BR112018001373B1

BR112018001373B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma planta transgênica e uma semente transgênica, para controlar a população de uma praga lepidóptera, para exterminar uma praga lepidóptera e para reduzir os danos de uma peste lepidóptera a uma planta, e, par de iniciadores

Info

Publication number: BR112018001373B1
Application number: BR112018001373-0A
Authority: BR
Inventors: Bolin Liu; Chao Tan; Qianqian YANG; Jieting XU; Qin Wen; Long QIU; Chonglie Ma; Wanggen Zhang
Original assignee: China National Seed Group Corporation, Ltd
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2023-12-26
Also published as: BR112018001373A2; CN106701789A; US10626411B2; WO2017012577A1; CN106701789B; US20180362998A1

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E UMA SEMENTE TRANSGÊNICA, PARA CONTROLAR A POPULAÇÃO DE UMA PRAGA LEPIDÓPTERA, PARA EXTERMINAR UMA PRAGA LEPIDÓPTERA E PARA REDUZIR OS DANOS DE UMA PESTE LEPIDÓPTERA A UMA PLANTA, TRANSGÊNICA, SONDA, E, PAR DE INICIADORES. É provido um gene Cry1Ab/Cry1AcZM, um kit de expressão, vetor de expressão e célula hospedeira compreendendo o gene, e um uso do gene no melhoramento vegetal. Proteínas codificadas pelo gene Cry1Ab/Cry1AcZM podem ser expressadas in monocotiledôneas, e adicionalmente usadas para melhorar monocotiledôneas resistentes a insetos de gene trans- Cry1Ab/Cry1AcZM. Experimentos de bioensaio provam que um produto de expressão do gene Cry1Ab/Cry1AcZM tem um efeito de exterminação em pragas lepidópteras.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] A descrição reivindica a prioridade sob Artigo 8 do PCT para o Pedido de Patente Chinesa No. 201510437025.2, depositado em 23 de julho de 2015, cujo conteúdo completo é incorporado aqui por referência.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A descrição refere-se ao campo da biotecnologia de plantas e, em particular, a um gene resistente aos insetos Bt e ao uso do vetor de expressão do mesmo.

FUNDAMENTOS

[0003] As pragas dos insetos são um dos principais fatores causando a perda de rendimento de culturas agrícolas e reduzir a perda causada por pragas de insetos é um modo importante para aumentar o rendimento e a qualidade de alimentos e culturas alimentícias. De acordo com estatísticas, a perda causada por ataques de pragas de insetos no rendimento total de alimentos e culturas alimentícias no mundo todo chegou a até 14% a cada ano, diretamente causando perdas econômicas tão elevadas como centenas de bilhões de dólares US para a produção agrícola. O uso de medidas de controle, como pulverização de pesticidas químicos e inseticidas biológicos, pode reduzir o dano de pragas às culturas agrícolas, mas pesticidas químicos causam poluição ambiental e os inseticidas biológicos são caros. Durante um longo tempo, a pulverização de grandes quantidades de pesticidas químicos Petição 870230086953, de 02/10/2023, pág. 9/14 não apenas intensifica a resistência das pragas aos pesticidas e afeta insetos benéficos e outros ecossistemas, como também polui seriamente os meios ambientes, aumenta os custos de produção e destrói o equilíbrio ecológico. Portanto, reduzir a quantidade de uso de inseticidas e desenvolver uma biotecnologia moderna tornou-se uma questão que deve ser enfrentada no desenvolvimento sustentável da agricultura.

[004] O milho é uma cultura alimentícia e industrial importante. Atualmente, pragas do milho incluem principalmente brocas do milho, que causam ataques sérios e redução significativa do rendimento do milho. Portanto, tomar medidas eficazes para controlar a perda do mesmo é de significado considerável para melhorar o rendimento do milho e aumentar a renda rural. O prejuízo causado por broca de milho é um dos importantes bioperigos, resultando em redução do rendimento de milho durante o ano todo e afetando seriamente a produção e a qualidade do milho. As brocas de milho incluem Ostrinia furnacalis e Ostrinia nubilalis. China é uma região onde o milho é frequentemente e seriamente atacado por Ostrinia furnacalis, e esse ataque ocorre, em grande escala, quase uma vez a cada dois anos. O rendimento de milho é reduzido em 10% a 15% por ataque de brocas de milho nos anos de situação geral, e pode ser reduzido em até 30% ou mais, ou mesmo uma perda total de colheita nos anos sob ataque de larga escala. Devido ao dano causado pelas brocas de milho, a perda de rendimento de milho alcança 6-9 milhões de toneladas por ano. As brocas do milho não apenas causam diretamente a perda da produção do milho, mas também podem induzir e agravar a ocorrência de podridão da espiga de milho, reduzindo, assim, a qualidade do milho.

[005] Atualmente, as brocas de milho ainda são controladas principalmente por inseticidas e pesticidas. Um gene Bt resistente a insetos pode ser introduzido em espécies de milho usando tecnologia transgênica, para melhorar assim a resistência aos insetos do milho transgênico, reduzir a quantidade de uso de pesticidas e economizar mão-de-obra, recursos materiais e recursos sociais.

[006] Uma proteína cristal inseticida codificada por gene Bt de Bacillus thuringiensis (sigla Bt) é um bacilo Gram-positivo do solo. No processo de esporulação, Bt produz uma proteína cristal paraesporal inseticida conhecida como δ-endotoxina. A proteína tem uma atividade inseticida muito elevada. O princípio de ação da mesma é que esta proteína resistente a insetos pode ser dissolvida por um suco intestinal alcalino e hidrolisada em fragmentos de toxina ativos menores - os fragmentos de núcleo (Hofte e Whiteley, 1989). Hidrólise adicional dos fragmentos de núcleo por protease pode ser evitada e as proteínas ativadas se ligam com as vesículas de escova nos tratos intestinais dos insetos, resultando em perfuração e afetando ainda mais o equilíbrio osmótico. Células se expandem e então são dissolvidas. Organismos alvo param a ingestão e, finalmente, morrem. Pesquisas mostraram que as células epiteliais intestinais de muitas pragas alvo-marcadas pela proteína Bt têm sítios de ligação altamente ligados por afinidade (Hofte e Whiteley, 1989). Ao longo das últimas décadas, dezenas de Bacillus thuringiensis e mais de 130 proteínas cristal inseticidas codificadas pelos mesmos foram identificadas. Pesquisas provaram que a proteína cristal Bt não é perigosa para corpos humanos, mamíferos, aves, peixes e vários insetos benéficos e não polui o meio ambiente. Portanto, preparações de Bt foram aplicadas na agricultura, silvicultura e saúde ambiental como um pesticida microbiano natural não perigoso por quase 50 anos.

[007] A proteína cristal de Bt deve ser ingerida por insetos para exercer a função de exterminar os insetos. No entanto, a proteína cristal de Bt tem baixa estabilidade no meio ambiente natural; seu efeito inseticida é muito afetado pelo clima; ela é facilmente degradada após exposição à luz solar; ela pode não penetrar nos tecidos das plantas; e é facilmente lavada pela chuva e orvalho. Esses fatores limitam muito seu desenvolvimento e aplicação.

[008] Vaeck et al. (Nature 328: 3-37, 1987) produziram um tabaco resistente a insetos Bt transgênico tendo uma proteína inseticida pela primeira vez, a partir do qual uma resistência baixa do inseto poderia ser detectada, e a proteína expressada do mesmo era quase indetectável, representando apenas 0,001% da proteína solúvel. Willbur et al. (Plant Physiol 92: 1-11, 1990) demonstraram, através de pesquisas, que havia uma diferença significativa no uso de códons entre bactérias biológicas inferiores e plantas superiores. Além disso, são notadas evidências de que o mRNA transcrito a partir de sequências ATTTA, AATAA instáveis ou outras sequências de tRNA em plantas não está completo, de modo que a proteína traduzida é muito curta para ter uma atividade inseticida.

SUMÁRIO

[009] A descrição fornece um gene resistente a inseto Cry1Ab/Cry1AcZM que pode ser expressado em plantas e produzir uma resistência a inseto, assim como vetores e células hospedeiras contendo o mesmo. A descrição fornece adicionalmente os usos do gene resistente a inseto, os vetores de expressão e as células hospedeiras na resistência a insetos de plantas transgênicas.

[0010] Em um aspecto, a descrição fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência complementar da mesma. Em uma modalidade, a descrição fornece uma sequência tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para o gene.

[0011] Em outro aspecto, a descrição fornece um cassete de expressão, que compreende a molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, referida molécula de ácido nucleico é operativamente ligada a um promotor Ubi e um terminador Ocs, ou a um promotor Ubi e um terminador Nos, ou a um promotor CaMV35S e um terminador Ocs, ou a um promotor CaMV35S e um terminador Nos.

[0012] Em um aspecto adicional, a descrição fornece um vetor de expressão, que compreende o cassete de expressão. Em uma modalidade, dito vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência Q. Em uma modalidade, dito vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência Kozak. Em uma modalidade, dito vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência PolyA. Em uma modalidade, dito vetor de expressão compreende adicionalmente um gene Bar.

[0013] Em outro aspecto adicional, a descrição fornece uma célula hospedeira, que compreende o vetor de expressão. Em uma modalidade, dita célula hospedeira é uma célula de planta ou uma célula procariótica. Em uma modalidade, dita célula hospedeira é uma célula de Escherichia coli ou uma célula de agrobacterium.

[0014] Em outro aspecto adicional, a descrição fornece um método para produzir uma planta transgênica, em que a planta transgênica é obtida pela transformação de uma planta pelo uso de vetor de expressão ou da célula hospedeira. Em uma modalidade, dita planta é uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, cevada nua, milheto, sorgo e cana-de- açúcar.

