uma placa do controle negativo. 3 horas mais tarde, todas as células foram submetidas à Use no gelo como se segue. As células foram lavadas 2X com 1 mL de PBS frio e depois submetidas à lise com 200 pL de tampão de amostra Lammeli 2X (24 mM Tris-HCI, 20 % de glicerol, 0,8 % de SDS, 0,04 % de azul de broPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 195/291
106/189 mofenol, 2 % de β-mercaptoetanol) para minimizar a degradação de
HIF-1a. Cada lisado foi coletado em tubo de 1,5 mL e fervido por 5 min. Em seguida, os lisados foram submetidos a western blot em um gel de SDS-PAGE a 8 %.
[00359] A Figura 22B fornece os dados de western blot mostrando que a intensidade de banda de HIF-1o diminuiu claramente nas células tratadas com HIF-ASO 12 a 1 e 10 aM.
[00360] HIF-1a Exemplo 13. qPCR por SYBR Green para o mRNA de HIF~1a em Células HeLa Tratadas com HIF-ASO 12.
[00361] O HIF-ASO 12 foi avaliado por qPCR aninhada com HIF1a quanto à sua capacidade de induzir uma alteração no mRNA de HIF-la em células HeLa como descrito em HIF-Ία e Exemplo 3, salvo indicação em contrário. As células HeLa foram tratadas com HIF-ASO 12 durante 6 horas e depois submetidas à extração de RNA total.
[00362] A Figura 22C fornece os dados de qPCR, nos quais os níveis de mRNA dos éxons 2 e 3 diminuíram significativamente (teste t de Student) em 70 ~ 80 % nas células tratadas com o ASO. As descobertas de qPCR são consistentes com o salto do éxons 2-4 induzidos por HIF-ASO 12 (conforme HIF-1a Exemplo 11).
Exemplos de atividade In Vitro e In Vivo de AR ASOs [00363] Derivados de PNA da Fórmula I direcionados complementarmente ao sítio de junção 5’ que mede a junção do éxon 5 e do íntron 5 no pré-mRNA do receptor de androgênio humano (AR) foram avaliados quanto à sua atividade de salto do éxon de antissenso de AR nas células e também nos camundongos. Exemplos biológicos para estes AR ASOs são fornecidos como exemplos para ilustrar que o salto do éxon é potentemente induzido pelo composto de Fórmula I direcionando um sítio de junção em um pré-mRNA alvo e, portanto, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a AR ASOs.
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107/189 [00364] AR Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por AR-ASO 1. [00365] AR-ASO 1 especificado na Tabela 3 é um ASO de 13-mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 5’ que abrange a junção do éxon 5 e do íntron 5 no pré-mRNA do receptor de androgênio (AR) humano. AR-ASO 1 liga-se complementarmente à sequência de 13-mer marcada como negrito e sublinhada na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ > 3') GCCUUGCCUG | guaagqaaaal. AR-ASO 1 possui uma sobreposição de 8-mer com o éxon 5 e uma sobreposição de 5-mer com o íntron 5.
[00366] AR-ASO 1 foi avaliado por PCR aninhada com AR quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 5 do mRNA de AR humano em células MCF7 como se segue.
Cultura de Células & Tratamento com ASO [00367] As células MCF7 (Número de Catálogo: HTB-22, ATCC) foram mantidas em meio EMEM suplementado com 10 % de FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina e 0,01 mg/mL de insulina bovina sob 5 % de atmosfera de CO2 a 37°C. As células cultivadas em placa de cultura de 60 mm foram tratadas com AR-ASO 1 durante 3 horas a 0 (controle negativo), 3, 30, 300 ou 3.000 am (isto é, 3 fM).
Extração de RNA [00368] RNA total foi extraído Kit de Extração de RNA Universal” (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00369] Utilizou-se 100 ng de padrão de RNA em uma reação de 25 μΙ_ de transcrição reversa utilizando 0 kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) e um conjunto de iniciadores específicos de éxon [AR-éxon 3_dianteiro: (5’ > 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; e AR-éxon 9 reverso: (5’ —> 3!) GGGTGTGGAAATAGATGGG] de acorPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 197/291
108/189 do com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, seguido por 39 ciclos de 30 s a 94°C, 30 seg a 55 e 1 min a 72°C.
Amplificação de PCR aninhada [00370] Ao longo do processo de amplificação, foi usada uma técnica de amplificação única (retocar como temperatura de recozimento crescente por ciclo) que funcionou de forma eficiente e específica em uma faixa de temperatura, em vez de uma temperatura de recozimento específica (ou seja, método de PCR convencional). 1 pL de cDNA foi posteriormente amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL usando um conjunto de iniciadores específicos para éxon [AR-éxon 3_dianteiro: (5’ > 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; e AR-éxon 7n reverso: (5! -» 3') GGGGTGATTTGGAGCCAT] de acordo com as seguintes condições de ciclo: 10 ciclos iniciais [94°C durante 30 seg, 47°C durante 40 seg (+ 0,5°C a cada ciclo), 72°C durante 40 seg], seguido de 20 ciclos [94°C durante 30 seg, 50°C durante 30 seg e 72°C durante 40 seg].
Identificação de Produtos de Salto de Éxon [00371] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger Na Figura 23A, existem três bandas de produto de PCR relacionadas com o tratamento atribuídas as variantes de junção de mRNA de AR sem o éxon 5. AR-ASO 1 induziu o salto do éxon 5, éxon 4-5 e éxon 4-6, embora a relação entre os produtos de salto parecesse depender da concentração de ASO. A Figura 23B fornece os dados reais de sequenciamento para a banda de salto dos éxons 4-5 na Figura 23A.
[00372] AR Exemplo 2. Inibição da Expressão de Proteína de AR em Células MCF7 por AR-ASO 1.
[00373] Células MCF7 em placa de cultura de 60 mm contendo 5
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109/189 mL de meio de cultura foram tratadas com AR-ASO 1 a 0 zM (controle negativo) ou 10 zM a 30 aM. 4 placas de cultura para o controle negativo. 48 horas mais tarde, as células foram lavadas 2X com PBS frio e depois submetidas à lise com 200 pL de tampão de lise celular 1X (Número de Catálogo 9803, Cell Signaling Tech) suplementado com 1X inibidores de protease (Número de Catálogo P8340, Sigma). Os lisados foram coletados em tubo-e de 1,5 mL. 200 pL de cada lisado foram misturados com 100 pL de tampão de amostra 3X e fervidos por 5 min. 20 pL de cada lisado (4 controles negativos e 8 amostras de tratamento com ASO) foram submetidos à separação eletroforética em um gel de SDS-PAGE a 8 % e transferidos para uma membrana de PVDF. A membrana foi sondada com um anticorpo anti~AR (Número de Catálogo 5153, Cell Signaling Tech) e um anticorpo anti-p-actina (Número de Catálogo sc4778, Santa Cruz). A Figura 23C fornece os dados de Western blot de AR obtidos em células MCF7 tratadas com AR-ASO 1 a 0 zM (4 controles negativos) a 30 aM. A intensidade da banda de AR (tamanho 120K) dos lisados tratados com o ASO foi mais fraca do que a intensidade dos lisados vizinhos no controle negativo.
[00374] AR Exemplo 3. qPCR por SYBR Green para mRNA de AR em Células MCF7 Tratadas com AR-ASO 1.
Tratamento com ASO e Extração de RNA [00375] As células MCF7 em 5 mL de meio de cultura foram tratadas com AR-ASO 1 a 0 zM (controle negativo) ou 1 zM a 1 aM. (2 placas de cultura por concentração) 5 horas mais tarde, o RNA total foi extraído utilizando Kit de Extração de RNA Universal MiniBEST de acordo com as instruções do fabricante (Número de Catálogo 9767, Takara).
Síntese de cDNA com OliqodT [00376] 500 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma síntese de cDNA contra oligo-dT de acordo com as instruções do fabricante
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110/189 (Número de Catálogo 6110A, Takara).
Primeira PCR [00377] O cDNA foi então submetido à 1a. PCR contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon [AR-éxon 3 dianteiro: (5! -» 3') TGGGTGTCACTATGGAGC; e AR-éxon 9__reverso: (5’ -> 3!) GGGTGTGGAAATAGATGGG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 94°C durante 2 min seguido por 15 ciclos de 15 seg a 94°C, 30 seg a 55°C e 2 min em 72°C.
PCR aninhada [00378] Os produtos de 1a. PCR foram diluídos em 2.000 vezes, e 1 pL de cada produto de PCR diluído foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL contra conjuntos de iniciadores específicos de éxon [AR-éxon 4 dianteiro (q) : (5’ -» 3') GACCATGTTTTGCCCATTG; AR-éxon 4__reverso (q): (5’ -> 3s) GGCTCTTTTGAAGAAGACC; AR-éxon 5 dianteiro (q): (5’ > 3') GAAACAGAAGTACCTGTGC; AR-éxon 5. ...reverso (q): (5’ -> 3’) GTCATCCCTGCTTC-ATAAC; AR-éxon 6__dianteiro (q): (5’ 3') CGGAAGCTGAAGAAACTTG; ARéxon o reverso (q): (5’ > 3') CACTTGACCACGTGTACAAG]. As reações de PCR foram sondadas por SYBR Green (Takara, Japan). Condições do Ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos durante 5 seg a 95°C e 30 seg a 60°C. Os níveis de éxon gradualmente mas significativamente diminuíram quanto a dose foi aumentada de 1 zM para 100 zM. As diminuições foram 40 ~ 50 % nas células tratadas com AR-ASO Γ a 100 zM [cf. Figura 24A], No entanto, os níveis de éxon se recuperaram perto dos níveis de controle negativo nas células tratadas com AR-ASO 1 a 1 aM.
[00379] AR Exemplo 4. qPCR por SYBR Green para o mRNA de AR em Células MCF7 Tratadas com AR-ASO 5.
[00380] AR-ASO 5 especificado na Tabela 3 é um ASO de 12-mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 5’ que
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111/189 abrange a junção do éxon 5 e do íntron 5 no pré-mRNA de AR humano. AR-ASO 5 liga-se complementarmente à sequência de 12-mer marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ > 3') GCCUUGCCUG | guaagqaaaal. AR-ASO 5 possui uma sobreposição de 7-mer com o éxon 5 e uma sobreposição de
5-mer com o íntron 5.
[00381] O AR-ASO 5 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir mudanças nos níveis de éxon RNA de AR por qPCR de acordo com os métodos descritos em AR Exemplo 3. Como apresentado na Figura 24B, os níveis de éxon de AR significativamente (teste t de Student) diminuíram cerca de 60 a 80 % nas células tratadas com ARASO 5 de 1 a 1.000 zM.
[00382] Ao contrário do caso de AR-ASO 1 (conforme AR Exemplo 3), não houve recuperação nos níveis de mensagem de éxon em AR-ASO 5 a 1.000 zM.
[00383] AR Exemplo 5. qPCR por Sonda TaqMan para mRNA de AR em células MCF7 Tratadas com AR-ASO 5.
[00384] AR-ASO 5 foi avaliado quanto à sua capacidade de subregular o mRNA de AR humano por qPCR, adoptando uma sonda TaqMan.
[00385] As células MCF7 foram tratadas com AR-ASO 5 a 0 zM (controle negativo) a 1 aM. (2 placas por concentração) 24 horas mais tarde, o RNA total foi extraído pelo Kit de Extração de RNA MiniBEST Universal de acordo com as instruções do fabricante (Número de Catálogo 9767, Takara).
[00386] 400 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma síntese de cDNA com o kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos para éxons [AR-éxon 3 dianteiro: (5’ > 3’) TGGGTGTCACTATGGAGC; e AR-éxon 9„reverso: (5! > 3') GGGTGTGGAAATAGATGGG] de acordo com as seguintes condições
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112/189 do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 s a 94CC, 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C.
[00387] 1 pL de cada solução de cDNA diluída por 50X foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [AR-éxon 4 dianteiro (q2): (5’ 3') TTGTCCATCTTGTCGTCTT; e AR-éxon 5„reverso (q2): (5’ -> 3!) CCTCTCCTTCCTCCTGTA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos por 15 s a 95°C e 30 s a 60°C. A reação de qPCR foi monitorada com uma sonda TaqMan de [(5’ -> 3') TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ], A sonda TaqMan foi projetada para sondar a junção do éxon 4 e éxon 5 no mRNA de AR de tamanho natural.
[00388] A Figura 24C fornece os dados de qPCR pela sonda TaqMan. A expressão relativa do mRNA de AR de tamanho natural significativamente (teste t de Student) diminuiu em cerca de 50 a 70 % nas células tratadas com AR-ASO 5 a 1 zM a 1 aM.
[00389] AR Exemplo 6. Inibição da Expressão de Proteína de AR na Pele de Camundongos Tratados por Via Subcutânea com ARASO-5.
[00390] AR-ASO 5 tem como alvo a sequência de pré-mRNA de AR conservada em humanos e camundongos. AR-ASO 5 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína de AR na pele de camundongos após uma única administração subcutânea da seguinte forma.
Remoção e Agrupamento de Pêlo [00391] No Dia 0, camundongos C57BL/6 machos com 7 semanas de idade foram anestesiados com zoletil/rompun, e o pêlo no dorso foi cortado com um aparador e removido por depuração de carboidratos. No dia 5, camundongos com remoção de pêlo sem falhas (ou seja, impecável) foram selecionados e distribuídos aleatoriamente em cinco
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113/189 grupos de 0 pmol/kg (somente veículo, controle negativo), 1 pmol/kg, pmol/kg, 100 pmol/kg e 1.000 pmol/Kg de AR-ASO 5. (6 animais por grupo).
[00392] [Solução de Injeção de ASO & Administração] Uma solução mãe aquosa de AR-ASO 5 foi diluída em série em PBS suplementado com 0,1 % de Tween 80 para preparar soluções de AR-ASO 5 de 0 nM (apenas veículo, controle negativo), 0,5 nM, 5 nM, 50 nM ou 500 nM. No dia 5, camundongos individuais em cada grupo de dose foram administrados subcutaneamente na nuca (isto é, perto do pescoço) com uma única injeção do artigo teste a 2 mL/kg.
Extração de Amostras de Pele [00393] No dia 10, sacrificaram-se os animais para obter amostras de pele do sítio da injeção e do quadril como um sítio de não injeção. As amostras de pele foram congeladas em nitrogênio líquido imediatamente após a amostragem. Cada amostra de pele foi micronizada, mantendo a amostra congelada com nitrogênio líquido. As amostras micronizadas foram submetidas à lise com tampão RIPA suplementado com SDS a 1 %. Os lisados foram misturados com tampão de amostra 5X e fervidos durante 5 min.
Western Blot de AR [00394] Os lisados foram submetidos a western blot de AR em uma membrana de PVDF. Um total de 10 lisados foram carregados em cada gel de PAGE a 10 % de com dois lisados individuais de cada grupo. A proteína de AR (120 K daltons) foi sondada com um anticorpo de AR policlonal (N-20, sc-816, Santa Cruz).
Quantificação da Expressão da Proteína de AR [00395] Cada banda de AR de uma única membrana de PVDF foi normalizado contra a banda de β-actina individual. A intensidade média da banda de AR (normalizada contra β-actina) das duas amostras do grupo controle negativo (ou seja, nenhum tratamento com ASO) foi
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114/189 utilizado para normalizar as intensidades da banda de AR das outras 8 amostras na mesma membrana de PVDF. Essa dupla normalização foi aplicada às outras duas membranas de PVDF para quantificar a expressão da proteína de AR de amostras individuais por densitometria. Todos os níveis de expressão de RA após a dupla normalização de amostras individuais foram agrupados para análise estatística pelo teste t de Student contra o nível de expressão sem o tratamento com ASO.
Inibição da Expressão de Proteína de AR [00396] As Figuras 25A e 25B são os dados de western blot de AR obtidos com as amostras de pele do sítio injeção e do sítio de não injeção, respectivamente.
[00397] A Figura 26A fornece o nível de expressão da proteína de AR por grupo, bem como por indivíduo. Existia um grande grau de variabilidade interindividual na expressão da proteína de AR, tanto no sítio da injeção quanto no sítio de não injeção. No entanto, a expressão de AR tendeu a diminuir à medida que a dose de ASO aumenta.
[00398] A Figura 26B fornece o nível médio de expressão de AR por grupo, conforme normalizado contra o grupo controle negativo. No sítio de injeção, a expressão da proteína de AR diminuiu significativamente em cerca de 35 % no grupo de 1.000 pmol/kg de AR-ASO 5. No sítio de não injeção, a expressão da proteína de AR diminuiu significativamente em cerca de 40 % nos grupos de tratamento de 100 e 1.000 pmoles/kg.
[00399] A inibição da expressão da proteína de AR observada na pele distai ao sítio da injeção demonstra que o ASO pode ser facilmente distribuído aos tecidos distais ao sítio de administração através da circulação sistêmica após uma injeção subcutânea. Os resultados ex vivo foram proporcionados para ilustrar o envolvimento alvo sistêmico após uma injeção subcutânea do derivado de PNA da Fórmula I e,
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115/189 portanto, não devem ser interpretados como limitante do escopo da presente invenção.
[00400] AR Exemplo 7. Salto de Éxon Induzido por AR-ASO 1 (2).
[00401] Dependendo da passagem, densidade celular e condições de cultura, a morfologia das células MCF7 variou. As células MCF nas primeiras passagens tenderam a crescer relativamente rápido e mostraram colônias de forma cumulus. É provável que as células MCF7 nas passagens posteriores cresçam lentamente e formem colônias epiteliais planas. No entanto, manter as células MCF7 para mostrar a morfologia da forma do cumulus foi um desafio.
[00402] O AR-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de salto do éxons em células MCF7 mostrando grosseiramente a morfologia da forma do cumulus como descrito em AR Exemplo 1, a menos que indicado de outro modo.
Tratamento com ASO [00403] As células MCF7 foram tratadas com AR-ASO 1 durante 3 horas a 0 (controle negativo), 30, 100 ou 1.000 aM (isto é, 1 fM). (2 placas de cultura por concentração de ASO)
Extração de RNA [00404] O RNA total foi extraído utilizando o kit de mini-preparação RNeasy (Número de Catálogo 74104, Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 500 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL.
Resultados do Salto de Éxon [00405] A Figura 27A fornece os dados de eletroforese obtidos com os produtos de RT-PCR aninhada. O salto do éxon 5 (confirmado pelo sequenciamento de Sanger: cf. Figura 27B) foi distintamente predominante nas células tratadas com o ASO, o que seria contrastado com o caso do AR Exemplo 1 (conforme Figura 23A).
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Exemplos para Atividade In Vitro e In Vivo de ASOs de SCN9A [00406] Os derivados de PNA de fórmula I que direcionam complementarmente múltiplos sítios de junção no pré-mRNA de SCN9A humano (subtipo de canal de sódio 9A) foram avaliados quanto à sua atividade antissenso de SCN9A e de salto do éxon em células e animais. Exemplos biológicos para estes ASOs de SCN9A são fornecidos como exemplos para ilustrar que o salto do éxon é potentemente induzido pelo composto de Fórmula I direcionando um sítio de junção em um pré-mRNA alvo e, portanto, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a ASOs de SCN9A.
[00407] SCN9A Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por SCN-ASO 7.
[00408] SCN-ASO 7 especificado na Tabela 4 é um ASO de 16mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 5’ que abrange a junção do éxon 4 e do íntron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano lido a partir do gene SCN9A humano (acessado da Sequência de Referência do NCBI: NC_000002.12). SCN-ASO 7 liga-se complementarmente à sequência de 16-mer marcada com negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ —> 3') IJÜGUUUUUGCl quaaquacuul. SCN-ASO 7 possui uma sobreposição de 10-mer com o éxon 4 e uma sobreposição de 6-mer com o íntron 4.
[00409] Dado que as células PC3 são conhecidas por expressarem abundantemente o pré-mRNA de SCN9A humman [Br. J. Pharmacol. vol. 156, 420-431 (2009)], SCN-ASO 7 foi avaliado por PCR Aninhada com SCN9A quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano em células PC3 como se segue. Cultura de Células & Tratamento com ASO [00410] As células PC3 (Número de Catálogo CRL-1435, ATCC) foram mantidas em meio F-12K de Ham suplementado com 10 % de FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina, 1 % de L-glutamina e 1 % de
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117/189 piruvato de sódio sob Atmosfera de 5 % de CO2 a 37°C.
