BR112017010766B1

BR112017010766B1 - Conservante de feno e métodos conservação de feno

Info

Publication number: BR112017010766B1
Application number: BR112017010766-0A
Authority: BR
Inventors: Julien SINDOU; Henri Durand
Original assignee: Danstar Ferment Ag
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2022-04-19
Also published as: EP3224345A1; EA201791141A1; PL3224345T3; AU2015352045B2; BR112017010766A2; NZ731618A; CO2017005171A2; ES2864217T3; HUE053811T2; JP7233839B2; PT3224345T; CL2017001228A1; EP3224345B1; CN106998750B; JP2017537980A; CA2967206C; US11903397B2; WO2016083996A1; MX2017006721A; JP2021035952A

Abstract

É proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo adicionar ao feno um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase, sozinha ou em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia ou uma bactéria do gênero Pediococcus. É também proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de levedura do gênero Pichia.

Description

CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente descrição refere-se a um conservante de feno. Mais especificamente, para o conservante de feno para conservar feno em feno de alta umidade armazenado e método de uso de conservante de feno para a conservação de feno em feno de alta umidade armazenado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Encolher o feno para um nível de umidade ótimo no campo antes do enfardamento seria uma situação ótima de modo a reduzir a perda de matéria seca (MS), o crescimento de fungos, e a respiração de células de plantas durante o enfardamento e o armazenamento do feno. No entanto, este processo resulta em perdas nutricionais consideráveis devido à respiração continuada de plantas, despedaçamento de folhas a partir de dano mecânico e lixiviação devido à chuva. O reconhecimento deste fato, e também devido a condições meteorológicas imprevisíveis, levou muitos produtores de feno a enfardar feno a um teor de umidade superior ao ótimo (20-30%) para minimizar o risco de danos causados pela chuva e perdas mecânicas de folhas. Esta prática, no entanto, resulta em perdas devido às atividades de levedura e bolores e, por vezes, as bactérias e o aquecimento e a pouca qualidade nutritiva resultantes do feno no momento da alimentação.

[0003] Uma abordagem simples foi a pulverização do feno úmido no momento do armazenamento com um ácido orgânico, tal como, por exemplo, ácido propiônico. Embora os ácidos orgânicos sejam geralmente eficazes na prevenção da proliferação de fungos no feno úmido, as taxas mais elevadas de aplicação, o aumento do campo, os custos de manipulação e as preocupações ambientais tornam a maioria dos produtores de feno relutantes em usá-los.

[0004] Embora a pesquisa mostre que os inoculantes baseados em bactérias poderiam potencialmente substituir os ácidos orgânicos na conservação do feno enfardado acima do teor de umidade ótimo (Baah et al., Asian-Aust, J. Anim. Sci. 18: 649-660, 2005.), resulta de outros estudos sobre a silagem e a ensilagem têm sido inconsistentes (Zahiroddini et al., Asian-Aust, J. Anim. Sci. 19(10):1429-1436, 2006, Muck, Trans. ASAE 47: 1011-1016, 2004). Há ampla evidência para indicar que as aparentes inconsistências nas respostas a inoculantes são devidas a interações entre espécies microbianas em inoculantes individuais e as populações epífitas microbianas (bactérias, leveduras e bolores) no feno antes da inoculação.

[0005] Seria altamente desejável ser proporcionado com um conservante de feno melhorado, particularmente para prevenir e reduzir o dano de calor do feno em feno de alta umidade armazenado e também para conservar o mesmo.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0006] A presente descrição proporciona um método para conservar a qualidade do feno em feno de alta umidade armazenado. O método se refere ao uso de um conservante de feno capaz de prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade armazenado. O conservante de feno usado impede e/ou reduz o calor em feno de alta umidade igual ou melhor do que os ácidos orgânicos.

[0007] Em um aspecto, é proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase, sozinha ou em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero Pediococcus. Em outro aspecto, é proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo adicionar ao feno um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase.

[0008] Em um outro aspecto, é proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

[0009] Ainda em um outro aspecto, é proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo adicionar ao feno um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma bactéria do gênero Pediococcus.

[0010] Em outro aspecto, é proporcionado um método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

[0011] Em um outro aspecto, é proporcionado um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase.

[0012] Ainda em um outro aspecto, é proporcionado um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero Pediococcus.

[0013] Em um aspecto adicional, é proporcionado um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

[0014] Em um aspecto, é proporcionado um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma bactéria do gênero Pediococcus.

[0015] Em um outro aspecto, todos os aspectos anteriormente mencionados podem compreender ainda pelo menos uma enzima tendo uma atividade de pectina liase, uma atividade de glucanase ou uma mistura das mesmas.

[0016] Em outro aspecto, é proporcionado um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

[0017] Em um aspecto adicional, é proporcionado um feno de alta umidade compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de levedura de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase, sozinha ou em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura de gênero Pichia ou de bactérias do gênero Pediococcus. O feno de alta umidade pode compreender ainda pelo menos uma enzima tendo uma atividade de pectina liase, uma atividade de glucanase ou uma mistura das mesmas.

[0018] Em outro aspecto, é proporcionado um feno de alta umidade compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Tendo assim descrito de modo geral a natureza da invenção, será agora feita referência aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração, uma forma de realização preferida da mesma, e em que:

[0020] A Figura 1 ilustra a temperatura média semanal durante o armazenamento de fardos de feno de alfafa tratados com uma levedura do gênero Pichia (P. anomala) ou pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase (Enzima); em comparação com fardos de feno de alfafa tratados com ácido propiônico (ácido prop.) e não tratados;

[0021] A Figura 2 ilustra a temperatura média diária durante o armazenamento de fardos de feno de alfafa tratados com pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia (PichChit) ou bactéria do gênero Pediococcus (Pedio pe), em comparação com fardos de feno de alfafa tratados com ácido propiônico (PROP) e não tratados;

[0022] A Figura 3 ilustra um gráfico do gasto de tempo em minutos acima de 40°C durante o armazenamento (2012) de fardos de feno de alfafa tratados com pelo menos uma enzima tendo atividade de quitinase em combinação com uma levedura do gênero Pichia (Pichia +Enz) ou uma bactéria do gênero Pediociccus (Pedio +Enz), em comparação com fardos de feno de alfafa tratados com ácido propiônico (ácido prop.) e não tratados (controle); e