[0015] Em outro aspecto adicional, a descrição fornece um método para produzir uma semente transgênica, em que a semente transgênica é produzida a partir da planta transgênica produzida pelo método para produzir a mesma.

[0016] Em um aspecto adicional, a descrição fornece um método para controlar a população de uma praga lepidóptera, compreendendo alimentar a população da praga lepidóptera com a planta transgênica obtida pelo método descrito aqui. Em uma modalidade, dita planta é uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, milheto, sorgo e cana-de-açúcar. Em uma modalidade, dita praga lepidóptera é Ostrinia furnacalis ou Ostrinia nubilalis.

[0017] Em outro aspecto adicional, a descrição fornece um método para exterminar uma praga lepidóptera, compreendendo alimentar a praga lepidóptera com uma quantidade inseticidamente eficaz da planta transgênica obtida pelo método descrito aqui. Em uma modalidade, dita planta é uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, milheto, sorgo e cana-de-açúcar. Em uma modalidade, dito praga lepidóptera é Ostrinia furnacalis ou Ostrinia nubilalis.

[0018] Em um aspecto adicional, a descrição fornece um método para reduzir os danos de uma praga lepidóptera a uma planta compreendendo integrar estavelmente um vetor de expressão no genoma da planta, em que dito vetor de expressão compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um gene resistente à praga lepidóptera, e referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência complementar da mesma. Em uma modalidade, dita planta é uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, milheto, sorgo e cana-de-açúcar. Em uma modalidade, dita praga lepidóptera é Ostrinia furnacalis ou Ostrinia nubilalis.

[0019] Em outro aspecto adicional, a descrição fornece uma planta transgênica compreendendo um cassete de expressão integrado em um genoma da mesma, em que dito cassete de expressão compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um gene resistente à praga lepidóptera, referida molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência complementar da mesma. Em uma modalidade, a descrição fornece uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para o gene. Em algumas modalidades, referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1 ou a molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, dita planta é uma planta monocotiledônea. Em algumas modalidades, dita planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, milheto, sorgo e cana-de-açúcar. Em algumas modalidades, a descrição ainda se refere a órgãos, tecidos e células da planta, assim como produtos processados, tal como alimentos e rações, produzidos a partir da dita planta.

[0020] Em algumas modalidades, o gene resistente a inseto Cry1Ab/Cry1AcZM descrito aqui pode ser estavelmente e eficazmente expressado em plantas, e tem um bom efeito inseticida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] As Figuras 1A-K são diagramas esquemáticos de vetores intermediários e vetores de transformação, onde a Figura 1A mostra vetor pZZ01205; a Figura 1B mostra vetor pZZ0015; a Figura 1C mostra vetor de transformação pZHZH25017; a Figura 1D mostra vetor pZZ01206; a Figura 1E mostra vetor de transformação pZHZH25018; a Figura 1F mostra vetor pZZ01207; a Figura 1G mostra vetor pZZ00005; a Figura 1H mostra vetor de transformação pZHZH25020; a Figura 1J mostra vetor pZZ01228; e a Figura 1K mostra vetor de transformação pZHZH25022. Significados do mapa do vetor e abreviações em inglês para os mesmos na Figura 1A a Figura 1K são apresentados abaixo: promotor Ubi: promotor ubiquitina Omega: sequência Omega Cry1Ab/Cry1AcZM: sequência de gene Bt otimizada polyA: sequência de ácido poliadenílico T-NOS: terminador nopalina sintetase T-OCS: terminador octopina sintetase pMB1 rep: replicon pMB1 Amp(R): resistência a amicilina EGFP: proteína fluorescente verde T-Borda (direita): sequência de borda direita de T-DNA promotor CaMV35S: promotor vírus mosaico do pepino 35S BAR: sequência de gene resistente a glufosinato CaMV35S polyA: sequência de ácido poliadenílico de vírus mosaico do pepino 35S T-Borda (esquerda): sequência de borda esquerda de T-DNA Bp: par de bases Canamicina (R): sequência resistente a canamicina pBR322 ori: sequência de originador de pBR322 pBR322 born: sequência de espinha dorsal pBR322 pVS1 rep: replicon pVS1 pVS1 sta: região de partida de transcrição pVS1

[0022] A Figura 2 mostra os resultados de identificação de uma planta de geração T0 por PCR, onde trilhas 1-6 são diferentes plantas transgênicas de geração T0, sendo positivas, enquanto trilha 7 é controle negativo, e o peso molecular da banda positiva é 333bp.

[0023] A Figura 3 é um diagrama do resultado de teste de Southern blot de DNA genômico em uma planta de milho transformada, isto é, o resultado de hibridação molecular de DNA genômico digerido com HindIII e digerido com NcoI de uma planta de milho de geração T1 transformada por um vetor pZHZH25017 respectivamente para uma sonda específica de Cry1Ab/Cry1AcZM tendo um comprimento de 333bp. Trilhas 1 e 6 são para controle negativo Xiang 249; trilhas 2 e 7 são para material T1-1; Trilhas 3 e 8 são para T1-2; Trilhas 4 e 9 são para T1-3; e trilhas 5 e 10 são para T1-4. Sob qualquer uma das condições de digestão de enzimas, uma banda positiva é respectivamente observada, indicando que uma cópia única de um gene exógeno foi inserida. M é para trilha com um marcador de peso molecular com um número de pares de bases marcado.

[0024] A Figura 4 é um diagrama do resultado de identificação de uma planta de geração T0 usando uma Immunostrip, onde números 1-2 são amostras de uma planta (vetor de transformação pZHZH25017); números 3-4 são amostras de uma planta (vetor de transformação pZHZH25018); número 5 é uma amostra de uma planta (vetor de transformação pZHZH25020); número 6 é uma amostra positiva de uma planta (vetor de transformação pZHZH25022), e número 7 é uma amostra de controle negativo.

[0025] A Figura 5A é um diagrama do resultado do bioensaio da resistência ao inseto de folhas destacadas de milho de geração T0, onde a Figura 5A-1 é uma folha resistente ao inseto (vetor de transformação pZHZH25018); a Figura 5A-2 é um controle negativo Xiang 249; e a Figura 5A-3 é uma amostra de controle positivo (Cryl1Ac). A Figura 5B é um diagrama do resultado do bioensaio de resistência de filamentos destacados em milho de geração T0, onde a Figura 5B-1 é um filamento resistente a inseto (vetor de transformação pZHZH25018); a Figura 5B-2 é um controle negativo Xiang 249; e a Figura 5B-3 é uma amostra de controle positivo (Cryl1Ac).

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES

[0026] Salvo indicado em contrário, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na direção 5’ para 3'; sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na direção dos terminais amino para carboxila. Aminoácidos podem ser referidos aqui por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser mencionados pelos códigos comumente aceitos de uma letra.

[0027] Faixas numéricas incluem os números que definem a faixa.

[0028] Como aqui usado, o termo “ácido nucleico” inclui a referência a polímeros de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo na forma de cadeia simples ou dupla e, salvo limitado de outra forma, engloba análogos conhecidos (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos) tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais em que eles se hibridam com ácidos nucleicos de fita única de um modo similar aos nucleotídeos de ocorrência natural.

[0029] Como aqui usado, o termo “codificando” ou “codificado” quando usado no contexto de um ácido nucleico especificado significa que o ácido nucleico compreende as informações necessárias para dirigir tradução da sequência de nucleotídeos em uma proteína especificada. A informação através da qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Como aqui usado, o termo “sequência de comprimento completo” refere-se a um polinucleotídeo especificado ou sua proteína codificada significa ter a sequência de ácido nucleico completa ou a sequência de aminoácidos completa de uma sequência endógena nativa (não sintética). Um polinucleotídeo de comprimento completo codifica a forma cataliticamente ativa, de comprimento completo, da proteína especificada.

[0030] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são aqui usados de forma interpermutável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são análogos químicos artificiais de aminoácidos de ocorrência natural correspondentes, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural.

[0031] Os termos “resíduo”, “resíduo de aminoácido” e “aminoácido” são aqui usados de modo interpermutável para se referir a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo (coletivamente conhecidos como “proteína”). O aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e, salvo limitado de outra forma, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de modo similar como os aminoácidos de ocorrência natural.

[0032] Os termos “isolado” e “purificado” são usados aqui de modo interpermutável para se referir a um ácido nucleico ou a um polipeptídeo ou a uma porção biologicamente ativa do mesmo, que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes normalmente acompanhando ou interagindo com o ácido nucleico ou o polipeptídeo, como encontrados em seu meio ambiente natural. Assim, um ácido nucleico ou polipeptídeo isolado ou purificado é substancialmente livre de outros materiais celulares ou meios de cultura quando produzidos por técnicas recombinantes, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados.

[0033] Um ácido nucleico “isolado” é geralmente livre de sequências (como, por exemplo, sequências de codificação de proteínas) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. Em várias modalidades, o ácido nucleico isolado pode conter sequências de nucleotídeos, por exemplo, menores do que cerca de 0,5 KB, flanqueando naturalmente o ácido nucleico no DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado.

[0034] Em toda a descrição, a palavra “compreendendo”, “compreende” ou variações da mesma será entendida como implicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa especificada, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[0035] Como aqui usado, o termo “impactando pragas de insetos” refere-se a mudanças que afetam a alimentação, crescimento e/ou comportamento de insetos em quaisquer estágios do desenvolvimento, incluindo, mas não limitadas a: matar o inseto, retardar o crescimento, prevenir a capacidade reprodutiva, atividade antialimentação e similares.

[0036] Como aqui usado, o termo “atividade inseticida” refere-se à atividade de um organismo ou uma substância (tal como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida por, mas não está limitada a, mortalidade da praga, perda de peso das pragas, repelência de pragas e outras mudanças comportamentais e físicas de uma praga após se alimentar e se expor durante um período de tempo apropriado. Assim, um organismo ou substância tendo atividade inseticida afeta adversamente pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão das pragas. Por exemplo, “proteínas inseticidas” são proteínas que exibem atividade inseticida sozinhas ou em combinação com outras proteínas.

