JP3115289B2

JP3115289B2 - キチナーゼを用いた植物病原菌防除剤

Info

Publication number: JP3115289B2
Application number: JP11220929A
Authority: JP
Inventors: 大三古賀; 洋司小村; 貞樹吉川
Original assignee: 山陰建設工業株式会社
Priority date: 1998-08-04
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2000-12-04
Anticipated expiration: 2019-08-04
Also published as: JP2000109405A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キチナーゼ、特に
ヤマイモ由来のキチナーゼを利用した植物病原菌防除剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、植物病原菌防除剤としては、複素
環芳香族系、有機リン酸エステル系等の有機合成植物病
原菌防除剤が主流であった。これらの薬剤は、病原菌の
みに効果を発揮するだけでなく、人体への悪影響を及ぼ
したり、残留農薬等の問題を引き起こしたりしている。

【０００３】キチナーゼは、キチン質を加水分解する酵
素であり、節足動物及び甲殻類等の脱皮、植物の生体防
御、微生物の生育等に利用されている。しかし、キチナ
ーゼの抗菌性に関しては知られておらず、キチナーゼは
植物病原菌防除剤としては利用されていなかった。一
方、キチナーゼは生物由来であることから、人体や環境
に対して安全であると考えられる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のように有機合成
化合物を利用した植物病原菌防除剤については様々な問
題点が指摘されている。このため、このようなタイプの
植物病原菌防除剤に代わる安全性の高い新規な植物病原
菌防除剤が望まれていた。本発明は、このような要求に
応えるべく、生物由来の物質を利用した新規な植物病原
菌防除剤を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究した結果、キチナーゼが抗菌
性を有すること、及びキチナーゼの抗菌効果はβ-1,3-
グルカナーゼにより相乗的に増大することを見いだし、
本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、キチ
ナーゼを有効成分として含有することを特徴とする植物
病原菌防除剤である。また、本発明は、キチナーゼとβ
-1,3-グルカナーゼとを有効成分として含有することを
特徴とする植物病原菌防除剤である。

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に使用するキチナーゼは、特に限定されないが、
好ましいキチナーゼとしては、ヤマイモ由来のキチナー
ゼを例示することができ、それらの中でも特に好ましい
キチナーゼとしてYam H1、Yam H2を例示することができ
る。Yam H1は、本発明者らによって単離されたキチナー
ゼであり、その至適pHは４（キチンオリゴ糖に対し
て）、３と９（グリコールキチンに対して）、安定pH域
は３〜12、至適温度は70℃、安定温度域は０〜80℃であ
る。従来既知のキチナーゼ、例えば、ライムギ由来のキ
チナーゼの安定pH域が４〜８、安定温度域が０〜50℃で
あることを考えると、Yam H1は熱及びpH安定性に非常に
すぐれているといえる。また、このキチナーゼは、少な
くとも配列番号１記載のアミノ酸配列を含んでいる。Ya
m H2も本発明者らによって単離されたキチナーゼであ
り、このキチナーゼは少なくとも配列番号２記載のアミ
ノ酸配列を含んでいる。

【０００６】本発明の植物病原防除剤は、キチナーゼの
みを有効成分としてもよいが、キチナーゼとβ-1,3-グ
ルカナーゼを有効成分とすることがより好ましい。本発
明に使用するβ-1,3-グルカナーゼは、植物由来のもの
でも、微生物由来のものでもよく特定の生物由来のもの
に限定されない。

【０００７】本発明の植物病原菌防除剤は、キチナーゼ
及びβ-1,3-グルカナーゼをそのまま使用してもよい
が、一般には適当な液体担体に溶解するか若しくは分散
させ、又は適当な粉末担体と混合するか若しくはこれに
吸着させ、所要の場合にはさらにこれに乳化剤、分散
剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添
加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤等の製剤として使用す
ることができる。

【０００８】製剤に使用する液体担体としては、水、リ
ン酸緩衝液、有機酸類の水溶液、液体肥料、海藻・植物
・木材抽出液、ミネラル類水溶液、アミノ酸類水溶液、
漢方薬類水溶液等が適当であり、これらの１種又は２種
以上を混合して使用することができる。

【０００９】また、製剤に使用する粉末担体としては、
タルク・クレー・葉ろう石等の粘土鉱物、活性炭、ゼオ
ライト、シリカ、セルロース、カルシウム、キトサン、
デンプン等が適当であり、これらの１種又は２種以上を
混合して使用することができる。

