BR112017015691B1 - dispositivo e método para determinar os efeitos dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos nos testes aquosos - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETERMINAR OS EFEITOS DOS INGREDIENTES ATIVOS NOS NEMATÓDEOS E OUTROS ORGANISMOS NOS TESTES AQUOSOS. A invenção refere-se a um dispositivo (1) e um método para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos nos testes aquosos. O dispositivo (1), de acordo com a invenção compreende um portador (13) para uma placa de cultura celular (30) com múltiplos poços (31) nos quais os nematódeos podem ser abastecidos com os ingredientes ativos, a dita placa de cultura celular (30) com um lado inferior (33), um lado superior (32) e também paredes laterais estendendo-se entre o lado inferior (33) e o lado superior (32), uma câmera (11) que é usada para gravar imagens preferivelmente do lado inferior (33) da placa de cultura celular (30), um mecanismo de iluminação (14) com pelo menos uma primeira fonte de luz (15) que ilumina a placa de cultura celular (30), lá estando disposta, entre a primeira fonte de luz (15) e uma primeira parede lateral (34) da placa de cultura celular (30) no estado instalado, uma primeira unidade óptica que direciona a luz da primeira fonte de luz (15) através da primeira parede lateral (34) na direção do lado inferior (33) da placa de cultura celular (30). O método de acordo com a invenção torna possível simultaneamente investigar muitos ingredientes ativos (...).
Description
[0001] A presente invenção refere-se a um dispositivo e um método para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos em testes aquosos.
[0002] Muitas espécies de nematódeos (nematelmintos) representam pragas agrícolas, já que podem gravemente prejudicar o metabolismo de planta como resultado de sua penetração nos sistemas de raiz. Diversas substâncias químicas, os denominados nematicidas, já foram desenvolvidas contra um ataque por nematódeos. Entretanto, existe uma grande demanda para identificar ingredientes ativos adicionais que podem controlar os nematódeos efetivamente.
[0003] Uma publicação por Macellino, Gut et al. (Marcellino C, Gut J, Lim KC, Singh R, McKerrow J, et al. (2012) WormAssay: A Novel Computer Application for WholePlate Motion-based Screening of Macroscopic Parasites. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1494. doi:10.1371/journal.pntd.0001494) revela um dispositivo para determinar a ação dos ingredientes ativos em vermes, compreendendo um portador para uma placa de cultura celular com múltiplos poços nos quais os vermes podem ser enchidos com os ingredientes ativos. A dita placa de cultura celular tem um lado inferior, um lado superior e também paredes laterais estendendo-se entre o lado inferior e o lado superior da placa de cultura celular. O dispositivo ainda compreende uma câmera que é usada para gravar imagens do fundo da placa de cultura celular. Um mecanismo de iluminação do dispositivo tem pelo menos uma fonte de luz que ilumina a placa de cultura celular.
[0004] Tornou-se aparente que as influências prejudiciais, tais como gotas condensadas em uma cobertura de filme da placa de cultura celular, podem influenciar muito nos resultados experimentais. Um mecanismo de iluminação deficientemente ajustado pode levar aos resultados experimentais sendo inutilizáveis.
[0005] Portanto, é um objeto da invenção fornecer um dispositivo para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos, cujo dispositivo pode minimizar as influências prejudiciais e, desse modo, permitir uma determinação confiável da ação dos ingredientes ativos.
[0006] O objeto fundamentando a invenção é atingido pela combinação dos recursos de acordo com a reivindicação 1. As realizações exemplares da invenção podem ser inferidas das reivindicações 2 a 8.
[0007] De acordo com a reivindicação 1, está disposto entre uma primeira fonte de luz e uma primeira parede lateral da placa de cultura celular no estado instalado uma primeira unidade óptica que direciona a luz da primeira fonte de luz através da primeira parede lateral na direção do lado inferior da placa de cultura celular. Em uma realização exemplar, a unidade óptica compreende uma lente que direciona e/ou focaliza a luz da primeira fonte de luz na direção do lado inferior da placa de cultura celular.