[0037] Como aqui usado, o termo “quantidade pesticidamente eficaz” refere-se a uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no meio ambiente de uma praga. Similarmente, uma “quantidade inseticidamente eficaz” pode ser usada para se referir a uma “quantidade pesticidamente eficaz” quando a praga é uma praga de inseto.

[0038] Como deve ser entendido, o termo “transgênico” é aqui usado para incluir qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, cujo genótipo foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo incluindo os transgênicos inicialmente assim alterados, bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. O termo “transgênico”, como aqui usado, não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extracromossômico) por métodos convencionais de melhoramento vegetal ou por eventos de ocorrência natural, como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação de bactéria não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[0039] Uma “planta em questão” ou “célula da planta em questão” é uma em que a alteração genética foi efetuada, ou é uma planta ou célula de planta que é descendente de uma planta ou célula assim alterada e que compreende a alteração. Um “controle” ou “planta de controle” ou “célula de planta de controle” fornece um ponto de referência para a medição de mudanças no fenótipo da planta ou célula de planta em questão.

[0040] Uma planta de controle ou célula de planta pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de tipo selvagem, isto é, do mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula em questão; (b) uma planta ou célula de planta do mesmo genótipo que o material de partida, mas que foi transformada com uma construção nula (isto é, com uma construção que não tem efeito conhecido sobre o traço de interesse, como uma construto compreendendo um gene marcador); (c) uma planta ou célula de planta que é um segregante não transformado entre a progênie de uma planta ou uma célula de planta em questão; (d) uma planta ou célula de planta geneticamente idêntica à planta ou célula de planta em questão, mas que não está exposta a condições ou estímulos que poderiam induzir a expressão do gene de interesse; ou (e) a própria planta ou célula de planta em questão, em condições em que o gene de interesse não é expressado.

[0041] Um versado na técnica reconhecerá prontamente que os avanços no campo da biologia molecular, como mutagênese sítio-específica e aleatória, metodologias de reação em cadeia da polimerase e técnicas de engenharia de proteínas, fornecem uma extensa coleção de ferramentas e etapas operacionais apropriadas para uso para alterar ou engenheirar tanto a sequência de aminoácidos como as sequências genéticas em potencial de proteínas de interesse agrícola.

[0042] Em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeos da descrição podem ser alteradas para substituições conservativas de aminoácidos. Os princípios e exemplos para tais substituições conservativas de aminoácidos serão ainda descritos a seguir. Em algumas modalidades, sequências de nucleotídeos da presente descrição podem ser substituídas sem mudar as sequências de aminoácidos com base em preferências de códons de plantas monocotiledôneas, como descrito na Figura 1. Por exemplo, códons codificando uma dada sequência de aminoácidos podem ser substituídos com códons preferidos por uma planta monocotiledônea, mas a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos não é mudada.

[0043] A descrição refere-se adicionalmente a sequências de nucleotídeos obtidas por otimização adicional de SEQ ID NO: 1. Maiores detalhes do método são descritos por Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498. As sequências de nucleotídeos otimizadas podem ser usadas para melhorar a expressão de proteínas inseticidas em plantas, que podem ser, por exemplo, plantas monocotiledôneas, por exemplo, plantas gramináceas, por exemplo, Zea mays. Como aqui usado, o termo “sequência de nucleotídeos mutada” ou “mutação” ou “sequência de nucleotídeos mutagenizada” conota uma sequência de nucleotídeos que foi mutagenizada ou alterada para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (por exemplo, par de bases), que não estão presentes na sequência de tipo selvagem correspondente.

[0044] Em algumas modalidades, partes das sequências de nucleotídeos na descrição são substituídas com diferentes códons codificando uma dada sequência de aminoácidos, assim mudando a sequência de nucleotídeos sem mudar sua sequência de aminoácidos codificada. Variantes conservativas incluem as sequências que, devido à degenerescência dos códons genéticos, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos inseticidas das modalidades. Em algumas modalidades, partes de sequências de nucleotídeos na descrição são substituídas com base nas preferências de códons de plantas monocotiledôneas.

[0045] Em algumas modalidades, sequências de nucleotídeos mutantes incluem ainda sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como as geradas, por exemplo, usando mutagenese sítio-dirigida, mas que ainda codificam uma proteína pesticida das modalidades, como uma toxina mutante. Em algumas modalidades, tais sequências de nucleotídeos mutantes ainda incluem adições, deleções ou substituições de um ou mais resíduos de ácido nucleico. Em algumas modalidades, tal adição, remoção ou substituição pode levar à adição, remoção ou substituição do resíduo de aminoácido correspondente. Geralmente, variantes de uma sequência de nucleotídeos particular das modalidades alcançarão, pelo menos, cerca de 90% ou mais de identidade de sequência para essa sequência de nucleotídeos particular, como determinado por programas de alinhamento de sequência descritos abaixo. Uma variante de uma sequência de nucleotídeos das modalidades pode diferir da sequência da descrição por tão pouco como 1-15 nucleotídeos, tão pouco como 1 a 10, como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 nucleotídeo.

[0046] Em algumas modalidades, sequência de nucleotídeos mutantes pode codificar uma proteína mutante tendo atividade inseticida melhorada ou diminuída. Essa atividade pesticida pode ser diferente ou melhorada com relação à proteína nativa ou pode ser inalterada, desde que a atividade pesticida seja mantida. Proteína variante engloba polipeptídeos que são derivados de uma proteína nativa. A derivação pode ser obtida por deleção (assim chamada truncagem) de um ou mais aminoácidos na extremidade N- terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; adição de um ou mais aminoácidos à extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em ou para um ou mais sítios na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa.

[0047] Proteínas variantes englobadas pelas modalidades são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, isto é, atividade pesticida, como aqui descrito. Essas variantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou manipulação humana. Será apreciado pelos versados na técnica que qualquer mutação útil pode ser adicionada às sequências das modalidades, desde que os polipeptídeos codificados retenham a atividade pesticida. A sequência de aminoácidos de uma proteína mutante de algumas modalidades terá, pelo menos, cerca de 90% ou mais de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos da proteína na descrição. Uma proteína mutante de algumas modalidades pode diferir da proteína na descrição por tão pouco como 1-15 resíduos de aminoácidos.

[0048] Em algumas modalidades, sequências também podem ser mutadas de modo que os polipeptídeos codificados sejam resistentes à digestão proteolítica por protease. Mutações podem proteger o polipeptídeo da degradação por protease, por exemplo, por remoção dos sítios proteolíticos putativos, como sítios de serina protease putativos e sítios de reconhecimento de elastase a partir de diferentes áreas. Alguns ou todos esses sítios putativos podem ser removidos ou alterados para que a proteólise no local do sítio original seja diminuída. Mudanças na proteólise podem ser avaliadas por comparação de um polipeptídeo mutante com toxinas de tipo selvagem ou por comparação de toxinas mutantes que diferem em sua sequência de aminoácidos. Sítios proteolíticos e sítios proteolíticos putativos incluem, mas não estão limitados a, as seguintes sequências: um sítio de clivagem de tripsina, um sítio de quimotripsina e um sítio de tripsina. Estes sítios podem ser alterados pela adição ou deleção de qualquer número e tipo de resíduos de aminoácidos, desde que a atividade pesticida do polipeptídeo seja intensificada. Assim, polipeptídeos codificados por sequências de nucleotídeos compreendendo mutações irão compreender, pelo menos, uma mudança ou adição de aminoácido em relação à sequência nativa ou de fundo, ou 50 ou mais mudanças ou adições de aminoácidos.

[0049] Os versados na técnica poderiam reconhecer que adições e/ou substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, carga, tamanho e similares. Grupos substituintes de aminoácidos exemplares, que levam em consideração várias das características acima, são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina. Orientações com relação às substituições apropriadas de aminoácidos que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Proteína Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), aqui incorporado por referência. Substituições conservativas, como a troca de um aminoácido por outro com propriedades similares, podem ser realizadas.

[0050] Quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção antes de realizar as mesmas, um versado na técnica apreciará que o efeito será avaliado por ensaios de triagem de rotina, como testes de alimentação de insetos. Ver, por exemplo, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 e Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 24802485, aqui incorporados por referência.

[0051] Em algumas modalidades, sequências de codificação de comprimento completo, motivos de sequência codificando um domínio estrutural de interesse, ou qualquer fragmento de uma sequência de nucleotídeos das modalidades podem ser recombinados entre as sequências de nucleotídeos das modalidades e porções correspondentes de outras sequências de nucleotídeos Cry conhecidas para obter um novo gene com uma propriedade aperfeiçoada.

[0052] Propriedades de interesse incluem, mas não são limitadas a, atividade pesticida por unidade de proteína pesticida, estabilidade de proteína e toxicidade para espécies não-alvo, particularmente humanos, animais de criação e plantas e micróbios que expressam os polipeptídeos pesticidas das modalidades. As modalidades não são limitadas por uma estratégia de rearranjo particular. Rearranjo pode envolver somente sequências de nucleotídeos aqui descritas ou podem, adicionalmente, envolver o rearranjo de outras sequências de nucleotídeos conhecidas na técnica. As estratégias para o rearranjo do DNA são conhecidas na técnica.

[0053] Identificação da identidade de sequência inclui uma técnica de hibridação. Por exemplo, a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que seletivamente hibrida com outras sequências de nucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonado ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genômicas ou cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridação podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser rotulados com um grupo detectável tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridação podem ser feitas rotulando oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências das modalidades. Métodos para a preparação de sondas para hibridação e para construção de cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica.