【００１０】キチナーゼを有効成分として含有すること
を特徴とする植物病原菌防除剤の場合、有効成分である
キチナーゼの濃度は、一般に乳剤の場合には0.01〜0.05
％、油脂剤の場合には 0.005〜0.025 ％、水和剤の場合
には0.01〜0.05％、粉剤の場合には1.0 〜5.0 ％が適当
であり、これらの濃度を適宜変更してもよい。

【００１１】また、キチナーゼとβ-1,3-グルカナーゼ
とを有効成分として含有することを特徴とする植物病原
菌防除剤の場合、有効成分であるキチナーゼ及びβ-1,3
-グルカナーゼの濃度は、各々、乳剤の場合には0.01〜
0.05％、0.01〜0.05％、油脂剤の場合には 0.005〜0.02
5 ％、 0.005〜0.025 ％、水和剤の場合には0.01〜0.05
％、0.01〜0.05％、粉剤の場合には0.01〜0.05％、0.01
〜0.05％が適当であり、これらの濃度を適宜変更しても
よい。

【００１２】キチナーゼを有効成分として含有すること
を特徴とする植物病原菌防除剤の使用量は、10a 当たり
0.1〜1.0 kgとすることができるが、10a 当たり 0.1〜
0.5kg とするのが好ましい。また、キチナーゼとβ-1,3
-グルカナーゼとを有効成分として含有することを特徴
とする植物病原菌防除剤の使用量は、10a 当たり 0.1〜
1.0kg とすることができるが、10a 当たり 0.1〜0.5kg
とするのが好ましい。

【００１３】本発明の植物病原菌防除剤により、植物病
原菌を防除することができる。例えば、本発明の植物病
原菌防除剤は、フォーマ・ワサビアエ(Phoma wasabia
e)、フザリウム ox.sp. ラファニ(Fusarium ox.sp.raph
ani)、ロゼリニア・ネカトリクス(Rozelinia necatrix)
等の植物病原菌に対して優れた防除効果を発揮する。特
に、キチナーゼとβ-1,3-グルカナーゼとを有効成分と
して含有することを特徴とする植物病原菌防除剤の場合
には、キチナーゼとβ-1,3-グルカナーゼとの相乗効果
により増強された植物病原菌防除効果が発揮される。

【００１４】

【実施例】〔実施例１〕キトサンによるキチナーゼの誘
導キトサンを予め液体培養しておいたイネ遊離細胞に終濃
度100 μg/mlになるように添加し、３日間振盪培養し
た。その後、細胞培養液を吸引濾過して細胞を除き粗酵
素液を抽出した。この粗酵素液に基質としてＮ−アセチ
ルキトサンを加えた後、遠心分離し、上澄み液に遊離し
た還元糖をシャーレス変法によって定量することによ
り、キチナーゼ活性を測定した。無添加で培養したも
の、及びキトサンの溶媒として用いた乳酸のみを添加し
て培養したものを対照とした。その結果、イネ遊離細胞
培養液にキトサンを添加することにより、イネキチナー
ゼ活性が増加した（表１）。これにより、イネ遊離細胞
において、キトサンがキチナーゼを誘導することが示さ
れた。

【００１５】

【表１】

【００１６】〔実施例２〕キチナーゼ誘導を促進させる
キトサンの濃度の決定脱アセチル化度80％キトサンを予め液体培養しておいた
イネ遊離細胞に終濃度50、100 、1000μg/mlになるよう
に添加し、３日間振盪培養した。その後、細胞培養液を
吸引濾過して細胞を除き粗酵素液を抽出した。この粗酵
素液に基質としてＮ−アセチルキトサンを加えた後、遠
心分離し、上澄み液に遊離した還元糖をシャーレス変法
によって定量することにより、キチナーゼ活性を測定し
た。その結果、100 μg/mlの濃度が最も高いキチナーゼ
活性を示した（図１）。

【００１７】〔実施例３〕イネキチナーゼ活性の至適温
度及び至適pHの決定実施例１と同様の方法により抽出したイネキチナーゼを
含む濾液にＮ−アセチルキトサン加え、温度20、30、4
0、50、60、70、80、90℃で５分間静置した。その後、
各々の濾液を遠心分離し、シャーレス変法により上澄み
液に遊離した還元糖を定量することにより、キチナーゼ
活性を測定した。また、pHについても、濾液がpH2 、4
、6 、8 、10、12となるように1N HCl及びNaOHで調整
し、上記と同様にシャーレス変法を用いてキチナーゼ活
性を測定した。その結果、至適温度は50〜60℃であり、
比較的高温度でも活性が安定していた（図２）。また、
至適pHは６〜７であった（図３）。

