JP2020504757A - ペプチド核酸誘導体によるエクソンスキッピング - Google Patents

ペプチド核酸誘導体によるエクソンスキッピング Download PDF

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Abstract

プレmRNA内のスプライス部位に配列特異的に緊密に結合する式Iのペプチド核酸誘導体が提供される。優れた細胞膜透過性及びRNAに対する強力なアフィニティーを備える前記ペプチド核酸誘導体は、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとしての、フェムトモル未満の濃度のペプチド核酸で処置された細胞内のエクソンスキッピングを誘導する。前記化合物は、全身投与すると、1μg/kg以下であってもなお対象において治療活性を示し、したがって、廉価の処置費用で疾患又は症状を処置するのに有用である。【選択図】図３７Ａ

Description

本発明は、良好な細胞透過、及び核酸に対する強力なアフィニティーを有するペプチド核酸誘導体により誘導されるエクソンスキッピングに関し、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2016年12月30日に出願された、米国特許仮出願第62/440,929号の利益を主張する。
オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現のアンチセンス阻害、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、遺伝子チップによる診断解析などを含む、多様な生物学的目的のために使用されている。オリゴヌクレオチドは、DNA及びRNAを含む核酸と配列特異的に相互作用するので、細胞内のDNA又はRNAが関与する生物学的過程を、予測可能な形でモジュレートするのに有用である。良好な細胞透過性を有するオリゴヌクレオチドは、細胞内のこのような生物学的過程を、配列により予測可能な形でモジュレートすることが可能である。
薬物標的としてのタンパク質: タンパク質は、多様な細胞機能を媒介する。現在市販されている薬物の大半が、タンパク質(複数可)の機能をモジュレートすることを介して、治療活性を示すことを見出しても、驚くには当たらないであろう。例えば、非ステロイド系抗炎症性薬であるアスピリンは、その抗炎症活性のために、シクロオキシゲナーゼと呼ばれる酵素を阻害する。ロサルタンは、その血圧降下活性のために、アンジオテンシンII受容体と呼ばれる膜貫通受容体に結合する。ロシグリタゾンは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)と呼ばれる細胞内受容体を選択的に活性化させて、その抗糖尿病活性を誘発する。エタネルセプトとは、腫瘍壊死因子α(TNF-α)と呼ばれるサイトカインに結合する融合タンパク質であり、その抗リウマチ活性のために、TNF-αの生物学的活性を中和する。ハーセプチンとは、ある特定の種類の乳がん細胞内で過剰発現したerbB2に選択的に結合することにより、乳がんを処置するモノクローナル抗体である。
プレmRNA: 遺伝情報は、DNA(2-デオキシリボース核酸)上に保有されており、このDNAは、核内で転写されて、プレmRNA(プレメッセンジャーリボ核酸)をもたらす。哺乳動物のプレmRNAは通例、エクソン及びイントロンからなり、エクソンとイントロンとは、互いと相互接続されている。エクソン及びイントロンは、図1Aに例示される通りに、番号付けされる。
プレmRNAからmRNAへのスプライシング: 核内でプレmRNAは、図1Bに概略的に例示される通り、「スプライシング」と総称される、一連の複雑な反応を介するイントロンの欠失及びエクソンのライゲーションの後、mRNAにプロセシングされる[Ann. Rev. Biochem. 72(1)、291〜336 (2003);Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5)、386〜398 (2005);Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2)、108〜121 (2014)]。
スプライシングは、プレmRNAとスプライシングアダプター因子との間で、「スプライスソームE複合体」(すなわち、初期スプライスソーム複合体)を形成することにより開始される。「スプライスソームE複合体」では、U1は、エクソンNとイントロンNとの接合部に結合し、U2AF35は、イントロンNとエクソン(N+1)との接合部に結合する。したがって、エクソン/イントロン又はイントロン/エクソンの接合部は、初期スプライスソーム複合体の形成にとって極めて重要である。「スプライスソームE複合体」は、U2とさらに複合体形成すると、「スプライスソームA複合体」に変化する。次いで、「スプライスソームA複合体」は、一連の複雑な反応を経てイントロンを欠失させるか又はスプライシングして、近傍のエクソンと隣接する。
選択的スプライシング及びスプライス変異体: プレmRNAの全てのエクソンは、スプライシング時において常に保持されて「全長」mRNAを形成するわけではない。ある特定のエクソンは、欠失するか又はスプライシングされて、変異体mRNA、すなわち、「スプライス変異体」を形成する。したがって、プレmRNAは、「選択的にスプライシングされ」て複数のスプライス変異体をもたらしうる。
哺乳動物細胞内の選択的スプライシングは、1981年に、カルシトニンをコードする遺伝子に関して報告された[Nature、290(5801)巻、63〜65 (1981);Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79(6)巻、1717〜1721 (1982)]。遺伝子は、6つのエクソンからなり、カルシトニンmRNAは、第5エクソン及び第6エクソンのスキッピングによりもたらされる。その一方で、第4エクソンのスキッピングは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)をコードするmRNA変異体をもたらす。
選択的スプライシングは、完全に、細胞及び細胞が曝露される条件次第であると考えられる。選択的スプライシングのために、複数のタンパク質が、単一の遺伝子から産生される。選択的スプライシングは、動物が、それらのゲノムサイズに対して、より大きな多様性を有するタンパク質を発生させることを可能とする。ヒトでは、マルチエクソン遺伝子のうちの95%が、選択的にスプライシングされていると推定される[Nature Genetics、40(12)巻、1413〜1415 (2008)]。
スプライス変異体及び生物学的機能: スプライス変異体は、細胞型又は組織に依存する形で、自発的に生じるものとして見出され、全長タンパク質のプロファイルと異なることが多い、生物学的プロファイルを保有するタンパク質をコードする。
アンドロゲン受容体(AR)は、複数のスプライス変異体をもたらす遺伝子のよい例であろう[Int. J. Biol. Sci.、7(6)巻、815〜822 (2011)]。ARプレmRNAは、8つのエクソンに加えた、4つの潜在的な（cryptic）エクソン(下記の図では、潜在的なエクソンを、影を付したものとして提示する)からなる。AR mRNAの、少なくとも7つのスプライス変異体が存在する。
AR mRNA変異体1は、直列に接続された、第1エクソン〜第8エクソンから構成され、図2Aに例示される、全長ARタンパク質をコードする。AR mRNA変異体3の場合、第4エクソン〜第8エクソンは、スプライシングされる(すなわち、欠失する)。結果として、AR mRNA変異体3は、全長タンパク質内に存在する、リガンド結合性ドメイン(LBD)を欠く、切断型ARタンパク質(AR3)をコードする。
全長ARタンパク質は、アンドロゲン、例えば、テストステロン又はジヒドロテストステロン(DHT)と複合体を形成すると、機能的に活性となる。その一方で、切断型AR3タンパク質は、アンドロゲンの非存在下であってもなお、機能的に活性である。アンドロゲンアブレーション療法に対して耐性である前立腺腫瘍では、AR3タンパク質は、上方調節されることが、しばしば見出される。したがって、AR3変異体タンパク質の内因性形成は、前立腺がん細胞が、アンドロゲンアブレーション療法を回避するための、天然の選択過程として理解しうるであろう。
低酸素症誘導因子1α(HIF-1α)とは、低酸素症誘導因子1(HIF-1)と呼ばれる転写因子のサブユニットであり、HIF 1A遺伝子によりコードされる。HIF-1αは、低酸素状態(すなわち、低酸素レベル)に応答して上方調節されるので、細胞の酸素センサーとして考えることができる[Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92巻、5510〜5514 (1995)]。HIF-1αは、VEGF及びEPOを含む、60を超える遺伝子の転写を誘導する。HIF-1αは、VEGFを介して、新血管の形成を促進する[Exp. Mol. Med.、36巻、1〜12 (2004)]。充実性腫瘍は、血液供給の制限のために、低酸素症状態を経、低酸素状態下で存続するように、HIF-1αを上方調節する。
HIF-1αタンパク質は、転写活性化因子としてのその機能活性のための、多様なドメインからなる。HIF-1αタンパク質は、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(bHLH)ドメイン、及び2PASドメインを含有する[PASドメインについては、Curr. Biol.、7(11)巻、R674〜677 (1997);Eur. J. Biochem.、271(6)巻、1198〜1208 (2004)を参照されたい]。HIF-1αは、酸素センサーとして用いられ、HIF-1αタンパク質の安定性に極めて重要であることが周知である、酸素依存性分解(ODD)ドメインを保有する。
図2Bに例示される通り、6つのHIF-1αmRNAスプライス変異体によりコードされる、HIF-1αタンパク質の、少なくとも6つの変異体が存在する[Exp. Mol. Med.、36巻、1〜12 (2004)]。全長HIF-1α(HIF-1αFL)mRNAは、選択的スプライシングに起因する、第1エクソンと第2エクソンとの間の、さらなる3つの塩基(UAG)を除き、野生型HIF-1α(HIF-1αWT)mRNAと同様である。HIF-1α736では、第14エクソンが欠失しているか、又はスキッピングされている。HIF-1α736は、C末端活性化ドメイン(CAD)を欠く。HIF-1αFL及びHIF-1α736のいずれも、低酸素状態時に、VEGFプロモーターを活性化させることが公知である。その一方で、HIF-1α557(HIF-1αZ)及びHIF-1α516は、HIF-1αのドミナントネガティブアイソフォームとして機能する。乳がんでは、HIF-1αFL mRNAのスプライス変異体は、がん進行の病期を反映し、予後不良と関連する[BMC Medicine、8(44)巻、1〜12 (2010)]。
アンドロゲン受容体タンパク質及びHIF-1αタンパク質により例示される通り、スプライス変異体は、所与の哺乳動物遺伝子について、生理学的多様性を発生させるのに、重要な役割を果たす。自然は、スプライス変異体を、自発的に発生させて、ホメオスタシスを維持するほか、生理学的動態にも応答する。
リボソームタンパク質の合成: プレmRNAのイントロンは、酵素的にスプライシングされて、mRNA(メッセンジャーリボ核酸)をもたらし、次いで、mRNAは、細胞質ゾルコンパートメントに移行する。細胞質ゾル内では、リボソームと呼ばれる、翻訳機構の複合体が、mRNAに結合し、mRNAに沿って、コードされる遺伝情報を走査しながら、タンパク質合成を実行する[Biochemistry、41巻、4503〜4510 (2002);Cancer Res.、48巻、2659〜2668 (1988)]。
コドン: リボソームによるタンパク質合成時に、各アミノ酸は、mRNA配列のトライアドによりコードされる。例えば、「AUG」、「UUA」、「CCC」、及び「AGA」は、それぞれ、「メチオニン」、「ロイシン」、「プロリン」、及び「アルギニン」をコードする。このようなトライアドを、「コドン」と呼ぶ。A、G、U、及びCの、4つのmRNA単量体があれば、64(4×4×4=64)の可能なコドンが存在する。ある特定のコドンは、リボソームによるタンパク質合成の「停止」シグナルに対応する。「UGA」、「UAA」、及び「UAG」は、「停止」シグナルのコドンである。リボソームによるタンパク質合成は、リボソーム機構が、mRNAに沿って走査しながら、「停止」コドンを認識する場合に終結する。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO): mRNA又はプレmRNAに、配列特異的に(すなわち、相補的に)結合するオリゴヌクレオチドを、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ASO)と呼ぶ。mRNAに緊密に結合するASOは、リボソームによるタンパク質合成を遮断しうる。同様に、プレmRNAに緊密に結合するASOは、スプライシング過程に干渉し、mRNAのスプライス変異体をもたらしうる。
アンチセンスによるスプライシングの阻害: プレmRNAのスプライシングは、「スプライスソームE複合体」(すなわち、E複合体)が形成された後で始まる。図3に概略的に記載される通り、SRタンパク質(すなわち、セリンアルギニンリッチタンパク質)は、「エクソンスプライシングエンハンサー」(ESE)領域に結合し、「5'側スプライス部位」及び「3'側スプライス部位」のそれぞれへの結合のために、U1及びU2AF35を動員する一助となる[Biochem. Cell Biol.、77(4)巻、277〜291 (1999);Curr. Opin. Cell Biol.、13(3)巻、302〜309 (2001)]。
原理的に、ASOは、E複合体の形成に極めて重要な、プレmRNAの、ある特定の領域への結合により、「スプライスソームE複合体」の形成を立体障害的に阻害しうる。ASOが、「5'側スプライス部位」、「3'側スプライス部位」、又はESE領域に、緊密に結合すれば、E複合体の形成は、阻害又は遮断される。
mRNAは、その配列に従い、タンパク質をコードするので、mRNAのスプライス変異体は、「元の」mRNA又は「全長」mRNAによりコードされるタンパク質とは異なるタンパク質をコードする。したがって、アンチセンスによるスプライシングの阻害は、「元の」mRNA又は「全長」mRNAによりコードされるタンパク質の生物学的特性と異なる生物学的特性を示す、変異体タンパク質(複数可)をコードすることによる、有効な治療選択肢である。
スプライシングのアンチセンス阻害により誘導されるフレームシフト: ヒトHIF-1αmRNA[NCBI mRNAコード:NM_001530]の、「コードDNA配列」(CDS)の一部を、スプライシングのアンチセンス阻害により誘導される「フレームシフト」(すなわち、フレーム外)を例示する例として、図4Aに提示する。CDS(すなわち、黄色のバー)は、コドン及びエクソン(すなわち、緑色の矢印)により表示される。CDS内のT(すなわち、チミン)は、mRNA内又はプレmRNA内のU(すなわち、ウラシル)で置き換えられることに注意されたい。
スプライシングのアンチセンス阻害により、第3エクソンを欠失させる場合、第2エクソンの3'末端を、第4エクソンの5'末端に直接連結する。次いで、第2エクソンと、第4エクソンとの接合部は、図4Bに提示される通り(左図を参照されたい)、「...-GAT-GCT-(G-TTT)-GAA-CTA-...」と読み取られる。全長mRNAの2つの隣り合うコドンの間には、4つのヌクレオチドが存在する。第3エクソンの欠失は、第4エクソンから始まるコドンを、フレームの外に置く。したがって、第3エクソンの欠失は、コドンの「フレームシフト」を誘導する。
スプライシングのアンチセンス阻害により、第3エクソン及び第4エクソンを、同時に欠失させる場合、第2エクソンの3'末端は、第5エクソンの5'末端に隣接する。次いで、第2エクソンと、第5エクソンとの接合部は、図4Bに提示される通り(右図を参照されたい)、「...-GAT-GCT-(G-GC)-CTT-GTC-...」と読み取られる。全長mRNAの2つの隣り合うコドンの間には、3つのヌクレオチドが存在する。第3エクソン及び第4エクソンの二重の欠失は、第5エクソンから始まるコドンをフレーム内に置く、すなわちフレームシフトを伴わない。
フレームシフトは、HIF-1αmRNA内の第3エクソンの欠失の場合についての、図4Cに例示されている通り「元の」コドンと異なるコドンをもたらし、未成熟終止コドン(PTC)を発生させることが多い。フレームシフトを誘導するエクソンスキッピングは、リボソームによるタンパク質合成の、未成熟終止のために、C末端切断型タンパク質断片をもたらすように定められている。このようなタンパク質断片は、「元の」タンパク質又は「全長」タンパク質と異なる生理学的特性を示しうるであろう。こうして、スプライシングのアンチセンス阻害は、疾患標的遺伝子についての、有効な治療選択肢でありうる。
ネステッドRT-PCRによるエクソンスキッピングの検出: ASOにより誘導される、スプライス変異体mRNAは、PCR(ポリメラー連鎖反応)により検出されることが多い。図5Aに例示される通り、ASOが、150bpの長さの第4エクソンのスキッピングを誘導する場合、ASOの標的プレmRNA、すなわち、全長mRNA及び第4エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体から産生される2つの可能なmRNAが存在する。ASOが、第4エクソンのスキッピングを完全に(すなわち、100%)誘導する場合、ASOで処置された細胞は、全長mRNAのPCR産物より150bp小さいPCR産物だけをもたらす。PCR産物バンドが、実際に、mRNAのスプライス変異体に由来したことを確認するために、エクソンスキッピングについてのPCR産物バンドをサンプリングし、シーケンシングにかけた。
PCR法によるエクソンスキッピング収率の推定: 文献では、エクソンスキッピングの収率又は効率は、通例、スプライス変異体mRNAについてのPCR産物のゲルバンド強度を全長mRNAについての強度と比較することにより推定されている。このような推定は、理論的には、全長mRNA及びスプライス変異体mRNAが、細胞内で、並びにPCRによる検出のために採用されるアッセイ手順において、同等の安定性を保有する場合、かつ、この場合に限り、一般に妥当である。しかし、mRNAの安定性が数十億年間にわたる進化の大まかな結果であることを考慮すれば、mRNAのスプライス変異体が全長mRNAと同じ安定性を示す可能性は小さい。
同様に、スプライス変異体mRNA及び全長mRNAの相対エンリッチメントは、PCRプライマー、PCR条件及びPCR検出法に応じて、大きく変動すると仮定することが理にかなっている。近年、モルホリノ又は2'-OMe PTO(ホスホロチオエート)によるジストロフィンASOで処置されたmdxマウスにおける、ジストロフィンmRNAのエクソンスキッピング収率を推定するのに、ディジタルqPCRが適用された。ディジタルqPCRによるエクソンスキッピング収率は、従来の方法、例えば、ネステッドqPCRによる収率と、大幅に異なる[Lab. Investigation、90巻、1396〜1402 (2010)]。ヒトDMD患者に由来する、筋芽細胞内及び線維芽細胞内のエクソンスキッピングについてのディジタルqPCR研究は、ディジタルqPCRが、エクソンスキッピング産物を、高感度の信頼できる形で検出する選択肢であることを示唆する[PLoS One 0162467、September 09 (2016)]。
見かけのエクソンスキッピング収率は、PCRアッセイの方法及び条件に応じて、変動する傾向があることを踏まえ、PCRアッセイによるエクソンスキッピング収率は、タンパク質の発現又は標的遺伝子についての機能的アッセイにより、加えて検証される必要がありうる。
EIciRNAによる、転写のフィードバック上方調節: イントロンのラリアート（lariat）は、プレmRNAのスプライシング時における副産物として形成される。エクソンスキッピングは、スプライス変異体mRNAだけでなく、また、図5Bに例示される通り、エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)ももたらすが、この場合、第3エクソン及び第4エクソンは、スプライシングされて、イントロン、第3エクソン、及び第4エクソンから構成されるラリアートをもたらす。当初形成されたラリアート、すなわち、EIciRNA(1)は、さらなるスプライシングを経てEIciRNA(2)と規定される二次ラリアートをもたらす場合がある。
これらのEIciRNAラリアートは、「第4エクソン」の、5'側スプライス部位の配列を保持し、「U1核内低分子リボ核タンパク質(U1 snRNP)」を動員することが可能である。次いで、U1 snRNPは、RNAポリメラーゼIIを動員し、これは、プレmRNAの転写を上方調節しうる。EIciRNAが、核内の閾値レベルを超えて蓄積されると、プレmRNAの転写が増大しうる。したがって、EIciRNAは、エクソンスキッピングが過度に生じる場合に、転写のフィードバック因子として機能することが多い[Nature Struct. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。
非天然オリゴヌクレオチド: DNAオリゴヌクレオチド又はRNAオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼによる分解を受けやすく、それらの治療的有用性を制限している。現在のところ、多数の非天然(すなわち、自然発生ではない)オリゴヌクレオチドが、開発され、集中的に探索されている[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.、33巻、533〜540 (2006)]。それらの多くが、DNA及びRNAと比較した、代謝的安定性の拡大を示す。図6Aでは、代表的な非天然オリゴヌクレオチドのうちの一部についての化学構造が提示される。これらのオリゴヌクレオチドは、DNA又はRNAと同様に、予測可能な形で、相補的な核酸に結合する。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(PTO): PTOとは、単量体1つ当たり、リン酸骨格の酸素原子のうちの1つを、硫黄原子で置き換えた、DNA類似体である。このように小さな構造的変化が、PTOを、ヌクレアーゼによる分解に対して、比較的耐性とした[Ann. Rev. Biochem.、54巻、367〜402 (1985)]。
PTOとDNAとの骨格の構造的類似性を反映して、これらはいずれも、大半の哺乳動物細胞型において、細胞膜を透過しにくい。しかし、DNAのためのトランスポーターを、夥多に発現させる、一部の細胞型に対しては、DNAとPTOとは、同等に良好な細胞透過性を示す。全身投与されたPTOは、DNAのためのトランスポーターの夥多な発現のために、肝臓及び腎臓に分布しやすいことが公知である[Nucleic Acids Res.、25巻、3290〜3296 (1997)]。
in vitroにおける、PTOの細胞透過性を改善するために、リポフェクションが、一般に採用されている。しかし、リポフェクションは、細胞膜を、物理的に変更し、細胞傷害作用を引き起こすので、長期にわたる治療的使用には、理想的ではないであろう。
過去30年間にわたり、PTO及びPTOの変異体は、がん、免疫障害、代謝疾患などを処置するために、臨床的に評価されてきた[Biochemistry、41巻、4503〜4510 (2002);Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.、33巻、533〜540 (2006)]。このようなアンチセンス薬候補物質の多くは、部分的には、PTOの低度な細胞透過性のために、開発に成功しなかった。低度な細胞透過性を克服するためには、PTOは、治療活性のために、高用量で投与する必要がある。しかし、PTOは、凝固時間の増大、補体の活性化、糸球体腎症、クッパー細胞の活性化、並びに脾腫、リンパ過形成、及び単核細胞浸潤を含む免疫刺激を含む、用量制限毒性を誘発することが公知である[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.、33巻、533〜540 (2006)]。
多くのアンチセンスPTOは、肝臓又は腎臓からの顕著な寄与を伴う疾患に対して、臨床活性を示すことが見出されている。ミポメルセンとは、LDLコレステロールの輸送に関与するタンパク質である、アポB-100の合成を阻害する、PTO類似体である。ミポメルセンは、その肝臓への優先的な分布のために、アテローム性動脈硬化患者の、ある特定の集団において、臨床活性を顕示した[Circulation、118(7)巻、743〜753 (2008)]。ISIS-113715とは、タンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)の合成を阻害するPTO類似体であり、II型糖尿病患者において、治療活性を示すことが見出された[Curr. Opin. Mol. Ther.、6巻、331〜336 (2004)]。
2'-O-アルキルRNA: 2'-O-アルキルRNAとは、リボース環上の2'-ヒドロキシ基を、アルキルオキシ基で置き換えた、RNA類似体である。2'-O-アルキルRNAは、PTO又はDNAより強力なRNAへのアフィニティーを示す。加えて、2'-O-アルキルRNAは、治療を目的とする代謝的安定性の改善を示す。しかし、2'-O-アルキルRNAは低度な膜透過性を示し、これが治療範囲を限定する。
ロックト核酸(LNA): LNAでは、RNAの骨格リボース環は、RNA又はDNAに対する結合アフィニティーを増大させるように、構造的に拘束されている。こうして、LNAは、高アフィニティーのDNA類似体又はRNA類似体として考えることができる[Biochemistry、45巻、7347〜7355 (2006)]。しかしながら、LNAはまた、DNA又はRNAと同様に、低度な細胞透過性も示す。
DNA骨格又はRNA骨格のハイブリッドオリゴヌクレオチド: PTOと、2'-O-アルキルRNAとを、単一のオリゴヌクレオチドに融合させることが多い。2'-O-アルキルRNA部分のために、このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、同じ配列のPTOオリゴヌクレオチドより強力な、RNAへの結合アフィニティーを保有する。同様に、LNAと、PTOとを、単一のオリゴヌクレオチドに融合させることも多く、ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、同じ配列のPTOオリゴヌクレオチドより強力な、RNAへの結合アフィニティーを保有する。しかし、このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドはまた、低度な細胞透過性も示す。
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO): PMOでは、リン酸及び2-デオキシリボースによるDNA骨格モジュールを、それぞれ、ホスホロジアミデート及びモルホリンで置き換える[Appl. Microbiol. Biotechnol.、71巻、575〜586 (2006)]。DNA骨格は、負に帯電しているが、PMO骨格は、帯電していない。したがって、PMOとmRNAとの結合は、骨格間の静電斥力を伴わず、DNAとmRNAとの結合より強力である傾向がある。PMOは、骨格構造が、DNAと顕著に異なるので、PMOは、DNA又はRNAを認識する肝トランスポーターによっては認識されない。しかし、PMOは細胞膜をたやすくは透過しない。
ペプチド核酸(PNA): PNAとは、N-(2-アミノエチル)グリシンの単位骨格を有するポリペプチドであり、Nielsen博士らにより発見された[Science、254巻、1497〜1500 (1991)]。図6Bは、試作品(すなわち、非修飾)PNAの化学構造及び略称法を例示する。
DNA及びRNAと同様に、PNAもまた、相補的な核酸に選択的に結合する[Nature (London)、365巻、566〜568 (1992)]。相補的な核酸への結合において、PNAのN末端はDNA又はRNAの5'末端と同等であり、PNAのC末端はDNA又はRNAの3'末端と同等である。
PMOと同様に、PNA骨格は帯電していない。したがって、PNAとRNAとの結合は、DNAとRNAとの結合より強力である傾向がある。PNAは、化学構造がDNAと顕著に異なるので、PNAは、DNAを認識する肝トランスポーターによっては認識されず、DNA又はPTOの組織内分布プロファイルとは異なる組織内分布プロファイルを示すであろう。しかし、PNAはまた哺乳動物の細胞膜の透過が低度でもある[Adv. Drug Delivery Rev.、55巻、267〜280 (2003)]。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD): DMDとは、新生の男児約3,500人当たり1人に影響を及ぼす筋萎縮性疾患である[Lancet Neurol.、9巻、77〜93 (2010)]。DMD患者は、自らの筋機能を徐々に失い、30歳に達する前に心不全又は呼吸器不全で死ぬ。多くのDMD患者では、ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン(PTC)を有するジストロフィンmRNAをもたらすように突然変異しており、C末端部分を欠く、非機能的な切断型ジストロフィンを発現させる[Human Mol. Genetics、12(8)巻、907〜914 (2003);及びこの中の参考文献]。
DMDを処置する、一般的な手法は、ASOを使用して、ジストロフィンmRNA内にPTCを保有するエクソンをスキッピングし、全長ジストロフィンと称されることが多い、C末端を伴う、スプライス変異体タンパク質をコードすることとなっている。
MDXマウスにおけるジストロフィンmRNAの第23エクソンのスキッピング: mdxマウスとは、ジストロフィンプレmRNAの第23エクソン内にPTCを有する突然変異体であり、ヒトDMDについての動物モデルとして広く採用されている[FEBS J.、280(17)巻、4177〜4186 (2013)]。マウスジストロフィンプレmRNAを、相補的にターゲティングするASOは、第23エクソンのスキッピングを誘導するそれらの能力について評価されている[Artificial DNA: PNA & XNA、2(1)巻、6〜15 (2011)]。この点で、mdxマウスは、オリゴヌクレオチドのクラスを、エクソンスキッピングを誘導するその能力について評価するための良好なモデルシステムとして用いられてきた。
第23エクソンと、第23イントロンとの接合部(すなわち、第23エクソンの5'側スプライス部位)と完全に相補的な、20量体の2'-OMe PTO(2'-O-メチルホスホロチオエート)ASOを、mdxマウスの筋肉に、両親媒性のトランスフェクション剤であるF127と共に製剤化された約10μg/kgで、局所注射し、全長ジストロフィンについての、免疫組織化学(IHC)及びウェスタンブロットによる、注射部位の筋組織内の、全長ジストロフィンの発現を増大させた。IHC及びウェスタンブロットによるこれらの所見は、第23エクソンが、ASOの局所注射によりスキッピングされたことを指し示す。ASOは、第23イントロンの5'末端との、18量体の相補的な重複、及び第23エクソンの3'末端との、2量体の相補的な重複を保有する[Nature Med.、9(8)巻、1009〜1014 (2003)]。
第23エクソンと、第23イントロンとの接合部(すなわち、第23エクソンの5'側スプライス部位)と完全に相補的な、別の20量体の2'-OMe PTO ASOを、第23エクソンのスキッピングを誘導する、その能力について評価した。20量体のASOは、第23エクソンと第23イントロンとの接合部を相補的にターゲティングし、第23イントロンの5'末端との18量体の相補的な重複、及び第23エクソンの3'末端との2量体の相補的な重複を保有する。2又は4μMのASOを伴う、マウス筋芽細胞の、96時間にわたるインキュベーションは、ネステッドRT-PCRにより確認される、第23エクソンのスキッピングを誘導した。第23エクソンのスキッピングはまた、2.9ナノモルのASOの、2回にわたる筋内注射を施されたmdxマウスにおける、RT-PCRによっても同定した。第23エクソンのスキッピングは、50mg/kgの2'-OMe PTO ASOを皮下投与されたmdxマウスの筋組織内で検出された。前述の2'-OMe PTO ASOと同じ配列を保有する、20量体の2'-FPS(2'-フルオロ-ホスホロチオエート)ASOもまた、2'-OMe PTO ASOと同様に、マウス筋芽細胞内の、第23エクソンのスキッピングを誘導した。しかし、2'-FPS ASOは、筋内注射又は皮下注射後のmdxマウスでは、第23エクソンのスキッピングを誘導しなかった[Mol. Ther. Nucl. Acids、4巻、e265 (2015)]。
第23エクソンと第23イントロンとの接合部を相補的にターゲティングする、20量体のペプチド核酸(PNA)を、mdxマウスにおいて、第23エクソンのスキッピングを誘導するその能力について評価した。20量体のPNA ASOは、第23イントロンの5'末端との、18量体の相補的な重複、及び第23エクソンの3'末端との、2量体の相補的な重複を保有する。250nMの、20量体PNAは、ネステッドRT-PCRにより解析される通り、H2K mdx細胞内の、第23エクソンの欠失を誘導した。mdxマウスにおける、5〜20μg(約0.25〜2mg/kg)の筋内注射の後、20量体のPNAは、注射部位の筋組織内で、第23エクソンのスキッピングを誘導した。mdxマウスにおいて、20量体PNAのエクソンスキッピング効率は、前述の2'-OMe PTO ASOのエクソンスキッピング効率より優れていることが結論付けられた。20量体のPNAを、多様な細胞透過性ペプチド(CPP)に共有結合によってコンジュゲートさせて、細胞透過性を改善した。これらのPNA-CPPコンジュゲートと、非修飾PNAとは、細胞内並びに注射部位の筋組織内で、第23エクソンのスキッピングを、同等に誘導した[Mol. Ther.、16(1)巻、38〜45 (2008)]。
第23エクソンと、第23イントロンとの接合部(すなわち、第23エクソンの5'側スプライス部位)と完全に相補的な、25量体のPMO ASOを、mdxマウスにおいて、第23エクソンのスキッピングを誘導する、その能力について評価した。25量体のASOは、第23イントロンとの、18量体の相補的な重複、及び第23エクソンとの、7量体の相補的な重複を保有する。25量体のPMOは、動物1匹当たり2mg(約100mg/kg)の、複数回にわたる静脈内注射時に、mdxマウスにおいて、第23エクソンのスキッピングを誘導した[Nat. Med.、12(2)巻、175〜177 (2006)]。細胞透過性を改善するために、25量体のPMOを多様な細胞透過性ペプチド(CPP) に共有結合によってコンジュゲートさせた。これらのPMO-CPPコンジュゲートは、3mg/kgの、単回静脈内注射時に筋内で第23エクソンのスキッピングを誘導した[Human Mol. Genet.、18(22)巻、4405〜4414 (2009)]。
ヒトDMD患者に由来する筋芽細胞内のジストロフィンmRNAの第46エクソンのスキッピング: 2'-OMe PTO ASOは、ヒトジストロフィンプレmRNA内の第46エクソン内の、エクソンスプライシングエンハンサー(ESE)領域を相補的にターゲティングするように設計し、ジストロフィンmRNA内の第45エクソンを欠くヒトDMD患者に由来する、筋芽細胞内の第46エクソンのスキッピング効率について評価した。リポフェクションにより、細胞に、1μMのASOをトランスフェクトし、第46エクソンのスキッピングを検出する、ネステッドRT-PCRのためのRNA抽出まで、24時間にわたりインキュベートした。被験ASOのうちのいくつかは、第46エクソンのスキッピングを誘導した[Human Mol. Genet.、10(15)巻、1547〜1554 (2001)]。
DMD患者におけるジストロフィンmRNAの第51エクソンのスキッピング: ドリサペルセン(PRO051又はGSK24022968)とは、ヒトジストロフィンプレmRNA内の第51エクソン内のESE領域を相補的にターゲティングするように設計された20量体の2'-OMe PTOであり、これをヒトDMD患者における治療活性について評価した。ネステッドPCRによる、筋組織の生検評価時に、ドリサペルセンは、毎週2〜6mg/kgを皮下から施されるDMD患者において、第51エクソンのスキッピングを誘導したが、エクソンスキッピングの有効性は高くなかった[N. Engl. J. Med.、364巻、1513〜1522 (2011)]。
エテプリルセン(AVI-4658)とは、ヒトジストロフィンプレmRNA内の第51エクソン内のESEを相補的にターゲティングするように設計された30量体のPMOであり、これを、DMD患者におけるその治療活性について評価した。全長ジストロフィンについてのIHC(免疫組織化学)による筋組織の生検評価時に、エテプリルセンは、毎週2〜20mg/kgを静脈内注入により施されるDMD患者において第51エクソンのスキッピングを誘導した[Lancet、378(9791)巻、595〜605 (2011)]。
HepG2細胞内のAPOB mRNAの第27エクソンのスキッピング: アポリポタンパク質B(APOB)は、リポタンパク質粒子の、不可欠な部分を構成する。APOB mRNAは、29のエクソンからなる。2'-OMe RNA APOB ASOは、第27エクソンの3'側スプライス部位、第27エクソンの5'側スプライス部位、又は3'側スプライス部位及び5'側スプライス部位の両方をターゲティングするように設計した。3'側スプライス部位ASO(3'-SS ASO)は、第26イントロンとの15量体の重複及び第27エクソンとの5量体の重複を有する[2007年1月17日に刊行された、BMC Mol. Biol. 2007、8:3]。5'側スプライス部位ASO(5'-SS ASO)は、第27エクソンとの5量体の重複及び第27イントロンとの15量体の重複を保有する。40量体の2'-OMe RNA ASOは、3'-SS ASOを、5'-SS ASOに共有結合によって融合させることにより設計した。したがって、40量体のASOは、3'側スプライス部位並びに5'側スプライス部位と同時に相互作用することが可能である。
ASOをリポフェクションにより、HepG2細胞内の第27エクソンのスキッピングを誘導する、それらの能力について評価した。興味深いことに、3'-SS ASO及び5'-SS ASOのいずれも、25〜250nMで、HepG2細胞内の第27エクソンのスキッピングを誘導しなかったことが注目される。その一方で、40量体のASOは、25〜250nMで顕著なレベルの第27エクソンのスキッピングを用量依存的に示した。2'-OME RNAのスプライス部位のイントロン部分単独との、15量体の相補的な重複では、初期スプライスソーム複合体の形成を有効に阻害するのに十分ではない可能性が高い。HepG2細胞内の初期スプライスソーム複合体の形成を有効に阻害することにより、エクソンスキッピングを誘導するには、APOBプレmRNAの第27エクソンにわたるスプライス部位への緊密な結合が所望されるであろう。
Bcl-xプレmRNAの選択的スプライシング: BCL2L1(Bcl-x)とは、選択的スプライシングにより、Bcl-xL又はBcl-xSをコードするヒト遺伝子である。18量体の2'-OMe PTO ASOは、第2エクソンの5'側スプライス部位をターゲティングするように設計され、第2エクソンとの16量体の相補的な重複、及び第2イントロンとの2量体の重複を保有する。80〜400nMのリポフェクションにより、ASOは、MCF7、PC3、Du 145、HeLa及びMDA MB231を含む、がん細胞のパネルにおいて、選択的スプライシングを介して、細胞内のBcl-xSの産生を促進した[J. Biol. Chem.、277(51)巻、49374〜49382 (2002)]。
in vitroにおけるβ-グロビンプレmRNA内の無細胞のスプライシング補正: サラセミアとは、ヘモグロビンの異常な形成により引き起こされる、遺伝性の血液障害である。地中海性サラセミア患者において見出されるIVS2705の希少な突然変異は、ヒトβ-グロビン遺伝子の第2イントロン内の705位のヌクレオチドにおいて点突然変異[T→G]を有する。IVS2705突然変異は、さらなる5'側スプライス部位を創出し、イントロンの579位において潜在的な3'側スプライス部位を活性化させる。IVS2705突然変異は、第2エクソンと第3エクソンとの間に127のヌクレオチド、すなわちイントロンのヌクレオチド579〜705を挿入する選択的スプライシングを誘導する[J. Biol. Chem.、260巻、16332〜16337 (1985)]。
IVS2705突然変異体の潜在的な5'側スプライス部位と完全に相補的な、17量体の2'-OMe RNA ASOを、in vitroの無細胞スプライシングシステムにおいて、異常なスプライシングを補正するその能力について評価した。ASOは、イントロンとの8量体の重複及び潜在的なエクソンとの9量体の重複を保有する。ASOは、0.12〜2μMで、異常なスプライシングを有効に補正して、第2イントロンに由来する潜在的なエクソンを伴わないmRNAをもたらした[Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、8673〜8677 (1993)]。in vitroスプライシングシステムは無細胞システムであり、したがって、エクソンスキッピングを誘導する送達剤を必要としない。ASOは、無細胞スプライシングシステムにおいて、120nMでエクソンスキッピングを誘導した。ASOが5'側スプライス部位に対する強力なアフィニティーを保有した場合は、エクソンスキッピング活性はより強力となるであろう。エクソンスキッピング効力を改善するために、5'側スプライス部位に対して強力なアフィニティーを保有するASOを使用することが所望される。
2'-OMe RNAによるHeLa pLuc/705細胞内のルシフェラーゼプレmRNAのスプライシング補正: pLuc/705とは、ヒトβ-グロビンのIVS2705突然変異体の第2イントロンを、ヌクレオチド1368と、ヌクレオチド1369との間に挿入しているように修飾された、ルシフェラーゼ遺伝子である。HeLa pLuc/705細胞は、修飾pLuc/705ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現させる。改変HeLa細胞は、ヌクレオチド1368とヌクレオチド1369との間に潜在的なエクソンを伴うルシフェラーゼmRNAを発現させ、したがって、非機能的なルシフェラーゼ変異体タンパク質をコードする
IVS2705突然変異体(イントロンとの8量体の重複、及び潜在的なエクソンとの9量体の重複を保有する)の潜在的な5'側スプライス部位を相補的にターゲティングする、17量体の2'-OMe RNAオリゴヌクレオチドを、HeLa pLuc/705細胞内の修飾ルシフェラーゼプレmRNAの異常なスプライシングを補正するその能力について評価した。20〜500nMのリポフェクションで、17量体のASOは、細胞のルシフェラーゼ活性を用量依存的に回復した。潜在的なエクソンは、ASOを伴う処置により、スプライシングされることが、RT-PCR解析により見出された。エクソンスキッピング活性は、20nM以上の濃度で観察された[Biochemistry、37巻、6235〜6239 (1998)]。
PNAによるHeLa pLuc/705細胞内のルシフェラーゼプレmRNAのスプライシング補正: IVS2705突然変異体(イントロンとの8量体の重複及び潜在的なエクソンとの9量体の重複を保有する)の潜在的な5'側スプライス部位を相補的にターゲティングする、17量体のPNA誘導体を、HeLa pLuc/705細胞内の、修飾ルシフェラーゼプレmRNAの異常なスプライシングを補正するその能力について評価した。これらのPNA誘導体は、数が変動するホスホネート基をPNA配列のN末端に共有結合によってコンジュゲートさせるように設計した[Nucl. Acids Res.、30(13)巻、4424〜4432 (2008)]。ホスホネート部分のPNAとの共有結合コンジュゲーションを導入して、リポフェクションによる細胞へのトランスフェクションを容易とした。
2.5〜60nMのリポフェクションで、PNA ASOは、細胞のルシフェラーゼ活性を用量依存的に回復した。潜在的なエクソンは、ASOを伴う処置により、スプライシングされることが、RT-PCRにより見出された。それに、より多くのホスホネート基を接合させたPNA ASOは、潜在的なエクソンのスプライシングにおいて、より大きな効力及び有効性を示した。12のホスホネート基を伴うPNA ASOは、2.5nMで81%のエクソンスキッピングの有効性を示した。
PNA ASOによるエクソンスキッピングについて観察された、ナノモル未満の効力は、17量体の2'-OMe RNA ASOの効力より、はるかに強力である[Biochemistry、37巻、6235〜6239 (1998)]。PNAは、細胞への送達のために、適正に修飾されれば、エクソンスキッピングを強力に誘導するのに、極めて有用であろう。
2'-OMe PTOによるFOLH 1プレmRNAのエクソンスキッピング: 前立腺特異的膜抗原(PSMA)とは、葉酸ヒドロラーゼ(FOLH1)遺伝子の産物であり、悪性前立腺組織内で、高度に発現する。FOLH 1プレmRNAをターゲティングする2'-OMe PTO ASOをリポフェクションによるトランスフェクション後において、LNCap前立腺がん細胞内のエクソンスキッピングを誘導する、それらの能力について評価した[Oligonucleotides、16巻、186〜175 (2006)]。