[0054] Em algumas modalidades, uma sequência completa aqui descrita, ou uma ou mais porções da mesma, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridar especificamente em correspondentes sequências e RNAs mensageiros. Para alcançar hibridação específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem sequências que são únicas para as sequências das modalidades e têm geralmente pelo menos cerca de 10 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Essas sondas podem ser usadas para amplificar as sequências Cry correspondentes de um organismo escolhido por PCR. Esta técnica pode ser usada para isolar sequências de codificação adicionais de um organismo desejado ou como um ensaio de detecção para determinar a presença de sequências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridação incluem triagem de hibridação de bibliotecas de DNA em placas.

[0055] Hibridação de tais sequências pode ser realizada em condições estringentes. O termo “condições estringentes” ou “condições de hibridação estringentes”, como aqui usado, refere-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridar em sua sequência alvo até um grau detectavelmente maior do que para outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes, 5 vezes, ou 10 vezes sobre fundo). Condições estringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Ao controlar a estringência das condições de hibridação e/ou lavagem, sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algumas faltas de correspondência em sequências, de modo que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos do que cerca de 1000 ou 500 nucleotídeos de comprimento.

[0056] Tipicamente, as condições estringentes serão as em que a concentração de sal é menor do que cerca 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridação com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, SDS a 1% (dodecilsulfato de sódio) a 37°C e uma lavagem em 1 x a 2 x SSC (20xSSC=3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de estringência moderadas exemplares incluem hibridação em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5 x a 1 x SSC a 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridação em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C e uma lavagem final em 0,1x SSC a 60 a 65°C durante pelo menos cerca de 20 minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridação é geralmente menor do que cerca de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[0057] Especificidade é tipicamente dependente da lavagem pós- hibridação, os fatores críticos sendo a potência iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, Tm (ponto de fusão térmica) pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5°C+16,6 (log M) +0,41 (% GC) -0,61 (% formamida) -500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, “% formamida” é a porcentagem de formamida na solução de hibridação, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. Tm é a temperatura (sob potência iônica e pH definidos), em que 50% de uma sequência alvo complementar hibrida com uma sonda perfeitamente correspondida. Lavagem é tipicamente realizada pelo menos até equilíbrio ser alcançado e um baixo nível de fundo de hibridação ser alcançado, como durante 2 horas, 1 hora ou 30 minutos.

[0058] Tm é reduzida em cerca de 1°C por cada 1% de falta de correspondência; assim, Tm, condições de hibridação e/ou de lavagem podem ser ajustadas para hibridar em sequências da identidade desejada. Por exemplo, se sequências com = 90% de identidade são buscadas, a Tm pode diminuir em 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para ser de cerca de 5°C menores do que a Tm para a sequência específica e sua sequência complementar em uma potência iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 4°C menor do que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 6°C menor do que a Tm; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem a 11°C menor do que a Tm.

[0059] Os fragmentos das sequências de nucleotídeos e as sequências de aminoácidos codificadas são também englobados por algumas modalidades. Como aqui usado, o termo “fragmento” refere-se a uma porção de uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo ou uma porção de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo das modalidades. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem codificar fragmentos de proteína que retém a atividade biológica da proteína nativa ou de comprimento completo correspondente e, assim, possuir a atividade pesticida. A proteína variante engloba fragmentos biologicamente ativos de uma proteína nativa que compreendem um número suficiente de resíduos de aminoácidos contíguos para reter a atividade biológica da proteína nativa.

[0060] É conhecido, na técnica, que a atividade pesticida das toxinas Bt é tipicamente ativada por clivagem do peptídeo no intestino do inseto por várias proteases. Como os peptídeos nem sempre podem ser clivados com eficiência completa no intestino do inseto, fragmentos de uma toxina de comprimento completo podem ter uma atividade pesticida intensificada em comparação com a própria toxina de comprimento completo. Em algumas modalidades, atividade pesticida de um polipeptídeo também pode ser aperfeiçoada por truncagem da sequência nativa ou de comprimento completo.

[0061] Assim, em algumas modalidades, a presente descrição refere- se a versões truncadas ou fragmentos dos polipeptídeos inseticidas de comprimento completo. Alguns dos fragmentos, variantes e mutações de polipeptídeos de algumas modalidades terão uma atividade pesticida intensificada em relação à atividade do polipeptídeo inseticida de ocorrência natural a partir do qual eles são derivados. Alguns dos fragmentos de polipeptídeos, variantes e mutações de algumas modalidades terão uma atividade pesticida reduzida em relação à atividade do polipeptídeo inseticida de ocorrência natural a partir do qual eles são derivados.

[0062] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos das modalidades que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína pesticida das modalidades irá codificar pelo menos 50 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo pesticida das modalidades. Ácidos nucleicos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos das modalidades compreendem pelo menos 150 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos aqui descrita. Modalidades particulares preveem fragmentos derivados de (por exemplo, produzidos a partir de) um primeiro ácido nucleico das modalidades, em que o fragmento codifica uma toxina truncada caracterizada por atividade pesticida. Polipeptídeos truncados codificados pelos fragmentos de polinucleotídeos das modalidades são caracterizados por atividade pesticida que é equivalente a, ou melhorada com relação à atividade do polipeptídeo de comprimento completo correspondente codificado pelo primeiro ácido nucleico a partir do qual o fragmento é derivado. É visado aqui que tais fragmentos de ácido nucleico das modalidades possam ser truncados na extremidade 3' da sequência de codificação nativa ou de comprimento completo correspondente. Fragmentos de ácido nucleico também podem ser truncados nas extremidades 5' e 3' da sequência de codificação nativa ou de comprimento completo correspondente.

[0063] A descrição refere-se a um cassete de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada. A descrição não limita o promotor e o terminador especificamente usados no cassete de expressão, desde que eles sejam aplicáveis para expressão em plantas. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada a um promotor 35S e a um terminador Nos.

[0064] A descrição ainda se refere a um vetor de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico isolada. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência PolyA e um melhorador ômega. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende adicionalmente outros cassetes de expressão para detectar a expressão do vetor de expressão em células.

[0065] Algumas modalidades ainda englobam um microrganismo, como Escherichia coli ou agrobacterium, que é transformado com pelo menos um ácido nucleico das modalidades, com um cassete de expressão compreendendo o ácido nucleico, ou com um vetor compreendendo o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o micro-organismo é um que se multiplica em dependência das plantas.

[0066] Algumas modalidades compreendem ainda células de plantas transformadas ou plantas transgênicas compreendendo, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos das modalidades. Em algumas modalidades, uma planta é transformada usando um vetor de expressão compreendendo, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos das modalidades e um promotor que é operacionalmente ligado ao mesmo e dirige expressão em uma célula de planta. A célula de planta transformada e planta transgênica referem-se a uma célula de planta ou planta que compreende, dentro de seu genoma, um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de modo estável dentro do genoma de uma célula de planta transformada ou planta transgênica, de tal modo que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um vetor de expressão.

[0067] Em algumas modalidades, a planta, como mencionado na descrição, é uma planta monocotiledônea; e, opcionalmente, a planta é selecionada do grupo que consiste de milho, arroz, trigo, aveia, cevada, cevada nua, milheto, sorgo e cana-de-açúcar.

[0068] Em algumas modalidades, a planta, como mencionada na descrição, inclui células de plantas, protoplastos de plantas, culturas de tecidos de células de plantas a partir das quais as plantas podem ser regeneradas, calos de plantas, aglomerados de plantas e células de plantas que são intactas em plantas ou partes de plantas, como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutas, grãos, espigões, espigas, cascas, talos, raízes, pontas de raízes, anteras e similares. A descrição ainda inclui células de plantas, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, hastes, frutos, folhas e raízes se originando de plantas transgênicas ou progênie das mesmas e, portanto, consistindo, pelo menos em parte, das sequências de nucleotídeos como aqui descritas.

[0069] Embora as modalidades não dependam de um mecanismo biológico particular para aumentar a resistência de uma planta a uma praga de planta, a expressão das sequências de nucleotídeos das modalidades em uma planta pode resultar na produção das proteínas pesticidas das modalidades e em um aumento na resistência da planta a uma praga de planta. As plantas das modalidades encontram uso na agricultura em métodos para impactar pragas de insetos. Certas modalidades fornecem uma planta de cultura agrícola transformada, que encontra uso em métodos para impactar pragas de insetos da planta, como, por exemplo, uma praga lepidóptera.

[0070] As pragas lepidópteras incluem, mas não são limitadas a, às pragas na família Noctuidae: Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Spodoptera litura, Mamestra configurata, Mamestra brassicae, Agrotis ipsilon, Agrotis orthogonia, Agrotis segetum, Alabama argillacea, Trichoplusia ni, Pseudoplusia includes, Anticarsia gemmatalis, Hypena scabra, Heliothis virescens, Pseudaletia unipuncta, Athetis mindara, Euxoa messoria, Earias insulana, Earias vittella, Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea; pragas na família Pyralidae: Ostrinia furnacalis, Ostrinia nubilalis, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Cadra cautella, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Corcyra cephalonica, Crambus caliginosellus, Crambus teterrellus, Cnaphalocrocis medinalis, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Galleria mellonella, Herpetogramma licarsisalis, Homoeosoma electellum, Elasmopalpus lignosellus, Achroia grisella, Loxostege sticticalis, Maruca testulalis, Plodia interpunctella, Scirpophaga incertulas e Udea rubigalis; pragas na família Tortricidae: Acleris variana, Archips argyrospila, Archips rosana, Argyrotaenia citrana, Choristoneura rosaceana; e pragas em outras famílias: Adoxophyes orana, Cochylis hospes, Cydia latiferreana, Cydia. Pomonella, Platynota flavedana, Platynota stultana, Lobesia botrana, Spilonota ocellana, Endopiza viteana, Eupoecilia ambiguella, Bonagota salubricola, Grapholita molesta, Suleima helianthana, etc.