[00411] Células PC3 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio foram tratadas com SCN-ASO 7 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM.
Extração de RNA [00412] Após uma incubação de 18 horas, as células PC3 foram tratadas com ciclo-heximida a 100 pg/mL durante mais 6 horas, a fim de congelar a translação ribossômica. Em seguida, 0 RNA total foi extraído das células utilizando 0 Kit de Extração de RNA Universal (número de catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00413] Utilizou-se 200 ng de padrão de RNA para uma reação de 25 pL de transcrição reversa utilizando 0 kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) e um conjunto de iniciadores específicos para éxon [SCN-éxon 2_dianteiro: (5’ -> 3’) CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT, e SCN-éxon 9___reverso: (5’ -» 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 40 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 55 e 2 min a 72°C.
Amplificação por PCR aninhada [00414] 1 pL de solução de cDNA (diluído em 100X) foi submetido a uma amplificação por PCR de 20 pl por PCR aninhada (Número Cat. K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [SCN-éxon 3n dianteiro: (5’ > 3') GGACCA-AAAATGTCGAGTATTT; e SCN-éxon 8 .reverso: (5’ -» 3') GCTAAGAAGGCCCAGC-TGAA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 5 min seguido por 35 ciclos de 30 seg a 95°C, 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C.
[00415] Note-se que 0 iniciador de SCN-éxon 3n dianteiro tem
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118/189 como alvo a junção do éxon 3 e éxon 5 para efetivamente sondar a deleção do éxon 4, embora o iniciador de 22-mer ainda possua uma sobreposição complementar de 18-mer com a junção do éxon 3 e éxon 4. Desta maneira, SCN-éxon 3n dianteiro reconhece a junção do éxon 3 e éxon 5 mais seletivamente do que a junção do éxon 3 e éxon 4 encontrada no mRNA de SCN9A de tamanho natural. A sequência de iniciadores foi concebida para detectar variantes de junção de SCN9A sem o éxon 4 mais sensivelmente do que o mRNA de SCN9A de tamanho natural. Tal iniciador de salto do éxons pode ser util para detectar variantes de junção de mRNA com fraca estabilidade metabólica, uma vez que o mRNA de tamanho natural tende a apresentar boa estabilidade metabólica obtida através da evolução ao longo de bilhões de anos.
Identificação de Produtos de Salto de Éxon [00416] Os produtos de PCR aninhada foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por sequenciamento de Sanger. O salto do éxon 4 era visivelmente forte em células PC3 tratadas com SCN ASO 7 a 1 aM, embora o salto do éxon 4 fosse visível também a 10 e 100 zM como mostrado na Figura 28A. A banda de salto do éxon foi inequivocamente confirmada pelo sequenciamento de Sanger, conforme mostrado na Figura 28B.
[00417] SCN9A Exemplo 2. qPCR por SYBR Green para mRNA de SCN9A em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 7.
[00418] O SCN-ASO 7 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A humano em células PC3 por qPCR contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon, como se segue.
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Cultura de Células & Tratamento com ASO [00419] Células PC3 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram incubadas com SCN-ASO 7 por horas a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (2 placas de cultura por concentração)
Extração de RNA [00420] O RNA total foi extraído utilizando Kit de Extração de RNA Universal MiniBEST (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00421] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa 20pL utilizando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) e contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [SCN-éxon 2_dianteiro: (5’ > 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; e SCN-éxon 9....reverso: (5’ 3') TTGCCTGGTTCTGTTCTT], Condições do Ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, o que foi seguido por 15 ciclos de 15 s a 94°C, 30 s a 55 e 2 min a 72°C.
Amplificação de qPCR aninhada [00422] 1 pL de cada solução de cDNA diluída em 50X foi submetida a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [SCN-éxon 4__dianteiro: (5’ —> 3') GTACACTTTTACTGGAATATATAC; SCN-éxon 4 .reverso: (5’ -> 3’) AATGACGACAAAATCCAGC; SCN-éxon 5__dianteiro: (5! 3') GTATTACAGAAT-TTGTAAACCT; SCN-éxon 5_reverso: (5’ > 3') CTGGGATTA-CAGAAATAGTTTTCA; SCN-éxon 6 ..dianteiro: (5’ -» 3’) GAAGACAATTGTAGGGGC; SCN-éxon 6__reverso: (5’ 3’) GTCTTCTTCACTCTCTAGGG]. As reações de PCR foram sondadas com SYBR Green (Takara, Jap). Condições do ciclo: 95°C durante 30 seg seguido
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120/189 de 40 ciclos 5 seg a 95°C e 30 seg a 60°C.
Resultados de qPCR [00423] O nível de éxon individual das células tratadas com ASO foi normalizado contra o nível de éxon das células controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO). A Figura 29 (A) resume os resultados do qPCR. Os níveis de expressão dos éxons 4-6 diminuíram significativamente em cerca de 70 %, 40 % e 20 ~ 30 % em 10, 100 e 1.000, respectivamente.
[00424] SCN9A Exemplo 3. qPCR por SYBR Green para mRNA de SCN9A em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 3.
[00425] SCN-ASO 3 especificado na Tabela 4 é um ASO de 14mer que tem como alvo o sítio de junção 5’ que abrange a junção do éxon 4 e do intron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 3 liga-se complementarmente à sequência de 12-mer marcada com negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ > 3') UUGUUUUUGC | gua ag uacuul, em quais as duas diferenças estão marcadas com um sinal de aspas (). SCN-ASO 3 possui uma sobreposição complementar de 7-mer com o éxon 4 e uma sobreposição complementar de 5-mer com o íntron 4.
[00426] O SCN-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A de tamanho natural em células PC3 de acordo com o protocolo descrito em SCN9A Exemplo 2, salvo indicação em contrário.
[00427] Os resultados do qPCR são fornecidos como resumidos na Figura 29B. Os níveis de expressão dos éxons 4-6 diminuíram significativamente em> 90 %, aproximadamente 70 % e aproximadamente 80 % em 10, 100 e 1.000, respectivamente. Tal como no caso de SCN-ASO 7, 10 zM manifestou a inibição mais forte do mRNA de SCN9A de tamanho natural.
[00428] SCN9A Exemplo 4. qPCR por SYBR Green para mRNA de
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SCN9A em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 8.
[00429] SCN-ASO 8 especificado na Tabela 4 é um ASO de 17mer que tem como alvo uma região no sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 4 e do íntron 4 no pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 8 liga-se complementarmente à sequência de 15-mer marcada com negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 20-mer de [(5’ > 3') UUGUUUUUGCl qua ag uacuu], em qual a incompatibilidade é marcada com um sinal de aspas ( ). SCN-ASO 8 possui uma sobreposição complementar de 10-mer com o éxon 4 e uma sobreposição complementar de 5-mer com o íntron 4 no prémRNA de SCN9A humano.
[00430] SCN-ASO 8 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A de tamanho natural em células PC3 de acordo com o protocolo descrito em SCN9A Exemplo 2, a menos que indicado de outro modo.
[00431] Os resultados do qPCR são fornecidos como resumidos na Figura 29C. Os níveis de expressão dos éxons 4-6 diminuíram significativamente em 50 - 70 % e 70 - 80 % em 10 e 100 zM, respectivamente.
[00432] SCN9A Exemplo 5. Inibição da Corrente de Sódio pelo Ensaio CoroNa em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 7.
[00433] Corrente de sódio celular é medida por grampo de emplastro. À medida que os íons de sódio entram na célula, o nível de tons de sódio intracelular aumenta. O nível de sódio intracelular pode ser sondado usando um corante sensível ao ion de sódio. CoroNa Green é um corante com um quelante de íons de sódio do tipo éter de coroa. Após a quelação com um ion de sódio, CoroNa Green emite fluorescência verde. O CoroNa Green tem sido usado para medir indiretamente o nível de sódio intracelular. Verificou-se que o nível de sódio medido pelo CoroNa Green correlaciona-se bem com a corrente de
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122/189 ions de sódio medida pelo dispositivo de bloqueio de íons de sódio. [Proc. Natl. Acad. Ser USA vol 106 (38), 16145-16150 (2009)] [00434] Sabe-se que as células PC3 expressam abundantemente o mRNA de SCN9A humano, embora existam outros subtipos de SCN expressos concomitantemente. [Br. J. Pharmacol, vol 156, 420-431 (2009)] Desta maneira, uma inibição da expressão de mRNA de SCN9A pode levar a uma redução considerável da corrente de sódio em células PC3, se a corrente de íon de sódio pelo subtipo de canal de sódio Nav1.7°Cupar uma porção marcada da corrente de íons de sódio total em células PC3. Note-se que o mRNA de SCN9A codifica o subtipo do canal de sódio Nav1.7.
[00435] O SCN-ASO 7 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de íons de sódio nas células PC3 utilizando CoroNa Green como se segue.
Tratamento com ASO [00436] Células PC3 cultivadas em placa de cultura de 35 mm contendo 2 mL de F-12K foram tratadas com SCN-ASO 7 a OzM (controle negativo), 100 zM ou 1 aM.
Ensaio CoroNa [00437] 30 horas mais tarde, as células foram lavadas com 2 ml de
HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank, número de cat. 14025092, Life Technologies) e depois carregadas com 2 ml de HBSS fresco. Em seguida, as células foram tratadas com 5 μΜ de CoroNa Green (número de catálogo C36676, Life Technologies) a 37°C. 30 min depois, as células foram lavadas 2X com 2 mL de HBSS e carregadas com 2 mL de HBSS fresco. A placa de cultura foi montada em um microscópio de fluorescência Olympus equipado com uma câmera de vídeo digital para capturar continuamente as imagens de fluorescência verde das células. As células foram tratadas de forma aguda com NaCI 100 mM e depois as mudanças nas imagens celulares de
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123/189 fluorescência foram registadas digitaimente ao longo de um período de 3 min. Havia cerca de 4 células por quadro, em média. As intensidades de fluorescência de cada célula individual foram rastreadas na resolução de um segundo. Os traços das intensidades de fluorescência intracelular de células individuais foram sobrepostos e calculados em média em cada ponto de tempo. A média dos traços das células individuais de cada concentração de ASO foram traçados como previsto na Figura 30A usando o programa ImageJ (versão 1.50Í, NIH). O traço de intensidade de fluorescência média foi tomado como o traço da concentração de sítio intracelular individual para as células tratadas com SCN-ASO 7 a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
Resultados do Ensaio CoroNa [00438] Os traços observados da intensidade de fluorescência intracelular estão resumidos na Figura 29B. O traço de intensidade de fluorescência para as células tratadas com SCN-ASO 7 a 1.000 μΜ é inferior ao traço para as células sem tratamento com ASO. A intensidade média de fluorescência das células sem tratamento com ASO foi de 81,86 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Desta maneira, a intensidade média de fluorescência das células tratadas com SCN-ASO 7 a 1.000 zM foi de 51,47 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Desta maneira, a incubação de 30 horas com SCN-ASO 7 a 1.000 μΜ induziu uma redução significativa da atividade do canal de sódio em 37 % de (p <0,05 pelo teste t de Student) em células PC3. Considerando que as células PC3 expressam vários subtipos do canal de sódio dependente de voltagem (VGSC), a diminuição de 37 % é considerada marcada pela inibição da expressão de Nav1.7 por SCN-ASO 7. Não houve diminuição notável na corrente de sódio nas células tratadas com SCN-ASO 7 a 100 zM.
[00439] SCN9A Exemplo 6. Inibição da Corrente de Sódio por Ensaio CoroNa em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 3.
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124/189 [00440] O SCN-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de sódio em células PC3 usando CoroNa Green de acordo com o protocolo descrito em SCN9A Exemplo 5, a menos que indicado de outra forma.
[00441] Os traços observados da intensidade de fluorescência celular são fornecidos na Figura 30B. O traço médio da intensidade de fluorescência é menor nas células tratadas com SCN-ASO 3 do que nas células sem tratamento com ASO. A intensidade média de fluorescência celular das células sem tratamento com ASO foi de 89,32 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Entretanto, a intensidade média de fluorescência celular das células tratadas com SCN-ASO 3 a 1.000 zM foi de 61,36 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Desta maneira, SCN-ASO 3 a 1.000 zM significativamente (p <0,01) diminuiu a corrente de sódio em 31 % nas células PC3. A diminuição induzida por SCN-ASO 3 a 100 zM foi de 18 %, embora sem significância.
[00442] SCN9A Exemplo 7. Inibição da Corrente de Sódio em Células PC3 Tratadas com SCN-ASO 8.
[00443] SCN-ASO 8 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de sódio em células PC3 usando CoroNa Green de acordo com o protocolo descrito em SCN9A Exemplo 3, a menos que indicado de outra forma.
[00444] Os traços observados da intensidade de fluorescência celular são fornecidos na Figura 30C. O traço médio da intensidade de fluorescência é menor nas células tratadas com SCN-ASO 8 do que nas células sem tratamento com ASO. A intensidade média de fluorescência celular das células sem tratamento com ASO foi de 130,32 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Entretanto, a intensidade média de fluorescência celular das células tratadas com SCN-ASO 8 a 1.000 zM foi de 89,7 (unidade arbitrária) a 100 segundos. Desta maneira, SCN-ASO 8 a 1.000 zM significativamente (p <0,001) diminuiu
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125/189 a corrente de sódio em 31 % nas células PC3. A diminuição induzida por SCN-ASO 8 a 100 zM foi de 30 % de (p <0,001).
[00445] SCN9A Exemplo 8. Salto de Éxon Induzido por SCN-ASO em Células PC3 (A).
[00446] SCN-ASO 27 especificado na Tabela 5 é um ASO de 14mer totalmente complementar ao sítio de junção 3’ que abrange a junção de íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de SCN9A humano. A sequência alvo de 14-mer dentro do sítio de junção 3' é marcado com negrito e sublinhado na sequência pré-mRNA de 20-mer de SCN9A de [(5' - 3 ') uuqugiiuuag | GUACACUUUU1. SCN-ASO 27 possui uma sobreposição de 6-mer com íntron 3, e uma sobreposição de 8mer com éxon 4.
[00447] O SCN-ASO 27 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 em células PC3 como descrito em SCN9A Exemplo 1, salvo indicação em contrário.
Cultura de Células & Tratamento com ASO [00448] Células PC3 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com SCN-ASO 27 em 0 (controle negativo), 1, 10 ou 100 zM.
Amplificação por PCR aninhada [00449] 1 pL de cDNA foi adicionalmente amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SCN-éxon 2n dianteiro: (5’ -> 3') CCACCGGACTGGACCAAAAA ; e SCN-éxon 9n reverso: (5’ -> 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95 durante 2 min seguido por 34 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 55 e 1 min a 72°C.
Identificação de Produtos de Salto de Éxon [00450] A Figura 31A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhadas, em que as células tratadas com SCN-ASO 27
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126/189 produziram uma banda de PCR forte atribuível ao salto dos éxons 4-5. No entanto, a intensidade da banda de PCR para o mRNA de SCN9A de tamanho natural foi mais forte em amostras de tratamento de ASO a 10 zM e 100 zM do que nas amostras do controle negativo. O estranho padrão de resposta à dose na PCR aninhada pode ser devido a uma regulação da transcrição induzida pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon por SCN-ASO 27. [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22 (3), 256-264 (2015)] O produto de PCR de salto do éxon foi confirmado por sequenciamento de Sanger para corresponder ao salto do éxons 4-5. (conforme Figura 31B) [00451] SCN9A Exemplo 9. Salto de Éxon Induzido por SCN-ASO 27 em Células PC3 (B).
[00452] O SCN-ASO 27 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 4 em células PC3 como descrito em SCN9A Exemplo 8, salvo indicação em contrário. Nesta experiência, as células PC3 foram tratadas com SCN-ASO 27 a 0 (controle negativo), 1, 10, 100 e 1000 aM durante 24 horas.
Amplificação de PCR aninhada [00453] A reação de PCR aninhada foi realizada contra um conjunto de iniciadores de [SCN-éxon 3/6__dianteiro: (5’ —+ 3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT; e SCN-éxon 9n__reverso: (5’ > 3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA] desenvolvido para amplificar seletivamente o produto que possui a sequência de junção do éxon 3 e éxon 6.
[00454] Note-se que a sequência iniciadora de SCN-éxon 3/6 dianteiro tem como alvo a junção do éxon 3 e éxon 6 para sondar o salto dos éxons 4-5, embora o iniciador de 20-mer ainda retenha uma sobreposição complementar de 17-mer com a junção do éxon 3 e éxon 4. Desta maneira, a sequência de iniciadores de SCN-éxon 3/6„_dianteiro” reconhece a junção de éxon 3 e éxon 6 mais seletivamente do que a junção de éxon 3 e éxon 4 encontrada no mRNA de
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SCN9A de tamanho natural· A sequência iniciadora foi concebida para detectar a variante de junção de SCN9A sem os éxons 4-5 mais sensivelmente do que o mRNA de SCN9A de tamanho natural. Tal iniciador de salto do éxons seria útil para detectar variantes de junção de mRNA com fraca estabilidade metabólica, uma vez que os mRNA de tamanho natural tendem a mostram boa estabilidade metabólica obtida através da evolução ao longo de bilhões de anos.
[00455] A Figura 31C fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada, nos quais as células tratadas com SCN-ASO 27 produziram uma forte banda de PCR atribuível ao salto dos éxons 4-5, o que foi confirmado por sequenciamento de Sanger.
[00456] SCN9A Exemplo 10. qPCR pela Síntese de cDNA de Uma Etapa para o mRNA de SCN9A em Células PC3 Tratada com SCNASO 27.
[00457] SCN-ASO 27 foi avaliado por qPCR aninhada por SCN9A quanto à sua capacidade para induzir mudanças no nível de mRNA de SCN9A humano em células PC3 como descrito em SCN9A Exemplo 2, salvo indicação em contrário.
Tratamento com ASO [00458] As células PC3 foram tratadas com SCN-ASO 27 a 0 (controle negativo), 0,1, 1 ou 10 aM durante 24 horas. (2 placas de cultura por concentração de ASO)
Síntese de cDNA por PCR de Uma Etapa [00459] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos para éxon de [SCN-éxon 2 dianteiro: (5’ —> 3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT; e SCN-éxon 8/9_reverso: (5! -> 3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de
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128/189 seg a 94°C, 30 seg a 55 e 2 min a 72°C.
Amplificação de qPCR aninhada [00460] 1 μΙ de cada solução de cDNA diluída em 100X foi submetida a uma reação de PCR de 20 pL em tempo real contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SCN-éxon 3 dianteiro: (5’ -> 3') TGACCATGAATAACCCAC; e SCN-éxon 4_reverso (2): (5’ 3’)
GCAAGGATTTTTACAAGT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 30 seg seguido de 40 ciclos 5 seg a 95°C e 30 seg a 60°C. A reação de qPCR foi monitorada com uma sonda TaqMan de [(5’ -> 3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC -3IABkFQ] direcionando a junção do éxon 3 e éxon 4 no mRNA de SCN9A de tamanho natural.
[00461] O nível de tamanho natural de mRNA de SCN9A diminuiu significativamente (pelo teste t de Student) nas células tratadas com SCN-ASO 27 em cerca de 35 a 45 %, como proporcionado na Figura 32A.
[00462] SCN9A Exemplo 11. qPCR por síntese de cDNA com Hexâmeros Aleatórios para mRNA de SCN9A em Células PC3 Tratada com SCN-ASO 27.
[00463] SCN-ASO 27 foi avaliado por qPCR de SCN9A quanto à sua capacidade para induzir mudanças no nível de mRNA de SCN9A humano em células PC3 como descrito em SCN9A Exemplo 10, a menos que indicado de outro modo. O cDNA foi sintetizado utilizando hexâmeros aleatórios e submetido a reação de qPCR SCN9A utilizando a sonda TaqMan.
[00464] O nível de mRNA de SCN9A de tamanho natural diminuiu significativamente teste t) nas células tratadas com SCN-ASO 27 em cerca de 50 a 60 % como proporcionado na Figura 32B.