[0023] A Figura 4 ilustra um gráfico do gasto de tempo em minutos acima de 40°C durante o armazenamento (2013) de fardos de feno de alfafa tratados com pelo menos uma enzima tendo atividade de quitinase em combinação com uma levedura do gênero Pichia (Pichia +Enz) ou uma bactéria do gênero Pediociccus (Pedio +Enz), em comparação com fardos de feno de alfafa tratados com uma levedura do gênero Pichia isolada (Pichia), uma bactéria do gênero Pediociccusa sozinha (Pedio), ácido propiônico (ácido prop.) e não tratados (controle).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0024] Um dos problemas com o feno de alta umidade é a deterioração e o apodrecimento causada(o) pelo calor gerado espontaneamente. Estes fardos aquecidos são usualmente mais fracos na cor, no valor nutritivo e têm o bolor visível maior. Uma abordagem tem sido a de pulverizar o feno úmido no momento da armazenagem com um ácido orgânico, tal como, por exemplo, ácido propiônico. Embora os ácidos orgânicos sejam geralmente eficazes na prevenção da proliferação de fungos no feno úmido, as taxas mais altas de aplicação, de aumento do campo, de custos de manipulação e de preocupações ambientais tornam a maioria dos produtores de feno relutantes em usá-los.

[0025] Embora a pesquisa mostre que os inoculantes baseados em bactérias poderiam potencialmente substituir os ácidos orgânicos na conservação do feno enfardado acima do teor ótimo de umidade, os resultados de outros estudos sobre a silagem e a ensilagem têm sido inconsistentes. Há ampla evidência para indicar que as aparentes inconsistências nas respostas aos inoculantes são devidas a interações entre espécies microbianas em inoculantes individuais e as populações epífitas microbianas (bactérias, leveduras e bolores) no feno antes da inoculação.

[0026] No seu aspecto mais amplo, a presente descrição proporciona um método para conservar a qualidade do feno e prevenir ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade armazenado, o método compreendendo o tratamento de feno fresco sob condições aeróbicas com um conservante de feno.

[0027] O conservante de feno compreende uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase. Surpreendentemente, verificou-se que o conservante de feno é ainda melhorado do ponto de vista do seu efeito conservante e da sua capacidade de prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno com alta umidade se a pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase for combinada com uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero Pediococcus. Quando a pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase é combinada com uma levedura do gênero Pichia ou uma bactéria do gênero Pediococcus, a redução de temperatura de feno com alta umidade é significativamente intensificada pela combinação, em comparação com o uso de cada componente da combinação sozinho como mostrado na Figura 4.

[0028] Alternativamente, o conservante de feno pode compreender uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia sozinha.

[0029] O termo “quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno”, quando aqui usado, será entendido como referindo-se a uma quantidade que é pelo menos suficiente para conservar a qualidade do feno. Assim, a quantidade é pelo menos suficiente para prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo.

[0030] O termo “feno”, quando usado aqui, será entendido como referindo-se a toda a forma de feno como o termo é comumente usado na agricultura. O feno é mais comumente composto de alfafa, gramínea, ou misturas de alfafa e gramínea colhidas a um nível de umidade alvo menor que 20%.

[0031] O método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo pode incluir a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase. Como mencionado anteriormente, a pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase pode ser combinada com uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero Pediococcus.

[0032] Em uma forma de realização, o método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo pode incluir a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia.

[0033] Em uma outra forma de realização, o método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir danos devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo pode incluir a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma bactéria do gênero Pediococcus.

[0034] Alternativamente, o método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo pode incluir a adição ao feno de um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia sozinha.

[0035] A levedura do gênero Pichia inclui, mas não se limita a, uma Pichia anomala sp. Em uma forma de realização, a levedura do gênero Pichia pode ser uma Pichia anomala sp tendo todas as características de identificação de Pichia anomala tendo uma cepa de número de acesso DBVPG 3003. Entende-se que qualquer isolado tendo as características de identificação de Pichia anomala tendo a cepa de número de acesso DBVPG 3003, incluindo subculturas e variantes das mesmas que têm as características e a atividade de identificação como aqui descritas são incluídas. A Pichia anomala tendo a cepa de número de acesso DBVPG 3003 foi depositada na Industrial Yeast Collection DBVPG do Dipartimento di Biologia Vegetale e Biotecnologie Agroambientali e Zootecniche, Sezione di Microbiologia Agroalimentare ed Ambientale, http//www.agr.unipg.it/dbvpg, Universidade de Perugia, Itália.

[0036] As bactérias do gênero Pediococcus incluem, mas não se limitam a, uma Pediococcus pentosaceus sp. Em uma forma de realização, as bactérias do gênero Pediococcus podem ser de uma Pediococcus pentosaceus sp tendo todas as características de identificação da cepa BTC328 de Pediococcus pentosaceus (com o número de acesso NCIMB 12674). Em uma outra forma de realização, as bactérias do gênero Pediococcus podem ser de uma Pediococcus pentosaceus sp tendo todas as características de identificação da cepa BTC401 de Pediococcus pentosaceus (com o número de acesso NCIMB 12675). Entende-se que qualquer isolado tendo as características de identificação da cepa BTC328 ou BTC401 de Pediococcus pentosaceus, incluindo subculturas e variantes das mesmas que têm as características e a atividade de identificação como aqui descritas, é incluído. As cepas de Pediococcus pentosaceus tendo o número de acesso NCIMB 12674 e 12675 foram depositadas com a National Coolection of Industrial, Food and Marine Bacteria Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA.

[0037] Em uma forma de realização do método, a faixa de tratamento para o feno é tipicamente 105 a 1015 organismos viáveis da levedura ou das bactérias por tonelada de feno, preferencialmente 107 a 1013 da levedura ou das bactérias por tonelada de feno, e mais preferencialmente 109 a 1012 organismos viáveis da levedura ou das bactérias por tonelada de feno. O termo “tonelada”, quando usado aqui, será entendido como referindo-se a uma tonelada métrica (1000 kg).