SSO1とは、第1エクソン5'側スプライス部位をターゲティングする18量体のASOであり、第1エクソンとの16量体の相補的な重複、及び第1イントロンとの2量体の重複を保有する。SSO6及びSSO18とは、それぞれ第6エクソン及び第18エクソンを相補的にターゲティングする、18量体のASOである。
SSO1は、選択的スプライシングを、約400nMのIC50で誘導した。SSO6は、第6エクソンのスキッピングを約4nMのIC50で誘導した。SSO18は、第18エクソンのスキッピングを約4nMのIC50で誘導した。
興味深いことに、エクソン内領域(すなわち、エクソンスプライシングのエンハンサー部位)をターゲティングするSSO6及びSSO18は、エクソンスキッピングを、5'側スプライス部位をターゲティングするSSO1より、はるかに強力に誘導したことが注目される。2'-OMe PTO ASOによる、ESE領域のターゲティングは、この具体例におけるスプライス部位のターゲティングより有効であることが見出された。
2'-O-MOE RNAによるIL-5RαプレmRNAの選択的スプライシング: マウスIL-5RαプレmRNAを相補的にターゲティングする、2'-O-MOE RNA(2'-O-メトキシエチルRNA)ASOを、電気穿孔によるトランスフェクション後において、BCL1細胞内の選択的スプライシング(すなわち、エクソンスキッピング)を誘導する、それらの能力について評価した[Mol. Pharmacol.、58巻、380〜387 (2000)]。
ASOは、第9エクソン、及び第9エクソンを挟むスプライス部位の多様な領域を、相補的に走査することにより設計した。第8イントロンとの4量体の重複を伴う第9エクソンの3'側スプライス部位(3' SS)と完全に相補的な20量体のASOは、選択的スプライシングを10μMで顕著に誘導した。第9エクソンのエクソン内領域をターゲティングするASOは、選択的スプライシングを10μMで3' SS ASOと同等な有効性により誘導した。全ての被験ASOが、選択的スプライシングを誘導したことから、第9エクソン及びそのスプライス部位は、エクソンスキッピングを、高度に受けやすいことが示される。3'側スプライス部位は、5'側スプライス部位より感受性が大きい。
20量体のASOはまた、イントロンとの4量体の重複を伴う、第8エクソンを挟むスプライス部位を、相補的にターゲティングするようにも設計された。ASOは、第8エクソンのスキッピングを、10μMで誘導したが、3' SS ASOは、5' SS ASOより有効であった。
電気穿孔による、2'-O-MOE RNA ASOの、マイクロモル単位のエクソンスキッピング効力は、リポフェクションによる、FOLH 1プレmRNAをターゲティングする、2'-OMe PTO ASOのナノモル単位のエクソンスキッピング効力と比較して、極めて低度であると考えられる[Oligonucleotides、16巻、186-175 (2006)]。リポフェクションは、負に帯電した骨格を伴うオリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションのための電気穿孔より有効であろう。
2'-O-MOE PTOによるタウプレmRNAの第10エクソンのスキッピング: タウプレmRNA内の第10エクソンの5'側スプライス部位は、ステムループの形成に適する、18量体の配列を保有し、スプライスソームE複合体の形成には適さないであろう。したがって、タウプレmRNAの第10エクソンはスキッピングを受けやすい。
タウ第10エクソンの、3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位をターゲティングする、2'-O-MOE PTO ASOを、第10エクソンのスキッピングを増強するそれらの能力について評価した[J. Biol. Chem.、276(46)巻、42986〜42993 (2001)]。E10αとは、3'側スプライス部位を相補的にターゲティングする18量体のASOである。E10αは、第9イントロンとの10量体の重複及び第10エクソンとの8量体の重複を保有する。E10βとは、5'側スプライス部位を相補的にターゲティングする21量体のASOである。E10βは、第10エクソンとの8量体の重複及び第10イントロンとの13量体の重複を保有する。
リポフェクションによる、COS-1細胞へのトランスフェクションの後、E10α及びE10βは、2〜5nMのIC50で第10エクソンのスキッピングを誘導した。電気穿孔によりトランスフェクトされたPC12細胞内で、ASOは、マイクロモル単位のIC50で第10エクソンのスキッピングを誘導した。
2'-O-MOE RNA ASOによるMyD88プレmRNAの第2エクソンのスキッピング: MyD88とは、IL-1R及びTLRによるNF-kBの誘導的活性化に関与するアダプタータンパク質である。20量体の2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)RNA ASOは、ヒトMyD88プレmRNA内の第2エクソンの3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位を相補的にターゲティングするように設計した。20量体のASOは、第1イントロンの5'末端(すなわち、第2エクソン3'側スプライス部位)又は第2イントロンの3'末端(すなわち、第2エクソン5'側スプライス部位)との、0、5、10、15又は20量体の重複を有するように設計した。ASOを、リポフェクションによるトランスフェクション後において、A549細胞内の第2エクソンのスキッピングを誘導するそれらの能力について評価した[J. Immunol.、176巻、3652〜3661 (2006)]。
ASOのうちで、第2エクソンの3'側スプライス部位内に第1イントロンとの20量体重複を保有するASOは、第2エクソンのスキッピングを最も強力かつ効果的に誘導した。第2エクソンのスキッピングについて観察されたIC50は、50〜100nMの間であった。5'側スプライス部位をターゲティングするASOは、3'側スプライス部位をターゲティングするASOほど有効ではなかった。5'側スプライス部位をターゲティングするASOのうちで最も強力なASOは、第2エクソンの3'末端と20量体の重複を保有するASOであった。
マウスMyD88プレmRNA内の第2エクソンの3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位を相補的にターゲティングするように同様に設計された、2'-O-MOE RNA ASOのうちで、第2エクソンの5'末端と20量体の重複を保有するASOは、リポフェクションによりトランスフェクトされた264.7生細胞内の第2エクソンのスキッピングを最も強力に誘導した。
マウス細胞内で最も強力なASOは、50mg/kgで毎週2回、2週間にわたり投与した。腸、脂肪組織、及び肝臓では、MyD88 mRNAの60〜85%の有意な低下が見られた。50mg/kgは、リン酸リボース骨格を伴うオリゴヌクレオチド治療剤に典型的な有害作用を引き起こしうる、大用量である。2'-O-MOE RNA ASOが典型的な有害作用を惹起せずに治療活性を示すには、エクソンスキッピング効力を顕著に改善することが強く必要とされる。
ヌシネルセンによるSMN2内の第7エクソンの回復: 脊髄性筋委縮症(SMA)とは、SMN 1(survival of motor neuron 1)遺伝子の欠失又は機能喪失により引き起こされる、希少な致死性疾患である。ヒトは、11のヌクレオチドを除き、同一なコード配列を有するパラロガスのSMN2遺伝子を有する。SMN2の第7エクソン内のCからTへのSNP(一塩基多型)は、第7エクソンのスキッピングを誘導し、結果として得られるスプライス変異体mRNAは、急速に代謝される、SMN2変異体タンパク質をコードする。したがって、SMN2突然変異体は、SMN1タンパク質の機能的欠点を補完することが不可能であり、これがSMAの発生をもたらす[Neurology、86巻、890〜897 (2016)]。
ヌシネルセン(Spiranza(商標))とは、SMN2の第7イントロン内のスプライシングサイレンサー領域を相補的にターゲティングする、18量体の2'-O-MOE RNA ASOである。ヌシネルセンは、スプライシングサイレンシングタンパク質の結合を立体障害的に遮断するので、第7エクソンは、保持されるか又は回復して、全長SMN2タンパク質をもたらす。ヌシネルセンは、SMN2の第7イントロン内に位置するスプライシングサイレンサー領域への結合により、通常のスプライシング過程を回復させる。
ヌシネルセンは、SMAを処置するために、米国FDAにより2016年に承認された。ヌシネルセンは、1クォーター又は2クォーター当たり12mgで髄腔内投与される。ヌシネルセンは、脊髄内、脳脊髄液(CSF)中に135〜177日間の半減期で滞留する[Nusinersen US Label、FDA、2016年12月]。
エクソンスキッピングオリゴヌクレオチド治療剤の治療効力: 本文献の前出で引用した例示的な場合における通り、リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングを、リポフェクションによりトランスフェクトされた細胞内では、ナノモル単位の効力で誘導するが、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして処置された細胞内では、マイクロモル単位の効力で誘導する。
MyD88プレmRNAのマイクロモル単位のエクソンスキッピング効力は、マウスにおける「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとしての全身投与時に、10mg/kg以上の治療用量に換算された[J. Immunol.、176巻、3652〜3661 (2006)]。このような高治療用量では、リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチドは、免疫学的有害事象を生じやすくなる。したがって、治療用量を、顕著に改善する方法又は製剤を開発することが、極めて強く所望されるであろう。
ヒトジストロフィンプレmRNA内の第51エクソンのスキッピングを誘導するように設計された、20量体の2'-OMe PTOである、ドリサペルセンは、毎週2〜6mg/kgのASOを、ネイキッドオリゴヌクレオチドとして、皮下から施されるDMD患者において、第51エクソンのスキッピングを誘導したが、エクソンスキッピングの有効性は、大きくなかった[N. Engl. J. Med.、364巻、1513〜1522 (2011)]。用量制限毒性に起因して、ドリサペルセンの治療用量の増大は懸念された。
PNA及びPMOは、中性の骨格を有し、免疫系(とりわけ、toll様受容体)により認識されず、リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチドに関して一般に観察される、免疫応答を惹起しないであろう。
ヒトジストロフィンプレmRNA内の第51エクソンのスキッピングを誘導するように開発された、30量体のPMOであるエテプリルセン(AVI-4658)は、毎週2〜20mg/kgの静脈内注入により、ASOを施されるDMD患者において、忍容が良好であった[Lancet、378(9791)巻、595〜605 (2011)]。近年、エテプリルセンは、DMD患者における使用のための、米国FDAからの加速的な承認を受けた。
ヌシネルセンは、エクソンスキッピングではなく、エクソン回復能を有するASOであるが、承認された治療用量である、1クォーター当たり12mgは、極めて魅力的である。髄腔内注射後における、ニューロンへの効率的な取込みは、ヌシネルセンの効力の、大きな一因であると考えられる。
リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチド治療剤の臨床開発は、toll様受容体の活性化、又は補体の活性化、肝臓若しくは腎臓における組織特異的毒性を介する、免疫学的毒性を含む、用量制限毒性により妨げられていることが極めて重要である。in vivoにおける治療効力を改善することにより、このような用量制限毒性を、克服しうるであろう。
オリゴヌクレオチドは、製造するのが、極めて高価である。毎週100mg〜2gの、ヒトにおける治療用量の現在のレベルは、APIの製造費用を、低廉に、1グラム当たり1,000 USDと仮定すると、毎週100〜2,000 USD(米国ドル)のAPI費用に換算される。実際には、オリゴヌクレオチド治療剤の、APIの製造費用は、優に、1グラム当たり1,000 USDを超える。したがって、慢性使用用に、処置費用が廉価のオリゴヌクレオチド治療剤を提供するために、治療効力を、顕著に改善するように、医療関係者から、強い要望がなされている。
オリゴヌクレオチドの良好な細胞透過性: 細胞膜は、数十億年にわたり進化した、脂質二重層の障壁である。細胞膜は、実際、4〜10KDaのサイズの、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、大きな障壁として機能する。細胞膜の直接的透過による、このようなASOの、細胞への送達は、実際上、不可能である。一本鎖オリゴヌクレオチドの、細胞への取込みには、他の経路が存在する。少数を挙げれば、ApoB100をターゲティングするミポメルセンに関して見られる、肝細胞におけるトランスポーター媒介性のエンドサイトーシス、ヌシネルセンに関して観察される、神経細胞への取込み(エンドサイトーシスである可能性が高い)、GalNac(N-アセチルガラクトサミン)媒介性の細胞への取込みなどである。しかし、このような細胞への取込み経路は、組織に高度に依存し、大半の組織型には、一般に、適用が難しい[Nature Biotechnol.、35(3)巻、222〜229 (2017)]。
良好な細胞透過性を有するように、リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチドを、適正に製剤化することが可能であり、このような製剤化されたオリゴヌクレオチドであれば、「ネイキッド」(すなわち、製剤化を伴わない)オリゴヌクレオチドより良好な、in vivoにおける治療効力を示すことが予測されるであろう。リン酸骨格を伴うオリゴヌクレオチドが、リポフェクションによりトランスフェクトされれば、細胞内で、少なくとも、ナノモル単位のエクソンスキッピング効力を示していることを踏まえると、良好な細胞透過性を有するように製剤化されたオリゴヌクレオチドについての、in vivoにおける治療効力も、in vitroにおける、ナノモル単位のエクソンスキッピング効力が指示する通りに、顕著に改善されるであろう。したがって、良好な細胞透過性は、エクソンスキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドのin vivoにおける治療効力にとって、極めて重要であろう。しかしながら、組織への良好な送達を誘発する製剤の開発は、オリゴヌクレオチド治療剤の分野で、大きな技術的難題であり続けている。
良好な細胞透過性及び高アフィニティーのためのPNAの修飾核酸塩基: 前出で引用した通り、PNA誘導体は、リポフェクションによる細胞への送達を容易とするように共有結合によってコンジュゲートさせた種々の数のホスホネート基を有するように設計した。このようなPNA ASOは、リポフェクション時に、HeLa細胞内で、ナノモル未満のエクソンスキッピング効力を示すことが見出された[Nucl. Acids Res.、30(13)巻、4424〜4432 (2008)]。ナノモル未満の効力は、リン酸骨格を伴うASOに関して観察された、エクソンスキッピング効力より、大幅に強力である。したがって、PNAは、細胞に、適正に送達されれば、エクソンスキッピングを強力に誘導するのに有用であろう。
PNAは、これに共有結合によって接合させた、カチオン性脂質又はその同等物で修飾された核酸塩基を導入することにより、哺乳動物の細胞膜に対して、高度に透過性とされた。このような修飾核酸塩基の化学構造を、図6Cに例示する。シトシン、アデニン、及びグアニンの、このような修飾核酸塩基は、それぞれ、グアニン、チミン、及びシトシンと、予測可能な形でハイブリダイズすることが見出された[PCT出願第PCT/KR2009/001256号;EP2268607;US8680253]。
このような修飾核酸塩基のPNAへの組込みは、リポフェクション状況をシミュレートする。リポフェクションにより、オリゴヌクレオチド分子は、カチオン性脂質分子、例えば、リポフェクタミンにより、梱包又は複合体化され、このようなリポフェクタミン/オリゴヌクレオチド複合体は、ネイキッドオリゴヌクレオチド分子と比較して、容易に細胞膜を透過する傾向がある。
良好な膜透過性に加えて、これらのPNA誘導体は、相補的な核酸に対する、極度に強力なアフィニティーを有することが見出された。例えば、4つ〜5つの修飾核酸塩基の、11〜13量体のPNA誘導体への組込みは、相補的DNAとの二重鎖形成において、20℃以上のTm増加をたやすくもたらした。
このようなPNA誘導体は、単一の塩基ミスマッチに対して、高感度であることが見出された。単一塩基のミスマッチは、修飾された塩基の種類並びにPNA配列に応じて、11〜22℃のTm低下を結果としてもたらした。
このような修飾核酸塩基を伴い、良好な膜透過性、及び核酸に対する超高アフィニティーを備える、PNA誘導体であれば、エクソンスキッピングを強力に誘導するのに有用であろう。
PCT出願第PCT/KR2009/001256号 EP2268607 US8680253
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発明の概要
本発明は、式I:
[式中、
nは、10〜25の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、独立に、重水素[D]基、ヒドリド[H]基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、ホルミル[H-C(=O)-]基、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]基、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、又は置換若しくは非置換のアリールホスホニル基を表し、
Zは、ヒドリド基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換のアルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、非置換アミノ[-NH2]基、置換若しくは非置換のアルキルアミノ基、置換若しくは非置換のアリールアミノ基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、核酸塩基部分に共有結合によって連結された、置換若しくは非置換のアミノ基を有する非天然の核酸塩基から選択される]
により表されるペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
一部の実施形態では、式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、ここで、標的スプライス部位配列は、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれでもない。
一部の実施形態では、式Iの化合物は、標的プレmRNA内の、標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、ここで、標的スプライス部位配列は、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれをも含まない。
式Iの化合物は、標的プレmRNA標的エクソンのスキッピングを強力に誘導し、標的エクソンを欠くmRNAスプライス変異体(複数可)をもたらし、したがって、標的プレmRNAを転写する遺伝子の機能活性をモジュレートするのに有用である。
プレmRNA内のイントロン及びエクソンのための番号付けについての例示である。 スプライシング過程についての、簡単な概略的例示である。 変異体ARタンパク質をコードする、AR mRNAスプライス変異体を示す図である。 変異体HIF-1αタンパク質をコードする、HIF-1αmRNAスプライス変異体を示す図である。 スプライスソーム初期複合体の形成に関与する生物学的過程についての概略的例示である。 ヒトHIF-1αmRNAから読み取られたCDSの一部を示す図である。 第3エクソン(左)及び第3〜4エクソン(右)を欠くHIF-1αスプライス変異体であって、それぞれ、フレームシフト(フレーム外)及びフレーム内を例示するスプライス変異体の、エクソン間接合部配列を示す図である。 PTCをもたらす、例示的なフレームシフトを示す図である。 エクソンスキッピングを検出するネステッドRT-PCRについての概略的例示である。 エクソンスキッピング時における、EIciRNAの形成についての概略的例示である。 代表的な非天然オリゴヌクレオチドの化学構造を示す図である。 試作品PNAの化学構造及び略称法を示す図である。 PNAの膜透過性を改善するように開発された、修飾核酸塩基を示す図である。 式Iのペプチド核酸誘導体に選択可能な、天然又は非天然の(修飾)核酸塩基の例を示す図である。 式Iのペプチド核酸誘導体に選択可能な、天然又は非天然の(修飾)核酸塩基の例を示す図である。 式Iのペプチド核酸誘導体に選択可能な、天然又は非天然の(修飾)核酸塩基の例を示す図である。 式Iの化合物に選択可能な、置換若しくは非置換のアルキル基についての例を示す図である。 式Iの化合物に選択可能な、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、及び置換若しくは非置換のアリールアシル基についての例を示す図である。 式Iの化合物に選択可能な、置換アルキルアミノ基、置換アリールアミノ基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、及び置換若しくは非置換のアリールホスホニル基についての例を示す図である。 式Iの化合物に選択可能な、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、及び置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基についての例を示す図である。 式Iの化合物に選択可能な、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、及び置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基についての例を示す図である。 天然又は修飾の核酸塩基を伴う、PNA単量体の化学構造を示す図である。 N末端又はC末端における置換基の略号の化学構造を示す図である。 (N→C)Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2の、14量体のPNA誘導体の化学構造を示す図である。 (N→C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2の、15量体のPNA誘導体の化学構造を示す図である。 本発明のPNA誘導体を合成するのに使用される、Fmoc-PNA単量体の化学構造を示す図である。 固相ペプチド合成において採用される、典型的な単量体伸長サイクルを示す図である。 精製の前における、「HIF-ASO 1」についての、C18逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。 HPLCによる精製の後における「HIF-ASO 1」についての、C18逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。 C18-RP 分取HPLCにより精製された、「HIF-ASO 1」についての、ESI-TOFによる質量スペクトルを示す図である。 HeLa細胞内で、「HIF-ASO 2」により誘導されるエクソンスキッピングを検出する、HIF-1αについてのネステッドPCRにおいて援用されるエクソン特異的プライマーの標的位置を示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αのネステッドPCR産物についての電気泳動データを示す図である。 HIF-1α第2エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0zM(陰性対照)、10zM、100zM、1aM、又は10aMの「HIF-ASO 2」で、24時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0zM(陰性対照)、10zM、100zM、1aM、又は10aMの「HIF-ASO 2」で、24時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、β-アクチンに対して正規化された、HIF-1αタンパク質の相対発現レベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内の、SYBR Greenによる、HIF-1αについてのネステッドqPCRを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内の、TaqManプローブによる、HIF-1αについてのネステッドqPCRを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 6」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αのネステッドPCR産物についての電気泳動データを示す図である。 0zM(陰性対照)、10zM、100zM、又は1aMの「HIF-ASO 6」で、24時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0zM(陰性対照)、10zM、100zM、又は1aMの「HIF-ASO 6」で、24時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、β-アクチンに対して正規化された、HIF-1αの発現レベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 6」で処置されたHeLa細胞内の、SYBR GreenによるネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 6」で処置されたHeLa細胞内の、TaqManプローブによるネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、1、3、10、30、又は100aMの「HIF-ASO 1」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αのネステッドPCR産物についての電気泳動データ(左)、及び第2〜3エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物についてのサンガーシーケンシングデータ(右)を示す図である。 0zM(陰性対照)、100zM、300zM、1aM、3aM、10aM、30aM、100aM、又は300aMの「HIF-ASO 1」で、72時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0zM(陰性対照)、100zM、300zM、1aM、3aM、10aM、30aM、100aM、又は300aMの「HIF-ASO 1」で、72時間にわたり処置されたHeLa細胞内の、β-アクチンに対して正規化された、HIF-1αの発現レベルを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 12」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのネステッドPCRデータ(左)を、エクソンスキッピングバンドについてのサンガーシーケンシングデータ(右)と共に示す図である。 0(陰性対照)、0.01、0.1、1、又は10aMの「HIF-ASO 12」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 12」で処置されたHeLa細胞内で得られた、HIF-1αについてのネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、3、30、300、又は3,000aMの「AR-ASO 1」で、3時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARのネステッドPCR産物についての電気泳動解析を示す図である。 第4〜5エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0zM(陰性対照、すなわち、N/C)、10zM、30zM、100zM、300zM、1aM、3aM、10aM又は30aMの「AR-ASO 1」で、48時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0(陰性対照)、1、10、100、又は1,000zMの「AR-ASO 1」で、5時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARの第4〜6エクソンレベルについての、SYBR GreenによるqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、1、10、100、又は1,000zMの「AR-ASO 5」で、5時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARの第4〜6エクソンレベルについての、SYBR GreenによるqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、1、10、100、又は1,000zMの「AR-ASO 5」で、24時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARのmRNAについての、TaqManアッセイによるqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 注射部位の皮膚により得られた、生のウェスタンブロットデータを示す図である。NC、1p、10p、100p、及び1,000pは、それぞれ、陰性対照群1kg当たり1、10、100、及び1,000ピコモルのASOによる処置群を指す。 非注射部位の皮膚により得られた、生のウェスタンブロットデータを示す図である。NC、1p、10p、100p、及び1,000pは、それぞれ、陰性対照群1kg当たり1、10、100、及び1,000ピコモルのASOによる処置群を指す。 注射部位(左)及び非注射部位(右)における、群ごと、並びに対象ごとの、ARタンパク質発現レベルを示す図である(**は、p<0.01に対応し、*は、p<0.05に対応する)。 注射部位(左)及び非注射部位(右)における、群ごとの、ARタンパク質の平均発現レベルを示す図である(**は、p<0.01に対応し、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)、30、100、又は1,000aMの「AR-ASO 1」で、3時間にわたり処置されたMCF7細胞内の、ARのネステッドPCR産物についての電気泳動解析を示す図である。 第5エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」で、24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、SCN9AのネステッドPCR産物についての電気泳動解析を示す図である。 第4エクソン(上)及び第4〜5エクソン(下)のスキッピングに、それぞれ、割り当てられる、ネステッドPCR産物についてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」で、24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、SCN9AについてのネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 3」で、24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、SCN9AについてのネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、又は100zMの「SCN-ASO 8」で、24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、SCN9AについてのネステッドqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」で、30時間にわたり処置されたPC3細胞内の、CoroNaアッセイ結果を示す図である。 0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 3」で、30時間にわたり処置されたPC3細胞内の、CoroNaアッセイ結果を示す図である。 0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 8」で、30時間にわたり処置されたPC3細胞内の、CoroNaアッセイ結果を示す図である。 0(陰性対照)、10、又は100zMの「ASO 27」で、24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、SCN9AのネステッドRT-PCR産物についての電気泳動データを示す図である。 第4〜5エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)、1、10、100、又は1,000aMの「ASO 27」で処置されたPC3細胞内の、SCN9AのネステッドRT-PCR産物についての電気泳動データを示す図である。 「SCN-ASO 27」で、0(陰性対照)、0.1、1、又は10aMにわたり24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、ワンステップcDNA合成による、SCN9AについてのqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 「SCN-ASO 27」で、0(陰性対照)、0.1、1、又は10aMにわたり24時間にわたり処置されたPC3細胞内の、ランダムヘキサマーを伴うcDNA合成による、SCN9AについてのqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 27」で処置されたラットL5 DRG細胞(L5/L6結紮により刺激された)内の、細胞蛍光強度についての平均出力波形を示す図である。 0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 27」で処置されたラットL5 DRG細胞(L5/L6結紮を伴わない)内の、細胞蛍光強度についての平均出力波形を示す図である。 0(すなわち、陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 30」で、24時間にわたり処置されたDRG神経細胞(L5/L6結紮により刺激された)内の、Nav 1.7タンパク質の発現についてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0(陰性対照)及び100zMの「SCN-ASO 30」で、4時間にわたり処置されたDRG神経細胞(L5/L6結紮により刺激された)内の、手動パッチクランプアッセイによるナトリウム電流を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、30、100、又は300zMの「SCN-ASO 30」で、24時間にわたり処置されたラットL5 DRG神経細胞内の、ワンステップcDNA合成による、SCN9AについてのqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、30、100、又は300zMの「SCN-ASO 30」で、24時間にわたり処置されたラットL5 DRG神経細胞内の、ランダムヘキサマーを伴うcDNA合成による、SCN9AについてのqPCRデータを示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 媒体(PBS;陰性対照)、100ピコモル/kgの「SCN-ASO 7」、100ピコモル/kgの「SCN-ASO 8」、100ピコモル/kgの「SCN-ASO 21」、100ピコモル/kgの「SCN-ASO 35」、100ピコモル/kgの「SCN-ASO 36」、又は100ピコモル/kgの「SCN-ASO 37」を皮下投与されたラットにおける、DPNPにより誘導されたアロディニアに対する拮抗を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 媒体だけ(陰性対照)、1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、又は1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 4」を毎日2回ずつ3日間にわたり皮下投与されたmdxマウスの筋組織により得られたネステッドPCR(方法A)産物についての電気泳動データを示す図である。 第23エクソンのスキッピングに割り当てられるPCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 媒体だけ(陰性対照)、1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、又は1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 4」を毎日2回ずつ3日間にわたり皮下投与されたmdxマウスの筋組織により得られたネステッドPCR(方法B)産物についての電気泳動データを示す図である。 第21〜23エクソンのスキッピングに割り当てられるPCR産物バンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)又は10ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」を毎日2回ずつ5日間にわたり皮下投与されたmdxマウスにおける三頭筋試料により得られたネステッドPCR(方法A)産物についての電気泳動データを示す図である。 媒体(陰性対照)、100ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、又は1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」で処置されたmdxマウスにおけるロータロッドスコアを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)、10、50、又は200ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」を慢性投与されたmdxマウスにおける握力スコアを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)又は200ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」を、毎週2回ずつ、30週間にわたり投与されたmdxマウスの筋組織における、DAPI染色とマージした、全長ジストロフィンについてのIHC画像を示す図である。 0(陰性対照)、10、50、又は200ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」を慢性投与されたmdxマウスの骨格筋における、全長ジストロフィンタンパク質の相対発現レベルを示す図である。発現レベルは、WTマウスにおける発現レベルに対して正規化された発現レベルである(誤差バーは、標準誤差により、*はp<0.05に対応し、**はp<0.01に対応する)。 7週目におけるmdxマウスからサンプリングされた骨格筋により得られたネステッドPCR産物についての電気泳動データを示す図である。 C57BL/6マウス(WT陰性対照)及び0(mdx陰性対照)、10、50又は200ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」を慢性投与されたmdxマウスの三頭筋についてのH&E染色による組織病理学的変化を示す図である。 0(mdx陰性対照)、10ピコモル/kg、又は30ピコモル/kgの「DMD ASO2」に、慢性曝露された、C57BL/6マウス(WT陰性対照)及びmdxマウスにおける、トレッドミル上の歩行距離を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*はp<0.05に対応し、**はp<0.01に対応し、***はp<0.001に対応する)。 0(mdx陰性対照)、10ピコモル/kg、又は30ピコモル/kgの「DMD ASO2」に、慢性曝露された、C57BL/6マウス(WT陰性対照)及びmdxマウスにおける、血清クレアチンキナーゼレベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、**はp<0.01に対応し、****はp<0.0001に対応する)。 0(mdx陰性対照)、10ピコモル/kg、又は30ピコモル/kgの「DMD ASO2」に、慢性曝露された、C57BL/6マウス(WT陰性対照)及びmdxマウスにおける、血清ミオグロビンレベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、***はp<0.001に対応し、****はp<0.0001に対応する)。 0(mdx陰性対照)、10、又は30ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」に慢性曝露された野生型マウス(WT陰性対照)又はmdxマウスに由来する骨格筋試料中の、全長ジストロフィンについてプローブされたウェスタンブロットデータを示す図である。 WTマウス(WT陰性対照)、ASOによる処置を伴わないmdxマウス、及び50ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、10ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」、又は10ピコモル/kgの「DMD-ASO 6」を毎週2回ずつ66週間にわたり皮下投与されたmdxマウスにおける、血清クレアチンキナーゼレベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、**はp<0.01に対応する)。 WTマウス(WT陰性対照)、ASOによる処置を伴わないmdxマウス、及び50ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、10ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」、又は10ピコモル/kgの「DMD-ASO 6」を毎週2回ずつ66週間にわたり皮下投与されたmdxマウスにおける、血清ミオグロビンレベルを示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*はp<0.05に対応し、***はp<0.001に対応する)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「IDO-ASO 1」で処置されたSKOV3細胞内の、IDO-1のネステッドPCR産物についての電気泳動データ(左図)、及びエキソンスキッピングPCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータ(右図)を示す図である。 0zM(陰性対照)又は10zM〜1fMの「IDO-ASO 1」で処置されたSKOV3細胞内の、キヌレニン分泌アッセイの結果を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)、1、3、10、30、又は100aMの「IDO-ASO 5」で処置されたSKOV3細胞内の、IDO-1のネステッドPCR産物についての電気泳動データを示す図である。 第2〜4エクソン及び第2〜6エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)、1、3、10、30、又は100aMの「IDO-ASO 6」で処置されたSKOV3細胞内の、IDO-1のネステッドPCR産物についての電気泳動データ(左図)、及び第2〜5エクソンのスキッピングに割り当てられるPCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータ(右図)を示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 3」で処置されたPC12細胞内の、SNAP25のネステッドPCR産物についての電気泳動解析(左図)、及び第5〜7エクソンのスキッピングに対するPCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 3」で処置されたPC12細胞内の、全長ラットSNAP25 mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 1」で処置されたPC12細胞内の、全長ラットSNAP25 mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0zM(陰性対照)、1zM、10zM、30zM、100zM、300zM、1aM、3aM、又は10aMの「SNAP-ASO 3」で、48時間にわたり処置されたPC12細胞内の、SNAP25についてのウェスタンブロットデータ(上図)、及びβ-アクチンに対して正規化されたSNAP25の相対発現レベル(下図)を示す図である。 0(陰性対照)、0.1、又は1aMの「SNAP-ASO 1」で、48時間又は72時間にわたり処置されたPC12細胞内の、SNAP25ウェスタンブロットデータを示す図である。 0zM(陰性対照)、1zM、10zM、100zM、1aM、10aM、又は100aMの「SNAP-ASO 3」で、48時間にわたり処置されたSiMa細胞内の、SNAP25についてのウェスタンブロットデータ(上図)、及びβ-アクチンに対して正規化されたSNAP25の相対発現レベル(下図)を示す図である。 0zM(陰性対照)、1zM、10zM、100zM、1aM、10aM、又は100aMの「SNAP-ASO 3」で処置されたSiMa細胞内の、全長ヒトSNAP25レベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、1、10、又は100fMの「SNAP-ASO 1」で、毎日2回ずつ、4日間にわたり局所投与されたマウスの皮膚試料についての、SNAP25 IHC画像である。 0(陰性対照)、1、10、又は1,000aMの「TYR-ASO 4」で処置されたB16F10マウス黒色腫細胞内の、ネステッドPCR産物についての電気泳動解析を示す図である。 第2〜3エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物についてのサンガーシーケンシングを示す図である。 0(陰性対照)、1、10、100、又は1,000aMの「TYR-ASO 4」で処置されたB16F10マウス黒色腫細胞内の、qPCRによる、全長TYR mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、0.01、0.1、1、又は10aMの「TYR-ASO 4」で、24時間にわたり処置されたB16F10細胞内の、TYRについてのウェスタンブロットデータを示す図である。 0(陰性対照)1、10、100、又は1,000aMの「TYR-ASO 4」、又は10μg/mL若しくは100μg/mLのアルブチンで処置されたB16F10マウス黒色腫細胞内の、メラニン含量の変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応し、**は、p<0.01に対応し、***は、p<0.001に対応する)。 0zM(陰性対照)、1zM、100zM、又は10aMの「TYR-ASO 1」で処置されたヒト初代上皮メラニン細胞内の、qPCRによる、全長TYR mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差による)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 3」で処置されたJurkat細胞内の、ネステッドPCR産物についての電気泳動解析を示す図である。 第2エクソン(左)及び第3エクソン(右)のスキッピングに、それぞれ、割り当てられる、PCR産物についてのサンガーシーケンシングを示す図である。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 3」で処置されたJurkat細胞内の、ネステッドqPCRによる、ヒトPD-1 mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、**は、p<0.01に対応し、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 3」で処置されたJurkat細胞内の、qPCRによる、ヒトIL-2 mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、**は、p<0.01に対応し、*は、p<0.05に対応する)。 0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 1」で処置されたJurkat細胞内の、ネステッドqPCRによる、ヒトPD-1 mRNAレベルの変化を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応する)。 2、10、又は50ピコモル/Kgの「PD-ASO 2」を、毎週2回ずつ皮下投与されたC57BL/6マウスにおける、B16F10黒色腫増殖の阻害を示す図である(誤差バーは、標準誤差により、*は、p<0.05に対応する)。