[00465] SCN9A Exemplo 12. Inibição da Corrente de Sódio por Ensaio CoroNa em Células de DRG de L5 de Rato Ativadas por SNL
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129/189 por SCN-ASO 27.
[00466] SCN-ASO 27 é um ASO de SCN9A de 14-mer totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano, mas possui um não pareamento único do pré-mRNA de SCN9A de rato lido a partir do DNA genômico de rato [Sequência de Referência de NCBI: NC__000002.12] . SCN-ASO 27 possui uma sobreposição complementar de 13-mer e um não pareamento único com o pré-mRNA de SCN9A de rato marcado como negrito e sublinhado na sequência de mRNA de 20-mer de rato de [(5’ -> 3S) uuuc c uuuag | GUACACUUUU1, em que o não pareamento único é marcado com um sinal de aspas ().
[00467] O SCN-ASO 27 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de ions de sódio em células de DRG de rato (gânglio da raiz dorsal) utilizando CoroNa Green como se segue.
Ligadura do Nervo Espinhal [00468] A ligadura do nervo espinhal (SNL) induz a neuropatia nos gânglios da raiz dorsal (GRD) e na medula espinhal e tem sido amplamente usada como modelo para as dores neuropáticas. [Pain vol 50 (3), 355-363 (1992)] Dependendo de como o (s) nervo (s) da coluna é(são) ligado(s), no entanto, pode haver várias variações do SNL. O grau e a duração da neuropatia no DRG parecem variar dependendo de como o nervo espinal é ligado. [Pain vol 43 (2), 205-218 (1990)] A dupla ligadura do nervo espinhal L5 e L6 (isto é, ligadura L5/L6) induz a neuropatia mais severa e persistente por mais tempo que a ligadura do nervo espinhal L5 sozinha (isto é, ligadura L5).
Cirurgia do SNL por Ligadura L5/L6 [00469] No dia 0, ratos SD machos com 6 semanas de idade foram anestesiados com zoletil/rompun. Em seguida, o nervo espinhal L5 e L6 (lado esquerdo) foram expostos e firmemente ligados. O músculo e a pele foram fechados e cortados por procedimentos assépticos devidos. Os ratos foram esporadicamente sensibilizados por von Frey,
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130/189 marcando um período de 4 semanas.
Preparação de Células Neuronais de DRG [00470] No Dia 31, um rato apresentando um baixo ponto de von Frey foi sacrificado para extrair o DRG esquerdo (lado ligado) e o lado direito (lado sem ligadura). Os DRGs foram imersos em 0,5 mL de PBS imediatamente após a extração. As células de DRG foram preparadas como segue de acordo com os procedimentos divulgados na literatura. [Methods Mol Biol, vol 846, 179-187 (2012); PLOS One vol 8 (4); e60558 (2013)] [00471] © O DRG foi imerso em um tubo de 1,5 ml contendo 0,2 ml de colagenase a 0,125 % (Colagenase Tipo IV, Número de Cat.° C5138-100MG, Sigma) em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank, Número de Catálogo 14025-092, Life Technologies) picado com uma tesoura em pedaços pequenos e incubado durante 20 min em uma incubadora de CO2 a 37°C sob 5 % de CO2 e 95 % de HR; © 50 pL de thpsina/EDTA a 0,25 % foram adicionados ao tubo e, que foi mantido na incubadora por mais 10 min; ® 0 tubo-e foi carregado com 1 mL de meio DMEM completo, e submetido a sedimentação centrífuga a 600 g por 5 min; © 0 pélete resultante foi suspenso em 4 mL de meio Neurobasal-A (Meio Neurobasal®, Número de Cat. 21103-049, Gibco) suplementado com 2X B-27 (Suplemento Sem Soro B-27®, Número de Catálogo 17504-044 , Gibco), 1X penicilina-estreptomicina, 1X L~glutamina, e 1 mL da suspensão celular foram cuidadosamente semeados sobre um vidro de cobertura revestido com laminina (Número de Cat. GG-25-1.5-lamin!na, Neuvitro) colocado em uma placa de cultura de 35 mm; © um dia após a semeadura, a placa foi cuidadosamente carregada com outro meio de Neurobasal-A fresco de 1 mL; Dois dias após a semeadura, 0 meio foi substituído por 2 mL de meio fresco de Neurobasal-A suplementado com 1 μΜ de Ara-C (Número de Catálogo C1768-100MG, Sigma) para suprimir seletivamente 0 cresPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 220/291
131/189 cimento de células diferentes das células neuronais de DRG; © quatro dias após a semeadura, o meio foi substituído novamente com 2 mL de meio Neurobasal-A fresco suplementado com 1 μΜ de Ara~C; e ® cinco ou seis dias após a semeadura, as células neuronais do DRG foram tratadas com SCN-ASO 27!!.
Tratamento com ASO & Ensaio CoroNa [00472] Células neuronais DRG de L5 com ligação L5/L6 ou sem ligação L5/L6 foram tratadas com SCN-ASO 27 a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM. 30 horas depois, as células foram lavadas com 2 mL de HBSS e, em seguida, carregadas com 2 mL de HBSS fresco. Em seguida, as células foram tratadas com 5 μΜ CoroNa Green a 37°C. 30 min depois, as células foram lavadas 2X com 2 mL de HBSS e carregadas com 2 mL de HBSS fresco. A placa de cultura foi montada em um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera CCD para capturar continuamente as imagens fluorescentes verdes das células. As células foram tratadas de forma aguda com NaCI 10 mM e depois as mudanças na intensidade de fluorescência celular foram registadas digitalmente ao longo de um período de 300 seg. Havia 4 a 5 células por estrutura para captura de imagem. As intensidades de fluorescência de cada célula individual foram traçadas com uma resolução de um segundo. Os traços das intensidades de fluorescência intracelular das células individuais foram calculados utilizando o programa ImageJ (versão 1.501, NIH), e os traços médios são fornecidos nas Figuras 33A e 33B para as células com ligadura L5/L6 e sem ligadura L5/L6, respectivamente. O traço de intensidade de fluorescência média foi tomado como o traço de concentração de sódio intracelular individual para as células tratadas com SCN-ASO 27 a 0 (controle negativo), 100 ou 1.000 zM.
Resultados do Ensaio CoroNa [00473] Nas células estimuladas com ligadura L5/L6 (ver Figura
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33A), o tratamento de 30 horas com SCN-ASO 27 a 100 zM ou 1 aM resultou em uma diminuição significativa (pelo teste t de Student) em a intensidade média de fluorescência celular em 80 a 85 % no tempo de
150 seg.
[00474] Nas células sem ligadura L5/L6 (conforme Figura 33B), o tratamento de 30 horas com SCN-ASO 27 a 1 aM produziu um decréscimo de cerca de 50 % na intensidade de fluorescência. No caso das células não estimuladas tratadas com SCN-ASO 27 a 100 zM, não houve diminuição na intensidade de fluorescência. A intensidade de fluorescência das células sem ligadura L5/L6 foi consideravelmente menor do que a das células estimuladas com ligadura L.5ZL6, o que sugere que L5./L6 induz uma regulação positiva marcada da atividade do canal de sódio Nav1.7.
[00475] Sabe-se que as células neuronals de DRG sem estimulação neuropática expressam vários subtipos de VGSC incluindo Nav1.7, Nav1.8, Nav1.2 e assim por diante. O subtipo Nav1.7 mostra uma contribuição limitada para toda a corrente de sódio em células neuronais DRG sem estimulação. [Nature Comm, vol 3, Artigo número 791: DOI: 10.1038/ncomms1795 (2012)] As células neuronais de DRG sem ligadura L5/L6 podem mostrar uma contribuição limitada da corrente de sódio do subtipo Nav1.7.
[00476] Entretanto, as células neuronais são conhecidas por regularem a expressão de Nav1.7 em resposta a neuropatia persistente. [J Bio! Chem. vol 279 (28), 29341-29350 (2004); J Neurosci.vol 28 (26), 6652-6658 (2008)] SCN-ASO 27 a 100 zM e 1 aM inibiram a corrente de sódio em 80 a 85 % nas células neuronais estimuladas por ligadura L5/L6 . A maior inibição da corrente de sódio por SCN-ASO 27 nas células de DRG com ligadura L5/L6 é consistente com a regulação positiva de Nav1.7 em células neuronais devido a neuropatia crônica.
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133/189 [00477] SCN9A Exemplo 13. Inibição da Expressão de Proteína
Nav1.7 em Células Neuronaís de DRG de L5 por SCN-ASO 30.
[00478] SCN-ASO 30 é um ASO de 14-mer totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A de rato, enquanto SCN-ASO 27 é um ASO de 14-mer totalmente complementar ao pré-mRNA de SCN9A humano. SCN-ASO 30 possui uma única incompatibilidade com SCN-ASO 27 na extremidade do C-terminal. SCN-ASO 30 contra o pré-mRNA de SCN9A de rato pode servir como um bom modelo de ASO para SCN-ASO 27 contra o pré-mRNA de SCN9A humano.
[00479] O SCN-ASO 30 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína Nav1.7 em células neuronaís DRG de rato como descrito abaixo.
Preparação de Células Neuronaís de DRG [00480] Ratos SD machos (7 semanas de idade) foram submetidos a ligeira ligadura L5/L6. 7 dias depois, 4 ratos foram anestesiados com zoletil/rompun para amostrar o DRG de L5 do lado ligado. Os DRGs foram reunidos e processados para preparar células neuronaís de DRG como descrito em SCN9A Exemplo 12.
T ratamento ASO [00481] As células neuronaís de DRG foram tratadas com SCNASO 30 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM por 24 horas, e então submetidas à lise para western blot contra um anticorpo Nav1.7 (Número de Catálogo ab85015, Abeam) sondando o C-terminal da proteína Nav1.7. A β-actina foi sondada para referência.
Inibição da Expressão de Nav1.7 [00482] A Figura 34A fornece os dados de western blot obtidos nas células neuronaís de DRG tratadas com SCN-ASO 30 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. Todos os lisados produziram uma banda forte a 170K, que seria atribuível a um fragmento ou metabólito da proteína Nav1.7 de tamanho natural. A banda de proteína Nav1.7 de
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134/189 tamanho natural foi detectada a 220 -- 240 K apenas com os lisados do controle negativo e SCN-ASO 30 a 10 zM. Desta maneira, a expressão de Nav1.7 foi marcadamente inibida em células neuronais DRG de rato Após uma incubação de 24 horas com SCN-ASO 30 a 100 e
1.000 mM.
[00483] SCN9A Exemplo 14. Inibição da Corrente de Sódio em Células Neuronais de DRG de L5 de Rato por SCN-ASO 30.
[00484] O SCN-ASO 30 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a corrente de sódio em células neuronais de DRG de L5 de rato estimuladas com ligadura L5/L6 como proporcionado abaixo.
Preparação de Células Neuronais de DRG [00485] Ratos SD machos (6 semanas de idade) foram submetidos a ligeira ligadura L5/L6. 7 dias depois, os ratos foram anestesiados com zoletil/rompun para a extração de DRG de L5 do lado ligado. As células neuronais DRG de L5 foram preparadas da seguinte forma: ® O DRG foi imerso em um tubo de 1,5 mL contendo 0,2 mL de colagenase a 0,125 % em HBSS, picado com tesoura em pequenos pedaços e incubado por 20 min em incubadora de CO2 a 37°C sob 5 % de CO2 e 95 % de HR; ® 50 pL tripsina/EDTA a 0,25 % foram adicionados ao tubo-e e 0 tubo~e foi mantido na incubadora por mais 10 min; ® 0 tuboe foi carregado com 1 mL de meio DMEM completo, e submetido a sedimentação centrífuga a 600 g por 5 min; ® então 0 pélete resultante foi suspenso em 4 mL de meio Neurobasal-A (Meio Neurobasal®, Número de Cat. 21103-049, Gibco) suplementado com 2X B-27 (Suplemento Sem Soro B-27®, Número de Catálogo 17504 -044, Gibco), 1X penicilina-estreptomicina, 1X L~glutamina; © a suspensão de células de DRG foi transportada por cerca de uma hora, como selada em um tubo falcon de 15 mL contendo cerca de 15 mL de meio Neurobasal-A;
@ 0,5 mL da suspensão de células foi cuidadosamente semeado sobre um vidro de cobertura revestido com laminina colocado em uma
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135/189 cavidade de placa de cultura de placas de 24 cavidades; ® As células semeadas na placa de cultura foram incubadas em um incubador de CO2 a 37°C durante 2 horas para ligar as células ao vidro de cobertura e depois tratadas com SCN-ASO 30” a 0 (controle negativo) ou 100 zM durante 4 horas na incubadora; e ® as células neuronais de DRG foram submetidas à medição de corrente de sódio por ensaio manual de fixação de adesivo em um aparelho de fixação de adesivo de sódio (Axopatch 200B Amplifier, Axon Instruments).
Resultados do Ensaio de Grampo de Emplastro [00486] A Figura 34B fornece os dados de corrente de sódio normalizados em relação ao tamanho da célula. Após uma incubação com SCN-ASO 30 a 100 zM durante 4 horas, a corrente de sódio diminuiu significativamente (p <0,01 pelo teste t de Student) em cerca de 90 % nas células neuronais de DRG expressando canais de sódio sensíveis à tetrodotoxina, ou seja, células neuronais de pequeno tamanho. (N = 4 células por grupo) [00487] SCN9A Exemplo 15. qPCR pela Síntese de cDNA de Uma Etapa para 0 mRNA de SCN9A em Células de DRG de Rato Tratada com SCN-ASO 30.
[00488] O SCN-ASO 30 foi avaliado por qPCR aninhada por SCN9A quanto à sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A em células de DRG de rato como se segue.
Preparação de Células de DRG de L5 [00489] Um rato SD macho de 4 semanas de idade foi anestesiado com zoletil/rompun para extrair os DRGs de L5. As amostras de DRG foram reunidas e processadas para preparar células de DRG de L5 como descrito em SCN9A Exemplo 12.
Tratamento com ASO [00490] As células de DRG de rato foram tratadas com SCN-ASO
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136/189 a 0 (controle negativo), 10, 30, 100, 300 ου 1.000 zM. (1 placa de cultura por concentração de ASO)
Extração de RNA & Síntese de cDNA por PCR de Uma Etapa [00491] 24 horas mais tarde, o RNA total foi extraído das células utilizando Kit de Extração de RNA Universal (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Utilizou~se 200 ng de padrão de RNA para uma reação de transcrição reversa de 25 pL utilizando kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [SCN-éxon 2 (3) dianteiro: (5’ -» 3') CAATCTTCCGTTTCAACGCC e SCN-éxon 10__reverso: (5’ 3’) ACCACAGCCAGGATCAAGTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 55 e 2 min a 72°C.
Amplificação de qPCR aninhada [00492] 1 pL de cada solução de cDNA (duplicado por concentração) diluído em 100X foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL com uma sonda TaqMan (Número de Catálogo RnO1514993__mH, ThermoFisher) direcionando a junção de SCN9A éxon 3 e éxon 4 de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 30 seg seguido por 40 ciclos 5 seg a 95°C e 30 seg a 60°C.
[00493] A Figura 35A apresenta os dados de qPCR. O nível de expressão total de mRNA de SCN9A diminuiu significativamente (pelo teste t de Student) nas células tratadas com SCN-ASO 30 em cerca de 45 ~ 60 %, embora houvesse uma placa de cultura por cada concentração de ASO.
[00494] SCN9A Exemplo 16. qPCR por Hexâmeros Aleatórios de Síntese de cDNA para mRNA de SCN9A em Células de DRG de Rato Tratadas com SCN-ASO 30.
[00495] SCN-ASO 30 foi avaliado por qPCR de SCN9A quanto à
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137/189 sua capacidade de inibir a expressão do mRNA de SCN9A em células de DRG de L5 de rato. O RNA total foi preparado como descrito em SCN9A Exemplo 15, e submetido à síntese de cDNA utilizando hexâmeros aleatórios. As soluções de cDNA (duplicado por concentração de ASO) foram diluídas 100 vezes e 1 pL de cada produto de PCR diluído foi submetido a uma reação de PCR de 20 pL em Tempo Real com o TaqMan relacionando a junção do SCN9A éxon 3 e éxon 4 de acordo com as seguintes condições de ciclo: 95°C durante 30 s seguido por 40 ciclos 5 s a 95°C e 30 s a 60°C.
[00496] As soluções de cDNA foram também submetidas à amplificação de qPCR para o mRNA de GAPDH. Os valores de Ct do mRNA de SCN9A foram normalizados contra os valores de Ct de mRNA de GAPDH.
[00497] A Figura 35B fornece os dados de qPCR do SCN9A normalizados contra o GAPDH. O nível de expressão total de mRNA de SCN9A diminuiu significativamente (teste t de Student) nas células tratadas com SCN-ASO 30 em cerca de 45 - 75 %.
[00498] SCN9A Exemplo 17. Inversão de alodinia por ASO de SCN9A em ratos com dor neuropática periférica induzida por diabetes. [00499] O gene de SCN9A codifica a subunidade α do subtipo VGSC Nav1.7. Há um número extremamente pequeno de indivíduos que não sentem dores severas, mas são normais em outras funções sensoriais. Tais indivíduos foram encontrados com o gene de SCN9A mutado para codificar o subtipo não funcional Nav1.7. [Nature vol 444, 894-898 (2006)] Este foi denominado como canalopatia de SCN9A. Os fenótipos comportamentais da canalopatia de SCN9A humana foram reproduzidos bastante em camundongos nocautes para SCN9A. [PLOS One 9 (9): e105895 (2014)] Desta maneira, os ASOs de SCN9A de Fórmula I podem mostrar atividade analgésica em modelos de dor de animais que acompanham a regulação positiva de Nav1.7.
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138/189 [00500] SCN-ASO 7, SCN-ASO 8, SCN-ASO 21”, SCN-ASO 35, SCN-ASO 36 e SCN-ASO 37 foram avaliados quanto à sua capacidade de reverter a alodinia em ratos com dor neuropática periférica induzida por diabetes (DPNP). Neste exemplo, os seis ASOs de SCN9A direcionando um total de cinco sítios de junção foram avaliadas quanto à sua capacidade de reverter a alodinia induzida por neuropatia diabética em ratos.
Indução de DPNP e Agrupamento [00501] Diabetes foi induzido em ratos por uma injeção intraperitoneal de esterozotocina a 60 mg/kg no dia 0. No dia 10, ratos com DPNP foram aleatoriamente designados para 6 grupos de controle negativo (somente veículo), SCN -ASO 7” 100 pmol/kg, SCN-ASO 8” 100 pmol/kg, SCN-ASO 21 100 pmol/kg, SCN-ASO 35 100 pmol/kg, SCN-ASO 36 100 pmol/Kg e SCN-ASO 37 100 pmol/Kg. Os animais foram agrupados com base nos resultados de von Frey de animais individuais no Dia 10. (N - 8 - 9 por grupo) A alodinia foi avaliada utilizando um conjunto de microfilamentos (Touch Test®) de acordo com o método Up & Down. [J Neurosci. Methods vol 53 (1), 55-63 (1994)]
Tratamento com ASO e Von Frey [00502] As soluções de ASO para injeção foram preparadas diluindo em série as soluções mãe dos ASOs de SCN9A a 100 nM em PBS (solução salina tamponada com fosfato). Os animais foram administrados subcutaneamente com ASO a 1 mL/Kg nos Dias 11, 13, 15, 17 e 19. A pontuação de Von Frey foi realizada 2 horas após a dose nos dias 11, 13, 15, 17 e 19. A pontuação de Von Frey foi adicionalmente realizada nos dias 21 e 23 para avaliar a duração da atividade terapêutica após a dosagem final. As pontuações diárias de von Frey foram avaliadas quanto à significância estatística pelo teste t de Student contra o grupo controle negativo (somente veículo, ou seja, PBS).
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Atividade Terapêutica [00503] As pontuações de von Frey observadas estão resumidas na Figura 36. A alodinia foi significativamente revertida por todos os ASOs, exceto SCN-ASO 36 e SCN-ASO 37, embora SCN-ASO 37 tenha mostrado uma clara tendência de atividade terapêutica (valor de p ··· 0,057 no Dia 19). A atividade terapêutica tendeu a aumentar gradualmente à medida que a dosagem foi repetida. A eficácia terapêutica máxima baseada nas pontuações de von Frey no dia 19 foi de 76 % (significativo), 61 % (significativo), 93 % (significativo), 52 % (significativo), 0 % e 22 % (não significante, valor de p - 0,05X) para SCN-ASO 7, SCN-ASO 8, SCN-ASO 21, SCN-ASO 35, SCN ASO 36 e SCN-ASO 37 , respectivamente.