[0008] A unidade óptica pode ter uma lente de haste que substancialmente abrange todo o comprimento da primeira parede lateral da placa de cultura celular. Com relação a isso, a lente de haste pode se espalhar em paralelo à primeira parede lateral. Um eixo central da lente de haste está preferivelmente entre o plano do lado superior da placa de cultura celular e o plano do lado inferior da placa de cultura celular.
[0009] A primeira fonte de luz pode ter um guia de luz de linha que preferivelmente também abrange todo o comprimento da primeira parede lateral da placa de cultura celular. Desse modo, a luz é alimentada na placa de cultura celular através de toda a primeira parede lateral, a lente de haste fazendo com que a luz seja direcionada e/ou focalizada na direção do lado inferior da placa de cultura celular. O guia de luz de linha ou seu eixo central está preferivelmente entre o plano do lado superior e o plano do lado inferior da placa de cultura celular suportada pelo portador. Com relação a isso, os feixes da luz a partir do guia de luz de linha percorrem substancialmente paralelos ao lado superior ou lado inferior da placa de cultura celular e então atingem a lente de haste, que então direciona a luz na direção do lado inferior.
[00010] Em uma realização exemplar, a unidade óptica impede uma iluminação direta de uma cobertura de poço superior da placa de cultura celular. A dita cobertura de poço superior pode, por exemplo, ser projetada na forma de um filme, no qual pode formar água de condensação. Entretanto, uma influência prejudicial dessas gotas condensadas nos resultados de investigação pode ser reduzida ou completamente eliminada pela iluminação direcionada da placa de cultura celular.
[00011] Alternativa ou adicionalmente, a unidade óptica pode ser projetada de modo que uma penetração direta de luz em uma objetiva da câmera seja impedida. Isso também foi averiguado como necessário para a qualidade e confiabilidade dos resultados de investigação.
[00012] Em uma realização exemplar da invenção, uma lacuna entre a primeira fonte de luz e a lente de haste é de 2 até 4 cm. Preferivelmente, é fornecido um mecanismo de ajuste que torna possível definir a lacuna entre a fonte de luz e a lente de haste dentro de determinados limites de um modo livremente selecionável. Com relação a isso, é preferivelmente possível por meio do mecanismo de ajuste definir não somente a lacuna (horizontal) entre a fonte de luz e a lente de haste, porém também uma compensação de altura entre a fonte de luz e a lente de haste.
[00013] Em uma realização exemplar, o portador é composto por um material transparente. Preferivelmente, um termoplástico, tal como PMMA (vidro de acrílico), é usado.
[00014] O mecanismo de iluminação pode ter uma segunda fonte de luz e uma segunda unidade óptica, que está disposto em uma segunda parede lateral da placa de cultura celular, a dita segunda parede lateral sendo oposta à primeira parede lateral. Com relação a isso, a segunda unidade óptica pode ser idêntica à primeira unidade óptica. Além disso, a disposição da segunda fonte de luz com relação à segunda unidade óptica pode corresponder à disposição, conforme exista entre a primeira fonte de luz e a primeira unidade óptica.
[00015] Devido à multiplicidade dos ingredientes ativos, cuja ação deve ser investigada nos nematódeos, existe uma necessidade de fornecer um método com o auxílio do dispositivo acima descrito, cujo dispositivo torna possível investigar os ingredientes ativos no tempo mais curto possível. É, portanto, um objeto adicional da invenção fornecer um método para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos, cujo método torna possível investigar tantos ingredientes ativos quanto possível em um tempo curto.
[00016] Este objeto é atingido pelo método de acordo com a reivindicação 9. As realizações exemplares do método de acordo com a invenção podem ser inferidas das reivindicações dependentes da reivindicação 9.