【００１８】〔実施例４〕イネキチナーゼの抗菌効果脱アセチル化度80％キトサン溶液を予め液体培養してお
いたイネ遊離細胞に終濃度100 μg/mlになるように添加
し、３日間振盪培養した。その後、細胞培養液を吸引濾
過して細胞を取り除き、濾液を透析して粗酵素液とし
た。この粗酵素液10、20、30％を含有するＹＧ寒天培地
（Yeast.抽出物 0.1%, Glucose 0.1%, KH₂PO₄ 0.02%,
K₂HPO₄ 0.03%, MgSO₄・7H₂O 0.02%, 寒天 1.5%)を調製
し、予め前培養しておいた病原菌(Pyricularia oryzae
及び Phoma wasabiae)を直径5mm のコルクボーラーで抜
き取り接種して培養した。粗酵素液を含まないＹＧ培地
を対照とし、対照ＹＧ寒天培地と粗酵素液含有ＹＧ寒天
培地とで増殖した病原菌の面積比を計算した。

【００１９】その結果、 Pyricularia oryzae の場合に
は、対照ＹＧ寒天培地と粗酵素液10％含有ＹＧ培地とで
の面積比は100:87であり、対照ＹＧ寒天培地と粗酵素液
20％含有ＹＧ培地とでの面積比は100:58であり、対照Ｙ
Ｇ寒天培地と粗酵素液30％含有ＹＧ培地とでの面積比は
100:41であった（図４）。また、 Phoma wasabiae の場
合には、対照ＹＧ寒天培地と粗酵素液10％含有ＹＧ培地
とでの面積比は100:38であり、対照ＹＧ寒天培地と粗酵
素液20％含有ＹＧ培地とでの面積比は100:22であり、対
照ＹＧ寒天培地と粗酵素液30％含有ＹＧ培地とでの面積
比は100:12であった（図５）。

【００２０】上記結果のように、粗酵素液含有ＹＧ寒天
培地で Pyricularia oryzae 及び Phoma wasabiae の増
殖は阻害されており、これによりイネキチナーゼが Pyr
icularia oryzae 及び Phoma wasabiae に対して抗菌効
果を有することが示された。

【００２１】〔実施例５〕キチナーゼ及びβ-1,3-グル
カナーゼによる溶菌活性 3.9％ポテトデキストロース寒天培地で生育させたフザ
リウム菌(Fusarium oxysporum)の菌糸体を、0.4M MgSO₄
を含むMacIlvaine緩衝液(pH4.0) 又は 0.4Ｍマンニトー
ルを含む５mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0) 中で、植
物キチナーゼ（ヤマイモキチナーゼＨ）及び３％のβ-
1,3-グルカナーゼ（ザイモリエース（登録商標））と27
℃で反応させると、該病原菌の菌糸体からプロトプラス
トが遊離した（図６）。このことから、植物キチナーゼ
とβ-1,3-グルカナーゼとの併用により、病原菌の細胞
壁が溶解され、抗菌効果が発揮されることが分かった。

【００２２】〔実施例６〕 Yam H1のｐH安定性 Yam H1をpHの異なる緩衝液中にインキュベートした後、
酵素活性を測定し、Yam H1のpH安定性を調べた。インキ
ュベートは、４℃で15時間行った。また、酵素活性の測
定は、GlcNAc₅ を基質とし、pH4.0 で行った。この結
果を図７に示す。図７に示すように、Yam H1の安定pH域
は３〜12であると考えられる。

【００２３】〔実施例７〕 Yam H1の温度安定性 Yam H1を温度の異なる緩衝液中にインキュベートした
後、酵素活性を測定し、Yam H1の温度安定性を調べた。
インキュベートは、pH7.0 で15分行った。また、酵素活
性の測定は、グリコールキチンを基質とし、pH4.0 で行
った。この結果を図８に示す。図８に示すように、Yam
H1の安定温度域は０〜80℃であると考えられる。

【００２４】〔実施例８〕ヤマイモキチナーゼＨの溶
菌活性植物病原菌のFuzarium oxysporum、Fuzarium roseum 、
Pyrenophora gramineaの３種類の菌糸体0.25 mg につい
て、最終濃度17μM のヤマイモキチナーゼ及び最終濃度
３％ザイモリエース（登録商標）を添加し、pH8.0 、27
℃暗所で反応し、14時間後に反応液を顕微鏡で観察し
た。その状態を図９に示す。植物病原菌３種類いずれも
５ミクロン程度のプロトプラストが遊離し、溶菌活性が
認められた。