[0038] A pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase pode ter uma atividade de quitinase em uma faixa de cerca de 6 a cerca de 300 unidades de enzima (U) por tonelada de feno a ser tratado. Em uma forma de realização, a atividade de quitinase pode estar na faixa de cerca de 6 a cerca de 100 U por tonelada de feno a ser tratado. Uma U é definida como a quantidade da enzima que produz uma certa quantidade de atividade de quitinase. Cada unidade de enzima (U) pode liberar cerca de 1,0 mg de N-acetil-D-glucosamina a partir de quitina (g) por hora a pH 6,0 e em uma temperatura de 25°C, em um ensaio de 2 horas.

[0039] O conservante de feno de acordo com a presente descrição pode compreender ainda pelo menos uma enzima tendo uma atividade de Pectina liase, uma atividade de Glucanase ou uma mistura das mesmas.

[0040] O conservante de feno de acordo com a presente descrição pode estar em qualquer líquido de forma sólida. O conservante de feno de acordo com a presente descrição pode compreender um carreador adequado ou pode ser usado como é. Na forma sólida, o conservante de feno pode compreender carreadores sólidos ou extensores físicos. O carreador adequado pode estar na forma líquida aquosa ou não aquosa ou na forma sólida. Exemplos não limitativos de carreador de forma líquida aquosa ou não aquosa incluem água, óleos e parafina. Exemplos não limitativos de carreador forma sólida incluem carreador orgânico ou inorgânico, tal como, por exemplo, malto-dextrina, amidos, carbonato de cálcio, celulose, soro de leite, espigas de milho moído e dióxido de silicone. A forma sólida pode ser aplicada diretamente ao feno na forma de uma poeira de pó leve, ou se é desembolsada em um carreador líquido, pode ser pulverizada com sucesso no feno. Entende-se que qualquer outro carreador adequado para a finalidade da presente descrição pode ser usado. Também entende-se que o conservante de feno de acordo com a presente descrição pode ser aplicado ao feno usando técnicas padrão comuns aos habilitados na técnica. O conservante do feno também pode ser aplicado antes, durante e/ou após o enfardamento. A presente invenção será mais facilmente compreendida por referência aos seguintes exemplos que são dados para ilustrar a invenção em vez de limitar o seu escopo.

EXEMPLOS Exemplo 1:

[0041] Feno, tratamentos e condições de enfardamento

[0042] O feno era um terceiro corte que consiste em 90% de alfalfa e 10% de bromo-mole. O feno foi cortado com um discbine New-Holland™ em 17 de setembro de 2011 e deixou para secar de modo incondicionado e imperturbável. O nível de umidade foi avaliado usando um testador de umidade de feno em fileira Farmex™ (1205 Danner Drive, Aurora, OH) cinco dias após o corte e verificou-se estar na faixa de 20 a 35%. Nesta altura, os conservantes de feno foram preparados por pré- pesagem de inoculantes e misturando cada um deles em jarros separados contendo 6,5 L de água destilada pré-medida e agitados por 1 minuto. Um tanque do pulverizador e uma lança do pulverizador com um único bocal foram montados em uma enfardadeira quadrada grande 4790 de Hesston. A lança foi colocada de modo que o padrão de pulverização cobria 90% da fileira com mínima derivação.

[0043] Dois fardos de ensaio foram feitos para determinar o tempo para completar a aplicação do aditivo em um fardo, o peso do fardo, bem como uma medida mais precisa do teor de umidade do material enfardado. Determinou-se a umidade do fardo usando uma sonda de feno. Verificou-se que o tempo médio para fazer um fardo (0,91 m x 1,22 m x 2,44 m) era de 2 minutos 30 segundos e o peso médio do fardo era de 820 kg. A taxa de aplicação de P. anomala foi de 1011 CFU em 1 L por tonelada de feno. A enzima tendo uma atividade de quitinase foi aplicada a uma taxa de 1,5 g (em suspensão em 1 L de água) por tonelada de feno, correspondendo a cerca de 6 U por tonelada de feno. O produto do ácido propiônico consistiu em 68% (vol/vol) de ácido propiônico e foi aplicado a uma taxa de 2,72/ton e considerado como controle positivo. O controle negativo foi água, e foi aplicado a uma taxa de 1 L por tonelada de feno. A P. anomala e a enzima tendo uma atividade de quitinase foram obtidas da Lallemand Specialties Inc. (Milwaukee, WI, EUA) enquanto o ácido propiônico era da Wausau Chemical Corporation (Wausau, WI, EUA). Cinco fardos replicados foram feitos para cada tratamento. Amostras de P. anomala foram retiradas após cada aplicação para verificar a viabilidade e os números do organismo. Isto foi para permitir a confirmação da taxa de aplicação para o organismo. Cada fardo foi rotulado imediatamente após a sua saída do enfardador usando tinta spray e mais tarde com etiquetas anexadas a amarrações com fecho. Todos os fardos foram pesados um dia após o enfardamento e amostras no núcleo foram tiradas. Os fardos foram deixados no campo por 2 semanas após o enfardamento, para reduzir o risco da combustão, antes de serem transportados e armazenados em uma única camada em um armazém de feno aberto de um lado. Foram tiradas amostras de núcleo dos fardos novamente no dia 90 de 4 lados (excluindo as partes superior e inferior dos fardos) e re-empilhados no topo ou nos outros (pilhas de dois fardos). As amostras do núcleo foram novamente coletadas no dia 180. Determinação microbiológica química

[0044] Foram realizadas análises químicas e microbiológicas em amostras de feno coletadas de seis seções diferentes do campo e em amostras de núcleo compósitas obtidas de quatro locais diferentes em cada fardo no dia 1, 90 e 180 de armazenamento. Os procedimentos descritos por McAllister et al. (1995. Intake, digestability and aerobic stability of barley silage inoculate with mistures of Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecium. Can. J. Anim. Sci. 75: 425-432.) foram usados para enumerar bactérias totais, bactérias produtoras de ácido lático (LAB), leveduras e bolores. A matéria seca (DM), a matéria orgânica (OM) e a proteína bruta (CP) foram determinadas de acordo com os procedimentos da AOAC (1990), e a fibra em detergente neutro (NFD), fibra em detergente ácido (ADF) e nitrogênio insolúvel em detergente ácido (ADIN) como descrito por Van Soest et al., (1991. Methods for dietary fiber, neutral detergente and non-starch polyssaccharides en relation to animal nutrition. J. Dairy Sci. 74: 3583-3597). Tabela 1. Composição química (% DM), pH e composição microbiológica (cfu log10) do feno 90 dias após o tratamento com vários conservantes de feno no enfardamento1.