[00017] O método, de acordo com a invenção, para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos nos testes aquosos contempla primeiramente o enchimento de pelo menos um poço de uma placa de cultura celular com os nematódeos e um ingrediente ativo. A placa de cultura celular é então colocada em um dispositivo de acordo com os desenhos acima. Neste ponto, deve ser ressaltado que, alternativamente, a placa de cultura celular pode estar disposta em um dispositivo que difere dos desenhos de acordo com as reivindicações 1 a 8.
[00018] Então, múltiplas imagens digitais seguindo outra cronologicamente são criadas da placa de cultura celular, preferivelmente do lado inferior. As ditas imagens são binarizadas, com cada pixel de uma imagem sendo designado a um primeiro grupo (p. ex., “preto”) ou um segundo grupo (p. ex., “branco”). Na binarização, um valor de limite pode ser definido/estabelecido: um pixel, cuja intensidade é inferior ao dito valor de limite, pertence ao segundo plano, considerando que um pixel, cuja intensidade é superior ao dito valor de limite, é designado aos nematódeos. Com relação a isso, o nível do valor de limite é dependente da iluminação da placa de cultura celular e, assim, dependente do mecanismo de iluminação usado.
[00019] Antes das imagens serem binarizadas, é útil usar um filtro de processamento de imagem morfológico. Isso envolve a filtragem de objetos, cujo tamanho é superior do que aquele dos organismos investigados. De modo correspondente, esta etapa do processo exige um tamanho de entrada, que especifica o tamanho dos organismos investigados.
[00020] Após a binarização, uma primeira curva de medição é determinada para uma primeira série de gravações, a dita primeira curva de medição sendo com base em pelo menos um poço e, desse modo, sobre o ingrediente ativo previamente enchido no dito poço. Com relação a isso, a primeira série de gravações tem uma imagem de base e múltiplas imagens de acompanhamento, com cada imagem de acompanhamento sendo comparada à imagem de base em um método de diferença e inúmeros pixels de diferença sendo determinados em cada caso. Além disso, pelo menos uma segunda curva de medição com base no poço é determinada para uma segunda série de gravações, e, para a segunda série, uma imagem de acompanhamento da primeira série é usada como a imagem de base e pelo menos uma imagem de acompanhamento adicional da primeira série é usada como uma imagem de acompanhamento da segunda série. Por fim, uma curva ponderada é determinada com base na primeira curva de medição e pelo menos na segunda curva de medição.
[00021] Devido a uma imagem individual ser usada para diversas curvas de medição, é possível minimizar o número de imagens a serem gravadas e, desse modo, o tempo exigido para tanto. Devido à criação de múltiplas curvas de medição, que são então incluídas em uma curva ponderada, é possível reduzir a variância estatística ou dispersão na medida em que seja possível, com base na curva ponderada, fornecer as informações reprodutíveis e primeiras informações confiáveis sobre a ação do ingrediente ativo.
[00022] Em um desenho da invenção, é usada, para a imagem de base da segunda série, uma primeira imagem de acompanhamento da primeira série, cuja primeira imagem de acompanhamento imediatamente segue a imagem de base da primeira série (ou seja, não existem imagens que são gravadas no período intermediário). Além disso, são usadas, para a segunda série, todas as imagens de acompanhamento da primeira série como imagens de acompanhamento da segunda série, exceto pela primeira imagem de acompanhamento da primeira série. A segunda série então meramente tem que ser concluída por uma imagem de acompanhamento adicional. Por exemplo, se a primeira série consistir em uma imagem de base e 9 imagens de acompanhamento, as 9 imagens de acompanhamento da primeira série são usadas para a segunda série, com a primeira imagem de acompanhamento da primeira série sendo usada como a imagem de base da segunda série e as 8 imagens de acompanhamento restantes da primeira série todas sendo usadas como imagens de acompanhamento da segunda série. De modo que a segunda série da mesma forma tenha 9 imagens de acompanhamento, a dita segunda série deve ser concluída por uma imagem adicional. Desse modo, no geral 11 imagens seguindo a outra cronologicamente são suficientes para criar a primeira curva de medição e a segunda curva de medição, cada qual contendo 10 pontos (incluindo o ponto zero) que representam o número de pixels de diferença em diferentes tempos.