[0071] Outras pragas lepidópteras agrícolas selecionadas inlcuem, mas não são limitadas a, Alsophila pometaria, Bucculatrix thurberiella, Colias eurytheme, Datana integerrima, Ennomos subsignaria, Erannis tiliaria, Euproctis chrysorrhoea, Harrisina Americana, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lymantria dispar, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Operophtera brumata, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Phryganidia californica, Phyllocnistis citrella, Phyllonorycter blancardella, Pieris brassicae, Pieris rapae, Pieris napi, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Sabulodes aegrotata, Sitotroga cerealella, Thaumetopoea pityocampa, Tineola bisselliella, Tuta absoluta e Yponomeuta padella.

EXEMPLOS Exemplo 1: Projeto e síntese de gene resistente a inseto

[0072] O gene na descrição é baseado em uma sequência de 608 aminoácidos de N-terminal da proteína de fusão após fusão e modificação de Cry1Ab e Cry1Ac, e as sequências de codificação foram substituídas por códons preferidos pelas plantas. Depois de eliminar sítios de digestão de enzimas de restrição ricos em sequência AT e sítios de digestão de enzimas de restrição comuns resultando em transcrição instável de plantas presentes na sequência de DNA, correções e eliminações foram realizadas substituindo os códons; uma sequência de ADN modificada foi obtida por adição de um códon de terminação TAA na extremidade 3'; e um gene Bt modificado, como sequência SEQ ID NO: 1, foi identificado e quimicamente sintetizado. Uma proteína codificada pela sequência de DNA modificada contém três zonas funcionais, onde duas zonas funcionais no N-terminal são altamente homólogas à contraparte de Cry1Ab e a zona funcional no terminal C é altamente homóloga a Cry1Ac. Assim, o gene na descrição foi chamado Cry1Ab/Cry1AcZM. Uma comparação homóloga entre a sequência, a sequência de Guo Sandui et al. (CN1037913C, 1996) e Cry1Ab na planta de milho transgênico Mon810 de Monsanto foi realizada (resultados como mostrado na Tabela 1), e o teor de GC foi calculado (resultados como mostrado na Tabela 2). Tabela 1. Comparação homóloga entre sequências de DNA Tabela 2. Porcentagem de teor de GC em CrylAb/CrylAcZM e sequências de Affinis

Exemplo 2: Construção de vetor

[0073] Com base nas necessidades de expressão de funções de genes em plantas, otimização da expressão foi ainda projetada para a montante e a jusante da região de codificação de gene Cry1Ab/Cry1AcZM, a fim de melhorar a potência do gene no nível da transcrição e a eficiência da tradução da proteína, incluindo a adição de um fragmento de uma sequência ômega (Q) consistindo de 67 nucleotídeos e uma sequência Kozak (SEQ ID NO: 2) consistindo de 3 nucleotídeos (acc) na extremidade 5’ para intensificar a eficiência de tradução de genes eucarióticos e um fragmento de sequência de cauda poly(A) (SEQ ID NO: 3) de mRNA eucariótico na extremidade 3’ para aumentar transporte de karyon para o citoplasma, estabilidade de mRNA e eficiência de tradução.

[0074] Sítios de digestão HindIII e PstI foram adicionados à extremidade 5' da SEQ ID NO: 1 sintetizado, e sítio de digestão PmeI foi adicionado à extremidade 3’. A sequência sintetizada foi clonada em um vetor Puc57 simples, e foi chamada pzz01194.

[0075] Quatro vetores de expressão de planta foram construídos, e descritos respectivamente como a seguir: (I) Construção de pZHZH25017: pzz00002 foi digerido com enzimas de restrição HindIII e BamHI para obter um fragmento de promotor Ubi, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0076] pzz01194 foi digerido com uma enzima de restrição PstI, uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase, e o promotor Ubi foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor chamado pzz01201 contendo um fragmento Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM.

[0077] pzz01188 foi digerido sozinho com uma enzima EcoRI para obter um fragmento de terminador Tnos, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0078] pzz01201 foi digerido com PmeI, e um terminador Tocs foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor chamado pzz01205 contendo um fragmento Ubi- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos (a Figura 1A).

[0079] pzz00002 foi digerido com HindIII+BamHI para obter um fragmento de promotor Ubi, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0080] pzz01194 foi digerido com PstI, uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase, e o promotor Ubi foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor chamado pzz01201 contendo um fragmento Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM.

[0081] Um vetor existente contendo o terminador Tnos (com sítio de digestão de EcoRI na extremidade 5’, e sítios PmeI e EcoRI na extremidade 3’) foi chamado pzz01188, e a sequência de terminação de Tnos pode ser obtida por digestão única de pzz01188 com EcoRI.

[0082] Um fragmento de terminador Tnos foi obtido por digestão única de pzz01188 com EcoRI, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0083] pzz01201 foi digerido com PmeI, e o terminador Tocs foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor pzz00015 contendo um fragmento Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM- Tnos (a Figura 1B).

[0084] Um elemento Ubi-EGFP-T35spolyA foi adicionado à espinha dorsal do vetor construído pzz00015 (a Figura 1B), isto é, pCambia3300 (com um elemento 35s-BAR-T35spolyA), por digestão dupla com HindIII+PmeI, e o elemento Ubi-EGFP-T35spolyA foi removido com HindIII+PmeI; e então um novo elemento foi adicionado aos sítios.

[0085] Um vetor pzz01205 foi digerido com HindIII+PmeI para obter um fragmento Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos.

[0086] O vetor pzz00015 foi digerido com HindIII+PmeI, e Ubi- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos foi ligado aos sítios de digestão para obter um vetor de expressão chamado pZHZH25017 contendo dois elementos de expressão, isto é, Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos e 35s-BAR-T35spolyA, como mostrado em Figura1C

(II) Construção de pZHZH25018:

[0087] pzz01194 foi digerido com uma enzima de restrição PstI, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase, e o promotor Ubi foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor chamado pzz01201 contendo um fragmento Ubi-Cry1 Ab/Cry1AcZM. Um vetor pzz00002 contendo o promotor Ubi foi digerido com enzimas de restrição HindIII+BamHI para obter um fragmento de promotor Ubi, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0088] Um vetor existente contendo o terminador Tocs (com sítio de digestão de EcoRI na extremidade 5’, e com sítios PmeI e EcoRI na extremidade 3’) foi chamado pzz01131, e a sequência de terminação Tocs pode ser obtida por digestão única de pzz01131 com EcoRI.

[0089] pzz01131 foi digerido com EcoRI para obter um fragmento de terminador Tocs, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0090] pzz01201 foi digerido com PmeI, e o terminador Tocs foi ligado ao mesmo através de um tipo de conexão de extremidade cega para obter um vetor chamado pzz01206 contendo um fragmento Ubi- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs (a Figura 1D).

[0091] Um elemento Ubi-EGFP-T35spolyA foi adicionado a um vetor construído pzz00015 com pCambia3300 (com um elemento 35s-BAR- T35spolyA) como sua espinha dorsal por digestão dupla com HindIII+PmeI, Ubi-EGFP-T35spolyA pode ser removido com HindIII+PmeI, e então um novo elemento foi adicionado aos sítios.

[0092] O vetor pzz01206 foi digerido com HindIII+PmeI para obter um fragmento Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs.

[0093] O vetor pzz00015 foi digerido com HindIII+PmeI, e Ubi- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs foi ligado aos sítios de digestão para obter um vetor de expressão chamado pZHZH25018 contendo dois componentes de expressão Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs e 35s-BAR-T35spolyA, como mostrado na Figura 1E.

(III) Construção de pZHZH25020

[0094] 1. Um vetor existente contendo promotor 35S (com sítio de digestão de SalI na extremidade 5’ e com sítio de digestão de BamHI na extremidade 3’) foi chamado pzz01143.

[0095] 2. pzz01143 foi duplamente digerido com SalI+BamHI para obter um fragmento de promotor 35S, e uma extremidade pegajosa produzida a partir do mesmo foi tornada cega com T4DNA polimerase.

[0096] 3. O promotor Rbcs em um fragmento Rbcs- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos contido em um vetor existente pzz01191 pode ser removido por digestão dupla com HindIII+PstI.

[0097] 4. pzz01191 foi duplamente digerido com HindIII+Pst, um fragmento de promotor Rbcs foi removido, e uma extremidade pegajosa do fragmento restante foi tornada cega com T4DNA polimerase. O fragmento de promotor 35S obtido na etapa 2 foi ligado ao mesmo para obter um vetor chamado pzz01207 contendo 35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos (a Figura 1F).

[0098] 5. Um vetor pzz00005 (a Figura 1G) foi construído com pCambia3300 (com um elemento Ubi-BAR-T35spolyA) como sua espinha dorsal e sítios de digestão de HindIII e PmeI nos fragmentos exógenos pode ser adicionado.

[0099] 6. O vetor pzz01207 foi digerido com HindIII+PmeI para obter um fragmento 35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos.

[00100] 7. O vetor pzz00005 foi digerido com HindIII+PmeI, e 35S- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos foi ligado aos sítios de digestão para obter um vetor de expressão chamado pZHZH25020 contendo dois componentes de expressão, isto é, 35S-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tnos e Ubi-BAR-T35spolyA, como mostrado na Figura 1H.

(IV) Construção de pZHZH25022

[00101] 1. Um vetor de clonagem pzz01194 foi usado para a construção.

[00102] 2. Um vetor existente contendo um fragmento Ubi- Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs (um fragmento PolyA em Cry1Ab/Cry1AcZM, junto com Tocs, pode ser obtido por digestão dupla com EcoRI+PmeI) foi chamado pzz01206.