【００２５】ヤマイモキチナーゼHの精製法〔実施例９〕 Yam H1 及びYam H2の単離ヤマイモ塊茎の皮（約200g）をその３倍量の0.1 Mリン
酸バッファー（pH 7.0）と一緒にホモゲナイズした。そ
れを9000gで20分間遠心分離し上澄液を集めた。その上
澄液にその1/20量の10%CTAB（hexadecyl trimethyl amm
onium bromide）を撹拌しつつ滴下した。混在する酸性
多糖類を沈澱物として除去した。さらに一晩放置後、こ
の溶液を9000gで20分間遠心分離して上澄液を集め、そ
れに60%飽和硫安溶液になるように硫安を加えよく撹拌
した。一晩後、これを9000gで20分間遠心分離して沈澱
物を集め、10mMリン酸バッファー（pH8.0）で透析し
た。この透析液を透析液と同じバッファーで平衡化した
DEAE-CellulofineA-500カラム（2.2x35 cm）にかけた。
同じバッファーでタンパク質がでなくなるまで溶出した
あとで、同じバッファーで0 Mから0.5 Mの塩化ナトリウ
ムのグラジエントによりキチナーゼを溶出した。伝導度
が5-10 mmhoの画分にキチナーゼHが溶出した。これを
さらに、同じDEAE-CellulofineA-500カラム（2.2x35 c
m）でリクロマトグラフィ−を行ったところ、２種類の
キチナーゼが分離したので、これらのキチナーゼをYam
H1及びYam H2と命名した。

【００２６】Yam H1を25mM ヒスチジン−塩酸バッファ
−（pH 5.5）で透析し、クロマトフォーカッシング用の
カラムポリバッファ−エクスチェンジカラム（1x20 c
m）かけた。溶出にはポリバッファ−74を8倍希釈し、さ
らにpHを3.0に調製した液で行った。Yam H1はpH3.6に溶
出した（等電点3.6）。このYam H1画分を0.1M塩化ナト
リウムを含む50mMリン酸バファ−で透析後、同じバッフ
ァーで平衡化したCellulofine GC-200カラム（2x120 c
m）でゲルろ過を行った。分子量約50,000の所に溶出し
た。分子量についてはSDS-PAGEで確認したところ、24,5
00のタンパク質が2量体を形成していることが分った。
精製の終了はネイティブPAGEで1本バンドであることに
より確認した。

【００２７】〔実施例１０〕 Yam H1 及びYam H2の部
分アミノ酸配列の決定ヤマイモの葉0.3gを-80℃で凍らせ、ドライアイスと共
に粉砕した。これに細胞及び細胞内容物を溶解させるた
め、Regent Bを1.7ml加え、よく混合した後、RNaseを40
0ng/mlになるように加え、37℃で30分間インキュベート
した。その後、不要なタンパク質を取り除くため、5M過
塩素酸ナトリウムを500μl加え、室温で20分間、よく攪
拌した。65℃のウォーターバスで数回転倒混和しなが
ら、20分間インキュベートした。インキュベート後、2.
9mlのクロロホルムを加え、室温で20分間攪拌し、その
後、遠心分離（室温、4000rpm、1分）を行った。得られ
た上清にNucleon Silica Suspensionを225μl加えた
後、再度遠心分離（室温、4000rpm、1分）を行った。上
清からDNAを含む水層だけを取りだし、これに冷100%エ
タノールを4.4ml加え、静かに攪拌した。遠心分離（4
℃、7000rpm、5分）を行い、沈殿を採取し、これに冷70
%エタノールを5.0ml加え、静かに攪拌した。沈殿を採取
し、75μlのTEに溶かし、ヤマイモ由来のゲノムDNAを得
た。

【００２８】上記で抽出したヤマイモ由来のゲノムDNA
を鋳型として、PCRを行った。プライマーとしては、Yam
H1とキチナーゼとしての性質が類似するヤマイモムカ
ゴキチナーゼのN-末端側（WGQNGFE)、C-末端側（NNPPC
H）のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを
使用した。増幅条件は、94℃1分、（94℃30秒、60℃１
分、72℃2.5分）25サイクル、72℃7分とした。反応の結
果、約1100bpの断片が増幅された。上記断片の塩基配列
の一部を決定し、その配列からアミノ酸配列を推定した
（配列番号１及び配列番号２）。

【００２９】

【発明の効果】本発明により、人体や環境に悪影響を及
ぼすことなく、植物病原菌を防除することができる。特
に、キチナーゼとβ-1,3-グルカナーゼとを有効成分と
して含有することを特徴とする植物病原菌防除剤の場合
には、キチナーゼとβ-1,3-グルカナーゼとの相乗効果
により増強された植物病原菌防除効果が発揮される。