[00023] Um período de gravação entre a imagem de base e a última imagem de acompanhamento de uma série pode ser estabelecido de modo que, dentro do dito período de gravação, um limite assintótico é atingido para o número de pixels de diferença para um poço no qual os nematódeos não tratados estão situados. O segundo plano para o limite assintótico será elucidado usando o exemplo de um poço no qual - para simplificação - meramente, somente um nematelminto foi colocado:
[00024] Se, por exemplo, 50 pixels brancos puderem ser designados a esse nematelminto individual, o número máximo de pixels de diferença decorrentes de uma comparação de uma imagem de base (no tempo t = 0) com uma imagem de acompanhamento subsequentemente seguinte é 100. O número 100 surge quando o nematelminto saiu completamente de sua posição original (tempo t = 0). Primeiramente, os 50 pixels brancos originais do nematelminto são agora pretos. Em segundo lugar, 50 outros pixels, que eram previamente pretos, são agora brancos devido à nova posição do nematelminto. Se o dito nematelminto então movimentar-se além, o número de pixels de diferença permanece constante, entretanto. No modelo simplista, o período de gravação corresponde, assim, ao tempo exigido por um nematelminto não tratado para mudar completamente de sua posição original (definida pela imagem de base). Preferivelmente, 50 a 100 nematódeos são geralmente colocados em um poço, e assim o valor assintótico não necessariamente deve corresponder a duas vezes os pixels classificados como “brancos”. Entretanto, torna-se aparente que o número de pixels de diferença opera contra um limite assintótico.
[00025] Um período total pode ser estabelecido entre a imagem de base da primeira série e uma última imagem de acompanhamento de uma última série, em que o período total pode aproximadamente corresponder a duas vezes aquele de um período de gravação (por exemplo, dentro de uma variação entre 1,5 e 2,5).
[00026] O intervalo de tempo entre duas imagens sucessivas pode ser constante em cada caso e variar de 1 a 5 segundos. Uma série de imagens pode compreender de 8 a 12 imagens. A curva ponderada pode ser determinada com base em 8 a 12 curvas de medição.
[00027] Se, por exemplo, um período de gravação de 30 segundos, no qual o limite assintótico é atingido, for determinado para um poço contendo nematódeos não tratados, o período total pode ser de 60 segundos. Um intervalo de três segundos entre duas imagens seguindo a outra cronologicamente, assim, rende, para um período de gravação, um número de 11 imagens por série (uma imagem de base e 10 imagens de acompanhamento, a imagem de base sendo gravada no tempo t = 0). Um período total de 60 segundos, no qual a primeira imagem é gravada no tempo t = 0 e a última imagem é gravada no tempo t = 60 segundos, assim, rende no geral 21 imagens, que então rendem 11 curvas de medição, cada uma contendo 11 pontos de medição (incluindo o ponto zero).
[00028] A invenção será mais particularmente elucidada com base nas realizações exemplares ilustradas nas figuras, nas quais:- A Figura 1 mostra esquematicamente em seção cruzada uma realização exemplar do dispositivo de acordo com a invenção;- A Figura 2 mostra esquematicamente a disposição de uma placa de cultura celular e um mecanismo de iluminação do dispositivo de acordo com a Figura 1;- A Figura 3 mostra um fluxograma de uma realização exemplar do método de acordo com a invenção; e - A Figura 4 mostra uma curva de medição para um poço contendo nematódeos não tratados e uma curva de medição para nematódeos tratados com um ingrediente ativo.