本発明の説明
本発明は、式I:
[式中、
nは、10〜25の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、独立に、重水素[D]基、ヒドリド[H]基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、ホルミル[H-C(=O)-]基、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]基、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、又は置換若しくは非置換のアリールホスホニル基を表し、
Zは、ヒドリド基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換のアルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、非置換アミノ[-NH2]基、置換若しくは非置換のアルキルアミノ基、置換若しくは非置換のアリールアミノ基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、核酸塩基部分に共有結合によって連結された、置換若しくは非置換のアミノ基を有する非天然の核酸塩基から選択される]
により表されるペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
一部の実施形態では、式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、この場合、標的スプライス部位配列は、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれでもない。
一部の実施形態では、式Iの化合物は、標的プレmRNA内の、標的スプライス部位との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、この場合、標的スプライス部位配列は、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれをも含まない。
式Iの化合物は、標的プレmRNAの標的エクソンのスキッピングを強力に誘導し、標的エクソンを欠く、mRNAのスプライス変異体(複数可)をもたらし、したがって、遺伝子を転写する、標的プレmRNAの機能活性をモジュレートするのに有用である。
式Iの化合物について記載するのに採用される、「nは、10〜25の間の整数である」という条件は、「nは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、及び24から選択される整数である」ことを文字通りに言明する。
全ヒトゲノムには、26,564の遺伝子が存在すると推定された[In Silico Biol. 4巻、387-393 (2004)]。遺伝子1つ当たり、平均で、約8.8のエクソン及び7.8のイントロンが存在することを踏まえると、ヒトゲノム内には、可能な、368、122のスプライス部位[{(8.2×2)-2}×25,564=368、122]が存在する。10量体のプレmRNAには、1,048,576(すなわち、410)の可能な配列が存在するので、10量体のPNA誘導体であってもなお、標的スプライス部位についての、十分なレベルの特異性を示すであろう。しかし、各イントロンの5'末端及び3'末端は、[(5'→3')│GU-]で始まる配列、及び[(5'→3')-AG│]で終わる配列[それぞれ、配列中、「│」は、イントロン-エクソン間又はエクソン-イントロン間の接合部を表す]を有するように、高度に保存されている。こうして、オリゴマー長が11量体以上の(すなわち、nは、10より大きな整数である)、式Iの化合物は、標的スプライス部位についての、十分なレベルの特異性を示すことが予測される。
式Iの化合物は、先行技術[PCT/KR2009/001256]において例示されている、相補的な核酸に緊密に結合する。例えば、4つ〜5つの修飾(すなわち、非天然であるか、又は自然発生ではない)核酸塩基の、11〜13量体の、式IのPNA誘導体への組込みは、相補的DNAとの二重鎖形成において、20℃以上のTm増加をたやすくもたらす。本発明の化合物は、相補的RNAに対して、相補的DNAに対するのと同様に強力なアフィニティーを保有する。したがって、前記化合物の、他のプレmRNA配列への、少数のミスマッチを伴う結合に由来する、所望されないオフターゲット効果を回避するために、本発明の化合物を、可能な限り短くすることが好ましい。こうして、前記化合物のオリゴマー長は、25量体より短くなるように制限される。
式Iの化合物は、先行技術[PCT/KR2009/001256]において例示されている通り、単一塩基のミスマッチに対しても、高感度である。例えば、単一塩基のミスマッチは、修飾された塩基の種類並びにPNA配列に応じて、11〜22℃のTm低下を結果としてもたらした。しかし、本発明の化合物は、RNAに対する強力なアフィニティーのために、1又は2カ所のミスマッチを保有する標的スプライス部位配列にも依然として緊密に結合し、標的エクソンのスキッピングを強力に誘導する。
式Iの化合物は、その配列に応じて、標的プレmRNA内の3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位に緊密に結合する。
化合物が、3'側スプライス部位に結合する場合、前記化合物は、標的イントロンに由来する7量体及び標的エクソンに由来する7量体からなる、標的3'側スプライス部位内の14量体の配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有する。こうして、3'側スプライス部位は、標的イントロンの3'末端と、標的エクソンの5'末端との間の接合部として、明確に規定される。
化合物が、5'側スプライス部位に結合する場合、前記化合物は、標的エクソンに由来する7量体及び標的イントロンに由来する7量体からなる、標的5'側スプライス部位内の14量体の配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有する。こうして、5'側スプライス部位は、標的エクソンの3'末端と、標的イントロンの5'末端との間の接合部として、明確に規定される。
3'側スプライス部位をターゲティングする、式Iの化合物について記載する、14量体の配列は、ヒトHIF 1A遺伝子[NCBI基準配列:NG_029606.1]から読み取られた、ヒトHIF-1α(低酸素症誘導因子1アルファ)プレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位により例示される。第1イントロンに由来する20量体、及び第2エクソンに由来する20量体からなる、3'側スプライス部位の、40量体の配列は、[(5'→3')uucuuguuguuguuaaguag│GAUAAGUUCUGAACGUCGAA][配列中、イントロン配列及びエクソン配列は、それぞれ、小文字及び大文字により表記され、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部は、「│」によりマークされる]と読み取られる。したがって、HIF-1αの第1イントロンに由来する7量体及びHIF-1αの第2エクソンに由来する7量体からなる、3'側スプライス部位の14量体の配列は、[(5'→3')uaaguag│GAUAAGU]と読み取られる。この3'側スプライス部位では、標的イントロン及び標的エクソンは、それぞれ、HIF-1αの第1イントロン及び第2エクソンである。
エクソン番号は、mRNA転写物に応じて、変動することが多いので、上記40量体のプレmRNA配列は、ヒトHIF-1αプレmRNA内の第2エクソンの、3'側スプライス部位を明確に同定するために提示した。本発明を通して、前記PNA化合物の標的スプライス部位は、該当する場合、標的エクソン番号及び標的スプライス部位を含むプレmRNA配列を、同時に指定することにより、明確に同定される。
5'側スプライス部位をターゲティングする、式Iの化合物について記載する、14量体の配列は、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第2エクソンと、第2イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位により例示される。第2エクソンに由来する20量体、及び第2イントロンに由来する20量体からなる、5'側スプライス部位の、40量体の配列は、[(5'→3')GAGGAAACUUCUGGAUGCUG│gugaguuauuuuacaagggu][配列中、エクソン配列及びイントロン配列は、それぞれ、大文字及び小文字により表記され、第2エクソンと、第2イントロンとの接合部は、「│」によりマークされる]と読み取られる。したがって、HIF-1αの第2エクソンに由来する7量体及びHIF-1αの第2イントロンに由来する7量体からなる、5'側スプライス部位の14量体の配列は、[(5'→3')GAUGCUG│gugaguu]と読み取られる。この5'側スプライス部位では、標的エクソン及び標的イントロンは、それぞれ、HIF-1αの、第2エクソン及び第2イントロンである。
式Iの化合物は、標的プレmRNA内の、標的スプライス部位に緊密に結合し、化合物の標的スプライス部位を伴う、「スプライスソーム初期複合体」の形成に干渉する。前記化合物は、前記化合物のヌクレオチド配列に応じて、標的プレmRNA内の、3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位に緊密に結合する。本発明の化合物は、「スプライスソーム初期複合体」の形成を立体障害的に阻害するので、標的エクソンは、スプライシングされて、標的エクソンを欠く、mRNAのスプライス変異体(複数可)をもたらす。結果として、本発明の化合物は、標的エクソンのスキッピングを強力に誘導する。
式IのPNA誘導体について記載するのに採用される、天然の(すなわち、自然発生である)核酸塩基又は非天然の(すなわち、自然発生ではない)核酸塩基の化学構造を、図7に例示する。本発明の、天然又は非天然の核酸塩基は、図7に提示される核酸塩基を含むがこれらに限定されない。このような、天然又は非天然の核酸塩基の提示は、許容可能な核酸塩基の多様性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲を、図7に提示される核酸塩基に限定するためのものと解釈されるべきではない。オリゴヌクレオチド分野の当業者は、図7に例示された非天然の核酸塩基の各々と相補的な、天然の核酸塩基を容易に理解しうる。したがって、当業者は、式Iの化合物と、標的プレmRNA配列との相補性を、明確に同定しうる。
式IのPNA誘導体について記載するのに採用される置換基を、図8A〜図8Eに例示する。図8Aは、置換若しくは非置換のアルキル基についての例を提示する。置換若しくは非置換のアルキルアシル基、及び置換若しくは非置換のアリールアシル基を、図8Bに例示する。図8Cは、置換アルキルアミノ基、置換アリールアミノ基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、及び置換若しくは非置換のアリールホスホニル基についての例を例示する。図8Dは、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、及び置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基についての例を提示する。図8Eには、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、及び置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基についての例が提示される。このような例示的な置換基の提示は、許容可能な置換基の多様性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲を、図8A〜図8Eに例示された置換基に限定するためのものと解釈されるべきではない。当業者は、オリゴヌクレオチド配列が、オリゴヌクレオチドの、標的プレmRNA配列への配列特異的結合に対して、N末端又はC末端における置換基を凌駕する、最優先の因子であることを容易に理解しうるので、本発明の前記化合物には、図8A〜図8Eに例示された置換基より多様な置換基が許容可能である。
式Iの化合物は、良好な細胞透過性を保有し、先行技術[PCT/KR2009/001256]で例示されている、「ネイキッド」(すなわち、細胞への送達を増大させるアジュバント(複数可)と共に製剤化されていない)オリゴヌクレオチドとして、細胞に、たやすく送達することができる。したがって、本発明の化合物は、標的プレmRNA内の、標的エクソンのスキッピングを強力に誘導して、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとしての式Iの化合物で処置された細胞内で、標的エクソンを欠く、mRNAのスプライス変異体(複数可)をもたらす。
式Iの化合物は、細胞内の、標的エクソンのスキッピングを強力に誘導するのに、細胞への送達のための手段又は製剤を必要としない。この点で、本発明の化合物は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドと、明確に差別化される。
RNAに対する強力なアフィニティー、及び良好な細胞透過性を備える、式Iの化合物は、フェムトモル未満のアンチセンス効力で、細胞内の、標的エクソンのスキッピングをたやすく誘導する。現在のところ、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドでは、フェムトモル未満のアンチセンスエクソンスキッピング効力は、報告又は実現されていない。ナノモル未満のアンチセンスエクソンスキッピング効力であってもなお、他のクラスのオリゴヌクレオチドでは、ほとんど記録されていない。ナノモル未満のアンチセンスエクソンスキッピング効力は、細胞へのトランスフェクションのためのリポフェクションを容易とするように、数を変動させるホスホネート基を、PNA配列のN末端に共有結合によってコンジュゲートさせるように設計された、PNA ASOにより報告された[Nucl. Acids Res. 30(13)巻、4424-4432 (2008)]。本文献の前出で引用した通り、in vitroにおけるアンチセンスエクソンスキッピング効力は、例えば、リポフェクション、電気穿孔など、細胞への強制的送達の条件下であってもなお、ナノモルからマイクロモルであることが報告されている。この点で、式Iの化合物は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドと、明確に差別化される。
オリゴヌクレオチド分子が、プレmRNA内の、その相補的配列に結合するためには、分子は、標的プレmRNA配列への相補的な結合のために、伸展又はアンフォールドする必要がある。オリゴヌクレオチド分子は、核酸塩基間で、分子間又は分子内の水素結合を形成する、それらの大きな傾向に起因して、凝集するか、又はフォールドしたままである(例えば、ヘアピン様に)傾向がある。したがって、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、一般に探索されているオリゴヌクレオチドによるアンチセンスエクソンスキッピングに対しては、さらなるエネルギー障壁が存在するであろう。オリゴヌクレオチドは、従来、オリゴヌクレオチド分子を、可能な限りアンフォールドするための、緩衝水溶液中、90℃超のインキュベーション後における、UV吸収により定量化されている。
式IのPNA誘導体は、その中の修飾核酸塩基に共有結合によって接合した、いくつかの塩基性アミノ基に起因して、生理学的pHにおいて、全オリゴヌクレオチド鎖にわたり分布する、複数の正電荷を保有する。複数の正電荷は、同じオリゴヌクレオチド鎖上の、近傍の正の電荷間の静電斥力に起因して、式Iの化合物が、アンフォールド又は伸展を維持することを可能とする。式Iの誘導体は、式Iの他の分子(複数可)と凝集する傾向が小さい。したがって、式Iの化合物は、標的プレmRNA内の標的配列への相補的結合の構造的準備(すなわち、伸展)を維持する傾向がある。標的プレmRNAは、DNAから転写されつつあるので、構造的な準備ができていることはまた、式Iのオリゴヌクレオチドが、標的プレmRNA配列と、迅速にアライメントするためにも重要である。こうして、構造的な準備ができていることは、強力なアフィニティーと組み合わされて、強力な結合アフィニティーとなり、式Iの化合物の、フェムトモル未満のアンチセンスエクソンスキッピング効力をもたらすと考えられる。これらの点で、式Iの化合物は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドと、高度に差別化される。
良好な細胞透過性のために、式IのPNA誘導体は、標的組織(複数可)内のエクソンスキッピングを強力に誘導する「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして、全身投与することができる。式Iの化合物は、所望の治療活性を強力に誘発するのに、標的組織への送達を増大させる製剤又はアジュバントを必要としない。式Iの化合物は、PBS(リン酸緩衝生理食塩液)中又は生理食塩液中に、簡単に溶解し、全身投与されて、標的組織(複数可)内で、治療活性を、無理なく誘発する。
「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして処置される、細胞内のエクソンスキッピングの、フェムトモル未満の効力を備える、本発明のPNA誘導体は、しばしば、1μg/kg以下の全身用量で、in vivoにおける治療活性を示す。このような強力な治療的効力は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドにより実現されたことがない。オリゴヌクレオチドの製造費用は、一般に、極めて高額であるので、極度に強力な効力は、とりわけ、慢性疾患を伴う患者に、廉価の処置費用を実現するために、大きな利点である。この点で、式Iの化合物は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドと、高度に差別化される。
良好な細胞透過性のために、本発明のPNA誘導体は、たやすく、局所送達又は経皮送達されて、投与部位において、治療活性を誘発する。本発明の化合物は、意図される局所治療活性を誘発するのに、重度に、又は侵襲的に製剤化される必要がない。式IのPNA誘導体は、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして、たやすく経皮送達される。極度に強力なエクソンスキッピング効力のために、前記化合物は、ピコモル未満のオリゴヌクレオチド溶液を局所投与又は経皮投与されても、治療活性を示す。「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとしての局所送達又は経皮送達は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドでは、極めて困難であった。この点で、式Iの化合物は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドと、明確に差別化される。
式Iの化合物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸などを含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される酸又は塩基との組合せとして使用することができる。
式IのPNA誘導体又は薬学的に許容されるその塩は、対象に、クエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、炭酸水素ナトリウム、蒸留水、保存剤(複数可)などを含むがこれらに限定されない、薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて投与することができる。
本発明の化合物は、対象に、投与スケジュール、対象の状態、又は状況などに応じて変動しうる、1フェムトモル/kg〜1ナノモル/kg超の範囲の治療有効用量で全身投与することができる。本発明の化合物は、対象に、投与スケジュール、対象の状態、又は状況などに応じて変動しうる、1aM〜1nM超の範囲の治療有効濃度で局所投与することができる。
式I:
[式中、
nは、10〜25の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、独立に、重水素基、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、ホルミル基、アミノカルボニル基、アミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、又は置換若しくは非置換のアリールホスホニル基を表し、
Zは、ヒドリド基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換のアルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、非置換アミノ基、置換若しくは非置換のアルキルアミノ基、置換若しくは非置換のアリールアミノ基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、式II、式III、又は式IV:
[式中、
R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
L1、L2、及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合によって連結している、式V:
[式中、
Q1及びQmは、置換若しくは非置換のメチレン(-CH2-)基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、置換若しくは非置換のメチレン基、酸素(-O-)基、硫黄(-S-)基、及び置換若しくは非置換のアミノ基[-N(H)-又は-N(置換基)-]から選択され、
mは、1〜15の間の整数である]
により表される共有結合リンカーである]
により表される非天然の核酸塩基から選択される]
のPNA誘導体、又は薬学的に許容されるその塩が好ましい。
式II、式III、及び式IVの非天然の核酸塩基は、それぞれ、先行技術[PCT/KR2009/001256]において例示されているプレmRNAと対合する、相補的な塩基について、シトシン、アデニン、及びグアニンと同等である。
式Vについて記載するのに採用される、「mは、1〜15の間の整数である」という条件は、「nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、及び14から選択される整数である」ことを文字通りに言明する。
式I:
[式中、
nは、11〜23の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、ヒドリド基であり、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、アミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
Zは、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
Q1及びQmは、置換若しくは非置換のメチレン基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、置換若しくは非置換のメチレン基、酸素基、及びアミノ基から選択され、
mは、1〜11の間の整数である]
のPNAオリゴマー、又は薬学的に許容されるその塩が目的である。
式I:
[式中、
nは、11〜21の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、ヒドリド基であり、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
Zは、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
Q1及びQmは、メチレン基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、メチレン基、酸素基、及びアミノ基から選択され、
mは、1〜11の間の整数である]
のPNA誘導体、又は薬学的に許容されるその塩が、特に目的である。
式I:
[式中、
nは、11〜19の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、ヒドリド基であり、
X及びYは、独立に、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
Zは、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
R1、R3、及びR5は、ヒドリド基であり、R2、R4、及びR6は、独立に、ヒドリド基、又は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、
Q1及びQmは、メチレン基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、メチレン基及び酸素基から選択され、
mは、1〜9の間の整数である]
のPNAオリゴマー、又は薬学的に許容されるその塩が、大きな目的である。
式I:
[式中、
nは、12〜19の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、ヒドリド基であり、
X及びYは、独立に、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、又は置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基を表し、
Zは、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも5つは、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、ヒドリド基であり、
Q1及びQmは、メチレン基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、メチレン基及び酸素基から選択され、
mは、1〜9の間の整数である]
のPNA誘導体、又は薬学的に許容されるその塩が、より大きな目的である。
式I:
[式中、
nは、12〜18の間の整数であり、
式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、ヒドリド基であり、
Xは、ヒドリド基であり、
Yは、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、又は置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基を表し、
Zは、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然の核酸塩基から選択され、
B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも5つは、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、ヒドリド基であり、
L1は、右側の端部が、塩基性アミノ基に直接連結された、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、-CH2-O-(CH2)5-、-CH2-O-(CH2)6-、又は-CH2-O-(CH2)7-を表し、
L2及びL3は、独立に、右側の端部が、塩基性アミノ基に直接連結された、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、及び-(CH2)2-O-(CH2)3-から選択される]
のPNA誘導体、又は薬学的に許容されるその塩が、最大の目的である。
式Iの化合物は、先行技術[PCT/KR2009/001256;EP2268607;US8680253]において記載されている通りに略記することができる。ヒトHIF 1A遺伝子(NCBI基準配列:NG_029606.1)から読み取られた、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位をターゲティングする、式IのPNA誘導体について記載するのに使用されるこのような略号の例を
(N → C) Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fmoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) H-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O3)-TA(5)-NH2;
(N → C) Ac-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Piv-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) ベンゾイル-CA(5)G(2O3)-AA(5)C-TTA(4)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) n-プロピル-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(2O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) ベンジル-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-CA(5)G-AA(5)C-TTA(2O2)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) [N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-CA(5)G(3)-AA(5)C-TTA(3)-TCC(1O2)-TA(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-CA(5)G(2O2)-AA(5)C-TTA(8)-TCC(1O2)-TA-Lys-NH2;
(N → C) N-フェニル-N-Me-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Piv-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) FAM-HEX-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2;
(N → C) Fethoc-Arg-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-Gly-NH2;
(N → C) Fethoc-Val-GA(5)A-CTT-A(6)TC-CTA(5)-C(2O2)T-Gly-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-C(1O5)TT-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2;
(N → C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2;及び
(N → C) Fethoc-TTC(1O5)-AG(5)A-A(4)CT-TA(5)T-CC(2O2)T-A(6)CT-TA(6)-NH2:
[略記中、
A、G、T、及びCは、それぞれ、アデニン、グアニン、チミン、及びシトシンによる、天然の核酸塩基を伴うPNA単量体であり、
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)、及びG(pOq)は、それぞれ、式VI、式VII、式VIII、式IX、及び式X:
[式中、
p及びqは、整数であり、
N末端置換基及びC末端置換基の略号は、具体的に、以下の通りに規定される:「Fmoc-」は、「[(9-フルオレニル)メチルオキシ]カルボニル-」;「Fethoc-」は、「[2-(9-フルオレニル)エチル-1-オキシ]カルボニル」;「Ac-」は、「アセチル-」;「ベンゾイル-」は、「ベンゼンカルボニル-」;「Piv-」は、「ピバリル-」;「n-プロピル-」は、「1-(n-プロピル)-」;「H-」は、「ヒドリド-」基;「p-トルエンスルホニル」は、「(4-メチルベンゼン)-1-スルホニル-」;「-Lys-」は、アミノ酸残基である「リシン」;「-Val-」は、アミノ酸残基である「バリン」;「-Leu-」は、アミノ酸残基である「ロイシン」;「-Arg-」は、アミノ酸残基である「アルギニン」;「-Gly-」は、アミノ酸残基である「グリシン」;「[N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-」は、「[N-1-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-」;「ベンジル-」は、「1-(フェニル)メチル-」;「フェニル-」は、「フェニル-」;「Me-」は、「メチル-」;「-HEX-」は、「6-アミノ-1-ヘキサノイル-」;「FAM-」は、「5、又は 6-フルオレセイン-カルボニル-(アイソマーの混合物)」の略記であり;「-NH2」は、非置換「-アミノ」基の略記である]
により表される、非天然の核酸塩基を伴うPNA単量体である]
に記載する。
図9は、併せて、A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)、及びG(pOq)として略記された、PNA単量体の化学構造を提示する。先行技術[PCT/KR2009/001256]において論じられている通り、C(pOq)は、その「グアニン」との優先的なハイブリダイゼーションに起因して、「シトシン」と同等な、修飾PNA単量体と見なされる。A(p)及びA(pOq)は、「チミン」に対する、それらの緊密なアフィニティーのために、「アデニン」として作用する、修飾PNA単量体として理解される。同様に、G(p)及びG(pOq)は、「グアニン」と同等な、それらの「シトシン」との生産的塩基対合のために、修飾PNA単量体であると考えられる。
図10は、本発明における、式IのPNA誘導体の、N末端又はC末端を多様化するのに使用される置換基の様々な略号の化学構造を明確に提示する。図10におけるN末端基又はC末端基の、例としての提示は、式IのPNA誘導体のN末端又はC末端に許容可能な置換基の多様性を例示するためのものであり、したがって、本発明の化合物のN末端基又はC末端基の範囲を限定するためのものと解釈されるべきではない。当業者は、オリゴヌクレオチド配列が、標的プレmRNA配列との、配列特異的相互作用への、最優先の寄与因子であることを容易に理解しうる。
このようなPNA誘導体に採用される略号を例示するために、「(N→C)Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2」として略記される、14量体のPNA誘導体の化学構造を、図11に提示する。
別の例示として、「(N→C)Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C-NH2」として略記される、15量体のPNA誘導体の化学構造を、図12に提示する。
式Iの化合物は、「標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複」を有することの要件を満たすものとする。式Iの化合物が、例えば、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと第2エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位をターゲティングする場合、3'側スプライス部位は、[(5'→3')guuguuguuaaguag│GAUAAGUUCUGAACG]の30量体のヒトHIF-1αプレmRNA配列により、明確に規定される。こうして、標的HIF-1αの3'側スプライス部位の14量体の配列は、[(5'→3')uaaguag│GAUAAGU]と読み取られる。
「(N→C)Fethoc-CA(5)G-AA(5)C-TTA(5)-TCC(1O2)-TA(5)C-NH2」の配列を伴う、15量体のHIF-1α ASOは、ヒトHIF-1αプレmRNAとの相補的な結合について、「(5'→3')CAG-AAC-TTA-TCC-TAC」のDNA配列と同等である。15量体のASOは、[(5'→3')guuguuguuaaguag│GAUAAGUUCUGAACG]の30量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」HIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたり、3'側スプライス部位との、15量体の相補的な重複(すなわち、完全に相補的な重複)を有する。PNA ASOは、[(5'→3')uaaguag│GAUAAGU]の、14量体のHIF-1αプレmRNA配列との、11量体の相補的な重複(すなわち、イントロン1に由来する4量体、及び第2エクソンに由来する7量体)を保有する。したがって、15量体のHIF-1α PNA ASOは、式Iの化合物に必要とされる、相補的な重複の条件を満たす。
「(N→C)Fethoc-CTC(1O2)-A(6)TC-CTA(6)-C(1O2)TT-AA(6)C-NH2」の配列を伴う、別の15量体のHIF-1α ASOは、HIF-1αプレmRNAとの相補的な結合について、「(5'→3')CTC-ATC-CTA-CTT-AAC」のDNA配列と同等である。15量体のPNA ASOは、[(5'→3')guuguuguuaaguag│GAU"A"AGUUCUGAACG]の30量体のHIF-1αプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位との、単一のミスマッチを保有するが、この場合、単一のミスマッチを、引用符(“")でマークする。15量体のPNAは、式Iの化合物について記載するのに採用された、[(5'→3')uaaguag│GAU"A"AGU]内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、14量体の3'側スプライス部位配列との、12量体の相補的な重複を保有し、この場合、単一のミスマッチを、引用符(“")でマークする。単一のミスマッチにもかかわらず、15量体のHIF-1α ASOは、式Iの化合物に必要とされる、相補的な重複の条件を満たす。
式Iの化合物が、例えば、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたる5'側スプライス部位をターゲティングする場合、5'側スプライス部位は、ヒトSCN9A遺伝子(NCBI基準配列:NC_000002.12からアクセスされた)から読み取られた、[(5'→3')CGUCAUUGUUUUUGC│guaaguacuuucagc]の、30量体のヒトSCN9AプレmRNA配列により、明確に規定される。こうして、標的SCN9AのSCN9A'側スプライス部位の14量体の配列は、[(5'→3')UUUUUGC│guaagua]と読み取られる。
「(N→C)Fethoc-AC(1O2)T-TA(5)C-G(6)CA-A(5)AA(5)-AC(1O2)A-A(5)-NH2」の配列を伴う、16量体のSCN9A ASOは、ヒトSCN9AプレmRNAとの相補的な結合について、「(5'→3')作用する-TAC-GCA-AAA-ACA-A」のDNA配列と同等である。16量体のPNAは、[(5'→3')CGUCAUUGUUUUUGC│guaaguacuuucagc]の30量体のSCN9AプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたり、5'側スプライス部位との、16量体の相補的な(すなわち、完全に相補的な)重複を保有する。16量体のSCN9A ASOは、[(5'→3')UUUUUGC│guaagua]内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、14量体の5'側スプライス部位配列との、13量体の相補的な重複を保有する。16量体のSCN9A ASOは、式Iの化合物に必要とされる、相補的な重複の条件を満たす。
発明の詳細な説明
PNAオリゴマーを調製するための一般的手順
PNAオリゴマーは、先行技術[US 6,133,444;WO 96/40685]に記載されている方法に従い、又は微細な改変を伴って、Fmoc-化学反応に基づく固相ペプチド合成(SPPS)により合成した。本発明で使用される固体支持体は、PCAS BioMatrix Inc.(Quebec、Canada)から購入された、H-Rink Amide-ChemMatrixであった。修飾核酸塩基を伴うFmoc-PNA単量体は、先行技術[PCT/KR2009/001256]において記載されている通りに、又は微細な改変を伴って合成した。
本発明で使用される修飾核酸塩基を伴うFmoc-PNA単量体の化学構造を、図13に提示する。図13に提示されるFmoc-PNA単量体は、例として理解されるべきであり、したがって、本発明の範囲を限定するためのものと理解されるべきではない。当業者は、式IのPNA誘導体を合成するのに使用される、このようなFmoc-PNA単量体には、例えば、保護基の多数の変動が可能であることを容易に理解しうる。