1PA = Pichia anomala; CE = Enzimas tendo uma atividade de quitinase; BPA = ácido propiônico; CON = Controle. 2TB = bactérias não-fastidiosas que crescem em ágar nutriente; LAB = bactéria crescendo em MRS presumido ser Lactobacilli; OM = Matéria orgânica; NH3 = Nitrogênio de amônia; TN = Nitrogênio total; LA = Ácido lático; ADF = Fibra em detergente ácido; ADIN = Nitrogênio insolúvel em detergente ácido

[0045] A Tabela 1 mostra o efeito dos tratamentos conservantes do feno sobre os perfis químicos e microbiológicos de amostras do feno coletadas no dia 0 (dia de enfardamento) e 90 dias após o enfardamento. Além do ácido lático e do nitrogênio insolúvel em detergente ácido (ADIN), os vários tratamentos não afetaram qualquer dos fatores avaliados, isto é, o pH, o nitrogênio total, o nitrogênio de amônia e o ADF. A concentração de ácido lático foi menor nos tratamentos com P. anomala em comparação com outros tratamentos. Em comparação com outros tratamentos, o nível de ADIN (% DM) foi maior no tratamento com P. anomala. As populações de bactérias totais (bactérias não-fastidiosas crescendo em ágar nutritivo), levedura e mofo em amostras de feno do dia 90 não foram afetadas pelo tratamento. Em comparação com outros tratamentos, as populações de lactobacilos foram maiores em P. anomala e os fardos de controle tendo aumentado de log10 3,80 CFU g-1 no dia de enfardamento para log10 5,42 e log10 6,29 CFU g-1, respectivamente no dia 90. Tabela 2. Composição química (% DM), pH e composição microbiológica (cfu log10) do feno 180 dias após o tratamento com vários inoculantes no enfardamento.1

1PA = Pichia anomala; CE = Enzimas tendo uma atividade de quitinase; BPA = ácido propiônico; CON = Controle. 2TB = bactérias não-fastidiosas que crescem em ágar nutriente; LAB = bactéria crescendo em MRS presumida ser Lactobacilli; OM = Matéria orgânica; NH3 = Nitrogênio de amônia; TN = Nitrogênio total; LA = Ácido lático; ADF = Fibra em detergente ácido; ADIN = Nitrogênio insolúvel em detergente ácido

[0046] Além do pH e da população de leveduras, não houve diferenças entre os tratamentos em composição química e microbiológica nas amostras do dia 180 (ver Tabela 2). Em comparação com todos os outros tratamentos, o pH foi mais baixo no P. anomala (6,00). A população de levedura foi mais alta nas enzimas com um tratamento com atividade de quitinase. Tabela 3. Concentrações de ácidos graxos voláteis (VFA) em amostras de núcleos de feno após 90 e 180 dias pós-tratamento com vários aditivos em enfardamento1

1PA = Pichia anomala; CE = Enzima com uma atividade de quitinase; BPA = Ácido propiônico; CON = Controle.

[0047] Com referência agora à Tabela 3, as concentrações totais de VFA (ácido graxo volátil) e acetato nas amostras do dia 90 e do dia 180 não foram afetadas pelo tratamento. O VFA predominante produzido após 180 dias de armazenamento foi o acetato e este representou 94% a 98% do VFA total produzido nos fardos. Houve uma tendência para maior concentração de acetato e VFA total em fardos tratados com P. anomala e enzimas com uma atividade de quitinase após 180 dias de armazenamento. As concentrações de acetato e VFA total em P. anomala e enzimas com uma atividade de quitinase tratada no dia 180, os fardos foram pelo menos 14% maior do que as concentrações nos outros tratamentos indicando que ambas deste tratamento induziram um maior grau de fermentação microbiana anaeróbica nos fardos em comparação com os outros tratamentos. Em comparação com o tratamento de controle, as concentrações totais de VFA e acetato foram aproximadamente 32% mais altas em P. Anomala - enzimas com fardos de 180 dias tratados com atividade de quitinase. Como esperado, a concentração de propionato nos fardos tratados com ácido propiônico foi maior que as concentrações nos outros tratamentos nas amostras no d 90 e no d 180, respectivamente (Tabela 3). Tabela 4. Avaliação da qualidade do feno tratado com vários aditivos e armazenado por 180 dias.

PA = Pichia anomala; CE = enzimas com UMA atividade de quitinase; BPA = Ácido propiônico; CON = Controle. Cor/Odor - com base na Ficha Técnica # 644 da Maryland Cooperative Extension ‘Avaliação da qualidade do feno’ (http://www.extension.umd.edu/publications/pdfs/fs644.pdf). Cor

[0048] Feno com cor verde brilhante, pontuação alta (15 a 20).

[0049] Fenos amarelo dourado a amarelo, pontuação 5 a 15 pontos

[0050] Fenos castanho escuro a preto, pontuação 0 a 5 pontos.

Odor

[0051] Cheiro de feno moído novo, pontuação alta (15 a 20 pontos).

[0052] Fenos com odor de mofo ou outros maus odores, pontuação 5 a 15 pontos.

[0053] Fenos com bolor ou usualmente pulverulentos, pontuação muito baixa (0 a 5 pontos)

Qualidade

[0054] Qualidade é baseada na avaliação total por examinador que incluiu; muito ruim, ruim, média, boa, muito boa, e excelente

[0055] Todos os fardos foram abertos no dia 180 e a sua qualidade foi avaliada com base na Ficha Técnica # 644 da Maryland Cooperative Extension. Com base na avaliação visual e sensorial, os tratamentos de controle e com ácido propiônico produziram feno de qualidade ruim enquanto o restante dos tratamentos produziu feno de qualidade média a boa (Tabela 4).