[00029] A Figura 1 mostra esquematicamente em seção cruzada um dispositivo para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos. O dispositivo 1 tem um alojamento 10, no qual uma câmera 11 com uma objetiva 12 está disposta. Além disso, o alojamento 10 é fornecido com um portador 13 para uma placa de cultura celular 30 que compreende múltiplos poços 31. A placa de cultura celular 30 tem um lado superior 32 e um lado inferior 33. Dispostas entre o lado superior 32 e o lado inferior 33 da placa retangular de cultura celular 30, existem quatro paredes laterais, das quais uma primeira parede lateral 34 e uma segunda parede lateral oposta 35 podem ser reconhecidas na ilustração na Figura 1.
[00030] Um mecanismo de iluminação 14 com uma primeira fonte de luz 15 e uma segunda fonte de luz 16 é da mesma forma dispostas no alojamento 10. Disposta entre a primeira fonte de luz 15 e a primeira parede lateral 34 existe, como parte de uma primeira unidade óptica, uma lente de haste 17, que, como a primeira fonte de luz 15, abrange todo o comprimento da primeira parede lateral 34. Uma lente de haste 18 está disposta também entre a segunda fonte de luz 16 e a segunda parede lateral 35.
[00031] O dispositivo 10 torna possível, usando a câmera 11, criar múltiplas imagens digitais da placa de cultura celular 30 que seguem a outra cronologicamente, as imagens sendo gravadas do lado inferior 33 da placa de cultura celular 30. De modo correspondente, a câmera 11 com sua objetiva 12 está disposta abaixo do portador 13 para a placa de cultura celular 30. Aqui, o dispositivo 10 tem os meios, que não são ainda ilustrados, para armazenar e processar as imagens gravadas pela câmera 11. Alternativamente, o dispositivo 10 pode ser conectado aos meios apropriados (computador).
[00032] A Figura 2 mostra, em uma escala ampliada, a disposição da placa de cultura celular 30 e o mecanismo de iluminação 14 com a primeira fonte de luz 15 e a segunda fonte de luz 16. Os poços individuais 31 da placa de cultura celular 30 são abastecidos com uma solução aquosa 36 na qual de 50 a 100 nematódeos e um ingrediente ativo a serem investigados estão situados. A Figura 2 ilustra oito poços 31 dispostos em uma fileira, e doze fileiras dispostas próximas à outra forneceriam no geral 96 poços individuais 31. Outros padrões para a placa de cultura celular 30 são possíveis, por exemplo, um padrão de 4 x 6 ou padrão de 6 x 8.
[00033] Diferentes ingredientes ativos podem ser abastecidos em diferentes poços 31. Além disso, também podem existir poços nos quais somente os nematódeos sem o ingrediente ativo estão situados na solução aquosa.
[00034] As lentes de haste 17, 18 fazem com que a luz das fontes de luz 15, 16 seja direcionada na direção do lado inferior 33. Ao mesmo tempo, as lentes de haste 17, 18 impedem a luz das fontes de luz 15, 16 de diretamente atingir o lado superior 32 da placa de cultura celular 30, sendo fornecido no lado superior 32 um filme 37 que cobre os poços individuais 31 de cima. Além disso, as lentes de haste 17, 18 ou a disposição das lentes de haste 17, 18 são projetadas de modo que nenhuma luz diretamente caia na objetiva 12 da câmera 11. 17a e 17b indicam os feixes de luz emergindo da lente de haste 17. Os feixes de saída correspondentes da lente de haste 18 são indicados por 18a, 18b.
[00035] A Figura 2 revela que as lentes de haste 17, 18, pelo menos seus eixos centrais estendendo-se perpendicularmente ao plano de desenho, estão dispostas entre o lado superior 32 e o lado inferior 33 da placa de cultura celular 30 quando a placa de cultura celular 30 está situada no portador 13 do dispositivo 10, cujo portador 13 está destinado para a dita placa de cultura celular 30.