[00504] SCN-ASO 7, SCN-ASO 8, SCN-ASO 21 e SCN-ASO 35 possuem uma sobreposição complementar de 5-mer com o seu íntron alvo. Entretanto, SCN-ASO 36 e SCN-ASO 37 possuem uma sobreposição complementar de 4-mer e 3-mer com o seu íntron alvo, respectivamente. Embora haja vários fatores que afetam a eficácia terapêutica, o número da sobreposição complementar com o íntron alvo parece afetar a eficácia terapêutica.
[00505] Neste exemplo, a atividade antissenso in vivo foi observada com ASO de SCN9A tendo como alvo 4 de 5 sítios de junção. A taxa de acerto de 80 % é considerada muito alta, dado que a atividade terapêutica in vivo depende de vários fatores, incluindo a atividade antissenso celular, o enriquecimento de moléculas de fármaco no tecido alvo, a meia-vida farmacocinética, e assim por diante. Desta maneira, o composto de Fórmula I modula de forma previsível a expressão do seu gene alvo.
[00506] Dado com o peso molecular de SCN-ASO 7 (conforme Tabela 4), 100 pmol/Kg é transladado em uma dose terapêutica de cerca de 0,53 pg/Kg. A potência do salto do éxon subatomolar in vitro
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140/189 de SCN-ASO 7 é considerada o grande responsável pela potência terapêutica ultraforte /7? vivo de cerca de 0,53 pg/kg em ratos com neuropatia diabética. Ainda mais surpreendentemente, o ASO foi administrado como oligonucleotídeo nu. Essa potência terapêutica in vivo forte nunca foi realizada com outras classes de oligonucleotídeos incluindo DNA, RNA, PTO, 2’-OMe PTO, 2s-OMe RNA, 2'~OMOE RNA, LNA, PMO, PNA e assim por diante.
Exemplos para Atividade In Vivo e Ex Vivo de ASOs de PMO [00507] A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença rara, monogênica, com risco de vida e degeneração muscular. Os pacientes com DMD não codificam a proteína distrofina de tamanho natural devido a um PTC (códon de terminação prematura) resultante de uma mutação pontual ou deleção de éxon (s).
[00508] O camundongo mdx (C57BL/10ScSn-Dmdrtld7J, Jackson Lab) é um camundongo mutante com uma mutação pontual no éxon 23 do gene da distrofina, que produz um PTC. Camundongos Mdx codificam uma forma truncada de distrofina sem a porção C-terminal. Uma vez que a porção C-terminal se liga à matriz extracelular (ECM), a forma truncada perde o seu papel destinado a ligar firmemente as fibras musculares ao ECM. Consequentemente, os camundongos mdx perdem gradualmente a integridade e força muscular com a idade.
[00509] Camundongos Mdx têm sido amplamente adotados como um modelo animal para DMD humana. ASOs de distrofina direcionando o éxon 23 de distrofina do rato foram investigados para eliminar o PTC através do salto do éxon 23.
[00510] Derivados de PNA de Fórmula I direcionando complementarmente o sítio da junção 3' ou 5’ do éxon 23 no pré-mRNA de distrofina de camundongo foram avaliados quanto à sua capacidade para induzirem o salto do éxon 23 de distrofina em camundongos mdx. Exemplos biológicos aqui proporcionados são para ilustrar a capacidaPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 230/291
141/189 de de salto do éxon de ASOs de distrofina como exemplos para o composto de Fórmula I e, por conseguinte, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a ASOs de distrofina.
[00511] DMD Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por DMD-ASO 1
ASO 4 em Camundongos Mdx (Método A de PCR Aninhada).
[00512] DMD-ASO 1 especificado na Tabela 7 é um ASO de 13mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ que abrange a junção do íntron 22 e éxon 23 no pré-mRNA de distrofina de camundongo. DMD-ASO 1” liga-se complementarmente à sequência de 13-mer marcado como negrito e sublinhado na sequência de 25mer de [(5’ 3’) uaauuuugag | GCUCUGCAAAGTTCT1. DMD-ASO possui uma sobreposição de 8-mer com o íntron 22 e uma sobreposição de 5-mer com o éxon 23.
[00513] DMD-ASO 4 especificado na Tabela 7 é um ASO de 17mer totalmente complementar a uma região na junção 3’ que abrange a junção do íntron 22 e do éxon 23 no pré-mRNA de distrofina de camundongo. DMD-ASO 4 liga-se complementarmente à sequência de 17-mer marcada como negrito e sublinhada na sequência de 25mer de [(5’ -> 3') uaauuuugag | GCUCUGCAAAGTTCT1. DMD-ASO 4 possui uma sobreposição de 5~mer com o íntron 22 e uma sobreposição de 12-mer com o éxon 23.
[00514] DMD-ASO 1 e DMD-ASO 4 foram avaliados quanto à capacidade de induzir o salto do éxon nos músculos dos camundongos mdx por administração subcutânea como segue.
Tratamento com ASO & Amostragem de Tecidos Musculares [00515] As soluções injetáveis foram preparadas diluindo uma solução mãe aquosa de DMD-ASO 1 ou DMD-ASO 4 em PBS a 500 nM. Camundongos mdx machos foram administrados por via subcutânea apenas com veículo (controle negativo), DMD-ASO 1” ou DMDASO 4 a 2 mL/kg, 2 vezes por dia (BID) durante 3 dias. Um dia após a
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142/189 dose final, os animais foram anestesiados com zoletil/rompun e sacrificados para amostrar tecidos musculares incluindo o coração, diafragma, gatrocnêmio, quadriceps e triceps.
Extração de RNA [00516] As amostras musculares foram homogeneizadas por moagem em um tubo mantido em gelo, e submetidas à extração de RNA total com 1 mL de reagente trizol (Invitrogen) por cerca de 100 mg de tecido muscular.
Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00517] 500 ng de padrão de RNA foram usados em uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) e um conjunto de iniciadores específicos para éxon [DMD-éxon 21__dianteiro: (5’ 3') CAAAGAGAAAGAGCTACAGAGA; e DMD-éxon 25 reverso: (5’ > 3’) CTGGGCTGAATTGTTTGAAT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 40 ciclos de 30 s a 94°C, 1 min a 58 e 2 min a 72°C.
Amplificação por PCR aninhada [00518] 1 pL de cDNA foi posteriormente amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores [DMD-éxon 22n dianteiro: (5’ -» 3') ATCCAGCAGTCAGAAAGCAAA; e DMD-éxon 25n__reverso: (5’ 3')
ACTAAAAGTCTGCATTGT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 5 min seguido por 39 ciclos de 30 s a 95°C, 40 s a 50°C e 50 s a 72°C.
Identificação do Produto de Salto de Éxon [00519] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em um gel de agarose a 2 % como proporcionado na Figura 37A. O salto do éxon 23 foi detectado apenas nos animais tratados
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143/189 com DMD-ASO 1 e DMD-ASO 4”. Embora o salto do éxon 23 tenha sido detectado apenas no quadriceps e no gastrocnêmio, DMD-ASO parece ser mais eficaz que DMD-ASO 4.
[00520] O indivíduo do controle negativo (isto é, nenhum tratamento com ASO) produziu uma banda de PCR atribuída ao salto dos éxons 22-23 nos quadriceps. O salto dos éxons 22-23 produz um desvio de estrutura e a variante de junção de mRNA da distrofina sem éxons 2223 está condenada a codificar uma distrofina truncada com a porção do C-terminal em falta.
[00521] As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger, e confirmadas o salto do éxon 23 induzido por DMD-ASO 1” e DMD-ASO 4”. (conforme Figura 37B) As bandas de PCR para o tamanho natural (isto é, sem salto) e o salto dos éxons 22-23 foram confirmadas por sequenciamento, embora os dados de sequenciamento para o salto dos éxons 22-23 não tenham sido fornecidos.
[00522] DMD Exemplo 2. Salto de Éxon Induzido por DMD-ASO 1 e DMD-ASO 4” em Camundongos Mdx (Método B de PCR Aninhada). [00523] As amostras de RNA obtidas no DMD Exemplo 1 foram submetidas à uma síntese de cDNA de uma etapa utilizando um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [DMD-éxon 20__dianteiro: (5’ - 3’) CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG; e DMD-éxon 26__reverso: (5’ 3’) TTCTTCAGCTTGTGTCATCC]. As amostras de cDNA foram então analisadas por PCR aninhada contra outro conjunto de iniciadores específicos de éxon de [DMD-éxon 20n__dianteiro: (5! -> 3') CCCAGTCTACCACCCTAT-CAGAGC; e DMD-éxon 26n__reverso: (5’ 3!) CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT].
[00524] Os resultados de RT-PCR aninhada são fornecidos como resumidos na Figura 38A e na Figura 38B. Nos animais tratados com ASO (N - 2 por grupo), os saltos dos éxons 21-23 e éxons 22-25 fo
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144/189 ram detectados. Enquanto o salto dos éxons 21-23 está na estrutura (isto é, sem fase de leitura), o salto dos éxons 22-25 é fora da estrutura. A banda de PCR atribuída ao salto dos éxons 21-23 foi inequivocamente confirmada pelo sequenciamento de Sanger, (conforme Figura 38B) [00525] Os perfis de salto do éxon variaram dependendo do método de PCR, conforme descrito acima. Desta maneira, os perfis de salto do éxon devem ser interpretados com discrição.
[00526] DMD Exemplo 3. Salto de Éxon Induzido por DMD-ASO 1 em Camundongos Mdx (Método A de PCR Aninhada).
[00527] Camundongos Mdx receberam subcutaneamente DMDASO 1 a 0 (controle negativo) ou 10 pmol/Kg, 2X por dia durante 5 dias. (2 animais por grupo) Um dia após a dose final, os animais foram sacrificados para amostragem de tecido. As amostras de triceps foram avaliadas quanto ao salto do éxon 23 de acordo com o método de RTPCR aninhada descrito em DMD Exemplo 1.
[00528] Os resultados de RT-PCR aninhada estão resumidos nas Figuras 38C. Embora um animal no grupo controle negativo tenha produzido a banda de PCR para o salto dos éxons 22-23, a variante de junção de mRNA sem os éxons 22-23 está fora da estrutura. A banda de PCR para o salto do éxon 23 foi detectada apenas em um animal no grupo de tratamento com ASO. Desta maneira, o DMD-ASO 1 induziu o salto do éxon 23 como foi projetado.
[00529] DMD Exemplo 4. Melhoria da função muscular através do teste de Rotarod em Camundongos Mdx Administrados por via Subcutânea com DMD-ASO 1.
[00530] O salto do éxon 23 em camundongos mdx remove o PTC no éxon 23, e a variante de junção de mRNA que não possui o éxon 23 está na estrutura e, portanto, codifica uma proteína variante com a porção C-terminal ligada à ECM. Desta maneira, a proteína da distrofiPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 234/291
145/189 na variante de tamanho natural restaura parcialmente as funções fisiológicas da distrofina de tamanho natural original ou tipo selvagem. [00531] Dado o potencial do salto do éxon, DMD-ASO 1 foi avaliado em camundongos mdx quanto à sua capacidade de melhorar a função muscular pelo teste de rotarod, conforme descrito abaixo. Agrupamento [00532] Camundongos mdx machos com 6 semanas de idade foram treinados para teste de rotarod durante um período de 2 semanas, e então distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de 0 (controle negativo), 100 e 1.000 pmol/Kg DMD-ASO 1 com base em pontuações individuais pelo teste de rotarod no dia 0, ou seja, o dia do agrupamento. (N 10 por grupo)
Tratamento com ASO [00533] As soluções injetáveis foram preparadas diluindo em série o ASO a 20 nM e 200 nM em PBS. Os animais foram administrados subcutaneamente com veículo (PBS, controle negativo), DMD-ASO 1 a 20 nM (100 pmol/kg), ou DMD-ASO 1 a 200 nM (1000 pmol/kg) a 5 mL/kg, 3X por semana durante um período do dia 0 ao dia 21.
Teste de Rotarod e Análise Estatística [00534] Os camundongos foram submetidos a ensaio de rotarod em um aparelho de rotarod (Modelo # 47650, Ugo Basile) com um programa de aceleração de 4 rpm a 45 rpm ao longo de 60 segundos. A latência para cair (isto é, a duração que o animal permaneceu no rotarod) foi pontuada para cada animal individual. A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student contra o grupo controle negativo. Melhoria da Função Muscular [00535] A Figura 39A resume as pontuações do rotarod por grupo. Os resultados do rotarod (ou seja, latência para cair) permaneceram estagnados em cerca de 70 a 120 segundos, em média, no grupo controle negativo. Enquanto isso, a função muscular do grupo de 1.000
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146/189 pmol/Kg melhorou gradual e acentuadamente até o dia 12, e depois permaneceu estável posteriormente em rotarods de 210 a 230 segundos em média. A função muscular foi significativamente melhorada nos dias 12, 14 e 19 pelo tratamento com ASO a 1.000 pmol/Kg. A função muscular do grupo 100 pmol/Kg mostrou uma forte propensão de melhora, mas não foi significativa.
[00536] DMD Exemplo 5. Melhoria da Função Muscular por Teste de Aderência e Integridade Muscular em Camundongos Mdx Administrados Cronicamente com DMD-ASO 1.
[00537] DMD-ASO 1 foi avaliado administrando cronicamente a camundongos mdx quanto à sua capacidade de melhorar a função muscular pelo teste de aderência, para induzir o salto do éxon, para super-regular a expressão da distrofina de tamanho natural (ou seja, proteína distrofina com o C~terminal codificado) por IHC, e para melhorar a integridade muscular por histopatologia com manchamento Η & E como descrito abaixo.
Agrupamento & Tratamento com ASO [00538] Camundongos mdx machos (7 semanas de idade) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 0 (controle negativo de mdx), 10, 50 e 200 pmol/Kg de DMD-ASO 1 com base nas pontuações individuais de teste de força de aderência. (N = 12 por grupo) Um grupo satélite de 12 camundongos C57BL/6 machos (7 semanas de idade) foi incluído neste estudo como o grupo controle negativo tipo selvagem para o nível de expressão da distrofina de tamanho natural.
[00539] O grupo 50 e 200 pmol/Kg recebeu subcutaneamente DMD-ASO 1 como dissolvido em PBS, 2X por semana até o sacrifício final na Semana 43. Entretanto, o grupo de 10 pmoles/kg recebeu subcutaneamente DMD-ASO 1. Inicialmente 2X por semana durante a semana 0 a 8 e 3X por semana depois para aumentar a exposição de ASO.
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Função Muscular por Teste de Aderência [00540] A função muscular foi avaliada semanalmente pela força de aderência em um medidor de força de aderência (Número de Cat. 47.200, Ugo Basile) de acordo com a literatura. [J. Appl. Physiol. vol 106 (4), 1311-1324 (2009)] As pontuações de força de aderência por grupo foram avaliados quanto à significância estatística pelo teste t de Student contra o grupo controle negativo do mdx.
[00541] A Figura 39B resume as pontuações de força de aderência observadas por grupo durante a Semana 0 a 30. Durante as primeiras 11 semanas após a primeira dose, não houve mudanças marcantes na força de aderência entre os grupos de tratamento com ASO e o grupo controle negativo. A força de aderência do grupo controle negativo do mdx atingiu o máximo de cerca de 107 g na semana 3, decaiu gradualmente ao longo de várias semanas e permaneceu relativamente estável a aproximadamente 75 a 95 g. A força de aderência dos grupos de tratamento com ASO começou a melhorar gradualmente a semana 10 ou mais. Nos grupos de tratamento, a força de aderência tendeu a aumentar em 30 -- 50 % em comparação com o grupo controle negativo do mdx.
[00542] Observa-se que 2 a 3 animais por grupo foram selecionados aleatoriamente e sacrificados nas Semanas 7, 13, 21 e 30 para avaliação por IHC ou PCR aninhada, (ver abaixo)
Avaliação por IHC de Músculos Esqueléticos contra Distrofina de Tamanho Natural [00543] Nas Semanas 7, 13 e 21, dois animais por grupo foram selecionados aleatoriamente e sacrificados para extrair tecidos musculares. Na semana 30, 3 animais foram sacrificados por grupo.
[00544] Os tecidos musculares amostrados na Semana 7 foram submetidos a IHC contra a distrofina de tamanho natural por criosseção. Os tecidos musculares amostrados nas Semanas 13, 21 e 30 foPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 237/291
148/189 ram imunocomponentes por meio de bloqueio de parafina. A IHC por bloco de parafina produziu imagens de melhor qualidade que a IHC durante criosseção.
[00545] As amostras musculares foram submetidas à imunomanchamento em série com um anticorpo primário direcionando o Cterminal da distrofina de camundongo (Número de Cat. sc-816, Santa Cruz) na diluição 1: 100, com um anticorpo anti-lgG secundário (Número de Cat. BA-1100, Vector) a uma diluição de 1:200, e depois com Dylight 594-estreptavidina (Número de Cat. SA-5594, Vector, CA, USA) a uma diluição de 1:200 para marcação com fluorescência vermelha. As imagens de IHC foram capturadas em um scanner de lâminas Zeiss (nas semanas 13, 21 e 30) ou em um microscópio de fluorescência Olympus (na semana 7). Manchamento de DAPI foi adicionalmente realizado.
[00546] A Figura 40 é um conjunto representativo de imagens de IHC de ditrofina de tamanho natural por grupo para as amostras musculares extraídas na semana 30. O grupo controle negativo de tipo selvagem (WT) produziu padrões distintos e angulares de expressão de distrofina refletindo a estrutura natural dos feixes de fibras musculares. No grupo controle negativo de camundongos mdx, não houve muito do manchamento da distrofina de tamanho natural. Enquanto isso, padrões fortes e angulares de manchamento de distrofina foram observados nos músculos esqueléticos do grupo de tratamento de 200 pmol/kg. Embora as estruturas do feixe de fibras musculares estivessem embaçadas em camundongos mdx em comparação com os camundongos WT, a expressão da distrofina de tamanho natural aumentou significativamente nos animais tratados com o ASO.
[00547] As imagens de IHC da distrofina foram submetidas à quantificação para a expressão de distrofina de tamanho natural por meio da avaliação digital da intensidade da fluorescência vermelha em cada
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149/189 imagem de IHC individual usando o programa ImageJ (NIH). Pontuações individuais de fluorescência foram combinadas por grupo e tipo de músculo para avaliação estatística contra o grupo controle negativo tipo selvagem.
[00548] A Figura 41 resume as mudanças no nível de expressão relativa da proteína distrofina de tamanho natural em camundongos mdx. A expressão da distrofina de tamanho natural tendeu a aumentar mais com doses mais altas de ASO e maior duração do tratamento. Na semana 30, a expressão da distrofina de tamanho natural no grupo de 200 pmol/Kg atingiu > 80 % do grupo controle negativo WT, enquanto que a expressão no controle negativo de mdx foi inferior a 20 % do grupo controle negativo tipo selvagem.
PCR Aninhada para Salto de Éxon (Método B) [00549] As amostras de músculo foram homogeneizadas por trituração em um tubo mantido em gelo e submetidas à extração de RNA total com 1 mL de reagente trizol (Invitrogen) por aproximadamente 100 mg de tecido muscular. Os RN As totais foram avaliados quanto ao salto do éxon por PCR aninhada como descrito em DMD Exemplo 2. [00550] A Figura 42 fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada obtidos com os músculos esqueléticos amostrados na Semana 7. Os produtos de PCR em estrutura dos Aéxons 21-23 e Aéxons 21-24 foram detectados em amostras de músculo dos grupos de tratamento com ASO, mas não em tudo naqueles do grupo controle negativo de mdx.
Histopatoloqia por Manchamento de Η & E [00551] A inflamação muscular e a degeneração são a marca dos sintomas da DMD. Amostras de músculo esquelético foram submetidas à avaliação histopatológica por manchamento de H & E. A Figura 43 fornece um conjunto representativo de imagens de manchamento de H & E para o triceps por grupo e ponto de tempo de amostragem.