Estabilidade da temperatura

[0056] A estabilidade de temperatura dos fardos foi monitorada medindo continuamente a temperatura interior de cada fardo com três iButtons de Dallas Thermochron (Embedded Data Systems, Lawrenceburg, KY) que foram inseridos nos furos do núcleo na manhã seguinte após o enfardamento. Os iButtons foram configurados para registrar as temperaturas a cada hora durante os primeiros 60 dias do período de armazenamento. Como as leituras de temperatura não mostraram mais aquecimento, as sondas não foram colocadas de volta nos fardos após 60 dias. Os fardos foram abertos e pontuados visualmente quanto à extensão da deterioração e mofo no final do período de armazenamento (180 d) com base na Ficha Técnica # 644 da Maryland Cooperative Extension ‘Avaliação da Qualidade do Feno’ (http://www.extension.umd.edu/publications/pdfs/fs644.pdf).

[0057] Como mostrado na Figura 1, a temperatura ambiente semanal média (área de armazenamento de fardos) reduziu de um máximo de aproximadamente 16°C durante a primeira semana de armazenamento a temperaturas abaixo de zero após a semana 7. No entanto, as temperaturas em todos os fardos permaneceram acima de 20°C durante as três primeiras semanas do período de armazenamento. A temperatura semanal mais elevada (cerca de 34°C) foi registada durante a semana 2 em fardos de controle. A temperatura média nos fardos de controle durante as primeiras três semanas foi de aproximadamente 30°C. As temperaturas em fardos tratados com enzimas com uma atividade de quitinase foram consistentemente mais baixas do que aquelas em fardos de controle da semana 1 à semana 7 (Figura 1). Observou-se uma tendência semelhante (exceto durante a semana 2) quando o tratamento foi comparado com o tratamento com ácido propiônico (Figura 2). Embora todos os tratamentos tiveram um efeito positivo na redução da temperatura em fardos durante o período de armazenamento, o tratamento mais eficaz; em comparação com os tratamentos de controle e com ácido propiônico, foram as enzimas com uma atividade de quitinase. Em comparação com os fardos tratados com o ácido propiônico e de controle, as temperaturas médias nas enzimas com fardos tratados com atividade de quitinase foram 6 - 8°C e 4 - 5°C menores que as temperaturas nos fardos de controle e tratados com ácido propiônico, respectivamente, durante o mesmo período.

Experimento animal

[0058] Taxa in situ e a extensão do desaparecimento de DM e NDF das amostras de feno do dia 180 foram determinadas em três gados dotados de cânulas de ruminação e alimentadas com uma dieta base de engorda padrão consistindo em 50% de feno de fléolo e mais 50% de silagem de cevada (base de DM). Subamostras das amostras de núcleo de 180 dias obtidas de fardos tratados com o mesmo conservante foram compostas e trituradas para passar através de uma peneira de 4 mm. Aproximadamente 4 g de cada amostra compósita foram pesados em sacos de Dacron e incubaram-se em triplicado em cada gado por 0, 2, 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h. Sacos foram feitos de malha de poliéster de monofilamento (tamanho de poro de 53 μm, 5 cm x 20 cm, Ankom, Fairport, Nova Iorque). Os gados receberam duas semanas para se adaptarem às suas dietas antes de iniciar as incubações. Imediatamente após a incubação, os sacos foram rinsados sob água fria de torneira até que todo o conteúdo do rume no exterior dos sacos tenha sido removido. Os sacos foram lavados em uma máquina de lavar doméstica em água fria por três minutos usando o ciclo de lavagem delicado sem detergente e ciclo de centrifugação. O procedimento de lavagem foi repetido uma vez. Conjuntos duplicados de sacos não incubados contendo amostras de cada tratamento foram lavados com os sacos acima e usados para estimar 0 h de desaparecimento para cada tratamento. Todos os sacos foram então secos em um forno de ar forçado a 55°C por 48 h. Os resíduos de sacos triplicados do mesmo tratamento incubados no mesmo gado foram reunidos e triturados para passar através de uma peneira de 1 mm antes de serem analisados quanto ao NDF de acordo com o método acima referido. A percentagem de desaparecimento de DM e NFD foi calculada a partir da proporção restante nos sacos após cada tempo de incubação. Os dados de desaparecimento de DM e NDF foram ajustados a uma versão modificada do modelo exponencial de Orskov e McDonald (1979) com uma fase de retardo: p = a + b (1-e-c(t-retardo)) para t > retardo

[0059] em que; p é o desaparecimento de DM ou NDF após t horas, a é a fração que desaparece rapidamente (%), b é a fração que desaparece lentamente (%), e c é a taxa fraccionada de desaparecimento (h-1) da fração b. Os parâmetros foram estimados através de um procedimento não linear iterativo (método de Marquardt) com o pacote de software SAS (1990). O desaparecimento eficaz (EFFD, %) em 48 h de incubação foi estimado com base em uma taxa de fluxo de saída fracional de 6%. Tabela 5. Efeito do conservante de feno1 no desaparecimento in situ de DM (%)2 de feno de alfafa - bromo-mole incubado no rume de gados de Jersey

1PA = Pichia anomala; CE = enzimas com uma atividade de quitinase BPA = Ácido propiônico; CON = Controle. 2Meios na mesma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). 3Parâmetros calculados a partir da equação ajustada: p = a + b [1-e-c(t-retardo)] para t > retardo, em que p é a proporção (%) de NDF desaparecendo dos sacos de náilon após t horas de incubação; a é a fração de desaparecimento rápido (%), b é a fração de desaparecimento lento (%), c é a taxa fracionária de desaparecimento (h-1) da fração b Desaparecimento de matéria seca in sacco