[00103] 3. Um vetor existente contendo um fragmento 35S- Cry1Ab/Cry1AcZM Zm-Tnos (um fragmento PolyA em Cry1Ab/Cry1AcZM, junto com Tnos, pode ser removido por digestão dupla com EcoRI+PmeI) foi chamado pzz01207.

[00104] 4. pzz01206 foi duplamente digerido com EcoRI+PmeI para obter um fragmento polyA+Tocs.

[00105] 5. pzz01207 foi duplamente digerido com EcoRI+PmeI para remover um fragmento polyA+Tnos. O fragmento polyA+Tocs obtido na etapa 5 foi ligado ao mesmo para obter um vetor chamado pzz01228 contendo 35S-Cry1Ab/CryAc Zm-Tocs (a Figura 1J).

[00106] 6. Um vetor pzz00005 foi construído com pCambia3300 (com um elemento Ubi-BAR-T35spolyA) como sua espinha dorsal e sítios de digestão de HindIII e PmeI nos fragmentos exógenos pode ser obtido.

[00107] 7. O vetor pzz01228 foi digerido com HindIII+PmeI para obter um fragmento 35S-Cry1Ab/Cry1Ac ZM-Tocs.

[00108] 8. O vetor pzz00005 foi digerido com HindIII+PmeI, e 35S- Cry1Ab/Cry1Ac Zm-Tocs foi ligado aos sítios de digestão para obter um vetor de expressão chamado pZHZH25022 contendo dois elementos de expressão, isto é, 35S-Cry1Ab/Cry1AcZM Zm-Tocs e Ubi-BAR-T35spolyA, como mostrado na Figura 1K. Tabela 3. Estrutura de cassete de expressão de um vetor de transformação

Exemplo 3: Transformação genética

[00109] (1) Transformação genética de milho: vetores de DNA pZHZH25017, pZHZH25018, pZHZH25020, pZHZH25022 e outros plasmídeos foram transformados em agrobacterium EHA105 por um método de eletroporação e foram identificados antes do uso. Linhagem isogênica de milho Xiang 249 foi autocruzada, e um embrião tendo um comprimento de 1,5mm foi então usado para transformação. Os embriões coletados de cerca de 200 espigas foram usados como um lote, colocados em tubos EP para aspirar a suspensão, co-cultivados com uma suspensão de agrobacterium contendo 200 μM de acetosiringona durante 5 minutos e então transferidos para um meio simbiótico e cultivados no escuro durante três dias. Após a cultura no escuro, os embriões foram colocados em um meio de cultura indutor de calo. Após a formação de calo, os embriões foram colocados em meio seletivo contendo 5 mg/L de bialaphos para cultura seletiva e foram subcultivados uma vez a cada duas semanas. Após a formação de calo resistente, calos embriônicos em boas condições foram selecionados e transferidos para um meio diferencial e cultivados sob condições de 26°C e 3000 Lux de intensidade de iluminação durante 16 horas todos os dias. Duas semanas depois, apareceram plântulas crescendo de novo. As plântulas crescendo novamente foram transferidas para um meio de formação de raiz, e foram transplantadas, após a formação de raiz secundária, em um pequeno vaso com uma mistura de solo de nutrientes e vermiculite (1:3). Ao mesmo tempo, DNA foi extraído de amostras de folhas para identificar plantas positivas por teste de PCR e então transplantadas para um vaso de plantas grande. Após 7 folhas serem formadas em uma planta, bioensaio de resistência a inseto foi realizado, e sementes de geração T1 foram obtidas por autocruzamento ou hibridação.

[00110] (2) Transformação genética do arroz: nesta descrição, a expressão de Cry1Ab/Cry1AcZM em arroz foi testada com arroz japonica “Kongyu 131” como o receptor de transformação. Os genes resistentes a insetos e resistentes a herbicidas foram introduzidos em arroz por um método de transformação genética mediada por agrobacterium usando um vetor pZHZH25020, incluindo as etapas específicas de: transformar um vetor de expressão construído em agrobacterium; infectando calos embriogênicos do arroz com uma suspensão de agrobacterium; transferir o calo para um meio seletivo adicionado com glufosinato para selecionar calo resistente; transferir o calo resistente para um meio diferencial para diferenciação, transferir plântulas crescendo novamente formadas por diferenciação para um meio de formação de raiz, deixar as plântulas endurecer após a formação da raiz e transplantar as plântulas para obter mais de 200 transformantes de arroz transgênico geração T0. Estas plantas transformadas foram analisadas por PCR, as sementes foram obtidas por autocruzamento das plantas positivas selecionadas e mais de 50 linhagens de plantas T1 transformadas foram identificadas. Análise da expressão da proteína Bt foi realizada para materiais de geração T1 após a semeadura e brotação.

Exemplo 4: Identificação molecular de DNA de plantas transgênicas usando PCR e SOUTHERN BLOT (1) Detecção por PCR

[00111] DNA genômico foi extraído de milho transgênico geração T0 milho com um kit de extração de DNA de Tiangen Biotech Co., Ltd.

[00112] Os seguintes reagentes foram retirados de um refrigerador a - 20oC, e então descongelados: solução tampão 10xPCR (Takara), mistura de deoxinucleotídeo (10mM, Sigma), iniciadores dianteiro e reverso (iniciador dianteiro CSP759 (SEQ ID NO: 4): 5'-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’; iniciador reverso CSP760 (SEQ ID NO: 5): 5’- GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’) e DNA gabarito de folhas de milho. Após descongelamento, todos os reagentes foram centrifugados pouco durante alguns segundos, e colocados em gelo. Uma solução misturada do sistema de reação PCR foi preparada, completamente misturada e centrifugada pouco durante alguns segundos. O sistema de reação PCR (20 μl): 2 μl de 10xPCR solução tampão (Takara), 0,5 μl de mistura de deoxiribonucleotídeo (10 mM, Sigma), 0, μl de uma mistura de iniciadores dianteiro e reverso (5 μM), 0,2 μl de r-Taq (5 u, Takara), 1 μl de DNA gabarito de folhas de milho, e o resto sendo dd H2O. A solução misturada foi sub-embalada em tubos de PCR de 200 μl, aos quais foram adicionados 1 μl de DNA gabarito, e diferentes amostras foram distinguidas pelos respectivos marcadores. Os tubos de reação de PCR foram colocados em um dispositivo de amplificação por PCR Thermo 9700 e um programa de amplificação por PCR pré-definido foi selecionado para iniciar a reação. Procedimento de reação de PCR: pré-degeneração a 94°C durante 2 minutos; e menos de 30 ciclos como a seguir: degeneração a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 58°C durante 30 segundos, extensão a 72°C durante 30 segundos; e extensão final a 72°C durante 5 minutos.

[00113] Após a conclusão do PCR, 5 μl do produto de PCR foram testados por eletroforese em gel de agarose. Gel de agarose a 1,5% foi preparado, colorido com brometo de etidio (EB) durante 10 minutos após a eletroforese a 150 V durante 25 minutos, e depois foi fotografado em um sistema de formação imagem em gel UV. O gene Cry1Ab/Cry1AcZM estava especificamente presente nos vetores de transformação. Desta forma, uma planta transgênica que pode amplificar a banda específica do gene é uma planta positiva ou, de outra forma, é um material negativo. A Figura 2 mostra o resultado do teste da plântula de milho transformada T0. Trilhas 1-6, respectivamente, referem-se a diferentes plantas transgênicas de geração T0, como mostrado na legenda dos desenhos em anexo. As linhagens da planta de geração T1 em progênies de autocruzamento ou híbridas de plantas de geração T0 selecionadas, e o seu resultado do teste de PCR também foi positivo. As plantas positivas obtidas e as linhagens da planta são mostradas na Tabela 4. Tabela 4. PCR convencional para identificação de plantas transformadas

(2) Identificação por Southern Blot

[00114] DNA genômico total do milho transgênico foi extraído. O precipitado de DNA obtido foi secado e então dissolvido em água deionizada e sua concentração foi determinada.

[00115] Uma sonda foi preparada com DNA plasmídeo pZHZH25018 como o gabarito. Uma sonda de 333bp para Cry1Ab/Cry1AcZM foi sintetizada usando um kit de síntese de sonda PCR DIG (artigo NO. 11636090910) de Roche Company com sequência 4 (SEQ NO 4, CSP759: CACGCAGATTCCAGCGGTCAA e CSP760: GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA) como o iniciador. O sistema de amplificação inclui: 5 μL (50pg) de DNA gabarito, 0,5 μL de iniciador CSP759, 0,5 μL de iniciador CSP760, 5 μL de mistura PCR DIG, 0,75 μL de DNA polimerase, 5 μL de solução tampão PCR (10x) e 33,25 μL de ddH2O. Procedimento de reação PCR: pré-degeneração a 94 °C durante 5 minutos; e menos do que 35 ciclos como a seguir: degeneração a 94°C durante 30 segundos, anelamento a 55 °C durante 30 segundos, extensão a 72°C durante 45 segundos; e extensão final a 72°C durante 7 minutos. Ao completar a amplificação por PCR, o produto foi mantido a 12°C, e o efeito do marcador foi detectado com gel a 1%.

[00116] Após a digestão com enzima de amostras, os fragmentos digeridos foram recuperados. Um sistema de digestão de 200 μL foi preparado a partir de 20 μg de DNA genômico de milho, 20 μL de enzima de restrição e 20 μL de 10x solução tampão, e foi suplementado com ddH2O até 200 μL. Após digestão com enzima durante 16h, 20 μL foram testados por eletroforese para determinar se o efeito de digestão estava completo. O produto de digestão de enzima foi suplementado com ddH2O até 400 μL, ao qual volume 1/10 de 3 M de solução de acetato de sódio (pH5,2) foi adicionado, 4 μl de carreador de precipitação Dr. GenTLE foi adicionado, e 2,5 volume de etanol anidro foi adicionado. A mistura foi completamente misturada, e centrifugada a 12000 RPM a 4°C durante 15 minutos. O precipitado foi dissolvido em 50 μl de ddH2O, ao qual 5 μl de 6x tampão de carga foi adicionado.