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150/189 [00552] No grupo controle negativo WT, a estrutura muscular era densa em todos os momentos de amostragem. Não houve sugestões de inflamação muscular nos músculos dos camundongos selvagens em todos os momentos.
[00553] No controle negativo do mdx, a estrutura muscular mostrou um padrão claro de degeneração gradual com a idade. Mais notavelmente na semana 30, os feixes musculares não estavam interconectados e tendiam a degenerar para formar a forma arredondada. Também houve infiltração maciça de células inflamatórias, como sugerido por manchas de pontos azuis, mais notavelmente nas semanas 13 e 21.
[00554] No grupo de 200 pmol/Kg, a estrutura muscular solta na Semana 7 recuperou gradualmente para uma estrutura densa. A infiltração acentuada de células inflamatórias na Semana 7 desapareceu gradualmente com a idade. Desta maneira, degeneração muscular e inflamação em camundongos mdx foram revertidas após administrações crônicas da ASO a 200 pmol/Kg, o que seria consistente com a regulação positiva da distrofina de tamanho natural no grupo de 200 pmol/Kg.
[00555] A gravidade dos resultados histopatológicos nos grupos 10 e 50 pmol/Kg foi mais fraca que a gravidade no mdx controle negativo, mas mais forte do que no grupo de 200 pmol/Kg. Desta maneira, a regulação positiva da distrofina de tamanho natural induzida pela exposição ao ASO é amplamente consistente com os resultados histopatológicos.
Resultados Diversos [00556] Houve três casos de sacrifício não planejado ou morte (semanas 26, 39 e 43) no grupo controle negativo do mdx devido a uma grande massa de linfoma muscular desenvolvida mais provavelmente pela inflamação muscular crônica. Não houve casos de linfoma em todos os grupos de tratamento com ASO.
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Comparação com Outra ASO de Distrofina [00557] Eteplirsen (éxondis 51) é um oligonucleotídeo antissenso de PMO concebido para induzir o salto do éxon 51 no pré-mRNA da distrofina humana. Recentemente, a FDA dos USA emitiu uma aprovação acelerada de eteplirsen para uso em uma população de pacientes com DMD que exigem o salto do éxon 51. A dose recomendada de eteplirsen é uma injeção intravenosa de 30 mg/Kg por semana.
[00558] A dose subcutânea de 200 pmol/kg de DMD-ASO 1 corresponde a cerca de 1 pg/kg. O ASO de distrofina da Fórmula I é mais potente que o ASO de PMO em cerca de 30.000 vezes, embora existam diferenças nas espécies e no éxon entre os dois tipos de ASO. A potência de salto do éxon ultraforte sem precedentes do derivado de PNA de Fórmula I foi novamente transladada em uma potência terapêutica in vivo ultraforte para esta doença rara difícil de tratar.
[00559] DMD Exemplo 6. Melhoria da Função Muscular por Distância Percorrida em Camundongos MDX Administrados Cronicamente com DMD-ASO 2.
[00560] DMD ASO 2 especificado na Tabela 7 é um ASO de 17mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 22 e éxon 23 no pré-mRNA de distrofina de camundongo. DMD-ASO 2 liga-se complementarmente à sequência 17-mer marcada com negrito e sublinhada como na sequência de pré-mRNA de distrofina de rato de 20-mer de [(5’ —> 3') uaauuuugaq | GCUCUGCAAA]. DMD-ASO 2 possui uma sobreposição de 8-mer com o íntron 22 e uma sobreposição complementar de 9mer com o éxon 23.
[00561] DMD-ASO 2 foi administrado cronicamente a camundongos mdx para avaliar sua capacidade de melhorar a função muscular pela distância percorrida na esteira, e inibir a degradação muscular pelos níveis séricos de creatina cinase (CK) e mioglobina.
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Animais & Agrupamento [00562] Camundongos mdx machos (6 semanas de idade) foram divididos aleatoriamente em três grupos do controle negativo de mdx (sem tratamento com ASO), DMD-ASO 2 10 pmol/Kg e DMD-ASO 2 30 mg/Kg com base no peso corporal. (N ~ 16 por grupo) 12 camundongos C57BL/6 machos (6 semanas de idade) foram adoptados como o grupo controle negativo tipo selvagem (WT).
Soluções de Injeção e Tratamento com ASO [00563] Uma solução mãe aquosa de DMD-ASO 2 foi diluída em PBS ou em PBS suplementado com 0,1 % de Tween 80 para preparar soluções de injeção de 20 e 60 nM de DMD-ASO 2 por 10 pmol/Kg e 30 pmol/Kg de DMD-ASO 2, respectivamente. A suplementação de solução de injeção de PBS com 0,1 % de Tween 80 foi considerada necessária para evitar que as moléculas de ASO aderissem a frascos de injeção de plástico, pontas de pipeta e seringas.
Distância Percorrida na Esteira [00564] Durante as primeiras 30 semanas após o agrupamento, os animais foram administrados com as soluções injetáveis sem Tween 80 2X por semana a 2 mL/Kg. A partir da Semana 7, os animais foram submetidos a caminhar em uma esteira (Modelo # LE8710, PanLab) semanalmente. Durante as primeiras 30 semanas, no entanto, os grupos de tratamento com ASO não mostraram melhorias significativas na distância percorrida em comparação com o grupo controle negativo de mdx.
[00565] De modo a aumentar eficazmente a dose de ASO, os animais foram administrados com as soluções injetáveis suplementadas com Tween 80, 2X por semana a partir da Semana 36. Houve um período de eliminação (isto é, sem dosagem de ASO) de 5 semanas entre elas.
[00566] A Figura 44A resume as distâncias percorridas na esteira
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153/189 por grupo durante as semanas 43 a 48. A distância média percorrida do grupo controle negativo do mdx diminuiu gradualmente de aproximadamente 250 metros na semana 43 para 130 metros na semana 48. A distância média percorrida dos grupos de tratamento com ASO foi marcadamente mais longa do que a distância do grupo controle negativo de mdx.
[00567] Durante as Semanas 46 a 48, o grupo de 10 pmol/Kg mostrou as distâncias médias percorrida de 240 a 280 metros, que foram significativamente mais longas do que as distâncias do grupo controle negativo do mdx. Enquanto isso, o grupo de 30 pmol/Kg apresentou distâncias percorridas de 180 a 230 metros nas Semanas 46 a 48. Houve uma tendência de maior distância percorrida com o grupo de 10 pmoles/kg do que o grupo de 30 pmoles/kg. A resposta à dose invertida da distância percorrida sugeriría uma seleção natural de diferentes éxons a uma dose de ASO mais elevada, tal como observado em HIF-1a Exemplo 9. Interessantemente, o grupo controle negativo WT e o grupo 30 pmol/Kg mostraram distâncias percorridas durante as semanas 44 a 47.
Sacrifício terminal [00568] Na semana 48, os animais foram submetidos a sacrifício terminal para amostragem de sangue. As amostras de sangue foram analisadas quanto ao nível sérico de CK (Kit de Ensaio de Atividade de Creatina Cinase, Número de Catálogo ab155901, Abeam) e mioglobina (Kit ELISA de Mioglobina, Número de Catálogo ab210965, Abeam) para avaliar o grau de degradação muscular de acordo com as instruções do fabricante. Os tecidos musculares foram analisados por western blot quanto à distrofina de tamanho natural.
Níveis séricos de CK e Mioqlobina [00569] A Figura 44B fornece os níveis séricos de CK observados por grupo. Refletindo a fragilidade muscular dos camundongos mdx,
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154/189 todos os grupos de camundongos mdx produziram atividades de CK séricas significativamente muito mais altas do que o grupo controle negativo WT. Por exemplo, o nível sérico de CK do grupo controle negativo do mdx foi cerca de 54 vezes maior do que o nível do grupo controle negativo WT. Os níveis séricos de CK do grupo 10 e 30 pmol/Kg foram menores que o nível do grupo controle negativo de mdx em 58 % e 38 %, respectivamente. A diferença nos níveis séricos de CK entre as 10 pmol/Kg e o grupo controle negativo de mdx foi significativa.
[00570] A Figura 44C fornece os níveis observados de mioglobina no soro por grupo. Refletindo a fragilidade muscular dos camundongos mdx, todos os grupos de camundongos mdx produziram níveis séricos de mioglobina muito superiores ao nível do grupo controle negativo WT. Por exemplo, o nível sérico de mioglobina do grupo controle negativo de mdx foi cerca de 22 vezes maior que o nível do grupo controle negativo WT. Os níveis de mioglobina no soro do grupo de 10 e 30 pmol/Kg foram significativamente menores do que o nível do grupo controle negativo do mdx em 67 % e 58 %, respectivamente.
[00571] Os dados observados dos biomarcadores séricos para a degradação muscular são grosseiramente consistentes com a dependência da dose da distância percorrida fornecida na Figura 44A.
Expressão de Distrofina de Tamanho Natural em Triceps por Western Blot [00572] Após homogeneização em temperatura de nitrogênio do líquido, as amostras de músculo (triceps) foram submetidas à lise em tampão RIPA suplementado com SDS a 1 %. A concentração de proteína em cada Usado foi quantificada por ensaio de BCA contra o padrão de BSA. 50 mg de proteína de cada lisado foi submetido a separação eletroforética em um gel de PAGE a 8 %. Em seguida, a membrana de PVDF foi sondada com um anticorpo de distrofina direciona
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155/189 do ao C-terminal (Número de Catálogo ab154168, Abeam).
[00573] A Figura 45A fornece os dados de western blot observados. A distrofina de tamanho natural de 427K não foi detectada em todas as amostras. Em vez disso, as amostras do músculo WT produziram proteínas menores da distrofina de 170K, 130K e 117K, dentre as quais a faixa de 130Kfoi a mais enriquecida.
[00574] No caso dos grupos de mdx, as três bandas de distrofina foram detectadas. Os grupos de tratamento de 10 e 30 pmol/kg forneceram uma banda de 117K marcadamente mais forte do que o grupo controle negativo de mdx, bem como o grupo controle de WT. A intensidade da banda de 130K foi consideravelmente mais forte no grupo de 10 pmol/Kg do que no grupo controle negativo do mdx, também.
[00575] DMD Exemplo 7. Avaliação a Longo Prazo de Camundongos MDX Administrado com DMD-ASO 1, DMD-ASO 2 ou DMDASO 6.
[00576] DMD ASO 6 especificado na Tabela 7 é um ASO de 18mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 5’ que abrange a junção do éxon 23 e do íntron 23 no pré-mRNA da distrofina de camundongo. DMD-ASO 6 sobrepõe-se complementarmente com a sequência de 18~mer marcada como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de distrofina de 25 membros de [(5’ > 3’) AAAAUUUCAGl quaagccgagquuuq]. DMD-ASO 6 possui uma sobreposição de 8-mer com o éxon 23 e uma sobreposição de 10-mer com o íntron 23.
[00577] DMD-ASO 1, DMD-ASO 2 e DMD-ASO 6 foram avaliados quanto aos seus efeitos fisiológicos em camundongos mdx machos por administração subeutânea a longo prazo. Nesta avaliação os animais não foram submetidos a testes físicos que requerem estresse muscular para manter a transcrição do gene da distrofina não perturbada pela estimulação muscular excessiva.
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Animais & Agrupamento [00578] Camundongos mdx machos (6 semanas de idade) foram aleatoriamente designados para 4 grupos do controle negativo de mdx (sem tratamento com ASO), DMD-ASO 1 50 pmol/kg, DMD-ASO 2 10 mg/Kg e DMD-ASO 6 10 mg/kg com base no peso corporal. (N ~ 12-13 por grupo) 12 camundongos C57BL/6 machos (6 semanas de idade) foram adoptados como o grupo controle negativo tipo selvagem (WT).
Soluções de Injeção & Tratamento com ASO [00579] As soluções mãe aquosa dos ASOs foram diluídas em PBS para preparar as soluções injetáveis de 25 nM de DMD-ASO 1 para 50 pmol/Kg de DMD-ASO 1”, 5 nM de DMD-ASO 2 para DMD-ASO 2 10 pmol/Kg e 5 nM de DMD-ASO 6 para DMD-ASO 6 10 pmol/Kg. Os animais foram administrados por via subcutânea com as soluções de injeção a 2 mL/kg, 2 x por semana.
Sacrifício ou Morte Não Programada [00580] Os camundongos mdx tratados com ASOs tenderam a mostrar vida mais longa do que o grupo controle negativo de mdx, sugerindo a atividade terapêutica dos ASOs.
[00581] No grupo controle negativo de mdx,°Correram três casos de morte ou sacrifício não programados: um de cada vez nas semanas 42, 58 e 61. O grupo de tratamento DMD-ASO 1 apresentou dois óbitos prematuros, um na semana 38 e outro em Semana 61. No caso do grupo de tratamento DMD-ASO 2, uma morte na semana 56 e outra na semana 62. Houve três mortes prematuras no grupo de tratamento DMD-ASO 6: uma de cada vez nas semanas 55, 65 e 66.
Sacrifício Terminal [00582] Todos os animais sobreviventes foram sacrificados por amostragem de sangue na semana 66 após p agrupamento. As amostras de sangue foram submetidas aos ensaios ELISA para creatina ci
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157/189 nase (CK) e mioglobina do soro, como descrito em DMD Exemplo 6”.
Níveis Séricos de CK e Mioglobina [00583] A Figura 45B fornece os níveis séricos de CK observados por grupo. Refletindo a fragilidade muscular dos camundongos mdx, todos os grupos de camundongos mdx produziram atividades de CK séricas significativamente muito mais altas do que o grupo controle negativo WT. Por exemplo, o nível sérico de CK do grupo controle negativo MDX foi cerca de 17 vezes maior do que o nível do grupo controle negativo WT. Os níveis séricos de CK dos grupos de tratamento com ASO tenderam a ser menores que o nível do grupo controle negativo MDX, sugerindo a atividade terapêutica pelos ASOs. No entanto, as diferenças não foram significativas.
[00584] A Figura 45C fornece os níveis observados de mioglobina no soro por grupo. Refletindo a fragilidade muscular dos camundongos mdx, todos os grupos de camundongos mdx produziram mioglobina sérica significativamente maior do que o grupo controle negativo WT. Por exemplo, o nível sérico de mioglobina do grupo controle negativo de mdx foi cerca de 26 vezes maior do que o nível do grupo controle negativo WT. Os níveis séricos de mioglobina dos grupos de tratamento de DMD-ASO 1, DMD-ASO 2 e DMD-ASO 6 foram menores que o nível do grupo controle negativo de mdx em 43 %, 49 % e 68 %, respectivamente. A diferença entre o controle negativo MDX e o grupo DMD-ASO 6 foi significativa. Os biomarcadores sicos para a integridade muscular indirectamente suportam que DMD-ASO 6 induz o salto do éxon 23 da distrofina e origina distrofina (s) de tamanho natural funcionalmente ativa (s) em camundongos mdx.
Exemplos para Atividades In Vitro de ASOs de IDO1 [00585] Os derivados de PNA de Fórmula I na Tabela 8 foram concebidos para complementarmente vários sítios de junção no prémRNA de IDO1 humano. Os ASOs de IDO1 foram avaliados quanto à
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158/189 atividade de saltos de éxons em células SKOV3. Dado que o IDO1 catalisa a degradação do L-triptofano em N-formil-quinurenina, os ASOs de IDO1 foram avaliados quanto à sua capacidade funcional de inibir a produção de quinurenina. Exemplos biológicos fornecidos aqui ilustram a atividade de salto do éxon dos ASOs de IDO1 como exemplos para o composto da Fórmula I e, portanto, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a ASOs de IDO1.
[00586] IDO1 Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por IDO-ASO 1. [00587] IDO-ASO 1 especificado na Tabela 8 é um ASO de 13mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 6 e éxon 7 no pré-mRNA de IDO1 humano. IDO-ASO 1 tem como alvo complementar a sequência de 13mer marcada como negrito e sublinhada na sequência de prémRNA de IDO1 humana de 20-mer de [(5’ -> 3!) uuuouuuuaq | GUAAUUCCUA1. IDO-ASO 1 possui uma sobreposição de 5-mer com o íntron 6 e uma sobreposição de 8-mer com o éxon 7.
[00588] IDO-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxons em células SKOV3 (Número de Cat. HTB-77, ATCC) por PCR aninhada com IDO1 como se segue.
[00589] Células SKOV3 (adenocarcinoma de ovário humano) foram subcultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio modificado de McCoy 5A suplementado com 10 % de FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina, 1 % de L-glutamina e 1 % de piruvato de sódio sob 5 % de CO2 a 37°C e tratado com IDO-ASO 1 durante 48 horas a 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM ou 1 aM.
Extração de RNA & Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00590] O RNA total foi extraído das células usando Kit de Extração de RNA Universal (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de 25 pL de transcrição reversa usando 0 kit
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159/189 de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [IDO -éxon 2__dianteiro: (5’ -+ 3’) TTCATTGCTAAACATCTGCC; e IDO-éxon 10_reverso: (5! -> 3') TGAAAGGACAAACTCACGGA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 40 ciclos de 30 s a 94°C, 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C. Amplificação por PCR aninhada [00591 ] 1 pL de cDNA foi posteriormente amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [IDO-éxon 4__dianteiro: (5’ -+ 3') CCTTACTGCCAACTCTCC ; e IDO-éxon 9 reverso: (5’ -+ 3') CTGCTTTGGCCTGCACTG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 5 min seguido por 30 ciclos de 30 seg a 95°C, 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C.
Identificação do produto de Salto de Éxon [00592] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por sequenciamento de Sanger.
[00593] A Figura 46A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhadas (diagrama à esquerda) e os dados de sequenciamento de Sanger para a banda de PCR atribuída ao salto dos éxons 6-7 (direita). O salto dos éxons 6-7 foi detectado no extrato de RNA das células tratadas com IDO-ASO 1 a 100 zM. A banda de salto do éxon não foi detectada nos extratos de RNA das células tratadas com o ASO a 10 zM ou 1 aM, provavelmente devido a fraca estabilidade da variante de junção de mRNA de IDO1 sem éxon 6-7. Embora a intensidade do mRNA de IDO-1 de tamanho natural tenha diminuído nas células tratadas com o ASO a 10 ou 100 zM, a intensidade do PCR de mRNA de tamanho natural aumentou nas células tratadas
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160/189 com o tratamento com ASO a 1 aM. O aumento observado do mRNA de tamanho natural em 1 aM ainda não foi elucidado. Pode ser um artefato durante as reações de PCR, ou pode ser devido a uma superregulação (transitória) da transcrição pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon por IDO-ASO 1. [Nature Struct. Mol. Biol, vol 22 (3), 256-264 (2015)] Os dados de sequenciamento de Sanger (diagrama à direita) demonstraram inequivocamente o salto dos éxons 6-7 induzidos por IDO-ASO 1 em células SKOV3.
[00594] ÍDO1 Exemplo 2. Atividade funcional antissenso de IDOASO 1.
[00595] A atividade funcional de IDO-ASO 1 foi avaliada quanto à sua capacidade para inibir a secreção de quinurenina em células SKOV3 como se segue.
Ensaio de Secreção de Quinurenina [00596] As células SKOV3 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com IDO-ASO 1 a 0 zM (controle negativo) ou 10 zM a 1 fM. (3 placas por concentração) As células foram tratadas com ASO juntamente com 10 ng/mL de γinterferon para aumentar a secreção de quinurenina. 24 horas depois, 200 pL do meio de cultura foram amostrados de cada cultura e misturados com 100 pL de ácido tricloroacético a 30 %. A mistura foi vortexada e submetida à centhfugação a 8.000 g durante 5 min. 75 pL do sobrenadante resultante foram misturados com 75 pL de reagente de Ehdich (0,8 % de p-dimetilamino-benzaldeído em ácido acético) e a mistura foi submetida a uma quantificação de quinurenina a 490 nm em um leitor de ELISA. [PLOS One 5 (8): e63301 (2013)] [00597] A Figura 46B fornece os resultados do ensaio da quinurenina. Excepto para as células tratadas com IDO-ASO 1 a 1 aM, a secreção de quinurenina significativamente (teste t de Student) diminuiu
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161/189 nas células tratadas com o ASO entre 10 zM e 1 fM. A secreção de quinurenina diminuiu cerca de 40 % nas células tratadas com IDOASO 1 a 1 fM.