[00036] A Figura 3 mostra um fluxograma de uma realização exemplar do método de acordo com a invenção. O fluxograma inicia com um bloco de início 100. No bloco 101, um valor assintótico AW é determinado com base nos nematódeos não tratados. Com relação a isso, o valor assintótico AW é o número de pixels de diferença que pode maximamente surgir quando uma imagem de acompanhamento é comparada com uma imagem de base. A Figura 4 mostra tal valor assintótico AW para uma curva de medição 50 para os nematódeos não tratados. Com relação a isso, os pontos de medição individuais refletem o número de pixels de diferença surgindo na comparação das imagens de acompanhamento gravadas em diferentes tempos com uma imagem de base gravada no tempo t = 0. Com relação a isso, o valor assintótico AW é ligado a um período de gravação TA, dentro do qual a curva de medição 50 pelo menos aproximadamente atinge o limite assintótico AW. No presente exemplo, o período de gravação será de 27 segundos, e o intervalo entre duas imagens adjacentes de acompanhamento ou o intervalo entre a primeira imagem de acompanhamento e a imagem de base (t = 0) será de três segundos. Portanto, um número nAW de imagens por curva de medição incluindo a imagem de base (t = 0) é igual a 10.
[00037] A Figura 4 também mostra de modo exemplar uma curva de medição (ponderada) 51 para nematódeos tratados. O que pode ser visto é que a curva de medição 51 percorre abaixo da curva de medição 50 para os nematódeos não tratados, já que os nematódeos tratados se movimentam mais lentamente ou alguns deles não mais se movimentam. Quanto menor a área sob a curva de medição 51 com relação à área abaixo da curva de medição para os nematódeos não tratados, mais forte a ação do ingrediente ativo correspondente. A curva de medição ponderada 51, entretanto, será discutida em mais detalhes posteriormente.
[00038] Após a determinação do valor assintótico AW, com base nos nematódeos não tratados e após o estabelecimento do número de imagens nAW por curva de medição ou por série (bloco 101), o que então ocorre é, de acordo com a Figura 3 no bloco 102, a gravação de determinado número de imagens Imagem_1 até Imagem_x. Neste ponto, deve ser ressaltado que a câmera 11 cria em cada momento uma imagem total da placa de cultura celular 30 com todos os poços, e as imagens Imagem_1 até Imagem_x são então cortadas ou criadas para cada poço individual da dita imagem total de um modo com base em poço. As ditas imagens são então binarizadas no bloco 103. Na binarização, os pixels individuais são designados aos nematódeos (pixel branco) ou ao segundo plano (pixel preto). A binarização no bloco 103 deve ocorrer a jusante de um estabelecimento de um valor de limite para a intensidade do pixel, cujo valor torna possível dividir os pixels em “branco” e “preto”.
[00039] Para uma primeira curva de medição m = 1 (ver bloco 104), as imagens Imagem_2 até Imagem_nAW são então usadas, de modo que o número de pixels de diferença entre inicialmente uma primeira imagem de acompanhamento Imagem_2 e a imagem de base Imagem_1 seja determinado por meio de um método de diferença (ver bloco 105 e bloco 106). Com relação a isso, o bloco 106 é passado através de múltiplas vezes como parte de um loop, e de modo que o número de pixels de diferença seja determinado para múltiplas imagens de acompanhamento (Imagem_2 - Imagem_1; Imagem_3 - Imagem_1; Imagem_4 - Imagem_1; ...; Imagem_nAW - Imagem_1). O loop 107 é saído quando o número de imagens para a primeira curva de medição atingiu o valor n = nAW + m -1 e a consulta 108 fornecida dentro do loop 107 não pode ser respondida com “Sim”. Neste caso, todos os valores estão disponíveis para criar a primeira curva de medição m = 1 (cf. bloco 109).