PNAオリゴマーを、C18逆相HPLC(0.1%のTFAを伴う、水/アセトニトリル又は水/メタノール)により精製し、MALDI-TOF/MS及びESI-TOF/MSを含む質量分析により特徴づけた。
図14は、本発明のSPPSにおいて採用される、典型的な単量体伸長サイクルを提示するが、合成についての詳細は、下記の通りに提示される。しかし、当業者には、自動式ペプチド合成器上又は手動式ペプチド合成器上で、このようなSPPS反応を行うのに、多くの微細な変動が、明らかに可能であるものとする。SPPSに関与する反応ステップを、例示的な反応手順として、下記に提示する。
[H-Rink-ChemMatrix樹脂の活性化]20%のピペリジン/ジメチルホルムアミド(DMF)1.5mL中、0.01ミリモル(約20mgの樹脂)のChemMatrix樹脂を、ライブラチューブ内で、20分間にわたりボルテックスし、反応溶液を濾過した。樹脂を、1.5mLの塩化メチレン(MC)、1.5mLのDMF、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCにより、各々30秒間ずつ、連続で洗浄した。結果として得られる、固体支持体上の遊離アミンを、Fmoc-PNA単量体又はFmocにより保護されたアミノ酸誘導体とのカップリングにかけた。
[DeFmoc]樹脂を、20%のピペリジン/DMF 1.5mL中で、7分間にわたりボルテックスし、DeFmoc溶液を濾過した。樹脂を、1.5mL MC、1.5mL DMF、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCにより、各々30秒間ずつ、連続で洗浄した。結果として得られる、固体支持体上の遊離アミンを、速やかに、Fmoc-PNA単量体とのカップリングにかけた。
[Fmoc-PNA単量体とのカップリング]固体支持体上の遊離アミンを、Fmoc-PNA単量体と、以下の通りにカップリングさせた。0.04ミリモルのFmoc-PNA単量体、0.05ミリモルのHBTU[2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸]、及び10ミリモルのDIEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン)を、1mLの無水DMF中で、2分間にわたりインキュベートし、遊離アミンと共に、樹脂に添加した。樹脂溶液を、1時間にわたりボルテックスし、反応媒体を濾過した。次いで、樹脂を、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCにより、各々30秒間ずつ、連続で洗浄した。
[キャッピング]カップリング反応の後、反応しなかった遊離アミンは、1.5mLのキャッピング溶液(DMF中に5%の無水酢酸及び6%の2,6-ルチジン)中で、5分間にわたり振盪することにより、キャッピングした。次いで、キャッピング溶液を濾過し、樹脂を、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCにより、各々30秒間ずつ、連続で洗浄した。
[N末端における、「Fethoc-」基の導入]樹脂上の遊離アミンを、通例の基本的なカップリング条件下で、「Fethoc-OSu」と反応させることにより、「Fethoc-」基を、N末端に導入した。「Fethoc-OSu」[CAS番号:179337-69-0、C20H17NO5、分子量:351.36]の化学構造を、以下の通りに提示する。
[樹脂からの切断]樹脂に結合させたPNAオリゴマーは、樹脂を、1.5mLの切断溶液(トリフルオロ酢酸中に、2.5%のトリイソプロピルシラン及び2.5%の水)中で、3時間にわたり振盪することにより、樹脂から切断した。樹脂を濾過し、濾液を、減圧下で、又は溶液上に窒素ガスを吹送することにより、濃縮した。結果として得られる残渣を、ジエチルエーテルと練和させ、結果として得られる沈殿物を、逆相HPLCによる精製のために、濾過により回収した。
[HPLCによる解析及び精製]樹脂を切断した後、PNA粗生成物を、0.1%のTFAを含有する、水/アセトニトリル又は水/メタノールへの、C18逆相HPLC溶離法(勾配法)により精製した。図15A及び図15Bは、それぞれ、HPLCによる精製の前及び後における、「HIF-ASO 1」についての、例示的なHPLCクロマトグラムである。「HIF-ASO 1」のオリゴマー配列を、表1に提示する。
式IのPNA誘導体の合成例
PNA誘導体は、微細な改変を伴うか、又は伴わない、上記の合成手順に従い調製した。本発明のPNA誘導体は、ヒト又はマウスのHIF-1αプレmRNA、ヒト又はマウスのアンドロゲン受容体(AR)プレmRNA、ヒトSCN9A又はラットSCN9AのプレmRNA、マウスジストロフィンプレmRNA、ヒト又はマウスのチロシナーゼプレmRNA、ヒト又はマウスのSNAP25プレmRNA、ヒトIDO1プレmRNA、ヒト又はマウスのPD-1プレmRNAなどを含むがこれらに限定されない、プレmRNA内のスプライス部位をターゲティングするように設計した。多数のプレmRNAについて、スプライス部位をターゲティングする、このようなPNA誘導体の提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、例として列挙される標的スプライス部位に限定するためのものと解釈されるべきではない。
表1は、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表1におけるHIF-1α ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表1で指定されたPNA誘導体に限定するためのものと解釈されるべきではない。
図15Aは、「HIF-ASO 1」の粗生成物により得られた、HPLCクロマトグラムである。粗生成物は、C18-RP調製用HPLCにより精製した。図15Bは、「HIF-ASO 1」の精製生成物についてのHPLCクロマトグラムである。「HIF-ASO 1」の純度は、調製用HPLCによる精製後において、顕著に改善された。図16は、精製生成物である「HIF-ASO 1」により得られた、ESI-TOF/MSスペクトルを提示する。「HIF-ASO 1」についての解析データの提示は、式IのPNA誘導体が、本発明において、どのようにして精製及び同定されたのかを例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものと解釈されるべきではない。
表2は、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第3イントロンと、第4エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表2におけるHIF-1α ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表2で指定されたHIF-1α ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表3は、ヒトAR遺伝子(NCBI基準配列:NC_000023.11からアクセスされた)から読み取られた、ヒトアンドロゲン受容体(AR)プレmRNA内の、第5エクソンと、第5イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表3におけるAR ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表3で指定されたAR ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表4は、ヒトSCN9A 遺伝子(NCBI基準配列:NC_000002.12からアクセスされた)から読み取られた、ヒトSCN9A(9A亜型ナトリウムチャネル)プレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表4におけるSCN9A ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表4で指定されたASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表5は、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第3イントロンと、第4エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表5におけるSCN9A ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表5で提示されたSCN9A ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表6は、ヒトSCN9A又はラットSCN9AのプレmRNA内の特異的スプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表6におけるSCN9A ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表6で指定されたSCN9A ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
「SCN-ASO 34」は、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第2エクソンと、第2イントロンとの接合部にわたる5'側スプライス部位と完全に相補的な、16量体のASOである。「SCN-ASO 34」は、[(5'→3')GAUUUUAGUACACUC│auauccuuuu]の25量体のヒトSCN9AプレmRNA配列内の、「太字」でマークされ、「下線を付された」、第2エクソンとの、11量体の相補的な重複、及び第2イントロンとの、5量体の相補的な重複を保有する。
「SCN-ASO 35」は、「ラット」SCN9AプレmRNA内の、第2エクソンと、第2イントロンとの接合部にわたる5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、16量体のASOである。「SCN-ASO 35」は、ラットゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_005102.3からアクセスされた]から読み取られた[(5'→3')GAUCUUAGUGCACUC│auauccuuuc]の25量体のラットSCN9AプレmRNA配列内の、「太字」でマークされ、「下線を付された」、第2エクソンとの、11量体の相補的な重複、及び第2イントロンとの、5量体の相補的な重複を保有する。「SCN-ASO 35」は、[(5'→3')GAUUUUAGU"A"CACUC│auauccuuuu]の25量体のプレmRNA配列内、引用符(“")でマークされた、ヒトSCN9AプレmRNAとの単一のミスマッチを保有する。
「SCN-ASO 36」は、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第7エクソンと、第7イントロンとの接合部にわたる5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、15量体のASOである。「SCN-ASO 36」は、[(5'→3')CAGCACAGAUUCAGG│guauguaaua]の25量体のヒトSCN9AプレmRNA配列内の、「太字」でマークされ、「下線を付された」、第7エクソンとの、11量体の相補的な重複、及び第7イントロンとの、4量体の相補的な重複を保有する。「SCN-ASO43」の標的配列は、ラットSCN9AプレmRNA内で保存されている。
「SCN-ASO 37」は、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第14イントロンと、第15エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、14量体のASOである。「SCN-ASO 37」は、[(5'→3')uugcuuuuag│CUCCGAGUCUUCAAG]の25量体のヒトSCN9AプレmRNA配列内の、「太字」でマークされ、「下線を付された」、第14イントロンとの、3量体の相補的な重複、及び第15エクソンとの、11量体の相補的な重複を保有する。ASOの標的配列は、ラットSCN9AプレmRNA内で保存されており、[(5'→3')uuauuucuag│CUCCGAGUCUUCAAG]の、ラット25量体のプレmRNA配列内で、「太字」でマークされ、「下線を付されて」いる。
表7は、マウスゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000086.7からアクセスされた]から読み取られた、マウスジストロフィンプレmRNA内の、第23エクソンの3'又は5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表7におけるジストロフィンASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表7で指定されたジストロフィンASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表8は、ヒト又はマウスのインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO1)プレmRNA内のスプライス部位を相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。ヒトIDO1及びマウスIDO1のプレmRNA配列は、それぞれ、ヒトゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000008.11からアクセスされた]、及びマウスゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000074からアクセスされた]から読み取った。表8におけるIDO1 ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表8で指定されたIDO1 ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表9は、ヒトSNAP25遺伝子[NCBI基準配列:NG_029626.1]から読み取られた、ヒトSNAP25プレmRNA内の、「第7エクソン」の3'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするPNA誘導体を、質量分析による構造的特徴付けデータと共に提示する。表9におけるSNAP25 ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表9で指定されたSNAP25 ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表10は、ヒトTYR遺伝子[NCBI基準配列:NG_0008748]から読み取られたヒトチロシナーゼ(TYR)プレmRNA内、又はマウスゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000073からアクセスされた]から読み取られたマウスTYRプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするPNA誘導体を提示する。表10におけるTYR ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表10で指定されたTYR ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
表11は、ヒトPDCD1遺伝子[NCBI基準配列:NG_012110]から読み取られたヒトPD-1プレmRNA内、又はマウスゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000067からアクセスされた]から読み取られたマウスPD-1プレmRNA内の、第2エクソンの3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするPNA誘導体を提示する。表11におけるPD-1 ASOの提示は、式IのPNA誘導体を例示するためのものであり、本発明の範囲を、表11で指定されたPD-1 ASOに限定するためのものと解釈されるべきではない。
相補的なRNA又はDNAについてのモデルであるPNA誘導体の結合アフィニティー
修飾核酸塩基を保有する、10量体のPNA誘導体を、RNA並びにDNAに対する、式IのPNA化合物の、強力なアフィニティーを例示する、モデル化合物として調製した。これらのモデルPNA化合物は、本発明で提供される合成手順に従い、又は微細な改変を伴って調製した。表12には、10量体のPNA誘導体が、質量分析による構造同定データと共に提示される。
表12における、10量体のPNAオリゴマーを、下記で記載される通りに、Tm値を測定することにより、相補的な、10量体のRNA又はDNAに対する、それらの結合アフィニティーについて評価した。
15mLのポリプロピレン製ファルコンチューブ内の4mLの緩衝水溶液(pH7.16、10mMのリン酸ナトリウム、100mMのNaCl)中に、4μMの10量体のPNAオリゴマーと、4μMの相補的な10量体のDNA又はRNAとの混合溶液を、90℃で、1分間にわたりインキュベートし、周囲温度に、ゆっくりと冷却した。次いで、溶液を、4mLの石英性のUV用キュベットに移し、先行技術[PCT/KR2009/001256]において記載されている通りに、又は微細な改変を伴って、UV/可視光分光光度計で、260nmにおけるTmの測定にかけた。Tm測定のためのDNA及びRNAは、Bioneer(www.bioneer.com、Dajeon、Republic of Korea)から購入し、さらなる精製を伴わずに使用した。
表13は、モデルPNAオリゴマーと、相補的DNA又はRNAとの間で測定されたTm値(非補正値としての)を提示する。修飾核酸塩基を伴わない基準PNAオリゴマーである「PNA10-1」は、相補的DNA及びRNAに対して、それぞれ、51及び55℃のTm値をもたらした。修飾核酸塩基(複数可)を保有するモデルPNAオリゴマーは、修飾核酸塩基の組込みが多くなるにつれて、より高いTm値を示す傾向があった。「PNA10-7」も、相補的DNA及びRNAに対して、同様に、69℃のTmを示したことから、モデルであるPNAオリゴマーが、それらの相補的DNA及びRNAに、同等の結合アフィニティーで結合することが示唆される。
10量体の、相補的DNAに対する、PNA誘導体の結合アフィニティー
式IのPNA誘導体を、N末端又はC末端を、相補的にターゲティングする、10量体のDNAに対する、それらの結合アフィニティーを評価した。結合アフィニティーは、PNAと、10量体の、相補的DNAとの二重鎖についてのTm値により評価した。PNA誘導体と、相補性が完全なDNAとの二重鎖は、通例、緩衝水溶液中でたやすく決定される程度に高値のTm値を示す。緩衝水溶液は、Tm測定時に、沸騰する傾向がある。
式IのPNA誘導体の、観察されたTm値(非補正値としての)は、10量体のDNAに対する、相補的な結合について極めて高値であったが、これを、表14に提示する。例えば、「AR-ASO 1」は、[(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2]において、「太字」でマークされ、「下線を付された」、PNA内の、N末端の10量体をターゲティングする、10量体の、相補的DNAとの二重鎖について、86.1℃のTm値を示した。その一方で、「AR-ASO 1」は、[(N→C)Fethoc-C(1O2)TT-A(5)CC-A(5)GG-C(1O2)AA(5)-G-NH2]において、「太字」でマークされ、「下線を付された」、PNA内の、C末端の10量体をターゲティングする、10量体の、相補的DNAとの二重鎖について、81.3℃のTm値を示した。
HIF-1α ASOの、in vitro活性についての例
ヒトHIF-1α(低酸素症誘導因子1α)プレmRNA内の、第2エクソン又は第4エクソンの3'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、式IのPNA誘導体を、それらのHIF-1αアンチセンスエクソンスキッピング活性について、HeLa細胞内で評価した。これらのHIF-1α ASOについての生物学的例は、エクソンスキッピングが、標的プレmRNA内のスプライス部位をターゲティングする、式Iの化合物により、強力に誘導されることを例示する例として提示されるものであり、したがって、本発明の範囲を、HIF-1α ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[HIF-1αについての実施例1]
「HIF-ASO 2」により誘導されるエクソンスキッピング
表1で指定された「HIF-ASO 2」とは、[(5'→3')uguuaaguag│GAUAAGUUCU][配列中、「│」の記号は、イントロン-エクソン間の接合部を表す]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第2エクソンの3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、14量体のASOである。「HIF-ASO 2」は、第1イントロンとの、5量体の相補的な重複、及び第2エクソンとの、9量体の相補的な重複を保有する。
「HIF-ASO 2」を、HIF-1αについてのネステッドPCRにより、HeLa細胞内の、ヒトHIF-1αmRNAの第2エクソンのスキッピングを誘導する、その能力について評価した。援用された手順は、下記に提示する。
[細胞の培養及びASOによる処置]HeLa細胞(型番:CCL-2、ATCC)を、37℃、5%のCO2雰囲気下、10%のFBS(ウシ胎仔血清)、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、1%のL-グルタミン、及び1%のピルビン酸ナトリウムを補充した、5mLのEMEM培地を含有する、60mmの培養ディッシュ内で増殖させた。細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置した。ASOを、DDW中の適正な濃度に、系列希釈し、培養ディッシュにアリコート分割した。
[RNAの抽出]5時間後、製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを抽出した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[HIF-エクソン1_フォワード:(5'→3')CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT;HIF-エクソン8_リバース:(5'→3')AACCCAGACATATCCACC]のセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、50℃で40秒間、及び72℃で50秒間による39サイクルに従い、エクソンプライマー[HIF-エクソン1n_フォワード:(5'→3')TGAAGACATCGCGGGGAC;HIF-エクソン5n_リバース:(5'→3')TTTTTCACAAGG-CCATTTCT]のセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)にかけた。
ワンステップRT-PCR及びネステッドPCR増幅の、エクソン特異的プライマーのセットを、図17Aに、概略的にまとめる。
[「第2エクソンスキッピング」産物の同定]PCR産物を、サイズマーカーカクテルと共に、2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。観察されたPCRバンドは、図17Bで割り当てられる通り、全長mRNA(すなわち、エクソンスキッピングを伴わない)、及び第2エクソンを欠くスプライス変異体に対応した。ASOで処置された細胞は、第2エクソンのスキッピングに割り当てられるサイズの、強力なPCRバンドをもたらした。ASOによる処置を伴わない細胞(すなわち、陰性対照)もまた、第2エクソンのスキッピングに対応するPCR産物をもたらしたことから、第2エクソンは、ある程度、自発的に欠失することが示唆される。しかし、エクソンスキッピングバンドの強度は、ASOで処置された細胞において、ASOによる処置を伴わない細胞におけるより、はるかに強力であった。したがって、「HIF-ASO 2」は、HeLa細胞内の、第2エクソンのスキッピングを促進した。エクソンスキッピングバンドについてのシーケンシングデータを、図17Cに提示するが、これは、第1エクソンと、第3エクソンとの接合部についての、mRNA配列を顕示する。
[単一のASO分子により影響を受ける細胞の数]「HIF-ASO 2」は、10zMであってもなお、第2エクソンのスキッピングを誘導した。60mmの培養ディッシュ内の、5mLの培養培地中、10zM(すなわち、10-21M)の濃度では、約30個のASO分子が存在する。約30個のASO分子が、60mmの培養ディッシュ内、約100,000個のHeLa細胞内で、スキッピングを誘導したことを踏まえると、各ASO分子は、平均で、約3,000個のHeLa細胞内のエクソンスキッピングに影響を及ぼすか、又はこれを制御したと推定される。したがって、各ASO分子は、多数の細胞間を迅速に往還し、エクソンスキッピングに定められた、その役割を果たしたと考えられる。
[HIF-1αについての実施例2]
「HIF-ASO 2」によるHeLa細胞内のHIF-1αタンパク質発現の阻害
「HIF-ASO 2」を下記で記載される通り、HeLa細胞内の、HIF-1αタンパク質の発現を阻害する、その能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたHeLa細胞を0zM(陰性対照)、10zM、100zM、1aM、又は10aMの「HIF-ASO 2」で処置した。
[CoCl2による処理及び細胞の溶解]ASOによる処置の24時間後、ASOによる処置を伴わない1つを除き、培養ディッシュを、200μMのCoCl2で、さらに3時間にわたり処理して、プロピルヒドロキシラーゼ(PHD)の活性を抑制することにより、HIF-1αタンパク質レベルを上方調節した。次いで、細胞を、1mLの低温PBSで、2回にわたり洗浄し、1%のSDS及び1倍濃度のプロテイナーゼ阻害剤カクテル(cOmplete Mini、Roche)を補充した、1倍濃度のRIPA緩衝液(型番:9806、Cell Signaling Tech)200μLを伴う、氷上の溶解にかけた。溶解物を、1.5mLのeチューブ内に回収し、5倍濃度の試料緩衝液100μLと混合し、100℃で、5分間にわたり沸騰させた。溶解物を、8%のSDS-PAGEゲル上の電気泳動による分離にかけ、0.45μmのPVDF膜に転写した。膜は、抗HIF-1α抗体(型番:610958、BD Biosciences)及び抗β-アクチン抗体(型番:sc4778、Santa Cruz)でプローブした。
[HIF-1αタンパク質発現の阻害]図18Aは、「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内で得られた、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを提示する。HIF-1αバンドは、CoCl2処理を伴わない細胞の溶解物によっては検出されなかったが、CoCl2で処理された細胞の溶解物は、HIF-1αについての強力なバンドをもたらした。図18Bは、デンシトメトリーにより、各個別のβ-アクチンバンド強度に対して正規化された、個別のHIF-1αバンド強度を提示する。HIF-1α発現は、「HIF-ASO 2」濃度が増大するにつれて、徐々に低下した。10aMの「HIF-ASO 2」で観察された低下は、約75%であった。
[HIF-1αについての実施例3]
「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内のHIF-1αmRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
「HIF-ASO 2」を以下の通りに、ネステッドqPCRにより、HeLa細胞内の全長HIF-1αmRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたHeLa細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zM(各ASO濃度につき、2つずつの培養ディッシュ)の「ASO 2」で処置した。
[RNAの抽出]ASOによる処置の3時間後、製造元の指示書に従い、「MiniBEST Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)により、全RNAを抽出した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[HIF-エクソン1_フォワード:(5'→3')CTTGCCTTTCCTTCTCTTCT;HIF-エクソン8_リバース:(5'→3')AACCCAGACATATCCACC]のセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドqPCR]100倍に希釈されたcDNA 1μLを、以下の、エクソン特異的プライマー:[HIF-エクソン2n_フォワード:(5'→3')CTTGCTCATCAGTTGCCACTTC;HIF-エクソン2n_リバース:(5'→3')AAGTTTCCT-CACACGCAAATAG;HIF-エクソン3n_フォワード:(5'→3')GAAAGCACAGATGAATTGC;HIF-エクソン3n_リバース:(5'→3')TCATGTCACCATCATCTGT;HIF-エクソン4n_フォワード:(5'→3')CTAACTGGACACAGTGTGTTTG;HIF-エクソン4n_リバース:(5'→3')TCTGTGTGTAAGC-ATTTCTCTC;HIF-エクソン5n_フォワード:(5'→3')GCCTTGTGAAAAAGGGTAAAG;HIF-エクソン5n_リバース:(5'→3')CCATGTTGCAGACTTTATGT]のセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。PCR反応は、以下のサイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルに従い、SYBR Green(日本、タカラバイオ株式会社)でプローブした。
[HIF-1αmRNAエクソンレベルの変化]ASOにより処置された試料の、個別のエクソンレベルは、ASOによる処置を伴わない、各個別のエクソンレベルに対して正規化した。観察された、個別の相対エクソンレベルを、図18Cに提示する。全ての個別のエクソンレベルは、10zM及び100zMの「HIF-ASO 2」で処置された細胞内で、それぞれ、60〜80%及び50〜70%、有意に低下した。しかし、1,000zM(すなわち、1aM)の「HIF-ASO 2」で処置された細胞により得られた、個別のエクソンレベルは、ASOによる処置を伴わない細胞におけるエクソンレベルと異ならなかった。ASO濃度が、1,000zMに増大したときに、なぜエクソンレベルが上昇して、陰性対照のレベルに戻ったのかは、依然として解明されていないが、ともあれ、図18Cにおける、逆の用量反応パターンは、「HIF-1αについての実施例1」における、エクソンスキッピングの、逆の用量反応パターンと同等である(図17Aを参照されたい)。
[HIF-1αについての実施例4]
「HIF-ASO 2」で処置されたHeLa細胞内のHIF-1αmRNAについての、TaqManプローブによるqPCR
「HIF-ASO 2」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例3」において記載される通りに、ネステッドqPCRにより、HeLa細胞内の、全長HIF-1αmRNAの発現を阻害する、その能力について評価した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、51℃で40秒間、及び72℃で50秒間による20サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[HIF-エクソン1_フォワード(2):(5'→3')CGCGAACGACAAGAAAAA;HIF-エクソン8_リバース(2):(5'→3')CTGTGGTGACTTGTCCTTT]のセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドqPCR]100倍に希釈されたcDNA 1μLを、以下のサイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で10秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルに従い、ヒトHIF-1αの、第1エクソンと、第2エクソンとの接合部を検出するように設計されたTaqManプローブ(Hs00936371_m1、Thermo Fisher)を使用する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。
[HIF-1αmRNAレベルの変化]ASOにより処置された試料の全長mRNAレベルは、ASOによる処置を伴わないmRNAレベルに対して正規化した。観察された正規化mRNAレベルを、図18Dに提示する。全長HIF-1αmRNAレベルは、100zM及び1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置された細胞内で、それぞれ、65%及び55%、有意に(スチューデントのt検定により)低下した。全長mRNAレベルは、10zMの「ASO 2」で処置された細胞内では、変化しないままであった。
[HIF-1αについての実施例5]
「HIF-ASO 6」により誘導されるエクソンスキッピング
表1で指定された「HIF-ASO 6」とは、[(5'→3')uguuaaguag│GAUAAGUUCU]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位と完全に相補的な、17量体のASOである。「HIF-ASO 6」は、第1イントロンとの7量体の相補的な重複、及び第2エクソンとの10量体の相補的な重複を保有する。
「HIF-ASO 6」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例1」において記載される手順に従い、HIF-1αについてのネステッドPCRにより、HeLa細胞内の、ヒトHIF-1αmRNAの第2エクソンのスキッピングを誘導する、その能力について評価した。
PCR産物を、2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけ、電気泳動結果を、図19Aに提示する。第2エクソンのスキッピングは、「HIF-ASO 6」の全ての処置濃度において、頑健であった。「HIF-ASO 6」は、「HIF-ASO 2」より効果的に、第2エクソンのスキッピングを誘導した。全長HIF-1αmRNAについてのPCRバンドは、「HIF-ASO 6」の全ての濃度において、ほぼ完全に消滅した。その一方で、10〜1,000zMの「HIF-ASO 2」で処置された細胞内では、有意なレベルの、全長HIF-1αmRNAが残存した[図17Aを参照されたい]。
「HIF-ASO 6」は、「HIF-ASO 2」より、第2エクソンの3'側スプライス部位との、より多くの相補的な重複を保有し、これが、「HIF-ASO 6」により観察される、より高度なエクソンスキッピングの有効性の一因であろう。ASOの、標的スプライス部位への、より緊密な結合は、標的エクソンのスキッピングを、より有効に誘導すると考えられる。
[HIF-1αについての実施例6]
「HIF-ASO 6」によるHeLa細胞内のHIF-1αタンパク質発現の阻害
「HIF-ASO 6」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例2」において記載される手順に従い、HeLa細胞内の、HIF-1αの発現を下方調節する、その能力について評価した。図19Bは、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「HIF-ASO6」で、24時間にわたり処置されたHeLa細胞により得られた、ウェスタンブロットデータである。図19Cは、デンシトメトリーにより、各個別のβ-アクチンバンド強度に対して正規化された、個別のHIF-1αバンド強度を提示する。HIF-1αタンパク質の発現は、「HIF-ASO6」で処置された細胞内で、約45〜55%低下した。
[HIF-1αについての実施例7]
「HIF-ASO 6」で処置されたHeLa細胞内のHIF-1αmRNAについてのSYBR GreenによるqPCR
「HIF-ASO 6」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例4」における手順に従い、ネステッドqPCRにより、HeLa細胞内のHIF-1αmRNAの変化を誘導するその能力について評価した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、51℃で40秒間、及び72℃で50秒間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[HIF-エクソン1_フォワード(2):(5'→3')CGCGAACGACAAGAAAAA;HIF-エクソン8(2)_リバース:(5'→3')CTGTGGTGACTTGTCCTTT]のセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[HIF-1αmRNAエクソンレベルの変化]ASOによる処置を伴わない、個別のエクソンレベルに対して正規化された、個別のエクソンレベルを、図20(A)に提示する。エクソンレベルは、10、100、及び1,000zMの「HIF-ASO 6」で処置された細胞内で、それぞれ、35%、約30%、及び約45%、有意に(スチューデントのt検定)低下した。
[HIF-1αについての実施例8]
「ASO 6」で処置されたHeLa細胞内のHIF-1αmRNAについてのTaqManプローブによるqPCR
「HIF ASO 6」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例4」において記載される通りに、ネステッドqPCRにより、HeLa細胞内の全長HIF-1αmRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
[全長HIF-1αmRNAレベルの変化]ASOにより処置された試料の全長mRNAレベルは、ASOによる処置を伴わないmRNAレベルに対して正規化した。観察された相対mRNAレベルを、図20(B)に提示する。全長HIF-1αmRNAレベルは、100zM及び1,000zM(1aM)の「HIF-ASO 6」で処置された細胞内で、それぞれ、約60%及び80%、有意に(スチューデントのt検定)低下した。しかし、全長mRNAレベルは、10zMの「HIF-ASO 6」で処置された細胞内では、変化しないままであった。
[HIF-1αについての実施例9]
「HIF-ASO 1」により誘導されるエクソンスキッピング
「HIF-ASO 1」とは、[(5'→3')uguuaaguag│GAUAAGUUCUGAA]の23量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、14量体のASOである。「HIF-ASO 1」は、第1イントロンとの、3量体の相補的な重複、及び第2エクソンとの、11量体の相補的な重複を保有する。
「HIF-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例1」において記載される通りに、HIF-1αmRNA内のエクソンスキッピングを誘導するその能力について評価した。HeLa細胞を、0(陰性対照)、1、3、10、30、又は100aMの「HIF-ASO 1」で、24時間にわたり処置し、その後、総RNAを抽出し、HIF-1αについてのネステッドPCRにかけて、エクソンスキッピングを検出した。
[エクソンスキッピングデータ]図21Aは、ネステッドPCR産物により得られる電気泳動データ、及び第2〜3エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCR産物についてのサンガーシーケンシングデータを提示する。全長mRNAレベルは、ASO濃度が、1aMから、100aMに増大するにつれて、低下する傾向があった。第2エクソンのスキッピングは、3aM及び10aMの「HIF-ASO 1」により、優勢であった。しかし、ASO濃度が、100aMまで増大すると、第2〜3エクソンのスキッピングが最優勢となった。第2〜3エクソンのスキッピング生成物についてのPCR産物は、サンガーシーケンシングにより明確に確認された[図21A右を参照されたい]。
[HIF-1αについての実施例10]
「HIF-ASO 1」によるHeLa細胞内のHIF-1αタンパク質発現の阻害
「HIF-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例2」において記載される手順に従い、HeLa細胞内の、HIF-1αタンパク質の発現を阻害する、その能力について評価した。本実施例では、HeLa細胞を、0zM(陰性対照)、100zM、300zM、1aM、3aM、10aM、30aM、100aM、又は300aMの「HIF-ASO 1」で、72時間にわたり処置してから、200μMのCoCl2と共に3時間インキュベートすることにより、PHDの活性を抑制した。陰性対照、すなわち、0zMの「HIF-ASO 1」の培養ディッシュは、4つとした。
図21Bは、HeLa細胞溶解物により得られた、HIF-1αについてのウェスタンブロットデータを提示する。HIF-1αタンパク質レベルは、陰性対照の溶解物中において、「HIF-ASO 1」で処置された細胞の溶解物中より、大幅に高かった。図21Cは、デンシトメトリーにより、β-アクチンバンド強度に対して正規化された、個別のHIF-1αバンド強度を提示する。HeLa細胞内のHIF-1α発現は、0.1〜300aMの「HIF-ASO 1」を伴う、72時間のインキュベーションにより、40〜80%低下した。
[HIF-1αについての実施例11]
「HIF-ASO 12」により誘導されるエクソンスキッピング
表2で指定された「HIF-ASO 12」とは、[(5'→3')uguuuacag│UUUGAACTAAC]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトHIF-1αプレmRNA内の、第3イントロンと、第4エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、15量体のASOである。「HIF-ASO 12」は、第3イントロンとの6量体の重複、及び第4エクソンとの9量体の重複を保有する。
「HIF-ASO 12」を、HIF-1αについてのネステッドPCRにより、HeLa細胞内の、ヒトHIF-1αmRNAの第4エクソンのスキッピングを誘導する、その能力について評価した。HeLa細胞を、「HIF-ASO 12」と共に、6時間にわたりインキュベートし、次いで、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例1」において記載されているプロトコールに従い、全RNAの抽出にかけた。
図22Aは、「HIF-ASO 12」で処置されたHeLa細胞内の、HIF-1αについてのネステッドPCRデータを提示する。第2〜4エクソンのスキッピングに割り当てられるエクソンスキッピングバンドは、ASOで処置された細胞の、全てのPCR産物中で検出されたが、非処置細胞のPCR産物中では検出されなかった(左図を参照されたい)。エクソンスキッピングバンドの強度は、100zMの「HIF-ASO 12」のときに、最も強かった。全長mRNAのバンドの強度は、100zMの「HIF-ASO 12」のときに、最も低下した。第2〜4エクソンのスキッピングは、右図に提示される通り、サンガーシーケンシングにより確認された。
[HIF-1αについての実施例12]
「HIF-ASO 12」によるHeLa細胞内のHIF-1αタンパク質発現の阻害
「HIF-ASO 12」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例2」において記載される通りに、HeLa細胞内のHIF-1αの発現を阻害するその能力について評価した。
[ASOによる処置]HeLa細胞を、0zM(陰性対照)、10zM、100zM又は1aMの「HIF-ASO 12」で処置した。3つの培養ディッシュを、陰性対照とした。21時間後、細胞を、陰性対照のディッシュ1つを除き、200μMのCoCl2で処理した。3時間後、全ての細胞を、以下の通りに、氷上の溶解にかけた。細胞を、1mLの低温PBSで、2回にわたり洗浄し、次いで、HIF-1αの分解を最小限とするように、2倍濃度のLaemmli試料緩衝液(24mMのトリス-HCl、20%のグリセロール、0.8%のSDS、0.04%のブロモフェノールブルー、2%のβ-メルカプトエタノール)200μLによる溶解にかけた。各溶解物を、1.5mLのeチューブ内に回収し、5分間にわたり沸騰させた。次いで、溶解物を、8%のSDS-PAGEゲル上のウェスタンブロットにかけた。
図22Bは、HIF-1αバンドの強度が、1及び10aMの「HIF-ASO 12」で処置された細胞内で、明確に低下したことを示す、ウェスタンブロットデータを提示する。
[HIF-1αについての実施例13]
「HIF-ASO 12」で処置されたHeLa細胞内のHIF-1αmRNAについてのSYBR GreenによるqPCR