[00598] IDO1 Exemplo 3. Salto de Éxon Induzido por IDO-ASO 5. [00599] IDO-ASO 5 especificado na Tabela 8 é um ASO de 13mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 5’ que vai à junção do éxon 3 e do intron 3 no pré-mRNA de IDO1 humano. IDO-ASO 5 se sobrepõe complementarmente com a sequência de 13-mer marcada como negrito e sublinhado” na sequência de prémRNA de IDO1 humana de 20 moles de [(5’ 3') UGUCCGUAAG | quuugqaoaul· IDO-ASO 5 tem uma sobreposição complementar de 8-mer com o éxon 3 e uma sobreposição complementar de 5-mer com o íntron 3.
[00600] IDO-ASO 5 foi avaliada quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxons em células SKOV3 por RT-PCR aninhada com IDO1, como descrito em IDO1, Exemplo 1, salvo indicação em contrário.
Tratamento com ASO [00601] Células SKOV3 cultivadas em placa de cultura de 60 mm foram tratadas com IDO-ASO 5 a 0 (controle negativo), 1,3, 10, 30 ou 100 aM durante 48 horas.
Síntese de cDNA por PCR de Uma Etapa [00602] 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de 25 μΙ de transcrição reversa utilizando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com polimerase Taq de platina® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [IDO-éxon 1 dianteiro: (5’ 3’) AAAACTCCTGGACAATCAGT; e IDO-éxon 8__reverso: (5! -> 3’) ACTTGAAGGGCTTTCTCC] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, seguido por 40 ciclos de 30 s a 94°C, 30
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162/189 sec a 52°C e 40 s a 72°C.
Amplificação por PCR aninhada [00603] 1 pL de cDNA foi adicionalmente amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) usando um conjunto de iniciadores específicos de éxon [IDO-éxon 1n__dianteiro: (5’ 3') TATTGATGAAGAAGTGGG ; e IDO-éxon
8n reverso: (5’ 3!) GTTCACATGATCGTGGATTTG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95CC durante 5 min seguido por 30 ciclos de 30 s a 95°C, 40 s a 52°C e 40 s a 72°C.
Dados de Produtos de PCR Aninhada [00604] A Figura 47A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada. As células tratadas com IDO-ASO 5 a 30 e 100 aM produziram claramente as variantes de junção de mRNA sem os éxons 2-4 e éxons 2-6. A intensidade do mRNA de tamanho natural diminuiu nas células tratadas com ASO, embora a intensidade tenha dado um pulo levemente nas células tratadas com o ASO a 10 aM. A Figura 47B fornece os dados de sequenciamento de Sanger para as variantes de junção de mRNA sem os éxons 2-4 e éxons 2-6.
[00605] IDO1 Exemplo 4. Salto de Éxon Induzido por IDO-ASO 6. [00606] IDO-ASO 6 especificado na Tabela 8 é um ASO de 13mer totalmente complementar a uma região no sítio de junção 3’ que abrange a junção do íntron 3 e éxon 4 no pré-mRNA de IDO1 humano. IDO-ASO 6 tem como alvo complementar a sequência de 13-mer marcada como negrito e sublinhada na sequência de pré-mRNA de IDO1 humana de 20-mer de [(5’ -+ 3') uuuuaaucag | GUCUUGCCAA1. IDO-ASO 6 possui uma sobreposição complementar de 5-mer com sobreposição complementar ao íntron 3 e 8-mer com o éxon 4.
[00607] IDO-ASO 6 foi avaliada quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxons em células SKOV3 por PCR aninhada com IDO1, como descrito em IDO1, Exemplo 3, salvo indicação em contrário.
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163/189 [00608] [Dados de Produtos de PCR Aninhada] A Figura 47C fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR aninhada (diagrama à esquerda) juntamente com os dados de sequenciamento de Sanger para a banda de PCR atribuível ao salto do éxon (diagrama à direita). As células tratadas com IDO-ASO 6 a 1 a 30 aM produziram claramente uma única variante de junção de mRNA sem os éxon 2-5, embora a banda de salto do éxon não tenha sido detectada nas células tratadas com ASO a 100 aM. A intensidade total do mRNA foi mais forte nas células tratadas com ASO do que nas células sem o tratamento com ASO, o que pode ser devido à expressão excessiva da atranschção pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon IDO-ASO 1 [Nature Struct. Mol. Biol, vol 22 (3), 256-264 (2015)]
Exemplos para Atividades In Vitro e Ex Vivo dos ASOs de SNAP25 [00609] SNAP25 (proteína associada ao sinaptossoma de 25 kDa) é uma proteína SNARE envolvida na exocitose de neurotransmissores em células neuronals motoras. A toxina botulínica A (Botox™) oliva SNAP25 por sua famosa atividade antirrugas. Os derivados de PNA de Fórmula I na Tabela 9 foram concebidos para complementarmente direcionar o sítio de junção 3’ do éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 humano. ASOs de SNAP25 foram avaliados quanto à atividade antissenso de SNAP25 em células SiMa (neuroblastoma humano) e células PC12 de origem de rato, bem como quanto à sua capacidade de inibir a expressão de SNAP25 na pele de camundongos sob administração tópica. Os exemplos biológicos aqui proporcionados são para ilustrar a atividade de salto do éxon dos ASO de SNAP25 como exemplos para o cpmposto de Fórmula I e, consequentemente, não deve ser interpretado como limitante do escopo da presente invenção a ASO de SNAP25.
[00610] SNAP25 Exemplo 1. Salto de Éxon em Células PC12 Tra
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164/189 tadas com SNAP-ASO 3”.
[00611] SNAP-ASO 3 especificado na Tabela 9 é um ASO de 14mer totalmente complementar a uma sequência de 14-mer no sítio de processamento 3’ que abrange a junção de íntron 6 e éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 humano. SNAP-ASO 3 sobrepõe-se complementarmente com a sequência de pré-mRNA de 14-mer marcada como negrito e sublinhada na sequência de pré-mRNA de 30-mer de [(5! -> 3') cucuuuqqaucccaq | GGUAACAAAUGAUGC1. SNAP-ASO 3 possui uma sobreposição de 7-mer com íntron 6”, e outro sobreposição de 7-mer com éxon 7.
[00612] O SNAP-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxons em células PC12 (Número de Catálogo CRL1721, ATCC), embora SNAP-ASO 3 possua um não pareamento único com o sítio de junção 3’ do éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 de rato lido a partir do DNA genômico de rato [acessado a partir da sequência de referência de NCBI: NC 005012], O ASO de 14-mer possui uma sobreposição complementar de 13~mer com o pré-mRNA de SNAP25 de rato marcado como negrito e sublinhado” na sequência de pré-mRNA de 25-mer de [(5’ 3') ugg c ucccag | GGUAACAAACGAUGCL em que o não pareamento único é marcado com um sinal de aspas ().
Cultura de Células & Tratamento com ASO [00613] As células PC12 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 5 % de FBS, 10 % de soro de cavalo, 1 % de estreptomicina/penicilina, 1 % de L-glutamina e 1 % de piruvato de sódio sob atmosfera de 5 % de CO2 a 37°C. As células cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com SNAP-ASO 3 a 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. Extração de RNA & Síntese de cDNA por POR de Uma Etapa [00614] Após uma incubação com SNAP-ASO 3 por 42 horas, as
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165/189 células foram tratadas com 100 pg/mL de ciclo-heximida por mais 6 horas para congelar a translação ribossômica. Em seguida, o RNA total foi extraído utilizando o Kit de Extração de RNA Universal (número de catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de padrão de RNA foi submetido a uma reação de transcrição reversa de 25 pL utilizando o kit Superscript® RT-PCR de Uma Etapa com Taq polimerase Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SNAP-éxon 1__dianteiro: (5! > 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; e SNAP-éxon 14__reverso: (5’ -> 3’) AGCATCTTTGTTGCACGTTG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 40 ciclos de 30 s a 94°C, 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C.
Amplificação por PCR aninhada [00615] 1 pL de cDNA foi submetido a uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SNAP-éxon 1__dianteiro: (5’ 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; -éxon 14n .reverso: (5’ > 3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 2 min seguido por 34 ciclos de 30 seg a 95°C, 30 seg a 55°C e 1 min a 72°C.
Identificação de Produtos de Salto de Éxon [00616] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger.
[00617] A Figura 48A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR, nos quais a amostra de tratamento com ASO a 10 zM produziu uma banda de PCR fraca atribuível ao salto dos éxons 5-7 (conforme diagrama à esquerda). Mesmo se as células foram tratadas com ciclo-heximida para desestabilizar o mRNA de tamanho natural
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166/189 por congelamento da translação ribossômica, a banda do salto do éxon foi detectada apenas fracamente. Desse modo, a variante de junção de mRNA de SNAP25 atribuível ao salto dos éxons 5-7 provavelmente mostrará fraca estabilidade metabólica nas células em comparação com o mRNA de tamanho natural. O produto de PCR do salto do éxon foi sequenciado para ser o salto dos éxons (5-7) como mostrado na Figura 48A. (conforme diagrama à direita). Dado que o produto de PCR atribuível ao salto do éxon 6 foi observado independentemente da concentração de ASO, considera-se que o salto do éxon 6°Corre espontaneamente.
[00618] A intensidade do mRNA de SNAP25 de tamanho natural diminuiu mais nas células tratadas com SNAP-ASO 3 a 10 zM. A intensidade de mRNA de tamanho natural aumentou gradualmente até a do controle negativo (isto é, sem tratamento com ASO), visto que a concentração de ASO foi aumentada de 10 para 1.000 zM. O padrão de resposta à dose invertida nos dados da PCR aninhada pode ser devido a uma super-regulação da transcrição peto RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon com SNAP-ASO 3. [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22 (3), 256-264 (2015)].
[00619] SNAP25 Exemplo 2. qPCR para o mRNA de SNAP25 em Células PC12 Tratadas com SNAP-ASO 3”.
[00620] SNAP-ASO 3 foi avaliado por qPCR aninhada com SNAP25 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de SNAP25 de rato em células PC12 como segue.
Cultura de Célula & Tratamento com ASO [00621] Células PC12 cultivadas em placas de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com SNAP-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 zM. (2 placas de cultura por concentração de ASO)
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Extração de RNA & Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00622] Após uma incubação com SNAP-ASO 3 durante 42 horas, as células foram tratadas com 100 pg/mL de ciclo-heximida por mais 6 horas para congelar a translação ribossôrnica. Em seguida, o RNA total foi extraído de células usando Kit de Extração de RNA Universal (número de catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de padrão de RNA foi submetido a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SNAP-éxon 1 ...dianteiro: (5’ -> 3’) ATGGCCGAGGACGCAGACA; e SNAP-éxon 14_reverso: (5’ -> 3’) AGCATCTTTGTTGCACGTTG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 20 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 55 e 1 min a 72°C.
Amplificação de qPCR aninhada [00623] 1 pl de cada solução de cDNA diluída em 100X foi submetida a uma reação de PCR em tempo real de de 20 pL contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [SNAP-éxon 7q__dianteiro: (5’ 3!) ATGGATGAAAACCTAGAGC; e SNAP-éxon 8q_reverso: (5’
3’) CTTCCCAGCATCTTTGTT] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos 10 seg a 95°C e 30 seg a 60°C. A reação de qPCR foi seguida com uma sonda Taqman de [(5’ -> 3') 5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT3IABkFQ] direcionando a junção do éxon 7 e éxon 8 para quantificar o mRNA de SNAP25 de tamanho natural.
[00624] A Figura 48B fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de Student) nas células tratadas com SNAP-ASO 3 em 10 zM e 100 zM por aproximadamente 50 % e 20 %, respectivamente. No entanto, o nível de mRNA de tamanho natural nas células tratadas com SNAP
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ASO 3 a 1.000 zM foi ligeiramente superior ao nível das células sem tratamento com ASO (isto é, controle negativo).
[00625] O padrão de resposta à dose invertida dos dados de qPCR é relativamente consistente com o padrão de resposta à dose do nível de mRNA de tamanho natural durante o salto do éxon descrito em SNAP25 Exemplo 1, sugerindo uma super-regulação da transcrição quando a dose de ASO aumentou de 10 para 1.000 zM. Desta maneira, a junção complementar de 13-mer com o pré-mRNA de SNAP25 de rato não seria suficiente para derrubar a regulação positiva da transcrição induzida pelo (s) ElcIRNA (s) que se acumula durante o salto do éxon.
[00626] SNAP25 Exemplo 3. qPCR para o mRNA de SNAP25 em Células PC12 Tratadas com SNAP-ASO 1.
[00627] SNAP-ASO 1 especificado na Tabela 8 é um ASO de 16mer totalmente complementar a uma sequência de 16-mer do sítio de junção 3’ que abrange a junção do íntron 6 e éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 humano. SNAP-ASO 1 se sobrepõe complementarmente com as sequências alvo 16 marcados com negrito” e sublinhados na sequência de pré-mRNA humana de 30-mer de [(5’ —> 3') cucuuuggaucccaq | GGUAACAAAUGAUGC1. SNAP-ASO 1 possui uma sobreposição de 6-mer com o íntron 6 e uma sobreposição de 10-mer com o éxon 7. No entanto, o ASO possui um não pareamento único com o pré-mRNA de SNAP25 marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de 25-mer de [(5’ > 3') uqqcucccag I GGUAACAAA C GAUGC], em que com a única diferença está marcada com um sinal de aspas ().
[00628] SNAP-ASO 1 foi avaliado por qPCR aninhada com SNAP25 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de SNAP25 de rato em células PC12, como descrito em SNAP25 Exemplo 2, salvo indicação em contrário.
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169/189 [00629] A Figura 48C fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de
Student) nas células tratadas com SNAP-ASO 1 a 10 zM, 100 zM e
1.000 zM em cerca de 50 %, 40 % e 70 %, respectivamente.
[00630] Tal como no caso de SNAP-ASO 3, o padrão de resposta à dose invertida foi parcialmente reproduzido com SNAP-ASO 1 quando a dose foi aumentada de 10 para 100 zM. Dado que o nível de mRNA de tamanho natural diminuiu ainda mais à medida que a concentração de ASO foi aumentada para 1.000 zM, no entanto, a eficácia do salto do éxon de SNAP-ASO 1 parece ser mais forte que a de SNAP-ASO 3. A sobreposição complementar de 15-mer de SNAPASO 1 com o pré-mRNA de rato seria responsável pela maior eficácia de salto do éxon.
[00631] SNAP25 Exemplo 4. Inibição da Expressão de Proteína SNAP25 em Células PC12 por SNAP-ASO 3.
[00632] SNAP-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão das células da proteína SNAP25 PC12 como se segue.
[00633] As células PC12 foram cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura e tratadas com SNAP-ASO 3 aOzM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM ou 10 aM por 48 horas. Houve 4 placas de cultura do controle negativo para compensar possíveis artefatos técnicos durante a análise de western blot.
Lise Celular [00634] Em seguida, as células foram submetidas à Hse em gelo com 200 pL de tampão RIPA 1X (Número de Catálogo 9806, Cell Signaling Tech) suplementado com 1 % de SDS e 1X de inibidores de proteinase (complete Mini, Roche). Os Hsados foram coletados em tubo de 1,5 mL, misturados com 100 pL de tampão de amostra 5X e
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170/189 fervidos por 5 min.
Western blot [00635] Os lisados foram submetidos à separação eletroforética em um gel de gradiente TGX-PAGE a 4-15 % (Número de Catálogo 4561086, Βίο-Rad) e depois transferidos para uma membrana de PVDF de 0,45 pm. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-SNAP25 (Número de Catálogo S9684, Sigma) e um anticorpo anti-3-actina (Número de Catálogo A3845, Sigma).
[00636] A Figura 49A fornece os dados de Western blot de SNAP25 obtidos com os lisados de células PC12 (diagrama de topo) juntamente com os níveis de expressão relativos de SNAP25 normalizados contra a actina a por densitometria (diagrama inferior). O nível de proteína SNAP25 diminuiu em 10 a 60 % nas células tratadas com SNAP-ASO 3. O nível de expressão do controle negativo (isto é, SNAP-ASO 3 a 0 zM) é o nível de expressão médio das 4 amostras.
[00637] SNAP25 Exemplo 5. Inibição da Expressão de Proteína SNAP25 em Células PC12 por SNAP-ASO 1 [00638] SNAP-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína SNAP25 em células PC12, como descrito em SNAP25 Exemplo 4, a menos que indicado de outro modo. As células PC12 foram tratadas com SNAP-ASO 1 a 0 (controle negativo) , 100 ou 1.000 zM por 48 horas ou por 72 horas. (Uma placa de cultura para cada concentração de ASO) [00639] A Figura 49B fornece os dados de western blot para o tratamento com ASO de 48 horas (esquerda) e 72 horas (direita). SNAPASO 1” inibiu consideravelmente a expressão da proteína SNAP25 em células PC12 em ambos os momentos.
[00640] SNAP25 Exemplo 6. Inibição da Expressão de Proteína SNAP25 em Células SiMa por SNAP-ASO 3.
[00641] O SNAP-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de
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171/189 inibir a expressão da proteína SNAP25 em células de neuroblastoma humano SiMa como se segue.
Cultura Celular e Tratamento com ASO [00642] Células SiMa (Número de Catálogo ACC164, DSMZ) foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina, 1 % de L-glutamina e 1 % de piruvato de sódio sob 5 % de CO2 atmosfera a 37°C. As células SiMa foram cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura, e foram tratadas por 48 horas com SNAP-ASO 3 a 0 zM (controle negativo), 1 zM a 100 aM. Havia 3 placas de cultura para 0 controle negativo para compensar possíveis artefatos técnicos durante a análise de western blot.
Lise [00643] As células foram submetidas à lise em gelo com 200 de tampão 1X RIPA (Número de Catálogo 9806, Cell Signaling Tech) suplementado com 0,1 % de SDS e 1X de coquetel de inibidores de proteinase (complete Mini, Roche). Em seguida, os lisados foram coletados em 1,5 mL tubo-e, misturado com 100 mL de tampão de amostra 5X, e fervidos por 5 min.
Western Blot [00644] Os lisados foram submetidos à separação eletroforética em um gel de SDS-PAGE a 12 % e transferidos para uma membrana de 0,2 pm de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana foi sondada com um anticorpo anti-SNAP25 (Número de Catálogo ab41455, Sigma) e um anticorpo anti-p-actina (Número de Catálogo A3845, Sigma). [00645] A Figura 50A fornece os dados de Western blot de SNAP25 obtidos com os lisados de células SiMa (diagrama de topo) juntamente com os níveis de expressão relativos de SNAP25 normalizados contra a actina a por densitometria (diagrama inferior). O nível de proteína SNAP 25 diminuiu em 40 a 50 % nas células tratadas com SNAP-ASO 3.
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172/189 [00646] SNAP25 Exemplo 7. qPCR para mRNA de SNAP25 em
Células SiMa Tratadas com SNAP-ASO 3.
[00647] SNAP-ASO 3 foi avaliado por qPCR aninhada com SNAP25 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de
SNAP25 humano em células SiMa como se segue.
Cultura Celular e Tratamento com ASO [00648] Células de SiMa foram cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura, e foram tratadas com SNAPASO 3 a 0 zM (controle negativo), 1 zM, 10 zM, 100 zM ou 1 aM, 10 aM ou 100 aM. (2 placas de cultura por concentração de ASO);Extração de RNA & Síntese de cDNA [00649] O RNA total foi extraído das células utilizando RNeasy Mini Kit (Número de Catálogo 74106, Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de padrão de RNA foi submetido a uma reação de 25 μΙ de transcrição reversa usando kit de síntese de cDNA de 1°. filamento PrimeScript (Número de Catálogo 6110B, Takara) contra hexâmeros aleatórios.
Amplificação de qPCR [00650] As reações de PCR foram monitoradas com uma sonda Taqman [(5’ -» 3!) 56-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA3IABkFQ] direcionando a junção do éxon 6 e éxon 7 contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon [SNAP-éxon 6 dianteiro: (5’ -> 3’) GACGAACGGGAGCAGATG e SNAP-éxon 8„reverso (2): (5’ -> 3') ATCTCATTGCCC-ATATCCAGG] .Condições do ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos 15 seg a 95 e 30 seg a 60cC.