【００３０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SANIN KENSETSU KOUGYOU KABUSHIKI GAISYA <120> KICHINAHZE WO MOCHIITA SYOKUBUTSU BYOUGENKIN BOUJYOZAI <130> P99-0421 <160> 2 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Dioscorea opposita Thunb <400> 1 Trp Gly Gln Asn Gly Phe Glu Gly Ser Leu Ala Glu Ala Cys Ser Thr 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Asp Ile Val Val Ile Ala Phe Leu Tyr Gln Phe Gly Asn 20 25 30 Phe Gln Thr Pro Gly Leu Asn Leu Ala Gly His Cys Asn Pro Ala Phe 35 40 45 Gly Gly Cys Val Ser Ile Gly Asn Asp Ile Lys Ala Cys Gln Ser Gln 50 55 60 Gly Ile Lys Val Phe Leu Ser Leu Gly Gly Ala Tyr Gly Ser Tyr Thr 65 70 75 80 Leu Val Ser Thr Gln Asp Ala Gln Gln Val Ala Asp Tyr Leu Trp Asn 85 90 95 Asn Phe Leu Gly Arg Ser Ser Ser Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val 100 105 110 Leu Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Trp 115 120 125 Asp Glu Leu Ala Gln Met Leu Phe Asp Tyr Ser Gln Gln Gly Gln Lys 130 135 140 Val Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Pro Tyr Pro Asp Ala Trp Met 145 150 155 160 Gly Lys Ala Leu Ala Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe 165 170 175 Tyr Asn Asn Pro Pro Cys His 180 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Dioscorea opposita Thunb <400> 2 Trp Gly Gln Asn Gly Phe Glu Gly Ser Leu Ala Glu Ala Cys Ser Thr 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Asp Ile Val Val Ile Ala Phe Leu Tyr Gln Phe Gly Asn 20 25 30 Phe Gln Thr Pro Gly Leu Asn Leu Ala Gly His Cys Asn Pro Ala Phe 35 40 45 Gly Gly Cys Val Ser Ile Gly Asn Asp Ile Lys Ala Cys Gln Ser Gln 50 55 60 Gly Ile Lys Val Phe Leu Ser Leu Gly Gly Ala Tyr Gly Ser Tyr Thr 65 70 75 80 Leu Val Ser Thr Gln Asp Ala Gln Gln Val Ala Asp Tyr Leu Trp Asn 85 90 95 Asn Phe Leu Gly Arg Ser Ser Ser Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val 100 105 110 Leu Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Gly Gly Thr Thr Gln His Trp 115 120 125 Asp Glu Leu Ala Gln Met Leu Phe Asp Tyr Ser Gln Gln Gly Gln Lys 130 135 140 Val Tyr Leu Ser Ala Ala Pro Gln Cys Pro Tyr Pro Asp Ala Trp Met 145 150 155 160 Gly Lys Ala Leu Ala Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe 165 170 175 Tyr Asn Asn Pro Pro Cys His 180

【図面の簡単な説明】

【図１】イネ遊離細胞において、添加するキトサンの濃
度とキチナーゼ活性との関係を表す図である。

【図２】温度とキチナーゼ活性との関係を表す図であ
る。

【図３】pHとキチナーゼ活性との関係を表す図である。

【図４】病原菌に対するキチナーゼの抗菌効果を表す写
真である。

【図５】病原菌に対するキチナーゼの抗菌効果を表す写
真である。

【図６】キチナーゼ及びβ-1,3-グルカナーゼによる溶
菌活性を表す図である。

【図７】インキュベート時のpHとYam H1の酵素活性との
関係を示す図である。

【図８】インキュベート時の温度とYam H1の酵素活性と
の関係を示す図である。

【図９】Yam H1のフザリウム菌への生育抑制効果を示す
写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開平２−502513（ＪＰ，Ａ) 特開平３−15393（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開497865（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 267，Ｎｏ．28，（1992），ｐ．19944− ７Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．335，Ｎｏ．１, （1996），ｐ．118−122 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01N 63/00 - 63/04 C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の性質を有するYam H1を有効成分と
して含有することを特徴とする植物病原菌防除剤。（１）安定pH域が３〜１２（２）安定温度域が０〜８０℃ （３）配列番号１記載のアミノ酸配列を含む
【請求項２】配列番号２記載のアミノ酸配列を含むYa
m H2を有効成分として含有することを特徴とする植物病
原菌防除剤。