[00117] Após eletroforese do DNA em 0,8% de gel a 20V durante 16h, trilhas em excesso e cavidades de carga foram cortados. O gel restante foi tratado com uma solução de degeneração duas vezes, durante 15 minutos cada vez, e agitado suavemente em leito agitado. Então, foi tratado com um tampão de neutralização duas vezes, durante 15 minutos cada, e agitado suavemente em leito agitado. Ele foi lavado com água ultrapura uma vez, tratado com 20xSSC durante 10 minutos, seguido por processamento de transmembrana com um sistema Whatman durante mais de 4 horas.

[00118] Ao completar a transmembrana, a membrana foi reticulada por um reticulador UV em papel de filtro Whatman 3MM embebido com 10x SSC durante 3-5 minutos. A membrana foi simplesmente lavada com ddH2O, e então secada em ar. Tanto os processos de hibridação como de desenvolvimento foram realizados de acordo com o manual de operação do kit de detecção de Roche DIG I (número de artigo 11745832910).

[00119] Neste experimento, o número de cópias de genes exógenos integrados no genoma do milho e as similaridades e diferenças entre as plantas transformadas foram detectados. Por digestão do DNA genômico respectivamente com enzimas de restrição HindIII e NcoI, o resultado do número de cópias integrado no genoma do milho foi obtido (a Figura 3). A Figura 3 mostra os resultados de hibridação molecular de HindIII digerido com DNA genômico de milho de uma linhagem de planta de geração T1 transformada por uma sonda específica Cry1Ab/Cry1AcZM tendo um comprimento de 333bp. Trilhas 1 e 6 são para um controle negativo Xiang 249; Trilhas 2 e 7 são para T1-1; Trilhas 3 e 8 são para T1-2; Trilhas 4 e 9 são para T1-3; e Trilhas 5 e 10 são para material T1-4. M é uma trilha para marcador de peso molecular com um número de pares de base. Sob as condições de digestão por enzima, para ambas as enzimas, uma banda positiva é respectivamente mostrada, indicando que uma cópia única de um gene exógeno foi inserida. As duas enzimas mostraram bandas positivas, indicando que a cópia de gene exógeno foi inserida. Com este método, várias plantas transformadas de cópia única com diferentes vetores de transformação em diferentes sítios de inserção foram identificadas. Dentre 4 vetores (pZHZH25017, pZHZH25018, pZHZH25020 e pZHZH25022), mais do que 15 plantas transformadas de cópia única foram identificadas para cada vetor de transformação.

Exemplo 5: Determinação de expressão de proteína Bt em plantas transgênicas

[00120] Os teores de proteínas resistentes a insetos em plantas transgênicas foram determinados por Immunostrip e teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA).

(I) Identificação por Immunostrip

[00121] Proteínas em tecidos de plantas foram testadas usando a tira de teste AntiCry1Ab(Cry1Ac) disponível de uma empresa de biotecnologia nas seguintes etapas. Amostragem: algumas quantidades dos tecidos a serem testados (folhas, filamentos, etc.) foram amostradas, trituradas na presença de uma solução aquosa de PBS (1 ml de solução adicionada a 0,2 g de amostra) e centrifugadas. O sobrenadante foi testado mergulhando a extremidade de teste da tira de teste na amostra. O resultado foi observado 5-10 minutos depois. Se a linha de controle estiver escurecida, isso significa que o teste é normal, e se a linha de teste estiver escurecida, isso significa que a solução contém a proteína a ser testada. Como mostrado na figura, bandas podem ser detectadas a partir de todas as plantas transgênicas com resultados de teste por PCR positivos, enquanto que bandas não foram detectadas a partir dos materiais de controle de tipo selvagem, indicando que um gene exógeno Cry1Ab/Cry1Ac pode expressar proteínas em células de milho transgênico. A Figura 4 mostra o resultado de imunoensaio de seis plantas de geração T0 de plântulas de milho transformadas, onde: materiais 1-6 eram positivos e material 7 negativo. A expressão da proteína em plantas transformadas de cópia única de vários vetores de transformação diferentes foi identificada por este método. Entre os quatro vetores (pZHZH25017, pZHZH25018, pZHZH25020 e pZHZH25022), foram identificadas mais de quinze plântulas transformadas de geração T0 para cada vetor de transformação.

(II) Detecção de teores de proteína resistente a inseto em folhas por ELISA.

[00122] O teor de proteína Bt codificada por Cry1Ab/Cry1AcZM em folhas de diferentes plantas transformadas de milho e arroz foi determinado usando um kit de teste imunossorvente ligado a enzima de sanduíche de anticorpo duplo (ELISA). O kit de teste imunossorvente ligado a enzima era um produto de Shanghai Youlong Biotech Co., Ltd., e o processo de operação específico seguindo pelo manual do fabricante. Teor de proteína Bt foi determinado com um espectrofotômetro de microplacas Tecan infinite M200pro equipado com software i-control 1.10, e os dados foram registrados a 450nm. Uma curva padrão foi feita com base em concentrações de amostra de proteína padrão e os valores OD registrados, e o teor de proteína Bt na amostra a ser testada (μg/g peso fresco de material) foi calculado.

(1) Detecção de teor de proteína Bt em folhas de milho

[00123] O processo de detecção de ELISA é descrito brevemente da seguinte forma: folhas frescas foram amostradas a partir de milho geração T1 (pZHZH25018) crescendo na fase de 9 folhas e 1 filoforo. Foram adicionados 250 μl de solução de extração de amostra (PBS) a 5 mg de peso fresco de amostras pesadas com uma balança eletrônica (sensibilidade de 0,0001 g). A proteína total foi extraída do homogenado de folhas obtidas por método de esfera de aço e centrifugada a 4000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi sugado e diluído para detecção por ELISA.

[00124] Uma curva padrão (R2 = 0,993) foi feita com base na proteína padrão Cry1Ab/Cry1Ac fornecida pelo fabricante para quantitativamente medir as amostras a serem testadas. A concentração de amostras desconhecidas e o teor de proteína Bt nas folhas (o número de microgramas por grama de peso fresco das folhas) foram calculados com base na equação da curva padrão, onde o número de amostras de cada grupo foi n = 12. Os resultados do Western blot são dados na Tabela 5A. Tabela 5A. Teor de proteína Bt em folhas de milho de diferentes plantas transformadas Nota: * significa di ferença significante do controle positivo.

[00125] Os materiais de teste No. 1-5 foram amostras de plantas transformadas selecionadas, material No. 5 foi a amostra de controle positivo interno, e material No.6 foi o controle negativo Xiang 249. Análise estatística demonstrou que o teor de proteína Bt em materiais No. 1-4 foi significativamente maior do que no material No. 5.

[00126] Os experimentos provaram que o gene Bt testado na descrição foi bem expressado em folhas das plantas de milho transformadas selecionadas, e o teor da proteína Cry1Ab/Cry1Ac em folhas frescas estava na faixa de 5-6 μg/g.

(2) Detecção de teor de proteína Bt em folhas de arroz

[00127] O processo de detecção ELISA é descrito brevemente da seguinte forma: folhas frescas foram amostradas a partir de arroz geração T1 (pZHZH25020) crescendo na fase de 7 folhas e 1 filoforo. Foram adicionados 250 μl de solução de extração de amostra (PBS) a 5 mg de peso fresco de amostras pesadas com uma balança eletrônica (sensibilidade de 0,0001 g). A proteína total foi extraída do homogenado de folhas obtidas por método de esfera de aço e centrifugada a 4000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi sugado e diluído para detecção por ELISA.

[00128] Uma curva padrão (R2 = 0,997) foi feita com base na proteína padrão Cry1Ab/Cry1Ac fornecida pelo fabricante para determinar e analisar as amostras a serem testadas. A concentração de amostras desconhecidas e o teor de proteína Bt nas folhas (o número de microgramas por grama de peso fresco das folhas) foram calculados com base na equação da curva padrão, onde o número de amostras de cada grupo foi n = 6. Folhas de cindo diferentes plantas transformadas foram determinadas, e os resultados são dados na Tabela 5B. Tabela 5B. Teor de proteína Bt (Cry1Ab/Cry1Ac) em folhas de arroz em diferentes plantas transformadas Nota: * significa diferença significante de controle positivo.

[00129] Materiais de teste No. T1-1 a T1-5 eram plantas de arroz transformadas selecionadas, material No. 6 controle positivo interno, e material No.7 foi o controle negativo. A análise estatística demonstrou que os teores de proteína em materiais No. 4-5 eram significativamente maiores do que no material de controle positivo interno No. 6.

[00130] Os experimentos demonstraram que o gene Bt testado na descrição foi bem expressado em folhas das plantas de arroz transformadas selecionadas, e os teores da proteína Cry1Ab/Cry1Ac em folhas frescas estavam na faixa de 4-8 μg/g.

Exemplo 6: Identificação de resistência a herbicida em plantas T0 e T1

[00131] Identificação da resistência ao herbicida: sementes obtidas por autocruzamento ou cruzamento de teste de plantas de geração T0 positivas foram semeadas em uma estufa, a resistência aos herbicidas das plantas de geração T1 crescendo em fase de 6 a 8 folhas foi identificada, e as plantas livres de genes resistentes foram removidas. Um gene Cry1Ab/Cry1AcZM e um gene resistente ao glufosinato estavam, ambos, na sequência das bordas esquerda e direita do T-DNA, e ambos foram transformados em milho recipiente. No caso do autocruzamento de geração T0 e de geração T1, a proporção da resistência isolada aos herbicidas nas populações de plantas de geração T2 foi uma das bases para julgar a homozigosidade genética.