[00040] Após a criação da primeira curva de medição m=1, o loop 110 é então usado para criar ainda as curvas de medição (m = 2, m = 3, ., m = mmáx). Com relação a isso, uma segunda curva de medição é com base nas imagens de diferença Imagem_3 - Imagem_2; Imagem_4 - Imagem_2; .; Imagem_nAW+1 - Imagem_2. Portanto, Imagem_3, por exemplo, é usada tanto para a criação da primeira curva de medição m = 1 quanto para a segunda curva de medição m = 2.
[00041] Quando uma consulta 111 dentro do loop 110 não pode ser respondida com “Sim”, o loop 110 é encerrado. Todas as curvas de medição 1, 2, ., mmáx estão agora disponíveis, e então essa série de medição pode ser ponderada no bloco 112. Foi averiguado que esta ponderação da série de medição individual, que confia nas mesmas imagens para a maior parte, pode consideravelmente reduzir a dispersão estatística. Desse modo, é possível usar no geral as imagens m+nAW-1 para gerar m séries de medição, cada uma contendo nAW pontos de medição (incluindo o ponto zero).
[00042] No bloco 113, o integral da curva ponderada é calculado, e o dito integral pode ser então comparado à área sob a curva de medição 50 para os nematódeos não tratados (ver bloco 114).
[00043] Presumindo-se que a série de medição 51, já acima mencionada na Figura 4, corresponde à série de medição ponderada, de acordo com o bloco 112 e que a área abaixo da curva de medição 50 compreende I50 = 100 unidades de área e a área abaixo da curva de medição (ponderada) compreende I51 = 65 unidades de área, é possível fornecer as informações sobre a eficácia do ingrediente ativo em conformidade com a seguinte fórmula: <Í50(não tratado) — I51(tratado))/I50(não tratado) .100%. No caso do exemplo de número considerado como uma base aqui, um valor de 35% então surgiria.
[00044] Desse modo, é possível, por exemplo, no caso de uma placa de cultura celular com 96 poços, investigar quase 100 ingredientes ativos ao mesmo tempo. 60 segundos são por vezes suficientes para a gravação de imagens exigidas para gerar um número suficiente de série de medição com pontos de medição suficientes para atingir os resultados estatisticamente confiáveis. A invenção, portanto, permite uma investigação rápida e eficiente da eficácia dos ingredientes ativos nos nematódeos ou organismos semelhantes.Lista de sinais de referência1 Dispositivo10 Alojamento11 Câmera12 Objetiva13 Portador14 Mecanismo de iluminação15 Primeira fonte de luz16 Segunda fonte de luz17 Lente de haste (17a, 17b feixes de saída)18 Lente de haste (18a, 18b feixes de saída)30 Placa de cultura celular31 Poço32 Lado superior33 Lado inferior34 Primeira parede lateral35 Segunda parede lateral36 Solução37 Cobertura de poço100 Bloco de início101 Bloco102 Bloco BlocoBlocoBlocoBloco Loop ConsultaBloco Loop ConsultaBlocoBloco103104105106107108109110111112113114Bloco 1/3
Claims (15)
1. Dispositivo (1) para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos nos testes aquosos, caracterizado por compreender:- um portador (13) para uma placa de cultura celular (30) com múltiplos poços (31) nos quais os nematódeos podem ser abastecidos com os ingredientes ativos, a dita placa de cultura celular (30) com um lado inferior (33), um lado superior (32) revestido por uma cobertura de poço superior (37) e também paredes laterais estendendo-se entre o lado inferior (33) e o lado superior (32);- uma câmera (11) que é usada para gravar imagens preferivelmente do lado inferior (33) da placa de cultura celular (30);- um mecanismo de iluminação (14) com pelo menos uma primeira fonte de luz (15) que ilumina a placa de cultura celular (30);estando disposto entre a primeira fonte de luz (15) e uma primeira parede lateral (34) da placa de cultura celular (30) no estado instalado, uma primeira unidade óptica que direciona a luz da primeira fonte de luz (15) através da primeira parede lateral (34) na direção do lado inferior (33) da placa de cultura celular (30), em que a unidade óptica tem uma lente de haste (17) que abrange substancialmente todo o comprimento da primeira parede lateral (34 ) da placa de cultura celular (30) e é configurada para evitar uma iluminação direta da cobertura de poço superior (37) da placa de cultura celular (30).