[00651] A Figura 50B fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de SNAP25 humano de tamanho natural diminuiu significativamente (teste t de Student) nas células tratadas com SNAP-ASO 3 a 1 zM, 100 zM, 1 aM e 100 aM por 20 para 40 %. As células tratadas com o ASO a 100 aM mostraram a inibição mais forte de 40 %.
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173/189 [00652] SNAP25 Exemplo 8. Inibição da Expressão de Proteína
SNAP25 na Pele do Camundongo Aplicada Topicamente com SNAPASO 1.
[00653] SNAP-ASO 1 é um ASO de 16-mer totalmente complementar ao sítio de junção 3’ abrangendo a junção do íntron 6 e éxon 7 no pré-mRNA de SNAP25 do rato lido a partir do DNA genômico de camundongo [acessado a partir da sequência de referência do NCBI: NC 000068 ]. SNAP-ASO 1 foi avaliado quanto à sua capacidade para inibir a expressão da proteína SNAP25 na pele após administração tópica como se segue.
Corte de pêlo e agrupamento [00654] No dia 0, 8 camundongos C57BL/6 fêmeas (5 semanas de idade) foram anestesiados com zoletil/rompun, e os pêlos no dorso (cerca de 3 cm x 4 cm) foram cortados com um aparador. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos, ou seja, nenhum grupo de tratamento com ASO (controle negativo) e 3 grupos de tratamento de SNAP-ASO 1 a 1 fM, 10 fM e 100 fM. (2 animais por grupo)
Administração Tópica [00655] Prepararam-se soluções tópicas diluindo em série uma solução mãe aquosa de SNAP-ASO 1 em etanol aquoso a 30 % (v/v) suplementado com glicerina a 3 % (v/v) para SNAP-ASO 1 a 0, 1, 10 e 100 fM. Cada animal foi administrado topicamente com cerca de 100 pL de solução tópica na pele do dorso com remoção de pêlos usando uma meia de algodão por dia durante os dias 0 a 4.
Amostragem de Pele [00656] Na tarde do Dia 4, os animais foram anestesiados com zoletil/rompun para amostrar a parte da pele tratada topicamente com o ASO. As amostras de pele foram então submetidas à IHC contra a proteína SNAP25 como descrito abaixo.
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SNAP25 IHC [00657] As amostras de pele foram criosseccionadas e imunocoradas em série com um anticorpo anti~SNAP25 primário (Número de cateter ab41455, Abeam) na diluição 1:200, com um anti-lgG secundário (Número de Cat. BA-1100, Vector) a uma diluição de 1:200, e depois com Dylight 594-estreptavidina (Número de Cat. SA-5594, Vector, CA, USA) a uma diluição de 1:200 para marcação com fluorescência vermelha. O anticorpo anti-SNAP25 sonda o C-terminal da proteína SNAP25. As imagens de IHC foram capturadas em um scanner de lâminas Zeiss para avaliar a expressão da proteína SANP25. O manchamento com DAPI foi realizado para visualizar a microestrutura da pele.
[00658] A Figura 51 fornece um conjunto representativo de imagens de IHC de SNAP25 por grupo. No grupo controle negativo, a expressão da proteína SNAP25 era alta na camada muscular logo abaixo da derme. A expressão da proteína SNAP25 na camada muscular é considerada originária da expressão da proteína SNAP25 nos axônios neuronais-motores inseridos na camada muscular. A expressão da proteína SNAP25 na camada muscular diminuiu gradualmente com o aumento da dose. A diminuição mais notável foi observada no grupo de tratamento de 100 fM.
[00659] A inibição da expressão da proteína SNAP25 de tamanho natural na pele por IHC parece ser mais forte do que a inibição por western blot observada em células PC12 (conforme SNAP25 Exemplo 5). A super-regulação transcricional pelo (s) ElciRNA (s) em células primárias, se houver, não parece ser tão marcada quanto a regulação positiva implicada nas células cancerígenas, incluindo as células PC12 e SiMa. Exemplos para a Atividade In Vitro de ASOs de TYR [00660] A tirosinase (TYR) é uma enzima envolvida na melanogênese ou pigmentação da pele. Os derivados de PNA de Fórmula I na
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Tabela 10 foram concebidos para complementar o alvo do sítio de junção 3’ do éxon 2 no pré-mRNA de TYR humano ou de camundongo. Os ASOs de TYR foram avaliados quanto à atividade do salto de antígenos anti-TYR nos melanócitos humanos, bem como nas células B16F10 (melanoma de camundongo). Os exemplos biológicos aqui proporcionados são para ilustrar a atividade de salto do éxon de TYR ASO como exemplos para o composto de Fórmula I e, consequentemente, não devem ser interpretados como limitante do escopo da presente invenção a ASOs de TYR.
[00661] TYR Exemplo 1. Salto de Éxon Induzido por TYR-ASO 4 em Células B16F10.
[00662] TYR-ASO 4 especificado na Tabela 10 é um ASO de TYR de 13-mer totalmente complementar ao sítio de junção 3’ abrangendo a junção dos íntron 1 e éxon 2 na TYR do camundongo marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de TYR de camundongo de [(5’ —>· 3') aauuquuuuucacag | AUC AUUUGU AG CAGAI. Entretanto, TYR-ASO 4 possui 4 não pareamentos com o sítio de junção 3’ que atravessa a junção dos íntron 1 e éxon 2 nos prémRNAs de TYR humanos marcados com aspas () que indicam a sequência de pré-mRNA de 30~mer de [(5’ 3S) ggguguuuug uacaq | AU UG!! U,,C,,UGUAGCCGA1.
[00663] TYR-ASO 4 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 2 de TYR de camundongo em células de melanoma B16F10 como se segue. TYR-ASO 4 pode servir como um bom composto substituto para TYR-ASO 1 que é totalmente complementar ao pré-mRNA de TYR humano.
Cultura Celular e Tratamento com ASO [00664] Células de melanoma de camundongo B16F10 (Número de Cat. CRL-6475, ATCC) foram mantidas em DMEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado de Dulbecco) suplementado com 10 % de
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FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina, e 0,01 mg/ml de insulina bovina. As células B16F10 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 ml de DMEM durante 5 horas com TYR-ASO 4 a 0 (controle negativo), 1, 10,100 ου 1000 aM.
Extração de RNA & Síntese de cDNA por PCR de Uma Etapa [00665] O RNA total foi extraído usando Kit de Extração de RNA Universal (Número de Catálogo 9767, Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Utilizou-se 200 ng de padrão de RNA para uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Platinum®Taq polimerase (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [TYR-éxon 1__dianteiro: (5’ > 3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; e TYR-éxon 4__reverso: (5! -> 3’) AGAGCGGTATGAAAGGAA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido por 15 ciclos de 30 s a 94°C, 30 seg a 52°C e 40 seg a 72°C.
Amplificação por PCR Aninhada [00666] 1 uL de cDNA foi ainda amplificado em um 20 ul de reação de PCR aninhada contra um conjunto de iniciadores específicos do éxon de [TYR-éxon 1n__dianteiro (Número de Catálogo K2612, Bioneer.): (5’ > 3') GAGAACTAACTGGGGATGA ; e TYR-éxon 4n reversa: (5’ -* 3!) CGATAGGTGCATTGGCTT] de acordo com as condições do ciclo seguinte: 95°C durante 5 min seguido por 30 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 52°C e 40 s a 72°C.
Identificação de Produtos de Salto de Éxon [00667] Os produtos de PCR foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por Sequenciamento de Sanger.
[00668] A Figura 52A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR. As células sem tratamento com ASO produziram duas
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177/189 bandas de PCR, uma para o mRNA de TYR de tamanho natural e a outra para o mRNA de RNA de variante de junção sem os éxons 2 e 3, sugerindo um salto espontneo dos éxons 2-3. As células tratadas com TYR-ASO 4 a 1 a 1000 aM, contudo, produziram essencialmente apenas a variante de junção mRNA de TYR sem os éxons 2 e 3. Desta maneira, TYR-ASO 4 aumenta a propensão do salto dos éxons 2-3 em células de melanoma B16F10.
[00669] O produto de PCR para o salto do éxons foi sequenciado para ser a variante de junção de mRNA sem os éxons 2-3, como mostrado na Figura 52B.
[00670] Exemplo TYR 2. qPCR para mRNA de TYR em Células B16F10 Tratadas com TYR-ASO 4.
[00671] O TYR-ASO 4 foi avaliado por qPCR aninhada TYR quanto à sua capacidade para induzir mudanças no nível de mRNA de TYR de camundongo em células B16F10 como se segue.
[00672] Cultura de Células e Tratamento de ASO Células B16F10 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com TYR-ASO 4 a 0 (controle negativo), 1, 10.100 ou 1000 aM. (2 placas de cultura por dose)
Extração de RNA & Síntese de cDNA por PCR de Uma Etapa [00673] O RNA total foi extraído e submetido à síntese de cDNA como descrito em TYR Exemplo 1.
Amplificação de qPCR aninhada [00674] 1 pL de cada solução de cDNA diluída em 100X foi submetido a uma reação de PCR em tempo real de 20 pL contra um conjunto de sonda Taqman direcionando a junção do éxon 2 e éxon 3 (Número de Catálogo Mm00495818 ml, Thermo Fisher Scientific) de acordo com as seguintes condições do ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 30 ciclos 10 seg a 95°C e 30 seg a 60°C.
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Análise Estatística [00675] A experiência de qPCR aninhada foi repetida independentemente quatro vezes, e os níveis de mRNA individuais de cada experiência foram normalizados contra o nível de mRNA sem tratamento com ASO. Os níveis de mRNA obtidos de todas as 4 experiências separadas foram reunidos para análise estatística pelo teste t de Student. Desta maneira, o número de amostras de RNA é de 8 por concentração de ASO.
[00676] A Figura 52C fornece os dados de qPCR agrupados, nos quais o nível de mRNA de tamanho natural significativamente (teste t de Student) diminuiu em cerca de 40 % nas células tratadas com TYR-ASO 4 entre 1 e 1.000 aM.
[00677] TYR Exemplo 3. Inibição da Expressão da Proteína TYR por TYR-ASO 4 em Células B16F10.
[00678] TYR-ASO 4 foi avaliado quanto à sua capacidade de inibir a expressão da proteína TYR em células B16F10 como descrito abaixo.
[00679] Células B16F10 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de melo de cultura foram tratadas com TYR-ASO 4” por 24 horas em 0 zM (controle negativo), 10 zM, 100 zM, 1 aM ou 10 aM e submetidas à lise com 200 pL de tampão de lise celular 1X (Número de Catálogo 9803, Cell Signaling Tech) suplementado com coquetel de inibidores de protease 1X (Número de Catálogo P8340, Sigma). 200 pL de cada lisado foram misturados com 100 pL de tampão de amostra 5X e fervidos a 100°C durante 5 min. 20 pL de cada lisado foram submetidos à separação eletroforética em um gel de TGX com gradiente de 4-15 % (Número de Catálogo 456-1086, Bio-Rad) e transferência de proteína para uma membrana PVDF de 0,45 pm. A membrana foi sondada com um anticorpo anti-TYR (Número de Catálogo 9319, Cell Signaling Tech) e um anticorpo anti-p-actina (Número de Catálogo a3845, Sigma).
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179/189 [00680] A Figura 53A fornece os dados de western blot TYR obtidos com os lisados de células B16F10. O nível de proteína TYR foi consideravelmente maior nos lisados do controle negativo do que os lisados das células tratadas com TYR-ASO 4.
[00681] TYR Exemplo 4. Inibição de Melanogênese por TYR-ASO 4 em Células B16F10.
[00682] TYR-ASO 4 foi avaliado quanto à sua capacidade para inibir a melanogênese em células B16F10 como descrito abaixo.
[00683] Células B16F10 cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas com TYR-ASO 4 a 0 (controle negativo) ou 1 a 1.000 aM, ou com 10 ou 100 pg/mL de arbutina como controle positivo. (2 placas de cultura por dose) 24 horas depois, as células foram submetidas à lise com 200 pL de NaOH 1N. Cada lisado foi coletado em tubo-e de 1,5 mL e mantido durante a noite em temperatura ambiente. O teor de melanina em cada lisado foi determinado por absorvência a 475 nm em um leitor de ELISA. A experiência foi repetida quatro vezes usando células em passagem diferente. Os quatro conjuntos de dados de conteúdo de melanina foram agrupados para análise estatística pelo teste t de Student contra o conteúdo de melanina sem tratamento (controle negativo).
[00684] A Figura 53B resume as mudanças no teor de melanina nas células B16F10 após uma incubação de 24 horas com TYR ASO 4 ou com arbutina. O teor de melanina diminuiu significativamente em cerca de 15 % e 25 % nas células tratadas com 10 pg/mL e 100 pg/mL de arbutina, respectivamente. No caso das células tratadas com TYRASO 4, o teor de melanina diminuiu significativamente em cerca de 15 % de sem muita dependência de dose. A atividade inibitória de TYRASO 4 foi comparável àquela de 10 pg/mL de arbutina.
[00685] TYR Exemplo 5. qPCR para mRNA de TYR em Melanócitos Humanos Tratados com TYR-ASO 1.
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180/189 [00686] TYR-ASO 1 especificado na Tabela 10 é um ASO de TYR de 13-mer totalmente complementar ao sítio de junção 3’ abrangendo a junção dos íntron 1 e éxon 2 no TYR humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de TYR humana de 30mer de [(5! -* 3') ggguguuuuguacag | AUUGUCUGUAGCCGA1.
[00687] O TYR-ASO 1 foi avaliado por qPCR aninhada com TYR quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de TYR em melanócitos epidérmicos primários humanos como segue. Cultura de Célula & Tratamento com ASO [00688] As células de melanócitos epidérmicos primários (Número de Catálogo PCS-200-013, ATCC) foram mantidas em Meio Basal de Células Dérmicas (Número de Catálogo PCS-200-030, ATCC) suplementado com Componente de Kit de Crescimento de Melanócitos Adultos (Número de Catálogo PCS-200-042, ATCC). Os melanócitos crescidos em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratados com TYR-ASO 1 a 0 zM (controle negativo), 1 zM, 100 zM ou 10 aM. (3 placas de cultura por concentração).
[00689] Extração de RNA & Síntese de cDNA por PCR de Uma etapaApós uma incubação com TYR-ASO 1 durante 5 horas, o RNA total foi extraído usando Kit RNeasy Mini (Número de Catálogo 74106, Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 200 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit de RT-PCR de Uma Etapa Super Script® com Taq polimerase de Platinum® (Número de Catálogo 10928-042, Invitrogen) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [TYR-éxon 1_dianteiro (2): (5’ > 3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; e TYR-éxon 5 reverso: (5’ -» 3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT] de acordo com as seguintes condições de ciclo especificadas: 50°C durante 30 min e 94°C durante 2 min, que foi seguido de 15 ciclos de 30 seg. a 94°C , 30 seg a 50°C e 1 min a 72°C.
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Amplificação por PCR Aninhada [00690] 1 pL de cDNA foi ainda amplificado em uma reação de PCR aninhada de 20 pL (Número de Catálogo K2612, Bioneer) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon de [TYR-éxon 2n dianteiro: (5’ -> 3') GATAAAGCTGCCAATTTC; e TYR-éxon 3n reverso: (5’ 3') TTGTGCATGCTGCTTTGA] contra uma sonda Taqman [(5’
-> 3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ], Condições do Ciclo: 95°C durante 3 min seguido por 40 ciclos de 10 seg a 95°C e 30 seg a 60°C.
[00691] A Figura 53C fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de TYR de tamanho natural diminuiu por aproximadamente 30 % nos melanócitos humanos tratados com TYR-ASO 1 entre 1 zM e 10 aM. As diminuições observadas foram significativas (teste t de Student) nas células tratadas com TYR-ASO 1 a 1 zM e 10 aM.
Exemplos para Atividades Biológicas de ASOs de PDO-1 [00692] A PD-1, também conhecida como proteína 1 de morte celular programada ou CD279, é um receptor de superfície celular expresso em células imunes. PD-1 é uma proteína de ponto de verificação imune envolvida na sub-regulação da resposta imune. Os anticorpos monoclonais da PD-1, tal como o nivolumabe e o pembrolizumabe, têm sido usados para tratar tumores sólidos, aumentando a resposta imune.
[00693] Os ASO de PD-1 de Fórmula I na Tabela 11 foram projetados para complementarmente direcionar o sítio de junção 3’ ou o sítio de junção 5’ do éxon 2 no pré-mRNA de PD-1 humano ou de camundongo. Os ASOs de PD-1 foram avaliados quanto à atividade do salto do éxon antissenso em células Jurkat, e também quanto à atividade antitumoral em camundongos tipo selvagem carregados com tumor singênico. Exemplos biológicos aqui fornecidos são para ilustrar a atividade do salto do éxon de ASOs de PD-1 como exemplos para o
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182/189 composto de Fórmula I e, por conseguinte, não deve ser interpretado para limitar o escopo da presente invenção ao ASO de PDO-1.
[00694] PD-1 Exemplo 1. Salto de Exon Induzido por PD-ASO 3 em Células Jurkat.
[00695] PD-ASO 3 especificado na Tabela 11 é um ASO de PD-1 de 14-mer totalmente complementar ao sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 2 e do íntron 2 no pré-mRNA de PD-1 humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de PD-1 humana de 30-mer de [(5’ 3') AGCUCAGGGUGACAG | gugcggccucggagg]. PD-ASO 3 possui uma sobreposição de 9-mer com o éxon 2 e uma sobreposição de 5-mer com o íntron 2.
[00696] PD-ASO 3 foi avaliado quanto à sua capacidade de induzir o salto do éxon 2 de PD-1 humano em células Jurkat como segue. Cultura de Células & Tratamento com ASO [00697] As células Jurkat (Número de Catálogo TIB-152, ATCC) foram mantidas em RPMI-1640 suplementado com 10 % de FBS e 1 % de estreptomicina/penicilina. Células Jurkat cultivadas em placa de cultura de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura foram tratadas durante 5 horas com PD-ASO 5 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM.
Extração de RNA e Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00698] O RNA total foi extraído usando o kit de mini-preparação RNAeasy (Qiagen, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. 500 ng de padrão de RNA foi submetido a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [PD-éxon 1 dianteiro: (5’ 3!) GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; PD-éxon
5__reverso: (5’ -> 3’) GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]. Condições do ciclo: 50°C durante 30 minutos e 94°C durante 2 minutos, que foi seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C e 1
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183/189 minuto a 72°C.
Amplificação por PCR Aninhada [00699] 1 pL de cDNA diluído em 100X foi também amplificado em uma PCR aninhada de 20 pL (Invitrogen, USA) usando as seguintes condições de ciclo: 20 segundos a 95°C, 30 segundos a 56°C e 40 segundos a 72°C durante 40 ciclos contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [PD-éxon 1n dianteiro: (5’ -> 3') GGCTGGCGGCCAGGATGGTTC; e PD-éxon Sn reverso: (5’ -> 3') GAAAGACAATGGTGGCATACTCC],
Identificação de Produtos do Salto do Exon [00700] Os produtos de PCR aninhada resultantes foram submetidos à separação eletroforética em um gel de agarose a 2 %. As bandas de tamanho alvo foram coletadas e analisadas por sequenciamento de Sanger.
[00701] A Figura 54A fornece os dados de eletroforese dos produtos de PCR. As células sem tratamento com ASO produziram apenas a banda do produto de PCR do mRNA de tamanho natural. Nesse meio tempo, havia três bandas de produto de PCR recém-formadas nas células tratadas com o ASO de PD-1. Das três bandas de produto de PCR, a banda de tamanho de aproximadamente 470 pb (marcada como não específica” na Figura 54A) não foi uma variante de junção de mRNA PD-1 com o salto do éxon de acordo com uma análise de sequenciamento de Sanger.