「HIF-ASO 12」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「HIF-1αについての実施例3」において記載されている通りに、HIF-1αネステッドqPCRにより、HeLa細胞内の、HIF-1αmRNAの変化を誘導する、その能力について評価した。HeLa細胞を「HIF-ASO 12」で6時間にわたり処置し、次いで、全RNAの抽出にかけた。
図22Cは、qPCRデータを提示するが、ここで、第2エクソン及び第3エクソンのmRNAレベルは、ASOで処置された細胞内で、70〜80%、有意に(スチューデントのt検定)低下した。qPCR所見は、「HIF-ASO 12」により誘導される、第2〜4エクソンのスキッピングと符合する(「HIF-1αについての実施例11」を参照されたい)。
AR ASOの、in vitro活性及びin vivo活性についての例
ヒトアンドロゲン受容体(AR)プレmRNA内の、第5エクソンと、第5イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、式IのPNA誘導体を、それらのARアンチセンスエクソンスキッピング活性について、細胞においても、マウスにおいても評価した。これらのAR ASOについての生物学的例は、エクソンスキッピングが、標的プレmRNA内のスプライス部位をターゲティングする、式Iの化合物により、強力に誘導されることを例示する例として提示されるものであり、したがって、本発明の範囲をAR ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[ARについての実施例1]
「AR-ASO 1」により誘導されるエクソンスキッピング
表3で指定された「AR-ASO 1」とは、ヒトアンドロゲン受容体(AR)プレmRNA内の、第5エクソンと、第5イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、13量体のASOである。「AR-ASO 1」は、[(5'→3')GCCUUGCCUG│guaaggaaaa]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、13量体の配列に相補的に結合する。「AR-ASO 1」は、第5エクソンとの8量体の重複及び第5イントロンとの5量体の重複を保有する。
「AR-ASO 1」を以下の通りに、ARネステッドPCRにより、MCF7細胞内のヒトAR mRNAの第5エクソンのスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]MCF7細胞(型番:HTB-22、ATCC)を、37℃、5%のCO2雰囲気下、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、及び0.01mg/mLのウシインスリンを補充した、EMEM培地中で維持した。60mmの培養ディッシュ内で増殖させた細胞を、0(陰性対照)、3、30、300、又は3,000aM(すなわち、3fM)の「AR-ASO 1」で、3時間にわたり処置した。
[RNAの抽出]製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを抽出した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]100ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による39サイクルに従い、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)及びエクソン特異的プライマー[AR-エクソン3_フォワード:(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC;及びAR-エクソン9_リバース:(5'→3')GGGT-GTGGAAATAGATGGG]のセットを使用する、25μLの逆転写反応において使用した。
[ネステッドPCRによる増幅]増幅過程を通して、1つの特殊なアニーリング温度(すなわち、従来型のPCR法)ではなく、温度範囲にわたり、効率的かつ特異的に働く、固有の増幅法(サイクルごとにアニーリング温度を上昇させる改良法)を使用した。1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:初期の10サイクル[94℃で30秒間、47℃で40秒間(サイクルごとに+0.5℃)、72℃で40秒間]に続く、20サイクル[94℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で40秒間]に従い、エクソン特異的プライマー[AR-エクソン3_フォワード:(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC;及びAR-エクソン7n_リバース:(5'→3')GGGGTGATTTGGAGC-CAT]のセットを使用する、20μLのネステッドPCR反応によりさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]PCR産物を、2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。図23Aには、ARの第5エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体に割り当てられる、3つの処置関連のPCR産物バンドが見られる。「AR-ASO 1」は、第5エクソン、第4〜5エクソン、及び第4〜6エクソンのスキッピングを誘導することが見出されたが、スキッピング産物の比は、ASO濃度に依存すると考えられた。図23Bは、図23Aにおける、第4〜5エクソンのスキッピングバンドについての、実際のシーケンシングデータを提示する。
[ARについての実施例2]
「AR-ASO 1」による、MCF7細胞内の、ARタンパク質の発現の阻害
5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ中のMCF7細胞を、0zM(陰性対照)又は10zM〜30aMの「AR-ASO 1」で処置した。4つの培養ディッシュを、陰性対照とした。48時間後、細胞を、低温PBSで、2回にわたり洗浄し、次いで、1倍濃度のプロテアーゼ阻害剤(型番:P8340、Sigma)を補充した、1倍濃度の細胞溶解緩衝液(型番:9803、Cell Signaling Tech)200μLを伴う溶解にかけた。溶解物を、1.5mLのeチューブ内に回収した。200μLずつの各溶解物を、3倍濃度の試料緩衝液100μLと混合し、5分間にわたり沸騰させた。20μLずつの各溶解物(4例の陰性対照及び8例のASO処置試料)を、8%のSDS-PAGEゲル上の電気泳動による分離にかけ、PVDF膜に転写した。膜は、抗AR抗体(型番:5153、Cell Signaling Tech)及び抗β-アクチン抗体(型番:sc4778、Santa Cruz)でプローブした。図23Cは、0zM(4例の陰性対照)〜30aMの「AR-ASO 1」で処置されたMCF7細胞内で得られた、ARについてのウェスタンブロットデータを提示する。ASOで処置された溶解物のARバンド(120Kのサイズ)強度は、陰性対照である、それらの隣接する溶解物の強度より弱かった。
[ARについての実施例3]
「AR-ASO 1」で処置されたMCF7細胞内のAR mRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
[ASOによる処置及びRNAの抽出]5mLの培養培地中のMCF7細胞を、0zM(陰性対照)又は1zM〜1aM(濃度1つ当たり2つずつの培養ディッシュ)の「AR-ASO 1」で処置した。5時間後、製造元の指示書(型番:9767、タカラバイオ株式会社)に従い、「MiniBEST Universal RNA Extraction Kit」を使用して、全RNAを抽出した。
[オリゴdTによる、cDNAの合成]500ngのRNA鋳型を、製造元の指示書(型番:6110A、タカラバイオ株式会社)に従い、「oligo-dT」に対する、cDNA合成にかけた。
[一次PCR]次いで、cDNAを、以下のサイクル条件:94℃で2分間に続く、94℃で15秒間、55℃で30秒間、及び72℃で2分間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[AR-エクソン3_フォワード:(5'→3')TGGGTGTCACTATGGAGC;及びAR-エクソン9_リバース:(5'→3')GGGTGTGGAAATAGATGGG]のセットに対する、一次PCRにかけた。
[ネステッドPCR]一次PCR産物を、2,000倍に希釈し、希釈された各PCR産物1μLずつを、エクソン特異的プライマー[AR-エクソン4_フォワード(q):(5'→3')GACCATGTTTTGCCCATTG;AR-エクソン4_リバース(q):(5'→3')GGCTCTTTTGAAGAAGACC;AR-エクソン5_フォワード(q):(5'→3')GAAACAGAAGTACCTGTGC;AR-エクソン5_リバース(q):(5'→3')GTCATCCCTGCTTC-ATAAC;AR-エクソン6_フォワード(q):(5'→3')CGGAAGCTGAAGAAACTTG;AR-エクソン6_リバース(q):(5'→3')CACTTGACCACGTGTACAAG]のセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。PCR反応は、SYBR Green(日本、タカラバイオ株式会社)によりプローブした。サイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルであった。エクソンレベルは、用量が、1zMから、100zMに増大するにつれて、徐々にではあるが、有意に低下した。低下は、100zMの「AR-ASO 1」で処置された細胞の40〜50%であった[図24Aを参照されたい]。しかし、エクソンレベルは、1aMの「AR-ASO 1」で処置された細胞内の陰性対照レベルにほぼ戻った。
[ARについての実施例4]
「AR-ASO 5」で処置されたMCF7細胞内のAR mRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
表3で指定された「AR-ASO 5」とは、ヒトARプレmRNA内の、第5エクソンと、第5イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、12量体のASOである。「AR-ASO 5」は、[(5'→3')GCCUUGCCUG│guaaggaaaa]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、12量体の配列に相補的に結合する。「AR-ASO 5」は、第5エクソンとの7量体の重複及び第5イントロンとの5量体の重複を保有する。
「AR-ASO 5」を、qPCRにより「ARについての実施例3」において記載されている方法に従い、AR mRNAエクソンレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。図24Bに提示される通り、ARエクソンレベルは、1〜1,000zMの「AR-ASO 5」で処置された細胞内で、約60〜80%有意に(スチューデントのt検定)低下した。
「AR-ASO 1」の場合(「ARについての実施例3」を参照されたい)と異なり、1,000zMの「AR-ASO 5」では、エクソンメッセージレベルのリバウンドが見られなかった。
[ARについての実施例5]
「AR-ASO 5」で処置されたMCF7細胞内のAR mRNAについてのTaqManプローブによるqPCR
「AR-ASO 5」をTaqManプローブを採用するqPCRにより、ヒトAR mRNAを下方調節するその能力について評価した。
MCF7細胞を、0zM(陰性対照)〜1aM(濃度1つ当たり2つずつのディッシュ)の「AR-ASO 5」で処置した。24時間後、製造元の指示書(型番:9767、タカラバイオ株式会社)に従い、「MiniBEST Universal RNA Extraction Kit」により、全RNAを抽出した。
400ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[AR-エクソン3_フォワード:(5'→3')TGGGT-GTCACTATGGAGC;及びAR-エクソン9_リバース:(5'→3')GGGTGTGGAAATAGATGGG]のセットに対して、One-Step RT-PCR kit(Invitrogen)によるcDNA合成にかけた。
50倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で15秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルに従い、[AR-エクソン4_フォワード(q2):(5'→3')TTGTCCATCTTGTCGTCTT;及びAR-エクソン5_リバース(q2):(5'→3')CCTCTCCTTCCTC-CTGTA]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。qPCR反応は、[(5'→3')TTTCTTCAG-ZEN-CTTCCGGGCTC-3IABkFQ]のTaqManプローブでモニタリングした。TaqManプローブは、全長AR mRNA内の、第4エクソンと、第5エクソンとの接合部をプローブするように設計した。
図24Cは、TaqManプローブによるqPCRデータを提示する。全長AR mRNAの相対発現は、1zM〜1aMの「AR-ASO 5」で処置された細胞内で、約50〜70%有意に(スチューデントのt検定)低下した。
[ARについての実施例6]
「AR-ASO-5」で皮下処置されたマウスの皮膚内の、ARタンパク質の発現の阻害
「AR-ASO 5」は、ヒト及びマウスにおいて保存されているARプレmRNA配列をターゲティングする。「AR-ASO 5」を以下の通りに、単回の皮下投与後におけるマウスの皮膚内のARタンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
[体毛の除去及び群分け]0日目に、7週齢の雄C57BL/6マウスに、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけ、背部における体毛を、バリカンで刈り、カーボワックスがけすることにより除去した。5日目に、体毛除去の完全な(すなわち、残毛斑のない)マウスを選択し、0ピコモル/Kgの(媒体だけの陰性対照)、1ピコモル/Kg、10ピコモル/Kg、100ピコモル/Kg、及び1,000ピコモル/Kgの「AR-ASO 5」の5群に、無作為に割り付けた(群1つ当たりの動物6匹)。
[ASO注射液及び投与]「AR-ASO 5」の水性母原液を、0.1%のTween 80を補充したPBS中で系列希釈して、0nM(媒体だけの陰性対照)、0.5nM、5nM、50nM、又は500nMの「AR-ASO 5」溶液を調製した。5日目に、各用量群内の個別のマウスの首筋(すなわち、頸部近傍)に、2mL/kgの被験薬の単回注射を皮下投与した。
[皮膚試料の抽出]10日目に、動物を屠殺して、注射部位、及び非注射部位としての臀部から、皮膚試料を得た。サンプリングの直後に、皮膚試料を、液体窒素中で凍結させた。各皮膚試料を、液体窒素による試料の凍結を維持しながら、微粉化した。微粉化された試料を、1%のSDSを補充した、RIPA緩衝液による溶解にかけた。溶解物を、5倍濃度の試料緩衝液と混合し、5分間にわたり沸騰させた。
[ARについてのウェスタンブロット]溶解物を、PVDF膜上の、ARについてのウェスタンブロットにかけた。合計10例の溶解物を、各群からの個別の溶解物を2例ずつとして、各々10%のPAGEゲル上に投入した。ARタンパク質(120キロドルトン)は、ARポリクローナル抗体(N-20、sc-816、Santa Cruz)でプローブした。
[ARタンパク質発現の定量化]単一のPVDF膜上の、各ARバンドは、個別のβ-アクチンバンドに対して正規化した。陰性対照群(すなわち、ASOによる処置を伴わない)の2例の試料の、平均ARバンド強度(β-アクチンに対して正規化された)を使用して、同じPVDF膜上の、他の8例の試料のARバンド強度を正規化した。このような二重の正規化を、他の2つのPVDF膜に適用して、デンシトメトリーにより、個別の試料の、ARタンパク質発現を定量化した。個別の試料の二重の正規化の後における、全てのAR発現レベルを、ASOによる処置を伴わない発現レベルに対する、スチューデントのt検定による統計学的解析のためにプールした。
[ARタンパク質発現の阻害]図25A及び25Bは、注射部位及び非注射部位のそれぞれに由来する皮膚試料により得られた、ARについてのウェスタンブロットデータである。
図26Aは、群ごとのARタンパク質発現レベル、並びに対象ごとのARタンパク質発現レベルを提示する。注射部位及び非注射部位のいずれにおいても、ARタンパク質の発現には、大きな程度の対象間のばらつきが見られた。しかし、ARの発現は、ASOの用量が増大するにつれ、低下する傾向があった。
図26Bは、陰性対照群に対して正規化された群ごとの、平均AR発現レベルを提示する。注射部位では、ARタンパク質の発現は、1,000ピコモル/Kgの「AR-ASO5」群内で、約35%、有意に低下した。非注射部位では、ARタンパク質の発現は、100及び1,000ピコモル/Kgの処置群内で、約40%、有意に低下した。
注射部位に対して遠位の皮膚において観察された、ARタンパク質発現の阻害は、ASOが、皮下注射後における全身循環を介して、投与部位に対して遠位の組織に、たやすく分布しうることを裏付ける。ex vivoにおける所見は、式IのPNA誘導体の皮下注射後における、全身標的への係合を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものと解釈されるべきではない。
[ARについての実施例7]
「AR-ASO 1」により誘導されるエクソンスキッピング(2)
継代、細胞密度、及び培養条件に応じて、MCF7細胞の形状は、変動した。早期継代におけるMCF細胞は、比較的急速に増殖し、積雲形のコロニーを示す傾向があった。後期継代におけるMCF7細胞は、緩慢に増殖し、平坦な上皮コロニーを形成する可能性が高い。しかし、積雲形状を示すMCF7細胞を維持することは、困難であった。
「AR-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「ARについての実施例1」において記載されている通りに、大まかに、積雲形の形状を示すMCF7細胞内の、そのエクソンスキッピング能について評価した。
[ASOによる処置]MCF7細胞を0(陰性対照)、30、100、又は1,000aM(すなわち、1fM)の「AR-ASO 1」で、3時間にわたり(ASO濃度1つ当たり、2つずつの培養ディッシュ)処置した。
[RNAの抽出]製造元の指示書に従い、RNeasy mini prep kit(型番:74104、Qiagen)を使用して、全RNAを抽出した。500ngのRNA鋳型を、25μLの逆転写反応にかけた。
[エクソンスキッピングの結果]図27Aは、ネステッドRT-PCR産物により得られた、電気泳動データを提示する。第5エクソンのスキッピング(サンガーシーケンシングにより確認された:図27Bを参照されたい)は、ASOで処置された細胞内では、明確に優勢であり、これは、「ARについての実施例1」の場合(図23Aを参照されたい)と対比されるであろう。
SCN9A ASOの、in vitro活性及びin vivo活性についての例
ヒトSCN9A(9A亜型ナトリウムチャネル)プレmRNA内の、複数のスプライス部位を、相補的にターゲティングする、式IのPNA誘導体を、それらのSCN9Aアンチセンス活性及びエクソンスキッピング活性について、細胞においても、動物においても評価した。これらのSCN9A ASOについての生物学的例は、エクソンスキッピングが、標的プレmRNA内のスプライス部位をターゲティングする、式Iの化合物により、強力に誘導されることを例示する例として提示されるものであり、したがって、本発明の範囲をSCN9A ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[SCN9Aについての実施例1]
「SCN-ASO 7」により誘導されるエクソンスキッピング
表4で指定された「SCN-ASO 7」とは、ヒトSCN9A遺伝子(NCBI基準配列:NC_000002.12からアクセスされた)から読み取られた、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、16量体のASOである。「SCN-ASO 7」は、[(5'→3')UUGUUUUUGC│guaaguacuu]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、16量体の配列に相補的に結合する。「SCN-ASO 7」は、第4エクソンとの10量体の重複及び第4イントロンとの6量体の重複を保有する。
PC3細胞は、ヒトSCN9AプレmRNAを、夥多に発現させることが公知である[Br. J. Pharmacol. 156巻、420-431 (2009)]ことを踏まえ、「SCN-ASO 7」を以下の通りに、SCN9A ネステッドPCRにより、PC3細胞内のヒトSCN9AプレmRNA内の第4エクソンのスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]PC3細胞(型番:CRL- 1435、ATCC)を、37℃、5%のCO2雰囲気下、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、1%のL-グルタミン、及び1%のピルビン酸ナトリウムを補充した、ハムF-12K培地中で維持した。
5mLの培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたPC3細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」で処置した。
[RNAの抽出]インキュベーションの18時間後、PC3細胞を、リボソームによる翻訳を中止させるために、100μg/mLのシクロヘキシミドで、さらに6時間にわたり処置した。次いで、製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを、細胞から抽出した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で2分間による40サイクルに従い、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)及びエクソン特異的プライマー[SCN-エクソン2_フォワード:(5'→3')CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT、及びSCN-エクソン9_リバース:(5'→3')CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]のセットを使用する、25μLの逆転写反応に使用した。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNA溶液(100倍に希釈された)を、以下のサイクル条件:95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による35サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[SCN-エクソン3n_フォワード:(5'→3')GGACCA-AAAATGTCGAGTATTT;及びSCN-エクソン8_リバース:(5'→3')GCTAAGAAGGCCCAGC-TGAA]のセットに対して、ネステッドPCR(型番:K2612、Bioneer)による、20μlのPCR増幅にかけた。
「SCN-エクソン3n_フォワード」のプライマーは、第4エクソンの欠失を有効にプローブするように、第3エクソンと、第5エクソンとの接合部をターゲティングするが、22量体のプライマーは、第3エクソンと、第4エクソンとの接合部との、18量体の相補的な重複を、なおも保持することが注目される。したがって、「SCN-エクソン3n_フォワード」は、全長SCN9A mRNA内に見出される、「第3エクソンと、第5エクソンとの接合部」を、「第3エクソンと、第4エクソンとの接合部」より選択的に認識する。プライマーの配列は、第4エクソンを欠く、SCN9Aのスプライス変異体を、全長SCN9A mRNAより高感度に検出するように設計した。全長mRNAは、数十億年にわたる進化を通して獲得された、良好な代謝的安定性を示す傾向があるので、このようなエクソンスキッピングプライマーは、代謝的安定性が低下した、mRNAのスプライス変異体を検出するのに有用であろう。
[エクソンスキッピング産物の同定]ネステッドPCR産物を、2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。第4エクソンのスキッピングは、1aMの「SCNASO7」で処置されたPC3細胞内で、著しく強力であったが、第4エクソンのスキッピングは、図28Aにおいて示される通り、10及び100zMでもまた、目視可能であった。エクソンスキッピングバンドは、図28Bに提示される通り、サンガーシーケンシングにより明確に確認された。
[SCN9Aについての実施例2]
「SCN-ASO 7」で処置されたPC3細胞内のSCN9A mRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
「SCN-ASO 7」を、以下の通りに、エクソン特異的プライマーのセットに対するqPCRにより、PC3細胞内のヒトSCN9A mRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたPC3細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」と共に、24時間にわたりインキュベートした(濃度1つ当たり2つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出]製造元の指示書に従い、「MiniBEST Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを抽出した。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)及びエクソン特異的プライマー[SCN-エクソン2_フォワード:(5'→3')CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT;及びSCN-エクソン9_リバース:(5'→3')TTGCCTGGTTCTGTTCTT]のセットを使用する、20μLの逆転写反応にかけた。サイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で15秒間、55℃で30秒間、及び72℃で2分間による15サイクルである。
[ネステッドqPCRによる増幅]50倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、エクソン特異的プライマー[SCN-エクソン4_フォワード:(5'→3')GTACACTTTTACTGGAATATATAC;SCN-エクソン4_リバース:(5'→3')AATGACGACAAAATCCAGC;SCN-エクソン5_フォワード:(5'→3')GTATTTAACAGAAT-TTGTAAACCT;SCN-エクソン5_リバース:(5'→3')CTGGGATTA-CAGAAATAGTTTTCA;SCN-エクソン6_フォワード:(5'→3')GAAGACAATTGTAGGGGC;SCN-エクソン6_リバース:(5'→3')GTCTTCTTCACTCTCTAGGG]のセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。PCR反応は、SYBR Green(日本、タカラバイオ株式会社)でプローブした。サイクル条件:95℃で30秒間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルである。
[qPCRの結果]ASOで処置された細胞の、個別のエクソンレベルは、陰性対照細胞(すなわち、ASOによる処置を伴わない)のエクソンレベルに対して正規化した。図29(A)は、qPCRの結果についてまとめる。第4〜6エクソンの発現レベルは、10、100、及び1,000zMにおいて、それぞれ、約70%、40%、及び20〜30%、有意に低下した。
[SCN9Aについての実施例3]
「SCN-ASO 3」で処置されたPC3細胞内のSCN9A mRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
表4で指定された「SCN-ASO 3」とは、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位をターゲティングする、14量体のASOである。「SCN-ASO 3」は、[(5'→3')UUGUUUUUGC│gua"ag"uacuu][配列中、2つのミスマッチは、引用符(“")でマークされる]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、12量体の配列に相補的に結合する。「SCN-ASO 3」は、第4エクソンとの、7量体の相補的な重複、及び第4イントロンとの、5量体の相補的な重複を保有する。
「SCN-ASO 3」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例2」において記載されているプロトコールに従い、PC3細胞内の全長SCN9A mRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
qPCRの結果を、図29Bにまとめられる通りに提示する。第4〜6エクソンの発現レベルは、10、100、及び1,000zMにおいて、それぞれ、>90%、約70%、及び約80%、有意に低下した。「SCN-ASO 7」の場合と同様に、10zMが、全長SCN9A mRNAの、最も強力な阻害を顕示した。
[SCN9Aについての実施例4]
「SCN-ASO 8」で処置されたPC3細胞内のSCN9A mRNAについての、SYBR GreenによるqPCR
表4で指定された「SCN-ASO 8」とは、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンと、第4イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域をターゲティングする、17量体のASOである。「SCN-ASO 8」は、[(5'→3')UUGUUUUUGC│gua"ag"uacuu][配列中、ミスマッチは、引用符(“")でマークされる]の20量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、15量体の配列に相補的に結合する。「SCN-ASO 8」は、ヒトSCN9AプレmRNA内の、第4エクソンとの、10量体の相補的な重複、及び第4イントロンとの、5量体の相補的な重複を保有する。
「SCN-ASO 8」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例2」において記載されているプロトコールに従い、PC3細胞内の全長SCN9A mRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
qPCRの結果を、図29Cにまとめられる通りに提示する。第4〜6エクソンの発現レベルは、10及び100zMにおいて、それぞれ、50〜70%及び70〜80%、有意に低下した。
[SCN9Aについての実施例5]
「SCN-ASO 7」で処置されたPC3細胞内のCoroNaアッセイによる、ナトリウム電流の阻害
細胞におけるナトリウム電流は、パッチクランプにより測定する。ナトリウムイオンが、細胞に進入すると、細胞内ナトリウムイオンレベルは、上昇する。細胞内ナトリウムレベルは、ナトリウムイオン感受性染料を使用して、プローブすることができる。「CoroNa Green」とは、クラウンエーテル型の、ナトリウムイオンキレート剤を伴う染料である。ナトリウムイオンとキレート化すると、「CoroNa Green」は、緑色の蛍光を発する。「CoroNa Green」は、細胞内ナトリウムレベルを、間接的に測定するのに使用されている。「CoroNa Green」により測定されるナトリウムレベルは、ナトリウムイオンについてのパッチクランプにより測定されるナトリウムイオン電流と、よく相関することが見出された[Proc. Natl. Acad. Sci. USA、106(38)巻、16145〜16150 (2009)]。
PC3細胞は、他のSCN亜型も、同時に発現させるが、ヒトSCN9A mRNAを、夥多に発現させることが公知である。[Br. J. Pharmacol.、156巻、420〜431 (2009)]。したがって、Nav 1.7ナトリウムチャネル亜型によるナトリウムイオン電流が、PC3細胞内の、全ナトリウムイオン電流のうちの、顕著な部分を占める場合、SCN9A mRNA発現の阻害は、PC3細胞内のナトリウム電流の大幅な低減をもたらしうる。SCN9A mRNAが、Nav 1.7ナトリウムチャネル亜型をコードすることは、注目に値する。
「SCN-ASO 7」を以下の通りに、「CoroNa Green」を使用して、PC3細胞内のナトリウムイオン電流を阻害するその能力について評価した。
[ASOによる処置]2mLのF-12K培地を含有する、35mmの培養ディッシュ内で増殖させたPC3細胞を、0zM(陰性対照)、100zM又は1aMの「SCN-ASO 7」で処置した。
[CoroNaアッセイ]30時間後、細胞を、2mLのHBSS(Hank's Balanced Salt Solution、型番:14025-092、Life Technologies)で洗浄し、2mLの新鮮なHBSSを投入した。次いで、細胞を、37℃で、5μMの「CoroNa Green」(型番:C36676、Life Technologies)により処置した。30分後、細胞を、2mLのHBSSで、2回にわたり洗浄し、2mLの新鮮なHBSSを投入した。培養ディッシュを、ディジタル式ビデオカメラを装備したOlympus製の蛍光顕微鏡にマウントして、細胞の緑色蛍光画像を、持続的に捕捉した。細胞を、100mMのNaClで、短時間にわたり処置し、次いで、細胞の蛍光画像の変化を、3分間にわたり、ディジタル式に記録した。フレーム1つ当たり、平均で、約4個の細胞が見られた。各個別の細胞による蛍光強度は、秒単位の分解能で追跡した。個別の細胞による細胞内蛍光強度についての出力波形を、各時点において、重ね合わせ、平均した。ImageJプログラム(version 1.50i、NIH)を使用して、各ASO濃度の、個別の細胞による出力波形の平均を、図30Aに提示される通りにプロットした。平均蛍光強度の出力波形を、0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 7」で処置された細胞についての、個別の細胞内ナトリウム濃度の出力波形として理解した。
[CoroNaアッセイの結果]観察された細胞蛍光強度の出力波形を、図29Bにまとめる。1,000zMの「SCN-ASO 7」で処置された細胞についての、蛍光強度の出力波形は、ASOによる処置を伴わない細胞についての出力波形より低値をとる。ASOによる処置を伴わない細胞の平均蛍光強度は、100秒後において、81.86(任意単位)であった。その一方で、1,000zMの「SCN-ASO 7」で処置された細胞の平均蛍光強度は、100秒後において、51.47(任意単位)であった。こうして、1,000zMの「SCN-ASO 7」を伴う、30時間にわたるインキュベーションは、PC3細胞内のナトリウムチャネル活性の、37%の有意な低減(スチューデントのt検定によるp<0.05)を誘導した。PC3細胞が、電位依存性ナトリウムチャネル(VGSC)の多様な亜型を発現させることを考慮すれば、37%の低下は、「SCN-ASO 7」によるNav 1.7発現の阻害について、顕著であると理解される。100zMの「SCN-ASO 7」で処置された細胞内では、ナトリウム電流の顕著な低下は見られなかった。
[SCN9Aについての実施例6]
「SCN-ASO 3」で処置されたPC3細胞内のCoroNaアッセイによる、ナトリウム電流の阻害
「SCN-ASO 3」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例5」において記載されているプロトコールに従い、「CoroNa Green」を使用して、PC3細胞内のナトリウム電流を阻害するその能力について評価した。
観察された細胞蛍光強度の出力波形を、図30Bに提示する。蛍光強度の平均出力波形は、「SCN-ASO 3」で処置された細胞内では、ASOによる処置を伴わない細胞内より低値をとる。ASOによる処置を伴わない細胞の平均細胞蛍光強度は、100秒後において、89.32(任意単位)であった。その一方で、1,000zMの「SCN-ASO 3」で処置された細胞の平均細胞蛍光強度は、100秒後において、61.36(任意単位)であった。したがって、1,000zMの「SCN-ASO 3」は、PC3細胞内のナトリウム電流を、31%、有意に(p<0.01)低下させた。100zMの「SCN-ASO 3」により誘導される低下は、18%であるが、有意性を伴わなかった。
[SCN9Aについての実施例7]
「SCN-ASO 8」で処置されたPC3細胞内の、ナトリウム電流の阻害
「SCN-ASO 8」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例3」において記載されているプロトコールに従い、「CoroNa Green」を使用して、PC3細胞内のナトリウム電流を阻害するその能力について評価した。
観察された細胞蛍光強度の出力波形を、図30Cに提示する。蛍光強度の平均出力波形は、「SCN-ASO 8」で処置された細胞内では、ASOによる処置を伴わない細胞内より低値をとる。ASOによる処置を伴わない細胞の平均細胞蛍光強度は、100秒後において、130.32(任意単位)であった。その一方で、1,000zMの「SCN-ASO 8」で処置された細胞の平均細胞蛍光強度は、100秒後において、89.7(任意単位)であった。したがって、1,000zMの「SCN-ASO 8」は、PC3細胞内のナトリウム電流を、31%、有意に(p<0.001)低下させた。100zMの「SCN-ASO 8」により誘導される低下は、30%であった(p<0.001)。
[SCN9Aについての実施例8]
PC3細胞内の、「SCN-ASO 27」により誘導されるエクソンスキッピング(A)
表5で指定された「SCN-ASO 27」とは、ヒトSCN9AプレmRNA内の、「第3イントロン」と、「第4エクソン」との接合部にわたる3'側スプライス部位と完全に相補的な、14量体のASOである。3'側スプライス部位内の、14量体の標的配列は、[(5'→3')uuguguuuag│GUACACUUUU]の20量体のSCN9AプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付されて」いる。「SCN-ASO 27」は、「第3イントロン」との6量体の重複及び「第4エクソン」との8量体の重複を保有する。
「SCN-ASO 27」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例1」において記載されている通りに、PC3細胞内の、「第4エクソン」のスキッピングを誘導する、その能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたPC3細胞を0(陰性対照)、1、10又は100zMの「SCN-ASO 27」で処置した。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で2分間に続く、95℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による34サイクルに従い、[SCN-エクソン2n_フォワード:(5'→3')CCACCGGACTGGACCAAAAA;及びSCN-エクソン9n_リバース:(5'→3')GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)においてさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]図31Aは、ネステッドPCR産物の電気泳動データを提示するが、この場合、「SCN-ASO 27」で処置された細胞は、第4〜5エクソンのスキッピングに割り当てられる、強力なPCRバンドをもたらした。しかし、全長SCN9A mRNAについてのPCRバンドの強度は、10zM及び100zMのASOによる処置試料中において、陰性対照による試料中より強力であった。ネステッドPCRにおける、奇妙な用量反応パターンは、「SCN-ASO27」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」により誘導される、転写の上方調節に起因しうるであろう[Nature Struc. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。エクソンスキッピングのPCR産物は、サンガーシーケンシングにより、第4〜5エクソンのスキッピングに対応することが確認された(図31Bを参照されたい)。
[SCN9Aについての実施例9]
PC3細胞内の、「SCN-ASO 27」により誘導されるエクソンスキッピング(B)
「SCN-ASO 27」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例8」において記載されている通りに、PC3細胞内の、「第4エクソン」のスキッピングを誘導する、その能力について評価した。本実験では、PC3細胞を、0(陰性対照)、1、10、100及び1,000aMの「SCN-ASO 27」で、24時間にわたり処置した。
[ネステッドPCRによる増幅]ネステッドPCR反応は、第3エクソンと、第6エクソンとの接合部配列を保有する生成物を、選択的に増幅するように設計された、[SCN-エクソン3/6_フォワード:(5'→3')GGACCAAAAATGTCGAGCCT;及びSCN-エクソン9n_リバース:(5'→3')GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]のプライマーのセットに対して実行した。
「SCN-エクソン3/6_フォワード」のプライマーの配列は、第4〜5エクソンのスキッピングをプローブするように、第3エクソンと、第6エクソンとの接合部をターゲティングするが、20量体のプライマーは、第3エクソンと、第4エクソンとの接合部との、17量体の相補的な重複を、なおも保持することが注目される。したがって、「SCN-エクソン3/6_フォワード」のプライマーの配列は、全長SCN9A mRNA内に見出される、「第3エクソンと、第6エクソンとの接合部」を、「第3エクソンと、第4エクソンとの接合部」より選択的に認識する。プライマーの配列は、第4〜5エクソンを欠く、SCN9Aのスプライス変異体を、全長SCN9A mRNAより高感度に検出するように設計した。全長mRNAは、数十億年にわたる進化を通して獲得された、良好な代謝的安定性を示す傾向があるので、このようなエクソンスキッピングプライマーは、代謝的安定性が低下した、mRNAのスプライス変異体を検出するのに有用であろう。
図31Cは、ネステッドPCR産物の電気泳動データを提示するが、この場合、「SCN-ASO 27」で処置された細胞は、第4〜5エクソンのスキッピングに割り当てられる、強力なPCRバンドをもたらし、これは、サンガーシーケンシングにより確認された。
[SCN9Aについての実施例10]
「SCN-ASO 27」で処置されたPC3細胞内のSCN9A mRNAについての、ワンステップcDNA合成によるqPCR
「SCN-ASO 27」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例2」において記載される通りに、SCN9AネステッドqPCRにより、PC3細胞内の、ヒトSCN9A mRNAレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。
[ASOによる処置]PC3細胞を0(陰性対照)、0.1、1、又は10aMの「SCN-ASO 27」で、24時間にわたり処置した(ASO濃度1つ当たり2つずつの培養ディッシュ)。
[ワンステップPCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で2分間による15サイクルに従い、[SCN-エクソン2_フォワード:(5'→3')CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT;及びSCN-エクソン8/9_リバース:(5'→3')CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]のエクソン特異的プライマーのセットに対して、One Step RT-PCR kit(Invitrogen、USA)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドqPCRによる増幅]100倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で30秒間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間による40サイクルに従い、[SCN-エクソン3_フォワード:(5'→3')TGACCATGAATAACCCAC;及びSCN-エクソン4_リバース(2):(5'→3')GCAAGGATTTTTACAAGT]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。qPCR反応は、全長SCN9A mRNA内の、第3エクソンと、第4エクソンとの接合部をターゲティングする、[(5'→3')5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]のTaqManプローブでモニタリングした。