[0060] Os efeitos dos conservantes sobre o desaparecimento de DM de 12, 24 e 48 h, incluindo a cinética de desaparecimento, são ilustrados na Tabela 5. Não houve tempo de retardo no desaparecimento da DM. As amostras de feno tratadas com o aditivo microbiano (P. anomala) apresentaram maior desaparecimento de MS em todos os pontos de tempo de incubação (12, 24 e 48 h) em comparação dos tratamentos de controle e com ácido propiônico; exceto às 48 h quando todos os aditivos (incluindo enzimas com uma atividade de quitinase e de ácido propiônico) eram mais elevados do que o controle. De forma semelhante, a taxa e o desaparecimento de DM eficaz foram mais elevados em amostras de feno tratadas com os aditivos microbianos em comparação com os tratamentos de controle e com ácido propiônico. Em comparação com todos os outros tratamentos, as amostras de feno a partir de fardos tratados com P. anomala apresentaram a taxa mais rápida de desaparecimento de DM (0,114 h-1. A menor taxa de 0,083 h-1 e 0,087 h-1 foram observadas no tratamento com ácido propiônico e de controle. Todos os aditivos aumentaram a fração de MS potencialmente digerível, com exceção de enzimas tendo uma atividade de quitinase, que apresentaram valor semelhante ao do controle, apesar do desaparecimento eficaz de MS na amostra tratada com P. anomala ser maior do que nos tratamentos de controle e com ácido propiônico. Tabela 6. Efeito de conservantes de feno1 no desaparecimento in situ de NFD (%)2

1PA = Pichia anomala; CE = Enzimas com uma atividade de quitinase; BPA = Ácido propiônico; CON = Controle. 2Médias na mesma linha com diferentes sobrescritos diferem (P < 0,05). 3Parâmetros calculados a partir da equação ajustada: p = a + b [1-e-c(t-retardo)] para t > retardo, em que p é a proporção (%) de NDF desaparecendo dos sacos de náilon após t horas de incubação; a é a fração de desaparecimento rápido (%), b é a fração de desaparecimento lento (%), c é a taxa fracionária de desaparecimento (h-1) da fração b.

[0061] Embora não houvesse diferenças entre os tratamentos em termos de taxa de desaparecimento de NFD, a fração de desaparecimento rápido e a fração de desaparecimento lento, o desaparecimento eficaz foi maior no feno tratado com P. anomala em comparação com todos os outros tratamentos (Tabela 6). O tempo de retardo mais longo no desaparecimento de NFD foi observado em feno tratado com enzimas tendo uma atividade de quitinase (3,67 h), enquanto o menor tempo de retardo de 1,89 h foi observado no tratamento com P. anomala. O último tempo de retardo, contudo, não foi diferente do dos outros tratamentos. O desaparecimento total de NFD em 12, 24 e 48 h variou de 37,28% (menor) em enzimas com feno tratado com atividade de quitinase a 41,06% (maior) no tratamento com P. anomala com outros tratamentos com valores intermediários. Uma tendência semelhante foi observada no desaparecimento de 24 h. O desaparecimento de NFD após 48 h foi mais baixo em enzimas com tratamentos com atividade de quitinase em comparação com todos os outros tratamentos.

[0062] Os dados de desaparecimento de DM in sacco sugerem que P. anomala aumentou a fração potencialmente digerível, bem como a taxa fracionária e o desaparecimento eficaz do feno em relação ao controle. De fato, os valores efetivos de desaparecimento do feno tratado com P. anomala foram superiores aos dos tratamentos controle e com ácido propiônico. Exemplo 2: Feno, tratamentos e condições de enfardamento

[0063] O feno era feno da alfalfa e foi coletado em 15 de agosto de 2012 em Fort Macleod, Alberta, Canadá. O feno de alfafa estava contraído no campo a níveis de umidade entre cerca de 24% e cerca de 30%. A umidade do fardo foi determinada como no Exemplo 1.

[0064] A taxa de aplicação da combinação de P. anomala em combinação com a enzima tendo uma atividade de quitinase foi respectivamente 1011 de CFU e 1,5 g em 1 L de água por tonelada de feno. De acordo com isto, a taxa de aplicação da combinação de P. pentosaceus em combinação com a enzima tendo uma atividade de quitinase de 1011 de CFU e 1,5 g em 1 L de água por tonelada de feno. O produto do ácido propiônico consistiu em 68% (vol/vol) de ácido propiônico e foi aplicado a uma taxa de 2,72 L/tonelada e considerado como controle positivo. O controle negativo foi água, e foi aplicado a uma taxa de 1 L por tonelada de feno. Foram feitos cinco grandes fardos redondos de cerca de 800 kg de acordo com o Exemplo 1 para cada tratamento no mesmo dia. As amostras de núcleo de fardos em todos os tratamentos foram coletadas no dia 0, 90 e 180 após o enfardamento para analisar seu valor nutricional, produto de fermentação e alterações microbianas.

[0065] As amostras de núcleo coletadas no dia 0 e 90, 180 após o enfardamento foram submetidas a análises microbiológicas e químicas. A análise microbiológica foi realizada para enumerar, isolar e caracterizar os microrganismos (bactérias, leveduras e bolores totais) em placas apropriadas através de diluição em série. Tabela 7 Contagens microbiana de feno de alfafa tratado com vários conservantes de feno no enfardamento

[0066] O perfil microbiológico do feno após cada tratamento foi semelhante ao enfardamento para bactérias totais, leveduras e bolores, mesmo que as diferenças numéricas foram registradas. Após 90 dias de enfardamento, a contagem total de bactérias foi reduzida pelo tratamento com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pediococcus pentosaceus quando comparado ao tratamento de controle e com ácido propiônico, enquanto o tratamento com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala tendeu a ter uma contagem bacteriana reduzida. A redução numérica de levedura foi relatada para os dois tratamentos com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus em oposição ao tratamento de controle e com ácido propiônico. A contagem de bolores não foi afetada pelos tratamentos, exceto após 180 dias, onde a contagem de bolores foi reduzida pelo tratamento com ácido propiônico.

[0067] Foram realizadas análises químicas para determinar pH, DM, nitrogênio total, nitrogênio de amônia, NDF, ADF, nitrogênio insolúvel em detergente ácido (ADIN), carboidratos solúveis em água, ácidos graxos voláteis (VFA) e ácido lático. Tabela 8 Composição química do feno de alfafa em 0, 90 e 180 dias após tratamento com conservante de feno no enfardamento

[0068] As enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus tendo uma atividade de quitinase combinada com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus, enzimas tendo uma quitinase combinada com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus Tabela 9 Produto de fermentação de feno de alfafa tratado com diferentes conservantes de feno durante o enfardamento

[0069] O processo fermentativo do feno não foi fortemente afetado pelos tratamentos com as enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus, uma vez que este material de forragem também não é propenso à fermentação. Contudo, o pH menor após 90 dias para o tratamento com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus.