2. Dispositivo (1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela unidade óptica ter uma lente de haste (17) que abrange substancialmente todo o comprimento da primeira parede lateral (34) da placa de cultura celular (30).
3. Dispositivo (1), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela primeira fonte de luz (15) ter um guia de luz de linha.
4. Dispositivo (1), de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela unidade óptica impedir uma iluminação direta de cobertura de poço superior (37) da placa de cultura celular (30).
5. Dispositivo (1), de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela unidade óptica impedir uma penetração direta de luz em uma objetiva (12) da câmera (11).
6. Dispositivo (1), de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo portador de placa (13) ser composto por material transparente.
7. Dispositivo (1), de acordo com quaisquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado por uma lacuna entre a primeira fonte de luz (15) e a lente de haste (17) estar entre 2 e 4 cm.
8. Dispositivo (1), de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo mecanismo de iluminação (13) ter uma segunda fonte de luz (16) e uma segunda unidade óptica, que está disposta em uma segunda parede lateral (35) da placa de cultura celular (30), a dita segunda parede lateral (35) estando oposta à primeira parede lateral.
9. Método para determinar a ação dos ingredientes ativos nos nematódeos e outros organismos nos testes aquosos, caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) encher pelo menos um poço (31) de uma placa de cultura celular (30) com os nematódeos e um ingrediente ativo e revestir com a cobertura de poço superior (37);b) dispor a placa de cultura celular (30) no dispositivo (1), de acordo com as Reivindicações 1 a 8;c) criar múltiplas imagens da placa de cultura celular (30) que seguem a outra cronologicamente;d) binarizar as imagens criadas dependendo de uma iluminação da placa de cultura celular (30);e) determinar uma primeira curva de medição com base no poço para uma primeira série de imagens, a dita primeira série com uma imagem de base e múltiplas imagens de acompanhamento, com cada imagem de acompanhamento sendo comparada à imagem de base em um método de diferença e um número de pixels de diferença sendo determinado; f) determinar pelo menos uma segunda curva de medição com base no poço para uma segunda série de imagens, e, para a segunda série, usando uma imagem de acompanhamento da primeira série como imagem de base e pelo menos uma imagem de acompanhamento adicional da primeira série como uma imagem de acompanhamento da segunda série;g) determinar uma curva ponderada com base na primeira curva de medição e pelo menos na segunda curva de medição.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser usada, para a imagem de base da segunda série, uma primeira imagem de acompanhamento da primeira série, cuja primeira imagem de acompanhamento imediatamente segue a imagem de base da primeira série, por serem usadas, para a segunda série, todas as imagens de acompanhamento da primeira série como imagens de acompanhamento da segunda série, exceto pela primeira imagem de acompanhamento da primeira série, e pela segunda série ser concluída por uma imagem de acompanhamento adicional.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por ser estabelecido um período de gravação (TA) entre a imagem de base e a última imagem de acompanhamento de uma série de modo que, dentro do dito período de gravação (TA), um limite assintótico AW seja atingido para o número de pixels de diferença para um poço no qual os nematódeos não tratados estão situados.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser estabelecido um período total entre a imagem de base da primeira série e uma última imagem de acompanhamento de uma última série, em que o período total corresponde aproximadamente a duas vezes aquele de um período de gravação (TA).
13. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo intervalo de tempo entre duas imagens sucessivas ser constante e variar de 1 a 5 segundos.
14. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 9 a 13, caracterizado por uma série de imagens compreender de 8 a 12 imagens.
15. Método, de acordo com quaisquer das reivindicações 10 a 14, caracterizado pela curva ponderada ser determinada com base em 8 a 12 curvas de medição.
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| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/01/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |