BR112016029654B1 - produto cosmético com fatores de crescimento lipossomados - Google Patents
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Abstract
PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSOMADOS. Produto cosmético com fatores de crescimento lipossomados com propriedades para reparar e rejuvenescer a pele o qual inclui na composição fatores de crescimento de plantas lipossomadas de alta pureza, antioxidantes lipossomados, peptídeos anti-rugas lipossomados e células tronco além de outros componentes para uso cosmético.
Description
[001] A invenção proposta se refere a um novo produto cosmético com propriedades para reparação e rejuvenescimento da pele que inclui em sua composição fatores de crescimento de plantas, além de antioxidantes, peptídeos anti-rugas e células tronco, o qual é aplicável ao setor da beleza, centros cosméticos e dermatológicos.
[002] Muitas preparações cosméticas são conhecidas até agora as quais tem efeitos de reparação e rejuvenescimento da pele, mas não são conhecidas preparações que incluam lipossomas com ingredientes ativos tais como fatores de crescimento de plantas de alta pureza juntamente com antioxidantes lipossomados, peptídeos anti-rugas e células tronco
[003] O produto que a invenção propõe consiste de uma preparação lipossomada na qual os lipossomas incorporam, como ingredientes ativos fundamentais, fatores de crescimento de plantas de alta pureza e antioxidantes, além de incluir, sem lipossomas, peptídeos anti-rugas e células tronco.
[004] Os fatores de crescimento são proteínas naturais que estimulam o crescimento celular, proliferação e diferenciação. Eles desempenham um papel importante na manutenção da estrutura de uma pele saudável, ao intervir na comunicação entre as células epidérmicas e dérmicas por meio de ligação a receptores específicos na superfície da célula.
[005] É bem conhecido que os fatores de crescimento desempenham um papel importante na reversão dos efeitos da idade da pele, a aplicação tópica de fatores de crescimento em pessoas tem demonstrado que atua em nível local e estimula a renovação celular, a redução de rugas e o aumento da síntese de colágeno.
[006] A principal vantagem do produto da presente invenção é que se refere a fatores de crescimento de plantas de alta pureza, conforme são incorporadas nos lipossomas, sua penetração na pele e sua estabilidade melhoram ao mesmo tempo que evita a sua degradação como proteínas que são.
[007] Entre os fatores de crescimento de plantas incluídos na composição, existem os fatores- HGH (hormônio de crescimento humano), Nicotiana benthamiana Sh- Polipeptideo-7, GM-CSF (fator de estimulação de colônias de macrófagos granulócitos), Nicotiana benthamiana Sh-Polipeptideo- 45 e TGFb2 (fator de crescimento tumoral beta 2) Nicotiana benthamianaHexapeptídeo-40 Sh-Polipeptídeo-76.
[008] Nicotiana benthamianaSh-Polipetídeo- 7 é um peptídeo humano recombinante de cadeia simples, produzido de maneira transitória na expressão de Nicotiana benthamiana em plantas. O gene de partida é uma cópia sintetizada a partir do gene humano que codifica o hormônio de crescimento (GH) utilizado como tal ou adaptado ao hospedeiro. Contém, no máximo, 197 aminoácidos. A proteína consiste na seqüência apropriada de 20 aminoácidos padrão.
[009] Nicotiana benthamianaSh-Polipetídeo- 45 é um peptídeo humano recombinante de cadeia simples, produzido de maneira transitória na expressão de Nicotiana benthamiana em plantas. O gene de partida é uma cópia sintética do gene humano que codifica o fator para estimular colônias de granulócitos e macrófagos utilizada como tal ou adaptada para a produção do hospedeiro. Contém, no máximo, 127 aminoácidos os quais podem conter ligações de dissulfureto e/ou glicosilação. A proteína consiste na seqüência apropriada de 20 aminoácidos padrão.
[010] Nicotiana benthamianaHexapetídeo-40 sh-Polipeptídeo-76 contem duas correntes de polipeptídeo idênticos unidos por uma única ligação dissulfureto. Eles são produzidos de maneira transitória na expressão de Nicotiana benthamiana em plantas. O gene de partida é uma cópia sintética do gene humano que codifica o fator de crescimento transformante beta 2 utilizado como tal ou adaptado para a produção do hospedeiro. Contém, no máximo, 237 aminoácidos os quais podem conter ligações de dissulfureto e/ou glicosilação. A proteína consiste na seqüência apropriada de 20 aminoácidos padrão.
[011] Além disso, entre os antioxidantes lipossomados que estão incluídos na composição existem ergotionina, quercetina e pterostilbeno e entre os peptídeos anti- rugas, também lipossomados, há extrato de centelha asiática, palmitoil-tripéptido-3 e caprooyl-tetrapeptídeo-3.
[012] Finalmente, o produto também incorpora como ingrediente ativo, sem lipossomas, extratos de células tronco de Malus doméstica.
[013] Nos testes realizados, cujos dados estão indicados abaixo, verifica-se que estes fatores de crescimento na forma de lipossomas mantém a mesma atividade que o fator de forma livre, mas sua penetração na pele e sua estabilidade é melhorada.
[014] Como incorporação preferida, é proposto um produto cosmético lipossomado que tem formas cosméticas diferentes tais como creme nutritivo, solução, sérum, emulsão, suspensão, etc, no qual os componentes diferentes podem ser encontrados no caso do creme nas seguintes proporções de ingredientes ativos e de lipossomas:
[015] Outra incorporação preferida é no caso do sérum onde os ingredientes diferentes são encontrados nas seguintes proporções:
[016] ANÁLISE DA ATIVIDADE DO FATOR LIVRE VERSUS O FATOR ENCAPSULADO EM FIBROBLASTOS DE PELE E QUERATINÓCITOS HUMANOS
[017] Fatores analisados: - Fatores GM-CSF (fator de estimulação de colônias de macrófagos granulócitos), HGH (hormônio de crescimento humano), TGFb2 (fator de crescimento tumoral beta 2) e folistatina. - Fatores GM-CSF, HGH, TGFb2 e folistatina encapsulada em lipossomas. GM-CSF e HGH ^ 50 mg/ml de lipídeos, fator 400 ng/ml TGFb2 e folistatina ^ 50 mg/ml de lipídeos, fator 200 ng/ml Métodos usados - Proliferação de células - Elastina de colágeno/síntese por meio de PCR quantitativa - Migração - Efeito antiinflamatório por meio de PCR quantitativa
[018] ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR MTT
[019] Este ensaio é baseado em redução metabólica de brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) efetuada pela enzima succinato desidrogenase mitocondrial num composto de cor azul (formazana) que permite determinar a funcionalidade mitocondrial das células tratadas. Este método tem sido amplamente utilizado para medir a sobrevivência e proliferação celular.
[020] A quantidade de células vivas é proporcional à quantidade de formazana produzida. Este método foi desenvolvido por Mosmann em 1983, modificado em 1986 por François Denizot e Rita Lang. Metodologia 1. Utilizando tripsina, separar as células e voltar a suspendê-las em meio de cultura suplementado (10% de sérum fetal bovino e antibiótico). 2. Determinar o número de células necessárias por fonte utilizando uma câmera Neubauer (HaCaT: 5.000 células/96 fontes, 30.000 células/24 fontes; HSF: 4.000 células/96 fontes, 30.000 células/24 fontes. 3. Incubação a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas para permitir a aderência da mesma. 4. Preparar as misturas de fator lipossomados e livres nas concentrações indicadas, remover o meio e adicionar as misturas. 5. Incubar a 37°C e 5% de CO2 por 72 horas. 6. Adicionar MTT (1.9 mg/ml) em solução PBS (25 pl total) sobre o meio. 7. Incubar por 3 horas a 37°C para permitir a formação de cristais de formazana. 8. Então remover o flutuante e adicionar 100 pl de DMSO. 9. Incubar por 30 minutos a 37°C para permitir que os cristais de formazana se dissolvam. 10. A leitura da densidade óptica (DO) é levada a cabo num espectrofotômetro a um comprimento de onda de 570 nm.
[021] A percentagem de viabilidade é obtida da seguinte maneira: % de viabilidade - células tratadas DO x 100/DO células de controle.
[022] ENSAIO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS (MIGRAÇÃO CELULAR)
[023] O objetivo do ensaio de cicatrização de feridas é o estudo da migração celular. É baseado na observação do comportamento de uma monocamada de célula confluente em que um furo ou ferida foi previamente feito. As células da borda do furo se movem em direção da abertura até que o contato de novas células com células sejam estabelecidos, fechando assim a ferida.
[024] Os passos básicos envolvem a criação da ferida ou área livre de célula na monocamada da célula, a captação de imagens periodicamente durante o experimento e a comparação de todas as imagens para determinar a velocidade da migração celular. Metodologia 1. Cultivar as células até à confluência (100% aproximadamente) em placas de 6 fontes (HaCaT: 500.000 células/6 fontes; HSF: 500.000 células/6 fontes) 2. Incubar até 37°C e 5% de CO2 por 24 horas. 3. Dimensionamento da ferida (2 feridas por poço de trajetória horizontal usando pontos estéreis amarelos (P200). Eles são arrastados ao longo da monocamada com um ângulo de inclinação de 30 graus (não perpendicular à placa) e guiados com uma seção previamente marcada. Marque três pontos para fazer medicos 4. Deixar descansar por 15 minutos antes de adicionar o tratamento. 5. Preparar as misturas de fatores lipossomas e fatores livres numa concentração de 1 ng/ml, o meio é removido e adicionadas as misturas. 6. Incubar a 37°C e 5% de CO2 por 72 horas. 7. Tomar as medidas em 0, 24, 48 e 72 horas.
[025] A porcentagem da migração é obtida da seguinte maneira: % de migração (Tempo medido 0-tempo medido X - tempo medido 0) * 100
[026] ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE GENES POR MEIO DE PCR EM TEMPO REAL.
[027] ENSAIO DE EXPRESSÃO DEELASTINA E CITOCINAS PRO-INFLAMATÓRIAS
[028] PCR em tempo real ou PCR quantitativa é uma variação do PCR padrão usado para quantificar DNA ou RNA mensageiro (mRNA) de uma amostra. Utilizando-se uma seqüência específica iniciadora, é possível determinar o número de cópias ou a quantidade relativa de uma seqüência determinada de DNA ou RNA.
[029] Quando o PCR em tempo real é combinado com uma retro-transcrição ou reação RT (RTPCR), a quantidade de mRNA de uma amostra pode ser determinada por meios de uma quantificação relativa. Tal quantificação é denominada relativa se a quantidade relativa ou proporção de mRNA de um gene específico for comparada, no que se refere à quantidade de mRNA de um gene constitutivo (controle endógeno, neste caso GAPDH), entre amostras diferentes. Isto é o que é designado como normalização da expressão de gene específica ou normalização em relação à diferente concentração total de RNA das amostras uma vez que se a quantidade de controle endógeno varia é devido a alterações na quantidade de RNA total utilizada na síntese de cDNA , não a mudanças em sua expressão. Para a quantificação, a quantidade de amplicão produzida é medida em cada ciclo do PCR. A quantificação do produto é produzida por meios de adição de fluoróforos que se juntam ao amplicão de maneira quantitativa de modo que quanto maior o produto, maior a fluorescência que será emitida.
[030] O Método quantitativo que foi usado é AACt no qual os Cts dos genes testados e genes referência (ACt) são comparados diretamente em cada amostra e subseqüentemente o (ACt) das amostras experimentais são comparados com a amostra de controle, para aplicar tal método é necessário para a eficiência de ambos os genes serem similares. Metodologia 1. Utilizando tripsina, separar as células e voltar a suspendê-las em meio de cultura suplementado (10% de sérum fetal bovino e antibiótico). 2. Determinar o número de células necessárias por fonte utilizando uma câmara Neubauer (HaCaT: 9.000 células/96 fontes, HSF: 9.000 células/96 fontes) 3. Incubação a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas para permitir a aderência da mesma. 4. Preparar as misturas de fator lipossomas e fator livre nas concentrações indicadas, remover o meio e adicionar as misturas. 5. Incubar a 37°C e 5% de CO2 por 72 horas. 6. Extração de RNA usando o Kit: E.Z.N.A.® Total RNA (Omega Bio-Tek, Inc., United States) seguindo as instruções do fabricante. O RNA isolado foi mantido a -80° até sua utilização. Um micrograma de RNA, estimado pela espectrofotometria NanoDrop 200 c (Thermo FisherScientific Inc.) foi utilizado para obter cDNA utilizando a transcriptase reversa M-MLV (invitrogen) de acordo com os procedimentos tradicionais. 7. O ensaio PCRq foi realizado usando o sistema ABI PRISM 7300 (Applied Biosystem, NJ, USA) e SYBR verde. As reações foram realizadas num volume de 20 pl na qual havia 2 pl de cDNA, 900 nm de primer, 200 nm de sonda e 10 pl do mestre de mistura universal TaqMan (Biosistema Aplicado) ou SYBR verde. As condições dos ciclos foram 50°C por 2 minutos e 95 graus por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. A expressão foi analisada pelo método de 2-DCt onde ACt é determinado subtraindo o valor de ACt do gene GAPDH, utilizado como controle endógeno, ao valor do objetivo Ct.
[031] Na Figura 1, pode-se observar que em queratinócitos humanos, ambos fatores lipossomados e fatores livres geram proliferação celular de 20-40% acima das células não tratadas (que indicam proliferação de 100%) a baixas concentrações (0.01ng/ml - 0.5 ng/ml). Entretanto, em concentrações maiores que 1 ng/ml, é observada uma alta diminuição da viabilidade celular com o fator lipossomado, mas não com o fator livre que mantém a proliferação celular ao redor de 20% acima das células não tratadas. Além disso, os lipossomas não induzem a proliferação a baixas concentrações (0.01 ng/ml - 0.5 ng/ml), embora induzam uma elevada diminuição da viabilidade celular em concentrações superiores ou iguais a 1 ng/ml.
[032] Além disso, na Figura 2, pode-se observar que em fibroblastos humanos, o fator livre não gera proliferação, sendo mantido por cerca de 100%. Entretanto, em concentrações maiores que 1 nh/ml, pode-se observar uma alta diminuição da viabilidade celular com o fator lipossomado, mas não com o fator livre que é mantido por cerca de 100%. Além disso, os lipossomas induzem numa diminuição da viabilidade celular (20%) em baixas concentrações (0.01 ng/ml - 05 ng/ml) e uma alta diminuição da viabilidade celular em concentrações superiores ou iguais a 1 ng/ml.
[033] Na Figura 3 pode-se observar que em queratinócitos humanos, ambos fatores lipossomados e livres geram a proliferação celular de 20% acima das células não tratadas (que indicam proliferação de 100%) em baixas concentrações (0.01 ng/ml - 0.5 ng/ml). Entretanto em concentrações maiores que 1 ng/ml, pode-se observar uma alta diminuição da viabilidade celular com o fator lipossomado, mas não com o fator livre que mantém a proliferação celular ao redor de 20% acima das células não tratadas. Além disso, os lipossomas não induzem a proliferação em baixas concentrações (0.01 ng/ml - 0.5 ng/ml), embora induzam uma alta diminuição da viabilidade celular em concentrações superiores ou iguais a 1 ng/ml.
[034] Além disso, na Figura 4, pode-se observar que nos queratinócitos humanos, o fator lipossomado e o fator livre geram a proliferação celular de 100% acima das células não tratadas (que indicam 100% de proliferação) a baixas concentrações (0.01 ng/ml - 0.5 ng/ml). Entretanto, em concentrações superiores a 1 ng/ml, é observada uma diminuição da viabilidade celular de 50-60% com o fator lipossomado, mas não com o fator livre que mantém a proliferação celular ao redor de 60% acima das células não tratadas. Adicionalmente, os lipossomas não induzem a proliferação em baixas concentrações (0.01 ng/ml - 0.5 ng/ml), embora induzam uma diminuição da viabilidade celular de 5060% em concentrações superiores ou igual a 1 ng/ml.
[035] Na Figura 5, pode-se observar que em queratinócitos humanos, ambos fatores lipossomados e livres geram a proliferação celular de 60-70% acima das células não tratadas (que indicam 100% de proliferação) a baixas concentrações (0.01 ng/ml). Entretanto, numa concentração de 0.5 ng/ml, o fator livre gera uma proliferação de 40%, enquanto que o fator lipossomado não gera proliferação. Além disso, em concentrações maiores que 1 ng/ml, pode-se observar uma diminuição da viabilidade celular de 50% com o fator lipossomado, mas não com o fator livre que mantém a proliferação celular em torno do controle. Adicionalmente, os lipossomas não induzem a proliferação a baixas concentrações (0.01 ng/ml - 05 ng/ml) embora induzam uma diminuição da viabilidade celular em concentrações superiores a 0.5 ng/ml.
[036] Na Figura 6, pode-se observar uma rápida velocidade de reparo da ferida com o fator livre em queratinócitos humanos desde 24 horas de tratamento, a ferida fecha-se 40% mais rápido do que nas células controle e em 48 horas já está completamente cicatrizada. Entretanto, pode-se observar que o fator lipossomado torna difícil fechar a ferida, começando a fechar mais lentamente do que nas células controle. Entretanto, na Figura 7, pode-se observar que em queratinócitos humanos há praticamente nenhuma diferença observada na velocidade de reparo da ferida entre as células tratadas com o fator livre e as células controle.
[037] Na Figura 8, é observado um ligeiro aumento na velocidade de reparo da ferida em queratinócitos humanos em relação às células de controle desde 24 horas do tratamento a ferida fechou 13% mais rápido que o controle e em 48 horas já estava completamente fechada. Entretanto, pode-se observar que o fator lipossomado torna difícil fechar a ferida, começando a fechar mais lentamente do que nas células controle. Além disso, na Figura 9 pode-se observar que em queratinócitos humanos as células tratadas com o fator livre mostram uma velocidade de reparo maior da ferida, 20% mais rápido do que no controle. Entretanto, como em outros casos, o fator lipossomado torna difícil fechar a ferida, começando fechar mais lentamente do que nas células controle.
[038] Deve ser destacado que os resultados obtidos com os ensaios de migração são similares àqueles obtidos nos ensaios da proliferação celular e, portanto, corroboram-se.
[039] Nas Figuras 10 e 11, pode-se observar um aumento na síntese da elastina nas células tratadas ambas com o fator livre e com o fator lipossomado em relação às células controle (indicado pela linha horizontal = valor 1), tanto em fibroblastos como em queratinócitos. O aumento é dependente da dose, aumentando à medida que a concentração do fator aumenta.
[040] Nas Figuras 12 e 13, pode-se observar um aumento na síntese da elastina nas células tratadas ambas com o fator livre e com o fator lipossomado em relação às células controle (indicado pela linha horizontal = valor 1), tanto em fibroblastos como em queratinócitos. O aumento é dependente da dose, aumentando à medida que a concentração do fator aumenta.
[041] Neste ensaio das células, foi induzida uma leve inflamação nas mesmas com LPS antes do tratamento. Para esta finalidade, foi adicionado meio com 200 ng/ml de LPS, durante 3 horas, removeu-se e adicionou-se o meio com os fatores.
[042] Nas Figuras 14 e 15, foi observada uma diminuição da inflamação, isto é, os níveis de transcrição de TNFa e IL6 nas células tratadas com o fator livre ou com o fator lipossomado após inflamação prévia com LPS (barras de c LPS) ter sido induzido nelas. Estes resultados indicam o efeito antiinflamatório do fator HGH, ambos livre e lipossomados. Esta diminuição é dependente da dose, aumentando à medida que a concentração do fator aumenta.
[043] Na Figura 16, é observada uma diminuição da inflamação, isto é, os níveis de transcrição de TNFa e IL6 nas células tratadas com o fator livre ou com o fator lipossomado após inflamação prévia com LPS (barras de c LPS) ter sido induzido nelas. Estes resultados indicam o efeito antiinflamatório do fator GN-CSF, ambos livre e lipossomado. Esta diminuição é dependente da dose, aumentando à medida que a concentração do fator aumenta.
[044] Com a natureza da presente invenção suficientemente descrita, tudo que precisa ser adicionado é que esta invenção pode sofrer certas variações em termos de componentes e porcentagens, contanto que tais alterações não modifiquem substancialmente as características que serão reivindicadas a seguir.
Claims (7)
1. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DECRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” caracterizado por compreender uma mistura de lipossomas que incorporam no seu interior antioxidantes tais como ergotioneina, quercetina e pterostilbeno, mistura de lipossomas de peptídeos anti-rugas, um extrato de Malus domestica células-tronco não incluídas nos lipossomas, e que também compreende uma mistura com as seguintes porcentagens de lipossomas dos seguintes fatores de crescimento de origem vegetal: - Lipossomas HGH (hormônio humano de crescimento) Nicotiana Benthamiana Sh-Polipeptídeo-7 de 4 a 10%. - Lipossomas GM-CSF (fator de estimulação de colônias de macrófagos granulócitos) Nicotiana benthamiana Sh-Polipeptídeo- 45 de 2 para 7%. - Lipossomas TGFb2 (fator de crescimento tumoral beta 2) Nicotiana benthamiana Hexapeptídeo-40 Sh-Polipeptídeo-76 de 2 para 10%.
2. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poros lipossomas encapsulam cada um dos fatores de crescimento, os peptídeos antioxidantes e anti-rugas separadamente.
3. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poros fatores de crescimento incluídos nos lipossomas terem uma pureza maior que 95%.
4. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poras porcentagens de lipossomas com antioxidantes no interior serem de 1 para 3%
5. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poros peptídeos anti-rugas serem palmitoil tripeptídeo-3, caprooyl tetrapeptídeo-3 e extrato de centelha asiática.
6. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1 e 5, caracterizado pora porcentagem de lipossomas com peptídeos anti-rugas no interior serem de 1 para 4.5%.
7. “PRODUTO COSMÉTICO COM FATORES DE CRESCIMENTO LIPOSSOMADOS” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pora porcentagem de extrato de célula tronco de Malus domestica ser de 0.1 para 1.5%.
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