[0070] As amostras de núcleo foram coletadas no dia 180 e avaliadas quanto à qualidade nutricional usando métodos in situ e in vitro.

[0071] Experimentos in situ foram conduzidos para avaliar o efeito dos conservantes de feno sobre a taxa e a extensão da digestão das amostras de feno coletadas 180 dias após o enfardamento. Foram usados três gados equipados com cânulas ruminais e alimentados com uma dieta base de engorda padrão. Aproximadamente 4 g de cada amostra compósita de cada fardo (repetição) por tratamento foram pesados em sacos de Dacron e incubados em triplicado em cada gado por 0, 2, 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h. Os sacos foram recuperados após incubação e processados de acordo com o SOP de LRC para determinar o desaparecimento in situ de NDF e DM ruminal. Tabela 11 Parâmetros in situ para o feno de alfafa tratado com conservantes de feno durante o enfardamento.

a = fração rapidamente degradável b = fração lentamente degradável c = a taxa à qual b é degradado (/h) retardo = tempo de retardo (h)

[0072] Os dados in situ mostrados na Tabela 11 revelam um material de feno mais digerível para os tratamentos com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus.

[0073] Experimento in vitro também foi conduzido para avaliar o efeito de inoculantes microbianos na produção de gás e cinética de amostras de feno de 180 dias. Foram conduzidas duas operações com fluidos de rúmen mistos de três gados com cânulas ruminais e alimentados com uma base de engorda padrão. Foram pesados aproximadamente 0,5 g de cada amostra compósita de feno de 180d por tratamento em frasco e incubados em triplicado em cada operação e o gás foi medido por 3, 6, 9, 12, 24 e 48h. Os frascos foram recuperados após incubação e processados de acordo com SOP LRC para determinar o desaparecimento de DM ruminal in vitro, produção de gás, amônia e VFA. Tabela 12 Digestibilidade in vitro de feno de alfafa tratado com conservantes de feno no enfardamento

a = Produção de gás assintótico (mL g-1 de DM) c = Taxa de fermentação da taxa de produção de gás fracional (mL h-1) retardo = tempo de retardo (h)

[0074] A digestibilidade in vitro e a fermentabilidade do feno no dia 180 confirmaram os resultados in situ de uma digestibilidade intensificada para tratamentos com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus. Estabilidade da temperatura

[0075] A temperatura de fardos individuais foi monitorada medindo continuamente a temperatura interior durante todo o período de armazenamento com três (3) iButtons de Dallas Thermochron (Embedded Data Systems, Lawrenceburg, KY) inseridos no interior de cada fardo imediatamente após a colheita (ilustrado em imagens). A temperatura foi registrada em intervalos de 4 horas por 10 semanas.

[0076] Como mostrado na Figura 2, os tratamentos com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus apresentaram uma temperatura média reduzida por um período de 60 dias após o enfardamento. O tratamento com ácido propiônico apresentou a temperatura média mais alta ao longo do tempo.

[0077] O efeito é particularmente significativo como mostrado na Figura 3. A Figura 3 ilustra o tempo gasto acima de 40°C para cada tratamento. Uma vez que esta temperatura é amplamente reconhecida como o limiar para danos por ADIN, ele ilustra a intensidade da temperatura interior de fardos de feno. O tratamento com ácido propiônico passou o tempo mais longo acima de 40°C. O tratamento com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pediococcus pentosaceus passou o menor tempo acima de 40°C, seguido pelo tratamento com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala, ambos tratamentos com enzimas tendo uma atividade de quitinase combinadas com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus passou menos tempo acima de 40°C do que o controle.

[0078] Em conclusão, a combinação de enzimas tendo uma atividade de quitinase com Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus reduziu a temperatura interior de fardos de feno, o pH e o número total de bactérias em comparação com o controle e o ácido propiônico no período de armazenamento. Também aumentaram o desaparecimento de matéria seca (DMD) in situ e a taxa de digestão, bem como o DMD in vitro e a taxa de produção de gás. Isto pode ser explicado pelo menor teor de NDF e ADF nestes dois tratamentos.

Exemplo 3

[0079] Este exemplo mostra que a enzima tendo uma atividade de quitinase é ainda mais intensificada do ponto de vista do seu efeito conservante e da sua capacidade na prevenção e/ou na redução de danos devido ao calor em feno com alta umidade se pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase é combinada com uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero

Pediococcus.

[0080] O feno foi coletado e contraído em campo a níveis de umidade como no exemplo 2.

[0081] A taxa de aplicação da combinação de P. anomala em combinação com a enzima tendo uma atividade de quitinase foi respectivamente 1011 de CFU e 1,5 g em 1 L de água por tonelada de feno. Correspondentemente, a taxa de aplicação da combinação de P. pentosaceus em combinação com a enzima tendo uma atividade de quitinase 1011 de CFU e 1,5 g em 1 L de água por tonelada de feno. A taxa de aplicação de P. anomala sozinha foi de 1011 de CFU em 1 L por tonelada de feno. A taxa de aplicação de P. pentosaceus sozinha foi de 1011 de CFU em 1 L por tonelada de feno. A enzima tendo apenas uma atividade de quitinase foi aplicada a uma taxa de 1,5 g (colocada em suspensão em 1 L de água) por tonelada de feno. O produto do ácido propiônico consistiu em 68% (vol/vol) de ácido propiônico, e foi aplicado a uma taxa de 2,72 L/ton e considerado como um controle positivo. O controle negativo foi água, e foi aplicado a uma taxa de 1 L por tonelada de feno. Foram feitos cinco grandes fardos redondos de cerca de 800 kg de acordo com o Exemplo 1 para cada tratamento no mesmo dia.

[0082] Como no exemplo 2, a temperatura de fardos individuais foi monitorada medindo continuamente a temperatura interior por todo o período de armazenamento com três (3) iButtons de Dallas Thermochron (Embedded Data Systems, Lawrenceburg, KY) inseridos no interior de cada fardo imediatamente após a colheita (ilustrado em imagens). A temperatura foi registrada em intervalos de 4 horas por 10 semanas. Como mostrado na Figura 4, quando a pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase é combinada com P. anomala ou P. pentosaceus, a redução de temperatura de feno com alta umidade é surpreendentemente significativamente intensificada pela combinação, em comparação com o uso de cada componente da combinação.