全長SCN9A mRNAレベルは、図32Aに提示される通り、「SCN-ASO 27」で処置された細胞内で、約35〜45%、有意に低下した(スチューデントのt検定による)。
[SCN9Aについての実施例11]
「SCN-ASO 27」で処置されたPC3細胞内のSCN9A mRNAについてのランダムヘキサマーを伴うcDNA合成によるqPCR
「SCN-ASO 27」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SCN9Aについての実施例10」において記載されている通りに、SCN9A qPCRにより、PC3細胞内の、ヒトSCN9A mRNAレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。ランダムヘキサマーを使用して、cDNAを合成し、TaqManプローブを使用して、SCN9A qPCR反応にかけた。
全長SCN9A mRNAレベルは、図32Bに提示される通り、「SCN-ASO 27」で処置された細胞内で、約50〜60%、有意に低下した(スチューデントのt検定)。
[SCN9Aについての実施例12]
「SCN-ASO 27」で処置されたSNL活性化ラットL5 DRG細胞内のCoroNaアッセイによる、ナトリウム電流の阻害
「SCN-ASO 27」は、ヒトSCN9AプレmRNAと完全に相補的な、14量体のSCN9A ASOであるが、ラットゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000002.12]から読み取られた、ラットSCN9AプレmRNAとの、単一のミスマッチを保有する。「SCN-ASO 27」は、[(5'→3')uuuc"c"uuuag│GUACACUUUU][配列中、単一のミスマッチを、引用符(“")でマークする]の20量体のラットプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ラットSCN9AプレmRNAとの、13量体の相補的な重複、及び単一のミスマッチを保有する。
「SCN-ASO 27」を以下の通りに、「CoroNa Green」を使用して、ラットDRG(後根神経節)細胞内のナトリウムイオン電流を阻害するその能力について評価した。
[脊髄神経結紮]脊髄神経結紮(SNL)は、後根神経節(DRG)及び脊髄において、神経障害を誘導し、神経障害性疼痛についてのモデルとして広く使用されている[Pain、50(3)巻、355〜363 (1992)]。しかし、脊髄神経(複数可)を、どのように結紮するのかに応じて、SNLのいくつかの変化形が存在する。脊髄神経(複数可)を、どのように結紮するのかに応じて、DRGにおける神経障害の程度及び持続期間は、変動すると考えられる[Pain、43(2)巻、205〜218 (1990)]。L5脊髄神経及びL6脊髄神経の二重の結紮(すなわち、「L5/L6結紮」)は、L5脊髄神経単独の結紮(すなわち、「L5結紮」)より重度であり、かつ、これより長期にわたり遷延する神経障害を誘導する。
[L5/L6結紮によるSNL術]0日目に、6週齢の雄SDラットに、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけた。次いで、L5及びL6の脊髄神経(左側)を露出させ、強く結紮した。筋肉及び皮膚は、無菌手順により、閉止及びクリッピングされた。ラットは、4週間にわたり、フォンフレイ評定により散発的に感作した。
[DRG神経細胞の調製]31日目に、低フォンフレイスコアを示すラットを屠殺し、左(結紮側)及び右(非結紮側)両方のDRGを摘出した。DRGは、摘出の直後に、0.5mLのPBS中に浸漬した。DRG細胞は、文献に開示された手順に従い、以下の通りに調製した[Methods Mol Biol.、846巻、179〜187 (2012);PLOS One、8(4)巻;e60558 (2013)]。
(1)DRGを、HBSS(Hank's Balanced Salt Solution、型番:14025-092、Life Technologies)中に0.125%のコラゲナーゼ(Collagenase Type IV、型番:C5138-100MG、Sigma)0.2mLを含有する、1.5mLのeチューブ内に浸漬し、鋏で、小片にみじん切りにし、5%のCO2及び95%のRH下、37℃のCO2インキュベーター内で、20分間にわたりインキュベートし;(2)0.25%のトリプシン/EDTA 50μLを、eチューブに添加し、これを、インキュベーター内で、さらに10分間にわたり保ち;(3)eチューブに、1mLの完全DMEM培地を投入し、600gで、5分間にわたり、遠心分離による沈降にかけ;(4)結果として得られるペレットを、2倍濃度のB-27(B-27(登録商標)Serum-Free Supplement、型番:17504-044、Gibco)、1倍濃度のペニシリン-ストレプトマイシン、1倍濃度のL-グルタミンを補充した、4mLのNeurobasal-A培地(Neurobasal(登録商標)Medium、型番:21103-049、Gibco)中に懸濁させ、1mLの細胞懸濁液を、35mmの培養ディッシュ内に置かれた、ラミニンでコーティングしたカバーガラス(型番:GG-25-1.5-laminin、Neuvitro)に、注意深く播種し;(5)播種の1日後、ディッシュに、さらに1mLの新鮮なNeurobasal-A培地を、注意深く投入し;(6)播種の2日後、培地を、1μMのAra-C(型番:C1768-100MG、Sigma)を補充した、2mLの新鮮なNeurobasal-A培地で置き換えて、DRG神経細胞以外の細胞の増殖を、選択的に抑制し;(7)播種の4日後、培地を、1μMのAra-Cを補充した、2mLの新鮮なNeurobasal-A培地で、再度置き換え;(8)播種の5又は6日後、DRG神経細胞を、「SCN-ASO 27」で処置した。
[ASOによる処置及びCoroNaアッセイ]L5/L6結紮を伴うL5 DRG神経細胞、又はL5/L6結紮を伴わないL5 DRG神経細胞を、0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 27」で処置した。30時間後、細胞を、2mLのHBSSで洗浄し、2mLの新鮮なHBSSを投入した。次いで、細胞を、37℃で、5μMの「CoroNa Green」により処置した。30分後、細胞を、2mLのHBSSで、2回にわたり洗浄し、2mLの新鮮なHBSSを投入した。培養ディッシュを、CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡にマウントして、細胞の緑色蛍光画像を、持続的に捕捉した。細胞を、10mMのNaClで、短時間にわたり処置し、次いで、細胞の蛍光強度の変化を、300秒間にわたり、ディジタル式に記録した。画像捕捉のためのフレーム1つ当たり、4〜5個の細胞が見られた。各個別の細胞による蛍光強度は、秒単位の分解能で追跡した。ImageJプログラム(version 1.50i、NIH)を使用して、個別の細胞による細胞内蛍光強度についての出力波形を平均し、平均出力波形を、「L5/L6結紮」を伴う細胞、及び「L5/L6結紮」を伴わない細胞について、それぞれ、図33A及び33Bに提示する。平均蛍光強度の出力波形を、0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 27」で処置された細胞についての、個別の細胞内ナトリウム濃度の出力波形として理解した。
[CoroNaアッセイの結果]L5/L6結紮で刺激された細胞(図33Aを参照されたい)では、100zM又は1aMの「SCN-ASO 27」による、30時間にわたる処置は、150秒後の時点において、80〜85%の、平均細胞蛍光強度の有意な低下(スチューデントのt検定)をもたらした。
L5/L6結紮を伴わない細胞(図33Bを参照されたい)では、1aMの「SCN-ASO 27」による、30時間にわたる処置は、蛍光強度の、約50%の低下をもたらした。100zMの「SCN-ASO 27」で処置された非刺激細胞の場合、蛍光強度の低下は見られなかった。L5/L6結紮を伴わない細胞の蛍光強度は、L5/L6結紮で刺激された細胞の蛍光強度より、大幅に小さかったことから、L5/L6は、Nav 1.7ナトリウムチャネル活性の、顕著な上方調節を誘導することが示唆される。
神経障害性刺激を伴わないDRG神経細胞は、Nav 1.7、Nav 1.8、Nav 1.2などを含む、VGSCの多様な亜型を発現させることが公知である。Nav 1.7亜型は、刺激を伴わないDRG神経細胞内の、全ナトリウム電流に対して、限定的な寄与を示す[Nature Comm.、3巻、Article Number 791: DOI: 10.1038/ncomms 1795 (2012)]。L5/L6結紮を伴わないDRG神経細胞は、Nav 1.7亜型からの、ナトリウム電流の限定的な寄与を示しうる。
その一方で、神経細胞は、遷延性の神経障害に応答して、Nav 1.7の発現を上方調節することが公知である[J Biol Chem.、279(28)巻、29341〜29350 (2004);J Neurosci.、28(26)巻、6652〜6658 (2008)]。100zM及び1aMのいずれの「SCN-ASO 27」も、「L5/L6結紮」により刺激された神経細胞内で、ナトリウム電流を、80〜85%阻害した。「L5/L6結紮」を伴うDRG細胞内の、「SCN-ASO 27」による、ナトリウム電流の高度な阻害は、慢性神経障害に起因する、神経細胞内のNav 1.7の上方調節と符合する。
[SCN9Aについての実施例13]
「SCN-ASO 30」によるL5 DRG神経細胞内のNav 1.7タンパク質発現の阻害
「SCN-ASO 30」が、ラットSCN9AプレmRNAと完全に相補的な、14量体のASOであるのに対し、「SCN-ASO 27」は、ヒトSCN9AプレmRNAと完全に相補的な、14量体のASOである。「SCN-ASO 30」は、C末端において、「SCN-ASO 27」との単一のミスマッチを保有する。ラットSCN9AプレmRNAに対する「SCN-ASO 30」は、ヒトSCN9AプレmRNAに対する「SCN-ASO 27」についての、良好なモデルASOとして用いられうる。
「SCN-ASO 30」を下記で記載される通り、ラットDRG神経細胞内のNav 1.7タンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
[DRG神経細胞の調製]雄SDラット(7週齢)を強い「L5/L6結紮」にかけた。7日後、4匹のラットに、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけて、結紮された側のL5 DRGをサンプリングした。DRGを、「SCN9Aについての実施例12」で記載されている通りに、プール及び加工して、DRG神経細胞を調製した。
[ASOによる処置]DRG神経細胞を0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 30」で、24時間にわたり処置し、次いで、Nav 1.7タンパク質のC末端をプロービングするNav 1.7抗体(型番:ab85015、Abcam)に対するウェスタンブロットのための溶解にかけた。β-アクチンは、基準のためにプローブした。
[Nav 1.7発現の阻害]図34Aは、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SCN-ASO 30」で処置された、DRG神経細胞内で得られたウェスタンブロットデータを提示する。全ての溶解物は、全長Nav 1.7タンパク質の断片又は代謝物に割り当てられる、170Kにおける強力なバンドをもたらした。全長Nav 1.7タンパク質のバンドは、陰性対照及び10zMの「SCN-ASO 30」の溶解物により、220〜240Kだけで検出された。こうして、Nav 1.7の発現は、ラットDRG神経細胞内で、100及び1,000zMの「SCN-ASO 30」を伴うインキュベーションの24時間後において、顕著に阻害された。
[SCN9Aについての実施例14]
「SCN-ASO 30」によるラットL5 DRG神経細胞内のナトリウム電流の阻害
「SCN-ASO 30」を、下記に提示されるL5/L6結紮で刺激されたラットL5DRG神経細胞内のナトリウム電流を阻害するその能力について評価した。
[DRG神経細胞の調製]雄SDラット(6週齢)を、強い「L5/L6結紮」にかけた。7日後、ラットに、結紮された側のL5 DRGを摘出するために、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけた。L5 DRG神経細胞は、以下の通りに調製した:(1)DRGを、HBSS中に0.125%のコラゲナーゼ0.2mLを含有する、1.5mLのeチューブ内に浸漬し、鋏で、小片にみじん切りにし、5%のCO2及び95%のRH下、37℃のCO2インキュベーター内で、20分間にわたりインキュベートし;(2)0.25%のトリプシン/EDTA 50μLを、eチューブに添加し、eチューブをインキュベーター内で、さらに10分間にわたり保ち;(3)eチューブに、1mLの完全DMEM培地を投入し、600gで、5分間にわたり、遠心分離による沈降にかけ;(4)次いで、結果として得られるペレットを、2倍濃度のB-27(B-27(登録商標)Serum-Free Supplement、型番:17504-044、Gibco)、1倍濃度のペニシリン-ストレプトマイシン、1倍濃度のL-グルタミンを補充した、4mLのNeurobasal-A培地(Neurobasal(登録商標)Medium、型番:21103-049、Gibco)中に懸濁させ;(5)DRG細胞の懸濁液を、約15mLのNeurobasal-A培地を含有する、15mLのファルコンチューブ内にシーリングして、約1時間にわたり輸送し;(6)0.5mLの細胞懸濁液を、24ウェルプレート型の培養ディッシュ内のウェル内に置かれた、ラミニンでコーティングしたカバーガラスに、注意深く播種し;(7)培養プレート内に播種された細胞を、CO2インキュベーター内、37℃で2時間にわたりインキュベートして、細胞をカバーガラスに付着させ、次いで、インキュベーター内、0(陰性対照)又は100zMの「SCN-ASO 30」で、4時間にわたり処置し;(8) DRG神経細胞を、ナトリウムパッチクランプ装置(Axopatch 200B Amplifier、Axon Instruments)上の、手動パッチクランプアッセイによる、ナトリウム電流の測定にかけた。
[パッチクランプアッセイの結果]図34Bは、細胞サイズに対して正規化された、ナトリウム電流データを提示する。100zMの「SCN-ASO 30」による、4時間にわたるインキュベーションで、ナトリウム電流は、テトロドトキシン感受性ナトリウムチャネルを発現させるDRG神経細胞、すなわち、小サイズ神経細胞内で、約90%有意に(スチューデントのt検定によるp<0.01)低下した(群1つ当たりの細胞のN=4)。
[SCN9Aについての実施例15]
「SCN-ASO 30」で処置されたラットDRG細胞内のSCN9A mRNAについてのワンステップcDNA合成によるqPCR
「SCN-ASO 30」を以下の通りに、SCN9AネステッドqPCRにより、ラットDRG細胞内のSCN9A mRNAの発現を阻害するその能力について評価した。
[L5 DRG細胞の調製]4週齢の雄SDラットに、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけて、L5 DRGを摘出した。DRG試料を、「SCN9Aについての実施例12」で記載されている通りに、プール及び加工して、L5 DRG細胞を調製した。
[ASOによる処置]ラットDRG細胞を、0(陰性対照)、10、30、100、300、又は1,000zMの「SCN-ASO 30」で処置した(ASO濃度1つ当たり1つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びワンステップPCRによるcDNAの合成]24時間後、製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを、細胞から抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で2分間による15サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[SCN-エクソン2(3)_フォワード:(5'→3')CAATCTTCCGTTTCAACGCC;及びSCN-エクソン10_リバース:(5'→3')ACCACAGCCAGGATCAAGTT]のセットに対して、One Step RT-PCR kit(Invitrogen、USA)を使用する、25μLの逆転写反応に使用した。
[ネステッドqPCRによる増幅]100倍希釈された各cDNA溶液(濃度1つ当たり二連)1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で30秒間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間による40サイクルに従い、SCN9Aの第3エクソンと、第4エクソンとの接合部をターゲティングするTaqManプローブ(型番:Rn01514993_mH、Thermo Fisher)を伴う、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。
図35Aは、qPCRデータを提示する。各ASO濃度につき、単一の培養ディッシュであったが、全長SCN9A mRNA発現レベルは、「SCN-ASO30」で処置された細胞内で、約45〜60%、有意に低下した(スチューデントのt検定による)。
[SCN9Aについての実施例16]
「SCN-ASO 30」で処置されたラットDRG細胞内のSCN9A mRNAについてのランダムヘキサマーを伴うcDNA合成によるqPCR
「SCN-ASO 30」を、SCN9A qPCRにより、ラットL5 DRG細胞内の、SCN9A mRNAの発現を阻害する、その能力について評価した。全RNAは、「SCN9Aについての実施例15」で記載されている通りに調製し、ランダムヘキサマーを使用するcDNA合成にかけた。cDNA溶液(ASO濃度1つ当たり二連)を、100倍希釈し、各希釈PCR産物1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で30秒間に続く、95℃で5秒間、及び60℃で30秒間による40サイクルに従い、SCN9Aの第3エクソンと、第4エクソンとの接合部をターゲティングするTaqManプローブを伴う、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。
cDNA溶液はまた、GAPDH mRNAについてのqPCR増幅にもかけた。SCN9A mRNAのCt値は、GAPDH mRNAのCt値に対して正規化した。
図35Bは、GAPDHに対して正規化された、SCN9AについてのqPCRデータを提示する。全長SCN9A mRNA発現レベルは、「SCN-ASO 30」で処置された細胞内で、約45〜75%、有意に低下した(スチューデントのt検定)。
[SCN9Aについての実施例17]
糖尿病誘導性末梢神経障害性疼痛を伴うラットにおける、SCN9A ASOによる、アロディニアへの拮抗
SCN9A遺伝子は、VGSCのNav 1.7亜型の、αサブユニットをコードする。他の感覚機能は正常であるが、激しい疼痛を感じない、極めて少数の個体が存在する。このような個体は、SCN9A遺伝子が、非機能的なNav 1.7亜型をコードするように突然変異していることが見出された[Nature、444巻、894〜898 (2006)]。これを、「SCN9Aチャネル病」と称する。ヒトSCN9Aチャネル病の、行動学的表現型は、SCN9Aノックアウトマウスにおいて、かなりよく再現された[PLOS One 9(9): e 105895 (2014)]。したがって、式IのSCN9A ASOは、Nav 1.7の上方調節を伴う動物疼痛モデルにおいて、鎮痛活性を示しうる。
「SCN-ASO 7」、「SCN-ASO 8」、「SCN-ASO 21」、「SCN-ASO 35」、「SCN-ASO 36」、及び「SCN-ASO 37」を、糖尿病誘導性末梢性神経障害性疼痛(DPNP)を伴うラットにおけるアロディニアに拮抗するそれらの能力について評価した。本実施例では、合計5つのスプライス部位をターゲティングする、6つのSCN9A ASOを、ラットにおける、糖尿病性神経障害により誘導されるアロディニアに拮抗するそれらの能力について評価した。
[DPNPの誘導及び群分け]0日目における、60mg/kgのストレプトゾトシンの腹腔内注射により、ラットにおいて、糖尿病を誘導した。10日目に、DPNPを伴うラットを、陰性対照(媒体だけ)、100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 7」、100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 8」、100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 21」、100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 35」、100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 36」、及び100ピコモル/Kgの「SCN-ASO 37」の、6つの群に、無作為に割り付けた。動物を、10日目における、個別の動物(群1つ当たりのN=8〜9)のフォンフレイスコアに基づき群分けした。アロディニアは、「アップダウン」法に従い、微小繊維のセット(Touch Test(登録商標))を使用して評定した[J Neurosci. Methods、53(1)巻、55〜63 (1994)]。
[ASOによる処置及びフォンフレイ評定]注射のためのASO溶液は、SCN9A ASOの水性母原液を、PBS(リン酸緩衝生理食塩液)中に100nMに系列希釈することにより調製した。11、13、15、17、及び19日目において、動物に、1mL/kgのASOを皮下投与した。フォンフレイ評定は、11、13、15、17、及び19日目における、投与の2時間後に実行した。フォンフレイ評定は、最終回の投与後における治療活性の持続期間を評価するために、21及び23日目においても、加えて実施した。毎日のフォンフレイスコアを、陰性対照群(媒体だけ、すなわち、PBS)に対する、スチューデントのt検定により、統計学的有意性について評価した。
[治療活性]観察されたフォンフレイスコアを、図36にまとめる。アロディニアは、「SCN-ASO 36」及び「SCN-ASO 37」を除く、全てのASOにより、有意に拮抗されたが、「SCN-ASO 37」は、治療活性の明確な傾向を示した(19日目におけるp値=0.057)。治療活性は、投与を繰り返すにつれて、徐々に増大する傾向があった。19日目におけるフォンフレイスコアに基づく、最大治療有効性は、「SCN-ASO 7」、「SCN-ASO 8」、「SCN-ASO 21」、「SCN-ASO 35」、「SCN-ASO 36」、及び「SCN-ASO 37」について、それぞれ、約76%(有意)、61%(有意)、93%(有意)、52%(有意)、0%、及び22%(非有意、p値=0.05X)であった。
「SCN-ASO 7」、「SCN-ASO 8」、「SCN-ASO 21」及び「SCN-ASO 35」は、それらの標的イントロンとの、5量体の相補的な重複を有する。その一方で、「SCN-ASO 36」及び「SCN-ASO 37」は、それらの標的イントロンと、それぞれ、4量体及び3量体の相補的な重複を有する。治療有効性に影響を及ぼす、多数の因子が存在するが、標的イントロンとの、相補的な重複の数は、治療有効性に影響を及ぼすと考えられる。
本実施例では、5つのスプライス部位のうち、4つをターゲティングするSCN9A ASOに関して、in vivoにおけるアンチセンス活性を観察した。in vivoにおける治療活性が、細胞のアンチセンス活性、標的組織内の薬物分子の濃縮、薬物動態半減期などを含む、多様な因子に依存することを踏まえると、80%のヒット率は、極めて高いと考えられる。したがって、式Iの化合物は、その標的遺伝子の発現を、予測可能な形でモジュレートする。
「SCN-ASO 7」の分子量(表4を参照されたい)と併せると、100ピコモル/kgは、約0.53μg/kgの治療用量に換算される。「SCN-ASO 7」の、in vitroにおける、アットモル未満のエクソンスキッピング効力は、糖尿病性神経障害を伴うラットのin vivoにおける、約0.53μg/kgの、極度に強力な治療効力の一大因子となると考えられる。なおより驚くべきことに、ASOは、「ネイキッド」オリゴヌクレオチドとして投与された。in vivoにおける、このように強力な治療効力は、DNA、RNA、PTO、2'-OMe PTO、2'-OMe RNA、2'-OMOE RNA、LNA、PMO、PNAなどを含む、他のクラスのオリゴヌクレオチドにより実現されたことがない。
DMD ASOの、in vitro活性及びex vivo活性についての例
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)とは、筋肉変性を伴う、希少な、致死性の、単一遺伝子性疾患である。DMD患者は、エクソン(複数可)点突然変異又は欠失から生じるPTC(未成熟終止コドン)に起因して、全長ジストロフィンタンパク質をコードしない。
mdxマウス(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J、Jackson Lab)とは、ジストロフィン遺伝子の第23エクソン内の点突然変異であって、PTCをもたらす点突然変異を伴う、突然変異体マウスである。mdxマウスは、C末端部分を欠く、ジストロフィンの切断形態をコードする。C末端部分は、細胞外マトリックス(ECM)に結合するので、切断形態は、筋線維を、ECMに緊密に連結するように定められた、その役割を失う。結果として、mdxマウスは、筋肉の完全性及び強度を、年齢と共に、徐々に失う。
mdxマウスは、ヒトDMDについての動物モデルとして、広く採用されている。マウスジストロフィンの第23エクソンをターゲティングする、ジストロフィンASOは、第23エクソンのスキッピングにより、PTCを消失させるために探索されている。
マウスジストロフィンプレmRNA内の第23エクソンの3'又は5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングする、式IのPNA誘導体を、mdxマウスにおける、ジストロフィンの第23エクソンのスキッピングを誘導するそれらの能力について評価した。本明細書で提示される生物学的例は、式Iの化合物についての例としてのジストロフィンASOのエクソンスキッピング能を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲を、ジストロフィンASOに限定するように解釈されるべきではない。
[DMDについての実施例1]
mdxマウスにおいて、「DMD-ASO 1」及び「DMD-ASO 4」により誘導されるエクソンスキッピング(ネステッドPCR法A)
表7で指定された「DMD-ASO 1」とは、マウスジストロフィンプレmRNA内の、第22イントロンと、第23エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、13量体のASOである。「DMD-ASO 1」は、[(5'→3')uaauuuugag│GCUCUGCAAAGTTCT]の25量体の配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、13量体の配列に相補的に結合する。「DMD-ASO 1」は、第22イントロンとの8量体の重複及び第23エクソンとの5量体の重複を保有する。
表7で指定された「DMD-ASO 4」とは、マウスジストロフィンプレmRNA内の、第22イントロンと、第23エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、17量体のASOである。「DMD-ASO 4」は、[(5'→3')uaauuuugag│GCUCUGCAAAGTTCT]の25量体の配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、17量体の配列に相補的に結合する。「DMD-ASO 4」は、第22イントロンとの5量体の重複及び第23エクソンとの12量体の重複を保有する。
「DMD-ASO 1」及び「DMD-ASO 4」を、以下の通りに、皮下投与により、mdxマウスの筋内のエクソンスキッピングを誘導する、それらの能力について評価した。
[ASOによる処置及び筋組織のサンプリング]注射液は、「DMD-ASO1」又は「DMD-ASO4」の水性母原液を、PBS中で、500nMに希釈することにより調製した。雄mdxマウスに、媒体だけ(陰性対照)、2mL/kgの「DMD-ASO 1」、又は「DMD-ASO 4」を、毎日2回(BID)、3日間にわたり皮下投与した。最終回投与の1日後に、動物にゾレチル/ロンパンで麻酔をかけ、屠殺して、心臓、横隔膜、腓腹筋、大腿四頭筋、及び三頭筋を含む筋組織をサンプリングした。
[RNAの抽出]筋肉試料を、氷上に保たれた試験管内ですり潰すことによりホモジナイズし、筋組織約100mg当たり、1mLのトリゾール試薬(Invitrogen)による全RNAの抽出にかけた。
[ワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]500ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、58℃で1分間、及び72℃で2分間による40サイクルに従い、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)及びエクソン特異的プライマー[DMD-エクソン21_フォワード:(5'→3')CAAAGAGAAAGAGCTACAGACA;及びDMD-エクソン25_リバース:(5'→3')CTGGGCTGAATTGTTTGAAT]のセットを使用する、25μLの逆転写反応において使用した。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、50℃で40秒間、及び72℃で50秒間による39サイクルに従い、プライマー[DMD-エクソン22n_フォワード:(5'→3')ATCCAGCAGTCAGAAAGCAAA;及びDMD-エクソン25n_リバース:(5'→3')ACTAAAAGTCTGCATTGT]のセットに対する、20μLのネステッドPCR(型番:K2612、Bioneer)反応においてさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]PCR産物を、図37Aに提示される通り、2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけた。第23エクソンのスキッピングは、「DMD-ASO 1」及び「DMD-ASO 4」で処置された動物だけにおいて検出された。第23エクソンのスキッピングの検出は、大腿四頭筋及び腓腹筋に限られるが、「DMD-ASO 1」は、「DMD-ASO 4」より有効であると考えられる。
陰性対照(すなわち、ASOによる処置を伴わない)による対象は、大腿四頭筋において、第22〜23エクソンのスキッピングに割り当てられるPCRバンドをもたらした。第22〜23エクソンのスキッピングは、フレームシフトをもたらし、第22〜23エクソンを欠く、ジストロフィンmRNAのスプライス変異体は、C末端部分が逸失した、切断型ジストロフィンをコードするように決定づけられる。
標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析し、「DMD-ASO 1」及び「DMD-ASO 4」により誘導される、第23エクソンのスキッピング(図37Bを参照されたい)を確認した。全長についてのPCRバンド(すなわち、スキッピングを伴わないPCRバンド)、及び第22〜23エクソンのスキッピングについてのPCRバンドは、シーケンシングにより確認したが、第22〜23エクソンのスキッピングについてのシーケンシングデータは提示しなかった。
[DMDについての実施例2]
mdxマウスにおいて、「DMD-ASO 1」及び「DMD-ASO 4」により誘導されるエクソンスキッピング(ネステッドPCR法B)
「DMDについての実施例1」で得られたRNA試料を、[DMD-エクソン20_フォワード:(5'→3')CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG;及びDMD-エクソン26_リバース:(5'→3')TTCTTCAGCTT-GTGTCATCC]のエクソン特異的プライマーのセットを使用する、ワンステップcDNA合成にかけた。次いで、cDNA試料を、[DMD-エクソン20n_フォワード:(5'→3')CCCAGTCTACCACCCTAT-CAGAGC;及びDMD-エクソン26n_リバース:(5'→3')CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT]のエクソン特異的プライマーという、別のセットに対する、ネステッドPCRにより解析した。
ネステッドRT-PCRの結果を、図38A及び図38Bにまとめられる通りに提示する。ASOにより処置された動物(群1つ当たりのN=2)では、第21〜23エクソン及び第22〜25エクソンのスキッピングが検出された。第21〜23エクソンのスキッピングは、フレーム内(すなわち、フレームシフトを伴わない)であるが、第22〜25エクソンのスキッピングは、フレーム外である。第21〜23エクソンのスキッピングに割り当てられるPCRバンドは、サンガーシーケンシングにより明確に確認された(図38Bを参照されたい)。
エクソンスキッピングのプロファイルは、上記で提示されたPCR法に応じて変動した。したがって、エクソンスキッピングのプロファイルは、慎重に解釈すべきである。
[DMDについての実施例3]
mdxマウスにおける「DMD-ASO 1」により誘導されるエクソンスキッピング(ネステッドPCR法A)
mdxマウスに、0(陰性対照)又は10ピコモル/Kgの「DMD-ASO 1」を毎日2回ずつ5日間にわたり、皮下から施した(群1つ当たりの動物2匹)。最終回投与の1日後に、動物を、組織サンプリングのために屠殺した。三頭筋試料を、「DMDについての実施例1」で記載されているネステッドRT-PCR法に従い、第23エクソンのスキッピングについて評価した。
ネステッドRT-PCRの結果を、図38Cにまとめる。陰性対照群内の1匹の動物が、第22〜23エクソンのスキッピングについてのPCRバンドをもたらしたが、第22〜23エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体は、フレーム外にある。第23エクソンのスキッピングについてのPCRバンドは、ASO処置群内の1匹の動物だけにおいて検出された。したがって、DMD-ASO 1は、それが設計された通りに、第23エクソンのスキッピングを誘導した。
[DMDについての実施例4]
「DMD-ASO 1」皮下投与されたmdxマウスにおけるロータロッド試験による筋機能の改善
mdxマウスにおける第23エクソンのスキッピングは、第23エクソン内のPTCを除去し、第23エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体は、フレーム内にあり、したがって、ECMに結合するC末端部分を伴う変異体タンパク質をコードする。こうして、全長変異体ジストロフィンタンパク質は、元の全長ジストロフィン又は野生型全長ジストロフィンの生理学的機能を、部分的に回復する。
エクソンスキッピングの潜在的可能性を踏まえ、「DMD-ASO 1」を、下記で記載される通り、mdxマウスにおいてロータロッド試験による筋機能を改善するその能力について評価した。
[群分け]6週齢の雄mdxマウスを、ロータロッド試験のために、2週間にわたりトレーニングし、次いで、0日目、すなわち、群分け日における、ロータロッド試験による、個別のスコアに基づき、0(陰性対照)、100、及び1,000ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」の、3つの群(群1つ当たりのN=10)に無作為に割り付けた。
[ASOによる処置]注射液は、ASOをPBS中に、20nM及び200nMに系列希釈することにより調製した。動物に、媒体(PBS;陰性対照)、20nM「DMD-ASO 1」(100ピコモル/kg)、又は200nM「DMD-ASO 1」(1,000ピコモル/kg)を5mL/kgで、毎週3回、0日目〜21日目の期間にわたり皮下投与した。
[ロータロッド試験及び統計学的解析]マウスを、60秒間にわたる、4rpm〜45rpmの加速化スケジュールで、ロータロッド装置(型番:47650、Ugo Basile)上のロータロッド試験にかけた。落下までの待ち時間(すなわち、動物が、ロータロッド上にとどまった持続時間)を、各個別の動物について評定した。統計学的有意性を、陰性対照群に対する、スチューデントのt検定により評価した。
[筋機能の改善]図39Aは、ロータロッドスコアを、群ごとにまとめる。陰性対照群では、ロータロッドスコア(すなわち、落下までの待ち時間)は、平均、約70〜120秒間で停滞するにとどまった。その一方で、1,000ピコモル/kg群の筋機能は、12日目まで、徐々に、顕著に改善され、次いで、その後、平均、210〜230秒間のロータロッドスコアで、安定を維持した。筋機能は、1,000ピコモル/kgのASO処置により、12、14、及び19日目に、著明に改善された。100ピコモル/kg群の筋機能は、改善の強い傾向を示したが有意ではなかった。
[DMDについての実施例5]
「DMD-ASO 1」を慢性投与されたmdxマウスにおける、握力試験による筋機能及び筋肉の完全性の改善
「DMD-ASO 1」を、下記で記載される通り、mdxマウスへの慢性投与により、握力試験による筋機能を改善するその能力、エクソンスキッピングを誘導するその能力、全長ジストロフィン(すなわち、C末端がコードされたジストロフィンタンパク質)の発現を上方調節するその能力について、IHCにより評価し、筋肉の完全性を改善するその能力について、H&E染色を伴う組織病理学により評価した。
[群分け及びASOによる処置]雄mdxマウス(7週齢)を、握力試験による、個別の握力スコアに基づき、0(mdx陰性対照)、10、50、及び200ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」の、4つの群(群1つ当たりのN=12)に無作為に割り付けた。本研究では、12匹の雄C57BL/6マウス(7週齢)による衛星群を、全長ジストロフィン発現レベルについての、野生型陰性対照群として組み入れた。
50及び200ピコモル/kg群には、43週目の最終的な屠殺まで、毎週2回、PBS中に溶解させた「DMD-ASO 1」を皮下から施した。その一方で、10ピコモル/kg群には、「DMD-ASO1」を、当初、0〜8週目において、毎週2回、その後、毎週3回、皮下から施して、ASOへの曝露を増大させた。
[握力試験による筋機能]筋機能を、文献[J. Appl. Physiol.、106(4)巻、1311〜1324 (2009)]に従い、握力計(型番:47,200、Ugo Basile)上の握力により、毎週ベースで評価した。群ごとの握力スコアを、mdx陰性対照群に対する、スチューデントのt検定により、統計学的有意性について評価した。
図39Bは、0〜30週目において観察された、群ごとの握力スコアについてまとめる。初回投与後、最初の11週間では、ASO処置群と、陰性対照群との間で、握力の顕著な変化は見られなかった。mdx陰性対照群の握力は、3週目に、約107gの最大値に達し、数週間にわたり、徐々に減退し、次いで、約75〜95gで、比較的な安定を維持した。ASO処置群の握力は、10週目くらいから、徐々に改善し始めた。処置群では、握力は、mdx陰性対照群と比較して、30〜50%増大する傾向があった。
群1つ当たりの動物2〜3匹を無作為に選択し、7、13、21及び30週目に、IHC又はネステッドPCRによる評価のために、屠殺したことが注意される(下記を参照されたい)。
[骨格筋についての、全長ジストロフィンに対するIHC評価]7、13、及び21週目に、群1つ当たりの動物2匹を、無作為に選択し、屠殺して、筋組織を摘出した。30週目に、群1つ当たりの動物3匹を屠殺した。
7週目にサンプリングされた筋組織を、低温切片化により、全長ジストロフィンに対するIHCにかけた。13、21、及び30週目にサンプリングされた筋組織を、パラフィンブロックにより、免疫染色した。パラフィンブロックによるIHCは、低温切片化によるIHCより、良好な品質の画像をもたらした。
筋肉試料を、1:100の希釈率の、マウスジストロフィンのC末端をターゲティングする一次抗体(型番:sc-816、Santa Cruz)、1:200の希釈率の、抗IgG二次抗体(型番:BA-1100、Vector)、次いで、赤色蛍光タグ付けのために、1:200の希釈率の、Dylight 594-streptavidin(型番:SA-5594、Vector、CA、USA)による、連続的な免疫染色にかけた。IHC画像は、Zeiss製のスライドスキャナー上(13、21、及び30週目において)、又はOlympus製の蛍光顕微鏡上(7週目において)で捕捉した。加えて、DAPI染色を実行した。
図40は、30週目に摘出された筋肉試料についての群ごとの全長ジストロフィンIHC画像の代表的なセットである。野生型(WT)陰性対照群は、筋線維束の天然の構造を反映する、ジストロフィン発現の顕著に異なる鮮明なパターンをもたらした。mdxマウス陰性対照群では、それほど強い全長ジストロフィン染色は見られなかった。その一方で、200ピコモル/kg処置群の骨格筋では、ジストロフィン染色の、強く、鮮明なパターンが観察された。mdxマウスでは、筋線維束構造がWTマウスと比較して不鮮明であったが、ASOで処置された動物では、全長ジストロフィン発現が顕著に増大した。
「ImageJ」プログラム(NIH)を使用して、各個別のIHC画像内の赤色蛍光の強度をディジタル式に評定することにより、ジストロフィンのIHC画像を、全長ジストロフィン発現についての定量化にかけた。個別の蛍光スコアを、野生型陰性対照群に対する統計学的評価のために、群及び筋肉型ごとに組み合わせた。
図41は、mdxマウスにおける、全長ジストロフィンタンパク質の相対発現レベルの変化についてまとめる。全長ジストロフィンの発現は、ASO用量が大きく、処置の持続期間が長くなると増大する傾向があった。30週目において、200ピコモル/kg群における、全長ジストロフィン発現が、WT陰性対照群の>80%に達したのに対し、mdx陰性対照における発現は、野生型陰性対照群の20%未満であった。
[エクソンスキッピングのためのネステッドPCR(方法B)]筋肉試料を、氷上に保たれた試験管内ですり潰すことによりホモジナイズし、筋組織約100mg当たり、1mLのトリゾール試薬(Invitrogen)による、全RNAの抽出にかけた。全RNAを、「DMDについての実施例2」で記載されている通りに、ネステッドPCRによるエクソンスキッピングについて評価した。
図42は、7週目にサンプリングされた骨格筋により得られた、ネステッドPCR産物の電気泳動データを提示する。ASO処置群の筋肉試料中では、Δ第21〜23エクソン及びΔ第21〜24エクソンの、フレーム内のPCR産物が検出されたが、mdx陰性対照群の筋肉試料中では、全く検出されなかった。
[H&E染色による組織病理学]筋肉の炎症及び変性は、DMD症状の顕著な特徴である。骨格筋試料を、H&E染色による組織病理学評価にかけた。図43は、群及びサンプリング時点ごとの、三頭筋についてのH&E染色画像の、代表的なセットを提示する。
WT陰性対照群では、筋肉構造は、全てのサンプリング時点において、稠密であった。全ての時点において、野生型マウスの筋肉内では、筋肉の炎症についての示唆が見られなかった。
mdx陰性対照では、筋肉構造は、年齢と共に、段階的な変性の、明確なパターンを示した。最も注目すべきことは、30週目において、筋束が、相互接続されず、丸形に変性する傾向があったことである。また、とりわけ、13及び21週目において、青色の点状の染色により示唆される、炎症性細胞の大規模な浸潤も見られた。
200ピコモル/kg群では、7週目における、緩い筋肉構造が、稠密な構造に、徐々に回復した。7週目における炎症性細胞の顕著な浸潤は、週齢と共に、徐々に消滅した。こうして、mdxマウスにおける、筋肉の変性及び炎症は、200ピコモル/kgのASOの慢性投与により拮抗され、これは、200ピコモル/kg群における全長ジストロフィンの上方調節と符合するであろう。
10ピコモル/kg群及び50ピコモル群における、組織病理学所見の重症度は、mdx陰性対照における重症度より軽かったが、200ピコモル/kg群における重症度より重かった。したがって、ASOへの曝露により誘導された、全長ジストロフィンの上方調節は、大部分、組織病理学的所見と符合する。
[その他の所見]慢性筋肉炎症により発症した可能性が極めて高い、筋リンパ腫の大きな塊に起因して、mdx陰性対照群では、3例の日程外の屠殺又は死亡(26、39、及び43週目)が見られた。全てのASO処置群では、リンパ腫の症例が見られなかった。
[他のジストロフィンASOとの比較]エテプリルセン(exondys 51)は、ヒトジストロフィンプレmRNAにおける、第51エクソンのスキッピングを誘導するように設計された、PMOアンチセンスオリゴヌクレオチドである。近年、米国FDAは、第51エクソンのスキッピングを必要とするDMD患者の集団における使用のための、エテプリルセンの承認の加速化を発表した。エテプリルセンの推奨用量は、毎週30mg/kgの静脈内注射である。
「DMD-ASO 1」の、200ピコモル/kgの皮下用量は、約1mg/kgに対応する。式IのジストロフィンASOは、PMO ASOより、約30,000倍強力であるが、ASOの2つの種類の間には、種及びエクソンの差違が存在する。ここでもまた、式IのPNA誘導体の、先例がないほどに極度に強力なエクソンスキッピング効力は、この処置が難しい、希少な疾患のための、極度に強力な、in vivoにおける治療効力に橋渡しされた。