[00132] O herbicida pulverizado foi produzido pela Bayer CropScience (China) Co., Ltd., com um líquido solúvel contendo um ingrediente ativo de glufosinato de amônio a 18%. Determinação da concentração de identificação de tolerância de glufosinato de amônio: a dosagem recomendada do herbicida é de 150-300 ml/Mu (diluída com 30-40 kg de água), isto é, diluída 100-267 vezes. Portanto, na descrição, a solução de GLA diluída por 100 vezes foi aplicada na segunda folha de topo (cortando o ápice da folha como marcador de inspeção) na planta de milho transformada no estágio de arranquio (6 a 8 folhas totalmente expandidas). 4-5 dias depois, a tolerância ao herbicida foi observada e registrada. Os resultados mostraram que um grande número de plantas de milho transformadas com folhas altamente resistentes ao glufosinato de amônio foi obtido neste experimento. Entre os quatro vetores (pzhzh225017, pZHZH25018, pZHZH25020 e pZHZH25022), mais do que 50 plântulas transformadas de geração T0 e subsequentes linhagens de plantas T1 e T2 foram identificados para cada vetor de transformação.

Exemplo 7: Bioensaio de resistência a inseto de plantas de milho transgênicas

[00133] Experimento de bioensaio de resistência a insetos de materiais de plantas T0 e T1 foi realizado usando dois métodos: método de folha destacada e método de filamento destacado. (1) Determinação de resistência in vitro de milho transgênico a brocas do milho usando método de identificação de folha destacada

[00134] Quando 6 a 7 folhas foram formadas no milho a ser testado, a segunda folha de topo foi, depois de cortar a parte do ápice da folha, colocada em uma placa de cultura com um diâmetro de 9 cm, e papel de filtro foi umedecido com 1300 μL de água destilada no fundo do disco de cultura para manter alta umidade. 10 larvas recentemente eclodidas de brocas de milho foram inoculadas em cada disco de cultura, que foi selado com tecido impermeável tipo medicinal, tendo boa permeabilidade ao ar. Amostras em triplicata foram coletadas de cada planta, uma linhagem endogâmica não transgênica Xiang 249 foi usada como controle negativo e uma amostra de controle positivo interno foi adicionalmente estabelecida. As larvas foram cultivadas a uma temperatura de 28°C e umidade de 75% sob as condições de iluminação: escuro = 14:10. Quatro dias depois, o número de insetos mortos em cada disco foi verificado para calcular a mortalidade da broca do milho e a mortalidade corrigida. Mortalidade corrigida (%) = (mortalidade de amostras tratadas - mortalidade de amostras de controle) / (1- mortalidade de amostras de controle).

[00135] Os resultados mostraram que as plantas de milho transformadas com folhas altamente resistentes às brocas de milho foram obtidas neste experimento (como mostrado nas Figura 5A e Tabela 6). Tabela 6: Desempenho de resistência a inseto de folhas em plantas transformadas de geração T0 de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene Bt Nota: 12 plantas positivas foram testadas para cada vetor de geração T0.

(2) Método de identificação de filamento destacado

[00136] Plantas transformadas de geração T1 excepcionalmente boas foram semeadas em uma estufa. Filamentos fresco em milho em floração foram retirados da estufa, e colocados em um disco de cultura após torcer várias vezes cada filamento. O método de inoculação de insetos e as condições de cultura foram iguais que os do método de folha destacada. Quatro dias depois, a condição de sobrevivência de larvas de brocas de milho foi verificada. Os resultados mostraram que as plantas de milho transformadas com filamentos altamente resistentes a brocas de milho foram obtidas neste experimento (como mostrado nas Figura 5B e Tabela 7). Tabela 7: Desempenho de resistência a insetos em plantas transformadas de geração T1 excepcionalmente boas de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene BtNota: Três plantas transformadas ótimas foram testadas para cada vetor de geração T1, amostras em triplicata foram definidas para cada planta transformada, e a classificação foi calculada com base nos resultados.

[00137] Sementes foram coletadas por autocruzamento ou criação cruzada de plantas transgênicas com folhas altamente resistentes a brocas de milho com a linhagem de planta transformada como a unidade para posterior análise, identificação e criação transgênica de progênies.

Exemplo 8: Comparação com genes existentes

[00138] Com base em uma sequência de nucleotídeos na técnica anterior (CN1037913C), transformação e identificação de resistência a insetos de plântulas transformadas foram realizadas do mesmo modo que no Exemplos 2-6. Com base em descrição em Exemplo 2, um vetor dirigido por um promotor CaMV35S e tendo um terminador Nos foi construído com a sequência em CN1037913C, e foi chamado pCN1037913C. pCN1037913C foi transferido em Xiang 249 através da tecnologia de transformação mediada por agrobacterium. Várias plantas com um gene Bt resistente a inseto exógeno foram obtidas por identificação molecular, todas as mesmas sendo diferentes plantas transformadas de vetor pCN1037913C. Então, com base em Exemplo 5, resistência à broca do milho em uma série de plantas de milho transformadas de pCN1037913C foi comparada com resistência à broca de milho em uma pluralidade de plantas de milho transformadas de diferentes vetores criados em uma descrição sob condições idênticas. Os resultados de desempenho de resistência a inseto em plantas transformadas de geração T0 de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene Bt foram listados em Tabela 8. Os resultados de desempenho de resistência a inseto de plantas transformadas de geração T1 excepcionalmente boas de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene Bt foram listados em Tabela 9. Tabela 8: Desempenhos de resistência a insetos em folhas em plantas transformadas de geração T0 de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene Bt Nota: Doze plantas positivas foram testadas para cada vetor de geração T0. Tabela 9: Desempenho de resistência a inseto em plantas transformadas excepcionalmente boas de diferentes cassetes de expressão de sequência de gene Bt Nota: Três plantas transformadas ótimas foram testadas para cada vetor de geração T1, amostras em triplicata foram definidas para cada planta transformada, e a classificação foi calculada com base nos resultados.

[00139] Os resultados demonstraram que a atividade inseticida de sequência de gene Bt Cry1Ab/Cry1AcZM designada na descrição é melhor do que a das sequências existentes. As folhas de geração T0, e folhas de geração T1 e filamentos nas plantas transgênicas excepcionalmente boas, têm uma capacidade mais forte para exterminar as brocas de milho.

[00140] Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência e usadas para todos os fins na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência para todos os fins. Quando as publicações e patentes ou pedidos de patente aqui incorporados por referência estão em conflito com os conteúdos descritos contidos no relatório descritivo, os conteúdos na substituição do relatório descritivo (e/ou) são superiores a tais materiais de referência em conflito.

[00141] Todos os números usados para mostrar as quantidades de componentes, condições cromatográficas e similares na DESCRIÇÃO e REIVINDICAÇÕES devem ser entendidos como sendo modificados pelo termo “cerca de” em todos os casos. Portanto, salvo especificado de outra forma, os parâmetros numéricos indicados na DESCRIÇÃO e nas REIVINDICAÇÕES em anexo são aproximações e podem ser mudados com base no desempenho desejado a ser adquirido a partir da descrição.

[00142] As modalidades aqui descritas são dadas apenas a título de exemplos e não se destinam a ser limitativas de qualquer modo. A DESCRIÇÃO e EXEMPLOS são considerados como apenas exemplares, com o verdadeiro alcance da descrição sendo limitado pelas reivindicações em anexo. Como é evidente para os versados na técnica, muitas modificações e alterações na descrição podem ser feitas sem sair do espírito e escopo da descrição. Portanto, essas modificações ou aperfeiçoamentos feitos sem sair do espírito da descrição são, todos, englobadas dentro do escopo de proteção da descrição.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a ou consiste na sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1.

2. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

3. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita molécula de ácido nucleico é operativamente ligada a um promotor Ubi e um terminador Ocs, ou com um promotor Ubi e um terminador Nos, ou a um promotor CaMV35S e um terminador Ocs, ou a um promotor CaMV35S e um terminador Nos.

4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão como definido na reivindicação 2 ou 3.

5. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão adicionalmente compreende uma sequência Q.

6. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão adicionalmente compreende uma sequência Kozak.

7. Vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão adicionalmente compreende uma sequência PolyA.

8. Vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito vetor de expressão adicionalmente compreendendo um gene Bar.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 8; em que dita célula hospedeira é uma célula de ESCHERICHIA COLI ou uma célula de Agrobactéria.

10. Método para produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é obtida pela transformação de uma planta pelo uso do vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 8.

11. Método para produzir uma semente transgênica, caracterizado pelo fato de que que a semente transgênica é produzida a partir da planta transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 10.

12. Método para controlar uma população de uma praga lepidóptera, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar a população de praga lepidóptera com planta transgênica obtida pelo método como definido na reivindicação 10.

13. Método para exterminar uma praga lepidóptera, caracterizado pelo fato de que compreende alimentar a praga lepidóptera com uma quantidade inseticidamente eficaz da planta transgênica obtida pelo método como definido na reivindicação 10.

14. Método para reduzir os danos de uma praga lepidóptera a uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende integrar estavelmente um vetor de expressão no genoma da planta, em que dito vetor de expressão compreende uma molécula de ácido nucleico codificando um gene resistente à praga lepidóptera, e dita molécula de ácido nucleico compreende a ou consiste na sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta monocotiledônea.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, milheto, sorgo e cana-de-açúcar.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a referida praga de lepidópteros é Ostrinia furnacalis ou Ostrinia nubilalis.

18. Par de iniciadores, caracterizado pelo fato de que é para detectar uma molécula de ácido nucleico, dita molécula de ácido nucleico compreendendo a ou consistindo na sequência de nucleotídeos como apresentada em SEQ ID NO: 1; em que, dito par de iniciadores é SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.