Exemplo 4 Objetivo do ensaio.

[0083] Este ensaio expande a implantação de uma prova de conceito para um aditivo de feno que reduziria o aquecimento dos fardos feitos em condições desafiadoras de colheita (maior teor de umidade do que o ideal). Seguiu-se um ensaio semelhante usando um modelo em escala laboratorial. O ensaio seguiu o perfil de temperatura dos pequenos fardos quadrados (~ 25 kg, 79,9% de DM) inoculados utilizando diferentes combinações de dois microrganismos (Pichia anomala ou Pediococcus pentosaceus) com duas enzimas (quitinase pura ou uma enzima comercial contendo atividades de pectina liase, glucanase e quitinase). Metodologia.

[0084] O ensaio foi realizado em pequenos fardos quadrados de mistura de alfafa-gramínea (45: 55), e tendo um peso médio de 25,0 kg no momento da colheita. O nível médio de umidade dos fardos foi de 79,9% de DM, dentro da faixa de nível de matéria seca esperado (80-83% de DM). Os fardos foram inoculadas com o tratamento diferente após a pulverização da forragem na frente da câmara de corte da enfardadeira, por um aplicador de inoculante Dorhmann. A configuração experimental permitiu a aplicação de um controle e quatro diferentes misturas aditivas dos aditivos microbianos (nenhum, Pichia anomala + quitinase, Pichia anomala + mistura de enzimas, Pediococcus pentosaceus + quitinase, Pediococcus pentosaceus + mistura de enzimas).

[0085] Para cada tratamento, seis fardos quadrados foram pulverizados em três blocos de dois fardos. Os fardos foram transportados para o galpão de armazenamento, pesados e colocados em paletes, em um padrão aleatório completo pré-definido de forma que nenhuma superfície estivesse em contato de outro fardo. Cada fardo foi equipado com uma sonda de temperatura em seu centro geométrico. Os fardos foram armazenados por 100 dias.

Resultados

[0086] Geralmente, os tratamentos inoculados com Pichia anomala (# 2 e 3 na tabela 13) mostraram um efeito retardando o aquecimento dos fardos, mas misturar Pichia anomala e quitinase (# 3) retardou significativamente o aquecimento e o tempo que a temperatura dos fardos fosse 5°C e 10°C acima da temperatura ambiente (Tabela 13). Este tratamento também mostrou uma temperatura mais baixa durante a fase entre 400 e 600 horas de incubação. A adição da mistura enzimática com a cepa de Pichia anomala resultou em alguma melhoria numérica, embora a melhora tenha sido menor do que com a mistura de quitinase.

[0087] As misturas de Pediococcus pentosaceus (n° 4 e 5) permitiram um período mais longo antes do aquecimento dos fardos. O uso de ambos os tipos de enzimas resultou em benefícios comparáveis com uma redução do tempo gasto a 10°C acima da temperatura ambiente (Tabela 13). Tabela 13. Descrição do tratamento e dados relacionados ao tempo em relação ao perfil de temperatura

[0088] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com formas de realização específicas da mesma, deve ser entendido que é capaz que outras modificações e esta descrição destinem-se a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, a princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição que se enquadram na prática conhecida ou usual na técnica à qual a invenção se refere e como podem ser aplicadas aos aspectos essenciais aqui anteriormente descritos, e como a seguir no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz redutora de calor e conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz redutora de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia ou uma bactéria da Gênero Pediococcus, caracterizado pelo fato de que: - a quantidade eficaz da pelo menos uma enzima isolada tendo uma atividade de quitinase está na faixa de 6 U a 300 U por tonelada de feno a ser tratado; - a quantidade eficaz de uma levedura do gênero Pichia ou de uma bactéria da Gênero Pediococcus é 105 a 1015 organismos viáveis da levedura ou das bactérias por tonelada de feno.

2. Conservante de feno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a levedura do gênero Pichia é de um Pichia anomala sp.

3. Conservante de feno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a levedura do gênero Pichia é de uma Pichia anomala sp tendo todas as características de identificação da cepa de Pichia anomala tendo o número de acesso DBVPG 3003.

4. Conservante de feno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as bactérias do gênero Pediococcus são de uma Pediococcus pentosaceus sp.

5. Conservante de feno de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria do gênero Pediococcus é de uma Pediococcus pentosaceus sp tendo todas as características de identificação de Pediococcus pentosaceus BTC328 tendo o número de acesso NCIMB 12674 ou cepa BTC401 tendo o número de acesso NCIMB 12675.

6. Conservante de feno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma enzima tendo uma atividade de Pectina liase, uma atividade de Glucanase ou uma mistura das mesmas.

7. Método de tratamento de feno para prevenir e/ou reduzir o dano devido ao calor em feno de alta umidade e também para conservar o mesmo, o método compreendendo adicionar ao feno um conservante de feno compreendendo uma quantidade eficaz de redutor de calor e conservante de feno de pelo menos uma enzima tendo uma atividade de quitinase em combinação com uma quantidade eficaz de redutor de calor e de conservante de feno de uma levedura do gênero Pichia ou bactérias do gênero Pediococcus, caracterizado pelo fato de que: - a quantidade eficaz da pelo menos uma enzima isolada tendo uma atividade de quitinase está na faixa de 6 U a 300 U por tonelada de feno a ser tratado; - a quantidade eficaz de uma levedura do gênero Pichia ou de uma bactéria da Gênero Pediococcus é 105 a 1015 organismos viáveis da levedura ou das bactérias por tonelada de feno.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a levedura do gênero Pichia é a espécie Pichia anomala.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que a levedura do gênero Pichia é a espécie Pichia anomala tendo todas as características de identificação da cepa de Pichia anomala tendo o número de acesso DBVPG 3003.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a bacteriado gênero Pediococcus é a espécie Pediococcus pentosaceus.

11. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 10, caracterizado pelo fato de que a bactéria do gênero Pediococcus é a espécie Pediococcus pentosaceus tendo todas as características de identificação de Pediococcus pentosaceus BTC328 tendo o número de acesso NCIMB 12674 ou cepa BTC401 com o número de acesso NCIMB 12675.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma enzima tendo uma atividade de Pectina liase, uma atividade de Glucanase ou uma mistura das mesmas.