[DMDについての実施例6]
「DMD-ASO 2」を慢性投与されたmdxマウスにおける歩行距離による筋機能の改善
表7で指定された「DMD ASO 2」とは、マウスジストロフィンプレmRNA内の、第22イントロンと、第23エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、17量体のASOである。「DMD-ASO 2」は、[(5'→3')uaauuuugag│GCUCUGCAAA]の20量体のマウスジストロフィンプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、17量体の配列に相補的に結合する。「DMD-ASO 2」は、第22イントロンとの8量体の重複及び第23エクソンとの9量体の重複を保有する。
「DMD-ASO 2」を、mdxマウスに慢性投与して、クレアチンキナーゼ(CK)及びミオグロビンの血清レベルにより、トレッドミル上の歩行距離による筋機能を改善し、筋分解を阻害する、その能力を評価した。
[動物及び群分け]雄mdxマウス(6週齢)を、mdxの陰性対照(ASOによる処置を伴わない)、体重に基づく、10ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」及び30mg/kgの「DMD-ASO 2」(群1つ当たりのN=16)による3つの群に無作為に割り付けた。12匹の雄C57BL/6マウス(6週齢)を、野生型(WT)陰性対照群として採用した。
[注射液及びASOによる処置]「DMD-ASO 2」の水性母原液を、PBS中、又は0.1%のTween 80を補充したPBS中で系列希釈して、10ピコモル/kg及び30ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」のための、それぞれ20及び60nMの「DMD-ASO 2」の注射液を調製した。PBS注射液への、0.1%のTween 80の補充は、ASO分子が、プラスチック製の注射用バイアル、ピペットチップ、及びシリンジに粘着することを防止するのに必要であると考えられた。
[トレッドミル上の歩行距離]群分け後、最初の30週間では、動物にTween 80を伴わない注射液を2mL/kgで毎週2回投与した。7週目から、動物を毎週ベースでトレッドミル(型番:LE8710、PanLab)上の歩行下に置いた。しかし、最初の30週間において、ASO処置群は、mdx陰性対照群と比較して、歩行距離の有意な改善を示さなかった。
ASO用量を、効果的に増大させるために、動物に、Tween 80を補充した注射液を、36週目から、毎週2回投与した。間に、5週間の休薬(すなわち、ASO投与を伴わない)期間を設けた。
図44Aは、43〜48週目における、群ごとの、トレッドミル上の歩行距離についてまとめる。mdx陰性対照群の平均歩行距離は、徐々にではあるが、43週目における約250メートルから、48週目における130メートルに、急速に減少した。ASO処置群の平均歩行距離は、mdx陰性対照群の距離より、顕著に長かった。
46〜48週目において、10ピコモル/kg群は、240〜280メートルの平均歩行距離を示したが、これは、mdx陰性対照群の距離より、有意に長かった。その一方で、30ピコモル/kg群は、46〜48週目において、約180〜230メートルの平均歩行距離を示した。30ピコモル/kg群より、10ピコモル/kg群による歩行距離が、長くなる傾向が見られた。歩行距離による、逆の用量応答は、「HIF-1αについての実施例9」で観察される通り、高ASO用量における、異なるエクソン(複数可)に対する、天然の選択を示唆するであろう。興味深いことに、WT陰性対照群と、30ピコモル/kg群とは、44〜47週目において、同等の歩行距離を示した。
[終了時における屠殺]48週目に、血液サンプリングのために、動物を、終了時における屠殺にかけた。製造元の指示書に従い、血液試料を、CK(Creatine Kinase Activity Assay Kit、型番:ab 155901、Abcam)、及びミオグロビン(Myoglobin ELISA Kit、型番:ab210965、Abcam)の血清レベルについて解析して、筋肉分解の程度を評価した。筋組織を、全長ジストロフィンについてのウェスタンブロットにより解析した。
[CK及びミオグロビンの血清レベル]図44Bは、群ごとに観察された血清CKレベルを提示する。mdxマウスの筋肉の脆弱性を反映して、全てのmdxマウス群は、WT陰性対照群より、有意に高度な、血清CK活性をもたらした。例えば、mdx陰性対照群の血清CKレベルは、WT陰性対照群のレベルより、約54倍高かった。10ピコモル/kg群及び30ピコモル群の血清CKレベルは、mdx陰性対照群のレベルより、それぞれ、58%及び38%低かった。10ピコモル/kg群と、mdx陰性対照群との、血清CKレベルの差違は、有意であった。
図44Cは、群ごとに観察された血清ミオグロビンレベルを提示する。mdxマウスの筋肉の脆弱性を反映して、全てのmdxマウス群は、WT陰性対照群のレベルより、はるかに高度な血清ミオグロビンレベルをもたらした。例えば、mdx陰性対照群の血清ミオグロビンレベルは、WT陰性対照群のレベルより、約22倍高かった。10及び30ピコモル/kg群の血清ミオグロビンレベルは、mdx陰性対照群のレベルより、それぞれ67%及び58%有意に低かった。
筋肉の分解についての血清バイオマーカーの観察されたデータは、図44Aに提示される歩行距離の用量依存性と大まかに符合する。
[ウェスタンブロットによる、三頭筋における全長ジストロフィン発現]液体窒素温度におけるホモジナイゼーションの後、筋肉(三頭筋)試料を、1%のSDSを補充したRIPA緩衝液中の溶解にかけた。各溶解物中のタンパク質濃度を、BSA標準物質に対するBCAアッセイにより定量化した。各溶解物のタンパク質50mgずつを8%のPAGEゲル上の電気泳動による分離にかけた。次いで、PVDF膜を、C末端をターゲティングするジストロフィン抗体(型番:ab154168、Abcam)でプローブした。
図45Aは、観察されたウェスタンブロットデータを提示する。427Kのサイズの全長ジストロフィンは、全ての試料中で検出されなかった。代わりに、WTの筋肉試料は、170K、130K、及び117Kのサイズの小型のジストロフィンタンパク質をもたらし、これらのうち、130Kのサイズのバンドが最も濃縮された。
mdx群の場合、3つのジストロフィンバンドが検出された。10ピコモル/kg処置群及び30ピコモル処置群は、mdx陰性対照群並びにWT対照群より顕著に強い117Kバンドをもたらした。130Kバンドの強度も、mdx陰性対照群より、10ピコモル/kg群において大幅に強かった。
[DMDについての実施例7]
「DMD-ASO 1」、「DMD-ASO 2」、又は「DMD-ASO 6」を投与されたmdxマウスについての長期評価
表7で指定された「DMD ASO 6」とは、マウスジストロフィンプレmRNA内の、第23エクソンと、第23イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、18量体のASOである。「DMD-ASO 6」は、[(5'→3')AAAAUUUCAG│guaagccgagguuug]の25量体のマウスジストロフィンプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、18量体の配列と相補的に重複する。「DMD-ASO 6」は、第23エクソンとの8量体の重複及び第23イントロンとの10量体の重複を保有する。
「DMD-ASO 1」、「DMD-ASO 2」、及び「DMD-ASO 6」を長期の皮下投与により、雄mdxマウスにおける、それらの生理学的効果について評価した。この評価では、動物を、ジストロフィン遺伝子の転写を、過剰な筋刺激により攪乱せずに保つために、筋緊張を必要とする身体試験にかけなかった。
[動物及び群分け]雄mdxマウス(6週齢)を、mdxの陰性対照(ASOによる処置を伴わない)、体重に基づく、50ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」、10mg/kgの「DMD-ASO 2」、及び10mg/kgの「DMD-ASO 6」(群1つ当たりのN=12〜13)による、4つの群に、無作為に割り付けた。12匹の雄C57BL/6マウス(6週齢)を野生型(WT)陰性対照群として採用した。
[注射液及びASOによる処置]ASOの水性母原液を、PBS中で系列希釈して、50ピコモル/kgの「DMD-ASO 1」のための25nMの「DMD-ASO 1」、10ピコモル/kgの「DMD-ASO 2」のための5nMの「DMD-ASO 2」、及び10ピコモル/kgの「DMD-ASO 6」のための5nMの「DMD-ASO 6」の注射液を調製した。動物に2mL/kgで毎週2回、注射液を皮下投与した。
[日程外の死亡又は屠殺]ASOで処置されたmdxマウスは、mdx陰性対照群より長い寿命を示す傾向があったことから、ASOの治療活性が示唆される。
mdx陰性対照群では、3例の日程外の死亡又は屠殺:42、58、及び61週目において、一度に1例ずつが見られた。「DMD-ASO 1」処置群は、1例は、38週目であり、別の例は、61週目である、2例の若齢死を示した。「DMD-ASO 2」処置群の場合、1例の死亡は56週目であり、別の例は62週目であった。「DMD-ASO 6」処置群では、3例の若齢死:55、65、及び66週目において、一度に1例ずつが見られた。
[終了時における屠殺]群分け後66週目に、血液サンプリングのために、全ての生存動物を屠殺した。血液試料を、「DMDについての実施例6」で記載されている通りに、血清クレアチンキナーゼ(CK)及び血清ミオグロビンについてのELISAアッセイにかけた。
[CK及びミオグロビンの血清レベル]図45Bは、群ごとに観察された血清CKレベルを提示する。mdxマウスの筋肉の脆弱性を反映して、全てのmdxマウス群は、WT陰性対照群より、有意に高度な、血清CK活性をもたらした。例えば、MDX陰性対照群の血清CKレベルは、WT陰性対照群のレベルより、約17倍高かった。ASO処置群の血清CKレベルは、MDX陰性対照群のレベルより低い傾向があったことから、ASOによる治療活性が示唆される。しかし、差違は、有意ではなかった。
図45Cは、群ごとに観察された血清ミオグロビンレベルを提示する。mdxマウスの筋肉の脆弱性を反映して、全てのmdxマウス群は、WT陰性対照群より、有意に高度な、血清ミオグロビンをもたらした。例えば、mdx陰性対照群の血清ミオグロビンレベルは、WT陰性対照群のレベルより、約26倍高かった。「DMD-ASO 1」、「DMD-ASO 2」、及び「DMD-ASO 6」の処置群の血清ミオグロビンレベルは、mdx陰性対照群のレベルより、それぞれ、43%、49%、及び68%低かった。MDX陰性対照群と、「DMD-ASO 6」群との差違は、有意であった。筋肉の完全性についての血清バイオマーカーは、「DMD-ASO 6」が、mdxマウスにおいて、ジストロフィンの第23エクソンのスキッピングを誘導し、機能的に活性の全長ジストロフィン(複数可)をもたらすことを間接的に裏付ける。
IDO1 ASOの、in vitro活性についての例
表8における、式IのPNA誘導体は、ヒトIDO1プレmRNA内の多様なスプライス部位を相補的にターゲティングするように設計した。IDO1 ASOをSKOV3細胞内のエクソンスキッピング活性について評価した。IDO1が、L-トリプトファンからN-ホルミルキヌレニンへの分解を触媒することを踏まえ、IDO1 ASOを、キヌレニンの産生を阻害するそれらの機能的な能力について評価した。本明細書で提示される生物学的例は、式Iの化合物についての例としての、IDO1 ASOのエクソンスキッピング活性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲をIDO1 ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[IDO1についての実施例1]
「IDO-ASO 1」により誘導されるエクソンスキッピング
表8で指定された「IDO-ASO 1」とは、ヒトIDO1プレmRNA内の、第6イントロンと、第7エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、13量体のASOである。「IDO-ASO 1」は、[(5'→3')uuuguuuuag│GUAAUUCCUA]の20量体のヒトIDO1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、13量体の配列を相補的にターゲティングする。「IDO-ASO 1」は、第6イントロンとの5量体の重複及び第7エクソンとの8量体の重複を保有する。
「IDO-ASO 1」を以下の通りに、IDO1ネステッドPCRにより、SKOV3細胞(型番:HTB-77、ATCC)内のエクソンスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]SKOV3(ヒト卵巣腺がん)細胞を、37℃、5%のCO2下、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、1%のL-グルタミン、及び1%のピルビン酸ナトリウムを補充された、5mLのマッコイ5A改変培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で継代培養し、0zM(陰性対照)、10zM、100zM、又は1aMの「IDO-ASO 1」で、48時間にわたり処置した。
[RNAの抽出及びワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを、細胞から抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による40サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[IDO-エクソン2_フォワード:(5'→3')TTCATTGCTAAACATCTGCC;及びIDO-エクソン10_リバース:(5'→3')TGAAAGGACAAACTCACGGA]のセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による30サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[IDO-エクソン4_フォワード:(5'→3')CCTTACTGCCAACTCTCC;及びIDO-エクソン9_リバース:(5'→3')CTGCTTTGGCCTGCACTG]のセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)においてさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]PCR産物を2%のアガロースゲル上の電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。
図46Aは、ネステッドPCR産物の電気泳動データ(左図)、及び第6〜7エクソンのスキッピングに割り当てられる、PCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータ(右)を提示する。第6〜7エクソンのスキッピングは、100zMの「IDO-ASO 1」で処置された細胞のRNA抽出物中で検出された。エクソンスキッピングバンドは、10zM又は1aMのASOで処置された細胞のRNA抽出物中では検出されなかったが、これは、第6〜7エクソンを欠く、IDO1 mRNAスプライス変異体の安定性の低下に起因する可能性が最も高い。全長IDO-1 mRNAの強度は、10又は100zMのASOで処置された細胞内で低下したが、全長mRNA PCRの強度は、1aMのASO処置で処置された細胞内で増大した。1aMで観察された、全長mRNAレベルの上昇は、いまだ解明されていない。PCR反応時におけるアーチファクトの可能性もあり、「IDO-ASO 1」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による、転写の(一過性の)上方調節に起因する可能性もあろう[Nature Struct. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。サンガーシーケンシングデータ(右図)は、SKOV3細胞内で、「IDO-ASO 1」により誘導された、第6〜7エクソンのスキッピングを、明確に裏付けた。
[IDO1についての実施例2]
「IDO-ASO 1」のアンチセンス機能活性
「IDO-ASO 1」の機能活性を以下の通りに、SKOV3細胞内のキヌレニンの分泌を阻害するその能力について評価した。
[キヌレニン分泌アッセイ]5mLの培養培地を含有する、60mmの培養ディッシュ内で増殖させたSKOV3細胞を、0zM(陰性対照)又は10zM〜1fMの「IDO-ASO 1」で処置した(濃度1つ当たり3つずつのディッシュ)。細胞を、10ng/mLのγ-インターフェロンと共に、ASOで処置して、キヌレニン分泌を増大させた。24時間後、200μLの培養培地を、各培養ディッシュからサンプリングし、30%のトリクロロ酢酸100μLと混合した。混合物を、ボルテックスし、8,000gで、5分間にわたる遠心分離にかけた。結果として得られる、75μLの上清を、75μLのエールリッヒ試薬(酢酸中に0.8%のp-ジメチルアミノベンズハルデヒド)と混合し、混合物を、ELISAリーダー上、490nmにおける、キヌレニンの定量化にかけた[PLOS One 5(8): e63301 (2013)]。
図46Bは、キヌレニンアッセイの結果を提示する。1aMの「IDO-ASO 1」で処置された細胞を除き、キヌレニンの分泌は、10zM〜1fMのASOで処置された細胞内で有意に(スチューデントのt検定)低下した。キヌレニンの分泌は、1fMの「IDO-ASO 1」で処置された細胞内で、約40%低下した。
[IDO1についての実施例3]
「IDO-ASO 5」により誘導されるエクソンスキッピング
表8で指定された「IDO-ASO 5」とは、ヒトIDO1プレmRNA内の、第3エクソンと、第3イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、13量体のASOである。「IDO-ASO 5」は、[(5'→3')UGUCCGUAAG│guuuggagau]の20量体のヒトIDO1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、13量体の配列と相補的に重複する。「IDO-ASO 5」は、第3エクソンとの、8量体の相補的な重複、及び第3イントロンとの、5量体の相補的な重複を有する。
「IDO-ASO 5」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「IDO1についての実施例1」において記載される通りに、IDO1ネステッドRT-PCRにより、SKOV3細胞内のエクソンスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[ASOによる処置]60mmの培養ディッシュ内で増殖させたSKOV3細胞を、0(陰性対照)、1、3、10、30、又は100aMの「IDO-ASO 5」で、48時間にわたり処置した。
[ワンステップPCRによるcDNAの合成]200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、52℃で30秒間、及び72℃で40秒間による40サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[IDO-エクソン1_フォワード:(5'→3')AAAACTCCTGGACAATCAGT;及びIDO-エクソン8_リバース:(5'→3')ACTTGAAGGGCTTTCTCC]のセットに対して、platinum(登録商標) Taq polymerase(型番:10928-042、Invitrogen)を伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kitを使用する、25μlの逆転写反応にかけた。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、52℃で40秒間、及び72℃で40秒間による30サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[IDO-エクソン1n_フォワード:(5'→3')TATTGATGAAGAAGTGGG;及びIDO-エクソン8n_リバース:(5'→3')GTTCACATGATCGTGGATTTG]のセットを使用する、20μLのネステッドPCR(型番:K2612、Bioneer)反応においてさらに増幅した。
[ネステッドPCR産物のデータ]図47Aは、ネステッドPCR産物の電気泳動データを提示する。30及び100aMの「IDO-ASO 5」で処置された細胞は、第2〜4エクソン及び第2〜6エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体を明確にもたらした。ASOで処置された細胞内では、全長mRNAの強度が低下したが、10aMのASOで処置された細胞内では、強度はわずかに上昇した。図47Bは、第2〜4エクソン及び第2〜6エクソンを欠くmRNAスプライス変異体についてのサンガーシーケンシングデータを提示する。
[IDO1についての実施例4]
「IDO-ASO 6」により誘導されるエクソンスキッピング
表8で指定された「IDO-ASO 6」とは、ヒトIDO1プレmRNA内の、第3イントロンと、第4エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位内の領域と完全に相補的な、13量体のASOである。「IDO-ASO 6」は、[(5'→3')uuuuaaucag│GUCUUGCCAA]の20量体のヒトIDO1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、13量体の配列を相補的にターゲティングする。「IDO-ASO 6」は、第3イントロンとの、5量体の相補的な重複、及び第4エクソンとの、8量体の相補的な重複を保有する。
「IDO-ASO 6」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「IDO1についての実施例3」において記載される通りに、IDO1ネステッドPCRにより、SKOV3細胞内のエクソンスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[ネステッドPCR産物のデータ]図47Cは、エクソンスキッピングに割り当てられる、PCRバンドについてのサンガーシーケンシングデータ(右図)と共に、ネステッドPCR産物の電気泳動データ(左図)を提示する。1〜30aMの「IDO-ASO 6」で処置された細胞は、第2〜5エクソンを欠く、単一のmRNAスプライス変異体を明確にもたらしたが、100aMのASOで処置された細胞内では、エクソンスキッピングバンドは、検出されなかった。全長mRNAの強度は、ASOで処置された細胞内で、ASOによる処置を伴わない細胞内より強力であったが、これは、「IDO-ASO 1」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による、転写の上方調節に起因しうるであろう[Nature Struct. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。
SNAP25 ASOの、in vitro活性及びex vivo活性についての例
SNAP25(25kDaのシナプトソーム関連タンパク質)とは、運動ニューロン細胞内の神経伝達物質のエクソサイトーシスに関与する、SNAREタンパク質である。ボツリヌストキシンA(Botox(商標))は、その有名な抗皺活性のために、SNAP25を切断する。表9における、式IのPNA誘導体は、ヒトSNAP25プレmRNA内の、第7エクソンの3'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするように設計した。SNAP25 ASOを、SiMa(ヒト神経芽細胞腫)細胞内及びラット由来のPC12細胞内の、SNAP25アンチセンス活性について、並びに局所投与時に、マウスの皮膚内の、SNAP25発現を阻害するそれらの能力について評価した。本明細書で提示される生物学的例は、式Iの化合物についての例としてのSNAP25 ASOのエクソンスキッピング活性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲をSNAP25 ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[SNAP25についての実施例1]
「SNAP-ASO 3」で処置されたPC12細胞内のエクソンスキッピング
表9で指定された「SNAP-ASO 3」とは、ヒトSNAP25プレmRNA内の、「第6イントロン」と、「第7エクソン」との接合部にわたる3'側スプライス部位内の、14量体の配列と完全に相補的な14量体のASOである。「SNAP-ASO 3」は、[(5'→3')cucuuuggaucccag│GGUAACAAAUGAUGC]の30量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、14量体のプレmRNA配列と相補的に重複する。「SNAP-ASO 3」は、「第6イントロン」との、7量体の重複、及び「第7エクソン」との、別の7量体の重複を保有する。
「SNAP-ASO 3」を、ラットゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_005012からアクセスされた]から読み取られた、ラットSNAP25プレmRNA内の、「第7エクソン」の3'側スプライス部位との単一のミスマッチを保有するが、PC12細胞(型番:CRL- 1721、ATCC)内のエクソンスキッピングを誘導する、その能力について評価した。14量体のASOは、[(5'→3')ugg"c"ucccag│GGUAACAAACGAUGC][配列中、単一のミスマッチは、引用符(“")でマークされる]の25量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ラットSNAP25プレmRNAとの、13量体の相補的な重複を保有する。
[細胞の培養及びASOによる処置]PC12細胞を、37℃、5%のCO2雰囲気下、5%のFBS、10%のウマ血清、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、1%のL-グルタミン、及び1%のピルビン酸ナトリウムを補充した、RPMI 1640培地中で維持した。5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させた細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 3」で処置した。
[RNAの抽出及びワンステップPCRによるcDNAの合成]「SNAP-ASO 3」を伴う、42時間にわたるインキュベーションの後、細胞を、リボソームによる翻訳を中止させるために、100μg/mLのシクロヘキシミドで、さらに6時間にわたり処置した。次いで、製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による40サイクルに従い、[SNAP-エクソン1_フォワード:(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA;及びSNAP-エクソン14_リバース:(5'→3')AGCATCTTT-GTTGCACGTTG]のエクソン特異的プライマーのセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:95℃で2分間に続く、95℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による34サイクルに従い、[SNAP-エクソン1_フォワード:(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA;SNAP-エクソン14n_リバース:(5'→3')TTGTTGGAGTCAGCGCCT]の、エクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)にかけた。
[エクソンスキッピング産物の同定]PCR産物を2%のアガロースゲル上の電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。
図48Aは、PCR産物の電気泳動データを提示するが、この場合、10zM ASO処置試料は、第5〜7エクソンのスキッピングに割り当てられる、微弱なPCRバンド(左図を参照されたい)をもたらした。リボソームによる翻訳を中止させることにより、全長mRNAを不安定化させるように、細胞をシクロヘキシミドで処置してもなお、エクソンスキッピングバンドは、微弱に検出されるに過ぎない。したがって、第5〜7エクソンのスキッピングに割り当てられる、SNAP25 mRNAのスプライス変異体は、全長mRNAと比較して、細胞内の代謝的安定性の低下を示す可能性が高い。エクソンスキッピングのPCR産物は、図48Aにおいて示される通り、エクソン(第5〜7)のスキッピング(右図を参照されたい)であることがシーケンシングされた。第6エクソンのスキッピングに割り当てられるPCR産物が、ASO濃度に関わらず観察されたことを踏まえ、第6エクソンのスキッピングは、自発的に生じると考えられる。
全長SNAP25 mRNAの強度は、10zMの「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内で、最も大きく低下した。全長mRNAの強度は、ASO濃度が10から1,000zMに増大するにつれ、陰性対照(すなわち、ASOによる処置を伴わない)の強度に徐々に増大した。ネステッドPCRデータ中の、逆の用量反応パターンは、「SNAP-ASO 3」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による転写の上方調節に起因しうるであろう[Nature Struc. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。
[SNAP25についての実施例2]
「SNAP-ASO 3」で処置されたPC12細胞内のSNAP25 mRNAについてのqPCR
「SNAP-ASO 3」を以下の通りに、SNAP25ネステッドqPCRにより、PC12細胞内のラットSNAP25 mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたPC12細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 3」で処置した(ASO濃度1つ当たり、2つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]「SNAP-ASO 3」を伴う、42時間にわたるインキュベーションの後、細胞を、リボソームによる翻訳を中止させるために、100μg/mLのシクロヘキシミドで、さらに6時間にわたり処置した。次いで、製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを、細胞から抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、55℃で30秒間、及び72℃で1分間による20サイクルに従い、[SNAP-エクソン1_フォワード:(5'→3')ATGGCCGAGGACGCAGACA;及びSNAP-エクソン14_リバース:(5'→3')AGCATCTTTGTTGCACGTTG]のエクソン特異的プライマーのセットに対して、One Step RT-PCR kit(Invitrogen、USA)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドqPCRによる増幅]100倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で10秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルに従い、[SNAP-エクソン7q_フォワード:(5'→3')ATGGATGAAAACCTAGAGC;及びSNAP-エクソン8q_リバース:(5'→3')CTTCCCAGCATCTTTGTT]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。全長SNAP25 mRNAを定量化するために、第7エクソンと第8エクソンとの接合部をターゲティングする、[(5'→3')5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ]のTaqmanプローブによるqPCR反応に従った。
図48Bは、qPCRデータを提示するが、ここで、全長mRNAレベルは、10zM及び100zMの「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内で、それぞれ、約50%及び20%、有意に低下した(スチューデントのt検定)。しかし、1,000zMの「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内の、全長mRNAレベルは、ASOによる処置を伴わない細胞(すなわち、陰性対照)のレベルより、わずかに高かった。
qPCRデータの、逆の用量反応パターンは、「SNAP25についての実施例1」で記載されている、エクソンスキッピング時における全長mRNAレベルの用量反応パターンと極めてよく符合することから、ASO用量が10から1,000zMに増大するときの転写の上方調節が示唆される。したがって、ラットSNAP25プレmRNAとの13量体の相補的な重複は、エクソンスキッピング時に蓄積されるEIciRNAにより誘導される、転写の上方調節をノックダウンするのに十分ではないであろう。
[SNAP25についての実施例3]
「SNAP-ASO 1」で処置されたPC12細胞内のSNAP25 mRNAについてのqPCR
表8で指定された「SNAP-ASO 1」とは、ヒトSNAP25プレmRNA内の、第6イントロンと、第7エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位の16量体の配列と完全に相補的な、16量体のASOである。「SNAP-ASO 1」は、[(5'→3')cucuuuggaucccag│GGUAACAAAUGAUGC]の30量体のヒトプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、16量体の標的配列と相補的に重複する。「SNAP-ASO 1」は、第6イントロンとの6量体の重複及び第7エクソンとの10量体の重複を保有する。しかし、ASOは、[(5'→3')uggcucccag│GGUAACAAA"C"GAUGC][配列中、単一のミスマッチを、引用符(“")でマークする]の25量体のプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ラットSNAP25プレmRNAとの、単一のミスマッチを保有する。
「SNAP-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SNAP25についての実施例2」において記載されている通りに、SNAP25ネステッドqPCRにより、PC12細胞内の、ラットSNAP25 mRNAレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。
図48Cは、qPCRデータを提示するが、ここで、全長mRNAレベルは、10zM、100zM、及び1,000zMの「SNAP-ASO 1」で処置された細胞内で、それぞれ、約50%、40%及び70%、有意に低下した(スチューデントのt検定)。
「SNAP-ASO 3」の場合と同様に、「SNAP-ASO 1」によっても、用量が10から100zMに増大するにつれて、逆の用量反応パターンが部分的に再現された。しかし、ASO濃度が、1,000zMに増大したとき、全長mRNAレベルは、さらに低下したことを踏まえると、「SNAP-ASO 1」のエクソンスキッピングの有効性は、「SNAP-ASO 3」の有効性より強力であると考えられる。「SNAP-ASO 1」のラットプレmRNAとの15量体の相補的な重複は、高度なエクソンスキッピングの有効性の一因となるであろう。
[SNAP25についての実施例4]
「SNAP-ASO 3」によるPC12細胞内のSNAP25タンパク質発現の阻害
「SNAP-ASO 3」を以下の通りに、PC12細胞内のSNAP25タンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
PC12細胞を、5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させ、0zM(陰性対照)、1zM、10zM、30zM、100zM、300zM、1aM、3aM、又は10aMの「SNAP-ASO 3」で48時間にわたり処置した。4つの培養ディッシュを、ウェスタンブロット解析時における潜在的な技術アーチファクトを代償する陰性対照とした。
[細胞溶解]次いで細胞を、0.1%のSDS及び1倍濃度のプロテイナーゼ阻害剤カクテル(cOmplete Mini、Roche)を補充した1倍濃度のRIPA緩衝液(型番:9806、Cell Signaling Tech)200μLを伴う、氷上の溶解にかけた。溶解物を1.5mLのeチューブ内に回収し、5倍濃度の試料緩衝液100μLと混合し、5分間にわたり沸騰させた。
[ウェスタンブロット]溶解物を4〜15%のTGX-PAGE gradient gel(型番:456-1086、Bio-Rad)上の電気泳動による分離にかけ、次いで、0.45μmのPVDF膜に転写した。膜は、抗SNAP25抗体(型番:S9684、Sigma)及び抗β-アクチン抗体(型番:A3845、Sigma)でプローブした。
図49Aは、デンシトメトリーによる、β-アクチンに対して正規化された、相対SNAP25発現レベル(下図)と共に、PC12細胞溶解物により得られたSNAP25ウェスタンブロットデータ(上図)を提示する。SNAP25タンパク質レベルは、「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内で、10〜60%低下した。陰性対照(すなわち、0zMの「SNAP-ASO 3」)の発現レベルは、4例の試料の平均発現レベルである。
[SNAP25についての実施例5]
「SNAP-ASO 1」によるPC12細胞内のSNAP25タンパク質発現の阻害
「SNAP-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「SNAP25についての実施例4」において記載されている通りに、PC12細胞内のSNAP25タンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。PC12細胞を0(陰性対照)、100、又は1,000zMの「SNAP-ASO 1」で48時間又は72時間にわたり処置した(各ASO濃度について、1つずつの培養ディッシュ)。
図49Bは、48時間(左)及び72時間(右)にわたる、ASOによる処置についてのウェスタンブロットデータを提示する。「SNAP-ASO 1」は、いずれの時点においてもPC12細胞内のSNAP25タンパク質の発現を大幅に阻害した。
[SNAP25についての実施例6]
「SNAP-ASO 3」によるSiMa細胞内のSNAP25タンパク質発現の阻害
「SNAP-ASO 3」を以下の通りに、SiMaヒト神経芽細胞腫細胞内のSNAP25タンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]SiMa細胞(型番:ACC 164、DSMZ)を、37℃、5%のCO2雰囲気下、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、1%のL-グルタミン、及び1%のピルビン酸ナトリウムを補充した、RPMI 1640培地中で維持した。SiMa細胞を、5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させ、0zM(陰性対照)、1zM〜100aMの「SNAP-ASO 3」で、48時間にわたり処置した。3つの培養ディッシュを、ウェスタンブロット解析時における、潜在的な技術アーチファクトを代償する陰性対照とした。
[溶解]細胞を、0.1%のSDS及び1倍濃度のプロテイナーゼ阻害剤カクテル(cOmplete Mini、Roche)を補充した1倍濃度のRIPA緩衝液(型番:9806、Cell Signaling Tech)200μLを伴う、氷上の溶解にかけた。次いで、溶解物を1.5mLのeチューブ内に回収し、5倍濃度の試料緩衝液100μLと混合し、5分間にわたり沸騰させた。
[ウェスタンブロット]溶解物を12%のSDS-PAGEゲル上の電気泳動による分離にかけ、0.2μmの二フッ化ポリビニリデン(PVDF)膜に転写した。膜は、抗SNAP25抗体(型番:ab41455、Sigma)及び抗β-アクチン抗体(型番:A3845、Sigma)でプローブした。
図50Aは、デンシトメトリーによる、β-アクチンに対して正規化された、相対SNAP25発現レベル(下図)と共に、SiMa細胞溶解物により得られたSNAP25ウェスタンブロットデータ(上図)を提示する。SNAP25タンパク質レベルは、「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内で40〜50%低下した。
[SNAP25についての実施例7]
「SNAP-ASO 3」で処置されたSiMa細胞内のSNAP25 mRNAについてのqPCR
「SNAP-ASO 3」を以下の通りに、SNAP25ネステッドqPCRにより、SiMa細胞内のヒトSNAP25 mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]SiMa細胞を、5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させ、0zM(陰性対照)、1zM、10zM、100zM、又は1aM、10aM、若しくは100aMの「SNAP-ASO 3」で処置した(ASO濃度1つ当たり、2つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びcDNAの合成]製造元の指示書に従い、「RNeasy Mini Kit」(型番:74106、Qiagen)を使用して、全RNAを、細胞から抽出した。200ngのRNA鋳型を、ランダムヘキサマーに対して、PrimeScript(商標)1st strand cDNA synthesis Kit(型番:6110B、タカラバイオ株式会社)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[qPCRの増幅]PCR反応は、エクソン特異的プライマー[SNAP-エクソン6_フォワード:(5'→3')GACGAACGGGAGCAGATG;及びSNAP-エクソン8_リバース(2):(5'→3')ATCTCATTGCCC-ATATCCAGG]のセットに対して、第6エクソンと、第7エクソンとの接合部をターゲティングするTaqmanプローブ[(5'→3')56-FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ]でモニタリングした。サイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で15秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルである。
図50Bは、qPCRデータを提示するが、ここで、全長ヒトSNAP25 mRNAレベルは、1zM、100zM、1aM、及び100aMの「SNAP-ASO 3」で処置された細胞内で、約20〜40%、有意に低下した(スチューデントのt検定)。100aMのASOで処置された細胞は、40%の、最も強力な阻害を示した。
[SNAP25についての実施例8]
「SNAP-ASO 1」を局所投与されたマウスの皮膚内のSNAP25タンパク質発現の阻害
「SNAP-ASO 1」とは、マウスゲノムDNA[NCBI基準配列:NC_000068からアクセスされた]から読み取られた、マウスSNAP25プレmRNA内の第6イントロンと第7エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位と完全に相補的な16量体のASOである。「SNAP-ASO 1」を以下の通りに、局所投与時における皮膚内のSNAP25タンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
[剃毛及び群分け]0日目に、8匹の雌C57BL/6マウス(5週齢)に、ゾレチル/ロンパンで麻酔をかけ、バリカンで背部(約3cm×4cm)の体毛を刈り取った。マウスを4つの群、すなわち、非ASO処置群(陰性対照)、並びに1fM、10fM、及び100fMの「SNAP-ASO 1」の3つの処置群に無作為に割り付けた(群1つ当たりの動物2匹)。
[局所投与]局所溶液は、「SNAP-ASO 1」の水性原液を、3%(v/v)のグリセリンを補充した30%(v/v)の水性エタノール中で、0、1、10及び100fMの「SNAP-ASO 1」に系列希釈することにより調製した。0〜4日目において、脱脂綿を使用して、各動物の体毛を除去した背部皮膚に、約100μLの局所溶液を毎日2回、局所投与した。
[皮膚のサンプリング]4日目の午後に、ASOで局所処置された皮膚部分をサンプリングするために、動物にゾレチル/ロムプンで麻酔をかけた。次いで、下記で記載される通りに、皮膚試料を、SNAP25タンパク質に対するIHCにかけた。