[00702] As células tratadas com PD-ASO 3 em 10 e 100 aM produziram uma banda de produto de PCR correspondendo ao salto do éxon 2 por sequenciamento de Sanger. Nas células tratadas com PDASO 3 a 1.000 pM, no entanto, o produto de PCR do salto do éxon 2 desapareceu e o nível de mRNA de tamanho natural foi superior ao nível de tamanho natural nas células tratadas nas concentrações de ASO mais baixas. Os dois produtos de PCR atribuídos ao salto do
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184/189 éxon 2 e do éxon 3 foram confirmados por sequenciamento de Sanger, (conforme a Figura 54B). O padrão de resposta à dose invertido nos dados da PCR aninhada pode ser devido a uma super-regulação da transcrição pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon com PD-ASO 3. [Nature Struc. Mot. Biol, vol 22 (3)s 256-264 (2015)].
[00703] PD-1 Exemplo 2. qPCR para mRNA de PD-1 em Células Jurkat Tratadas com PD-ASO 3.
[00704] PD-ASO 3 foi avaliado por qPCR aninhada com PD-1 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de PD-1 humano em células Jurkat como segue.
Cultura de Célula & Tratamento com ASO [00705] Células Jurkat cultivadas em placa de cultura de 60 mm foram ativadas com um anticorpo anti-CD3 (Número de Catálogo 160037, eBioscience) em 1pg/mL e um antiocorpo anti-CD28 (Número de Catálogo 16- 0289, eBioscience) em 0,5 pg/mL durante 48 horas. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por meio fresco e tratado com PD-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM durante 24 horas (4 placas de cultura por concentração de ASO).
Extração de RNA e Síntese de cDNA por RT-PCR de Uma Etapa [00706] O RNA total foi extraído usando kit de mini-preparação RNAeasy (Qiagen, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. 500 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando kit RT-PCR de Uma Etapa (Invitrogen, USA) contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [PD-éxon 1 __dianteiro: (5’ > 3') GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC; e PD-éxon 5 reverso: (5! —> 3') GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]. Condições do ciclo: 50°C durante 30 minutos e 94°C durante 2 minutos, que foi seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C e 1 minuto a 72°C.
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185/189 qPCR Aninhada por SYBR [00707] 1 pL de cada solução de cDNA diluída em 100X foi submetida a uma amplificação de qPCR aninhada de 20 pL contra um conjunto de iniciadores específicos de éxon [PD-éxon 2 dianteiro: (5’ -» 3') ACAACGCCACCTTCACCTGC; e PD-éxon 2 reverso: (5! -» 3') GCCAGCTTGTCCGTCTGGTTG] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 20 segundos a 95°C, 30 segundos a 56°C e 40 segundos a 72°C durante 40 ciclos. A reação de qPCR foi sondada com SYBR (Bio-Rad, USA).
[00708] A Figura 55A fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de PD-1 significativamente (teste t de Student) diminuiu em > 80 % nas células tratadas com PD-ASO 3 em 10 e 100 aM. No caso das células tratadas com o ASO a 1.000 aM, o nível de mRNA de PD-1 recuperou-se a aproximadamente 55 % do nível de controle negativo. O rebote do nível de mRNA em 1.000 aM é consistente com o padrão de resposta à dose invertida observado em PD-1 Exemplo 1. (conforme a Figura 54A).
[00709] PD-1 Exemplo 3. qPCR para mRNA de IL-2 em Células Jurkat Tratadas com PD-ASO 3.
[00710] Sabe-se que a sub-regulação da atividade da PD-1 subregula a expressão da interleucina 2 (IL-2). [Am. J. Clin. Oncol. Vol. 39 (1), 98-106 (2016)] PD-ASO 3 foi avaliada por qPCR aninhada com IL-2 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de IL-2 humana em células Jurkat como segue.
Cultura de Célula & Tratamento com ASO [00711] Células Jurkat cultivadas em placa de cultura de 60 mm foram ativadas com um anticorpo anti-CD3 (Número de Catálogo 160037, eBioscience) a 1pg/mL e um anticorpo anti-CD28 (Número de Catálogo 16- 0289, eBioscience) em 0,5 pg/mL durante 48 horas. Em seguida, o meio de cultura foi substituído por meio fresco e tratado
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186/189 com PD-ASO 3 em 0 (controle negativo), 10, 100 ou 1.000 aM durante 24 horas. (4 placas de cultura por concentração de ASO)
Extração de RNA e síntese de cDNA [00712] O RNA total foi extraído usando o kit de mini-preparação RNeasy (Qiagen, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. 500 ng de padrão de RNA foram submetidos a uma reação de transcrição reversa de 25 pL usando o kit de síntese de cDNA de 1o filamento de PrimeScript™ (Takara, Japan) de acordo com o protocolo do fabricante.
qPCR por SYBR [00713] 1 pL de cada solução de cDNA foi submetido a 20 pL de amplificações de qPCR contra um conjunto de iniciadores direcionando o mRNA de IL-2 [IL-2__dianteiro: (5’ -> 3') GTCACAAACAGTGCACCTAC; e IL-2 reversa: (5’ 3’) GGTGAGTTTGGGATT-CTTGTA] de acordo com as seguintes condições do ciclo: 20 segundos a 95°C, 30 segundos a 56°C e 40 segundos a 72°C durante 40 ciclos. A reação de qPCR foi sondada com SYBR (Bio-Rad, USA).
[00714] A Figura 55B fornece os dados de qPCR de IL-2, em que o nível de mRNA de IL-2 significativamente (teste t de Student) aumentou por aproximadamente 140 %, 120 % e 40 % nas células tratadas com PD-ASO 3 em 10, 100 e 1.000 aM, respectivamente. O padrão de resposta à dose invertido é consistente com o padrão de resposta à dose invertido observado em SSPD-1 Exemplo 1 e PD-1 Exemplo 2. (conforme Figura 54A e Figura 55A).
[00715] PD-1 Exemplo 4. qPCR para mRNA de PD-1 em Células Jurkat Tratadas com PD-ASO 1.
[00716] PD-ASO 1 especificado na Tabela 11 é um ASO de PD-1 de 14-mer totalmente complementar ao sítio de junção 3’ abrangendo a junção dos íntron 1 e éxon 2 no pré-mRNA de PD-1 humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de PD-1 humano
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187/189 de 30-mer de [(5’ > 3') cucuccaucucucag | ACUCCCCAGACAGGC].
PD-ASO 1 possui uma sobreposição de 5-mer com o intron 1 e uma sobreposição de 9~mer com o éxon 2.
[00717] PD-ASO 1 foi avaliada por qPCR aninhada com PD-1 quanto à sua capacidade de induzir mudanças no nível de mRNA de PD-1 humano em células Jurkat como descrito em PD-1 Exemplo 2, a menos que notado de outra maneira.
[00718] A Figura 56A fornece os dados de qPCR, nos quais o nível de mRNA de PD-1 significativamente (teste t de Student) diminuiu por aproximadamente 60 % nas células tratadas com PD-ASO 1 em 100 e 1.000 aM. Ao contrário do caso com PD-ASO 3, PD-ASO 1 não mostrou nenhuma sugestão clara do padrão de resposta à dose invertida.
[00719] PD-1 Exemplo 5. Atividade Antitumoral de PD-ASO 2 contra Melanoma de B16F10 em Camundongos C57BL/6.
[00720] PD-ASO 2 especificado na Tabela 11 é um ASO de PD-1 de 16-mer totalmente complementar ao sítio de junção 5’ abrangendo a junção do éxon 2 e do íntron 2 no pré-mRNA de PD-1 de camundongo marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de PD-1 de camundongo de 30-mer de [(5’ -* 3') AGCUCGUGGUAACAG| gugaggcuaguagaa]. PD-ASO 2 possui uma sobreposição de 10-mer com o éxon 2 e uma sobreposição de 6-mer com o íntron 2.
[00721] Nesse meio tempo, PD-ASO 2 possui quatro não pareamentos com o pré-mRNA de PD-1 humano marcado como negrito e sublinhado na sequência de pré-mRNA de PD-1 humano de 30-mer de [(5’ 3’) AGCUC AGGGyGACAG | gug c ggccucggagg], onde as quatro não pareamentos foram marcadas com o sinal de aspas ( ). PD-ASO 2 pode ser empregado como substituto de ASO de PD-ASO 3 para o pré-mRNA de PD-1 humano.
[00722] O PD-ASO 2 foi avaliado quanto à sua atividade antitumo
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188/189 ral em camundongos C57BL/6 machos (4 semanas de idade) injectados com células de melanoma B16F10 como fornecido abaixo.
Inoculacão de Células de Melanoma B16F10 [00723] Células de melanoma de camundongo B16F10 (Número de Catálogo CRL-6475, ATCC) foram mantidas em placa de cultura de 150 mm contendo DMEM suplementado com 10 % de FBS, 1 % de estreptomicina/penicilina e 0,01 mg/ml de insulina bovina. No Dia 0, aproximadamente 1x105 de células B16F10 dissolvidas em 50 pL de PBS foram injetadas em cada animal no flanco posterior direito. Agrupamento & Tratamento com ASO [00724] No Dia 3, os animais foram distribuídos randomizadamente por peso para 4 grupos de 0 (controle negativo), 2, 10 e 50 pmol/Kg de PD-ASO 2. (N = 15 por grupo).
[00725] As soluções de injeção foram preparadas diluindo em série uma solução mãe aquosa de PD-ASO 2 em PBS a 0 nM (apenas PBS), 0,4 nM, 2 nM e 12,5 nM de PD-ASO2 para o controle negativo, 2, 10 e 50 pmol/Kg de PD-ASO 2, respectivamente.
[00726] Os animais foram administrados por via subcutânea com uma solução de injeção em 5 mL/Kg, 2X por semana durante o Dia 3 ao Dia 17.
Atividade Antitumoral [00727] A atividade antitumoral foi avaliada por mudanças no volume do tumor entre cada grupo de tratamento com ASO e o grupo controle negativo.
[00728] A Figura 56B fornece os volumes tumorais observados por grupo durante o Dia 0 ao Dia 19. O crescimento tumoral de 2 pmol/Kg foi significativamente inibido durante o Dia 10 ao Dia 19. A inibição observada no Dia 19 foi de aproximadamente 55 % (aproximadamente 375 mm3 e 850 mm3 com o grupo controle de 2 pmol/kg e negativo, respectivamente). A atividade antitumoral do grupo de 50 pmol/Kg foi
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189/189 comparável a do grupo de 2 pmol/Kg durante o Dia 10 ao Dia 17. No entanto, a atividade antitumoral do grupo de 50 pmol/Kg desapareceu no Dia 19. A atividade antitumor do grupo de pmol/Kg foi marginal sem significância ao longo de todo o periodo.
[00729] O padrão de resposta à dose desconhecido pode ser devido a uma super-regulação da transcrição pelo RNA circular de éxon íntron (ElciRNA) acumulado durante o salto do éxon com PD-ASO 2. [Nature Struc. Mol. Biol. vol 22 (3), 256-264 (2015)]. Dado que o nivolumabe, um fármaco de anticorpo monoclonal de PD-1 aprovado pela US FDA, mostrou um padrão de resposta à dose em forma de sino em pacientes com tumor [J. Clin. Oncol. Vol 33 (18), 2013-2020 (2015)], no entanto, o padrão de resposta à dose desconhecido de PD-ASO 2 pode ser devido à farmacologia intrínseca da inibição de PD-1.
[00730] No día 19, os animais foram sacrificados para medir o peso do tumor por grupo. Os pesos médios dos tumores foram de aproximadamente 0,35 g e 1,20 g para o grupo de 2 pmol/Kg e do grupo controle negativo, respectivamente. Desta maneira, o crescimento do tumor em peso foi significativamente inibido no grupo de 2 pmoles/Kg por aproximadamente 70 %. (p < 0,01 pelo teste t de Student).

Claims (14)

1. Derivado de ácido nucleico de peptídeo representado por Fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Figure BR112019011692A2_C0001
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
o composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10~mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, Sn-i, Sn, Ti, T2, Tn-i, e Tn independentemente representam deuterido [D], híbrido [H], alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
X e Y independentemente representam hídrido, formila [HC(~O)-], aminocarbonila [NH2-C(=O)-], aminotiocarbonila [NH2-C(“S)-], alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 280/291
2/11 ida ou não substituída, alquilfosfoníla substituída ou não substituída, ou radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa hídrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino não substituído [-Nhh], alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
Bi, 82, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais; e pelo menos quatro dentre Bi, 62, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais com um radical amino substituído ou não substituído covalentemente ligado à porção de nucleobase.
2. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 10 e 25;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
0 composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, ..., Sn-1, Sn, Τι, T2, .... Tn.i, e Tn independentemente representam deuterido, hídrido, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
X e Y independentemente representam hídrido, formila, aminocarbonila, aminotiocarbonila, alquila substituída ou não substitu
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3/11 ida, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, ariloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, arilaminocarbonila substituída ou não substituída, alquilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, arilaminotiocarbonila substituída ou não substituída, alquiloxitiocarbonila substituída ou não substituída, ariloxitiocarbonila substituída ou não substituída, alquilsulfonila substituída ou não substituída, arilsulfonila substituída ou não substituída, radical alquilfosfonila substituída ou não substituída, ou radical arilfosfonila substituída ou não substituída;
Z representa hídrido, hidróxi, alquilóxi substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, amino não substituído, alquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, alquila substituída ou não substituída, ou radical arila substituída ou não substituída;
Bi, 82, Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula Π, Fórmula III, ou Fórmula IV:
Si H;: rí
Figure BR112019011692A2_C0002
Figure BR112019011692A2_C0003
Figure BR112019011692A2_C0004
Fórmula II
Fórmula III
Fórmula IV em que,
R1, Rs, Rs, R4, Rs e Rs são independentemente selecionaPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 282/291
4/11 dos dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Li, L.2 e Ls são um ligador covalente representado por Fórmula V covalentemente ligando o grupo amino básico à porção de nucleobase:
Fórmula v em que,
Q1 e Qm são radical metileno substituído ou não substituído (-CH2-), e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Qs, .... e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno substituído ou não substituído, oxigênio (-0-), enxofre (-S-), e radical amino substituído ou não substituído [-N(H)-, ou N(substituinte)-]; e m é um número inteiro entre 1 e 15.
3. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 23;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
0 composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
S1, S2, ..., Sn-1, Sn, T1, T2, ..., Tn-1, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam hídrido, aminocarbonila, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituíPetição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 283/291
5/11 da, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-1, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula Π, Fórmula HI, ou Fórmula IV;
Ri, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são radical metileno substituído ou não substituído, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Qs, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno substituído ou não substituído, oxigênio, e radical amino; e m é um número inteiro entre 1 e 11.
4. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 21;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
0 composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo, ou parcialmente complementar à sequência pré-mRNA alvo com um ou dois não pareamentos;
Si, S2, Sn-1, Sn, Ti, T2, Tn-ι, e Tn são radical híbrido;
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6/11
X e Y independentemente representam hídrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, .... Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
Ri, R2, Rs, R4, Rs e Re são independentemente selecionados dentre hídrido, e radical alquila substituída ou não substituída;
Qi e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre metileno, oxigênio, e radical amino; e m é um número inteiro entre 1 e 11.
5. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 11 e 19;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7~mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
0 composto de Fórmula I é completamente complementar
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7/11 à sequência pré-mRNA alvo;
Si, S2, .... Sn-1, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam hídrido, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, alquiloxicarbonila substituída ou não substituída, alquilaminocarbonila substituída ou não substituída, ou radical arilsulfonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases naturais incluindo adenina, timina, guanina, citosina e uracila, e nucleobases não naturais;
pelo menos quatro dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
Ri, R3, e Rs são radical híbrido, e R2, R4, e Re independentemente representam hídrido, ou radical alquila substituída ou não substituída;
Q1 e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3i ..... e Qm-ι são independentemente selecionados dentre radical metileno e oxigênio; e m é um número inteiro entre 1 e 9.
6. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 12 e 19;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção
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8/11 alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
o composto de Fórmula I é completamente complementar à sequência pré-mRNA alvo;
Si, S2, .... Sn-1, Sn, Τι, Ϊ2, Tn-i, e Tn são radical híbrido;
X e Y independentemente representam alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou radical alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, 62, Bn-ι, e Bn são independentemente selecionados dentre adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco dentre B1, Bs, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula III, ou Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são radical híbrido;
Q1 e Qm são radical metileno, e Qm é diretamente ligado ao grupo amino básico;
Q2, Q3, e Qm-ι são independentemente selecionados dentre radical metileno e oxigênio; e m é um número inteiro entre 1 e 9.
7. Derivado de ácido nucleico de peptídeo de acordo com a reivindicação 1, ou um sal farmacêutico do mesmo:
caracterizado pelo fato de que, n é um número inteiro entre 12 e 18;
0 composto de Fórmula I possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo;
0 composto de Fórmula I é completamente complementar
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 287/291
9/11 à sequência pré-mRNA alvo;
Si, S2, .... Sn-1, Sn, Τι, T2, Tn-i, e Tn são radical híbrido;
X é radical híbrido;
Y representa alquilacila substituída ou não substituída, arilacila substituída ou não substituída, ou radical alquiloxicarbonila substituída ou não substituída;
Z representa amino não substituído, ou radical alquilamino substituído ou não substituído;
Bi, B2, .... Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre adenina, timina, guanina, citosina, e nucleobases não naturais;
pelo menos cinco dentre Bi, B2, Bn-i, e Bn são independentemente selecionados dentre nucleobases não naturais representadas por Fórmula II, Fórmula HI, ou Fórmula IV;
R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são radical híbrido;
L1 representa -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, -CH2-O-(CH2)5-, -CH2-O-(CH2)6-, ou -CH2-O(CH2)z- com a extremidade direita é diretamente ligado ao grupo amino básico; e
L2 e Ls são independentemente selecionados dentre (CH2)2-, -(CH2)3~, -(CH2)4-, -(CH2)5~, -(CH2)6-, -(CH2)z~, -(CH2)8-, -(CH2)2~ 0-(0142)2-. -(CH2)3-O-(CH2)2-, e -(CH2)2-O-(CH2)3- com a extremidade direita é diretamente ligado ao grupo amino básico.
8. Método de induzir em células 0 salto de éxon alvo dentro do pré-mRNA alvo do derivado de ácido nucleico de peptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado por uso do referido derivado de ácido nucleico de peptídeo.
9. Método de induzir em um indivíduo 0 salto de éxon alvo dentro do pré-mRNA alvo do derivado de ácido nucleico de peptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado por administração do referido derivado de ácido nucleico de peptídeo.
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 288/291
10/11
10. Método de tratar doenças ou condições envolvendo a expressão do gene alvo do derivado de ácido nucleico de peptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado por administração do referido derivado de ácido nucleico de peptídeo.
11. Método para modular em células a atividade funcional do gene alvo do derivado de ácido nucleico de peptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado por uso do referido derivado de ácido nucleico de peptídeo.
12. Método para modular em um indivíduo a atividade funcional do gene alvo do derivado de ácido nucleico de peptídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado por administração do referido derivado de ácido nucleico de peptídeo.
13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a7, caracterizado pelo fato de que o composto possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com uma sequência de sítio de junção alvo de 14-mer que consiste em 7-mer de íntron e 7-mer de éxon dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não é [(5' > 3‘) UUGCCUGGUAAGGA] dentro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5! -* 3!) UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5’ 3’)
UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano, [(5’ > 3’) AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5S -> 3’) UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, ou [(5' -> 3’) UGUACAGAUUGUCU] dentro do pré-mRNA de tirossinase humano.
14. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o composto possui pelo menos uma sobreposição complementar de 10-mer com um sítio de junção alvo dentro de um pré-mRNA alvo, em que a sequência de sítio de junção alvo não compreende [(5' -> 3‘) UUGCCUGGUAAGGA] den-
Petição 870190053033, de 11/06/2019, pág. 289/291
11/11 tro do pré-mRNA do receptor de andrógeno humano, [(5' > 3')
UUUUUGCGUAAGUA] dentro do pré-mRNA de SCN9A humano, [(5'
3’) UAAGUAGGAUAAGU] dentro do pré-mRNA de HIF-1a humano, [(5! -> 3’) AUCCCAGGGUAACA] dentro do pré-mRNA de SNAP25 humano, [(5' 3') UGUUUAGGUACACU] dentro do pré-mRNA de
SCN9A humano, ou [(5' 3’) UGUACAGAUUGUCU] dentro do prémRNA de tirossinase humano.
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