[SNAP25 IHC]皮膚試料を低温切片化し、1:200の希釈率の抗SNAP25一次抗体(型番:ab41455、Abcam)、1:200の希釈率の、抗IgG二次抗体(型番:BA-1100、Vector)、次いで、赤色蛍光タグ付けのために、1:200の希釈率のDylight 594-streptavidin(型番:SA-5594、Vector、CA、USA)により、連続的に免疫染色した。抗SNAP25抗体は、SNAP25タンパク質のC末端をプローブする。IHC画像をZeiss製のスライドスキャナー上で捕捉して、SNAP25タンパク質の発現について評価した。DAPI染色を実施して、皮膚の微細構造を可視化した。
図51は、SNAP25 IHC画像の代表的なセットを群ごとに提示する。陰性対照群では、SNAP25タンパク質の発現は、真皮の直下の筋層において高度であった。筋層内のSNAP25タンパク質発現は、筋層に埋め込まれた、運動ニューロン軸索内のSNAP25タンパク質発現に由来すると考えられる。筋層内のSNAP25タンパク質発現は、用量が増大するにつれて、徐々に低下した。最も顕著な低下は、100fM処置群内で観察された。
IHCによる、皮膚内の全長SNAP25タンパク質発現の阻害は、PC12細胞内で観察される、ウェスタンブロットによる阻害(「SNAP25についての実施例5」を参照されたい)より強力であると考えられる。初代細胞内のEIciRNAによる、転写の上方調節は、存在する場合でも、PC12細胞及びSiMa細胞を含むがん細胞に関与する上方調節ほど顕著ではないと考えられた。
TYR ASOの、in vitro活性についての例
チロシナーゼ(TYR)とは、メラニン形成又は皮膚の染料沈着に関与する酵素である。表10における、式IのPNA誘導体は、ヒト又はマウスのTYRプレmRNA内の第2エクソンの3'側スプライス部位を相補的にターゲティングするように設計した。TYR ASOをヒトメラニン細胞内並びにB16F10(マウス黒色腫)細胞内のTYRアンチセンスエクソンスキッピング活性を評価した。本明細書で提示される生物学的例は、式Iの化合物についての例としてのTYR ASOのエクソンスキッピング活性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲をTYR ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[TYRについての実施例1]
B16F10細胞内の「TYR-ASO 4」により誘導されるエクソンスキッピング
表10で指定された「TYR-ASO 4」とは、[(5'→3')aauuguuuuucacag│AUCAUUUGUAGCAGA]の30量体のマウスTYRプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、マウスTYR内の第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位と完全に相補的な、13量体のTYR ASOである。その一方で、「TYR-ASO 4」は、[(5'→3')ggguguuuug"u"acag│AU"UG"U"C"UGUAGCCGA]の、30量体のプレmRNA配列内、引用符(“")でマークされた、ヒトTYRプレmRNA内の第1イントロンと第2エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位との、4つのミスマッチを保有する。
「TYR-ASO 4」を以下の通りに、B16F10黒色腫細胞内のマウスTYR第2エクソンのスキッピングを誘導するその能力について評価した。「TYR-ASO 4」は、ヒトTYRプレmRNAと完全に相補的な、「TYR-ASO 1」の良好な代替化合物として用いられうる。
[細胞の培養及びASOによる処置]B16F10マウス黒色腫細胞(型番:CRL-6475、ATCC)を、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン、及び0.01mg/mlのウシインスリンを補充した、DMEM(ダルベッコ改変イーグル最小必須培地)中で維持した。5 mLのDMEMを含有する、60mmの培養ディッシュ内で増殖させたB16F10細胞を、0(陰性対照)、1、10、100、又は1000aMの「TYR-ASO 4」と共に、5時間にわたりインキュベートした。
[RNAの抽出及びワンステップPCRによるcDNAの合成]製造元の指示書に従い、「Universal RNA Extraction Kit」(型番:9767、タカラバイオ株式会社)を使用して、全RNAを抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、52℃で30秒間、及び72℃で40秒間による15サイクルに従い、[TYR-エクソン1_フォワード:(5'→3')GTAAGTTTGGATTTGGGG;及びTYR-エクソン4_リバース:(5'→3')AGAGCGGTATGAAAGGAA]のエクソン特異的プライマーのセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応に使用した。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、以下のサイクル条件: 95℃で5分間に続く、95℃で30秒間、52℃で30秒間、及び72℃で40秒間による30サイクルに従い、[TYR-エクソン1n_フォワード:(5'→3')GAGAACTAACTGGGGATGA;及びTYR-エクソン4n_リバース:(5'→3')CGATAGGTGCATTGGCTT]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)においてさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]PCR産物を2%のアガロースゲル上の電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。
図52Aは、PCR産物の電気泳動データを提示する。ASOによる処置を伴わない細胞は、一方は、全長TYR mRNAについてのPCRバンドであり、他方は、第2エクソン及び第3エクソンを欠く、スプライス変異体のTYR mRNAについてのPCRバンドである、2つのPCRバンドをもたらしたことから、第2〜3エクソンの、自発的なスキッピングが示唆される。しかし、1〜1,000aMの「TYR-ASO 4」で処置された細胞は、本質的に、第2エクソン及び第3エクソンを欠く、スプライス変異体のTYR mRNAだけをもたらした。したがって、「TYR-ASO 4」は、B16F10黒色腫細胞内の、第2〜3エクソンのスキッピングの傾向を増大させる。
エクソンスキッピングのためのPCR産物は、図52Bにおいて示される通り、第2〜3エクソンを欠く、mRNAスプライス変異体であるとシーケンシングされた。
[TYRについての実施例2]
「TYR-ASO 4」で処置されたB16F10細胞内のTYR mRNAについてのqPCR
「TYR-ASO 4」を以下の通りに、TYRネステッドqPCRにより、B16F10細胞内のマウスTYR mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたB16F10細胞を、0(陰性対照)、1、10、100、又は1000aMの「TYR-ASO 4」で処置した(用量1つ当たり2つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びワンステップPCRによるcDNAの合成]全RNAを抽出し、「TYRについての実施例1」で記載されている通りにcDNA合成にかけた。
[ネステッドqPCRによる増幅]100倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で10秒間、及び60℃で30秒間の30サイクルに従い、第2エクソンと、第3エクソンとの接合部をターゲティングするTaqmanプローブセット(型番:Mm00495818_m1、Thermo Fisher Scientific)に対する20μLのリアルタイムPCR反応にかけた。
[統計学的解析]ネステッドqPCR実験は、独立に4回にわたり繰り返し、各実験による個別のmRNAレベルは、ASOによる処置を伴わないmRNAレベルに対して正規化した。4つの別個の実験全てから得られたmRNAレベルは、スチューデントのt検定による統計学的解析のためにプールした。したがって、RNA試料の数は、ASO濃度1つ当たり8例ずつである。
図52Cは、プールしたqPCRデータを提示するが、ここで、完全長mRNAレベルは、1〜1,000aMの「TYR-ASO 4」ASOで処置された細胞内で約40%有意に(スチューデントのt検定)低下した。
[TYRについての実施例3]
「TYR-ASO 4」によるB16F10細胞内のTYRタンパク質発現の阻害
「TYR-ASO 4」を下記で記載される通り、B16F10細胞内のTYRタンパク質の発現を阻害するその能力について評価した。
5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたB16F10細胞を0zM(陰性対照)、10zM、100zM、1aM、又は10aMの「TYR-ASO 4」で、24時間にわたり処置し、1倍濃度のプロテアーゼ阻害剤カクテル(型番:P8340、Sigma)を補充した、1倍濃度の細胞溶解緩衝液(型番:9803、Cell Signaling Tech)200μLを伴う溶解にかけた。200μLずつの各溶解物を5倍濃度の試料緩衝液100μLと混合し、100℃で5分間にわたり沸騰させた。20μLずつの各溶解物を、4-15%勾配TGX gel(型番:456-1086、Bio-Rad)上の電気泳動による分離、及び0.45μmのPVDF膜へのタンパク質転写にかけた。膜は、抗TYR抗体(型番:9319、Cell Signaling Tech)及び抗β-アクチン抗体(型番:a3845、Sigma)でプローブした。
図53Aは、B16F10細胞溶解物により得られたTYRウェスタンブロットデータを提示する。TYRタンパク質レベルは、陰性対照の溶解物中において「TYR-ASO 4」で処置された細胞の溶解物中より、大幅に高かった。
[TYRについての実施例4]
「TYR-ASO 4」によるB16F10細胞内のメラニン形成の阻害
「TYR-ASO 4」を下記で記載される通り、B16F10細胞内のメラニン形成を阻害するその能力について評価した。
5mLの培養培地を含有する60mmの培養ディッシュ内で増殖させたB16F10細胞を0(陰性対照)、又は1〜1,000aMの「TYR-ASO 4」、又は陽性対照としての、10若しくは100μg/mLのアルブチン(用量1つ当たり2つずつの培養ディッシュ)で処置した。24時間後、細胞を、200μLの1N NaOHによる溶解にかけた。各溶解物を、1.5mLのeチューブ内に回収し、室温で、一晩にわたり保持した。各溶解物中のメラニン含量は、ELISAリーダー上475nmの吸光度で決定した。実験は、異なる継代の細胞を使用して4回繰り返した。4セットのメラニン含量データを、処置を伴わないメラニン含量(陰性対照)に対するスチューデントのt検定による統計学的解析のためにプールした。
図53Bは、「TYR ASO 4」又はアルブチンを伴う、24時間にわたるインキュベーション後におけるB16F10細胞内のメラニン含量の変化についてまとめる。メラニン含量は、10μg/mL及び100μg/mLのアルブチンで処置された細胞内でそれぞれ約15%及び25%、有意に低下した。「TYR-ASO 4」で処置された細胞の場合、メラニン含量は、それほどの用量依存性を伴わずに、約15%有意に低下した。「TYR-ASO 4」の阻害活性は、10μg/mLのアルブチンの阻害活性と同等であった。
[TYRについての実施例5]
「TYR-ASO 1」で処置されたヒトメラニン細胞内のTYR mRNAについてのqPCR
表10で指定された「TYR-ASO 1」とは、[(5'→3')ggguguuuuguacag│AUUGUCUGUAGCCGA]の30量体のヒトTYRプレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトTYR内の第1イントロンと第2エクソンとの接合部にわたる3'側スプライス部位と完全に相補的な13量体のTYR ASOである。
「TYR-ASO 1」を以下の通りに、TYRネステッドqPCRにより、ヒト初代表皮メラニン細胞内のTYR mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]初代表皮メラニン細胞(型番:PCS-200-013、ATCC)を、Adult Melanocyte Growth Kit Component(型番:PCS-200-042、ATCC)を補充した、Dermal Cell Basal Medium(型番:PCS-200-030、ATCC)中で維持した。5mLの培養培地を含有する、60mmの培養ディッシュ内で増殖させたメラニン細胞を、0zM(陰性対照)、1zM、100zM、又は10aMの「TYR-ASO 1」で処置した(濃度1つ当たり3つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びワンステップPCRによるcDNAの合成]「TYR-ASO 1」を伴う、5時間にわたるインキュベーションの後、製造元の指示書に従い、「RNeasy Mini Kit」(型番:74106、Qiagen)を使用して、全RNAを抽出した。200ngのRNA鋳型を、指定された以下のサイクル条件: 50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で1分間による15サイクルに従い、[TYR-エクソン1_フォワード(2):(5'→3')CTCTTTGTCTGGATGCATT;及びTYR-エクソン5_リバース:(5'→3')CTGTGGTAATCCTCTTTCT]のエクソン特異的プライマーのセットに対して、Platinum(登録商標)Taq polymeraseを伴う、Super Script(登録商標)One-Step RT-PCR kit(型番:10928-042、Invitrogen)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[ネステッドPCRによる増幅]1μLのcDNAを、Taqmanプローブ[(5'→3')5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]に対する、[TYR-エクソン2n_フォワード:(5'→3')GATAAAGCTGCCAATTTC;及びTYR-エクソン3n_リバース:(5'→3')TTGTGCATGCTGCTTTGA]のエクソン特異的プライマーのセットに対する、20μLのネステッドPCR反応(型番:K2612、Bioneer)においてさらに増幅した。サイクル条件:95℃で3分間に続く、95℃で10秒間、及び60℃で30秒間の40サイクルである。
図53Cは、qPCRデータを提示するが、ここで、全長TYR mRNAレベルは、1zM〜10aMの「TYR-ASO 1」で処置されたヒトメラニン細胞内で、約30%低下した。観察された低下は、1zM及び10aMの「TYR-ASO 1」で処置された細胞内で有意(スチューデントのt検定)であった。
PD-1 ASOの、生物学的活性についての例
プログラム細胞死タンパク質1又はCD279としてもまた公知のPD-1とは、免疫細胞内で発現する細胞表面受容体である。PD-1は、免疫応答の下方調節に関与する免疫チェックポイントタンパク質である。PD-1モノクローナル抗体、例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブが免疫応答を増大させることにより、充実性腫瘍を処置するのに使用されている。
表11における、式IのPD-1 ASOは、ヒト又はマウスのPD-1プレmRNA内の、第2エクソンの、3'側スプライス部位又は5'側スプライス部位を、相補的にターゲティングするように設計した。PD-1 ASOを、Jurkat細胞内のアンチセンスエクソンスキッピング活性について評価し、また、同系腫瘍の負荷を受けた野生型マウスにおける抗腫瘍活性についても評価した。本明細書で提示される生物学的例は、式Iの化合物についての例としてのPD-1 ASOのエクソンスキッピング活性を例示するためのものであり、したがって、本発明の範囲をPD-1 ASOに限定するように解釈されるべきではない。
[PD-1についての実施例1]
Jurkat細胞内の、「PD-ASO 3」により誘導されるエクソンスキッピング
表11で指定された「PD-ASO 3」とは、[(5'→3')AGCUCAGGGUGACAG│gugcggccucggagg]の30量体のヒトPD-1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトPD-1プレmRNA内の第2エクソンと第2イントロンとの接合部にわたる5'側スプライス部位と完全に相補的な14量体のPD-1 ASOである。「PD-ASO 3」は、第2エクソンとの9量体の重複及び第2イントロンとの5量体の重複を保有する。
「PD-ASO 3」を以下の通りに、Jurkat細胞内のヒトPD-1の第2エクソンのスキッピングを誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]Jurkat細胞(型番:TIB-152、ATCC)を、10%のFBS及び1%のストレプトマイシン/ペニシリンを補充した、RPMI-1640中で維持した。5mLの培養培地を含有する、60mmの培養ディッシュ内で増殖させたJurkat細胞を、0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 5」で5時間にわたり処置した。
[RNAの抽出及びワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]製造元のプロトコールに従い、RNAeasy mini prep kit (Qiagen、USA)を使用して、全RNAを抽出した。500ngのRNA鋳型を、エクソン特異的プライマー[PD-エクソン1_フォワード:(5'→3')GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC;及びPD-エクソン5_リバース:(5'→3')GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]のセットに対して、One Step RT-PCR kit(Invitrogen、USA)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。サイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、53℃で30秒間、及び72℃で1分間による30サイクルである。
[ネステッドPCRによる増幅]100倍に希釈されたcDNA 1μLずつを、エクソン特異的プライマー[PD-エクソン1n_フォワード:(5'→3')GGCTGGCGGCCAGGATGGTTC;及びPD-エクソン5n_リバース:(5'→3')GAAAGACAATGGTGGCATACTCC]のセットに対して、以下のサイクル条件:95℃で20秒間、56℃で30秒間、及び72℃で40秒間の40サイクルを使用する、20μLのネステッドPCR(Invitrogen、USA)においてさらに増幅した。
[エクソンスキッピング産物の同定]結果として得られるネステッドPCR産物を2%のアガロースゲル上の、電気泳動による分離にかけた。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングにより解析した。
図54Aは、PCR産物の電気泳動データを提示する。ASOによる処置を伴わない細胞は、全長mRNAのPCR産物バンドだけをもたらした。その一方で、PD-1 ASOで処置された細胞内では、3つのPCR産物バンドが新たに形成された。3つのPCR産物バンドのうち、約470bpのサイズのバンド(図54Aで「非特異的」とマークされている)は、サンガーシーケンシング解析に従う、エクソンスキッピングを伴う、PD-1 mRNAのスプライス変異体ではなかった。
10及び100aMの「PD-ASO 3」で処置された細胞は、サンガーシーケンシングにより、第2エクソンのスキッピングに対応するPCR産物バンドをもたらした。しかし、1,000aMの「PD-ASO 3」で処置された細胞内で、第2エクソンのスキッピングのPCR産物は、消滅し、全長mRNAレベルは、低ASO濃度で処置された細胞内の全長レベルより高くなった。第2エクソン及び第3エクソンのスキッピングに割り当てられる、2つのPCR産物は、サンガーシーケンシングにより確認した(図54Bを参照されたい)。ネステッドPCRデータ中の、逆の用量反応パターンは、「PD-ASO 3」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による、転写の上方調節に起因しうるであろう[Nature Struc. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。
[PD-1についての実施例2]
「PD-ASO 3」で処置されたJurkat細胞内のPD-1 mRNAについてのqPCR
「PD-ASO 3」を以下の通りに、PD-1ネステッドqPCRにより、Jurkat細胞内のヒトPD-1 mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]60mmの培養ディッシュ内で増殖させたJurkat細胞を、1μg/mLの抗CD3抗体(型番:16-0037、eBioscience)及び0.5μg/mLの抗CD28抗体(型番:16-0289、eBioscience)で、48時間にわたり活性化させた。次いで、培養培地を、新鮮な培地で置き換え、0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 3」で、24時間にわたり処置した(ASO濃度1つ当たり4つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びワンステップRT-PCRによるcDNAの合成]製造元のプロトコールに従い、RNAeasy mini prep kit (Qiagen、USA)を使用して、全RNAを抽出した。500ngのRNA鋳型を、エクソン特異的プライマー[PD-エクソン1_フォワード:(5'→3')GTCGTCTGGGCGGTGCTACAAC;及びPD-エクソン5_リバース:(5'→3')GGGTGTGGAA-ATAGATGGG]のセットに対して、One Step RT-PCR kit(Invitrogen、USA)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。サイクル条件:50℃で30分間及び94℃で2分間に続く、94℃で30秒間、53℃で30秒間、及び72℃で1分間による30サイクルである。
[SYBRによるネステッドqPCR]100倍に希釈された各cDNA溶液1μLずつを、以下のサイクル条件:95℃で20秒間、56℃で30秒間、及び72℃で40秒間の40サイクルに従い、エクソン特異的プライマー[PD-エクソン2_フォワード:(5'→3')ACAACGCCACCTTCACCTGC;及びPD-エクソン2_リバース:(5'→3')GCCAGCTTGTCCGTCTGGTTG]のセットに対する、20μLのネステッドqPCR増幅にかけた。qPCR反応は、SYBR(Bio-Rad、USA)でプローブした。
図55Aは、qPCRデータを提示するが、ここで、PD-1 mRNAレベルは、10及び100aMの「PD-ASO 3」で処置された細胞内で、80%超有意に(スチューデントのt検定)低下した。1,000aMのASOで処置された細胞の場合、PD-1 mRNAレベルは、陰性対照レベルの約55%にリバウンドした。1,000aMにおけるmRNAレベルのリバウンドは、「PD-1についての実施例1」において観察された、逆の用量反応パターンと符合する(図54Aを参照されたい)。
[PD-1についての実施例3]
「PD-ASO 3」で処置されたJurkat細胞内のIL-2 mRNAについてのqPCR
PD-1活性の下方調節は、インターロイキン2(IL-2)の発現を上方調節することが公知である[Am. J. Clin. Oncol. 39(1)巻、98- 106 (2016)]。「PD-ASO 3」を、以下の通りに、IL-2ネステッドqPCRにより、Jurkat細胞内の、ヒトIL-2 mRNAレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。
[細胞の培養及びASOによる処置]60mmの培養ディッシュ内で増殖させたJurkat細胞を、1μg/mLの抗CD3抗体(型番:16-0037、eBioscience)及び0.5μg/mLの抗CD28抗体(型番:16-0289、eBioscience)で、48時間にわたり活性化させた。次いで、培養培地を、新鮮な培地で置き換え、0(陰性対照)、10、100、又は1,000aMの「PD-ASO 3」で、24時間にわたり処置した(ASO濃度1つ当たり4つずつの培養ディッシュ)。
[RNAの抽出及びcDNAの合成]製造元のプロトコールに従い、RNeasy mini prep kit (Qiagen、USA)を使用して、全RNAを抽出した。500ngのRNA鋳型を、製造元のプロトコールに従い、PrimeScript(商標)1st strand cDNA synthesis kit(日本、タカラバイオ株式会社)を使用する、25μLの逆転写反応にかけた。
[SYBRによるqPCR]1μLずつの各cDNA溶液を、以下のサイクル条件:95℃で20秒間、56℃で30秒間、及び72℃で40秒間の40サイクルに従い、IL-2 mRNAをターゲティングするプライマー[IL-2_フォワード:(5'→3')GTCACAAACAGTGCACCTAC;及びIL-2_リバース:(5'→3')GGTGAGTTTGGGATT-CTTGTA]のセットに対する、20μLのqPCR増幅にかけた。qPCR反応は、SYBR(Bio-Rad、USA)でプローブした。
図55Bは、IL-2 qPCRデータを提示するが、この場合、IL-2 mRNAレベルは、10、100及び1,000aMの「PD-ASO 3」で処置された細胞内で、それぞれ、約140%、120%、及び40%、有意に(スチューデントのt検定)上昇した。逆の用量反応パターンは、「PD-1についての実施例1」及び「PD-1についての実施例2」において観察された、逆の用量反応パターンと符合する(図54A及び図55Aを参照されたい)。
[PD-1についての実施例4]
「PD-ASO 1」で処置されたJurkat細胞内の、PD-1 mRNAについてのqPCR
表11で指定された「PD-ASO 1」とは、[(5'→3')cucuccaucucucag│ACUCCCCAGACAGGC]の30量体のヒトPD-1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトPD-1プレmRNA内の、第1イントロンと、第2エクソンとの接合部にわたる、3'側スプライス部位と完全に相補的な、14量体のPD-1 ASOである。「PD-ASO 1」は、第1イントロンとの5量体の重複及び第2エクソンとの9量体の重複を保有する。
「PD-ASO 1」を、そうでないことが注記されない限りにおいて、「PD-1についての実施例2」において記載されている通りに、PD-1ネステッドqPCRにより、Jurkat細胞内の、ヒトPD-1 mRNAレベルの変化を誘導する、その能力について評価した。
図56Aは、qPCRデータを提示するが、ここで、PD-1 mRNAレベルは、100及び1,000aMの「PD-ASO 1」で処置された細胞内で、約60%、有意に(スチューデントのt検定)低下した。「PD-ASO 3」の場合と異なり、「PD-ASO 1」は、逆の用量反応パターンについての明確な示唆を示さなかった。
[PD-1についての実施例5]
C57BL/6マウスにおける、B16F10黒色腫に対する、「PD-ASO 2」の抗腫瘍活性
表11で指定された「PD-ASO 2」とは、[(5'→3')AGCUCGUGGUAACAG│gugaggcuaguagaa]の30量体のマウスPD-1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、マウスPD-1プレmRNA内の、第2エクソンと、第2イントロンとの接合部にわたる、5'側スプライス部位と完全に相補的な、16量体のPD-1 ASOである。「PD-ASO 2」は、第2エクソンとの10量体の重複及び第2イントロンとの6量体の重複を保有する。
その一方で、「PD-ASO 2」は、[(5'→3')AGCUC"AG"GGU"G"ACAG│gug"c"ggccucggagg][配列中、4カ所のミスマッチを、引用符(“")でマークした]の30量体のヒトPD-1プレmRNA配列内、「太字」でマークされ、「下線を付された」、ヒトPD-1プレmRNAとの、4カ所のミスマッチを保有する。「PD-ASO 2」ヒトPD-1プレmRNAのための、「PD-ASO 3」の代替ASOとして理解することができる。
「PD-ASO 2」を、下記に提示される通り、B16F10黒色腫細胞を注射された、雄C57BL/6マウス(4週齢)における、その抗腫瘍活性について評価した。
[B16F10黒色腫細胞の接種]B16F10マウス黒色腫細胞(型番:CRL-6475、ATCC)を、10%のFBS、1%のストレプトマイシン/ペニシリン及び0.01mg/mlのウシインスリンを補充した、DMEMを含有する、150mmの培養ディッシュ内で維持した。0日目に、50μLのPBS中に溶解させたB16F10細胞約1×105個を各動物の右後方の脇腹に注射した。
[群分け及びASOによる処置]3日目に、動物を体重により0(陰性対照)、2、10、及び50ピコモル/kgの「PD-ASO 2」(群1つ当たりのN=15)の4つの群に無作為に割り付けた。
注射液は、陰性対照、2、10、及び50ピコモル/kgの「PD-ASO 2」群のそれぞれのために、「PD-ASO 2」の水性母原液をPBS中に0nM(PBSだけ)、0.4nM、2nM、及び12.5nMの「PD-ASO 2」に系列希釈することにより調製した。
動物に3日目〜17日目において、毎週2回5mL/kgで注射液を皮下投与した。
[抗腫瘍活性]抗腫瘍活性は、各ASO処置群と陰性対照群との間の腫瘍体積の変化により評価した。
図56Bは、0日目〜19日目において、群ごとに観察された腫瘍体積を提示する。2ピコモル/kgのときの腫瘍増殖は、0日目〜19日目において有意に阻害された。19日目において観察された阻害は約55%であった(2ピコモル/kg群及び陰性対照群によりそれぞれ、約375mm3及び850mm3)。50ピコモル/kg群の抗腫瘍活性は、10日目〜17日目において、2ピコモル/kg群の抗腫瘍活性と同等であった。しかし、50ピコモル/kg群の抗腫瘍活性は、19日目に消滅した。10ピコモル/kg群の抗腫瘍活性は、全期間を通して、有意性を伴わない、最小限のものであった。
奇妙な用量反応パターンは、「PD-ASO 2」によるエクソンスキッピング時に蓄積される、「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による転写の上方調節に起因しうるであろう[Nature Struc. Mol. Biol.、22(3)巻、256〜264 (2015)]。しかし、米国FDAにより承認されたPD-1モノクローナル抗体薬であるニボルマブが、腫瘍患者において釣り鐘型の用量反応パターンを示した[J. Clin. Oncol. 33(18)巻、2013〜2020 (2015)]ことを踏まえると、「PD-ASO 2」の奇妙な用量反応パターンは、PD-1阻害の内因性薬理学に起因しうるであろう。
19日目に動物を屠殺して、群ごとに腫瘍重量を測定した。平均腫瘍重量は、2ピコモル/kg群及び陰性対照群のそれぞれについて約0.35g及び1.20gであった。こうして、重量による腫瘍増殖は、2ピコモル/kg群では約70%有意に阻害された(スチューデントのt検定によるp<0.01)。

Claims (14)

  1. 式I:
    [式中、
    nは、10〜25の間の整数であり、
    式Iの化合物は、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物は、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnは、独立に、重水素[D]基、ヒドリド[H]基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
    X及びYは、独立に、ヒドリド基、ホルミル[H-C(=O)-]基、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]基、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、又は置換若しくは非置換のアリールホスホニル基を表し、
    Zは、ヒドリド基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換のアルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、非置換アミノ[-NH2]基、置換若しくは非置換のアルキルアミノ基、置換若しくは非置換のアリールアミノ基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnは、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つは、独立に、核酸塩基部分に共有結合によって連結された、置換若しくは非置換のアミノ基を有する非天然の核酸塩基から選択される]
    により表されるペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  2. nが、10〜25の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、独立に、重水素基、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
    X及びYが、独立に、ヒドリド基、ホルミル基、アミノカルボニル基、アミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールアミノチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアリールオキシチオカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルスルホニル基、置換若しくは非置換のアリールスルホニル基、置換若しくは非置換のアルキルホスホニル基、又は置換若しくは非置換のアリールホスホニル基を表し、
    Zが、ヒドリド基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換のアルキルオキシ基、置換若しくは非置換のアリールオキシ基、非置換アミノ基、置換若しくは非置換のアルキルアミノ基、置換若しくは非置換のアリールアミノ基、置換若しくは非置換のアルキル基、又は置換若しくは非置換のアリール基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つが、独立に、式II、式III、又は式IV:
    [式中、
    R1、R2、R3、R4、R5、及びR6は、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
    L1、L2、及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合によって連結している、式V:
    (式中、
    Q1及びQmは、置換若しくは非置換のメチレン(-CH2-)基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
    Q2、Q3、…、及びQm-1は、独立に、置換若しくは非置換のメチレン基、酸素(-O-)基、硫黄(-S-)基、及び置換若しくは非置換のアミノ基[-N(H)-又は-N(置換基)-]から選択され、
    mは、1〜15の間の整数である)
    により表される共有結合リンカーである]
    により表される非天然の核酸塩基から選択される、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  3. nが、11〜23の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、ヒドリド基であり、
    X及びYが、独立に、ヒドリド基、アミノカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
    Zが、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つが、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
    R1、R2、R3、R4、R5、及びR6が、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
    Q1及びQmが、置換若しくは非置換のメチレン基であり、Qmが、塩基性アミノ基に直接連結されており、
    Q2、Q3、…、及びQm-1が、独立に、置換若しくは非置換のメチレン基、酸素基、及びアミノ基から選択され、
    mが、1〜11の間の整数である、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  4. nが、11〜21の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であるか、又は標的プレmRNA配列と、1つ又は2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、ヒドリド基であり、
    X及びYが、独立に、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
    Zが、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つが、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
    R1、R2、R3、R4、R5、及びR6が、独立に、ヒドリド基、及び置換又は非置換のアルキル基から選択され、
    Q1及びQmが、メチレン基であり、Qmが、塩基性アミノ基に直接連結されており、
    Q2、Q3、…、及びQm-1が、独立に、メチレン基、酸素基、及びアミノ基から選択され、
    mが、1〜11の間の整数である、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  5. nが、11〜19の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、ヒドリド基であり、
    X及びYが、独立に、ヒドリド基、置換若しくは非置換のアルキル基、置換若しくは非置換のアリール基、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基、置換若しくは非置換のアルキルアミノカルボニル基、又は置換若しくは非置換のアリールスルホニル基を表し、
    Zが、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルを含む天然の核酸塩基、並びに非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも4つが、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
    R1、R3、及びR5が、ヒドリド基であり、R2、R4、及びR6が、独立に、ヒドリド基、又は置換若しくは非置換のアルキル基を表し、
    Q1及びQmが、メチレン基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接連結されており、
    Q2、Q3、…、及びQm-1が、独立に、メチレン基及び酸素基から選択され、
    mが、1〜9の間の整数である、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  6. nが、12〜19の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、ヒドリド基であり、
    X及びYが、独立に、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、又は置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基を表し、
    Zが、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも5つが、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
    R1、R2、R3、R4、R5、及びR6が、ヒドリド基であり、
    Q1及びQmが、メチレン基であり、Qmが、塩基性アミノ基に直接連結されており、
    Q2、Q3、…、及びQm-1が、独立に、メチレン基及び酸素基から選択され、
    mが、1〜9の間の整数である、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  7. nが、12〜18の間の整数であり、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、
    式Iの化合物が、標的プレmRNA配列と完全に相補的であり、
    S1、S2、…、Sn-1、Sn、T1、T2、…、Tn-1、及びTnが、ヒドリド基であり、
    Xが、ヒドリド基であり、
    Yが、置換若しくは非置換のアルキルアシル基、置換若しくは非置換のアリールアシル基、又は置換若しくは非置換のアルキルオキシカルボニル基を表し、
    Zが、非置換アミノ基、又は置換若しくは非置換のアルキルアミノ基を表し、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnが、独立に、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然の核酸塩基から選択され、
    B1、B2、…、Bn-1、及びBnのうちの少なくとも5つが、独立に、式II、式III、又は式IVにより表される、非天然の核酸塩基から選択され、
    R1、R2、R3、R4、R5、及びR6が、ヒドリド基であり、
    L1が、右側の端部が、塩基性アミノ基に直接連結された、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、-CH2-O-(CH2)5-、-CH2-O-(CH2)6-、又は-CH2-O-(CH2)7-を表し、
    L2及びL3が、独立に、右側の端部が、塩基性アミノ基に直接連結された、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、及び-(CH2)2-O-(CH2)3-から選択される、
    請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又は薬学的に許容されるその塩。
  8. 細胞において請求項1に記載のペプチド核酸誘導体の標的プレmRNA内の標的エクソンのスキッピングを、前記ペプチド核酸誘導体の使用により誘導する方法。
  9. 対象において請求項1に記載のペプチド核酸誘導体の標的プレmRNA内の標的エクソンのスキッピングを、前記ペプチド核酸誘導体の投与により誘導する方法。
  10. 請求項1に記載のペプチド核酸誘導体の標的遺伝子の発現を伴う疾患又は状態を、前記ペプチド核酸誘導体の投与により処置する方法。
  11. 細胞において請求項1に記載のペプチド核酸誘導体の標的遺伝子の機能的活性を、前記ペプチド核酸誘導体の使用によりモジュレートする方法。
  12. 対象において請求項1に記載のペプチド核酸誘導体の標的遺伝子の機能的活性を、前記ペプチド核酸誘導体の投与によりモジュレートする方法。
  13. 標的プレmRNA内のイントロンに由来する7量体及びエクソンに由来する7量体からなる14量体の標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、標的スプライス部位配列が、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれでもない、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
  14. 標的プレmRNA内の、標的スプライス部位配列との、少なくとも10量体の相補的な重複を保有し、標的スプライス部位配列が、ヒトアンドロゲン受容体プレmRNA内の[(5'→3')UUGCCUGGUAAGGA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UUUUUGCGUAAGUA]、ヒトHIF-1αプレmRNA内の[(5'→3')UAAGUAGGAUAAGU]、ヒトSNAP25プレmRNA内の[(5'→3')AUCCCAGGGUAACA]、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]、又はヒトチロシナーゼプレmRNA内の[(5'→3')UGUACAGAUUGUCU]のいずれをも含まない、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
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